DE3789781T2

DE3789781T2 - Antigene, Antikörper und Verfahren zur Identifizierung humaner metastatischer Tumoren und Zellinien zur Herstellung dieser Antikörper.

Info

Publication number: DE3789781T2
Application number: DE3789781T
Authority: DE
Inventors: Garth L Nicolson; Susan M North; Peter A Steck
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1986-04-01
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2007-04-02
Also published as: AU599364B2; FI871411A; FI89806B; EP0240341B1; FI89806C; DK162387A; US5030559A; JPH0742320B2; JPS62253395A; ATE105569T1; NO175642C; ES2051737T3; DK162387D0; NO871352L; FI871411A0; EP0240341A2; EP0240341A3; DE3789781D1; NO175642B; CA1307478C

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für den Nachweis von menschlichen Tumorzellen. Die Erfindung betrifft insbesondere Antikörper, entwickelt gegen ein Ratten- oder menschlisches Glycoprotein-Antigen mit 580 Kilodalton, als potentiell wertvolle immunodiagnostische Reagentien für Tumoren und weiterhin als nützliche Reagentien für die Verhinderung von metastatischen Läsionen. Gemäß der Erfindung wird das menschliche Antigen bereitgestellt.
Brustkrebs ist eine Hauptursache von Todesfällen bei Frauen in Nordamerika und Nordeuropa. Obwohl die Häufigkeit der Entdekkung und der Beseitigung von primärem Brustkrebs durch neuere Fortschritte signifikant verbessert worden ist, entwickelt ein großer Prozentsatz der Patientinnen mit Brustkrebs metastatische Läsionen, die schließlich zum Tode führen.
Der Prozeß der Tumormetastasis verläuft mittels einer Anzahl von sequentiellen und hochselektiven Schritten. Viele von diesen Schritten erfordern eine Anzahl von komplexen Wechselwirkungen zwischen den Tumorzellen und der Wirtsumgebung, und die Mehrzahl dieser Wechselwirkungen scheint durch Zelloberflächenkomponenten vermittelt zu werden. Zur Untersuchung der möglichen funktionellen Rollen von verschiedenen Zelloberflächenkomponenten in dem metastatischen Prozeß haben verschiedene Forscher die Expression oder enzymatische Wirkungen dieser Komponenten mit dem metastatischen Potential von Tumorzellsublinien oder Klonen in Beziehung gesetzt. Alternativ sind die Oberflächen von Tumorzellen metabolisch oder enzymatisch modifiziert und die metastatischen Eigenschaften der modifizierten Zellen untersucht worden.
Zelloberflächenkomponenten von spontan metastasierenden Mamma-Adenokarzinomen bei Ratten sind z. B. bereits bezüglich möglicher biochemischer Marker untersucht worden, für die eine Beziehung zu der Metastase von Mamma-Tumoren bei der Ratte bestehen könnte. Ein System, von dem gefunden wurde, daß es ein nützliches Modell der Metastasis von Mamma-Tumoren bei der Ratte darstellt, ist das Ratten-Mamma-Adenokarzinom 13762NF, beschrieben in Neri et al. (1982), J. Natl. Cancer Inst., 68: 507-517. Verschiedene Zellklone und Linien, die aus dem 13762NF-System erhalten wurden, erwiesen sich als unterschiedlich bezüglich ihrer Fähigkeit, spontan zu regionalen Lymphknoten und entfernten Organen zu metastasieren. Zusätzlich zeigen sie Unterschiede bezüglich des morphologischen Zell- und Gewebeaussehens, der Karyotypen und der Reaktion auf therapeutische Mittel.
Die Expression von speziellen Zelloberflächen-Glycoproteinen erwies sich als korrelierbar mit den metastatischen Fähigkeiten dieser Zellen. Zum Beispiel werden Sialoglycoproteine mit Molekulargewichten zwischen 175.000 und 250.000 auf Metastase-abgeleiteten Zellen exprimiert, während die hauptsächlichen Sialoglycoproteine Molekulargewichte zwischen 80.000 und 120.000 bei von einem primären Rattentumor abgeleiteten Zellen aufweisen. Ein Sialoglycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 80.000 wurde in mehr metastatischen Rattentumorzellen weniger exprimiert; ein anderes Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 580.000, synthetisiert in Rattentumorzellen, wies eine vergrößerte Expression in den stärker metastatischen Rattentumorzellen auf. Bisher wurde jedoch kein mit der Metastasis assoziiertes Glycoprotein mit 580 Kilodalton in menschlichen Tumorzellen identifiziert oder als mit diesen assoziiert nachgewiesen.
Die Identifizierung von menschlichen, tumorassoziierten antigenen Proteinen auf der Oberfläche von menschlichen Tumorzellen könnte zu der Bildung von Antikörpern führen, welche zur Immunodiagnose von menschlichen Tumorzellen befähigt sind. Unglücklicherweise sind jedoch die Oberflächenkomponenten menschlicher Tumorzellen entweder wenig oder nicht antigen und sind zudem mit verschiedenen normalen menschlichen Geweben assoziiert. Wenn Zelloberflächenantigene sowohl bei normalen als auch bei Tumorzellen üblich sind, weisen immunodiagnostische Sonden, die gegen diese Antigene gerichtet sind, unbefriedigende Eigenschaften auf, da sie eine hohe Anzahl von falsch-positiven Reaktionen zeigen.
Immunodiagnostische Krebssonden sind daher ungenau, weil sie eine große Anzahl von entweder falsch-positiven Reaktionen und/oder falsch-negativen Reaktionen ergeben. Demgemäß wäre eine tumordiagnostische Sonde mit einem hohen Ausmaß der Korrelation mit dem Krebszustand beim Menschen bei der frühen Diagnose und der Behandlung von menschlichen Tumoren nützlich. Eine immunodiagnostische Sonde, die in Beziehung zu metastatischen Tumoren steht, wäre zudem in ähnlicher Weise nützlich für den behandelnden Onkologen oder Chirurgen.
In ihrer allgemeinsten Form betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die für die Identifizierung von menschlichen metastatischen Tumorzellen nützlich sind, die Antikörper, und zwar sowohl polyklonale als auch monoklonale, einschliessen, gebildet gegen ein Glycoprotein-Tumorantigen mit 580 Kilodalton, bezeichnet als hgp580. Das Antigen stellt somit einen wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Das aus einer menschlichen Tumorquelle isolierte und charakterisierte hgp580-Antigen wird mit hgp580 bezeichnet. In der hier benutzten Bedeutung besagt der Ausdruck "isolierbar", daß das spezielle Antigen als aus einer speziellen Quelle isolierbar charakterisiert ist. Diese Bezeichnung soll jedoch nicht bedeuten, daß eine derartige Quelle die einzige Quelle für die Isolierung des so bezeichneten Antigens ist.
Die hgp580-Antigene der vorliegenden Erfindung sind Glycoproteine, die mittels der Gelelektrophorese mit einem Molekulargewicht von etwa 580 Kilodalton identifizierbar sind. In der hier benutzten Form besagt der Ausdruck "identifizierbar", daß das hgp580-Antigen ein angenähertes Molekulargewicht von 580 Kilodalton aufweist, wenn es der Gelelektrophorese unter Bedingungen unterworfen wird, die ähnlich zu den hier erläuterten sind. Wie für den Fachmann erkennbar ist, sind derartige Größenbestimmungen jedoch keinesfalls genau, und Veränderungen oder Variationen der Methoden der Molekulargrößenbestimmungen können zu Schwankungen der Größe führen, welche ein spezielles Antigen aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der mittels üblicher Methoden, die dem Fachmann bestens geläufig sind, hergestellt wird. Derartige monoklonale Antikörper werden vorzugsweise durch Fusion von Milzzellen einer immunisierten Ratte mit Rattenmyelomzellen hergestellt. Es wird jedoch auch in Erwägung gezogen, daß der Vorteil der vorliegenden Erfindung auch dadurch erreicht werden kann, daß man andere Zelltypen fusioniert, einschließlich solcher eines Murinursprungs.
Die Erfindung ist weiterhin auf eine hybride, kontinuierliche Zellinie gerichtet, die mit dem hgp580-Antigen reagierende Antikörper bildet, erhalten mittels eines Verfahrens, das folgende Schritte einschließt: Fusion von Milzzellen von Säugetieren mit Myelomzellen, abgeleitet von einer homologen Gattung, wobei der die Milzzellen liefernde Organismus mit einem antigenen, ein gp580-Antigen umfassenden Gemisch immunisiert worden ist; Züchtung der Zellen in einem selektiven Medium; Testen bezüglich der Anwesenheit der gewünschten Antikörper und Klonen der den gewünschten Antikörper bildenden Zellen. Hybride, kontinuierliche Zellinien, die Antikörper produzieren, welche mit menschlichem hgp580-Antigen reagieren, können insofern unter Verwendung von Milzzellen hergestellt werden, die entweder gegen hgp580 oder rgp580-Antigen immunisiert worden sind, wobei rgp580 das gp580 vom Ursprung der Ratte ist, als sich gezeigt hat, daß derartige Antikörper kreuz reagieren.
Im wesentlichen reine Tumor-gp580-Antigene, die für die Bildung von menschlichen, gegen Tumoren gerichtete Antikörper verwendbar sind, werden mittels eines Verfahrens hergestellt, das die folgenden Schritte einschließt: Extraktion gp580 einschließender Proteine aus einem das gp580 enthaltendem Tumor; Unterwerfen des Extraktes der Gelausschlußchromatographie; Sammeln des Ausschlußproduktes, Unterwerfung des Ausschlußproduktes einer anionischen Austauschchromatographie; Elution der an die anionischen Austauschharze bindenden Fraktionen; Unterwerfen des Eluates einer Gelausschlußchromatographie; und Sammlung der Ausschlußfraktionen. Der Fachwelt wird klar sein, daß es zahlreiche Variationen bei den Methoden der Proteinisolation gibt.
Im wesentlichen reines rpg580-Antigen, das ebenfalls bei der Herstellung von menschlichen, gegen Tumoren gerichteten Antikörpern verwendet werden kann, kann in ähnlicher Weise hergestellt werden. Zusätzlich kann gp580 mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das die folgenden Schritte einschließt: Extraktion der gp580 einschließenden Proteine aus einem Ratten- oder menschlichen Tumor, der das Antigen enthält; Unterwerfen des Extraktes einer Gelausschlußchromatographie; Sammeln des Ausschlußproduktes; Unterwerfen des Ausschlußproduktes einer Dichtegradienten-Zentrifugierung; Fraktionierung des äquilibrierten Dichtegradienten; Unterwerfen der gp580 enthaltenden Fraktionen einer Gelausschlußchromatographie; und Sammeln der Ausschlußfraktionen. Das Verfahren schließt den zusätzlichen Schritt der Dichtegradienten-Zentrifugierung ein, von dem sich gezeigt hat, daß er bei der Herstellung von im wesentlichen reinen gp580-Antigenen nicht unbedingt wichtig ist.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von metastatischen, menschlichen Tumorzellen in einer Probe gerichtet, das die folgenden Schritte einschließt: Kontaktieren der Probe mit einem für das hgp580-Antigen spezifischen Antikörper und Bestimmung der an den Antikörper gebundenen Materialien. Die besonderen Vorteile dieses Verfahrens können erreicht werden, indem man die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen mischt, die spezifische Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen fördern, und die Antigen/Antikörper-Wechselwirkung bestimmt. Es wird angenommen, daß derartige diagnostische Verfahren allgemein bei Proben anwendbar sind, die aus zahlreichen biologischen Quellen stammen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, aus Blut, Plasma, Milch, Brustsekreten, Urin, Speichel, Schweiß, Serum und Gewebeproben.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von metastatischen, menschlichen Tumorzellen in einer nicht-wäßrigen Probe gerichtet, das folgende Schritte einschließt: Schichtung der Probe mit einem rgp580- oder hgp580-Antikörper; Inkubieren der geschichteten Probe unter Bedingungen, die spezifische Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen fördern; und Bestimmung der Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zur Verringerung der Häufigkeit von metastatischen Läsionen bei Krebspatienten gerichtet, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer einen Antikörper gegen ein gp580-Antigen enthaltenden Zusammensetzung einschließt.
Fig. 1. Schematisches Diagramm der bei der Isolierung von rgp580 verwendeten Verfahren.
Fig. 2. Gelfiltration von radioaktiv markierten Makromolekülen, synthetisiert von MTLn3-Zellen nach einer dissoziativen CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.
A,[³H]Glucosamin-(-) und [³&sup5;S]-Sulfat-( . . . ); und B,[³H]Serin-markierte Zellextrakte aus den verschiedenen Dichtegradientenfraktionen wurden einer Sepharose- CL-2B-Säulenchromatographie in 4 M-Guanidin-HCl (GdnHCl) und 0,1 M Natriumacetat, sämtlich bei pH 5,8, unterworfen. Die durchschnittliche Dichte der Fraktionen wurde aufgezeichnet (p-Werte) und die Pfeile geben die Leervolumen(V&sub0;)- und die Gesamtvolumen(VT)-Elutionsfraktionen der Säulen an.
Fig. 3. Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sephacel-Säulen von metabolisch radiomarkierten, gepoolten Leervolumenfraktionen aus der Sepharose-CL-2B-Elution. Elutionsprofile von A,[³H]Glucosamin-, B,[³H]Fucose- und C,[¹&sup4;C]Serin-markierten Proben aus kultivierten MTLn3-Zellen werden gezeigt. Die durchgezogene Linie zeigt die Konzentration der Natriumchlorid-Elution. Die verschiedenen Fraktionen I, II, III und IV wurden für die weitere Analyse gepoolt. Die radioaktiven Peaks wurden durch ihre Elutionsposition im Vergleich zu der [³H]-Glucosamin-Probe bezeichnet.
Fig. 4. Diethylaminethyl(DEAE)-Sephacel-Elutionsprofil von Dichtegradientenfraktionen von Rattentumorextrakten (A). Die durchgezogene Linie zeigt die bei der Elution verwendete Konzentration von Natriumchlorid. Die verschiedenen Peaks (I-IV) wurden einzeln gepoolt, und anschließend wurden Teile der SDS-PAGE unterworfen. Die Platte B, Autoradiogramm von bindendem ¹²&sup5;J-markiertem Erdnußagglutinin (PNA) an die gereinigten, DEAE-gepoolten Peaks nach der SDS-PAGE an einem 7,5% Acrylamidgel. Die Spuren A-D entsprechen den Peaks I-IV auf der DEAE-Kolonne. Die PNA-Bindung wurde mittels eines Kontrollgels als spezifisch nachgewiesen, wo Lactose bei der Inkubation eingeschlossen wurde. Die Proteinstandards schließen Myosin, B-Galactosidase, Phosphorylase,
Rinder-Serumalbumin und Ovalbumin mit Mr(X10³) von 200, 130, 92, 68 bzw. 45 ein.
Fig. 5. Bindung von MAb, GP21 : 56 an Glutaraldehyd-fixierte und nicht fixierte, lebensfähige 13762NF-Adenokarzinomzellen. ¹²&sup5;J-markiertes MAb GP21 : 56 wurde 1 h inkubiert, und die zellgebundene Reaktivität wurde direkt nach der Lyse der Zellen bestimmt. Fixierte Zellen (schraffiert); nicht fixierte Zellen (offene Kästchen).
Fig. 6. SDS-PAGE von radiomarkierten und gereinigten Fraktionen. Bei der Platte A entsprechen die [³H]Glucosaminmarkierten Sephacel-DEAE-Cellulosefraktionen I-IV den Spuren A-D. Bei Platte B sind das [¹&sup4;C]Serin-markierte gereinigte gp580 (Spur A) und das Trifluormethylsulfonsäure-behandelte gp580 (Spur B) gezeigt. Die Elektrophorese wurde an einem 2 bis 17,5% DATD-Acrylamidgel, gefolgt von einer Fluorographie, durchgeführt. Die Proteinstandards schließen Myosin, Phosphorylase a, Rinder-Serumalbumin und Ovalbumin mit ein, wobei Mr (· 10³) 200, 94, 68 bzw. 45 beträgt.
In ihrem allgemeinsten Sinne betrifft die vorliegende Erfindung immunodiagnostische Reagentien für menschliche Tumore, die bei der Identifizierung und der Diagnose von Krebs verwendet werden können, und insbesondere die Diagnose von metastatischem Krebs bei Menschen. Zusätzlich betrifft die Verbindung therapeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Verhinderung und der Behandlung von metastatischen Erkrankungen. Es wurde gefunden, daß monoklonale Antikörper, gebildet gegen ein Zelloberflächen-Glycoprotein eines Rattentumors mit der Bezeichnung rgp580 oder ein Zelloberflächen-Glycoprotein eines menschlichen Tumors mit der Bezeichnung hgp580, als diagnostische Reagentien für menschliche Tumore verwendet werden können. Weiterhin wurde gefunden, daß therapeutische Zusammensetzungen, die derartige Antikörper einschließen, die Entwicklung von metastatischen Läsionen verhindern.
Obwohl früher gezeigt wurde, daß das Ratten-rgp580-Protein auf den Zelloberflächen von verschiedenen Rattentumoren exprimiert wird, wurde von diesem niemals gezeigt, daß es antigenisch ist. In ähnlicher Weise ist bisher kein 580 Kilodalton-Glycoprotein gefunden worden, das mit menschlichen Tumorzellen assoziiert ist. Die vorliegende Erfindung offenbart daher die einzigartige Erkenntnis, daß gegen das Ratten-Tumorantigen rgp580 gerichtete Antikörper erfolgreich menschliche Tumoren immunodiagnostizieren können. Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung Antikörper, die gegen ein bisher nicht beschriebenes, menschliches 580 Kilodalton-Glycoproteinantigen gerichtet sind, welches bei der Immunodiagnose von menschlichem Krebs verwendet werden kann. Beide offenbarten Typen von Antikörpern scheinen stark mit metastatischen menschlichen Mammatumoren zu reagieren.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf Methoden offenbart, die von den Erfindern als besonders nützlich festgestellt wurden, und zwar bei 1) der Isolierung und partiellen Reinigung des rgp580-Antigens; 2) der Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität für das rgp580-Antigen; 3) der Isolierung und partiellen Reinigung des hgp580-Antigens; und 4) der Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität für das hgp580-Antigen. Die Antigen-Reinigungsschritte wurden so ausgestaltet, daß sie durch das relativ große Molekulargewicht der Antigene begünstigt werden ebenso wie durch deren Auftriebsdichte relativ zu anderen Proteinen und deren elektrostatische Ladungen im Vergleich zu anderen Proteinen. Es wurden monoklonale Antikörper unter Verwendung von sowohl Ratte/Ratte- als auch Maus/Maus-Fusionen hergestellt, wobei Ratte/Ratte-Hybride bevorzugt sind.
Durch die vorliegenden Erfinder durchgeführte Experimente haben die potentielle Nützlichkeit der anti-gp580-Antikörper gezeigt, und zwar sowohl bei der Bestimmung von Krebs als auch als Immunoscreening-Antikörper und bei der möglichen Verhinderung und Behandlung von Krebs. Die hier offenbarten Immunodetektionsmethoden sind insoweit einzigartig, als sie einzigartige Antikörper mit einzigartigen Spezifizitäten für Proteine verwenden, von welchen bisher nicht bekannt war, daß diese antigenisch und mit menschlichen Tumoren assoziiert sind. Die grundliegende Immunoscreening-Methodik ist jedoch in der Fachwelt bekannt.
In seiner allgemeinsten Ausgestaltung beinhaltet das Immunoscreening, daß ein gp580-Antikörper in Kontakt mit einer Probe gebracht wird, bei welcher der Verdacht besteht, daß sie entweder Tumorzellen oder Tumorzellprodukte (d. h. Tumorantigene) mit dieser assoziiert enthält. Eine positive Immunoreaktion zwischen einer verdächtigten Probe und dem gp580-Antikörper wäre daher ein Indiz für die Anwesenheit von Krebszellen in dem Organismus, von dem die Probe stammt. Verschiedene Methoden zur Bestimmung einer positiven Immunoreaktion sind in der Fachwelt bekannt, einschließlich radioaktiven Markern, farbbildenden Substraten, die von Enzymen (z. B. Peroxidase), verknüpft entweder mit dem Antigen oder dem Antikörper, aktiviert werden, Radioimmunoassays (RIAs), enzymverknüpften Immunosorptionsassays (ELISAs) oder anderen Liganden, die an das Antigen oder den Antikörper gebunden sind, z. B. Ferritin oder Avidin/Biotin.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß gp580-Antigene gemäß der vorliegenden Erfindung als solche als Krebsscreening-Reagentien verwendet werden. Solche Antigene können z. B. in einen geeigneten ELISA gegeben werden, um die Anwesenheit von zirkulierenden anti-gp580-Antikörpern in dem Serum eines Patienten zu bestimmen, wobei die Anwesenheit derartiger zirkulierender Antikörper ein Indiz für Krebs ist. Methoden zur Verwendung von Antigenen zur Bestimmung von zirkulierenden Antikörpern sind allgemein in der Fachwelt bekannt.
Von den Erfindern durchgeführte Ergebnisse haben gezeigt, daß Antikörper der vorliegenden Erfindung bei der Prävention von Krebs verwendet werden können, insbesondere bei der Prävention von metastatischen Erkrankungen. Es wird angenommen, daß dies eine neue Erkenntnis in bezug auf Antikörperreagentien ist, die neue Ansatzpunkte für die Verhinderung von Krebs nahelegt. Man kann sich vorstellen, daß derartige Antikörper-Zubereitungen sehr nützlich sein können, z. B. bei der Behandlung von postoperativen Krebspatienten zur Verhinderung des Auftretens von sekundären metastatischen Läsionen, von denen anzunehmen ist, daß sie mögliche operationsbedingte Komplikationen darstellen. Derartige Zubereitungen können durch intravenöse Infusion über einen Zeitraum von Tagen verabreicht werden, z. B. im Anschluß an derartige Operationen.
Alternativ können Antikörper-Zubereitungen des anti-gp580 mit toxigenen Molekülen verknüpft werden, z. B. Cholera-, Ricin-, Abrin- oder Modeccin-Toxin, zur Herstellung von spezifischen "Killer"-Antikörpern. Derartige toxinkonjugierte Antikörper würden dadurch sowohl eine Spezifizität für die Zieltumorzellen als auch die Fähigkeit zum Abtöten derartiger einmal angezielter Zellen aufweisen. Derartige Antikörper weisen daher die Fähigkeit sowohl zum Aussuchen und zur Zerstörung von Tumorzellpopulationen als auch in erster Linie zur Verhinderung der Entwicklung solcher Populationen auf.
Es wird in Betracht gezogen, daß Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in Form eines Krebsscreening-Kits formuliert werden können. Derartige Kits können den geeigneten antigp580-Antikörper zusammen mit einem Mittel zur Bestimmung einer Immunoreaktion einschließen. Ein Mittel zur Bestimmung einer Immunoreaktion ist, wie hier verwendet, ein Reagens, das eine spezifische Immunoreaktion anzeigen oder bestimmen kann, und zwar zwischen dem Antikörper und dem gp580-Antigen. Beispiele für derartige Reagentien schließen Peroxidase-markierte oder radiomarkierte Antigene oder Antikörper ein. Solche Reagentien und ihre Verwendung sind in der Fachwelt bekannt.

Beispiel I: Isolierung und Charakterisierung von Rattenrgp580.

Das 580 Kilodalton-Glycoprotein von Ratten, rg580, kann aus zahlreichen Rattentumoren oder Zellinien von Rattentumoren isoliert werden. In der Tat kann jeder Rattentumor, von dem gefunden wird, daß er mit dem anti-rgp580-Rattenantikörper kreuzreagiert, als Ausgangsquelle für die Isolierung dieses Rattentumor-Antigens dienen. Die vorliegenden Erfinder haben jedoch festgestellt, daß eine bevorzugte Quelle für rgp580 von Mamma-Adenokarzinomzellen von Ratten gebildet wird, und zwar weil diese Zellen einen hohen Spiegel an rgp580 aufzuweisen scheinen, das mit ihren Membranen assoziiert ist. Insbesondere eine Zellinie, Ratten-13762NF-Tumorzellklon MLTn3, wird als bevorzugte Quelle verwendet. Derartige Zellen wurden aus spontanen Lungenmetastasen kloniert, wie von Neri et al. (1982), J. Natl. Cancer Inst., 68 : 507-517, beschrieben. Es ist jedoch für den Fachmann ebenfalls verständlich, daß andere Zellinien in Zukunft identifiziert werden können, von denen gezeigt wird, daß sie bessere Quellen für rgp580 sind.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm der im folgenden eingehend beschriebenen Verfahren, die bei der Isolierung von rgp580 verwendet werden. Kurz gesagt wird der Extrakt nach der Extraktion von löslichen Proteinen aus einer geeigneten Tumorzelle über eine Sephadex-G-50-Kolonne geleitet, und die geleerten Fraktionen werden gesammelt. Die gepoolten Leerfraktionen werden anschließend in einem CsCl-Auftriebsdichtegradienten zentrifugiert, gefolgt von einer Sepharose-C1-2B- Chromatographie. Die Sepharose-C1-2B-Fraktionen werden anschließend auf eine DEAE-Sephacel-Kolonne gegeben und mit NaCl eluiert; die Fraktionen werden bezüglich der Anwesenheit von rgp580 analysiert.

a. Chemikalien.

Die folgenden Chemikalien stellen eine partielle Auflistung von Beispielen für Reagentien dar, die bei der Isolierung von rgp580 und seiner Charakterisierung verwendet werden. Es ist für den Fachmann jedoch klar, daß zahlreiche geeignete Austauschmittel verwendet werden können, ohne daß dabei der Rahmen der Erfindung verlassen wird. D-[6-³H]Glucosamin (20-30 Ci/mmol), D-[1-³H]Galactbse (1-5 Ci/mmol), L-[6-³H]Fucose (20-35 Ci/mmol), L-[4,5-³H]Leucin (30-50 Ci/mmol), L[6-³H]Serin (5-10 Ci/mmol), L-[U-¹&sup4;C]Serin (135-165 mCi/mmol) und [³&sup5;S]Na&sub2;SO&sub4; wurden von ICN Pharmaceutics (Irvine, CA) erworben; D-[2-³H]Mannose (10-20 Ci/mmol) stammte von New England Nuclear (Boston, MA); Streptomyces-Hyaluronidase und Chondroitinase ABC stammten von Miles Laboratories (Elkhart, IN); Collagenase Typ VII stammte von Sigma Chemical Co, (St. Louis, MO); Trypsin (dreimal kristallisiert) stammte von Worthington (Freehold, NJ); Pronase stammte von Calbiochem (San Diego, CA); Alpha-modifiziertes Eagle-Medium (AMEM) stammte von GIBCO (Grand Island, NY); fötales Rinderserum (FBS) stammte von Sterile Systems (Logan, UT); und Cäsiumchlorid stammte von Bethesda Research Laboratories (Rockville, MD).

b. Zellen.

Der Ratten-13762NF-Tumorzellklon MTLn3 mit einem hohen metastatischen Potential zeigt hohe Spiegel an rgp580 und ist daher eine bevorzugte Quelle für dessen Isolierung. Die für die Isolierung verwendeten Zellen wurden aus spontanen Lungenmetastasen kloniert, wie von Neri et al. (1982), J. Natl. Cancer Inst., 68 : 507-517, beschrieben, und als gefrorener Vorrat aufbewahrt. MTLn3-Zellen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-feuchter Luft-Mischung auf 100 mm Gewebekulturplatten (Corning Class, Corning, NY) in AMEM-Medium mit einem Gehalt von 10% FBS und keinen Antibiotika gezüchtet. Die bei diesem Beispiel verwendeten Zellen fanden sich in der exponentiellen Wachstumsphase und stammten von in vitro-Passagen T14 bis T20. Die Zellen wurden routinemäßig gescreent und erwiesen sich als frei von Mycoplasma und Virusverunreinigungen, bestimmt mittels des Verfahrens von Chen (1976), In Vitro, 3 : 229-232.
Mamma-Tumoren wurden durch subkutane Injektion von etwa 1 · 10&sup6; lebensfähigen MTLn3-Zellen in die inguinale Brustfettpartie von leicht anästhesierten syngenen weiblichen Fischer- 344-Ratten (Charles Riyer Breeding Laboratories, Portage, MI) erhalten. Dieses Verfahren führte zu einem Tumor mit einem Durchmesser von 11,7 ± 4,6 mm 30 Tage nach Injektion der Tumorzellen bei jeweils 100% bzw. 50% von tumortragenden Tieren mit Lymphknoten- bzw. Pulmonarmetastasen-Läsionen. Da das Zentrum des Tumors bei 30 Tagen nekrotisch war, wurde die Mehrzahl der verwendeten Tumore nach 14 Tagen gewonnen. Für die Tumorgewinnung wurden die Ratten durch Inhalierung von Metofane (Pitman-Moore, Inc., Washington, NJ) getötet, und die Tumoren wurden sorgfältig von dem umliegenden Gewebe entfernt, in phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS) gespült und zerkleinert. Die Tumorstücke wurden anschließend in der unten beschriebenen Weise extrahiert.

c. Radioaktive Markierung von Tumorzellen.

Die metabolische Radiomarkierung von in-vitro gezüchteten Zellen wurde verwendet, um das rgp580-Antigen radioaktiv zu markieren. Im allgemeinen wird dies in leichter Weise erreicht, indem man die Zellen in vollständigem Medium (AMEM plus 10% FBS; 5 ml in einer 100 mm-Kulturplatte) mit einem Gehalt an 10 u Ci/ml von [³H]Glucosamin, [³H]Galactose oder [³H]Fucose züchtet, und zwar 24 h lang, um die Kohlehydratreste zu markieren. Bei Experimenten, in denen Zellen mit [³H]Mannose markiert wurden, erwies sich 200 u Ci/ml als ausreichend, wenn es dem vollständigen Medium zugesetzt wurde, indem das AMEM eine Hälfte der normalen Konzentration an Dextrose (1 g/l) enthielt. Zur Herstellung von mit [³H]Leucin, [¹&sup4;C]Serin oder [³H]Serin markierten Zellen enthielt das Medium 10 u Ci/ml des radioaktiven Vorläufers und ein Zehntel der gewöhnlichen Konzentration der Aminosäure (5,25 mg/l bzw. 2,5 mg/l). Die MTLn3-Zellen wurden mit 50 u Ci/ml Na&sub2; [³&sup5;S]O&sub4; in AMEM markiert, wobei das MgSO&sub4; (80,9 mol) durch MgCl&sub2; ersetzt wurde. Nach der Markierungsperiode von 24 h kann das Medium gesammelt, bei 4ºC 10 min lang bei 2.000 · g zur Entfernung von Zelltrümmern zentrifugiert und bei -80ºC gefroren werden. Die Kulturplatten werden zweimal mit PBS gewaschen und rgp580, wird aus den Zellen in der im folgenden beschriebenen Weise extrahiert.

d. Isolierung von rgp580 aus metabolisch-markierten Tumorzellen.

Zellen, die metabolisch mit Radioisotopen markiert worden sind, können bei der Isolierung von rgp580 verwendet werden, um ein Mittel zur Verfolgung der Isolierung und der Reinheit wie oben beschrieben zu liefern. Das markierte Protein wandert in die Nähe des Leervolumens der Sepharose-CL-4B-Kolonnen. Zusätzlich bindet rgp580 ¹²&sup5;J-markiertes Erdnußagglutinin nach der Desialylierung, und das desialylierte rgp580 kann nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) als ein PNA- bindendes Glycoprotein hohen Molekulargewichts identifiziert werden. Diese zwei Methoden, die im folgenden eingehend beschrieben werden, wurden verwendet, um die Reinigung von rgp580 sowohl aus gezüchteten MTLn3-Zellen als auch aus MTLn3-Tumoren zu überwachen.
Die Extraktion von rgp580 wird durchgeführt, indem zunächst die Zellen (0,5 · 10&sup6; Zellen pro Gefäß) in Extraktionspuffer (1 ml pro 5 Gefäße mit 4% Zwittergent 3-12, 4 M Guanidin-HCl, 0,1 M 6-Aminohexansäure, 10 mM Na&sub2; EDTA, 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM Benzamidin-HCl, 10 Millieinheiten/ml Aprotinin und 0,1 M Natriumacetat; pH 6,0) solubilisiert wurden. Die Platten wurden abgekratzt, die Extrakte wurden kombiniert, und die Solubilisierung wurde bei 4ºC 18 h unter Rühren fortgesetzt. Es ergab sich kein merklicher Anstieg in der Freisetzung von [³H]Glucosamin oder [³H]Serin-markiertem Material hohen Molekulargewichts aus den Zellen, wenn diese nacheinander mit 8% Zwittergent, gefolgt von einer Zugabe von 8 M Guanidin-HCl (GdnHCl) (beide mit Protease-Inhibitoren) extrahiert wurden. Die Extrakte, die vorzugsweise über Whatman-1-Papier filtriert wurden, wurden auf Sephadex G-50-Kolonnen aufgetragen, um gelöste Stoffe niedrigen Molekulargewichts zu entfernen, und die geleerten Volumenfraktionen wurden gepoolt.
Die gepoolten, ausgeschlossenen Fraktionen von den Sephadex G-50-Kolonnen wurden zur isopyknischen dissoziativen Dichtegradienten-Zentrifugierung vorbereitet, und zwar durch Einmischen in 0,55 g Cäsiumchlorid (CsCl) pro Gramm Lösung, und bei 9ºC 48 bis 72 h bei 35.000 rpm in entweder einem Beckman SW 50.1- oder einem TI 50.2-Rotor zentrifugiert. Die Gradienten wurden in 8 gleiche Fraktionen aufgeteilt, und die Dichte und Radioaktivität, sofern vorhanden, jeder Fraktion wurden bestimmt. Die Fraktionen wurden anschließend gepoolt, wobei man 4 gleichvolumige Fraktionen erhielt, die mit D1 bis D4 bezeichnet wurden, und jede Fraktion wurde durch Gelfiltrationschromatographie analysiert. Bestimmte radiomarkierte Anteile von gereinigtem rgp580 wurden der isopyknischen Zentrifugierung unterworfen, und zwar durch Vermischen von [¹&sup4;C]Serinmarkiertem rgp580 (1 · 10&sup4; cpm) mit 4 M GdnHCl und 4,3 M CsCl (oder 0,5 M GdnHCl und 6,5 M CsCl) in 10 mM Tris, alle bei pH 7,2. Die Proben wurden bei 4ºC 60 h bei 35.000 rpm in einem Beckman SW 50.1-Rotor zentrifugiert und anschließend in 20 gleiche Fraktionen aufgetrennt.
Bei den 4 Cäsiumchloridfraktionen mit gleichem Volumen, D1 bis D4, zeigte sich, daß die Cäsiumchloridkonzentration von 1,58 g/ml für D1 bis 1,37 g/ml für D4 abnahm. Anteile der verschiedenen Dichtefraktionen wurden dialysiert, lyophilisiert und der SDS-PAGE unterworfen, um die in jeder Fraktion enthaltenen Hauptproteine zu identifizieren. Die Glycoproteine in den Gelen können desialyliert werden, und zwar durch milde Säurebehandlung mittels der Methode von Burridge, K. (1976), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4457-4481, und die Gele wurden mit ¹²&sup5;J-markiertem PNA angefärbt. Das rgp580 wurde hauptsächlich in der D2-Fraktion gefunden (P = 1,48 ± 0,03 g/ml), wobei kleine Mengen in den D1- und D3-Fraktionen auftraten. Annähernd 50% der [³H]Glucosamin-, jedoch weniger als 8% der [³H]Serin-markierten Makromoleküle wurden in den Fraktionen D1 bis D3 gefunden.
Anteile der D1- bis D4-Fraktionen wurden auf eine kalibrierte Sepharose CL-2B-Kolonne (115 · 0,8 cm), äquilibriert mit 4 M GdnHCl in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,8, aufgetragen. Die Radioaktivität jeder Fraktion wurde bestimmt, indem 200 ul Ethanol zu 100 ul Anteilen der Fraktionen zugeführt wurden, die anschließend zu 3 ml LiquidScint (National Diagnostics, Somerville, NJ) gegeben wurden. Die Fraktionen wurden gepoolt, gründlich gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Bestimmte gepoolte Fraktionen wurden erneut in 8 M Harnstoff, 0,2% CHAPS, in 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, gelöst, und auf eine DEAE-Sephacel-Kolonne (5 · 1 cm) in dem gleichen Puffer aufgetragen. Die Kolonne wurde gewaschen und mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten von 0 bis 1 M eluiert. Nach der Vervollständigung des Gradienten wurde die Kolonne mit 8 M Harnstoff, enthaltend 3 M Natriumchlorid, gewaschen. Die Radioaktivität wurde zu mehr als 90% wiedergewonnen. Die Fraktionen wurden entsprechend ihrer Radioaktivität gepoolt, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Fraktionen wurden wie oben beschrieben analysiert. Einige Fraktionen wurden weiter an Sepharose CL-2B-Kolonnen (115 · 0,8 cm), äquilibriert und eluiert mit 1% SDS und 5 mM B-Mercaptoethanol in 10 mM Tris-HCl, fraktioniert.
Die Sepharose CL-2B-Kolonnen wurden standardisiert, und zwar unter Verwendung von Dextranen (Mr = 2 · 10&sup6;, 5 · 10&sup5;, 1,5 · 10&sup5; bzw. 7 · 10&sup4;). Für die Kohlehydratanalyse verwendete Proben wurden auf eine BioGel PG-Kolonne (115 · 0,8 cm), äquilibriert mit 50 mM Pyridiumacetat, pH 5,3, aufgetragen. Die Kolonnen wurden mit aus Fetuin hergestellten Oligosacchariden standardisiert, wie von Spiro und Bhoyroo (1974), J. Biol. Chem., 249 : 5709-5717, beschrieben.
Die Fig. 2 zeigt das Sepharose CL-2B-Elutionsprofil von radioaktiv markierten Makromolekülen, die von MTLn3-Zellen synthetisiert werden, nach einer dissoziativen CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugier,ung. Zellen, die mit ³H]Galactose, [³H]Glucosamin oder [³H]Serin markiert waren, ergaben Elutionsprofile, welche 2 radioaktive Peaks enthielten (Kav = 0,22 und 0,60). Der erste Elutionspeak enthielt 18,6% [³H]Glucosamin, 0,45% [³H]Galactose, und 0,1% [³H]Serin, das in makromolekulares Material eingebaut war. Die MTLn3-Zellen, die metabolisch mit [³H]Leucin, [³H]Mannose oder [³H]Fucose metabolisch markiert waren, ergaben ein ähnliches Profil mit 2 Peaks, die Leervolumen-Fraktionen enthielten, jedoch weniger als 0,05 bis 0,002% der eingesetzten Radioaktivität. Lediglich ein radioaktiver Peak wurde beobachtet, wenn die Zellen mit Na&sub2;³&sup5;SO&sub4; (Kav = 0,60) inkubiert wurden. Die Analyse der D2-Peaks zeigte, daß die Leervolumenfraktionen die Mehrzahl (mehr als 90%) des rgp580 enthielten, bestimmt durch ¹²&sup5;J- markierte PNA-Bindung nach der Desialylierung und SDS-PAGE.
Die Sepharose CL-2B-Leervolumenfraktionen aus den Dichtefraktionen D1 bis D3 wurden gesammelt, desialyliert und anschliessend einer Ionenaustauschchromatographie an Sephacel-DEAE- Cellulosekolonnen unter Verwendung eines NaCl-Elutionsgradienten unterworfen, wie in Fig. 3 gezeigt. Mit [³H]Glucosamin oder [³H]Galactose markierte Zellen führten zu Säulenprofilen, die 4 Peaks enthielten (Fig. 3A, Peaks I bis IV). Die mit den Peaks I bis IV assoziierte Radioaktivität entsprach 2,0%, 7,8%, 8,1% bzw. 0,9% des eingebauten [³H]Glucosamins. Demgegenüber wurden nur 3 radioaktive Peaks beobachtet, wenn MTLn3-Zellen mit [³H]Mannose oder [³H]Fucose markiert wurden (Fig. 3B; Peaks I, III und IV). Lediglich die letzteren 2 Peaks (III und IV) wurden mit [¹&sup4;C]Serin-markiertem Material gefunden (Fig. 3C).

e. Isolierung von rgp580 aus festen Tumoren.

MTLn3-Tumore, die für die Isolierung von rgp580 verwendet wurden, wurden präpariert, gewaschen und anschließend in 5 Volumina Extraktionspuffer pro g Gewebe (Naßgewicht) homogenisiert. Die Extrakte wurden bei -80ºC eingefroren und sofort nach der Filtration durch Whatman-1-Papier weiterverwendet. Das Filtrat wurde anschließend der Gelfiltration an Sephadex G-50-Kolonnen (entweder 10 · 1 cm oder 50 · 4 cm), äquilibriert mit Extraktionspuffer minus Zwittergent, unterworfen. Die Leervolumenfraktionen wurden für die weitere Analyse gepoolt.
Die Extrakte wurden der dissoziativen Dichtegradientenzentrifugierung wie oben beschrieben ausgesetzt, und die Dichtefraktionen entsprechend p = 1,48 ± 0,07 g/ml wurden gepoolt. Geeignete Anteile wurden auf eine kalibrierte Sepharose CL-2B-Kolonne aufgetragen, und die Leervolumenfraktionen wurden gepoolt. Wie zuvor bestimmt für die in-vitro gezüchteten MTLn3-Zellen war der Hauptteil eines Glycoproteins hohen Molekulargewichts, das ¹²&sup5;J-markierte PNA nach Desialylierung band und eine niedrige Migration in 7,5% SDS-PAGE Gelen aufwies, in den Sepharose CL-2B-Leervolumenfraktionen der D2-Präparationen der Dichtegradientenfraktionen zu finden. Anteile der gepoolten, dialysierten und lyophilisierten Leervolumenfraktionen wurden mit ¹²&sup5;J markiert, und zwar unter Verwendung der Chloramin-T-Methode, die von Hunter und Greenwood (1962), Nature, 194 : 495-496, beschrieben wurde, und zwar für Proteinmaterialien, oder Perjodat-[³H]-Borhydrid für Sialylsäurereste, wie von Mashborn et al. (1974), Biochem. Biophys. Acta, 362 : 366-374, beschrieben. Anteile der nicht markierten und markierten Extrakte wurden kombiniert und anschließend auf eine DEAE-Sephacel-Kolonne aufgetragen. Das ³H-markierte Material eluierte in 4 radioaktiven Peaks ähnlich dem [³H]Glucosaminmarkierten Extrakt, mit der Ausnahme, daß der zweite Peak weniger Radioaktivität enthielt. Der ¹²&sup5;J-markierte Extrakt eluierte mit einem Profil, das sehr ähnlich dem des [³H]Serin-markierten Materials war (vgl. Fig. 2 und 3A).

f. SDS-PAGE-Charakterisierung von rgp580.

SDS-PAGE wurde gemäß der Methode von Laemmli (1973), Nature, 227 : 680-685, durchgeführt, und zwar unter Verwendung eines 7,5% Acrylamid-Laufgels und eines 3% Acrylamid-Stapelgels. Für die Glycoproteinbestimmung wurden die Gele mit ²&sup5;J-markierter PNA behandelt, wie von Burridge (1976), Proc. Natl. Acad. Sci., 77 : 4457-4461, beschrieben, und anschließend zu einer milden Säurebehandlung überschichtet, um Sialylsäurereste zu entfernen, wie von Steck et al. (1983), Exp. Cell Res., 147: 255-267, beschrieben. Alternativ wurde SDS-PAGE mit dem gleichen System durchgeführt, mit der Ausnahme, daß ein 2,0 bis 17,5% lineares Acrylamid-Gradientgel unter Verwendung von DATD (Diallyltartardiamid) anstelle von BIS (Bisacrylamid) als Vernetzungsmittel und ein Stapelgel von 2% DATD-Acrylamid verwendet wurden. Das Gel wurde aus einem 37,8% Acrylamid, 1,6% DATD-Vorratslösung, konstruiert, was die Porosität des Gels steigerte und die Migration des rgp580 in die laufende Gelmatrix gestattete. Gele mit einem Gehalt an ¹²&sup5;J-markiertem Material wurden gewaschen, getrocknet und einer Autoradiographie unter Verwendung von Kodak X-Omat AR-Film mit Verstärkungsschirmen unterworfen. Für Gele mit einem Gehalt an ³H-markierten oder ¹&sup4;C-markierten Proben wurden die entfärbten Gele für die Fluorographie vorbereitet, und zwar durch Behandlung mit Enhance (New England Nuclear, Boston, MA), gefolgt von Trocknen und Belichten eines Röntgenfilms an dem Gel. Der belichtete Röntgenfilm wurden densitometrisch abgetastet, und zwar unter Verwendung eines Beckman-DU-8-Spektrophotometers mit Gelabtastzubehör. Die isoelektrische Fokussierung in einem Sucrose-Dichtegradienten wurde durchgeführt, wie von Behnta et al. (1975), Anal. Biochem., 69 : 1-9, beschrieben, mit Ausnahme eines verwendeten gleichen Gemisches (V/V) von Ampholinen (pH 2,5 bis 5,0 und 3,0 bis 10,0, Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Anteile der unterschiedlichen Elutionspeaks von DEAE Sephacel wurden auf 7,5% oder 5% Polyacrylamidgele aufgetragen, desialyliert und mit ¹²&sup5;J-markierter PNA gefärbt. Lediglich die Peaks III und IV banden ¹²&sup5;J-markiertes PNA (Fig. 4B, Bahnen C und D). Da rgp580 kaum in ein 5% Polyacrlyamidgel eindringt, wurde auf Gradientgelen eine Elektrophorese durchgeführt, und zwar unter Verwendung von DATD als Vernetzungsmittel anstelle von BIS-Acrylamid. Die Verwendung eines 2,0 bis 17,5% DATD- Acrylamidgradienten ermöglicht den Eintritt der markierten Materialien in das Gel. Die Untersuchung der vier [³H]Glucosamin-markierten Peaks von der DEAE-Sephacel-Chromatographie nach der Elektrophorese und Fluorographie zeigte, daß der Peak I lediglich Material niedrigen Molekulargewichts enthielt. Es wurde beobachtet, daß die Peaks II bis IV lediglich Material hohen Molekulargewichts enthielten, die als diffuse, jedoch homogene Banden wanderten (Molekulargewichte von etwa 350.000 bis 800.000) (Fig. 6A). Keine anderen Banden niedrigen Molekulargewichts wurden in metabolisch oder chemisch markierten Fraktionen gefunden, selbst bei Überbelichtung der Röntgenfilme, was nahelegt, daß im wesentlichen sämtliche Komponenten mit diesen Methoden ermittelt wurden.
Bei der Analyse der [³H]Serin- oder ¹²&sup5;J-markierten Peaks wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, mit der Ausnahme, daß das Material des Peaks II nicht markiert war. Die Abschätzung des durchschnittlichen Molekulargewichts von rgp580 mittels densitometrischer Analyse des Fluorogramms und Vergleich mit Standardproteinen ergab einen ungefähren Wert von 550.000 (Fig. 6B). Die Reinigung von rgp580 konnte durch SDS-PAGE demonstriert werden, und zwar unter Verwendung von [¹&sup4;C]Serin-markierten Zellysaten von MTLn3-Zellen als Ausgangsmaterial. Nach der Reinigung erwies sich rgp580 als homogen in der SDS-PAGE-Analyse, und es enthielt etwa 0,08% des gesamten [14C]Serins, eingebaut in mit Säure ausfällbarer Radioaktivität.
Zur Bestimmung der Zusammensetzung der verschiedenen DEAE- Sephacel-Peaks wurden Anteile mit verschiedenen abbauenden Enzymen inkubiert, und diese wurden anschließend mittels SDS-PAGE analysiert. Wir haben gefunden, daß das [³H]Glucosamin-markierte Material im Peak II unempfindlich gegenüber Pronase und Trypsin zu sein scheint, daß es jedoch durch Streptomyces-Hyaluronidase (Tabelle I) abgebaut werden kann, was nahelegt, daß diene Komponente Hyaluronsäure ist. Komponenten von den Peaks III und IV wiesen identische Empfindlichkeiten gegenüber verschiedenen Enzymen auf und wurden lediglich durch Pronase abgebaut (Tabelle I). Weiterhin banden Materialien in den Peaks III und IV ¹²&sup5;J-markiertes PNA an Komponenten hohen Molekulargewichts nach milder Säurebehandlung, was nahelegt, daß diese Peaks rgp580 enthalten. Die Analyse der DEAE-Sephacel-Fraktionen aus chemisch markiertem MTLn3-Tumorgewebe zeigte ähnliche Eigenschaften. Tabelle I Analyse von DEAE-Sephacel-Fraktionen durch SDS-PAGE Behandlung a Peak Molekulargewicht PNA-Bindung empfindlich gegen: Trypsin Pronase Hyaluronidase a Das Molekulargewicht ist die relative Migration von [³H]Glucosamin oder Perjodat-[³H] Borhydrat-markierten Fraktionen auf Gradient-DATD-vernetzten Polyacrylamidgelen in SDS.

g. Chemische Charakterisierung von rgp580.

Enzymatische Behandlungen. Die Empfindlichkeit von rgp580 gegenüber verschiedenen abbauenden Enzymen wurde durch Inkubation von 1 h bei 37ºC mit [³H]Glucosamin-, [³H]Serin- oder chemisch markiertem rgp580 in 100 ml Dulbecco's PBS, enthaltend gereinigtes Trypsin, Pronase, Papain, alpha-Chymotrypsin, Subtilopeptidase A (1 oder 10 mg/ml), Collagenase Typ VI (1000 Einheiten/ml), Chondroitinase ABC (1 Einheit/ml), Streptomyces-Hyaluronidase (100 trübungsverringernde Einheiten pro ml), Vibrio cholerae-Neuraminidase (100 m Einheiten/ml) oder beta-Galactosidase (1000 Einheiten/ml) bestimmt. Die Proben und unbehandelte Vergleichsproben wurden durch SDS-PAGE auf einem 2,0 bis 17,5% DATD-Acrylamid-Gradientengel analysiert, gefolgt von einer densitometrischen Quantifizierung des belichteten Fluorogramms.

Kernprotein-Bestimmung.

Unmarkiertes rgp580 oder metabolisch mit [¹&sup4;C]Serin markiertes rgp580 wurde zu 100 mg Rinderserum- Albumin als Trägerprotein gegeben; das Gemisch wurde mit Trifluormethylsulfonsäure in Anisol (2 : 1 w/w) in einem stickstoffgespülten Reaktionsgefäß für 10 oder 30 min bei 4ºC behandelt, wie von Edge et al. (1981), Anal. Biochem., 118: 131-137, beschrieben. Die Proben wurden mit Diethylether extrahiert, dialysiert und lyophilisiert. Das unmarkierte, behandelte Material wurde chemisch mit ¹²&sup5;J markiert, und zwar unter Verwendung der Chlbramin-T-Methode. Proben wurden mit SDS-PAGE analysiert, und zwar unter Verwendung von 2,0 bis 17,5% DATD-Acrylamid-Gelen.

Aminosäureanalyse.

Proben von rgp580 wurden in säuregewaschenen Röhrchen lyophilisiert und mit 6 N oder 4 N HCl 4, 10 oder 24 h bei 110ºC hydrolysiert. Die Analyse wurde unter Verwendung eines LKB-Modell 401-Aminosäureanalysators durchgeführt, und zwar mit Norleucin als zugesetztem internen Standard.

Alkalische Borhydrid-Behandlung.

Lyophilisierte Proben von isoliertem rgp580 mit radioaktiv markiertem Kohlehydrat wurden mit 50 mM NaOH, 1,0 M NaBH&sub4; bei 45ºC für 24 h behandelt. Die Proben wurden mit Essigsäure neutralisiert, über eine Dowex 50 (H&supmin;)-Kolonne geleitet und mit destilliertem Wasser eluiert; die Fraktionen wurden wiederholt in Anwesenheit von Methanol getrocknet. Die Oligosaccharitol-Proben wurden erneut in 5 mM Tris-HCl (pH 7,5) gelöst und auf eine QAE-Sephadex (5 · 1 cm)-Kolonne in dem gleichen Puffer aufgetragen. Die Kolonne wurde mit 25 ml 5 mM Tris-HCl gewaschen, gefolgt von einer linearen Gradientenelution auf 120 ml von 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5). Die radioaktiven Peaks wurden gepoolt und anschließend auf eine BioGel P6-Kolonne aufgetragen, wie von Carlson (1968), J. Biol. Chem., 243 : 616-622, beschrieben.
Chemische Zusammensetzung von rgp580. Die Aminosäurezusammensetzung von gereinigtem rgp580 ist in Tabelle II gezeigt. Wie der Fachmann erkennen wird, liegen die in Tabelle II gezeigten Werte, die für gp580 erhalten wurden, isoliert aus kultivierten MTLn3-Zellen und einem MTLn3-Tumor, innerhalb des experimentellen Fehlers. Ein experimenteller Fehler von etwa ±10% ist bei derartigen Aminosäureanalysen zu erwarten. Die in Tabelle II gezeigten Werte sind die Durchschnitte von 4 verschiedenen Experimenten. Glutamat, Aspartat und Serin waren die vorhandenen Hauptaminosäuren, wobei Threonin, Glycin und Lysin ebenfalls in erheblichen Mengen vorhanden waren. Diese Aminosäuren bildeten mehr als die Hälfte der Gesamtzusammensetzung von rgp580. Die Aminozucker, Glucosamin und Galactosamin, bildeten etwa 20% der Zusammensetzung von rgp580 (Tabelle II). Tabelle II Aminosäureanalyse von rgp580, synthetisiert durch Mamma- Adenokarzinomzellen von Ratten Aminosäure gezüchtete MTLn3-Zellen Reste/1000 Aminosäuren MTLn3-Tumor Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Leucin Isoleucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Arginin Glucosamin Galactosamin
Die Werte geben die Durchschnittswerte von doppelten Analysen von rgp580, gereinigt aus gezüchteten MTLn3-Zellen und Tumorgeweben, wieder. Die Kohlehydratewerte wurden durch Extrapolation der Werte bestimmt, und zwar zu unterschiedlichen Dialysezeiten, bezogen auf die Zeit Null der Hydrolyse. Tryptophan wurde nicht gefunden.
Das rgp580 wurde mit Trifluormethylsulfonsäure deglycosyliert, um den Proteinkern darzustellen. [¹&sup4;C]Serin-markiertes rgp580 wurde mit Säure behandelt und anschließend mit SDS-PAGE analysiert. Der Proteinkern wanderte als einzelne Bande mit einem geschätzten Molekulargewicht von 150 Kilodalton. Keine andere markierte Bande wurde gefunden. Der Proteinkern des rgp580, isoliert aus Tumorgewebe und anschließend radioaktiv markiert mit ¹²&sup5;J, war von identischer Größe, ermittelt durch SDS-PAGE.
Anteile von gereinigtem, [¹&sup4;C]Serin-markiertem rgp580 wurden einer isopyknischen Zentrifugierung unterworfen, um seine scheinbare Dichte zu bestimmen. Die Zentrifugierung in Gegenwart von 4 M GdnHCl ergab eine Dichte von etwa 1,432 g/ml (> 90% zwischen 1,475 bis 1,398 g/ml). In Gegenwart einer assoziativen Konzentration von GdnHCl (0,5 M) betrug die scheinbare Dichte jedoch 1,615 g/ml (> 90% zwischen 1,671 bis 1,563 g/ml). Diese Zunahme der scheinbaren Dichte unter schwächeren Denaturierungsbedingungen wurde auch bei Hyaluronsäure und anderen stark sauren Molekülen beobachtet. Die saure Natur von rgp580 wurde durch seinen hohen Gehalt an anionischen Aminosäuren und großen Mengen an Sialinsäure bestätigt. Eine Abschätzung des Gehaltes an Sialinsäure in rgp580 wurde durch Behandlung von [³H]Glucosamin-markiertem rgp580 mit milder Säure (50 mM H&sub2;SO&sub4;, 1 h, 80ºC) erhalten, gefolgt von einer Chromatographie an einer BioGel P4-Kolonne. Annähernd 25,5% der in rgp580 eingebauten Radioaktivität wurden durch diese Behandlung freigesetzt, was nahelegt, daß Sialinsäure eine Hauptkomponente von rgp580 ist. Weiterhin wanderte rgp580 als eine diffuse Bande auf der Sucrose-Dichtegradient-isoelektrischen Fokussierung mit einem isoelektrischen Punkt von 3,2 ± 0,5, was seine saure Zusammensetzung bestätigt.
Die Daten legen nahe, daß rgp580 Sialomucin-artige Eigenschaften aufweist, und diese Erkenntnis wurde durch Inkubation von [³H]Serin-markiertem rgp580 mit verschiedenen abbauenden Enzymen bestätigt. Die Empfindlichkeit wurde beurteilt, indem das behandelte rgp580 der SDS-PAGE und einer densitometrischen Analyse der sich ergebenden Banden unterworfen wurde. Das gereinigte rgp580 war stabil gegenüber einer Anzahl von Proteasen, Chondroitinase ABC und Hyaluronidase (Tabelle III). Ein Verdau wurde lediglich mit Pronase, Subtilopeptidase A und einer Kombination von Neuraminidase und B-Galactosidase beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn ¹²&sup5;J-markiertes MTLn3-Tumor-rgp580 den abbauenden Enzymen unterworfen wurde. Diese Daten legen nahe, daß rgp580 ein Sialomucin ist, und daß es daher eine Anzahl von O-vernetzten Oligosacchariden aufweisen sollte. Tabelle III Empfindlichkeit von rgp580 gegenüber abbauenden Enzymen Enzym mg/ml oder Einheiten relative Dichte (Fläche) b Vergleich Tryosin Pronase Subtilopeptidase A Papain Pepsin a-Chymotripsinogen Colagenase Chondroitinase ABC Hyaluronidase Neuraminidase B-Galactosidase Neuraminidase + B-Galactosidase a Nach der Inkubation mit den Enzymen wurden die verschiedenen Proben der PAGE unterworfen, und zwar auf 2 bis 17 DATD-vernetzten Gelen und Fluorographie. b Die relative Dichte wurde bezüglich der Fläche unter den densitometrischen Messungen der Fluorogramme von den SDS-PAGE-Gelen normalisiert, und zwar unter Verwendung der unbehandelten Spur als 1. Die Flächen wurden auf einem Beckman DU-8-Spektrophotometer bestimmt, und zwar unter Verwendung des Programms des niedrigsten Tals. c nicht ermittelt.

Borhydridfreisetzung von rgp580-Oligosacchariden.

Eine Anzahl von Oligosacchariden wurde durch alkalische Borhydrid-Behandlung von rgp580, welches radioaktiv mit [³H]Glucosamin, [³H]Galactose und [³H]Fucose markiert war, freigesetzt. [³H]Glucosaminm-markierte Oligosaccharide wurden auf eine QAE-Sephadex-Kolonne aufgetragen und in neutrale (durchgehende Fraktionen mit 22,5% der gesamten Radioaktivität) und saure (zurückgehaltene Fraktionen, 76,3% der Radioaktivität) Komponenten aufgetrennt. Die sauren Fraktionen wurden unter Bedingungen eluiert, bei denen mono- und di-sialylierte Oligosaccharitole erhalten werden (10 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7,5). Eine weitere Fraktionierung wurde durch Gelfiltrations-Chromatographie auf BioGel P6-Kolonnen durchgeführt. Verschiedene, relativ große radioaktive Peaks wurden für die sauren Oligosaccharitole beobachtet. Die Mehrzahl der neutralen Oligosaccharide erwiesen sich als mit einem radioaktiven Peak assoziiert. Von rgp580 freigesetzte Oligosaccharide, welches aus Tumorgewebe isoliert und dessen Sialinsäurereste chemisch markiert worden waren, zeigten ein ähnliches Profil.

Beispiel II: Entwicklung und Charakterisierung eines gegen rgp580 gestellten monoklonalen Antikörpers.

Es wurde ein Rattenhybridom erzeugt, das monoklonale Antikörper (GP21 : 56) mit einer Spezifizität gegenüber rgp580-Antigenen erzeugt, welche in großen Mengen auf hoch metastatischen 13762NF Mamma-Adenokarzinomzellen von Ratten vorliegen. Das Hybridom wurde durch Fusion von Ratten-Y3-Ag1.2.3-Myelomzellen mit Milzzellen von einer mit gereinigtem rgp580 i.d.-immusierten Ratte hergestellt. Das rgp580 schien von einer niedrigen Immunogenizität bei syngenen F344-Ratten zu sein, da eine Gesamtzahl von 27 Fusionen erforderlich war, um ein Hybridom mit einer Spezifizität gegenüber diesem Glycoprotein zu erzeugen. In einem Versuch zur Vergrößerung der Häufigkeit von Hybridomen, die Antikörper mit einer Spezifizität gegenüber rgp580 ausscheiden, wurde eine Anzahl von verschiedenen Immunisierungsprotokollen verwendet, wie i.d.- und i.p.-Wege der Verabreichung des Antigens, die in vitro-Immunisierung und die Verwendung von sowohl Milz- als auch Lymphknoten als Quellen für B-Zellblasten.
Enzymverknüpfte Immunoabsorptionsassays (ELISA) und direkte Bindungsassays zeigten, daß erfindungsgemäß hergestellte Hybridome monoklonale Antikörper erzeugen, die spezifisch an geklonte Zielzellinien des 13762NF-Rattenkarzinoms in Abhängigkeit von deren spontanen metastatischen Potentialen binden. Die dreifache Zahl von GP21 : 56-Antikörpermolekülen band an hochmetastatische MTLn3-Zellen als an metastatische MTC-Zellen, GP21 : 56 zeigte jedoch nur eine geringe oder gar keine Aktivität mit anderen Zellinien aus Menschen oder Nagetieren. Direkte Antikörper-Bindungsassays unter Verwendung von gereinigtem rgp580, gebunden an Miktrotiterplatten, und Immunoblotting unter Verwendung von Lysaten von verschiedenen 13762NF-Zellsubklonen bestätigten, daß GP21 : 56 spezifisch an rgp580 bindet.
Kinetische Untersuchungen zeigten, daß GP21 : 56 keine hohe Affinität für rgp580 hat, daß es jedoch eine hohe Avidität gegenüber diesem Glycoprotein aufweist. Einmal an MTLn3-Zellen in vitro gebunden, werden GP21 : 56-Moleküle mit einer Halbwertszeit von 24 h entfernt. Lokalisationsstudien unter Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitten von 13762NF-Tumoren zeigten, daß GP21 : 56 mit in vivo gezüchteten Tumorzellen in einer analogen Weise zu in vitro gezüchteten Zellen reagiert. Mehr als 50% der hoch metastatischen MTLn3-Tumorzellen waren unter Verwendung von Immunoperoxidase-Techniken positiv, wobei etwa 20% der intermediären metastatischen MTF7- und MTLn2-Zellen und weniger als 10% der niedrig metastatischen MTC- und MTPa-Zellen positiv für rgp580 waren. Die Expression von rgp580 war unter den Zellen heterogen und hauptsächlich mit der Tumorzelloberfläche assoziiert.

a. Materialien und Methoden

Die folgenden Materialien und Methoden geben Arbeitsweisen wieder, bei denen die Erfinder gefunden haben, daß sie bei der Herstellung von gegen rgp580 gerichteten monoklonalen Antikörpern geeignet sind. Obwohl die folgenden Ausführungsformen Rattenmilz/Rattenmyelom-Hybride für die Hybridomproduktion verwenden, haben die Erfinder festgestellt, daß andere Hybridommethoden wie diejenigen, die Maus/Maus-Hybride verwenden, ebenso gut funktionieren.

Tiere.

Acht Wochen alte Fischer (F344/CDL)-Inzuchtratten (RT1¹) wurden von den Charles River Breeding Laboratories bezogen. Die Tiere wurden 7 Tage unter Quarantäne genommen, bevor sie eingesetzt wurden, und sie wurden mit üblichem Nagetierfutter und unchloriertem Quellwasser ad libitum gefüttert. Sie wurden unter den Richtlinien gehalten, wie sie von dem University of Texas System Cancer Center und dem Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, festgelegt wurden.

Zellen und Zellinien.

Die Rattenmyelom-Y3 Ag1.2.3 (RT1v)-Zellinie wurde von C. Milstein, MRC Laboratories, Cambridge, England, bezogen und in einer Spinnerkultur in Antibiotika-freiem DMEM und 20 mM Hepes in hoher Glucose plus 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) gehalten.
Klonierte Sublinien des 13762NF-Ratten-Mamma-Adenokarzinoms (MTLn3, MTLn2, MTF7, MTC) und unklonierte Elterlinien MTLY (von einer Lymphknotenmetastase) und MTPa (von dem Ursprungstumor) wurden erhalten und gezüchtet, wie von Neri et al. (1982), J. Natl. Cancer Inst., 68 : 507, beschrieben. Sämtliche Zellinien und Klone wurden routinemäßig gescreent und erwiesen sich als frei von Mycoplasma und Nagetiervirus-Kontaminationen. Die Zellinien MTLn3, MTF7, MTC, MTLY und MTPa wurden zwischen den in vitro-Passagen 10-18 verwendet und die MTLn2-Zellen bei den Passagen 38-40.
Zusätzliche Zellinien wurden aus Tumorexplantaten von Ratten- Mamma-Adenokarzinomen R32-30Ac (RT1¹) CSE und MNU-F344 (Mason Research Institute, Worcester, MA) hergestellt. Tumorstücke wurden subkutan in den sYngenen Wirt implantiert und zweimal in vivo vor der Entferriung der Tumore passagiert. Die Tumorexplantate wurden enzymatisch 1 h bei Umgebungstemperatur mit 0,25% Trypsin (GIBCO, Grand Island, NY) und 1% Collagenase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) behandelt, um die Zellinien darzustellen. Kurzzeit-Kulturen von Fibroblasten normaler, erwachsener Ratten wurden aus den Xiphisternae von 8 Wochen alten F344 Ratten unter Verwendung des gleichen enzymatischen Verfahrens hergestellt. Fötale Lungenfibroblasten wurden aus 14-16 Tage alten F344 Rattenföten ohne enzymatische Behandlung isoliert. Die Lungen wurden zerkleinert und in Kultur gesetzt, um das Auswachsen der Fibroblasten zu ermöglichen. Die Zellinien wurden bei niedrigen Passagen gehalten (weniger als Passage 7), und zwar in AMEM plus 10% FBS; wenn nichts anderes angegeben ist, wurden sie routinemäßig auf 100 mm Gewebekulturplatten (Corning Glass, Corning, NY) kultiviert.
Die Melanom-Zellinien SK-MEL-19, SK-MEL-75, DX1 und HS929 wurden von J. Fogh (Memorial Sloane-Kettering Center, New York, NY) erhalten. Die Zellinien MDA286 und MDA436 stammten von R. Cailleau (U.T. M.D. Anderson Hospital und Tumor Institute at Houston, Houston, TX). Maus-Mamma-Tumorzellen 66, 67, 168.1 und 4526 wurden von G. Heppner (Michigan Cancer Foundation, Detroit, MI) erhalten.

Immunisierungsprotokolle.

(i) In vivo:

Acht Wochen alte F344-Ratten wurden i.d. mit einer 1 : 1 (v/v)-Emulsion, enthaltend die obige D2-Fraktion, und Freund's vollständigem Adjuvans immunisiert. Jede Ratte erhielt eine Gesamtheit von 0,4 ml an 4 i.d. Orten (0,1 ml/Ort). Die Immunisierungen wurden zweimal pro Woche durch Injektion von 0,1 ml Antigen in Freund's unvollständigem Adjuvans in jegliche, entstehende Granulome wiederholt. Eine Schluß-i.d.-Immunisierung erfolgte 4 bis 5 Tage vor Entfernung der Milz oder der zervikalen Lymphknoten für die Fusion. Alternativ wurden die Ratten durch i.p.-Injektion des Antigens entsprechend ähnlicher Verfahren immunisiert.

(ii) In vitro:

Das verwendete Verfahren war eine Modifikation des ursprünglich von Luben und Mohler (1980), Mol. Immunol., 17 : 935, beschriebenen. Thymozyten-konditioniertes Medium wurde durch Kultivierung von 10 Tage alten Rattenthymozyten für 48 h in DMEM plus 2% Kaninchenserum (Quadroma, Inc., Escondido, CA) erhalten, und zwar bei einer Konzentration von 2 · 10&sup6; Zellen/ml. Nach dem Zentrifugieren wurde das konditionierte Medium bei -70ºC gelagert. Für die Immunisierung wurde eine Einzelzellsuspension aus der Milz einer unbehandelten F344-Ratte hergestellt. Die Splenozyten wurden 5 Tage mit 10 ml Thymozyten-konditioniertem Medium und Antigen in DMEM mit 2% Kaninchenserum inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die erhaltenen Blastzellen mit Y3 Ag1.2.3-Myelomzellen unter Verwendung üblicher Verfahren fusioniert.

Hybridomproduktion.

Milz- oder Lymphknotenzellen wurden durch Passage durch ein feinmaschiges Netz in 5 ml Medium hergestellt. Die Zellen wurden zweimal in serumfreiem Medium gewaschen, und die Zellebensfähigkeit wurde durch Trypanblau- Exklusion bestimmt. Milzzellen (2 · 10&sup8;) wurden mit 10&sup8; Y3 Ag1.2.3-Zellen vermischt, und das Zellgemisch wurde durch Zentrifugieren bei 500 · g 5 Minuten pelletisiert. Das Pellet wurde vorsichtig durch Zugabe von 2 ml 50% Polyethylenglykol 1450 (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) in DMEM, eingestellt auf pH 7,2, während 1 Minute resuspendiert. Das Fusionsgemisch wurde eine weitere Minute geschüttelt, mit 8 ml DMEM verdünnt und 5 min bei 500 · g zentrifugiert. Die Zellen wurden in 200 ml DMEM, enthaltend 20% FBS, 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin (Sigma, St. Louis, MO), 4 · 10&supmin;&sup7; MAminopterin (Sigma) und 1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin (HAT-Medium, Sigma) resuspendiert. Anteile (1 ml) wurden in Costar-24 Vertiefungen-Platten verteilt (Costar, Cambridge, MA), die 24 h zuvor mit 2 · 10&sup4; bestrahlten (30 Gy, Gamma-Bestrahlung) Rattenfibroblasten/Vertiefung besät worden waren. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37ºC unter Standard-Kulturbedingungen wurde das HAT-Medium (1 ml) zugesetzt. Die Zellfusionen wurden 7-14 Tage inkubiert, bevor das Screenen bezüglich der Anwesenheit von Hybriden erfolgte.

Screenen auf spezifische Antikörper.

Hybridomkulturen wurden für die Bildung von spezifischen Antikörpern getestet, und zwar unter Verwendung eines ELISA. Monoschichten von Zielzellen wurden bis zur Konfluenz in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet, mit 0,5% Glutaraldehyd fixiert und bei -20ºC in PBS, enthaltend 1,0% Rinderserumalbumin (BSA), gelagert. Proben der Überstände der Hybridomkulturen (50 ul/Vertiefung) wurden mit den Zielzellen 1 h bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Zielzellen wurden dreimal mit PBS plus 0,05% BSA gewaschen. Biotinyliertes Ziegen/Ratten-IgG (Vector Labs., Burlingame, CA), verdünnt 1/1000 in PBS, enthaltend 1% BSA, wurde zugesetzt (50 ul/Vertiefung) und mit den Zellen 1 h bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Streptavidin-Verbrückungsreagens (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) (50 ul/Vertiefung), verdünnt 1/1000 in PBS plus 1% BSA, und die Inkubation erfolgte für zusätzliche 45 min bei Umgebungstemperatur.
Die Platten wurden sechsmal mit PBS plus 0,05% BSA gewaschen. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von o-Phenylendiamin (1 mg/ml)-Reagens (100 ul/Vertiefung) quantifiziert, welches in 0,1 M Zitratpuffer, pH 4,5 und 0,012% Wasserstoffperoxid gelöst wurde. Nach 15 min Inkubieren im Dunklen wurde die Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines Titertek Multiscanners bestimmt (Flow Laboratories, McLean, VA). In sämtlichen Tests wurde ein Y3 Ag1.2.3-Kulturüberstand als negativer Vergleich verwendet. Die Überstände wurden als positiv bezüglich gp580-spezifischen monoklonalen Antikörpern (MAb) angesehen, wenn sie eine Absorption aufwiesen, die gleich oder größer als zwei Standardabweichungen oberhalb des Hintergrundes waren. Hybridome von positiven Vertiefungen wurden zweimal durch begrenzende Verdünnung kloniert, und zwar unter Verwendung von bestrahlten Rattenfibroblasten als Zufuhrzellen.
Andere MAb-Bindungsassays verwendeten ¹²&sup5;J-markierte, affinitätsgereinigte Antikörper gegen Ratten-F(ab')&sub2; (Dr. C.J. Dean, Chester Beatty Research Institute, Sutton, Surrey, England). Proben von Kulturüberständen oder gereinigtem MAb wurden 1 h bei 4ºC mit konfluenten Monoschichten von lebensfähigen Zellen oder bei Umgebungstemperatur mit fixierten Zellen, gezüchtet in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen, inkubiert. Gebundenes MAb wurde durch Inkubation in 5 · 10&sup5; cpm/Vertiefung von ¹²&sup5;J-markiertem Schaf/Ratten-F(ab')&sub2; bestimmt, und zwar 1 h bei 4ºC (lebensfähige Zellen) oder bei Umgebungstemperatur (fixierte Zellen). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 200 ul 2 N NaOH lysiert. Die Radioaktivität wurde durch Zählen in einem Beckman Model 8000-Gammazähler bestimmt.

Geschwindigkeiten der MAb-Clearance durch MTLn3-Zellen in vitro.

Exponentiell wachsende Klone von MTLn3-Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen wurden einmal in AMEM, enthaltend 5% PBS, gewaschen und auf Eis 1 h mit 50 ul/Vertiefung Kulturüberstand (10 ug/ml Antikörper) inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit AMEM gewaschen, und jede Platte wurde in 4 Abschnitte unterteilt. Um die Menge von anfänglich gebundenem MAb zu bestimmen, wurde eine Sektion mit 30 ul ¹²&sup5;J-markiertem Schaf/Ratten-F(ab')&sub2; 1 h bei 4ºC inkubiert. Die verbleibenden Sektionen wurden 37ºC in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO&sub2; für 0 bis 32 h inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurde ein Abschnitt wie oben beschrieben weiterverarbeitet. Nach gründlichem Waschen wurden die Zellen lysiert, und die Radioaktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Platten für die Bindung von MAb GP21 : 56 an rgp580.

Gereinigtes rgp580 wurde über Nacht auf Immunotech 1-Platten immunisiert (A/S Nunc, Kamstrap, Dänemark), und zwar mittels des folgenden Verfahrens. Eine Lösung von rgp580 (1 ug/ml) wurde zunächst beschallt und Anteile wurden auf Mikrotestplatten pipettiert (50 ul/Vertiefung). Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und anschließend mit PBS plus 1% BSA 1 h bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Platten wurden bei -20ºC in PBS plus 1% BSA gelagert.

Kinetische Untersuchung.

Klonierte MTLn3-Zellen wurden einmal mit PBS plus 1% BSA gewaschen und mit ¹²&sup5;J-markiertem GP21 : 56 (1 Ci/mg) bei 4ºC inkubiert. Für die Bestimmung der Sättigungsbindung wurden MTLn3-Zellen (8 · 10&sup4;) mit ¹²&sup5;J-markiertem GP21 : 56 (4,2 · 10&sup4; CPM) inkubiert, und Anteile wurden in regelmäßigen Abständen von bis zu 1-½ h entnommen. Die Anteile wurden dreimal mit PBS/BSA-Puffer gewaschen, und die Radioaktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die nicht-spezifische Bindung wurde abgeschätzt, indem die gebundene Radioaktivität gemessen wurde, wenn die Proben in Gegenwart eines 1000-fachen Überschusses an unmarkiertem Antikörper inkubiert wurden. Die Dissoziationsgeschwindigkeit wurde durch Inkubieren von MTLn3-Zellen für 1 h mit ¹²&sup5;J-markiertem GP21 : 56 wie oben bestimmt; anschließend wurde ein 1000-facher Überschuß an kaltem Antikörper zugesetzt, und Anteile wurden über einen Zeitraum von 1-½ h entfernt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS/BSA-Puffer gewaschen, und die zellassoziierte Radioaktivität wurde gemäß der üblichen Verfahren bestimmt.

Reinigung von MAb.

MAbs wurden aus Kulturüberständen durch Affinitätschromatographie nach der Konzentration durch Ammoniumsulfat-Ausfällung (40% Sättigung) isoliert. Die Immunosorptionskolonne wurde hergestellt, indem ein Antiratten-K- Ketten-MAb (Mark 1; H. Bazin, Brüssel, Belgien) an AffiGel 10 (10 mg Protein/ml Perlen) gegründet wurde. Die Elution von MAb GP21 : 56 aus der Immunosorptionskolonne wurde mit 3 M Kaliumthiocyanat vorgenommen, und Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt und augenblicklich mit 0,1 Hepespuffer, pH 8,0, neutralisiert. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford- Assays, wie in Bradford (1976), Anal. Biochem., 72 : 248 beschrieben, bestimmt, und die Reinheit des MAb wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) bestimmt. Ein Antikörper-Isotyp wurde durch doppelte Diffusionsanalyse in Weichagar identifiziert, und zwar unter Verwendung von Antisera gegen Ratten IgG&sub1;, IgG2a, IgG2b, IgG2c und IgM (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL). Gereinigte Antikörper wurden mit ¹²&sup5;J-markiert (ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA), und zwar bis zu einer spezifischen Aktivität von 2 Ci/mg mittels des Chloramin-T-Verfahrens.

Immunoperoxidase-Verfahren.

Gewebeproben von 13762NF-Adenokarzinom-Subklonen wurden aus subkutan (s.c.) gezüchteten Tumoren in den Mamma-Fettpolstern von F344-Ratten 23 Tage nach der Injektion von 10&sup6; Tumorzellen/Ratte erhalten. Die Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei -20ºC bis zum Verbrauch gelagert. Kryostatschnitte (4 um dick) wurden für die Immunoperoxidase-Anfärbung verwendet. In dem Verfahren wurde der Vectastain-ABC-anti-Ratten-IgG-Kit verwendet (Vector Laboratories, San Francisco, CA), und zwar mit Diaminobenzidin (DAB) (1 mg/ml in Tris-HCl, pH 7,2) als Substrat. Schnitte wurden mit Meyer's Hämatoxylin gegengefärbt und in einem Leitz-Fotomikroskop untersucht.

Immunoblotting.

Westernblot wurden im wesentlichen wie von Towbin et al. (1979), P.N.A.S., 76 : 4350 beschrieben durchgeführt. Die Proteine wurden elektrophoretisch über Nacht von 2-17,5% DATD vernetzten, denaturierenden Polyacrylamid-Gradientgelen auf Nitrocellulosepapier bei 50 Volt und 0,29 Ampere transferiert. Antigene wurden durch Inkubierung des Blots mit ¹²&sup5;J-markiertem Antikörper für 3 h und eine anschließend durchgeführte Autoradiographie unter Verwendung von Kodak X-OMAT AR-Film bestimmt.

b. Bildung und Spezifizität von MAb GP21 : 56

Eine Anzahl von verschiedenen in vivo- und in vitro- Immunisationsverfahren wurde verwendet, um MAbs gegen rgp580 zu bilden (siehe Tabelle IV). Unbehandelte Ratten wurden entweder intradermal (i.d.) oder intraperitoneal (i.p.) mit rgp580 geimpft, und sowohl die Milz- als auch die zervikalen Lymphknoten wurden als Quelle für B-Blastzellen für die Fusion mit den Y3 Ag1.2.3-Myelomzellen verwendet. Zusätzlich wurden in vitro-Immunisationsverfahren verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Hybridoma mit der gewünschten Spezifizität zu vergrößern. Von einer Gesamtzahl von 27 Fusionen unter Verwendung dieser Immunisationstechniken lieferte lediglich eine MAb (bezeichnet GP21 : 56), die eine spezifische ELISA-Reaktivität mit MTLn3-Zellen in dem primären Screening- Assay zeigte. Die Häufigkeit der pro Fusion gebildeten Hybride war gering. Im Durchschnitt waren lediglich 20 bis 25% der Vertiefungen wachstumspositiv, obwohl dies teilweise von dem Immunisierungsprotokoll und der Quelle der B-Blastzellen abhing. Bei einigen Fusionen ließen sich weniger oder gar keine Hybride feststellen. Tabelle IV Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen gp580 Immunogen Immunisierungsprotokoll B Zellenquuelle Zahl d. Fusionen Gesamtzahl der Vertiefungen mit Hybriden/Gesamtzahl der Vertiefungen (%) Zahl AB-reaktiver Klone Milz 1. Knoten Zellen d keines e
Abkürzungen: NA: nicht anwendbar.
a Zweimal pro Woche mit gp580 geimpfte Tiere, geprimed mit Antigen, emulgiert in vollständigem Freund's Adjuvans, und erneut geimpft mit Antigen, emulgiert in unvollständigem Freund's Adjuvans (1 : 1).
b In vitro-Immunisierung, wo die Milz aus einem unbehandelten Tier entfernt war und in vitro mit gp580 stimuliert wurde.
c In vitro-Immunisierung, wo das Tier einmal in vivo geimpft und anschließend die Milz entfernt sowie in vitro geimpft wurde.
d MTln3-Zellen, s.c. injiziert, und die Milz nach 21 Tagen Tumorwachstum entfernt.
e Milz einer unbehandelten Ratte entnommen.
Die Häufigkeit von gebildeten Hybriden mit einer Spezifizität gegen rgp580 war deutlich niedriger im Vergleich zu der bei anderen Antigenen. Als ein Vergleich wurde die Milz von einer unbehandelten Ratte verwendet, und es wurde gefunden, daß die Anzahl von Vertiefungen mit Hybridomwachstum gewöhnlich in der Größenordnung von 16 bis 20% lag, wobei jedoch andere Antigene als rgp580 bis zu 100% für Hybridwachstum positive Vertiefungen lieferten. Die niedrige Häufigkeit von gegen rgp580 gebildeten Hybriden legt nahe, daß dieses Antigen in dem syngenen Wirt von niedriger Immunogenizität ist. Wegen begrenzter Mengen an rpg580 wurden die Hybride ursprünglich auf der Basis ihrer Reaktivität mit MTLn3-Zellen selektiert. Unter diesen Bedingungen war nur MAb GP21 : 56 reaktiv.

Bindung von MAb GP21 : 56 an gereinigtes rgp580.

Der ELISA, beschrieben in dem vorherigen Abschnitt, legt nahe, daß das MAb GP21 : 56 ein auf rgp580 vorhandenes Epitop erkennt. Um dies zu bestätigen, wurde die Fähigkeit von MAb GP21 : 56 zur Erkennung von gereinigtem rgp580 bestimmt, und zwar in einem Festphasen-Antikörperbindungsassay unter Verwendung von immobilisiertem rgp580 als Antigen. Die Bindung von affinitätsgereinigtem MAb GP21 : 56 (100 ug/ml) wurde in dreifachen Proben bestimmt. Das MAb GP21 : 56 band spezifisch an rgp580, während MAbs mit einer Spezifizität für andere Zelloberflächen-Antigene, exprimiert auf dem 13762NF-Adenokarzinom, nicht mit rgp580 banden.

Bindung von MAb GP21 : 56 an nicht klonierte und klonierte 13762NF-Zellinien.

Der vorige Assay zeigte, daß MAb GP21 : 56 mit gereinigtem rgp580 reagiert. Unter Verwendung verschiedener Sublinien des 13762NF-Mamma-Adenokarzinoms wurden quantitative Daten für die Reaktivität von MAb GP21 : 56 mit diesen klonierten Zellinien erhalten. Ein direkter Bindungsassay an Glutaraldehyd-fixierten MTLn3-, MTF7-, MTC- und MTPa-Zellen wurde verwendet, und gebundenes MAb wurde unter Verwendung von ¹²&sup5;J-markiertem Schaf/Ratten-F (ab')&sub2; bestimmt. Es kann aus Fig. 5 entnommen werden, daß bei hohen MAb-Konzentrationen das Bindungsprofil von MAb GP21 : 56 an die 13762NF-Zellen von dem metastatischen Potential und den zellulären Mengen an rgp580 auf diesen Zellklonen abhängt. Die Ergebnisse zeigen, daß die dreifache Menge an MAb GP21 : 56, gebunden an MTLn3, als an MTF7- oder MTC'-Zellen vorhanden war, und daß eine geringe Bindung an Elter-MTPa-Zellen vorhanden war. Eine alternative Erklärung für diese Ergebnisse ist die, daß es eine verringerte Verfügbarkeit des rgp580-Epitops zur Bindung von GP21 : 56 gibt, und zwar als Konsequenz des Fixierungsverfahrens, oder daß die Expression von zusätzlichen "maskierenden" Proteoglycanen auf der Zelloberfläche die Bindung von MAb verhindern. NP40-Extrakte von unfixiertem 13762NF dagegen reagierten mit GP21 : 56 ähnlich wie intakte Zellen, und die chemischen Mengen an rgp580, extrahiert von verschiedenen 13762NF-Zellklonen, stimmen mit MAb-Bindungsdaten überein.
Die Bindung von NAb GP21 : 56 war außerdem die gleiche bei lebensfähigen, nicht fixierten Zellen und bei fixierten Zellen. Unter Verwendung der oben beschriebenen Zellinien zuzüglich der Elterlinie wurde auch MTLy (eine unklonierte Zellinie, hergestellt aus einer Lymphknotenmetastase) getestet. MTLy ist hoch metastatisch. MAb GP21 : 56 hat im wesentlichen das gleiche Reaktivitätsmuster auf verschiedene fixierte und lebensfähige 13762NF-Zellklone, obwohl die tatsächliche Bindung von MAb GP21 : 56 an lebensfähige Zellen etwa 40% niedriger als an fixierte MTLn3- oder MTLy-Zellen war.

Identifizierung des MAb GP21 : 56-Antigens.

Anzeichen, die die Spezifizität von GP21 : 56 für rgp580 bestätigen, wurden durch Immunoblotten von ¹²&sup5;J-markiertem, affinitätsgereinigtem GP21 : 56 auf SDS-Polyacrylamidgelen, enthaltend Zellysate der 13762NF-Klone und gereinigtes rgp580, demonstriert. Bei diesen Versuchen band GP21 : 56 an die Komponente höheren Molekulargewichts, welche als rgp580 identifiziert wurde.

Spezifizität der MAb GP21 : 56-Bindung an in vitro-gezüchtete Zellinien.

Zum Nachweis der Spezifizität von MAb GP21 : 56 wurde die Bindung dieses MAb gegen eine Anzahl von dargestellten Zellinien unter Verwendung eines ELISA getestet. Es wurden Zellinien von Ratten und Mäusen sowie menschlichen Ursprungs verwendet, und die Ergebnisse zeigen, daß GP21 : 56 spezifisch für die klonierten Zellinien des 13762NF Ratten-Mamma-Adenokarzinoms ist. Eine sehr geringe Reaktivität wurde bei anderen gezüchteten Rattentumorzellen oder normalen Fibroblasten festgestellt, und es gab eine vernachlässigbare Bindung von GP21 : 56 an dargestellte Mäuse- oder menschliche Mammatumorzellen oder an menschliche Melanom-Zellinien. Eine sehr gute Reaktivität wurde jedoch zwischen GP21 : 56 und menschlichen Tumorbiopsieschnitten beobachtet, insbesondere bei solchen menschlichen Tumoren mit Mamma-Ursprung. Zusätzlich wurde keine Crossreaktivität bei fötalen Rattenlungen- oder Leberfibroblasten beobachtet.

Sättigungsbindung von MAb GP21 : 56 an MTLn3-Zellen.

Die Affinität von GP21 : 56 für das rgp580-Antigen, exprimiert auf MTLn3-Zellen, wurde bestimmt, indem die Assoziations- und Dissoziationskinetik der Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem GP21 : 56 gemessen wurde. MAb GP21 : 56 hat eine relativ niedrige Assoziationsgeschwindigkeit mit MTLn3-Zellen; etwa 1 h wurde für die Sättigungsbindung benötigt. Die Anfangsgeschwindigkeit der Dissoziation für an MTLn3-Zellen gebundenes GP21 : 56 war langsam, wobei während 1-½ h-Assays eine sehr niedrige Freisetzung beobachtet wurde. Diese Daten zeigen, daß GP21 : 56 keine hohe Affinität für das zelluläre Antigen aufweist, wenn es jedoch einmal gebunden hat, hat es ein hohes Bindungsvermögen.

Modulation von zellgebundenem MAb GP21 : 56.

Die Freisetzungsgeschwindigkeit von MAb GP21 : 56 von der Oberfläche von kultivierten MTLn3-Zellen wurde durch Verfolgung des Schicksals von oberflächengebundenem MAb bestimmt. Kulturüberstände (10 ug/ml MAb) wurden mit MTLn3-Zellen 1 h inkubiert, und das auf der Zelloberfläche verbliebene MAb wurde anschließend mit ¹²&sup5;J-markiertem Schaf/Ratten-F(ab')&sub2; zu unterschiedlichen Zeiten, bis zu 32 h, quantifiziert. Die Halbwertszeit von oberflächengebundenem GP21 : 56 auf MTLn3-Zellen in vitro wurde auf eine Größenordnung von 24 h geschätzt.

Reaktivität von MAb GP21 : 56 mit 13762NF-Tumoren in Gewebeschnitten.

Zur Bestimmung der Verteilung von rgp580 auf in situ wachsenden Tumoren und zur Bestätigung der Reaktivität von MAb GP21 : 56-Tumorgeweben aus syngenen F344-Ratten wurde die Verteilung von gebundenem MAb untersucht. Aus s.c.-Injektionen von 10&sup6; MTLn3-, MTF7-, MTLn2- oder MTPa-Zellen gebildete Tumore wurden nach 23 Tagen entfernt und gefroren. Die MAb-Reaktivität wurde unter Verwendung von Immunoperoxidase-Färbungsverfahren bestimmt. MAb GP21 : 56 zeigte eine extensive, jedoch heterogene Bindung an MTLn3-Zellen. Nicht alle MTLn3-Zellen waren reaktiv, es reagierten jedoch im allgemeinen mehr als 50% der Zellen mit MAb. Die meiste Reaktivität erwies sich als mit der Zelloberfläche und der extrazellulären Matrix assoziiert. MTF7-, MTLn2- und MTPa-Tumore wiesen erheblich niedrigere Prozentsätze an GP21 : 56-reaktiven Zellen auf. Annähernd 20% der Zellen in MTF7- und MTLn2-Tumoren waren mit GP21 : 56 reaktiv, während MTPa-Tumore wenige GP21 : 56-reaktive Zellen aufwiesen. In sämtlichen der 13762NF-Sublinien, die untersucht wurden, war die Lokalisierung von GP21 : 56 heterogen und vornehmlich assoziiert mit der Zelloberfläche.

Beispiel III: Isolierung und Charakterisierung von hgp580.

Unter Verwendung von Methoden, die ähnlich zu denen bei der Isolierung von rgp580 waren, wurde ein mit hgp580 bezeichnetes Protein, das ähnliche Eigenschaften wie rgp580 aufweist, aus einer menschlichen Zellquelle identifiziert und isoliert. Dieses Glycoprotein ist biochemisch unterscheidbar von rgp580, es wurde jedoch gefunden, daß hgp580 ein tumorassoziierter "Marker" ist und bei der Entwicklung von immunodiagnostischen Reagentien für menschliche Tumore ähnlich wirkt. Es wurde gefunden, daß eine Antikörperzubereitung, hergestellt gegen rgp580, allgemein einer solchen gegen rgp580 in der menschlichen Tumorimmunodiagnose zu bevorzugen ist. Die Fachwelt erkennt, daß geringe Variationen zwischen den für hgp580 verwendeten Methoden und den für rgp580 beschriebenen im allgemeinen keine wesentlichen Variationen darstellen, wenn nichts anderes angegeben ist.

a. Isolierung von hgp580.

Gewebe und Zellen.

Die Ratten-13762NF-Zellinien und -Klone wurden in AMEM mit 10% fötalem Rinderserum, ohne Antibiotika sowie in einer feuchten Atmosphäre bei 37ºC, wie in Beispiel I beschrieben, gezüchtet. Menschliche Brustkrebstumore wurden von dem Department of Pathology, M. D. Anderson Hospital and Tumor Institute, nach chirurgischer Enfernung oder Autopsie erhalten.

Isolierung von hgp580.

Ein Verfahren, das für die Reinigung von hgp580 verwendet wurde, folgt im wesentlichen der für die Isolierung von rgp580 beschriebenen Methode. Kurz gesagt werden Tumore zerkleinert und mit (5 Volumina pro g Gewebe, Naßgewicht) 4 M Guanidinhydrochlorid und 4% Zwittergent 3-12 in 0,1 M Natriumacetat, pH 6,0, enthaltend Proteaseinhibitoren (5 mM EDTA, 2 mM L-Tosylamid-2-phenylethylchlormethylalkali, 50 mM 6-Aminohexansäure, 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM Benzamidin-HCl und 10 Einheiten/ml Aprotinin) 12 h bei 4ºC extrahiert. Die Extrakte wurden durch Whatman 1-Papier filtriert und anschließend einer Gelfiltration unterworfen, und zwar an einer Sephadex G-50-Kolonne (50 · 4 cm), äquilibriert mit dem Extraktionspuffer ohne das Zwittergent. Die Leervolumenfraktionen wurden gepoolt, und Cäsiumchlorid wurde zugefügt (0,55 g CsCl/g Lösung). Die Proben wurden 48 bis 60 h bei 35.000 rpm in einem Beckman TI 50,3-Rotor bei 9ºC zentrifugiert. Die Gradienten wurden anschließend in 8 gleiche Fraktionen fraktioniert, und ihre Dichte wurde bestimmt. Fraktionen mit einer Dichte zwischen 1,55-1,45 g/ml wurden gepoolt und auf eine kalibrierte Sepharose-CL-2B-Kolonne (100 · 2 cm), äquilibriert mit 4 M Guanidinhydrochlorid in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,8, gegeben. Die Leervolumenfraktionen wurden anschließend gepoölt, dialysiert und lyophilisiert. Anteile der Fraktionen wurden anschließend mit ¹²&sup5;J und Chloramin T bei Proteinen oder Perjodat-[³H]-Borhydrid bei Sialinsäure chemisch markiert.
Eine weitere Reinigung wurde durch Ionenaustauschchromatographie erreicht, und zwar an einer Sephacel-DEAE-Kolonne (5 · 1 cm), äquilibriert mit 8 M Harnstoff, 0,2% Triton X-100 und 50 mM Tris HCl, pH 6,8. Die Elution wurde mit einem Natriumchlorid-Gradienten (0 bis 1 M) durchgeführt, gefolgt von einer Waschung mit hohem Salzgehalt (3 M). Die geeigneten Fraktionen, wie durch ihre radioaktiven Profile bestimmt, wurden anschließend gepoolt, dialysiert und lyophilisiert.

Verbessertes Verfahren für die Isolierun von h 580.

In einer verbesserten Methode für die Isolierung von hgp580 wurde das Tumorgewebe in PBS gewaschen und anschließend zerkleinert und in einer Lösung von 4 M Guanidin-HCl, 1% Zwittergent 3-12, 0,1 M Natriumacetat, pH 6,2, in Gegenwart von Proteaseinhibitoren extrahiert. Nach einer Extraktion über Nacht von etwa 18 h wurde die Lösung durch einen feinmaschigen Nylonfilter filtriert und anschließend auf eine präparative Sephadex G-50-Kolonne (4 · 50 cm), äquilibriert mit 8 M Harnstoff, 5 mM Natriumchlorid und Natriumacetat, pH 7,0, aufgetragen. Die Leervolumenfraktionen wurden gesammelt und anschließend auf eine DEAE-Sephacel-Kolonne in dem gleichen Puffer, mit Ausnahme eines Gehalts von 0,2% CHAPS, aufgetragen. Die Kolonne wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und anschließend mit einem zunehmenden, linearen Natriumchlorid-Gradienten eluiert. Die verschiedenen Peak-Fraktionen wurden gepoolt, dreimal (V/V) mit 8 M Harnstoff verdünnt und auf eine DEAE-Sephacel- Kolonne (1 ml) gegeben. Das Material wurde anschließend mit einem kleinen Volumen von 4 M Guanidin-HCl eluiert. Das Eluent wurde anschließend wurde anschließend einer Gelfiltrationschromatographie an einer kalibrierten Sepharose-CL-2B-Kolonne (2 · 100 cm) unterworfen, und zwar in 4 M Guanidin-HCl, 0,2% CHAPS und 0,1 M Natriumacetat, pH 5,8. Die Leervolumenfraktionen wurden gepoolt und stellten gereinigtes hgp580 dar, und sie wurden bezüglich ihrer Reinigung durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, gefolgt von Silberanfärbung, getestet.

b. Chemische Charakterisierung von hgp580.

Die Analyse von hgp580 durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) wurde mittels zweier Methoden durchgeführt. Für die Bestimmung von Glycoprotein wurde die SDS-PAGE unter Verwendung eines 7% Acrylamid-Laufgels und eines 3% Acrylamid-Stapelgels durchgeführt. Die Gele wurden fixiert, mit 50 mM H&sub2;SO&sub4; 1 h bei 80ºC zur Desialylierung des Glycoproteins behandelt und anschließend mit ¹²&sup5;J-markiertem Erdnußagglutinin überschichtet, gewaschen und getrocknet. Um die Migration der Glycoproteine in das Polyacrylamidgel zu erreichen, wurde ein Lineargradientgel mit N,N-Diallyltartardiamid (DATD) als Vernetzungsmittel anstelle von N,N-Methylenbisacrylamid verwendet. Das Stapelgel wurde aus 2% DATD-Acrylamid konstruiert. ¹²&sup5;J-markiertes Material enthaltende Gele wurden der Autoradiographie unterworfen, und zwar unter Verwendung von Kodak X-Omat AR-Film mit Verstärkungsschirmen. Für ³H-markierte Proben wurden die entfärbten Gele mit Enhance (New England Nuclear, Boston, MA) vor dem Trocknen behandelt und anschließend dem Röntgenstrahlenfilm ausgesetzt.
Die Wirkung von verschiedenen abbauenden Enzymen auf rgp580 und hgp580 wurde durch Inkubation von ¹²&sup5;J-markiertem Glycoprotein in 100 ml DPBS 1 h bei 37ºC bestimmt. Die getesteten Enzyme waren Trypsin, Pepsin, Pronase, Papain (aktiviert mit 1 mM B-Mercaptoethanol), ein Chymotrypsin, Subtilopeptidase A (bei 1 und 10 mg/ml), Chondroitinase ABS (1 Einheit/ml), Streptomyces-hyaluronidase (100 TRU/ml), Vibrio chlorea-Neuraminidase (100 m Einheiten/ml) und B-Galactosidase (10 Einheiten/ml). Die Proben und ein unbehandelter Vergleich wurden der SDS-PAGE-Analyse auf einem 2-17,5% DATD-Acrylamidgel unterworfen, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der erhaltene Film wurde densitometrisch auf einem Beckman DU-8 unter Verwendung des Gelabtastzubehörs abgetastet.
Die Sialinsäurereste wurden chemisch mit Perjodat-[³H]- Borhydrid markiert, und anschließend wurden die 0-gebundenen Oligosaccharide (Bindung von Kohlehydrat an Serin oder Threonin) durch Behandlung mit 50 mM Na0H in 1 M NaBH&sub4; bei 45ºC 24 h unter einer N&sub2;-Atmosphäre freigesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Essigsäure gestoppt, und die Probe wurde durch eine Dowex 50 (H&supmin;)-Kolonne geleitet. Die die Oligosaccharide enthaltende Sialinsäure wurde in einer Bio Gel P6-Kolonne, äqulilibriert mit 50 mM Pyridiniumacetat, pH 5,3, analysiert.
Die Aminosäureanalyse von rgp580 und hgp580 wurde auf einem LKB-Modell 401 Aminosäureanalysator mit Norleucin als interner Standard durchgeführt. Die Proben wurden in mit Säure gewaschenen Röhrchen lyophilisiert und anschließend mit Gdn HCl 24 h bei 100ºC hydrolysiert.
Die Ergebnisse der vergleichsweise durchgeführten Charakterisierung des hgp580 sind in Tabelle V wiedergegeben. Wie dort gezeigt ist, teilt hgp580 zahlreiche biochemische Eigenschaften mit rgp580. Die zwei sind jedoch auf der Basis der Aminosäureanalyse unterscheidbar. Die Ergebnisse der Aminosäureanalysen gemäß Tabelle V zeigen den Durchschnitt von 4 Versuchen und werden als genau innerhalb von ± 10% angesehen. Tabelle V Eigenschaften von gereinigtem Ratten- und Mensch-Sialogalacto- Protein gp580 Eigenschaft Ratten-gp580 Mensch-gp5580 1. Molekulargewicht a. Gelektrophorese b. Gelchromatographie 2. Dichte a. 4 M Guanidin-HCl b. 0,5 M Guanidin-HCl 3. Bindung von Erdnuß-Agglutinin a. unbehandelt b. Desialylierung 4. Stabilität gegen degradative Enzyme a. Trypsin b. Papain c. Pepsin d. Chondroitinase ABC e. Hyaluronidase f. Pronase g. Subtilopeptidase 5. Oligosaccarride a. Bindung an Lectine b. freigesetzt durch NaOH/NaBH&sub4; c. Sialinsäure 6. Aminosäuren und Aminozucker (Rest/1000 Aminosäuren) a. Asparaginsäure b. Threonin c. Serin d. Glutaminsäure e. Prolin f. Glycin g. Alanin h. Cystein i. Valin j. Methionin k. Leucin l. Isoleucin m Tyrosin n. Phenylalanin o. Histidin p. Lysin q. Arginin r. Glucosamin s. Galactosamin N.D. = nicht gefunden

Beispiel IV: Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen hgp 580

Es wurden monoklonale Antikörper mit einer Spezifizität gegen menschliche Tumorzellen hergestellt, und zwar unter Verwendung einer hgp580-Antigenzubereitung in einer sehr ähnlichen Weise wie oben für das rgp580-Antigen beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform, die im folgenden beschrieben wird, wurden Hybridome entwickelt, und zwar unter Verwendung von Milzzellen von Ratten, welche mit einer Zubereitung immunisiert wurden, die hgp580 und die an eine Ratten-Myelomzellinie fusionierten Milzzellen enthielt. Andere Zellsysteme, z. B. Maus/Maus-Hybride, können jedoch ebenfalls für die Herstellung von Hybridomen erfolgreich verwendet werden. Variationen zwischen den folgenden Verfahren für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen hgp580 und die oben für rgp580 beschriebenen Verfahren sind nicht von Bedeutung, sondern stellen vielmehr Verbesserungen dar.

a. Materialien und Methoden.

Tiere.

8 Wochen alte Fischer(F344/CDL)-Inzucht-Ratten (RT1¹) stammten von Harland Sprague Dawley, Houston, Texas. Die Ratten wurden mit üblichem Nagetierfutter und nichtchloriertem Quellwasser ad libitum gefüttert und unter den Richtlinien gehalten, die von dem University of Texas System Cancer Center und dem Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, festgelegt wurden.
Zellen und Zellinien. Das Rattenmyelom Y3Ag1.2.3 (RT1v) wurde von C. Milstein, MRC Laboratories, Cambridge, England, erhalten und wurde in einer Spinnerkultur in antibiotikafreiem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 20 mM Hepeshohe Glucose plus 10% fötales Rinderserum (FBS), (Hyclone, Logan, UT) gehalten.
Klonierte Sublinien des 13762NF-Ratten-Mammaadenokarzinoms (MTLn3, MTLn2, MTF7, MTC) und unkloniertes MTPa wurden erhalten und wie oben beschrieben gezüchtet. Sämtliche Zellinien wurden routinemäßig gescreent und erwiesen sich als frei von Mykoplasma und Virusverunreinigungen.
Zusätzliche Zellinien wurden aus Ratten-Mammaadenokarzinomen R32-30Ac (RT1¹), DMBA-1 (RT1¹), Ratten-Mammaadenokarzinomen MNU-F344-(RT1¹) und dem Ratten-Fibrosarcom CSE (RT1¹) dargestellt. Kurzzeitkulturen von erwachsenen und fötalen Rattenfibroblasten wurden wie oben beschrieben erhalten. Menschliche Melanomlinien wurden von J. Fogh (Sloane Kettering Cancer Center, NY, NY) zur Verfügung gestellt, MDA-436 wurde von R. Cailleau erhalten, und menschliche Mamma-Gehirnmetastasen wurden von dem Department für Neuroonkologie, M.D. Anderson Hospital, Houston, Texas, bezogen.

Hybridom-Herstellung.

Hybridome wurden hergestellt, indem Milzzellen von mit hgp580 i.d. immunisierten Ratten verwendet wurden, wobei das oben beschriebene Protokoll für rgp580 befolgt wurde. Milzzellen wurden durch Passage durch ein feinmaschiges Netz in 5 ml Medium hergestellt. Die Zellen wurden zweimal in serumfreiem Medium gewaschen, die Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Exklusion bestimmt. Milzzellen (2 · 10&sup8;) wurden mit 10&sup8; Y3Ag1.2.3 Ratten-Myelomzellen gemischt, und das Zellgemisch wurde durch Zentrifugierung bei 500 · g 5 min pelletisiert. Das Pellet wurde vorsichtig durch Zugabe von 2 ml 50% Polyethylenglycol 1450 (J.T. Baker Chemical Co, Phillipsburg, NJ) in DMEM resuspendiert und auf pH 7,2 eingestellt, und zwar über eine Zeitspanne von 1 min. Das Fusionsgemisch wurde eine weitere Minute geschüttelt, mit 8 ml DMEM verdünnt und 5 min bei 500 · g zentrifugiert. Die Zellen wurden in 200 ml DNEM, enthaltend 20% FBS 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin (Sigma), 4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin (Sigma) und 1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin (HA-Medium: Sigma), resuspendiert. Anteile (1 ml) wurden auf Costar 24-Loch-Platten (Costar, Cambridge, MA) verteilt, die 24 h zuvor mit 2 · 10&sup4; bestrahlten (30 Gy, Gammabestrahlung) Rattenfibroblasten/Vertiefung besät worden waren. Nach 24 h Inkubationszeit bei 37ºC unter Standard-Kultivierungsbedingungen wurde 1 ml HAT-Medium zugesetzt. Die Fusionen wurden 7 bis 14 Tage unter den oben genannten Bediungungen inkubiert, bevor bezüglich der Anwesenheit von Hybriden gescreent wurde.

Screening auf spezifische Antikörper.

Hybridome wurden auf die Bildung von spezifischen Antikörpern getestet, und zwar unter Verwendung eines ELISA-Assays wie folgt. Um auf Antikörper gegen hgp580 zu testen, wurde gereinigtes Antigen beschallt und anschließend über Nacht auf Immunotech-1-Platten (50 ul/Vertiefung; A/S Nunc, Kamstrap, Dänemark) immobilisiert. Die Platten wurden dreimal mit Dulbecco's phosphatgepuffertem Kochsalz (DPBS) gewaschen, und einmal 1 h mit PBS plus 1% Rinderserumalbumin (BSA). Die Platten wurden bei -20ºC in einem BSA enthaltenden Puffer bis zum Verbrauch aufbewahrt. Proben des Überstandes der Hybridomkultur (50 ul/Vertiefung) wurden mit hgp580 1 h bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Die Platten wurden dreimal mit PBS plus 0,05% BSA gewaschen. Biotinylisiertes Ziege/Ratten-IgG (Vector Labs., Burlingame, CA), verdünnt 1/1000 in PBS plus 1% BSA, wurde zugesetzt (50 ul/Vertiefung) und mit den Zellen 1 h bei 25ºC inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Streptavidin-Verbrückungsreagens (50 ul/Vertiefung), verdünnt 1/1000 in PBS plus 1% BSA (Bethesda Research Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD); nach der Zugabe zu jeder Vertiefung wurde 45 min bei 25ºC inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit PBS plus 0,05% BSA gewaschen, und gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von 0-Phenylendiamin (1 mg/ml), gelöst in 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5, nachdem 0,012% Wasserstoffperoxid zugesetzt worden war (100 ul/Vertiefung), quantifiziert. Nach 15 min Inkubation im Dunklen wurde die Absorption bei 450 nm bestimmt, und zwar unter Verwendung eines Titertek-Multiscanners (Flow Laboratories). Bei allen Assays wurde ein Überstand der Y3Ag1.2.3-Kultur als Negativkontrolle verwendet. Überstände wurden als positiv angesehen, wenn sie eine Absorption gleich oder größer als Standardabweichungen oberhalb des Hintergrundes aufwiesen. Hybridome aus positiven Vertiefungen wurden zweimal durch begrenzende Verdünnung unter Verwendung von bestrahlten Rattenfibroblasten als Feederzellen kloniert.
Zusätzliche Immunoassays unter Verwendung von ¹²&sup5;J-markierten, affinitätsgereinigten Antikörpern gegen Ratten-F(ab')&sub2; (Dr. C.J. Dean Chester Beatty Research Institute Sutton, Surrey, England) wurden durchgeführt. 50 ul Verdünnungen von monoklonalen Antikörpern wurden 1 h bei 4ºC mit Monoschichten von lebenden Zellen inkubiert, oder bei 25ºC mit fixierten Zellen, gezüchtet zur Konfluenz auf 96-Loch-Mikrotestplatten. Gebundene monoklonale Antikörper wurden nach gründlichem Waschen quantifiziert, und zwar durch Inkubation mit 5 · 10&sup5; cpm/Vertiefung von J-markiertem Schaf/Ratten-F(ab')&sub2; für 1 h bei entweder 4ºC (lebensfähige Zellen) oder 25ºC (fixierte Zellen). Die Zellen wurden mit dem Medium gewaschen und mit 200 ul 2 N NaOH lysiert. Die Radioaktivität wurde durch Zählung in einem Beckman-Modell 8000-Gammazähler bestimmt.

Reinigung und Radioinarkierung von monoklonalen Antikörpern.

Monoklonale Antikörper-wurden aus Kulturüberständen durch Affinitätschromatographie nach Konzentration durch Ammoniumsulfat(40% Sättigung)-Ausfällung isoliert. Das anti-Ratten-K- Kette-MAb, Mark 1 (H. Bazin, Brüssel, Belgien) wurde an Affigel-10 (10 mg Protein/ml Perlen) gebunden, und zwar unter Einhaltung der Anweisungen des Herstellers, und zur Reinigung von positiven monoklonalen Antikörpern verwendet. Die Elution von monoklonalen Antikörpern aus der Absorptionskolonne wurde mit 3 M Kaliumthiocyanat erreicht, Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt und augenblicklich mit 0,1 M Hepes-Puffer, pH 8,0, neutralisiert. Monoklonale Antikörper wurden bezüglich ihrer Reinheit durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) geprüft und, falls erforderlich, mit ¹²&sup5;J radiomarkiert (ICN Pharmaceutical Inc., Irvine, CA), und zwar mittels der Chloramin T-Methode, mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 uCi/ug.

Immunoblotten.

Immunoblots wurden im wesentlichen nach der Methode von Towbin et al. (1979) P.N.A.S., 76 : 4350, durchgeführt, und zwar unter Verwendung der bereits beschriebenen Modifikationen. Die Proteine wurden elektrophoretisch über Nacht von 2-17,5% DATD vernetzten, denaturierenden Polyacrylamid-Gradientgelen auf Nitrocellulosepapier bei 50 Volt und 0,29 Ampere transferiert. Das Antigen wurde unter Verwendung der Vectastain-alkalischen Phosphatase-Methode bestimmt, gemäß den Herstelleranweisungen (Vector Labs, San Francisco, CA).

Immunoperoxidase-Methode.

Gewebeproben (von Menschen und Ratten) wurden in flüssigem N&sub2; schockgefrostet und anschließend bei -20ºC bis zum Verbrauch gelagert; 4 um-Kryostatschnitte wurden in der Immunoperoxidase-Färbungsmethode verwendet. Das verfolgte Protokoll war das des Vectastain-ABC-anti-Ratten-IgG-Verfahrens (Vector Laboraratories, San Francisco, CA), und zwar mit Diaminobenzidin als Substrat (1 mg/ml in Tris- HCl, pH 7,2), verdünnt 1 : 1 mit 0,02% Wasserstoffperoxid.

b. Beispiel für anti-menschliche gp580-monoklonale Antikörper.

Die Tabelle VI zeigt eine Probe von positiven Hybridomklonen, die entweder gegen rgp580 oder hgp580 erzeugt wurden und die eine Immunoreaktivität gegen das hgp580-Antigen zeigen. Auf der Basis seines hohen Titers der Antikörperproduktion wurde der Klon HGR1 : 69 für die Untersuchungen bezüglich der Antikörpercharakterisierung ausgewählt.
Hybridomklone HGR1 : 69 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB9041) und GP21 : 56 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB9042) wurden bei der American Type Culture Collection am 20. März 1986 unter dem Budapester Abkommen hinterlegt. Tabelle VI Hybridomklone Immunogen monoklonaler Antikörper Spezifizität Ratten-gp580 menschl. gp580 Maus-HGM1:4

Beispiel V: Nachweis von menschlichen Tumoren

Gemäß dem obigen Verfahren hergestellte monoklonale Antikörper können erfolgreich in Testprotokollen für die Identifizierung und Ermittlung von vermuteten menschlichen Tumoren verwendet werden. Im allgemeinen sind immunodiagnostische Protokolle der Fachwelt bestens bekannt. Die Immunodetektionssysteme für monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können bequem angepaßt werden, um Tumorzellen in einer Vielzahl von Probentypen nachzuweisen. Zum Beispiel kann die Anwesenheit des Tumorantigens hgp580 in wäßrigen Proben wie Blut, Urin, Schweiß, Serum, Plasma, pleuralen Effusionen oder Aszitesflüssigkeit nachgewiesen werden; dieser Nachweis kann mittels eines der zahlreichen Immunodetektionsverfahren des Standes der Technik durchgeführt werden, z. B. Radioimmunoassays ("RIAs") und enzymbezogener Immunosorptionsassays ("ELISAs"). Alternativ können Tumorzellen, die in festen Geweben wie in menschlichen Gewebebiopsien vorhanden sind, nachgewiesen werden, und zwar unter Verwendung bekannter immunohistologischer Assays.

a. Vorgeschlagener Festphasen-Radioimmunoassay für die Qunatifizierung und den Nachweis von gp580 in wäßrigen Proben.

Die Anwesenheit von zirkulierendem hgp580 kann entweder einen wertvollen diagnostischen Indikator für die Anwesenheit eines Tumors irgendwo in dem Körper des Patienten oder alternativ ein diagnostisches Mittel für das Verfolgen der Progression der Chemotherapie oder des Einsetzens eines Rezidivs darstellen. Das folgende Protokoll ist ein Vorschlag für eine Methode für die Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung bei der Ermittlung und Quantifizierung von zirkulierenden hgp580-Antigenen in wäßrigen Proben.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Assays einer wäßrigen Probe verwendet eine Standard-Radioimmunoassay-Methode für die Quantifizierung von hgp580-Antigen. Kurz gesagt werden Immunoperlen hergestellt, indem man affinitätsgereinigte monoklonale Antikörper an Affi-Gel 10 bindet (1 ml Affi-Gel 10 mit 20 mg Protein), und zwar unter Beachtung der Herstelleranweisungen. Auf diese Weise hergestellte Immunoperlen werden verwendet, um anfänglich sämtliches in einer gegebenen Probenmenge vorhandenes hgp580 zu binden.
Um diese Anfangsbindung von hgp580 aus einem Probenanteil durchzuführen, werden die Immunoperlen (10 ul Packungsvolumen) mit 100 ml RIA-Puffer (0,5% Rinderserumalbumin, 0,19% Triton X-100, 0,02% Azid in DPBS, pH 7,4), Standard-Antigenverdünnungen (oder wäßrigen Proben wie Serumproben von Patienten), 100 ul normalem menschlichen Serum und Proteaseinhibitoren in 1,5 ml Polystyrolröhrchen zusammengemischt. Die Bindung wird vervollständigt, indem man die Röhrchen über Nacht bei 4ºC rotiert, gefolgt von einem Waschen den Antigen-beladenen Immunoperlen, und zwar sechsmal mit RIA-Puffer.
Die an die Immunoperlen gebundene Menge von hgp580 kann anschließend quantifiziert werden, und zwar z. B. unter Verwendung einer biotinylierten monoklonalen Antikörperzubereitung und radiomarkiertem Streptavidin, wobei die Avidin/Biotin-Reaktion ausgenutzt wird. Kurz gesagt werden biotinylierte monoklonale Antikörper hergestellt, indem man den monoklonalen Antikörper (1 mg/ml in 0,1 M Hepes, pH 8,0) mit 1 mg/ml D-Biotin-N-Hydroxysuccinimid-ester (NHS-Biotin) in wasserfreiem DMSO 4 h bei 0ºC bei einem NHS-Biotin monoklonaler Antikörper-Verhältnis von 1 : 8 (v/v) umsetzt. Nachdem die Biotinylierung vollständig abgelaufen ist, können die biotinylierten Antikörper von NHS und ungebundenem Biotin befreit werden, und zwar durch Ultrafiltration mit einer Centrifree-Micropartition-Einheit und YM-30-Membranen. Ein verwendbarer Waschpuffer ist 100 mM Hepes und 0,05% Azid, pH 8,0.
10 Mikrogramm biotinylierte Antikörper werden zu den Antigenbeladenen und gewaschenen Immunoperlen gegeben und 4 h bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Immunoperlen werden anschließend sechsmal mit RIA-Puffer gewaschen und weitere 4 h mit 5 ug ¹²&sup5;J-Streptavidin inkubiert, sechsmal mit RIA-Puffer gewaschen, und die gebundene Radioaktivität wird mit einem Autogamma-Zähler bestimmt. Die Jodierung des Streptavidins kann bequem mittels der Chloramin-T-Methode durchgeführt werden. Durch Vergleich von Standardkurven, erhalten mit bekannten Antigenkonzentrationen, mit solchen, die von Patientenproben erhalten wurden, kann die Konzentration von hgp580 in der von dem Patienten stammenden Probe bestimmt werden.

b. Bestimmung von hgp580-Antigen auf Biopsien von menschlichem Gewebe.

Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch erfolgreich verwendet werden, um die Anwesenheit von Tumorzellen in menschlichen Gewebebiopsien festzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Tumorgewebeproben in flüssigem Stickstoff gefroren und in luftdichten Behältern bei -20ºC bis zum Verbrauch gelagert. Bevorzugt werden Cryostatschnitte, annähernd 4 um dick, in allen immunohistologischen Assays verwendet. Das bevorzugte Testprotokoll, das in den Vectastatin ABS-anti-Ratten-IgG- oder anti-Maus-IgG-Verfahren verwendet wird, welche jeweils in der Fachwelt bekannt sind, verwendet entweder Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase als Enzymmarker.
Kurz gesagt werden die Gewebeschnitte in Aceton fixiert, und die endogene Enzymaktivität wird inhibiert, indem man etwa 0,3% H&sub2;O&sub2; in Methanol (für die Peroxidasefärbung) oder 20% Essigsäure (für die Färbung mit Phosphatase) verwendet. Antikörper (Überstände, Aszites- oder affinitätsgereinigt) werden auf den Träger geschichtet, 1 h inkubiert, gewaschen, und die Gewebe werden 30 min mit biotinyliertem anti-Ratten-(oder Maus-)IgG gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Der Avidin-Enzym-Komplex wird anschließend auf den Träger geschichtet, und zwar nach gründlichem Waschen mit Puffer, und mit dem Gewebe 1 h inkubiert. Zu dieser Zeit werden die geeigneten Enzymsubstrate hergestellt. Die Gewebe werden gewaschen und mit dem Enzym 5 bis 30 min inkubiert, gewaschen und mit Mayer's Hematoxylin gegengefärbt. Die Anwesenheit von Tumorzellen in dem Biopsiegewebe wird durch das Erscheinen einer positiven Enzymreaktion angezeigt, die mikroskopisch auf dem Träger beobachtet werden kann.
Die Tabelle VII zeigt Ergebnisse, die bei dem Screenen von verschiedenen Gewebeproben in der oben genannten Weise erhalten wurden, und zwar unter Verwendung eines entweder gegen rgp580 (GP21 : 56) oder eines gegen hgp580 (HGR1 : 69) entwickelten repräsentativen monoklonalen Antikörpers. Gegen entweder das Ratten- oder das Menschen-Antigen hergestellte Antikörper scheinen bei der Identifizierung von menschlichen Tumoren gleich gut zu wirken. Den Fachleuten wird weiterhin verständlich sein, daß diese monoklonalen Antikörper eine Präferenz für Tumoren mit Ursprung Mamma und insbesondere metastatische Tumoren mit Ursprung Mammagewebe aufweisen. Tabelle VII Immunoscreenen von verschiedenen Geweben Tumor Monoklonaler Antikörper Zahl der Positiven/getestete Gesamtzahl Infiltrierendes duktales Mammakarzinom Normale Mamma Lymphknotenmetastase (Brust) Lungenmetastase Gehirnmetastase Colonkarzinom Normales Colon Lebermetastase Gutartiger Colontumur Melanom

Beispiel VI: Antikörper gegen gp580 als Inhibitoren der Tumorkolonisierung und Metastasen

Rattentumorassays wurden entwickelt, um die Wirksamkeit der monoklonalen Antikörper der Erfindung nachzuweisen, und zwar bezüglich der Prävention oder der Inhibierung der Lungenkolonisierung und der spontanen Metastasen von Tumorzellen. In einem Versuch wurde affinitätsgereinigtes GP21 : 56 intravenös in die Jugularvene von Metofane-anästhetisierten Ratten (100 ug/Ratte) injiziert, und zwar 24 h vor der Injektion von 106 MTLn3-Zellen subkutan in das Mamma-Fettgewebe von jeder Ratte. Gleichzeitig zu der Injektion der Tumorzellen wurde jeder Ratte zusätzlich 100 ug Antikörper intravenös in die Jugularvene gegeben.
Man ließ den Tumor in vitro 30 Tage wachsen; während dieser Zeit wurden die Antikörper intravenös bei einer Konzentration von 50 ug/Ratte dreimal pro Woche verabreicht. Nach 30 Tagen wurden die Tiere durch Inhalation von Metofane getötet und makroskopisch bezüglich der Anwesenheit von offenen Metastasen in der Lunge, den inguinalen und lumbaren Lymphknoten, den Nieren und dem Thyinus untersucht. In der Kontrollgruppe wurde ein Antikörper verabreicht, der nicht mit gp580 kreuzreagiert. Tabelle VIII Wirkung von MAb auf die spontanen Metastasen von 13762NF-Klon MTLn3-Zellen, s.c. ir&ijlig;iziert Anti-gp580 MAb-Behandlung* Tumor Größe Lunge Ing. Zahl Ratten mit Metastasen/Gesamtzahl Ratten am Tag 30 LN Lumb. LN Renal Thymus Vergleich * F344-Ratten erhielten 50 ug MAb 3X Woche 3 Tage nach s.c. Injektion von 10&sup6; MTLn3-Zellen.
Wie sich aus den Ergebnissen der Tabelle VIII ergibt, erniedrigt ein gegen das tumorassoziierte Protein, gp580, gerichteter Antikörper signifikant das Auftreten von Spontanmetastasen. In einer ähnlichen Untersuchung wurde die Fähigkeit der Antikörper zur Verhinderung der Lungenkolonisation durch injizierte Tumorzellen geprüft. F344-Ratten wurden durch Metofane-Inhalation anästhetisiert, und 50 ug affinitätsgereinigtes MAb wurde intravenös in die Jugularvene jeder Ratte injiziert. Augenblicklich nach der Injektion von MAb wurden 5 · 10&sup4; MTLn3-Zellen i.v. in die Jugularvene injiziert. Die Tiere wurden nach 23 bis 30 Tagen getötet, und jedes Tier wurde auf offen erkennbare Metastasen untersucht. Die Menge an in der Lunge vorhandenen Tumoren eines jeden Tieres wurde durch Zählung der Anzahl der sichtbaren Tumorkolonien in jeder Lunge bestimmt. Die geeigneten, nicht-reaktiven MAbs wurden als Vergleiche benutzt. Der monoklonale Antikörper MT10 : 21 ist ein monoklonaler Antikörper, der nicht mit gp580 reagiert. Es wird jedoch angenommen, daß dieser Antikörper mit anderen metastasenassoziierten Antigenen reagieren kann. Tabelle IX Wirkung von MAb auf die experimentelle Metastasis von 13762NF- Klon-MTLn3-Zellen, i.v. injiziert Anti-gp580 MAb-Behandlung* Zahl der Lungentumorkoloien (Bereich) am Tag 30 Vergleich * F344-Ratten erhielten 50 ug MAb i.v. vor der Injektion i.v. von 5 · 10&sup4; MTLn3-Zellen.
Die in Tabelle IX gezeigten Daten zeigen erneut die potentielle Nützlichkeit für die Reduzierung von spontanen Metastasen, insbesondere solchen in der Lunge. Diese Erkenntnis läßt weiterhin die Möglichkeit zu, derartige Antikörper z. B. als Adjuvantien in der Krebschirurgie zu verwenden, von der einige Onkologen annehmen, daß sie die Dislokation von metastatischen Tumoren fördert. Zusätzlich können derartige Antikörper und das gp580-Antigen zu der Entwicklung von Immunisationsprotokollen zur Verhinderung von Metastasen führen.
Obwohl die vorliegende Erfindung in bezug auf spezifische Ausführungsformen erläutert wurde, versteht der Fachmann, daß die verwendeten Methoden allgemein gut bekannte Methoden mit verschiedenen Variationen und Ausführungsformen sind. Geeignete Variationen sind für den Fachmann erkennbar. Zum Beispiel können, obwohl die vorliegenden monoklonalen Antikörper in erster Linie in bezug auf Ratten/Ratten-Hybride beschrieben worden sind, Maus/Maus-Hybride in ähnlicher Weise eingesetzt werden, wie dies in Tabelle VI erläutert worden ist. In ähnlicher Weise werden geschulte Molekularbiologen und Proteinbiochemiker erkennen, daß zahlreiche Variationen in den veröffentlichten Isolationsmethoden der Proteine für die erfolgreiche Isolierung von gp580 verwendet werden können. Sämtliche derartiger Variationen werden als im Umfang der Erfindung liegend angesehen.

Claims

1. In wesentlichen reines Tumor-hgp580-Antigen, enthaltend ein Glycoprotein mit einem durch SDS-PAGE identifizierbaren Molekulargewicht von annähernd 550 Kilodalton, wobei das Antigen weiterhin als aus Zellmembranfraktionen von menschlichen Mammakarzinomzellen isolierbar; als im wesentlichen widerstandsfähig gegenüber einer Behandlung mit Trypsin oder Hyaluronidase und als im wesentlichen empfindlich gegenüber einer Behandlung mit Pronase; oder als eine wesentliche Bindung an Erdnußagglutinin nach Behandlung mit Neuraminidase aufweisend charakterisiert ist und annähernd die folgende Anzahl von jedem der angegebenen Aminosäurereste und Aminozuckerreste auf jeweils 1000 Aiinosäurereste des Glycoproteins aufweist:

Asparginsäure 120

Threonin 87

Serin 166

Glutaminsäure 154

Prolin 37

Glycin 78

Alanin 26

Cystein nicht festgestellt

Valin 65

Methionin nicht festgestellt

Leucin 56

Isoleucin 38

Tyrosin 23

Phenylalanin 29

Histidin 11

Lysin 94

Arginin 16

Glucosamin 147

Galactosamin 113

wobei bezüglich der Aminosäureanalyse eine Genauigkeit innerhalb von ± 10% angenommen wird.

2. Im wesentlichen reines Tumor-gp580-Antigen mit einem Glycoprotein mit einem durch SDS-PAGE identifizierbaren Molekulargewicht von etwa 550 Kilodalton, verwendbar bei der Herstellung von humangerichteten Antikörpern, wobei das Antigen aus Zellmembranfraktionen von menschlichen Mammakarzinomzellen isolierbar ist; im wesentlichen widerstandsfähig gegenüber einer Behandlung mit Trypsin oder Hyaluronidase und im wesentlichen empfindlich gegenüber einer Behandlung mit Pronase ist, oder eine wesentliche Bindung an Erdnußagglutinin nach Behandlung mit Neuraminidase aufweisend ist, wobei das Antigen durch ein Verfahren mit den folgenden Schritten erhältlich ist:

A.

(a) Extraktion gp580 einschließender löslicher Proteine aus einem Tumor, der das gp580-Antigen enthält;

(b) Unterwerfen des Extrakts einer Gelausschlußchromatographie;

(c) Sammlung des Ausschlußproduktes;

(d) Unterwerfen des Ausschlußproduktes einer anionischen Austauschchromatographie;

(e) Elution der an das anionische Austauschharz bindenden Fraktionen;

(f) Unterwerfen des Eluates einer Gelausschlußchromatographie; und

(g) Sammlung der Ausschlußfraktionen; oder

B.

(a) Extraktion gp580 einschließender löslicher Proteine aus einem das gp580-Antigen enthaltenden Tumor;

(b) Unterwerfen des Extrakts einer Gelausschlußchromatographie;

(c) Sammlung des Ausschlußproduktes;

(d) Unterwerfen des Ausschlußproduktes einer Dichtegradienten-Zentrifugierung;

(e) Fraktionierung des äquilibrierten Dichtegradienten;

(f) Unterwerfen der gp580 enthaltenden Fraktionen einer Gelausschlußchromatographie; und

(g) Sammlung der Ausschlußfraktionen.

3. Antikörper gegen das Antigen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.

4. Antikörper nach Anspruch 3, wobei der Antikörper weiterhin als monoklonaler Antikörper definiert ist.

5. Antikörper nach Anspruch 4, wobei der monoklonale Antikörper weiterhin als GP21 : 56 oder HGR1 : 69 definiert ist (erhältlich aus den ATCC-Hinterlegungen HB 9042 bzw. HB 9041).

6. Hybride, kontinuierliche Zellinie, gekennzeichnet durch die Bildung eines Antikörpers gegen das Antigen des Anspruchs 1 oder Anspruchs 2.

7. Hybride, kontinuierliche Zellinie, die einen gegenüber dem hgp580-Antigen reaktiven Antikörper bildet, erhältlich durch ein die folgenden Schritte umfassendes Verfahren:

(a) Fusion von Milzzellen einer Ratte mit Myelomzellen einer Ratte, wobei die die Milzzellen liefernde Ratte mit einem ein gp580-Antigen enthaltenden Antigengemisch immunisiert worden ist;

(b) Züchtung der Zellen in einem selektiven Medium;

(c) Testen auf die Anwesenheit des gewünschten Antikörpers; und

(d) Klonen der den gewünschten Antikörper bildenden Zellen.

8. Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen gp580-Antigens nach Anspruch 2, verwendbar bei der Herstellung von menschlichen, tumorgerichteten Antikörpern, wobei das Antigen aus Zellmembranfraktionen von Mammakarzinomzellen isolierbar ist, im wesentlich widerstandsfähig gegenüber der Behandlung mit Trypsin oder Hyaluronidase ist und im wesentlichen empfindlich gegenüber der Behandlung mit Pronase ist, oder eine wesentliche Bindung gegenüber Erdnußagglutinin nach Behandlung mit Neuraminidase aufweisend ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

A.

(a) Extraktion gp580 einschließender löslicher Proteine aus einem das gp580 enthaltenden Tumor;

(b) Unterwerfen des Extrakts einer Gelausschlußchromatographie;

(c) Sammlung des Auschlußproduktes;

(e) Elution der an das anionische Austauschharz bindenden Fraktionen;

(f) Unterwerfen des Eluates einer Gelausschlußchromatographie; und

(g) Sammlung der Ausschlußfraktionen; oder

B.

(b) Unterwerfen des Extrakts einer Gelausschlußchromatographie;

(c) Sammlung des Ausschlußproduktes;

(d) Unterwerfen des Ausschlußproduktes einer Dichtegradienten-Zentrifugierung;

(e) Fraktionierung des äquilibrierten Dichtegradienten;

(f) Unterwerfung der gp580 enthaltenden Fraktionen einer Gelausschlußchromatographie; und

(g) Sammlung der Ausschlußfraktionen.

9. In-vitro-diagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von metastatischen menschlichen Tumorzellen in einer Probe, mit dem Schritt des Zusammenbringens der Probe mit einem Antikörper, welcher eine Spezifität gegenüber dem Antigen des Anspruchs 1 oder Anspruchs 2 aufweist, und Bestimmung der durch den Antikörper gebundenen Materialien.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Probe eine wäßrige Probe ist und das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Vermischung der Probe mit einem Antikörper, der eine Spezifität gegenüber dem Antigen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 aufweist, unter Bedingungen, denenzufolge spezifische Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen gefördert werden, und

(b) Bestimmung der Antigen/Antikörper-Wechselwirkung oder wobei die Probe eine nichtwäßrige Probe ist und das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Schichtung der Probe mit einem Antikörper mit einer Spezifität gegenüber dem Antigen des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 2;

(b) Inkubierung der geschichteten Probe unter Bedingungen, die spezifische Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen fördern; und

(c) Bestimmung der Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen.

11. Kit für den Nachweis von Krebs in menschlichen Lebewesen, wobei das Kit folgendes umfaßt:

(a) ein Antigen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, oder einen hierfür spezifischen Antikörper; und

(b) ein Reagens für die Immundetektion.