CN1871259A

CN1871259A - 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法

Info

Publication number: CN1871259A
Application number: CNA2004800313871A
Authority: CN
Inventors: 弗雷德里克·R·泰勒; 埃伦·加伯
Original assignee: Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-08-23
Publication date: 2006-11-29
Also published as: AU2010201922B2; JP2007503206A; EP2502935A2; US20120100575A1; US7863419B2; AU2010201922A1; EP1664116A4; CA2536408A1; US8318917B2; AU2004266159A1; EP1664116A2; WO2005018572A2; EP2502935A3; WO2005018572A3; EP2502935B1; NZ545776A; US20070048300A1

Abstract

本发明提供生产无糖基化的包含Fc的多肽，诸如具有所需效应物功能的抗体的方法。本发明还提供根据该方法制备的无糖基化的抗体以及利用这些抗体作治疗剂的方法。

Description

具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法

相关信息

本申请要求2003年10月22日提交的美国临时专利申请号60/497,193的优先权，将其全部内容并入作为参考。

将整个本说明书中引用的任何专利，专利申请和参考文献的全部内容并入作为参考。

发明背景

免疫应答是身体防御自身免受侵入它的外源物质侵害而引发感染或疾病的机制。这一机制是基于产生的抗体或施用到宿主中的抗体通过其可变区结合抗原的能力。一旦抗原被抗体结合，抗原就被靶向破坏，其经常是部分由抗体的恒定区或Fc结构域介导的。

例如，抗体的Fc结构域的一种活性是结合补体蛋白，所述补体蛋白可以有助于裂解靶抗原，例如，细胞病原体。Fc区的另一种活性是结合免疫细胞，或所谓的效应细胞表面上的Fc受体(FcR)，所述受体具有促发其它免疫作用的能力。这些免疫作用包括，例如，免疫激活剂的释放，抗体生产的调控，胞内吞作用，吞噬作用和细胞杀死。在一些临床应用中这些应答对于抗体的效力是至关重要的，而在其它情况中它们引起有害的副作用。效应物介导的副作用的一个例子是引发急性发热反应的炎性细胞因子的释放。另一个例子是具有抗原的细胞的长期缺失。

通过使用缺失Fc区的抗体片段(例如，如Fab，Fab’2，或单链抗体(sFv))可能避免抗体的效应物功能，不过这些片段的半寿期缩短，只有一个抗原结合位点而非两个(例如，在Fab抗体或单链抗(sFv)的情况下)，并且更加难以纯化。

目前只有有限的途径来减弱抗体的效应物功能，同时保留Fc区的其它有价值的属性。一种方法是突变抗体表面涉及效应物结合相互作用的氨基酸。尽管一些突变导致效应物功能的减弱，但其余活性通常保留。而且，这些加入的突变可以使得抗体具有免疫原性。

另一种减弱效应物功能的方法是通过例如，缺失或改变糖所附着的残基，通过酶促作用去除糖，通过在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体，或通过在不能使蛋白质糖基化的细胞中表达抗体，来去除连接于Fc区中特定残基的糖。不过，前述的方法遗留残余的效应物功能，其形式为补体依赖性溶细胞活性和Fc受体结合。因而，为了保证活性的完全消除，效应物功能的进一步降低是重要的。

因此，对于制备具有改变的或减弱的效应物功能的无糖基化(aglycosylted)抗体的改进方法存在着需求。

发明概述

通过提供改进的方法，由只引入最小的改变，来制备无糖基化的抗原结合蛋白，例如无糖基化的抗体，更具体地为无糖基化的IgG抗体，本发明解决了无糖基化抗体的，实际上是任何包含Fc的蛋白的前述问题。具体地，本发明提供在第一个氨基酸残基位置上引入氨基酸改变的方法，这导致多肽在不同的或第二个氨基酸残基位置的糖基化的减弱。可以将第一个氨基酸修饰为包含所需的侧链化学结构，从而使它们能够连接到，例如，另外的功能性部分上，如阻断性部分(blocking moiety)，可检测的部分，诊断性部分，或治疗性部分。得到的无糖基化抗原结合多肽，例如，无糖基化IgG抗体具有，例如，改变的或减弱的效应物功能。由本发明的多肽和方法提供的不良效应物功能的降低令人吃惊地比其它传统无糖基化型Fc区手段更加明显。

因此，本发明具有几种优点，其包括，但不限于，下述内容：

-提供无糖基化的抗原结合多肽，例如，无糖基化的IgG抗体，由于它们减弱的效应物功能而适合作为治疗剂；

-制备对该多肽的改变最小的无糖基化抗体的有效方法；

-制备无糖基化抗体的有效方法，同时还提供连接所需功能性部分的位点，所述功能性部分如阻断性部分，可检测的部分，诊断性部分，或治疗性部分；

-一种改变抗体效应物功能的方法，同时避免任何免疫原性的提高；和

-治疗需要无糖基化抗原结合多肽疗法的受试者的方法。

因此，一方面，本发明提供包含Fc区的多肽，或变体多肽，其中所述Fc区具有带有优选侧链化学结构的经修饰的第一个氨基酸残基，和与未经修饰的多肽或亲本多肽相比具有减弱的糖基化的第二个氨基酸残基。

在某些实施方案中，第一个氨基酸残基的侧链化学结构可以连接到，例如，共价连接到另外的部分，即，功能性部分，诸如阻断性部分，可检测的部分，诊断性部分和/或治疗性部分。

在一个实施方案中，所述功能性部分是阻断性部分，因为所述部分抑制或阻断多肽在第二个氨基酸残基处的糖基化。所述阻断性部分还可以作用来阻抑效应物功能，例如，通过抑制多肽的Fc区与Fc受体或补体蛋白的结合。

在优选的实施方案中，所述阻断性部分是半胱氨酸加合物，其在第一个氨基酸残基是半胱氨酸或具有包含硫醇基的侧链化学结构时形成。

在某些实施方案中，第一个氨基酸包含半胱氨酸，半胱氨酸加合物，胱氨酸，混合的二硫化物加合物，或二硫化物连接。

在另一个优选的实施方案中，所述阻断性部分是聚乙二醇部分，例如，PEG部分并且优选是PEG-顺丁烯二酰亚胺部分。

在相关的实施方案中，多肽的第一个氨基酸是半胱氨酸或具有包含硫醇基(thiol)的侧链化学结构，并且PEG部分附于其上。

在某些实施方案中，还原半胱氨酸或硫醇基侧链化学结构以去除这种半胱氨酸加合物，胱氨酸，混合的二硫化物加合物，或二硫化物连接，随后将PEG部分附着于所述半胱氨酸残基或硫醇基侧链。

在另一个实施方案中，所述功能性部分是可以检测的部分，如，但不限于，荧光部分或同位素部分。

在另一个实施方案中，所述功能性部分是诊断性部分，其是能够显示疾病或病症存在的部分。

在另一个实施方案中，所述功能性部分是治疗性部分，诸如，但不限于，抗炎剂，抗癌剂，抗神经变性剂，或抗感染剂。

在另一方面，亲本多肽的变体多肽包含具有经修饰的第一个氨基酸残基的Fc区，其中所述经修饰的第一个氨基酸的空间位置使得第二个氨基酸处的糖基化减弱。在优选的实施方案中，无糖基化的变体多肽与亲本多肽相比也具有减弱的效应物功能。

在相关的实施方案中，经修饰的第一个氨基酸的空间位置距离第二个氨基酸至少1个氨基酸位置或更多，例如，2，3，4，5，6，7，8，9，或10个氨基酸位置或更多。

在一个实施方案中，经修饰的第一个氨基酸残基具有优选的侧链化学结构。在相关的实施方案中，优选的侧链化学结构具有足够的空间大小(steric bulk)和/或电荷从而使得所述多肽显示减弱的糖基化和/或效应物功能。

在一个实施方案中，所述减弱的效应物功能是与Fc受体(FcR)，如FcγRI，FcγRII，FcγRIII，和/或FcγRIIIb的结合减弱。

在另一个实施方案中，所述减弱的效应物功能是与补体蛋白，如C1q的结合减弱。

在相关的实施方案，所述的结合减弱大约1倍-大约15倍或更多倍数。

在另一个实施方案中，所述多肽具有在糖基化基序附近或之内的第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基，例如包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序。在具体的实施方案中，该方法的多肽具有被氨基酸取代所修饰的第一个氨基酸残基。在相关的实施方案中，根据Kabat编号，所述第一个氨基酸残基是氨基酸299而所述第二个氨基酸残基是氨基酸297。

在另一个实施方案中，根据Kabat编号，所述氨基酸取代选自T299A，T299N，T299G，T299Y，T299C，T299H，T299E，T299D，T299K，T299R，T299G，T299I，T299L，T299M，T299F，T299P，T299W，或T299V。

在具体的实施方案中，所述氨基酸取代是T299C或T299A。

在另一个实施方案中，本发明的多肽在经修饰的第一个氨基酸残基，例如，半胱氨酸处进行PEG(聚乙二醇化)，具体是利用PEG-顺丁烯二酰亚胺(maleimide)。

在优选的实施方案中，所述多肽是抗体，例如，具有Fc区的抗体，所述Fc区获自抗体如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4，优选获自IgG1或IgG4。

还在另一个实施方案中，前述的多肽显示改变的效应物功能，例如，与Fc受体(FcR)(如FcγRI，FcγRII，或FcγRIII)的结合减弱或与补体蛋白，如C1q的结合减弱。

在另一个实施方案中，前述的多肽结合抗原如配体，细胞因子，受体，细胞表面抗原，或癌细胞抗原。

在另一个实施方案中，前述的多肽在适合的药学载体中。

在另一方面，本发明提供编码任何一种前述多肽的分离的核酸，其中所述核酸能够在载体中编码，从而，例如，编码该多肽的核酸或载体能够在宿主细胞中表达。

在另一方面，本发明提供制备抗原结合多肽的方法，所述方法是通过在适合制备所述多肽的培养条件下培养前述含有编码本发明多肽的核酸的宿主细胞，随后，例如，从所述宿主细胞培养物中回收所述多肽来进行的。

在另一方面，本发明提供制备Fc区中的糖基化减弱的、经修饰的抗原结合多肽的方法，所述方法是通过鉴定原始多肽中的第一个原始氨基酸残基和能够在原始多肽的Fc区中被糖基化的第二个氨基酸残基，并且修饰原始多肽中的第一个原始氨基酸残基以便在修饰的多肽中产生第一个经修饰的氨基酸，从而与原始的或亲本多肽相比，在经修饰的或变异的多肽中，Fc区的第二个氨基酸残基的糖基化减弱。

在一个实施方案中，该方法可以包含确定经修饰的抗原结合多肽是否显示改变的效应物功能的步骤。

在另一方面，本发明提供通过鉴定抗体中的第一个氨基酸残基来减弱效应物功能的方法，当所述第一个氨基酸残基被修饰时，能够改变抗体Fc区中第二个氨基酸残基的糖基化。待修饰的第一个氨基酸残基的鉴定能够利用例如本领域公认的建模软件进行计算机辅助。随后修饰所述第一个氨基酸残基，从而与未经修饰的亲本抗体相比，在经修饰的抗体中Fc区的第二个氨基酸残基的糖基化得以减弱。

在另一方面，本发明提供由任一种前述方法制备的多肽。

在另一方面，本发明提供通过给药具有减弱的糖基化和/或效应物功能的本发明的多肽，在动物例如人患者中诊断、治疗或预防疾病或病症的方法。

本发明的其它特征和优点由下列详述和权利要求书将显而易见。

附图简述

图1描绘常见抗体结合多肽(IgG抗体)的结构以及抗体的抗原结合功能特性和效应物功能(例如，Fc受体(FcR)结合)。还显示了抗体的CH2结构域中糖的存在(糖基化)如何改变效应物功能(FcR结合)但不影响抗原结合。

图2图示本发明抗体的Fc区的结构和序列，其中可以将最接近糖基化的氨基酸残基的残基改变为抑制糖基化(左图)。还显示了(右图)如果第一个氨基酸残基是半胱氨酸，不仅糖基化受到抑制，而且半胱氨酸残基也提供用于连接功能性部分，例如，阻断性部分，如半胱氨酸加合物或PEG化作用部分(显示)或其它功能性部分(未显示)的位点。

图3图示在非还原性条件(泳道1-5)和还原性条件(泳道7-11)下，糖基化抗体和无糖基化抗体IgG1变体的SDS-PAGE分析的数字图像。无糖基化抗体变体(或其Fc区)比糖基化的对照迁移得更快，因为它们缺少添加的糖部分(将泳道3-5与泳道2相比以及将泳道9-11与泳道8相比)。具体地，泳道1包含对照全长抗体(单克隆的IgG1)，泳道2包含对照野生型(糖基化的)Fc区(IgG1)，泳道3包含无糖基化的Fc变体(N297Q人IgG1)，泳道4包含无糖基化的Fc变体(T299A人IgG1)，泳道5包含无糖基化的Fc变体(T299C人IgG1)，泳道6包含分子量标准品，泳道7包含对照全长抗体(单克隆的IgG1)，泳道8包含对照野生型(糖基化的)Fc区(IgG1)，泳道9包含无糖基化的Fc变体(N297Q人IgG1)，泳道10包含无糖基化的Fc变体(T299A人IgG1)，而泳道11包含无糖基化的Fc变体(T299C人IgG1)。

图4图示在非还原性条件(泳道1-3)和还原性条件(泳道5-7)下糖基化抗体和非糖基抗体IgG4变体的SDS-PAGE分析的数字图像。IgG4非糖基抗体变体比糖基化的对照迁移更快，因为它们缺少添加的糖部分(将泳道3与泳道2相比以及将泳道7与泳道6相比)。具体地，泳道1和5包含对照IgG1，泳道2和6包含对照IgG4抗体，而泳道3和7包含IgG4无糖基变体(T299A)。泳道4包含分子量标准品。

图5描述在非还原性条件下无糖基化抗体变体(Fc区)的SDS-PAGE分析的数字图像，显示半胱氨酸在存在(泳道3，4，8和9)或缺失(泳道1，2，6和7)peg-顺丁烯二酰亚胺的情况下被封闭。具体地，泳道1-45包含T299C而泳道6-9包含T299A，分子量标准品在泳道10中。

图6描述在还原性条件下无糖基化抗体变体(Fc区)的SDS-PAGE分析的数字图像，显示如通过减小的迁移率证明的那样，导入的半胱氨酸(T299C)被糖基化但丙氨酸残基(T299A)未被糖基化。具体地，泳道1-2加样增多量(2.5μg，7.5μg)的Fc T299C，泳道3-4加样PEG化的Fc T299C，泳道5-6加样增多量(2.5μg，7.5μg)的Fc T299A，泳道7-8加样PEG化的Fc T299A，而泳道9加样蛋白质分子量标记。

图7描述在第一次用TCEP还原受试蛋白质以去除半胱氨酸加合物，然后进行PEG化作用之后，在非还原性和非变性条件下与抗体变体T299A(Fc区)相比，对抗体变体T299C(Fc区)的PEG化作用的SDS-PAGE分析的数字图像，显示如通过减小的迁移率证明的那样，导入的半胱氨酸(T299C)被糖基化但丙氨酸残基(T299A)未被糖基化。具体地，泳道1加样还原和重新氧化后的Fc T299C，非还原性凝胶条件，泳道2加样还原和重新氧化后的FcT299A，非还原性凝胶条件，泳道3加样蛋白质分子量标记，泳道4加样无peg-顺丁烯二酰亚胺的Fc T299A，还原性凝胶条件，泳道5加样无peg-顺丁烯二酰亚胺的Fc T299C，还原性凝胶条件，泳道6加样Fc T299A加peg-顺丁烯二酰亚胺，还原性凝胶条件，而泳道7加样Fc T299C加peg-顺丁烯二酰亚胺，还原性凝胶条件。

图8-11显示在还原性和非还原性条件下具有半胱氨酸(T299C)或丙氨酸(T299A)突变的无糖基化抗体变体的质谱柱状图分析。质谱数据显示在非还原性条件下T299C抗体变体具有增加的质量，因为形成了偶联到299位的半胱氨酸的半胱氨酸加合物，但是当存在丙氨酸时(即，T299A)不形成这样的加合物。

图12显示作为FcγRI(上图)或FcγRIII(下图)结合的函数(function)，本发明的无糖基化抗体IgG1变体的降低的效应物功能。被去糖基化并由半胱氨酸加合物修饰的T299C变体与仅被去糖基的抗体(上图)相比，具有更小的效应物功能(FcγRI结合)。

图13显示作为FcγRI(上图)或FcγRIII(下图)结合的函数，本发明的无糖基化抗体IgG4变体的降低的效应物功能。与无糖基化的IgG1形式相比，T299A IgG4变体具有更小的效应物功能(FcγRI结合)。

图14显示作为与补体蛋白C1q结合的函数，非糖基IgG1抗体(既，hu5c8)的降低的效应物功能。被去糖基化并由半胱氨酸加合物修饰的T299C变体与仅去糖基的形式相比，具有更小的效应物功能(C1q结合)。

图15显示作为与补体蛋白C1q结合的函数，非糖基IgG4抗体(既，hu5c8)的降低的效应物功能。与无糖基化的IgG1形式相比，T299A IgG4变体具有更小的效应物功能(C1q结合)。

发明详述

为了提供说明书和权利要求书的清楚理解，下面便利地提供下列定义。

定义

术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，嵌合抗体，CDR-移植抗体，人源化抗体，人抗体，及其片段，其中减弱的糖基化和/或效应物功能是所需的，例如，抗体轻链(VL)，抗体重链(VH)，单链抗体(scFv)，F(ab’)2片段，Fab片段，Fd片段，Fv片段，和单一结构域抗体片段(DAb)。

术语“亲本抗体”包括任何这样的抗体，其需要糖基化修饰，效应物功能，和/或提供优选的或所需的侧链化学结构以便添加，例如，功能性部分。因而，亲本抗体代表本发明的方法在其上实施的原始抗体。亲本多肽可以包含天然序列(即天然存在的)抗体(包括天然存在的等位基因变体)，或具有预先存在的氨基酸序列修饰(如插入，删除和/或其它改变)的天然序列抗体。亲本抗体可以是单克隆的，嵌合的，CDR-移植的，人源化的，或人抗体。

术语“抗体变体”或“修饰的抗体”包括如本文所述的抗体，其氨基酸序列或氨基酸侧链化学结构与亲本抗体的氨基酸序列或氨基酸侧链化学结构有至少一个氨基酸或氨基酸修饰不同。在优选的实施方案中，与亲本抗体相比，抗体变体将具有减弱的糖基化，以及，任选减弱的效应物功能，和/或进一步包含一个或多个功能性部分。

术语“第一个氨基酸残基”指通过插入，取代，或删除氨基酸残基或通过直接改变现存氨基酸残基的侧链化学结构而进行修饰的多肽的氨基酸残基(或位置)，从而使得被修饰的氨基酸残基(或残基位置)不同并由此减弱或消除第二个氨基酸的糖基化。优选地，第一个氨基酸的修饰，当影响多肽的糖基化和/或效应物功能时(并任选地提供连接功能性部分的位点)，所述修饰并不显著改变多肽的其它所需功能，也不改变附于其上的功能性部分。例如，当包含Fc的多肽是抗体时，第一个氨基酸的修饰并不显著改变抗体的抗原结合活性。

术语“第二个氨基酸残基”指能够共价连接一个或多个碳水化合物的多肽的氨基酸残基，例如，糖基化的多肽的氨基酸残基。

术语“优选的侧链化学结构”指赋予多肽所需特性的化学结构，例如，氨基酸残基侧链或R-基团化学结构。通过氨基酸取代将优选的侧链化学结构导入在第一个氨基酸的位置，通过化学取代从而修饰其侧链化学结构，或通过氨基酸取代或删除从而在第一个氨基酸位置提供不同的氨基酸侧链化学结构。如本文所述，使得它包含优选的侧链化学结构的亲本抗体的侧链化学结构的修饰减弱在第二个氨基酸位置的糖基化，导致效应物功能的减弱。所述修饰还提供连接所需功能性部分的位点，在某些实施方案中，有关优选侧链化学结构的确定可以通过in silico或基于计算机的方法获知，所述in silico或基于计算机的方法用来确定在第一个氨基酸位置上待导入(例如，通过取代)的侧链化学结构的空间大小，和/或电荷。

术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明的范围之内，并且包括正亮氨酸，omithine，正缬氨酸，高丝氨酸，以及其它氨基酸残基类似物诸如在Ellman等.Meth.Enzym.202：301-336(1991)中描述的那些。为了生成这些非天然存在的氨基酸残基，可以使用上文所述Noren等.Science 244：182(1989)和Ellman等的方法。简言之，这些方法包括用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制剂tRNA，随后进行RNA的体外转录和翻译。还可以利用本领域已知的肽化学结构实现非传统性氨基酸的导入。

术语“优选的侧链化学结构具有足够的空间大小”包括具有足够空间大小的氨基酸残基的侧链化学结构，从而抑制包含Fc的多肽的糖基化和/或其效应物功能。这些残基包括，例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺，和甲硫氨酸，或其类似物或模拟物。

术语“优选的侧链化学结构具有足够的电荷”或“静电电荷”包括具有足够电荷的氨基酸残基的侧链化学结构，从而抑制包含Fc的多肽的糖基化和/或其效应物功能。这些残基包括，例如，带负电的氨基残基，例如，天冬氨酸，谷氨酸，或其类似物或模拟物，和带正电的氨基残基，例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，及其类似物或模拟物。

术语“优选的侧链化学结构具有足够的空间大小和电荷”包括具有足够的空间大小和电荷的氨基酸残基的侧链化学结构，从而抑制包含Fc的多肽的糖基化和/或其效应物功能。这些残基包括，例如，赖氨酸，精氨酸，酪氨酸，及其类似物或模拟物。

本文所用的术语“足够的”一般指本文所述的优选的修饰，其在包含Fc的多肽中至少实现下列作用中的至少一种：减弱的多肽糖基化；减弱的多肽效应物功能；和/或提供连接功能性部分的位点。

术语“功能性部分”包括优选向变体多肽添加所需功能的部分。优选地，添加所述功能而不显著改变多肽固有的所需活性，例如，对于抗体来说，分子的抗原结合活性。本发明的变体多肽可以包含一种或多种功能性部分，其可以是相同的或不同的。有用功能性部分的例子包括，但不限于，阻断性部分，可检测部分，诊断性部分和治疗性部分。例示性的阻断性部分包括足够空间大小和/或电荷的部分，从而发生减弱的糖基化，例如，通过阻断糖苷酶使多肽糖基化的能力。所述阻断性部分可以另外地或可选地减弱效应物功能，例如，通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力。优选的阻断性部分包括半胱氨酸加合物，胱氨酸，混合的二硫化物加合物和PEG部分。例示性的可检测部分包括荧光部分，放射性同位素部分，不透射线的部分等等。例示性的诊断性部分的例子包括适于揭示疾病或病症指征存在的部分。例示性的治疗性部分包括，例如，抗炎剂，抗癌剂，抗神经变性剂，和抗感染剂。所述功能性部分还可以具有一种或多种上述功能。其它有用的功能性部分是本领域已知的并且在下面进行描述。

术语“PEG化作用”，“聚乙二醇”，或“PEG”包括聚乙二醇化合物或其衍生物，具有或没有偶联剂或用偶联或活化部分(例如，用巯基，triflate，tresylate，氮丙啶，环氧乙烷，或优选用顺丁烯二酰亚胺部分，例如，PEG-顺丁烯二酰亚胺)进行衍生化。其它合适的聚乙二醇化合物包括，但不限于，maleimido monomethoxy PEG，激活的PEG聚丙烯乙二醇，以及带电的或中性的下列类型的聚合物：葡聚糖，多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)，或其它基于糖类的聚合物，氨基酸的聚合物，和生物素衍生物。

术语“空间定位”包括多肽中被修饰的第一个氨基酸位置和第二个氨基酸位置之间的相对位置或距离，其中希望通过修饰第一个氨基酸位置来改变或减弱第二个氨基酸位置处的糖基化。大约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，10-20或更多氨基酸位置，或前述范围的任何区间的氨基酸距离在本发明的范围之内。确定第一个和第二个氨基酸的所需空间定位实现了所需效果，例如，减弱的糖基化和/或效应物功能的方法，是本领域已知的并且在本文进行描述(见，例如，实施例1和4)。

术语“效应物功能”指抗体的Fc或恒定区抗合免疫系统的蛋白质和/或细胞的功能性能力。典型的效应物功能包括结合补体蛋白(例如、补体蛋白C1q)，和/或Fc受体(FcR)(例如，FcγRI，FcγRII，FcγRIII，和/或FcγRIIIb)。能够结合一种或多种前述物质的功能性结果包括，调理作用，吞噬作用，抗原依赖性的细胞毒(ADCC)，补体依赖性的细胞毒(CDC)和/或效应物细胞调节。效应物功能的降低指一种或多种生化的或细胞活性的降低，同时保持抗体可变区(或其片段)的抗原结合能力。效应物功能的降低，例如，与Fc受体或补体蛋白的Fc结合，能够以成倍减少的形式表现(例如减少1倍，2倍等等)，并且可以基于，例如用本文所述的测定法(见，例如，实施例4)或本领域已知的测定法确定的结合活性的减少百分比进行计算。

术语“糖基化”指一种或多种糖与多肽的共价连接。一般，糖基化是翻译后事件，其能够在细胞的细胞内环境或其提取物中发生。术语糖基化包括，例如，N-连接的糖基化(其中一个或多个糖连接到天冬酰胺残基上)和/或O-连接的糖基化(其中一个或多个糖连接到具有羟基的氨基酸残基上(例如，丝氨酸或苏氨酸))。

本文对于多肽Fc区的全部氨基酸编号都对应于如，例如，Kabat等，在“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，U.S.Dept.Health andHuman Services，1983和1987中所述的Kabat编号。

发明详述

通过改变抑制第二个氨基酸残基的糖基化的第一个氨基酸残基，已经发展了产生无糖基化抗原结合多肽，例如，抗体或含Fc的融合蛋白的方法。该方法特别好地适于在真核细胞中产生治疗性无糖基化的含Fc的多肽，且只对所述多肽作最小的氨基酸改变。由此本发明的方法避免将能够是免疫原性的氨基酸序列导入所述多肽。

优选地，第一个氨基酸的修饰，尽管影响多肽糖基化和/或效应物功能(并且随意地提供连接功能部分的位点)，并不显著改变多肽的其它所需功能，也不改变附于其上的功能部分。例如，当所述含Fc的多肽是抗体时，第一个氨基酸的修饰并不显著改变所述抗体的抗原结合活性。

因此，当需要改变的或减弱的效应物功能时，该方法适于生产治疗性抗体，例如，IgG抗体。通过利用本发明的方法减弱或消除抗体Fc区的糖基化来获得所述改变的或减弱的效应物功能(图1)。具体地，靶向第一个氨基酸残基进行改变(例如，通过取代，插入，删除或通过化学修饰)，这抑制第二个氨基酸残基的糖基化。得到的抗体在第二个氨基酸残发生糖基化并且具有改变的或减弱的效应物功能，例如，补体结合活性或效应细胞活性如结合Fc受体。

在某些实施方案中，减弱的效应物功能是与以下物质的结合减弱：Fc受体(FcR)，如FcγRI，FcγRII，FcγRIII，和/或FcγRIIIb受体，或补体蛋白，例如，补体蛋白C1q。结合的这种改变可以是大约1倍或更多，例如，通过大约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，50，或100-倍或更多，或改变其任何区间或范围的倍数。

基于，例如，利用本文所述的测定法(见，例如实施例4)或本领域已知的任何测定法确定的结合活性的减小百分比，容易计算这些效应物功能例如Fc与Fc受体或补体蛋白的结合的降低。

在另一个实施方案中，将第一个氨基酸残基修饰或取代为包含具有足够空间大小和/或电荷的优选侧链化学结构，从而获得减弱的糖基化和/或效应物功能。

具有足够空间大小的侧链化学结构的例示性氨基酸残基包括苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸，或其类似物或模拟物。

具有足够电荷的侧链化学结构的示例性氨基酸残基包括，例如，带负电的氨基残基，例如，天冬氨酸，谷氨酸类似物或模拟物，和带正电的氨基残基，例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，及其类似物或模拟物。

另外，当位于改变生理pH的环境中时，于生理pH不带电的氨基酸残基可以变得带电，例如，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，酪氨酸，及其类似物或模拟物。例如，不带电的氨基酸残基能够包埋在折叠的蛋白质中并经历pKa的转变，由此与生理pH的电荷相比该残基的电荷改变。

在一个实施方案中，优选的氨基酸具有足够的空间大小和/或电荷，从而使得该残基抑制第二个氨基酸位置上的糖基化。这种氨基酸包括，例如，赖氨酸，精氨酸和酪氨酸。

在本发明优选的实施方案中，对可选择被修饰的氨基酸残基其它特性，例如，作为偶联赋予多肽所需特性的所需的功能性部分的位点而起作用。这些优选的部分包括，例如，阻断性部分，可检测部分，诊断性部分和治疗性部分。

在另一个实施方案中，亲本多肽的变体多肽包含Fc区，其包含被修饰的第一个氨基酸残基，其中所述被修饰的第一个氨基酸的空间位置使得第二个氨基酸的糖基化减弱，由此所述变体多肽与亲本多肽相比具有减弱的效应物功能。

优选的空间定位可以基于第一个氨基酸与第二个氨基酸的预计接近性以及在第一个氨基酸的位置导入的优选侧链化学结构的空间大小和/或电荷。或者，获知有关最佳空间定位的判定信息可以通过在一个或多个位置进行优选的氨基酸侧链化学结构取代之后的经验观察和/或利用本领域公认用来确定空间大小、电荷的in silico或基于计算机的方法，和/或第一个氨基酸位置与第二个氨基酸位置的距离来获得。大约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，10-20或更多残基位置的氨基酸距离，或前述范围的任何区间，在本发明的范围之内。因而，在某些优选的实施方案中，经修饰的第一个氨基酸的空间位置距第二个氨基酸至少1个氨基酸位置或更多，例如，2，3，4，5，6，7，8，9，或10个氨基酸位置或更多个氨基酸位置。

本文描述了确定第一个和第二个氨基酸的所需空间定位达到了所需的效果，例如，减弱的糖基化和/或效应物功能的方法(见，例如，实施例1和4)。

在优选的实施方案中，本发明的多肽是包含Fc的多肽，如抗体，优选IgG免疫球蛋白，例如，亚型IgG1，IgG2，IgG3或IgG4，并且优选亚型IgG1或IgG4。在优选的实施方案中，前述多肽结合抗原如配体、细胞因子、受体、细胞表面抗原，或癌细胞抗原。

因为本发明提供编码前述多肽任何一种的分离的核酸，所以所述核酸能够导入载体并在宿主细胞中表达。因此，本发明的多肽可以通过在适合产生所述多肽的培养条件下培养含有编码本发明多肽的核酸的合适宿主细胞来进行生产。

在优选的实施方案中，本发明的多肽具有第一个氨基酸，其已经修饰为具有半胱氨酸残基或其侧链化学结构，即，巯基，从而使得所述多肽在以上培养条件下能够形成加合物，具有在所述培养条件下提供的游离半胱氨酸。在优选的实施方案中，得到的多肽具有减弱的糖基化和效应物功能。

在相关的实施方案中，所述多肽能够进一步加工，例如，置于还原性条件下，从而除去半胱氨酸加合物，胱氨酸，混合的二硫化物加合物，或二硫化物连接，由此提供位点来用功能性部分，例如，PEG化部分进一步修饰所述多肽。

在另一个实施方案中，所述多肽具有在糖基化基序附近或之内的第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基，例如包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接糖基化基序。在具体的实施方案中，该方法的多肽具有被氨基酸取代所修饰的第一个氨基酸残基。在相关的实施方案中，根据Kabat编号，所述第一个氨基酸残基是氨基酸299而所述第二个氨基酸残基是氨基酸297。

在具体的实施方案中，所述氨基酸取代是T299C或T299A。

尽管本文所述的本发明的方法使用正常情况下在Fc区的具体残基(氨基酸297)发生N-糖基化的IgG抗体(图1-2)，应当理解该方法可以同样应用于任何多肽中的Fc区。当所述多肽是抗体时，所述抗体可以是合成的，天然来源的(例如，来自血清)，由细胞系(例如，杂交瘤)产生的，或在转基因生物中产生的。另外，该方法还可以应用于不包含Fc区的多肽，前提是所述多肽包含至少一个糖基化位点。

该方法提供超过目前诱变方法的几种优点，例如，因为该方法能够以最小破坏性的方式用来抑制多肽的糖基化(图2，左版)，例如，无正常糖基化残基的突变，糖基化位点的删除，或糖部分的酶促去除。因此，多肽的结构得以维持，多肽对抗原的结合亲和力得以维持，多肽的免疫原性得以避免，并且如果需要，可以将多肽偶联到希望的功能性部分上(图2，右版)。这些功能性部分可以进一步消除效应物功能或提高多肽的半寿期或获得所需的治疗功能。而且，利用标准遗传工程技术可以实施本发明的方法。

1.鉴定糖基化位点

通过鉴定包含Fc区的多肽，例如，抗体，在一个实施方案中，IgG抗体中的糖基化位点实施本发明的方法。所述糖基化位点鉴定可以是根据实验或基于序列分析或模型化数据。已经描述过共有基序(consensus motif)，即各种糖基转移酶所识别的氨基酸序列。例如，N-连接的糖基化基序的共有基序经常是NXT或NXS，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸(图2)。还曾经描述过几种定位潜在糖基化基序的算法。因此，为了鉴定抗体或包含Fc片段中潜在的糖基化位点，对抗体序列进行检查，例如，通过使用公众可用的数据库，如Center for Biological Sequence Analysis提供的网站(见www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/用来预测N-连接的糖基化位点)和www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/用来预测O-连接的糖基化位点)。例如，在美国专利号6,350,861和5,714,350中描述了改变抗体糖基化位点的其它方法。

在某些情况下，给定基序的糖基化将依赖于蛋白质的其它特征，细胞或细胞提取物的类型以及抗体得以产生或接触这种细胞或提取物的条件。如本文所述的，在给定细胞或提取物导致给定基序糖基化的方面，已有确定基序是否已进行糖基化的本领域公认的技术，例如，使用凝胶电泳和/或质谱分析。

实际的或潜在的糖基化基序的鉴定也揭示了糖共价连接的残基。例如，N-连接的糖基化导致糖残基(聚糖)在精氨酸残基上连接末端侧链氮。在另一个实施例中，O-连接的糖基化导致糖残基(聚糖)共价连接到具有羟基侧基团的氨基酸残基如丝氨酸或苏氨酸上。在任一种情况中，本发明的方法并不改变一个或多个糖将要共价连接的残基。更确切地，本发明的方法采用残基的改变，所述残基不同于正常情况下通过顺式操作的机制而共价连接于糖残基的残基，由此抑制一个或多个糖与所述残基的偶联，但是不需要改变能够连接于糖即发生糖基化的实际残基。

本发明的方法可以应用于多种用途，包括，使用真核细胞的无糖基化多肽的生物生产。这种无糖基化多肽，例如，抗体，是治疗人类疾病所需的治疗剂。

2.具有改变的Fc区的抗体的生产

选择了待改进的抗体，例如，嵌合的，人的，人源化的，或合成的抗体后，现有多种方法用于产生这些抗体。由于密码的简并性，多种核酸序列将编码每种抗体氨基酸序列。通过重新(de novo)固相DNA合成或通过PCR诱变早先制备的编码抗体的多核苷酸，可以生产所需的核酸序列。寡核苷酸介导的诱变是一种制备这种改变(例如，改变的密码子)的取代、删除或插入的方法，其减弱第二个，通常是最接近的氨基酸的糖基化。例如，通过将编码所需突变的寡核苷酸杂交到单链DNA模板来改变靶向多肽DNA。杂交后，使用DNA聚合酶合成模板的完整第二互补链，其掺入了寡核苷酸引物，并编码变体多肽DNA中选定的改变。在一个实施方案中，遗传工程，例如，基于引物的PCR诱变，足以改变本文所定义的第一个氨基酸，以产生编码多肽的多核苷酸，使得在所述多肽在真核细胞中表达时，将具有无糖基化区，例如，无糖基化的Fc区。如上所述生产的抗体一般包含至少一部分的抗体恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。一般，所述抗体将包含轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包括CH1，铰链，CH2，和CH3区。不过，应当理解本文所述的抗体包括具有全部类型恒定区的抗体，包括IgM，IgG，IgD，和IgE，以及任何同种型，包括IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。在一个实施方案中，使用人同种型IgG1。在另一个实施方案中，使用人同种型IgG4。轻链恒定区可以是λ或κ。人源化的抗体可以包含来自一种以上类型或同种型的序列。抗体能够表达为包含两条轻链和两条重链的四聚体，表达为重链，轻链，表达为Fab，Fab′F(ab′)2，和Fv，或表达为单链抗体(sFv)，其中重链和轻链可变结构域通过间隔区连接。

本文描述了确定包含Fc区的多肽，例如，抗体的效效应物功能的方法，包括基于细胞的桥接(bridging)测定法以确定经修饰的Fc区结合Fc受体能力的变化。可以利用其它的结合测定法来确定Fc区结合补体蛋白，例如，C1q补体蛋白的能力。本领域描述了确定经修饰的Fc区的效应物功能的其它技术。

3.功能性部分以及将这些部分连接到包含Fc的多肽上的化学结构

本发明提供可以作进一步修饰以提供所需效果的抗体和包含Fc的多肽。例如，在优选的实施方案中，将第一个氨基酸修饰成这样的残基，即不仅改变第二位点上多肽的糖基化，还提供所需的侧链化学结构。

在某些优选的实施方案，氨基酸残基的侧链化学结构能够被连接到，例如，共价连接到另外的部分上，即，功能性部分如，诸如阻断性部分，可检测部分，诊断性部分，和/或治疗性部分。下面首先介绍例示性的功能性部分，随后介绍用于将这些功能性部分连接到不同氨基酸侧链化学结构上的有用的化学结构。

3.1功能性部分

有用的功能性部分的例子包括，但不限于，阻断性部分，可检测部分，诊断性部分，和治疗性部分。

例示性的阻断性部分包括足够空间大小和/或电荷的部分，从而发生减弱的糖基化，例如，通过阻抑糖苷酶使多肽糖基化的能力。另外地或备选地，所述阻断性部分可以减弱效应物功能，例如，通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力。优选的阻断性部分包括半胱氨酸加合物和PEG部分。

在优选的实施方案中，阻断性部分是半胱氨酸，优选与游离半胱氨酸关联(associated)的半胱氨酸，例如在包含Fc的多肽的翻译期间或之后，例如，在细胞培养物中。其它的阻断性部分包括胱氨酸，混合的二硫化物加合物，或二硫化物连接。

在另一个优选的实施方案中，阻断性部分是聚乙二醇部分，例如，PEG部分并且优选PEG-顺丁烯二酰亚胺部分。优选的PEG化部分(或相关的聚合物)可以是，例如，聚乙二醇(″PEG″)，聚丙烯二醇(″PPG″)，聚氧乙基化甘油(″POG″)和其它聚氧乙基化多元醇，聚乙烯醇(″PVA)和其它聚烯基氧化物，聚氧乙基化山梨糖醇，或聚氧乙基化葡萄糖。所述聚合物可以是同聚物，随机的或嵌块共聚物，基于以上所列单体的三聚体，直链或分支的，取代的或未取代的，只要它具有至少一个活性磺基部分。聚合部分可以是任何长度或分子量，但这些特征能够影响生物学特性。在药学应用中对于降低清除率特别有用的聚合物平均分子量在2,000到35,000道尔顿的范围内。此外，如果两个基团在每端连接到聚合物上，所述聚合物的长度能够影响两个基团之间的有效距离和其它空间关系。因而，本领域技术能够变化聚合物的长度以优化或赋予所需的生物学活性。由于几种原因，PEG可用于生物学应用。一般PEG干净，无色，无味，可溶于水，对热稳定，对许多化学试剂惰性，不水解，并且无毒。PEG化作用能够通过提高分子的表观分子量来改进分子的药物动力学性能。提高的表观分子量减小在皮下或全身给药后从体内的清除率。在许多情况下，PEG化能够降低抗原性和免疫原性。此外，PEG化能够提高生物学活性分子的溶解性。

PEG化的抗体和抗体片段一般可以用来治疗可以通过给药本文所述的抗体和抗体片段来减轻或调整的疾病。一般PEG化的无糖基化抗体和抗体片段与非PEG化的无糖基化抗体和抗体片段相比具有提高的半寿期。PEG化的无糖基化抗体和抗体片段可以单独使用，一起使用，或与以其它药物组合物联用。

可用于本发明的方法和多肽的可检测部分的例子包括荧光部分，放射性同位素部分，不透射线的部分等等，例如可检测的标记如生物素，荧光团，发色团，自旋共振探针，或放射性标记。例示性的荧光团包括荧光性染料(例如荧光素，罗丹明等等)和其它发冷光的分子(例如鲁米诺(luminal))。荧光团可以是对于环境敏感的，从而如果它位于被修饰蛋白质的一个或多个残基附近则它的荧光改变，所述被修饰蛋白质在结合底物(例如丹磺酰基(dansyl)探针)后发生结构变化。例示性的放射性标记包括包含具有一个或多个低敏感性核(¹³C，¹⁵N，²H，¹²⁵I，¹²³I，⁹⁹Tc，⁴³K，⁵²Fe，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，¹¹¹In等等)的原子的小分子。其它有用的部分是本领域已知的。

可用于本发明的方法和多肽的诊断性部分的例子包括适于揭示疾病或病症存在的可检测部分。一般诊断性部分允许确定分子的存在，缺失，或水平，例如，与疾病或病症相关联的靶肽，蛋白质，或多种蛋白质。这些诊断剂还适于预测和/或诊断疾病或病症及其进程。

可用于本发明的方法和多肽的治疗性部分的例子包括，例如，抗炎剂，抗癌剂，抗神经变性剂，和抗感染剂。所述功能性部分还可以具有一种或多种上述功能。

例示性的治疗剂包括具有高能离子化放射的多放射性核，它能够引发核DNA中多条链断裂，所以适于诱导细胞(例如，癌细胞)死亡。例示性的高能放射性核包括：⁹⁰Y，¹²⁵I，¹³¹I，¹²³I，¹¹¹In，¹⁰⁵Rh，¹⁵³Sm，⁶⁷Cu，⁶⁷Ga，¹⁶⁶Ho，¹⁷⁷Lu，¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。这些同位素一般产生具有短路径长度的高α-或β-粒子。这种放射性核杀死它们靠近的细胞，例如偶联物已附着于其上或进入其中的瘤细胞。它们对于非定位的细胞具有少许或没有影响，并且基本上无免疫原性。

例示性的治疗剂还包括细胞毒性剂如细胞抑制剂(例如烷化剂，DNA合成抑制剂，DNA插入剂或交联剂，或DNA-RNA转录调控剂)，酶抑制剂，基因调控剂，细胞毒核苷，微管蛋白结合剂，激素和激素拮抗剂，抗血管生成剂等等。

例示性的治疗剂还包括烷化剂如蒽环霉素药物家族(例如阿霉素(adriamycin)、洋红霉素(carminomycin)、环孢菌素-A、氯喹(chloroquine)、甲基叶酸(methopterin)、光神霉素(mithramycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、链黑菌素(strentonigrin)、甲基丝裂霉素、蒽二酮(anthracenediones)和氮丙啶(aziridines))。在另一个实施方案中，化疗部分是细胞抑制剂如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的例子包括，但不限于，氨甲蝶呤(methotrexate)和二氯氨甲蝶呤(dichloromethotrexate)，3-氨基-1，2，4-苯并三嗪1，4-二氧化物(3-amino-1，2，4-benzotriazine 1，4-dioxide)，氨基蝶呤(aminopterin)，胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(cytosine β-D-arabinofuranoside)，5-氟-5′-脱氧尿苷(5-fluoro-5′-deoxyuridine)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，)，更昔洛韦(ganciclovir)，羟基脲(hydroxyurea)，放线菌素-D(actinomycin-D)，和丝裂霉素C(mitomycin C)。例示性的DNA插入剂或交联剂包括，但不限于，博来霉素(bleomycin)，卡铂(carboplatin)，卡氮芥(carmustine)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，顺式二氨铂(II)二氯化物(cis-diammineplatinum(II)dichloride)(顺铂(cisplatin))，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，米托蒽醌(mitoxantrone)和奥沙利铂(oxaliplatin)。

例示性的治疗剂还包括转录调控剂如放线菌素D(actinomycin D)，柔红霉素(daunorubicin)，阿霉素(doxorubicin)，高三尖杉酯碱(homoharringtonine)和伊达比星(idarubicin)。可用于本发明的其它例示性细胞抑制剂包括苯醌安莎霉素(ansamycin benzoquinones)，醌型衍生物(quinonoid derivatives)(例如喹诺酮(quinolones)，染料木素(genistein)，bactacyclin)，白消安(busulfan)，异环磷酰胺(ifosfamide)，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，三亚胺醌(triaziquone)，地吖醌(diaziquone)，卡巴醌(carbazilquinone)，indoloquinoneEO9，diaziridinyl-甲基苯醌DZQ(diaziridinyl-benzoquinone methyl DZQ)，三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)，和亚硝基脲化合物(nitrosoureacompounds)(例如卡氮芥(carmustine)，洛莫司汀(lomustine)，司莫司汀(semustine))。

例示性的治疗剂还包括细胞毒性核苷如，例如，腺苷阿拉伯糖苷(adenosine arabinoside)，阿糖胞苷(cytarabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，氟达拉滨(fludarabine)，氟尿苷(floxuridine)，替加氟(florafur)和6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)；微管蛋白结合试剂如紫杉化合物(taxoids)(例如紫杉醇(paclitaxel)，紫杉萜(docetaxel)，紫杉烷(taxane))，噻氨酯哒唑(nocodazole)，根霉素(rhizoxin)，多拉抑放素(dolastatins)(例如多在抑放素(Dolastatin)-10，-11，或-15)，秋水仙素(colchicine)和类秋水仙素(colchicinoid)(例如 ZD6126)，考布他汀(combretastatins)(例如考布他汀 A-4，AVE-6032)，和长春花生物碱(vincaalkaloids)(例如长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，长春地辛(vindesine)，和长春瑞宾(vinorelbine)(navelbine))；抗-血管生成化合物如血管他丁(Angiostatin) K1-3，DL-α-二氟甲基-鸟氨酸(DL-α-difluoromethyl-ornithine)，内皮他丁(endostatin)，烟曲霉素(fumagillin)，染料木素(genistein)，二甲胺四环素(minocycline)，星状孢菌素(staurosporin)，和(±)-沙利度胺(thalidomide)。

例示性的治疗剂还包括激素和激素拮抗剂，如皮质甾类(corticosteroids)(例如强的松(prednisone))，孕酮(progestins)(例如羟孕酮(hydroxyprogesterone)或甲孕酮(medroprogesterone))，雌激素，(例如己烯雌酚(diethylstilbestrol))，抗雌激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen))，雄激素(例如睾丸激素)，芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminogluthetimide))，17-(烯丙基氨基(allylamino))-17-去甲氧基格尔德霉素(demethoxygeldanamycin)，4-氨基1，8-萘二甲酰亚胺(4-amino-1，8-naphthalimide)，芹黄素(apigenin)，布雷菲德菌素A(brefeldin A)，甲腈咪胍(cimetidine)，二氯亚甲基-二磷酸(dichloromethylene-diphosphonic acid)，亮氨脯氨肽(leuprolide)(亮丙瑞林(leuprorelin))，黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone)，pifithrin-α，雷帕霉素(rapamycin)，性激素结合球蛋白(sex hormone-bindingglobulin)，和毒胡萝卜素(thapsigargin)。

例示性的治疗剂还包括酶抑制剂如，S(+)-喜树碱(S(+)-camptothecin)，姜黄素(curcumin)，(-)-鱼藤素(deguelin)，5，6-二氯苯-咪唑1-β-D-核糖呋喃糖苷()5，6-二氯苯(dichlorobenz)-咪唑(imidazole)1-β-D-ribofuranoside，依托泊甙(etoposide)，福美司坦(formestane)，磷曲星(fostriecin)，hispidin，2-亚氨-1-咪唑烷乙酸(2-imino-1-imidazolidineacetic acid)(环肌酸(cyclocreatine))，洛伐他丁(mevinolin)，曲古抑菌素A(trichostatin A)，酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG 34，和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879。

例示性的治疗剂还包括基因调控剂如5-氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-2′-deoxycytidine)，5-氮胞苷(5-azacytidine)，胆钙化甾醇(cholecalciferol)(维生素D3)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，褪黑激素(melatonin)，米非司酮(mifepristone)，雷洛昔芬(raloxifene)，反式视黄醛(trans-retinal)(维生素A醛)，视黄酸(retinoic aci)，维生素A酸(vitamin A acid)，9-顺式视黄酸(9-cis-retinoic acid)，13-顺式视黄酸(13-cis-retinoic acid)，视黄醇(retinol)(维生素A)，他莫昔芬(tamoxifen)，和曲格列酮(troglitazone)。

例示性的治疗剂还包括细胞毒剂如，例如，蝶啶家族的药物(pteridinefamily of drugs)，diynenes，和鬼臼毒素(podophyllotoxins)。这些类型中特别有用的成员包括，例如，甲蝶呤(methopterin)，鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如依托泊甙(etoposide)或依托泊甙磷酸酯(etoposide phosphate)，异长春碱(leurosidine)，长春地辛(vindesine)，环氧长春碱(leurosine)等等。

其它与本文教导相容的细胞毒素还包括auristatins(例如auristatin E和monomethylauristan E)，刺孢霉素(calicheamicin)，短杆菌肽达西(gramicidinD)，美登素类(maytansanoids)(例如美登素)，新制癌菌素(neocarzinostatin)，托泊替康(topotecan)，紫杉烷(taxanes)，细胞分裂抑素B(cytochalasin B)，溴化乙锭(ethidium bromide)，吐根碱(emetine)，替尼泊甙(tenoposide)，秋水仙碱(colchicin)，二羟基(dibydroxy)anthracindione，米托蒽醌(mitoxantrone)，普鲁卡因(procaine)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocain)，心得安(propranolol)，嘌呤霉素(puromycin)，及其类似物或同系物。

其它类型的功能性部分是本领域已知的并且可以基于包含在本文中的教导轻易用于本发明的方法和组合物中。

3.2.用于将功能性部分连接到氨基酸侧链上的化学结构

将前述功能性部分如小分子，核酸，聚合物，肽，蛋白质，化疗剂，或其它类型的分子连接到特定氨基酸侧链上的化学结构是本领域已知的(对于特异性接头的详细综述参见，例如，Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic Press(1996))。

对于巯基部分(例如，半胱氨酸或硫醇基侧链化学结构)的例示性的本领域公认的连接基团包括，但不限于，活化的酰基基团(例如，α-卤代醋酸盐，氯乙酸，或氯乙酰胺(chloroacetamide))，活化的烷基基团，迈克尔接受体(Michael acceptors)如顺丁烯二酰亚胺或丙烯酸基团，通过氧化还原反应与巯基部分反应的基团，和活化的二硫化物基团。巯基部分还可以通过反应连接于溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)，α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸(alpha-bromo-beta-(5-imidazoyl)propionic acid)，氯乙酰磷酸酯(chloroacetylphosphate)，N-烷基顺丁烯二酰亚胺(N-alkylmaleimides)，3-硝基-2-吡啶基二硫化物(3-nitro-2-pyridyl disulfide)，甲基-2-吡啶基二硫化物(methyl-2-pyridyldisulfide)，p-氯汞苯甲酸酯(p-chloromercuribenzoate)，2-氯汞基-4-硝基酚(2-chloromercuri-4-nitrophenol)，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)。

在优选的实施方案中，在产生包含Fc的多肽期间或之后连接半胱氨酸或硫醇基侧链化学结构。例如，当利用细胞培养物生产经修饰的包含Fc的多肽时，提供的条件使得溶液中游离的半胱氨酸能够形成具有包含Fc的多肽的硫醇基侧链的半胱氨酸加合物。这样形成的加合物可以用来抑制糖基化和/或效应物功能，或者，随后置于还原性条件下以除去加合物并由此允许使用前述巯基化学结构的其中一种。

对于羟基部分(例如，丝氨酸，苏氨酸，或酪氨酸侧链化学结构)，例示性的本领域公认的连接基团包括上面对于巯基部分所述的那些，包括活化的酰基基团，活化的烷基基团，和迈克尔接受体。

对于胺基部分(例如，天冬酰胺或精氨酸侧链化学结构)，例示性的本领域公认的连接基团包括，但不限于，N-琥铂酰亚胺基(N-succinimidyl)，N-磺基琥铂酰亚胺基(N-sulfosuccinimidyl)，N-邻苯二甲酰亚胺(N-phthalimidyl)，N-磺基邻苯二甲酰亚胺(N-sulfophthalimidyl)，2-硝基苯基(2-nitrophenyl)，4-硝基苯基(4-nitrophenyl)，2，4-二硝基苯基(2，4-dinitrophenyl)，3-磺酰基-4-硝基苯基(3-sulfonyl-4-nitrophenyl)，3-羰基-4-硝基苯基(3-carboxy-4-nitrophenyl)，亚氨酸酯(imidoester)(例如，甲基甲基吡啶酰亚胺酸(methyl picolinimidate))，磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate)，吡哆醛(pyridoxal)，氯硼氢化物(chloroborohydride)，三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)，O-methyliosurea，和2，4-戊二酮酸盐(2，4-pentanedione)。

对于酸性部分(例如，天冬氨酸或谷氨酸侧链化学结构)，例示性的本领域公认的连接基团包括活化的酯和活化的羰基。酸性部分还可以通过与碳二亚胺(R′N-C-N-R′)(carbodiimides(R′N-C-N-R′))诸如1-环己基-3-[2-吗啉基-(4-乙基)]碳二亚胺(1-cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4-ethyl)]carbodiimide)或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-二甲基苯基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(4-azonia-4，4-dimethylpentyl)carbo diimide)反应而发生选择性修饰。

当所需的功能部分是PEG化部分时，采用本领域已知的PEG化反应或如本文所述的那样(还参见，例如，实施例3)。例如，在一种方法中，通过与反应性聚乙二醇(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰基化反应或烷基化反应实施PEG化作用。进行本发明抗体和抗体片段的PEG化作用的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在另一个实施方案中，进行PEG化作用的聚合物是聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺(即，PEG-顺丁烯二酰亚胺)。

制备本发明的PEG抗体或抗体片段的方法一般将包括步骤a)在使得抗体或抗体片段附于一个或多个PEG基团的条件下，将抗体或抗体片段与聚乙二醇，如PEG的反应性酯类或醛类衍生物反应，和b)获得反应产物。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是基于已知的参数和所需结果来选择优化的反应条件或酰化条件。在一个实施方案中，可以靶向具体氨基酸，例如，改变第一个氨基酸残基以便抑制第二个氨基酸残基的糖基化，优选其中所述第一个氨基酸是半胱氨酸或具有硫醇基化学结构。

4.重组抗体的表达

本发明的经修饰的抗体一般通过重组表达来生产。将编码轻链和重链可变区的核酸，其任选地连接于恒定区，插入到表达载体中。可以将所述轻链和重链克隆入相同或不同的表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接于表达载体中的控制序列，所述控制序列确保了免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括，但不限于，启动子(例如，天然关联的或异源启动子)，信号序列，增强子序列和转录终止序列。优选地，所述表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主保持在适于高水平表达所述核苷酸序列以及收集和纯化交叉反应抗体的条件下。

这些表达载体一般可以在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记(例如，氨苄青霉素抗性，潮霉素抗性，四环素抗性或新霉素抗性)以便允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞(见，例如，Itakura等，美国专利4,704,362).

大肠杆菌(E.coli)是一种对于克隆本发明的多核苷酸(例如，DNA序列)特别有用的原核宿主。其它适合使用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilus，)，和其它的肠杆菌，如沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，以及各种假单胞菌物种(Pseudomonas)。

其它微生物，如酵母，也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)是示范性的酵母宿主，根据需要带有具有表达控制序列(例如，启动子)，复制起点，终止序列等等的合适载体。典型的启动子包括磷酸甘油酯激酶和其它糖分解酶。可诱导的酵母启动子包括来自乙醇脱氢酶，异细胞色素(isocytochrome)C，和负责甲醇，麦芽糖，和半乳糖利用的酶的启动子等。

除微生物外，哺乳动物组织培养物也可用来表达和产生本发明的多肽(例如，编码免疫球蛋白或其片段)。见Winnacker，From Genes to Clones，VCHPublishers，N.Y.，N.Y.(1987)。实际上，优选真核细胞，因为现有技术已开发许多能分泌异源蛋白质(例如，完整免疫球蛋白)的合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞，293细胞，骨髓瘤细胞系，转化的B细胞和杂交瘤。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89，46-68(1986)，和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。优选的表达控制序列是源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等等的启动子。参见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

或者，抗体编码序列可掺入到转基因中，用于导入转基因动物基因组并随后在转基因动物乳汁中表达(参见，例如Deboer等，US5,741,957，Rosen，US5,304,489，和Meade等，US5,849,992)。合适的转基因包括与哺乳动物乳腺特异基因，例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻链和重链的编码序列。

含有目的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达调控序列)的载体可依据细胞宿主的类型通过公知的方法被转到宿主中。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪(biolistics)和基于病毒的转染可用于其它细胞宿主。(通常参见Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第2版，1989)。用于转化哺乳动物的其它方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔以及显微注射(通常参见，Sambrook等，同上)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射入受精卵细胞，或可以掺入胚胎干细胞的基因组中，以及将这些细胞的核转入去核卵母细胞中。

本发明的抗体可以利用单一的载体或两种载体进行表达。当抗体重链和轻链被克隆在分离的表达载体上时，将所述载体共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和装配。一旦表达后，可以根据本领域的标准方法对本发明的抗体，其二聚体，各个轻链和重链，或其它免疫球蛋白形式进行纯化，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，HPLC纯化，凝胶电泳等等(通常参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于药学用途，优选具有至少大约90-95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白，最优选具有98-99％或更大的同质性的基本上纯的免疫球蛋白。

5.预防，诊断和治疗方法

本发明还涉及适用于与免疫病症相关联疾病的预防，诊断或治疗的无糖基化抗体的制备等，所述免疫病症包括例如，希望利用治疗性抗体结合抗原但避免促发效应物功能的病症。

因此，在某些实施方案中，本发明的无糖基化的抗体或抗原-结合片段可用于预防或治疗免疫病症包括，例如，肾小球肾炎(glomerulonephritis)、硬皮病、肝硬化、多发性硬化、狼疮肾炎、动脉粥样硬化、炎性肠疾病或类风湿性关节炎{glomerulonephritis，scleroderma，cirrhosis，multiple sclerosis，lupus nephritis，atherosclerosis，inflammatory bowel diseases or rheumatoidarthritis}。在另一个实施方案中，可以利用本发明的抗体或抗原-结合片段治疗或预防炎性病症，包括，但不限于，Alzheimer病(Alzheimer′s)、重度哮喘(severe asthma)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、恶病质(cachexia)、CHF-缺血(CHF-ischemia)、冠状动脉再狭窄(coronary restinosis)、克隆氏病(Crohn′sdisease)、糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)、淋巴瘤(lymphoma)、牛皮癣(psoriasis)、纤维变性/辐射诱导型(fibrosis/radiation-induced)、幼年型关节炎(juvenile arthritis)、中风(stroke)、由外伤引发的脑或中枢神经系统的炎症(inflammation of the brain or central nervous system caused by trauma)，和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)。

可以用本发明的无糖基化的抗体或抗原-结合片段预防或治疗的其它炎性病症包括由于角膜移植、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、多发性骨髓瘤，和骨关节炎而产生的炎症。

在另一个实施方案中，可以利用本发明的抗体或包含Fc的片段来预防或治疗瘤形成，包括，但不限于膀胱癌、乳癌、头和颈癌、卡波西肉瘤、黑素瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、胃癌、白血病/淋巴瘤，和多发性骨髓瘤。另外的瘤形成疾病包括，宫颈癌、结肠-直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、非鳞状细胞肺癌，和前列腺癌。

在另一个实施方案中，可以用本发明的抗体或抗原-结合片段预防或治疗神经变性性病症，包括，但不限于Alzheimer病，中风，和脑外伤或中枢神经系统损伤。另外的神经变性性病症包括ALS/运动神经元疾病，糖尿病性外周神经病，糖尿病性视网膜病，享廷顿(Huntingto)舞蹈病，黄斑变性(macular degeneration)，和帕金森氏症(Parkinson′s disease)。

还在另一种实施方案中，可以利用本发明的抗体或包含Fc的片段来预防或治疗由病原体，例如病毒，原核生物或真核生物引发的感染。

在临床应用中，受试者通过显示疾病或病症的至少一种体征或症状而被鉴定为已患或可能患上述疾病的其中一种。将至少一种本发明的抗体或其抗原结合片段或包含至少一种本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物以足够的量进行给药以治疗疾病或病症的至少一种症状，例如，如上所述的疾病或病症。在一个实施方案中，受试者被鉴定为显示与有害的CD154活性相关联的疾病或病症的至少一种体征或症状(还称为CD40配体或CD40L；见，例如，Yamada 等，Transplantation，73：S36-9(2002)；Schonbeck等，Cell.Mol.Life Sci.58：4-43(2001)；Kirk等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Sci.356：691-702(2001)；Fiumara等，Br.J.Haematol.113：265-74(2001)；和Biancone等，Int.J.Mol.Med.3(4)：343-53(1999))。

因此，本发明的无糖基化抗体适于在受试者中产生有益治疗反应的条件下作为治疗性免疫学药剂向受试者给药，例如，作为适于预防或治疗诸如本文所述的疾病或病症的药剂给药受试者。

本发明的治疗剂一般是基本上纯的，不含不希望的污染物。这意味着药剂一般是至少大约50％w/w(重量/重量)纯度，以及基本上不含干扰性蛋白质和污染物。有时所述药剂是至少大约80％w/w，并且更加优选地，至少90或大约95％w/w纯度。不过，利用传统的蛋白质纯化技术，例如本文所述的技术，可以获得至少99％w/w的同质多肽。

所述方法可以用于无症状的受试者和那些目前显示疾病症状的人。用于这些方法中的抗体可以是人抗体，人源化的抗体，嵌合的抗体或非人抗体，或其片段(例如，抗原结合片段)并且可以是单克隆的或多克隆的。

在另一方面，本发明的特征是将抗体与药物载体一起作为药物组合物进行给药。或者，可以通过施用编码至少一种抗体链的多核苷酸来向受试者施用所述抗体。在受试者中表达所述多核苷酸以产生抗体链。任选地，所述多核苷酸编码所述抗体的重链和轻链。在受试者中表达所述多核苷酸以产生重链和轻链。在例示性的实施方案中，监测受试者血液中所施用的抗体的水平。

因而本发明满足了对于预防或改善免疫疾病，例如CD154-关联的免疫疾病的治疗方案的长期需求。

还应理解本发明的抗体适于诊断或研究应用，具体是，包含基于细胞的测定法的诊断或研究应用，其中希望有减弱的效应物功能。

6.检测无糖基化抗体效力的动物模型

可以将本发明的抗体向需要例如无糖基化抗体疗法的非人动物给药，其用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型，所述人类疾病例如，上述的免疫疾病或病症。关于后者，这些动物模型可以用来评估本发明抗体的治疗效力(例如，测试效应物功能，剂量，和给药的时程)。

可以用来评估本发明的抗体或抗原结合片段预防或治疗类风湿性关节炎(RA)的治疗效力的动物模型的例子包括佐剂诱导的RA，胶原诱导的RA，和胶原mAb-诱导的RA(Holmdahl等，(2001)Immunol.Rev.184：184；Holmdahl等，(2002)Ageing Res.Rev.1：135；Van den Berg(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：232)。

可以用来评估本发明的抗体或抗原结合片段预防或治疗炎性肠疾病(IBD)的治疗效力的动物模型的例子包括TNBS-诱导的IBD，DSS-诱导的IBD，和(Padol等.(2000)Eur.J Gastrolenterol.Hepatol.12：257；Murthy等.(1993)Dig.Dis.Sci.38：1722)。

可以用来评估本发明的抗体或抗原结合片段预防或治疗肾小球肾炎的治疗效力的动物模型的例子包括抗-GBM-诱导的肾小球肾炎(Wada等.(1996)Kidney Int.49：761-767)和抗-thy1-诱导的肾小球肾炎(Schneider等.(1999)Kidney Int.56：135-144)。

可以用来评估本发明的抗体或抗原结合片段预防或治疗多发性硬化症的治疗效力的动物模型的例子包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(linkand Xiao(2001)Immunol.Rev.184：117-128)。

动物模型还可以用来评估本发明的抗体或抗原结合片段预防或治疗CD154-相关的疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)的治疗效力，所述治疗例如使用MRL-Fas^lpr小鼠(Schneider，同上；Tesch等.(1999)J.Exp.Med.190)。

7.治疗方案和剂量

在预防性应用中，以足以消除或减少危险，减轻严重性，或延迟病症开始，包括病症的生化、组织学和/或行为学症状，其在病症发展过程中呈现的并发症和中间病理表型的量，向患有病症的受试者给药药物组合物或药剂，所述病症可以用具有Fc区的多肽治疗，例如免疫系统病症。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分地阻滞所述病症的症状(生化的，组织学的和/或行为学的症状)，包括它的并发症和病症发展中的中间病理表型的量，向可疑患有或已经患有这样一种病症的受试者给药组合物或药剂。本发明的多肽对于调节存在于血液中的细胞表面抗原的生物学活性特别有用，其中被治疗或预防的疾病至少部分地由异常高的或低的抗原生物学活性所引发。

在一些方法中，施用药剂减弱或消除了免疫病症例如炎症，诸如与CD154活性关联的疾病。将足以实现治疗性或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，通常以数个剂量施用药剂直到达到充分的免疫反应。

用于治疗上述病症的本发明组合物的有效剂量依赖于许多不同因素而变化，包括给药方法，靶位点，受试者的生理状态，受试者是人或动物，给药的其它药剂，以及治疗是预防性的或治疗性的。通常，受试者是人但非人动物包括转基因动物也可以进行治疗。

为了用抗体进行被动免疫，剂量从大约0.0001到100mg/kg宿主体重，更通常是0.01-20mg/kg的宿主体重。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围之内，优选至少1mg/kg。受试者可以每天，或每隔一天(alternative days)，每周一次或根据任何由经验分析确定的其它时间表给药这样的剂量。例示性的治疗使人在长时期例如至少六个月内接受多次剂量的给药。另外的例示性治疗方案使人每两周一次或每月一次或每3-6个月一次接受给药。例示性的剂量时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，每隔一天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时给药两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下每种给药的抗体剂量都落在指定的范围之内。

抗体通常在多种时机下给药。在单次剂量之间的间隔可以为周，月或年。在一些方法中，对剂量进行调节以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度而在一些方法中为25-300μg/ml。或者，抗体可以作为持续释放剂型给药，在这种情况下需要较少的给药频率。剂量和频率根据抗体在受试者中的半寿期而变化。通常，人抗体显示最长的半寿期，其后是人源化的抗体，嵌合抗体和非人抗体。

给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的或治疗性的而变化。在预防性的应用中，向尚未处于疾病状态的受试者给药包含本发明抗体或其混合物的组合物以增强受试者的抵抗力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在这种情况下，精确的量再次依赖于受试者的健康状态和一般免疫性，但通常其范围是从0.1到25mg/每剂，具体是0.5-2.5mg/每剂。于相对不频繁的间隔在长期内给药相对低的剂量。一些受试者在他们的余生继续接受治疗。

在治疗性应用中，有时需要于以相对短的间隔给予相对高的剂量(例如，从大约1到200mg的抗体每剂，更加普遍使用的是从5到25mg的剂量)直到疾病的进程得以减弱或终止，优选直到受试者显示部分或完全的疾病症状的改善。其后，可以向患者施用预防性方案。

编码抗体的核酸的剂量范围是从大约10ng到1g，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μg DNA/受试者。感染性病毒载体的剂量可为10到100，或更多病毒粒子每剂。

治疗剂可以通过经肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹腔内、鼻内或肌内的方法进行预防性和/或治疗性治疗。蛋白质药物最常见的给药途径是经血管内，皮下或肌内，但其它途径也可以有效。在一些方法中，将药剂直接注射入已经积聚了沉淀物的特定组织中，例如，颅内注射。在一些方法中，将抗体作为持续释放组合物或通过装置，如Medipad^TM装置进行给药。蛋白质药物还可以通过呼吸道，例如，利用干粉吸入装置进行给药。

任选地本发明的药剂可以联用其它在免疫病症治疗中至少部分有效的药剂进行给药。

8药物组合物

本发明的药物组合物包括至少一种在可药用载体中的本发明的无糖基化抗体或抗体片段。“可药用载体”指药物制品的至少一种组分，其在正常情况下用于活性成分的施用。由此，载体可以包含任何本领域所用的药物赋形剂和任何形式的给药媒介物(rehicle)。所述组合物可以是，例如，可注射的溶液，水性悬浮液或溶液，非水性的悬浮液或溶液，固体和液体口服剂型，软膏(salve)，凝胶，油膏，真皮内贴剂，乳膏，洗剂，片剂，胶囊，持续释放剂型等等。另外的赋形剂可以包括，例如，着色剂，遮味剂，溶解性辅助剂，悬浮剂，压缩剂，肠包衣，持续释放辅助剂等等。

本发明的药剂经常作为包含活性治疗剂以及多种其它可药用组分的药物组合物进行给药。见Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))。优选的形式依赖于意欲的给药模式和治疗性应用。根据所需剂型，所述组合物还可以包括，可药用的，无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的例子是蒸馏水，生理性磷酸盐缓冲的盐溶液，林格氏溶液，葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，所述药物组合物或制剂还可以包括其它载体，佐剂，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等等。

抗体能够以储存注射物或植入制品的形式给药，其能够以允许活性成分持续释放的方式进行制剂。例示性的组合物包含5mg/mL的单克隆抗体，在由50mM L-组氨酸，150mM NaCl组成的水性缓冲液中配制，用HCl调节到pH 6.0。

一般，将组合物制备成可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适于注射前溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。如上面所讨论的(见Langer，Science 249：1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews28：97(1997))，所述制品还可以进行乳化或在脂质体或微粒如聚丙交酯，聚乙交酯，或共聚物中形成包囊化以增强佐剂作用。

9.监测治疗过程

利用标准方法可以监测患疾病或病症，诸如免疫病症的受试者的治疗。一些方法使得需要确定基线值，例如，给药药剂之前受试者中的抗体水平或曲线，并且将其与治疗后的曲线或水平值相比较。所述水平或曲线值的显著提高(即，大于在相同样品重复测定中实验性误差的一般界限，表示为二次测定在其后不久进行以确定峰值抗体水平，间隔进行一次或多次另外的测量以监测抗体水平的衰减。当抗体水平降低到基线或预定的峰值减基线百分比(perceatage of the peak less baeline)时(例如，50％，25％或10％)，另外施用一定剂量的抗体。在一些方法中，将峰值或随后测定的水平减去背景的值与早先确定的对照水平相比较，所述对照水平测定为在其它受试者中构成有利的预防性或治疗性治疗方案。如果测定的抗体水平显著小于参照水平(即，小于平均值减去获益于所述治疗的受试者群体中的参照值的一个标准偏差)，则指示施用额外剂量的抗体。

其它的方法包括在治疗期内监测任何本领域公认的生理学症状(例如，身体或精神症状)，所述监测常规地依赖于研究者或医师来诊断或监测病症。

下列实施例是为了例证的目的而包括进来的并且不应视为限制本发明。

实施例

在全部实施例中，使用下列的材料和方法，除非另外规定。

材料和方法

一般，除非另外规定，本发明的实施采用化学，分子生物学，重组DNA技术，免疫学(特别是，例如，抗体技术)的传统技术，和标准的电泳技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods inMolecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：APractical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，IrlPr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel 等，JohnWiley&Sons(1992)。

经修饰抗体的生产

为了生产本发明的经修饰的抗体，将编码模式人抗体(hu5c8)，其变异抗这些测量平均值的标准偏差)表明阳性的治疗结果(即，药剂的施用达到了希望的反应)。如果免疫反应值没有明显改变，或降低了，则表明为阴性的治疗结果。

在其它方法中，确定对照群体的水平或曲线(profile)的对照值(即，平均值和标准偏差)。一般对照群体中的个体未接受过在先的治疗。将施用一种治疗剂后受试者中的水平或曲线的测定值与对照值相比较。相对于对照值的显著提高(即，大于自平均值的一个标准偏差)表明阳性的或充分的治疗结果。没有明显的信号提高或出现降低表明阴性的或不充分的治疗结果。一般继续药剂的施用同时所述水平相对于对照值提高。如以前一样，相对于对照值的平台期的达到是可以停止施用治疗或减少剂量和/或频率的指征。

在其它的方法中，所述水平或曲线的对照值(即，平均和标准偏差)自对照群体确定，所述对照群体是已经用治疗剂进行过治疗并且其水平或曲线反应于治疗而出现平台期的个体的群体。将受试者中的水平或曲线的测定值与对照值相比较。如果受试者中的测量值与对照值没有显著差异(例如，大于一个标准偏差)，则能够停止治疗。如果受试者中的水平显著低于对照值，则证明需要继续施用药剂。如果受试者中的水平持续低于对照值，那么可能指示治疗的变化。

在其它方法中，监测目前没有接受治疗但曾经经历过早先疗程的受试者的抗体水平或曲线以确定是否需要恢复治疗。可以将受试者中的测定的水平或曲线与于早先的疗程之后在受体者体内获得的值相比较。相对于早先测定值的显著降低(即大于在相同样品的重复测定中误差的一般界限)是可以恢复治疗的指示。或者，可以将在受试者中测定的值与经历过治疗过程之后在受试者群体中确定的对照值(平均值加标准偏差)相比。或者，可以将受试者中的测量值与保持无疾病症状的经预防性治疗的受试者群体中的对照值，或显示疾病特征改善的经治疗性治疗的受试者群体中的对照值相比较。在所有这些情况中，相对于对照水平的显著降低(即，大于标准偏差)都是在受试者中应当恢复治疗的指征。

给药后抗体曲线一般显示紧接的抗体浓度峰值，接着是指数衰减。没有另外的剂量，根据给药的抗体的半寿期，所述衰减在几天到几个月的时间内接近治疗前水平。例如一些人抗体的半寿期是20天的数量级。

在一些方法中，在给药前在受试者中测定给定抗原的抗体的基线，第体，或相应的Fc区的多核苷酸导入标准的表达载体中。人抗体hu5c8及其变体在，例如，美国专利号5,474,771和6,331,615中进行过描述，在序列表中分别提供了hu5c8 IgG1重链(SEQ ID NOS：1-2)，hu5c8轻链(SEQ IDNOS：3-4)，hu5c8IgG1 Fc区(SEQ ID NOS：5-6)，hu5C8IgG4重链(SEQ IDNOS：7-8)，hu5c8IgG4变体(S228P)(SEQ ID NOS：9-10)，和hu5c8IgG4变体(S228P/T299A)(SEQ ID NOS：11-12)的cDNA序列和氨基酸序列。随后利用大规模瞬时转染技术将载体导入EBNA 293细胞中。利用标准培养基和温育条件培养经转染的293细胞。一般在转染后1天重饲细胞并且随后让其表达和分泌重组蛋白1-3天。随后收集含有分泌的重组抗体或Fc区的培养基进行纯化。

经修饰抗体的纯化

为了进行抗体纯化，从细胞培养基中收集真核细胞中产生的重组无糖基化抗体并实施下列层析技术。具体地，制备重组蛋白A柱(5mL)并用100mL 0.1N NaOH洗涤并且随后用PBS进行平衡直到中和。随后以10mL/min穿过柱抽吸条件培养基(～1.5L)。加样后，用100mL 3X PBS并且随后用10mL 1X PBS洗涤柱。用1.3mL含100mM NaH₂PO₄，pH 2.8的级分将抗体洗脱入包含0.3mL 1M HEPES，pH 8的收集管中进行紧接着的中和化。通过利用每种级分1∶10的稀释液的光吸收度(A280)监测浓度来鉴定含有洗脱的抗体的级分。将这一纯化步骤按比例增加或减少至所述瞬时转染的规模。

通过在1.6mL Poros HS柱上的层析进一步纯化得到的蛋白质A合并物。用25mM NaAc，pH 4.5将重组蛋白合并物(～8mL)稀释十倍，并将一半加样于两个利用BioCad HPLC的纯化过程(runs)的每一个中。以5mL/min的流速加样蛋白质，用10倍柱体积的稀释缓冲液洗涤柱并且随后用25倍柱体积的0-1M NaCl梯度稀释缓冲液进行洗脱。收集0.8mL的级分并通过光吸收度(A280)监测蛋白质浓度。

或者，通过蛋白L层析法纯化由小规模制备得到的蛋白质A合并物。制备蛋白L柱(1mL)并用10mL 0.1N NaOH洗涤并且随后用PBS进行平衡直到中和。中和的蛋白质A合并物(3mL)随后加样在1mL等份试样中。加样后，用10mL 3X PBS并且随后用10mL 1X PBS洗涤柱。用0.4mL含100mM NaH₂PO₄，pH 2.8的级分将抗体洗脱入包含0.1mL 1M HEPES，pH8的收集管中进行紧接着的中和。通过利用每种级分1∶5稀释液的光吸收度(A280)监测浓度来鉴定含有洗脱抗体的级分。

除了光吸收度以外，还用折光率检测器(Waters)和Precision DetectorPD2020光散射仪监测含有重组蛋白的洗脱液。用Precision Detector软件计算分子量。全部变异抗体(hu5c8的四种形式)相同地从SEC柱上洗脱，显示具有最小量更高分子量物质(二聚体)的单一主峰。对于T299C hu5c8变体的主峰通过光散射确定了148,300的分子量。以与全长抗体相同的方式对于huIgG1 Fc变体实施了大小排阻层析。全部四种Fc蛋白相同地进行，给出具有从53,000到55,000道尔顿范围的计算分子量的主峰。最后，获得重组蛋白样品，相对于PBS进行透析，无菌过滤，并在10mg等份中保存于4C直到需要作进一步分析。

SDS-PAGE

为了进行SDS-PAGE，一般将蛋白质样品在Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液中稀释至200μg/mL，所述缓冲液对于还原性条件含有25mM DTT，或对于非还原性条件含有25mM NEM。将2.5和10μl的等分试样加样于4-20％梯度凝胶上。

质谱分析

为了进行质谱分析，在分析前将蛋白质样品在9mM DTT中，于pH7.8进行还原。将样品在C4 guard柱上脱盐并利用三重四极(triprequadrupole)仪器通过ESMS进行在线分析。通过MaxEnt程序将原始数据去褶合(deconvoluted)以生成零带电质谱(zero charged mass spectra)。这一过程允许多个带电信号折迭入一个峰中进行分子质量测定。

PEG化

为了进行本发明的无糖基化多肽的PEG化，首先用1mL乙醇将50μL等份的0.94mg/mL T299A和T299C变体Fc溶液于-20℃过夜沉淀。随后将得到的沉淀物制粒并除去乙醇，加入50μL的6.4M尿素，2％SDS和10mM EDTA溶液，pH8，并将溶液加热到100℃5min。为了进行还原，将一半样品用4mM TCEP于室温处理30min。加入5μL等份的pH 6.5的1M MES缓冲液，随后加入50μLH₂O或5mM的PEG(5K)-顺丁烯二酰亚胺溶液。室温30分钟后，将10μL等份的Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液的4X溶液加入30μL反应混合物中，并将溶液加热到100℃持续5min。随后将5和15μL等份的重组蛋白加样到4-20％梯度凝胶上以测定发生的PEG化的相对量。

实施例1：产生和定性无糖基化抗体的方法

下列实施例描述在真核细胞中产生无糖基化抗体和所得抗体的定性。

将编码具有对CD154配体结合亲和力的IgG1亚型的模式人抗体(hu5c8)的核酸进行遗传工程改造以便具有几种改变的其中一种。第一种改变包含编码用于取代野生型氨基酸残基(即299位的苏氨酸)的丙氨酸的密码子(T299A)。在另一种改变中，将编码299位苏氨酸的密码子改变为编码半胱氨酸(T299A)。还包括一种对照改变，其中糖基化的特定天冬酰胺被突变(N297Q)(图3，5-7)。此外，将T299A突变引入IgG4亚型的模式人抗体hu5C8中。所述IgG4序列在铰链肽中具有另外的修饰(S228P)以便稳定链间二硫化物，这与非糖基修饰不相关(图4)。将每种改变并入表达载体中并利用本文所述的方法导入真核细胞系。此外，还在与相应可变区不相连的Fc区背景中测试前述改变。随后将每种修饰的抗体，或其Fc片段，与相应的对照抗体或抗体片段一起在细胞培养物中表达，从细胞培养基中收集，并利用标准技术纯化。随后对每种抗体或抗体片段的糖基化和结合活性进行定性。

利用标准凝胶电泳和层析技术对每种抗体或抗体片段的糖基化进行定性。具体地，在天然条件下进行还原性和非还原性SDS-PAGE和大小排阻层析，并且显示受试抗体(hu5c8)的T299A和T299C变体及其片段，即huIgG1 Fc，具有预期的分子大小和亚基组成。所述蛋白质的重链在还原性SDS-PAGE上更加快速的迁移，表明T299A和T299C抗体变体不存在糖基化(图3)。此外，在还原性条件下的质谱分析确认了所述构建体的预期分子量以及在T299A和T299C变体中聚糖的缺失(图8-11)。在非还原性条件下的质谱分析表明在huIgG1 T299C Fc变体上存在半胱氨酸加合物(图8-11)。

T299A变体的分子对应于预测的蛋白质二聚体(预期的，51,824.7，发现的，51,826)。相反T299C变体的质量比预期的大246道尔顿(预期的为51,886，发现的为52,132)(图3)。这将对应于两个半胱氨酸加合物添加到Fc二聚体上(2×120＝240)(图5)。

因此，据推断最接近糖基化基序的第一个氨基酸的改变抑制第二个氨基酸残基上抗体的糖基化，由此提供一种在真核细胞中生产无糖基化抗体的有效的且可靠的方法。

实施例2：利用具有足够空间大小和/或电荷的氨基酸进行取代生产无糖基化抗体的方法

下列实施例描述了通过用具有足够空间大小和/或电荷的残基改变抗体的第一个氨基酸残基来生产无糖基化的抗体。

将编码候选抗体，例如IgG1或IgG4亚型的抗体的核酸，进行遗传工程化改造以便具有几种被预测可抑制糖基化和/或效应物功能的改变中的一种。尽管不希望被理论所束缚，上面对于半胱氨酸加合物获得的结果支持这样一种理论，即足够大的和/或带电的残基将抑制糖苷酶对包含Fc的多肽的糖基化并减弱不需要的效应物功能。例如，也预测用大的或带电的残基在Kabat位置299(例如，T299)上进行取代可调节抗体结合Fc受体。在抗体Fc区和Fc受体例如FcγIIIb受体之间的结合复合物中，抗体Fc区的残基与FcγIIIb受体的结合界面极为接近。具体地，T299残基的侧链化学结构与FcγIIIb受体的Y150和H152残基的距离分别是4.2和5.6。因而，通过将T299取代为具有足够空间大小的残基如F，H，Q，W或Y，由于不利的空间相互作用，抗体将不仅被去糖基化还具有减弱的与Fc受体的结合亲和力。

另外，通过用带电侧链化学结构诸如D，E，K，或R取代T299可以调节对糖基化的抑制和Fc结合。由于不利的空间相互作用，得到的抗体变体将不仅具有减弱的糖基化还具有减弱的与Fc受体的结合亲和力。

因此，预测将第一个氨基酸残基侧链化学结构修饰为具有足够空间大小和/或电荷的侧链化学结构可抑制抗体在第二个氨基酸残基的糖基化以及减弱Fc与Fc受体的结合。因而，本发明提供一种在真核细胞中产生具有减弱的效应物功能的无糖基化抗体的有效的和可靠的方法。

实施例3：将无糖基化的抗体PEG化的方法

下列实施例描述了在真核细胞中产生无糖基化抗体和将得到的抗体PEG化的方法。

具体地，确定T299C抗体变体被确定为在非变性条件下用PEG-顺丁烯二酰亚胺进行特异性修饰，这通过首先用TCEP还原蛋白质以去除半胱氨酸加合物，通过将蛋白质透析几天允许铰链二硫化物重新形成，以及与PEG-顺丁烯二酰亚胺反应来进行。T299A抗体变体不能在这些条件下进行修饰(图6)。

简言之，为了还原受试蛋白质，用4μL的500mM EDTA，pH 8(最终浓度10mM)和10μL的100mM TCEP(最终浓度5mM)于室温处理200μL0.94mg/mL T299A和T299C Fc抗体变体制品3小时。用PBS透析还原的蛋白质四天，以1∶1000体积比换液五次。随后在非变性条件下用5μL 5mMPEG-顺丁烯二酰亚胺(5,000mw)处理等份(5μL)的蛋白质制品的，加入包含100mM DTT的5μL 4X Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液，准备进行SDS-PAGE。只有观察到T299C抗体变体具有PEG加合物(图7)。

通过试图将Fc与巯醇基特异性修饰试剂PEG-顺丁烯二酰亚胺反应获得T299C半胱氨酸已经形成胱氨酸二硫键的确证事实。在变性(6.4M尿素，2％SDS)，但非还原性条件下，与PEG-顺丁烯二酰亚胺没有发生反应。在还原性条件下T299C变体确实与PEG-顺丁烯二酰亚胺反应，产生比T299A变体更大的产物，表明存在额外的半胱氨酸(图3)。

因此，据推断，当改变为半胱氨酸残基时，最接近糖基化基序的第一个氨基酸的改变能够抑制抗体在第二个氨基酸残基的糖基化，还提供有效和可靠的PEG化作用残基。

实施例4：确定无糖基化抗体的改变的效应物功能的方法

下列实施例描述了确定本发明的无糖基化抗体的改变的效应物功能的测定法。

本发明的无糖基化变异抗体的效应物功能的特征是它们结合抗原还有结合Fc受体或补体分子如C 1q的能力。具体地，用基于抗体形成CD154抗原和具有Fc受体的细胞之间的“桥”的能力的测定法来测定FcγR结合亲和力。基于抗体形成CD154抗原和C1q之间的“桥”的能力来测定C1q结合亲和力(图14-15)。

简言之，通过用重组的可溶性人CD154配体涂布96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)(即，以1μg/ml的浓度在PBS中于4℃过夜；Karpusas，Hsu等1995)进行FcγR桥接(bridging)物测定。随后，抗CD154抗体(hu5c8)的糖基化或无糖基化形式的滴定于37℃结合到CD 15430分钟，随后洗涤板，并测定荧光标记的U937(CD64⁺)细胞的结合。将U937细胞生长于具有10％FBS，10mM HEPES，L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素的RPMI培养基中，以1∶2分裂，并在测定前用1000单位/ml的IFNγ活化一天以增强Fc受体(FcγRI)的表达。

在该测定法的另一种变化形式中，利用上面的桥接测定法，相对于用CD16表达构建体转染的荧光标记的人T细胞(Jurkat细胞)，测定本发明抗体结合，或更确切地，不能结合另一种Fc受体(具体为FcγRIII(CD16))的能力。所述配体由生长在96孔组织培养板(Corning Life Sciences Acton，MA，USA)中的单层表达CD154的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生。以1×10⁵细胞/ml将CHO-CD154⁺细胞接种到96板中，并在具有10％经透析的FBS，100nM氨甲蝶呤，L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素(Gibco-BRL Rockville，MD，USA)的α^-MEM中生长至满底。CD16⁺Jurkat细胞生长于具有10％FBS，400μg/ml遗传霉素(Geneticin)10mM HEPES，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素(Gibco-BRL)的RPMI中，并在实施测定的前一天以1∶2分裂。

在两种受体的测定中，将具有Fc受体的细胞用2’，7’-二-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酸甲基酯(BCECF-AM)(Molecular Probes Eugene，OR，USA)于37℃标记20分钟。在洗涤去除多余的标记后，在测定法中将1×10⁵个标记的细胞于37℃温育30分钟。通过洗涤几次去除未结合的FcγR阳性细胞并在微量板读取器(Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader，Millipore Corporation Bedford，MA，USA)上、于485nm的激发波长和530nm的发射波长读板。

在每次桥接测定法中，都观察到本发明的无糖基化IgG1抗体变体的减弱的效应物功能，其作为FcγRI(上图)或FcγRIII(下图)结合的函数(图12-13)。具体地，观察到被去糖基化并且能够形成半胱氨酸加合物的T299C变体与只被去糖基化的抗体相比具有更小的效应物功能(FcγRI结合)(图12上图)。还发现非糖基IgG4 T299A抗体变体与FcRγI结合特别低，比IgG1T299A变体更低。这是未预料到的，因为糖基化的IgG1和IgG4抗体在这种测定法中显示类似的结合(图13)。

通过用PBS中的50μl 10μg/ml的重组可溶性人CD154配体(Karpusaset al.Structure，15；3(12)：1426(1995)于4℃涂布96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)来进行C1q结合测定。抽吸所述孔并用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)洗涤三次，用200μl/孔的封闭/稀释缓冲液(0.1M Na₂HPO₄，pH 7，0.1M NaCl，0.05％Tween 20，0.1％白明胶)封闭≥1h。将待测试的抗体稀释于封闭/稀释缓冲液中，以15μg/ml 3倍稀释液开始。每孔加入50μl，并将板于室温温育2h。如上进行抽吸和洗涤之后，以50μl/孔加入稀释于封闭/稀释缓冲液中的2μg/ml Sigma人C1q(C0660)并于室

温温育1.5h。如上进行抽吸和洗涤之后，加入于封闭/稀释缓冲液中稀释3,560倍的50μl/孔的羊抗C1q(Serotec AHP033)。于室温温育1h后，如上对孔进行抽吸和洗涤。随后加入在封闭/稀释液中稀释到1∶10,000的50μl/孔的驴抗羊IgG HRP偶联物(Jackson ImmunoResearch 713-035-147)，并将所述孔于室温温育1h。如上进行抽吸和洗涤之后，加入100μl TMB底物(420μM TMB，0.004％H₂O₂，于0.1M醋酸钠/柠檬酸缓冲液中，pH 4.9)，并在用100μl 2N硫酸停止反应之前温育2分钟。用Softmax PRO仪器于450nm读取吸光度，并使用Softmax软件利用4-参数拟合确定相对结合亲和力(C值)。

如图14-15中所示，T299C突变体具有C1q结合亲和力，其不仅低于hu5c8抗体还低于无糖基化N297Q和T299A变体的亲和力，这表明对半胱氨酸的突变是出乎意料地有利的。与无糖基化的IgG4类似，IgG4T299A突变体不显示与C1q的结合。

因此，据推断最接近糖基化基序的第一个氨基酸的改变能够抑制抗体在第二个氨基酸残基的糖基化，并且当第一个氨基酸为半胱氨酸残基时，所述抗体具有弱的效应物功能。此外，IgG4亚型的抗体的糖基化的抑制对FcγRI结合影响比预期的更深刻。

等同方案

对于本领域的技术人员而言，只是利用常规的实验，就有许多本文所述的本发明的具体实施方案的等同方案。意欲通过下列权利要求书包括这些等同方案。

序列表

<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.，et al.)

<120>具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法

<130>BGNA190PC

<160>12

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1404

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag caccaggtgc ccactcccag 60

gtccaactgg tgcagtcagg ggctgaagtg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacat cttcaccagt tattatatgt actgggtgaa gcaggcgccc 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca atggtgatac taacttcaat 240

gagaagttca agagtaaggc cacactgact gtagacaaat ccgccagcac agcatacatg 300

gagctcagca gcctgaggtc tgaggacact gcggtctatt actgtacaag atcggacggt 360

agaaatgata tggactcctg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720

gacaagactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 1260

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380

ctctccctgt ctcccgggaa atga 1404

<210>2

<211>467

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210>3

<211>717

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtac tgacacagtc tcctgctacc ttatctgtat ctccgggaga gagggccacc 120

atctcatgca gggccagcca acgtgtcagt tcatctacct atagttatat gcactggtac 180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggactg acttcaccct caccatctct 300

tctgtggagc cggaggattt tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccg 360

acgttcggtg gagggaccaa gctggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

<210>4

<211>238

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg

35 40 45

Val Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>5

<211>756

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

atgaagctcc ccgtcaggct tctcgtgctc atgttctgga ttccggcgtc gtcaagtgag 60

cccaaatcta gtgacaagac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 120

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 180

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 240

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 300

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 360

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 420

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgcgat 480

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 540

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 600

gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 660

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 720

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaatga 756

<210>6

<211>251

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

20 25 30

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

35 40 45

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

50 55 60

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

65 70 75 80

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

85 90 95

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

100 105 110

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

115 120 125

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

145 150 155 160

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

180 185 190

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

195 200 205

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

225 230 235 240

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245 250

<210>7

<211>1335

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

caggtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc agttattata tgtactgggt gaagcaggcg 120

cccggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtga tactaacttc 180

aatgagaagt tcaagagtaa ggccacactg actgtagaca aatccgccag cacagcatac 240

atggagctca gcagcctgag gtctgaggac actgcggtct attactgtac aagatcggac 300

ggtagaaatg atatggactc ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctcagcttcc 360

accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca gatctacctc cgagagcaca 420

gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600

tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660

ggtcccccat gcccatcatg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 720

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960

gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020

ccccgagagc cacaagtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtcctcga ttccgacggc 1200

tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320

ctgtctctgg gttga 1335

<210>8

<211>444

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210>9

<211>1335

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

caggtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc agttattata tgtactgggt gaagcaggcg 120

cccggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtga tactaacttc 180

aatgagaagt tcaagagtaa ggccacactg actgtagaca aatccgccag cacagcatac 240

atggagctca gcagcctgag gtctgaggac actgcggtct attactgtac aagatcggac 300

ggtagaaatg atatggactc ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctcagcttcc 360

accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca gatctacctc cgagagcaca 420

gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600

tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660

ggtcccccat gcccaccgtg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 720

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960

gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020

ccccgagagc cacaagtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140

agcaatgggc agccggagaa caactaoaag accacgcctc ccgtcctcga ttccgacggc 1200

tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260

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<210>10

<211>444

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

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Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

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<210>11

<211>1335

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

caggtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc agttattata tgtactgggt gaagcaggcg 120

cccggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtga tactaacttc 180

aatgagaagt tcaagagtaa ggccacactg actgtagaca aatccgccag cacagcatac 240

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tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660

ggtcccccat gcccaccgtg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 720

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcgc gtaccgtgtg 900

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960

gtctccaaca aaggcctccc gtcctceatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020

ccccgagagc cacaagtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtcctcga ttccgacggc 1200

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ctgtctctgg gttga 1335

<210>12

<211>444

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

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Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

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Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

Claims

1.包含Fc区的亲本多肽的变体多肽，其中所述Fc区包含具有优选侧链化学结构的经修饰的第一个氨基酸残基，以及具有减弱的糖基化的第二个氨基酸残基，其中所述变体多肽与亲本多肽相比具有减弱的效应物功能。

2.包含Fc区的亲本多肽的变体多肽，其中所述Fc区包含经修饰的第一个氨基酸残基，以及具有减弱的糖基化的第二个氨基酸残基，所述经修饰的第一个氨基酸残基具有含有半胱氨酸硫醇基的优选侧链化学结构，其中所述变体多肽与亲本多肽相比具有减弱的效应物功能。

3.包含Fc区的多肽，其中与不具有对第一个氨基酸残基的修饰的多肽相比，所述Fc区包含具有优选侧链化学结构的经修饰的第一个氨基酸残基，以及具有减弱的糖基化的第二个氨基酸残基。

4.包含Fc区的亲本多肽的变体多肽，其中所述Fc区包含经修饰的第一个氨基酸残基，其中所述经修饰的第一个氨基酸的空间位置使得可实现第二个氨基酸的糖基化的减弱，由此所述变体多肽与所述亲本多肽相比具有减弱的效应物功能。

5.权利要求4的多肽，其中所述经修饰的第一个氨基酸在空间位置上距离第二个氨基酸的间隔为至少1个氨基酸位置或1个氨基酸位置以上，至少2个氨基酸位置或2个氨基酸位置以上，至少3个氨基酸位置或3个氨基酸位置以上，至少4个氨基酸位置或4个氨基酸位置以上，至少5个氨基酸位置或5个氨基酸位置以上，至少6个氨基酸位置或6个氨基酸位置以上，至少7个氨基酸位置或7个氨基酸位置以上，至少8个氨基酸位置或8个氨基酸位置以上，至少9个氨基酸位置或9个氨基酸位置以上，或至少10个氨基酸位置或10个氨基酸位置以上。

6.权利要求4的多肽，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基具有优选的侧链化学结构。

7.权利要求1-3或6任一项的多肽，其中所述优选的侧链化学结构具有足够的空间大小从而使得所述多肽显示减弱的效应物功能。

8.权利要求7的多肽，其中所述具有足够空间大小的优选的侧链化学结构是选自Phe，Trp，His，Glu，Gln，Arg，Lys，Met，或Tyr的氨基酸残基的侧链化学结构。

9.权利要求1-3或6任一项的多肽，其中所述优选的侧链化学结构具有足够的静电荷从而使得所述多肽显示减弱的效应物功能。

10.权利要求9的多肽，其中所述优选的侧链化学结构是选自Asp，Glu，Lys，Arg，或His的氨基酸残基的侧链化学结构。

11.权利要求3的多肽，其中所述多肽显示减弱的效应物功能。

12.权利要求1，2，4或11任一项的多肽，其中所述减弱的效应物功能是与Fc受体(FcR)的结合减弱。

13.权利要求12的多肽，其中所述结合减弱大约1倍或更多的倍数，大约2倍或更多的倍数，大约3倍或更多的倍数，大约4倍或更多的倍数，大约5倍或更多的倍数，大约6倍或更多的倍数，大约7倍或更多的倍数，大约8倍或更多的倍数，大约9倍或更多的倍数，大约10倍或更多的倍数，大约15倍或更多的倍数，大约50倍或更多的倍数，或大约100倍或更多的倍数。

14.权利要求12的多肽，其中所述Fc受体(FcR)选自FcγRI，FcγRII，或FcγRIII。

15.权利要求1，2，4或11任一项的多肽，其中所述减弱的效应物功能是与补体蛋白的结合减弱。

16.权利要求15的多肽，其中所述补体蛋白是C1q。

17.权利要求15的多肽，其中所述与补体蛋白的结合减弱大约1倍或更多的倍数，大约2倍或更多的倍数，大约3倍或更多的倍数，大约4倍或更多的倍数，大约5倍或更多的倍数，大约6倍或更多的倍数，大约7倍或更多的倍数，大约8倍或更多的倍数，大约9倍或更多的倍数，大约10倍或更多的倍数，大约15倍或更多的倍数。

18.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基位于N-连接的糖基化基序附近或在N-连接的糖基化基序之内。

19.权利要求18的多肽，其中所述N-连接的糖基化基序包含氨基酸序列NXT或NXS。

20.权利要求19的多肽，其中所述N-连接的糖基化基序包含氨基酸序列NXT。

21.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述第一个氨基酸残基由氨基酸取代所修饰。

22.权利要求21的多肽，其中所述氨基酸取代选自Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Asn，Gln，Trp，Pro，Ser，Thr，Tyr，Cys，Met，Asp，Glu，Lys，Arg，或His。

23.权利要求21的多肽，其中所述氨基酸取代是非传统氨基酸残基。

24.权利要求1-3或6任一项的多肽，其中所述具有优选侧链化学结构的第一个氨基酸残基能够连接于功能性部分。

25.权利要求24的多肽，其中所述功能性部分选自阻断性部分，可检测部分，诊断性部分和治疗性部分。

26.权利要求25的多肽，其中所述阻断性部分选自半胱氨酸加合物，混合的二硫化物，聚乙二醇，或聚乙二醇顺丁烯二酰亚胺。

27.权利要求25的多肽，其中所述可检测部分选自荧光部分或同位素部分。

28.权利要求25的多肽，其中所述诊断剂能够揭示疾病或病症的存在。

29.权利要求25的多肽，其中所述治疗性部分选自抗炎剂，抗癌剂，抗神经变性剂，或抗感染剂。

30.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述第二个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸297。

31.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸299。

32.权利要求21的多肽，其中所述氨基酸取代选自根据Kabat编号的T299A，T299N，T299G，T299Y，T299C，T299H，T299E，T299D，T299K，T299R，T299G，T299I，T299L，T299M，T299F，T299P，T299W，或T299V。

33.权利要求32的多肽，其中所述氨基酸取代是T299C。

34.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述多肽在经修饰的第一个氨基酸残基处发生PEG化。

35.权利要求34的多肽，其中所述多肽用PEG-顺丁烯二酰亚胺进行PEG化。

36.权利要求1或3-5任一项的多肽，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基是由半胱氨酸或混合的二硫化物加合物修饰的半胱氨酸残基。

37.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述多肽是抗体。

38.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述Fc区获自选自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的抗体。

39.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述多肽结合选自配体，细胞因子，受体，细胞表面抗原，或癌细胞抗原的抗原。

40.组合物，其包含位于适合的可药用载体中的权利要求1-5任一项的多肽。

41.一种治疗或预防人类病症或疾病的方法，包括，给药治疗上有效量的权利要求40的药物组合物，从而实现对所述人类疾病或病症的治疗或预防。

42.编码权利要求1-5任一项的多肽的分离的核酸。

43.权利要求42的核酸，其中编码的第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基是N-连接的糖基化基序的一部分。

44.权利要求43的核酸，其中所述N-连接的糖基化基序包含氨基酸序列NXT或NXS。

45.权利要求42的核酸，其中第二个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸297。

46.权利要求42的核酸，其中能够被糖基化的第二个氨基酸残基在第297位。

47.权利要求42的核酸，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸299。

48.权利要求16的核酸，其中所述编码的第一个氨基酸残基是通过氨基酸取代所修饰的。

49.权利要求48的核酸，其中所述氨基酸取代选自T299A，T299N，T299G，T299Y，T299C，T299H，T299E，T299D，T299K，T299R，T299G，T299I，T299L，T299M，T299F，T299P，T299W，或T299V。

50.权利要求49的核酸，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基是T299C。

51.权利要求42的核酸，其中所编码的具有优选侧链化学结构的第一个氨基酸残基能够连接于功能性部分。

52.权利要求48的核酸，其中所述功能性部分选自阻断性部分，可检测部分，诊断性部分或治疗性部分。

53.权利要求42的核酸，其中所编码的多肽是抗体。

54.权利要求53的核酸，其中Fc区选自IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。

55.权利要求42的核酸，其中所编码的多肽显示与Fc受体(FcR)的结合减弱。

56.权利要求55的核酸，其中所述Fc受体(FcR)选自FcγRI，FcγRII，或FcγRIII。

57.权利要求42的核酸，其中所编码的多肽显示与补体蛋白C 1q的结合减弱。

58.权利要求42的核酸，其中所编码的多肽多肽结合选自配体，细胞因子，受体，细胞表面抗原，或癌细胞抗原的抗原。

59.载体，其包含权利要求42的核酸。

60.宿主细胞，其包含权利要求42的核酸。

61.一种制备抗原结合多肽的方法，包括将权利要求60的宿主细胞在适合通过宿主细胞产生所述多肽的条件下进行培养。

62.权利要求61的方法，包括从宿主细胞培养物回收所述多肽。

63.一种制备在Fc区中的糖基化减弱的、经修饰的抗原结合多肽的方法，该方法包括，

鉴定原始多肽中的第一个氨基酸残基和原始多肽的Fc区中能够被糖基化的第二个氨基酸残基，其中对第一个氨基酸残基的修饰将降低第二个氨基酸的糖基化；

选择具有优选侧链化学结构的氨基酸，和

修饰所述第一个氨基酸残基以包含所述优选的侧链化学结构，从而产生经修饰的多肽，其中在经修饰多肽Fc区中的所述第二个氨基酸残基的糖基化与原始多肽相比减弱。

64.一种减弱抗体的效应物功能的方法，包括，

鉴定抗体中能够改变该抗体Fc区中第二个氨基酸残基的糖基化的第一个氨基酸残基；和

修饰所述第一个氨基酸残基，使得与未修饰的抗体相比，在经修饰的抗体的Fc区中的第二个氨基酸残基的糖基化减弱，并且使得该经修饰的氨基酸具有优选的侧链化学结构。

65.权利要求63的方法，进一步包括确定经修饰的抗原结合多肽是否显示改变的效应物功能的步骤。

66.权利要求63或64的方法，其中当对所述第一个氨基酸进行修饰时，所述鉴定进一步包括确定Fc区的氨基酸的空间图谱(representation)。

67.权利要求63或64的方法，其中一个或多个步骤是计算机辅助的。

68.权利要求63或64的方法，其中所述第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基在糖基化基序之内或接近糖基化基序。

69.权利要求68的方法，其中所述糖基化基序是N-连接的糖基化基序，包含氨基酸序列NXT或NXS。

70.权利要求63或64的方法，其中所述第一个氨基酸残基修饰选自氨基酸取代，氨基酸删除，氨基酸插入，或氨基酸化学修饰。

71.权利要求63或64的方法，其中根据其优选侧链化学结构选出的第一个氨基酸残基能够连接于功能性效应物部分。

72.权利要求71的方法，其中所述功能性部分选自半胱氨酸加合物，PEG-顺丁烯二酰亚胺，或治疗性部分。

73.权利要求63或64的方法，其中所述第二个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸297。

74.权利要求63或64的方法，其中所述经修饰的第一个氨基酸残基是根据Kabat编号的氨基酸299。

75.权利要求70的方法，其中所述氨基酸残基取代选自T299A，T299N，T299G，T299Y，T299C，T299H，T299E，T299D，T299K，T299R，T299G，T299I，T299L，T299M，T299F，T299P，T299W，或T299V。

76.权利要求70的方法，其中经修饰的第一个氨基酸残基是T299C。

77.权利要求63或64的方法，其中所述多肽显示改变的效应物功能。

78.权利要求77的方法，其中所述或改变的效应物功能是与Fc受体(FcR)的结合减弱。

79.权利要求78的方法，其中所述Fc受体(FcR)选自FcγRI，FcγRII，或FcγRIII。

80.权利要求78的方法，其中所述改变的效应物功能是与补体蛋白Clq的结合减弱。

81.由权利要求63-80任一项的方法制备的多肽。