DE69033457T2

DE69033457T2 - Prohormonspaltungsplatzblockierungsantikörper

Info

Publication number: DE69033457T2
Application number: DE69033457T
Authority: DE
Inventors: Michael Kriegler; Carl Perez
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-08-16
Filing date: 1990-08-13
Publication date: 2000-09-14
Anticipated expiration: 2010-08-14
Also published as: EP0487610A1; US5686259A; ATE189682T1; WO1991002756A1; US5702705A; AU641178B2; US5677182A; DE69033457D1; AU6276590A; JPH05501351A; EP0487610B1; CA2023250A1

Description

Diese Erfindung liegt im Gebiet der Immunologie/Biochemie und stellt die Entwicklung eines Antikörpers vor, bevorzugt eines monoclonalen Antikörpers, der die Erzeugung reifer Proteinhormone aus Prohormonvorläufern verhindert, indem er an die Prohormone bindet und dadurch spezifische Stellen blockiert, die durch proteolytische Enzyme gespalten werden. Der Antikörper besitzt diagnostische, prophylaktische und therapeutische Anwendungen zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere Sepsis und AIDS, die mit erhöhten Mengen an reifen Hormonen verbunden sind.
Tumornekrosefaktor (TNF) ist ein Cytokin, von dem bekannt ist, daß es eine cytolytische und cytostatische Antitumoraktivität besitzt. Carswell et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3666-3670; Williamson et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 5397- 5401. Darüberhinaus wurde kürzlich gezeigt, daß TNF ein Vermittler in der Immunentzündungskaskade ist und eine Schlüsselrolle in der Sepsis spielt. Beutler, et al. (1985) Science 229: 869, berichteten, daß in einem murinen Modell die tödliche Wirkung von Endotoxin durch polyclonalen Kaninchen-anti-murinem TNF-Antikörper verringert werden kann. Allein in den Vereinigten Staaten entwickelt sich Nosokomialbakteriämie in etwa 194,000 Patienten, und von ihnen sterben etwa 75,000. Maki, D. G., 1981 Nosocomial Infect., (Dikson, R. E., Hrsg.), Seite 183, Yrke Medical Books, U. S. A.. Die meisten dieser Todesfälle sind sechs bedeutenden gram-negativen Bacillen zuzuschreiben, und diese sind Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Klebstella, Enterobacter und Serratia. Die aktuelle Behandlung von Bakteriämie besteht in der Verabreichung von Antibiotika, die leider eingeschränkte Wirksamkeit besitzen.
Obwohl die genaue Pathologie von Bakteriämie nicht völlig aufgeklärt ist, ist bekannt, daß bakterielle Endotoxine, Lipopolysaccharide (LPS), die primären Verursachungsagentien sind. LPS besteht aus mindestens drei bedeutenden antigenen Bereichen, dem Lipid A, dem Kernpolysaccharid und dem O-spezifischen Polysaccharid.
Letzteres wird auch als O-spezifische Kette oder einfach O-Antigen bezeichnet. Der Ospezifische Kettenbereich ist ein langkettiges Polysaccharid, das aus wiederholten Polysaccharideinheiten aufgebaut ist. Die Anzahl von Polysaccharideinheiten unterscheidet sich in verschiedenen Bakterienarten und kann von einer bis sechs oder sieben Monosaccharideinheiten variieren. Während die O-spezifische Kette zwischen verschiedenen gram-negativen Bakterien variiert, sind das Lipid A und die Kernpolysaccharide ähnlich, wenn nicht identisch.
Da LPS eine Schlüsselrolle in der Sepsis spielt, wurde eine Vielzahl von Versuchen unternommen, um seine Aktivität zu neutralisieren. Gegenwärtig gibt es beachtliche Arbeiten, die nahelegen, daß Antikörper gegen LPS bald eine wertvolle klinische Beigabe zu der Standard-Antibiotikumtherapie sein werden.
LPS initiiert eine Kaskade biochemischer Ereignisse, die schließlich den Tod des Patienten verursacht. Es wird allgemein geglaubt, daß das zweite Ereignis nach der Einführung des LPS, die Erzeugung von Tumornekrosefaktor (TNF) als ein Ergebnis der LPS-Stimulation von Makrophagen-Zellen ist. Folglich wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um neutralisierende Antikörper gegen TNF oder andere Moleküle, die seine septischen Effekte hemmen können, herzustellen. Es ist wahrscheinlich, daß ein Antikörper gegen TNT wertvolle klinische Anwendungen haben wird. Tracey, et al., 1987, Nature, 330: 662.
Es wurde gezeigt, daß TNF sowohl in membrangebundener als auch in löslicher sekretierter Form existiert. Decker, et al., I 987, J. of Immunol. 138: 957; Kriegler, et al., 1988, Cell, 53: 45. Menschlicher TNF wurde cloniert, und es wurde gezeigt, daß er aus einem 17 kD-Polypeptid plus einer ungewöhnlich langen mutmaßlichen Signalleadersequenz von 76 Aminosäuren besteht. Das 17 kD-Molekül ist ein Schlüsselagens, das an der Initiierung der für die Sepsis verantwortlichen biochemischen Kaskade beteiligt ist. Es wurde von Kriegler, et al., 1988, Cell, 5345 vorgeschlagen, daß TNF sowohl als eine membrangebundene 26 kD-Form als auch eine lösliche Form, die der 17 kD-Form entspricht, existieren kann. Die 26 kD-Form ist der Vorläufer, oder das Prohormon, des reifen 17 kD-Moleküls. Die 17 kD-Form von INF spielt eine zentrale Rolle in der Verursachung von Sepsis. Es wurde von Kriegler, et al., vorstehend, vorgeschlagen, daß die zwei Formen von INIF verschiedene biologische Effekte haben können, obwohl nicht angegeben wurde, was diese sein könnten.
Darüberhinaus, daß TNF eine kritische Rolle in der Sepsis spielt, wurde kürzlich gezeigt, daß TNF an der Initiierung der Expression von menschlichen Immunschwächevirus in menschlichen Zellen, die latenten Virus tragen, beteiligt ist. Folks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, S. 2365 (1989). Folglich wäre das Verhindern oder die Hemmung der Erzeugung der 17 kD-Form oder von Formen von TNF mit niedrigem Molekulargewicht aus seinem 26 kD-Vorläufer ein wirksamer Weg, AIDS-Patienten, die latenten Virus tragen, durch Verhindern der Expression des Virus zu heilen.
Da TNF an der Verursachung von Krankheiten beteiligt ist, wird nach Inhibitoren seiner Wirkung eifrig gesucht. Zusätzlich zu dem vorstehend erwähnten anti-TNF- Antikörper wurden andere Moleküle mit TNF-hemmender Wirkung identifiziert. Ein solcher Nicht-Antikörper-TNF-Inhibitor wird von Seckinger, et al., 1988, J. Exp. Med., 167: 1511 beschrieben. Er kommt im Urin fiebriger Patienten vor, aber leider wurde er nicht gereinigt und soweit charakterisiert, daß er klinisch anwendbar ist.
Die immunpathogenen Eigenschaften von TNF machen die akute Überwachung des biologisch aktiven 17 kD-TNF in einem Patientenserum wünschenswert. Momentan wird 17 kD-TNF mittels eines aufwendigen in vitro-Cytotoxizitätstests gemessen, der Mausfibroblastenzellen verwendet, oder durch Verwendung von Antikörper gegen die 17 kD-Form. Da das 17 kD-Molekül von 26 kD-TNF abgeleitet ist, hätte das Verhältnis von 26 kD-TNF zu der 17 kD-Form für den Verlauf der Krankheit eines Patienten einen größeren Informationsgehalt und Vorhersagewert. Derzeit gibt es keinen zuverlässigen Test für das 26 kD-Molekül.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon bereit, ggf. ein F(ab')2-, Fab- oder Fv-Fragment, der (das) an ein Prohormon bindet und dadurch die proteolytische Erzeugung (eines) biologisch aktiven(r) Fragments(e) des Prohormons verhindert, zur Verwendung als ein Arzneistoff.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers bereit, der an ein Prohormon bindet, für die Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Patienten mit einer Krankheit, die durch die Gegenwart von Fragmenten des Prohormons in dem Patienten verursacht wird, wobei ggf. das Prohormon TNF-Prohormon ist und die Fragmente TNF-Prohormon- Fragmente mit Molekulargewichten von 17.000 oder 15.000 sind.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon bereit, ggf. ein F(ab'X-, Fab- oder Fv-Fragment, der (das) an ein Prohormon bindet und dadurch die proteolytische Erzeugung (eines) biologisch aktiven(r) Fragments(e) des Prohormons verhindert, wobei das Prohormon TNF- Prohormon, IL-1-Prohormon oder ein CSF-Prohormon ist. In diesem Aspekt kann das Prohormon TNF-Prohormon sein, und das biologisch aktive Fragment davon kann ein Molekulargewicht von etwa 17 kD oder etwa 15 kD besitzen. Der Antikörper oder das Fragment können polyclonal, monoclonal, einzelkettig, bispezifisch oder rekombinant sein und können auch menschlich oder humanisiert sein. Antikörper, sowohl polyclonal als auch monoclonal, und antigenbindende Fragmente, die die Erzeugung von Hormonen aus ihren Prohormonvorläufern durch Bindung an einen Bereich des Prohormons verhindern oder die Erzeugungsrate verringern, der entweder direkt oder indirekt den Zugang von Proteasen zu den Spaltstellen sterisch behindert, die das Hormon ergeben, zur medizinischen Verwendung, sind genauso gut beschrieben wie Antikörper, sowohl polyclonal als auch monoclonal, und antigenbindende Fragmente davon, die direkt die Erzeugung von Formen von TNT mit niedrigem Molekulargewicht aus seinem 26 kD-Prohormonvorläufer verhindern oder die Erzeugungsrate verringern, indem sie an Epitope auf dem 26 kD- Molekül binden, die proteolysiert werden, um TNF-Formen mit niedrigem Molekulargewicht zu ergeben, und dadurch die Proteolyse an diesen Stellen blockieren.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon bereit, ggf. ein F(ab')&sub2;-, Fab- oder Fv-Fragment, der (das) an ein spaltstellenspezifisches Epitop auf einem Prohormon bindet und die Spaltung blockiert, wobei das Epitop die Eigenschaft aufweist, daß es proteolytisch zu einer oder mehreren biologisch aktiven Form(en) des Prohormons mit niedrigem Molekulargewicht gespalten wird, wobei das Prohormon TNF-Prohormon, ILl-Prohormon oder ein CSF- Prohormon ist. In diesem Aspekt kann das Prohormon TNF-Prohormon sein, und das biologisch aktive Fragment davon kann ein Molekulargewicht von etwa 17 kD oder etwa 15 kD besitzen. Der Antikörper oder das Fragment kann polyclonal, monoclonal, einzelkettig, bispezifisch oder rekombinant sein, und er (es) kann auch menschlich oder humanisiert sein. Antikörper, sowohl polyclonal als auch monoclonal, und Antigenfragmente davon, die indirekt die Erzeugung niedermolekularer Formen von TNF aus seinem 26 kD- Prohormonvorläufer verhindern oder die Erzeugungsrate verringern, indem sie an (ein) Epitop(e) binden, das (die) von den Spaltungsstellen auf dem 26 kD = Prohormon entfernt liegt(en), und dadurch die Proteolyse an dieser(n) Stelle(n) durch sterische Behinderung blockieren, sind spezifisch beschrieben.
In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zelllinien bereit, die Antikörper, wie die in den dritten und vierten Aspekten der Erfindung definierten Antikörper, produzieren.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Verhinderung einer proteolytischen Spaltung eines Prohormons in große und kleine proteolytische Fragmente bereit, umfassend einen ersten und einen zweiten nichtkreuzreagierenden Antikörper, die an das Prohormon binden, wobei der erste Antikörper die Erzeugung des großen Fragments verhindert und der zweite Antikörper die Erzeugung des kleinen Fragments verhindert. In diesem Aspekt kann das Prohormon TNF-Prohormon sein, und ggf. besitzen die großen und kleinen TNF-Prohormon-Fragmente Molekulargewichte von etwa 17.000 beziehungsweise 15.000. Der Antikörper kann polyclonal, monoclonal, einzelkettig, bispezifisch oder rekombinant sein, und/oder umfaßt menschlichen oder humanisierten Antikörper.
In einem siebten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen auf TNF-Prohormon in Gegenwart von reifem TNF-Hormon in einer Flüssigkeitsprobe bereit, umfassend die Schritte:
(a) Erzeugen eines ersten Komplexes, umfassend das lnkontaktbringen von TNF- Prohormon mit einem Antikörper, der an das TNF-Prohormon bindet, der aber im wesentlichen nicht an das reife Hormon binden kann;
(b) Erzeugen eines zweiten Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit einem Reportermolekül; und
(c) Testen auf das Reportermolekül in dem zweiten Komplex.
In dem obigen Verfahren kann die Erzeugung des zweiten Komplexes das Isolieren des ersten Komplexes, der im wesentlichen frei ist von ungebundenem TNF-Prohormon und Antikörper, der an das INE-Prohormon bindet, vor dem Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit dem Reportermolekül umfassen. Das Testen auf das Reportermolekül kann das Isolieren des zweiten Komplexes vor dem Inkontaktbringen des zweiten Komplexes mit dem Reportermolekül und Isolieren des zweiten Komplexes mit dem Reportermolekül umfassen.
In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen auf TNF-Prohormon und auf das reife TNF-Hormon in einer Flüssigkeitsprobe bereit, umfassend die Schritte:
(a) Erzeugen eines primären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen von TNF- Prohormon mit Antikörper, der an das TNF-Prohormon bindet, aber im wesentlichen nicht an das reife Hormon binden kann;
(b) Erzeugen eines sekundären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen von reifem TNF-Hormon mit einem Antikörper, der an das reife TNF-Hormon bindet, aber im wesentlichen nicht an das Prohormon binden kann;
(c) Erzeugen eines tertiären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen der primären und sekundären Komplexe mit unterscheidbaren Reportermolekülen; und
(d) Testen der unterscheidbaren Reportermoleküle in dem tertiären Komplex.
Ein Immuntest, der sowohl 17 kD- als auch 26 kD-TNF in einer Flüssigkeitsprobe, wie Blut, mißt, wird daher bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper neutralisierend und stellt daher ein Maß für biologisch aktiven INT in der Probe bereit.
Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden nach einer Inbetrachtnahme der folgenden Beschreibung der Erfindung vollständiger verstanden werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Herstellung von Prohormon-Antikörper, bevorzugt hochaffiner polyclonaler oder monoclonaler Antikörper, der die Erzeugung eines Hormons aus seinem Prohormonvorläufer verhindert oder verringert. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung solcher Antikörper in Immuntests sowie für die Behandlung parasitärer Erkrankungen.
Um die vorliegende Erfindung klarer zu definieren werden spezielle Begriffe hierin verwendet, gemäß den folgenden, im allgemeinen mit ihrer Verwendung im Fachgebiet übereinstimmenden Definitionen.
Die Begriffe "Prohormon" und "reifes Hormon" besitzen die folgenden Bedeutungen. Prohormon soll Proteine, bevorzugt immunologischen Urspungs, einschließen, die ein Peptidsegment des Proteins besitzen, das während seiner Erzeugung entfernt wird. Die Entfernung des Peptids liefert die "reife" Form des Hormons. Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist das 26 kD-TNF-Prohormon, wie nachstehend im Detail diskutiert wird, das hauptsächlich in eine reife 17 kD-Form gespalten wird. Andere Spaltungsprodukte werden jedoch auch aus dem Prohormon gebildet, und diese sollen in der Bedeutung des "reifen" Hormons eingeschlossen sein. Schließlich ist es wichtig zu bemerken, daß Prohormone zusätzlich zu TNF innerhalb des Umfangs dieser Definitionen eingeschlossen sein sollen und als ein Teil der Erfindung betrachtet werden. Beispielhafte Prohormone sind die CSFs und IL-1.
"Monoclonaler Antikörper" bezieht sich auf eine Zusammensetzung von Antikörpern, die von einer clonalen Population (oder Clon), die sich durch Mitose von einer einzelnen Antikörper-produzierenden Zelle ableitet, produziert wird. Eine Zusammensetzung von monoclonalen Antikörpern ist "im wesentlichen frei von anderen Antikörpern", wenn sie im wesentlichen frei von Antikörpern ist, die nicht von Zellen der clonalen Population produziert werden, Der Begriff "im wesentlichen frei" bedeutet ungefähr 5% (w/w) oder weniger verunreinigende Antikörper in der Zusammensetzung.
"Spaltstellen-blockierender Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der an TNF-Prohormon bindet und die Spaltung des Prohormons in Fragmente mit niederem Molekulargewicht hemmt oder verhindert. Die Bindung kann an der (den) Spaltungsstelle(n) oder entfernt davon sein.
Eine "Antikörper-produzierende Zelllinie" ist eine clonale Population oder ein Clon, die (der) sich durch Mitose von einer einzelnen Antikörper-produzierenden Zelle ableitet, die zu stabilem Wachstum in vitro über viele Generationen fähig ist.
"Tumornekrosefaktor" oder "TNF", wie hier verwendet, bezieht sich sowohl auf native als auch rekombinante Formen dieses bekannten Cytokins aus Säugern. TNF wurde in der Literatur durch andere Namen bezeichnet, einschließlich "Cachectin" und "TNF-α". "Rekombinanter TNF" oder "rTNF" bezieht sich aufProteine, einschließlich Muteine, die durch Expression rekombinanter DNA produziert werden und die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie nativer TNF (oder Teile davon) besitzen und die sowohl die biologische in vitro- als auch die in vivo-Aktivität von TNF behalten. Die Isolierung und Produktion von sowohl nativem als auch rekombinantem Säuger-TNF, einschließlich menschlichem TNF, ist im Fachgebiet bekannt. Siehe, z. B., Carswell et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3666-3670; Williamson et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5397-5401; Wang et al. (1985) Science 228: 149-154; Beutler et al. (1985) J. Exp. Med. 161 : 984; Beutler et al. (1985) Science 229 : 869; Beutler et al. (1985) Nature 316: 552; Pennicia et al. (1984) Nature 312: 724; Aggarwal et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2345.
Wie hier verwendet, bezieht sich TNF mit einem Molekulargewicht von 26,000 auf die Prohormon-Form von TNF. Es ist bekannt, daß das aminoterminale Peptid des Prohormons in der Länge variiert, abhängig von der Art, aus der es stammt, während das Propeptidsegment des Moleküls hochkonserviert ist. Tatsächlich sind in der Maus ungefähr 86% der 79 Aminosäuren, die die mutmaßliche Leadersequenz des Prohormons bilden, identisch mit den 76 bekannten Aminosäuren, die die Prosequenz von menschlichem TNF umfassen. Folglich wird der Fachmann Verständnis dafür haben, daß nachstehend im Falle einer Bezugnahme auf TNF mit einem Molekulargewicht von etwa 26,000 das Bezeichnete ein Molekül ist, das nicht von einer bestimmten Art abgeleitet ist und das eine leicht veränderte Leadersequenz verglichen mit der menschlichen Sequenz, wie sie im Fachgebiet bekannt ist, besitzen kann.
Sepsis bedeutet hier eine Krankheit, die sich aus einer bakteriellen Infektion aufgrund des bakteriellen Endotoxins Lipopolysaccharid (LPS) ergibt. Sie kann mindestens durch die sechs bedeutenden gram-negativen Bacillen ausgelöst werden, und diese sind Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Klebstella, Enterobacter und Serratia. TNF ist ein Faktor, der an der frühen Phase der Erkrankung beteiligt ist, und vor allem die 17 kD-Form des Moleküls oder kürzere im Fachgebiet bekannte Muteine sind die primären aktiven Faktoren.
Der Begriff "Konvertase", oder "TNF-Konvertase", soll ein Enzym umfassen, das normalerweise im Körper vorkommt und für die proteolytische Spaltung von 26 kD-TNF in eine oder mehrere niedermolekulare Formen verantwortlich ist. Die Konvertase ist im wesentlichen membranassoziiert, obwohl eine bedeutende Aktivität im Cytosol lokalisiert ist.
Der Ausdruck "membranassoziiert", wie für TNF-Konvertase verwendet, bezeichnet eine Form der Konvertase, die im wesentlichen unlöslich ist, wie die Anwesenheit des Großteils der Konvertaseakivität in einer 30,000 Pelletfraktion schließen läßt. "Rekombinanter Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, in dem ein Teil jeder der Aminosäuresequenzen von schwerer und leichter Kette homolog zu den entsprechenden Sequenzen in einem Antikörper ist, der von einer bestimmten Art abgeleitet ist oder einer bestimmten Klasse angehört, während der restliche Abschnitt der Ketten zu den entsprechenden Sequenzen in einem anderen Antikörper homolog ist. Am üblichsten spiegelt in einem rekombinanten Antikörper der variable Bereich von sowohl schwerer als auch leichter Kette die variablen Bereiche eines Antikörpers wieder, der von einer Art von Säugern abgeleitet ist, während die konstanten Bereiche zu den Sequenzen in einem Antikörper homolog sind, der von einer anderen Art abgeleitet ist.
Zwei Antikörper sind "kreuzblockierend" oder besitzen ein "gemeinsames Epitop", wenn jeder Antikörper wirksam die Bindung des anderen Antikörpers in einem Bindungshemmungstest blockiert. Folglich, wenn die Antikörper A und B kreuzblockierend sind, würde Antikörper A nicht an sein Antigen binden, wenn das Antigen mit Antikörper B vorinkubiert wurde, und Antikörper B würde nicht an sein Antigen binden, wenn das Antigen mit Antikörper A vorinkubiert wurde.
Der Begriff "Bindungsaffinität" oder "Ka" eines Antikörpers an sein Epitop, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Bindungsaffinität, die gemäß Standardmethoden mit der Formel Ka = 8/3 (It-Tt) berechnet wurde, wobei It die gesamte molare Konzentration der Inhibitoraufnahme bei 50% Indikator ist, und Tt die gesamte molare Konzentration des Indikators ist. Siehe Muller, (1980) J. Immunol. Methods 34: 345-352.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "Inkubation" das lnkontaktbringen von Antikörpern und Antigenen unter Bedingungen, die die Bildung von Antigen/Antikörper- Komplexen erlauben (z. B. geeigneter pH-Wert, geeignete Temperatur, geeignete Zeit, geeignetes Medium, usw.). Auch wie hier verwendet bezieht sich "Trennung" auf jedes Verfahren, normalerweise Waschen, der Trennung einer Zusammensetzung von einem Testträger oder immobilisierten Antikörper, so daß jedes ungebundene Antigen oder jeder ungebundene Antikörper in der Zusammensetzung entfernt wird und jeder Antigen/Antikörper-Komplex auf dem Träger intakt bleibt. Die Selektion der geeigneten Inkubations- und Separationstechniken liegt im Fachwissen.

I. Spaltstellen-blockierender Anti-26kD-Antikörper

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Anti-TNF-Antikörper-produzierende immunologische Zellen aus einem Säugetier, das mit 26 kD-TNF immunisiert wurde, isoliert und immortalisiert, um Antikörper-sekretierende Hybridomzelllinien zu ergeben. Zelllinien, die Anti-26 kD- TNF, das die Spaltung des Moleküls in niedermolekulare TNF- Formen verhindert oder behindert, sekretieren, können durch Testen von Kulturüberständen auf den gewünschten Antikörper in Gegenwart eines Konvertase-Enzyms, das das 26 kD- Molekül spaltet, identifiziert werden. Folglich kann die Erfindung in 3 Abschnitte üpterteilt werden, und jeder Abschnitt wird einzeln diskutiert.

A. 26 kD-TNF-Immunogen:

Antikörper, der die Spaltungsstelle(n) auf dem 26 kD-Molekül blockiert, kann unter Verwendung von Zellen, Geweben usw., die das 26 kD-Molekül exprimieren, als Immunogen hergestellt werden. Beispiele schließen biologische Agenzien ein, von denen im Fachgebiet bekannt ist, daß sie 26 kD-TNF exprimieren, wie stimulierte Monocyten, wie von Kriegler, et al., 1988, in Cell 53: 45 beschrieben, Leukocyten oder Zelllinien leukocytären Ursprungs. Die Verfahren zur isolierung von Monocyten sind im Fachgebiet gut bekannt, wie auch Verfahren zur Kultivierung von Zelllinien.
Ein zweiter und bevorzugter Ansatz ist die Synthese von Peptiden, hier nachstehend als TNF-Peptide bezeichnet, die von der Konvertase erkannt werden, und die Verwendung dieser als Immunogene. Die Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen Peptide sind im Fachgebiet gut bekannt und erfordern im allgemeinen die Kopplung des Peptids an ein geeignetes Trägermolekül, wie Serumalbumin. Die bevorzugten Peptide sind Gln-Ala-Val- Arg-Ser-Ser-Ser, Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala, Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His- Val-Val-Ala, Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala und Pro-Leu-Ala- Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro. Die Peptide können mittels im Fachgebiet gut bekannter Techniken hergestellt werden, wie z. B. die Merrifield-Festphasenmethode, beschrieben in Science, 232341-347 (1985). Das Verfahren kann kommerziell erhältliche Synthesegeräte verwenden, wie eine Biosearch 9500 automatisierte Peptidmaschine, wobei die Spaltung der blockierten Aminosäuren mit Hydrogenfluorid erreicht wird, und die Peptide mittels präparativer HPLC unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000- Gerätes auf einer 15-20 um-Vydac C4 PrepPAK-Säule gereinigt werden.
Ein dritter Ansatz, mit dem 26 kD-TNF erhalten werden kann, ist die in vitro- Transkription/Translation des 26 kD-Moleküls. Das 26 kD-Molekül wird durch eine DNA- Sequenz codiert, die im Plasmid B 11 vorhanden ist, beschrieben in der ebenfalls anhängigen Cetus-Patentanmeldung, Europäische Patentveröffentlichungsnr. 200748, veröffentlicht am 12. November, 1986; und U. S. Patent Nr. 4,677,063 und 4,677,064. Die Sequenz wird aus pBl 1 durch PstI-Spaltung entfernt, in einen geeigneten Vektor cloniert und unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Materialien und Methoden · translatiert/transkribiert. Siehe, zum Beispiel, Transcription and Translation - a Practical Approach (Hrsg. B. D. Hames und S. Higgins) IRL press, 1984; Melton, D. A. et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12, 7035; und Pelham und Jackson, Eur. J. Biochem. 67, 5 247. Das Transkriptionsprodukt 26 kD-TNF kann als lmmunogen verwendet werden. Da in vitro- Transkription/Translation jedoch eine geringe Menge an Produkt ergibt, wird das so erhaltene Material primär für in vitro-Immunisierungen verwendet.
Ein anderer Ansatz ist die Transformation von Zellen mit der DNA-Sequenz, die das 26 kD-Molekül codiert, und die Verwendung der transformierten Zellen, die das Molekül exprimieren, oder des davon isolierten 26 kD-TNF5 als lmmunogen. Das wird bevorzugt erreicht durch Einfügen der DNA-Sequenz aus pB11 in einen geeigneten Vektor, wie das Plasmid pFVXM, das bei American Type Culture Collection hinterlegt ist und die Hinterlegungsnr. 67,103 besitzt. uFVXM ist ein retroviraler Vektor, der von dem Plasmid pEVX abgeleitet wurde, beschrieben von Kriegler, et al., 1984, in Cell 38: 483. pEVX enthält eine Spleißdonorstelle 3' der 5'-langen terminalen Sequenzwiederholung, die von Moloney-Maus-Leukämievirus abgeleitet ist. Es wurde früher gezeigt, daß diese Spleißdonorsequenz die Ausbeute richtig gespleißter translationaler Matrizen retroviraler Konstrukte erniedrigt. Folglich wurde pEVX verändert, um die Spleißdonorstelle zu entfernen, und mit einem analogen Smal-Fragment des Harvey-Maus-Sarcomvirusgenoms ersetzt, dem die Spleißdonorsequenz des Moloney-Maus-Leukämievirus fehlt. Dem resultierenden Vektor, pFVXM, fehlt die Spleißdonorsequenz des Moloney-Maus- Leukämievirus, und er trägt eine virale Verpackungssequenz. pFVXM besitzt eine günstige PstI-Stelle, in die die DNA-Sequenz, die die 26 kD-TNF-Form codiert, eingefügt werden kann.
So werden pFVXM oder andere geeignete Vektoren in einen geeigneten Zelltyp transfiziert, zusammen mit einem Selektionsmarker, der die Selektion transfizierter Zellen, die TNF exprimieren, erleichtert. Der Marker kann mit einem zweiten Vektor eingeführt werden, wie zum Beispiel pEVX-neo. pEVX-neo wird von Kriegler, et al., 1984, in Cell, 38: 483 beschrieben. Die Transfektion kann mittels im Fachgebiet bekannter Methoden oder mittels einer Modifikation der Calciumphosphatmethode von Wigler, et al., 1978, Cell, 14: 725 durchgeführt werden. TNF-exprimierende Zellen werden in Medium, das mit einer geeigneten Konzentration an G418, erhältlich bei Gibco, ergänzt ist, selektiert. Ein wirksamer Weg, G418-resistente Kolonien, die TNF-Aktivität exprimieren, zu identifizieren, ist die Durchführung eines Lysistests mit L929-Zellen. Der Test wird im Detail in U. S. Patent Nr. 4,677,064 beschrieben.

B. Anti-26 kD-TNF-Antikörper:

Antikörper gegen 26 kD-TNF kann entweder polyclonal oder monoclonal sein. Der Antikörper ist bevorzugt menschlich oder humanisiert, obwohl nicht-menschlicher Antikörper zufriedenstellend wirkt.
Monoclonaler Antikörper kann unter Verwendung von TNF- Peptiden/Peptidkonjugaten, wie vorstehend beschrieben, oder 26 kD-TNF und mittels den von Köhler, G. und Milstein, C., 1975, Nature, 256: 495, oder im Fachgebiet bekannten Modifikationen davon beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Es ist wichtig zu bemerken, daß wenn 26 kD-TNF als Immunogen verwendet wird, eine Immunantwort nicht nur gegen einzig mit 26 kD-TNF assoziierte Epitope hervorgerufen wird, sondern auch gegen die reife oder 17 kD-Form. Unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Durchmusterungstests kann die Spezifität des hergestellten Antikörpers mit 26 kD-TNF als Immunogen ermittelt werden. Aufgrund dieser inherenten Limitation jedoch bei Verwendung von 26 kD-TNF ist das bevorzugte Immunogen ein TNF-Peptidkonjugat.
Die anfängliche Arbeit von Köhler und Milstein, siehe vorstehend, schloß die Fusion muriner Lymphocyten und Wirkstoff-selektierbarer Plasmozytome ein, um Hybridome herzustellen. Anschließend wurde die Technik angewendet, um hybride Zelllinien herzustellen, die menschliche monoclonale Antikörper sekretieren. Letztere Verfahren werden allgemein in Abrams, P., 1986, Methods in Enzy nology, 121: 107, beschrieben, aber andere Modifikationen sind dem Fachmann bekannt. Ungeachtet dessen, ob muriner oder menschlicher Antikörper hergestellt wird, werden die Antikörper-sekretierenden Zeilen mit dem Fusionspartner vereint, und die Zellen werden mit einem geeigneten Fusionsagens fusioniert, bevorzugt Polyethylenglycol, und stärker bevorzugt Polyethylenglycol 1000. Letzteres wird zu einem Zellpellet, das die Antikörper-sekretierenden Zellen und den Fusionspartner enthält, in kleinen Mengen über einen kurzen Zeitraum unter sanftem Schütteln hinzugegeben. Nach Zugabe des Fusionsagens wird das Zellgemisch gewaschen, um das Fusionsagens und alle Zelltrümmer zu entfernen, und das Zellgemisch, das aus fusionierten und nicht-fusionierten Zellen besteht, wird in geeignete Zellkulturkammern, die selektive Wachstumsmedien enthalten, geimpft. Nach einem Zeitraum von mehreren Wochen werden Hybridzellen sichtbar, und sie können auf Antikörperproduktion getestet - und subcloniert werden, um die Verfügbarkeit einer stabilen Hybridzelllinie sicherzustellen.
Der bevorzugte Antikörper ist menschlicher monoclonaler Antikörper, der aus mit 26 kD-TNF sensibilisierten Lymphocyten entweder in vivo oder in vitro durch Immortalisierung Antikörper-produzierender Hybridzelllinien hergestellt werden kann" wodurch eine ständige Quelle des gewünschten Antikörpers verfügbar wird. In vivo- Immunisierungstechniken sind im Fachgebiet gut bekannt, während in vitro-Techniken allgemein von Luben, R. und Mohler, M., 1980, Molecular Immunology 17: 635, Reading, C., Methods in Enzymology, 121 (Teil 1): 18, oder Voss, B., 1986, Methods in Enzymolo~y, 121: 27 beschrieben werden. Eine Reihe von in vitro-Immunisierungssystemen erwiesen sich als wirksam zur Sensibilisierung menschlicher B-Zellen. Reading, C., 1982, J. of Immun. Methods, 53: 261.
Es wird dem Fachmann offensichtlich sein, daß anstelle der Immunisierung von Individuen mit 26 kD-TNF direkt Lymphocyten aus Individuen isoliert werden können, die einem bakteriellen Angriff ausgesetzt sind oder ausgesetzt waren. Ein Teil dieser Lymphocyten kann gegen 2 G kD-TNF sensibilisiert sein und kann verwendet werden, um ständig Antikörper-sekretierende Hybridzelllinien herzustellen. Zum Beispiel sind immungeschwächte menschliche Patienten allgemein empfänglich für bakterielle Infektionen, insbesondere solche, die an verschiedenen Malignitäten, umfangreichen Verbrennungen, usw. leiden, und davon isolierte Lymphocyten können eine Quelle Antikörper-sekretierender Zellen sein.
Sensibilisierte Lymphocyten können durch virale Transformation immortalisiert werden. Die bevorzugte virale Transformationstechnik für menschliche Lymphocyten beinhaltet die Verwendung von Epstein-Barr-Virus. Das Virus kann menschliche B-Zellen transformieren und wurde verwendet, um menschliche monoclonale Antikörper zu erzeugen. Crawford, D. et al., 1983, J. of General Virologv, 64: 697; Kozbor, V. und Roder, J., 1983, J. Immun. Today, 4: 72.
Ein anderes Verfahren, mit dem sensibilisierte Lymphocyten immortalisiert werden können, besteht aus einer Kombination der obigen zwei Techniken, d. h. der viralen Transformation und der Zellfusion. Die bevorzugte Kombination besteht in der Transformation Antikörper-sekretierender Zellen mit Epstein-Barr-Virus und der anschließenden Fusion der transformierten Zellen mit einem geeigneten Fusionspartner. Der Fusionspartner kann eine Maus-Myelomzelllinie, eine Heteromyelomlinie oder eine menschliche Myelomlinie oder eine andere immortalisierte Zelllinie sein. PCT- Patentanmeldungsnr. 81/00957; Schlom et al., 1980, PNAS USA, 77: 6841; Croce et al., 1980, Nature, 288: 488. Der bevorzugte Fusionspartner ist ein Maus-Mensch-Heterohybrid, und stärker bevorzugt ist die Zelllinie mit der Bezeichnung FJB6. Diese Zelllinie ist bei American Type Culture Collection, Hinterlegungsnr. HB8785, hinterlegt. Sie wurde am 18. April 1985 hinterlegt. Die Verfahren zu Erzeugung von F3B6 werden in der Europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 174,204 beschrieben.
Techniken zur Verwendung der Epstein-Barr-Virustransformation und Produktion immortaler Antikörper-sekretierender Zelllinien werden von Roder, J. et al., 1986, Methods in Enzymology, 121: 140 dargestellt. Grundlegend besteht das Verfahren aus der Isolation von Epstein-Barr-Virus aus einer geeigneten Quelle, im allgemeinen eine infizierte Zelllinie, und dem Aussetzen der den Ziel-Antikörper-sekretierenden Zellen gegen Kulturüberstände, die das Virus enthalten. Die Zellen werden gewaschen und in einem geeigneten Zellkulturnedium kultiviert. Anschließend können in der Zellkultur vorhandene viral transformierte Zellen durch die Anwesenheit des Epstein-Barr-viralen nucleären Antigens identifiziert werden, und transformierte Antikörper-sekretierende Zellen können mittels im Fachgebiet bekannter Standardverfahren identifiziert werden.
Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß, obwohl die bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung die Neutralisierung von Anti-Konvertasemonoclonalem Antikörper, einzeln oder in Kombination, ist, der (die) Antikörper verändert werden kann (können) und die biologische Aktivität noch bewahrt (bewahren). Folglich ist innerhalb des Umfangs der Erfindung ein Antikörper einueschlossen, der durch Reduktion auf verschieden große Fragmente modifiziert ist, wie F(ab')&sub2;, Fab, Fv oder dergleichen. Auch können die Hybridzelllinien, die den Antikörper produzieren, als eine Quelle der DNA in Betracht gezogen werden, die den gewünschten Antikörper codiert und die isoliert und in Zellen übertragen werden kann mittels bekannter genetischer Techniken, um einen genetisch hergestellten Antikörper herzustellen. Ein Beispiel für letzteres wäre die Herstellung von einzelkettigem Antikörper, der die Antikörper-verbindende Stelle der Hybridome enthält, wie hier beschrieben. Einzelkettiger Antikörper ist in US. Patent, Nr. 4,704,692 beschrieben. Ein zweites Beispiel eines genetisch hergestellten Antikörpers ist rekombinanter oder chimärer Antikörper. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers werden gezeigt in dem U. S. Patent, Nr. 4,816,567, Erfinder Cabilly, et al.; in der Japanischen Patentanmeldung, Seriennr. 84169370, eingereicht am 15. August 1984; in der Britischen Patentanmeldung 8422238, eingereicht am 3. September 1984; und in der Japanischen Patentanmeldung, Nr. 85239543, eingereicht am 28. Oktober 1985. Auch die Britische Patentanmeldung Nr. 867679, eingereicht am 27. März 1986 beschreibt Verfahren zur Herstellung eines veränderten Antikörpers, in dem mindestens Teile der Komplementaritäts-bestimmenden Bereiche (CDRs) in den variablen Domänen der leichten und schweren Kette durch analoge Teile der CDRs eines Antikörpers unterschiedlicher Spezifität ersetzt wurden. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, rekombinanten Antikörper, bei dem der CDR-Bereich einer Art in den Antikörper einer zweiten Art eingebaut ist, dessen CDR-Bereich ersetzt wird, zu konstruieren. Eine bevorzugte Ausführung in diesem Fall ist ein CDR-Bereich eines murinen Anti-26 kD-TNF- Antikörpers, der den CDR-Bereich des menschlichen Antikörpers ersetzt.
Ungeachtet des Typs des Antikörpers, polyclonal oder monoclonal usw., ist es wünschenswert, den Antikörper mittels Standardtechniken zu reinigen, wie im Fachgebiet bekannt, oder wie von Springer, 1980, Monoclonal Antibodies, 194, Hrsg. Kennett, T. McKearn und K. Bechtol, Plenum Press, New York beschrieben. Allgemein besteht dies aus mindestens einer Ammoniumsulfatpräzipitation des Antikörpers mit einer 50% Ammoniumsulfat-lösung. Antikörper-Affinitätssäulen können auch verwendet werden.

C. Screening des Anti-26 kD-TNF-Antikörpers:

Zelilinien, die Anti-26 kD-TNF-Antikörper sekretieren, der die Spaltung des Moleküls in niedermolekulare Formen von TNF verhindert oder behindert, können durch Testen von Kulturüberständen, Aszitesflüssigkeiten usw. auf den Antikörper identifiziert werden. Das bevorzugte Durchmusterungsverfahren besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Zuerst werden die Hybridome, die Anti-26 kD-TNF-Antikörper sekretieren, identifiziert; und zweitens wird der Antikörper getestet, um zu bestimmen, ob er spaltstellenspezifisch ist. Wenn er für Zellkulturüberstände verwendet wird, wird der anfängliche Durchmusterungsschritt vorzugsweise mittels eines ELISA-Tests durchgeführt. Der ELISA-Test ist im Fachgebiet bekannt und besteht in der Bindung von 26 kD-TNF an eine feste Matrix und dem Nachweis der Anwesenheit des Antikörpers durch Bindung an das 26 kD-Molekül. Langone, J. und Van Vinakis, H., Methods of Enzymology, 92, Teil E (1983). Da dies jedoch nicht Antikörper, der nur gegen 26 kD-TNF oder die 17 kD-Form gerichtet ist, unterscheidet, ist ein alternativer erster Schritt die Bindung von TNF- Peptidkonjugaten an eine feste Matrix und die Durchmusterung auf die Konjugate oder das Verfolgen eines positiven ELISA-Ergebnisses mit einem nachstehend beschriebenen Immunpräzipitationstest.
Ein zusätzlicher anfänglicher Test auf den 26 kD-TNF-Antikörper ist die Durchmusterung von Antikörpern auf ihre Fähigkeit, differentiell mit 26 kD- und 17 kD- TNF aus einer homogenen Phase zu immunpräzipitieren. Zum Beispiel wird Überstand, der die zu durchmusternden monoclonalen Antikörper enthält, mit markiertem 26 kD- oder 17 kD-TNF für eine geeignete Zeit inkubiert, um Antigen/Antikörper-Komplex-Bildung zu erlauben. Nach dieser Inkubation werden die monoclonalen Antikörper mit antixenotypischen oder antiisotypischen Antikörpern, die für den durchmusterten monoclonalen Antikörper spezifisch sind, inkubiert. Diese anti-xenotypischen oder antiisotypischen Antikörper werden immobilisiert, zum Beispiel, auf einem Plastikkügelchen. Zum Beispiel wird, wenn der durchmusterte monoclonale Antikörper Anti-26 kD-TNF ist, markiertes 26 kD-TNF an das Kügelchen gebunden und dadurch immunpräzipitiert. Das Material kann von dem Kügelchen mittels Standardtechniken dissoziiert und als 26 kD-TNF mittels Gelelektrophorese identifiziert werden, wie im Fachgebiet bekannt ist.
Um zu bestimmen, ob der 26 kD-TNE-Antikörper spaltstellenspezifisch ist, wird die Fähigkeit des Antikörpers, die Umwandlung des 26 kD-Moleküls in niedermolekulare Formen zu verhindern oder zu verlangsamen, kontrolliert. Dieser Test wird bevorzugt durch Inkubation von 26 kD-TNF mit einer Quelle von Konvertase-Aktivität und des zu testenden Antikörpers ausgeführt. Das 26 kD-Molekül wird derart markiert, daß seine Umwandlung oder Nicht-Umwandlung, wie es der Fall sein kann, kontrolliert werden kann. Es wird vom Fachmann verstanden werden, daß Antikörper dem Reaktionsgemisch vor oder nach Zugabe der Konvertase zugegeben werden kann. Die Reihenfolge der Zugabe kann die Identifikation der Suche nach dem Antikörper erleichtern, aber sie ist nicht bestimmend. Wenn ein Antikörper hemmende Aktivität besitzt und die Spaltung des 26 kD-Moleküls verhindert, kann das durch elektrophoretische Analyse der Lösung erkannt werden, die eine geringe oder keine Umwandlung der 26 kD-Form zeigen wird und daneben wenige oder keine niedermolekularen TNF-Moleküle.
Um den Test zu beschleunigen, können mehrere Kulturüberstände vereint und gleichzeitig getestet werden. Wenn das Gemisch positiv ist, können Medien jeder Vertiefung aufeinanderfolgend unabhängig getestet werden, um die Hybridome zu identifizieren, die spaltstellenspezifischen Anti-TNF-Antikörper sekretieren.
Eine Vielfalt biologischer Materialien sind als Quellen von Konvertase-Aktivität verfügbar. Diese schließen Gewebe, Zellen, Extrakte oder damit assoziierte Flüssigkeiten ein, die vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, immunologischen Ursprungs sind. Darüberhinaus können auch etablierte Zellinien verwendet werden. Geeignete Quellen würden menschliche periphere mononucleäre Blutzellen einschließen, wie Leukocyten oder Zelllinien leukocytären Ursprungs, wie die HL60-Zelllinie. Folglich kann die Umwandlung der 26 kD-TNF-Form in die 17 kD-Form durch Vereinigung der 26 kD-Form mit entweder intakten HL60-Zellen oder Extrakten davon beeinflußt werden. Darüberhinaus ist es möglich, da die Konvertase-Aktivität teilweise membranassozüert ist, eine Membranfraktion zu erhalten, die verwendet werden kann.

II. Immuntest

In einer anderen Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf einen Immuntest, der verwendet werden kann, um 26 kD-TNF nachzuweisen, der wiederum anschließend verwendet werden kann, um das Verhältnis von 26 kD-TNF zu 17 kD-TNF oder niedermolekularen Formen von TNF zu bestimmen. Die nachweisbaren Konzentrationen werden im Bereich von etwa 1 ng/ml bis etwa 1 ug/ml jeder Form von TNF liegen. Der Immuntest der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Sandwichtest unter Verwendung der hier offenbarten Antikörper, obwohl andere im Fachgebiet bekannte Testformate auch verwendet werden können.
Bei der Durchführung des Immuntestverfahrens der vorliegenden Erfindung werden Anti-TNF-Antikörper, die gegen die 26 kD- oder 17 kD-Formen von TNF gerichtet sind, immobilisiert und dann mit der Flüssigkeitsprobe, die unbekannte Konzentrationen dieser TNF-Moleküle enthält, inkubiert. Nach einem geeigneten Zeitraum der Inkubation zur Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen, wird der immobilisierte Antikörper mit einer Indikatorlösung inkubiert, die einen zweiten Anti-TNF-Antikörper enthält, entweder monoclonal oder polyclonal, der markiert wurde. Dieser zweite Anti-TNF-Antikörper wird mit immobilisiertem Antikörper für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, um die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zwischen dem markierten Antikörper und jedem von dem immobilisierten monoclonalen Antikörper gebundenen TNF zu erlauben. Nach dieser Inkubation wird der immobilisierte monoclonale Antikörper von jedem ungebundenen markierten Antikörper getrennt, und die Menge an Markierung, die an dem immobilisierten Antikörper gebunden bleibt, wird gemessen. Das wird normalerweise durch Messung eines Signals, das im Verhältnis mit der Menge an Markieruüg am immobilisierten. Antikörper steht, durchgeführt. Das Signal ermöglicht daher eine Messung der Menge an INF in der Flüssigkeitsprobe.
Die 26 kD- und die 17 kD-Formen können gleichzeitig in der gleichen Flüssigkeit oder getrennt unter Verwendung verschiedener Aliquots der gleichen Flüssigkeit gemessen werden. Wenn sie gleichzeitig gemessen werden, darf der 26 kD- und 17 kD-Antikörper nicht kreuzblockieren, und darüberhinaus stammt der 26 kD- und 17 kD-Antikörper vorzugsweise aus verschiedenen Arten, so daß der Nachweis mit einem zweiten Anti-TNF- Antikörper durchgeführt werden kann, der nicht kreuzreagiert. Die bevorzugte Kombination ist die Messung von 26 kD-TNF mit einem monoclonalen Maus-Antikörper und von 17 kD- TNF mit einem Kaninchen-Antikörper und der Nachweis dieser mit differentiell markiertem zweitem Maus- beziehungsweise Kaninchen-Antikörper. 17 kD-Kaninchen-TNF- Antikörper ist im Fachgebiet bekannt und leicht verfügbar.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper können auf jedem geeigneten festen Testträger durch jede geeignete Technik immobilisiert werden. Der feste Testträger kann jedes geeignete unlösliche Trägermaterial zur Bindung der Antikörper und für Immuntests sein. Viele solche Materialien sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Nitrocelluloseblätter oder -filter; Agarose-, Harz-, Plastik- (z. B. PVC oder Polystyrol), Latex- oder Metallkügelchen; Plastikgefäße; und dergleichen. Viele Verfahren der Immobilisierung von Antikörpern sind auch im Fachgebiet bekannt. Siehe, z. B., Silman et al. (1966), Ann. Rev. Biochem. 35: 873; Melrose (1971) Rev. Pure & App. Chem. 21: 83; Cuatrecaas et al. (1971) Meth. Enzym., Bd. 22. Solche Verfahren schließen kovalentes Koppeln, direkte Adsorption, physikalischen Einschluß und Anheften an eine Protein-beschichtete Oberfläche ein. In letzterem Verfahren wird die Oberfläche zuerst mit einem wasserunlöslichen Protein, wie Zein, Collagen, Fibrinogen, Keratin, Glutelin, usw., beschichtet. Der Antikörper wird einfach durch Inkontaktbringen der Protein-beschichteten Oberfläche mit einer wäßrigen Lösung des Antikörpers und Trocknung angeheftet.
Jede Kombination von Träger und Bindungstechnik, die den Antikörper immunreaktiv erhält, den Antikörper jedoch noch genug immobilisiert, so daß er mit jedem gebundenen Antigen während des Waschens zurückgehalten werden kann, kann in der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Ein bevorzugter fester Testträger ist ein Plastikkügelchen.
Wie oben diskutiert verwendet der Test der vorliegenden Erfindung einen markierten Anti-TNF-Antikörper, um die Menge an von dem immobilisierten monoclonalen Antikörper gebundenem TNF zu messen. Die Markierung kann von jeder Art sein, die den Nachweis des Antikörpers erlaubt, wenn er an einen Träger gebunden ist. Allgemein resultiert die Markierung direkt oder indirekt in einem Signal, das meßbar ist und mit der Menge an in der Probe vorhandener Markierung zusammenhängt. Zum Beispiel können direkt meßbare Markierungen radioaktive Markierungen einschließen (z. B. ¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, usw.). Eine bevorzugte direkt meßbare Markierung ist ein Enzym, gebunden an den Anti-TNF- Antikörper, das eine Farbreaktion in Gegenwart des geeigneten Substrats erzeugt (z. B. Meerrettich-Peroxidase/o-Phenylendiamin). Ein Beispiel einer indirekt meßbaren Markierung wäre ein Anti-TNF-Antikörper, der biotinyliert wurde. Die Anwesenheit dieser Markierung wird durch lnkontaktbringen mit einer Lösung, die einen markierten Avidin- Komplex enthält, gemessen, wobei das Avidin an den biotinylierten Antikörper bindet. Die mit Avidin assoziierte Markierung wird dann gemessen. Ein bevorzugtes Beispiel einer indirekten Markierung ist das AvidinlBiotin-System, das ein Enzym verwendet, das an Avidin gebunden ist, wobei das Enzym eine Farbreaktion wie oben beschrieben erzeugt. Es soll jedoch so verstanden werden, daß der Begriff "Markierung" in seiner breitesten Bedeutung verwendet wird und, zum Beispiel, die Anwendung "markierter" Anti-TNF- Antikörper einschließen kann, wobei die Markierung sich xenotypisch oder isotypisch zu dem immobilisierten Anti-TNF-Antikörper unterscheidet, so daß die Anwesenheit "markierter" Antikörper durch Inkubation mit einem anti-xenotypischen oder antiisotypischen Antikörper, der direkt eine nachweisbare Markierung trägt, nachweisbar ist.
Welche Markierung auch immer selektiert wird, sie resultiert in einem Signal, das gemessen werden kann und mit der Menge an Markierung in einer Probe zusammenhängt. Übliche Signale sind Strahlungsmengen (wenn Radioisotope verwendet werden), optische Dichte (z. B. wenn Enzymfarbreaktionen verwendet werden) und Fluoreszenz (wenn Fluoreszenzverbindungen verwendet werden). Es wird bevorzugt, ein nichtradioaktives Signal zu verwenden, wie optische Dichte (oder Farbintensität), die durch eine Enzymreaktion hervorgerufen wird. Zahlreiche Enzym/Substrat-Kombinationen, die ein geeignetes Signal hervornrfen können, sind im lmmuntestfachgebiet bekannt. Siehe, z. B., U.5. Patent Nr. 4,323,647 & 4,190,496, deren Offenbarungen hier enthalten sind.
Nach Beschreibung der von den Anmeldern angenommenen Bedeutung ihrer Erfindung werden die folgenden Beispiele aufgeführt, um die Erfindung zu veranschaulichen, und sie sollen nicht aufgefaßt werden, den Rahmen der Erfindung einzuschränken. Zum Beispiel, Variation in der Quelle, dem Typ oder dem Verfahren der Produktion der Antikörper; verschiedene Markierungen und/oder Signale; Testträger aus verschiedenen Materialien und Formen; verschiedene Immobilisierungsverfahren; und verschiedene Arten von TNF können verwendet werden, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiel I

Herstellung von 26 kD-TNF- oder TNF-Peptid-Immunogenen

A. Membranfraktion

Der Vektor pFVXM, hinterlegt bei American Type Culture Collection, Hinterlegungsnr. 67,103, wurde verwendet, um den Vektor pFVXM-TNF6 herzustellen, der die DNA-Sequenz, die die 26 kD-TNF-Form codiert, enthält. Der Vektor wurde wiederum verwendet, um eine Zelllinie zu transfizieren, aus der eine Membranfraktion isoliert und als eine Quelle von 26 kD-TNF verwendet werden kann.
Um den Vektor pFVXM-TNF6 herzustellen, wurde das Plasmid B11, das die cDNA- Sequenz, die die 26 kD-TNF-Form codiert, enthält, mit PstI behandelt, das die codierende Sequenz herausschneidet. Das Fragment wurde mittels elektropioretischen Standardtechniken gereinigt. Als nächstes wurde der Vektor pFVXM mit Pst1 behandelt, und das PstI-Fragment aus pB 11, das die 26 kD codierende Sequenz enthält, wurde in den Polylinkerbereich des Vektors mittels Standardtechniken eingefügt, wie vorstehend beschrieben, um pFVX-TNF6 herzustellen.
pFVXM und das Plasmid pB1 1 wurden beide in dem E. coli Stamm HB101 amplifiziert. Die Ligierung der Fragmente wurde unter Standardbedingungen durchgeführt. Plasmid-DNA wurde nach dem Ligierungsverfahren isoliert, und die richtige Orientierung der TNF-codierenden Sequenzen wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt.
Plasmid-DNA wurde nach der Methode von Birnboim und Doly hergestellt, wie in Nucleic Acid Research, 7: 1513 (1979) beschrieben. Die Plasmid-DNA ist im Cäsiumchlorid in zwei Banden vorhanden, und sie wurde ausgiebig gegen TE-Puffer dialysiert, der aus 10 mM Tris, pH 8.0 und 1 mM EDTA besteht.
pFVXM-TNF6 wurde in psi AM-Zellen transfiziert, um eine Zelllinie herzustellen, genannt TNF6.8, die die 26 kD-TNF-Form exprimiert. pFVXM-TNF6 wurde gemeinsam mit einem zweiten Vektor, pEVX-neo, transfiziert, der die Selektion transfizierter Zellen, die TNF exprimieren, erleichtert. uEVX-neo wird von Kriegler, et al., 1984, Cell, 38: 483 beschrieben. Die Transfektion wurde mit einer Modifikation der Calciumphosphatmethode von Wigler, et al., 1978, Cell, 14: 725, durchgeführt. Kurz gesagt wurden 10 ug Träger- DNA, verdünnt mit sterilem 1 mM Tris, pH 8.1, 0.1 mM EDTA, zusammen mit Plasmid- DNA, 50-1,000 ng pro 100 mm-Petrischale zu 100 mm-Petrischalen hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 2.5 M CaCl&sub2;. Dieses Gemisch wurde gründlich geschüttelt, um eine einheitliche Suspension zu garantieren, und ein äquivalentes Volumen 2x HEPES (N-2- hydroxyethyldiperazin N'-2-ethansulfonsäure)-gepufferte Salzlösung, pH 7.1, wurde zugefügt. Das Gemisch wurde auch geschüttelt, um eine einheitliche Suspension zu garantieren, wonach die Bildung eines Präzipitats stattfand. 30 Minuten später wurde 1 ml der Suspension zu psi AM-Zellen in 100 mm-Petrischalen, die 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, enthielten, zugefügt. Die Kulturen wurden bei 37ºC 16 Stunden inkubiert, und anschließend wurde das Medium durch frisches Wachstumsmedium ersetzt. Als nächstes wurde das Wachstumsmedium wieder durch frisches Medium, aber ergänzt mit 400 ug/ml G418 von Gibco ersetzt.
Um die G418-resistenten Kolonien, die TNF-Aktivität exprimieren, zu identifizieren, wurden die Kulturschalen mit L929-Zellen in einer Dichte von etwa 7.3x 10&supmin;&sup4; Zellen/cm² überschichtet. Nachdem die Zellen angeheftet waren, wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen wurden mit DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0.9% Noble-Agar, überschichtet. Nach Inkubation für 18-24 Stunden wurden Clone, die von einer lysierten Zone von L929-Zellen umgeben waren, mittels Standardclonierungszylinder isoliert und zu einer Großkultur expandiert. Der Test auf TNF unter Verwendung von L929-Zellen wird im Detail in dem U. S. Patent Nr. 4,677,064 beschrieben. Ein Clon, TNF6.8, produzierte 26 kD- TNF. Die 26 kD-TNF-Form kann aus dieser Zelllinie in Membranform isoliert und als Immunogen verwendet werden.
Eine Membranfraktion wird aus TNF6.8-Zellen hergestellt, was die Zellernte von fünf subkonfluenten 100 mm-Petrischalen beinhaltet. Vor der Zellernte werden sie mit einem Puffer gespült, der einen Proteaseinhibitor enthält und aus 10 mM KPO&sub4;, pH 7.0, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid besteht. Die Lösung wird von den Zellen entfernt, und die Zellen werden in ein 1.5 ml-Eppendorf-Mikrozentrifugengefäß abgeschabt, und die Zellen werden mit einem Ultraschall-Zellenaufbruchgerät behandelt. Dieses Lysat wird dann bei 1,000 xg für 20 Minuten zentrifugiert, und der Überstand S-1 behalten. Der S-1-Überstand wird bei 30,000 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet und der Überstand, S-3- Überstand, die Membranmaterial beziehungsweise Cytosolfraktion enthalten, werden aufbewahrt. Die Membranfraktion wird wie nachstehend beschrieben verwendet, umMäuse zu immunisieren.

B. Peptidkonjugate

Peptide, die die Spaltstelle(n) von 26 kD-TNF enthalten, werden unter Verwendung der Festphasenmethode, detaillierter beschrieben in Merrifield R. B. (1985), Sci., 232 : 341- 347, mit einer Biosearch 9500 automatisierten Peptidmaschine synthetisiert, mit Hydrogenfluorid gespalten und mittels präparativer HPLC unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000-Instruments auf einer 15-20 um-Vydac C4 PrepPAK-Säule gereinigt. Die folgenden Peptide wurden synthetisiert:
Vor der Verwendung der Peptide, um Antikörper herzustellen, wurden sie an ein geeignetes Trägermolekül angeheftet, um das Hervorrufen einer Antikörperantwort zu verstärken. Diese Verfahren werden in U. S. Patent Nr. 4,762,706, Erfinder McCormick et al. beschrieben. Geeignete Träger sind KLH ("keyhole limpet hemocyanin") oder Rinderserumalbumin (BSA). Die Konjugation wird über Sulfhydrylgruppen eines Cysteinrestes erreicht, der zum amino- oder carboxylterminalen Ende der Peptide hinzugefügt wird. Ein heterobifunktionales Crosslinking-Reagens, N-maleimido-6- aminocaproylester des 1-Hydroxy-2-nitro-benzol-4-sulfonsäurenatriumsalzes, wird mit dem folgenden Verfahren hergestellt.
Ein einmolares Äquivalent (2.24 g) 4-Hydroxy-3-nitro-benzolsulfonsäurenatriumsalz (HNSA) wird mit einem einmolaren Äquivalent (2.06 g) Dicyclohexylcarbodümid und einem einmolaren Äquivalent (2.10 g) N-maleimido-6- aminocapronsäure in 25 ml Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur über Nacht gemischt. Ein weißes Präzipitat aus Dicyclohexylharnstoff bildet sich. Das Präzipitat wird filtriert, und 300 ml Diethylether werden zu der Mutterflüssigkeit zugegeben. Nach etwa 10 Minuten bis 4 Stunden bildete sich ein zäher Feststoft der aus der Mutterflüssigkeit - präzipitiert wurde. Dieser Feststoff enthält 58% aktiven HNSA-Ester und 42% freies HNSA.
Die Analyse besteht aus der Auflösung einer kleinen Menge des Präzipitats in Phosphatpuffer bei pH 7.0 und der Messung der Absorption bei 406 nm; diese Ablesung liefert die Menge an nicht umgesetztem freiem HNSA, die das verunreinigende Material in der HNSA-Ester-Präparation ist. Zugabe sehr kleiner Mengen konzentrierter starker Base (wie 5 N NaOH) hydrolysiert sofort den gebildeten Ester, und ein zweites Ablesen wird vorgenommen. Der Abzug des ersten Wertes von dem zweiten ergab die Menge an Ester im Originalmaterial. Der Feststoff wird dann in DMF aufgelöst und auf eine LH20- Sephadexsäule aufgebracht und mit DMF eluiert, so daß der Ester von dem verunreinigenden, freien HNSA abgetrennt wird. Der Vorgang der Reinigung wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von eluierenden Lösungsmitteln aus Chloroform, Aceton und Essigsäure (6 : 3 : 1 Vol/Vol) kontrolliert. Das Produkt wird eindeutig als mal-sac-HNSA-Ester durch seine Realaivität mit Amin identifiziert. Die Ausbeute an reinem Ester wird auf ungefähr 30% der theoretischen Menge geschätzt; das gereinigte Material besteht aus 99% Ester.
Der so erhaltene Ester wird als vollständig in Wasser löslich befunden und ist in Wasser stabil für mehrere Stunden, vorausgesetzt es werden keine Nucleophile zugegeben. Bei Zugabe zu 1 N Ammoniak erzeiegt der Ester das entsprechende Amid mit einem zur freien Säure hydrolysierten Teil. Der gereinigte Ester wird als stabil für längere Zeiträume befunden, wenn er trocken gelagert wird.
Etwa 0.5 mg des gereinigten mal-sac-HNSA-Esters werden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Ein 10 ul-Aliquot dieser Lösung wird in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer bei pH 7.0 verdünnt. Die Absorption bei 406 nm wird verwendet, um die Konzentration an freiem HNSA wie vorstehend beschrieben zu berechnen. Wenn 50 ul 4.8 N
Natriumhydroxidlösung zu dem verdünnten Aliquot des Esters zugegeben und gemischt werden, steigt die Absorption der Lösung bei 406 nm signifikant, was andeutet, daß das Hydroxidnucleophil den Ester schnell zu den Bestandteilen Säure und freies HNSA-Anion hydrolysiert.
Der Unterschied zwischen der postbasischen und der anfänglich freien HNSA- Konzentration stellt die Konzentration an Ester dar. Aus der tatsächlichen Konzentration an Ester und Proteinaminogruppen kann die Menge an Ester errechnet werden, die zu der Proteinlösung zugegeben werden muß, um den gewünschten Grad an Substitution zu erreichen.
Der gereinigte HNSA-Ester wird dann mit BSA zur Reaktion wie folgt gebracht (die Reaktion mit KLH ist ähnlich zu diesem Vorgang):
Eine Gesamtmenge von 22 mg (20 uMol) BSA (des Molekulargewichts 66,296) wird in 2.0 ml 0.1 M Phosphatpuffer bei pH 7.5 gelöst, um eine Gesamtaminkonzentration von 1.0 · 102 Mol pro Liter zu ergeben (unter der Annahme von 59 Lysinen BSA-Molekül). Eine berechnete Menge (11 mg, 2.35x 10&supmin;&sup5; Mol) des vorstehend hergestellten mal-sac- HNSA-Esters (97.7% rein) in Puderform wird in 2.0 ml BSA-Lösung gelöst. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur durchgeführt. 10 ul-Aliquots werden nach bestimmten Zeiträumen aus der Lösung entnommen, und jedes wird in 1.0 ml 0.01 M Phosphatpuffer bei pH 7.0 verdünnt. Das Spektrum von jedem verdünnten Aliquot wird mit einem Hewlett- Packard-Spektrophotometer aufgenommen, und die Absorption bei 406 nm gemessen. Eine Gesamtmenge von 50 ul 4.8 N NaOH wird dann zu jedem Aliquot zugegeben, jedes Aliquot wird gemischt und sein Spektrum wieder aufgenommen, und die Absorption bei 406 nm gemessen.
Aus der Absorption bei 406 nm vor und nach der Zugabe der Base werden die Konzentration des zurückbleibenden Esters und der Prozentsatz des reagierenden Esters für die Reaktionsgemische bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Reaktionsrate im wesentlichen linear ist über einen 15minütigen Zeitraum.
Nach 15 Minuten Reaktionszeit wird die Reaktion durch Auftragen des Reaktionsgemisches auf eine PD10 entsalzende Sephadex G-25-Säule (Pharmacia, Inc.), äquilibriert mit 0.1 M Phosphatpuffer bei pH 6.0, gestoppt. Es ergibt sich, daß 2.6 · 10&supmin;³ Moll des Esters reagieren, und so 25.9% der 59 Epsilon-Aminogruppen von BSA vermutlich substituiert werden. Folglich enthält das Produkt 16 mal-sac-Gruppen pro Molekül.
Das Produkt der ersten Reaktion, mal-sac-BSA (oder mal-sac-KLH), wird durch Auftragen des Reaktionsgemisches auf eine PD 10 entsalzende Sephadex G-25-Säule, äquilibriert mit 0.1 M Phosphatpuffer bei pH 6.0, isoliert. Die Säule wird mit 0.1 M Phosphatpuffer in 1.0 ml-Fraktionen eluiert. Die Säulenelution wird durch Kontrolle des Absorptionsspektrums verfolgt, und Gipfelfraktionen, die das mal-sac-BSA enthalten, werden vereint. Die wie vorstehend beschrieben synthetisierten TNF-Peptide werden zugegeben, und das vereinte Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Konjugate werden einer ausgiebigen Dialyse gegen destilliertes Wasser und der Lyophilisation unterzogen, und in einigen Fällen auf Veränderungen in der Aminosäurezusammensetzung untersucht. Diese TNF-Peptidkonjugate können verwendet werden, um Tiere oder Lymphocyten in vitro zu immunisieren, um Anti-26 kD-TNF- Antikörper zu produzieren.

Beispiel II

Immunisierung mit 26 kD-TNF oder Peptidimmunogenen / Herstellung von Hybridomen

A. Muriner monoclonaler Antikörper

Das Folgende beschreibt die Immunisierung von Mäusen mit 26 kD-TNF oder TNF- Peptidimmunogenen mit dem Ziel, immunisierte Lymphocyten zu isolieren und murine Hybridome herzustellen. Allgemein wird nach den in den folgenden Referenzen beschriebenen Vrerfahren vorgegangen. Shulman et al. (1978) Nature 276: 269; Oi et al. in Selected Methods in Cellular Immunology, S. 351 (Mischell & Schiigi, Hrsg. 1980). Foung et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7484. Die allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die monoclonale Antikörper umfassen, einschließlich der Zelllinien, die solche Zusammensetzungen produzieren, sind im Fachgebiet sehr gut bekannt. Vgl. z. B. Gerhard et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 15 10; Monoclonal Antibodies (R. Kennett, T. McKearn & K. Bechtol, Hrsg. 1980); Schreier et al., Hybridoma Technigues (1980); Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (G. Hammerling, U. Hammerling& J. Kearney, Hrsg. 198 l); Kozbor et al. (L 982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6651; Jonak et al. (1983) Hybridoma 2: 124; Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines (R. Kennett, K. Bechtol & T. McKearn, Hrsg. 1983); Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4: 72-79; Shulman et al. (1982) Nature 276: 269-270; Oi et al., in Selected Methods and Cellular Immunology, S. 35 1-371 (8. Mischell & S. Schiigi, Hrsg. 1980); Foung et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7484-7488.
Kurz gesagt werden BALB/c-Mäuse mit S mg Membranmaterial, das wie in Beispiel 1 isoliert wurde, oder 0.5 mg TNF-.Peptiden pro Maus in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) intraperitoneal (LP.) oder intravenös (I.V.) zweimal mit 3 Wochen Abstand immunisiert und I.V. in die Schwanzvene mit 0.1 mg in PBS drei Tage vor der Fusion nachimmunisiert. Drei Tage nach der I.V.-Nachimmunisierung werden die Mäuse getötet, ihre Milz wird entfernt, und die Milzzellen werden isoliert und mit einer immortalisierten, mit einem Wirkstoff selektierbaren Myelornpartnerzelllinie fusioniert. Zahlreiche solche Myelomzelllinien sind im Fachgebiet bekannt, von denen die meisten nicht in HATergänztem Zellkulturmedium wachsen können. Eine typische Myelomzelllinie ist SP-2/OAg 14. Folglich werden die Hybridome durch Vereinigung von Milzzellen und Myelomzellen in einem 5 : 1-Verhältnis gebildet, das im allgemeinen aus 2 · 106 Myelomzellen zu 1 · 10 Milzzellen besteht. Das Zellgemisch wird pelletiert, die Medien werden entfernt, und die Fusion wird durch die tropfenweise Zugabe von 1.0 ml 40% (Vol./Vol.) Polyethylenglycol 1500-Lösung über 60 Sekunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 60 Sekunden- Inkubation bei 37ºC bewirkt. Zur Zellsuspension werden unter sanftem Schütteln 9 ml Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium über 5 Minuten zugegeben. Zellklumpen im Gemisch werden sanft resuspendiert, die Zellen gewaschen, um jedes restliche PEG zu entfernen, und in Mikroliter-Platten zu etwa 2 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, ausplattiert. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit einer 2xLösung von Hypoxanthin- und Azaserin-Selektionsmedium versetzt. Etwa zwei bis drei Wochen später sind lebensfähige Hybridomkolonien sichtbar, und das Medium wird auf Antikörper durchmustert, wie nachstehend beschrieben. Aszitesflüssigkeit, die Antikörper enthält, kann mit Pristan-sensibilisierten Mäusen hergestellt und gereinigt werden, wie es im Fachgebiet bekannt ist.

B. Menschliche Hybridome/Menschlicher Monoclonaler Antikörper

Periphere Blutlymphocyten werden aus septischen Patienten isoliert und dann mit Epstein-Barr-Virus infiziert und die infizierten Lymphocyten durch Fusion mit einer selektierbaren Myelomzelllinie immortalisiert und die so geschaffenen Hybridzelllinien isoliert und auf Antikörperproduktion charakterisiert.
Genauer gesagt werden mononucleare Zellen auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia) vereinzelt und Monocyten aus dem Gemisch durch Anheften an Plastik entfernt.
Standardlabortechniken wurden verwendet, um diese Verfahren auszuführen. Als nächstes wurden nichtadhärente Zellen auf Antikörper-Produzenten durch Antigen-spezifisches Panning angereichert. Panning ist eine allgemein im Fachgebiet bekannte Technik, und sie beinhaltet die Inkubation einer Population Antikörper-sekretierender Zellen auf einer Plastikoberfläche, die mit dem geeigneten Antigen beschichtet ist, in diesem Fall TNF- Peptide oder 26 kD-TNF, produziert wie in Beispiel I beschrieben durch Isolation einer Membranfraktion aus 26 kD-exprimierenden Zellen. Die Zellen, die Antikörper auf ihrer Oberfläche exprimieren, binden Antigen, und heften folglich an der Plastikoberfläche, während Zellen, die keinen Zelloberflächenantikörper exprimieren, sich nicht anheften und durch Waschen entfernt werden können. Folglich werden spezifischen Antikörper sekretierende Zellen durch diese Technik angereichert.
Genauer gesagt werden Platten mit 6 Vertiefungen (Costar) mit einer Membranfraktion der Zelllinie TNF6.8, die 26 kD-TNF exprimiert, beschichtet. 150 ug des Membranmaterials werden pro Vertiefung in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 4ºC über Nacht zur Beschichtung verwendet. Die Vertiefungen werden nach dem Inkubationszeitraum über Nacht mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthält, für mindestens 1 Stunde bei 4ºC blockiert und anschließend mit Phosphat-gepufferter Salzlösung/BSA gewaschen. Als nächstes werden 10' Lymphocyten in 1 ml PBS/BSA zu jeder Vertiefung der Platten mit 6 Vertiefungen zugegeben. Die Lymphocyten werden 70 Minuten auf den Platten inkubiert, wonach alle nichtadhärenten Zellen durch Absaugen entfernt werden. Die adhärenten Zellen werden mit Zellkulturmedium (IMDM, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), das 10% fötales Kälberserum enthält, inkubiert.
Die adhärenten Zellen werden der Epstein-Barr-Virus-Transformation durch Zugabe einer äquivalenten Menge an Kulturmedium, das von der Züchtung der Epstein-Barr-Virusinfizierten Marmoset-Zelllinie B9S-8, die somit das Virus enthält, erhalten wurde, zu dem Medium, in dem sich die adhärenten Zellen befinden, unterworfen. Die Zellen wurden in dieser Umgebung 3 Stunden bei 37ºC gezüchtet, und auf diese Weise werden die Lymphocyten in der adhärenten Zellpopulation der Epstein-Barr-Virus-Infektion unterworfen. Folgend auf den lnfektionszeitraum werden die Zellen gewaschen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von etwa 10&sup4;-10&sup5; Zellen/Vertiefung in IMDM-Medium, plus 10% fötalem Kälberserum und 30% konditioniertem Medium, ausplattiert. Letzteres stammt von einer Lymphoblastoidzelllinie, bevorzugt JWS. Das Medium enthält auch 5 · 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol, 50 ug/ml Gentamycinsulfat (Sigma) und 600 ng/ml Cyclosporin A (Sandimmune, Sandoz, Basel, Schweiz).
Nach etwa 14 bis 21 Tagen Inkubation werden die Zellkulturüberstände vereint und auf 26 kD-TNF-Bindungsaktivität wie untenstehend beschrieben getestet. Positive Hybridome werden in geringer Dichte subkultiviert, nochmals auf Aktivität getestet und wachsen gelassen und mit der Zelllinie F3B6 unter Verwendung von Polyethylenglycol und der im Fachgebiet bekannten Plattenfusionstechnik fusioniert. Die letztere Technik wird von Larrick, J. W. (1985), in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, E. G. Engleman, S. K. H. Foung, J. W. Larrick und A. A. Raubitschek, Herausgeber, Plenum Press, New York, Seite 446 beschrieben. F3B6 ist eine Heteromyelomzelllinie, die in ihrem Wachstum in Medien, die 100 uM Hypoxanthin, 5 ug/ml Azaserin und 5 uM Ouabain enthalten, sensitiv ist. Zuletzt werden die resultierenden Hybride nochmals durchmustert, um sicherzustellen, daß sie Anti-26 kD-TNF-Antikörper produzieren.
Das Medium aus den Gewebekulturplattenvertiefungen, die entweder murine oder menschliche Hybridome enthalten, oder Aszitesflüssigkeit, die murine Antikörper enthält, wird auf Anti-26 kD-TNF-Antikörper durchmustert, und insbesondere auf Antikörper, der spaltstellenspezifisch ist, wie im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel 111

Identifikation des Spaltstellen-blockierenden Antikörpers

Das Medium wird anfänglich auf Antikörper gegen 26 kD-TNF durchmustert, und Antikörper, der 26 kD-TNF bindet, wird weiter getestet, um zu bestimmen, ob er die proteolytische Spaltung des Prohormons blockieren kann.
Eine Membranfraktion, die 26 kD-TNF enthält, kann aus der Zelllinie TNF6.8 isoliert werden, beschrieben in Beispiel I, und in einem ELISA-Test eingesetzt werden, um 26 kD-Antikörper zu identifizieren. Der ELISA-Test wird von Klotz in: Methods in Enzymology, Bd. 84, Teil D, S. 194-201 (1982) gezeigt. Kurz gesagt besteht der Test aus der Beschichtung von Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit einer Membranfraktion von TNF6.8. 150 ug Membranmaterial werden pro Vertiefung in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 4ºC über Nacht zur Beschichtung verwendet. Die Vertiefungen werden nach der inkubation über Nacht mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthält, bei 4ºC für mindestens 1 Stunde blockiert und anschließend mit der gleichen Lösung gewaschen. 100 ul-Aliquots an Medium werden zu den Gewebekulturplattenvertiefungen zugegeben, und die Platten werden bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert, wonach die Vertiefungen 3x mit Phosphatgepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthält, gewaschen werden. Als nächstes wird Ziege-anti-Maus-Antiserum, das an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, zu den Vertiefungen zugegeben und für zusätzliche 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen der Vertiefungen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthält. Zuletzt werden in jede Vertiefung 150 ul des alkalischen Phosphatase-Substrats p-Nitrophenylphosphat (5 mg/ml) in Carbonatpuffer, pH 9.8 mit 1 mM MgC(z zugegeben. Nach 30 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 0.1 ml 2 M NaOH gestoppt. Hydrolyse des Substrats wird durch eine gelbe Farbe angezeigt, die leicht durch Messung der Absorption der Lösung bei 410 nm kontrolliert wird. Man läßt Hybridome von positiven Gewebekulturplattenvertiefungen, d. h. die, die Anti-26 kD-TNF- Antikörper sekretieren, wachsen. Um sicherzustellen, daß die Absorption bei 410 nm aufgrund der Gegenwart des 26 kD-TNF-Antikörpers erfolgt, werden Kontrollen durchgeführt, die daraus bestehen, daß 26 kD-TNF in den Zellkulturplatten weggelassen wird.
Ein alternativer Test für Anti-26 kD-TNF-Antikörper besteht darin, die Zellkulturmedien auf TNF-Peptide unter Verwendung des vorstehend beschriebenen ELISAs zu durchmustern. In diesem Test sollten solche Antikörper, die ein positives Signal geben, an oder sehr nahe an die Spaltungstelle(n) auf dem Prohormon binden. Das kann durch Testen der Fähigkeit der Antikörper, die Proteolyse des 26 kD-Moleküls zu blockieren, bestätigt werden.
Antikörper, der an rnembranständiges 26 kD-TNF oder TNF-Peptide bindet, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Spaltung des 26 kD-Moleküls in niedermolekulare Formen zu blockieren. Die zwei bedeutendsten niedermolekularen Formen besitzen Molekulargewichte von etwa 17,000 und 15,000. Der bevorzugte Test besteht aus der in vitro- Transkription/Translation des 26 kD-Moleküls, wie vorstehend beschrieben, gefolgt von Behandlung mit Konvertase in Gegenwart oder Abwesenheit des Antikörpers, der auf die Spaltstellen-blockierende Aktivität getestet wird. Das Verfahren schließt die in vitro- Transkription/Translation des 26 kD-Moleküls ein, das vom Plasmid B11 codiert wird. Folglich wird die Sequenz durch PstI-Spaltung aus pB11 entfernt und in die PstI-Stelle von pGEM-3 (erhältlich von Promega Biotec.) eingefügt. Das resultierende Plasmid, genannt pGEM-TNF14, wurde unter Verwendung etablierter Techniken in E. coli amplifiziert, und Plasmid-DNA wurde nach der vorstehend beschriebenen Methode von Birnboim und Doly hergestellt. Plasmid-DNA wurde in vitro durch Linearisierung mit Hindlii transkribiert, und die linearisierten Plasmidmatrizen wurden verwendet, um Transkripte mit einer Kappenstruktur mit T7-RNA-Polyinerase und einem von Promega Biotec verfügbaren in vitro-Transkriptionskit herzustellen. Die Transkription wurde mit Standardtechniken durchgeführt, wie von der Herstelleranleitung empfohlen.
Die mRNA wird in vitro translatiert in Gegenwart von ³&sup5;S-Cystein, um ³&sup5;S-Cystein markierten 26 kD-TNF herzustellen. Das Verfahren verwendet einen Kaninchen- Retikulocytenlysat-Translationskit, ebenfalls von Promega Biotec verfügbar, entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen.
³&sup5;S-Cystein-markierter 26 kD-TNF wird verwendet, um auf Antikörper-blockierende Aktivität wie folgt zu testen. 25 ul in vitro translatiertes Material wird mit 250 ul nichtinduzierter HL60-Konvertaseaktivität vereint, plus der Bestandteile, die auf inhibitorische Aktivität getestet werden sollen. Die Konvertase wird durch Ernte von 2 · 10&sup9; HL60-Zellen und Isolierung von S-1- und P-30-Fraktionen, insgesamt 18 beziehungsweise 6 ml, hergestellt. 250 ul der P-30-Fraktion werden verwendet, obwohl die S-1-Fraktion auch verwendet werden kann. Der Test wird 1 Stunde bei 30ºC durchgeführt, im wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Als nächstes wird das Reaktionsgemisch mit Anti-TNF polyclonalen Antisera und Protein A-Sepharose immunpräzipitiert, pelletiert und gewaschen. Das gebundene Protein wird eluiert und der Gelelektrophorese unterzogen. 12% SDS-PAGE-Gele ergeben eine gute Auflösung aller 26 kD-Fragmente und werden gemäß der Methode von Laemmli (1970) Nature (London) 227: 680 laufen gelassen. Die Gele werden getrocknet und auf Röntgenfilm (DuPont, Wilmington, DE) bei -70ºC mit Verstärkungsfolien exponiert, Bonner et al. (1974) Eur. J. Biochem. 46: 8, und anschließend entwickelt. Die elektrophoretischen Profile des mit HL60-Konvertase und blockierendem Antikörper behandelten 26 LD-TNF zeigen gerin gen oder keinen Hinweis auf niedermolekulare Fragmente des Prohormons.

Beispiel IV

Test auf 26 und 17 kD-TNF in Körperflüssigkeiten

Das Folgende beschreibt einen Immuntest für 26 kD- und 17 kD-TNT in Körperflüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung, der in dieser Ausführung ein Polystyrolkügelchen-Enzymimmunometriktest (EIMA) ist.
Zuerst ist es wünschenswert, zwei Antikörper zu identifizieren, einer, der 26 kD- TNF bindet, und ein anderer, der 17 kD-TNF bindet. Der letztere Antikörper ist im Fachgebiet gut bekannt und leicht erhältlich. Fendly et al., Hybridoma, Bd. 6 Nr. 4 S. 359 (1987). Im wesentlichen kreuzreagieren die Antikörper nicht.
Zweitens wird eine Standardkurve mit bekannten Mengen an markiertem 26 kD- und 17 kD-TNF erstellt. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt. Kurz gesagt würde das aus der Titration von sowohl 26 kD- als auch 17 kD-TNF in normalem menschlichem Serum bestehen. Ein halber Milliliter jeder Verdünnung wird in einzelne 12 · 75 mm Glasteströhrchen gegeben. Dann werden 6.4 mm-Polystyrolkügelchen mit entweder Anti-26 kD- oder Anti-17 kD-Antikörper unter Verwendung von 0.2% Glutaraldehyd beschichtet. Als nächstes werden die Kügelchen zu jeder Probe zugegeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Kügelchen dreimal mit 1-2 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen werden und gezählt werden. Die Kügelchen können zu denselben einzelnen Teströhrchen zugegeben werden. Um die Menge an 26 kD- und 17 kD-TNF in einer unbekannten Probe zu bestimmen, wird das gleiche Verfahren wiederholt, und die Ergebnisse werden mit der Standardkurve verglichen.

Beispiel V

Klinische Anwendungen des Spaltstellen-blockierenden Antikörpers

26 kD-TNF-Spaltstellen-blockierender Antikörper kann prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden, um Sepsis zu behandeln. Individuen mit dem Risiko, an Sepsis zu erkranken, speziell Patienten, die sich einer Operation unterziehen, oder solchen mit Sepsis, kann eine wirksame Menge blockierender Antikörper verabreicht werden, um die Krankheit zu verhindern oder ihre Schwere zu vermindern. Ein typisches Behandlungsschema würde aus der Verabreichung von etwa 5-10 mg Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten bestehen. Prophylaktisch würde die Dosis gerade vor der Operation gegeben werden und mindestens einmal sofort danach wiederholt werden. Therapeutisch würde die Dosis alle 24-48 Stunden gegeben werden, bis ein Nachlassen der Krankheit zu erkennen ist. Die anfängliche therapeutische Dosis wäre 25 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten und würde dann auf 5-10 mg pro Kilogramm reduziert werden. Der Antikörper kann auf jedem Wege verabreicht werden, aber die bevorzugte Art der Verabreichung ist i.v.
Variationen der obigen Ausführungen werden dem Durchschnittsfachmann leicht erkennbar sein, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen, wie in den folgenden Patentansprüchen beschrieben.

Claims

1. Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, ggf. ein F(ab')&sub2;-, Fab-, oder Fv- Fragment, der (das) an ein Prohormon bindet und dadurch die proteolytische Erzeugung (eines) biologisch aktiven(r) Fragments(e) des Prohormons verhindert, zur Verwendung als ein Arzneistoff.

2. Verwendung eines Antikörpers, der an ein Prohormon bindet, für die Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Patienten mit einer Krankheit, die durch die Gegenwart von Fragmenten des Prohormons in dem Patienten verursacht wird, wobei ggf. das Prohormon TNF- Prohormon ist und die Fragmente TNF-Prohormon-Fragmente mit Molekulargewichten von 17.000 oder 15.000 sind.

3. Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, ggf. ein F(ab')&sub2;-, Fab- oder Fv- Fragment, der (das) an ein Prohormon bindet und dadurch die proteolytische Erzeugung (eines) biologisch aktiven(r) Fragments(e) des Prohormons verhindert, wobei das Prohormon TNE-Prohormon, ILl-Prohormon oder ein CSF-Prohormon ist.

4. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 3, wobei das Prohormon TNF-Prohormon ist und das biologisch aktive Fragment davon ein Molekulargewicht von etwa 17kD oder etwa 15kD hat.

5. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 3 oder 4, der polyclonal, monoclonal, einzelkettig, bispezifisch oder recombinant ist.

6. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 3 bis 5, der menschlich oder humanisiert ist.

7. Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, ggf. ein F(ab')&sub2;-, Fab-, oder Fv- Fragment, der (das) an ein spaltstellenspezifisches Epitop auf einem Prohormon bindet und die Spaltung blockiert, wobei das Epitop die Eigenschaft aufweist, daß es proteolytisch zu einer oder mehreren biologisch aktiven Form(en) des Prohormons mit niedrigem Molekulargewicht gespalten wird, wobei das Prohormon TNF- Prohormon, IL1-Prohormon oder ein CSF-Prohormon ist.

8. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 7 und ferner definiert durch eine oder mehrere der Eigenschaften gemäß den Ansprüchen 4 bis 6.

9. Zelilinien, die Antikörper gemäß der Definitionen einer der Ansprüche 3 bis 8 produzieren.

10. Mittel zur Verhinderung einer proteolytischen Spaltung eines Prohormons in große und kleine proteolytische Fragmente, umfassend:

a) einen ersten und einen zweiten nichtkreuzreagierenden Antikörper, die an das Prohormon binden, wobei der erste Antikörper die Erzeugung des großen Fragments verhindert und der zweite Antikörper die Erzeugung des kleinen Fragments verhindert.

11. Mittel nach Anspruch 10, wobei das Prohormon TNF-Prohormon ist, und ggf. die großen und kleinen TKF-Prohormon-Fragmente Molekulargewichte von etwa 17.000 bzw. 15.000 aufweisen.

12. Mittel nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Antikörper polyclonal, monoclonal, einzelkettig, bispezifisch oder recombinant ist und/oder menschlichen oder humanisierten Antikörper umfaßt.

13. Verfahren zum Testen auf TNF-Prohormon in Gegenwart von reifem TNF-Hormon in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend die Schritte:

a) Erzeugen eines ersten Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen von TNF- Prohormon mit einem Antikörper, der an das TNF-Prohormon bindet, der aber im wesentlichen nicht an das reife Hormon binden kann,

b) Erzeugen eines zweiten Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit einem Reportermolekül, und

c) Testen auf das Reportermolekül in dem zweiten Komplex.

4. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Erzeugung des zweiten Komplexes das Isolieren des ersten Komplexes, der im wesentlichen frei ist von ungebundem TNF- Prohormon und Antikörper, der an das TNF-Prohormon bindet, vor dem Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit dem Reportermolekül umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Testen auf das Reportermolekül das Isolieren des zweiten Komplexes vor dem Inkontaktbringen des zweiten Komplexes mit dem Reportermolekül umfaßt, und Isolieren des zweiten Komplexes mit dem Reportermolekül.

5. Verfahren zum Testen auf TNF-Prohormon und auf das reife TNF-Hormon in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend die Schritte:

a) Erzeugen eines primären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen von TNF- Prohormon mit Antikörper, der an das TNF-Prohormon bindet, aber im wesentlichen nicht an das reife Hormon binden kann;

b) Erzeugen eines sekundären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen von reifem TNF-Hormon mit einem Antikörper, der an das reife TNF-Hormon bindet, aber im wesentlichen nicht an das Prohormon binden kann;

c) Erzeugen eines tertiären Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen der primären und sekundären Komplexe mit unterscheidbaren Reportermolekülen; und

d) Testen der unterscheidbaren Reportermoleküle in dem tertiären Komplex,