PT2417156E

PT2417156E - Anticorpos trivalentes, biespecíficos

Info

Publication number: PT2417156E
Application number: PT107123655T
Authority: PT
Inventors: Christian Klein; Ulrich Brinkmann; Juergen Michael Schanzer; Ekkehard Moessner; Rebecca Croasdale; Eike Hoffmann; Pablo Umana; Claudio Sustmann
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2015-04-29
Also published as: US20100256340A1; AU2010234031B2; JP2012522527A; PL2417156T3; IL214884A; US9890204B2; US11993642B2; KR20110130460A; AU2010234031A1; EP2417156A1; WO2010115589A1; MX2011010168A; ES2537100T3; BRPI1010297A2; JP2014193181A; AR076193A1; KR101456326B1; US20200062826A1; CA2757931A1; CA2757931C

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS TRIVALENTES, BIESPECÍFICOS" A invenção presente diz respeito a anticorpos trivalentes, biespecificos, a métodos para a sua produção, a composições farmacêuticas que contenham os anticorpos referidos, e às suas utilizações.

Nos últimos tempos foi desenvolvida uma grande variedade de formatos de anticorpos multiespecificos recombinantes, por exemplo anticorpos tetravalentes biespecificos por fusão de, por exemplo, um anticorpo com formato de IgG e domínios de cadeia singela (veja-se por exemplo Coloma, M. J., et al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO 2001/077.342; e Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234).

Foram também desenvolvidos diversos formatos novos nos quais a estrutura nuclear do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) já não é mantida, tais como diacorpos, triacorpos ou tetracorpos, minicorpos, diversos formatos de cadeia singela (scFv, Bis-scFv), que são capazes de se ligar a dois ou a mais antigénios (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., e Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al. , Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

Todos estes formatos utilizam agentes de ligação para fundir o núcleo de anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) a mais uma proteína ligante (por exemplo scFv) ou para fundir por exemplo dois fragmentos Fab ou scFv (Fischer, N., e Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Deve ter-se presente que pode ser pretendido manter funções efectivadoras, tais como por exemplo citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou toxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), que são mediadas pela ligação ao receptor Fc, através da manutenção de um grau de semelhança elevado aos anticorpos de ocorrência natural.

No WO 2007/024.715 descrevem-se imunoglobulinas com domínio variável dual como proteínas de ligação transformadas multivalentes e multiespecíficas. Um processo para a preparação de dímeros de anticorpos biologicamente activos foi descrito na US 6.897.044. Foram descritas construções de anticorpo multivalente Fv contendo pelo menos quatro domínios variáveis que se ligam uns aos outros através de agentes de ligação peptídicos na US 7.129.330. Foram descritas estruturas diméricas e multiméricas que se ligam a antigénios no US 2005/0 079.170. Foram descritas proteínas trivalentes ou tetravalentes monoespecíficas que se ligam a antigénios, que incluem três ou quatro fragmentos Fab ligados covalentemente uns aos outros por uma estrutura de ligação, proteínas estas que não são imunoglobulinas naturais, na US 6.511.663. No WO 2006/020.258 descreveram-se anticorpos biespecificos tetravalentes que podem ser eficientemente expressos em células procarióticas e eucarióticas, e que são úteis em métodos terapêuticos e de diagnóstico. Descreveu-se um método de separar ou preferivelmente de sintetizar dimeros que estão ligados através de pelo menos uma ligação dissulfureto entre cadeias, de dimeros que não estão ligados por pelo menos uma ligação dissulfureto entre cadeias, a partir de uma mistura que inclua os dois tipos de dimeros polipeptidicos no US 2005/0 163.782. Foram descritos receptores biespecificos tetravalentes na US 5.959.083. Foram descritos anticorpos geneticamente modificados com três ou mais locais funcionais de ligação a antigénio no WO 2001/077.342.

Foram descritos polipéptidos multiespecificos e multivalentes que se ligam a antigénios no WO 1997/001.580. No WO 1992/004.053 descrevem-se homoconjugados preparados tipicamente a partir de anticorpos monoclonais da classe IgG, que se ligam ao mesmo determinante antigénico e estão ligados covalentemente por ligações cruzadas sintéticas. Foram descritos anticorpos monoclonais oligoméricos com uma elevada avidez para antigénio no WO 1991/06.305 em que os oligómeros, tipicamente da classe IgG, são segregados tendo dois ou mais monómeros de imunoglobulina associados entre si para formar moléculas de IgG tetravalentes ou hexavalentes. Foram descritos anticorpos derivados de ovelha e construções de anticorpos modificadas na US 6.350.860, que se podem utilizar para tratar doenças nas quais a actividade do interferão gama é patogénica. No US 2005/0 100.543 estão descritas construções alvejáveis que são veículos multivalentes de anticorpos biespecíficos, isto é, cada molécula de uma construção alvejável pode servir como veículo de dois ou mais anticorpos

biespecíficos. Estão descritos anticorpos geneticamente modificados biespecíficos e tetravalentes no WO 1995/009.917. No WO 2007/109.254 estão descritas moléculas de ligação estabilizadas constituídas por ou contendo um scFv estabilizado.

No WO 2009/018.386 descreve-se um formato de anticorpo tetravalente, biespecífico, no qual estão fundidos dois scFv aos terminais C de um anticorpo de comprimento inteiro e descreve-se também um formato de anticorpo bivalente no qual um domínio VH e um domínio VL estão respectivamente fundidos aos dois terminais C de um fragmento Fab.

Descrição Resumida da Invenção

Um primeiro aspecto da invenção corrente é um anticorpo trivalente, biespecífico, incluindo a) um anticorpo de comprimento inteiro que se ligue especificamente um primeiro antigénio e constituído por duas cadeias pesadas de anticorpo e por duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipéptido constituído por ba) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante 1 de anticorpo (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH por um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve (CL); em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VL por um agente de ligação peptídico que se liga ao terminal C da outra de entre as duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; e em que o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) formem em conjunto um local de ligação a antigénio que se ligue especificamente a um segundo antigénio.

Um aspecto adicional da invenção é uma molécula de ácido nucleico codificando para um anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção.

Outros aspectos adicionais da invenção são uma composição farmacêutica contendo o referido anticorpo trivalente, biespecífico.

Os anticorpos trivalente, biespecíficos consoante a invenção denotam por um lado novas propriedades devidas à sua ligação a diferentes antigénios, e por outro lado são adequados para a produção e a formulação farmacêutica devido à sua estabilidade, pouca agregação e propriedades farmacocinéticas e biológicas. Devido ao seu núcleo Ig eles ainda manterão as propriedades dos anticorpos naturais, tais como a ADCC e a CDC.

Descrição pormenorizada da invenção

Um aspecto da invenção é um anticorpo trivalente, biespecifico incluindo a) um anticorpo de comprimento inteiro que se ligue especificamente um primeiro antigénio e constituído por duas cadeias pesadas de anticorpo e por duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipéptido constituído por ba) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante 1 de anticorpo (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH por um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve (CL); em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VL por um agente de ligação peptídico que se liga ao terminal C da outra de entre as duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; e em que o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) formem em conjunto um local de ligação a antigénio que se ligue especificamente a um segundo antigénio.

Opcionalmente o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) estão ligados e estabilizados por uma ponte dissulfureto entre cadeias, por introdução de uma ligação dissulfureto entre as seguintes posições: i) posição 44 do domínio variável da cadeia pesada e posição 100 do domínio variável da cadeia leve, ii) posição 105 do domínio variável da cadeia pesada e posição 43 do domínio variável da cadeia leve, ou iii) posição 101 do domínio variável da cadeia pesada e posição 100 do domínio variável da cadeia leve, (a numeração é sempre consoante o índice EU de Rabat).

Estão descritas técnicas para introduzir pontes dissulfureto não naturais para estabilização, por exemplo no WO 94/029.350, em Rajagopal, V., et al. , Prot. Engin. (1997) 1453-59; em Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, 25, (1998) 387-393; ou em Schmidt, M., et al.,

Oncogene (1999) 18 1711-1721. Numa concretização a ligação dissulfureto opcional entre os domínios variáveis dos polipéptidos mencionados em b) e em c) é entre a posição 44 do domínio variável da cadeia pesada e a posição 100 do domínio variável da cadeia leve. Numa concretização a ligação dissulfureto opcional entre os domínios variáveis dos polipéptidos mencionados em b) e em c) é entre a posição 105 do domínio variável da cadeia pesada e a posição 43 do domínio variável da cadeia leve. (a numeração é sempre consoante o índice EU de Rabat). Numa concretização, prefere-se um anticorpo trivalente, biespecífico sem a referida estabilização adicional por dissulfureto entre os domínios variáveis VH e VL dos fragmentos Fab de cadeia singela. 0 termo "anticorpo de comprimento inteiro" denota um anticorpo constituído por "cadeias pesadas de comprimento inteiro de anticorpo" e duas "cadeias leves de comprimento inteiro de anticorpo" (veja-se a Fig. 1). Uma "cadeia pesada de comprimento inteiro de anticorpo" é um polipéptido constituído, numa direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável de uma cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 de uma cadeia pesada de anticorpo (CHI), uma região charneira do anticorpo (HR), um domínio constante 2 de uma cadeia pesada de anticorpo (CH2), e um domínio constante 3 de uma cadeia pesada de anticorpo (CH3), o que se abrevia como VH-CH1-HR-CH2-CH3; e opcionalmente um domínio constante 4 de uma cadeia pesada de anticorpo (CH4) no caso de um anticorpo da subclasse IgE. Preferivelmente "a cadeia pesada de comprimento inteiro de um anticorpo" é um polipéptido constituído, na direcção do terminal N para o terminal C, por VH, CHI, HR, CH2 e CH3. Uma "cadeia leve de comprimento inteiro de um anticorpo" é um polipéptido constituído por, na direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia leve de um anticorpo (VL), e por um domínio constante da cadeia leve de um anticorpo (CL) , o que se abrevia como VL-CL. 0 domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL) pode ser κ (kapa) ou λ (lambda) . As duas cadeias de anticorpo de comprimento inteiro estão ligadas uma à outra por ligações dissulfureto inter-polipéptidos entre o domínio CL e o domínio CHI e entre as regiões charneira das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento inteiro. São exemplos típicos de anticorpos de comprimento inteiro os anticorpos naturais tais como IgG (por exemplo IgGl e IgG2), IgM, IgA, IgD, e IgE) . Os anticorpos de comprimento inteiro consoante a invenção podem ser provenientes de uma única espécie, por exemplo a humana, ou podem ser anticorpos quimerizados ou humanizados. Os anticorpos de comprimento inteiro consoante a invenção incluem dois locais de ligação a antigénio, formados cada um deles por um par de VH e VL, que se ligam ambos especificamente ao mesmo antigénio. 0 terminal C da cadeia pesada ou da leve do referido anticorpo de comprimento inteiro denota o último aminoácido no terminal C da referida cadeia pesada ou leve. 0 terminal N do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) do polipéptido mencionado em c) denotam o último aminoácido no terminal N do domínio VH ou VL.

Os domínios CH3 do referido anticorpo de comprimento inteiro consoante a invenção podem ser alterados pela tecnologia "punhos nas cavidades" que se descreve em pormenor com diversos exemplos, por exemplo no WO 96/027.011, em Ridgway, J.B., et al. , Protein Eng. 9 (1996) 617-621; e em Merchant, A.M., et al., Nat.

Biotechnol. 16 (1998) 677-681. Neste método as superficies de interacção dos dois domínios CH3 estão alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas que contêm estes dois domínios CH3. Qualquer um dos domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser o "punho", enquanto o outro será a "cavidade". A introdução de uma ponte dissulfureto estabiliza ainda mais os heterodímeros (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et ai., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e aumenta o rendimento.

Deste modo, num aspecto da invenção o referido anticorpo trivalente, biespecífico é além disto caracterizado por o domínio CH3 de uma das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento inteiro e o domínio CH3 da outra cadeia pesada do anticorpo de comprimento inteiro encontram-se ambos numa interface que inclui a interface original entre os domínios CH3 do anticorpo; em que a interface referida esteja alterada para promover a formação do anticorpo trivalente, biespecífico, e em que esta alteração seja caracterizada por: a) o domínio CH3 de uma das cadeias pesadas está alterado, de modo a que dentro da interface original no domínio CH3 de uma das cadeias originais que se encontra na interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada no anticorpo trivalente, biespecifico, se substituiu um resíduo de aminoácido por outro aminoácido com uma cadeia lateral de maior volume, gerando deste modo uma protuberância na interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que se pode posicionar numa cavidade adentro da interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada e b) o domínio CH3 da outra cadeia pesada está alterado, de modo que adentro da interface original do segundo domínio CH3 que se encontra com a interface original do primeiro domínio CH3 no anticorpo trivalente, biespecifico, um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com um menor volume, gerando deste modo uma cavidade adentro da interface do segundo domínio CH3 dentro da qual se pode posicionar a protuberância gerada na interface do primeiro domínio CH3.

Preferivelmente o resíduo de aminoácido referido com uma cadeia lateral com um maior volume é seleccionado de entre o conjunto constituído por arginina (R) , fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W).

Preferivelmente o resíduo de aminoácido referido com uma cadeia lateral com um menor volume é seleccionado de entre o conjunto constituído por alanina (A) , serina (S), treonina (T), valina (V).

Num aspecto da invenção ambos os domínios CH3 são também alterados pela introdução de cisteína (C) a título de aminoácido nas posições correspondentes de cada domínio CH3, de modo a que se possa formar uma ponte dissulfureto entre ambos os domínios CH3.

Numa concretização preferida, o referido anticorpo trivalente, biespecífico, inclui uma mutação T366W no domínio CH3 da "cadeia com o punho" e mutações T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 da "cadeia com a cavidade". Também se pode utilizar uma ponte dissulfureto adicional entre os domínios CH3 (Merchant, A.M., et ai., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681) por exemplo introduzindo uma mutação Y349C no domínio CH3 da "cadeia com o punho" e uma mutação E356C ou uma mutação S354C no domínio CH3 da "cadeia com a cavidade". Deste modo, noutra concretização preferida, o referido anticorpo trivalente, biespecífico inclui mutações Y349C, T366W num dos dois domínios CH3 e mutações E356C, T366S, L368A e Y407V no outro dos dois domínios CH3 do referido anticorpo trivalente, biespecífico (a mutação adicional Y349C num dos domínios CH3 e a mutação adicional E356C ou S354C no outro domínio CH3 formando uma ponte dissulfureto entre as cadeias) (a numeração é sempre consoante o índice EU de Rabat) . Mas também se podem utilizar outras tecnologias de punhos nas cavidades, tal como se descreve na EP 1.870.459A1, em alternativa ou adicionalmente. Um exemplo preferido do referido anticorpo trivalente, biespecífico contém mutações R409D e K370E no domínio CH3 da "cadeia do punho" e mutações D399K e E357K no domínio CH3 da "cadeia da cavidade" (a numeração é sempre consoante o índice EU de Rabat).

Noutra concretização preferida, o referido anticorpo trivalente, biespecífico inclui uma mutação T366W no domínio CH3 da "cadeia do punho" e mutações T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da "cadeia da cavidade" e além disto mutações R409D e R370E no domínio CH3 da "cadeia do punho" e mutações D399R e E357R no domínio CH3 da "cadeia da cavidade".

Noutra concretização preferida, o referido trivalente, biespecífico inclui as mutações Y349C e T366W num dos dois domínios CH3 e as mutações S354C, T366S, L368A e Y407V no outro dos dois domínios CH3 ou o referido anticorpo trivalente, biespecífico inclui as mutações Y349C e T366W num dos dois domínios CH3 e as mutações S354C, T366S, L368A e Y407V no outro dos dois domínios CH3, e além disto as mutações R409D e R370E no domínio CH3 da "cadeia do punho" e as mutações D399K e E357K no domínio CH3 da "cadeia da cavidade". 0 anticorpo biespecífico consoante a invenção inclui três locais de ligação a antigénio (A) o anticorpo de comprimento inteiro inclui dois locais idênticos de ligação a antigénio que se ligam especificamente a um primeiro antigénio, e B) o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) bem como o domínio variável da cadeia leve (VL) da cadeia de polipéptido mencionada em c) formam em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio) . Os termos "local de ligação" ou "local de ligação a antigénio", tal como se utilizam neste documento, denotam a ou as regiões do referido anticorpo biespecífico consoante a invenção às quais o antigénio respectivo de facto se liga especificamente. Os locais de ligação a antigénio quer no anticorpo de comprimento inteiro, quer que definidos pelo domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipéptido mencionado em b) e pelo domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) do polipéptido mencionado em c), são ambos formados por um par constituído por um domínio variável de uma cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio variável de uma cadeia pesada do anticorpo (VH).

Os locais de ligação a antigénio que de facto se ligam especificamente ao antigénio pretendido podem ser derivados de a) anticorpos já conhecidos contra aquele antigénio ou b) de novos anticorpos ou fragmentos de anticorpo obtidos por imunização de novo utilizando entre outras quer uma proteína ou um ácido nucleico de antigénio ou seus fragmentos, ou por apresentação de fagos.

Um local de ligação a antigénio de um anticorpo da invenção contém seis regiões de determinação de complementaridade (CDR) que contribuem em graus diversos para a afinidade do local de ligação em relação ao antigénio. Existem três CRD no domínio variável da cadeia pesada (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e três CDR no domínio variável da cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3). A extensão das regiões dos CDR e do quadro (FR) é determinada por comparação com uma base de dados compilada de sequências de aminoácidos nas quais aquelas regiões foram definidas de acordo com a variabilidade entre sequências. A especificidade de um anticorpo refere-se ao reconhecimento selectivo do anticorpo em relação a um epítopo bem determinado de um antigénio. Os anticorpos naturais, por exemplo, são monoespecíficos. "Anticorpos biespecíficos" consoante a invenção são anticorpos que possuem duas especificidades diferentes de ligação a antigénio. Quando um anticorpo tem mais do que uma especificidade, os epítopos que reconhece podem estar associados a um único antigénio ou a mais do que um antigénio. 0 termo anticorpo "monoespecífico" tal como se utiliza neste documento, denota um anticorpo que tenha um ou mais locais de ligação, cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo do mesmo antigénio. 0 termo "valente", tal como se utiliza neste pedido, denota a presença de um número especificado de locais de ligação numa molécula de anticorpo. Um anticorpo natural por exemplo ou um anticorpo de comprimento inteiro consoante a invenção, tem dois locais de ligação e é bivalente. Deste modo, o termo "trivalente", denota a presença de três locais de ligação numa molécula de anticorpo. Os anticorpos biespecíficos consoante a invenção são "trivalentes". 0 termo anticorpo "biespecífico, trivalente", tal como se utiliza neste documento, denota um anticorpo que tem três locais de ligação a antigénio, dos quais dois se ligam ao mesmo antigénio (ou ao mesmo epítopo do antigénio) e o terceiro se liga a um antigénio diferente ou a um epítopo diferente do mesmo antigénio. Os anticorpos da invenção presente possuem três locais de ligação e são biespecíficos.

Outra concretização da invenção corrente é um anticorpo trivalente, biespecífico que contenha: a) um anticorpo de comprimento inteiro que se ligue especificamente a um primeiro antigénio, e seja constituído por: aa) duas cadeias pesadas de anticorpo constituídas, na direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio 1 constante da cadeia pesada do anticorpo (CHI), uma região charneira do anticorpo (HR), um domínio 2 constante da cadeia pesada do anticorpo (CH2), e um domínio 3 constante da cadeia pesada do anticorpo (CH3); e ab) duas cadeias leves do anticorpo constituídas, na direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL); e b) um polipéptido constituído por ba) um domínio constante da cadeia pesada do anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) e um domínio constante 1 do anticorpo (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH através de um péptido de ligação ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro, em que o referido agente de ligação peptídico seja um péptido com pelo menos 5 aminoácidos, preferivelmente com entre 25 e 50 aminoácidos; c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL); em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VL através de um péptido de ligação ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; em que o referido péptido de ligação seja idêntico ao péptido de ligação mencionado em b) ; e em que o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) do polipéptido mencionado em c) formem em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio.

Nesta concretização, preferivelmente o anticorpo trivalente, biespecífico inclui uma mutação T366W num dos seus dois domínios CH3, e mutações T366S, L368A, Y407V no outro dos seus dois domínios CH3, e mais preferivelmente o anticorpo trivalente, biespecífico inclui mutações Y349C, T366W num dos seus dois domínios CH3 e mutações D356C, T366S, L368A e Y407V no outro dos seus dois domínios (a mutação adicional Y349C num domínio CH3 e a mutação adicional D356C no outro domínio CH3 formando uma ponte dissulfureto entre cadeias).

Numa concretização da invenção, o anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção é caracterizado por a) o referido anticorpo de comprimento inteiro que se liga especificamente a ErbB-3 inclui a título de sequência do domínio variável da cadeia pesada a SEQ ID NO: 1, e a título de sequência do domínio variável da cadeia leve a SEQ ID NO: 2 b) o polipéptido referido em b) inclui a título de sequência do domínio variável da cadeia pesada a SEQ ID NO: 3; e c) o polipéptido referido em c) inclui a título de sequência do domínio variável da cadeia leve a SEQ ID NO: 4.

Noutro aspecto da invenção corrente o anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção inclui a) um anticorpo de comprimento inteiro que se liga a um primeiro antigénio, constituído por duas cadeias pesadas do anticorpo VH-CH1-HR-CH2-CH3 e duas cadeias leves do anticorpo VL-CL; (em que preferivelmente um dos dois domínios CH3 inclua mutações Y349C, T366W e o outro dos dois domínios CH3 inclua mutações S354C, T366S, L368A, Y407V); b) um polipéptido constituído por ba) um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH) e um domínio 1 constante (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH através de um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL); em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VL através de um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; e em que o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) formam em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio.

Outra concretização da invenção corrente é um anticorpo trivalente, biespecífico que inclua a) um anticorpo de comprimento inteiro ligando-se especificamente a ErbB-3 humano e constituído por: aa) duas cadeias pesadas de anticorpo constituídas, na direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 da cadeia pesada do anticorpo (CHI), uma região charneira do anticorpo (HR), um domínio constante 2 da cadeia pesada do anticorpo (CH2), e um domínio constante 3 da cadeia pesada do anticorpo (CH3); e ab) duas cadeias leves do anticorpo constituídas, na direcção do terminal N ao terminal C, do domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), e um domínio constante da cadeia leve (CL), (VL-CL); e b) um fragmento de cadeia singela Fv que se liga especificamente a c-Met humana), em que o fragmento de cadeia singela Fv mencionado em b) esteja fundido ao referido anticorpo de comprimento inteiro em a) através de um agente de ligação peptídico, ao terminal C ou ao N da cadeia pesada ou da cadeia leve (preferivelmente ao terminal C da cadeia pesada) do referido anticorpo de comprimento inteiro; em que o referido agente de ligação peptídica seja um péptido com pelo menos 5 aminoácidos, preferivelmente entre 25 e 50 aminoácidos.

Preferivelmente um tal anticorpo trivalente, biespecifico contém também mutações Y349C, T366W num dos dois domínios CH3 do anticorpo de comprimento inteiro, e mutações S354C (ou E356C), T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios CH3 do anticorpo de comprimento inteiro.

Outra concretização da invenção corrente é um anticorpo trivalente, biespecifico incluindo a) um anticorpo de comprimento inteiro que se ligue especificamente a ErbB-3 humano, e constituído por: aa) duas cadeias pesadas de anticorpo constituídas, na direcção do N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 do anticorpo (CHI), uma região charneira do anticorpo (HR), um domínio constante 2 da cadeia pesada do anticorpo (CH2), e um domínio constante 3 da cadeia pesada do anticorpo (CH3); e ab) duas cadeias leves do anticorpo constituídas, na direcção do terminal N para o terminal C, por um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL); e b) um polipéptido constituído por ba) um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) e um domínio constante 1 da cadeia pesada do anticorpo (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH por um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro, em que o referido agente de ligação seja um péptido com pelo menos 5 aminoácidos, preferivelmente entre 25 e 50 aminoácidos; c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL); em que o referido polipéptido esteja fundido ao terminal N do domínio VL através de um agente de ligação peptídico ao terminal C da outra das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; em que o referido agente de ligação peptídico seja idêntico ao agente de ligação peptídico mencionado em b); e em que o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) do polipéptido mencionado em c) formem em conjunto um local de ligação a antigénio que se ligue especificamente a c-Met humana.

Os anticorpos de comprimento inteiro da invenção incluem regiões constantes de imunoglobulina de uma ou mais classes de imunoglobulina. Incluem-se nas classes de imunoglobulina os isotipos IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE e, no caso de IgG e de IgA, os seus subtipos. Numa concretização preferida, um anticorpo de comprimento inteiro da invenção tem uma estrutura do domínio constante de um anticorpo de tipo IgG.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", tal como se utilizam neste documento, referem uma preparação de moléculas de anticorpo com uma única composição em aminoácidos. 0 termo "anticorpo quimérico" refere um anticorpo que inclua uma região variável, isto é, uma região de ligação, proveniente de uma fonte ou espécie, e pelo menos uma parte de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, preparado em geral por técnicas de ADN recombinante. São preferidos os anticorpos quiméricos que incluam uma região variável murina e uma região constante humana. Outras formas preferidas de "anticorpos quiméricos" incluídas na invenção presente são aquelas nas quais a região constante foi modificada ou alterada em relação à do anticorpo original para gerar as propriedades consoante a invenção, em particular no que toca à ligação a Clq e/ou à ligação a receptor Fc (FcR). Também se referem estes anticorpos quiméricos como "anticorpos de classe alterada. Os anticorpos quiméricos são produto de genes de imunoglobulina expressos que incluam segmentos de ADN codificando para regiões variáveis de imunoglobulina e segmentos de ADN codificando para regiões constantes de imunoglobulina. São bem conhecidos na técnica métodos para a produção de anticorpos quiméricos, envolvendo técnicas convencionais de ADN recombinante de transfecção de genes. Vejam-se, por exemplo, Morrison, S.L., et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238 e US 5.204.244. 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais s regiões do quadro ou "regiões determinantes da complementaridade" (CDR) foram modificadas de modo a incluir CDR de uma imunoglobulina com uma especificidade diferente em comparação com a da imunoglobulina original. Numa concretização preferida, enxerta-se uma CDR murina na região do quadro de um anticorpo humano para se preparar o "anticorpo humanizado". Vejam-se, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al. , Nature 314 (1985) 268-270. As CDR especialmente preferidas correspondem às que representam sequências que reconhecem os antigénios mencionados acima para os anticorpos quiméricos. Outras formas de "anticorpos humanizados" incluídas na invenção presente são aquelas cuja região constante foi adicionalmente modificada ou alterada em relação à do anticorpo original para gerar as propriedades consoante a invenção, em particular no que toca à ligação a Clq e/ou à ligação ao receptor Fc (FcR). O termo "anticorpo humano", tal como se utiliza neste documento, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulinas da linha de gérmen humana. Os anticorpos humanos são bem conhecidos integrando o estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Também podem produzir-se anticorpos humanos em animais transgénicos (por exemplo, murganhos) que sejam capazes, quando imunizados, de produzir um reportório completo ou uma selecção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Transferindo o conjunto de genes codificando para as imunoglobulinas da linha de gérmen humana para estes murganhos com uma linga genética mutada originará a produção de anticorpos humanos quando eles forem provocados com antigénios (vejam-se, por exemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Também se podem produzir anticorpos humanos em bibliotecas de apresentação de fagos (Hoogenboom, H.R., e Winter, G.J., Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . Também se encontram disponíveis as técnicas de Cole, S.P.C., et al., e de Boerner, P., et al., para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, págs. 77-96 (1985); e Boerner, P., et al. , J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Tal como já se mencionou para os anticorpos quiméricos e humanizados consoante a invenção, o termo "anticorpo humano", tal como se utiliza neste documento, também inclui anticorpos que hajam sido modificados na sua região constante de modo a gerar as propriedades consoante a invenção, em particular no que toca à ligação a Clq e/ou à ligação a FcR, por exemplo por "alteração de classe", isto é, alteração ou mutação de partes de Fc (por exemplo de IgGl para IgG4 e/ou mutação IgGl/lgG4). 0 termo "anticorpo recombinante humano", tal como se utiliza neste documento, pretende incluir todos os anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por metodologias recombinantes, tais como os anticorpos isolados de uma célula hospedeira tal como uma célula NSO ou CHO, ou de um animal (por exemplo um murganho) que seja transgénico por ter genes de imunoglobulinas humanas, ou anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira. Estes anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes sob uma forma transposta. Os anticorpos recombinantes humanos consoante a invenção foram submetidos a uma hipermutação somática in vivo. Deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora sejam derivadas de, e relacionadas com, as sequências de VH e de VL da linha de gérmen humano, podem não existir na natureza adentro do reportório de anticorpos da linha de gérmen humano in vivo. 0 "domínio variável" (domínio variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH) , tal como se utiliza neste documento, denota cada um de um par de cadeias leve e pesada que estão directamente envolvidos na ligação entre o anticorpo e o antigénio. Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada possuem a mesma estrutura geral e cada um destes domínios inclui quatro regiões do quadro (FR) cujas sequências são largamente mantidas, ligadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinantes da complementaridade, CDR) . As regiões do quadro adoptam uma conformação de folhas β e as CDR podem formar ansas ligando as estruturas em folha β. As CDR de cada uma das cadeias são mantidas na sua estrutura tridimensional pelas regiões quadro e formam em conjunto com as CDR da outra cadeia, o local de ligação ao antigénio. As regiões CD3 da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo desempenham um papel especialmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos consoante a invenção e portanto proporcionam um objecto adicional da invenção.

Os termos "região hipervariável" ou "parte de um anticorpo que se liga ao antigénio", quando utilizados neste documento, referem os resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável inclui resíduos de aminoácido das "regiões determinantes da complementaridade" ou "CDR". As regiões do "quadro" ou "FR" são as regiões dos domínios variáveis para além dos resíduos de aminoácido das regiões hipervariáveis tal como se definem neste documento. Portanto, as regiões leve e pesada de um anticorpo incluem na direcção do terminal N para o terminal C, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4 . As CDR de cada cadeia estão separadas por estes aminoácidos do quadro. Em particular, a CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antigénio. Determinam-se as regiões CDR e FR de acordo com a definição padrão de Rabat, E. A., et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Public Health Service, National

Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Tal como se utiliza neste documento, o termo "ligando-se a" ou "ligando-se especificamente a" referem-se à ligação de um anticorpo a um epitopo do antigénio, num ensaio in vitro, preferivelmente num ensaio de ressonância do plasmão (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suécia), com um antigénio de tipo selvagem purificado. Define-se a afinidade da ligação pelos termos ka (constante de velocidade para a associação do anticorpo a partir do complexo anticorpo/antigénio), kD (constante de dissociação), e KD (kD/ka) . A ligação ou uma ligação especifica significa uma afinidade de ligação (KD) de 1CT8 mol/L ou menos, preferivelmente entre 1CT9 M e 1CT13 mol/L. Deste modo, um anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção liga-se especificamente a cada um dos antigénios para os quais é especifico, com uma afinidade de ligação (KD) de 1CT8 mol/L ou menos, preferivelmente de entre 1CT9 M e 1CT13 mol/L.

Pode investigar-se a ligação do anticorpo ao FcyRIII por um ensaio BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de velocidade para a associação do anticorpo a partir do complexo anticorpo/antigénio), kD (constante de dissociação) , e KD (kD/ka) . 0 termo "epítopo" inclui qualquer determinante polipeptidico capaz de uma ligação especifica a um anticorpo. Em determinadas concretizações, incluem-se nos determinantes peptidicos grupos superficiais de moléculas quimicamente activos tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, fosforilo, ou sulfonilo, e em determinadas concretizações eles podem ter caracteristicas estruturais tridimensionais particulares, e ou caracteristicas de carga também especificas. Um epitopo é uma região de um antigénio à qual se liga um anticorpo.

Em determinadas concretizações, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando ele reconhece preferencialmente o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou de macromoléculas. 0 termo "agente de ligação peptídico", tal como se utiliza na invenção, denota um péptido com sequência de aminoácidos específica, que seja preferivelmente de origem sintética. Estes agentes de ligação peptidicos consoante a invenção são utilizados para fundir os polipéptidos mencionados em b) e em c) aos terminais C das cadeias pesadas do anticorpo de comprimento inteiro para formar o anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção. Preferivelmente os referidos agentes de ligação peptidicos são péptidos com uma sequência de aminoácidos com um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, preferivelmente com um comprimento de 10 a 100 aminoácidos, mais preferivelmente com um comprimento de 25 a 50 aminoácidos.

Preferivelmente os referidos agentes de ligação peptidico mencionado em b) e em c) são péptidos idênticos com um comprimento de pelo menos 25 aminoácidos, preferivelmente com um comprimento de entre 25 e 50 aminoácidos e mais preferivelmente o referido agente de ligação peptidico é (GxS)n ou (GxS)nGm em que G = glicina, S = serina, e (x = 3, n= 6, 7 ou 8, e m= 0, 1, 2 ou 3) ou (x =4, n= 3, 4, 5, 6, ou 7 e m= 0, 1, 2 ou 3), preferivelmente x = 4 e n= 5, 6, ou 7.

Numa concretização adicional, o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por o referido anticorpo de comprimento inteiro ser da subclasse IgGl humana, ou da subclasse IgGl humana com as mutações L234A e L235A.

Numa concretização adicional, o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por o referido anticorpo de comprimento inteiro ser de subclasse IgG2 humana.

Numa concretização adicional o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por o referido anticorpo de comprimento inteiro ser de subclasse IgG3 humana.

Numa concretização adicional o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por o referido anticorpo de comprimento inteiro ser de subclasse IgGa humana com a mutação adicional S228P.

Preferivelmente o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por o referido anticorpo de comprimento inteiro ser de subclasse IgGl humana, ou de subclasse IgG4 humana com a mutação adicional S228P.

Verificou-se agora que os anticorpos trivalentes, biespecificos consoante a invenção possuem caracteristicas melhoradas tais como actividade biológica ou farmacológica, propriedades farmacocinéticas ou toxicidade. Eles podem por exemplo ser utilizados para o tratamento de doenças tais como o cancro.

Numa concretização adicional o anticorpo trivalente, biespecifico consoante a invenção é caracterizado por se ligar especificamente a ErbB3 e a c-Met. 0 termo "região constante", tal como se utiliza no pedido corrente denota a soma dos domínios de um anticorpo que não sejam as regiões variáveis. A região constante não está directamente envolvida na ligação ao antigénio, mas exibe diversas funções efectivadoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos dividem-se nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversos de entre estes podem ainda ser subdivididos em subclasses, tais como IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, IgAl e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominadas respect ivamente α, δ, ε, γ, e μ. As regiões constantes da cadeia leve (CL) que existem em todas as cinco classes de anticorpo são denominadas κ (kapa) e λ (lambda). 0 termo "região constante derivada de uma origem humana", tal como se utiliza neste pedido, denota uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo humano da subclasse IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 e/ou uma região constante kapa ou lambda da cadeia leve. Estas regiões constantes são bem conhecidas na técnica, estando descritas por exemplo por Rabat, E.A., (veja-se por exemplo Johnson, G., e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218;

Rabat, E.A., et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788) .

Se por um lado os anticorpos da subclasse IgG4 denotam menores ligações ao receptor Fc (FcYRIIIa), os anticorpos das outras subclasses de IgG apresentam ligações fortes. No entanto os resíduos Pro238, Asp265, Asp270,

Asn297 (perda de hidrato de carbono em Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, e His435 são resíduos que, quando alterados, também proporcionam menor ligação ao receptor Fc (Shields, R.L., et al. , J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307.434) .

Numa concretização, um anticorpo consoante a invenção apresenta uma menor ligação a FcR em comparação com um anticorpo IgGl e o anticorpo de comprimento inteiro com ele relacionado pertence à subclasse IgG4, ou às subclasses IgGl ou IgG2 com uma mutação em S228, L234, L235 e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236, em relação à ligação a FcR. Numa concretização as mutações no anticorpo de comprimento inteiro de origem são S228P, L234A, L235A, L235E e/ou PVA236. Noutra concretização as mutações as mutações no anticorpo de comprimento inteiro de origem são em IgG4, S228P e em IgGl, L234A e L235A. A região constante de um anticorpo está directamente envolvida na ADCC (citotoxicidade dependente do anticorpo e mediada pela célula) e CDC (citotoxicidade dependente do complemento). A activação do complemento (CDC) é iniciada pela ligação do factor de complemento Clq à região constante da maior parte das subclasses de anticorpos IgG. A ligação de Clq a um anticorpo é provocada por interacções entre proteínas bem definidas, no assim denominado local de ligação. Estes locais de ligação da região constante são bem conhecidos na técnica e estão descritos por exemplo por Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319- 324; e na ΕΡ Ο 307.434. Estes locais de ligação da região constante são caracterizados por exemplo, pêlos aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e P329 (numeração consoante o índice EU de Rabat). O termo "citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)" refere-se à lise de células humanas alvo por um anticorpo consoante a invenção na presença de células efectivadoras. Mede-se a ADCC preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de células que expressem antigénio com um anticorpo consoante a invenção na presença de células efectivadoras tais como PBMC isoladas de fresco ou células efectivadoras purificadas a partir de cremes leucocitários, tais como monócitos ou células assassinas naturais (NK) ou uma linha de células NK em crescimento permanente. O termo "citotoxicidade dependente do complemento(CDC) " denota um processo iniciado pela ligação do factor complemento Clq à parte Fc da maior parte das subclasses de anticorpos IgG. A ligação do Clq a um anticorpo é provocada por interacções bem definidas entre proteínas no assim denominado local de ligação. Estes locais de ligação das partes Fc são conhecidos no estado da técnica (veja-se acima). Estes locais de ligação das partes Fc são, por exemplo, caracterizados pêlos aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Rabat) . Os anticorpos das subclasses IgGl, IgG2, e IgG3 denotam em geral activação do complemento incluindo ligação a Clq e a C3, enquanto os IgG4 não activam o sistema complemento e não se ligam nem a Clq nem a C3.

Podem incrementar-se as funções efectivadoras de anticorpos monoclonais mediadas por células por transformação da sua componente oligossacarídica tal como se descreveu em Umana, P., et al. , Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, e na US 6.602.684. Os anticorpos de tipo

IgGl, que são os anticorpos terapêuticos mais habitualmente utilizados, são glicoproteínas que possuem um local de glicosilação ligada a N conservado no Asn297 em cada um dos domínios CH2. Os dois oligossacáridos complexos com duas antenas que se ligam a Asn297 estão mergulhados entre os domínios CH2, formando contactos extensivos com o esqueleto polipeptídico, e a sua presença é essencial para que o anticorpo medeie funções efectivadoras tais como a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822;

Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., e Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176- 180 e o WO 99/54.342 mostraram que a sobre-expressão em células de ovário de hamster Chinês (CHO) da β(1,4)-Ν-acetilglucosaminiltransferase III ("GnTIII"), uma glicosiltransferase eu catalisa a formação de oligossacáridos bissectados, aumenta significativamente a actividade in vitro de ADCC dos anticorpos. Aa alterações composicionais do hidrato de carbono de Asn297 ou a sua eliminação também afectam a ligação a FcyR e a Clq (Umana, P., et al. , Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147) .

Foram descritos métodos para aumentar as funções efectivadoras mediadas por células dos anticorpos monoclonais, por exemplo nos WO 2005/018.572, WO 2006/116.260, WO 2006/114.700, WO 2004/065.540, WO 2005/011.735, WO 2005/027.966, WO 1997/028.267, US 2006/0 134.709, US 2005/0 054.048, US 2005/0 1528.94, WO 2003/035.835, WO 2000/061.739.

De um modo surpreendente, os anticorpos biespecíficos <ErbB3-c-Met> que são uma concretização da invenção denotam uma menor regulação em baixa e internalização do antigénio alvo, em comparação com o seu <ErbB3> de origem e/ou com anticorpos <c-Met>. Portanto, numa concretização preferida da invenção, o anticorpo biespecífico é glicosilado (quando inclui uma parte Fc de subclasse IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferivelmente das subclasses IgGl ou IgG3) com uma cadeia sacarídica no Asn297, em que a quantidade de fucose na referida cadeia sacarídica seja de 65 % ou menos (numeração consoante

Rabat). Noutra concretização, a quantidade de fucose na referida cadeia sacaridica é de entre 5 % e 65 %, preferivelmente de entre 20 % e 40 %. "Asn297", consoante a invenção, significa o aminoácido asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc. Com base em variações menores de sequências nos anticorpos, o Asn297 também pode star localizado a alguns aminoácidos (em geral não mais do que ±3 aminoácidos) a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300. Numa concretização o anticorpo glicosilado consoante a invenção, da subclasse IgG, pertence à subclasse IgGl humana, ou à subclasse IgGl humana com as mutações L234A e L235A, ou à subclasse IgG3. Numa concretização adicional, a quantidade de ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) é de 1 % ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose no terminal N é de 1 % ou menos na referida cadeia sacaridica. A cadeia sacaridica mostra preferivelmente as caracteristicas de glicanos ligados por N a Asn297, de um anticorpo expresso de modo recombinante numa célula CHO. O termo "a cadeia sacaridica mostra caracteristicas de glicanos ligados por N a Asn297 de um anticorpo expresso de forma recombinante numa célula CHO" denota que a cadeia sacaridica em Asn297 do anticorpo de comprimento inteiro de origem consoante a invenção, tem a mesma estrutura e a mesma sequência de resíduos de hidrato de carbono excepto no que toca ao resíduo fucose, do que o mesmo anticorpo expresso em células CHO não modificadas, por exemplo as descritas no WO 2006/103.100. 0 termo "NGNA", tal como se utiliza neste pedido, denota o resíduo de hidrato de carbono, ácido N-glicolilneuramínico. A glicosilação dos IgGl ou IgG3 humanos ocorre no Asn297 sob a forma de um oligossacárido complexo fucosilado com duas antenas, terminadas por até dois resíduos Gal. As regiões constantes da cadeia pesada humana das subclasses IgGl ou IgG3 foram descritas em pormenor por Rabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), e por Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Estas estruturas são designadas como resíduos de glicano GO, G1 (a-1,6- ou a- I, 3-), ou G2, dependendo da quantidade de resíduos Gal terminais (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53) . A glicosilação do tipo da de CHO nas partes Fc de anticorpos foi descrita por exemplo por Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207. Os anticorpos que são expresso a título recombinante em células CHO cuja glicosilação não foi modificada são habitualmente fucosilados em Asn297 numa quantidade de pelo menos 85 %. Os oligossacáridos modificados do anticorpo de comprimento inteiro de origem podem ser híbridos ou complexos. Preferivelmente os oligossacáridos bissectados, reduzidos/não fucosilados são híbridos. Noutra concretização, os oligossacáridos bissectados, reduzidos/não fucosilados são complexos.

De acordo com a invenção "quantidade de fucose" significa a quantidade daquele açúcar na cadeia sacaridica ligada ao Asn297, em relação à soma de todas as estruturas glicosidicas ligadas a Asn297 (por exemplo estruturas complexa, híbridas e de teor elevado em manose), medida por espectrometria de massa MALDI-TOF e calculada sob a forma de um valor médio. A quantidade relativa de fucose é a percentagem de estruturas contendo fucose em relação a todas as estruturas glicosiladas identificadas numa amostra tratada por N-Glicosidase F (por exemplo estruturas complexas, híbridas, oligo-manósicas e de elevado teor em manose, respectivamente) por MALDI-TOF. 0 anticorpo consoante a invenção é produzido por métodos recombinantes. Deste modo, um aspecto da invenção corrente é um ácido nucleico codificando para o anticorpo consoante a invenção e um aspecto adicional é uma célula contendo o referido ácido nucleico codificando para um anticorpo consoante a invenção. Os métodos para a produção recombinante são largamente conhecidos integrando o estado da técnica e incluem a sua expressão proteica em células procarióticas e eucarióticas com o subsequente isolamento do anticorpo e em geral a sua purificação até um grau de pureza aceitável do ponto de vista farmacêutico. Para a expresso dos anticorpos tal como se mencionou acima numa célula hospedeira, inserem-se os ácidos nucleicos codificando para as respectivas cadeias leves e pesadas em vectores de expressão pêlos métodos habituais. A expressão é conduzida em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas tais como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, células de levedura ou de E. coli, e recupera-se o anticorpo das células (do sobrenadante ou das células depois de lisadas). São bem conhecidos no estado da técnica os métodos para a produção recombinante de anticorpos, descrevendo-se, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al. , Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Os anticorpos trivalentes, biespecificos consoante a invenção são adequadamente separados do meio de cultura por processos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, Protein A-Sepharose, cromatografia sobre hidroxilapatite, electroforese sobre gel, diálise, ou cromatografia por afinidade. O ADN e o ARN codificando para os anticorpos monoclonais são facilmente isolados e sequenciados utilizando processos convencionais. As células hibridoma podem servir de fonte destes ADN e ARN. Uma vez isolado, o ADN pode ser inserido em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células HEK 293, células CHO, ou células de mieloma, as quais não produzam por si próprias nenhuma proteína imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais por um processo recombinante, nas células hospedeiras.

Preparam-se variantes na sequência de aminoácidos (ou mutantes) do anticorpo trivalente, biespecífico introduzindo alterações de nucleótidos apropriadas no ADN do anticorpo, ou por síntese de nucleótidos. Estas modificações podem ser obtidas, no entanto, apenas numa gama muito limitada, por exemplo tal como se descreveu acima. Por exemplo, as modificações não alteram as características dos anticorpos mencionadas acima tais como o seu isotipo IgG e a sua ligação ao antigénio, mas podem melhorar o rendimento da produção recombinante, a estabilidade da proteína, ou facilitar a purificação. 0 termo "célula hospedeira" tal como se utiliza neste pedido, denota qualquer tipo de sistema celular que possa ser transformado para gerar os anticorpos consoante a invenção corrente. Numa concretização utilizam-se a título de células hospedeiras células HEK293 e células CHO. Tal como se utilizam neste documento, as expressões "célula", "linha de células", e "cultura de células" são utilizadas com o mês mo sentido e todas estas designações incluem as descendentes. Deste modo, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem não só a célula que é o sujeito designado como também as culturas derivadas dele sem que seja dada qualquer importância ao número de transferências. Também se entende que as descendentes não têm que ser precisamente idênticas no seu conteúdo em ADN, devido a mutações deliberadas ou que hajam ocorrido por inadvertência. Está incluída a prole variante que apresente a mesma função ou actividade biológica, tal como havia sido despistada a título de objectivo para a célula originalmente transformada.

Descreveu-se a expressão em células NSO em, por exemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão passageira está descrita em, por exemplo, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis foi descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; e por Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Foi descrito um sistema preferido de expressão transiente (em HEK 293) por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., em Cytotechnology 30 (1999) 71-83 e por Schlaeger, E.-J., no J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, incrementadores e sinais de poliadenilação.

Um ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou para um lider de secreção está operacionalmente ligado ao ADN para um polipéptido quando é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou um incrementador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando está posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "operacionalmente ligado/a" significa que as sequências de ADN que estão ligadas são contíguas, e, no caso de um líder de secreção, contíguas e no quadro de leitura. No entanto, os incrementadores não têm que ser contíguos. Consegue-se a ligação por uma ligação em locais de restrição convenientes. Quando não existirem locais desses, utilizam-se adaptadores ou agentes de ligação oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Purificam-se os anticorpos para eliminar componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo outros ácidos nucleicos ou proteínas da célula, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, classificação em bandas com CsCl, cromatografia em coluna, electroforese sobre gel de agarose, e outros métodos bem conhecidos na técnica. Veja-se Ausubel, F., et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene

Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (1987). Estão bem estabelecidos e são largamente utilizados diferentes métodos para a purificação de proteínas, tais como cromatografia por afinidade com proteínas microbianas (por exemplo cromatografia por afinidade com Protein A ou com proteína G) , cromatografia de permuta iónica (por exemplo de permuta catiónica (resinas carboximetílicas), de permuta aniónica (resinas aminoetílicas) e permuta de modo misto), adsorção tiofílica (por exemplo com beta-mercaptoetanol e outros ligandos SH), cromatografia de interacção hidrofóbica ou de adsorção aromática (por exemplo com fenil-sepharose, resinas aza-arenofílicas, ou ácido m-aminofenilborónico), cromatografia de afinidade para quelatos metálicos (por exemplo com material de afinidade de Ni(II) e de Cu (II)), cromatografia de exclusão de dimensões, e métodos electroforéticos (tais como electroforese sobre gel, electroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .

Um aspecto da invenção é uma composição farmacêutica contendo um anticorpo consoante a invenção. Outro aspecto da invenção é a utilização de um anticorpo consoante a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica. Um aspecto adicional da invenção é um método para o fabrico de uma composição farmacêutica que inclua um anticorpo consoante a invenção. Noutro aspecto, a invenção presente proporciona uma composição, por exemplo uma composição farmacêutica, contendo um anticorpo consoante a invenção presente, formulado em conjunto com um veículo farmacêutico.

Tal como se utiliza neste documento, "veículo farmacêutico" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade e de prolongamento da absorção, e outros semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração endovenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo por injecção ou por infusão).

Pode administrar-se uma composição da invenção presente por diversos métodos conhecidos na técnica. Tal como o entenderá qualquer indivíduo com conhecimentos técnicos apropriados, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados pretendidos. Para se administrar um composto da invenção por determinadas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para evitar a sua inactivação. Por exemplo, pode administrar-se um composto a um sujeito num veículo adequado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Incluem-se nos diluentes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico o soro salino e as soluções aquosas de tampões. Incluem-se nos veículos farmacêuticos soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação de soluções ou dispersões estéreis e injectáveis na altura da sua administração. A utilização destes meios e agentes para substâncias activas do ponto de vista farmacêutico é conhecida na técnica.

As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica", tal como se utilizam neste documento, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, em geral por injecção, e incluem, sem limitação, a injecção endovenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbitai, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, epidural e intraesternal, bem como a infusão. 0 termo cancro, tal como se utiliza neste documento, refere-se a doenças proliferativas, tais como linfomas, leucemias linfociticas, cancro do pulmão, cancro do pulmão sem ser de células pequenas (NSCL), cancro do pulmão das células bronquioloalveolares, cancro dos ossos, cancro pancreático, cancro da pele, cancro da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, cancro do útero, cancro do ovário, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro gástrico, cancro do cólon, cancro da mama, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma da cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiróide, cancro da glândula paratiróide, cancro da glândula supra-renal, sarcoma do tecido mole, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro do rim ou do ureter, carcinoma das células renais, carcinoma do pélvis renal, mesotelioma, cancro hepatocelular, cancro biliar, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas e células escamosas, adenoma da pituitária e sarcoma de Ewings, incluindo versões refractárias dos cancros acima, ou uma combinação de dois ou mais dos cancros acima.

Estas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. Pode contribuir-se para assegurar a ausência de micro-organismos tanto por processos de esterilização, acima, como pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e outros semelhantes. Também pode ser pretendido incluir nas composições agentes de isotonicidade, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros semelhantes. Além disto, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser conseguida pela inclusão de agentes que atrasam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Independentemente da via de administração que se seleccionar, formulam-se os compostos da invenção presente, que podem ser utilizados sob uma forma adequada hidratada, e/ou as composições farmacêuticas da invenção presente, em formas de dosagem aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, recorrendo a métodos convencionais conhecidos dos técnicos apropriados.

Os teores de dosagem dos ingredientes activos utilizados de facto nas composições farmacêuticas da invenção presente podem ser variados de modo a obter-se uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para se conseguir a resposta terapêutica pretendida para um determinado doente, a composição a aplicar, e o modo de administração, sem que seja tóxico para o doente. 0 teor de dosagem seleccionado dependerá de uma série de factores farmacocinéticos, incluindo a actividade das composições especificas da invenção presente que se empregarem, a via de administração, a altura da administração, a velocidade de excreção do composto especifico que se utilizar, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições especificamente empregues, a idade, o sexo, o peso, o estado geral de saúde e o historial medicinal prévio do doente que se estiver a tratar, e de factores semelhantes bem conhecidos nas técnicas medicinais. A composição tem que ser estéril e fluida na medida em que a composição possa ser administrada por intermédio de uma seringa. Para além de água, o veiculo será preferivelmente uma solução salina tamponizada e isotónica.

Pode manter-se uma fluidez apropriada, por exemplo, utilizando um revestimento tal como lecitina, mantendo uma dimensão de partículas pretendida no caso de dispersões, e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes de isotonicidade, por exemplo, açúcares, polióis tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio, na composição.

Tal como se utilizam neste documento, as expressões "célula", "linha de células", e "cultura de células" são utilizadas com o mesmo sentido e todas estas designações incluem as descendentes. Deste modo, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem não só a célula que é o sujeito designado como também as culturas derivadas dele sem que seja dada qualquer importância ao número de transferências. Também se entende que as descendentes não têm que ser precisamente idênticas no seu conteúdo em ADN, devido a mutações deliberadas ou que hajam ocorrido por inadvertência. Está incluída a prole variante que apresente a mesma função ou actividade biológica, tal como havia sido despistada a título de objectivo para a célula originalmente transformada. Quando se pretenderem designações diferentes, isso será claro a partir do contexto. 0 termo "transfecção", tal como se utiliza neste documento, refere-se ao processo de transferência de vectores/ácido nucleico para uma célula hospedeira. Caso se utilizem como células hospedeiras células que não apresentem barreiras muito fortes a nivel das paredes celulares, leva-se a cabo a transfecção por exemplo pelo método de precipitação com fosfato de cálcio tal como o descrito por Graham, F.L., e van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467. No entanto, também se podem utilizar outros métodos para introduzir ADN em células, tal como por injecção nuclear ou por fusão de protoplastos. Quando se utilizarem células procarióticas ou células que contenham construções substanciais nas suas paredes celulares, por exemplo, um método de transfecção é um tratamento com cálcio, utilizando cloreto de cálcio tal como descrito por Cohen, S.N, et al., PNAS 69 (1972) 2110-2114.

Tal como se utiliza neste documento, "expressão" refere-se ao processo através do qual um ácido nucleico é transcrito em mARN e/ou ao processo pelo qual o mARN transcrito (também referido como o transcrito) é subsequentemente traduzido em péptidos, polipéptidos, ou proteínas. Os transcritos e os polipéptidos codificados são referidos colectivamente como o produto genético. Caso o polinucleótido seja derivado de ADN genómico, a expressão numa célula eucariótica pode incluir emendas no mARN.

Um "vector" é uma molécula de ácido nucleico, em especial capaz de auto-replicação, que transfere uma molécula de ácido nucleico inserta para e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vectores que funcionam sobretudo para a inserção de ADN ou de ARN numa célula (por exemplo, integração cromossómica), a replicação de vectores que funcionam sobretudo para a replicação de ADN ou de ARN, e os vectores de expressão que funcionam para a transcrição e/ou a tradução do ADN ou do ARN. Também se incluem vectores que proporcionam mais do que uma das funções tal como se descreveram.

Um "vector de expressão" é um polinucleótido que, quando é introduzido numa célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido a um polipéptido. Um "sistema de expressão" refere-se habitualmente a uma célula hospedeira adequada que inclua um vector expressão que possa funcionar para se produzir um produto de expressão pretendido.

Descrição das Sequências de Aminoácidos SEQ ID NO:l domínio variável da cadeia pesada <ErbB3>, HER3 clone 29 SEQ ID NO: 2 domínio variável da cadeia leve <ErbB3>, HER3 clone 29 SEQ ID NO:3 domínio variável da cadeia pesada <c-Met>, Mab 5D5 SEQ ID NO: 4 domínio variável da cadeia leve <c-Met>, Mab 5D5 SEQ ID NO:5 cadeia pesada <ErbB3>, HER3 clone 29 SEQ ID NO:6 cadeia leve <ErbB3>, HER3 clone 29 SEQ ID NO:7 cadeia pesada <c-Met>, Mab 5D5 SEQ ID NO:8 cadeia leve <c-Met>, Mab 5D5 SEQ ID NO:9 cadeia pesada <c-Met>, Fab SD5 SEQ ID NO:10 cadeia leve <c-Met>, Fab 5D5 SEQ ID NO:11 cadeia pesada 1 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_KHSS SEQ ID NO:12 cadeia pesada 2 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_KHSS

SEQ ID NO:13 cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_KHSS

SEQ ID NO:14 cadeia pesada 1 <ErbB3-c-Met>, Her3/Met SSKH SEQ ID NO:15 cadeia pesada 2 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_SSKH

SEQ ID NO:16 cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_SSKH SEQ ID NO:17 cadeia pesada 1 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_SSKHSS SEQ ID NO:18 cadeia pesada 2 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_SSKHSS

SEQ ID NO:19 cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_SSKHSS SEQ ID NO:20 cadeia pesada 1 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_lC SEQ ID NO:21 cadeia pesada 2 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_lC

SEQ ID NO:22 cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_lC SEQ ID NO:23 cadeia pesada 1 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_6C SEQ ID NO:24 cadeia pesada 2 <ErbB3-c-Met>,

Her3/Met_6C

SEQ ID NO:25 cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_6C SEQ ID NO:26 região constante da cadeia pesada de IgGl humano SEQ ID NO:27 região constante da cadeia pesada de IgGl humano SEQ ID NO:28 região constante da cadeia leve kapa humana SEQ ID NO:29 região constante da cadeia leve lambda humana

Os exemplos que se seguem, a listagem de sequências e as figuras, são proporcionados para ajudar à compreensão da invenção presente, cujo verdadeiro âmbito se encontra espelhado nas reivindicações apensas.

Descrição das Figuras

Figura 1 Estrutura esquemática de um anticorpo de comprimento inteiro sem domínio CH4 ligando-se especificamente a um primeiro antigénio 1 com dois pares de cadeias pesadas e leves que incluem domínios variáveis e constantes numa ordem típica.

Figura 2 Representação esquemática de um anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção, incluindo um anticorpo de comprimento inteiro que se liga especificamente a um primeiro antigénio 1 em que a) na Fig. 2a dois polipéptidos VH e VL estão fundidos (os domínios VH e VL de ambos formam em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio 2; b) na Fig. 2b dois polipéptidos VH-CH1 e VL-CL estão fundidos (os domínios VH e VL de ambos formam em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio 2).

Figura 3 Representação esquemática de um anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção, incluindo um anticorpo de comprimento inteiro que se liga especificamente a um primeiro antigénio 1 com o qual dois polipéptidos VH e VL estão fundidos (formando os domínios VH e VL de ambos em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio 2) com "punhos e cavidades".

Figura 4 Representação esquemática de um anticorpo trivalente, biespecífico consoante a invenção, incluindo um anticorpo de comprimento inteiro que se liga especificamente a um primeiro antigénio 1 com o qual dois polipéptidos VH e VL estão fundidos (formando os domínios VH e VL de ambos em conjunto um local de ligação a antigénio que se liga especificamente a um segundo antigénio 2, em que estes domínios VH e VL incluam uma ponte dissulfureto entre cadeias ligando as posições VH44 e VL100) com "punhos e cavidades".

Figura 5 Ligação de anticorpos biespecíficos à superfície celular de células cancerosas.

Figura 6 Inibição da fosforilação de receptor c-Met induzida por HGF por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met.

Figura 7 Inibição da fosforilação de receptor Her3 induzida por HRG por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met.

Figura 8 Inibição da proliferação de HUVEC induzida por HGF por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met.

Figura 9 Inibição da proliferação na linha de células cancerosas A431 por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met.

Figura 10 Análise da inibição da disseminação (dispersando-se) das células da linha de células cancerosas A431 por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met.

Procedimentos Experimentais

Exemplos

Materiais & Métodos Técnicas de ADN Recombinante

Utilizaram-se métodos padrão para a manipulação do ADN, tais como descritos em Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes de biologia biológica foram utilizados seguindo as instruções dos fabricantes.

Análise das sequências de ADN e proteicas e gestão dos dados sobre as sequências

Pode encontrar-se informação geral sobre as sequências de nucleótidos das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas humanas em: Rabat, E.A. et al., (1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação do NIH N2 91-3242. Os aminoácidos das cadeias dos anticorpos são numerados pelo indice de numeração EU (Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85;

Rabat, E.A., et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação do NIH N2 91-3242. Utilizou-se para a criação de sequências, seu mapeamento, análise anotação e ilustração a versão 10.2 do conjunto de pogramas da GCG (Genetics Computer Group,

Madison, Wisconsin), bem como a versão 8.0 do conjunto Vector NTI Advance da Infomax.

Sequenciação de ADN

Determinaram-se as sequências de ADN por sequenciação de duplas cadeias levada a cabo na SequiServe (Vaterstetten, Alemanha) e na Geneart AG (Regensburg, Alemanha).

Sintese de genes

Os segmentos de gene pretendidos foram preparados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleótidos sintéticos e de produtos de PCR por sintese automatizada de genes. Os segmentos de gene que estão flanqueados por locais singulares de restrição para clivagem por endonuclease foram clonados em plasmideos pGA18 (ampR) . Purificou-se o ADN plasmidico a partir de bactérias transformadas e a sua concentração foi determinada por espectroscopia no UV. Confirmou-se a sequência de ADN dos fragmentos de gene subclonados por sequenciação de ADN. Sintetizaram-se os Segmentos de Gene codificando para a cadeia pesada de anticorpo com uma mutação T366W no domínio CH3 "punhos nas cavidades" Her3 (clone 29) e com uma região do terminal C 5D5 VH ligada por um agente de ligação peptídico (G4S)n bem como a "punhos nas cavidades" Her3 (clone 29) portadora das mutações

T366S, L368A e Y407V com uma região de terminal C 5D5 VL ligada por um agente de ligação peptídico (G4S)n, com os locais de restrição 5'-BamHI e 3'-XbaI. De um modo semelhantes, sintetizaram-se sequências de ADN codificando para a cadeia pesada "punhos na cavidades" Her3 (clone 29) de anticorpo, portadora das mutações S354C e T366W no domínio CH3, com um agente de ligação peptídico ligado pelo terminal C à região 5D5 da VH e flanqueado por um agente de ligação (G4S)n bem como para a cadeia pesada "punhos na cavidades" Her3 (clone 29) de anticorpo, portadora das mutações "punhos na cavidade" Her3 (clone 29) portadora das mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V com o terminal C ligado à região 5D5 de VL por um agente de ligação peptídico (G4S)n, por síntese de genes com locais de restrição flanqueantes BamHI e Xbal. Por último, sintetizaram-se sequências de ADN codificando para cadeias pesadas e leves não modificadas de Her3 (clone 29) e do anticorpo 5D5, flanqueadas por locais de restrição BamHI e Xbal. Conceberam-se todas as construções com uma sequência terminal 5' de ADN codificando para um péptido líder (MGWSCIILFVATATGVHS), que alveja proteínas para secreção a partir de células eucarióticas.

Construção dos plasmídeos de expressão

Utilizou-se um vector de expressão Roche para a construção de todas as VH pesadas/ou proteínas de fusão VL e plasmídeos de expressão codificando para proteínas da cadeia leve. 0 vector é constituído pêlos seguintes elementos: • um gene de resistência à higromicina a titulo de marcador de selecção, • uma origem da replicação, oriP, do virus de Epstein-Barr (EBV), • uma origem de replicação do vector pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli • um gene de beta-lactamase que confere resistência à ampicilina no E. coli, • o incrementador imediato precoce e o promotor do citomegalovirus humano (HCMV), • a sequência de sinal humana de poliadenilação de 1-imunoglobulina ("poly A"), e • locais de restrição únicos BamHI e Xbal.

Prepararam-se os genes de fusão de imunoglobulina incluindo as construções da cadeia pesada ou da leve bem como as construções "punhos nas cavidades" com domínios dos terminais C de VH e de VL, por síntese genética e clonaram-se em plasmídeos pGA18 (ampR) tal como se descreveu. Os plasmídeos pG18 (ampR) transportando os segmentos de ADN sintetizados e o vector de expressão Roche foram digeridos com enzimas de restrição BamHI e Xbal (Roche Molecular Biochemicals) e submetidos a electroforese sobre gel de agarose. Ligaram-se então os segmentos purificados de ADN codificando para as cadeias pesada e leve, ao fragmento BamHI/Xbal do vector de expressão Roche isolado, resultando os vectores de expressão finais. Transformaram-se os vectores de expressão finais em células de E. coli, isolou-se o plasmideo de expressão de ADN (Miniprep) e submeteu-se a uma análise com enzimas de restrição e a uma sequenciação do ADN. Cultivaram-se os clones correctos em 150 mL de meio LB-Amp, isolou-se de novo o ADN plasmídico (Maxiprep) e confirmou-se a identidade da sequência por sequenciação do ADN.

Expressão passageira de variantes de imunoglobulina em células HEK293

Expressaram-se as imunoglobulinas variantes recombinantes por transfecção passageira de células 293-F embriónicas de rim utilizando o Sistema de Expressão Freestyle™ 293 e seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA) . Em suma, cultivaram-se em suspensão Freestyle™ células 293-em meio de Expressão Freestyle™ 293 a 37°C/8 % de C02 e semearam-se as células em meio fresco a uma densidade de l-2xl06 células viáveis/mL no dia da transfecção. Prepararam-se complexos de DNA-293fectin™ em meio Opti-MEM® 1 (Invitrogen, EUA) utilizando 325 pL de 293fectin™ (Invitrogen, Alemanha) e 250 pg de ADN plasmídico da cadeia pesada e da leve a uma razão molar de 1:1 para um volume final de transfecção de 250 mL. Prepararam-se complexos "punhos nas cavidades" de ADN-293fectin em meio Opti-MEM® I (Invitrogen, EUA) utilizando 325 pL de 293fectin™ (Invitrogen, Alemanha) e 250 pg ADN plasmídico de cadeias pesadas 1 e 2 "punhos nas cavidades" e de cadeia leve, a razões molares de 1:1:2 para um volume final de transfecção de 250 mL. Colheram-se os sobrenadantes de cultura de células contendo anticorpos 7 dias depois da transfecção, por centrifugação a 14.000 g durante 30 minutos, filtrando-se através de um filtro estéril (0,22 pm) . Armazenaram-se os sobrenadantes a -20°C até serem purificados.

Purificação de anticorpos trivalentes biespecificos e de controlo

Purificaram-se anticorpos trivalentes biespecificos e de controlo a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Protein A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suécia) e por cromatografia de exclusão de dimensões Superdex200. Em suma, colocaram-se sobrenadantes filtrados estéreis da cultura de células sobre uma coluna HiTrap ProteinA HP (5 mL) equilibrada com tampão PBS buffer (10 mM em Na2HP04, 1 mM em KH2P04, 137 mM em NaCl e 2,7 mM em KC1, pH 7,4) . Descartaram-se as proteínas não ligadas lavando com tampão de equilibração. Eluíram-se os anticorpos e as variantes de anticorpos com tampão citrato 0,1 M, pH 2,8, e neutralizaram-se as fracções contendo proteína com 0,1 mL de Tris 1 M, pH 8,5. Em seguida, juntaram-se as fracções proteicas eluídas, concentrou-se com um dispositivo filtrante centrífugo Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) até um volume de 3 mL e carregou-se sobre uma coluna de filtração sobre gel Superdex200 HiLoad de 120 mL 16/60 (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com Histidina 20 mM, 140 mM em NaCl, pH 6,0. Misturaram-se as fracções contendo anticorpos biespecificos purificados e anticorpos de controlo com menos do que 5 % de agregados com elevada massa molecular e armazenaram-se sob a forma de aliquotas a 1,0 mg/mL, a -80°C. Geraram-se os fragmentos Fab por digestão com Papaína do anticorpo monoclonal purificado 5D5 e uma remoção subsequente dos domínios contaminantes de Fc por cromatografia sobre Protein A. Purificaram-se mais os fragmentos Fab sobre uma coluna de filtração sobre gel Superdex200 HiLoad de 120 mL 16/60 (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com Histidina 20mM, 140 mM em NaCl, pH 6,0, juntaram-se e armazenaram-se sob a forma de aliquotas a 1,0 mg/mL, a -80°C.

Análise de proteínas purificadas

Determinou-se a concentração proteica em amostras de proteína purificada medindo a densidade óptica (DO) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. Analisaram-se a pureza e a massa molecular dos anticorpos biespecificos e dos de controlo por SDS-PAGE, na presença e na ausência de um agente redutor (1,4-ditiotreitol 5 mM) e contrastando-se com azul brilhante de Coomassie). Utilizou-se o sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, EUA) seguindo as instruções do fabricante (geles com 4-20 % de Tris-Glicina). Analisou-se o conteúdo em agregados de anticorpos biespecificos e de controlo em amostras por cromatografia de exclusão de dimensões de elevado desempenho utilizando uma coluna de exclusão Superdex 200 de tamanho analítico (GE Healthcare, Suécia) em tampão móvel de KH2P04 200 mM, 250 mM em KC1, a pH 7,0 e a 25°C. Injectaram-se 25 pg de proteína na coluna a um caudal de 0,5 mL/minutos e eluiu-se isocraticamente ao longo de 50 minutos. Para a análise da estabilidade, incubaram-se concentrações de 1 mg/mL de proteínas purificadas a 4°C e a 40°C durante 7 dias e depois avaliou-se por cromatografia de exclusão de dimensões de elevado desempenho: Verificou-se a integridade do esqueleto de aminoácidos das cadeias pesada e leve do anticorpo biespecífico reduzido por espectrometria NanoElectrospray Q-TOF depois da remoção dos N-glicanos por tratamento enzimático com Peptide-N-Glycosidase F (Roche Molecular Biochemicals).

Ensaio de fosforilação de c-Met

Semearam-se 5xl05 células A549 por poço de uma placa de 6 poços no dia anterior à estimulação por HGF em RPMI com 0,5 % de FCS (soro fetal de vitelo) . No dia seguinte, substituiu-se o meio de crescimento durante uma hora por RPMI contendo 0,2 % de BSA (albumina de soro de bovino). Adicionaram-se então 5 pg/mL do anticorpo biespecífico ao meio e incubaram-se as células durante 10 minutos, adicionou-se HGF durante mais 10 minutos para uma concentração final de 50 ng/mL. Lavaram-se as células uma vez com solução PBS gelada contendo vanadato de sódio 1 mM e colocaram-se sobre gelo, lisando-se na placa de cultura de células com 100 pL de tampão de lise (Tris-Cl 50 mM a pH 7,5, 150 mM em NaCl, com 1 % de NP40, 0,5 % de DOC, aprotinina, 0,5 mM em PMSF, 1 mM em vanadato de sódio) . Transferiram-se os lisados celulares para tubos de Eppendorf e deixou-se prosseguir a lise durante 30 minutos, sobre gelo. Determinou-se a concentração proteica utilizando o método BCA (Pierce). Separaram-se 30-50 pg do lisado num gel de 4-12 % Bis-Tris NuPage (Invitrogen) e transferiram-se as proteínas no gel para uma membrana de nitrocelulose. Bloquearam-se as membranas durante uma hora com TBS-T contendo 5 % de BSA e desenvolveram-se com um anticorpo c-Met fosfo-específico dirigido contra Y1230, 1234, 1235 (44-888, Biosource) seguindo as instruções d fabricante. Sondaram-se de novo as transferências pontuais com um anticorpo que se liga a c-Met não fosforilado (AF276, R&D).

Ensaio de fosforilação de Her3 (ErbB3)

Semearam-se 2xl05 células MCF7 por poço de uma placa com 12 poços, em meio de crescimento completo (RPMI 1640, 10 % de FCS). Deixou-se que as células crescessem até 90 % de confluência ao longo de dois dias. Substituiu-se então meio por meio de fome contendo 0,5 % de FCS. No dia seguinte suplementaram-se os anticorpos respectivos às concentrações indicadas 1 hora antes de se lhes adicionar 500 ng/mL de Heregulin (R&D). Depois de se adicionar Heregulin cultivaram-se as células durante mais 10 minutos, colheram-se as células e lisaram-se. Determinou-se a concentração proteica utilizando o método BCA (Pierce).

Separaram-se 30-50 pg do lisado num gel de 4-12 % Bis-Tris NuPage (Invitrogen) e transferiram-se as proteínas no gel para uma membrana de nitrocelulose. Bloquearam-se as membranas durante uma hora com TBS-T contendo 5 % de BSA e desenvolveram-se com um anticorpo fosfoespecífico

Her3/ErbB3 reconhecendo em especial Tyrl289 (4791, Cell Signaling).

Ensaio de dispersão

Semearam-se células A549 (4.000 células por poço) ou A431 (8.000 células por poço) no dia antes do tratamento com composto num volume total de 200 pL em Placas E de 96 poços (Roche, 05232368001) em RPMI com 0,5 % de FCS. Monitorizou-se a adesão e o crescimento celular de um dia para o outro com uma máquina Real Time Cell Analyzer (Analisador de Células em Tempo Real) que varre de 15 em 15 minutos monitorizando a impedância. No dia seguinte, pré-incubaram-se as células com 5 pL das diluições respectivas de anticorpo em PBS, com varrimentos de 5 em 5 minutos. Passados 30 minutos, adicionou-se-lhes 2,5 pL de uma solução de HGF de modo a se obter uma concentração final de 20 ng/mL, e deixou-se a experiência prosseguir durante mais 72 horas. Monitorizaram-se as alterações imediatas com varrimentos de minuto a minuto durante 180 minutos, seguindo-se varrimentos de 15 em 15 minutos durante o resto do tempo.

FACS a) Ensaio de Ligação

Soltaram-se células A431 e contaram-se. Semearam-se l,5xl05 células por poço de uma placa de 96 poços cónica. Centrifugaram-se as células (1.500 rpm, 4°C, 5 minutos) e incubaram-se durante 30 minutos sobre gelo em 50 pL de uma diluição em série do anticorpo biespecífico respectivo em PBS, com 2 % de FCS (soro fetal de vitelo) . Centrifugaram-se de novo as células e lavaram-se uma vez com 200 pL de PBS contendo 2 % de FCS, seguindo-se uma segunda incubação durante 30 minutos com um anticorpo acoplado a ficoeritrina dirigido contra Fc humana, que se diluiu em PBS contendo 2 % de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098). Centrifugaram-se as células e lavaram-se por duas vezes com 200 pL de PBS contendo 2 % de FCS, voltaram a suspender-se em solução BD CellFix (BD Biosciences) e incubaram-se durante pelo menos 10 minutos sobre gelo. Mediu-se a intensidade de fluorescência média (mfi) das células por citometria de fluxo (FACS Canto, BD) . Determinou-se a mfi pelo menos em duplicados de duas contrastações independentes. Processaram-se os espectros de citometria de fluxo em mais pormenor recorrendo ao programa FlowJo (TreeStar). Determinou-se a ligação a metade do máximo com o programa XLFit 4.0 (IDBS), bem como um modelo de dose resposta para um local 205. b) Ensaio de Internalização

Soltaram-se as células e contaram-se. Semearam-se 5xl05 células em 50 pL de meio completo num tubo de Eppendorf e incubou-se com 5 pg/mL do anticorpo biespecífico respectivo a 37°C. Após os potos ao longo do tempo indicados, armazenaram-se as células sobre gelo até se completar o decurso temporal. Em seguida, transferiram-se as células para tubos de FACS, centrifugaram-se (1.500 rpm, 4°C, 5 minutos), lavaram-se com PBS + 2 % de FCS e incubaram-se durante 30 minutos em 50 pL de anticorpo secundário acoplado a ficoeritrina dirigido contra Fc humano que se diluiu em PBS contendo 2 % de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098) . Voltaram a centrifugar-se as células, lavaram-se com PBS + 2 % de FCS e determinou-se a intensidade da fluorescência por citometria de fluxo (FACS Canto, BD) . c) Experiência de Ligações Cruzadas

Soltaram-se células HT29, contaram-se e repartiram-se por duas populações que se contrastaram individualmente com PKH26 e com PKH67 (Sigma) seguindo as instruções do fabricante. Obtiveram-se 5xl05 células de cada uma das populações, combinaram-se e incubou-se durante 30 e durante 60 minutos com 10 pg/mL do anticorpo biespecífico respectivo em meio completo. A seguir aos períodos de tempo indicados armazenaram-se as células sobre gelo até se completar o decurso de tempo. Centrifugaram-se as células (1.500 rpm, 4°C, 5 minutos), lavaram-se com PBS + 2 % de FCS e determinou-se a intensidade da fluorescência por citometria de fluxo (FACS Canto, BD).

Ensaio de Brilho do Titulo em Células

Quantificou-se a viabilidade e a proliferação das células utilizando o ensaio de brilho do titulo em células (Promega). Levou-se a cabo o ensaio seguindo as instruções do fabricante. Em suma, cultivaram-se as células em placas de 96poços a um volume total de 100 pL durante o período de tempo pretendido. Para o ensaio de proliferação, removeram-se as células da incubadora e colocaram-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionaram-se 100 pL de reagente de brilho do título em células e colocaram-se placas com múltiplos poços numa agitadora orbital durante 2 minutos. Quantificou-se a luminescência ao fim de 15 minutos, num leitor de microplacas (Tecan).

Ensaio Wst-1

Levou-se a cabo a título de análise do ponto terminal um ensaio Wst-1 de viabilidade e proliferação celular, detectando-se o número de células metabolicamente activas. Em suma, adicionaram-se 20 pL de reagente Wst-1 (Roche, 11644807001) a 200 pL de meio de cultura. Incubaram-se em seguida placas de 96 poços durante entre 30 minutos e 1 h, até se observar um desenvolvimento robusto do corante. Quantificou-se a intensidade da contrastação num leitor de microplacas (Tecan) a um comprimento de onda de 450 nm.

Concepção dos anticorpos trivalentes, biespecíficos <ErbB3-c-Met> expressos e purificados

Na Tabela 1: Expressaram-se e purificaram-se anticorpos <ErbB3-c-Met> trivalentes e biespecíficos baseados num anticorpo ErbB-3 de comprimento inteiro (HER3, clone 29) e nos domínios VH e VL de um anticorpo C-met (c-Met 5D5), com as características respectivas listadas na Tabela 1, seguindo os métodos gerais descritos acima. As VH e VL de HER3, clone 29, e de c-Met 5D5 estão na listagem de sequências.

Exemplo 1 (Figura 5):

Ligação dos anticorpos biespecificos à superfície celular de células cancerosas.

As propriedades de ligação dos anticorpos biespecificos ao seu receptor respectivo à superfície da célula foram analisadas em células cancerosas A431 num ensaio baseado em citometria de fluxo. Incubaram-se as células com os anticorpos primários monoespecíficos ou biespecificos e detectou-se a ligação desses anticorpos aos seus receptores conhecidos com um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo que se ligava especificamente à parte Fc do anticorpo primário. Representou-se a intensidade média da fluorescência para uma diluição em série dos anticorpos primários em relação à concentração do anticorpo, para se obter uma curva de ligação sigmóide. Validou-se a expressão de c-Met e de Her3 por incubação apenas com o anticorpo bivalente 5D5 e com o clone 29 de Her3. 0 anticorpo Her3/c-Met_KHSS liga-se facilmente à superfície celular das A431. Nestas condições experimentais, o anticorpo apenas se consegue ligar através da sua parte Her3 e em consequência a intensidade média de fluorescência não excede a da contrastação para o clone 29 de Her3 por si só.

Exemplo 2 (Figura 6) :

Inibição da fosforilação do receptor de c-Met induzida por HGF por anticorpos biespecíficos com formatos de anticorpos Her3/c-Met

Para confirmar a funcionalidade da parte c-Met nos anticorpos biespecíficos levou-se a cabo um ensaio de fosforilação de c-Met. Nesta experiência trataram-se células de cancro do pulmão A549 ou células de cancro colorrectal HT29 com os anticorpos biespecíficos ou com anticorpos de controlo antes da exposição a HGF. Lisaram-se as células e examinou-se a fosforilação do receptor de c-Met. Ambas as linhas de células podem ser estimuladas por HGF, como se pode observar devido à ocorrência de uma banda característica de fosfo-c-Met na imunotransferência.

Exemplo 3 (Figura 6):

Inibição da fosforilação de receptor de Her3 induzida por HRG através de anticorpos biespecificos com formatos Her3/c-Met

Para se confirmar a funcionalidade da parte Her3 nos anticorpos biespecificos levou-se a cabo um ensaio de fosforilação de Her3. Nesta experiência trataram-se células MCF7 com os anticorpos biespecificos ou com anticorpos de controlo, antes de as expor a HRG (Heregulin) . Lisaram-se então as células e examinou-se a fosforilação do receptor de Her3. Os Her3/c-Met_KHSS inibem a fosforilação do receptor de Her3 na mesma extensão do que o clone 29 de

Her3 de que provêm, indicando que a ligação de Her3 e a funcionalidade do anticorpo não ficam comprometidas quando ele assume o formato de anticorpo trivalente.

Exemplo 4 (Figura 8):

Inibição da proliferação de HUVEC induzida por HGF através de anticorpos biespecificos com formatos Her3/c-Met

Levaram-se a cabo ensaios de proliferação de HUVEC para demonstrar o efeito mitogénico de HGF.

Adicionando HGF a HUVEC verifica-se um aumento para o dobro na proliferação. Por adição de anticorpo IgG de controlo, na mesma gama de concentrações que a dos anticorpos biespecificos não existe qualquer impacto sobre a proliferação celular, enquanto o fragmento Fab de 5D5 inibe a proliferação induzida por HGF. Uma titulação dos Her3/c-Met_KHSS demonstra um efeito inibidor fraco do anticorpo (Fig. 8) . Este efeito é mais pronunciado para o anticorpo Her3/Met-6C o que indica que um agente de ligação mais longo aumenta a eficácia do anticorpo. Isto demonstra a funcionalidade da componente c-Met no formato de anticorpo trivalente.

Exemplo 5 (Figura 9):

Inibição da proliferação na linha de células cancerosas A431 por anticorpos biespecíficos com formatos Her3/c-Met

Quando se semeiam A431 em meio com soro diminuído, a adição HGF induz para além da dispersão um efeito mitogénico fraco. Isto foi explorado para se analisar o impacto de Her3/c-Met_KHSS sobre a proliferação de A431 tratadas com HGF. De facto, os anticorpos biespecíficos conseguem inibir em grande medida o aumento da proliferação induzido por HGF (15 %). Um anticorpo IgGl humano de controlo não tem nenhuma influência no crescimento de células A431 promovido por HGF.

Exemplo 6 (Figura 10):

Análise da inibição da disseminação celular (dispersão) para a linha de células cancerosas A431 induzida por HGF, pelos anticorpos específicos com formatos Her3/c-Met A dispersão induzida por HGF inclui alterações morfológicas da célula, resultando no arredondamento das células, no aparecimento de apêndices do tipo filopódios, de estruturas de tipo roca e numa determinada mobilidade das células. 0 Real Time Cell Analyzer (Roche) mede a impedância de uma determinada cultura de células e pode portanto servir para monitorizar indirectamente alterações da morfologia celular e proliferação. Por adição de HGF a células A431 e A549, observaram-se alterações da impedância que se monitorizava, em função do tempo. Os Her3/c-Met_KHSS e Her3/Met-6C inibiam a dispersão induzida por HGF sendo o Her3/Met-6C mais eficaz (inibição de dispersão de 20,7 % e de 43,7 %) (Fig. 10).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Roche Glycart AG

<120> Anticorpos trivalentes, biespecíficos <130> 26063 WO <150> EP 09005108.7 <151> 2009-04-07 <160> 29 <170> Patente na versão 3.2 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> domínio variável da cadeia pesada <ErbB3>, HER3 clone 29 <4 0 0> 1

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg Phe Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> domínio variável da cadeia leve <ErbB3>, HER3 clone 29 <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Set Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10. 15

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> domínio variável da cadeia pesada <c-Met>, Mab 5D5 <400> 3

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 , 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> domínio variável da cadeia leve <c-Met>, Mab 5D5 <400> 4

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30

Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Glh Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110

Lys <210> 5 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> cadeia pesada de Her3-clone 29 <400> 5

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 IS

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg Phe Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr. Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin 165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 -Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys.Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser 405 410 415

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 465 470 475 480 • Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 485 490 495 tih. t a.« Ρλ» Μα λι a γλη ri ·· >p<.w tu» nk« tu *r.τ . ru.y ucu ocl vyo mo m.a gxy x y x xiix. ruçs x1ix. iyi x x. jy jjcu 500 505 510

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Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys Thr Leu 340 345 350

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp' Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460

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Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr 565 570 575

Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 580 585 590 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> cadeia leve <ErbB3-c-Met>, Her3/Met_6C <400> 25

Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Set Ala Ser Leu Gly I S 10 15

Asp Arg Val Thr lie. Ser Cys Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp He Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100· 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 · 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Léu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 1B0 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 26

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pró Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser VaA Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr, Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 , Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 27 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser-Val Phe Pro Lea Ala Pro Cys Ser Arg 1 5. 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn áer Gly Ala Leu Thr Ser 35 '40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu i 5 10 is

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys •100 105

<210> 29 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15

Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr 20 25 30

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr '50 55 60

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 65 70 75 80

Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100

Lisboa, 7 de Abril de 2015.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo trivalente, biespecífico incluindo a) um anticorpo de comprimento inteiro que se ligue especificamente um primeiro antigénio e constituído por duas cadeias pesadas de anticorpo e por duas cadeias leves de anticorpo; b) um polipéptido constituído por ba) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); ou bb) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio constante 1 de anticorpo (CHI), em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VH por um agente de ligação peptídico ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro c) um polipéptido constituído por ca) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), ou cb) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve (CL); em que o polipéptido referido esteja fundido ao terminal N do domínio VL por um agente de ligação peptídico que se liga ao terminal C da outra de entre as duas cadeias pesadas do referido anticorpo de comprimento inteiro; e em que o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) formem em conjunto um local de ligação a antigénio que se ligue especificamente a um segundo antigénio.
2. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante a reivindicação 1, caracterizado por o domínio CH3 de uma cadeia pesada e o domínio CH3 da outra cadeia pesada encontram-se ambos numa interface que inclui a interface original entre os domínios CH3 do anticorpo; em que a interface referida seja alterada para promover a formação do anticorpo trivalente, biespecifico, em que a alteração seja caracterizada por: i) o domínio CH3 de uma cadeia pesada seja alterado, de tal modo que na interface original o domínio CH3 de uma cadeia que se encontra com a interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada no anticorpo trivalente, biespecifico, um resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com um volume maior, gerando deste modo uma protuberância na interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que se possa posicionar numa cavidade na interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada e ii) o domínio CH3 da outra cadeia pesada seja alterado, de modo que na interface original do segundo domínio CH3 que se encontra com a interface original do primeiro domínio CH3 no anticorpo trivalente, biespecífico aonde um resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido com um menor volume de cadeia lateral, gerando deste modo uma cavidade na interface do segundo domínio CH3, na qual uma protuberância na interface do primeiro domínio CH3 seja posicionável.
3. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante a reivindicação 2, caracterizado por i) o referido resíduo de aminoácido com um maior volume de cadeia seja seleccionado de entre o conjunto constituído por arginina (R) , fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W); e ii) o referido resíduo de aminoácido com um menor volume de cadeia seja seleccionado de entre o conjunto constituído por alanina (A) , serina (S), treonina (T), valina (V).
4. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante as reivindicações 2 ou 3, caracterizado por ambos os domínios CH3 também serem alterados pela introdução de cisteína (C) como aminoácido nas posições correspondentes de cada domínio CH3, de tal modo que se possa formar uma ponte dissulfureto entre os dois domínios CH3 .
5. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por o domínio CH3 mencionado em i) incluir uma mutação T366W; e o domínio CH3 mencionado em ii) incluir as mutações T366S, L368A, Y407V.
6. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante a reivindicação 4, caracterizado por o domínio CH3 mencionado em i) incluir as mutações Y349C, T366W; e o domínio CH3 mencionado em ii) incluir as mutações S354C, T366S, L368A, Y407V.
7. 0 anticorpo trivalente, biespecífico consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) do polipéptido mencionado em c) estarem ligados e estabilizados através de uma ponte dissulfureto entre cadeias, ligando as posições seguintes: i) posição 44 do domínio variável da cadeia pesada e posição 100 do domínio variável da cadeia leve, ii) posição 105 do domínio variável da cadeia pesada e posição 43 do domínio variável da cadeia leve, ou iii) posição 101 do domínio variável da cadeia pesada e posição 100 do domínio variável da cadeia leve.
8. O anticorpo trivalente, biespecífico consoante a reivindicação 7, caracterizado por o domínio variável da cadeia pesada (VH) do polipéptido mencionado em b) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do polipéptido mencionado em c) estarem ligados e estabilizados através de uma ponte dissulfureto entre cadeias por introdução de uma ligação dissulfureto entre as posições seguintes: i) posição 44 do domínio variável da cadeia pesada e posição 100 do domínio variável da cadeia leve.
9. O anticorpo trivalente, biespecífico consoante a reivindicação 6, caracterizado por os agentes de ligação peptídicos mencionados em b) e em c) serem péptidos idênticos com um comprimento de entre 25 e 50 aminoácidos.
10. Uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo trivalente, biespecifico consoante as reivindicações 1 a 9.
11. Um ácido nucleico codificando para um anticorpo trivalente, biespecifico consoante as reivindicações 1 a 9. Lisboa, 7 de Abril de 2015.