JP2837160B2 - ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクローナル抗体を含有する敗血症治療薬及びリューマチ性疾患治療薬 - Google Patents

ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクローナル抗体を含有する敗血症治療薬及びリューマチ性疾患治療薬

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト腫瘍壊死因子（TNF）に対して特異性
の高いモノクロナール抗体（mAb）を含有する敗血症用
薬及びリューマチ性疾患用薬に関し、更に該モノクロナ
ール抗体を合成する雑種細胞系、TNFに対するモノクロ
ナール抗体、この雑種細胞系及び抗体の製法、ならびに
このモノクロナール抗体の使用を記載する。 マウス骨髄腫細胞と免疫されたマウスからの脾臓細胞
との融合（コーラー及びミルシユタイン著、ネイチヤー
第256巻1957年495〜497頁参照）により、均質な（モノ
クロナール）抗体を産生する連続的な細胞系を得ること
が可能であることが初めて示された。それ以来、種々の
雑種細胞（ハイブリドーマと呼ばれる）を製造するた
め、そしてそれが産生する抗体を種々の科学的研究に使
用するための多くの試みがなされた（カレント・トピツ
クス・イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロ
ジイ第８巻：リンホサイト・ハイブリドーマス、シユプ
リンガー出版社1978年参照）。 その生物学的性質のため、TNFは腫瘍性疾患の興味深
くかつ有望な処置剤であることが明らかである。天然細
胞中のTNFの濃度がきわめて低いため、初期には詳細な
研究は失敗に終つた。ヒト蛋白質を下等生物中でクロー
ニングできる可能性を有する遺伝子操作が開発されるま
では、TNFを微生物中で発現させることはできなかつ
た。高度に精製された形で、この組換えTNF（rTNF）は
天然TNF（nTNF）と同じ効果を有する。 科学的研究ならびに治療上の使用は、TNFの活性ばか
りでなく蛋白質TNF自体を検出することを必要にした。
生物学的活性の測定は常に面到で費用がかかる。 本発明は、組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）により免
疫されたマウスの骨髄腫細胞と脾臓細胞との細胞融合に
より得られたものであり、そして天然及び／又は組換え
TNFと反応するモノクロナール抗体を産生する雑種細胞
系、ならびに天然及び／又は組換えTNFと反応する新規
なモノクロナール抗体である。 本発明はさらに、細胞融合により抗体を産生する雑種
細胞系を製造し、この細胞をサブクローニングし、そし
て細胞が生長したのち、抗ヒト腫瘍壊死因子特異性を有
するモノクロナール抗体を分離することを特徴とする、
このモノクロナール抗体の製法である。 モノクロナール抗体の製造は公知の方法（モノクロナ
ール・アンテイボデイズ、ケネツトら著、プレナム・プ
レス社発行、1980年363〜419頁参照）に基づいて行われ
た。 BALB/cマウスを、大腸菌からの精製組換えTNFの少量
を繰返し注射することにより免疫した。血清中に充分な
抗体が検出されるとすぐに、この動物の脾臓細胞を骨髄
腫細胞と融合し、そして雑種を培養した。 個々の培養物は、TNFに対する特異的抗体の濃度につ
いてのスクリーニング試験にかけられた。 適当なハイブリドーマの単一細胞から導かれたコロニ
ーを、制限希釈クローニング法により分離した。この方
法により４種の雑種細胞系が得られ、これらが異なる性
質を有するモノクロナール抗体を分泌することにより区
別された。すなわち雑種細胞系AM−１、AM−114、AM−1
95及びAM−199である。これらの細胞系は、英国ソリズ
バリイSP4 OJ6・ポートン・ダウン所在の応用微生物学
及び研究のためのPHLSセンター、動物細胞培養物のヨー
ロツパ収集所（ECACC）に、番号87−050804、87−05080
3、87−050801及び87−050802として寄託されている。 これらの雑種細胞を、試験管内及び生体内の両方の培
養により生長させた。生体内での高い生長速度はこの培
養法を特に好適にした。プリスタン(R)により前処理さ
れた名称BALB/cマウスに、各雑種株の細胞を腹腔内注射
により与えた。形成された腹水腫瘍を８〜10日後に採取
した。 TNFに対するモノクロナール抗体は、試験管内細胞培
養又は腹水液からの上澄液を精製処理することにより分
離された。精製はブルツフらの方法（J.Immunol.Method
s第53巻1982年313〜319頁参照）に基づいて行われた。 モノクロナール抗体の分子の特性は下記のように決定
された。 精製された抗体の分子量は150000ダルトンに等しいか
それより大きい（ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定）。 抗体AM−１、AM−114及びAM−199はIgG1型のもので、
その重鎖はガンマ１である。抗体AM−195はIgG3型のも
ので、その重鎖はガンマ３である。軽鎖はすべての抗体
においてカツパである（ELISAにおけるサブタイプ特異
的抗体により測定）。 モノクロナール抗体は、＞109/mol程度の高い親和
定数を有し、リンホトキシンと交叉反応しない。 TNF分子上の個々の抗体のための結合部位の相対的位
置は、抗体の競合結合により調べられた。 TNFをマイクロ滴定板上に固定した。１種のビチオン
標識抗体を、他の未標識抗体とともに保温した。TNF上
の類似の部位に対し抗体の相互反応がある組合せを調べ
た。抗体AM−195が結合するエピトープは、AM−１及びA
M−199のためのそれと相違する。AM−114についてわず
かな競合が観察された。 TNF活性は普通の細胞毒検定法により測定された。組
換え及び天然TNFを過剰の抗体とともに保温した。両TNF
標本の細胞毒活性は抗体AM−195により中和された。AM
−114による中和は1/10の強さであつた。この知見は、
抗原上の異なる領域が種々の抗体と別様に反応すると仮
定することにより説明できる。AM−195モノクロナール
抗体だけが、生物学的活性に対して責任のある部位と反
応する。 抗体の結合及びTNFの中和の結果は、TNFの少なくとも
３種の異なるエピトープを認めることができ、そしてモ
ノクロナール抗体の採取により定義しうることを示すも
のである。 抗体を用いて特定の抗原を検出するためには、原則と
して二つの検定方法が可能である。両者において、抗原
中に天然の標識がない場合には一方の成分を標識する必
要がある。抗原に、例えば放射活性標識同位体により標
識を行い、この場合は通常は競合置換検定法例えばラジ
オイムノアツセイ（RIA）を用い、あるいは抗体を標識
する。この場合の好ましい検定法の型はイムノラジオメ
トリツクアツセイ（IRMA）、酵素免疫測定法（ELISA）
又は化学発光測定法である。これら種々の測定法及びそ
の変法の詳細は、この技術の専門家に公知である。 他の選択は、低分子量ハプテンの抗体とカツプリング
であり、これは第二の反応により特異的に検出できる。
普通に用いられるものの例は、ストレプトアビジンと反
応するビチオンである。従つて本発明のすべての抗体
は、長鎖ビオチンにより標識され、後続の段階において
ストレプトアビジン／セイヨウワサビパーオキシダーゼ
を用いて可視化された。 本明細書に記載される検定法は、固相サンドイツチEL
ISAである。未標識の抗体（AM−１又はAM−199）を受身
吸着又は共有結合により表面例えばマイクロ滴定板に結
合し、そしてこの表面を既知の手段で非特異的結合に対
してブロツクした。TNF含有試料及びビチオンで標識し
た抗体（AM−195）を、ピペツトでウエル中に入れ、そ
して保温した。試料中のTNFを10pg/mlの検出限界で検出
できることが示された。rTNFはマウスL929の測定におい
て8.0×106U/mgの比活性を有するので、このELISA法に
より0.1UのTNF/mlを検出することが可能である。ウエス
タン・ブロツテイング法は抗体がヒト血清のどの成分と
も交叉反応しないことを示した。従つて本発明の抗体
は、TNFにより処置された患者の血清中のTNFを測定する
ために用いることができる。これらの抗体は現行の診断
の目的に、例えば血清及び血漿中のTNFレベルを検査す
るために用いることもできる。 本発明の抗体はTNFを不活性化するので（実施例６参
照）、血中TNF濃度が上昇する疾患、例えば敗血症性シ
ヨツクの処置のために使用できる。さらに次の障害にお
けるTNF抗体での処置があげられる。移植拒絶反応、ア
レルギー、自己免疫性疾患、リウマチ性障害、肺シヨツ
ク、炎症性骨疾患、凝固障害及び火傷。この目的に適す
る抗体は、TNFの細胞毒活性を中和するものである。 TNFを含有する生物学的材料からTNFを抽出するため
に、免疫アフイニテイクロマトグラフイを用いることも
できる。このためには抗体を既知の方法によりゲルマト
リツクスに結合し、これにTNF含有溶液を通過させる。 下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。 実施例１ モノクロナール抗体の製造 （ａ）BALB/cマウスの免疫 雌性BALB/cマウスを、完全なフロインドのアジユバン
ト0.5ml中のrTNF30μｇを用いて腹腔内注射（i.p.）に
より免疫した。14日後に動物に、不完全なフロインドの
アジユバント中の抗体30μｇを再び腹腔内注射により投
与した。さらに２回の腹腔内注射による免疫を、各30μ
ｇの抗体を用いて14日の間隔で行つた。最後の抗体投与
の３日後に、２匹の動物の脾臓を摘出した。 （ｂ）脾臓細胞懸濁液の製造 摘出された脾臓から、ステンレススチール製スクリー
ン（目幅100μｍ）にこの器官を強制的に通過させるこ
とにより、細胞懸濁液を製造した。ぶどう糖4.5g/、
グルタミン10mM、ペニシリン1000単位/ml、ストレプト
マイシン100μg/ml及び胎児牛血清15％が追加されたダ
ルベツコの最小必須培地（DMEM）中に細胞を移した。細
胞をこの培地で３回洗浄したのち、同じ培地中に希望す
る濃度に再懸濁した。一般に各脾臓から約５〜10×107
個の細胞が得られた。 （ｃ）骨髄腫細胞の生長 骨髄腫細胞Sp2/O−Ag14（ATCC No.CRL8287）を融合の
ために使用した。この細胞は20μg/mlの８−アザグアニ
ンに耐性であるが、ヒポキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含有する培地中（HAT）ではもはや生長で
きない。この細胞を、ぶどう糖4.5g/、グルタミン10m
M、ペニシリン1000単位/ml、ストレプトマイシン100μg
/ml及び胎児牛血清15％が追加されたDMEM（完全培地）
中で培養した。この細胞を、生長の対数増殖期において
融合に用いた。 （ｄ）細胞融合 脾臓細胞懸濁液を骨髄腫細胞と5:1の割合で混合し、
血清不含のDMEMで洗浄した。洗浄された細胞を血清不含
のDMEM30ml中に再懸濁し、内容50mlのポリプロピレン製
円錐管中で800rpmで５分間遠心分離した。上澄液を完全
に吸引過した。分子量2000のポリエチレングリコール
（PEG、ベーリンガー社）の50％溶液0.5mlを、きわめて
注意深くペレツトに添加し、ペレツトを軽くたたいてPE
Gと混合し、次いで混合物を1000rpmで３分間遠心分離し
た。DMEM10mlを添加し、細胞ペレツトを注意深く懸濁
し、次いで2000rpmで３分間遠心分離した。細胞ペレツ
トを２×106細胞/mlの濃度でHAT培地中に再懸濁し、そ
の0.2mlをマイクロ滴定板上に分散した。前日に、主と
してマクロフアージである腹腔内単核細胞約50000個
を、供与者細胞としてウエル中に入れた。 （ｅ）ハイブリドーマの選択及び培養 細胞融合したのち、細胞をリトルフイールドHAT培地
（サイエンス第145巻1964年709〜712頁参照）中で37℃
において、CO2を５％含有する湿つた雰囲気中で培養し
た。 １週間に２回、培地の半分を新しいHAT培地で置き換
えることにより培養物を育てた。数週間ののち、ハイブ
リドーマ細胞培養物からの上澄液を、抗ヒト腫瘍壊死因
子活性の存在について調べた。スクリーニング試験にお
いて正の結果を示したハイブリドーマを、クローニング
のために選択した。このためにはハイブリドーマを制限
希釈法に付し、その際96個のマイクロ滴定ウエルのそれ
ぞれに平均で0.5個の細胞／ウエルを入れ、そして105個
のマウス胸腺細胞を供与者細胞として添加した。このク
ローニング操作により選択された抗体産生細胞を増殖
し、凍結し、そして液体窒素中で胎児牛血清10％及びジ
メチルスルホキシド10％を含有する完全培地中に貯蔵し
た。 （ｆ）特異的TNF抗体のためのスクリーニング試験 rTNFを、PBS（燐酸塩緩衝塩水、NaCl0.8％及び燐酸ナ
トリウム0.02モルを含有し、HCl又はNaOHでpH7.4にした
もの）中に３μg/mlに希釈した。この溶液の各0.1mlを
マイクロタイター(R)板のウエル中に入れた。室温で２
時間ののち、上澄液を吸引過し、ウエルを１％牛血清
アルブミン溶液（シグマ社、RIA等級）0.3mlで30分以内
に処理し、次いで上澄液を捨てた。生長しているハイブ
リドーマ細胞系（約20〜30％集合）からの上澄液又は免
疫されたマウスからの血清の希釈液を、室温で２時間以
上保温した。ウエルをPBS0.3mlで数回洗浄した。次いで
適当な濃度の抗マウス免疫グロブリン抗体（マイルズ社
製）0.1mlとともに室温で２時間保温した。これらの抗
体を酵素標識としてのパーオキシダーゼとカツプリング
した。正のパーオキシダーゼ反応を有するウエルは、抗
原に特異的な抗体を示した。 最初に用いた360個のウエルの80％において、細胞の
生長が観察された。これらのうち12個がTNFスクリーニ
ング試験において正の結果を示した。繰返し試験する
と、そのうちの11個が正であつた。４種の異なるモノク
ロナールハイブリドーマを本発明のために追求した。そ
れはAM−１、AM−195、AM−114及びAM−199である。 （ｇ）ハイブリドーマ細胞培養の展開 細胞培養における展開（試験管内）： 約２×107個の細胞を、175cm2の生長面積を有する細
胞培養ビン中に入れた。３日後に、細胞不含の上澄液
は、細胞により分泌されたモノクロナール抗体を10〜20
μg/mlの範囲で含有していた。 マウス腹水における展開（生体内）： BALB/cマウスに、腹膜の条件付けのためにプリスタン
(R)0.5mlを腹腔内注射により与えた。PBS中の５〜10×1
06個のハイブリドーマの懸濁液を、前処置された各動物
に１〜２週間の期間にわたり投与した。８〜10日のの
ち、腹膜を針で刺し、細胞を含有する腹水液を採取し
た。 腹水液の試料の細胞成分を遠心分離（5000rpm、５
分）により除去した。モノクロナール抗体を含有する上
澄液を小分けして−70℃で凍結するか、あるいはクロマ
トグラフイにより少なくとも90％に精製した。純度はド
デシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により評価された（西独特許出願公開3330160号明細
書参照）。 （ｈ）モノクロナール抗体の型の決定 モノクロナール抗体を、ELISA系において特性決定し
た。マイクロ滴定板のくぼみにrTNF（５μg/ml）を充填
した。このように準備された板を、細胞培養からの精製
モノクロナール抗体とともに室温で２時間保温したの
ち、第２の保温段階（室温で２時間）を、種々のクラス
及びサブクラスの抗マウス免疫グロブリンならびに種々
のクラスの免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖（マイルズ社
製）とともに行つた。他の段階で、パーオキシダーゼで
標識したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（マイルズ社製）
を添加した。１時間保温したのち、着色基質であるテト
ラメチルベンジジン（マイルド社製）及び過酸化水素を
添加して酵素反応を開始した。その結果を第１表にまと
めて示す。 （ｉ）モノクロナール抗体の標識 NHS−LC−ビオチン（ピアス社製）をPBSに溶解し、濃
度を1mg/mlにした。この溶液の0.1mlを精製モノクロナ
ール抗体（0.5mg/ml PBS）0.1mlと混合し、この溶液を
室温で２時間保温した。反応に続いて、溶液をPBSで1ml
となし、４℃でPBSに対して透析した。透析液すなわち
透析管中の溶液を、使用するまで４℃で貯蔵した。 実施例２ TNFに対するモノクロナール抗体の親和性 親和性定数を、ELISAからのデータを用いて測定し
た。このためには精製抗体を一定量のTNFに対して滴定
し、そして抗体の結合を、パーオキシダーゼで標識した
ウサギ抗マウス免疫グロブリンの結合により検出した。
特異性プログラムを用いて結合のデータを分析した。 これらの会合定数Kaは、抗TNF抗体の高い親和性を示
している。 実施例３ TNFの細胞毒活性の中和 TNFの試験管内での生物学的活性を、アガーワルらに
より記載された方法（J.Biol.Chem.第260巻1985年2345
〜2354頁参照）と同様にして、マウス細胞系L929（ATCC
No.CCL1）の溶解により測定した。モノクロナール抗体
によるTNFの細胞毒活性の中和の試験において、TNF濃度
は少なくとも90％の細胞が溶解する濃度であつた。抗体
をマイクロ滴定板中で完全培地中に1:2で段階的に希釈
した。組換え又は天然TNF（1.3ng/ml）0.05mlを各抗体
溶液（0.1ml）に添加し、混合物を室温で２時間保温し
た。次いで培地0.05ml中のL929細胞50000個を添加し、
インキユベーター中で20〜24時間保温したのち、細胞を
固定し、クリスタルバイオレツトで染色した。 TNFの細胞毒効果は細胞の溶解に導き、従つて細胞は
染色中に洗浄除去される。しかし充分な抗体が存在する
場合には、TNFの細胞毒効果は中和され、そして細胞は
染色される。 第３表から認められるように、中和試験において３種
類の抗体が見出された。TNFの中和は、AM−195では0.2
μg/ml及びAM−114では２μg/mlのモノクロナール抗体
濃度において認められたが、20μg/mlのAM−１及びAM−
199では中和は不完全であつた。 実施例２における会合定数の測定は、各抗体がほぼ同
じ程度に結合することを示した。抗体を、強く中和する
もの、弱く中和するもの又は全く中和しないものに類別
することは、TNF分子上の種々のエピトープを区別でき
るようにする情報を提供する。抗体の結合及びTNFの中
和についての結果は、TNFの少なくとも３種の異なるエ
ピトープを認識することができかつモノクロナール抗体
の収集により定義することができることを示す。 実施例４ TNFの測定 （ａ）好適な１対のモノクロナール抗体の選択 ２種の抗体の同じエピトープへの競合的結合と、異な
るエピトープへの付加的結合とを区別するために、抗体
だけを用いかつ可能なすべての対の組合せにおいて、固
定化されたTNFへの結合を試験した。TNFは実施例１に記
載のように結合した。精製TNFを、24000ng/mlから出発
して1:4段階に希釈した。次いでビチオン化された抗体A
M−195を添加したのち、90分間保温した。ウエルをPBS/
0.05％ツイーン(R)20で洗浄し、ストレプトアビジン−
パーオキシダーゼ錯体（BRL社）を添加し、混合物を30
分間保温した。洗浄工程ののち、パーオキシダーゼ基質
（実施例4b参照）0.1mlを各ウエルに添加した。競合的
結合は、シグナルを消失させる結果となる。第４表から
明らかなように、モノクロナール抗体AM−195を結合す
るTNFエピトープは、AM−１又はAM−199のためのものと
相違する。AM−114とのわずかな競合が認められる。こ
の理由から、固定化されたAM−１又はAM−199抗体とビ
オチンで標識したAM−195を用いて、次の実験を行つ
た。 （ｂ）酵素イムノアツセイの設計 抗体AM−１又はAM−199を、受身吸着又は共有結合に
より担体（小球、材、ポリスチレン又はポリ塩化ビニ
ル製マイクロ滴定板、紙又は他の材料）上に固定し
た。モノクロナール抗体の特異性は、特異的な抗原（こ
の場合はTNF）だけが、この抗原上の単一分子結合部位
を介して結合することを可能にする。結合できるTNFの
量は溶液中の抗原の濃度及び量に比例する。抗原は、抗
体AM−195が他の分子結合部位に結合することにより認
識される。抗体AM−195は１個のシグナルを有する。そ
れ故、固定化されたシグナルの量は固定化された抗原の
量に、従つて調べられる溶液中の抗原の濃度にも直接比
例する。 アツセイの操作： （１）被覆 精製抗体AM−１又はAM−199を粘着緩衝液（重炭酸ナ
トリウム緩衝液、pH9.5、4.2g/＝0.05M）中に0.5μg/
mlに希釈した。マイクロ滴定板のウエルにこの溶液0.1m
lを入れ、４℃で16〜20時間保温した。 （２）遮断 （１）により得られた溶液を吸引過し、ウエルをPB
S（NaCl2g/、KCl0.2g/、Na2HPO4・2H2O1.44g/、K
H2PO40.2g/、pH7.0）で２回洗浄し、次いで１％牛血
清アルブミン（シグマ社、RIA等級）により室温で30分
間遮断した。 （３）系列希釈及びTNF試料 （２）からの溶液を吸引過し、ウエルをPBSで２回
洗浄した。rTNFを緩衝液Ｉ〔牛血清アルブミン（シグマ
社、RIA等級）1gをPBS1に添加したもの〕により2.5ng
/mlとなし、1:2段階に希釈した。試料各0.1mlをピペツ
トにより各ウエル中に入れ、室温で２〜４時間保温し
た。緩衝液（洗浄用緩衝液:PBS＋0.1％ツイーン(R)20）
により３回洗浄したのち、ビオチンで標識した抗体AM−
195を0.1ml添加した。実施例１（ｈ）の方法により製造
した接合物を緩衝液Ｉにより1:400に希釈し、室温で２
時間又は４〜10℃で16〜20時間保温した。 （４）増幅系 ウエルを洗浄用緩衝液により３回洗浄したのち、スト
レプトアビジン−パーオキシダーゼ錯体（BRL社、PBS/B
SA緩衝液中に1:2000に希釈したもの）0.1mlとともに室
温で30分間保温した。 （５）展開 ウエルを洗浄用緩衝液により３回洗浄し、パーオキシ
ダーゼ基質0.1mlをピペツトにより各ウエル中に入れ、
室温で30分間保温した。2M−H2SO40.1ml/ウエルにより
反応を停止した。マイクロ滴定板における吸光を、450n
mの波長において１時間以内に記録した。特性を示す検
量線を第１図に曲線○−○−○として示す。TNFの検出
限界は10pg/mlである。 パーオキシダーゼ基質 TMB溶液:DMSO中の42mM−TMB（3,3′,5,5′−テトラメチ
ルベンジジン、マイルズ）。 基質用緩衝液，水１に加えた酢酸ナトリウム50g、く
えん酸1gによりpH4.9に調整。 TMB溶液0.1mlを基質用緩衝液10mlに振動しながら徐々
に添加し、次いで30％H2O2超純粋、メルク社）1.47μ
を添加した。 （ｃ）ヒト血清中のTNFの測定 組換え及び／又は天然TNFを緩衝液Ｉ（実施例4b参
照）又はヒト血清中に2.5ng/mlとなし、同じ条件下で1:
2で段階的に希釈した。その0.1mlをピペツトにより、実
施例４（ｂ）に記載のようにして抗体AM−199又はAM−
１によりあらかじめ被覆された各ウエル中に加えた。後
続の操作を実施例４（ｂ）と同様に行つた。その結果を
第１図に曲線●−●−●として示す。 第１図から明らかなように、ヒト血清のどの成分も、
モノクロナール抗体を用いるTNFの測定を妨害しない。 （ｄ）抗体とリンホトキシンとの交叉反応 抗体とリンホトキシンとの可能な交叉反応を、実施例
１（ｅ）に記載のようにして試験した。その際マイクロ
滴定板のウエルを精製された組換えリンホトキシンによ
り被覆した。抗体AM−１、AM−114、AM−195又はAM−19
9のリンホトキシンとの結合は認められなかつた。 実施例５ ウエスタン・ブロツテイング法によるモノクロナール抗
体を用いる血清中のTNFの検出 種々の量のTNFが添加されたヒト血清を、ゲル電気泳
動により12.5％ゲル中でレムリの方法（J.Mol.Biol.第8
0巻1973年575〜599頁参照）により分別した。ウエスタ
ン・ブロツテング法は、バーネツト（Anal.Biochem.第1
12巻1981年195〜203頁参照）及びライネスら（J.Biol.C
hem.第260巻1985年1133〜1139頁参照）により報告され
た方法である。ゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜
（シユライヘル及びシユル）上に１夜ブロツトした。こ
のニトロセルロース膜を１％ゼラチン溶液（バイオーラ
ド社、ゼラチン10gをPBS1に加えたもの）とともに室
温で３時間保温した。次いでニトロセルロース膜を、緩
衝液（PBS中の１％ゼラチン）中に１μg/mlに希釈され
た抗体溶液20mlとともに室温で２時間保温した。上澄液
を傾斜により除去し、膜を数回洗浄した。パーオキシダ
ーゼで標識した抗マウス免疫グロブリンを用いて、TNF
をニトロセルロース膜上で見えるようにした。検出限界
はTNF30ngである。 TNFを種々の量で添加されたヒト血清のゲル電気泳動
による分画（Ａ）及びこのゲル電気泳動分画についてモ
ノクロナール抗体AM−195を用いて行つたウエスタン・
ブロツテイングの結果（Ｂ）から、AM−195はヒト血清
中の成分と反応せず、したがつてTNFに対して特異的で
あると認められた。抗体AM−１、AM−114及びAM−199に
ついても同じ結果が得られた。 実施例６ TNFの中和 TNFに対するmAKの保護作用を、生体内条件下で雌性の
BALB/cマウス（試験１、２及び４）及びC3H/HeNマウス
（試験３）において調べた。４〜６週令のマウスを無作
為に１群３匹又は５匹に分けた。被験物質を静脈内注射
により外側尾静脈内に投与した（投与量10ml/kg）。注
射の前に、TNFを緩衝液Ａ〔150mM−NaCl及び0.18％牛血
清アルブミン（シグマ社、RIA等級）〕に溶解し、４〜1
0℃で６時間貯蔵した。TNFの毒性はこの時間後に最高で
あつた。最初にTNFを、次いで15〜30分後にmAKを添加し
た。24時間後に死亡率を測定した。第５表にその結果を
示す（この表中、例えば3/5は動物５匹のうち３匹が死
んだことを意味する）。 第５表から明らかなように、中和性の抗体AM−195は
マウスにおいて致死量のTNFを中和することができる。
動物の生存率は抗体及びTNFの重量比に依存する。TNFの
毒性の完全阻止は5:1の比率において認められた。TNFが
三量体であると考えると（FEBS Lett.第211巻1987年179
頁参照）、これは1.6:1の抗体:TNFのモル比に相当す
る。 マウスにおいてTNFを非中和性抗体により中和するこ
とはできない。
【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明のモノクロナール抗体を用いてTNFを
測定するための検量線を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, 137［２］（13．６月．1986）ｐ．847− 854 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．ハイブリッドセルラインECACC87050801から生産さ
    れ、かつその重鎖がサブタイプIgGγ−３を示す、天然
    及び／又は組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）と反応する
    モノクローナル抗体を含有することを特徴とする、敗血
    症治療薬。 ２．ハイブリッドセルラインECACC87050801から生産さ
    れ、かつその重鎖がサブタイプIgGγ−３を示す、天然
    及び／又は組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）と反応する
    モノクローナル抗体を含有することを特徴とする、リュ
    ーマチ性疾患治療薬。
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