KR20080080675A - 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체 - Google Patents

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헨리 비. 로우만
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조나단 에스. 마빈
사만다 리엔
유-주 지. 멩
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 변경된 Fc 이펙터 기능을 나타내는 폴리펩티드가 생성되도록 하는 아미노산 변형을 수반한 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
변이체 Fc 영역, 변경된 이펙터 기능, 폴리펩티드, IgG Fc 영역, Fc 이펙터

Description

변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체 {Polypeptide Variants with Altered Effector Function}
본 출원은 2004년 8월 19일자로 출원된 미국 가특허원 제60/603,057호 (이 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)의 이권을 청구하고 있다.
본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 그의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형이 발생함에 따라 변경된 이펙터 기능을 지닌 Fc 영역-함유 폴리펩티드에 관한 것이다.
항체는 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 천연 항체는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연쇄 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다 른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하고, 이러한 부분이 그의 특정한 항원에 대한 특정한 각 항체의 결합 특이성에 책임이 있다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리우는 3가지 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분이 골격 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 CDR은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)].
불변 영역은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 이펙터 기능을 나타낸다. 그들 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체 또는 면역글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 면역글로 불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중의 몇 가지는 아부류 (이소형), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다. 인간 면역글로불린 부류 중에서 인간 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgM 만이 보체를 활성화시키는 것으로 공지되어 있고, 인간 IgGl 및 IgG3은 IgG2 및 IgG4보다 더 효과적으로 ADCC를 매개한다.
천연의 IgGl 구조를 도식적으로 나타낸 것이 도 1A에 도시되었는데, 여기서는 천연 항체 분자의 각종 부분이 표시되었다. 항체를 파파인 분해시키면, Fab 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원 결합성 단편 (각각은 단일 항원 결합 부위를 갖는다)과 잔류성 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 인간 IgG Fc 영역의 결정 구조가 결정되었다 [참고: Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981)]. 인간 IgG 분자에서는, Fc 영역이 Cys 226에 대해 N-말단인 파파인 절단에 의해 생성된다. Fc 영역은 항체의 이펙터 기능에 있어 중요하다.
항체 이펙터 기능
항체 Fc 영역에 의해 매개된 이펙터 기능은 다음 2가지 범주로 나눌 수 있다: (1) 항체가 항원과 결합한 후에 작동하는 이펙터 기능 [이러한 기능은 보체 케스케이드 또는 Fc 수용체 (FcR)-보유 세포의 참여와 관련이 있다]; 및 (2) 항원 결합과는 독립적으로 작동하는 이펙터 기능 [이러한 기능은 순환시 영속성을 부여해 주고, 트랜스사이토시스 (transcytosis)에 의해 세포성 장벽을 가로질러 전이될 수 있는 능력을 부여해 준다] [참고: Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)].
특정 항체가 그의 필수 항원과 결합하는 것이, 외래 항원이 그의 내인성 표적 (예: 수용체 또는 리간드)와 결합하는 것을 방지하기도 하는 중화 효과를 지니긴 하지만, 결합 자체가 외래 항원을 제거시킬 수는 없다. 외래 항원을 효율적으로 제거하고/하거나 파괴시키기 위해, 항체가 자신의 항원과 높은 친화도로 결합할 수 있으면서도 효율적인 이펙터 기능을 지녀야만 한다.
항체 및 항체-항원 복합체와 면역계 세포와의 상호 작용으로 인해, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 포함한 각종 반응이 일어난다 [참고: Daeron, Annu . Rev . Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); as well as Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)].
몇 가지 항체 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역과 결합하는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 매개된다. FcR은 면역글로불린 이소형에 대한 그들의 특이성에 의해 규정되는데; 예를 들어, IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로서 지칭되고, IgE 항체에 대한 Fc 수용체는 FcεR로서 지칭되며, IgA 항체에 대한 Fc 수용체는 FcαR로서 지칭된다. FcγR의 3가지 아부류가 확인 (동정)되었다: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16). 각 FcγR 아부류는 2개 또는 3개의 유전자에 의해 코딩되고, 대체 RNA 스플라이싱으로 인해 다중 전사체가 생성되기 때문에, 광범위하게 다양한 FcγR 이소형들이 존재한다. FcγRI 아부류 (FcγRIA, FcγRIB 및 Fcγ RIC)를 코딩하는 3가지 유전자는 염색체 장 암 (arm)의 영역 1q21.1에 군집되어 있고; FcγRII 이소형 (FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC)을 코딩하는 유전자 및 FcγRIII 이소형 (FcγRIIIA 및 FcγRIIIB)을 코딩하는 2개의 유전자는 모두 영역 1q22에 군집되어 있다. 이들 상이한 FcR 아유형은 상이한 세포 유형 상에서 발현된다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)]. 예를 들어, 인간에게서는 FcγRIIIB가 호중구에서만 발견되는 반면, FcγRIIIA는 대식 세포, 단구, 천연 킬러 (NK) 세포, 및 T-세포 아집단 상에서 발견된다.
구조적으로, FcγR은 2개 (FcγRI 및 FcγRIII) 또는 3개 (FcγRI) Ig-유사 도메인으로 구성된 세포외 부분을 갖는 IgG-결합성 α-쇄를 갖는, 면역글로불린 초분자군의 모든 구성원이다. 또한, FcγRI 및 FcγRIII은 신호 변환에 있어 기능하는 α-쇄와 연합된 보조 단백질 쇄 (γ,ζ)를 갖는다. 이들 수용체는 또한, IgG에 대한 그들의 친화성으로써 구별된다. FcγRI은 IgG에 대한 고 친화도 [Ka = 108 내지 109M-1]를 나타내고 [참고: Ravetch et al. Ann . Rev . Immunol. 19:275-290 (2001)], 단량체성 IgG와 결합할 수 있다. 이와는 달리, FcγRII 및 FcγRIII은 단량체성 IgG에 대한 비교적 약한 친화도를 나타내므로 [Ka ≤ 107M-1] [참고: Ravetch et al. Ann . Rev . Immunol. 19:275-290 (2001)], 단지 다량체성 면역 복합체와만 효과적으로 상호 작용한다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함되는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [참고: Daeron, Annu . Rev . Immunol. 15: 203-234 (1997)]. NK 세포는 FcγRIIIA 만을 수반하므로, FcγRIIIA에 대한 항체 결합으로 인해, NK 세포에 의해 ADCC 활성이 유발된다.
인간 FcγR 중의 몇 가지의 대립유전자성 변이체가 인간 집단에게서 발견되었다. 이들 대립유전자성 변이체 형태는 인간 및 뮤린 IgG의 결합에 있어 상이성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이와 연관된 수 많은 연구 결과, 임상적 성과가 특이적 대립유전자성 형태의 존재와 상관이 있었다 [참고: Lehrnbecher et al. Blood 94(12):4220-4232 (1999)]. 몇 가지 연구는 FcγRIIA의 2가지 형태, 즉 R131 및 H131과, 그들과 임상적 성과 간의 연관성에 관해 조사하였다 [참고: Hatta et al. Genes and Immunity 1:53-60 (1999); Yap et al. Lupus 8:305-310 (1999); and Lorenz et al. European J. Immunogenetics 22:397-401 (1995)]. FcγRIIIA의 2가지 대립유전자성 형태인 F158 및 V158은 현재 연구중에 있다 [참고: Lehrnbecher et al., 상기 참고; and Wu et al. J. Clin . Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)]. FcγRIIIA (Vall58) 동종이형 (allotype)은 FcγRIIIA (Phel58) 동종이형보다 더 우수하게 인간 IgG와 상호 작용한다 [참고: Shields et al. J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001); Koene et al. Blood 90:1109-1114 (1997); and Wu et al. J. Clin . Invest. 100: 1059-1070 (1997)].
FcγR에 대한 인간 및 뮤린 항체 상의 결합 부위는 기존에는, 잔기 233 내지 239 (문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에서와 같은 EU 인덱스 넘버링)로 이루어진 소위 "하부 힌지 영역"에 위치하였다 [참고: Woof et al. Molec . Immunol. 23:319-330 (1986); Duncan et al. Nature 332:563 (1988); Canfield and Morrison, J. Exp . Med . 173:1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 88:9036-9040 (1991)]. 잔기 233 내지 239 중에서, P238 및 S239가 결합에 관여하는 것으로 추정된다고 언급되었다.
기존에 FcγR에 대한 결합에 관여하는 것으로 추정되는 것으로 언급된 기타 부위는, 인간 FcγRI의 경우에는 G316-K338 (인간 IgG)이고 (단지 서열 비교에 의함; 치환 돌연변이체에 관해서는 전혀 평가하지 않았다) [참고: Woof et al. Molec. Immunol. 23:319-330 (1986)]; 인간 FcγRIII의 경우에는 K274-R301 (인간 IgGl) (펩티드에 기초함)이며 [참고: Sarmay et al. Molec . Immunol. 21:43-51 (1984)]; 인간 FcγRIII의 경우에는 Y407-R416 (인간 IgG) (펩티드에 기초함)이고 [참고: Gergely et al. Biochem . Soc . Trans. 12:739-743 (1984)]; 뿐만 아니라 뮤린 FcγRII의 경우에는 N297 및 E318 (뮤린 IgG2b)이다 [참고: Lund et al., Molec. Immunol. 29:53-59 (1992)]. 또한, 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Armour et al. Eur . J. Immunol. 29: 2613-2624 (1999)].
미국 특허 제6,737,056호 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 저하 된 폴리펩티드 변이체가 기재되어 있다. 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Shields et al. J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]. FcγR과 결합하는 변이체 Fcs가 또한 WO 2004/063351에 기재되어 있다.
Clq와 2개의 세린 프로테아제인 Clr 및 Cls는 복합체 Cl을 형성하는데, 이는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분이다. C1q는 분자량이 대략 460,000이고, 6개의 콜라겐성 "줄기"가 6개의 구상 두부 영역에 연결되는 튤립 부케와 비슷한 구조를 지닌 6가 분자이다 [참고: Burton and Woof, Advances in Immunol. 51:1-84 (1992)]. 보체 케스케이드를 활성화시키기 위해서는, C1q가 IgGl, IgG2, 또는 IgG3 중의 적어도 두 분자와는 결합하지만 (IgG4가 보체를 활성화시키지 않는다는 것에는 일치한다), 항원성 표적에 부착된 IgM의 한 분자와만 결합할 필요가 있다 [참고: Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) at page 80].
화학적 변형 및 결정학적 연구 결과에 기초하여, 문헌 [참고: Burton et al. Nature, 288:338-344 (1980)]에서는 IgG 상의 보체 아성분 C1q에 대한 결합 부위가 CH2 도메인의 마지막 2개 (C-말단) β-가닥과 관련이 있다고 제안하였다. 상기 문헌의 저자는 나중에, 아미노산 잔기 318 내지 337을 포함하는 영역이 보체 고정에 관여할 수도 있다고 제안하였다 [참고: Molec . Immunol ., 22(3): 161-206 (1985)].
부위 지시된 돌연변이 유발을 사용하는 문헌 [참고: Duncan and Winter Nature 332:738-40 (1988)]에는 Glu318, Lys320 및 Lys322가 C1q에 대한 결합 부위를 형성한다고 보고되었다. 상기 문헌의 데이터는 기니아 피그 (guinea pig) C1q 에 대한 마우스 IgG2b 이소형의 결합을 시험함으로써 발생되었다. C1q의 결합에 있어서의 Glu318, Lys320 및 Lys322 잔기의 역할은 보체 매개된 용해를 억제할 수 있는, 이들 잔기를 함유하는 짧은 합성 펩티드의 능력에 의해 확증되었다. 유사한 잔기가 미국 특허 제5,648,260호 (1997년 7월 15일자로 허여됨) 및 미국 특허 제5,624,821호 (1997년 4월 29일자로 허여됨)에 기재되었다.
잔기 Pro331은 보체 매개된 세포 용해를 수행할 수 있는 인간 IgG 아부류의 능력을 분석함으로써 C1q 결합에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. IgG4에서 Ser331가 Pro331로 돌연변이되면, 보체를 활성화시킬 수 있는 능력이 부여되었다 [참고: Tao et al., J. Exp . Med ., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur . J. Immunol ., 24:2542-47 (1994)].
상기 윈터 (Winter) 그룹의 데이터와, 타오 (Tao) 등의 문헌 및 브레케 (Brekke) 등의 문헌을 비교함으로써, 워드 (Ward)와 게티 (Ghetie)는 적어도 2개의 상이한 영역이 C1q의 결합에 관여하는데, 그중 한 가지는 Glu318, Lys320 및 Lys322 잔기를 보유하고 있는 CH2 도메인의 β-가닥 위에 있고, 다른 하나는 동일한 β-가닥에 아주 근접하여 위치하고 위치 331에 주요 아미노산 잔기를 함유하는 선회 (turn) 상에 존재한다고 결론지었다.
기타 보고서는 하부 힌지 영역에 위치한 인간 IgGl 잔기 Lys235, 및 Gly237이 보체 고정과 활성화에 있어 결정적인 역할을 한다고 제안하였다 [참고: Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993)]. WO94/29351 (1994년 12월 22일자로 공개됨)에는 인간 IgGl의 C1q 및 FcR 결합에 필요한 아미노산 잔기가 CH2 도메 인의 N-말단 영역, 즉 잔기 231 내지 238에 위치한다고 보고되었다.
C1q와 결합할 수 있는 능력과, 보체 케스케이드를 활성화시킬 수 있는 능력 또한, 2개의 CH2 도메인 사이에 위치한 탄수화물 부분 (이는 통상적으로 Asn297에 고정된다)의 존재, 부재 또는 변형에 좌우된다고 추가로 제안되었다 [참고: Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) at page 81].
변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖고, 증가되거나 저하된 C1q 결합 능력을 지닌 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551Bl호 및 WO 99/51642에 기재되었다 (이들 특허의 전문이 본원에 참고로 도입된다). 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)].
또 다른 유형의 Fc 수용체는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)이다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로불린에 비공유적으로 결합된 α-쇄로 이루어진다. 신생아 Fc 수용체 FcRn의 여러 가지 기능이 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ghetie and Ward (2000) Annu . Rev . Immunol. 18, 739-766]. FcRn은 항체 Fc 영역과의 pH-의존성 상호 작용에 기초하여 IgG 생체항상성에 있어 중요한 역할을 한다 [참고: Ghetie and Ward (2000) Annu Rev Immunol 18, 739-766; Ghetie and Ward (1997) Immunol Today 18, 592-598]. pH 7.4에서는 Fc-FcRn 복합체의 저 친화성을 유지하면서도 pH 6에서는 Fc-FcRn 복합체의 친화성을 증가시키는 것이 항체 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279, 6213-6216]. FcRn은 면역글로불린 IgGs를 어머니로부터 자식으로 수동 전달하고 혈청 IgG 수준을 조절하는데 있어 일정 역할을 한다. FcRn은 재이용 (salvage) 수용체로서 작용하여, 도 6에 예시된 바와 같이, 천연 형태의 세포흡수 작용된 IgGs와 결합하고 이를 세포 내와 세포를 가로질러 수송하며, 이들을 디폴트 분해 경로로부터 구조한다. IgGs를 재이용하는데 책임이 있는 기전은 여전히 명확치 않지만, 결합되지 않은 IgGs은 리소솜 내에서 단백질 분해되도록 지시되는 반면, 결합된 IgGs는 세포 표면에 재순환되어 방출된다고 여겨진다. 이러한 제어는 성체 조직 전반에 걸쳐 위치한 내피 세포 내에서 일어난다. FcRn은 적어도 간, 유선 및 성체 창자 (장)에서 발현된다.
FcRn은 IgG과 결합하므로, 이러한 FcRn-IgG 상호 작용을 광범위하게 연구한 결과, 이는 IgG의 Fc 영역의 CH2,CH3 도메인 계면 하의 잔기와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 이들 잔기는 FcRn의 α2 도메인 내에 주로 위치한 잔기와 상호 작용한다.
문헌 [참고: Ghetie et al. in Nature Biotechnology 15: 637-640 (1997)]에는 FcRn-IgG 상호 작용 부위에 근접하여 위치한 잔기인, 뮤린 Fcγ1 내의 Thr252, Thr254, 및 Thr256을 무작위 돌연변이시켜, 이들 변이체 힌지-Fc 단편의 혈청 반감기에 대한 효과를 연구하였다고 보고되었다. 뮤린 FcRn에 대한 친화도가 가장 높은 돌연변이체는 pH 7.4에서 FcRn로부터의 그의 이탈 속도가 더 낮음에도 불구하고 야생형 단편보다 반감기가 더 길다.
기존의 연구에서 광범위하게 알라닌-스캐닝한 결과 [참고: Presta and colleagues (Shields et al., J. Biol . Chem. 276: 6591-6604 (2001); Presta US patent 6,737,056], Fc:FcRn의 친화성을 각각 3.5배, 2.2배 및 1.8배 증가시키는 3 가지 Fc 변이체 N434A, E38OA, 및 T307A를 확인 (동정)하였다. 이러한 삼중 돌연변이체는 pH 6에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형과 비교해서 12배 정도 증가하였다.
인간 Fc:FcRn과 랫트 Fc-FcRn 간의 구조적 상동성을 고려하여 (이에 대한 x-선 구조는 공지되어 있다) [참고: Burnmeister et al., Nature 372: 336-343 (1994); Burnmeister et al., Nature 372: 379- 383 (1994)], 다음 문헌의 저자들은 파지 디스플레이 (phage display)에 의해 보다 높은 친화도 개선을 추구하였다 [참고: Dall'Acqua et al. (Journal of Immunology. 169: 5171-5180 (2002); US2003/0190311)]. 이들은 Fc의 4개의 무작위화 라이브러리 [각 라이브러리는 완전히 무작위화된 4개 또는 5개의 잔기를 갖는다 (즉, 가능한 모든 아미노산 잔기가 치환되어, 2개 라이브러리는 204가지 다양성을 나타내고, 2개의 라이브러리는 205가지 다양성을 나타낸다)]를 작제하였고, 이들을 대상으로 하여 뮤린 FcRn와 결합하는 것을 선별하였다. 이들은 이들 라이브러리를 스크리닝하기 위해 인간 FcRn을 사용하고자 한 노력들은 성공적이지 못하였다고 보고하였다. 뮤린 FcRn을 사용하여 파지 선별로부터 확인된 결합성-친화성 개선으로 인해 인간 FcRn에 대한 결합성이 또한 개선되긴 하였지만, 문헌 [참고: Dall'Acqua et al., 2002]에 기재된 방법을 사용하여 인간 FcRn을 이용한 직접적인 파지 선별은 성공적이지 못하였다고 보고되었다. 이들 라이브러리로부터, 이들은 H433, N434, 및 Y436에서 돌연변이를 나타내고, M252, S254, 및 T256에서 돌연변이를 나타내는 변이체를 확인하였다. 이들 라이브러리-유래된 변이체들 중의 2개, 즉 H433K+N434F+Y436H 및 M252Y+S254T+T256E가 pH 6.0에서 뮤린 FcRn과 인간 FcRn 둘 다에 대해 10배 내지 20배 증가된 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 돌연변이의 조합으로 인해서는, 뮤린 FcRn에 대한 결합이 30배 증가하였고 인간 FcRn에 대한 결합은 57배 증가하였다. 그러나, 이들 변이체는 pH 7.4에서도 증가된 친화성을 나타내긴 하였지만, 마우스에서는 반감기를 연장시키지 못하였다. 이는 효율적인 IgG 재순환이 pH 의존적 친화성과 관계가 있다는 상기 결론을 뒷받침해준다. 영장류 종이나 인간 FcRn 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서의 이들 변이체에 대해서는 어떠한 결과도 보고되지 않았다.
US 6,277,375, US 6,821,505 및 US 6,165,745 (Ward et al)에는 Fc 위치 434에서 돌연변이를 나타내고 반감기가 증가된 면역글로불린-유사 도메인이 기재되어 있다. 이로써 생성된 돌연변이체 N434Q는 실제적으로, 감소된 반감기를 나타내었다. WO 98/23289 (Israel and Simister)에서는 FcRn에 대한 결합에 영향을 미치기 위해 일반적으로 잔기 434를 부가, 치환 또는 결실시킴으로써 이러한 잔기를 변경시키는 것에 관해 논의되어 있지만, 이 잔기가 어느 잔기로 치환되어야 하는지 아니면 어떤 잔기를 부가해야 하는지에 관한 언급은 없었다.
인간 Fc-FcRn 계면을 모형으로 하는 랫트 Fc-FcRn 복합체에 대한 구조적 상동성을 또한 고려하여 [참고: Burnmeister et al., 1997], 다음 문헌의 저자들은 huFcRn을 결합하는데 중요할 수 있는 잔기로서 인간 IgG2 내의 잔기 T250, L314, 및 M428을 확인하였다 [참고: Hinton et al., J. Biol . Chem. 279: 6213-6216 (2004)]. 이들은 pH 6.0에서는 인간 FcRn에 대한 친화도가 각각 약 3배 및 7배 더 높았지만, pH 7.5에서는 실재적인 결합을 전혀 나타내지 않은 것으로서 돌연변이물 T250Q 및 M428L을 확인하였다. 조합 변이체 T250Q+M428L는 28배 증가된 결합성을 지닌 것으로 보고되었다. 붉은털 원숭이 (rhesus monkey) FcRn에 대해서는 유사한 결합이 관찰되었다. 약동학적 연구 결과, 이들 2가지 돌연변이물을 수반한 IgG2 항체는 붉은털 원숭이에서 약 1.9배 정도 더 긴 제거 반감기 (t 1/2 베타)를 지닌 것으로 나타났다.
당해 분야에서는 이펙터 기능을 개선시키거나 조정시킨 항체, 특히 치료적 항체를 생성시킬 필요성이 여전히 대두되고 있다. 항체 공학에 대한 목표들 중의 한 가지는 항체의 생체내 반감기를 증가시키는 것이다. 이는 항체와 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 간의 상호 작용을 조정함으로써 달성될 수 있다. 본 발명은 이들 필요성 및 기타 필요성을 충족시켜 준다.
본 발명의 목적은 FcRn 및 FcγRIII에 대한 결합 친화성이 천연 서열/야생형 서열 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 더 높은 폴리펩티드, 특히 항체를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 FcRn 및 FcγRIII에 대한 결합 친화성이 천연 서열/야생형 서열 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 더 높은 것으로 입증된 폴리펩티드, 특히 항체를 제공한다. 이들 Fc 변이체 폴리펩티드 및 항체는 분해되는 것이 아니라 오히려 재이용되고 재활용된다는 이점을 지니고 있다. 혈청 반감기 증가는 항체에 대한 노출을 증가시키고 Fc 함유 폴리펩티드, 예를 들어 Abs 및 기타 항체 융합 단백질, 예를 들어 면역부착인자의 투여 횟수를 감소시키는데 유리할 것이다.
본 발명은 적어도 Asn 434에서 Trp로의 아미노산 치환 (N434W)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
제2의 단리된 폴리펩티드는 적어도 Asn 434에서 His로의 아미노산 치환 (N434H)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 것이다.
본 발명에 의해 제공된 또 다른 단리된 폴리펩티드는 적어도 Asn 434에서 Tyr로의 아미노산 치환 (N434Y)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드인데, 이러한 폴리펩티드는 H433R, H433S, Y436H, Y436R, Y436T로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 치환을 추가로 수반하지 않는다.
또 다른 폴리펩티드는 적어도 Asn 434에서 Phe로의 아미노산 치환 (N434F)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드인데, 이러한 폴리펩티드는 H433K, Y436H, M252Y, S254T, 또는 T256E의 아미노산 치환을 추가로 수반하지 않는다.
본 발명은 Asn 434에서 Tyr로의 아미노산 치환 (N434Y)으로 필수적으로 이루어지거나 이러한 치환으로 이루어진 아미노산 치환을 수반한 변이체 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, Asn 434에서 Phe로의 아미노산 치환 (N434F) 으로 필수적으로 이루어지거나 이러한 치환으로 이루어진 아미노산 치환을 수반한 변이체 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
한 양태에서, 전술된 양태들 모두의 단리된 폴리펩티드는 항체이다. 또 다른 양태에서는, 이러한 폴리펩티드가 면역부착인자이다.
바람직한 양태에서는, 전술된 양태들 모두의 IgG 항체가 뮤린 또는 인간, 바람직하게는 인간 항체이다. 인간 IgG는 모든 인간 IgG 이소형 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4를 포괄한다. 뮤린 IgG는 그의 이소형 IgGl, 2a, 2b, 3을 포괄한다. 바람직하게는, 인간에게 사용하기 위한 치료적 항체가 인간화, 인간 또는 키메라 항체이다.
항체를 포함한 전술된 폴리펩티드에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 천연 서열 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드보다 높은 친화도로 pH 6.0에서 인간 FcRn과 결합하고, pH 7.4 또는 pH 7.5에서는 pH 6.0에서 보다 더 약한 결합 친화도로 인간 FcRn과 결합한다. 바람직한 양태에서는, pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체 폴리펩티드의 결합 친화도가 천연 서열/천연 서열 Fc보다 4배 이상, 바람직하게는 7배 이상, 9배 이상, 보다 더 바람직하게는 20배 이상 더 높다. 전술된 양태들의 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 영장류 혈청, 특히 인간 또는 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 혈청 내에서의 혈청 반감기가 더 길다.
본 발명의 또 다른 국면은 적어도 Lys 334에서 루이신으로의 아미노산 치환 (K334L)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드이다. 한 양태에서는 이러한 폴리펩티드가 천연 서열 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 3배 이상 더 높은 친화도로 인간 FcγRIII와 결합한다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게도, 천연 서열 IgG Fc 영역을 수반한 폴리펩티드에 비해 증가된 ADCC를 나타낸다.
또한, pH 6에서는 인간 FcRn에 대한 결합성에 있어서 개선을 나타내지만, pH 7.4에서는 결합 증가를 나타내지 않고, 적어도 G385H, D312H, 또는 N315H에서 아미노산 치환을 수반하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.
한 양태에서, 전술된 양태들 모두의 단리된 폴리펩티드는 항체이다. 또 다른 양태에서는, 이러한 폴리펩티드가 면역부착인자이다.
바람직한 양태에서는, 전술된 양태들 모두의 IgG 항체가 뮤린 또는 인간, 바람직하게는 인간 항체이다. 인간 IgG는 모든 인간 IgG 이소형 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4를 포괄한다. 뮤린 IgG는 그의 이소형 IgGl, 2a, 2b, 3을 포괄한다. 바람직하게는, 인간에게 사용하기 위한 치료적 항체가 인간화, 인간 또는 키메라 항체이다.
본 발명은 구체적으로, CD20, Her2, BR3, TNF, VEGF, IgE, CD11a로 이루어진 군과 결합하는 전술된 양태들의 항체를 제공한다. 구체적 양태에서는, 특이적 항원과 결합하는, 재조합적으로 생성된 인간화 항체가 다음에 항체 조성물이란 부제 하의 서열에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서는, CD20이 영장류 CD20이다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD20이 구체적 양태이다. 보다 구체적 양태에서 항체가 인간 CD20과 결합하는 경우에는, 이러한 항체가 서열 2의 VH 서열과, 서열 1의 VL 서열을 포함하는 L 쇄 또는 서열 26의 전장의 L 쇄 서열을 포함할 것이다. 또 다른 양태에서는, CD20 결합성 항체가 도 10에 도시된 바와 같이, 서열 24로부터의 C2B8 VL 서열과, 서열 25로부터의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서는, 인간 CD20와 결합하는 단리된 인간화 항체가 다음에 인간화 2H7 변이체 하에 기재된 VH 서열과 VL 서열을 포함할 것이다.
보다 구체적 양태에서 항체가 HER2가 결합하는 경우에는, 이러한 항체가 서열 4의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 3의 VL 서열; 및 서열 6의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 5의 VL 서열 중에서 선택된 VL 및 VH 서열을 포함할 것이다. 한 가지 구체적인 항-HER2 항체는 적어도 Asn 434에서 His로의 아미노산 치환 (N434H)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 서열 5의 VL 서열, 서열 6의 VH 서열, 및 적어도 Asn 434에서 Ala로의 아미노산 치환 (N434A)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 항-HER2 항체를 제공한다.
바람직한 양태에서는, 제공된 VH 서열과 VL 서열이 인간 IgGl 불변 영역 (이의 서열이 도 4 및 5에 제시되어 있다)에 연결된다.
한 국면에서, 전술된 양태들의 항체는 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하여, 천연 서열 Fc 영역을 갖는 항체와 비교해서 증가된 FcγR 결 합성을 나타내거나, 증가된 ADCC을 나타내거나, 증가된 CDC를 나타내거나, 저하된 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC와 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC 기능을 나타내긴 하지만 CDC 기능은 저하되거나, 증가된 FcRn 결합성과 혈청 반감기를 나타내는 등의 한 가지 이상의 상기 특성을 나타내는 항체를 생성시킨다.
전술된 양태들의 항체는 D265A, S298A/E333A/K334A, K334L, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있는데, 이러한 잔기의 넘버링은 카바트 (Kabat)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. 폴리펩티드가 K334L의 아미노산 치환을 수반하는 경우에는, D265A, S298A/E333A, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술된 양태들 모두의 폴리펩티드 또는 항체와, 담체, 예를 들어 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면은 전술된 양태들 모두의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산이다. 본 발명의 항체를 포함한 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터가 또한 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 폴리펩티드를 발현하고 생산하는 숙주 세포에는 CHO 세포 또는 이. 콜라이 (E. coli) 세균성 세포가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포 (이러한 숙주 세포는 상기 폴리펩티드를 생산한다)를 배양하고, 이러한 폴리펩티드를 상기 세포 배양물로부터 회수하는 것을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 면역부착인자를 생성시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 국면은 특정 용기와, 이러한 용기 내에 함유된 조성물 (이 조성물은 전술된 양태들 모두의 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다)를 포함하는 제조품이다. 이러한 제조품은 상기 조성물이 항체를 그에 의도한 바 대로 적응증을 치료하기 위해 사용할 수 있다는 것을 표시한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양을 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 CD20 결합성 항체, 특히 인간화 CD20 결합성 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 양태에서는, B 세포 신생물이 비-호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소포 중심 세포 (FCC) 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 모발 세포 백혈병이다.
한 양태는 만성 림프구성 백혈병을 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하는 항체 (이러한 항체는 인간 CD20과 결합하고, 아미노산 치환 K326A 또는 K326W를 추가로 포함한다)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 만성 림프구성 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 국면은 B-세포 조절된 자가면역 질환을 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하는 CD20 결합성 항체의 치료 유효량을 투여하는 것 을 포함하여, 상기 B-세포 조절된 자가면역 질환을 완화시키는 방법이다. 구체적 양태에서는, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년성 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병 (Wegener's disease), 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 저혈소판증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome) 및 사구체신염으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
제공된 기타 치료 방법은 다음과 같다:
혈관형성 관련 장애를 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하는 VEGF 결합성 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 혈관형성 관련 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
HER2 발현성 암을 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하는 HER2 결합성 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 HER2 발현성 암을 치료하는 방법이 제공된다.
LFA-1 매개된 장애를 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하고 인간 항-CD11a와 결합하는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 LFA-1 매개된 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
IgE 매개된 장애를 앓고 있는 환자에게 상기 양태들의 변이체 IgG Fc를 포함하고 인간 IgE와 결합하는 항체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 IgE 매개된 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 국면은 pH 6.0에서 FcRn과 보다 높은 친화도로 결합하고, pH 7.4에서는 pH 6.0에서 보다 더 약한 결합 친화도로 FcRn과 결합하는 폴리펩티드에 대한 스크리닝 방법이다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 항체보다 더 높은 친화도로 pH 6.0에서 인간 FcRn과 결합한다. 상기 방법은 후보 폴리펩티드를 파지 상에 발현하고; 고체 매트릭스 상에 고정화된 huFcRn을 제공하여, 파지 입자가 매트릭스 상의 FcRn와 결합할 수 있게 하며; 수 차례 세척하여 (세척할 때마다 엄격도를 증가시킨다) 결합되지 않은 파지 입자를 제거하고; pH 7.4에서 잔존하는 결합된 파지를 용출시키는 것을 포함한다.
발명의 상세한 설명
IgG의 생체 항상성에 있어 중요한 성분은 Fc 영역과 세포-표면 신생아 수용체 FcRn 간의 pH 의존적 상호 작용에 의해 매개된 재순환 경로이다. 항체 공학 분야에 대한 중요한 목표는 pH 7.4에서는 저 친화성을 유지하면서도 pH 6에서는 Fc-FcRn 복합체의 친화성을 증가시키는, Fc 내의 돌연변이물을 확인하는 것이었다 [참고: Ghetie et al., 1997]. 더우기, 고도로 보존된 불변 도메인에 대한 돌연변이를 포함하는 치료적 항체를 이용하여 치료받은 환자에게서 잠재적 항-약물 면역 반응이 발생하는 것을 피하기 위해서는 Fc 내로 도입되는 돌연변이 횟수를 최소화하는 것이 고도로 요망된다. 본 발명에서 본 발명자들은 파지-디스플레이를 사용하고 무작위화 아미노산의 라이브러리를 작제하는 신규한 방법을 사용함으로써, 인간 FcRn에 대한 Fc의 친화성을 증가시키는 단일 아미노산 돌연변이물 (N434W, N434Y, 및 N434F; IgG Fc 영역에 대해 본원에 사용된 넘버링 시스템은 문헌 [참고: Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991)]에 기재된 바와 같은 EU 표기이다)를 확인 (동정)하였는데, N434W 돌연변이체는 pH 6.0에서는 huFcRn에 대한 Fc 결합 친화도를 약 170배 정도 증가시켰고, pH 7.4에서는 huFcRn에 대한 저 친화도를 유지하였다.
FcRn에 대한 결합성을 측정하는 방법은 본 실시예에 기재되어 있을 뿐만 아니라 공지되어 있다 [참고: Ghetie 1997, Hinton 2004]. 인간 FcRn 고 친화도 결합성 폴리펩티드의 혈청 반감기 및 생체 내에서 인간 FcRn에 대한 결합성은, 예를 들어 인간 FcRn를 발현하는 형질감염된 인간 세포주 또는 트랜스제닉 마우스에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. 별개의 양태에서는, 변이체 IgG Fc를 갖는 본 발명의 폴리펩티드 및 구체적으로는 항체가, 야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드에 비해 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 7배 이상, 9배 이상, 보다 바람직하게는 20배 이상, 바람직하게는 40배 이상, 보다 더 바람직하게는 70 내지 100배 이상 증가된다. 구체적 양태에서는, 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 약 70배 정도 증가된다.
본 발명은 또한, 적어도 Lys 334에서 루이신으로의 아미노산 치환 (K334L)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 천연 서열 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 3배 이상 더 높은 친화도로 인간 FcγRIII와 결합한다. 이들 폴리펩티드는 바람직하게도, 천연 서열 IgG Fc를 수반한 폴리펩티드에 비해 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 ADCC를 나타낸다. 항체가 CD20 결합성 항체인 경우에는, 인간 CD20 + CDl6을 발현하는 트 랜스제닉 마우스 (hCD20+/hCDl6+ Tg 마우스)에서 ADCC 활성을 시험할 수 있다. ADCC에 대한 검정은, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호 (Presta)에 기재되었다.
FcRn에 대한 결합 친화도의 경우, 한 양태에서는 상기 폴리펩티드의 EC50 또는 겉보기 Kd (pH 6.0에서)는 ≤100 nM, 보다 바람직하게는 ≤10 nM이다. FcγRIII에 대한 증가된 결합 친화도의 경우 (F158; 즉, 저-친화도 이소형), 한 양태에서는 EC50 또는 겉보기 Kd가 ≤10 nM이고, FcgRIII의 경우 (V158; 고-친화도), EC50 또는 겉보기 Kd는 ≤3 nM이다.
본 명세서와 청구의 범위 전반에 걸쳐, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (본원에 참고로 도입된다)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. "카바트 문헌에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgGl EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"모 폴리펩티드"는 본원에 기재된 Fc 영역 변형들 중의 하나 이상이 결여되고 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 변이체와 비교해서 이펙터 기능 면에서 상이한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예: 부가, 결실 및/또는 치환)을 수반하는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
용어 "Fc 영역"은, 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양하긴 하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226 또는 Pro230에서의 아미노산 잔기로부터 그의 카복실 말단까지 연장되는 것으로 통상 규정된다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로, 도 1에 도시된 바와 같이 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함한다. IgGl의 중쇄 내의 마지막 잔기인 리신은 성숙한 단백질 중의 Fc 내에 말단 잔기로서 존재할 수는 있지만, 반드시 존재해야 하는 것은 아니다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인으로서 지칭되기도 함)은 통상적으로, 아미노산 약 231에서부터 아미노산 약 340까지 연장된다. 이러한 CH2 도메인은 그것이 또 다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 천연의 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 이러한 탄수화물이 도메인-도메인 쌍 형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다 [참고: Burton, Molec . Immunol. 22:16l-206 (1985)].
"CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 연장물을 포함한다 (즉, IgG의 아미노산 잔기 약 341에서부터 아미노산 잔기 약 447까지).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유하고 있다. "이펙터 기능"의 예에는 Clq 결합성; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이러한 이펙터 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역이 결합성 도메인 (예: 항체 가변 도메인)과 합해야만 하고, 이는 예 를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역이 도 4 및 5에 도시되어 있고, 이에는 천연 서열 인간 IgGl Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 천연 발생적 변이체가 포함된다. 천연 서열 뮤린 Fc 영역이 도 5에 도시되어 있다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에 정의된 바와 같은 한 가지 이상의 "아미노산 변형"을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동률이 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상일 것이다.
"상동률"은 최대 상동률을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 필요한 경우에는 갭을 도입한 후 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율로서 정의된다. 정렬시키기 위한 방법 및 이를 위한 컴퓨터 프로그램이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 컴퓨터 프로그램 중의 한 가지가 "Align 2"인데, 이는 제넨테크, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 1991년 12월 10일자로 미국 저작권국 (United States Copyright Office, Washington, DC 20559)에 사용자 문서로 출원되었다.
용어 "Fc 영역-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 면역부착인자 (하기 정의 참고)를 지칭한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 IgG 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 한 양태에서는, FcR이 FcγR이고, 이에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아부류의 수용체가 포함되는데, 이에는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체 및 대체 스플라이싱된 형태 또한 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함되는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [참고: M. in Daeron, Annu . Rev . Immunol. 15: 203-234 (1997)]. 상기 용어에는 동종이형, 예를 들어 FcγRIIA 동종이형: FcγRIIA-Phe158, FcγRIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131이 포함된다. FcR은 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol 9: 457-492 (1991); Capel et al. Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al. J. Lab . Clin . Med. 126: 330-41 (1995)]. 기타 FcR은 앞으로 확인될 것을 포함하여, 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한, 모계 IgGs를 태아에 게 전이시키는데 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다 [참고: Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)].
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정의 세포독성 세포 [예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포] 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상으로 결합된 분비된 IgG로 인해, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포와 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 연속해서 이러한 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 이러한 세포독성 세포와 "전투 준비를 하므로", 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는데 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [참고: Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al. PNAS ( USA ) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포가 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되는데, PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시키는 것을 지칭한다. 전통적인 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을, 그의 동족 항원과 결합하는 (적당한 아부류의) 항체와 결합시킴으로써 개시시킨다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
"변경된" FcR 결합 친화성 또는 ADCC 활성을 지닌 변이체 IgG Fc를 수반하는 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증강되거나 저하된 FcR 결합 활성 (FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 지닌 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드보다 더 우수한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교한 결합성 상의 개선은 약 3배, 바람직하게는 약 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 500배 이하, 또는 약 25% 내지 1000% 개선일 수 있다. FcR에 대한 "저하된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 열악한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교한 결합성 상의 저하는 약 40% 이상의 저하일 수 있다. 이와 같이 FcR에 대한 저하된 결합성을 나타내는 Fc 변이체는 FcR에 대한 인지할 만한 수준의 결합이 거의 또는 전혀 없는데, 예를 들어 본원의 실시예에서 결정된 바와 같이 천연 서열 IgG Fc 영역과 비교해서 FcR에 대한 0 내지 20% 정도의 결합성을 나타낸다.
특정 폴리펩티드 또는 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc을 갖는 모 폴리펩티드보다 "더 우수한 친화도" 또는 "보다 고 친화도"로 FcR과 결합하는 변이체 Fc를 갖는 폴리펩티드는, 결합 검정에서 변이체 Fc를 수반한 폴리펩티드와 모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 천연 서열 Fc을 수반한 모 폴리펩티드보다 실질적으로 더 우수한 결합 친화도로 상기 확인된 FcR 중의 하나 이상과 결합하는 것이다. 예를 들어, 개선된 FcR 결합 친화성을 지닌 변이체 Fc 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교해서 FcR 결합 친화성에 있어 약 2배 내지 약 300배, 예를 들어 약 3배 내지 약 170배 정도의 개선을 나타낼 수 있는데, FcR 결합 친화성은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결정한다.
야생형 IgG Fc을 갖는 폴리펩티드보다 더 효과적으로 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 매개하거나 "증가된 ADCC를 나타내는" 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 본 검정에 사용된 변이체 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드와 야생형 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일한 경우에, ADCC를 매개하는데 있어 시험관 내에서 또는 생체 내에서 실질적으로 보다 유효한 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 확인할 것이지만, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하는 기타 검정 또는 방법도 고려된다. 바람직한 변이체는 ADCC를 매개하는데 있어서 야생형 Fc보다 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25배 내 지 약 50배 정도 더 유효하다.
"아미노산 변형"은 예정된 아미노산 서열의 아미노산 서열 상의 변화를 지칭한다. 예시되는 변형에는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함된다. 본원에서 바람직한 변형은 치환이다.
예를 들어, Fc 영역의 명시된 위치 "에서의 아미노산 변형"은 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 이러한 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 특정의 명시된 잔기에 "인접하게" 삽입한다는 것은, 그의 1개 내지 2개 잔기 이내에 삽입하는 것을 의미한다. 이러한 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 예정된 아미노산 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체시키는 것을 지칭한다. 대체 잔기(들)는 "천연 발생적 아미노산 잔기" (즉, 유전 암호에 의해 코딩됨)일 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소루이신 (Ile): 루이신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 바람직하게는, 대체 잔기가 시스테인이 아니다. 1개 이상의 비-천연 발생적 아미노산 잔기로의 치환 역시 본원의 아미노산 치환 정의에 포괄된다. "비-천연 발생적 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기(들)와 공유적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생적 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생적 아미노산 잔기의 예에는 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 잔기가 포함된다 [참고: Ellman et al. Meth . Enzym. 202:301-336 (1991)]. 이러한 비-천연 발생적 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, 문헌 [참고: Noren et al. Science 244:182 (1989) and Ellman et al., 상기 참고]의 과정을 사용할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 과정은 억제인자 tRNA를 비-천연 발생적 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시킨 다음, RNA를 시험관 내에서 전사 및 해독시키는 것을 포함한다.
본 발명 내에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적" 아미노산 치환은 기능적 등가의 아미노산을 치환시키는 아미노산 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 변화로 인해, 이로써 생성되는 펩티드의 아미노산 서열에 있어 침묵 (silent) 변화가 일어난다. 예를 들어, 유사한 극성의 1개 이상의 아미노산이 기능적 등가물로서 작용하여, 해당 펩티드의 아미노산 서열 내에서 침묵 변경을 유발시킨다. 일반적으로, 특정 군 내에서의 치환은 구조와 기능 면에서 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 특정한 잔기의 역할이 그것이 존재하는 분자의 3차원적 구조 내에서의 전후 관계에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, Cys 잔기는 산화된 (디설파이드) 형태로 존재할 수 있는데, 이는 환원된 (티올) 형태보다 덜 극성이다. Arg 측쇄의 장 지방족 부분은 그의 구조적 또는 기능적 역할에 있어 결정적인 특징을 구성할 수 있고, 이는 또 다른 염기성 잔기가 아닌 비극성 잔기를 치환시킴으로써 가장 잘 보존될 수 있다. 또한, 방향족기를 함유하는 측쇄 (Trp, Tyr, 및 Phe)는 이온성-방향족 또는 "양이온-파이" 상호 작용에 참여할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 경우에는, 이들 측쇄 중의 하나를 산성 또는 전하를 띠지 않는 극성기의 한 구성원으로 치환시키는 것이 구조와 기능 면에서 보존적일 수 있다. Pro, Gly, 및 Cys (디설파이드 형태)와 같은 잔기는 주쇄 입체 형태에 대해 직접적인 효과를 나타낼 수 있으므로, 종종 구조적인 왜곡없이 치환될 수가 없다.
"아미노산 삽입"은 하나 이상의 아미노산을 예정된 아미노산 서열 내로 혼입시키는 것을 지칭한다. 삽입이 통상적으로 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 삽입하는 것으로 이루어질 것이긴 하지만, 본 출원은 보다 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 약 10개 이하 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)는 상기 언급된 바와 같은 천연 발생적이거나 또는 비-천연 발생적일 수 있다.
"아미노산 결실"은 예정된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 지칭한다.
아미노산은 그들의 측쇄 특성 면에서의 유사성에 따라서 분류될 수 있다 [참고: A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]:
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 전하를 띠지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
또 다른 한편, 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
"힌지 영역은 일반적으로, 인간 IgGl의 Glu216에서 부터 Pro230까지 연장하는 것으로 규정된다 [참고: Burton, Molec . Immunol.22:16l-206 (1985)]. 기타 IgG 이소형의 힌지 영역은, 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓아둠으로써 IgGl 서열과 정렬시킬 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 힌지 영역에 대해 바로 C-말단인 잔기들, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239의 연장물로서 통상 규정된다. 본 발명 이전에는, FcγR 결합성이 일반적으로, IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 기인하였다.
"Clq"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이 다. Clq는 2개의 세린 프로테아제 Clr 및 Cls와 함께, 복합체 Cl을 형성하는데, 이는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분이다. 인간 Clq는, 예를 들어 다음 공급처로부터 구입할 수 있다 [공급처: Quidel, San Diego, CA].
용어 "결합성 도메인"은 또 다른 분자와 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합성 도메인은 Fc 영역을 결합시키는데 책임이 있는 그의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 그의 α쇄)의 일부를 포함할 수 있다. 한 가지 유용한 결합성 도메인은 FcR α 쇄의 세포외 도메인이다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 항체의 "기능적 단편"은 FcR 결합 능력을 보유하고 있는 항체의 Fc 영역 또는 천연 항체의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한, 천연 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 가능한 천연 발생적 돌연변이 (이는 미량으로 존재할 수 있다)를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대항하여 유도된, 고도로 특이적이다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로, 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 지시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab)2 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 유입된 CDR 또는 골격 서열 어디에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키고 최대화시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이지만, FR 영역은 결합 친화성을 개선시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서의 이들 아미노산 치환 수는 전형적으로, H 쇄에서는 6 이하이고, L 쇄에서는 3 이하이다. 인간화 항체는 최적으로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체에는 항체의 항원-결합성 영역이, 예를 들어 짧은꼬리 (macaque) 원숭이를 관심있는 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED® 항체가 포함된다. 인간화 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
당해 분야에 공지된 각종 기술, 예를 들어 파지-디스플레이 라이브러리를 이용하여 인간 항체를 생성시킬 수도 있다 [참고: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 다음 문헌의 기술 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하는 데에 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)].
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역부착인자"는 이종 단백질 ("부착인자")의 결합 특이성과 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능을 조합한 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조상, 면역부착인자는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, 이종인) 목적하는 결합 특이성을 지닌 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역부착인자 분자의 부착인자 부분은 전형적으로, 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속되는 아미노산 서열이다. 면역부착인자 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 모든 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 유용한 면역부착인자는 BLyS 수용체의 막관통 또는 세포질 서열을 수반하지 않는 BLyS 수용체의 BLyS 결합성 부분을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 양태에서는, BR3, TACI 또는 BCMA의 세포외 도메인을 면역글로불린 서열의 불변 도메인에 융합시킨다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩티드"는 함께 공유적으로 연결된 2개의 부분을 갖는 폴리펩티드를 지칭하는데, 이러한 부분 각각은 상이한 특성을 지닌 폴리펩티드이다. 특성은 생물학적 특성, 예를 들면 시험관내 또는 생체내 활성일 수 있다. 특성은 또한, 단순한 화학적 또는 물리적 특성, 예를 들어 표적 분자에 대한 결합성, 반응의 촉매작용 등일 수 있다. 2개의 부분을 단일 펩티드 결합에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 통하여 직접 연결할 수 있다. 일반적으로, 상기 2개의 부분과 링커는 서로 동일한 판독 프레임 내에 존재할 것이다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 항체는 그의 천연 환경의 특정 구성분으로 확인되어, 이러한 환경으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 상기 폴리펩티드 또는 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색 (silver stain)을 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환 경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조할 것이다.
본 발명의 CD20 결합성 및 인간화 CD20 결합성 항체의 생물학적 활성에는 적어도 인간 CD20, 보다 바람직하게는 인간 및 기타 영장류 CD20 (시노몰구스 원숭이, 붉은털 원숭이, 침팬지 포함)에 대한 항체의 결합성이 포함될 것이다. 항체는 1 x 10-8 이하의 Kd, 바람직하게는 약 1 x 10-9 이하의 Kd 값으로 CD20와 결합하고, 이러한 항체로 처리되지 않은 적당한 음성 대조군과 비교해서, 생체 내에서 B 세포를 바람직하게는 20% 이상 사멸 또는 고갈시킬 수 있다. B 세포 고갈은 ADCC, CDC, 또는 기타 기전 중의 한 가지 이상의 결과일 수 있다. 본원의 질병 치료에 관한 몇몇 양태에서는, 다른 기능이나 기전에 비해 특이적 이펙터 기능이나 기전이 요망될 수 있고, 인간화 2H7의 특정의 변이체가 생물학적 기능, 예를 들어 ADCC를 달성하는데 선호된다.
"치료하는", "치료 (처치)" 또는 "완화"는 치료적 처치를 지칭하는데, 이의 목적은 표적화된 병리적 질환이나 장애를 경감시키거나 느리게 진행시키는 것이다. 본 발명의 방법에 따라서 본 발명의 치료량의 CD20 결합성 항체를 투여한 후에, 대상체가 특정한 질병의 한 가지 이상 징후 및 증상을 나타내지 않거나 또는 이러한 징후 및 증상이 관찰 가능하고/하거나 측정 가능한 수준으로 저하된 경우에, 이러한 대상체가, 예를 들어 CD20 양성 암 또는 자가면역 질환에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다. 예를 들어, 암의 경우에는 암 세포 수를 감소시키거나 암 세포를 없애고/없애거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 차도 기간을 연장시키고/시키거나; 특이적 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키고/시키거나; 발병률 및 사망률을 감소시키고/시키거나; 삶의 질을 개선시킨다. 특정 질병의 징후 또는 증상 감소를 환자가 느낄 수도 있다. 치료로 인해, 모든 암 증상이 사라지는 것으로서 규정되는 완전한 반응, 또는 부분 반응 (여기서는, 종양 크기가 바람직하게는 50% 초과, 보다 바람직하게는 75% 정도 감소된다)을 달성할 수 있다. 환자가 안정 기간을 경험한 경우에도 환자가 치료된 것으로 간주된다. 바람직한 양태에서는, 암 환자가 1년 후, 바람직하게는 15개월 후에도 암이 진행되지 않는 것이다. 해당 질병을 성공적으로 치료하고 개선시킨 것을 평가하기 위한 이들 파라미터는 당해 분야의 전문의에게 친숙한 통상의 과정에 의해 용이하게 평가할 수 있다.
"치료 유효량"은 특정 대상체에게서 특정 질병 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 항체 또는 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다 ["치료하는"에 관한 앞서의 정의 참고]. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포 를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"만성" 투여는 작용제(들)를 급성 방식과는 달리 지속적인 방식으로 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)가 장기간 유지되도록 하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 수행하지는 않지만, 사실상 순환식 치료이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 다음에 기재되는 각종 항종양 또는 항암제가 포함된다. 기타 세포독성제가 다음에 기재된다.
본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 및/또는 생체 내에서 특정 세포, 특히 CD20 발현성 암 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상의 PSCA 발현성 세포 비율을 상당히 저하시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단시키는 작용제, 예를 들어 G1 정지와 M-상 정지를 유도시키는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제가 또한 S-상 정지로까지 영향을 미치는데, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들면, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 있다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 모두 주목 (yew tree)으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽산 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, 공급처: Rhone-Poulenc Rorer)는 파클리탁셀 (TAXOL®, 공급처: Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀과 도세탁셀은 투불린 (tubulin) 이량체로부터 미소관 (microtubulin)의 어셈블리를 증진시고, 탈중합을 방지함으로써 미소관을 안정화시켜 세포에서의 유사분열을 억제시킨다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들 어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸롤로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀼라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리 코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜킨; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL®; 공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (TAXOTERE®; 공급처: Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 약물의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐, 에를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤); 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미 드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"에는 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유류에게 무독성인 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제가 포함된다. 종종 생리적으로 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리적으로 허용 가능한 담체의 예에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™이 포함된다.
용어 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭하는데, 이에는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 바람직하게, 본원에서의 포유류는 인간이다.
조성물
구체적 양태에서, 본 발명의 항체는 다음에 제시된 전장의 서열 또는 V 도메인 서열을 포함할 것이지만, Fc 이펙터 기능들 중의 한 가지 이상을 개선시켜 주는 본 발명의 Fc 돌연변이를 수반할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 항체는, 예를 들어 기타 Fc 기능을 개선 또는 저하시키거나, 동일한 Fc 기능을 추가로 개선시키거나, 항원 결합 친화성을 증가시키거나, 안정성을 증가시키거나, 당화를 변형시키거나, 또는 동종이형 변이체를 포함하는 기타 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하여, 이러한 항체가 야생형 Fc를 갖는 폴리펩티드 및 항체와 비교해서 증가된 FcγR 결합성을 나타내거나, 증가된 ADCC을 나타내거나, 증가된 CDC를 나타내거나, 저하된 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC와 CDC 기능을 나타내거나, 증가된 ADCC 기능을 나타내긴 하지만 CDC 기능은 저하되거나 (예를 들어, 주입 반을 최소화하기 위함), 증가된 FcRn 결합성과 혈청 반감기를 나타내는 등의 한 가지 이상의 상기 특성을 나타내도록 한다. 이들 활성은 본원에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.
Fc 기능을 개선시키는 부가의 아미노산 변경에 대해서는, 본원에 참고로 도입된 US 6,737,056를 참고할 수 있다. 본 발명의 모든 항체는, 예를 들어 적어도 치환 K322A를 포함하는, CDC 활성을 저하시키는 Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다 [참고: 미국 특허 제6,528,624Bl호 (Idusogie et al.)]. ADCC 및 CDC를 개선시키는 돌연변이에는 S298A/E333A/K334A가 포함되는데, 이는 본원에서 삼중 Ala 돌연변이체로서 지칭된다. K334L은 CDl6에 대한 결합성을 증가시킨다. K322A는 CDC 활성 저하를 가져오고; K326A 또는 K326W는 CDC 활성을 증강시키며; D265A는 ADCC 활성 저하를 가져온다. ADCC 기능을 증가시키는 당화 변이체가 본원에 참고로 도입된 WO 03/035835에 기재되어 있다. 안정성 변이체는, 예를 들어 산화, 탈아미드화 측면에서 개선된 안정성을 나타내는 변이체이다.
뮤린 HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 버젼 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 트라스투주마브 또는 HERCEPTIN®; 미국 특허 제5,821,337호)은 기존에 광범위한 항암 요법을 받은 적이 있는 HER2-과발현성 전이성 유방암 환자에게서 임상적으로 활성을 나타낸다 [참고: Baselga et al., J. Clin . Oncol. 14:737-744 (1996)]. 트라스투주마브는 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암 환자를 치료하도록 1998년 9월 25일자로 식품 의약청으로부터 승인되어 판매되고 있는 약품이다.
각종 특성을 지닌 기타 HER2 항체가 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Tagliabue et al. Int . J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS ( USA ) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int . J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol . Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Patent No. 5,783,186; and Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997)].
한 양태에서는, 항-HER2 항체가 다음 VL 및 VH 도메인 서열 (CDR이 진하게 표시된다)을 포함한다:
인간화 2C4 버젼 574 항체 VL (서열 3)
Figure 112008054666762-PAT00001
및 인간화 2C4 버젼 574 항체 VH (서열 4)
Figure 112008054666762-PAT00002
또 다른 양태에서는, 항-HER2 항체가 도 2A 및 2B에 도시된 바와 같은 트라스투주마브의 VL 도메인 서열 (서열 5) 및 VH 도메인 서열 (서열 6)을 포함한다.
구체적 양태에서는, 본 발명의 항-VEGF 항체가 다음 서열을 포함한다:
한 양태에서는 항-VEGF 항체가 다음 VL 서열: (서열 7)
Figure 112008054666762-PAT00003
및 다음 VH 서열: (서열 8)
Figure 112008054666762-PAT00004
을 포함한다.
또 다른 양태에서는 항-VEGF 항체가 다음 VL 서열: (서열 9)
Figure 112008054666762-PAT00005
및 다음 VH 서열: (서열 10)
Figure 112008054666762-PAT00006
을 포함한다.
제3 양태에서는 항-VEGF 항체가 다음 VL 서열: (서열 11)
Figure 112008054666762-PAT00007
및 다음 VH 서열: (서열 12)
Figure 112008054666762-PAT00008
을 포함한다.
인간화 항-CD11a 항체 에팔리주마브 (efalizumab) 또는 랍티바 (Raptiva®) (참고: 미국 특허 제6,037,454호)는 건선을 치료하도록 2003년 10월 27일자로 식품 의약청으로부터 승인되어 판매되고 있는 약품이다. 한 양태는 Fc 이펙터 기능들 중의 한 가지 이상을 개선시키는 본 발명의 Fc 돌연변이를 포함하는 항-인간 CDl1a 항체를 제공하는데, 이러한 항체는 다음 HuMHM24의 VL 및 VH 서열을 포함한다:
가변 경쇄 (서열 13)
Figure 112008054666762-PAT00009
가변 중쇄 (서열 14)
Figure 112008054666762-PAT00010
항-인간 CDl1a 항체는 서열 14의 VH, 및 다음 서열을 갖는 HuMHM24의 전장의 L 쇄를 포함할 수 있다:
Figure 112008054666762-PAT00011
구체적 양태에서, Fc 이펙터 기능들 중의 한 가지 이상을 개선시켜 주는 본 발명의 Fc 돌연변이를 지닌 항-IgE 항체는 항-IgE 항체 E25, E26, E27 및 Hu-901의 적어도 V 영역 서열을 포함한다 (그의 L 및 H 쇄가 도 3A 및 3B에 도시되어 있다). 경쇄 서열은 다음과 같다: E25 L 쇄 (서열 16); E26 L 쇄 (서열 17); E27 L 쇄 (서열 18); 및 Hu-901 L 쇄 (서열 19). 중쇄 서열은 다음과 같다: E25 H 쇄 (서열 20); E26 H 쇄 (서열 21); E27 H 쇄 (서열 22); 및 Hu-901 H 쇄 (서열 23). 도 3A 및 3B에 도시된 항-IgE 항체의 경우, VL은 VEIK (도 3A 중의 잔기 111)에서 종결되고, VH는 VTVSS (도 3B 중의 대략 잔기 #121)에서 종결된다. E25, E26, E27 및 Hu-901 항체의 VL 서열은 각각 서열 47, 서열 49, 서열 51 및 서열 53이다. E25, E26, E27 및 Hu-901 항체의 VH 서열은 각각 서열 48, 서열 50, 서열 52 및 서열 54이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 Fc 돌연변이를 지닌 항-IgE 항체는 다음 항체들 중의 어느 하나로부터 선택된 L 쇄 (그의 서열이 도 3A에 도시되어 있다)를 포 함할 것이다: E25 L 쇄 (서열 16); E26 L 쇄 (서열 17); E27 L 쇄 (서열 18); 및 Hu-901 L 쇄 (서열 19).
CD20 항원과 결합하는 항체의 예에는 현재 "리툭시마브 (Rituximab)" ("RITUXAN®")로 불리우는 "C2B8" [참고: 미국 특허 제5,736,137호 (본원에 참고로 도입됨)]; "Y2B8" 또는 "이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan)" (ZEVALIN®)로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 [참고: 미국 특허 제5,736,137호 (본원에 참고로 도입됨)]; "131I-B1" 항체 (요오드 I131 토시투모마브 (tositumomab), BEXXAR™)를 생성시키기 위해 131I로 임의로 표지시킨, "토시투모마브"로 불리우기도 하는 뮤린 IgG2a "B1"[참고: 미국 특허 제5,595,721호 (본원에 참고로 도입됨)]; 뮤린 모노클로날 항체 "lF5" [참고: Press et al. Blood 69 (2): 584-591 (1987)] 및 그의 변이체 (이에는 "골격 패치되거나" 또는 인간화 1F5가 포함된다) [참고: W0 03/002607, Leung, S.; ATCC 기탁번호 HB-96450]; 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 [참고: Clark et al. PNAS 82: 1766-1770 (1985); 미국 특허 제5,500,362호 (본원에 참고로 도입됨)]; 인간화 2H7; huMax-CD20 [참고: WO 04/035607, Genmab, Denmark]; AME-133 (공급처: Applied Molecular Evolution); A20 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, hA20) [참고: US 2003/0219433, Immunomedics]; 및 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 [International Leukocyte Typing Workshop로부터 입수 가능함; 참고: Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)]이 포함된다.
본원에서의 용어 "리툭시마브" 또는 "RITUXAN®"은 CD20 항원에 대항하여 유도되고 미국 특허 제5,736,137호 (본원에 참고로 도입됨)에서 "C2B8"로 명명된, 유전 공학적으로 처리한 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체 (이에는 CD20과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 그의 단편이 포함된다)를 지칭한다. C2B8 경쇄 (서열 24) 및 중쇄 (서열 25) 서열이 도 10에 도시되어 있다. VL 및 VH가 서술되었다.
구체적 양태에서, CD20 항원과 결합하는 항체에는 다음에 기재된 인간화 2H7 v16 항체 및 그의 변이체가 포함된다. 인간화 2H7v.16은
가변 경쇄 서열:
Figure 112008054666762-PAT00012
및 가변 중쇄 서열:
Figure 112008054666762-PAT00013
을 포함하는 천연 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
인간화 2H7.v16 항체가 천연 항체인 경우, 이는 바람직하게 v16 전장의 경쇄 아미노산 서열:
2H7.v16 경쇄:
Figure 112008054666762-PAT00014
및 전장의 중쇄 아미노산 서열:
2H7.vl6 중쇄:
Figure 112008054666762-PAT00015
를 포함한다.
버젼 16에 기초한 기타 모든 변이체의 V 영역은 다음 표에 나타낸 아미노산 치환 위치를 제외하고는, v16의 아미노산 서열을 갖는다. 달리 지시되지 않는 한, 2H7 변이체는 v16과 동일한 L 쇄를 갖는다.
Figure 112008054666762-PAT00016
버젼 114, 115, 116, 138, 477, 511 각각은 다음 VL 서열을 포함한다:
Figure 112008054666762-PAT00017
버젼 96, 114, 115, 116, 138, 477 각각은 다음 VH 서열을 포함한다:
Figure 112008054666762-PAT00018
전술한 인간화 2H7 mAb의 변이체는 상기 v16과 동일한 VL (서열 1) 및 VH (서열 2) 및 L 쇄 (서열 26) 서열을 갖고, 다음과 같은 전장의 H 쇄 아미노산 서열 을 갖는 2H7v.31이다:
2H7v.31 H 쇄:
Figure 112008054666762-PAT00019
인간화 2H7 항체의 또 다른 변이체는 다음에 나타낸 서열 39의 L쇄 서열과 서열 40의 H 쇄 서열을 갖는 2H7v.l38이다:
2H7.vl38 경쇄 (서열 39)
Figure 112008054666762-PAT00020
2H7.vl38 중쇄 (서열 40)
Figure 112008054666762-PAT00021
변이체 인간화 2H7 v.477은 서열 39의 L 쇄 서열과 서열 43의 H 쇄 서열을 갖는다 (N434W의 아미노산 치환을 수반한다):
Figure 112008054666762-PAT00022
vl38의 기타 변이체는 N434Y 또는 N434F의 아미노산 치환을 갖는다.
변이체 2H7v.l14는 서열 39의 완전한 L 쇄 서열과 다음 완전한 H 쇄 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112008054666762-PAT00023
변이체 2H7v.511은 상기 서열 41의 VL, 및 다음 서열 45의 VH를 포함한다:
Figure 112008054666762-PAT00024
2H7.v511은 상기 서열 39의 경쇄 서열과, 다음 중쇄 서열을 갖는다:
Figure 112008054666762-PAT00025
N434을 방향족 잔기 F, Y, H 또는 S로 치환시킨 항-BR3 항체가 또한 제공된다.
본 발명의 방법
본 발명은 또한, 본 실시예에 기재된 바와 같이, pH 6.0에서 FcRn과 보다 높은 친화도로 결합하고, pH 7.4에서는 pH 6.0에서 보다 더 약한 결합 친화도로 FcRn과 결합하는 폴리펩티드에 대한 스크리닝 방법이다. 이러한 방법은 후보 폴리펩티드를 파지 상에 발현하고; 고체 매트릭스 상에 고정화된 huFcRn을 제공하여, 파지 입자가 매트릭스 상의 FcRn와 결합할 수 있게 하며; 수 차례 세척하여 (세척할 때 마다 엄격도를 증가시킨다) 결합되지 않은 파지 입자를 제거하고; pH 7.4에서 잔존하는 결합된 파지를 용출시키는 것을 포함한다. 실시예 1에서와 같이, 엄격도를 증가시키는 것은 세척 횟수 및/또는 시간을 증가시키는 것을 의미한다. 용출된 파지는 증식시킬 수 있고, 이러한 파지로부터 폴리펩티드를 단리시킨다. 한 양태에서는 폴리펩티드가 IgG Fc 함유 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 면역부착인자이다.
항체 생성
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]에 의해 만들 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 상기 언급된 바와 같이 면역시켜, 면역을 위해 사용된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또 다른 한편, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다. 면역시킨 후, 림프구를 단리시킨 다음, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 림프구를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이로써 제조된 하이브리도마 세포를 시딩하고, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포 (융합 파트너로서 지칭되기도 함)의 성장 또는 생존을 억제하는 한 가지 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마에 대한 선택적 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지시키는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합시켜 주고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 안정한 고수준의 항체 생성을 뒷받침해주며, 융합되지 않은 모 세포에 대항하여 선별되는 선택적 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 공급처 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA]로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것; 및 공급처 [American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA]로부터 입수 가능한 SP-2 및 유도체 (예: X63-Ag8-653 세포)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 [참고: Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 관련 항원에 대항하여 유도된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하 이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [참고: Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
일단 목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인하면, 제한 희석 과정에 의해 클론을 아클로닝시킨 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를, 예를 들어 마우스에게 복강내 주사함으로써 동물 중에서 복수 (ascites) 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
상기 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를, 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 친화 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 이용함) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 격리시킨다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열 분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이들은 항체 단백질을 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 세균 내에서 재조합 발현시키는 것에 관한 고찰 문헌에는 다음 문헌이 포함된다 [참고: Skerra et al., Curr . Opinion in Immunol ., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol . Revs ., 130: 151-188 (1992)].
추가의 양태에서는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [참고: McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 [참고: Waterhouse et al, Nuc . Acids . Res., 21: 2265-2266 (1993)] 뿐만 아니라 연쇄 셔플링 [참고: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]에 의해 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리시키기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대체 방안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환시키거나 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison, et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA, 81: 6851 (1984)], 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 융합시킴으로써 변형시켜 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 항체의 불변 도메인을 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열로 치환시킬 수 있거나 또는 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인을 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열로 치환시켜, 특정의 항원에 대한 특이성을 지닌 하나의 항원 결합 부위와, 상이한 항원에 대한 특이성을 지닌 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 창출시킨다.
인간화 항체
비-인간 항체를 인간화시키는 방법이 당해 분야에 보고되었다. 바람직하게는, 인간화 항체가 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜한 천연의 인간 가변 도메인을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될, 중쇄 및 경쇄의 인간 가변 도메인의 선택이 항원성을 저하시키고, 항체를 인간 치료용으로 사용하고자 하는 경우에는 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 저하시키는데 있어 매우 중요하다. 소위 "최량 적합 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이의 내부의 인간 골격 영역 (FR)을 인간화 항체에 허용하였다 [참고: Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol . Biol., 196:901 (1987)]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 [참고: Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol ., 15-1:2623 (1993)].
항원에 대한 높은 결합 친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성을 유지하고 있는 항체로 인간화시키는 것이 추가로 중요하다. 이를 달성하기 위한 바람직한 양태에 따르면, 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고, 당업자에게 널리 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 추정상의 3차원적 입체 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수 가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선별하고, 이를 수용자로부터 유입 서열과 합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성을 달성하도록 한다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합성에 영향을 미치는데 있어 직접적이면서도 가장 실재적으로 관여한다.
인간화 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)와 임의로 접합되는 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 또 다른 한편, 인간화 항체는 전장의 항체, 예를 들어 전장의 IgG1 항체일 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 방법론
인간화에 대한 대체 방안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제되는 것으로 보 고되었다. 이러한 생식 계열 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 [참고: Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (GenPharm),제5,545,807호; 및 WO 97/17852].
또 다른 한편, 파지 디스플레이 기술 [참고: McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피 (copy)를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기준으로 하여 선별하게 되면, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수 있다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성들 중의 몇 가지 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있으며, 이들에 대한 고찰은, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]. V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역시키지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 작제할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 [참고: Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라서 단리시킬 수 있다 [또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참고].
앞서 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [참고: 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호].
항체 단편
특정 상황 하에서는 완전한 항체보다는 오히려 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 신속한 청소 (제거)를 허용해 주고, 고형 종양에 대한 접근을 증진시킬 수 있다.
항체 단편을 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 천연의 항체를 단백질 분해적 절단시킴으로써 유도되었다 [참고: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성시킬 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현하여 이로부터 분비될 수 있으므로, 이들 단편의 대량 생산이 용이해진다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로 부터 단리할 수 있다. 또 다른 한편, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al., Bio / Technology 10:163-167 (1992)]. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리시킬 수 있다. 재이용 수용체 결합성 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술은 전문의에게 명백할 것이다. 기타 양태에서는 선택되는 항체가 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [참조: WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호]. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 천연의 결합 부위를 갖는 유일한 종이므로, 이들은 생체내 사용 동안 환원된 비특이적 결합을 위해 적합하다. sFv 융합 단백질을 작제하여 sFv의 아미노 말단 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생성시킬 수 있다 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 참고]. 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.
이중-특이적 항체
이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체이다. 예시되는 이중-특이적 항체는 CD20 단백질의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 CD20 결합 부위를 또 다른 단백질에 대한 결합 부위와 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 항-CD20 암을, CD20-발현성 세포에 대한 세포성 방어 기전에 집중하고 국재하도록, 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예: CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16), 또는 NKG2D 또는 기타 NK 세포 활성화 리간드와 결합하는 암과 합할 수 있다. 이중-특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, CD20을 발현하는 세포에 국재시킬 수도 있다. 이들 항체는 CD20-결합성 암과, 세포독성제 (예: 사포린, 항인터페론-α, 빈카 알카로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)과 결합하는 암을 보유하고 있다. 이중-특이적 항체는 전장의 항체 또는 항체 단편 (예: F(ab')2 이중-특이적 항체)로서 제조할 수 있다.
WO 96/16673에는 이중-특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중-특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 기재되어 있다. 이중-특이적 항-ErbB2/Fcα 항체가 WO 98/02463에 제시된다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중-특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.
이중-특이적 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전통적인 전장의 이중-특이적 항체의 생성 방법은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [참고: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마 (quadromas)]는 10개의 상이 한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 친화 크로마토그래피 단계에 의해 통상 수행되는, 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율도 낮다. 유사한 과정이 문헌 [참고: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, Ig 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 세포 내로 공동 형질감염시킨다. 이는 작제에 사용된 3가지 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적 수율의 목적하는 이중-특이적 항체를 제공해주는 경우의 양태에서, 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 융통성을 제공해준다. 그러나, 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄를 동등한 비율로 발현시키는 것이 고 수율을 가져다 주거나, 또는 이들 비율이 목적하는 쇄 조합 수율에 대해 상당한 영향을 미치지 않는 경우에는, 2가지 또는 3가지 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터 내로 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 바람직한 양태에서는, 이중-특이적 항체가 하나의 암 중에 제1의 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 암 중에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2의 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가 목적하는 이중-특이적 화합물을 불필요한 면역글로불린 쇄 조합물로부터 격리시키는 것을 촉진시켜 주는데, 이는 이중-특이적 분자의 단지 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 격리 방식을 제공해주기 때문인 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중-특이적 항체를 생성시키기 위한 추가의 내역에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참고할 수 있다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 계면을 공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종-이량체의 비율 (%)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)로 대체시킨다. 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "강 (cavity)"은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 창출시킨다. 이는 기타 불필요한 최종 생성물, 예를 들어 동종-이량체에 비해 이종-이량체의 수율을 증가시켜 주는 기전을 제공한다.
이중-특이적 항체에는 가교결합되거나 "이종-접합체" 항체가 포함된다. 예 를 들어, 이종-접합체 내의 항체들 중의 하나를 아비딘에 커플링시킬 수 있고, 다른 것은 바이오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 불필요한 세포에 표적화하고 [참고: 미국 특허 제4,676,980호], HIV 감염을 치료하는 것으로 제안되었다 [참조: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089]. 이종-접합체 항체는 편리한 모든 가교결합 방법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 수 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이중-특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [참고: Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 천연의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을 디티올 착화제 나트륨 아비산염의 존재 하에 환원시켜 근접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시킨다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써, Fab'-TNB 유도체들 중의 하나를 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중-특이적 항체를, 효소를 선택적으로 고정화시키기 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근 기술상의 진보로 인해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 것이 촉진되었는데, 이들 단편을 화학적으로 커플링하여 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [참고: Shalaby et al., J. Exp . Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중-특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성 방법이 기재되어 있다. 각 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 별개로 분비시키고, 이를 대상으로 하여 시험관 내에서 직접적인 화학적 커플링을 수행하여 이중-특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중-특이적 항체는 인간 유방 종양 표적에 대항한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킬 뿐만 아니라 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포와 결합할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중-특이적 항체를 생성시켰다 [참고: Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종-이량체를 생성시키기 위해 활용할 수도 있다. 문헌 [참고: Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디 (diabody)" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍 형성 (짝짓기)을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH을 포함한 다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인와 짝짓기함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 [참고: Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)].
2 원자가 이상을 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중-특이적 항체를 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체와 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 신속하게 내재화 (및/또는 이화 작용)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 부류 이외의 항체) (예: 4가 항체)일 수 있는데, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산을 재조합 발현시킴으로써 용이하게 생성시킬 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인과 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 시나리오에서는, 항체가 Fc 영역과, 이러한 Fc 영역에 대해 아미노-말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진다. 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc [여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 1개 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다]을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게, 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어 약 2 내지 약 8개 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에 기재된 재조합 mAbs, 면역부착인자 및 기타 폴리펩티드 길항제를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵 생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실 루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다.
전장의 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질은 특히 당화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우, 예를 들어 치료적 항체를 세포독성제 (예: 독소)와 접합시키고 이러한 면역접합체 그 자체가 종양 세포 파괴에 있어 효능을 나타내는 경우에는, 세균에서 생산될 수 있다. 전장의 항체는 순환시 반감기가 보다 크다. 이. 콜라이에서의 생산은 보다 신속하고 비용면에서 보다 효율적이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 세균에서 발현하기 위해서는, 예를 들어 미국 특허 제5,648,237호 (Carter et. al.), 미국 특허 제5,789,199호 (Joly et al.), 및 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons et al.)를 참고할 수 있는데 (이들 특허는 본원에 참고로 도입된다), 이에는 발현 및 분비를 최적화하기 위한 해독 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열이 기재되어 있다. 발현 후, 항체를 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리하고, 이를 이소형에 따라서 단백질 A 또는 G 칼럼 내로 정제할 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 과정과 유사하게 수행할 수 있다.
원핵 생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들면, 필라멘트상 진균 또는 효모가 항체-코딩, 예를 들어 CD20 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모가 저급 진핵성 숙주 미생물 중에 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면 시조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.
예를 들어, 당화 CD20 결합성 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된 다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 [참고: Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]; 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO; 참고: Urlaub et al., Proc . Natl . Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고: Mather, Biol . Reprod ., 23:243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [참고: Mather et al., Annals N. Y. Acad . Sci ., 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 B 세포 고갈 항체 (예: CD20 결합성 항체) 또는 인테그린 길항제 항체 생성을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al., Meth . Enz ., 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem ., 102:255 (1980); 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 재특허 제30,985호]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트 륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시 킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 γ3에 권장된다 [참고: Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라서 이용하기도 한다.
예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 반응 크로마토그래피할 수 있다.
항체 접합체
항체를 세포독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소에 접합시킬 수 있다. 특정 양태에서는, 독소가 바람직하게는, 칼리케아미신, 마이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴 E, 및 이의 유사체 또는 유도체이다.
항체 조성물의 치료적 용도
본 발명의 CD20 결합성 항체는 수 많은 악성 및 비-악성 질환 (자가면역 질환 및 관련 질환 포함), 및 CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양 (B 세포 림프종 및 백혈병 포함)을 치료하는데 유용하다. 골수 내의 줄기 세포 (B-세포 전구 세포)에는 CD20 항원이 결여되어 있으므로, 치료 후에 건강한 B 세포가 재생되기 시작하여 수 개월 내에는 정상 수준으로 돌아온다.
본원에서의 "자가면역 질환"은 개개인 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물로부터 유발되고 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물에 대항하여 유도된 질병 또는 장애, 또는 이로부터 비롯되는 질환이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예에는 관절염 [류마티스성 관절염, 유년성 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염], 건선, 피부염 (아토피성 피부염 포함); 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역성 두드러기, 다발성 근염/피부 근 염, 독성 표피 괴사용해, 전신성 피부 경화증 및 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (크론병, 궤양성 결장염)과 연관된 반응, 및 괴저 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염 및/또는 상공막염의 공동-분리물을 수반한 IBD; 호흡기 장애 증후군, 예를 들어 성인 호흡기 장애 증후군 (ARDS), 수막염, IgE-매개성 질환, 예를 들어 아나필락시스 및 알레르기성 비염, 뇌염, 예를 들어 라스무센 (Rasmussen) 뇌염, 포도막염, 결장염, 예를 들어 현미경적 (미세) 결장염 및 콜라겐성 결장염, 사구체신염 (GN), 예를 들어 막성 GN, 특발성 막성 GN, 막성 증식성 GN (MPGN) (유형 I 및 유형 II 포함), 및 신속한 진행성 GN, 알레르기성 질환, 습진, 천식, T 세포 침윤과 만성 염증 반응과 관련된 질환, 아테롬성 경화증, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 피부 SLE, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신, 원판상, 탈모증 포함), 유년성 발병 당뇨병, 다발성 경화증 (MS), 예를 들면 스피노-광학 (spino-optical) MS, 알레르기성 뇌척수염, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증 (sarcoidosis), 베게너스 (Wegener's) 육아종증을 포함한 육아종증, 과립구결핍증, 혈관염, 예를 들어 대혈관 혈관염 [류마티스성 다발성 근육통 및 거대 세포 (다카야스) 관절염 포함], 중혈관 혈관염 [가와사키병 (Kawasaki's disease) 및 결절성 다발성 동맥염 포함], CNS 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어 추르크-스트라우쓰 (Churg-Strauss) 혈관염 또는 증후군 (CSS), 재생불량성 빈혈, 콤브스 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진정 적혈구계 무형성 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병 (Bechet disease), 캐슬맨 증후군 (Castleman's syndrome), 구드패스츄어 증후군 (Goodpasture's Syndrome), 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 (Stevens- Johnson) 증후군, 고형 기관 이식체 거부 반응 (고 패널 반응성 항체 역가에 대한 전처리, 조직 내에서의 IgA 침착, 및 신장 이식, 간 이식, 장 이식, 심장 이식 등으로부터 야기된 거부 반응 포함), 이식편 대 숙주 질병 (GVHD), 수포성 유사천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 및 점막 유사천포창 천포창 포함), 자가면역성 다발성 내분비병증, 라이터병 (Reiter's disease), 근육강직 증후군, 면역 복합 신염, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개된 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발병되는 바와 같다), 예를 들어 자가면역성 저혈소판증, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역성 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능저하증; 자가면역성 내분비 질환, 예를 들어 자가면역성 갑상선염, 만성 갑상선염 [하시모토 (Hashimoto') 갑상선염], 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디송병 (Addison's disease), 그레이브스병 (Grave's disease), 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비증 증후군), 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM)으로서 지칭되기도 하는 유형 I 당뇨병 (소아 IDDM 포함), 및 쉬이한 증후군 (Sheehan's syndrome); 자가면역성 간염, 림프계 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre' Syndrome), 베르거병 [Berger's Disease (IgA 신경병증)], 원발성 담즙성 간경변, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 포진성 피부염의 공동-분비물을 수반한 난치성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; Lou Gehrig's disease), 관상 동맥 질환, 자가면역성 내이 질환 (AIED), 자가면역성 난청, 안전진 간대성근경련증 (OMS), 다발성 연골염, 예를 들어 난치성 다발성 연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 거대 세포 간염, 공막염, 의미 미확정의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 말초 신경병증, 종양연관성 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비 및 CNS의 채널병증; 자폐증, 염증성 근육병증, 및 국소 분절성 사구체경화증 (FSGS)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양은 세포 표면 상에 CD20을 발현하는 세포의 비정상적인 증식을 포함하는 것이다. CD20+ B 세포를 갖는 B 세포 신생물에는 CD20-양성 호지킨병 [림프구 우세형 호지킨병 (LPHD) 포함]; 비-호지킨 림프종 (NHL); 소포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발 세포 백혈병이 포함된다. 비-호지킨 림프종에는 저 악성도/소포성 비-호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 림프종 (SLL), 중간 악성도/소포성 NHL, 중간 악성도 확산성 NHL, 고 악성도 면역모세포성 NHL, 고 악성도 림프아구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 형질세포계 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia)이 포함된다. 이들 암의 재발을 치료하는 것 또한 고려된다. LPHD는 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발하는 경향이 있는 호지킨병의 유형이고, CD20-양성 악성 세포를 특징적으로 나타낸다. CLL은 4가지 주요 유형의 백혈병 중의 하나이다. 림프구로 불리우는 성숙한 B 세포의 암인 CLL은 세포가 혈액, 골수 및 림프 조직 내에 진행성 축적되는 징후를 나타낸다. 무통성 림프종은 서서히 성장하는 불치병인데, 수 차례의 일시적 차도와 재발을 반복한 후에 환자들은 평균 6 내지 10년 정도 생존한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계 암을 지칭한다. 호지킨 림프종은 일반적으로, 리드-슈테른베르크 (Reed-Sternberg) 세포가 호지킨 림프종에는 존재하고 비-호지킨 림프종에는 존재하지 않는 것으로써, 비-호지킨 림프종과 구별될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어에 포괄되는 비-호지킨 림프종의 예에는 당해 분야에 공지된 분류 도식, 예를 들어 문헌 [참고: Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd. 2000) (특히 도 11.57, 11.58 및/또는 11.59 내의 목록)]에 기재된 바와 같은 개정 유럽-미국 림프종 [Revised European-American Lymphoma (REAL)] 분류에 따라서 당업자 (예: 종양학자 또는 병리학자)에 의해 그 자체로서 확인될 수 있는 것이 포함된다. 보다 구체적인 예에는 재발성 또는 난치성 NHL, 제일선 저 악성도 (front line low grade) NHL, 병기 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 소 림프구성 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 프로-림프구성 백혈병 및/또는 소 림프구성 림프종, B-세포 프로-림프구성 림프종, 면역종 및/또는 림프형질세포성 림프종, 연변층 (marginal zone) B 세포 림프종, 비장 연변층 림프종, 림프절 이외 연변층 - MALT 림프종, 림프절 연변층 림프종, 모발 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 형질 세포 골수종, 저 악성도/소포성 림프종, 중간 악성도/소포성 NHL, 외투 세포 림프종, 소포 중심 림프종 (소포성), 중간 악성도 확산성 NHL, 확산성 대형 B-세포 림프종, 침습성 (공격성) NHL (침습성 제일선 NHL 및 침습성 재발 NHL 포함), 자기 유래 줄기 세포 이식 후에 재발하거나 이에 난치성인 NHL, 원발성 종격 (mediastinal) 대형 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 고 악성도 면역모세포성 NHL, 고 악성도 림프아구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 버키트 (Burkitt) 림프종, 전구체 (말초) T-세포 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 성체 T-세포 림프종 및/또는 백혈병, T 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 프로-림프구성 백혈병, 대형 과립상 림프구성 백혈병, 균상식육종 (mycosis fungoides) 및/또는 세자리 (Sezary) 증후군, 림프절 이외 천연 킬러/T-세포 (코 유형) 림프종, 장병증 유형 T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 피하 지방층염 (panniculitis) 유사 T-세포 림프종, 피부 림프종, 역형성 대형 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 소장 T 세포 림프종, 말초 T 세포 (달리 명시되지 않는 한) 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
구체적 양태에서, 본 발명의 CD20+ B 세포를 갖는 B 세포 암을 치료하는 방법은 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소 림프구성 림프종 (SLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 치료하는데 사용한다.
구체적 양태에서, 자가면역 질환을 치료하거나 B 세포를 고갈시키는 방법은 류마티스성 관절염 및 유년성 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염 포함), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 치료하는데 사용한다.
목적 수준의 B 세포 고갈은 해당 질병에 좌우될 것이다. CD20 양성 암을 치료하기 위해서는, 본 발명의 항-CD20 항체의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, CD20 양성 B 세포 신생물을 치료하기 위해서는, 예를 들어 종양 성장 (크기), 암성 세포 유형의 증식, 전이, 특정 암의 기타 징후 및 증상을 모니터링함으로써, 당해 분야의 전문의에 의해 평가될 수 있는 질병의 진행을 적어도 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 질병의 진행을 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월, 보다 바람직하게는 4개월, 보다 바람직하게는 5개월, 보다 더 바람직하게는 6개월 이상 동안 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 보다 더 바람직한 양태에서는, 병의 차도 시간을 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년, 보다 바람직하게는 3년, 보다 더 바람직하게는 5년 이상 증가시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 가장 바람직한 양태에서는, 해당 질병을 치유하기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 바람직한 양태에서는, 암 환자에게서의 B 세포 고갈이 치료 전 기준선 수준의 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 및 심지어 100%이다.
자가면역 질환을 치료하기 위해서는, CD20 결합성 항체의 투여량을 조정함으로써, 개개 환자에게서 질병 및/또는 질환의 중증도에 따라서 B 세포 고갈 정도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다. B 세포 고갈은 완전히 이루어질 수는 있지만, 반드시 완전히 이루어질 필요는 없다. 또한, 총 B 세포 고갈은 초기 치료 동안에 요망되지만, 후속 치료에서는 부분 고갈 만을 달성하도록 투여량을 조정할 수 있다. 한 양태에서는, B 세포 고갈이 20% 이상인데, 즉 치료 전의 기준선 수준과 비교해서 CD20 양성 B 세포의 80% 이하가 잔존한다. 기타 양태에서, B 세포 고갈은 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상이다. 바람직하게는, B 세포 고갈이 질병의 진행을 중지시키기에 충분하고, 보다 바람직하게는 치료 중인 특정한 질병의 징후 및 증상을 완화시키기에 충분하고, 보다 더 바람직하게는 질병을 치유하기에 충분하다.
신생물의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 해당 질병 전문의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 전문의는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 파라미터에는 평균 질병 진행 시간, 병의 차도 시간 및 안정 기간이 포함될 수 있다.
다음 참고 문헌에는 림프종 및 CLL, 이들의 진단, 치료, 및 치료 효능을 측 정하기 위한 표준 의학 과정이 기재되어 있다 [참고: Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].
자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 해당 질병 전문의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 전문의는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 다음의 이의 예이다:
한 양태에서는, 본 발명의 방법 및 조성물이 류마티스성 관절염을 치료하는데 유용하다. RA는 많은 관절에 있어서의 염증, 연골 손실 및 골 침식을 유발시켜 관절 파괴를 가져오고, 궁극적으로는 관절 기능 저하를 야기시키는 것을 특징으로 한다. 부가적으로, RA는 전신 질환이기 때문에, 폐, 눈 및 골수와 같은 기타 조직에 영향을 미칠 수 있다.
CD20 결합성 항체를 초기 RA 환자에게서 1차 치료로서 사용하거나 [즉, 메토트렉세이트 (MTX)를 투약하지 않음], 또는 예를 들어, MTX 또는 시클로포스파미드 와 병용해서 사용할 수 있다. 또는, 상기 항체를 DMARD 및/또는 MTX로는 치료하기 어려운 (난치성) 환자에 대한 2차 치료 요법로서, 예를 들어 MTX와 병용해서 사용할 수 있다. CD20 결합성 항체는 또한, B 세포를 혈류 내로 동원하여 보다 효과적으로 사멸시키는 B 세포 동원제, 예를 들어 인테그린 항체와 병용해서 투여할 수 있다. CD20 결합성 항체는 관절 손상을 예방 및 제어하고, 구조적 손상을 지연시키며, RA 내의 염증과 연관된 통증을 감소시키고, 일반적으로 중간 수준 내지 중중의 RA 징후 및 증상들을 저하시키는데 유용하다. RA 환자는 RA를 치료하는데 사용되어 온 기타 약물을 이용한 치료에 앞서, 치료 후에, 또는 이러한 치료와 함께, CD20 결합성 항체로 치료할 수 있다 (하기 병용 요법 참고). 한 양태에서는, 기존에 질병 완화 항류미티스약을 이용한 치료에 실패하였고/하였거나 메토트렉세이트 단독 치료에 대해 부적절한 반응을 나타낸 바 있는 환자를 CD20 결합성 항체로 치료한다. 또 다른 양태에서는, 환자에게 인간화 CD20 결합성 항체 + 시클로포스파미드, 또는 CD20 결합성 항체 + 메토트렉세이트를 투여한다.
RA에서의 치료 효능을 평가하기 위한 한 가지 방법은 미국 류마티스 협회 (ACR) 기준에 근거한 것인데, 이는 특히 부서지기 쉽고 팽윤된 관절 상의 개선율을 측정한다. RA 환자는 항체 치료하지 않았거나 (예를 들면, 치료 전의 기준선) 또는 플라시보 (위약)으로 치료한 경우와 비교해서 ACR 20 (20% 개선)으로 스코어링될 수 있다. 항체 치료 효능을 평가하기 위한 다른 방식에는 X선 스코어링, 예를 들면, 골 침식 및 관절 공간 협소화와 같은 구조적 손상을 스코어링하는데 사용되어 온 샤프 X선 스코어가 포함된다. 치료 동안 또는 치료 후 일정 기간에 건강 평 가 질문서 [HAQ] 스코어, AIMS 스코어, SF-36를 기준으로 하여 장애를 예방하거나 개선시키는 것에 대해 환자를 평가할 수 있다. ACR 20 기준은 부서지기 쉬운 (통증있는) 관절 계수치와 팽윤된 관절 계수치 둘 다에 있어서의 20% 개선과, 5가지 부가의 조치 중의 적어도 3가지에 있어서 20% 개선을 포함할 수 있다:
1. 가시적 아날로그 규모에 의한 환자의 통증 평가 (VAS),
2. 질병 활성에 대한 환자의 포괄적인 평가 (VAS),
3. 질병 활성에 대한 의사의 포괄적인 평가 (VAS),
4. 건강 평가 질문서에 의해 측정된 환자의 자체 평가된 장애; 및
5. 급성 상 반응물 CRP 또는 ESR.
ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, ACR 스코어 20 이상, 바람직하게는 ACR 30 이상, 보다 바람직하게는 ACR 50 이상, 보다 더 바람직하게는 ACR 70 이상, 가장 바람직하게는 ACR 75 이상을 달성하기에 유효한 양의 본 발명의 CD20 결합성 항체를 환자에게 투여한다.
건선성 관절염은 독특하면서도 별개의 방사선촬영 특징을 갖는다. 건선성 관절염의 경우, 관절 침식과 관절 공간 협소화는 또한, 샤프 스코어에 의해 평가할 수 있다. 본원에 기재된 인간화 CD20 결합성 항체를 사용하여 관절 손상을 예방할 뿐만 아니라 상기 질환의 병 징후와 증상을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 치료 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합성 항체를, SLE로 인해 고통받고 있는 환자에게 투여함으로써 루푸스 또는 SLE를 치료하는 방법이다. SLEDAI 스코어는 질병 활성의 수치적 정량화를 제공해준다. SLEDAI 는 질병 활성과 상관이 있는 것으로 공지된 24가지 임상 및 실험실용 파라미터의 칭량 지수이고, 수치 범위는 0 내지 103이다 [참고: Bryan, Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14: 515-521]. 이중 가닥 DNA에 대한 항체는 신장 발적 (renal flares) 및 루푸스의 기타 소견 (증상)을 유발시키는 것으로 여겨진다. 항체 치료를 받고 있는 환자를 대상으로 하여, 혈청 크레아티닌, 뇨단백 또는 뇨중 혈액 상의 상당하고도 재현 가능한 증가로서 정의되는 신장 발적 시간에 대해 모니터링할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 환자를 대상으로 하여, 항핵 항체 및 이중-가닥 DNA에 대한 항체 수준을 모니터링할 수 있다. SLE에 대한 치료는 고 용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.
척추관절병증은 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 포함한 관절 질환 군이다. 치료 성공은 입증된 환자 및 의사의 포괄적인 평가 측정 도구에 의해 결정할 수 있다.
각종 약물을 사용하여 건선을 치료하고; 치료는 질병 중증도와 직접 관련하여 상이하다. 보다 순한 형태의 건선을 나타내는 환자는 전형적으로, 국소 치료를 활용하는데, 예를 들면, 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐을 활용하여 질병을 관리하는 반면, 중간 정도 및 중증의 건선을 나타내는 환자는 전신 요법 (예: 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB)를 이용하는 것으로 예상된다. 타르를 사용하기도 한다. 이들 요법은 안전성 측면에서의 우려, 시간 소모적 섭생 또는 불편한 치료 과정을 복합적으로 나타낸다. 더우기, 몇몇 요법은 비용이 많이 드는 장비가 요구되고 연구실 세팅 내에 전용 공간이 필요하다. 전신용 약물은 고혈압, 고지혈증, 골수 억제, 간 질환, 신장 질환 및 위장 장해를 포함한 심각한 부작용을 유발시킬 수 있다. 또한, 광요법의 사용은 피부암 발병을 증가시킬 수 있다. 국소 요법의 사용과 연관된 불편함과 불쾌함 이외에도, 광요법과 전신 치료는 요법을 수행하거나 요법을 수행하지 않은 경우에도 환자를 순환시켜야 하고, 부작용으로 인한 평생 노출을 모니터링해야 한다.
건선에 대한 치료 효능은 기준선 질환과 비교한 의사의 포괄적 평가 (PGA) 변화 및 건선 부위 및 중증도 지수 (PASI) 스코어, 건선 증상 평가 (PSA)를 포함한, 상기 질병의 임상 징후 및 증상의 변화를 모니터링함으로써 평가한다. 환자를 대상으로 하여, 특정 시점에 경험한 가려움 정도를 표시하기 위해 사용되어 온 가시적 아날로그 등급에 대해 치료 전 과정에 걸쳐 주기적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 Fc 돌연변이를 수반하는 항-HER2 항체는 HER2-발현성 또는 과발현성 암을 치료하는데 유용하다. "HER2-발현성 암"은 그들의 세포 표면에 존재하는 HER2 단백질을 갖는 세포를 포함하는 것이다. HER2 수용체를 "과발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교해서, 그의 세포 표면에 상당히 고 수준의 HER 수용체, 예를 들어 HER2를 갖는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 유발되거나 또는 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. HER 수용체 과발현은 특정 세포 표면 상에 존재하는 HER 단백질의 수준 증가를 평가함으로써 진단 또는 예후 검정 (예: 면역조직화학 검정; IHC)에서 결정할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 예를 들어 형광성 계내 혼성화 [FISH; 참고: WO 98/45479 (1998 년 10월에 공개됨)], 서던 블롯팅 (southern blotting), 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량 PCR (RT-PCR)을 통하여 세포 내의 HER-코딩 핵산 수준을 측정할 수 있다. 또한, 생물학적 유체, 예를 들어 혈청에서 쉐드 (shed) 항원 (예: HER 세포외 도메인)을 측정함으로써 HER 수용체 과발현을 연구할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,933,294호 (1990년 6월 12일자로 허여됨); WO 91/05264 (1991년 4월 18일자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995년 3월 28일자로 허여됨); 및 Sias et al. J. Immunol . Methods, 132: 73-80 (1990)]. 상기 검정 이외에도, 각종 생체내 검정이 전문의에게 이용 가능하다. 예를 들어, 환자 체내 세포를, 탐지 가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지시킨 항체에 노출시킬 수 있고, 이러한 환자 내의 세포에 대한 항체 결합을, 예를 들어 방사능에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 미리 노출시킨 환자로부터 취한 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.
Her-2 항체 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 각종 암이 다음에 열거된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 [카르시노이드 종양, 가스트린종 (gastrinoma) 및 섬세포 암 포함], 중피종, 신경집종 (청신경초종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세 포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관암 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
HER2 항체를 사용하여 각종 비-악성 질병 또는 장애, 예를 들어 자가면역 질환 (예: 건선); 자궁내막증; 피부 경화증; 재발 협착증; 폴립, 예를 들어 결장 폴립, 비내 폴립 또는 위장 폴립; 섬유선종; 호흡기 질환; 담낭염; 신경섬유종증; 다낭성 신장 질환; 염증 질환; 피부 장애, 예를 들어 건선 및 피부염; 혈관 질환; 혈관 상피 세포의 비정상적인 증식과 관련된 질환; 위장 궤양; 메네트리에병 (Menetrier's disease), 분비성 선종 또는 단백질 손실 증후군; 신 장애; 혈관형성성 장애; 안과 질환, 예를 들어 연령 관련 황반 변성, 추정 눈 히스토플라스마증, 증식성 당뇨병성 망막병증으로부터의 망막 신생혈관증식, 망막 혈관화, 당뇨병성 망막병증, 또는 연령 관련 황반 변성; 뼈 관련 병리 상태, 예를 들어 골관절염, 구루병 및 골다공증; 뇌 허혈성 사건 후 외상; 섬유성 또는 부종 질환, 예를 들어 간경변증, 폐 섬유증, 카르코이드증 (carcoidosis), 갑상선염, 전신성 과점성 증후군, 오슬러 웨버-렌두병 (Osler Weber-Rendu disease), 만성 폐쇄성 폐 질환, 또는 화상, 외상, 방사선, 발작, 저산소증 또는 허혈증 후의 부종; 피부의 과민 반응; 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병성 신병증; 길랑-바레 증후군; 이식편 대 숙주 질환 또는 이식조직 거부; 파제트병 (Paget's disease); 뼈 또는 관절 염증; 광노화 (예 를 들어, 인간 피부에 자외선을 조사함으로써 유발됨); 양성 전립선 비대증; 특정의 미생물 감염증 [아데노바이러스, 한타바이러스, 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 예르시니아 (Yersinia) 종 및 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis) 중에서 선택된 미생물성 병원체 포함]; 혈소판 응집에 의해 유발된 혈전증; 생식기 질환, 예를 들어 자궁내막증, 난소 과자극 증후군, 자간전증, 기능이상 자궁 출혈 또는 불규칙 과다월경; 활막염; 죽종 (atheroma); 급성 및 만성 신병증 (증식성 사구체신염 및 당뇨병-유도된 신 질환 포함); 습진; 비대성 흉터 형성; 내독성 쇽 및 진균성 감염; 가족성 선종성 폴립증; 신경변성 질환 (예: 알츠하이머병, AIDS-관련 치매, 파키슨병 (Parkinson's disease), 근위축성 측삭 경화증, 색소성 망막염, 척수 근위축증 및 소뇌 변성); 골수형성이상 증후군; 재생불량성 빈혈; 허혈성 손상; 폐, 신장 또는 간의 섬유증; T-세포 매개된 과민증; 영아 비대성 유문 협착증; 뇨 폐쇄성 증후군; 건선성 관절염; 및 하시모토 갑상선염을 치료할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 본원에서 치료하는데 바람직한 비-악성 적증증에는 건선, 자궁내막증, 피부 경화증, 혈관 질환 (예: 재발 협착증, 동맥경화증, 관상 동맥 질환 또는 고혈압), 결장 폴립, 섬유선종 또는 호흡기 질환 (예: 천식, 만성 기관지염, 기관지확장증 또는 낭포성 섬유증)이 포함된다.
본 발명의 항-혈관형성 및 항-VEGF 항체는 다음 종양성 및 비-종양성 장애를 포함한 혈관형성 관련 장애를 치료하는데 유용하다. 종양성 장애에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 신장암 또는 신암, 유방암, 결장 암, 직장암, 결장직장암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 편평 세포암 (예: 상피 편평 세포암), 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 두경부암, 교모세포종, 망막모세포종, 성상세포종, 난포막종, 남성배세포종 (arrhenoblastoma), 간세포암, 혈액 악성 종양, 예를 들어 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 및 급성 혈액 악성 종양, 자궁내막 또는 자궁 암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 타액선 암종, 외음부암, 갑상선암, 식도 암종, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 비인두 암종, 후두 암종, 카포시 (Kaposi) 육종, 흑색종, 피부 암종, 신경집종, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골원성 육종, 평활근육종, 요로 암종, 갑상선 암종, 윌름 종양 (Wilm's tumor) 뿐만 아니라 모반증 (phakomatoses)과 연관된 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종), 및 메이그스 (Meigs) 증후군이 포함된다. 보다 특히, 본 발명의 길항제에 의해 치료할 수 있는 암에는 신암, 유방암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 비-호지킨 림프종 (NHL), 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종이 포함된다.
항-VEGF 항체를 포함한 항-혈관형성 항체를 이용하여 치료할 수 있는 비-종양성 질환에는, 예를 들어 바람직하지 못하거나 이상한 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 반점, 사르코이드증, 아테롬성 경화증, 아테롬성 경화성 반점, 심근 경색으로부터의 부종, 당뇨병 및 기타 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙아 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변 성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식편 신생혈관증식, 각막 이식편 거부, 망막/융모막 신생혈관증식, 전방각 신생혈관증식 (홍색증), 안과 신생혈관 질환, 혈관성 재발 협착증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과형성 [그레이브스병 (Grave's disease) 포함], 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 발작/폐쇄성 두부 손상/외상과 연관된 부종), 활막 염증, RA에서 판누스 형성, 골화성 근육염, 비대성 뼈 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 제3 유체 공간형성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 근종, 조산, 만성 염증, 예를 들어 IBD (크론병 및 궤양성 결장염), 신 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 바람직하지 못하거나 이상한 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비대성 흉터, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식증, 피부 경화증, 트라코마 (trachoma), 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심막염과 연관된 삼출), 및 흉막 삼출이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 Fc 아미노산 변경을 지닌 항-CD11a 항체는 LFA-1 매개된 장애를 치료하는데 유용하다. 용어 "LFA-1-매개된 장애"는 림프구 상에서의 LFA-1 수용체가 관여하는 세포 부착 상호 작용에 의해 유발된 병적 상태를 지칭한다. 이러한 장애의 예에는 T 세포 염증 반응, 예를 들어 염증성 피부 질환 (건선 포함); 염증성 장 질환과 연관된 반응 [예: 크론병 및 궤양성 결장염]; 성인 호흡기 장애 증후군; 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 알레르기성 질환, 예를 들어 습진 및 천식; T 세포 침윤 및 만성 염증 반응과 관련이 있는 기타 질환; 피부 과민증 반응 [옻 (poison ivy) 과민 반응 및 덩굴떡갈나무 (poison oak) 과민 반응 포함]; 아테롬성 경화증; 백혈구 부착 결핍증; 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 자가면역성 갑상선염, 실험적 자가면역성 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 유년성 발병 당뇨병, 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발성 근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 지연형 과민증과 연관된 면역 반응; 악성 빈혈; 백혈구 누출과 관련된 질환; CNS 염증 장애; 패혈증 또는 외상의 영향 하의 다발성 기관 손상 증후군; 자가면역성 용혈성 빈혈; 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개된 질환; 모든 유형의 이식 거부, 예를 들어 이식편 대 숙주, 또는 숙주 대 이식편 질환 등이 포함된다.
FcRn에 대한 결합을 증가시키고 혈청 반감기를 증가시키는 본 발명의 Fc 아미노산 변경을 지닌 항-IgE 항체는 IgE 매개된 장애를 치료하는데 유용하다.
IgE 매개된 장애에는 아토피성 장애가 포함되는데, 이는 천연상 존재하여 흔히 흡입되고 섭취되는 수 많은 항원에 대해 면역학적으로 반응하여 IgE 항체를 지속적으로 생성시키는 유전적 성향을 특징으로 한다. 구체적인 아토피성 장애에는 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 및 알레르기성 위장병증이 포함된다. 아토피 환자들은 종종 복합적인 알레르기를 나타내는데, 이는 이들 환자가 많은 환경적 알레르기 유발 항원 (이에는 계절적, 사계절 및 직업적 알레르기 유발 항원이 포함된다)에 대한 IgE 항체를 갖고 있고, 이로부터의 증상을 지니고 있다는 것을 의미한다. 계적절 알레르기 유발 항원의 예에는 꽃가루 [예: 풀, 나무, 호밀, 티모시 (timothy), 두드러기쑥)이 포함되는 반면, 사계절 알레르기 유발 항원의 예에는 진균 (예: 곰팡이, 곰팡이 포자), 털 (feather), 동물 및 곤충 (예: 먼지 진드기) 부스러기가 포함된다. 직업적 알레르기 유발 항원의 예에는 세정제, 금속 및 이소시아네이트가 포함된다. IgG-매개된 반응을 유발시킬 수 있는 비-항원 특이적 자극에는 감염, 자극제 (예: 연기), 연소 연기, 디젤 배기 미립자 및 이산화황, 운동, 찬바람 및 감정상의 스트레스가 포함된다. 과민 반응은 음식물 내의 단백질, 사독, 백신, 호르몬, 항혈청, 효소 및 라텍스, 항생제, 근육 이완제, 비타민, 세포독소, 아편제, 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 철 덱스트란 및 폴리겔린에 대한 노출로부터 비롯될 수 있다.
그러나, IgE 수준 상승과 연관된 장애는 유전적 (아토피성) 병인을 수반한 것으로 제한되지 않는다. IgE-매개된 것으로 여겨지고 본 발명의 제형을 사용하여 치료할 수 있는, IgE 수준 상승과 연관된 기타 장애에는 과민증 (예: 아나필락시성 과민증), 습진, 두드러기, 알레르기성 기관지폐성 아스페르길루스증, 기생충병, 고-IgE 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 비스코트-알드리히 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 추르크-스트라우쓰 증후군, 전신성 혈관염, 흉선 림프조직형성부전증, IgE 골수종, 이식편 대 숙주 반응, 염증성 장 질환 (예: 크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염 및 감염성 결장염), 위장병증, 장염, 점막염 (예: 구강 점막염, 위장 점막염, 비내 점막염 및 직장염), 괴사성 소장결장염 및 식도염이 포함된다.
투여량
해당 분야의 전문의에게 잘 알려져 있는 투약과 관련한 요인들과 치료하고자 하는 적응증에 따라서, 본 발명의 길항제 및 항체를, 독성과 부작용은 최소화시키면서 상기 적응증을 치료하는데 효능이 있는 투여량으로 투여할 것이다. CD20 양성 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료상 유효 투여량은 약 250 mg/㎡ 내지 약 400 mg/㎡ 또는 500 mg/㎡, 바람직하게는 약 250 내지 375 mg/㎡의 범위일 수 있다. 한 양태에서는, 투여량 범위가 275 내지 375 mg/㎡이다. CD20 양성 B-세포 신생물을 치료하는 한 양태에서는, 상기 항체를 300 내지 375 mg/㎡의 범위로 투여한다. B 세포 림프종, 예를 들어 비-호지킨 림프종으로 인해 고통받고 있는 환자를 치료하기 위한 구체적 양태에서는, 본 발명의 항-CD20 항체 및 인간화 항-CD20 항체를 인간 환자에게 10 mg/kg 또는 375 mg/㎡의 투여량으로 투여한다. 한 양태에서는, 리툭시마브를 7 내지 15 mg/kg의 투여량 범위로 투여할 수 있다. NHL를 치료하기 위한 한 가지 투약 섭생은 치료 첫째 주에는 항체 조성물 1회분을 10 mg/kg의 투여량으로 투여한 다음, 2주 간격으로 동일한 양의 항체 두번째 용량을 투여한다. 일반적으로, NHL 환자는 이러한 치료를 1년에 1회 받지만, 림프종이 재발한 경우에는 이를 반복할 수 있다. 또 다른 투약 섭생에서는, 저 악성도 NHL 치료받은 환자에게 4주 동안 인간화 2H7의 특정 버젼, 바람직하게는 v16을 투여한 다음 (매주 375 mg/㎡씩 투여), 5주째에는 항체 + 표준 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 또는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손) 화학요법을 3회 부가 과정 동안 투여하는데, 이는 3 주기 동안 3주 마다 공급하였다.
류마티스성 관절염을 치료하기 위한 한 가지 양태에서는, 상기 인간화 항체에 대한 투여량 범위가 125 mg/㎡ (1회분당 약 200 mg에 상응함) 내지 600 mg/㎡인데, 이는 2회분으로 나누어 투여하는데, 예를 들어 제1 회분 200 mg을 1일 째에 투여한 다음, 제2 회분 200 mg을 15일 째에 투여한다. 상이한 양태에서는, 투여량이 1회분당 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg이다.
질병을 치료하는데 있어서, 본 발명의 B 세포 표적화 항체, 예를 들어 CD20 결합성 항체를 이러한 질병 전문의에 의해 결정되는 바와 같이, 만성적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여할 수 있다.
약물을 정맥내 주입 또는 피하 방식으로 투여한 환자는 부작용, 예를 들어 발열, 오한, 화끈감, 무력증 및 두통을 경험할 수 있다. 이러한 부작용을 완화시키거나 최소화시키기 위해, 환자에게 해당 항체의 초기 컨디셔닝 용량(들)을 투여한 다음 치료 용량을 투여할 수 있다. 컨디셔닝 용량(들)은 환자가 보다 높은 투여량을 견딜 수 있도록 적응시키기 위해 치료 용량보다는 낮을 것이다.
투여 경로
본 발명의 방법에 사용된 항체는 의사에게 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 전 기간에 걸친 연속식 주입, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 관절내, 활막내, 수막강내, 병변내 또는 흡입 경로 (예: 비내)에 의해, 일반적으로 정맥내 또는 피하 투여에 의해 인간 환자에게 투여한다.
한 양태에서는, 인간화 2H7 항체를, 주입용 비히클로서 0.9% 염화나트륨 용액을 수반한 정맥내 주입제로서 투여한다.
병용 요법
상기 언급된 B 세포 신생물을 치료하는데 있어서, 환자를 다중 약물 섭생에서의 화학요법제와 같은 한 가지 이상의 치료제와 연계해서 본 발명의 CD20 결합성 항체로 치료할 수 있다. CD20 결합성 항체는 이러한 화학요법제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여하거나, 또는 기타 요법과의 비-반응성 후에 투여할 수 있다. 림프종 치료를 위한 표준 화학요법에는 시클로포스파미드, 시타라빈, 멜팔란 및 미톡산트론 + 멜팔란이 포함될 수 있다. CHOP는 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 가장 흔한 화학요법 섭생 중의 하나이다. 다음은 CHOP 섭생에 사용된 약물이다: 시클로포스파미드 (브랜드명 시톡산, 네오사르); 아드리아마이신 (독소루비신/히드록시독소루비신); 빈크리스틴 (온코빈: Oncovin); 및 프레드니솔론 (종종 델타손 또는 오라손으로 지칭됨). 특정한 양태에서는, CD20 결합성 항체를, 이를 필요로 하는 환자에게 다음 화학요법제들 중의 하나 이상과 병용해서 투여한다: 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론. 구체적 양태에서는, 림프종 (예: 비-호지킨 림프종)으로 인해 고통받고 있는 환자를 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 요법과 연계해서 본 발명의 항-CD20 항체로 치료한다. 또 다른 양태에서는, 암 환자를 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손) 화학요법과 병용해서 본 발명의 인간화 CD20 결합성 항체로 치료할 수 있다. 구체적 양태에서는, CD20-양성 NHL로 인해 고통받고 있는 환자를 CVP와 연계해서 인간화 2H7.v16 또는 상기 언급된 그의 변이체로 치료한다. CLL 치료법의 구체적 양태에서는, CD20 결합성 항체를 플루다라빈 및 시톡산 중의 하나 또는 둘 다를 이용한 화학요법과 연계해서 투여한다.
상기 언급된 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환을 치료하는데 있어서, 환자를, 예를 들어 다중 약물 섭생에서와 같은 제2 치료제, 예를 들면 면역억제제와 연계해서, 본 발명의 B 세포 고갈제 (예: CD20 결합성 항체)로 치료할 수 있다. B 세포 고갈제는 면역억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여하거나 기타 요법과의 비-반응성시 투여할 수 있다. 면역억제제는 당해 분야에 제시된 바와 동일한 투여량으로 투여하거나 이 보다 적은 양으로 투여할 수 있다. 바람직한 부가 면역억제제는 치료하고자 하는 질환 유형 뿐만 아니라 환자의 병력을 포함한 많은 요인들에 의해 좌우될 것이다.
부가 요법을 위해 본원에 사용된 바와 같은 "면역억제제"는 환자의 면역계를 억제하거나 은폐시키는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이러한 작용제에는 사이토킨 생성을 억제하거나, 자기 항원 발현을 하향 조절하거나 억제시키거나, 또는 MHC 항원을 은폐시키는 물질이 포함될 것이다. 이러한 작용제의 예에는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 [참고: 미국 특허 제4,664,077호], 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대한 부작용이 있는 경우에는, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (이는 미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 은폐시킨다); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개체특 이형 항체; 시클로스포린 A; 사이토킨 또는 사이토킨 수용체 길항제 (항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체 포함); 항종양 괴사 인자-α 항체; 항종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범 (pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합성 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 [참고: 1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187]; 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 [참고: 미국 특허 제5,114,721호]; T-세포 수용체 단편 [참고: Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; 및 WO91/01133]; 및 T 세포 수용체 항체 [참고: EP 340,109], 예를 들면 TlOB9가 포함된다.
류마티스성 관절염을 치료하기 위해, 환자를 다음 약물들 중의 한 가지 이상과 연계해서, 본 발명의 CD20 결합성 항체로 치료할 수 있다: DMARD (질병 완화 항류마티스약) (예: 메토트렉세이트), NSAI 또는 NSAID (비-스테로이드계 소염 약물), HUMIRA™ [아달리무마브 (adalimumab); 공급처: Abbott Laboratories], ARAVA® (레플루노미드: leflunomide), REMICADE® [인플릭시마브 (infliximab); 공급처: Centocor Inc., of Malvern, Pa], ENBREL [에타네르셉트 (etanercept); 공급처: Immunex, WA], COX-2 억제제. RA에 흔히 사용되는 DMARDs는 히드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 스타필 로코쿠스성 단백질 A 면역흡착제이다. 아달리무마브는 TNFα와 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시마브는 TNFα와 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 "면역부착인자" 융합 단백질이다. RA의 통상적인 치료법에 대해서는, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46 (2): 328-346 (February, 2002)]. 구체적 양태에서는, RA 환자를 메토트렉세이트 (MTX)와 연계해서 본 발명의 CD20 항체로 치료한다. MTX 투여량의 한 예는 1주에 약 7.5 내지 25 mg/kg이다. MTX는 경구 및 피하 투여할 수 있다.
강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 치료하기 위해서는, 환자를, 예를 들어 Remicade® (인플릭시마브; 공급처: Centocor Inc., of Malvern, Pa.), ENBREL (에타네르셉트; 공급처: Immunex, WA)와 연계해서, 본 발명의 CD20 결합성 항체로 치료할 수 있다.
SLE에 대한 치료에는 고 용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)가 포함된다.
건선을 치료하기 위해서는, 환자에게 CD20 결합성 항체를, 국소 치료, 예를 들어 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐과 연계하거나 또는 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 요법과 함께 투여할 수 있다. 한 양태에서는, 건선 환자를 시클로스포린과 순차적으로 또는 동 시에 CD20 결합성 항체로 치료한다.
제약 제형
본 발명에 따라서 사용된 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
항-CD20 항체 제형의 예는 본원에 참고도 도입된 W0 98/56418에 기재되어 있 다. 또 다른 제형은 2 내지 8℃ 하의 저장시 최소 2년의 저장 수명을 갖는, 항-CD20 항체 40 mg/ml, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9% 벤질 알코올, 0.02% 폴리솔베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 반복투여용 액상 제형이다. 관심있는 또 다른 항-CD20 제형은 9.0 mg/ml 염화나트륨 중의 10 mg/ml 항체, 7.35 mg/ml 나트륨 시트레이트 이수화물, 0.7 mg/ml 폴리솔베이트 80, 및 멸균성 주사용 수 (pH 6.5)를 포함한다. 또 다른 수성 제약 제형은 10 내지 30 mM 나트륨 아세테이트 (약 pH 4.8 내지 약 pH 5.5, 바람직하게는 pH 5.5), 약 0.01 내지 0.1% v/v 양의 계면활성제로서의 폴리솔베이트, 약 2 내지 10% w/v 양의 트레할로스, 및 방부제로서의 벤질 알코올 [참고: 미국 특허 제6,171,586호]을 포함한다. 피하 투여용으로 적응시킨 동결건조된 제형은 W0 97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제를 사용하여 고 단백질 농도가 되도록 재구성할 수 있고, 이와 같이 재구성된 제형은 본원에서 치료하고자 하는 포유류에게 피하 투여할 수 있다.
인간화 2H7 변이체에 대한 한 가지 제형은 10 mM 히스티딘, 6% 슈크로스, 0.02% 폴리솔베이트 20 (pH 5.8) 중의 12 내지 14 mg/ml의 항체를 포함한다. 구체적 양태에서, 2H7 변이체, 특히 2H7.v16를 lO mM 히스티딘 설페이트, 60 mg/ml 슈크로스, 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 20, 및 멸균성 주사용 수 (pH 5.8) 중의 항체 20 mg/ml로 제형화한다.
본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세 포독성제, 화학요법제, 사이토킨 또는 면역억제제 (예를 들어, T 세포 상에서 작용하는 작용제, 예를 들면, 시클로스포린, 또는 T 세포와 결합하는 항체, 예를 들면, LFA-1과 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용하거나, 또는 전술된 이용 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 길항제를 함유하는 고형 친수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테애트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리 콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
제조품 및 키트
본 발명의 또 다른 양태는 전술된 장애, 예를 들어 자가면역 질환 또는 암 (예: CLL)을 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 본 발명의 제조품은 1개 이상의 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 적어도 1개의 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 2개의 치료 조성물이 제조품에 제공될 수 있다. 제1 조성물 중의 한 가지 이상의 활성제는 본 발명의 Fc 변이체 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 특정한 질환을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시해준다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지시사항을 추가로 포함할 것이다. 패키지 삽입물은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시사항을 지칭한다. 부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충액, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에 의해, FcRn 및 FcγRIII에 대한 결합 친화성이 천연 서열/야생형 서열 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 더 높은 폴리펩티드, 특히 항체를 수득할 수 있다.
본 실험 실시예는 단지 예시적이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
실시예 1
인간 FcRn 에 대한 최적화된 pH -의존적 결합을 나타내는 단일-부위 돌연변이체를 선별하기 위한 인간 IgG1 - Fc 의 파지 디스플레이
파지 디스플레이하기 위해, 본 발명자들은 힌지 영역의 디설파이드를 제거시켰고 (C226이 결실되고 C229가 Ser으로 대체됨) C-말단을 파지미드 구조물 (pW0437) 내의 M13 gIII 단백질 (g3p)의 C-말단 영역에 융합시킨, 인간 IgGl Fc의 "힌지없는" 변이체를 사용하였다. 단백질 서열 (서열 38)이 도 7에 도시되었다. 본 발명자들은 파지-선별 표적으로서, 바이오티닐화시키고 pH 6.0 완충액 중에서 뉴트라비딘-피복된 면역흡착 (Maxisorp™) 판 상에 포획시킨 huFcRn를 사용하였고, 이를 pH 6.0 완충액으로 광범위하게 세척하여 저 친화도 변이체를 제거하였으며, 보다 고 친화도의 pH 민감성 변이체를 pH 7.4 완충액으로 용출시켰다. 선별 제3 회전에 의해, N434W이 우성 클론이었는데 (서열 분석된 48개 클론 중의 44개가 상기 변이체에 상응한다), N434Y (3/48)와 N434F (1/48) 또한 존재하였다.
Fc에 대한 돌연변이 횟수를 최소화시키고, 이로써 치료적 항체 내에서의 면역원성의 위험을 최소화하기 위해, 단지 단일의 아미노산 치환만이 파지 디스플레이 라이브러리에 포함되었다. 파지 디스플레이에 의해 선별하기 위해 항체 단편의 무작위화 라이브러리를 창출시키기 위한 가장 통상적인 방법은 다중 잔기를 동시에 돌연변이시키는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발, 및 변이성 (error prone) PCR 또는 유사한 방법을 통한 무작위 돌연변이 유발 [참고: Clackson and Lowman (eds.) in Phage Display : A Practical Approach, Oxford University Press (2004)]이지만, 이들 방법은 일반적으로 분자당 다중의 돌연변이를 유발시키는데, 이러한 돌연변이는 목적하는 분자 특성을 달성하는데 필요한 최소 수의 돌연변이를 결정하기 위해 반드시 풀어야만 한다. 대안으로서, 본 발명자들은 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발에 의해, (FcRn이 IgG와 결합되는 경우의 구조 내에서) 10Å의 FcRn 내에 각 잔기를 개별적으로 (랫트 FcRn 구조에 대한 상동성에 의함 [참고: Burnmeister, 1997]) 체계적으로 돌연변이시킴으로써 무작위화 라이브러리를 작제하였다. 따라서, 각각 특정한 아미노산 위치 (표 1)에 20개의 변이체로 이루어진 43개 "미니-라이브러리"는 FcRn에 대한 증강된 pH-의존적 결합성을 지닌 단일 부위 Fc 변이체를 선별하는데 사용된 8600개 변이체의 완전한 라이브러리를 포 함하고 있다.
Figure 112008054666762-PAT00026
보다 높은 친화도로 인간 FcRn과 결합하는 Fc 변이체를 선별하기 위한 기존의 시도들은 성공적이지 못하였다 [참고: Dall'Acqua 2002; US2003/0190311]. 이들 연구에서는 huFcRn을 맥시소르프 (Maxisorp) 판 상에 직접적으로 피복시켰다. 본 발명자들은 huFcRn이 피복 조건에 대해 극히 민감하므로, Fc와 결합할 수 있는 능력을 보유하기 위해서는 이를 바이오티닐화하고 뉴트라비딘 피복된 맥시소르프 판 상에 포획시켜야만 한다는 것을 밝혀내었다.
맥시소르프 판을 4℃ 하에 밤새 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 2 ㎍/ml 뉴트라비딘으로 피복시킨 다음, 검정 희석액 (PBS + 0.5 % BSA, pH 6.0)으로 차단시켰다. 50 ㎕ huFcRn (약 0.2 mg/mL)을, 이를 신선하게 제조된 lO ㎕의 10 mM 바이오틴-LC-NHS (공급처: Pierce)와 실온에서 30분 동안 혼합함으로써 바이오티닐화하였다. 10 ㎕ 1M 트리스를 부가함으로써, 반응되지 않은 바이오틴-LC-NHS를 불활성화시켰다. huFcRn-바이오틴을 PBS pH 6.0 평형된 PD-10 칼럼 (공급처: Amersham-Pharmacia) 상에서 겔 여과함으로써 과량의 바이오틴-트리스로부터 정제하였다. 2 mL를 수집하였다 (huFcRn-바이오틴, 5 ㎍/mL). huFcRn-바이오틴을 피복된 8 뉴트라비딘에 포획시키고, 웰을 1시간 동안 차단시켰다 (웰당 110 ㎕). 파지를 부가하기 전에, 상기 판을 검정 희석액으로 신속하게 3회 세정하였다.
고밀도 밤새 성장물로부터의 파지 입자를 2.5M NaCl/20% PEG로 침전시킴으로써 수거하고, 이를 전형적으로 1013개 파지/mL의 농도로 검정 희석액에 재현탁시켰다. 이어서, 파지를 검정 희석액에서 1:10으로 희석시키고, 대략 1시간 동안 huFcRn-바이오핀 피복된 웰 (또는 음성 대조군으로서의 피복되지 않은 웰)과 결합할 수 있게 하였다 (100 ㎕/웰). 판을 PBS + 0.05% 트윈 (Tween), pH 6.0으로 세척하였다. 세척은 각 선별 회전에 대한 엄격도를 증가시키면서 수행하였다 [제1 회전: 10회 신속 세척; 제2 회전: 20회 신속 세척; 제3 회전: 40회 신속 세척; 제4 회전: 16회 신속 세척 및 15초의 20회 세척; 제5 회전: 4회 신속 세척 및 1회 3분 세척, 5회 반복 (총 20회 세척)]. 나머지 결합된 파지를 110 ㎕ PBS pH 7.4로 융출시키고, 이를 10 mL 대수증식기 이. 콜라이 (XLl-Blue; Stratagene, Inc.) 증식용 배양물에 가하였다.
실시예 2
가용성 Fc 변이체 단백질의 성상 확인
이들 돌연변이를 수반한 가용성 Fc 변이체를 발현하고, 정제한 다음, 인간, 시노몰구스 원숭이, 랫트 및 마우스 FcRn에 대한 그들의 친화도를 알아보기 위해 BIA코어 결합 검정으로 검정하였다. 이러한 Fc 변이체를 대상으로 하여, 크기 배제 크로마토그래피함으로써 분석하여 그들의 응집 경향을 결정하였다.
변이체 Fc 단편은, 34B8 이. 콜라이 세포를 돌연변이체 pW0437 파지미드로 형질전환시키고, 인산염-무함유 배지 중에서 30℃ 하에 24시간 동안 성장시켜 Fc 유전자의 발현을 유도시킨 다음, 세포를 수거함으로써 발현시켰다. 세포 페이스트를 밤새 동결시키고, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA 중에서의 삼투압 쇽에 의해 용해시켰다. 용해물을 원심분리시켜 청소시키고, 이를 단백질 A 칼럼에 적용하였다. 이 칼럼을 PBS로 세척하고, 가용성 Fc를 단백질 A 시트레이트 용출 완충액 (0.1 M 시트레이트, pH 3.0)로 용출시킨 다음, 트리스 pH 7.5로 중화시켰다. 가용성 Fc를 아미콘 센트리프렙 (Amicon Centriprep)에서 농축시켰다.
인간, 시노몰구스 원숭이, 랫트 또는 마우스로부터의 FcRn를 다양한 밀도 (100 내지 3000 RU)로 비아코어 (Biacore) CM5 칩 상에서 NHS 화학에 의해 고정화시켰다. Fc 변이체를 PBS pH 6.0 중에서 10 μM 내지 1 nM로 일련으로 희석시키고, 시간 경과에 따라 결합성을 모니터링하였다. 모 힌지없는 Fc (즉, 야생형)의 경우에는, huFcRn에 대한 평형 결합이 거의 즉시 도달하였는데, 이는 극히 신속한 작동 속도와 이탈 속도를 지니고 있고, 평형 분석에 의해 결정된 바와 같이 Kd 추정치가 700 nM이라는 것을 시사한다 (도 8). N434W 변이체에 대해서는, 작동 속도가 인지할 만한 수준으로 더 느리고, 이탈 속도는 극도로 느렸다. N434W를 보다 느린 유속으로 장기간 동안 주사함으로써, 평형 분석이 가능하였고, Kd가 대략 4 nM이었다. 변이체 N434W, N434F, N434A, 및 삼중 돌연변이체 N434A+E380A+T307A는 pH 6.0에서 야생형 Fc에 비해 각각 약 170배, 약 9배, 약 2.7배 및 약 14배 정도의 명백한 친화도 증가를 나타내었다. 이와는 달리, pH 7.4에서는 huFcRn에 대한 N434 변이체의 친화도가 효과적으로 너무 낮아서 본 검정에서 측정할 수가 없었다. 야생형에 비해 N434W가 개선된 것은 시노 FcRn에 대한 결합의 경우에는 유의적이지 않았는데, 이는 랫트 FcRn에 대한 결합의 경우에는 단지 약 10배 증가하였고 뮤린 FcRn에 대한 결합에 대해서는 사실상 WT와 동일하다는 것을 보여준다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 상기 돌연변이에 의해 달성된 개선은 인간 FcRn에 대해서만 특이적이다.
응집된 Fc는 원자가 효과로부터 FcRn에 대한 보다 높은 친화도를 지니는 것으로 여겨질 수 있다. 본 발명자들은 Fc 변이체 (WT, N434W, N434Y, N434F, N434A, 및 N434A+E380A+T307A)를 정량적 크기 배제 크로마토그래피함으로써 분석하였다. 모든 변이체는 상당한 이량체성, 사량체성 및 팔량체성 형태 집단을 지닌 N434W를 제외하고는 90% 이상이 단량체성인 것으로 여겨졌다. 단량체성 N434W 변이체는 S-200 칼럼 상에서 분취 크기 배제 크로마토그래피함으로써 올리고머성 형태로부터 정제하였다. 이와 같이 정제된 단량체성 물질은 SPR 결합 검정에서 huFcRn에 대한 고 친화도를 유지하였는데, 이는 N434W에 대해 관찰된 친화도 상의 증가는 실제로 huFcRn에 대한 그의 고유 친화도 상의 변화에 기인하고, 응집 인공물이 아니라는 것을 시사한다. 사실상 정제된 올리고머성 N434W는 FcRn에 대한 저하된 친화도를 나타내었다 (도 8).
실시예 3
FcRn 돌연변이를 수반한 인간화 항- CD20 IgGl 변이체의 성상 확인
인간 Fc의 파지 디스플레이에 의해 확인된 돌연변이물을 대상으로 하여, 천연 항체 2H7.vl38의 배경에 있어서의 그들의 효과에 대해 또한 시험하였다. 2H7.vl38은 다음 돌연변이를 통하여 ADCC 및 CDC 활성을 증가시키기 위해 Fc를 변형시킨 인간화 항-CD20 항체이다: S298A, K326A, E333A, K334A. 위치 N434에서의 돌연변이를 이러한 배경 내로 도입하고, 앞서 기재된 바와 같이 293 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 IgG (표 2)를 제조하였다. 각 경우에 있어, 정제된 IgG 변이체는 상기 언급된 바와 같이 크기-배제 크로마토그래피함으로써 저 수준의 단백질 응집을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112008054666762-PAT00027
2H7.vl38의 인간 IgGl 변이체를 대상으로 하여, 바이오티닐화 FcRn를 이용하여 ELISA에서 인간 FcRn에 대한 pH-의존적 결합에 대해 분석하였다. 맥시소르프 96-웰 마이크로웰 판 (공급처: Nunc, Roskilde, Denmark)을 4℃ 하에 밤새, 50 mM 탄산염 완충액, pH 9.6 중에서 100 ㎕/웰로 2 ㎍/ml 뉴트라비딘 (공급처: Pierce, Rockford, IL)으로 피복시켰다. 판을, 0.05% 폴리솔베이트 (세척 완충액), pH 7.4를 함유하는 PBS로 세척하고, 0.5% BSA, pH 7.4를 함유하는 PBS로 150 ㎕/웰로 차단시켰다. 실온 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액, pH 7.4로 세척하였다. 바이오틴-X-NHS (공급처: Research Organics, Cleveland, OH)를 사용하여 인간 FcRn를 바이오티닐화하였다. 바이오티닐화된 FcRn을, 0.5% BSA, 0.05% 폴리솔베이트 20 (샘플 완충액), pH 7.4를 함유하는 PBS에서 2 ㎍/ml, 100 ㎕/웰로 판에 가하였다. 이 판을 1시간 동안 항온 배양하고, 세척 완충액, pH 6.0으로 세척하였다. 샘플 완충액, pH 6.0 중의 7개의 2배 일련 희석의 IgG 항체 (3.1 내지 200 ng/ml)를 상기 판에 가하였다. 2시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액 pH 6.0으로 세척하였다. 퍼옥시다제 표지된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG F(ab')2 (공급처: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)을 샘플 완충액, pH 6.0 중에서 100 ㎕/웰로 부가함으로써, 결합된 IgG를 탐지하였다. 1시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액, pH 6.0으로 세척하고, 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) (공급처: Kirkegaard & Perry Laboratories)를 100 ㎕/웰로 가하였다. 1M 인산을 100 ㎕/웰로 가함으로써 상기 반응을 중지시켰다. 멀티스캔 어센트 (multiskan Ascent) 판독기 (공급처: Thermo Labsystems, Helsinki, Finland) 상에서 450 nm 하의 흡광도를 판독하였다. 표준 곡선의 중간점 (중간-OD)에서의 흡광도를 계산하였다. 이러한 중간-OD에서의 표준물 및 샘플의 상응하는 농도는, 4개-파라미터 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (공급처: KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)을 이용하여 적정 곡선으로부터 결정하였다. 표준물의 중간-OD 농도를 샘플의 중간-OD 농도로 나눔으로써, 상대 활성을 계산하였다.
pH 6.0 또는 pH 7.4에서 FcRn으로부터 결합된 IgG의 해리를 평가하기 위해, 샘플 항온 배양 단계 후 및 판을 세척할 때, pH 6.0 또는 pH 7.4 하의 샘플 완충액을 100 ㎕/웰로 부가하는 것을 제외하고는, 상기 검정을 유사하게 수행하였다. 판을 45분 동안 항온 배양하고 세척하였다. 이어서, 검정을 상기 언급된 바와 같이 지속하였다.
그 결과 (도 9)는 Fc 변이체에 대한 관찰된 바와 유사한 상대적 결합 친화도를 나타내었다. pH 6.0에서는 상대적 결합 친화도가 다음과 같다: v477 > v478 = v479 > v364 > vl38. pH 7.4에서는 상대적 결합 친화도가 pH 6.0에서 보다는 일관되게 약하였는데, 동일한 상대적 결합을 나타내었다: v477 > v478 = v479 > v364 > vl38.
이들 Fc 돌연변이는 인간 IgG 항체에 광범위하게 적용 가능하다.
실시예 4
약동학에 대한 FcRn 결합 효과에 관한 생체내 연구
생체 내에서 이들 Fc 변이체 항체의 약동학에 대한 개선된 FcRn 결합 효과를 결정하기 위해, 시노몰구스 (Macaca fascicularis) 원숭이 또는 기타 영장류 종에게 각 항체 변이체를 정맥내 주사하고, 시간이 지남에 따라 혈액 샘플을 수집하여 상기 항체의 청소 (제거)를 모니터링하였다. 몇 마리 동물에게는 1회 이상 용량 수준으로 주사하였다. 한 가지 실험에서는, 1 내지 20 mg/kg의 단일 정맥내 용량을 1일 째에 시간 0에 주사하였다. 투여하기에 앞서, 및 투여 후 6시간, 24시간 및 72시간 째에 각 동물로부터 혈액 (혈청) 샘플을 수집하였다. 8일, 10일, 30일 및 60일 째에 부가의 샘플을 수집하였다. ELISA를 사용하여 혈청 샘플 중의 항체 농도를 결정하였다. 표준 약리학 기술을 사용하여, 혈청 중의 항체 농도가 시간 의존적으로 감소되는 것을 모델링하였다 [참고: Shargel and Yu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999)]. 2-구획 모델을 사용하여 조직에 대한 항체의 초기 분포도 (알파 상)를 고려한 다음, 종말 또는 제거 상 (베타 상)을 고려하였다. 이와 같이 계산된 제거 반감기 (t1 /2 β)는 FcRn이 순환시 IgG를 유지하는 기능을 하기 때문에 개선된 FcRn 결합 효과를 나타내었다.
이러한 연구의 한 예에서는, FcRn에 대한 상이한 결합 친화도를 나타내는 3가지 인간화 모노클로날 항-BR3 항체 (PRO145234, PRO145181, 및 PRO145182)의 약동학을 시노몰구스 원숭이에서 비교하였다. BR3 (BAFF-R로서 공지되기도 함)은 B 세포 표면 상에 발현된 184-잔기 유형 III 막관통 단백질이다 [참고: Thompson, J. S., et al., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et al., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552]. PRO145234는 야생형 항-BR3 항체인 반면, PRO145181 및 PRO145182는 각각, 인간 및 시노 FcRn에 대한 결합 친화도가 증가된 N434A 및 N434W 변이체이다.
17마리 숫컷과 17마리 암컷 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)를 SNBL USA 스톡으로부터 수득하였다. 이들 원숭이를 대상으로 하여 연구를 시작하여 신체 검사할 시점 (예를 들어, 새환경 순응 초기 시점)의 연령은 45세이고 체중은 24 kg였다. 건강해 보이고 명백한 이상을 전혀 나타내지 않는 동물 만을 본 연구에 참여시켰다. 30마리 동물을 체중 별로 무작위로 추출하여 3개 그룹 중의 1개 그룹으로 분류하였다. 그룹 1, 2 및 3 동물에게는 20 mg/kg 단일 정맥내 용량의 PRO145234 (야생형), PRO145181 (N434A), 또는 PRO145182 (N434W)를 각각 투여하였다. 연구 계획은 표 11에 요약되었다.
[표 11]
Figure 112008054666762-PAT00028
a총 용량 용적 (ml)은 가장 최근의 체중을 기준으로 하여 계산하였다. 용량 용적은 0.1 ml에 가장 가깝게 외삽하였다.
다음 시점에 각 동물의 말초 정맥으로부터 약동학적 분석을 위한 혈액 대략 1.0 ml를 수집하였다:
· 투여전
· 연구 1일째 투여 후 30분 및 6시간
· 연구 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 106, 113, 120, 127, 및 134일째에 1회 투여.
다음 시점에 각 동물의 말초 정맥으로부터 항-치료적 항체 분석을 위한 혈액 대략 1.0 ml를 수집하였다:
· 투여전
· 연구 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127 및 134째에 1회 투여.
약동학적 (PK) 및 항-치료적 항체 (ATA) 분석을 위한 혈액 샘플을 혈청 분리기 튜브 내로 수집하고, 대략 30 내지 80분 동안 실온 하에 응고시켰다. 원심분리 (실온에서 15분 동안 2000 xg)함으로써 혈청 (대략 0.5 mL)을 수득하였다. 혈청 샘플을 예비표지된 1.5-mL 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브에 옮기고, 드라이 아이스로 포장할 때까지 -60 내지 -80℃를 유지하기 위해 동결기 세트에서 저장하고, PRO145234, PRO145181, 및 PRO145182 농도 결정을 위해 밤새 제넨테크 (Genentech)로 발송하였다.
각 혈청 샘플 중의 PRO145234, PRO145181, 또는 PRO145182 농도는 ELISA 검정을 이용하여 결정하였다. 혈청 중의 검정 정량화 하한치 (LLOQ)는 0.05 ㎍/mL였다. 이러한 하한치 아래 값은 보고 가치가 덜한 (LTR) 것으로 기록하였다. 각 샘플 중의 항-치료적 항체는 브릿징 ECLA 검정을 이용하여 결정하였다.
상기 스케쥴로부터 최소 편차를 수반한 공칭 용량과 샘플 수집 시간을 데이터 분석에 사용하였다. 숫컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에서 혈청 PRO145234, PRO145181, 및 PRO145182 농도의 평균 및 SD는 엑셀 (Excel) (버젼 2000, Microsoft Corporation, Redmond, WA)을 이용하여 계산하였고, 시그마플롯 (SigmaPlot) (버젼 9.0; Systat Software, Inc., Point Richmond, CA)을 사용하여 플롯하였다. 보고 가치가 덜한 혈청 농도는 모든 데이터 분석으로부터 배제시켰다. n이 ≤2인 경우에는 SD를 계산하지 않았다. 그 결과를 3개의 유효 숫자로 제시하였다.
1 오버 y 햇 (1 over y hat) 칭량 도식 (WinNonlin Version 3.2; Pharsight Corporation; Mountain View, CA)을 이용한 가우스-뉴톤 (Gauss-Newton) (Levenberg and Hartley) 2-구획 모델을 사용하여, 각 동물로부터 PK 파라미터를 평가하였다. 그룹 1 (야생형; PRO145234)에서 10마리 시노스 중의 8마리와, 그룹 3 (N434W; PRO145182)에서 10마리 시노스 중의 5마리에게서 57일 째에 ATA's가 발생하였다. 일반적으로, 특정 시점에 ATA's가 탐지된다는 것은 이러한 시간 동안 또는 후에 혈청 농도가 급격히 떨어지는 것과 상관이 있어, 종말 반감기가 보다 단축되고 약물 노출이 저하된다. PK에 대한 ATA 반응 효과 크기를 이해하기 위해, 2가지 방법을 사용하여 각 그룹에 대한 평균 PK 파라미터를 계산하였다. 방법 1에서는, 각 그룹에서 10마리 시노스 모두로부터의 데이터를 사용하여 PK 파라미터 (평균 ± 표준 편차)를 계산하였다. 방법 2에서는, 57일 째까지 항-치료적 항체가 전혀 발생하지 않은 시노스 (그룹 1의 경우에는 n=2, 그룹 2의 경우에는 n=10, 그룹 3의 경우에는 n=5)로부터 만의 데이터를 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다. 그룹 1 및 3의 경우에는 방법 1을 사용하면 방법 2를 사용한 경우와 비교해서, 종말 반감기 (t1 /2,β)와 노출 (AUC; 전반적인 약물 노출 측정치) 추정치가 더 낮아졌다. 그러나 두 방법을 사용한 경우의 전반적인 결과는 유사하였다. 따라서, 본원에 보고된 평균 PK 파라미터는 방법 1 (예를 들어, 모든 시노스로부터의 데이터를 포함함)을 사용하여 계산하였다.
결과
20 mg/kg의 PRO145234 (야생형 항체), PRO145181 (N434A 변이체) 및 PRO145182 (N434W 변이체)를 단일 정맥내 거환 투여한 후, 혈청 농도는 이상 (biphasic) 성향을 나타내었는데, 급격한 초기 분포 상에 이어 보다 느린 제거 상을 나타내었다 (도 12). 각 그룹에 대해 추정된 PK 파라미터가 표 12에 제시되었고, 이에는 각 그룹 내의 10마리 모든 시노스로부터의 데이터가 포함되었다. PRO145234 (야생형 항체)의 종말 반감기 (평균 ± SD)는 6.15 ± 2.01일이었고, 10마리 시노스에게서 4.24 내지 11.0일의 범위였다. 57일 째까지 ATA's가 발생하지 않은 2마리 시노스에게서 PRO145234의 평균 종말 반감기 (t1 /2,β)는 8.95일이었다. PRO145181 (N434A 변이체)의 경우에는, 평균 종말 반감기가 14.1 ± 1.55일인데, 이는 PRO145234보다 1.6 내지 2.3배 더 크다 (p<0.05). PRO145182 (N434W 변이체)의 경우에는, 10마리 시노스에게서의 평균 ± SD 종말 반감기가 9.55 ± 2.49일이었다. 이러한 수치는 10마리 시노스에게서 PROl45234 (야생형 항체)의 전반적인 평균 t1 /2,β보다 상당히 더 컸지만 (p<0.05), 탐지 가능한 ATA's가 발생하지 않은 2마리 시노스에게서 PRO145234의 평균 t1 /2,β (8.95일)과 극히 유사하였다. 이와 같이 관찰된 PRO145234 (야생형 항체)와 PRO145182 (N434W 변이체) 간의 t1 /2,β 상의 차이는 이들 두 그룹 내에서의 ATA 반응에 의해 혼란을 겪는 것으로 예상되었다.
PRO145234 (야생형 항체)의 무한히 외삽된 농도-시간 곡선 하의 면역 (AUC)은 2440 ± 398일*㎍/mL이었고, 10마리 시노스에 대해 1740 내지 3140일*㎍/mL의 범위였다. 57일 째까지 ATA's가 발생하지 않은 2마리 시노스에게서 PRO145234의 평균 AUC는 2850일*㎍/mL였다. PRO145181 (N434A 변이체)의 경우에는, 평균 AUC가 4450 ± 685일*㎍/mL인데, 이는 PRO145234 (야생형 항체)보다 1.6 내지 1.8배 더 크다 (p<0.05). PRO145234 (야생형 항체)의 AUC와 PRO145182 (N434W 변이체)의 AUC 간에는 차이가 없었다.
[표 12]
Figure 112008054666762-PAT00029
*PRO145234 및 PRO145182 그룹에서 10마리 시노스 중의 8마리 및 10마리 시노스 중의 5마리에게서 항-약물 항체가 존재하는 것은 PRO145234 및 PRO145182의 PK 파라미터를 혼란스럽게할 수 있다 (예를 들어, AUC가 감소되고 t1 /2,β가 단축된다)
**PROl45234과 상이함 (p<0.05).
요약하면, 시노몰로구스 원숭이에게 20 mg/kg을 단일 정맥내 투여한 후에 PRO1451234, PRO145181, 및 PRO145182의 약동학을 조사하였다. 10마리 시노스 중의 8마리에서 56일 째까지 PRO145234에 대한 항-치료적 항체 (ATA's)가 발생한 반면, 10마리 시노스 중의 5마리에서 56일 째까지 PRO145182에 대한 ATA's가 발생하였다. 56일 째까지 PRO145181에 대한 ATA's가 발생한 시노스는 전혀 없었다. PRO145181 (N343A 변이체)는 PRO145234 (야생형 항체)와 비교해서 증가된 종말 반감기와 증가된 AUC를 나타내었다 (p<0.05). PRO145182는 PRO145234와 비교해서 약간 증가된 종말 반감기를 나타내었지만, 이와 같이 관찰된 차이는 PRO145234와 PRO145182 둘 다에 대한 항-치료적 항체에 의해 혼란을 겪는 것으로 예상되었다.
실시예 5
Fc γ RIII 에 대한 증강된 결합을 나타내는 인간 IgGl 변이체
활성화 Fcγ 수용체에 대한 증강된 IgG 결합과 억제성 Fcγ 수용체에 대한 저하된 IgG 결합을 통하여 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 개선시키기 위한 돌연변이는 기존에 보고되었다 [참고: Shields et al., J. Biol . Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem . Soc . Trans. 30:487-490 (2002)]. 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유지 또는 증가시키면서 ADCC 활성을 증가시키는 돌연변이가 특히 관심이 있는데, 이는 양 기전이 생체 내에서 CD20-양성 세포를 용해시키는데 있어 중요할 수 있기 때문이다. 특히, 3가지 Ala 돌연변이를 병용하는 것이 개선된 Clq 결합을 통하여 CDC 활성을 개선시키고 [참고: Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)], FcγRIII 결합 상의 개선과 FcγRII 결합 상의 저하를 통하여 ADCC 활성을 개선시키는 것으로 기존에 확인되었다: S298A+E333A+K334A [참고: Shields et al., 2001]. 이들 돌연변이는 ADCC 활성과 CDC 활성을 증강시키는 추가의 치환인 K326A와 함께, 2H7.vl38로서 공지된 인간화 항-CD20 항체 변이체 내로 도입하였다 (표 3).
본 실시예에서 본 발명자들은 위치 298, 333, 및 334에서의 부가의 아미노산 치환을 기술하였다. 각 치환은 2H7.v16의 배경 하에 만들어졌고, 이를 인간 FcγRIII의 고 친화성 또는 저 친화성 이소형에 대한 상대적 결합을 알아보기 위해 ELISA에서 v16과 비교하였다 (도 11). 그 결과는 이들 위치에서의 몇 가지 치환, 예를 들어 S298T, S298L, E333L, 및 K334G가 널리 관용되고, FcγRIII에 대한 결합 친화성에 대한 효과가 거의 없다는 것을 나타내었다 (표 1). 기타 치환, 예를 들어 S298G, E333G, 및 K334R은 결합에 불리하였는데, 이는 이들 측쇄와 상기 수용체 간의 바람직하지 못한 상호 작용 때문이거나 또는 Fc 구조에 대한 탈안정화 효과 때문이다. 하나의 돌연변이 K334L은 FcγRIII에 대한 결합 친화성이 3배 이상 증가된 것으로 확인되었다.
이들 결과는 Ala 치환을 이용한 경우에 효과를 나타내는 Fc 내의 선별된 위치에서 Ala 이외의 치환이 Fcγ 수용체에 대한 결합성을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 특히 K334L는 FcγRIII에 대한 결합성을 개선시키고, 기타 Fc 돌연변이, 예를 들어 2H7.vl38에서와 같은 돌연변이와 병용해서 결합성을 추가로 개선시킬 수 있다. 이러한 항체 변이체는 개선된 ADCC 활성을 지니고 있고, 생체 내에서 표적 세포를 고갈시키는데 있어 더 효능이 있는 것으로 예상된다.
Figure 112008054666762-PAT00030
실시예 6
히스티딘 돌연변이체
본 실시예에서는, 랫트 FcRn [참고: Burnmeister, 1997]와의 복합체 중의 랫트 IgG의 공개된 구조로부터 추론된 바와 같은 Fc와 FcRn 간의 계면 내의 잔기를 히스티딘-스캐닝 (His-스캔)함으로써 점 돌연변이를 연구 조사하였다. 이러한 이유는 His의 측쇄가 pH 6과 7 사이에서 종종 적정 가능하기 때문에 His의 치환이 FcRn에 대한 IgG의 결합에 관한 pH-의존성 효과에 유리할 수 있었기 때문이다. 양성자화 형태가 FcRn 결합에 유리하긴 하지만, 양성자화되지 않은 형태는 유리하지 않은, Fc 내의 특정 부위에서의 His 치환은 생체 내에서 분자의 반감기를 증강시키는데 있어 요망되는 특징들을 산출해야만 한다.
본 발명자들은 전장의 항체 (헤르셉틴®) 맥락에서 기존에 보고된 점 돌연변이체에 관하여 추가로 성상 확인하였고, 점 돌연변이의 조합물을 포함한 몇 가지 새로운 변이체의 특징들을 연구 조사하였다.
트라스투주마브 FcRn 변이체의 작제
앞서의 실시예들은 FcRn에 대한 결합성을 개선시키는 Fc 내의 몇몇 돌연변이에 관해 기재하였고, Fc 단편으로서, 또는 천연 항체 2H7.vl38의 배경에 관해 연구하였다. 전장의 인간 IgGl에 대한 이들 돌연변이 효과 (단, 기타 Fc 변화는 존재하지 않는다)를 연구하기 위해, 앞서 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 부위-지시된 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이 N434W, N434Y, N434F, 및 N434A를 rhuMab 4D5 (트라스투주마브, 헤르셉틴®)의 배경 내로 도입하였다. 4개의 방향족 아미노산 중의 3개가 Fc-파지 점-돌연변이 라이브러리를 이용하여 위치 N434에서 치환되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자들은 일반적으로 방향족 치환이 FcRn (저-pH, 및 가능한 고-pH) 결합성을 증강시킨다고 결론지었다. 따라서, 부가의 돌연변이인 N434H를 또한 작제하였다. 이들 헤르셉틴의 5개 변이체를, 단백질 A 친화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피함으로써 대규모의 일시적 CHO 세포 배양물로부터 정제하여 응집물을 제거하였다.
부가적으로, 돌연변이 E380A, E380A + T307A, +/- N434A, 및 +/- N434H을 헤르셉틴 상에 작제하였다. 항체를 293 세포에서 발현하고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, FcRn에 대한 결합성을 알아보기 위해 검정하였다.
FcRn 결합에 있어 중요한 부가의 잔기를 확인하고, 결합을 개선시킬 수 있는 돌연변이를 확인하기 위해, 히스티딘 스캐닝 접근법을 사용하였다. 이들 실험은 (랫트 FcRn 구조에 대한 상동성에 의해) [참고: Burnmeister, 1997] Fc와 FcRn 간의 계면 상의 잔기를 히스티딘으로 치환하였다. 이들 돌연변이를 수반한 항체를 293 세포에서 발현시키고, 상기 언급된 바와 같이 정제한 다음 결합성을 알아보기 위해 검정하였다. FcRn에 대한 개선된 결합성을 제공해 주는 히스티딘 스캐닝 돌연변이를 N434에서의 돌연변이와 병용하여 부가의 변이체 세트를 제공하였다.
FcRn ELISA
가용성 FcRn을 기존에 보고된 바와 같이 제조하였다 [참고: Shields et. al., 2001]. 맥시소르프 96-웰 마이크로웰 판 (공급처: Nunc, Roskilde, Denmark)을 4℃ 하에 밤새, 50 mM 탄산염 완충액, pH 9.6 중에서 100 ㎕/웰로 2 ㎍/ml 뉴트라비딘 (공급처: Pierce, Rockford, IL)으로 피복시켰다. 판을, 0.05% 폴리솔베이트 (세척 완충액), pH 7.4를 함유하는 PBS으로 세척하고, 0.5% BSA, pH 7.4를 함유하는 PBS로 150 ㎕/웰로 차단시켰다. 실온 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액, pH 7.4로 세척하였다. 바이오틴-X-NHS (공급처: Research Organics, Cleveland, OH)를 사용하여 인간 FcRn를 바이오티닐화하였다. 바이오티닐화된 FcRn을, 0.5% BSA, 0.05% 폴리솔베이트 20 (샘플 완충액), pH 7.4를 함유하는 PBS에서 2 ㎍/ml, 100 ㎕/웰로 판에 가하였다. 이 판을 1시간 동안 항온 배양하고, 세척 완충액, pH 6.0으로 세척하였다. 검정 완충액, pH 6.0 중의 7개의 2배 일련 희석의 IgG 항체 (3.1 내지 200 ng/ml)를 상기 판에 가하였다. 헤르셉틴을 표준물로서 사용하였다. 2시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액 pH 6.0으로 세척하였다. pH 6.0 또는 pH 7.4 하의 검정 완충액을 100 ㎕/웰로 부가함으로써 해리 단계를 수행하였다. 판을 45분 동안 항온 배양하고, 세척 완충액, pH 6.0으로 세척하였다. 퍼옥시다제 표지된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG F(ab')2 (공급처: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)을 검정 완충액, pH 6.0 중에서 100 ㎕/웰로 부가함으로써, 결합된 IgG를 탐지하였다. 1시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척 완충액, pH 6.0으로 세척하고, 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) (공급처: Kirkegaard & Perry Laboratories)를 100 ㎕/웰로 가하였다. 1M 인산을 100 ㎕/웰로 가함으로써 상기 반응을 중지시켰다. 멀티스캔 어센트 판독기 (공급처: Thermo Labsystems, Helsinki, Finland) 상에서 450 nm 하의 흡광도를 판독하였다. pH 6.0에서 헤르셉틴 곡선의 중간점에서의 흡광도 (중간-OD)를 계산하였다. 이러한 중간-OD에서의 헤르셉틴 및 샘플의 상응하는 농도는, 4개-파라미터 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (공급처: KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)을 이용하여 적정 곡선으로부터 결정하였다. 표준물의 중간-OD 농도를 샘플의 중간-OD 농도로 나눔으로써, 상대 활성을 계산하였다.
BIA 코어 방법
BIA코어-3000 표면 플라즈몬 공명 시스템 (6,7)을 사용하여, 인간 및 시노몰구스 원숭이 FcRn에 대한 몇 가지 4D5 변이체 결합의 겉보기 연합 속도 (ka), 겉보기 해리 속도 (kd) 및 겉보기 (KD)를 측정하였다. 겉보기 평형 해리 상수에 의해 기재된 바와 같은, 항원에 대한 각 항체의 결합 친화도는 KD = kd/ka로서 계산할 뿐 만 아니라 (7) 평형 결합 실험에서 직접 측정하였다.
본질적으로 제조업자의 지시사항 (6,8)에 기재된 바와 같이, 인간 및 시노 FcRn을 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (cat. no. CM5, BIAcore, Inc.) 상으로 고정화시키기 위해 아민-커플링 방법을 사용하였다. 간략하게 언급하면, 상기 바이오센서 칩은 N-히드록시석신이미드 (NHS)와 혼합된 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)를 사용하여 활성화하였다. 이어서, 10 mM 나트륨 아세테이트 pH 4에서 예비-평형시킨 FcRn을 상기 활성화된 칩 상으로 주사하여 700 내지 900 반응 단위 (RU)의 시노 FcRn와 대략 2000 RU의 인간 FcRn의 고정화된 농축물을 수득하였다. 반응되지 않은 석신이미드기는 1M 에탄올아민을 주사하여 차단시켰다.
다음과 같이 역학 측정을 수행하였다. 3배 일련의 항체 희석물 (1 μM 내지 0.5 nM)을 25℃ 하에 0.02 ml/min의 유속을 이용하여 수행 완충액 (0.05% 트윈-20을 함유하는 인산염 완충 식염수, pH 6)에 2분 동안 주사하였다. 10 mM 트리스, pH 9, 150 mM NaCl을 0.01 ml 주사하여 재생을 달성하였다. 데이터는 각 결합 곡선에 대해 샘플 1:1 랑뮈르 (Langmuir) 결합 모델에 피팅하였다. 가성-1차 속도 상수 (ks)를 각 연합 곡선에 대해 계산하였고, 단백질 농도 함수로서 플롯하여 ka +/- s.e. (피트의 표준 오차)를 수득하였다. 평형 결합 측정을 pH 6과 pH 7.4 둘 다에서 수행하였다. 3배 일련의 항체 희석물 (1 μM 내지 0.5 nM)을 25℃ 하에 2 ㎕/min의 유속을 이용하여 수행 완충액 (0.05% 트윈-20을 함유하는 인산염 완충 식염수)에 6분 동안 주사하였다. 주사 후, 유속을 0.02 ml/min로 상승시켰다. 10 mM 트리스, pH 9, 150 mM NaCl을 0.01 ml 주사하여 재생을 달성하였다. 평형시 결합된 항체 양 (Req)을 항체 농도의 함수로서 플롯하고, KD를 결정하기 위해 4가지 파라미터 용량 반응 곡선에 피팅하였다.
ELISA 결과
pH 6.0 및 7.4에서 FcRn에 대한 결합성을 측정하였다. 상대 결합 친화도를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 계산하였고, 표 4에 나타내었다. 그 결과는 돌연변이 N434A, N434W, N434Y, N434F, 또는 N434H에 대해 개선된 pH 6 결합성을 나타내었다. N434W, N434Y, 및 N434F에 대해서는 pH 7.4에서 헤르셉틴과 비교하여 증가된 결합성이 또한 관찰되었다.
Figure 112008054666762-PAT00031
N434H 또는 N434A와의 조합 변이체 및 기존에 보고된 Ala 치환물 [참고: Shields et al, 2000]은 pH 6.0에서 개선된 결합을 나타내었지만, pH 7.4에서는 결합 상의 증가가 거의 또는 전혀 없었다 (표 5).
Figure 112008054666762-PAT00032
Fc 계면 영역을 His-스캔하여, FcRn 결합성이 증가되거나 저하된 몇 가지 His 치환물을 확인하였다 (표 6). 이들 변이체 중의 몇 가지는 pH-의존적 결합을 나타내었지만, pH 7.4에서는 FcRn과 탐지 가능한 상호 작용이 거의 또는 전혀 없었다. 이들 부가의 His 돌연변이물 단독으로는, N434H보다 더 많은 pH 6 결합성 증가를 전혀 나타내지 않았지만, 치환물 Q311H, D312H, N315H, 및 G385H 각각은 pH 6 결합성을 4배 초과 개선시켰지만, pH 7.4 결합성에 있어서는 상당한 (유의적인) 증가가 없었다.
Figure 112008054666762-PAT00033
최종적으로, 몇 가지 His-스캔 점 돌연변이물을 돌연변이물 N434A 또는 N434H와 쌍을 이루어 조합하였다. 이들 변이체 중에서, 이중 돌연변이체 T289H/N434H 및 N315H/N434H는 pH 6 결합성에 있어 가장 개선된 결합성을 나타내었지만, pH 7.4 결합성에 있어서는 가시적인 개선이 전혀 없었다.
Figure 112008054666762-PAT00034
BIA 코어 결과
ELISA FcRn 결합성에 근거하여 몇 가지 항체를 선별하였고, 이를 BIA코어 분석을 위해 3가지 군으로 나누었다. 세트 1은 주로 Asn434에서의 돌연변이체로 이루어졌고, 세트 2는 히스티딘 스캔 돌연변이체로 이루어진 반면, 세트 3은 기존에 공개된 돌연변이체 (3)로 이루어졌다. pH 6에서 세트 1로부터의 항체의 역학 및 평형 결합성 분석으로부터의 결과 (표 8)는 KD 상의 개선이 ka 및/또는 kd 상의 변화 결과라는 것을 제안하였다. 더우기, 인간 FcRn에 대한 결합성이 개선된 돌연변이체는 마찬가지로, 시노FcRn에 대한 결합성이 개선된 것으로 여겨진다. pH 6에서 가장 개선된 결합성을 나타내는 돌연변이체는 N434W, N434Y 및 N434F이다. 그러나, 이들 돌연변이체는 또한, pH 7.4에서도 상당히 개선된 결합성을 나타내었다. 이와는 달리, 헤르셉틴, N434A, N434H 및 T250Q/M428L 모두는 pH 7.4에서 결합성을 거의 내지 전혀 나타내지 않았다. N434W, N434Y 및 N434F의 pH 7.4 결합성은 야생형 Fc에 비해 인지할 만한 수준으로 증가되었지만, 연합 및 해리 속도는 평형 해리 상수가 정확하게 결정될 수 없을 정도로 너무 신속하였다는 것을 인지해야 한다. 따라서, pH 7.4에서의 결합성은 표 4에서 + 또는 -로서 표시되었다. 특히 - 는 헤르셉틴과 유사한 수준의 결합성을 의미하고, +/-는 무시할 만한 수준의 결합성을 의미하며, + 는 인지할 만한 수준의 결합성을 의미하고, ++ 는 상당한 결합성을 의미한다.
Figure 112008054666762-PAT00035
aKD는 역학 파라미터로부터 계산하였다.
bKD는 평형 결합성 실험으로부터 계산하였다.
c단백질은 293 세포에서 발현되었다.
역학 및 평형 결합성 분석에 의해 결정된 KD 간에는 약간이 차이가 있었다. 그러나, 이들 값 비교는 인간 FcRn에 대한 결합성에 관한 상관 계수 0.994와 시노FcRn에 대한 결합성에 관한 상관 계수 0.934를 나타내었는데, 이는 계통적 편차를 제안하였다.
세트 2로부터의 항체의 역학 및 평형 결합성을 분석한 결과 (표 9), 이는 세트 1로부터의 항체와 유사한 결과를 나타내었다. 인간 FcRn에 대한 결합성이 개선된 돌연변이체는 또한, 시노FcRn에 대한 결합성이 개선된 것으로 여겨진다. pH 6에서 가장 개선된 결합성을 나타내는 돌연변이체는 N434H/T370A/E380A, N434H/T289H 및 N434H/N315H이다. 그러나, 이들 변이체는 pH 7.4에서도 상당히 증가된 결합성을 나타내었다. 이와는 달리, 나머지 항체 모두는 pH 7.4에서의 결합성이 거의 또는 전혀 없었다.
Figure 112008054666762-PAT00036
aKD는 역학 파라미터로부터 계산하였다.
bKD는 평형 결합성 실험으로부터 계산하였다.
c단백질은 293 세포에서 발현되었다.
역학 및 평형 결합성 분석에 의해 결정된 KD 간의 상관 계수를 조사한 결과, 인간 FcRn 결합성에 대한 상관 계수는 0.246인 반면, 시노FcRn 결합성에 대한 상관 계수는 0.966이란 사실이 밝혀졌다. 인간 FcRn 결합성에 대한 상관 계수가 낮은 원인은 G385H이었는데, 이는 평형 결합 동안 몇 가지 응집 문제점을 경험하였다. 이러한 데이터 점을 배제하여 0.916의 상관 계수를 수득하였다.
세트 3으로부터의 항체의 역학 및 평형 결합성을 분석한 결과 (표 10), 이는 세트 1로부터의 항체와 유사한 결과를 나타내었다. 인간 FcRn에 대한 결합성이 개선된 돌연변이체는 또한, 시노FcRn에 대한 결합성이 개선된 것으로 여겨진다. T250Q/M428L 조합 돌연변이체는 pH 6에서 가장 개선된 결합성을 나타내었다. 이는 또한 pH 7.4에서도 약간 증가된 결합성을 나타내긴 하였지만, 이러한 수준은 세트 1 및 2로부터의 돌연변이체와 비교해서 낮았다.
Figure 112008054666762-PAT00037
aKD는 역학 파라미터로부터 계산하였다.
bKD는 평형 결합성 실험으로부터 계산하였다.
c단백질은 293 세포에서 발현되었다.
역학 및 평형 결합성 분석에 의해 결정된 KD 간의 상관 계수를 조사한 결과, 인간 FcRn 결합성에 대한 상관 계수는 0.966인 반면, 시노FcRn 결합성에 대한 상관 계수는 0.902란 사실이 밝혀졌다.
앞서, 본 발명자들은 돌연변이물 N434W, N434F 및 N434A를 함유하는 힌지없는 Fcs의 친화성이 인간 FcRn 결합성에 있어 pH 6에서 야생형과 비교해서 170배, 9배 및 2.7배 개선되었다고 보고하였다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 전장의 4D5 항체 맥락에서 이들 돌연변이물 및 기타 돌연변이물을 관찰하였다. 평형 결합성 분석에 의해 획득한 결과를 비교한 결과, 본 발명자들은 N434W, N434F 및 N434A가 pH 6에서 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 20배, 7배 및 2배 개선되었다는 사실을 밝혀내었다. 유사한 결과가 시노 FcRn에 대한 결합성에도 관찰되었다. 방향족 돌연변이물, 예를 들어 N434Y 및 N434H를 함유하는 부가의 돌연변이체는 인간 FcRn에 대한 pH 6 결합성이 9배 및 4배 증가하였다. 그러나, N434W, N434Y 및 N434F 돌연변이체 모두는 pH 7.4에서 인간 FcRn와 시노 FcRn 둘 다에 대한 결합성이 상당히 증가되었다.
N434H로부터 예상되는 결과와, pH-의존적 Fc-FcRn 상호 작용에 있어서의 히스티딘 잔기의 중요성을 고려하여 (9), 본 발명자들은 기타 맥락에서 히스티딘 돌연변이물을 연구 조사하기로 결정하였다. 랫트 Fc-FcRn 복합체에 대해 설명된 구조를 이용하고 (9,10) 인간 단백질에 대한 상동성을 고려하여, 히스티딘-스캔을 수행하였다. 부가적으로, 프레스타 (Presta) 등에 의해 확인된 (4) T370A 및 E380A 돌연변이물과 조합된 N434H 돌연변이물에 관한 연구를 수행하였다. BIA코어 분석에 의해 pH 6 결합성에 있어서는 개선을 나타내었지만, pH 7.4 결합성은 전혀 증가되지 않은 변이체에는 G385H, D312H, N315H, 및 N434H가 포함되었다. 신규한 히스티딘 돌연변이물 또는 히스티딘 조합 돌연변이물들 중의 어느 것도, N434H 돌연변이물 단독보다 훨씬 더 큰 pH 6 FcRn 결합성 상의 개선을 나타내지 못하였다. 그러나, 조합 돌연변이물 모두는 pH 7.4에서 상당히 증가된 FcRn 결합성을 나타내었다. 2가지 이상의 히스티딘 돌연변이물과 조합한 부가의 변이체는 FcRn에 대한 증강된 pH-의존적 결합성을 제공해줄 수 있다. 또한, His 돌연변이물에 의해 영향을 받는 부위를 확인한 결과, 이는 부가의 아미노산 치환을 위한 새로운 부위라는 것을 제안하고 있다.
최종적으로, 본 발명자들은 또한, IgGl 분자 맥락에서 힌톤 (Hinton) 등에 의해 보고된 (3) 돌연변이물을 연구 조사하였다. 이들은 IgG2 분자의 배경에서 T250Q, M428L 및 T250Q/M428L에 대한 pH 6 결합성이 각각 3배, 7배 및 28배 증가하였다고 보고한 반면, 본 발명자들은 IgG1의 맥락에서 각각 3배, 3배 및 5배의 보다 적당한 수준의 증가를 밝혀내었다. 유사한 결과가 시노 FcRn에 대한 결합성에 대해서도 관찰되었다. 단일 돌연변이체는 pH 7.4에서 인간 또는 시노 FcRn에 대한 결합성이 전혀 증가하지 않은 반면, 이중 돌연변이체는 단지 약간 증가된 결합성을 나타내었다.
본 연구에서 본 발명자들은 pH 6 및 pH 7.4 모두에서 인간 FcRn 및 시노 FcRn에 대한 몇 가지 Fc 돌연변이체의 친화성을 정량화하였다. 본 발명자들은 전반적인 친화성과 친화성 개선이 소정의 분자에 대해 인간 FcRn와 시노 FcRn 간에 유사하다고 결정하였다. ELISA 및 BIA코어 분석에 의한 pH 6 결합성에 근거하여 개선된 변이체의 순위를 매개는 것은 일반적으로 일치하였지만, pH 7.4 결합성 평가는 종종 상이하였다. 이러한 불일치는 사용된 상이한 고정화 과정 하에 FcRn 또는 IgG의 행위 상의 차이로부터 비롯될 수 있다.
실시예 6에 대한 참고 문헌
Figure 112008054666762-PAT00038
참고 문헌
본원에 인용된 참고 문헌 (이에는 특허, 공개공보 및 기타 공개 문헌이 포함된다)은 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 수준 내에 있는 통상적인 분자 생물학 기술 등을 이용할 것이다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다 [참고: 예를 들어,
Figure 112008054666762-PAT00039
도 1은 천연 IgG, 및 각종 항체 단편을 생성시키기 위한 그의 효소적 분해를 도식적으로 나타낸 것이다. 디설파이드 결합은 CHl 도메인과 CL 도메인 사이, 그리고 2개의 CH2 도메인 사이에 S-S로써 나타내었다. V는 가변 도메인이고; C는 불변 도메인이며; L은 경쇄를 나타내고, H는 중쇄를 나타낸다.
도 2A 및 2B는 항-Her2 항체 (트라스투주마브: Trastuzumab)의 VL 아미노산 서열 (도 2A; 서열 5) 및 VH 아미노산 서열 (도 2B; 서열 6)을 도시한 것이다.
도 3A 및 3B는 특이적 항-IgE 항체 E25, E26, E27 및 Hu-901의 경쇄 및 중쇄 서열을 도시한 것이다.
도 4는 천연 서열 인간 IgG Fc 영역 서열, humlgGl (비-A 및 A 동종이형; 각각 서열 29 및 30), humIgG2 (서열 31), humIgG3 (서열 32) 및 humIgG4 (서열 33)를 정렬하여 도시한 것인데, 서열들 간의 차이는 별표로 표시하였다.
도 5는 천연 서열 IgG Fc 영역을 정렬하여 도시한 것이다. 천연 서열 인간 IgG Fc 영역 서열, humlgGl (비-A 및 A 동종이형) (각각 서열 29 및 30), humIgG2 (서열 31), humIgG3 (서열 32) 및 humIgG4 (서열 33)이 도시되어 있다. 인간 IgGl 서열은 비-A 동종이형이고, 이러한 서열과 A 동종이형 간의 차이는 (위치 356 및 358에서; EU 넘버링 시스템)이 인간 IgG1 서열 아래에 제시되었다. 천연 서열 뮤린 IgG Fc 영역 서열, murlgGl (서열 34), murIgG2A (서열 35), murIgG2B (서열 36) 및 murIgG3 (서열 37)이 또한 도시되었다.
도 6은 IgG 생체 항상성에 있어서의 FcRn의 역할을 도시한 것이다. 소포 내 의 타원형이 FcRn이다.
도 7은 파지-디스플레이에 사용된 인간 IgGl Fc 단백질 변이체 (W0437)의 서열을 도시한 것이다. 가용성 Fc의 성숙한 단백질 서열 (서열 38)이 도시되어 있고; 파지 디스플레이에 사용된 M13 g3p의 일부는 도시되어 있지 않다. 성숙한 단백질 서열 내의 첫 번째 잔기인 Ser는 힌지 영역의 두 번째 Cys (C229)의 돌연변이에 상응하고, 마지막 잔기 (Leu)는 M13 g3p에 대한 융합 부위이다. 밑줄친 잔기는 N434에 상응한다.
도 8은 SPR (BIAcore)에 의한, pH 6.0에서 huFcRn에 대한 이. 콜라이-생산된 야생형 및 변이체 Fc 결합성의 평형 분석을 도시한 것이다.
도 9는 인간 FcRn에 대한 2H7 IgGl 변이체 결합성의 ELISA 분석을 도시한 것이다. 인간 IgGl 변이체는 포유류 세포에서 일시적으로 형질감염시킴으로써 생성시키고, 이를 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 FcRn와 결합하는 것에 관해 인간화 4D5 (헤르셉틴: Herceptin®)와 비교하였다. 뉴트라비딘 (NeutrAvidin) 외피/FcRn-바이오티닐화/항체/염소 항-hu-IgG-F(ab)'2-HRP 연합 (pH 6.0) 및 해리 (pH 7.4).
도 10은 C2B8 경쇄 서열 (서열 24) 및 중쇄 서열 (서열 25)을 도시한 것이다. 불변 영역과 Fc 영역이 박스 안에 있고, 가변 영역은 박스 밖에 있다.
도 11은 ELISA에서 인간 FcγRIII (V158)에 대한 2H7 변이체의 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 12는 시노몰구스 원숭이에게 20 mg/kg을 단일 정맥내 투여한 후 PRO145234, PRO145181, 및 PRO145182의 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한 것이다.
도 13은 ELISA에 의해 검정된 바와 같이, pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 헤르셉틴 및 hu4D5 (N434H)의 결합성을 도시한 것이다.
<110> Genentech, Inc. <120> POLYPEPTIDE VARIANTS WITH ALTERED EFFECTOR FUNCTION <130> P2158R1PCT <140> PCT/US2005/029511 <141> 2005-08-19 <150> US 60/603,057 <151> 2004-08-19 <160> 54 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 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Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser 95 100 105 Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val

Claims (41)

  1. 적어도 Asn 434에서 Tyr로의 아미노산 치환 (N434Y)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하며, H433R, H433S, Y436H, Y436R, Y436T로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 치환을 추가로 갖지 않는 단리된 폴리펩티드.
  2. 적어도 Asn 434에서 Phe로의 아미노산 치환 (N434F)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하며, H433K, Y436H, M252Y, S254T, 또는 T256E의 아미노산 치환을 추가로 갖지 않는 단리된 폴리펩티드.
  3. 적어도 Asn 434에서 His로의 아미노산 치환 (N434H)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 영역이 천연 서열 IgG Fc 영역보다 높은 친화도로 pH 6.0에서 인간 FcRn과 결합하고, pH 7.4에서는 pH 6.0에서의 결합 친화도보다 더 약한 결합 친화도로 인간 FcRn과 결합하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체인 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 항체가 키메라, 인간 또는 인간화 항체인 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, IgG가 인간 IgG1인 폴리펩티드.
  8. 제5항에 있어서, 항체가 CD20, HER2, BR3, TNF, VEGF, IgE, 및 CD11a로 이루어진 항원 군 중에서 선택된 항원과 결합하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제3항에 있어서, HER2와 결합하는 항체인 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 항체가 서열 4의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 3의 VL 서열; 및 서열 6의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 5의 VL 서열로 이루어진 서열 군 중에서 선택된 VL 및 VH 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서, HER2 결합성 항체가 천연 서열 Fc 영역을 갖는 항체와 비교해서 증가된 FcγR 결합성을 나타내거나, 증가된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 나타내거나, 증가된 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 나타내거나, 저하된 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC와 CDC 기능을 나타내거나, 증가된 ADCC 기능을 나타내긴 하지만 CDC 기능은 저하되거나, 증가된 FcRn 결합성과 혈청 반감기를 나타내는 것 중 한 가지 이상의 상기 특성을 나타내는 폴리펩티드가 생성되도록, Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제9항에 있어서, D265A, S298A/E333A/K334A, K334L, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 여기서 상기 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩티드.
  13. 제9항에 있어서, IgG Fc 영역에 아미노산 치환 T307A/E380A를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 서열 6의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 5의 VL 서열을 포함하고, pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 항체의 결합성이 모 항체 트라스투주마브 (trastuzumab)보다 40배 이상 더 우수한 것인 폴리펩티드.
  15. 제9항에 있어서, T289H 또는 N315H의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역부착인자인 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 증가된 FcγR 결합성을 나타내거나, 증가된 ADCC을 나타내거나, 증가된 CDC를 나타내거나, 저하된 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC와 CDC 기능을 나타내거나, 증가된 ADCC 기능을 나타내긴 하지만 CDC 기능은 저하되는 것 중 한 가지 이상의 상기 특성을 나타내는 폴리펩티드가 생성되도록, Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, D265A, S298A/E333A/K334A, K334L, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 여기서 상기 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제3항 및 제9항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드, 및 담체를 포함하는 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 및 제9항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  21. 제20항의 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 제1항 내지 제3항 및 제9항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포.
  23. 적어도 Asn 434에서 His로의 아미노산 치환 (N434H)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 생산하는 제22항의 숙주 세포를 배양하고, 이러한 폴리펩티드를 상기 세포 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  24. 용기와 이에 함유된 조성물을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 제1항 내지 제3항 및 제9항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 것인 제조품.
  25. 치료 유효량의 제9항의 항체를 포함하는, HER2 발현성 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 항체가 서열 4의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 3의 VL 서열; 및 서열 6의 VH 서열과 쌍을 형성한 서열 5의 VL 서열로 이루어진 서열 군 중에서 선택된 VL 및 VH 서열을 포함하는 제약 조성물.
  27. 적어도 Lys 334에서 루이신으로의 아미노산 치환 (K334L)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 변이체 Fc가 천연 서열 IgG Fc 영역보다 높은 친화도로 인간 FcγRIII과 결합하는 것인 폴리펩티드.
  29. 제27항에 있어서, 천연 서열 IgG Fc 영역을 갖는 폴리펩티드보다 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 항체 의존성 세포독성을 나타내는 폴리펩티드.
  30. 제27항에 있어서, 천연 서열 Fc 영역을 갖는 항체와 비교해서 증가된 FcγR 결합성을 나타내거나, 증가된 ADCC을 나타내거나, 증가된 CDC를 나타내거나, 저하된 CDC를 나타내거나, 증가된 ADCC와 CDC 기능을 나타내거나, 증가된 ADCC 기능을 나타내긴 하지만 CDC 기능은 저하되거나, 증가된 FcRn 결합성과 혈청 반감기를 나타내는 것 중 한 가지 이상의 상기 특성을 나타내는 폴리펩티드가 생성되도록, Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  31. 제27항에 있어서, D265A, S298A/E333A, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 여기서 상기 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것인 폴리펩티드.
  32. 제27항에 있어서, 키메라, 인간화 또는 인간 IgG 항체인 폴리펩티드.
  33. Fc 영역 내의 N434가 Y, F 또는 A로 치환되는 것을 제외하고는, 서열 39의 L 쇄 서열과 서열 40의 H 쇄 서열을 갖는 인간화 CD20 결합 항체.
  34. 제33항의 항체, 및 담체를 포함하는 조성물.
  35. 제34항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  36. 제35항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  37. 치료 유효량의 제33항의 인간화 CD20 결합 항체를 포함하는, CD20을 발현하는 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 신생물 또는 악성 종양을 치료하기 위한 제약 조성물.
  38. 치료 유효량의 제33항의 인간화 CD20 결합 항체를 포함하는, B-세포 조절된 자가면역 질환을 완화시키기 위한 제약 조성물.
  39. 후보 폴리펩티드를 파지 상에 발현하고; 고체 매트릭스 상에 고정화된 huFcRn을 제공하여, 파지 입자가 매트릭스 상의 인간 FcRn와 결합할 수 있게 하며; 각 세척에 따라 증가하는 엄격도로 수 차례 세척하여 결합되지 않은 파지 입자를 제거하고; pH 7.4에서 잔존하는 결합된 파지를 용출시키는 것을 포함하며, 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드와 비교해서, pH 6.0에서 FcRn과 보다 높은 친화도로 결합하고, pH 7.4에서는 pH 6.0에서의 결합 친화도보다 더 약한 결합 친화도로 FcRn과 결합하는 폴리펩티드에 대한 스크리닝 방법.
  40. 서열 5의 VL 서열, 서열 6의 VH 서열, 및 적어도 Asn 434에서 Ala로의 아미노산 치환 (N434A)을 포함하는 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 단리된 항-HER2 항체.
  41. 제40항에 있어서, D265A, S298A/E333A/K334A, K334L, K322A, K326A, K326W, E380A 및 E380A/T307A로 이루어진 군 중에서 선택된 잔기 위치에서 IgG Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 여기서 상기 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것인 항체.
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Families Citing this family (196)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
MXPA01011279A (es) 1999-05-07 2002-07-02 Genentech Inc Tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas que se unene a los marcadores de superficie, de celulas b.
SI1282443T1 (sl) * 2000-05-19 2010-01-29 Genentech Inc Metoda detekcije gena za izboljšanje verjetnosti učinkovitega odziva na terapijo raka z antagonistom ErbB
US20020058029A1 (en) * 2000-09-18 2002-05-16 Nabil Hanna Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using B cell depleting/immunoregulatory antibody combination
KR100988949B1 (ko) * 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US7984268B2 (en) * 2002-10-08 2011-07-19 Netlogic Microsystems, Inc. Advanced processor scheduling in a multithreaded system
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US8101720B2 (en) * 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US9296820B2 (en) * 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CA2575838A1 (en) 2004-07-26 2006-03-30 Biogen Idec Ma Inc. Anti-cd154 antibodies
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) * 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US9200079B2 (en) 2004-11-12 2015-12-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20070135620A1 (en) * 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
BRPI0606542A8 (pt) 2005-02-23 2018-03-20 Genentech Inc métodos para aumentar o tempo de progressão de uma doença (ttp)
US20100104564A1 (en) * 2005-03-29 2010-04-29 Genevieve Hansen Altered Antibody Fc Regions and Uses Thereof
CA2614181A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Medimmune, Inc. An integrated approach for generating multidomain protein therapeutics
US7557190B2 (en) * 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
WO2007047578A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
IN2014DN10515A (ko) 2006-03-31 2015-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
TWI414531B (zh) * 2006-10-12 2013-11-11 Genentech Inc 淋巴毒素α之抗體
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
CA2677108A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
WO2008119566A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
AU2008255027B2 (en) 2007-05-14 2013-10-03 Astrazeneca Ab Methods of reducing eosinophil levels
EP2176298B1 (en) 2007-05-30 2017-11-15 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
CA2700701C (en) 2007-09-26 2020-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
PL3059246T3 (pl) 2007-09-26 2018-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Zmodyfikowany region stały przeciwciała
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP4098661A1 (en) * 2007-12-26 2022-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
SG189775A1 (en) 2008-04-11 2013-05-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CN102112494A (zh) 2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AR077718A1 (es) * 2008-07-15 2011-09-21 Genentech Inc Metodos para tratar enfermedades autoinmunes usando anticuerpos anti cd4. formulacion farmaceutica
TW201438738A (zh) * 2008-09-16 2014-10-16 Genentech Inc 治療進展型多發性硬化症之方法
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
KR102100066B1 (ko) * 2008-10-14 2020-04-10 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도
CN102281902B (zh) * 2008-11-17 2013-11-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于减少大分子在生理条件下聚集的方法和制剂
EP2373692A4 (en) * 2008-12-04 2013-11-20 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINE WITH DOUBLE VARIABLE DOMAIN AND ITS USE
WO2010080528A1 (en) 2008-12-17 2010-07-15 Genentech, Inc. Hepatitis c virus combination therapy
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
AU2015204268B2 (en) * 2009-03-09 2017-03-02 Bioatla, Llc Mirac Proteins
KR101979188B1 (ko) * 2009-03-09 2019-05-16 바이오아트라, 엘엘씨 미락 단백질
CN102369215B (zh) 2009-04-02 2015-01-21 罗切格利卡特公司 包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体
PT2417156E (pt) 2009-04-07 2015-04-29 Roche Glycart Ag Anticorpos trivalentes, biespecíficos
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
SG10201403327WA (en) * 2009-06-17 2014-10-30 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-vegf antibodies and their uses
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2013503607A (ja) 2009-09-01 2013-02-04 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AR078161A1 (es) * 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
US20120302737A1 (en) 2009-09-16 2012-11-29 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
AR078651A1 (es) 2009-10-15 2011-11-23 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2786692A1 (en) * 2010-01-11 2011-07-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers of immunomodulatory effects in humans treated with anti-cd200 antibodies
EP2533810B1 (en) * 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
CN102844332B (zh) * 2010-03-11 2015-08-19 瑞纳神经科学公司 呈pH依赖性抗原结合的抗体
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2011150110A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 Genentech, Inc. Methods of purifying polypeptides
NZ607480A (en) 2010-08-03 2014-10-31 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112013001847A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, método de preparação do anticorpo biespecífico, do anticorpo biespecífico trivalente, métodos e composição farmacêutica
EP2608803A4 (en) 2010-08-26 2014-01-15 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
JP5798307B2 (ja) * 2010-09-03 2015-10-21 国立大学法人名古屋大学 グロボトリアオシルセラミドを特異的に認識するモノクローナル抗体及びその作製法
KR20130096731A (ko) * 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
RS57038B1 (sr) 2010-11-17 2018-05-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specifičan antigen-vezujući molekul koji ima alternativnu funkciju funkciji faktora viii koagulacije krvi
CN103328632A (zh) 2010-11-30 2013-09-25 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
SG192945A1 (en) 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
KR101572338B1 (ko) 2011-02-28 2015-11-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 1가 항원 결합 단백질
AU2012234335B2 (en) 2011-03-29 2016-09-01 Roche Glycart Ag Antibody Fc variants
JP6152090B2 (ja) 2011-04-21 2017-06-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ 視神経脊髄炎を処置するための組成物および方法
GB201114858D0 (en) * 2011-08-29 2011-10-12 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies and methods of using the same
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
KR102492584B1 (ko) 2011-09-30 2023-01-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
TW201726745A (zh) 2011-09-30 2017-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失的抗原結合分子
KR102099991B1 (ko) 2011-10-14 2020-04-14 제넨테크, 인크. Her2 이량체화 억제제인 페르투주맙의 용도 및 이를 포함하는 제조품
ES2637423T5 (es) 2011-11-02 2022-03-17 Hoffmann La Roche Cromatografía de sobrecarga y elución
RU2739792C1 (ru) 2011-11-30 2020-12-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Содержащий лекарственное средство переносчик в клетку для формирования иммунного комплекса
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
JP6486686B2 (ja) 2012-02-10 2019-03-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 単鎖抗体及び他のヘテロ多量体
US20150018241A1 (en) 2012-02-15 2015-01-15 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-receptor based affinity chromatography
JP6138108B2 (ja) 2012-02-24 2017-05-31 中外製薬株式会社 ＦｃγＲＩＩＢを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
EP3892638A1 (en) 2012-05-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
US20140004121A1 (en) 2012-06-27 2014-01-02 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
EP3495387B1 (en) 2012-07-13 2021-09-01 Roche Glycart AG Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014030750A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
DK2889377T3 (da) 2012-08-24 2020-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc?RIIb-Specifik Fc-regionsvariant
WO2014052713A2 (en) * 2012-09-27 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Her2-and vegf-a-binding proteins with enhanced stability
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2890979A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 Genentech, Inc. Ionic strength-mediated ph gradient ion exchange chromatography
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
MX2015013166A (es) 2013-03-15 2015-12-11 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-1 beta y/o il-17.
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
MY173295A (en) 2013-04-16 2020-01-14 Genentech Inc Pertuzumab variants and evaluation thereof
MX2015015060A (es) 2013-04-29 2016-02-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos asimetricos modificados que se unen al receptor fc y metodos de uso.
TWI653243B (zh) 2013-04-29 2019-03-11 赫孚孟拉羅股份公司 遏止ＦｃＲｎ結合之抗ＩＧＦ－１Ｒ抗體及其治療血管性眼疾之用途
CN105143262A (zh) 2013-04-29 2015-12-09 豪夫迈·罗氏有限公司 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法
JPWO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
CA2918052A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Genentech, Inc. Elucidation of ion exchange chromatography input optimization
MX2016002798A (es) 2013-09-05 2016-07-21 Genentech Inc Metodo para reutilizacion de cromatografia.
CA2922912A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
TWI702316B (zh) 2013-12-04 2020-08-21 日商中外製藥股份有限公司 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
JP6778110B2 (ja) 2014-01-15 2020-10-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 改善されたプロテインＡ結合を有するＦｃ領域バリアント
CA2931986A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
WO2015164665A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Genentech, Inc. Methods of treating early breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1 and pertuzumab
WO2015170480A1 (ja) 2014-05-08 2015-11-12 中外製薬株式会社 Ｇｐｃ３標的治療剤療法が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤
CN106573051B (zh) * 2014-06-13 2021-07-13 梅约医药教育及研究基金会 治疗淋巴瘤
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
KR20170078677A (ko) 2014-11-06 2017-07-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 Fcrn-결합이 개질된 fc-영역 변이체 및 이의 사용 방법
WO2016071377A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
EA038349B1 (ru) * 2014-11-21 2021-08-12 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела, содержащие модифицированные константные участки тяжелой цепи
ES2764111T3 (es) 2014-12-03 2020-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
CR20170326A (es) 2014-12-19 2017-08-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes, y métodos de uso
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
MX2017010795A (es) 2015-02-24 2018-04-11 Bioatla Llc Proteínas biológicas condicionalmente activas.
WO2016191750A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Genentech, Inc. Cell-based assay for detecting anti-cd3 homodimers
WO2016196373A2 (en) 2015-05-30 2016-12-08 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive metastatic breast cancer
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MX2018003005A (es) 2015-09-18 2018-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos.
AU2016332900C1 (en) 2015-09-29 2024-02-01 Amgen Inc. ASGR inhibitors
KR20180064534A (ko) 2015-11-02 2018-06-14 바이오아트라, 엘엘씨 조건부 활성 폴리펩티드
WO2017087280A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive cancer
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3395835B1 (en) * 2015-12-25 2021-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody having enhanced activity, and method for modifying same
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
US11513127B2 (en) 2016-01-25 2022-11-29 Genentech, Inc. Methods for assaying T-cell dependent bispecific antibodies
CN116196412A (zh) 2016-03-15 2023-06-02 中外制药株式会社 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗gpc3抗体治疗癌症的方法
WO2017214452A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Xencor, Inc. Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
WO2018052556A1 (en) * 2016-08-02 2018-03-22 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
WO2018035025A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Genentech, Inc. Chromatography method for quantifying a non-ionic surfactant in a composition comprising the non-ionic surfactant and a polypeptide
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US20180221481A1 (en) 2016-12-28 2018-08-09 Genentech, Inc. Treatment of advanced her2 expressing cancer
WO2018129713A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 杭州翰思生物医药有限公司 提高IgG类抗体对FcRn的结合亲和力并延长其血清半衰期的方法
TW202138007A (zh) 2017-01-17 2021-10-16 美商建南德克公司 皮下her2抗體調配物
EP3589661B1 (en) 2017-03-02 2023-11-01 Genentech, Inc. Adjuvant treatment of her2-positive breast cancer
CN110536969A (zh) 2017-04-24 2019-12-03 豪夫迈·罗氏有限公司 跨膜或近膜域中的erbb2/her2突变
BR112019023543A2 (pt) * 2017-05-10 2020-05-26 Albajuna Therapeutics, S.L. Derivados de proteína de fusão fc com alta atividade dual antiviral e imunomoduladora do hiv
JP7382922B2 (ja) 2017-09-20 2023-11-17 中外製薬株式会社 Ｐｄ－１系結合アンタゴニストおよびｇｐｃ３標的化剤を使用する併用療法のための投与レジメン
JP6496095B1 (ja) 2017-09-29 2019-04-03 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤
WO2019126536A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Alexion Pharmaceuticals Inc. Humanized anti-cd200 antibodies and uses thereof
WO2019147973A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Genzyme Corporation Fc variants with enhanced binding to fcrn and prolonged half-life
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
JPWO2020116560A1 (ja) 2018-12-05 2021-10-21 株式会社バイカ・セラピュティクス 抗体のＦｃ領域改変体
US11542333B2 (en) 2019-01-03 2023-01-03 Invetx, Inc. Compositions for increasing half-life of a therapeutic agent in canines and methods of use
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
CN113711037A (zh) 2019-04-18 2021-11-26 基因泰克公司 抗体效力测定
AR119264A1 (es) 2019-06-05 2021-12-09 Genentech Inc Método para reutilización de cromatografía
KR20220062084A (ko) * 2019-09-13 2022-05-13 체에스엘 베링 렝나우 아게 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021092287A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 North Carolina State University Cross-linking compounds and methods of use thereof
PE20221661A1 (es) 2019-12-18 2022-10-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-ccl2 biespecificos
EP4136109A1 (en) 2020-04-17 2023-02-22 Zoetis Services LLC Feline antibody variants
MX2022012866A (es) 2020-04-17 2022-11-08 Zoetis Services Llc Variantes de anticuerpos caninos.
CA3178123A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 William Brondyk Compositions for increasing half-life of a therapeutic agent in canines and methods of use
US20230303715A1 (en) * 2020-05-20 2023-09-28 Zymeworks Bc Inc. IMMUNOGLOBULIN Fc REGION VARIANTS COMPRISING STABILITY-ENHANCING MUTATIONS
WO2021234655A2 (en) * 2020-05-21 2021-11-25 Cadila Healthcare Limited Fc variant and preparation thereof
WO2021251438A1 (ja) 2020-06-10 2021-12-16 株式会社バイカ・セラピュティクス エリスロポエチンポリペプチドを含む融合タンパク質
WO2022005883A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Zoetis Services Llc Feline antibody variants for improving stability
WO2022010652A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Invetx Inc. Compositions for increasing half-life of a therapeutic agent in felines and methods of use
MX2023003624A (es) 2020-09-28 2023-04-11 Zoetis Services Llc Variantes de anticuerpos caninos.
WO2022072446A1 (en) 2020-09-29 2022-04-07 Zoetis Services Llc Feline antibody variants
CA3202089A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Zoetis Services Llc Bovine antibody variants
KR20230121056A (ko) 2020-12-18 2023-08-17 조에티스 서비시즈 엘엘씨 고양이 항체 불변 영역의 돌연변이
AU2022214843A1 (en) 2021-01-28 2023-07-20 Zoetis Services Llc Mutations in canine antibody constant regions
KR20240021859A (ko) 2021-06-18 2024-02-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
WO2023108115A1 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Ph-selective antibody fc domains
US20230364020A1 (en) 2022-04-01 2023-11-16 Genentech, Inc. Hydroxypropyl methyl cellulose derivatives to stabilize polypeptides
WO2023245105A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Genentech, Inc. Use of kosmotropes to enhance yield of an affinity chromatography purification step

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4752601A (en) * 1983-08-12 1988-06-21 Immunetech Pharmaceuticals Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin FC receptors
US5985599A (en) * 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
GB8916400D0 (en) * 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
US5364930A (en) * 1990-10-16 1994-11-15 Northwestern University Synthetic C1q peptide fragments
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
CA2118508A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5595721A (en) * 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5648821A (en) * 1993-09-29 1997-07-15 Becker; Ricky C. Remote cursor control apparatus
US5783186A (en) * 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) * 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) * 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1355919E (pt) * 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
WO2003062375A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-31 Genentech, Inc. Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea
KR101033196B1 (ko) * 2002-02-14 2011-05-09 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 항-ｃｄ20 항체 및 그 융합 단백질 및 이들의 이용방법
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7365168B2 (en) * 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2347241T3 (es) * 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2007532680A (ja) * 2004-04-16 2007-11-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 疾患の治療方法
AU2005241431A1 (en) * 2004-04-16 2005-11-17 Genentech, Inc. Assay for antibodies

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