CN102675460B - 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体及其应用，所述抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体相比现有的小鼠嵌合抗体，在保持了抗体识别抗原的能力的同时，极大降低了鼠源性抗体的免疫原性，从而提高了抗体在临床应用的安全性。

Description

抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
技术领域
本发明涉及至少一种抗肿瘤坏死因子-α(TNFα)或其片段的人源化抗体，包括其特定部分或变体，以及编码所述抗TNFα人源化抗体的核酸、其互补核酸、载体、宿主细胞及其制备方法和包含所述抗TNFα人源化抗体的组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
人肿瘤坏死因子-α(TNFα)是由单核细胞和巨噬细胞产生的一种促炎性细胞因子，最初生成的是26kDa的前体蛋白，N端在胞内，C端在胞外，称为跨膜型TNFα，Pennica等1984年首先克隆了TNF-α基因cDNA，并推导出人TNF-α分子由157个氨基酸组成，其分子量约为17KD(Pennica D，et al，Nature 1984；312：724)。人TNFα有两种分子形式，即TNFα和TNFβ.TNFα是由激活的巨噬细胞或单核细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，也称恶病质素；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌，两者有相似致热性。TNFα作用于瘤细胞表面的受体，通过对细胞的识别、结合、内吞进入溶酶体，致溶酶体和蛋白酶类高度活化导致细胞死亡，它在免疫反应、炎症和对损伤反应中起重要作用，主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调节，不仅对肿瘤细胞有细胞毒性、细胞溶解、诱导细胞凋亡、抑制增殖等作用，还能够促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，提高中性粒细胞的吞噬能力。
适量的TNFα能激活免疫系统从而增强机体的免疫力，能够在宿主抵抗微生物入侵和抑制肿瘤产生的防御系统中起着关键作用。但过量的TNFα表达时，可以与其它炎性因子一起产生多种病理损伤，因此可在不同水平上抑制或中和TNFα的活性，使其不能达到受体，进而避免信号传导引发的后果。
为试图克服使用非人源抗体造成的相关问题，通过构建的人-鼠嵌合抗体来降低HAMA引发的机体免疫原性，已成为较为有效的治疗策略。此种嵌合抗体就是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区，保留了非人源抗体原有的重链、轻链可变区的氨基酸序列(参见，Daddona，P.E等的PCT公开WO92/16553号，Le，J.等人的美国专利5,919,452号，Kang，Heui H等PCT公开WO2005/047329号，金伯泉等的中国专利公开CN1544466A号)，金宜慧等中国专利公开CN101177453号提供了一种新的与人肿瘤坏死因子结合和嵌合抗体，此种嵌合抗体相对于非人源抗体，其免疫原性虽有所降低，但是，由于嵌合抗体中鼠源化程度依然较高，从而可能导致不同程度的HAMA应答反应，具体表现为皮肤黏膜反应、变态反应、心律失常和心绞痛、肾功能不全，严重时甚至可能造成昏迷，此类嵌合抗体的临床应用受到了很大的限制。
通过临床试验证明，此种嵌合抗体作为异种蛋白作用于人体后，可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，即人抗鼠抗体(Human anti mouse antibody，HAMA)应答反应，该反应会使鼠源单抗在人体内往往被快速清除，其半衰期也较短，重复用药甚至可能导致病人严重的过敏性休克。而且，这些外来抗体可能受到免疫抗体的攻击，其结果使得他们在呈现药效之前被中和掉。
发明人在上述专利技术基础上进行了开发，为了尽可能的降低在嵌合抗体中的鼠源部分，可利用基因工程技术制备人源化抗体，即，将鼠源抗体重链可变区、轻链可变区的互补决定区(Complementaritydetermining reign，CDRs)分别移植到人抗体骨架区(Framework region，FR)，由此获得的人源化抗体在其结构上尽可能接近人类序列的同时，也能维持其与亲本非人源抗体相似的CDR构象。相对于亲本非人源抗体和嵌合抗体，改造后的人源化抗体来源于亲本非人源氨基酸序列减少，一方面保持了抗体识别抗原的能力；另一方面，极大降低了鼠源性抗体的免疫原性，从而提高了抗体在临床应用的安全性。
因此，本发明提供了一种比现有技术中的小鼠嵌合抗体更加安全可靠的，在人体内半衰期更长、功能更显著的人源化抗体。
发明内容
本发明的一方面提供了如本文所描述的至少一种抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体及特定的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任意部分。本发明的抗体可以包括或来源于任何哺乳动物，例如，但不限于人、小鼠、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或其任意组合等。
本发明的抗体特异性地结合至少一种TNF蛋白、其亚基、片段、部分或其任意组合的特定表位。所述至少一种表位可以包含至少一种抗体结合区。所述至少一种抗体可以任选地包含至少一种互补决定区(CDR)(如重链可变区或轻链可变区)和/或至少一种恒定或可变构架区(FR)或其任意部分。所述至少一种抗体的氨基酸序列可以进一步任选包含至少一种氨基酸残基的插入、缺失或保守性置换。
本发明再一方面提供了至少一种核酸分子，所述核酸分子包含编码至少一种本文的抗肿瘤坏死因子人源化抗体的多核苷酸，或者与所述编码至少一种本文的的抗肿瘤坏死因子人源化抗体的多核苷酸相互补或者相杂交，所述抗体包含至少一种其特定序列、结构域、部分或变体。
本发明的再一方面提供了包含所述抗肿瘤坏死因子人源化抗体核酸分子的重组载体，包含所述核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及所述核酸、载体和/或宿主细胞的制备方法和/或应用。
本发明的至少一种抗体具有至少一种活性，例如但不限于中和rhTNFα对L929靶向细胞展现的毒性、抑制和/或竞争TNF与受体和/或其他单抗例如但不限于阿达木单抗的结合。
本发明的再一方面提供了本发明的抗体和/或组合物在抑制人hTNFα活性的应用，其中hTNFα有关的疾病可以是例如脓毒症、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肺功能紊乱、移植排斥、细菌性脑膜炎、脑型疟、AIDS和AIDS相关综合症(ARC)、移植继发的巨细胞病毒感染。
本发明的再一方面提供了本发明的抗体和/或组合物在制备用于hTNFα的诊断性分析的药物中的应用，其中所述抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体还可以被检测分子进行标记和/或不进行标记，所述标记包括放射性同位素；荧光标记；各种酶底物标记。
本发明的再一方面提供了本发明的抗体和/或组合物在分析方法中的应用，其中所述分析方法包括竞争性结合分析、直接或间接夹心分析或免疫沉淀分析。
本发明的再一方面提供了至少一种组合物，所述组合物包括本发明的抗肿瘤坏死因子人源化抗体和/或其编码核酸，一种或多种可以选自但不限于可药用载体、赋形剂、稀释剂、添加剂等的辅剂。所述组合物可以任选地进一步包括至少一种其他抗体、核酸、辅剂或其任意组合。
本发明的再一方面提供了包括预定量试剂和说明书的试剂盒，所述试剂包括本发明的抗体、核酸和/或组合物。所述试剂盒还包括酶所需的底物和辅因子。所述试剂盒还可以进一步包括但不限于稳定剂、缓冲剂等其他添加剂。
附图说明
本领域技术人员将理解下述附图仅是为了举例说明。这些附图不是要以任何方式限制本教导的范围。
图1显示了抗体中和TNFα杀伤U937细胞作用曲线
图2显示了II型胶原诱导大鼠关节肿胀程度在体评分
图3A显示了Tg197小鼠关节炎在体评分，图3B显示了治疗组对Tg197小鼠的的组织病理学评价，图3C显示了治疗组对Tg197小鼠的关节炎评分(AS)和组织病理(HS)评分的影响。
具体实施方式
抗肿瘤坏死因子抗体
本发明的抗体包含由任意合适的多核苷酸编码的本文的抗体氨基酸序列，或任意分离的或制备的抗体。人源化抗体或抗原结合片段优选结合人肿瘤坏死因子，并因此部分地、基本上地或者全部地中和人肿瘤坏死因子的至少一种生物活性，从而抑制由TNF与TNF受体相结合所介导的信号传递过程以及生理过程。
本发明的人源化抗体可以是任意类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，可以包含κ或λ轻链以及α，μ，γ，ε或δ重链。
本发明的至少一种抗体结合至少一种TNF蛋白、其亚基、片段、部分或其任意组合的至少一种特定表位。
本发明的至少一种抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体具有以下氨基酸序列，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：2：
ENVLTQSPPILSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK
其中所述重链可变区的互补决定区CDR-H1为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；CDR-H2为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；CDR-H3为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；其中构架区FR-H1内氨基酸16的A能被E替换，氨基酸17的S能被T替换，氨基酸20的I能被V替换(SEQ ID NO：11)；FR-H2内氨基酸3的K能被R替换，氨基酸9的G能被S替换(SEQ ID NO：12)；FR-H3内氨基酸3的T能被V替换，氨基酸7的E能被D替换，氨基酸10的V能被T替换，氨基酸14的F能被Y替换，氨基酸19的S能被T替换，氨基酸27的T能被V替换(SEQ ID NO：13)；以及该人源化抗体的轻链可变区的互补决定区CDR-L1为SEQ IDNO：6所示氨基酸序列；CDR-L2为SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；CDR-L3为SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，其中构架区FR-L1内氨基酸11的L能被M替换，氨基酸18的R能被E替换，氨基酸21的M能被I替换(SEQ ID NO：14)；FR-L2内氨基酸13的W能被L替换(SEQ ID NO：15)；FR-L3内氨基酸4的S能被A替换，氨基酸22的L能被V替换，以及氨基酸27的A能被F替换(SEQ ID NO：16)。
SEQ ID NO.3：
HYGMH
SEQ ID NO：4：
WINTYTGEPTYDADFQG
SEQ ID NO：5：
YDFDGFDY
SEQ ID NO：6：
RASSSITFNYLH
SEQ ID NO：7：
STSNLVS
SEQ ID NO：8：
QQYSDYPYT
SEQ ID NO：9：
QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFTHYGMHWV(K/R)QTPGR(S/G)LKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：10：
ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKV(W/L)IYSTSNLVSGVP(A/S)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：11：
QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFT
SEQ ID NO：12：
WV(K/R)QTPGR(S/G)LKWVG
SEQ ID NO：13：
RF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCAR
SEQ ID NO：14：
ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TC
SEQ ID NO：15：
WYQQKSGDSPKV(W/L)IY
SEQ ID NO：16：
GVP(S/A)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYC
在本发明的一个实施方式中，本发明的人源化抗体的重链恒定区序列是人IgG1的重链恒定区序列。
在本发明的一个实施方式中，本发明的人源化抗体的轻链恒定区序列是人抗体的轻链恒定区序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体的氨基酸序列可通过插入、缺失或保守性替换一个或多个氨基酸残基，优选为1-3个氨基酸残基而被修饰。
通过一个或多个以任何组合形式存在的插入、缺失或保守性替换进行修饰的或变异的单克隆抗体在氨基酸序列上有所差异。优选的变异体中修饰是通过氨基酸保守性替换从上述本发明单克隆抗体中变化而来。所述保守性替换是指用性质相似的另一个氨基酸取代指定的氨基酸。下列以非限制性方式例举的氨基酸被认为是可进行保守性替换(性质相似的)：a)丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷胺酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和缬氨酸和f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。
根据本发明功能相当的单克隆抗体是一种变异体，其中一个或多个氨基酸残基，优选为1-3个氨基酸残基被保守性替换。保守性替换是指在芳香族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间一个替换另一个；羟基残基Ser和Thr之间的相互替换；酸性残基Asp和Glu之间的相互替换；酰胺残基Asn和Gln之间的相互替换；碱性残基Lys和Arg之间的相互替换；芳香族残基Phe和Tyr之间的相互替换。
另外，本发明公开了与本文公开的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列，或其片段和功能相当的氨基酸序列。在一个实施方式中，该氨基酸序列与本文提供的氨基酸序列SEQ ID NO：1和2具有至少75％的同源性，较优选为至少85％的同源性，更优选为至少90％同源性，更为优选的是至少95％同源性，更加优选至少97％同源性，最优选至少99％的同源性。
各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如抗hTNFα抗体可以是全长的抗体(例如具有完整的人Fc区)，或者抗体片段(如Fv，scFv，Fab，Fab’和(Fab’)2)等。此外，抗体可以用可检测的标记物进行标记，固定在固相载体上，和/或偶联于异源化合物(如细胞毒性物质)。
Fab是通过用蛋白酶/木瓜蛋白酶处理IgG抗体分子获得的。这是具有大约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在通过木瓜蛋白酶(在H链的224位切开氨基酸残基)获得的片段中，H链的大约一半N-端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。本发明的Fab也可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中以表达Fab来生产。
Fab’是具有抗体结合活性的抗体片段，由(Fab’)2铰链区的二硫键切开而产生，分子量大约50,000，本发明的Fab’也可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab’来生产。
(Fab’)2是具有抗原结合活性的抗体片段，分子量为大约100,000.其中在用蛋白酶/胃蛋白酶(在第234个氨基酸残基处切开H链)处理IgG抗体而获得的片段中，Fab通过铰链区中的二硫键连接在一起的抗体片段略大。本发明的(Fab’)2可以通过用胃蛋白酶处理抗体来生产。此外，本发明的(Fab’)2也可以通过用硫醚键或二硫键连接Fab’来生产。
scFv是具有抗原结合活性的抗体片段，是使用适当的肽接头将一条链VH和一条链VL连接在一起。本发明的scFv的生产可以通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将编码抗体的scFv的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入原核生物或真核生物中表达scFv。
核酸
本发明的核酸编码如SEQ ID NO：1-16中的至少一种、其特定片段、变体或共有序列的至少70-100％的连续氨基酸的核苷酸序列，可以根据本文所描述的或本领域公知的方法获得编码至少一种抗TNF抗体的本发明的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任意其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于通过克隆或合成产生，或其任意组合而产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链。DNA或RNA的至少一条链的任意部分可以是编码链，也称作有义链，或可以是非编码链，也称作反义链。
如本文中所指出的，包含编码抗TNF抗体的核酸的本发明的核酸分子可以包括，但不限于自身编码抗体片段的氨基酸序列的核酸；完整抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列，以及其它的序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，它具有或不具有前面提到的其它编码序列，如至少一种内含子，同时具有其它的非编码序列，包括，但不限于非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加工，包括剪接和聚腺昔酸化信号中起作用(例如mRNA的核糖体结合和稳定性)的转录的、未翻译的序列；编码其它氨基酸，如提供其它功能的氨基酸的其它序列。因此，编码抗体的序列可以与标记序列融合，例如与促进包含抗体片段或部分的融合抗体纯化的肽的编码序列融合。本发明的核酸还包括选择性与此处描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。
本发明的核酸可以利用本领域公知的(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术或其组合进行制备。
本发明的核酸如DNA、RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合可以用本领域技术人员公知的任何克隆方法从生物来源中获得。在一些实施方案中，在严格条件下选择性与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针被用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离和cDNA以及基因组文库的构建是本领域普通技术人员所公知的。
可以采用基于本发明的多核苷酸序列的探针筛选cDNA或基因组文库。可以用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将理解，在测定中可以使用不同严格性程度的杂交，杂交或洗涤介质中的任意一个都可以是严格的。当杂交条件更严格时，探针和靶序列之间的互补性必须更高，这样才能形成双链体。严格性程度可以由温度、离子强度、pH和甲酞胺等部分变性溶剂的存在中的一个或多个条件进行控制。例如，杂交的严格性可以通过改变反应物溶液的极性而方便地改变，反应物溶液的极性可以通过例如在0％-50％的范围内操作甲酞胺的浓度而改变。可检测的结合所要求的互补性程度(序列等同性)将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而改变。互补性程度最佳为100％或70-100％，或其中的任意范围或任意值。然而，应该理解，探针和引物中的小量序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性而补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域公知的。已知的扩增RNA或DNA的方法包括，但不限于聚合酶链式反应(PCR)和相关的扩增方法和RNA介导的扩增。
本发明的核酸也可以根据已知方法通过直接化学合成而制备。化学合成一般产生单链核苷酸，该单链核苷酸可以通过与互补序列杂交或通过用单链作为模板，采用DNA聚合酶进行聚合而转化为双链DNA。
人源化单克隆抗体表达载体的构建
将含有人源化抗体重链可变区序列VH基因片段的质粒(pHu-VH)作为模板，使用5′引物FVHX(5’-CGCGCAAG-CTTCCTCGAG-3’SEQ IDNO：17)和3′引物RVCG(5’CGATGGGCCCTTGGTGGA3’SEQ ID NO：18)得到5′片段，含有人源化抗体的重链可变区(VH)和人IgG1重链恒定区(Cγ1)5′端的7个氨基酸的基因。在此同时，用从人白细胞制备的RNA以合适的5′引物HuCGF(5’-ACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3’；SEQID NO：19)和3′引物HUCGE(5’-CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA 3’，SEQ ID NO：20)通过逆转录反应和PCR得到含人IgG1重链恒定区(Cγ1)编码序列的基因。最后，将含有人源化抗体的重链可变区(VH)的片段与以上的人Cγ1基因通过PCR，用5′引物(FVHX，SEQ ID NO：17)和3′引物(HUCGE，SEQ ID NO：20)，将人源化抗体的重链可变区(VH)和人Cγ1基因片段连接起来，得到含有重链编码序列、长度约为1400bp的基因片段。此基因片段以内切酶Hind III和EcoR1处理后，插入载体如PUC19(ref：Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.andMessing，J.(1985)Gene，33，103-119.)中。
将含有人源化抗体轻链可变区序列VL基因片段的质粒(pHu-VL)作为模板，使用5′引物FVHX(SEQ ID NO：17)和3′引物VKCKO(5’-AGATGG TGC AGC CAC AGT TCG CTT GAT CTC CAG CTT GGT GCC-3’SEQ ID NO：21)得到5′片段，含有人源化抗体的轻链可变区(VL)和人κ轻链恒定区(Cκ)5′端的7个氨基酸的基因。在此同时，用从人白细胞制备的RNA以合适的5′引物HuCKF (5’-GTG GCT GCA CCA TCT GTCTTC-3’SEQ ID NO：22)和3′引物HUCKB(5’-TGC GGA TCC CTAACA CTC TCC CCT GTT GAA-3’，SEQ ID NO：23)通过逆转录和PCR得到含人κ轻链恒定区(Cκ)编码序列的基因。最后，将含有人源化抗体的轻链可变区(VL)的片段与以上的人Cκ基因通过PCR，用5′引物(FVHX，SEQ ID NO：17)和3′引物(HUCKB，SEQ ID NO：23)，将人源化的轻链可变区(VL)和人Cκ基因片段连接起来，得到含有轻链编码序列、长度约为700bp的基因片段。此基因片段以内切酶Hind III和BamH1处理后，插入载体如PUC19(ref：Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.andMessing，J.(1985)Gene，33，103-119.)中。
用上述方法中获得的重链或轻链的编码cDNA、或编码其修改产物的cDNA插入到pcDNA3(购自Invitrogen USA，Carlsbad，CA USA)载体中，构建pHu_anti-TNFα人源化表达载体。该表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动因子-增强子。同时，载体质粒中含有可选择标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，载体质粒中含有DHFR基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲喋呤(Methotrexate，MTX，Sigma)共扩增嵌合抗体基因和DHFR基因(参见，例如Axel，R.，等人的美国专利5,179,017号；Kaufman，R.和Sharp，P.，J.Mol.Biol.159：601-621，1982)。
抗体宿主细胞
本发明也涉及用重组载体基因工程化的宿主细胞，以及通过本领域公知的重组技术产生至少一种抗TNF抗体。
多核苷酸可以任选与含有可选择标记的载体连接，用于在宿主中增殖。一般地，将质粒载体导入一种沉淀物，例如磷酸钙沉淀，或导入具有带电脂质的复合物。
宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域公知的。适当的载体是本领域技术人员容易理解的。可以通过磷酸钙转染、DEAE一右旋糖昔介导的转染、阴离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法将载体构建体导入宿主细胞。
本发明的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体的宿主细胞由中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)衍生而得，经包含抗-TNFα基因内码的质粒转殖，及随后一系列严谨、特定的筛选过程获得，其间包括药物筛选、基因放大和单细胞克隆以建立最终的细胞株。本发明的宿主细胞中国仓鼠卵巢细胞株CHO HUAT 132于2011年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.：C201117。
本细胞株的细胞能在无血清培养液中悬浮繁殖；在2升发酵罐中培养时，于16-20天培养周期结束后其分泌于培养液中抗-TNFα的水平将不低于每升一克(1g/L)。本细胞株所生产的抗-TNFα为人源化单克隆抗体。
与TNFα结合活性
本发明的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体仅与重组人源肿瘤坏死因子(rhTNFα，标靶分子)有特定亲和力，不与其他任何蛋白分子交叉结合。在对其标靶分子亲和力的竞争性测试中，可测得与阿达木单抗(阿达木单抗)相近的亲和力。
本发明的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体还具有活性可以中和rhTNFα对L929靶向细胞展现的毒性，其EC50值与阿达木单抗的EC50值相似，在20.4ng/mL至50ng/mL浓度范围内。
治疗用途
抗hTNFα抗体可用于治疗和预防TNFα有关的疾病，其中hTNFα有关的疾病可以是例如脓毒症、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肺功能紊乱、移植排斥、细菌性脑膜炎、脑型疟、AIDS和AIDS相关综合症(ARC)、移植继发的巨细胞病毒感染，以下进一步讨论本发明的抗体和抗体部分在治疗hTNFα有关疾病的用途
1)脓毒症
肿瘤坏死因子在脓毒症病理学中已有确定地位，其生物学效应包括低血压、心肌抑制、血管漏出综合症、器官坏死等(参见例如美国专利5,231,024号)，因此本发明的人源化抗体和抗体部分可用于治疗任何临床背景中得脓毒症，包括脓毒症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和毒性休克综合症。
2)自身免疫性疾病
已发现肿瘤坏死因子在各种自身免疫疾病的病理生理学中起作用，例如，已发现TNFα参与激活组织炎症并引起类风湿性关节炎中的关节破坏(参见例如美国专利5,231,024号；Moeller，A.等(1990)Cytokine 2：162-169；)，也发现TNFα在糖尿病中参与促进胰岛细胞死亡和介导对少突神经胶质细胞的细胞毒和诱导炎症斑。
本发明的人源化抗体和抗体部分可以用于治疗自身免疫疾病，特别是那些与炎症有关的自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊髓炎、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎和肾病综合症。
3)恶性肿瘤
已发现肿瘤坏死因子在恶性肿瘤中参与诱导恶病质、刺激肿瘤生长、增强转移潜力和介导细胞毒性。因此，可以使用本发明的抗体和抗体部分治疗恶性肿瘤，抑制肿瘤生长或转移和/或减轻恶性肿瘤继发的恶病质。可以将该抗体或抗体部分系统性给药或局部给予该肿瘤部位。
4)肺功能紊乱
已知肿瘤坏死因子参与成人呼吸窘迫综合症(ARDS)的病理生理学，包括刺激白细胞-内皮细胞激活、细胞毒性导向肺细胞和诱导血管漏出综合症。因此，可以用本发明的抗体和抗体部分治疗肺功能紊乱，包括成人呼吸窘迫综合症、慢性肺炎、肺结节病、肺纤维化和硅肺。
5)肠功能紊乱
可以使用本发明的人抗体和抗体部分治疗肠功能紊乱，例如特发性炎症性肠病，该病包括两种综合症，即局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。
6)移植
已发现肿瘤坏死因子可能是同种移植排斥和移植植物抗宿主病(GVHD)的关键介质并参与介导在用导向T细胞受体CD3复合物的大鼠抗体OKT3抑制肾移植排斥时观察到的副反应(参见例如Suthanthiran，M.和Strom，T.B.(1994)New Engl，J.Med.331：365-375)因此，可以用本发明的抗体和抗体部分抑制移植排斥，包括同种移植和异种移植排斥和抑制GVHD.
7)传染病
可以用本发明的抗体和抗体部分治疗传染病，包括细菌性脑膜炎、脑型疟、AIDS和AIDS相关综合症(ARC)以及移植继发得巨细胞病毒感染，也可以用于减轻与传染病有关的症状，包括因感染(例如流感)引起的发烧和肌痛和感染继发的恶病质(例如AIDS或ARC继发的)。
分析及诊断用途
本发明抗体可以用在任何一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接夹心分析和免疫沉淀分析。Zola，《单克隆抗体：技术手册》(Monoclone Antibodies；A Manual of Techniques)，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)。
竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中hTNFα的量与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。
夹心分析法涉及使用两种抗体，各自结合待测蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夹心分析中，被测样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶性三部分复合物。参见美国专利4,376,110。第二抗体本身可以是用可检测部分标记过的(直接夹心分析法)，或者利用被可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心分析法)。例如，夹心分析法之一是ELISA，其中的可检测部分是酶。
抗hTNFα抗体还可用于hTNFα的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这种诊断方法可用于诊断自身免疫疾病等的病因。
抗体通常用可检测分子进行标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：
(a)放射性同位素，例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S。可以利用例如《现代免疫学方法》(Current Protocols inImmunology)第1和第2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定，以利用免疫闪烁照相术来定位患病部位。
(b)荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红(Texas red)。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。
(c)有各种酶底物标记可供使用，而美国专利4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定，或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如荧光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones).苹果酸脱氢酶，脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶、b-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。O’Sullivan等在“制备用于酶免疫分析的酶-抗体偶联物的方法”，《酶学方法》(”Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay”(Methods in Enzym.)(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中描述了酶与抗体偶联的技术。
酶-底物的组合物包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶使染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB))氧化；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；
(iii)b-D-半乳酸酐酶(b-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-b-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮-b-D-半乳糖苷酶。
对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的综述可参见美国专利4275149和4318980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合物的方法。例如，抗体可以与生物素(biotin)偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。
在本发明另一实施方案中，抗hTNFα抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该hTNFα抗体的抗体来检测。
亲和纯化试剂
本发明的抗体可以用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体利用本领域公知的方法固定在例如Sephadex树脂或滤纸的固相上。被固定的抗体与待纯化的含hTNFα的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，所述的溶剂能够基本上去除样品中除了与固定化抗体结合的hTNFα之外所有其它物质。
药用组合物和给药方式
可以将本发明的抗体和抗体部分加入适于给予受治疗者的药物组合物中，其中，该药物组合物包括本发明抗体和可药用赋形剂，药用赋形剂包括任何所有的生理适用的溶剂、分散介质、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂、包衣、吸收延迟剂等等。本发明的药物组合物可以有各种形式，包括例如液半固体和固体剂量形式。
可将在药学上可接受的剂型中的本发明抗-hTNFα抗体，用已知方法施用于人。所述方法包括在静脉内(例如静脉注射浓缩药团(bolus)或在一段时间内连续输注)、肌内、腹膜内、脑脊髓腔内、皮下、动脉内、滑模腔内、鞘内注射、口服、局部或吸入途经使用。抗体还可合适地通过瘤内、瘤周围、损伤部位内、损伤部位周围的途经给药，以发挥局部和全身的治疗效果。腹膜内途经预计特别有用，例如对于治疗卵巢癌。
为了预防或治疗疾病来说，抗体的合适剂量将取决于上述定义的待治疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体给予是用来预防还是用来治疗、以前的治疗情况、患者病史和对抗体的应答性，以及主治医师的独立判断。抗体适合一次性或系列地给患者使用。
根据疾病的类型和严重程度，不论是一次或多次分开给药，还是连续输注。1微克/公斤至50毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗体是给患者使用的最初候选剂量。典型的日剂量或周剂量可在约1毫克/公斤-20毫克/公斤或以上，这取决于上述提到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药(这取决于病况)来说，治疗需持续直至疾病症状发生所期望的抑制。但是，也可以使用其它给药方案。所述治疗的进展可以方便地利用常规技术和分析方法来监测。
产品
1)注射剂
本发明另一实施方案提供了一种含有用于治疗上述疾病的材料的产品。该产品包括容器和标签。合适的容器包括例如普通瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治疗疾病的有效组合物，并具有一个无菌的出入口(例如容器可以是一个有塞子的静脉输液袋或药瓶，该塞子可用皮下注射针头穿透)。该组合物中的有效成分是抗hTNFα抗体。容器上或与容器相联的标签说明组合物所治疗的特定病症。产品还可以含有另一个容器，其中包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格式(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根据商业上的需要或使用者的需要，它还可以包括其他材料，例如其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、以及附有使用说明的包装说明书。
2)缓释制剂
本发明的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体可以用于制备缓释制剂。合适的缓释制剂包括例如包含所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质体，所述的基质体是有形的物体，例如膜或微胶囊。合适的缓释基质体包括例如聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate组成的可注射微球)之类可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类聚合物能够使分子释放持续100天以上，有些水凝胶可在较短的时间内释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，它们可能会因为在37℃接触水分而变性或凝聚，结果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改变。根据有关的机制可以设计出合理的稳定化策略。例如，如果发现凝聚机制是通过硫-二硫键互换反应而形成了分子间的S-S键，稳定化可以是通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含水量、使用合适的添加剂和设计特殊的聚合基质组合物而达到。
试剂盒
为了方便，本发明抗体可以试剂盒的形式提供，即将预定量的试剂与进行诊断分析的说明书的包装组合在一起。如果抗体是用酶标记的，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可测定的生色团和荧光团的底物前体)。此外，还可能包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。为了使所提供的试剂浓度能使得分析的灵敏度最高，各种试剂的相对量变化很大。具体地说，试剂可以是干粉，通常是冻干粉末形式的，可包括赋形剂在内，它们一经溶解将形成具有合适浓度的试剂溶液。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York；Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1：抗hTNFα鼠单克隆抗体的生产
1)免疫
将重组hTNFα(rhTNFα，购自Pepro Tech Inc.)对一些7至11周龄的雌性Balb/c小鼠进行IP或ID免疫，这些重组人TNFα采用等体积的TITERMAX或弗氏完全佐剂进行乳化，其最终体积为100-400μL。每只小鼠在1-7，5-12，10-18，17-25和/或21-34天后用等体积TITERMAX或弗氏不完全佐剂乳化的TNF进行IP(1-400μg)和SC(1400μg×2)免疫。12-25和25-40天之后可以通过不抗凝条件下的框后穿刺而从小鼠取血。然后使血液在RT下凝固1小时，收集血清，根据已知的方法采用TNFαELA测定滴度。当重复注射不导致滴度增加时进行融合。此时，可以用稀释于100μL生理盐水的1-400μg TNFα给予小鼠最后一次加强注射。3天后，通过断颈椎处死小鼠，在无菌条件下取出脾，浸入含有1000U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、和0.25μg/mL两性霉素B(PSA)的10mL冰冷盐酸缓冲盐水(PBS)。通过用PSA-PBS无菌灌注脾而收获脾细胞，用台盼蓝染色排除法计数，并且重悬于含25mMHepes的RPMI 1640培养基。
2)小鼠血清测试
用PBS中的2μg/mL TNFα包被平板过夜。在含有0.02％(v/v)Tween20的0.15M盐水中洗涤后，用PBS中的1％(w/v)BSA，以200μL/孔在RT下封闭各个孔1小时。立即使用平板或在-20℃下冷冻，以便将来使用。在TNFα包被的板上以50μL/孔在RT下孵育小鼠血清稀释液1小时。洗涤平板，然后用1％BSA-PBS中1∶30000特异性稀释的50μL/孔HRP标记的IgG Fc在RT下探测1小时，再次洗涤平板，在RT下加入100μL/孔柠檬酸盐-磷酸盐底物溶液(0.1M柠檬酸和0.2M硫酸钠，0.01％H2O2和1mg/mL OPD)15分钟，然后加入25μL/孔终止溶液(4N硫酸)，在490nm下通过自动平板分光光度计读出OD值。
3)细胞融合
将血清测试鉴定出的，具有高水平抗hTNFα抗体血清的小鼠存活脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，两者比例为1∶1至10∶1。作为非限制性的实例，将脾细胞和骨髓瘤细胞一起沉淀，然后在37℃下，在1mL50％(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1450，sigma)中重悬沉淀30秒以上。然后通过缓慢加入10.5mL含有25mM Hepes(37℃)的RPMI 1640培养基1分钟以上，以便终止融合。以500-1500rpm将融合细胞离心5分钟。然后将细胞重悬于HAT培养基(RPMI 1640培养基，含有25mMHepes，10％Fetal Clone I血清(Hyclone)，1mM丙酮酸钠，4mM L-谷氨酰胺，10μg/mL庆大霉素，2.5％Origen培养补充物(Fisher)，10％653调节的RPMI 1640/Hepes培养基，50μM 2-巯基乙醇，100μM次黄嘌呤和16μM胸苷)，并且以200μL/孔平铺于15个96孔平底组织培养板。然后将板置于含有5％CO2和95％空气的潮湿的37℃孵育器中7-10天。
实施例2：抗hTNFα鼠源抗体的定性
抗hTNFα抗体的定性有两种测定法。一种方法是测定抗体对阿达木单抗与hTNFα的竞争结合，另一种方法是测定抗体在L929细胞毒性测定中中和hTNFα的能力。下文中分别对这两种方法及其实验结果进行了描述。
1)与阿达木单抗的竞争结合测定
以辣根过氧化物酶(HRP)标记抗hTNFα人抗体阿达木单抗作为试剂。将rhTNF(50μl，0.05g/mL)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的1％脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05％吐温(Tween)20的PBS洗孔。然后每孔加入50μl生长培养基与50μl HRP标记的阿达木单抗的混合液。以未标记的阿达木单抗和不含抗体的培养基分别作为阳性与阴性对照。以此方法可筛选出含有高能力抑制HRP标记阿达木单抗与rhTNFα结合的鼠单克隆抗体。将含有抑制HRP标记阿达木单抗与rhTNFα结合的孔放大并亚克隆，继续进一步分析数个表现出此抑制作用的鼠单克隆抗体，最后筛选出二杂交瘤细胞。将此二杂交瘤细胞扩大培养，取澄清液提纯，得鼠单克隆抗体TM2-11-12与TM2-6-3。以纯化的鼠单克隆抗体TM2-11-12与TM2-6-3进行竞争结合测定，鼠抗体TM2-6-3在高达1μg/mL浓度时，只能竞争掉约50％阿达木单抗与hTNFα的结合。另一个鼠抗体TM2-11-12则显示与未标记的阿达木单抗具有同等优良的竞争能力，在大约0.05μg/mL浓度时(相当于3×10-10M)，即可竞争掉约50％阿达木单抗与hTNFα的结合
2)抗hTNFα鼠源抗体的定性：体外中和hTNFα的活性测定
抗hTNFα鼠源抗体与嵌合抗体中和hTNFα的生物活性皆可用L929细胞毒性测定，方法如下所述。将96孔培养板的每孔注入共7.5×103L929细胞(ATCC)(105/mL，75μl)，置于37℃5％CO2的培养箱内24小时。L929细胞的生长培养基为含有5％胎牛血清的RPMI-1640(GIBCO)。用另一块96孔培养板将含有抗hTNFα抗体的溶液用RPMI生长培养基双份进行1/2连续稀释，并加入rhTNFα使每个样品孔rhTNFα的最终浓度为5ng/mL，将有混合液的培养板放在37℃，5％CO2的培养箱内2小时后，再将含有抗体与rhTNFα的混合液加入L929细胞孔内，每行各孔抗体浓度依次为0.001至2μg/mL。将此培养板置入37℃，5％CO2。3天后测存活细胞时，加入20μl PBS中有2.5mg/mL溴化3(4，4-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑翁(MTT；购自Sigma Biochemicals)在37℃培育4小时，再加入100μl 0.01N HCl中有10％十二烷基硫酸钠(SDS)过夜。其后测定每孔于540/690nm光密度。将光密度度数与抗体浓度绘制曲线。分析结合曲线得IC50，即在此抗体浓度时，50％的rhTNFα对L929细胞的毒性可被中和。因此可用IC50值来比较个抗体抑制hTNFα细胞毒性的能力。数个抗hTNFα鼠源抗体(TM2-11-12，TM2-10-20，TM2-2-2)的IC50值与阿达木单抗的IC50值皆在0.01至0.04μg/mL浓度范围内，即皆具有相似的能力中和rhTNFα引起的L929细胞毒性。抗hTNFα鼠源抗体TM2-11-12被选作进一步制备嵌合抗体。
实施例3：克隆TM2-11-12鼠源抗体的重链和轻链
1)TM2-11-12鼠源抗体的重链可变区的克隆
为设计鼠源抗体的人源化，首先须获得含鼠源抗体TM2-11-12重链和轻链可变区编码序列的DNA片段。用RNA纯化试剂盒(InvitrogenCorp.)从TM2-11-12小鼠杂交瘤细胞分离出RNA，以此制备cDNA(GeneRacer试剂盒，Invitrogen Corp.)。通过聚合酶链反应(PCR)使用5’引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，SEQ ID NO：24)和3’引物(5’-TCCAGGGGCCAGTGGATAGAGAGA-3’，SEQ ID NO：25)从cDNA中分离重链可变区DNA片段，3’引物与小鼠IgG1重链恒定区同源反义。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)并测序。重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)，互补决定区的氨基酸残基为CDR-H1(SEQ ID NO：3)，CDR-H2(SEQ ID NO：4)和CDR-H3(SEQ ID NO：5)。互补决定区的定义参见Kabat E.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242。
2)TM2-11-12鼠源抗体的轻链可变区的克隆
以类似重链可变区克隆的PCR方法，使用SEQ ID NO：29作为5’引物和另一个与小鼠免疫球蛋白κ轻链恒定区同源反义的3’引物(5’-CACTGGATGGTGGGAAGATGGATA-3’，SEQ ID NO：26)，从cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆进TOPOTA载体并测序，发现有两类克隆。约3/4的克隆显示部分核苷酸序列不能翻译成能够通读的氨基酸序列(未显示其序列)。此类克隆为畸变轻链信使RNA，不能编码有功能的抗体轻链蛋白。另外约1/4的克隆显示的核苷酸序列则可完全翻译为能够通读的氨基酸序列，此类克隆衍生于有功能的轻链信使RNA。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)并测序。轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)，互补决定区的氨基酸残基为CDR-L1(SEQ ID NO：6)，CDR-L2(SEQ IDNO：7)和CDR-L3(SEQ ID NO：8)。此氨基酸序列用于轻链的人源化设计。
实施例4：重链与轻链可变区的人源化设计
为了保留抗原结合的活性，在人源化过程中所有轻链和重链高变区内的氨基酸残基仍然沿用TM2-11-12鼠源抗体的序列。人源化设计则是依照人抗体的序列改变构架区内的氨基酸残基，设计了具有各种不同修饰的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区，通过计算机模拟技术，将抗体重链和轻链可变区序列的寡核苷酸位点进行定向诱变。以增加抗体结合亲和力或减小抗体免疫原性。
对于人源化抗体重链可变区(SEQ ID NO：1)而言，其中构架区FR-H1内氨基酸16的A能被E替换，氨基酸17的S能被T替换，氨基酸20的I能被V替换；FR-H2内氨基酸3的K能被R替换，氨基酸9的G能被S替换；FR-H3内氨基酸3的T能被V替换，氨基酸7的E能被D替换，氨基酸10的V能被T替换，氨基酸14的F能被Y替换，氨基酸19的S能被T替换，氨基酸27的T能被V替换。
对于抗体人源化轻链可变区(SEQ ID NO：2)而言，构架区FR-L1内氨基酸11的L能被M替换，氨基酸18的R能被E替换，氨基酸21的M能被I替换；FR-L2内氨基酸13的W能被L替换；FR-L3内氨基酸4的S能被A替换，氨基酸22的L能被V替换，以及氨基酸27的A能被F替换。
通过导入上述氨基酸修饰中至少一个修饰，设计多种人源化抗体重轻链可变区的氨基酸序列，部分人源化抗体重链可变区VH、轻链可变区VL氨基酸序列如表1所示：
表1：人源化抗体重链可变区VH、轻链可变区VL氨基酸序列
实施例5：pHu_anti-H1L1-TNFα人源化抗体表达载体的构建
1)人源化抗体轻链基因的构建
首先，以人工合成方法制备人源化抗体轻链可变区(F001VL)的基因片段，制备的程序可先以轻链可变区的氨基酸序列依其相对的遗传密码子反转化取得核苷序列，并于5’终端加入Kozak序列及轻链前导序列，再以人工合成方法制备成轻链可变区的基因片段。将此基因片段克隆入适当载体，得pHu-VL1质粒。其后再以pHu-VL1质粒作为模板，使用5′引物FVHX(5’-CgCgCAAg-CTTCCTCgAg-3’SEQ ID NO：23)和3′引物VKCKO (5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG CTT GATCTC CAG CTT GGT GCC-3’SEQ ID NO：24)得到5′片段，含有人源化抗体的轻链可变区(VL)和人κ轻链恒定区(Cκ)5′端的7个氨基酸的基因片段。在此同时，用从人白细胞制备的RNA以合适的5′引物HuCKF(5’-GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3’SEQ ID NO：25)和3′引物HUCKB (5’-TGC GGA TCC CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA-3’，SEQ ID NO：26)通过逆转录和PCR得到含人κ轻链恒定区(Cκ)编码序列的基因。最后，将含有人源化抗体的轻链可变区(VL1)的片段与以上的人Cκ基因通过PCR，用5′引物(FVHX，SEQ ID NO：17)和3′引物(HUCKB，SEQ ID NO：28)，将人源化的轻链可变区(VL1)和人Cκ基因片段连接起来，得到含有轻链编码序列、长度约为700bp的基因片段。此基因片段以内切酶Hind III和Bam H1处理后，插入载体如PUC19(ref：Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.and Messing，J.(1985)Gene，33，103-119.)，用以表达人源化抗体的轻链蛋白。该基因片段的序列经DNA测序验证正确。
2)人源化抗体重链基因的构建
首先，以人工合成方法制备人源化抗体重链可变区(E001VH)的基因片段，制备的程序可先以重链可变区的氨基酸序列依其相对的遗传密码子反转化取得核苷序列，并于5’终端加入Kozak序列及重链前导序列，再以人工合成方法制备成重链可变区的基因片段。将此基因片段克隆入适当载体，得pHu-VH1质粒。其后再以pHu-VH1质粒作为模板，使用5′引物FVHX(5’-CGCGCAAG-CTTCCTCGAG-3’SEQ ID NO：17)和3′引物RVCG(5’CGATGGGCCCTTGGTGGA3’SEQ ID NO：18)得到5′片段，含有人源化抗体的重链可变区(VH1)和人IgG1重链恒定区(Cγ1)5′端的7个氨基酸的基因。在此同时，用从人白细胞制备的RNA以合适的5′引物HuCGF(5’-ACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3’；SEQID NO：19)和3′引物HUCGE(5’-CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA 3’，SEQ ID NO：20)通过逆转录反应和PCR得到含人IgG1重链恒定区(Cγ1)编码序列的基因。最后，将含有人源化抗体的重链可变区(VH)的片段与以上的人Cγ1基因通过PCR，用5′引物(FVHX，SEQ ID NO：21)和3′引物(HUCGE，SEQ ID NO：22)，将人源化抗体的重链可变区(VH1)和人Cγ1基因片段连接起来，得到含有重链编码序列、长度约为1400bp的基因片段。此基因片段以内切酶Hind III和EcoR1处理后，插入载体如PUC19(ref：Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.andMessing，J.(1985)Gene，33，103-119.)，用以表达人源化抗体的的重链蛋白。该基因片段的序列经DNA测序验证正确。
3)人源化抗体单一链表达载体
用上述方法中获得的重链和轻链的编码cDNA插入到pcDNA3(购自Invitrogen USA，Carlsbad，CA USA)载体中，构建pHu_anti-H1L1-TNFα人源化表达载体。该表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动因子-增强子。同时，载体质粒中含有可选择标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，载体质粒中含有DHFR基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲喋呤(Methotrexate，MTX，Sigma)共扩增嵌合抗体基因和DHFR基因(参见，例如Axel，R.，等人的美国专利5,179,017号；Kaufman，R.和Sharp，P.，J.Mol.Biol.159：601-621，1982)。
实施例6：人源化抗体的表达
将上述已构建的重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达抗hTNFα人源化抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(参见，例如Chasin，L.等人的美国专利4,818,679号)。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为250V电场和960μFd电容的Gene Pulser(Bio-Rad Laboratories)，在比色杯内加入2×107个细胞悬浮在0.8mL的PBS中，并含有10μg用PvuI(TakaRa)线性化的表达载体质粒DNA。转染2天后，加入含有0.2mg/mL G418以及200nM氨甲喋呤(methotrexate或MTX)。为了实现较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因共扩增转染的人源化抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子，测定各细胞系的分泌率，选出高水平表达人源化抗体的细胞株。
实施例7：抗体中和TNFα对L929细胞的杀伤作用研究
将L929细胞用胰蛋白酶消化、离心，以10％FCS的1640培养基重悬、计数，以一定浓度加至96孔板1～11列，再加入合适浓度的TNFα于96孔板1～10列，分别以首孔浓度0.4ug/mL，2倍梯度稀释阿达木单抗(购自雅培公司)、氨基酸未修饰的嵌合抗体AT(CE)-1、以及按照实施例5和6的方法制备的人源化抗体AT132、AT135、AT143、AT151、AT164，每一抗体按从高到低(1列至9列)的浓度分别加至加至96孔板A、B排，C、D排，E、F排和G、H排，第10列为TNFα对照，第11列为细胞对照，第12列为培养基对照，加好后置37℃二氧化碳培养箱中培养。完成孵育后，加入显色液，孵育，酶标仪检测吸光度，结果见表2所示。
表2：抗体中和TNFα对L929细胞的杀伤作用
  抗体类型   重链   轻链   EC50(ng/mL)
  AT132   E001VH   F001VL   20.4
  AT135   E002VH   F001VL   50
  AT143   E003VH   F003VL   39.8
  AT151   E001VH   F002VL   42.1
  AT164   E002VH   F003VL   45.5
  AT(CE)-1   --   --   15.2
  阿达木单抗   --   --   19.1
表2分析结果表明，进行FR区突变后的人源化抗体仍然具有较好的中和TNFα的活性，AT132的EC50值与阿达木单抗相近，为20.4ng/mL。
实施例8：AT132中和TNFα对人U937细胞(人淋巴瘤)的杀伤作用研究
取状态良好的U937细胞，计数后以10％FCS的1640培养基调整细胞浓度至3.75×104个/孔，按75μl/孔加入到96孔培养板。用含120ng/mL TNFα的细胞培养液分别梯度稀释AT132标准品和供试品，使其首孔浓度均为600ng/mL、稀释梯度1.5倍，稀释完毕后分别以25μl/孔加至96孔板，置37℃二氧化碳培养箱中培养40小时。孵育完成后，每孔加入10μl CCK8显色液，孵育3h，酶标仪490nm/630nm双波长检测，以四参数进行曲线拟合，统计标准品和供试品的ED50，计算比活性(公式：100％×标准品ED50/供试品ED50)。
图1为抗体中和TNFα杀伤U937细胞作用曲线
图1分析结果表明，在AT132极低浓度的情况下TNFα对细胞基本处于杀伤状态，随着AT132浓度的增高，TNFα的作用逐渐被拮抗，至AT132浓度约80ng/mL时TNFα的杀细胞作用基本被完全拮抗，因此存在明显的剂量依赖性，根据多次试验的结果，其中和30ng/mL TNFα的半数有效浓度平均为24.1ng/mL。
实施例9：AT132亲和力测定
应用Biacore X100测定，Biacore X100动力学/亲和力软件分析，采用间接捕获的方法，通过Amine Coupling Kit把羊抗人IgG Fc多克隆抗体偶联在CM5芯片表面作为捕获分子，通过计算分别把AT132和对照阿达木单抗稀释到一定浓度作为配体，把TNFα作为分析物。分析物稀释5个浓度，每个浓度作为一个循环，先用HBS-EP缓冲液运行3个循环，设计一个分析物浓度为0浓度运行2个循环，最后设计一个重复的分析物浓度运行1个循环。整个过程运行11个循环，每个循环都可绘制一条曲线，通过Biacore X100动力学/亲和力分析软件分析得到所测抗体阿达木单抗的动力学/亲和力数据。
测定结果：AT132解离常数(Kd)为1.19×10-11M，即亲和常数(Ka)为8.4×1010M-1，阿达木单抗解离常数为1.08×10-10M，即亲和常数为9.3×109M-1。
实施例10：AT132与鼠TNFα和猴TNFα结合活性
分别包被重组人TNFα5ng/孔，小鼠TNFα25ng/孔，猴TNFα5ng/孔，室温封闭1h，洗涤，然后加入1.8倍梯度稀释的AT132，起始浓度为250ng/mL，25℃孵育2h，洗涤，加入HRP标记的抗人Fc抗体，室温孵育1h，洗涤后加入底物溶液，100μl/well，37℃避光30min，按照加显色液的顺序，加入0.2M H2SO4，50μl/well，终止反应。终止约5分钟内，在酶标仪上450nm/630nm测OD值，采用四参数拟合，得出半数有效浓度，比较AT132与不同种属来源的TNFα的结合活性。
与小鼠TNFα结合活性的比较研究结果表明，AT132与小鼠TNFα无结合，根据包被浓度和AT132加样浓度计算，其与小鼠TNFα结合活性至少比与人TNFα的结合活性低1000倍。
与猴TNFα结合活性的比较研究结果表明，结果与猴TNFα结合活性约为与人TNFα结合活性的50％。
实施例11：注射剂的制备
AT132、AT135注射剂制备方法如下：
1)制备20L缓冲液(相当于20.180kg-溶液的密度：1.009g/mL)
称量出以下重量的成分：240.0g甘露糖醇、26.1g一水合柠檬酸、6.1g柠檬酸钠、30.6g二水合磷酸氢二钠、17.2g二水合磷酸二氢钠、123.3g氯化钠、20.0g失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯和19715.7-19716.1g的水。
通过将40.0g的氢氧化钠与1000.8g的注射用水混合制备氢氧化钠溶液。
然后，通过将以下预先称量好的成分(如上文所述)溶解在大约90％的注射用水中制备缓冲液：甘露糖醇、一水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
在添加上述所有缓冲液成分之后，用按上述方法制备的1M氢氧化钠调节该溶液的pH。在添加氢氧化钠之后，添加最终重量的水。然后通过过滤膜(亲水性聚偏二氟乙烯，0.22μm孔径)将缓冲液过滤到无菌容器中。所使用的过滤介质是过滤消毒的氨气。
2)制备40L制剂(相当于40.88kg)
将过滤的缓冲溶液添加到按以下方法制备的解冻的并且合并的抗体浓缩物(所述药物制剂的活性成分)中。在制备所述药物制剂之前的水浴中对所述抗体(浓缩物)进行解冻。使用34.207g抗体浓缩物，它相当于2.0kg的蛋白，浓度为60mg蛋白/mL蛋白浓缩物。所述浓缩物的密度为1.0262g/mL。可以使用25.655-37.316范围内的任何蛋白浓缩物，它相当于蛋白浓缩物中蛋白的浓度为50-80mg/mL。在搅拌状态下添加所述缓冲液，直到达到总溶液的最终重量。
然后按照上述方法，过滤包含它的所有成分的制剂，所不同的是所述制剂是通过两层无菌0.22μm的膜过滤器过滤的。在消毒之后，对所述制剂进行包装，以便在管形瓶或预先填充的注射器中使用。
实施例12：AT132小鼠急性毒性试验
受试样品：AT132冻干粉针，规格：20mg/瓶；辅料对照品：AT132缓冲液(含组氨酸、海藻糖)；溶剂：灭菌注射用水。试验动物分组和给药剂量：4-6周龄昆明(KM)小鼠60只，18-22g，雌雄各半，SPF级。将以上动物随机分为3组，每组20只，雌雄各半。单次给药，观察14天。按表3所示给药剂量和给药途径：
表3：给药剂量和给药途径
观察指标：体重、食量、精神状态、行为活动、粪便性状等，试验观察期结束后，将动物实施安乐死并进行病理学大体解剖观察，发现异常组织或器官进行组织学检查。
结果：试验期间，所有动物未发生死亡或濒死；所有动物精神状态良好，行为活动、饮食、饮水正常，未见明显异常表现。各给药组动物的体重未见有与给药相关的规律性改变。病理学大体解剖观察未见与给药相关的异常变化。
结论：在本试验条件下，AT132粉针以500mg/kg的剂量单次静脉和皮下注射给予小鼠，未见明显毒性反应，最大耐受剂量(MTD)大于500mg/kg。
实施例13：AT132对D-氨基半乳糖致敏小鼠rhTNFα诱导致死保护作用
取C57BL/6小鼠51只，体重为20.0±2.0g，分为6组(见表4)。第2-5组小鼠每只分别腹膜内注射AT132溶液0.25mL，其中，第2组小鼠每只给药剂量以AT132计是5.2μg/只，第3组小鼠每只给药剂量以AT132计是26μg/只，第4组小鼠每只给药剂量以AT132计是52μg/只，第5组小鼠每只给药剂量以AT132计是26μg/只；第1组小鼠每只腹膜内均注射pH 5.63的柠檬酸盐缓冲液0.25mL，第6组小鼠每只腹膜内均注射0.25mL人IgG1(HuIgG1，阴性对照)，以HuIgG1计是26μg/只。30分钟后各组小鼠(除第5组外)每只均腹膜内注射0.25mLrhTNFα(Primegene，批号1030109021)和D-氨基半乳糖混合物溶液，第5组小鼠腹膜内注射0.25mL缓冲液，观察48小时的小鼠致死数，计算存活率如表4所示。
表4：各组小鼠存活率
结果：缓冲液和HuIgG1组小鼠存活率为0，而AT132剂量依赖地保护了rhTNFα和D-氨基半乳糖致敏小鼠。因此，AT132对D-氨基半乳糖致敏小鼠rhTNFα诱导致死有保护作用。
实施例14：AT132对大鼠II型胶原诱导的关节炎的作用研究
取Wistar雌性大鼠50只随机分为4组，每组均为10只。分别为空白对照组、致炎对照组(即模型组)、AT132 1mg/kg组、AT132 5mg/kg组。
除空白对照组，其余各组分别在大鼠背部皮内注射II型胶原免疫，致炎对照组注射0.1mol/L醋酸及完全或不完全弗氏佐剂乳化液(Sigma公司，批号129K8701).
AT132 1mg/kg、AT132 5mg/kg组于注射免疫当天开始腹腔注射给药。于第1次免疫后一周再以同样方式加强免疫一次，共给药28天。给药前及给药后不同时间用YLS-7B足趾容积测量仪测量大鼠足关节肿胀值。实验结束后取足关节做病理检查。然后计算肿胀率及抑制率，组间差异以t检验进行比较。计算公式如下：
En致炎后不同时间的肿胀值
E0＝致炎前的肿胀值
实验数据以均数和标准差(s)表示，采用t检验进行分析统计。结果见图2所示。AT1321mg/kg组显示明显的抑制效果，在第19天开始即有较好疗效，且此时疗效最佳为63.10％，此后抑制效果逐渐降低，在第28天仍有比较好的效果，抑制率为55.71％；AT132 5mg/kg组显示出明显的抑制效果，从第19天开始有显著疗效，大鼠足关节红肿逐渐消退，活动趋于正常，疗效一直持续到第28天，抑制率第21d最高，为47.27％，其它均为40％左右。
实施例15：AT132对Tg197小鼠关节炎模型的药效学研究
本实验选用Tg197转基因小鼠(购自Cyagen Biosciences)，将小鼠分为6组，每组10只小鼠，雌雄各半。具体为：组1：AT132 1mg/kg；组2：溶剂组(含柠檬酸和氯化钠的缓冲液)；组3：AT132 30mg/kg；组4：AT132 10mg/kg)；组5：阿达木单抗10mg/kg；组6：AT132 3mg/kg。另外选择4只Tg197小鼠做为空白对照组。
给3周龄Tg197小鼠腹腔内注射AT132，每周2次，至10周龄；给药前用缓冲液将AT132稀释至所需的浓度，每组给予受试药物的剂量为10μl/g体重，观察小鼠关节炎程度，对小鼠裸关节进行病理学评分，根据关节炎评分和病理评分计算抑制率。
1)AT132对Tg197小鼠关节炎程度的研究
每周对小鼠关节形态变化进行评分以评估关节炎程度，具体关节炎评分标准如下：
0.0＝没有关节炎(外观正常，小鼠能够支持身体的体重，整体的灵活性/逃避能力正常，握力最大)；
0.5＝发病的关节炎(关节爪子轻微肿胀，外观正常，小鼠能够支持身体的体重，整体的灵活性/逃避能力正常，握力最大)；
1.0＝轻度关节炎(关节肿胀变形，爪子红肿，外观正常，小鼠能够支持身体的体重，整体的灵活性/逃避能力正常，握力最大)；
1.5＝轻度到中度关节炎(关节爪子肿胀，变形+最后手指向内变形，简短支持上部的重量边缘是/否，整体灵活性减低，握力减少)；
2.0＝中度关节炎(严重关节、爪子和手指肿胀，脚关节变形，不能支持上部体重跌倒，整体灵活性消失，握力消失，爬行/进食受影响)；
2.5＝中度到严重关节炎(严重关节、爪子和手指肿胀，脚关节变形，不能支持上部体重跌倒，整体灵活性消失，握力消失，爬行/进食受影响+手指爪子变形，小鼠活动受损)；
3.0＝严重关节炎(关节僵硬，检测到弯曲和严重活动受损，小鼠垂死挣扎)。
Tg197小鼠关节炎在体评分如图3A所示：
2)Tg197小鼠的踝关节组织病理学研究
为了监测疾病的状态，本试验的4只同窝出生的Tg197小鼠(编号为Con1-Con4)在3周龄时处死，作为治疗开始的关节样本。实验小鼠于10周龄时处死，取踝关节切片，苏木/伊红染色好后以盲法的方式进行关节炎的显微镜组织病理得分评价，其评级为0-4，如下：
0＝无可检测的病理
1＝滑膜增生，多形核白细胞存在浸润
2＝血管翳及纤维组织的形成和病灶软骨下骨质侵蚀
3＝软骨破坏和骨质侵蚀
4＝扩大的软骨破坏和骨质侵蚀
Tg197小鼠的组织病理学分析如图3B、3C所示
3)根据关节炎和病理评分计算抑制率。
根据关节炎评分计算抑制率，计算公式如下：
En＝各组关节炎评分
E0＝溶剂组关节炎评分
根据病理学评分计算抑制率，计算公式如下：
En＝各组病理学评分
E0＝溶剂组病理学评分
结果见表5所示。
表5：小鼠关节炎评分抑制率和病理评分抑制率研究
结果：给予不同剂量AT132(组1，组3，组4，组6)后，对类风湿关节炎表现出显著的抑制作用，呈现出典型的量效作用。特别是从组1(1mg/kg)到组6(3mg/kg)，其抑制作用能够明显的区别开来。从组6(3mg/kg)到组4(10mg/kg)，其抑制作用又明显的区别开来。只有组4(10mg/kg)与最高剂量组3(30mg/kg)间的抑制作用没有区别。重要的是在10mg/kg相同剂量水平，AT132治疗组4与阿达木治疗组5间的抑制作用没有显著性差异，与溶剂组2相比对关节炎的组织病理有明显改善作用。
实施例16：AT132单克隆抗体组织交叉反应
1)AT132单克隆抗体人体组织交叉反应
将人鼻息肉石蜡切片及四套正常人体组织(供体A、B、C、D，由中国食品药品检定研究院，国家药物安全评价监测中心提供)石蜡切片分为3组，分别为实验组(生物素标记AT132)、阳性对照组(生物素标记阿达木单抗)、阴性对照组(缓冲液PBS)，观察组织交叉反应后的组织切片的着色情况。
实验结果表明，阴性对照组人鼻息肉以及正常人体各组织均无染色。生物素-阿达木单抗阳性对照组与人体鼻息肉的巨噬细胞、正常人体淋巴结的巨噬细胞以及肺脏的肺泡巨噬细胞可见弱到中度染色；其余组织无染色。生物素-AT132实验组与人体鼻息肉的巨噬细胞可见弱到中度染色；正常人体组织交叉反应与阿达木单抗具有相似结果。
2)AT132单克隆抗体食蟹猴组织交叉反应
将人鼻息肉石蜡切片及三套正常食蟹猴组织(供体A、B、C，由中国食品药品检定研究院，国家药物安全评价监测中心提供)石蜡切片分为3组，分别为实验组(生物素标记AT132)、阳性对照组(生物素标记阿达木单抗)、阴性对照组(缓冲液PBS)，观察组织交叉反应后的组织切片的着色情况。
实验结果表明，阴性对照组人鼻息肉以及正常食蟹猴各组织均无染色。生物素-阿达木单抗阳性对照组与人体鼻息肉的巨噬细胞可见弱到中度染色；正常食蟹猴组织无染色。生物素-AT132实验组与人鼻息肉的巨噬细胞可见弱到中度染色。正常食蟹猴组织交叉反应与阿达木单抗具有相似结果。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体，其包括重链和轻链，所述抗体选自AT132、AT135、AT143、AT151和AT164，其中AT132包括重链可变区序列SEQ ID No.:1和轻链可变区序列SEQ ID No.:2；AT135包括重链可变区序列SEQ ID No.:27和轻链可变区序列SEQ IDNo.:2；AT143包括重链可变区序列SEQ ID No.:28和轻链可变区序列SEQ ID No.:32；AT151包括重链可变区序列SEQ ID No.:1和轻链可变区序列SEQ ID No.:31和AT164包括重链可变区序列SEQ ID No.:27和轻链可变区序列SEQ ID No.:32。
2.编码如权利要求1所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体的核酸序列。
3.包括如权利要求2所述的核酸序列的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其中所述载体也包括与所述核酸可操作性连接以有利于其表达的启动子。
5.包含如权利要求3或4所述的载体的宿主细胞。
6.如权利要求1所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体在制备用于hTNFα的诊断性分析的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体在制备用于治疗hTNFα有关的疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述的hTNFα有关的疾病是脓毒症、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肺功能紊乱、移植排斥、细菌性脑膜炎、脑型疟、AIDS和AIDS相关综合症(ARC)、移植继发的巨细胞病毒感染。
9.包括如权利要求1所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体的药物组合物，其中所述药物组合物包括如权利要求1所述的抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体和可药用赋形剂。
10.一种抗肿瘤坏死因子人源化单克隆抗体，其包括重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列是SEQ ID No.：1，所述轻链可变区序列是SEQ ID No.：2。
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