JP2022502037A

JP2022502037A - コラーゲンに局在化される免疫調節分子およびその方法

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Publication number: JP2022502037A
Application number: JP2021516890A
Authority: JP
Inventors: カールデインウィットラップ，; ノアモミン，; ジョゼフパルメリ，; マグノリアチン，
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2022-01-11
Also published as: AU2019346335A1; CN112771071A; SG11202100935TA; WO2020068261A1; CA3113618A1; KR20210068478A; BR112021004383A2; IL281568A; MX2021003435A; US20230174623A1; EP3856763A1; US20200102370A1

Abstract

本開示は、免疫調節ドメインに作動可能に連結されているコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。本開示は、例えばがんを処置するための、組成物およびそれらを使用する方法も特徴とする。本開示は、免疫調節ドメイン（例えば、サイトカイン、抗免疫受容体抗体、抗腫瘍関連抗原抗体など）をコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートさせ、それによって、非コンジュゲート免疫調節ドメインと比較して向上した抗腫瘍有効性を得ることができるという発見に、少なくとも一部は基づく。

Description

関連情報
本願は、２０１８年９月２８日に出願した米国仮出願第６２／７３８，９８１号の優先日の利益を主張するものであり、前記仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の資金提供

本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた認可番号Ｒ０１ＣＡ０９６５０４およびＲ０１ＣＡ１７４７９５のもとで政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明に関してある一定の権利を有する。

免疫療法は、少数の患者での持続的治療応答によって腫瘍学を変革したが、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）がその最も広い応用を制約する（Ｍｉｃｈｏｔｅｔａｌ．２０１６，ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，５４：１３９−１４８）。非腫瘍健常組織を温存しながら最も強力な免疫活性化事象を腫瘍組織に限定することが、望ましい。新しい免疫療法の一般に認められている目的は、免疫学的に「冷たい」腫瘍を「熱くする」こと、ひいては炎症および免疫細胞浸潤を推進することである（ＣｈｅｎａｎｄＭｅｌｌｍａｎ２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，５４１：３２１−３３０）。様々な腫瘍局在手法が提案されている：イムノサイトカインにおける腫瘍標的化モジュールへの免疫調節剤の連結（ＨｕｔｍａｃｈｅｒａｎｄＮｅｒｉ２０１８，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ）；腫瘍局在型のタンパク質分解活性を伴う、薬剤活性の全身的マスキング（ＴｈｏｍａｓａｎｄＤａｕｇｈｅｒｔｙ２００９，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１８：２０５３−２０５９）；薬剤の腫瘍内注射（ＳｉｎｇｈａｎｄＯｖｅｒｗｉｊｋ２０１５，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ８：１４４７；Ａｇｅｒｅｔａｌ．２０１７，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ５：６７６−６８４；Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙｅｔａｌ．２０１７，ＣａｎｃｅｒＪ２３：４０−４７；Ｍｉｌｌｉｎｇｅｔａｌ．２０１７，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ１１４：７９−１０１；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．２０１７，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ８：１４４７；Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉｅｔａｌ．２０１８，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ１０：ｅａａｎ４４８８）；薬剤を捕捉するための固体生体材料の腫瘍周囲注射（Ｐａｒｋｅｔａｌ．２０１８，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ，１０：ｅａａｒ１９１６）；固体粒子へのコンジュゲーション（Ｋｗｏｎｇｅｔａｌ．２０１３，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７３：１５４７−１５５８）または腫瘍細胞外マトリックスへの薬剤の幾らかの非特異的固着を推進するための塩基性荷電ペプチドのコンジュゲーション（Ｉｓｈｉｈａｒａｅｔａｌ．２０１７，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ９：ｅａａｎ０４０１；Ｉｓｈｉｈａｒａｅｔａｌ．２０１８，ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ１７：２３９９−２４１１）。関連しているが明確に異なる手法は、組織再生を推進するために組織内に増殖因子を局在させる手法である（Ｎｉｓｈｉｅｔａｌ．１９９８，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ９５：７０１８−７０２３；Ｍａｒｔｉｎｏｅｔａｌ．２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ３４３：８８５−８８８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌｅｔａｌ．２０１６，ＡｃｔａＢｉｏｍａｔｅｒ３０：１−１２）。

上記の現行の手法の各々に関して重大な問題が存在する。イムノサイトカインは、免疫細胞を免疫調節剤に全身曝露する（Ｔｚｅｎｇｅｔａｌ．２０１５，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ１１２：３３２０−３３２５）。マスキング剤は、標的組織外では脱マスクされることがあり、マスキング剤は、製造および免疫原性を複雑にすることもある。腫瘍内注射は、腫瘍区画からの迅速な拡散に至ることが多い。ランダムな部位でのペプチドのコンジュゲーションは、再現するのが困難であり、特定の活性にマイナス影響を与えることがあり、腫瘍流出（ｔｕｍｏｒｅｘｉｔ）を十分に防止せず、ランダムコンジュゲーション法の不均一な産物のために重大なＣＭＣ問題を生じさせる。

したがって、腫瘍局在を促進し、有効性を増加させるが、全身毒性を防止する、新規免疫療法手法が、依然として必要とされている。

Ｍｉｃｈｏｔｅｔａｌ．２０１６，ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，５４：１３９−１４８ＣｈｅｎａｎｄＭｅｌｌｍａｎ２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，５４１：３２１−３３０ＨｕｔｍａｃｈｅｒａｎｄＮｅｒｉ２０１８，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ

本開示は、免疫調節ドメイン（例えば、サイトカイン、抗免疫受容体抗体、抗腫瘍関連抗原抗体など）をコラーゲン結合ドメインにコンジュゲートさせ、それによって、非コンジュゲート免疫調節ドメインと比較して向上した抗腫瘍有効性を得ることができるという発見に、少なくとも一部は基づく。理論により拘束されることを望まないが、免疫調節ドメインのコラーゲンへの局在化は、Ｔ細胞が腫瘍周囲のコラーゲンを多く含む帯域に捕捉され、結果としてそのような部位を免疫調節剤の標的化に望ましいものにするので、抗腫瘍有効性を向上させることになる。ヒト腫瘍のほぼ半数は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、コラーゲンを多く含む線維形成性間質内に捕捉されているように見える、免疫排除表現型を示す（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１８，５５４：５４４−５４８）。免疫療法の有効性においてＣＤ８＋Ｔ細胞が一番重要であることを考えると、腫瘍のこのコラーゲンを多く含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞を多く含む区画に、免疫調節剤を局在させることが望ましい。特異性は重要である。なぜなら、滞留のために小さい非構造化ペプチド内での非特異的静電相互作用を利用する以前の薬剤（Ｍａｒｔｉｎｏ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４３：８８５−８８８）は、コラーゲンを多く含む目的の特定の区画内ではなく、負荷電細胞外マトリックス成分の大部分に無差別に結合するからである。このような非構造化、正荷電ペプチドはまた、注射されたコンジュゲートペイロードの半分が体循環に漏出する場合もある、比較的弱い滞留動態をもたらす（Ｉｓｈｉｈａｒａ，ｅｔａｌ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．２０１８，１７：２３９９−２４１１）。

したがって、コラーゲンを多く含む目的の特定の区画内でのより高度な滞留につながる、コラーゲンに対する特異的親和性を有する構造化タンパク質との免疫調節融合体が、本明細書で提供される。本明細書に記載される一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、サイトカインを含み、前臨床動物モデルにおいて腫瘍内投与後、コラーゲン結合ドメインが、腫瘍滞留を増加させ、サイトカインへの全身曝露を防止し、それによって処置関連毒性を低減する。さらに、免疫調節融合タンパク質は、１つまたは複数のさらなる免疫療法（例えば、腫瘍標的化抗体、チェックポイント遮断、がんワクチン、およびＴ細胞療法）と組み合わせられたとき、コラーゲン結合ドメインを欠いている同等の融合タンパク質と比較して、抗腫瘍有効性の増加および毒性の低減を有する。

本明細書で提供されるこれらの免疫調節融合タンパク質は、注射された腫瘍に対する局所的免疫、および対側の注射されていない腫瘍の有効な処置のための全身性免疫を可能にする、持続的な全身性の抗腫瘍応答を実証する。免疫調節融合タンパク質のネオアジュバント投与は、残存原発腫瘍の外科的切除後の転移を防止することにより生存率も改善し、したがって、免疫調節融合タンパク質が全身性抗腫瘍免疫を促進することをさらに実証した。したがって、本開示の免疫調節融合タンパク質は、治療（例えば、抗がん）方法での転移性腫瘍の処置および／またはアブスコパル効果の媒介に有用である。

コラーゲンに対する結合親和性が変更された（例えば、増加されたまたは減少された）バリアントコラーゲン結合ドメインも、本明細書で提供される。コラーゲン結合親和性が異なるバリアントコラーゲン結合ドメインの選択を開示することにより、本明細書における開示は、コラーゲンを多く含む区画（例えば、コラーゲン発現腫瘍）に対する結合親和性が異なる免疫調節融合タンパク質を選択するための選択肢を提供する。

本明細書で提供されるコラーゲン結合組成物および方法は、活性治療薬の腫瘍およびペイロード非依存的な局所標的化を可能にする。コラーゲン結合組成物は、全身性免疫療法に関連する毒性の付随的減少を伴う有効性増加も実証する。

一部の態様では、本開示は、
（ｉ）免疫調節ドメインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）必要に応じて、リンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
免疫調節ドメインが、リンカーにより、またはリンカーなしでコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

一部の態様では、Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、約５〜１００ｋＤａ、約１０〜８０ｋＤａ、約２０〜６０ｋＤａ、約３０〜５０ｋＤａの、または約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａもしくは約１００ｋＤａのＭＷを有する。

一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、コラーゲンに結合する１つまたは複数のロイシンリッチリピートを含むコラーゲン結合ドメインを含む。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに結合する２、３、４、５、６、７、８、９または１０のロイシンリッチリピートを含む。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのヒトプロテオグリカンクラスＩＩメンバーからの１つまたは複数のロイシンリッチリピートを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択される。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。

一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、ヒトＳＬＲＰを含むコラーゲン結合ドメインを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択される。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の態様では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、コラーゲンに結合する、Ｉｇ様ドメインを有するヒトＩ型糖タンパク質、またはその細胞外部分を含む、コラーゲン結合ドメインを含む。一部の態様では、Ｉ型糖タンパク質は、Ｉ型コラーゲンへの結合についての結合についてルミカンと競合する。一部の態様では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の態様では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１である。一部の態様では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１であり、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を活性化、強化または促進するポリペプチドを含む。他の態様では、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を阻害、低下または抑制するポリペプチドを含む。

一部の態様では、免疫細胞は、自然リンパ系細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびこれらの組合せから選択されるリンパ系細胞である。他の態様では、免疫細胞は、単球、好中球、顆粒球、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞およびこれらの組合せから選択される骨髄系細胞である。

一部の態様では、免疫細胞による応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞傷害性の増加、ならびにこれらの組合せを含む。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、サイトカイン、ケモカイン、活性化リガンド／受容体、阻害性リガンド／受容体、またはこれらの組合せから選択される１つまたは複数を含む。一部の態様では、免疫調節ドメインは、１つまたは複数のサイトカインを含む。

一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−２１およびこれらの組合せから選択されるヒト共通ガンマ鎖受容体インターロイキンである。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２である。

一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１２（ｐ３５）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１２ファミリーメンバーである。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体である。

他の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１ファミリーメンバーである。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１８である。

さらに他の態様では、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびこれらの組合せから選択される。

一部の態様では、免疫調節ドメインは、１つまたは複数のケモカインを含む。一部の態様では、ケモカインは、ＬＩＦ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびこれらの組合せから選択される。他の態様では、ケモカインは、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシンおよびこれらの組合せから選択される。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つまたは複数の活性化リガンド／受容体を含む。一部の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、Ｂ７リガンドファミリーおよびＴ細胞受容体から選択される。他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０およびこれらの組合せから選択されるＴＮＦスーパーファミリーリガンドである。さらに他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体であり、免疫調節ドメインは、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバー、またはＩＣＯＳリガンド、ＣＤ８０およびＣＤ８６ならびにこれらの組合せから選択されるＢ７ファミリーメンバーである。さらに他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらなる態様では、活性化リガンド／受容体は、Ｔ細胞受容体であり、免疫調節ドメインは、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体および抗ＣＤ３ε抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。

一部の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、Ｂ７リガンドファミリー、Ｔ細胞受容体、キラー細胞Ｉｇ様受容体、白血球Ｉｇ様受容体、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリーおよびＦｃ受容体から選択される。他の態様では、活性化リガンド／受容体は、キラー細胞Ｉｇ様受容体リガンドであり、免疫調節ドメインは、抗ＫＩＲ２ＤＳ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ４抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ５抗体および抗ＫＩＲ３ＤＳ１抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらなる態様では、活性化リガンド／受容体は、白血球Ｉｇ様受容体であり、免疫調節ドメインは、抗ＬＩＲＡ２抗体またはその抗原結合性断片を含む。他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５（アイソフォーム１）、ＵＬＢＰ５（アイソフォーム２）およびＵＬＢＰ６から選択されるＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリーメンバーである。さらに他の態様では、活性化リガンド／受容体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｄ抗体、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ抗体、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ抗体および抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｈ抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらなる態様では、活性化リガンド／受容体は、Ｆｃ受容体ファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＣ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＩＢ抗体、抗ＦｃεＲＩ抗体、抗ＦｃεＲＩＩ抗体、抗ＦｃαＲ抗体および抗ＦｃμＲ抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つまたは複数の阻害性リガンド／受容体を含む。一部の態様では、阻害性リガンド／受容体は、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリーおよびチェックポイント阻害剤から選択される。他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらに他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＢＴＬＡ抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。一部の態様では、阻害性リガンド／受容体は、チェックポイント阻害剤であり、免疫調節ドメインは、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４７抗体および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。

一部の態様では、阻害性リガンド／受容体は、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、シグレックファミリー、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａファミリー、白血球Ｉｇ様受容体ファミリー、キラー細胞Ｉｇ様受容体リガンド、Ｆｃ受容体、アデノシン経路分子およびチェックポイント阻害剤から選択される。他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、シグレックファミリーメンバーを含み、免疫調節ドメインは、抗シグレック１抗体、抗シグレック２抗体、抗シグレック３抗体、抗シグレック４ａ抗体、抗シグレック５抗体、抗シグレック６抗体、抗シグレック７抗体、抗シグレック８抗体、抗シグレック９抗体、抗シグレック１０抗体、抗シグレック１１抗体および抗シグレック１２抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。さらに他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー阻害性受容体または阻害性リガンドを含み、免疫調節ドメインは、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体および抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。一部の態様では、阻害性リガンド／受容体は、白血球Ｉｇ様受容体を含み、免疫調節ドメインは、抗ＬＩＲＢ１抗体、抗ＬＩＲＢ２抗体、抗ＬＩＲＢ３抗体、抗ＬＩＲＢ４抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、キラー細胞Ｉｇ様受容体リガンドを含み、免疫調節ドメインは、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ４抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体および抗ＫＩＲ３ＤＬ３抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらに他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、Ｆｃ受容体を含み、免疫調節ドメインは、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体または抗原結合性断片を含む。一部の態様では、阻害性リガンド／受容体は、アデノシン経路分子を含み、免疫調節ドメインは、抗ＣＤ３９抗体および抗ＣＤ７３抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。他の態様では、阻害性リガンド／受容体は、チェックポイント阻害剤を含み、免疫調節ドメインは、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４７抗体および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、リンカーを介してコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている。一部の態様では、リンカーは、コラーゲン原線維上への免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さまたは質量のものである。一部の態様では、リンカーは、融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供する。一部の態様では、リンカーは、受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする。一部の態様では、リンカーは、１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドである。一部の態様では、リンカーは、ヒト血清アルブミンまたはその断片である。他の態様では、リンカーは、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質は、投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである。一部の態様では、融合タンパク質は、≧６０ｋＤａである。一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する。

一部の態様では、本開示は、
（ｉ）少なくとも１つのサイトカインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドあるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
サイトカインが、リンカーを介してコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の態様では、Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の態様では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。他の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１である。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−２１およびこれらの組合せから選択されるヒト共通ガンマ鎖受容体インターロイキンである。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−２である。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１２（ｐ３５）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１２ファミリーメンバーである。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体である。一部の態様では、免疫調節融合タンパク質は、第２のサイトカインを含む。一部の態様では、第２のサイトカインは、ＩＬ−２である。

他の態様では、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１ファミリーメンバーである。さらに他の態様では、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびこれらの組合せから選択される。

一部の態様では、リンカーは、コラーゲン原線維上への免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さもしくは質量のものであり、および／または融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供し、および／または受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする。一部の態様では、リンカーは、ヒト血清アルブミンまたはその断片である。他の態様では、リンカーは、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む。

一部の態様では、融合タンパク質は、投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである。一部の態様では、融合タンパク質は、投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する。

他の態様では、本開示は、
（ｉ）少なくとも１つのケモカインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ケモカインが、リンカーを介してコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の態様では、Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の態様では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。他の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１である。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

一部の態様では、ケモカインは、ＬＩＦ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびこれらの組合せから選択される。一部の態様では、ケモカインは、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシンおよびこれらの組合せから選択される。

さらに他の態様では、本開示は、
（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む活性化リガンド／受容体に結合するアゴニスト抗体と、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
コラーゲン結合ドメインが、Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、
免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の態様では、Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の態様では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。他の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１である。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

一部の態様では、アゴニスト抗体は、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される。他の態様では、アゴニスト抗体は、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される。一部の態様では、アゴニスト抗体は、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体、および抗ＣＤ３ε抗体から選択される。

さらなる態様では、本開示は、
（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む阻害性リガンド／受容体に結合するアンタゴニスト抗体と、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
コラーゲン結合ドメインが、Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、
免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の態様では、Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカンおよびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む。一部の態様では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の態様では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。他の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１である。一部の態様では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

一部の態様では、アンタゴニスト抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４７抗体、および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される。

他の態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトＩＬ−２と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−２が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

さらなる態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

さらにさらなる態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトＣＣＬ−３と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−３が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

他の態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトＣＣＬ−４と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−４が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

一部の態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトＣＣＬ−５と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−５が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

他の態様では、本開示は、
（ｉ）ヒトエオタキシンと、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
エオタキシンが、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を提供する。

上述の態様のいずれかにおいて、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。

上述の態様のいずれかにおいて、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されている。他のさらなる実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されている。

上述の態様のいずれかにおいて、リンカーは、コラーゲン原線維上への免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さもしくは質量のものであり、および／または融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供し、および／または受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする。一部の態様では、リンカーは、ヒト血清アルブミンまたはその断片である。他の態様では、リンカーは、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む。

さらに他の態様では、本開示は、

（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含むアゴニスト抗体であって、抗ＣＤ３抗体、抗４−１−ＢＢ抗体、抗ＣＤ４０抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される、アゴニスト抗体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ルミカンまたはＬＡＩＲ１が、Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

他の態様では、本開示は、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される核酸を含む発現ベクターを提供する。他の態様では、本開示は、本明細書で開示される発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、免疫調節融合タンパク質を産生する方法であって、本明細書に記載される細胞を、免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で維持するステップを含む方法を提供する。さらなる態様では、方法は、免疫調節融合タンパク質を得るステップを含む。

他の態様では、本開示は、対象における免疫細胞による応答を活性化、強化または促進する方法であって、必要な対象に、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。

さらにさらなる態様では、本開示は、対象における免疫細胞による応答を阻害、低下または抑制する方法であって、必要な対象に、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫細胞は、自然リンパ系細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびこれらの組合せから選択されるリンパ系細胞である。他の態様では、免疫細胞は、単球、好中球、顆粒球、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞およびこれらの組合せから選択される骨髄系細胞である。一部の態様では、免疫細胞による応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞傷害性の増加、ならびにこれらの組合せを含む。一部の態様では、免疫細胞は、腫瘍微小環境に存在する。

他の態様では、本開示は、腫瘍成長を低減または阻害する方法であって、必要な対象に、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、必要な対象に、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。

上述の態様のいずれかにおいて、抗腫瘍免疫応答は、対象において免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の投与後に誘導される。一部の態様では、抗腫瘍免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の一方または両方によるＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２の産生を含むＴ細胞応答である。

上述の態様のいずれかにおいて、腫瘍微小環境への免疫細胞の浸潤は、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の投与後に増加される。

上述の態様のいずれかにおいて、腫瘍微小環境内の調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の量は、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の投与後に低減される。上述の態様のいずれかにおいて、腫瘍微小環境内でのＴ細胞疲弊は、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の投与後に軽減される。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物は、腫瘍内投与される。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物は、ウイルスベクター、電気穿孔、免疫調節融合タンパク質を発現する細胞の移植、またはレプリコンによって投与される。

他の態様では、本開示は、必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または本明細書に記載される医薬組成物を含む容器と、融合タンパク質または医薬組成物を投与するための説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。

さらにさらなる態様では、本開示は、必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または本明細書に記載される医薬組成物を含む容器と、抗体または医薬組成物を単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。

一部の態様では、本開示は、必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための医薬を製造するための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または本明細書に記載される医薬組成物の使用を提供する。

他の態様では、本開示は、必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための医薬の製造における、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質および必要に応じた薬学的に許容される担体、または本明細書に記載される医薬組成物を提供する。

さらにさらなる態様では、本開示は、医薬として使用するための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または本明細書に記載される医薬組成物を提供する。

他の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量と、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合性断片を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）、または腫瘍ネオ抗原である。他の態様では、腫瘍抗原標的化抗体は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３またはＣＤ３８に特異的に結合する。

さらに他の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量と、がんワクチンを含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、がんワクチンは、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍抗原で免疫されて対象に投与される細胞の集団である。他の態様では、がんワクチンは、１つまたは複数の腫瘍関連抗原を含むペプチドである。一部の態様では、がんワクチンは、腫瘍関連抗原と、脂質と、必要に応じたリンカーとを含む両親媒性ペプチドコンジュゲートであって、生理条件下でアルブミンに結合する両親媒性ペプチドコンジュゲートである。一部の態様では、がんワクチンは、アジュバントをさらに含む。

一部の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

さらなる態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質または医薬組成物の有効量と、養子細胞療法薬を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、養子細胞療法薬は、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む。一部の態様では、ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、疾患に関連する腫瘍抗原に結合する。一部の態様では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０およびＢＣＭＡから選択される。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞である。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

上述の方法のいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物は、腫瘍内投与される。一部の態様では、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物、および第２の組成物は、同時にまたは逐次的に投与される。

他の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、
（ｉ）ヒトＩＬ−２と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−２が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を投与するステップを含み、
それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を投与するステップを含み、
それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、
（ｉ）ヒトＩＬ−２と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−２が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質を含む、第１の組成物の有効量と、
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、または、と、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体が、リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を含む第２の組成物と
を投与するステップを含み、
それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法を提供する。

一部の態様では、方法は、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合性断片の有効量を含む第２の（または第３の、または第４の）組成物を投与するステップをさらに含む。他の態様では、方法は、がんワクチンを含む組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む。さらに他の態様では、方法は、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

別の態様では、方法は、養子細胞療法薬を含む第２の組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含み、それによって対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害する、またはがんを処置する。一部の態様では、養子細胞療法薬は、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞、またはＮＫ細胞である。

上述の態様のいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質または医薬組成物、および第２の組成物は、同時にまたは逐次的に投与される。

本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、請求して必要料金を支払うと、米国特許商標庁によって提供されるであろう。

図１Ａは、Ｉ型コラーゲンへの、単独でのガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、またはコラーゲン結合ポリペプチドに融合したガウシアルシフェラーゼ（ルミカン−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃ）の結合を、濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ＥＬＩＳＡにより判定した。

図１Ｂは、ＩＶ型コラーゲンへの、単独でのガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、またはコラーゲン結合ポリペプチドに融合したガウシアルシフェラーゼ（ルミカン−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃ）の結合を、濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ＥＬＩＳＡにより判定した。

図１Ｃは、Ｉ型コラーゲンへの、Ｈｉｓタグ付きマウスＬＡＩＲ−１（ｍＬＡＩＲ１−Ｈｉｓ）およびＨｉｓタグ付きビオチン化ルミカン（Ｌｗｔ−ＨＩＳ−ｂ）の結合を、濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗ＨＩＳ抗体を使用してＥＬＩＳＡにより判定した。

図１Ｄは、Ｈｉｓタグ付きマウスＬＡＩＲ−１（ｍＬＡＩＲ１）とＨｉｓタグ付きビオチン化ルミカン間のＩ型コラーゲンへの競合的結合を、ｍＬＡＩＲ１濃度の関数として示すグラフを提供する。Ｉ型コラーゲンへのルミカンの結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｐｅｒｉｏｘｉｄａｔｅ）（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたストレプトアビジンを使用して様々な濃度のｍＬＡＩＲ１の存在下で競合ＥＬＩＳＡにより判定した。

図２Ａは、ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングにより判定して、Ｂ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯ腫瘍への腫瘍内注射後の蛍光標識ＭＳＡと比較した蛍光標識ルミカンまたはルミカン−ＭＳＡについての相対腫瘍蛍光を経時的に定量するグラフを提供する。

図２Ｂは、蛍光標識ルミカン−ＭＳＡまたは蛍光標識ＭＳＡを注射したＢ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯ腫瘍担持マウスからの血清の蛍光を注射用量のパーセンテージとして定量するグラフを提供する。血清蛍光は、マウス血液試料が入っているミクロヘマトクリットヘパリンコーティングチューブの蛍光イメージングにより判定した。

図３Ａは、ＰＢＳ（対照）（ｉ．ｔｕ．）、ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）、Ｌｕｍｉｃａｎ−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）、またはルミカン（ｉ．ｔｕ．）で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスのマンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウス（処置群当たりｎ＝５または７）を、示されているように（矢印）、６および１２日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊＊（Ｐ＜０．００２）で有意性が示されている。

図３Ｂは、ＰＢＳで腫瘍内処置した（ｎ＝７、ｉ．ｔｕ．）、ＭＳＡ−ＩＬ２（ｎ＝１７、ｉ．ｔｕ．）と組み合わせて、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｎ＝１７、ｉ．ｔｕ．）と組み合わせて、またはルミカン（ｎ＝１７、ｉ．ｔｕ．）と組み合わせて抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＡ９９）（ｉ．ｐ．）で処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウスを、示されているように（矢印）、６、１２および１８日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図３Ｃは、ＰＢＳ（対照）（ｉ．ｔｕ．）で処置した、または抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＡ９９）（ｉ．ｐ．）と腫瘍内に（ｉ．ｔｕ．）、腫瘍周囲に（ｐｅｒｉ．ｔｕ．）（すなわち、腫瘍に隣接して）もしくは尾の付け根付近の皮下に（ｓ．ｃ．尾の付け根）投与されるルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せで処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウスを、示されているように（矢印）、６、１２および１８日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図３Ｄは、（ｉ．ｔｕ．）と鼠径部腫瘍流入領域リンパ節へ（ｉ．ｔｄＬＮ）の両方のＰＢＳ（対照）で処置した、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）およびＰＢＳ（ｉ．ｔｄＬＮ）と組み合わせて抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＡ９９）（ｉ．ｐ．）で、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｄＬＮ）およびＰＢＳ（ｉ．ｔｕ．）と組み合わせて抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＡ９９）（ｉ．ｐ．）で処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウス（処置群当たりｎ＝７）を、示されているように（矢印）、６日目および１２日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊＊（Ｐ＜０．００２）で有意性が示されている。

図４は、ＰＢＳ（対照）（ｉ．ｔｕ．）で処置した、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）および示されている通りの免疫細胞枯渇もしくはサイトカイン中和抗体と組み合わせて抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＡ９９）（ｉ．ｐ．）で処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持ＢａｔＦ３^−／−または野生型（ＷＴ）マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウス（処置群当たりｎ＝５）を、示されているように、６、１２および１８日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図５Ａは、ブレフェルジンＡの存在下で１２時間、照射Ｂ１６Ｆ１０または４Ｔ１細胞で刺激したマウス（図３Ｂに記載の通り処置した）の１０日目に切除した脾細胞から採取し、その後、表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮγ（処置群当たりマウスｎ＝５）について染色した、生ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＩＦＮγ＋細胞を定量するグラフを提供する。テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによってデータを解析した。

図５Ｂは、処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスからの対側（未処置）（左側パネル）および同側（処置）（中央パネル）病変の平均腫瘍面積と、経時的にモニターした生存パーセント（右側パネル）（ｎ＝７／群）とを定量するグラフを提供する。０日目に、マウスの右側腹部（同側）にＢ１６Ｆ１０細胞、および左側腹部（対側）にＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。腫瘍内処置を６日目および１２日目にＴＡ９９（ｉ．ｐ．）と並行して同側腫瘍に投与した。対側（未処置）および同側（処置）病変（左側）の腫瘍面積（平均＋Ｓ．Ｄ．）ならびに生存率（右側）を経時的にモニターした（ｎ＝７／群）。各群について、マウスが安楽死基準に達するまでの腫瘍面積を示す。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊、Ｐ＜０．０３；^＊＊、Ｐ＜０．００２；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００２；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１で有意性が推測される；ｎ．ｓ．、有意でない。

図６Ａは、ＰＢＳ（ｉ．ｔｕ．）（ｎ＝６）、ルミカン（ｉ．ｔｕ．）（ｎ＝７）、ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｔｕ．）（ｎ＝７）、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ．）（ｎ＝７）、またはＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｐ．）（ｎ＝７）での処置後のＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの体重変化を定量するグラフを提供する。マウスを、示されているように（矢印）、６日および１２日目に処置した。

図６Ｂは、０日目にＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍を接種し、６および１２日目目にＰＢＳ（対照）、ルミカン（ｉ．ｔｕ．）、ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｔｕ）、ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｐ．）またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ）で処置したマウスについての生存率曲線を提供する。

図７は、５日目および１１日目にＰＢＳ（ｎ＝５）、ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ（ｎ＝５）、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射で処置したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの、ベースラインからの体重変化（左側パネル）および対応する経時的な生存率（右側パネル）を示すグラフを提供する。矢印は、処置の時点を示す。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図８Ａは、ＰＢＳ（対照）（ｉ．ｔｕ．）で処置した、またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ．）および示されている通りの免疫細胞枯渇もしくはサイトカイン中和抗体と組み合わせてルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）で処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持ＢａｔＦ３^−／−または野生型（ＷＴ）マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウス（処置群当たりｎ＝５）を、示されているように、６、１２および１８日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図８Ｂは、ＰＢＳ（対照）（ｉ．ｔｕ．）で処置した、またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ．）および示されている通りの免疫細胞枯渇抗体と組み合わせてルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ．）で処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持ＢａｔＦ３−／−または野生型（ＷＴ）マウスの、マンテル−コックス生存率曲線を提供する。マウス（処置群当たりｎ＝５）を、示されているように、６、１２および１８日目に処置した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図８Ｃは、ＰＢＳでの処置に対する、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せ（ルミカンバージョン）またはＩＬ１２−ＭＳＡ＋ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せ（ＭＳＡバージョン）で腫瘍内処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスからの腫瘍浸潤物中の免疫細胞の変化倍率を示す、ヒートマップを提供する。

図８Ｄ〜８Ｅは、腫瘍細胞注射後１１日目にＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスから単離した腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｄ）および腫瘍細胞注射後５日目に図８Ｃの場合と同様に処置した後のそれらの対応する表面ＰＤ−１の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）（図８Ｅ）を定量するグラフを提供する。

図９は、５日目および１１日目にＰＢＳ（ｎ＝５）、ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡとの組合せでの抗ＰＤ−１抗体（ｎ＝５）、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとの組合せでの抗ＰＤ−１抗体（ｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、ベースラインからの体重変化（左側パネル）および対応する経時的な生存率（右側パネル）を示すグラフを提供する。矢印は、処置の時点を示す。テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによって体重変化および比較統計量を決定した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊（Ｐ＜０．０３）、^＊＊（Ｐ＜０．００２）、^＊＊＊（Ｐ＜０．０００２）、^＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図１０Ａ〜１０Ｂは、示されているように（矢印）５、１１および１７日目に処置した、ＥＭＴ６腫瘍担持マウス（図１０Ａ）またはＭＣ３８腫瘍担持マウス（図１０Ｂ）の腫瘍面積（左側パネル）および生存パーセント（右パネル）を示すグラフを提供する。テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによって体重変化および比較統計量を決定した。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。^＊、Ｐ＜０．０３；^＊＊、Ｐ＜０．００２；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００２；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１で、有意性が示されている；ｎ．ｓ．、有意でない。

図１１は、示されているように（矢印）５、１１および１７日目にＰＢＳ（ｎ＝１２）もしくはＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝１０；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝１０）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射、または単独でのがんワクチン（ｎ＝７）、またはがんワクチンとＩＬ１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝７；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝７）で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、ベースラインからの体重変化（左側、平均＋Ｓ．Ｄ．）、対応する腫瘍面積（中央、平均＋Ｓ．Ｄ．）および生存率（右側）を示すグラフを提供する。マウスが安楽死基準（＞１００ｍｍ^２）に達するまでの腫瘍面積が示されている。図中に示されている体重変化統計量は、テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。説明文に隣接している生存率統計量は、ログランクマンテル−コックス検定により決定した。^＊、Ｐ＜０．０３；^＊＊、Ｐ＜０．００２；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００２；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１で、有意性が推測される；ｎ．ｓ．、有意でない。

図１２は、示されているように（矢印）５および１１日目にＰＢＳ（ｎ＝１１）、またはＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝９；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）、または単独でのＣＡＲ−Ｔ（ｎ＝１１）、またはＣＡＲ−ＴおよびＩＬ１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝９；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの、ベースラインからの体重変化（左側、平均＋Ｓ．Ｄ．）、対応する腫瘍面積（中央、平均＋Ｓ．Ｄ．）および生存パーセント（右側）を示すグラフを提供する。０日目にＢ１６Ｆ１０細胞をマウスに接種し、４日目に全身照射によりリンパ球を枯渇させた。ＣＡＲ−Ｔ処置は、５日目に単回ボーラス尾静脈注射（ｉ．ｖ．）で投与した。マウスが安楽死基準（＞１００ｍｍ^２）に達するまでの腫瘍面積が示されている。図中に示されている体重変化統計量は、テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。説明文に隣接している生存率統計量は、ログランクマンテル−コックス検定により決定した。^＊、Ｐ＜０．０３；^＊＊、Ｐ＜０．００２；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００２；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１で、有意性が推測される；ｎ．ｓ．、有意でない。

図１３は、７および１３日目にＩＬ−１２（ＩＬ１２についてｎ＝５；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射および抗ＰＤ−１の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で処置した４Ｔ１乳癌腫瘍担持マウスの、ネオアジュバント処置中の体重変化（左側）、原発腫瘍成長および体重（中央）ならびに生存率（右側）を示すグラフである。矢印は、処置の時点を示し、×印は、手術の時点を示す。０日目にマウスの乳房脂肪体に４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を接種した。ネオアジュバント療法を７および１３日目に投与し、原発腫瘍を１６日目に外科的に切除した。術後、マウスをｉｎｖｉｖｏイメージング（ＩＶＩＳ）により転移についてモニターした。各群について、原発腫瘍を切除するまでの腫瘍面積が示されている。図中に示されている体重変化統計量は、テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。説明文に隣接している生存率統計量は、ログランクマンテル−コックス検定により決定した。^＊、Ｐ＜０．０３；^＊＊、Ｐ＜０．００２；^＊＊＊、Ｐ＜０．０００２；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１で、有意性が推測される；ｎ．ｓ．、有意でない。

図１４Ａは、７日目および１３日目にルミカン−ＧＬｕｃでまたはルミカン−ＣＣＬ３とルミカン−ＣＣＬ４とルミカン−ＣＣＬの組合せで腫瘍内処置した４Ｔ１乳癌腫瘍担持マウスの平均腫瘍面積を示すグラフを提供する。ＩＦＮαの腹腔内投与を９日目および１５日目に行った。腫瘍成長（平均＋ＳＥＭ）を１日おきに経時的にモニターした。

図１４Ｂは、７日目および１３日目にルミカン−ＧＬｕｃでまたはルミカン−ＣＣＬ３とルミカン−ＣＣＬ４とルミカン−ＣＣＬ５の組合せで腫瘍内処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスの平均腫瘍面積を示すグラフを提供する。９日目および１５日目にＩＦＮαを腹腔内投与した。腫瘍成長（平均＋ＳＥＭ）を１日おきに経時的にモニターした。

図１４Ｃは、ｉｎｖｉｔｒｏでの４Ｔ１乳房腫瘍細胞の増殖に対する、様々な濃度の融合タンパク質ルミカン−ＧＬｕｃ（ＬｕｍＧＬｕｃ）、ルミカン−ＣＣＬ３（ＬｕｍＣＣＬ３）、ルミカン−ＣＣＬ５（ＬｕｍＣＣＬ５）の効果を示すグラフを提供する。増殖は、４５０ｎｍでの吸光度によるＷＳＴ−１増殖試薬の測定により判定した。

図１４Ｄは、ｉｎｖｉｔｒｏでのＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞の増殖に対する、様々な濃度の融合タンパク質ルミカン−ＧＬｕｃ（ＬｕｍＧＬｕｃ）、ルミカン−ＣＣＬ３（ＬｕｍＣＣＬ３）、ルミカン−ＣＣＬ５（ＬｕｍＣＣＬ５）の効果を示すグラフを提供する。増殖は、４５０ｎｍでの吸光度によるＷＳＴ−１増殖試薬の測定により判定した。

図１５は、腫瘍細胞注射後５日目にプライムならびに１１および１７日目にブーストを尾の付け根に皮下（ｓ．ｃ．）投与するがんワクチンで処置した、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスにおける腫瘍病変の平均腫瘍面積を示すグラフを提供する。がんワクチンを、示されているように単独でまたはＣＣＬ１１−ルミカン、ＴＮＦα、ＩＦＮγもしくはルミカンと組み合わせて投与し、１１、１７、２３および２９日目に腫瘍内投与した。腫瘍面積（平均＋ＳＤ）を１日おきに経時的に測定した。

図１６Ａ〜１６Ｂは、５および１１日目に投与されたルミカン（Ｌｗｔ）（ｉ．ｔｕ．）（図１６Ｂ）またはＣＣＬ１１−ルミカン（１１Ｌ）（ｉ．ｔｕ．）（図１６Ａ）のどちらかと組み合わせて、腫瘍細胞注射後５、１１および１７日目に腫瘍標的化抗体２．５Ｆ−Ｆｃ（ｉ．ｐ．）およびＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｐ．）で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスにおける、腫瘍病変の個々の腫瘍面積を示すグラフを提供する。腫瘍面積を１日おきに経時的にモニターした。

図１７Ａは、Ｉ型コラーゲンへのアゴニスト抗体−ルミカン融合タンパク質の結合を濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ＥＬＩＳＡにより判定した。

図１７Ｂは、ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングにより判定して、マウス（ｍｉｃ）の４Ｔ１腫瘍への腫瘍内注射後の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で蛍光標識された、単独でのまたはルミカンに融合したマウス抗ＦＩＴＣ抗体（４４２０）についてのｉｎｖｉｖｏ蛍光を経時的に定量するグラフを提供する。ｉｎｖｉｖｏ蛍光の測定値を総放射効率（ｐ／ｓ）／（μＷ／ｃｍ２）の単位で提供する。

図１８Ａは、Ｉ型コラーゲン（左側パネル）またはＩＶ型コラーゲン（右側パネル）への、示されている通りの、Ｈｉｓタグ付きルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質のサブセットの結合を、濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ＥＬＩＳＡにより判定した。

図１８Ｂは、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＣ１．１８．４）へのＨｉｓタグ付きルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質の結合を濃度の関数として示すグラフを提供する。結合は、ＥＬＩＳＡにより判定した。抗Ｈｉｓ（クローンａｂ１１８７）を使用して各構築物を検出した。

図１９は、ＳＨＧ顕微鏡法により灰色でコラーゲンをイメージングした、ＯＶＣＡ４３３ヒト卵巣腫瘍担持マウスからのマウス大網組織の３Ｄ顕微鏡画像であって、マウス大網組織におけるＲＦＰ発現ＯＶＣＡ４３３ヒト卵巣腫瘍細胞微小コロニー（赤色）の周囲のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ルミカン（黄色）の特異的蓄積を示す、３Ｄ顕微鏡画像を提供する。標識ルミカンを担腫瘍マウスに腹腔内注射した。

図２０Ａは、フローサイトメトリーにより判定して、Ｂ１６Ｆ１０細胞における自己複製ＲＮＡからの、単独でのＩＬ−１２融合タンパク質または示されている通りの蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）に融合したＩＬ−１２融合タンパク質の発現を示すグラフを提供する。

図２０Ｂは、ＩＬ−１２ＥＬＩＳＡにより判定して、Ｂ１６Ｆ１０細胞における自己複製ＲＮＡからの単独でのＩＬ−１２融合タンパク質または示されている通りの蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）に融合したＩＬ−１２融合タンパク質の発現を示すグラフを提供する。

図２１Ａは、２５、３１、３７、４３、４９、５５および６１日目に、ＰＢＳの腫瘍内注射で処置した（ｎ＝４）か、または腫瘍内コラーゲン固定サイトカインルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンと腹腔内ＴＡ９９および抗ＰＤ−１とで処置した（ｎ＝５）、担腫瘍マウスの腫瘍体積（平均＋ＳＤ）を示すグラフを提供する。各群について、マウスが安楽死基準（＞１２００ｍｍ^３）に達するまでの腫瘍体積が示されている。

図２１Ｂは、２５、３１、３７、４３、４９、５５および６１日目に、腫瘍内ＰＢＳで処置した（ｎ＝１０）、腫瘍内ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンと腹腔内ＴＡ９９および抗ＰＤ−１とで処置した（ｎ＝１４）、腫瘍内ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンと腹腔内抗ＰＤ−１とで処置した（ｎ＝１０）、腫瘍内ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡと腹腔内ＴＡ９９および抗ＰＤ−１とで処置した（ｎ＝９）、または腫瘍内ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ−１２−ＭＳＡと腹腔内抗ＰＤ−１とで処置した（ｎ＝８）、担腫瘍マウスのマンテル−コックス生存率曲線を提供する。矢尻は、処置の時点を示す。全生存率グラフは、腫瘍負荷（＞１２００ｍｍ^３）で死んだマウスまたは処置関連体重減少（＞２０％）で死んだマウスを数えており、後者は、各マウスについて青色「×」により示されている。生存期間をログランクマンテル−コックス検定により比較した。^＊Ｐ＜０．０３、^＊＊＊Ｐ＜０．０００２、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

図２２Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍におけるＬＡＩＲ結合能の測定についての概略図を提供する。

図２２Ｂは、切除された腫瘍およびその細胞外マトリックスの重量を示すグラフを提供する。

図２２Ｃは、マトリックス画分と比較したＢ１６Ｆ１０細胞画分のヒドロキシプロリン含量を示すグラフを提供する。

図２２Ｄは、Ｂ１６Ｆ１０由来のマトリックス画分を１ｍＬのＡＦ６４７標識ＬＡＩＲに入れたときのＬＡＩＲ蛍光の激減を示すグラフを提供する。

図２２Ｅは、Ｂ１６Ｆ１０由来マトリックス画分のマトリックス画分ヒドロキシプロリン含量とＬＡＩＲ結合能との相関関係を示すグラフを提供する。

図２３Ａは、６および１３日目にＰＢＳ対照（ｉ．ｔｕ）（ｎ＝５）またはＬＡＩＲ−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）ＴＡ９９（ｉ．ｐ．）（ｎ＝７）で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍（１×１０^６個の細胞を０日目に接種した）の腫瘍面積を示すグラフを提供する。

図２３Ｂは６および１３日目にＰＢＳ対照（ｉ．ｔｕ）（ｎ＝５）またはＬＡＩＲ−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＴＡ９９（ｉ．ｐ．）（ｎ＝７）で処置したＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウス（１×１０^６個の細胞を０日目に接種した）のマンテル−コックス生存率曲線を提供する。

図２４Ａは、野生型ＬＡＩＲ（ＬＡＩＲ）と比較した、低親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ａ、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｂ、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．ＣおよびＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｄの配列アラインメントを提供する。

図２４Ｂ〜Ｅは、灰色リボンとして示されている野生型ＬＡＩＲ（ＰＤＢ４ＥＴＹ）の結晶構造の描写であって、低親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ａ（図２４Ｂ）、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｂ（図２４Ｃ）、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｃ（図２４Ｄ）およびＬＡＩＲ．３０．ｄ．Ｄ（図２４Ｅ）、の選択された突然変異アミノ酸残基が結合球として選択されている描写を提供する。

図２４Ｆは、ＥＬＩＳＡアッセイ（ｎ＝２）におけるＷＴＬＡＩＲ、ＷＴＬＡＩＲ−ＭＳＡ、ＭＳＡ−ＩＬ−２（非特異的結合対照）および突然変異型ＬＡＩＲ−ＭＳＡ融合体の、１型コラーゲンへの結合を示すグラフを提供する。非線形一部位結合フィットを用いて算出した、各ＬＡＩＲ構築物の結合親和性（Ｋｄ）も示されている。

図２５Ａは、野生型ＬＡＩＲと比較した低親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．ＥおよびＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｆ、の配列アラインメントを提供する。

図２５Ｂ〜Ｃは、灰色リボンとして示されている野生型ＬＡＩＲ（ＰＤＢ４ＥＴＹ）の結晶構造の描写であって、低親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｅ（図２５Ｂ）およびＬＡＩＲ．３０．ｗ．Ｆ（図２５Ｃ）、の選択された突然変異アミノ酸残基が結合球として強調されている描写を提供する。

図２５Ｄは、ＥＬＩＳＡアッセイ（ｎ＝２）におけるＷＴＬＡＩＲ、ＷＴＬＡＩＲ−ＭＳＡ、ＭＳＡ−ＩＬ−２（非特異的結合対照）および突然変異型ＬＡＩＲ−ＭＳＡ融合体の、１型コラーゲンへの結合を示すグラフを提供する。非線形一部位結合フィットを用いてモデル化した、各ＬＡＩＲ構築物の結合親和性（Ｋｄ）も示されている。

図２６Ａは、野生型ＬＡＩＲと比較した高親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．２．Ｋ１．Ｂ、の配列アラインメントを提供する。

図２６Ｂは、灰色リボンとして示されている野生型ＬＡＩＲ（ＰＤＢ４ＥＴＹ）の結晶構造の描写であって、高親和性コラーゲン結合因子、ＬＡＩＲ．３０．２．Ｋ１．Ｂ、の選択された突然変異アミノ酸残基が結合球として強調されている描写を提供する。

図２６Ｃ〜Ｄは、１００ｎＭ（図２６Ｃ）または０．０１ｎＭ（図２６Ｄ）のどちらかのＣＲＰ−ＸＬ−ビオチン中でインキュベートした、野生型ＬＡＩＲ（黒色）またはＬＡＩＲ３０．２．Ｋ１．Ｂ（シアン）を有する酵母のタンパク質提示（ヤギ抗ニワトリＡＦ４８８）に対してＣＲＰ−ＸＬ−ビオチン結合（ストレプトアビジン−ＡＦ６４７）を示す、フローサイトメトリープロットを提供する。

図２６Ｅ〜Ｆは、過剰な非ビオチン化ＣＲＰ−ＸＬとの競合後の異なる時点（０時間、１６時間および４０時間の競合）でのＬＡＩＲ３０．２．Ｋ１．Ｂ（図２６Ｅ）または野生型ＬＡＩＲ（図２６Ｆ）を有する酵母のタンパク質提示（ヤギ抗ニワトリＡＦ４８８）に対して残存する表面ＣＲＰ−ＸＬ−ビオチンシグナル（ストレプトアビジン−ＡＦ６４７）を示す、フローサイトメトリープロットを提供する。

図２６Ｇは、図２６Ｅ〜Ｆに示した動的解離実験における結合ＣＲＰ−ＸＬ−ビオチンの蛍光強度中央値を経時的に示すグラフを提供する。１フェーズ指数関数的減衰フィットを用いてモデル化した推定解離速度も示されている。

コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている免疫調節ドメインを含む免疫調節融合タンパク質が、本明細書で提供される。このような融合タンパク質は、免疫調節ドメイン（例えば、サイトカイン、抗体）を、それが全身播種されないように、局在させる。免疫調節ドメインの全身播種は、目的の部位（例えば、腫瘍）からの迅速なクリアランスに起因して有効性の低下をもたらすことがあり、および／または腫瘍の外部の非標的細胞に対する作用に起因して毒性をもたらすこともある。したがって、コラーゲン結合タンパク質への免疫調節ドメインの連結は、全身播種を防止するように免疫調節ドメインを局在させ、それによって、免疫調節ドメインを目的の部位に維持し、毒性をもたらす可能性がある潜在的オフターゲット効果を低下させる。
定義

本特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、別段の定めがない限り、下記に示される通りに定義される。親仮特許出願において使用された用語と直接矛盾する場合、本願で使用される用語が優先されるものとする。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

本明細書で使用される場合、「約」は、当業者には理解されるであろうが、それが使用される文脈に依存してある程度変わることになる。「約」は、それが使用されている文脈から考えて当業者に明白でないこの用語の使用がある場合、特定の値のプラスまたはマイナス１０％までを意味することになる。

本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」は、本明細書で開示される天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全に促進、増加または活性化する、任意の分子（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）を指す。好適なアゴニスト分子は、具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子などを含む。一部の実施形態では、アゴニストの存在下での活性化は、用量依存的に観察される。一部の実施形態では、測定されるシグナル（例えば、生物活性）は、同等の条件下で陰性対照を用いて測定されるシグナルより、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％高い。本開示の方法における使用に好適なアゴニストを同定する方法も、本明細書で開示される。例えば、これらの方法は、結合アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｃ）システム、および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含むが、これらに限定されない。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、受容体またはリガンド）に結合するアゴニストの能力を判定し、したがって、ポリペプチドの活性を促進、増加または活性化するアゴニストの能力を示す。アゴニストの有効性、例えば、ポリペプチドの機能を活性化または促進するアゴニストの能力を、機能アッセイを使用して判定することもできる。例えば、機能アッセイは、ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させること、およびそのポリペプチドに通常付随する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。アゴニストの作用強度は、通常は、そのＥＣ_５０値（アゴニスト応答の５０％を活性化するために必要とされる濃度）によって定義される。ＥＣ_５０値が低いほど、アゴニストの作用強度が高く、最大の生物学的応答を活性化するために必要とされる濃度が低い。

用語「アルブミン」は、ヒトアルブミン（配列番号４２）と同じまたは非常に類似している三次元構造を有するタンパク質であって、長い血清半減期を有するタンパク質を指す。例示的なアルブミンタンパク質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；配列番号４２および４３）、霊長類血清アルブミン（例えば、チンパンジー血清アルブミン）、ゴリラ血清アルブミンまたはマカク血清アルブミン、げっ歯動物血清アルブミン（例えば、ハムスター血清アルブミン）、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミンおよびラット血清アルブミン、ウシ亜科動物血清アルブミン（例えば、雌ウシ血清アルブミン）、ウマ科動物血清アルブミン（例えば、ウマ血清アルブミンまたはロバ血清アルブミン）、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミンおよびブタ血清アルブミンが挙げられる。

用語「改善」は、病状、例えばがんの処置（その予防、重症度もしくは進行の低下、寛解または治癒を含む）をもたらす、任意の治療上有益な結果を指す。

「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸はもちろん、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体も指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされているもの、ならびに後で改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているα炭素（ａｎａｃａｒｂｏｎ）、を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは、改変されたＲ基｛例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に公知の３文字記号によって言及されることもあり、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨されている１文字記号によって言及されることもある。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及されることもある。

「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）中の少なくとも１つの既存アミノ酸残基の、第２の異なる「代替」アミノ酸残基での置き換えを指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加のアミノ酸の組込みを指す。挿入は、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入から通常はなるであろうが、より大きい「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５またはさらには約１０、１５もしくは２０までのアミノ酸残基の挿入を行うこともできる。挿入される残基は、上で開示されたように、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともある。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。

本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、本明細書で開示される天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害または中和する任意の分子（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）を指す。好適なアンタゴニスト分子は、具体的には、アンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子などを含む。一部の実施形態では、アンタゴニストの存在下での阻害は、用量依存的に観察される。一部の実施形態では、測定されるシグナル（例えば、生物活性）は、同等の条件下で陰性対照を用いて測定されるシグナルより、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。本開示の方法における使用に好適なアンタゴニストを同定する方法も、本明細書で開示される。例えば、これらの方法は、結合アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｃ）システム、および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含むが、これらに限定されない。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、受容体またはリガンド）に結合するアンタゴニストの能力を判定し、したがって、ポリペプチドの活性を阻害、中和または遮断するアンタゴニストの能力を示す。アンタゴニストの有効性、例えば、ポリペプチドまたはアゴニストの機能を阻害するアンタゴニストの能力を、機能アッセイを使用して判定することもできる。例えば、機能アッセイは、ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させること、およびそのポリペプチドに通常付随する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。アンタゴニストの作用強度は、通常は、そのＩＣ_５０値（アゴニスト応答の５０％を阻害するために必要とされる濃度）によって定義される。ＩＣ_５０値が低いほど、アンタゴニストの作用強度が高く、最大の生物学的応答を阻害するために必要とされる濃度が低い。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとを含む全抗体を指す。全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプを含む。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体を、様々な種、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスのいずれかにおいて生じさせることができ、またはそれらのいずれかから採取することができる。抗体は、精製または組換え抗体であることもある。

本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」、「抗原結合性断片」または類似の用語は、標的抗原に結合して標的抗原の活性を促進する、誘導するおよび／または増加させる能力を保持する抗体の断片を指す。そのような断片は、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）_２断片を含む。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含む単一ポリペプチド鎖である。加えて、イントラボディ、ミニボディ、トリアボディおよびディアボディも、抗体の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合する。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａｅｔａｌ．（２００１）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２４８（１）：４７−６６；ＨｕｄｓｏｎａｎｄＫｏｒｔｔ（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２３１（１）：１７７−１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２（１２）：１１２１−１１２３；ＲｏｎｄｏｎａｎｄＭａｒａｓｃｏ（１９９７）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５１：２５７−２８３を参照されたく、これらの各々の開示は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」は、例えば、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体も含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓｅｔａｌ．（２００１）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ２６：２３０−２３５；Ｎｕｔｔａｌｌｅｔａｌ．（２０００）ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈ１：２５３−２６３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ２３１：２５−３８；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／０４６７８およびＷＯ９４／２５５９１；ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたく、これらの全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変された２つのＶＨドメインを含む、単一ドメイン抗体を提供する。

「Ｂ７ファミリー」は、活性化および阻害性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーは、活性化リガンドＢ７−１およびＢ７−２、ならびに阻害性リガンドＢ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４を少なくとも包含する。Ｂ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８に結合し、Ｂ７−Ｈ１（すなわち、ＰＤ−Ｌ１）は、ＰＤ−１に結合し、Ｂ７−Ｈ２は、ＩＣＯＳに結合する。Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４は、未知の受容体に結合する。さらに、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４は、腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞上で上方調節されることが示されている。完全ｈＢ７−Ｈ３およびｈＢ７−Ｈ４配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ５ＺＰＲ３およびＡＡＺ１７４０６（配列番号４９および５０）で見出すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、（ｉ）少なくとも１つの所定のＣＡＲリガンドもしくは抗原にまたは所定のＣＡＲリガンドおよび抗原に結合することができる細胞外ドメインと、（ｉｉ）細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１つまたは複数の細胞質内ドメインを含む細胞内セグメントと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含む、人工膜貫通型タンパク質受容体を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。

「ＣＡＲ抗原」と同義的に使用される句「ＣＡＲリガンド」は、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外ドメイン）に特異的に結合することができる任意の天然もしくは合成分子（例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸）またはその一部もしくは断片を意味する。一部の実施形態では、ＣＡＲリガンドは、腫瘍関連抗原またはその断片である。一部の実施形態では、ＣＡＲリガンドは、タグである。

「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、細胞における生物学的プロセスの活性化または阻害、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化を引き起こすシグナルを伝達するように機能することが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドドメインを意味する。例としては、ＩＬＲ鎖、ＣＤ２８および／またはＣＤ３ζが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「がん抗原」は、（ｉ）腫瘍特異性抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異性抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胎児性抗原、（ｖｉ）自家腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）増殖因子受容体、（ｘ）増殖因子リガンド、および（ｘｉ）がんに関連する任意の他のタイプの抗原または抗原提示細胞または物質を指す。

本明細書で使用される場合、「がんワクチン」は、１つまたは複数の腫瘍関連抗原を有する細胞を攻撃するように免疫系を誘導する処置剤を指す。ワクチンは、既存のがんを処置することができ（例えば、治療的がんワクチン）、またはある特定の個体におけるがんの発生を防止することができる（例えば、予防的がんワクチン）。ワクチンは、抗原を有する腫瘍細胞を認識する、したがって腫瘍成長を防止することになる、メモリー細胞を生じさせる。

本明細書で使用される場合、用語「ケモカイン」は、方向性を持った走化性を誘導する小さいサイトカインまたはシグナル伝達タンパク質のファミリーのメンバーを指す。ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、（Ｘ）ＣおよびＣＸ３Ｃという４つのサブファミリーに分類される。

本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン」は、細胞外空間に位置する主要構造タンパク質を指し、多くの異なる組織の機械的完全性を維持する。コラーゲンの分子構成によってその機能が決まる。現時点で２０を超える型のコラーゲンが同定されており、Ｉ型が最も一般的である。

本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン結合ドメイン」は、コラーゲンに結合するポリペプチドまたはその一部分を指す。コラーゲン結合ドメインは、より大きい融合タンパク質、生物活性剤または医薬剤の一部であることもある。コラーゲンへの組成物、ポリペプチドもしくはその一部分、融合タンパク質、または医薬剤あるいは生物活性剤の結合は、当技術分野において公知の方法（例えば、コラーゲン結合アッセイ；例えばＴｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，（２００２）ＳｅｍｉｎＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ２８（２）：１４９−１６０を参照されたい）によって判定することができる。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、公知または参照コラーゲン結合タンパク質とコラーゲンへの結合について競合するその能力によって判定される。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、天然に存在するコラーゲン結合タンパク質またはコラーゲン受容体に由来する。コラーゲン結合ドメインを構成する、コラーゲン結合タンパク質およびコラーゲン受容体は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｖｅｎｓｓｏｎｅｔａｌ．，（２００１）ＯｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓＣａｒｔｉｌａｇｅ９ＳｕｐｐｌＡ：Ｓ２３−２８；ＬｅｉｔｉｎｇｅｒａｎｄＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒＥ（２００７）ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ２６（３）：１４６−１５５を参照されたい）。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、真核生物コラーゲン結合タンパク質に由来する。真核生物コラーゲン結合タンパク質は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｙｍｅｒｓｋｙｅｔａｌ．，（１９９７）ＮａｔＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ４：８３３−８３８を参照されたい）。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに対するその親和性を増加させる１つまたは複数の突然変異を含む。

本明細書で使用される場合、「併用療法」は、有益な併用効果を提供することになるレジメンで逐次的なまたは同時に行われる方式での各薬剤または治療の投与、および実質的に同時に行われる方式での、例えば、固定比のこれらの活性薬剤を有する単一のカプセルで、または各薬剤についての複数の別々のカプセルでの、これらの薬剤または治療の併用投与を包含する。併用療法は、個々の要素が、異なる時点でおよび／または異なる経路により投与されることもあるが、それらが、併用療法の各薬剤または腫瘍処置手法の相互作用または薬物動態および薬力学的効果によって有益な効果を提供するように一緒に作用する、組合せも含む。

「共刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさって、Ｔ細胞増殖および／または重要な分子の上方調節もしくは下方調節をもたらすシグナルを指す。

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することによって免疫系を下方調節する。用語「ＣＴＬＡ−４」は、本明細書で使用される場合、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）、ｈＣＴＬＡ−４のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ−４と共通エピトープを少なくとも１つは有するアナログを含む。完全ｈＣＴＬＡ−４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１６４１０（配列番号４６）で見出すことができる。

指定ポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部分と本質的に同一であるアミノ酸配列であって、その一部分が、少なくとも１０〜２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０アミノ酸からなる、アミノ酸配列、またはその配列にその起源があると当業者に別様に識別可能であるアミノ酸配列を有する。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して１つまたは複数の突然変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された１つまたは複数のアミノ残基を有することがあり、または１つもしくは複数のアミノ酸残基挿入もしくは欠失を有する。

ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含むことができる。そのようなバリアントは、出発分子と１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。ある特定の実施形態では、バリアントは、例えばバリアント分子の長さにわたって、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、および最も好ましくは約９５％〜１００％未満の、アミノ酸配列同一性または類似性を有することになる。

ある特定の実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列との間には１つのアミノ酸の相違がある。この配列に関する同一性または類似性は、配列をアラインメントし、最大配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同じ残基）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと、本明細書では定義される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列概要表から選択されるアミノ酸配列からなる、から本質的になる、またはそのようなアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列概要表から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列概要表から選択される連続するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の連続するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列概要表から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００または５００（またはこれらの数の中の任意の整数）の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ヌクレオチド配列によりコードされる。本開示のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子療法、タンパク質発現および精製、突然変異導入、それを必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種、例えば受動免疫のための、抗体生成、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブ生成などを含む、いくつかの用途に有用であり得る。ある特定の実施形態では、本開示のヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３から選択されるヌクレオチド配列を含む、そのようなヌクレオチド配列からなる、またはそのようなヌクレオチド配列から本質的になる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列概要表に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列概要表に示される連続するヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の連続するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列概要表に示されるヌクレオチド配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００または５００（またはこれらの数の中の任意の整数）の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なポリペプチドを、それらが由来した天然に存在するまたは天然の配列とは配列が異なるがその天然の配列の望ましい活性を保持するように、変更することができることも、当業者には理解されるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基の保存的置換または変化につながるヌクレオチドまたはアミノ酸置換を行うことができる。部位指定突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの、標準的な技法によって、突然変異を導入することができる。

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸残基の、例えば、必須または非必須アミノ酸残基の、保存的アミノ酸置換を含むことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、結合ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似した鎖で、置き換えることができる。あるいは、ある特定の実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発などによって、コード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じた突然変異体を本開示の結合ポリペプチドに組み込み、所望の標的に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。

本明細書で使用される場合、用語「エフェクター細胞」または「エフェクター免疫細胞」は、免疫応答に関与する細胞、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、抗原を特異的に認識する。免疫エフェクター細胞の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。本明細書で使用される場合、用語「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター応答」は、標的に対する免疫応答を促進する免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。

本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、天然免疫グロブリンの、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって構成される部分を指す。一部の実施形態では、用語「Ｆｃドメイン」は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない、単一免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分を指す。一部の実施形態では、用語「Ｆｃドメイン」は、Ｆｖドメインも含む、単一免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分を指す。しかるが故に、Ｆｃドメインは、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」とも呼ばれることがある。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全Ｆｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中間部および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアント、一部分もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全Ｆｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部分）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部分からなる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部分）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部分）からなる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）およびＣＨ３ドメインからなる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部分）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部分）からなる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠いている。本明細書におけるＦｃドメインは、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全てまたは一部を含むポリペプチドを一般に指す。これは、全ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むポリペプチド、ならびに例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む、そのようなペプチドの断片を含むが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、任意の種の、および／またはこれらに限定されないがヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含む任意のサブタイプの、免疫グロブリンに由来し得る。ヒトＩｇＧ１定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔＰ０１８５７および配列番号１１４で見出すことができる。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号１１５で見出すことができる。Ｆｃドメインは、天然ＦｃおよびＦｃバリアント分子を包含する。Ｆｃバリアントおよび天然Ｆｃと同様に、用語Ｆｃドメインは、全抗体から消化されたのか、他の手段により産生されたのかを問わず、単量体または多量体形態の分子を含む。Ｆｃドメインへのアミノ酸残基番号の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う。例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＴａｂｌｅｏｆＣｏｎｔｅｎｔｓ，ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｔａｎｔＲｅｇｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓｓｅｃｔｉｏｎｓ），５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＮＩＨｖｏｌ．１：６４７−７２３（１９９１）；Ｋａｂａｔｅｔａｌ．， ”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ” ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤｖｏｌ．ｌ：ｘｉｉｉ−ｘｃｖｉ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９）を参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に示されるように、任意のＦｃドメインを、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインとアミノ酸配列が異なるように改変することができることは、当業者には理解されるであろう。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）が低下している。

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことがある。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子におよび一部はＩｇＧ３分子に由来する、キメラヒンジ領域を含むこともある。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子におよび一部はＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含むこともある。

本明細書で使用される場合、用語「ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー」または「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３。ある特定の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）４。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。ある特定の実施形態では、ｎ＝７である。ある特定の実施形態では、ｎ＝８である。ある特定の実施形態では、ｎ＝９である。ある特定の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。

本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎｖｉｖｏで体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８（６４７４）：８５６−８５９）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ７６４：５３６−５４６を参照されたい）。しかし、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含まない。

本明細書で使用される場合、用語「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からならない生物に見られるものに対応する、アミノ酸配列またはコード核酸配列であって、一般に、トランスジェニック非ヒト動物のもの以外の種からのアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する、抗体を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、造血細胞を起源とする細胞であり、免疫応答に関与する。免疫細胞は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、および骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球）を含む。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、免疫細胞を調節する、共刺激および阻害シグナルを指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントは、阻害シグナルである。ある特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用である。ある特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ２８結合を置き換えるための、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。ある特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ３分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の間の相互作用である。ある特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９の間の相互作用である。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント遮断薬」は、１つもしくは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、そのようなタンパク質に干渉する、またはそのようなタンパク質をモジュレートする分子を指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナル伝達を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、阻害シグナル伝達を妨げる小分子である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、チェックポイント遮断薬タンパク質間の相互作用を防止する抗体、その断片または抗体模倣物、例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＬＡＧ３とそのリガンドの間のまたはＴＩＭ−３とそのリガンドの間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。

本明細書で使用される場合、用語「免疫調節融合タンパク質」は、少なくとも１つの免疫調節ドメインに作動可能に連結されているコラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドを指す。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、リンカーを介して免疫調節ドメインに作動可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、用語「免疫調節ドメイン」は、免疫応答の活性化または抑制（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激）をもたらす活性を付与するポリペプチド（例えば、サイトカイン、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体）を指す。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、その同種リガンドまたは受容体に結合することによって免疫応答の活性化または抑制をもたらすポリペプチドを指す。

用語「免疫応答を誘導すること」および「免疫応答を強化すること」は、同義的に使用され、特定の抗原に対する免疫応答（すなわち、受動免疫応答または適応免疫応答のどちらか）の刺激を指す。ＣＤＣまたはＡＤＣＣを誘導することに関して使用される場合の用語「誘導する」は、特定の直接的な細胞死滅機序の刺激を指す。

本明細書で使用される場合、「予防を必要とする」、「処置を必要とする」、または「それを必要とする」対象は、適切な医師（例えば、ヒトの場合は医者、看護師または診療看護師；非ヒト哺乳動物の場合は獣医）の判断により、所与の処置（例えば、本明細書に記載される融合タンパク質を含む組成物での処置）の恩恵を合理的に受けることになる者を指す。

用語「ｉｎｖｉｖｏ」は、生体内で起こるプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「インターロイキン（ＩＬ）−２」は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を活性化および誘導する多機能サイトカインを指す。ＩＬ−２は、アルファ、ベータおよびガンマサブユニットから構成されているその受容体であるＩＬ−２Ｒに結合することにより、シグナル伝達する。ＩＬ−２シグナル伝達は、抗原により活性化されたＴ細胞の増殖を刺激する。

本明細書で使用される場合、用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すように意図されている（例えば、免疫チェックポイント遮断薬または共刺激分子に結合する単離された抗体は、目的の標的以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、エピトープに特異的に結合する単離された抗体は、異なる種からの他の標的に対して交差反応性を有することがある。加えて、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を通常は実質的に含まない。

本明細書で使用される場合、用語「単離された核酸分子」は、本明細書で開示される融合タンパク質、ポリペプチド、抗体または抗体部分をコードする核酸を指し、融合タンパク質、ポリペプチド、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、他のヌクレオチド配列（これらの他の配列は、ヒトゲノムＤＮＡ中でその核酸に天然に隣接していることがある）を含まない、核酸分子を指すように意図されている。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。

本明細書で使用される場合、用語「ＫＤ」または「Ｋ_Ｄ」は、例えば、リガンドと受容体、抗原と抗体、またはコラーゲン結合タンパク質とコラーゲンの間の、結合反応の平衡解離定数を指す。Ｋ_Ｄの値は、結合タンパク質解離速度定数（ｋｄ）の結合タンパク質会合速度定数（ｋａ）に対する比の数値表現である。Ｋ_Ｄの値は、結合タンパク質のその結合パートナーへの結合親和性に反比例する。Ｋ_Ｄ値が小さいほど、結合タンパク質のその結合パートナーに対する親和性は大きい。親和性は、単一分子のそのリガンドへの結合の強度であり、通常は、二分子相互作用の強度の評価および順位付けに使用される平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定され、報告される。

本明細書で使用される場合、用語「ｋｄ」または「ｋ_ｄ」（あるいは「ｋｏｆｆ」または「ｋ_ｏｆｆ」）は、結合タンパク質／パートナー複合体からの結合タンパク質の解離についての解離速度定数を指すように意図されている。ｋｄの値は、１秒当たりの減衰または解離する複合体の分率の数値表現であり、秒^−１という単位で表される。

本明細書で使用される場合、用語「ｋａ」または「ｋ_ａ」（あるいは「ｋｏｎ」または「ｋ_ｏｎ」）は、結合タンパク質と結合パートナーの会合についての会合速度定数を指すように意図されている。ｋａの値は、結合パートナーの１モル（１Ｍ）溶液中で１秒当たりに形成される抗体／抗原複合体の数の数値表現であり、Ｍ^−１秒^−１という単位で表される。

本明細書で使用される場合、用語「連結した／された／される」、「作動可能に連結した／された／される」、「融合した／された／される」または「融合」は、同義的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーション、非共有結合性複合体形成または組換え手段を含むあらゆる手段による、２つより多くのエレメントまたは成分またはドメインの結合を指す。化学的コンジュゲーションの方法（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用する）は、当技術分野において公知である。

本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、組成物または薬剤のその意図された標的組織または部位への血管系による輸送に依拠しない送達を指す。例えば、免疫調節融合タンパク質、またはこの融合タンパク質を含む組成物は、融合タンパク質もしくは組成物の注射もしくは注入により、または融合タンパク質もしくは組成物を含有するデバイスの注射もしくは植え込みにより、送達することができる。標的組織または部位の近傍への局所投与後、組成物もしくは薬剤、またはその１つもしくは複数の成分は、意図された標的組織または部位に拡散し得る。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ウイルスベクター、電気穿孔、免疫調節融合タンパク質を発現する細胞の移植、またはレプリコンによって局所投与される。

「リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合によるリンパ球活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を強化し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機能を阻害する。用語「ＬＡＧ３」は、本明細書で使用される場合、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全ｈＬＡＧ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１８６２７（配列番号４７）で見出すことができる。

用語「哺乳動物」または「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトと非ヒトの両方を含み、これらに限定されないがヒト、非ヒト霊長類、イヌ科動物、ネコ科動物、ネズミ科動物、ウシ亜科動物、ウマ科動物およびブタ類を含む。

「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態どちらかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特別な制約がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も明確に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって果たすことができる（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８，１９８５；およびＣａｓｓｏｌｅｔａｌ，１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８，１９９４）。アルギニンおよびロイシンの場合、２番目の塩基の改変も保存的であり得る。核酸という用語は、遺伝子、遺伝子によりコードされるｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと、同義的に使用される。

本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡもしくは改変ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されていることがある。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖またはより典型的には二本鎖であり得るまたは一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で、構成されていることがある。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域で構成されていることがある。ポリヌクレオチドは、安定性のためにまたは他の理由のために改変された、１つまたは複数の改変塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有することもある。「改変」塩基は、例えば、トリチル化塩基、および非通常塩基、例えばイノシンを含む。様々な改変をＤＮＡおよびＲＮＡに加えることができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態を包含する。

本明細書で使用される場合、「非経口投与」、「非経口投与した／された」、および他の文法的に等価の句は、通常は注射による、腸内および局部的投与以外の投与方法を指し、限定ではないが、静脈内、鼻腔内、眼内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、結腸内／腸管内、膀胱内／膣内、および胸骨内注射および注入を含む。

２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈での用語「同一性パーセント」は、下記の配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して測定してまたは目視検査により測定して、比較し、最大に一致するようにアラインメントしたとき、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定パーセンテージを有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。用途に依存して、「同一性パーセント」は、比較することになる配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在することもあり、または、代替的に、比較すべき２配列の完全長にわたって存在することもある。配列比較のために、通常は１つの配列が、被験配列を比較する参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。すると、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列同一性パーセントを計算する。

比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，上掲を参照されたい）により、行うことができる。

配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手できる。

本明細書で一般的に使用される場合の「薬学的に許容される」は、正当な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織、臓器および／または体液と接触する使用に適しており、過度の毒性も、刺激も、アレルギー反応も、他の問題も、他の合併症も伴わず、妥当な損益比に見合っている、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では同義的に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーばかりでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「プログラム死−１（ＰＤ−１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫阻害性受容体を指す。ＰＤ−１は、ｉｎｖｉｖｏで既に活性化されているＴ細胞上に主に発現され、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドに結合する。用語「ＰＤ−１」は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ−１と共通のエピトープを少なくとも１つは有するアナログを含む。完全ｈＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１７７３（配列番号４４）で見出すことができる。

「プログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）」は、ＰＤ−１への結合時にＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方調節する、ＰＤ−１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの一方（他方はＰＤ−Ｌ２である）である。用語「ＰＤ−Ｌ１」は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−Ｌ１のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ−Ｌ１と共通のエピトープを少なくとも１つは有するアナログを含む。完全ｈＰＤ−Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号４５）で見出すことができる。

本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるタンパク質（融合タンパク質、抗体または断片）のいずれかに適用される場合の用語「精製された」または「単離された」は、それに天然に付随する成分（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生体分子もしくは有機分子）、例えば、タンパク質を発現する真核生物における他のタンパク質、脂質および核酸から、分離または精製されたポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、それが試料中の全タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７または９９）重量％を占める場合、精製されている。

本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」および「選択的に結合する」は、コラーゲン結合ドメインによるコラーゲンへの結合、または抗体による所定の抗原上のエピトープへの結合を指す。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに対するＫ_Ｄに基づいて、コラーゲンに特異的に結合する、または選択的に結合する（すなわち、コラーゲンへの結合についてのＫ_Ｄは、少なくともフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンに対するＫ_Ｄより低い）。

用語「十分な量」または「〜に十分な量」は、所望の効果を生じさせるのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズを低減するのに十分な量を意味する。

用語「Ｔ細胞」は、細胞表面のＴ細胞受容体の存在により他の白血球と区別することができるタイプの白血球を指す。Ｔ細胞のいくつかのサブセットがあり、そのようなサブセットは、これらに限定されないが、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞としても公知）ならびにサブタイプ、例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_Ｈ９およびＴ_ＦＨ細胞など；細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔ_Ｃ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔキラー細胞、キラーＴ細胞としても公知）；メモリーＴ細胞ならびにサブタイプ、例えば、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭおよびＴ_ＥＭＲＡ細胞）、および常在性メモリーＴ細胞（Ｔ_ＲＭ細胞）など；調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞またはサプレッサーＴ細胞としても公知）ならびにサブタイプ、例えば、ＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、ＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ_ｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞およびＴ_ｒｅｇ１７細胞など；ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞としても公知）；粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）；ならびにガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、例えば、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞などを含む。上述のまたは言及されていないＴ細胞のいずれか１つまたは複数が、本明細書で開示される方法の標的細胞型であることもある。

用語「Ｔ細胞細胞傷害性」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化により媒介される任意の免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、サイトカイン産生、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、グランザイムまたはパーフォリン産生、および感染病原体のクリアランスが挙げられる。

「Ｔ細胞膜タンパク質−３（ＴＩＭ３）」は、Ｔ_Ｈ１細胞応答の阻害によりリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類のがんにおいて上方調節されるガレクチン９である。用語「ＴＩＭ３」は、本明細書で使用される場合、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全ｈＴＩＭ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ８ＴＤＱｏ（配列番号４８）で見出すことができる。

「治療用抗体」は、抗体、抗体の断片、または抗体に由来する構築物であり、標的細胞上の細胞表面抗原に結合して治療効果を生じさせることができる。そのような抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体であることがある。そのような抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である。そのような抗体は、抗体の一本鎖Ｆｃ断片、ミニボディおよびディアボディを含む。がん療法に有用であることが当技術分野において公知である治療用抗体のいずれかを、本明細書で開示される方法における使用に好適な併用療法において使用することができる。治療用抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、またはポリクローナル抗体であってもよい。好ましい実施形態では、治療用抗体は、がん抗原を標的とする。

用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効である量である。治療有効量は、予防を治療と見なすことができる場合、「予防有効量」であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、その核酸分子が連結されている別の核酸を輸送することができる、核酸分子を指すことが意図されている。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによってそれらのベクターは宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらのベクターが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最もよく使用される形態であるので、同義的に使用されることがある。しかし、本開示は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、そのような他の形態の発現ベクターを含むように意図されている。
免疫調節融合タンパク質

一部の態様では、本開示は、免疫調節ドメインに作動可能に連結されているコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、リンカーをさらに含み、したがって、コラーゲン結合ドメインは、リンカーに作動可能に連結されており、リンカーは、免疫調節ドメインに作動可能に連結されている。
Ｉ．コラーゲン結合ドメイン

一部の実施形態では、本開示は、コラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、約５〜１００ｋＤａ、約１０〜８０ｋＤａ、約２０〜６０ｋＤａ、約３０〜５０ｋＤａの、または約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａもしくは約１００ｋＤａのＭＷを有する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａもしくは約１００ｋＤａである。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、約３０ｋＤａである。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、約４０ｋＤａである。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１０〜３５０、約１０〜３００、約１０〜２５０、約１０〜２００、約１０〜１５０、約１０〜１００、約１０〜５０、または約１０〜２０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１５アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約２０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約３０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約４０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約５０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約６０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約７０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約８０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約９０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１００アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１２０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約１５０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約２００アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約２５０アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約３００アミノ酸である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、長さ約３５０アミノ酸である。
Ａ．等電点

等電点（ｐＩ、ｐＨ（Ｉ）、ＩＥＰ）は、特定の分子（例えば、コラーゲン結合ドメイン）が正味電荷を有さないかまたは電気的に中性である、ｐＨである。表１は、本明細書に記載される例示的なコラーゲン結合ドメインの算出ｐＩを提供する。表１に示すコラーゲン結合ドメインの等電点（ｐＩ）は、ＳｗｉｓｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓからのＥｘＰＡＳｙツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）を使用して計算した。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、約１０、約８、約６、約４、約２または約１未満（＜）の等電点ｐＩを有する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、１０未満（＜）の等電点ｐＩを有する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、１０未満（＜）の等電点ｐＩおよび５ｋＤａより大きい（＞）分子量（ＭＷ）を有する。
表１：例示的コラーゲン結合ドメインの算出ｐＩ

Ｂ．Ｉ型コラーゲン

コラーゲンは、細胞外空間内に位置する主要構造タンパク質であり、Ｉ型コラーゲンは、哺乳動物に最も大量に存在するタンパク質である（ＤｉＬｕｌｌｏｅｔａｌ．，（２００２）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７７（６）：４２２３−４２３１）。Ｉ型コラーゲンの基本構造単位は、２つのα１（Ｉ）鎖と１つのα２（Ｉ）である３つのコイル状サブユニットからなる、長い（３００ｎｍ）、細い（直径１．５ｎｍ）タンパク質である。各鎖は、特徴的な右巻きトリプルヘリックスで互いに巻き付いている１０５０のアミノ酸を含有する。ヒトの場合、Ｉ型コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２遺伝子によりコードされる。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子は、Ｉ型コラーゲンのプロアルファ１鎖をコードする。ＣＯＬ１Ａ２遺伝子は、Ｉ型コラーゲンのプロアルファ２鎖をコードし、そのトリプルヘリックスは２つのアルファ１鎖と１つのアルファ２鎖を含む。Ｉ型は、ほとんどの結合組織に見られる原線維形成コラーゲンであり、骨、角膜、真皮および腱に大量に存在する。

Ｉ型コラーゲンのヒトアルファ１鎖前駆体の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９０（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００７９．２）に示されている。

Ｉ型コラーゲンのヒトアルファ２鎖前駆体の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９１（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００８０．２）に示されている。
Ｃ．ＩＶ型コラーゲン

ＩＶ型コラーゲンは、ポリペプチドのファミリーから構成されており、哺乳動物基底膜の主要構成要素である（Ｔｉｍｐｌ（１９８９）ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１８０：４８７−５０２；Ｐａｕｌｓｓｏｎ（１９９２）ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌ２７：９３−１２７）。α１（ＩＶ）およびα２（ＩＶ）鎖は、ヒトでは第１３染色体上に対で頭−頭の形で位置する明確に異なる遺伝子（それぞれ、ＣＯＬ４Ａ１およびＣＯＬ４Ａ２）の産物である（Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ．，（１９９３）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６８：２６０３３−２６０３６）。α３（ＩＶ）およびα４（ＩＶ）鎖（それぞれ、ＣＯＬ４Ａ３およびＣＯＬ４Ａ４遺伝子によりコードされる）は、ヒトでは２番染色体上に同じ配向で存在し、α５（ＩＶ）およびα６（ＩＶ）鎖（それぞれ、ＣＯＬ４Ａ５およびＣＯＬ４Ａ６遺伝子によりコードされる）は、ヒトではＸ染色体上に位置する（Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ．，（１９９１）ｉｎＰａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄＫａｎｇＡ．（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ），ｐｐ１７−３０）。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ１鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９２（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１１５１９３５０．１）に示されている。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ２鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９３（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１８３７．２）に示されている。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ３鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９４（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００８２．２）に示されている。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ４鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００８３．３）に示されている。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ５鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９６（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１１５２９１５１．２）に示されている。

ＩＶ型コラーゲンのヒトアルファ６鎖の例示的なアミノ酸配列は、配列番号９７（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００６７２４６８０．１）に示されている。

したがって、一部の実施形態では、本開示は、コラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヒトＩ型コラーゲンおよび／またはヒトＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヒトＩ型コラーゲンに結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヒトＩＶ型コラーゲンに結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヒトＩ型コラーゲンおよびヒトＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヒトＩ型コラーゲンまたはヒトＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する。
Ｄ．コラーゲンへの結合親和性

一部の実施形態では、本開示は、コラーゲン結合アッセイにより判定して約０．５ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、コラーゲン結合アッセイにより判定して約５ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、コラーゲン結合アッセイにより判定して約５０ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、コラーゲン結合アッセイにより判定して約５００ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲン結合アッセイにより判定して約０．５〜５ｎＭ、５〜５０ｎＭ、または５０〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲン結合アッセイにより判定して約５０〜１００ｎＭ、１００〜２００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、３００〜４００ｎＭ、または４００〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合アッセイは、コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインの結合親和性を判定する。一部の実施形態では、コラーゲン結合アッセイは、Ｉ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインの結合親和性を判定する。一部の実施形態では、コラーゲン結合アッセイは、ＩＶ型コラーゲンに対する結合親和性を判定する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合アッセイは、ＥＬＩＳＡである。コラーゲン結合ＥＬＩＳＡを行うための方法および技術は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，（２０００）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５：４２０５−４２０９を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＥＬＩＳＡにより判定して約０．５ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＥＬＩＳＡにより判定して約５ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＥＬＩＳＡにより判定して約５０ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＥＬＩＳＡにより判定して約５００ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＥＬＩＳＡにより判定して約０．５〜５ｎＭ、４〜４０ｎＭ、５０〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＥＬＩＳＡにより判定して約５０〜１００ｎＭ、１００〜２００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、３００〜４００ｎＭ、または４００〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合アッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。コラーゲン結合ＳＰＲアッセイを行うための方法および技術は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓａｅｎｋｏｅｔａｌ．，（２００２）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ３０２（２）：２５２−２６２を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＳＰＲアッセイにより判定して約５００ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合するコラーゲン結合ドメインを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＳＰＲアッセイにより判定して約５０〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＳＰＲアッセイにより判定して約５０〜１００ｎＭ、１００〜２００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、３００〜４００ｎＭ、または４００〜５００ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でコラーゲンに特異的に結合する。

句「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする、光学現象を含む。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
Ｅ．コラーゲンへの結合特異性

一部の実施形態では、本開示は、コラーゲンには特異的に結合するが、これらに限定されないがフィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンＣ、オステオポンチンおよびフィブリノゲンを含む１つまたは複数の非コラーゲン細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分には特異的に結合しない、コラーゲン結合ドメインを含む、免疫調節融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、１つまたは複数の非コラーゲンＥＣＭ成分へのＫ_Ｄより低いＫ_Ｄでコラーゲンに結合する。一部の実施形態では、Ｉ型コラーゲンに対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対するコラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、１つまたは複数の非コラーゲンＥＣＭ成分へのＫ_Ｄより約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％低いＫ_Ｄでコラーゲンに結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、１つまたは複数の非コラーゲンＥＣＭ成分へのＫ_Ｄの約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約１０分の１のＫ_Ｄでコラーゲンに結合する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＥＣＭ成分の無差別な結合因子ではない。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ヘパリン結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、細胞外マトリックスに結合する増殖因子でもその一部分でもない。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＩＶ型コラーゲンへのＫ_Ｄより低いＫ_ＤでＩ型コラーゲンに結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、Ｉ型コラーゲンへのＫ_Ｄより低いＫ_ＤでＩＶ型コラーゲンに結合する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンへの結合について参照コラーゲン結合ドメインと競合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、Ｉ型コラーゲンへの結合について参照コラーゲン結合ドメインと競合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＩＶ型コラーゲンへの結合について参照コラーゲン結合ドメインと競合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンへの結合について、参照コラーゲン結合ドメインと競合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、参照コラーゲン結合ドメインと、Ｉ型コラーゲンへの結合について競合するが、ＩＶ型コラーゲンへの結合については競合しない。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、参照コラーゲン結合ドメインと、ＩＶ型コラーゲンへの結合について競合するが、Ｉ型コラーゲンへの結合について競合しない。

一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに結合する１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のロイシンリッチリピートを含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、プロテオグリカンを含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、プロテオグリカンを含み、プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、ニドゲンからなる群から選択される。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、ルミカンである。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、クラスＩ小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。ＳＬＲＰは、コラーゲンに結合することが公知である（ＣｈｅｎａｎｄＢｉｒｋ（２０１３）ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ２１２０−２１３７）。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＩＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＩＩＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＶＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、クラスＶＳＬＲＰを含む。ＳＬＲＰクラスのさらなる説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｅｆｅｒ＆Ｉｏｚｚｏ（２００８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８３（３１）：２１３０５−２１３０９において開示されている。

一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ−１）タンパク質を含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、白血球関連免疫グロブリン様受容体２（ＬＡＩＲ−２）タンパク質を含む。一部の実施形態では、参照コラーゲン結合ドメインは、糖タンパク質ＩＶを含む。
Ｆ．例示的コラーゲン結合ドメイン

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに結合する１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のロイシンリッチリピートを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、プロテオグリカンを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、プロテオグリカンを含み、プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、テスチカン、ビクニン、フィブロモジュリン、ルミカン、コンドロアドヘリン、ケラチン、ＥＣＭ２、エピフィカン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、ケラトカン、オステオアドヘリン、オプチシン、オステオグリカン、ニクタロピン、Ｔｓｕｋｕｓｈｉ、ポドカン、ポドカン様タンパク質１、バーシカン、パールカン、ニドゲン、ニューロカン、アグリカンおよびブレビカンからなる群から選択される。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、クラスＩ小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＩＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＩＩＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、クラスＩＶＳＬＲＰを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、クラスＶＳＬＲＰを含む。ＳＬＲＰクラスのさらなる説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｅｆｅｒ＆Ｉｏｚｚｏ（２００８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８３（３１）：２１３０５−２１３０９において開示されている。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのヒトプロテオグリカンクラスＩＩメンバーからの１つまたは複数のロイシンリッチリピートを含む。一部の実施形態では、ＳＬＲＰは、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ケラチン、エピフィカン、アスポリンおよびオステオグリシンから選択される。一部の実施形態では、ＳＬＲＰは、ルミカンである。一部の実施形態では、ルミカンは、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む。
ルミカン

ＬＵＭとしても公知のルミカンは、ヒトでは１２番染色体上のＬＵＭ遺伝子によりコードされる、細胞外マトリックスタンパク質である（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉｅｔａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２７（３）：４８１−４８８）。ルミカンは、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、エピフィカンおよびオステオグリシンを含む小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのプロテオグリカンクラスＩＩメンバーである（Ｉｏｚｚｏ＆Ｓｃｈａｅｆｅｒ（２０１５）ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌｏｇｙ４２：１１−５５）。

他のＳＬＲＰと同様、ルミカンは、約４０ｋＤａの分子量を有し、次の４つの主要分子内ドメインを有する：１）１６アミノ酸残基のシグナルペプチド、２）硫酸化チロシンとジスルフィド結合とを含有する負荷電Ｎ末端ドメイン、３）コラーゲンへのルミカンの結合を可能にする１０個のタンデムロイシンリッチリピート、および４）２つの保存システインを３２残基離れて含有する５０アミノ酸残基のカルボキシル末端ドメイン。（Ｋａｏｅｔａｌ．，（２００６）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｙｅＲｅｓｅａｒｃｈ８２（１）：３−４）。ケラタン硫酸で置換することができる４つのＮ連結部位が、タンパク質コアのロイシンリッチリピートドメイン内にある。ルミカン（デコリンおよびフィブロモジュリンと同様に）のコアタンパク質は、Ｕ字形である。これは、ルミカンがコラーゲン原線維内のコラーゲン分子に結合することを可能にし、したがって、隣接する原線維がくっつかないようにするのに役立つ（Ｓｃｏｔｔ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５（２７）：８７９５−８７９９）。
白血球関連免疫グロブリン様受容体（ＬＡＩＲ−１およびＬＡＩＲ−２）

白血球関連Ｉｇ様受容体（ＬＡＩＲ）−１は、コラーゲン結合時に免疫細胞機能を阻害するコラーゲン受容体である。ＬＡＩＲ−１の次に、ヒトゲノムは、可溶性ホモログであるＬＡＩＲ−２をコードする。ヒト（ｈ）ＬＡＩＲ−１は、ＰＢＭＣおよび胸腺細胞の大部分に発現される（Ｍａａｓｈｏｅｔａｌ．，（２００５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ４２：１５２１−１５３０）。ｉｎｖｉｔｒｏでのｍＡｂによるｈＬＡＩＲ−１の架橋は、免疫細胞機能を阻害することができる強力な阻害シグナルを送達する（４、１０〜１５）。コラーゲンは、ＬＡＩＲ分子に対する天然の高親和性リガンドであることが公知である。ｈＬＡＩＲ−１とコラーゲンの相互作用は、ｉｎｖｉｔｒｏで免疫細胞活性化を直接阻害する（Ｍｅｙａａｒｄｅｔａｌ．，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ７：２８３−２９０；Ｐｏｇｇｉ（１９９８）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２８：２０８６ −２０９１；ＶａｎｄｅｒＶｕｕｒｓｔｄｅＶｒｉｅｓｅｔａｌ．，（１９９９）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２９：３１６０−３１６７；Ｌｅｂｂｉｎｋｅｔａｌ．，（２００６）ＪＥｘｐＭｅｄ２０３：１４１９−１４２５）。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、コラーゲンに結合する、Ｉｇ様ドメインを有するヒトＩ型糖タンパク質、またはその細胞外部分を含む。一部の実施形態では、Ｉ型糖タンパク質は、Ｉ型コラーゲンへの結合についての結合についてルミカンと競合する。一部の実施形態では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される。一部の実施形態では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１である。一部の実施形態では、ヒトＩ型糖タンパク質は、ＬＡＩＲ１であり、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２または糖タンパク質ＩＶのバリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアント、ＬＡＩＲ２バリアント、または糖タンパク質ＩＶバリアントは、野生型ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２または糖タンパク質ＩＶタンパク質配列と比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のアミノ酸置換、付加または欠失を含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、ＬＡＩＲ１バリアントである。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１結合ポケット（例えば、１つまたは複数の残基Ｅ６１、Ｓ６６、Ｙ６８、Ｉ１０２、Ｗ１０９、Ｙ１１５、Ｒ５９、Ｅ６３、Ｒ１００、Ｅ１１１およびＱ１１２ならびにこれらの組合せを含む、ＬＡＩＲ１結合部位）内に１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、ＬＡＩＲ１バリアント（Ｂｒｏｎｄｉｊｋｅｔａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１５：１３６４−１３７３）である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、ＬＡＩＲ１結合ポケットの外部に１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のアミノ酸置換、付加または欠失を含む、ＬＡＩＲ１バリアントである。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、野生型ＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントである。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性の増加を明示する。一部の実施形態では、野生型ＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアント。一部の実施形態では、ＬＡＩＲ１バリアントは、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性の減少を明示する。
糖タンパク質ＩＶ（ＣＤ３６）

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、糖タンパク質ＩＶ（ＧＰＩＶ）を含む。糖タンパク質ＩＶは、コラーゲンを含む多くのリガンドに結合する（Ｔａｎｄｏｎ（１９８９）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６４（１３）：７５７６−７５８３）。多機能性糖タンパク質であるＧＰＩＶは、トロンボスポンジン、フィブロネクチン、コラーゲンまたはアミロイド−ベータを含む、広範なリガンドの受容体としてはもちろん、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、アニオン性リン脂質、長鎖脂肪酸および細菌のジアシル化リポペプチドなどの、脂質的性質の受容体としても作用する。ＧＰＩＶは、ヒトではＣＤ３６遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＣＤ３６抗原は、脊椎動物における多くの細胞型の表面に見られる膜内在性タンパク質である。それは、細胞内に脂肪酸を運び入れ、細胞表面タンパク質のクラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。一部の実施形態では、ＣＤ３６は、配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．免疫調節ドメイン

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている少なくとも１つの免疫調節ドメインを含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの免疫調節ドメインを含む。一部の実施形態では、１つより多くの免疫調節ドメインが融合タンパク質に存在する場合、これらの免疫調節ドメインは、同じである。一部の実施形態では、１つより多くの免疫調節ドメインが融合タンパク質に存在する場合、これらの免疫調節ドメインは、異なる。一部の実施形態では、１つより多くの免疫調節ドメインが融合タンパク質に存在する場合、各ドメインは、コラーゲン結合ドメインのＮ末端に位置する。一部の実施形態では、１つより多くの免疫調節ドメインが融合タンパク質に存在する場合、各ドメインは、コラーゲン結合ドメインのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、１つより多くの免疫調節ドメインが融合タンパク質に存在する場合、少なくとも１つのドメインは、コラーゲン結合ドメインのＮ末端に位置し、少なくとも１つのドメインは、コラーゲン結合ドメインのＣ末端に位置する。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、免疫系の細胞の活性を活性化する。例えば、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、免疫応答刺激性のもの、例えば、これらに限定されないが、サイトカイン、例えばインターロイキン、ケモカイン、ＴＮＦファミリーのメンバー、アゴニスト抗体、免疫チェックポイント遮断薬、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、免疫応答を強化する。一部の実施形態では、免疫応答の強化は、Ｔ細胞の刺激、Ｂ細胞の刺激、樹状細胞応答の刺激、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、免疫応答の強化は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞）産生、Ｉ型インターフェロン応答の刺激、またはこれらの組合せをもたらす。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を活性化、強化または促進するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を阻害、低下または抑制するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および自然リンパ系細胞を含むがこれらに限定されない、リンパ系細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、単球、好中球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞および顆粒球を含むがこれらに限定されない、骨髄系細胞である。

一部の実施形態では、免疫細胞の応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、またはこれらの組合せである。
Ａ．インターロイキン

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、インターロイキン（ＩＬ）である。インターロイキンは、それらの特異的受容体に結合して白血球間の通信に関与する分泌タンパク質である。免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインとしての使用に好適なインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＳＡ）、ＩＬ−２１、ＩＬ−６、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−１８、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＬ−９を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、免疫調節ドメインとしての使用に好適なインターロイキンは、配列番号１〜５および９〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−２ポリペプチドである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１２ポリペプチドである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１５ポリペプチドである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１５ＳＡポリペプチドである。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、共通ガンマ鎖受容体に結合するインターロイキンポリペプチドである。共通ガンマ鎖受容体に結合するインターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−２１を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１２ファミリーに属するポリペプチドである。ＩＬ−１２ファミリーは、ヘリックス構造を有するαサブユニット（例えば、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ−２７ｐ２８）とβサブユニット（例えば、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−２３ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０と同一である）、ＥＢＩ３）とから構成されているヘテロ二量体リガンドを含む。例示的なメンバーとしては、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびＩＬ−３５が挙げられる。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１スーパーファミリーに属するポリペプチドである。インターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーは、一群の密接に関連している受容体を介して作用する、最も強力な免疫系シグナル伝達分子の中に入る、１１の構造的に関連しているファミリーメンバー（ＩＬ−１α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３およびＩＬ−１Ｆ５〜ＩＬ−１Ｆ１０）からなる。全てのＩＬ−１受容体は、同様の活性化様式を有する：第１の受容体サブユニット（すなわち、ＩＬ−１αおよびβについてはＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１８についてはＩＬ−１８Ｒ、およびＩＬ−３３についてはＳＴ２）にリガンドが結合すると、第２の受容体サブユニット（すなわち、ＩＬ−１αおよびβについてはＩＬ−１ＲＡＰ、ＩＬ−１８についてはＩＬ−１８ＲＡＰ、およびＩＬ−３３についてはＩＬ−１ＲＡＰ）が動員され、これらの受容体サブユニットの細胞質内Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインの並置によってシグナル伝達が開始される。二量体化ＴＩＲドメインは、他の中間体の動員によって炎症誘発性核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化をもたらすＭＹＤ８８アダプタータンパク質のドッキングプラットフォームを提供する。ＩＬ−１ファミリーメンバーは、主として自然免疫細胞によって産生され、免疫応答中に様々な細胞型に対して作用する。したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＬ−１８ポリペプチドである。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、必要に応じてリンカーを介して、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されているＩＬ−２ファミリーのメンバーを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ファミリーのメンバーは、ＩＬ−２である。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、抗原により活性化されたＴ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激する、サイトカインである。ＩＬ−２の生物活性は、ｐ５５（ＩＬ−２Ｒα、アルファサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても公知）、ｐ７５（ＩＬ−２ＲＰ、ベータサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても公知）およびｐ６４（ＩＬ−２Ｒγ、ガンマサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても公知）という、細胞膜を貫通する３つのポリペプチドサブユニットの、マルチサブユニットＩＬ−２受容体複合体（ＩＬ−２Ｒ）によって媒介される。ＩＬ−２へのＴ細胞応答は、（１）ＩＬ−２の濃度；（２）細胞表面のＩＬ−２Ｒ分子の数；および（３）ＩＬ−２により占有されるＩＬ−２Ｒの数（すなわち、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒの間の結合相互作用の親和性（Ｓｍｉｔｈ， ”ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｓＱｕａｎｔａｌ” ＩｎＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙＡｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ７６６：２６３−２７１，１９９５））を含む、様々な因子に依存する。ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒ複合体は、リガンド結合時に内在化され、異なる成分は、異なる選別を受ける。ＩＬ−２Ｒαは、細胞表面に再循環されるが、ＩＬ−２：ＩＬ−２ＲＰγ複合体に付随するＩＬ−２は、リソソームに送られ、分解される。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして投与されたとき、ＩＬ−２は、迅速な全身クリアランス（半減期が１２．９分である初期クリアランス段階、続いて、半減期が８５分であるより緩徐なクリアランス段階）を有する（Ｋｏｎｒａｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０：２００９−２０１７，１９９０）。

がん患者における全身ＩＬ−２投与の転帰は、理想には程遠い。客観的には、患者の１５〜２０パーセントは、高用量ＩＬ−２に対して応答するが、大多数は応答せず、多くの者が、悪心、錯乱、低血圧および敗血症性ショックをはじめとする重篤な生命を脅かす副作用で苦しむ。高用量ＩＬ−２処置に関連する重度の毒性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に主として起因する。ＮＫ細胞は、中親和性受容体であるＩＬ−２ＲＰγ_ｃを発現し、その結果としてナノモル濃度のＩＬ−２で刺激され、このことが実際に高用量ＩＬ−２療法中に患者血清中で起こる。用量を低減することおよび投与レジメンを調整することによって、血清濃度を低下させること、したがって、ＩＬ−２ＲａＰγ_ｃを有する細胞を選択的に刺激することが試みられ、毒性は低かったが、そのような処置は、有効性も低かった。高用量ＩＬ−２がん療法に関連する毒性の問題を考慮して、非常に多くのグループが、治療用抗体を並行して投与することによりＩＬ−２の抗がん有効性を向上させることを試みている。しかし、そのような努力は、大部分が成功しておらず、単独でのＩＬ−２療法と比較してさらなる臨床的有益性をもたらさなかったか、またはわずかな臨床的有益性をもたらした。したがって、さまざまながんとより有効に闘うために新規ＩＬ−２療法が必要とされている。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインへのＩＬ−２の連結は、サイトカインを細胞に局在させ、したがって、全身毒性を防止する。さらに、一部の実施形態では、腫瘍または病変に直接投与されると、コラーゲン結合ドメインは、サイトカインを腫瘍または病変微小環境に局在させることによって、ＩＬ−２処置に関連する全身毒性を防止する。

一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒト組換えＩＬ−２、例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生されるヒト組換えインターロイキン−２産物である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、天然インターロイキン−２とは次の点で異なる：ａ）それは、グリコシル化されない；ｂ）それは、Ｎ末端アラニンを有さない、およびｃ）それは、アミノ酸１２５位のシステインがセリンで置換されている。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、平均サイズが組換えインターロイキン−２分子２７個である、生物活性の非共有結合型微小凝集塊として存在する。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は、静脈内注入により投与される。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、野生型ＩＬ−２（例えば、その前駆体型のヒトＩＬ−２、または成熟ＩＬ−２）である。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒアルファ受容体に対して未改変ＩＬ−２と比較して変更された親和性（例えば、より高い親和性）を有するように突然変異される。部位指定突然変異誘発を使用して、野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５、すなわちＩＬ−２Ｒα、への高い親和性結合を示すＩＬ−２突然変異体を単離することができる。細胞表面のＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２の親和性の増加は、限られたＩＬ−２濃度範囲内で受容体占有率を増加させることになり、細胞表面のＩＬ−２の局所濃度を上昇させることにもなる。

一部の実施形態では、本開示は、精製されているとは限らないが、実質的に精製されていることもあるＩＬ−２突然変異体であって、高親和性ＣＤ２５結合因子として機能することができるＩＬ−２突然変異体を特徴とする。ＩＬ−２は、抗原により活性化されたＴ細胞の増殖およびＮＫ細胞の刺激を誘導する、Ｔ細胞増殖因子である。高親和性結合因子である例示的ＩＬ−２突然変異体としては、ＷＯ２０１３／１７７１８７Ａ２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。ＣＤ２５に対する親和性が増加された、さらなる例示的ＩＬ−２突然変異体は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６９，２１５号において開示されている。

一部の実施形態では、本開示は、野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５への結合親和性が低減されたＩＬ−２突然変異体を特徴とする。一部の実施形態では、ＩＬ−２突然変異体は、ＣＤ２５に結合しない。

一部の実施形態では、ＩＬ−２突然変異体は、ＣＤ２５に結合する、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ＩＬ−２と比較してＩＬ−２受容体のアルファサブユニット対する親和性を増加させる少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのアミノ酸残基の欠失、付加または置換）を有する。マウスＩＬ−２において同定された突然変異を、完全長ヒトＩＬ−２（核酸配列（受託番号ＮＭ０００５８６）；アミノ酸配列（受託番号Ｐ６０５６８））におけるまたはシグナルペプチドのないヒトＩＬ−２における対応する残基に対して行うことができることは、理解されるはずである。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩＬ−２である。他の実施形態では、ＩＬ−２は、変異型ヒトＩＬ−２である。

一部の実施形態では、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ＩＬ−２（その前駆体型または好ましくは成熟型のもの）とアミノ酸配列が少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９９％同一である。突然変異は、アミノ酸残基の数または内容の変化からなり得る。例えば、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ＩＬ−２より多いまたは少ない数のアミノ酸残基を有することができる。あるいは、または加えて、ＩＬ−２突然変異体は、野生型ＩＬ−２に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含有することができる。

実例として、配列番号１の参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号１の参照アミノ酸の５つ以下の変更を含むことを除いて参照配列と同一である配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列中のアミノ酸残基の５％以下を欠失させることもしくは別のアミノ酸で置換することができ、または参照配列中の全アミノ酸残基の５％以下の数のアミノ酸を参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ）末端もしくはカルボキシ（Ｃ）末端位置に存在してもよく、またはこれらの末端位置の間の、参照配列の残基間に個々に散在するか参照配列の１つもしくは複数の連続する基に散在する形で、任意の位置に存在してもよい。

置換アミノ酸残基は、必ずしも保存的置換ではないが、保存的置換であることもあり、この保存的置換は典型的には、次の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。これらの突然変異は、ＩＬ−２Ｒαと接触するアミノ酸残基の突然変異であることもある。
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、必要に応じてリンカーを介して、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されているＩＬ−１２ポリペプチドを含む。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、自然および適応免疫において重要な役割を果たす炎症誘発性サイトカインである。Ｇａｔｅｌｙ，ＭＫｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１（１９９８）。ＩＬ−１２は、２つのジスルフィド連結ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなる７０ｋＤａヘテロ二量体タンパク質として主として機能する。ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ−１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも呼ばれる）の前駆体型は、長さ３２８アミノ酸であるが、その成熟型は、３０６アミノ酸長である。ＩＬ−１２ｐ３５サブユニット（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ−１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも呼ばれる）の前駆体型は、長さ２１９アミノ酸であるが、その成熟型は、１９７アミノ酸長である。同書。ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は、異なる染色体上に存在し、互いに独立して調節される。Ｇａｔｅｌｙ，ＭＫｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５−５２１（１９９８）。多くの異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激に基づいてＩＬ−１２を産生する。活性ＩＬ−１２ヘテロ二量体は、タンパク質合成後に形成される。同書。

ＮＫ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化するその能力のため、ＩＬ−１２タンパク質は、１９９４年以来、有望な抗がん治療薬として研究されている。Ｎａｓｔａｌａ，Ｃ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５３：１６９７−１７０６（１９９４）を参照されたい。高い期待に反して、早期臨床研究は、満足のいく結果をもたらさなかった。ＬａｓｅｋＷ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６３：４１９−４３５，４２４（２０１４）。ＩＬ−１２の反復投与は、ほとんどの患者において、適応応答、および血液中のＩＬ−１２誘導インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベルの漸進的低下をもたらした。同書。さらに、ＩＬ−１２誘導抗がん活性が主としてＩＦＮγの二次分泌により媒介されることが認められた上に、ＩＬ−１２によるＩＦＮγと他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）またはケモカイン（ＩＰ−１０もしくはＭＩＧ）との同時誘導が重度の毒性を生じさせた。同書。

ネガティブフィードバックおよび毒性に加えて、ヒトにおける強い免疫抑制環境が原因で、臨床の場でのＩＬ−１２療法の有効性はわずかであり得る。同書。ＩＦＮγの毒性を最小限に抑え、ＩＬ−１２の有効性を向上させるために、科学者は、ＩＬ−１２療法のための様々な用量および時間プロトコールなどの様々な手法を試みた。Ｓａｃｃｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９０：４４７３−４４７９（１９９７）；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９０：２５４１−２５４８（１９９７）；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：２４６０−２４６７（１９９７）；Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｐａｔｕｒｅｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ９１：１１３−１２２（２００１）；およびＳａｕｄｅｍｏｎｔ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ１６：１６３７−１６４４（２００２）を参照されたい。それにもかかわらず、これらの手法は、患者の生存率に有意な影響を与えなかった。Ｋａｎｇ，Ｗ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１２：６７１−６８４（２００１）。

腫瘍細胞における発現のためにレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターを使用して、ＩＬ−１２の膜固定バージョンが、全身投与に関連する毒性を低減する手段として研究された。Ｐａｎ，Ｗ−Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（５）：９２７−９３７（２０１２）を参照されたい。しかし、基礎をなすウイルスはがん遺伝子として作用することがあり、ウイルスベクターは免疫原性であり得るので、ウイルスベクターの使用は、潜在的な健康リスクを提示する。

したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、コラーゲン−結合ドメインに作動可能に連結されているＩＬ−１２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインへのＩＬ−１２ポリペプチドの連結は、サイトカインを細胞に局在させ、したがって、全身毒性を防止する。さらに、一部の実施形態では、腫瘍または病変に直接投与されると、コラーゲン結合ドメインは、サイトカインを腫瘍または病変微小環境に局在させることによって、全身毒性を防止する。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ＩＬ−１２Ａ（例えば、配列番号３）を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ＩＬ−１２Ｂ（例えば、配列番号２）を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂの両方を含む。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２Ｂは、ＩＬ−１２ポリペプチド中のＩＬ−１２ＡのＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、ＩＬ−１２Ａは、ＩＬ−１２ポリペプチド中のＩＬ−１２ＢのＮ末端側に位置する。「のＮ末端側に位置する」という句は、ポリペプチド中の他の配列に対するポリペプチド中の位置をポリペプチドのＮ末端を基準にして示す。例えば、ＩＬ−１２Ａ「のＮ末端側」にあるＩＬ−１２Ｂは、ＩＬ−１２Ｂが、ＩＬ−１２ＡよりＩＬ−１２ポリペプチドのＮ末端の近くに位置することを意味する。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、互いに直接融合されているまたはリンカー（本明細書では「サブユニットリンカー」と呼ばれる）によって互いに連結されているＩＬ−１２ＢとＩＬ−１２Ａとを含む単一のポリペプチド鎖を含む。リンカーの非限定な例は、本明細書中の他の箇所で開示される。

一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２ポリペプチドは、バリアントであるか、機能的断片であるか、または野生型ＩＬ−１２ＡもしくはＩＬ−１２Ｂ配列に対して置換、挿入および／もしくは付加、欠失、および／もしくは共有結合性の改変を含有する、ＩＬ−１２Ａおよび／またはＩＬ−１２Ｂを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドのカルボキシ、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基が、欠失され、それによって断片が得られる。

一部の実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、または３つより多くの置換を含むことがある、ＩＬ−１２Ａおよび／またはＩＬ−１２Ｂアミノ酸配列の置換バリアントを含む。一部の実施形態では、置換バリアントは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含むことがある。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。

当業者には分かるように、ＩＬ−１２タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、および相同タンパク質（オルソログ）も、本開示のＩＬ−１２ポリペプチドの範囲内に入ると考えられる。本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＩＬ−１２ポリペプチドの非限定的な例は、配列番号２〜３に示される。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では免疫調節融合タンパク質は、配列番号２および３に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１２ポリペプチドを含む。
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、必要に応じてリンカーを介して、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されているＩＬ−１５ポリペプチドを含む。ＩＬ−１５は、サイトカインの４αヘリックスバンドルファミリーのメンバーであり、有効な免疫応答の発生において重要な役割を果たす。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：２１９−２２７（２０１５）。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の適切な発達におよびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の長期維持に不可欠である。ＩＬ−１５遺伝子は、４８アミノ酸のシグナルペプチドを有する１６２アミノ酸プレタンパク質をコードし、その成熟タンパク質は、長さ１１４アミノ酸である。Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２８９７−２９０２（１９９６）。例えば、ホモサピエンスＩＬ１５転写バリアント３ｍＲＮＡ配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５８５および対応するＩＬ１５アイソフォーム１プレプロタンパク質についてのＮＰ＿０００５７６も参照されたい。

ＩＬ−１５は、ある特定の構造的類似性をインターロイキン−２（ＩＬ−２）と共有する。ＩＬ−２同様、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を介してシグナルを伝達する。しかし、ＩＬ−２とは異なり、ＩＬ−１５は、それ自体がＣＤ１２２およびＣＤ１３２に有効に結合することができない。ＩＬ−１５は、先ず、ＩＬ−１５アルファ受容体サブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）に結合しなければならない。ＩＬ−１５Ｒα遺伝子は、３０アミノ酸のシグナルペプチドを有する２６７アミノ酸プレタンパク質をコードし、その成熟タンパク質は、長さ２３７アミノ酸である。例えば、ホモサピエンスＩＬ−１５Ｒα転写バリアント１ｍＲＮＡについてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１８９およびホモサピエンスＩＬ−１５Ｒαアイソフォーム１前駆体アミノ酸配列についてのＮＰ＿００２１８０を参照されたい。

ヒトＩＬ−１５Ｒαは、主として、活性化樹状細胞および単球などの細胞の表面のＩＬ−１５に結合する膜貫通型タンパク質である。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：２１９−２２７（２０１５）。したがって、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαの膜結合複合体は、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２サブユニットにトランスでＩＬ−１５を提示する。したがって、ＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５活性の必須成分である。

全身注射されたＩＬ−１５の短い半減期を克服するために、ＩＬ−１５と可溶性組換えＩＬ−１５Ｒａを予め複合体化して、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＳＡ）を得ることによって、ＩＬ−１５の全身性の作用強度が約５０倍強化されること、および全身注射後の血清中のサイトカインの半減期も約２０時間に伸ばされることが示されている（Ｓｔｏｋｌａｓｅｋｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７７（９）：６０７２，２００６；Ｄｕｂｏｉｓｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８０（４）：２０９９，２００８；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎｅｔ．ａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３（２４）：９１６６，２００６）。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインは、ＩＬ−１５ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとを含むＩＬ−１５スーパーアゴニストである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５スーパーアゴニストは、配列番号４および５に示されるアミノ酸配列を含む。
Ｂ．インターフェロン

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、インターフェロン（ＩＦＮ）である。インターフェロンは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激による特異的細胞外刺激に応答して誘導される分泌タンパク質のファミリーを構成する。一部の実施形態では、インターフェロンは、免疫系の抗ウイルス防御（例えば、抗原提示）を強める。高親和性細胞表面受容体を介して、ＩＦＮは、シグナル伝達分子を使用して遺伝子を刺激する。免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインとしての使用に好適なインターフェロンとしては、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−アルファが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されているＩＦＮ−ガンマポリペプチドを含む。ＩＦＮ−ガンマは、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの様々な免疫細胞により産生される。ＩＦＮ−ガンマは、細胞表面の特異的受容体と相互作用し、免疫調節効果を生じさせるシグナル伝達経路を活性化する。したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＦＮ−ガンマポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＦＮ−ガンマポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されているＩＦＮ−アルファポリペプチドを含む。ＩＦＮ−アルファは、Ｂリンパ球、ヌルリンパ球およびマクロファージによって産生され、ＮＫ細胞を活性化することに加えて、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性も有する。したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＦＮ−アルファポリペプチドである。一部の実施形態では、ＩＦＮ−アルファポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
Ｃ．免疫細胞分化刺激因子

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、免疫細胞分化刺激因子である。一部の実施形態では、免疫細胞分化刺激因子は、免疫細胞の特定のサブタイプへの造血前駆細胞分化、発達および増殖を推進する細胞内シグナル伝達経路を活性化する。本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫細胞分化刺激因子としては、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）およびＦＬＴ３Ｌ（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド）が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドである。ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞および線維芽細胞により分泌される単量体糖タンパク質である。造血前駆細胞に対する成長刺激および分化の機能を有することに加えて、ＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現する免疫細胞に対して様々な効果を及ぼす。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＦＬＴ３Ｌポリペプチドである。ＦＬＴ３は、未熟造血前駆細胞により発現される受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＦＬＴ３Ｌは、膜貫通型タンパク質または可溶性タンパク質であり、骨髄の造血細胞および間質細胞を含む多数の細胞により発現される。他の増殖因子と組み合わさって、ＦＬＴ３Ｌは、骨髄系およびリンパ系前駆細胞、樹状細胞およびＮＫ細胞を含む、様々な細胞型の増殖および発達を刺激する。一部の実施形態では、ＦＬＴ３Ｌポリペプチドは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインはＧ−ＣＳＦポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、好中性顆粒球の増殖、分化および機能的活性化を調節する。一部の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。
Ｄ．ケモカイン

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ケモカインである。一部の実施形態では、ケモカインは、応答細胞（例えば、白血球）の方向性を持った走化性を誘導するタンパク質である。一般に、ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、（Ｘ）ＣおよびＣＸ３Ｃという４つのサブファミリーに分類される。ＣＸＣケモカインでは、１つのアミノ酸が、最初の２つのシステインを隔てている（「ＣＸＣモチーフ」）。ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインに特異的に結合するＧタンパク質共役型７回膜貫通ドメイン型受容体である、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２ケモカイン受容体のリガンドである。７つのヒトＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ヒトＧｒｏ−アルファ（ＣＸＣＬ１としても公知）、ヒトＧｒｏ−ベータ（ＣＸＣＬ２としても公知）、ヒトＧｒｏ−ガンマ（ＣＸＣＬ３としても公知）、ヒトＥＮＡ−７８（ＣＸＣＬ５としても公知）、ヒトＧＣＰ−２（ＣＸＣＬ６としても公知）、ヒトＮＡＰ−２（ＣＸＣＬ７としても公知）、およびヒトＩＬ−８（ＣＸＣＬ８としても公知）である。全てのＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ２受容体に結合し、さらに、一部のＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体（すなわち、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ８）の両方に結合し、これらの全てが、活性化経路の冗長性の一因となる。５つのマウスＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ケラチノサイト化学誘引物質（ＫＣ）（ＣＸＣＬ１としても公知）、マクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）（ＣＸＣＬ２としても公知）、樹状細胞炎症性タンパク質−１（ＤＣＩＰ−１）（ＣＸＣＬ３としても公知）、リポ多糖誘導ＣＸＣケモカイン（ＬＩＸ）（ＣＸＣＬ５としても公知）、および好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）（ＣＸＣＬ７としても公知）である。

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なケモカインとしては、ＬＩＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１ベータ、ＫＰ（ＣＸＬＣ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびＭＩＰ−１アルファが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質のための免疫調節ドメインとしての使用に好適な例示的ケモカインをコードするアミノ酸は、下記に示される：

Ｅ．腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインである。リガンドおよび受容体の腫瘍壊死因子スーパーファミリーは、リガンド−受容体複合体の三量体クラスターを形成することによってシグナルを伝達する一連の構造的に相同な細胞表面タンパク質である。活性化ＴＮＦスーパーファミリー受容体のライゲーションは、増殖、エフェクター機能強化、ならびにケモカインおよびサイトカインの産生を含む、広範なプロ免疫応答をもたらすことができる。Ｆａｓなどの一部のリガンドは、アポトーシスの誘導をもたらすことができ、免疫細胞の表面に発現される。加えて、他のリガンドは、免疫応答を弱める阻害性受容体として機能する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＴＮＦ−アルファ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＬＴ−ベータ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２またはＧＩＴＲＬに由来する。細胞外ドメインは、選択されたＴＮＦスーパーファミリーメンバーの受容体に結合することによって免疫応答を誘導または刺激することができる。

下記の表は、由来する細胞外ドメインに対応する受容体を示す：

Ｆ．ＣＤ２８ファミリー

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８ファミリーのメンバーの細胞外ドメインである。ＣＤ２８ファミリーは、リガンドのＢ７ファミリーのメンバーに結合する、阻害性（ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４）および活性化（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）受容体のファミリーである。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞を（ＴＣＲのライゲーションとともに）活性化するために必要とされる二次シグナルを提供する共刺激受容体であり、ＣＤ８０およびＣＤ８６という２つの天然リガンドを有する。ＣＤ２８シグナル伝達は、増殖、エフェクター機能および抗アポトーシスシグナル伝達を増加させるのに役立つことができる。ＣＤ２８シグナル伝達は、有効なＰＤ１／ＰＤＬ１遮断に必要とされることが、最近、明らかになった。ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）は、活性化Ｔ細胞上に発現され、ＣＤ２８と同様の機能を示す、密接に関連している表面受容体である。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ８０（Ｂ７−１）の細胞外ドメインである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ２８に結合することができるＣＤ８６（Ｂ７−２）の細胞外ドメインである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含む。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＩＣＯＳＬＧの細胞外ドメインである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含む。
Ｇ．アゴニスト抗体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、アゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。それらの標的の機能を遮断するアンタゴニスト抗体とは対照的に、アゴニスト抗体は、目的のそれらの標的を活性化する。一部の実施形態では、アゴニスト抗体、またはそれらの抗原結合性断片は、免疫活性化受容体に結合する。一部の実施形態では、免疫活性化受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、ＣＤ２８ファミリーメンバー、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体、Ｆｃ受容体、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）および活性化シグレック受容体を含むが、これらに限定されない。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。ＴＮＦスーパーファミリーは、上に記載されている。例えば、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＴＮＦＲ１に結合することによってその受容体を活性化する、アゴニスト抗体または抗原結合性断片である。

下記の表は、アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＴＮＦスーパーファミリーメンバー受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＴＮＦスーパーファミリーメンバー受容体のリストを提供する：

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体である。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体である。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ４０アゴニスト抗体である。
ＣＤ２８受容体スーパーファミリー

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８スーパーファミリー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。ＣＤ２８スーパーファミリーは、上に記載されている。例えば、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ２８に結合することによってその受容体を活性化する、アゴニスト抗体または抗原結合性断片である。

下記の表は、アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＣＤ２８スーパーファミリーメンバー受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＣＤ２８スーパーファミリーメンバー受容体のリストを提供する：

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞への抗原特異性の付与に関与する細胞表面受容体である。各ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合）またはＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合）のどちらかによって提示される特定のペプチドに特異的である。ナイーブＴ細胞の場合、ＴＣＲのライゲーションによって、Ｔ細胞を活性化するために必要とされる２つのシグナルのうちの第１のシグナルが得られる。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲライゲーションは、パーフォリンおよびグランザイムＢなどの可溶性因子の放出、ならびにＦａｓリガンドなどのアポトーシス誘導リガンドの上方調節によって、同種ｐＭＨＣを提示する細胞（およびバイスタンダー細胞の可能性もある）の死を招く。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の場合、ＴＣＲとその同種ｐＭＨＣのライゲーションによって、サイトカインが放出されることになる。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＴＣＲに結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。例えば、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ３γに結合することによってその受容体を活性化するアゴニスト抗体または抗原結合性断片である。

下記の表は、アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＴＣＲ複合体のメンバーであって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＴＣＲ複合体のメンバーのリストを提供する：

キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＮＫ細胞上およびＴ細胞の一部のサブセット上に主として発現される受容体のファミリーである。これらの受容体は、主として、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）分子への結合による自己の認識（およびしたがって阻害機能）によって応答できる。これらの受容体は、細胞質内尾部の長さに依存して、活性化受容体であることもあり、阻害性受容体であることもある。阻害性受容体は、より長い尾部を有し、ＩＴＩＭドメインを含有する。活性化ＫＩＲは、より短い細胞質内ドメインを有し、ＤＡＰ１２と会合してシグナル伝達を媒介する。

アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得る活性化ＫＩＲであって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適な活性化ＫＩＲが、下記の表に提供される：

白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。ＬＩＲ受容体は、自然免疫細胞上に主として発現される免疫受容体のクラスである。それらの一次リガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子であり、それらは、大部分は阻害機能を示すが、一部は活性化機能を有する。例えば、ＬＩＲＡ２は、微生物プロテアーゼにより切断された免疫グロブリン断片の自然免疫センサーとして働く。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＬＩＲＡ２に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、ＬＩＲＡ２に結合することができる抗体をＵｎｉｐｒｏｔＩＤＱ８Ｎ１４９に基づいて生成することができる。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２は、ＮＫ細胞の表面およびＣＤ８Ｔ細胞の一部のサブセットの表面に発現されるヘテロ二量体Ｃ型レクチン受容体である。それらは、ＨＬＡ−Ｅ分子（非古典的ＭＨＣクラスＩ分子）に結合し、阻害シグナルと活性化シグナルの両方をＮＫ細胞に伝達することができる。阻害性受容体は、それらの細胞質内尾部にＩＴＩＭドメインを含有するが、活性化受容体は、ＩＴＡＭドメインを含有するＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０と会合する。

アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得る活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適な活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体は、下記の表に提供される。

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２リガンドの細胞外ドメインである。下記の表は、由来する細胞外ドメインに対応する受容体を示す：

Ｆｃ受容体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、Ｆｃ受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。Ｆｃ受容体は、抗体の定常領域に結合して広範な機能を惹起する、自然免疫細胞上に主として発現される免疫細胞受容体である。Ｆｃ受容体は、ほぼ排他的に活性化受容体である（阻害シグナルを伝達するＦｃγＲＩＩＢを除く）。Ｆｃ受容体ライゲーションは、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、脱顆粒、およびエフェクター機能を増加させる活性化シグナルの伝達をもたらすことができる。

下記の表は、アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＦｃ受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＦｃ受容体のリストを提供する：

シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。ＳＬＡＭ受容体は、受容体としてもリガンドとしても機能する一連の分子である。ＳＬＡＭ分子は、隣接細胞上で互いに相互作用して、活性化シグナルまたは阻害シグナルのどちらかを送る。ＳＬＡＭ分子は、免疫受容体チロシン依存性スイッチ（Ｓｗｉｔｈ）モチーフをそれらの細胞質内尾部に含有し、それによって、それらは、活性化シグナル伝達分子と阻害シグナル伝達分子の両方と細胞内で会合することができる。

下記の表は、アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＳＬＡＭ受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＳＬＡＭ受容体のリストを提供する。

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＳＬＡＭリガンドの細胞外ドメインである。下記の表は、由来する細胞外ドメインに対応する受容体を示す：

シグレックファミリー受容体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、シグレックファミリー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。シグレックは、レクチンファミリー（糖結合タンパク質）の一部である、主として免疫細胞上に見られる表面受容体のファミリーである。これらの受容体は、シアル酸含有リガンドに結合する。これらの受容体は、主として、広範な免疫細胞型上で阻害性受容体として機能するが、一部（シグレック１４、１５および１６）は、ＩＴＡＭ活性化ドメインを含有する。

アゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得る活性化シグレック受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適な活性化シグレック受容体が、下記の表に提供される：

Ｈ．アンタゴニスト抗体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、アンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。アンタゴニスト抗体は、それらの標的の機能を遮断する。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片は、免疫阻害性受容体に結合することによって、免疫応答の誘導を可能にする。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片は、免疫阻害性リガンドに結合することによって、免疫応答の誘導を可能にする。一部の実施形態では、免疫阻害剤受容体およびリガンドは、ＣＤ２８受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体、シグレック受容体、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、Ｆｃ受容体、アデノシン経路分子、他のチェックポイント阻害剤、およびＬＡＩＲ１を含むが、これらに限定されない。
ＣＤ２８分子

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８分子に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、ＣＤ２８ファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＣＤ２８分子であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＣＤ２８分子のリストを提供する。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＰＤ−１に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＰＤ−Ｌ１に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＴＬＡ−４に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。
ＴＮＦスーパーファミリー分子

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、ＴＮＦスーパーファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＴＮＦスーパーファミリー分子であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＴＮＦスーパーファミリー分子のリストを提供する。

シグレック受容体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、シグレック受容体に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、シグレックファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るシグレック受容体であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なシグレック受容体のリストを提供する。

ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ２６７１５に基づいて生成される。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂに結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＱ１３２４１に基づいて生成される。
白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、ＬＩＲファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＬＩＲであって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＬＩＲのリストを提供する。

キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、ＫＩＲファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得るＫＩＲであって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なＫＩＲのリストを提供する。

Ｆｃ受容体

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、Ｆｃ受容体に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。上記の通り、Ｆｃ受容体のファミリーは、活性化分子と阻害性分子の両方を含む。したがって、一部の実施形態では、阻害性分子に拮抗することにより免疫応答の誘導または刺激がもたらされる。

一部の実施形態では、阻害性Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢである。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢに結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ３１９９４に基づいて生成される。
アデノシン経路分子

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、アデノシン経路のメンバーに結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。例えば、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、アデノシンへのＡＴＰの変換を触媒する、細胞の表面に発現される酵素である。細胞外ＡＴＰは、免疫応答を惹起する危険分子であるが、アデノシンは、免疫抑制性である。これらの分子は、アデノシンを生成することにより局所的免疫抑制環境に寄与する。

したがって、一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ３９に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ４９９６１に基づいて生成される。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、ＣＤ７３に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ２１５８９に基づいて生成される。
他のチェックポイント阻害剤

一部の実施形態では、本開示の免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫調節ドメインは、免疫チェックポイント阻害剤に結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、そのような免疫チェックポイント阻害剤に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

下記の表は、アンタゴニスト抗体またはそれらの抗原結合性断片が生成されて標的とし得る免疫チェックポイント阻害剤であって、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適な免疫チェックポイント阻害剤のリストを提供する。

ＩＩＩ．リンカー

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、リンカーを介してコラーゲン結合タンパク質に作動可能に連結されている免疫調節ドメインを含む。一部の実施形態では、免疫調節ドメインとコラーゲン結合タンパク質の間のリンカーは、免疫調節ドメインがその活性を保持する（例えば、受容体／リガンド会合を促進する）ための立体的分離を生じさせる。一部の実施形態では、免疫調節ドメインとコラーゲン結合タンパク質の間のリンカーは、コラーゲン原線維上への免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さまたは質量のものである。吸着を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、吸着は、偏光解析法（ＥＬＭ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、光導波路光モード分光法（ＯＷＬＳ）、減衰全内部反射率−赤外分光法（ＡＴＲ−ＩＲ）、円偏光二色性分光法（ＣＤ）、全内部反射率−赤外分光法（ＴＩＲＦ）、および他の高分解能顕微鏡法技術により測定することができる。一部の実施形態では、これらの方法は、免疫調節融合タンパク質のドメイン間の空間的配置を示す。

一部の実施形態では、免疫調節ドメインとコラーゲン結合タンパク質の間のリンカーは、組織からの拡散を緩徐化または低減するのに十分な分子量をもたらす。組織からの拡散を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、拡散は、ｉｎｖｉｖｏイメージングにより、または組織切片の経時的な顕微鏡観察によって、測定することができる。例示的な方法は、少なくとも、Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，ＭｏｌＣａｎｃＴｈｅｒ．２００９’およびＷｉｔｔｒｕｐｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ２０１２に記載されており、これらの各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、リンカーは、Ｎ＝１〜１０００、５０〜８００、１００〜６００、または２００〜５００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドである。
Ａ．血清アルブミン

一部の実施形態では、リンカーは、血清アルブミンまたはその断片である。血清アルブミンをタンパク質に融合させる方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１４４５９９号、米国特許出願公開第２００７／００４８２８２号および米国特許出願公開２０１１／００２０３４５号において開示されており、これらは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは、米国特許第５，８７６，９６９号、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６、およびＷＯ２０１１／０５１４７８９において開示されているものなどの、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはそのバリアントもしくは断片である。

免疫調節融合タンパク質において使用するための好適なアルブミンは、ヒト、霊長類、げっ歯動物、ウシ亜科動物、ウマ科動物、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリまたはブタからのものであり得る。一部の実施形態では、アルブミンは、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（配列番号４２）、霊長類血清アルブミン（例えば、チンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン）、げっ歯動物血清アルブミン（例えば、ハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミンおよびラット血清アルブミン）、ウシ亜科動物血清アルブミン、ウマ科動物血清アルブミン、ロバ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミンおよびブタ血清アルブミンである。

一部の実施形態では、アルブミン、またはそのバリアントもしくは断片は、配列番号４２に示される野生型ＨＳＡの配列に対して少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

一部の実施形態では、アルブミンバリアント中の変更、例えば置換、挿入または欠失、の数は、対応する野生型アルブミン（例えば、ＨＳＡ）と比較して変更１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

一部の実施形態では、アルブミンの断片、またはそのバリアントの断片は、免疫調節融合タンパク質における使用に好適である。例示的なアルブミン断片は、ＷＯ２０１１／１２４７１８において開示されている。一部の実施形態では、アルブミンの断片（例えば、ＨＳＡの断片）は、長さ少なくとも２０アミノ酸、例えば、長さ少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、または少なくとも５００アミノ酸である。

一部の実施形態では、アルブミン断片は、アルブミンの少なくとも１つのサブドメイン全体を含み得る。ＨＳＡのドメインは、ドメインＩが、ＨＳＡ（配列番号４２）のアミノ酸１〜１９７（配列番号１１６）からなると定義され、ドメインＩＩが、ＨＳＡ（配列番号４２）のアミノ酸１８９〜３８５（配列番号１１７）からなると定義され、ドメインＩＩＩが、ＨＳＡ（配列番号４２）のアミノ酸３８１〜５８５（配列番号１１８）からなると定義される、組換えタンパク質として発現された（Ｄｏｃｋａｌｅｔａｌ．，ＪＢＣ１９９９；２７４：９３０３−１０）。ドメインＩとドメインＩＩの間およびドメインＩＩとドメインＩＩＩの間に存在する伸長αヘリックス構造（ｈ１０〜ｈ１）（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９６，ｏｐ．ｃｉｔ，Ｔａｂｌｅ２−４）を考えると、ドメインの部分的オーバーラップが存在する。ＨＳＡは、６つのサブドメイン（サブドメインＩＡ、ＩＢ、ＮＡ、ＮＢ、ＩＮＡおよびＮＩＢ）も含む。サブドメインＩＡは、配列番号４２のアミノ酸６〜１０５を含み、サブドメインＩＢは、配列番号４２のアミノ酸１２０〜１７７を含み、サブドメインＮＡは、配列番号４２のアミノ酸２００〜２９１を含み、サブドメインＮＢは、配列番号４２のアミノ酸３１６〜３６９を含み、サブドメインＩＮＡは、配列番号４２のアミノ酸３９２〜４９１を含み、サブドメインＮＩＢは、配列番号４２のアミノ酸５１２〜５８３を含む。

一部の実施形態では、断片は、上で定義された１つもしくは複数のドメインもしくはサブドメインの全部もしくは一部、またはこれらのドメインおよび／もしくはサブドメインの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、アルブミン断片は、アルブミンの、またはアルブミンのドメインの、またはそのバリアントもしくは断片の、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％を構成する。
Ｂ．Ｆｃドメイン

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、上記のアゴニストまたはアンタゴニスト抗体の成分であり、したがって、別個のＦｃドメインは必要とされない。

ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１１５に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含有しない。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含有する。本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質に好適なＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域からのものである。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号１１５に示される。しかし、Ｆｃドメインが、例えば齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来することもあることは、理解されよう。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来することもある。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、突然変異型Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、突然変異型のＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、突然変異型Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに１つまたは複数の突然変異を含む。一部の態様では、突然変異型Ｆｃドメインは、Ｄ２６５Ａ突然変異を含む。

様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。特定のエフェクター機能を欠いている、および／または免疫原性を低下させるための特定の改変を有する、Ｆｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを、選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＦｃドメイン配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３配列、またはその一部分）を、当技術分野において認知されている技術を使用してこれらの配列から誘導することができる。次いで、上述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝物質を変更または合成して、本明細書で開示される方法における使用に好適なポリペプチドを得ることができる。本開示の範囲が、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアントおよび突然変異を包含することは、さらに理解されるであろう。

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応と目的のドメインを増幅するために選択されるプライマーとを使用して、Ｆｃドメイン配列をクローニングすることができる。抗体からＦｃドメイン配列をクローニングするために、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、脾臓またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲにより増幅することができる。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号に、および例えば、”ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｈｏｅｔａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．１９９３．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０に、詳細に記載されている。ＰＣＲをコンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいてより特異的なプライマーによって、開始することができる。上述のようにＰＣＲを使用して、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーを、コンセンサスプライマーにより、またはより大きい相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブにより、スクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に好適な非常に多くのプライマーセットが、当技術分野において公知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒａｎｄＰａｓｔａｎ．１９９４．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：１５０９）；ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７３：３３）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９８９；１６０：１２５０））。抗体配列のクローニングは、参照により本明細書に組み込まれる、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号に、さらに記載されている。

一部の実施形態では、開示される免疫調節融合タンパク質は、１つまたは複数のＦｃドメイン（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのＦｃドメイン）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、異なるタイプのものであり得る。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質に存在する少なくとも１つのＦｃドメインは、ヒンジドメインまたはその一部分を含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはその一部分を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分とを（例えば、ヒンジ−ＣＨ２配向で）含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分とを（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３配向で）含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分とを、例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２、またはＣＨ２−ＣＨ３−ヒンジという配向で含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも１つの完全Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含むが、これらが同じ抗体に由来する必要はない、Ｆｃドメイン）を含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する、少なくとも２つの完全Ｆｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、完全Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、完全ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、完全ＣＨ２ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、少なくともＣＨ３ドメインとヒンジ領域およびＣＨ２ドメインのうちの少なくとも一方とを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。

免疫調節融合タンパク質のＦｃドメインを構成する定常領域ドメインまたはそれらの一部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来することもある。例えば、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なポリペプチドは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインまたはその一部分、およびＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３領域またはその一部分を含むこともある。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、一部はＩｇＧ１分子におよび一部はＩｇＧ３分子に由来するヒンジドメインを含む、Ｆｃドメインを含む。本明細書において示されるように、Ｆｃドメインを、天然に存在する抗体分子とアミノ酸配列が異なるように変更することができることは、当業者には理解されるであろう。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、完全Ｆｃ領域の１つまたは複数の定常領域ドメインを欠いている、すなわち、それらが部分的にまたは完全に欠失されている。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、全ＣＨ２ドメインを欠いている。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインをコードするベクター（例えば、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏからのもの）に由来するＣＨ２ドメイン欠失Ｆｃ領域を含む（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照されたい）。この例示的ベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させてドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターが得られるように操作される。これらの例示的構築物は、結合ＣＨ３ドメインをそれぞれのＦｃドメインのヒンジ領域に直接融合させるように操作されることが好ましいことに留意されたい。

他の構築物では、１つまたは複数の構成要素Ｆｃドメインの間にペプチドスペーサーを備えさせることが望ましいこともある。例えば、ペプチドスペーサーをヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間に、および／またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間に配置することができる。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失されており、残存するＣＨ３ドメイン（合成または非合成のもの）が１〜２０、１〜１０または１〜５アミノ酸ペプチドスペーサーでヒンジ領域に結合されている、適合性構築物を発現させることができるだろう。例えば、定常領域ドメインの調節エレメントが、遊離していて利用可能である状態を確実に維持するために、またはヒンジ領域が可動性である状態を確実に維持するために、そのようなペプチドスペーサーを付加させることができる。好ましくは、本開示で使用される適合性のいずれのリンカーペプチドも、比較的非免疫原性であり、Ｆｃの適切なフォールディングを妨げないであろう。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質に利用されるＦｃドメインは、例えばアミノ酸突然変異（例えば、付加、欠失または置換）により、変更または改変される。本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃドメインバリアント」は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃと比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換、を有するＦｃドメインを指す。例えば、Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、バリアントは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の対応する位置に野生型アミノ酸と比較して少なくとも１つのアミノ酸突然変異（例えば、置換）を含む。

ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその一部分の中に位置するアミノ酸位置に置換を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその一部分の中に位置するアミノ酸位置に置換を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその一部分の中に位置するアミノ酸位置に置換を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその一部分の中に位置するアミノ酸位置に置換を含む。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、１つより多くのアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。免疫調節融合タンパク質は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換をＦｃドメインに含むこともある。好ましくは、アミノ酸置換は、空間的に互いにアミノ酸位置少なくとも１個分のまたはそれより大きい間隔で、例えば、アミノ酸位置少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個分のまたはそれより大きい間隔で配置される。より好ましくは、操作されたアミノ酸は、空間的に互いにアミノ酸位置少なくとも５、１０、１５、２０または２５個分のまたはそれより大きい間隔を空けて配置される。

一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの最初の配列ＬＬＧＧＰを含むアミノ酸２３４〜２３８の間の領域内の変化を含む。一部の実施形態では、Ｆｃバリアントは、Ｆｃ媒介エフェクター機能、特に、ＡＤＣＣを変更し、および／またはＦｃ受容体に対する結合のアビディティーを減少させる。一部の態様では、Ｋ３２２またはＰ３３１などの位置におけるＣＨ２−ＣＨ３接合部のより近くの配列の変化は、補体媒介性細胞傷害を消失させ、および／またはＦｃＲ結合のアビディティーを変更し得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、残基Ｐ２３８およびＰ３３１の変化、例えば、これらの位置の野生型プロリンのセリンへの変化を組み込む。一部の実施形態では、ヒンジ領域内の３つのヒンジシスシステインのうちの１つまたは複数を、これらの残基にＣＣＣ、ＳＣＣ、ＳＳＣ、ＳＣＳまたはＳＳＳをコードするように変更することも、例えば、フォールディングされたタンパク質を不安定化し得る不対システインを消失させることにより、ＦｃＲ結合および分子均一性に影響を及ぼし得る。

Ｆｃガンマ受容体およびＦｃガンマ受容体サブタイプへの結合を低減するために、Ｆｃドメイン内の他のアミノ酸突然変異が企図される。例えば、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２２、３２４、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３５６、３６０、３７３、３７６、３７８、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９位における突然変異は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年５月１８日に発行された米国特許第６，７３７，０５６号に記載されているように、結合を変更し得る。この特許により、ＩｇＧ３のＰｒｏ３３１をＳｅｒに変化させると、突然変異を受けていないＩｇＧ３と比較して親和性が６分の１になることが報告された。これはＦｃガンマＲＩ結合へのＰｒｏ３３１の関与を示す。加えて、２３４、２３５、２３６および２３７、２９７、３１８、３２０および３２２位のアミノ酸改変は、１９９７年４月２９に発行され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許５，６２４，８２１号において受容体結合親和性を変更する可能性があると開示されている。

使用が企図されるさらなる突然変異としては、例えば、２００６年１０月１９日に公開され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号に記載されているものが挙げられる。加えて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号に記載されている突然変異は、使用が企図される。突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａは、例えば、２００３年６月１２日に公開され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１０８５４８号に記載されている。実施形態には、記載の改変が個々にまたは組み合わせて含まれる。ある特定の実施形態では、突然変異は、ヒトＩｇＧ１におけるＤ２６５Ａである。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ポリペプチドの抗原依存性エフェクター機能、特に、ＡＤＣＣまたは補体活性化を、例えば野生型Ｆｃ領域と比較して、変更するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。そのような免疫調節融合タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較したときＦｃＲガンマへの結合の減少を示し、したがって、エフェクター機能の低下を媒介する。ＦｃＲガンマ結合親和性が減少されたＦｃバリアントは、エフェクター機能を低下させると予想され、そのような分子は、例えば、標的細胞破壊が望ましくない状態、例えば、正常細胞が標的分子を発現し得る状態、またはポリペプチドの慢性投与が、不要な免疫系活性化をもたらす可能性がある状態の処置に、有用でもある。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合の変更を示す。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）への結合親和性の変更を示す。ＦｃＲまたは補体結合活性を変更した例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０６３８１５において開示されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、融合タンパク質のグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、グリコシル化（例えば、Ｎ連結もしくはＯ連結グリコシル化）の低減に至る突然変異を含むか、または野生型Ｆｃドメインの糖型の変更（例えば、低フコースもしくはフコース不含グリカン）を含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ連結グリコシル化モチーフ、の付近または中にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低減または変更する例示的なアミノ酸置換は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０５／０１８５７２および米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号において開示されている。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、溶媒露出表面に位置する操作されたシステイン残基またはそのアナログを有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、第２のシステイン残基とのジスルフィド結合が実質的にない少なくとも１つの操作された遊離システイン残基またはそのアナログを含むＦｃドメインを含む。上記の操作されたシステイン残基またはそれらのアナログのいずれかを、その後、当技術分野で認知されている技術を使用して機能的ドメインにコンジュゲートさせる（例えば、チオール反応性ヘテロ二官能性リンカーとコンジュゲートさせる）ことができる。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、本明細書に記載されるＦｃドメインから独立して選択されるその構成要素Ｆｃドメインのうちの２つまたはそれより多くを有する遺伝子学的に融合されたＦｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、これらのＦｃドメインは、同じである。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２つは、異なる。例えば、Ｆｃドメインは、同数のアミノ酸残基を含み、またはそれらは、１または複数のアミノ酸残基分（例えば、約５アミノ酸残基（例えば、１、２、３、４もしくは５アミノ酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基もしくは約５０残基分）長さが異なることもある。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列内の１カ所または複数カ所のアミノ酸位置において異なる。例えば、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２つは、約５カ所のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４もしくは５カ所のアミノ酸位置）、約１０カ所の位置、約１５カ所の位置、約２０カ所の位置、約３０カ所の位置、約４０カ所の位置または約５０カ所の位置において異なり得る。
Ｃ．さらなるリンカー

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ドメインである。ＰＥＧは、周知の水溶性ポリマーであり、このポリマーは、市販されており、または当技術分野において周知の方法（ＳａｎｄｌｅｒａｎｄＫａｒｏ，ＰｏｌｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ１３８−１６１）に従ってエチレングリコールの開環重合により調製することができる。用語「ＰＥＧ」は、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−_１ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ（式中、ｎは、２０〜２３００であり、Ｘは、Ｈであるかまたは末端修飾、例えばＣ_１〜４アルキルである）によって表すことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法における使用に好適なＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わり、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ_３（「メトキシＰＥＧ」）である。ＰＥＧは、結合反応に必要であるさらなる化学基、分子の化学合成の結果として生じるさらなる化学基、または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーであるさらなる化学基を含有することができる。加えて、そのようなＰＥＧは、互いに連結されている１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなることもある。１つより多くのＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多量体型または分岐型ＰＥＧと呼ばれる。分岐型ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）およびソルビトールを含む、様々なポリオールへのポリエチレンオキシドの付加により、調製することができる。例えば、４腕分岐型ＰＥＧをペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分岐型ＰＥＧは、例えば、欧州特許Ａ０４７３０８４号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されており、これらの両方が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＧの１つの形態は、リシンの第１級アミノ基を介して連結されている２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含む（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ１９９５；６：６２−９）。

ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、免疫調節融合タンパク質のドメイン（例えば、免疫調節ドメインおよびコラーゲン結合ドメイン）のＮ末端またはＣ末端のシステイン部分にコンジュゲートされる。ＰＥＧ部分を、アミンへのコンジュゲーションによるものを含む、他の化学作用によって結合させることもできる。ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧコンジュゲーションは、一般に、ＰＥＧを活性化すること、および活性化されたＰＥＧ中間体を、直接標的タンパク質／ペプチドとカップリングさせること、またはリンカーとカップリングさせ、その後、そのリンカーを活性化し、標的タンパク質／ペプチドとカップリングさせることを含む（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＪＢＣ１９７７；２５２：３５７１およびＪＢＣ１９７７；２５２：３５８２、ならびにＨａｒｒｉｓｅｔ．ａｌ．，ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓｅｄ．）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２；Ｃｈａｐ．２１ａｎｄ２２を参照されたい）。様々な分子量形態のＰＥＧを、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００である）から選択することができる。ＰＥＧ中の繰り返し単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量について概算される。

当業者は、ＰＥＧの好適な分子量を、例えば、ＰＥＧのない免疫調節融合タンパク質の分子量に少なくとも基づいて選択することができる。

ある特定の実施形態では、ＰＥＧ分子を活性化して、ドメイン上のアミノ基と、例えばリシンと反応させることができる（ＢｅｎｃｈａｍＣ．Ｏ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２５（１９８３）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，１４１（１９８５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＤｒｕｇｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ａｄｒｓ９−１１０ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ４６９（１９９９）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９，１１７７−１１８３（１９８３）；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，１１９−１２８（１９９０））。

ある特定の実施形態では、ＰＥＧをコンジュゲートさせるためにＰＥＧの炭酸エステルが使用される。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）をＰＥＧとの反応に使用して、活性な混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成することができ、これを、その後、リンカーの求核基またはＩＬ−２のアミノ基と反応させることができる（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号を参照されたい）。同様のタイプの反応で、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させて、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネート（米国特許第５，３８２，６５７号）をそれぞれ形成することができる。ＰＥＧ化は、従来技術の方法、例えば、ＩＬ−２と求電子活性ＰＥＧの反応（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＣｏｒｐ．，ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）に従って、行うことができる。本明細書で開示される方法における使用に好適な好ましいＰＥＧ試薬は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたは分岐型Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えば、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳである（（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号において開示されているような、トランスフェリンである。

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１７８０８２号において開示されているものなどの、血清免疫グロブリン結合タンパク質である。

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、グロブリン、例えば、チロキシン結合グロブリン、ａ２マクログロブリンまたはハプトグロブリンである。

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質における使用に好適なリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００９４９０９号において開示されているものなどの、フィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を製造する方法も、米国特許出願公開第２０１２／００９４９０９号において開示されている。Ｆｎ３ベースの伸長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）である。
Ｄ．他のリンカー

一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、リンカー、例えば、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを介して、コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、免疫調節ドメインは、リンカー（例えば、血清アルブミン）を介してコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されており、このリンカーは、コラーゲン結合ドメインおよび免疫調節ドメインにさらなるリンカー（例えば、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー）を介して連結されている。コラーゲン結合ドメインと免疫調節ドメインを融合させるのに好適なリンカー、またはコラーゲン結合ドメインと免疫調節ドメインとリンカー（例えば、血清アルブミン）とを融合させるのに好適なリンカーは、当技術分野において周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２１０５１１号、米国特許出願公開第２０１０／０１７９０９４号および米国特許出願公開第２０１２／００９４９０９号において開示されている。例示的なリンカーとしては、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー、グリシン−プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー、すなわち、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。

例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３。ある特定の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）４。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。ある特定の実施形態では、ｎ＝７である。ある特定の実施形態では、ｎ＝８である。ある特定の実施形態では、ｎ＝９である。ある特定の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）ｎを含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。

免疫調節融合タンパク質における使用に好適である他のリンカーは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，５２５，４９１号において開示されているセリンリッチリンカー、Ａｒａｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ２００１；１４：５２９−３２において開示されているヘリックス形成性ペプチドリンカー（例えば、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５））、ならびにＣｈｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＰｈａｒｍ２０１１；８：４５７−６５において開示されている安定したリンカー、すなわち、ジペプチドリンカーＬＥ、トロンビン感受性ジスルフィドシクロペプチドリンカー、およびアルファヘリックス形成性リンカーＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥ（配列番号１１９）である。

他の例示的なリンカーとしては、ＧＳリンカー（すなわち、（ＧＳ）ｎ）、ＧＧＳＧリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧ）ｎ）、ＧＳＡＴリンカー、ＳＥＧリンカー、およびＧＧＳリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ）が挙げられ、ここでのｎは、正の整数（例えば、１、２、３、４または５）である。ハイブリッドヌクレアーゼ−アルブミン分子における使用のための他の好適なリンカーは、ＬｉｎｋｅｒＤａｔａｂａｓｅ（ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｌｉｎｋｅｒｄｂｗｗｗ）などの公開データベースを使用して見つけることができる。ＬｉｎｋｅｒＤａｔａｂａｓｅは、新規融合タンパク質において可能性のあるリンカーとして役立つ複合作用酵素のドメイン間リンカーについてのデータベースである（例えば、Ｇｅｏｒｇｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２００２；１５：８７１−９を参照されたい）。

１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がポリペプチドリンカーに導入されるように、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより、これらの例示的ポリペプチドリンカーのバリアント形態を作出することができることは、理解されるであろう。部位指定突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの、標準的な技法によって、突然変異を導入することができる。

本開示のポリペプチドリンカーは、長さ少なくとも１アミノ酸であるが、様々な長さのものであってもよい。一実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ約１〜約５０アミノ酸である。この文脈で使用される場合の用語「約」は、＋／−２アミノ酸残基を示す。リンカー長は、正の整数でなければならないので、長さ約１〜約５０アミノ酸である長さは、長さ１〜４８乃至５２アミノ酸である長さを意味する。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ約１０〜２０アミノ酸である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ約１５〜約５０アミノ酸である。

別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ約２０〜約４５アミノ酸である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ約１５〜約２５アミノ酸である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０もしくは６１アミノ酸またはそれを超えるアミノ酸である。

当技術分野において公知の技術を使用して、ポリペプチドリンカーをポリペプチド配列に導入することができる。改変をＤＮＡ配列分析により確認することができる。産生されるポリペプチドの安定した産生のために、プラスミドＤＮＡを使用して宿主細胞を形質転換することができる。
ＩＶ．例示的な免疫調節融合タンパク質

本開示は、免疫調節ドメインおよびコラーゲン結合ドメイン、必要に応じてリンカーを含む、免疫調節融合タンパク質であって、免疫調節ドメインが、リンカーにより、またはリンカーなしでコラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質を提供する。本開示の免疫調節融合タンパク質は、モジュール型であり、様々な個々のドメインを含むように構成することができる。
Ａ．ＩＬ−２融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ−２およびルミカンを含み、ＩＬ−２は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号１に示されるヒトＩＬ−２配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号１に示されるヒトＩＬ−２配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ−２およびＬＡＩＲ−１を含み、ＩＬ−２は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号１に示されるヒトＩＬ−２配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号１に示されるヒトＩＬ−２配列を含む。
Ｂ．ＩＬ−１２融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ−１２およびルミカンを含み、ＩＬ−１２は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号２および配列番号３に示されるヒトＩＬ−１２配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号２および配列番号３に示されるヒトＩＬ−１２配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ−１２およびＬＡＩＲ−１を含み、ＩＬ−１２は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号２および配列番号３に示されるヒトＩＬ−１２配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号２および配列番号３に示されるヒトＩＬ−１２配列を含む。
Ｃ．ＣＣＬ−３融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−３およびルミカンを含み、ＣＣＬ−３は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号４１に示されるヒトＣＣＬ−３配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号４１に示されるヒトＣＣＬ−３配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−３およびＬＡＩＲ−１を含み、ＣＣＬ−３は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−３は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号４１に示されるヒトＣＣＬ−３配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号４１に示されるヒトＣＣＬ−３配列を含む。
Ｄ．ＣＣＬ−４融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−４およびルミカンを含み、ＣＣＬ−４は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３３に示されるヒトＣＣＬ−４配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３３に示されるヒトＣＣＬ−４配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−４およびＬＡＩＲ−１を含み、ＣＣＬ−４は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−４は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３３に示されるヒトＣＣＬ−４配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３３に示されるヒトＣＣＬ−４配列を含む。
Ｅ．ＣＣＬ−５融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−５およびルミカンを含み、ＣＣＬ−５は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３９に示されるヒトＣＣＬ−５配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３９に示されるヒトＣＣＬ−５配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、ＣＣＬ−５およびＬＡＩＲ−１を含み、ＣＣＬ−５は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＣＬ−５は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３９に示されるヒトＣＣＬ−５配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３９に示されるヒトＣＣＬ−５配列を含む。
Ｆ．エオタキシン融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、エオタキシンおよびルミカンを含み、エオタキシンは、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、アルブミンでルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３８に示されるヒトエオタキシン配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号１０７に示されるヒトルミカン配列に作動可能に連結されている、配列番号３８に示されるヒトエオタキシン配列を含む。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、エオタキシンおよびＬＡＩＲ−１を含み、エオタキシンは、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、アルブミンでＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、エオタキシンは、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３８に示されるヒトエオタキシン配列を含む。一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、配列番号４２および配列番号４３から選択されるヒト血清アルブミン配列で、配列番号９８に示されるヒトＬＡＩＲ−１配列に作動可能に連結されている、配列番号３８に示されるヒトエオタキシン配列を含む。
Ｇ．抗体融合タンパク質

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＣＤ３抗体およびルミカンを含み、抗ＣＤ３抗体は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＣＤ３抗体およびＬＡＩＲ−１を含み、抗ＣＤ３抗体は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗４−１−ＢＢ抗体およびルミカンを含み、抗４−１−ＢＢ抗体は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗４−１−ＢＢ抗体は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗４−１−ＢＢ抗体は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗４−１−ＢＢ抗体およびＬＡＩＲ−１を含み、抗４−１−ＢＢ抗体は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗４−１−ＢＢ抗体は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗４−１−ＢＢ抗体は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＣＤ４０抗体およびルミカンを含み、抗ＣＤ４０抗体は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＣＤ４０抗体およびＬＡＩＲ−１を含み、抗ＣＤ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＯＸ４０抗体およびルミカンを含み、抗ＯＸ４０抗体は、ルミカンに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ルミカンのＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ルミカンのＣ末端に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、抗ＯＸ４０抗体およびＬＡＩＲ−１を含み、抗ＯＸ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１のＮ末端に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＬＡＩＲ−１のＣ末端に作動可能に連結されている。
Ｖ．免疫調節融合タンパク質を製造する方法

一部の態様では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、コラーゲン結合ドメイン、サイトカイン、抗体）は、形質転換宿主細胞において組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。そうするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、好適な制限酵素を使用して、ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り取ることができるだろう。あるいは、ホスホロアミデート法などの化学合成技術を使用して、ＤＮＡ分子を合成することができるだろう。また、これらの技術の組合せを使用することができるだろう。

ポリペプチドを製造する方法は、適切な宿主においてペプチドを発現することができるベクターも含む。ベクターは、適切な発現制御配列に動作可能に連結されているペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子がベクターに挿入される前またはされた後どちらかにこの動作可能な連結に影響を与える方法は、周知である。発現制御配列は、プロモーター、活性化因子、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。

ＤＮＡ分子を担持している得られたベクターは、適切な宿主を形質転換させるために使用される。この形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して行うことができる。

多数の利用可能な周知の宿主細胞のいずれも、本明細書で開示される方法における使用に好適である可能性がある。特定の宿主の選択は、当技術分野で認知されているいくつかの因子に依存する。これらは、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティおよびコストを含む。全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に同等に有効であり得るとは限らないということを理解した上で、これらの因子のバランスをとらなければならない。これらの一般的ガイドラインの範囲内で有用な微生物宿主は、培養下の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉｓｐ．）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）および他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）細胞、または当技術分野において公知の他の宿主を含む。

次に、形質転換宿主は、培養され、精製される。宿主細胞を、従来の発酵条件下で、所望の化合物が発現されるように培養することができる。そのような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、ペプチドは、当技術分野において周知の方法により培養物から精製される。

化合物を合成法により製造することもできる。例えば、固相合成技術を使用することができる。好適な技術は、当技術分野において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓａｎｄＰａｎａｙｏｔｉｓｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；ＳｔｅｗａｒｔａｎｄＹｏｕｎｇ（１９６９），ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：１０５−２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：２５７−５２７に記載されているものを含む。固相合成は、小ペプチドの最も対費用効果の高い製造方法であるので、個々のペプチドを製造する好ましい技術である。誘導体化ペプチドを含有する化合物、または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術により合成することができる。

他の方法は、分子発現／合成についてのものであり、当業者に一般に公知である。

上記の核酸分子は、それらの発現を指令することができるベクター、例えば、ベクターで形質導入された細胞に、含まれていることもある。したがって、ある特定の実施形態には、ポリペプチド突然変異体に加えて、突然変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、およびこれらのベクターがトランスフェクトされた細胞もある。

使用に好適なベクターとしては、細菌における使用のためのＴ７ベースのベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ５６：１２５，１９８７を参照されたい）、哺乳動物細胞における使用のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅａｎｄＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５２１，１９８８）、および昆虫細胞における使用のためのバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．からの発現ベクターｐＢａｃＰＡＫＳ）が挙げられる。そのようなベクター内の目的のポリペプチドをコードする核酸挿入物をプロモーターに作動可能に連結させることができ、このプロモーターは、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択される。例えば、Ｔ７プロモーターを細菌において使用することができ、ポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞において使用することができ、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターを哺乳動物細胞において使用することができる。また、高等真核生物の場合、組織特異的および細胞型特異的プロモーターが広範に利用可能である。これらのプロモーターは、体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を指令するそれらの能力にちなんで、そのように名付けられている。当業者は、核酸の発現を指令するために使用することができる非常に多くのプロモーターおよび他の調節エレメントを十分に承知している。

挿入された核酸分子の転写を助長する配列に加えて、ベクターは、複製起点、および選択可能マーカーをコードする他の遺伝子を含有することができる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ^ｒ）遺伝子は、それが発現される細胞にＧ４１８耐性を付与し、ひいてはトランスフェクト細胞の表現型選択を可能にする。当業者は、所与の調節エレメントまたは選択可能マーカーが、特定の実験状況での使用に好適であるかどうかを容易に判定することができる。

使用に好適であるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．），ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，ＣＳＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。

ポリペプチド突然変異体をコードする核酸分子を含有し、発現する、原核細胞または真核細胞も、使用に好適である。細胞は、トランスフェクト細胞、すなわち、核酸分子、例えば、突然変異型ポリペプチドをコードする核酸分子が、組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫も、本明細書で開示される方法における使用に好適であると考えられる。

発現系の正確な成分は、重要でない。例えば、ポリペプチド突然変異体を、細菌Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主において、または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞もしくはＨｅＬａ細胞）などの、真核生物宿主において、産生することができる。これらの細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）を含む多くの供給元から入手可能である。発現系を選択する際、唯一の問題は、成分が互いに適合性であることである。当業者は、そのような判定をなすことができる。さらに、発現系を選択する際に助言が必要とされる場合、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）およびＰｏｕｗｅｌｓｅｔａｌ．（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８５Ｓｕｐｐｌ．１９８７）を参考にすることができる。

発現されたポリペプチドは、通例の生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、本明細書に記載されるように、例えば治療剤として、使用することができる。
医薬組成物および投与方法

ある特定の実施形態では、本開示は、免疫調節融合タンパク質と薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。

ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、好ましくは、利用される投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。ある特定の実施形態では、製剤材料は、ｓ．ｃ．および／またはＩ．Ｖ．投与用のものである。ある特定の実施形態では、製剤材料は、局所投与、例えば、腫瘍内投与用のものである。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透性を、改変、維持または保持するための、製剤材料を含有することができる。ある特定の実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩もしくは他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色剤、着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、シクロヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性向上剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）；等張性向上剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達媒体；希釈剤；賦形剤および／または補助薬が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９９５））。ある特定の実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭＮａＣｌ；および／または１０ｍＭＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。ある特定の実施形態では、必要に応じた医薬組成物は、例えば、意図された投与経路、送達形式および所望の投薬量に依存して、当業者により決定されることになる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、上掲を参照されたい。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、免疫調節融合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎｖｉｖｏ放出速度およびｉｎｖｉｖｏクリアランス速度に影響し得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質を含む製剤は、対象に投与されるとき４℃〜３７℃である。

ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要な媒体または担体は、本来、水性または非水性のどちらであってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、好適な媒体または担体は、非経口投与用の組成物によく見られる他の材料がことによると補充された、注射用蒸留水、生理食塩水または人工脳脊髄液であることもある。ある特定の実施形態では、食塩水は、等張性リン酸緩衝食塩水を含む。ある特定の実施形態では、中性緩衝食塩水、または血清アルブミンと混合された食塩水が、さらなる例示的媒体である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、ソルビトールまたはその好適な代用品をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物と必要に応じた製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、上掲）とを混合することにより凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保管用に調製される。さらに、ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化される。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達に選択される。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入に、または消化管経由の送達、例えば経口送達に選択される。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。

ある特定の実施形態では、製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態では、組成物を生理的ｐＨで、またはそれよりやや低いｐＨで、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内で維持するために、緩衝剤が使用される。

ある特定の実施形態では、非経口投与が企図される場合、治療用組成物は、薬学的に許容される媒体中の、免疫調節融合タンパク質を含むパイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態である。ある特定の実施形態では、非経口注射用の媒体は、滅菌蒸留水であり、この滅菌蒸留水中で、免疫調節融合タンパク質が滅菌等張溶液として製剤化され、適切に保存される。ある特定の実施形態では、調製は、蓄積注射によって後に送達することができる生成物の制御放出または持続放出をもたらすことができる薬剤、例えば、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを用いて、所望の分子を製剤化することを含むことができる。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸も使用することができ、ヒアルロン酸には、循環血中での持続期間を促進する効果があり得る。ある特定の実施形態では、植え込み型薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を導入することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化される。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、吸入用のドライパウダーとして製剤化される。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質を含む吸入溶液が、噴射剤を用いてエアロゾル送達用に製剤化される。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺内投与は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されており、この特許文献には、化学的に改変されたタンパク質の肺送達が記載されている。

ある特定の実施形態では、製剤は経口投与されることが企図される。ある特定の実施形態では、この方法で投与される免疫調節融合タンパク質は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の配合に通常使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化される。ある特定の実施形態では、カプセルは、製剤の活性部分が、胃腸管において、バイオアベイラビリティが最大化され、プレシステミック分解が最小化された時点で、製剤の活性部分を放出するように設計される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤が、免疫調節融合タンパク質の吸収を助長するために含まれる。ある特定の実施形態では、希釈剤、着香剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も、利用することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の製造に好適である非毒性賦形剤との混合物で有効量の免疫調節融合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、滅菌水または別の適切な媒体に錠剤を溶解することにより、溶液が単位剤形で調製される。ある特定の実施形態では、好適な賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；あるいは滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクを含むが、これらに限定されない。

持続送達または制御送達製剤での、免疫調節融合タンパク質を含む製剤を含む、さらなる医薬組成物は、当業者には明らかであろう。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射などの、様々な他の持続送達または制御送達手段を考案する技術もまた、当業者には公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微小粒子の制御放出が記載されているＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。ある特定の実施形態では、持続放出性調製物は、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセル、の形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８− １０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．、上掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）を含み得る。ある特定の実施形態では、持続放出性組成物は、当技術分野において公知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができるリポソームを含む。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許第０３６，６７６号、欧州特許第０８８，０４６号および欧州特許第１４３，９４９号を参照されたい。

ｉｎｖｉｖｏでの投与に使用される医薬組成物は、通常は無菌である。ある特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜による濾過により遂行される。ある特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および復元の前かまたは後に行われる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中で保管することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、滅菌取出口を有する容器、例えば、静脈内注射用溶液バッグ、または皮下注射針により穴を開けることができるストッパーを有するバイアルに、一般に入れられる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物を製剤化したら、それを溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または乾燥もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルで保管することができる。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使用可能な形態、または投与前に復元される形態（例えば、凍結乾燥形態）のどちらかで保管することができる。

ある特定の実施形態では、単一用量投与単位を生成するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。ある特定の実施形態では、１室式および多室式プレフィルドシリンジ（例えば、リキッドシリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが含まれる。

ある特定の実施形態では、治療的に利用される免疫調節融合タンパク質を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に依存することになる。したがって、ある特定の実施形態による処置のための適切な投薬量レベルが、送達される分子、免疫調節融合タンパク質が使用されることになる適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表もしくは臓器サイズ）および／または状態（年齢および総体的な健康）にある程度依存して変わることになることは、当業者には理解されるであろう。ある特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果が得られるように投薬量のタイトレーションおよび投与経路の修正を行うことができる。

ある特定の実施形態では、投与頻度は、使用される製剤中の免疫調節融合タンパク質の薬物動態パラメーターを考慮することになる。ある特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与することになる。したがって、ある特定の実施形態では、組成物を、単一用量として、または経時的に２用量もしくはそれより多い用量（これらは同量の所望の分子を含有することもあり、しないこともある）として、または植え込みデバイスもしくはカテーテルによる持続注入として、投与することができる。適切な投薬量のさらなる調整は、当業者により日常的に行われており、彼らにより日常的に行われる職務の範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な用量応答データを使用することにより適切な投薬量を突き止めることができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口的にであるか、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内もしくは病巣内経路による注射によるか、持続放出システムによるか、または植え込みデバイスによる。ある特定の実施形態では、組成物をボーラス注射により投与することができ、または注入により連続投与することができ、または植え込みデバイスにより投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素が異なる経路により投与されることもある。

ある特定の実施形態では、所望の分子が吸収またはカプセル化された、膜、スポンジまたは別の適切な材料の植え込みによって、組成物を局所投与することができる。ある特定の実施形態では、植え込みデバイスが使用される場合、デバイスを任意の適切な組織または臓器に植え込むことができ、所望の分子の送達は、拡散によることもあり、徐放ボーラスによることもあり、または連続投与によることもある。ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質を含む医薬組成物をｅｘｖｉｖｏ法で使用することが望ましいこともある。そのような場合、患者から除去した細胞、組織および／または臓器は、これらの細胞、組織および／または臓器がその後患者に再び植え込まれた後に、免疫調節融合タンパク質を含む医薬組成物に曝露される。

ある特定の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、本明細書に記載されるものなどの方法を使用してポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作されたある特定の細胞を植え込むことにより送達される。ある特定の実施形態では、そのような細胞は、動物またはヒト細胞であることがあり、自家、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であることがある。ある特定の実施形態では、細胞は、不死化され得る。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の機会を減らすために、細胞をカプセル化して、周囲組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、カプセル化材料は、典型的に、生体適合性で半透性の高分子封入体または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防止する。
処置方法

本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質および／またはそれらを発現する核酸は、異常アポトーシスに関連する障害、または分化プロセスに関連する障害（例えば、細胞増殖性疾患（例えば、過剰増殖性障害）もしくは細胞分化性障害、例えばがん）の処置に有用である。本開示の方法で処置可能であるがんの非限定的な例は、下で説明される。

細胞増殖性および／または分化性障害の例としては、がん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血系新生物性障害、例えば白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓のものを含むがこれらに限定されない、多数の原発腫瘍型から生じ得る。したがって、例えば免疫調節融合タンパク質を含む、本明細書において使用される組成物を、がんを有する患者に投与することができる。

本明細書で使用される場合、用語「がん」（または「がん性（の）」）、「過剰増殖性（の）」、および「新生物性（の）」は、自律的成長能力のある細胞（すなわち、急速増殖性細胞成長を特徴とする異常な状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ））を指す。過剰増殖性および新生物性の病状は、病的（すなわち、病状を特徴付けるもしくは構成する）と大別されることもあり、または非病的と（すなわち、病状に関連していないが正常な状態からの逸脱と）大別されることもある。これらの用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性ステージに関係なく、あらゆるタイプのがん性成長または発がんプロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織もしくは臓器を包含することを意味する。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする病状で発生する。非病的過剰増殖性細胞の例には、創傷修復に関連する細胞の増殖が含まれる。

用語「がん」または「新生物」は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ系組織、消化器臓器および尿生殖路を冒すものを含む、様々な臓器系の悪性病変、ならびに腺癌を指し、腺癌は、ほとんどの結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍などの悪性病変、非小細胞肺癌、小腸がんならびに食道がんを含むと一般に考えられている。

用語「癌腫」は、当技術分野では認知されており、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性病変を指す。免疫調節融合タンパク質は、腎癌もしくは黒色腫を含む任意の種類のがん、または任意のウイルス性疾患を有する患者、それを有する疑いがある患者、またはそれを発症するリスクが高い可能性がある患者を処置するために使用することができる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成するものを含む。この用語は、癌腫性および肉腫性組織で構成されている悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識可能な腺状構造を形成している癌腫を指す。

増殖性障害のさらなる例としては、造血系新生物性障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「造血系新生物性障害」は、造血細胞を起源とする、例えば、骨髄系列、リンパ系列もしくは赤血球系列、またはこれらの前駆細胞から生じる、増生／新生物性細胞に関わる疾患を含む。好ましくは、これらの疾患は、低分化型急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。さらなる例示的な骨髄系障害としては、急性前骨髄系白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎＯｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７において概説されている）が挙げられ；リンパ系悪性病変は、これらに限定されないが、Ｂ細胞系列ＡＬＬおよびＴ細胞系列ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）、ならびにヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含む。さらなる型の悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード−スタンバーグ病を挙げることができるが、これらに限定されない。

腫瘍成長およびサイズを低減するのに十分な免疫調節融合タンパク質の量、または治療有効量が、選択される特定の化合物または組成物のみならず、投与経路、処置されることになる状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によって変わり、最終的には患者の医師または薬剤師の判断によることになることは、当業者には理解されるであろう。本方法において使用される化合物が与えられることになる期間は、個々に異なる。

本明細書において使用されるＢ１６黒色腫モデルが、固形腫瘍の一般化モデルであることは、当業者には理解されるであろう。すなわち、このモデルにおける処置の有効性は、他の非黒色腫固形腫瘍における処置の有効性も予示する。例えば、Ｂａｉｒｄｅｔａｌ．（ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０１３；１９０：４６９−７８；ＥｐｕｂＤｅｃ７，２０１２）に記載されているように、適応免疫応答を誘導する寄生虫株であるｃｐｓの、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対する抗腫瘍免疫を媒介する点での有効性は、肺癌および卵巣がんのモデルを含む他の固形腫瘍に一般化可能であることが判明した。別の例では、ＶＥＧＦ標的化リンパ球に関する一連の研究からの結果もまた、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の結果が、研究した他の腫瘍型に一般化可能であったことを示している（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＪＣＩ２０１０；１２０：３９５３−６８；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２；１８：１６７２−８３）。さらに別の例では、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１を伴う免疫療法は、腫瘍負荷の低減に至り、線維肉腫および結腸腺癌細胞系において一般化可能な結果を有した（Ｗｏｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２；７２：９１７−２７）。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、がんを処置するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、黒色腫、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がんおよび脳がんを処置するために使用される。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、腫瘍サイズを低減する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫調節融合タンパク質は、原発腫瘍の転移を阻害する。

本明細書での処置への言及が、述べられているがんおよび症状の処置ばかりでなく予防にも及ぶことは、当業者には理解されるであろう。
併用治療

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、他の療法と組み合わせて使用される。例えば、一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質は、別の免疫療法と組み合わせて使用される。例示的な免疫療法としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、腫瘍関連抗原標的化抗体、免疫チェックポイント阻害剤、およびがんワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）エフェクター細胞

一部の態様では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）エフェクター細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞）とともに使用または実行される免疫調節融合タンパク質を提供する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、遺伝子操作された人工の膜貫通型受容体であって、リガンドに対する任意の特異性を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞または他の免疫細胞）に付与し、認識およびリガンドへの結合時にエフェクター細胞の活性化をもたらす受容体である。典型的に、これらの受容体は、モノクローナル抗体の抗原特異性をＴ細胞に付与するために使用される。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、１）シグナルペプチドとリガンドまたは抗原認識領域（例えば、ｓｃＦｖ）と可動性スペーサーとを典型的に含むエクトドメイン；２）膜貫通（ＴＭ）ドメイン；３）１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを典型的に含むエンドドメイン（代替的には「活性化ドメイン」としても公知）の、３つのドメインを含有する。ＣＡＲのエクトドメインは、細胞の外部に存在し、細胞外空間に露出しており、それによってその同種リガンドとの相互作用に利用可能である。ＴＭドメインは、ＣＡＲをエフェクター細胞の細胞膜に固定することを可能にする。第３のエンドドメイン（「活性化ドメイン」としても公知）は、ＣＡＲのその特異的リガンドへの結合時にエフェクター細胞活性化を助ける。一部の実施形態では、エフェクター細胞活性化は、サイトカインおよびケモカイン産生の誘導、ならびに細胞の細胞溶解活性の活性化を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞傷害性の指向性を腫瘍細胞へと変更する。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、特異的標的リガンドまたは抗原に結合する、リガンド特異的または抗原特異的認識ドメイン（結合ドメインとも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）、テザーリガンド、または共受容体の細胞外ドメインであり、これは、膜貫通ドメインに融合されており、そしてまたこの膜貫通ドメインがシグナル伝達ドメインに結合されている。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγに由来する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０としても公知）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）などのタンパク質に由来する、１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。

ＣＡＲの抗原結合ドメインとその標的抗原との、標的細胞の表面での会合によって、ＣＡＲのクラスター化が生じることになり、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激が送達される。一部の実施形態では、ＣＡＲの主要特性は、免疫エフェクター細胞特異性の指向性を変更するそれらの能力であり、それによって、増殖を誘発し、サイトカイン産生を誘発し、ファゴサイトーシスを誘発し、またはモノクローナル抗体、可溶性リガンドもしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用して主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的に標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することができる分子の産生を誘発する。ＣＤ３ζまたはＦｃＲγからのシグナル伝達ドメインを含有するように操作されたｓｃＦｖベースのＣＡＲは、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能の強力なシグナルを送達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルの非存在下でＴ細胞生存および拡大を促進するシグナルを惹起するのに十分なものではない。結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγに由来するシグナル伝達ドメインとを、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激ドメイン）とともに含有する、新世代のＣＡＲは、動物モデルおよびがん患者において、ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌、溶解活性、生存率および増殖の増加ばかりでなく、抗腫瘍活性をより有効に指向させることが示されている（Ｍｉｌｏｎｅｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２００９；１７：１４５３−１４６４；Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２０１０；１８：４１３−４２０；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９；１０６：３３６０−３３６５）。

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体発現エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、疾患または状態を有する患者から採取され、リガンドへの任意の特異性を有する少なくとも１つのＣＡＲを発現するようにｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子改変された細胞である。これらの細胞は、ＣＡＲへのリガンドの特異的結合により刺激または誘導される、および同じ患者の疾患または状態の処置に有用である、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、サイトカインの誘導）を果たす。エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞）であることもある。他の細胞型（例えば、ナチュラルキラー細胞または幹細胞）がＣＡＲを発現し得ること、およびキメラ抗原受容体エフェクター細胞がＴ細胞以外のエフェクター細胞を含み得ることは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的または標的細胞（例えば、がん細胞）に接触また近接した状態にされたときに標的細胞に対してそのエフェクター機能（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を発揮するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）である（例えば、ＣｈａｎｇａｎｄＣｈｅｎ（２０１７）ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ２３（５）：４３０−４５０を参照されたい）。

Ｔ細胞のそれらの同種抗原への長期曝露は、エフェクター機能の疲弊をもたらすことがあり、その結果、感染細胞または形質転換細胞の存続が可能になる。免疫チェックポイント遮断を誘導する薬剤を使用して宿主エフェクター機能を刺激するまたは若返らせる、最近開発された戦略は、いくつかのがんの処置に成功を収めた。新たに出現した証拠は、Ｔ細胞疲弊が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）による長期抗腫瘍活性の持続の有意な障害になることも示唆している。一部の実施形態では、ＣＡＲ形質導入前に患者から採取したＴ細胞の分化状態、およびＣＡＲ−Ｔ細胞を再導入する前に患者が受けるコンディショニングレジメン（例えば、アルキル化剤の追加または排除、フルダラビン、全身照射）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の持続性および細胞傷害能に多大な影響を与え得る。Ｔ細胞集団を刺激し（抗ＣＤ３／ＣＤ２８または刺激細胞によって）、拡大させる（ＩＬ−２などのサイトカインによって）、ｉｎｖｉｔｒｏ培養条件もまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化状態およびエフェクター機能を変更し得る（Ｇｈｏｎｅｉｍｅｔａｌ．，（２０１６）ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ２２（１２）：１０００−１０１１）。

一部の実施形態では、特に、ＡＬＬおよび／またはＮＨＬの処置のために、好適なＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とする。非限定的な例としては、次の構造を含むＣＡＲが挙げられる：（ｉ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８Ｈ／ＴＭドメイン、４−１ＢＢＣＳドメインおよびＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン；（ｉｉ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメインならびにＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン；および（ｉｉｉ）抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ、ＩｇＧヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８／４−１ＢＢ共刺激ドメインならびにＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン。一部の実施形態では、本明細書で開示される組合せおよび方法との組合せに好適なＣＡＲエフェクター細胞は、ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とし、これらに限定されないがＫｙｍｒｉａｈ（商標）（チサゲンレクルユーセル；Ｎｏｖａｒｔｉｓ；旧名ＣＴＬ０１９）およびＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（アキシカブタジンシロルーセル；ＫｉｔｅＰｈａｒｍａ）を含む。
Ａ．再標的化されたＣＡＲＴ細胞

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用するために好適なＣＡＲ−Ｔ療法は、再標的化されたＣＡＲ−Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ユニバーサル免疫受容体、タグ、スイッチまたは免疫グロブリン上のＦｃ領域に結合するＣＡＲを発現するように改変されたエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本明細書に記載される方法に好適である。

一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ユニバーサル免疫受容体またはＵｎｉｖＩＲを発現するように改変される。１つのタイプのＵｎｉｖＩＲは、ビオチン結合免疫受容体（ＢＢＩＲ）である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２３４３４８Ａ１号を参照されたい）。ユニバーサルキメラ受容体および／またはユニバーサルキメラ受容体を発現するエフェクター細胞に関する方法および組成物の他の例は、国際特許出願ＷＯ２０１６１２３１２２Ａ１、ＷＯ２０１７１４３０９４Ａ１、ＷＯ２０１３０７４９１６Ａ１、米国特許出願公開第２０１６０３４８０７３Ａ１号に記載されており、これらの全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ユニバーサルなモジュール型の抗タグキメラ抗原受容体（ＵｎｉＣＡＲ）を発現するように改変される。この系は、複数の抗原に対するＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞の再標的化を可能にする（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７０２４０６１２Ａ１号；その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉｅｔａｌ．，（２０１６）ＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌ６，ｅ４５８を参照されたい）。

一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、切替え可能なキメラ抗原受容体およびキメラ抗原受容体エフェクター細胞（ＣＡＲ−ＥＣ）スイッチを発現するように改変される。この系では、ＣＡＲ−ＥＣスイッチは、ＣＡＲ−ＥＣ上のキメラ抗原受容体が結合する第１の領域と、標的細胞上の細胞表面分子に結合する第２の領域とを有し、それによって、結合した標的細胞に対して細胞傷害性であるＣＡＲ−ＥＣからの免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−ＥＣは、Ｔ細胞であり、この場合、ＣＡＲ−ＥＣスイッチは、ＣＡＲ−ＥＣ活性の「オン−スイッチ」として動作することができる。スイッチの投与を低減または停止することにより、活性を「オフにする」ことができる。これらのＣＡＲ−ＥＣスイッチは、標的細胞が悪性細胞である、がんなどの疾患または状態の処置のために、本明細書において開示されるＣＡＲ−ＥＣ、および既存のＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、使用することができる。そのような処置を本明細書では切替え可能な免疫療法と呼ぶこともある（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公報第９６２４２７６Ｂ２号）。

一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する受容体（例えば、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｕｄｏｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７４（１）：９３−１０３）を発現するように改変される。

一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）に結合するユニバーサル免疫受容体（例えば、切替え可能なＣＡＲ、ｓＣＡＲ）を発現するように改変される。一部の実施形態では、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）は、抗原（抗体スイッチ）を標的とする抗体内の定義された異なる位置に組み込まれている。したがって、ｓＣＡＲ−Ｔ細胞特異性の指向性は、ヒトプロテオーム中に存在しないＰＮＥのみへと変更され、結果として、ｓＣＡＲ−Ｔ細胞と抗体スイッチ間の直交相互作用が可能になる。このように、ｓＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗体スイッチの存在に厳格に依存して完全に活性化され、結果として、抗体スイッチの非存在下での内在性組織または抗原のＣＡＲＴ細胞オフターゲット認識が排除される（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｒｃａｎｇｅｌｉｅｔａｌ．，（２０１６）ＴｒａｎｓｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ５（Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ１７４−Ｓ１７７）。切替え可能なＣＡＲの他の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０２７２７１８Ａ１号により提供されている。

本明細書で使用される場合、用語「タグ」は、上記のユニバーサル免疫受容体、タグ、スイッチ、または免疫グロブリンのＦｃ領域を包含する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、タグ結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ジニトロフェノール、ペリジニン・クロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、グルコースオキシダーゼ、またはマルトース結合タンパク質に結合する。
Ｂ．抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用するために好適なＣＡＲ−Ｔ療法は、抗タグＣＡＲＴ細胞である。ＣＡＲＴ細胞の一般化臨床応用にはいくつかの制約がある。例えば、あらゆるがん型により普遍的に発現される単一の腫瘍抗原はないので、ＣＡＲ中の各ｓｃＦｖを所望の腫瘍抗原に対する特異性に関して操作する必要がある。加えて、ＣＡＲの標的となる腫瘍抗原は、処置に反応して下方調節または突然変異され、その結果、腫瘍回避が生じることがある。

代替案として、ユニバーサル抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）およびＣＡＲ−Ｔ細胞が開発された。例えば、ヒトＴ細胞は、抗フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ＣＡＲ（抗ＦＩＴＣ−ＣＡＲと呼ばれる）を発現するように操作された。このプラットフォームは、抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ（細胞表面の）とＦＩＴＣの間の高親和性相互作用、ならびにＦＩＴＣ分子（または他のタグ）をセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（ｒｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０）およびハーセプチン（抗Ｈｅｒ２）などの任意の抗がんベースのモノクローナル抗体にコンジュゲートさせることができることを、うまく利用する。

したがって、一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２０８２８４１および米国特許出願公開第２０１６０１２９１０９Ａ１号に少なくとも記載されているようなユニバーサル抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）を発現するように改変される。そのようなＡＴ−ＣＡＲ系では、Ｔ細胞は、抗体などのタグ付きタンパク質を認識し、結合する。例えば、一部の実施形態では、ＡＴ−ＣＡＲＴ細胞は、ＦＩＴＣ標識抗体などのタグ標識抗体を認識する。一部の実施形態では、抗腫瘍抗原抗体は、タグ（例えば、ＦＩＴＣ）にコンジュゲートされ、ＡＴ−ＣＡＲ療法の前に、それと同時に、またはその後に投与される。抗腫瘍抗原抗体は、当業者に公知である。

述べたように、タグ結合ドメインの結合特異性は、標的細胞に結合するために使用されるタンパク質にコンジュゲートされるタグの正体に依存する。例えば、本開示の一部の態様では、タグは、ＦＩＴＣであり、タグ結合ドメインは、抗ＦＩＴＣｓｃＦｖである。あるいは、本開示の一部の態様では、タグは、ビオチンまたはＰＥ（フィコエリトリン）であり、タグ結合ドメインは、抗ビオチンｓｃＦｖまたは抗ＰＥｓｃＦｖである。

一部の実施形態では、タグ付きタンパク質の各製剤のタンパク質は、同じであり、または異なり、タンパク質は、抗体またはその抗原結合性断片である。一部の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オマリズマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、およびベバシズマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ）である。

したがって、一部の実施形態では、タグ付きタンパク質は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗体、ビオチンコンジュゲート抗体、ＰＥコンジュゲート抗体、ヒスチジンコンジュゲート抗体およびストレプトアビジンコンジュゲート抗体を含み、これらの抗体は、標的細胞により発現されるＴＡＡまたはＴＳＡに結合する。例えば、タグ付きタンパク質は、ＦＩＴＣコンジュゲートセツキシマブ、ＦＩＴＣコンジュゲートリツキシマブ、ＦＩＴＣコンジュゲートハーセプチン、ビオチンコンジュゲートセツキシマブ、ビオチンコンジュゲートリツキシマブ、ビオチンコンジュゲートハーセプチン、ＰＥコンジュゲートセツキシマブ、ＰＥコンジュゲートリツキシマブ、ＰＥコンジュゲートハーセプチン、ヒスチジンコンジュゲートセツキシマブ、ヒスチジンコンジュゲートリツキシマブ、ヒスチジンコンジュゲートハーセプチン、ストレプトアビジンコンジュゲートセツキシマブ、ストレプトアビジンコンジュゲートリツキシマブ、およびストレプトアビジンコンジュゲートハーセプチンを含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の各集団のＡＴ−ＣＡＲは、同じであり、または異なり、ＡＴ−ＣＡＲは、タグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、タグ結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片である。一部の態様では、タグ結合ドメインは、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する。一部の実施形態では、タグ結合ドメインは、抗原結合性断片であり、この抗原結合性断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、例えば、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合するｓｃＦｖである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖のヒンジおよび膜貫通領域である。一部の実施形態では、活性化ドメインは、ＣＤ２８の細胞質内領域、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）の細胞質内領域、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζおよびＦｃＲεのうちの１つまたは複数を含む。

一部の実施形態では、タグ付きタンパク質の各製剤のタグは、同じであり、または異なり、タグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニン・クロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される。

タグは、化学的カップリングおよび化学的架橋剤などの技術を使用して、タンパク質にコンジュゲートさせることができる。あるいは、融合タンパク質としてタグ付きタンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。その場合、細胞系は、タグ付きタンパク質を発現するように操作され、タグ付きタンパク質を培養培地から単離し、精製し、本明細書で開示される方法において使用することができる。

一部の実施形態では、タグ付きタンパク質は、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の前に、またはそれと同時に、またはその後に、対象に投与される。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）処置を必要とする対象にタグ付きタンパク質の製剤を投与するステップであって、タグ付きタンパク質が、対象におけるがん細胞に結合するものである、ステップと、（ｂ）抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の治療有効集団を対象に投与するステップであって、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導するものである、ステップとを含み、それによって対象におけるがんを処置する方法を提供する。
Ｃ．タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）エフェクター細胞

一部の実施形態では、免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用するために好適なＣＡＲ−Ｔ療法は、タンデムＣＡＲエフェクター細胞である。がん処置、腫瘍不均一性および免疫編集のためのＣＡＲ手法の使用はＣＡＲ処置からの逃避を引き起こし得ることが観察された（Ｇｒｕｐｐｅｔａｌ．，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ（２０１３）３６８：１５０９−１５１８）。代替手法として、複数のがん特異的マーカーを同時に標的化することを目指して、タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二特異性ＣＡＲが開発された。ＴａｎＣＡＲの場合、細胞外ドメインは、リンカーにより結合されている２つの抗原結合特異性をタンデムに含む。したがって、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は、両方とも単一の膜貫通部分に連結されている：一方のｓｃＦｖは、膜と並置され、他方は、遠位にある。例示的なＴａｎＣＡＲとして、Ｇｒａｄａら（ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、続いて、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖを含む、ＴａｎＣＡＲを記載している。ＨＥＲ２−ｓｃＦｖは、膜近傍の位置にあり、ＣＤ１９−ｓｃＦｖは、遠位にある。ＴａｎＣＡＲは、２つの腫瘍限定抗原の各々に対して明確に異なるＴ細胞反応性を誘導することが示された。

したがって、本開示の一部の態様は、Ｔ細胞の二特異性活性化および標的化を媒介するタンデムキメラ抗原受容体に関する。本開示は、ＣＡＲの二特異性に言及するが、一部の態様では、ＣＡＲは、３つ、４つまたはそれより多くの腫瘍抗原を標的とすることができる。ＣＡＲＴ細胞を使用する複数抗原の標的化は、Ｔ細胞活性化を増強することができ、および／または抗原欠損による腫瘍逃避を相殺することができる。ＴａｎＣＡＲはまた、複数の発現された抗原を標的とすることができ、広い特異性を有する同じ細胞生成物を使用して様々な腫瘍を標的とすることができ、および／またはシグナル伝達強度のより低いＣＡＲが多特異性に起因して同じ結果を達成する、より良好な毒性プロファイルを提供することができる。

一部の実施形態では、本開示は、２つの標的化ドメインを含むＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、３つまたはそれより多くの標的化ドメインを含む多特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。別の実施形態では、本開示は、各々のＣＡＲが抗原結合ドメインを含む、細胞表面における第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲであって、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインが、第１の腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＥＲ２）に結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが、別の（異なる）腫瘍抗原に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを提供する。ＴａｎＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６０３０３２３０Ａ１号および米国特許出願公開第２０１７０３４０７０５Ａ１号に記載されている。

一部の実施形態では、本開示のＴａｎＣＡＲは、２つまたはそれより多くの腫瘍抗原を標的とする。例示的な腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、がん胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ＬｅｗｉｓＹ、Ｇ２５０／ＣＡＬＸ、ＨＬＡ−ＡＩＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ２ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、および／またはＴＥＭ８のうちの、１つまたは複数を含む。

一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ１９および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ２２および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＥＲ２および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＩＬ１３Ｒ−アルファ２および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦ−Ａおよび別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、Ｔｅｍ８および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＦＡＰおよび別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＥｐｈＡ２および別の腫瘍抗原を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、次の腫瘍抗原のうちの１つもしくは複数、２つもしくは複数、３つもしくは複数、または４つもしくは複数：ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ＩＬ１３Ｒ−アルファ２、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｔｅｍ８、ＦＡＰまたはＥｐｈＡ２、およびこれらの任意の組合せを標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＥＲ２およびＩＬ１３Ｒ−アルファ２を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする、二特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。
Ｄ．キメラ抗原受容体およびＣＡＲエフェクター細胞を生成する方法

一部の実施形態では、対象のエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体を用いて遺伝子改変される（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．３：３８８−３９８，２０１３）。例えば、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が用意され、キメラ抗原受容体をコードする組換え核酸が、患者由来エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入されて、ＣＡＲ細胞が生成される。一部の実施形態では、対象に由来しないエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が、キメラ抗原受容体を用いて遺伝子改変される。例えば、一部の実施形態では、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓにより開発されたユニバーサルキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ）などの「既成の」養子細胞療法薬として使用するために操作された同種異系細胞である。ＵＣＡＲＴは、特定のがん型を有する多数の患者の処置に使用するために操作された同種異系ＣＡＲＴ細胞である。Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓにより開発中のＵＣＡＲＴの非限定的な例は、次の腫瘍抗原を標的とするものを含む：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＳ１およびＣＤ３８。

当技術分野において公知の様々な異なる方法を使用して、本明細書で開示される核酸または発現ベクターのいずれかをエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。核酸をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入する方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高分岐有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマーベースのトランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子ベースのトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、電気穿孔、細胞圧搾、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、およびヌクレオフェクションが挙げられる。さらに、当技術分野において公知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、ＣＡＲ核酸をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入して、および／または他の遺伝子改変（例えば、下で説明される通り）をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入して、ＣＡＲ細胞活性を増強することができる（ＣＡＲＴ細胞に関連するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用については、例えば、米国特許第９，８９０，３９３号、米国特許第９，８５５，２９７号、米国特許出願公開第２０１７／０１７５１２８号、米国特許出願公開第２０１６／０１８４３６２号、米国特許出願公開第２０１６／０２７２９９９号、ＷＯ２０１５／１６１２７６、ＷＯ２０１４／１９１１２８、中国特許第１０６７５５０８８号、中国特許第１０６５９１３６３号、中国特許第１０６４８００９７号、中国特許第１０６３９９３７５号、中国特許第１０４８９４０６８号を参照されたい）。

本明細書に記載される細胞または組成物のいずれかを生成するために使用することができる方法であって、各細胞がＣＡＲ（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか）を発現することができるものである、方法が、本明細書で提供される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合ドメインが抗原に結合したときにＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζ配列の細胞質内配列を含む細胞質内シグナル伝達ドメインと、必要に応じて、抗原結合ドメインが抗原に結合したときにＴ細胞に対する共刺激を提供する１つまたは複数（例えば、２つ、３つまたは４つ）の共刺激タンパク質の細胞質内配列（例えば、Ｂ７−Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、および特異的にＣＤ８３に結合するリガンド、のうちの１つまたは複数の細胞質内配列）とを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカーをさらに含み得る。ＣＡＲの非限定的な態様および特徴は、下で説明される。例示的な抗原結合ドメイン、リンカー、膜貫通ドメインおよび細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ細胞のさらなる態様は、例えば、Ｋａｋａｒｌａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１５１−１５５，２０１４；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．３６：４９４−５０２，２０１５；Ｎｉｓｈｉｏｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４（２）：ｅ９８８０９８，２０１５；Ｇｈｏｒａｓｈｉａｎｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１６９：４６３−４７８，２０１５；Ｌｅｖｉｎｅ，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２２：７９−８４，２０１５；Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９−１５，２０１５；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２２：９５−１００，２０１５；Ｌｉｅｔａｌ．，ＺｈｏｎｇｇｕｏＳｈｉＹａｎＸｕｅＹｅＸｕｅＺａＺｈｉ２２：１７５３−１７５６，２０１４；Ｇｉｌｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６３：６８−８９，２０１５；Ｍａｇｅｅｅｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１８：２６５−２７１，２０１４；Ｇａｒｇｅｔｔｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：２３５，２０１４；Ｙｕａｎｅｔａｌ．，ＺｈｏｎｇｇｕｏＳｈｉＹａｎＸｕｅＹｅＸｕｅＺａＺｈｉ２２：１１３７−１１４１，２０１４；Ｐｅｄｇｒａｍｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１２７−１３３，２０１４；Ｅｓｈｈａｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１２３−１２６，２０１４；Ｒａｍｏｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１１２−１１８，２０１４；Ｍａｕｓｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２３：２６２５−２６３５，２０１４；Ｊｅｎａｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．９：５０−５６，２０１４；Ｍａｈｅｒｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４：３５−４３，２０１４；Ｒｉｃｈｅｓｅｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１６：２９５−３０２，２０１３；Ｃｈｅａｄｌｅｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：８３−９０，２０１４；Ｄａｖｉｌａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９９：３６１−３７１，２０１４；Ｘｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．３４３：１７２−１７８，２０１４；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：２６７−２７６，２０１３；Ｈｏｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．８：６０−７０，２０１３；Ｈｏｍｂａｃｈｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３：１０７９−１０８８，２０１３；Ｘｕｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ５４：２５５−２６０，２０１３；Ｇｉｌｈａｍｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．１８：３７７−３８４，２０１２；Ｌｉｐｏｗｓｋａ−Ｂｈａｌｌａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１：９５３−９６２，２０１２；Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１：１２６９−１２７７，２０１３；Ｊｅｎａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１６：１０３５−１０４４，２０１０；Ｄｏｔｔｉｅｔａｌ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ２５７（１）：１０７−１２６，２０１３；Ｄａｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１０８（７）：ｄｊｖ４３９，２０１６；ＷａｎｇａｎｄＲｉｖｉｅｒｅ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ−Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ３：１６０１５，２０１６；米国特許出願公開第２０１８／００５７６０９号、同第２０１８／００３７６２５号、同第２０１７／０３６２２９５号、同第２０１７／０１３７７８３号、同第２０１６／０１５２７２３号、同第２０１６／０２０６６５６号、同第２０１６／０１９９４１２号、同第２０１６／０２０８０１８号、同第２０１５／０２３２８８０号、同第２０１５／０２２５４８０号、同第２０１５／０２２４１４３号、同第２０１５／０２２４１４２号、同第２０１５／０１９０４２８号、同第２０１５／０１９６５９９号、同第２０１５／０１５２１８１号、同第２０１５／０１４００２３号、同第２０１５／０１１８２０２号、同第２０１５／０１１０７６０号、同第２０１５／００９９２９９号、同第２０１５／００９３８２２号、同第２０１５／００９３４０１号、同第２０１５／００５１２６６号、同第２０１５／００５０７２９号、同第２０１５／００２４４８２号、同第２０１５／００２３９３７号、同第２０１５／００１７１４１号、同第２０１５／００１７１３６号、同第２０１５／００１７１２０号、同第２０１４／０３７００４５号、同第２０１４／０３７００１７号、同第２０１４／０３６９９７７号、同第２０１４／０３４９４０２号、同第２０１４／０３２８８１２号、同第２０１４／０３２２２７５号、同第２０１４／０３２２２１６号、同第２０１４／０３２２２１２号、同第２０１４／０３２２１８３号、同第２０１４／０３１４７９５号、同第２０１４／０３０８２５９号、同第２０１４／０３０１９９３号、同第２０１４／０２９６４９２号、同第２０１４／０２９４７８４号、同第２０１４／０２８６９７３号、同第２０１４／０２７４９０９号、同第２０１４／０２７４８０１号、同第２０１４／０２７１６３５号、同第２０１４／０２７１５８２号、同第２０１４／０２７１５８１号、同第２０１４／０２７１５７９号、同第２０１４／０２５５３６３号、同第２０１４／０２４２７０１号、同第２０１４／０２４２０４９号、同第２０１４／０２２７２７２号、同第２０１４／０２１９９７５号、同第２０１４／０１７０１１４号、同第２０１４／０１３４７２０号、同第２０１４／０１３４１４２号、同第２０１４／０１２０６２２号、同第２０１４／０１２０１３６号、同第２０１４／０１０６４４９号、同第２０１４／０１０６４４９号、同第２０１４／００９９３４０号、同第２０１４／００８６８２８号、同第２０１４／００６５６２９号、同第２０１４／００５０７０８号、同第２０１４／００２４８０９号、同第２０１３／０３４４０３９号、同第２０１３／０３２３２１４号、同第２０１３／０３１５８８４号、同第２０１３／０３０９２５８号、同第２０１３／０２８８３６８号、同第２０１３／０２８７７５２号、同第２０１３／０２８７７４８号、同第２０１３／０２８０２２１号、同第２０１３／０２８０２２０号、同第２０１３／０２６６５５１号、同第２０１３／０２１６５２８号、同第２０１３／０２０２６２２号、同第２０１３／００７１４１４号、同第２０１２／０３２１６６７号、同第２０１２／０３０２４６６号、同第２０１２／０３０１４４８号、同第２０１２／０３０１４４７号、同第２０１２／００６０２３０号、同第２０１１／０２１３２８８号、同第２０１１／０１５８９５７号、同第２０１１／０１０４１２８号、同第２０１１／００３８８３６号、同第２００７／００３６７７３号、および同第２００４／００４３４０１号に記載されている。例示的な抗原結合ドメイン、リンカー、膜貫通ドメインおよび細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ細胞のさらなる態様は、ＷＯ２０１６／１６８５９５；ＷＯ１２／０７９０００；２０１５／０１４１３４７；２０１５／００３１６２４；２０１５／００３０５９７；２０１４／０３７８３８９；２０１４／０２１９９７８；２０１４／０２０６６２０；２０１４／００３７６２８；２０１３／０２７４２０３；２０１３／０２２５６６８；２０１３／０１１６１６７；２０１２／０２３０９６２；２０１２／０２１３７８３；２０１２／００９３８４２；２０１２／００７１４２０；２０１２／００１５８８８；２０１１／０２６８７５４；２０１０／０２９７０９３；２０１０／０１５８８８１；２０１０／００３４８３４；２０１０／００１５１１３；２００９／０３０４６５７；２００４／００４３４０１；２０１４／０３２２２５３；２０１５／０１１８２０８；２０１５／００３８６８４；２０１４／００２４６０１；２０１２／０１４８５５２；２０１１／０２２３１２９；２００９／０２５７９９４；２００８／０１６０６０７；２００８／０００３６８３；２０１３／０１２１９６０；２０１１／００５２５５４；および２０１０／０１７８２７６に記載されている。
抗原結合ドメイン

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれる抗原結合ドメインは、抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、もしくは非がん性細胞上に発現されない抗原）またはユニバーサル受容体（例えば、タグ）に特異的に結合することができる。抗原結合ドメインの非限定的な例としては、モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）（例えば、完全ヒトまたはキメラ（例えば、ヒト化）抗体）、抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２断片）（例えば、完全ヒトまたはキメラ（例えば、ヒト化）抗体の断片）、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦａｂ、ビスｓｃＦｖ、ｈｃ−ＩｇＧ、ＢｉＴＥ、単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ−ＮＡＲドメインまたはＶｈＨドメイン）、ＩｇＮＡＲ、および多特異性（例えば、二特異性抗体）抗体が挙げられる。これらの抗原結合ドメインを製造する方法は、当技術分野において公知である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合することができる抗体、例えば、免疫グロブリン分子（例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン分子）および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（抗原結合）断片、の少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）のＣＤＲ（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲのうちのいずれか、または免疫グロブリン重鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲのうちのいずれか）を含む。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（例えば、Ｖ−ＮＡＲドメインもしくはＶ_ＨＨドメイン、または本明細書に記載の一本鎖抗体のいずれか）である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、全抗体分子（例えば、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体）または多量体抗体（例えば、二特異性抗体）である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体断片および多特異性（例えば、二特異性）抗体もしくは抗体断片を含む。抗体およびその抗原結合性断片の例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのどちらかを含有する断片が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で提供されるさらなる抗原結合ドメインは、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性（多量体、例えば二特異性）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト−マウスキメラ）、一本鎖抗体、細胞内で作られる抗体（すなわち、イントラボディ）、およびそれらの抗原結合性断片である。抗体またはそれらの抗原結合性断片は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスのものであり得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ_１抗体またはその抗原結合性断片である。一部の例では、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ_４抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリンである。

抗原結合ドメインのさらなる例は、ＩｇＧの抗原結合性断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の抗原結合性断片）（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、例えばヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、の抗原結合性断片）、ＩｇＡの抗原結合性断片（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の抗原結合性断片）（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＡ、例えばヒトもしくはヒト化ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２、の抗原結合性断片）、ＩｇＤの抗原結合性断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＤの抗原結合性断片）、ＩｇＥの抗原結合性断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＥの抗原結合性断片）、またはＩｇＭの抗原結合性断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＭの抗原結合性断片）である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば食塩水中またはリン酸緩衝食塩水中、約１×１０^−７Ｍまたはそれ未満（例えば、約１×１０^−８Ｍもしくはそれ未満、約５×１０^−９Ｍもしくはそれ未満、約２×１０^−９Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０^−９Ｍもしくはそれ未満）の親和性（Ｋ_Ｄ）で特定の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合することができる。

一部の実施形態では、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、腫瘍抗原に結合する（例えば、腫瘍抗原結合ドメインを含む）ＣＡＲ分子を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、固形腫瘍（例えば、乳がん、結腸がんなど）の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む、上記のタンデムＣＡＲ分子である。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、血液学的悪性疾患（例えば、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄系白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真正赤血球増加症、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫など）の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。

一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞上に出現しない。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＡＡは、腫瘍細胞に特有のものではなく、それどころか、抗原に対する免疫学的寛容状態を誘導することができない条件下では正常細胞上にも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系による抗原への応答を可能にする条件下で起こり得る。一部の実施形態では、ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり応答することができない胎児発生中に正常な細胞上に発現され、または通常は、正常細胞上に極低レベルで存在するが腫瘍細胞上にははるかに高レベルで発現される。

ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、患者の腫瘍細胞をシークエンシングすることおよび腫瘍にのみ見られる突然変異タンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と呼ばれる。ネオ抗原が同定されたら、それに対する治療用抗体を産生せ、本明細書に記載される方法において使用することができる。

一部の実施形態では、腫瘍抗原は、上皮がん抗原、（例えば、乳房、消化器、肺）、前立腺特異がん抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱がん抗原、肺（例えば、小細胞肺）がん抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、または結腸直腸がん抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、Ｂ細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫もしくは形質細胞性骨髄腫）抗原、急性リンパ性白血病抗原、慢性骨髄系白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。

ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の標的となり得る腫瘍抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ））としては、１ＧＨ−ＩＧＫ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、シクロフィリン（ａｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）Ｃ関連タンパク質、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ベータ−カテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢｒＥ３抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯ−０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳＡ、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、ＬＡＧＥ−１ａ、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ＰＡＭ４抗原、膵臓がんムチン、ＰＤ１受容体（ＰＤ−１）、ＰＤ−１受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−１受容体リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅｌ１７前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、ＴＬＰ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＳＰ−１８０、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１−２、ｂｃ１−６、およびＫ−ｒａｓ、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｅｎｓｉｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６，１２：５０２３−３２；Ｐａｒｍｉａｎｉｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ２００７，１７８：１９７５−７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ２００５、５４：１８７−２０７を参照されたい）。

一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒト慢性疾患またはがん（例えば、子宮頸がん）に関連するウイルスに由来するウイルス抗原である。例えば、一部の実施形態では、ウイルス抗原は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＰＶ抗原Ｅ６および／もしくはＥ７、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。

例示的ながんまたは腫瘍、およびそのような腫瘍に（排他的にではないが）関連する特異的腫瘍抗原としては、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇイディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱がん（ｐ２１ｒａｓ）、胆管がん（ｐ２１ｒａｓ）、乳がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸がん（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−ＣＯ１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛がん（ＣＥＡ）、上皮細胞がん（シクロフィリンｂ）、胃がん（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞がん（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、肺がん（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ系細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００）、骨髄腫（ｍｙｃｌｏｍａ）（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、上咽頭がん（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣がん（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺がん（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎がん（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸部および食道の扁平細胞がん、精巣がん（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ならびにＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、ならびにウイルス産物またはタンパク質が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、メソテリン結合ドメインを含むＣＡＲを発現する（すなわち、ＣＡＲＴ細胞は、メソテリンを特異的に認識する）。メソテリンは、卵巣、肺および膵臓がんを含む様々ながんに過剰発現される腫瘍抗原である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＨＥＲ２結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＥＧＦＲ結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。

一部の実施形態では、ＣＤ１９標的化または結合ドメインを含むＣＡＲを発現するＣＡＲエフェクター細胞は、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）（チサゲンレクルユーセル；Ｎｏｖａｒｔｉｓ；その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６１０９４１０を参照されたい）またはＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（アキシカブタジンシロルーセル；Ｋｉｔｅ；その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０３４６３２６号を参照されたい）である。
リンカー

（１）抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間および／または（２）膜貫通ドメインと細胞質内シグナル伝達ドメインの間に必要に応じてリンカーを含むことができるＣＡＲが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、約１アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸、約４アミノ酸もしくは約２アミノ酸の間；約２アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸もしくは約４アミノ酸；約４アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸もしくは約６アミノ酸；約６アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸もしくは約８アミノ酸；約８アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸もしくは約１０アミノ酸；約１０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸もしくは約１２アミノ酸；約１２アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸もしくは約１４アミノ酸；約１４アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸もしくは約１６アミノ酸；約１６アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸もしくは約１８アミノ酸；約１８アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸もしくは約２０アミノ酸；約２０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸もしくは約２５アミノ酸；約２５アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸もしくは約３０アミノ酸；約３０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸もしくは約３５アミノ酸；約３５アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸もしくは約４０アミノ酸；約４０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸もしくは約５０アミノ酸；約５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸もしくは約６０アミノ酸；約６０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸もしくは約７０アミノ酸；約７０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸もしくは約８０アミノ酸；約８０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸もしくは約９０アミノ酸；約９０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸もしくは約１００アミノ酸；約１００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸もしくは約２００アミノ酸；約２００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸もしくは約３００アミノ酸；約３００アミノ酸〜約５００アミノ酸もしくは約４００アミノ酸；または約４００アミノ酸〜約５００アミノ酸の長さを有することができる。

リンカーのさらなる例および態様は、本明細書に引用される参考文献に記載されており、したがって、それら全体が本明細書に組み込まれる。
膜貫通ドメイン

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、膜貫通ドメインも含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞質内ドメインにおける配列と自然に会合している。一部の実施形態では、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０）のアミノ酸置換によって膜貫通ドメインの他の膜貫通ドメイン（例えば、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメイン）への結合を回避するように改変することができる。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然源に由来し得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通型タンパク質に由来し得る。本明細書で使用され得る膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来する（例えば、この膜貫通配列、またはこの膜貫通配列の一部を、少なくとも含む）ことができる。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成のものであることもある。例えば、膜貫通ドメインが合成源からのものである一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性残基（例えば、ロイシンおよびバリン）を含む（例えば、主として含む）ことができる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの末端にフェニルアラニンとトリプトファンとバリンの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）のトリプレットを含むことになる。一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインを含むことができる。

膜貫通ドメインのさらなる具体例は、本明細書に引用される参考文献に記載されている。
細胞質内ドメイン

例えば、抗原結合ドメインが抗原に結合したときにＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζの細胞質内配列と、必要に応じて、Ｔ細胞に対する共刺激を提供する共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数についての細胞質内配列（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＣＤ２４４、ＣＤ８０、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、特異的にＣＤ８３に結合するリガンド、および本明細書に記載されるもしくは当技術分野において公知であるＩＴＡＭ配列のいずれか、のうちの１つもしくは複数についての細胞質内配列）とを含む細胞質内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子も、本明細書で提供される。ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の刺激は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の１つまたは複数の抗がん活性の活性化をもたらすことができる。例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の刺激は、サイトカインの分泌を含む、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性の増加をもたらすことができる。一部の実施形態では、共刺激タンパク質の全細胞内シグナル伝達ドメインが、細胞質内シグナル伝達ドメインに含まれる。一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分（例えば、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞におけるエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分）を含む。細胞質内シグナル伝達ドメインに含めることができる細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質内配列、ならびに少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０）の置換を含み、同じまたはほぼ同じ機能を有する、これらの配列の任意のバリアントが挙げられる。

一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲを介して抗原依存性活性化を開始させるシグナル伝達配列（一次細胞質内シグナル伝達配列）（例えば、ＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達配列）、および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原非依存的に作用する共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数についての細胞質内配列（二次細胞質内シグナル伝達配列）の、２つの明確に異なるクラスの細胞質内シグナル伝達配列を含むことができる。

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質内ドメインを、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で含むように、またはＣＡＲに関連して有用な他の所望の細胞質内シグナル伝達配列と組み合わせたＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように、設計することができる。一部の例では、ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激細胞質内シグナル伝達配列を含むことができる。共刺激細胞質内シグナル伝達配列は、共刺激タンパク質（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、および特異的にＣＤ８３と結合するリガンド）の細胞質内シグナル伝達配列を含む、ＣＡＲの一部分を指す。

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質内シグナル伝達ドメインの中の細胞質内シグナル伝達配列は、ランダムな順序で配置される。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質内シグナル伝達ドメインの中の細胞質内シグナル伝達配列は、互いに特定の順序で連結される。一部の実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカーのいずれか）を使用して、異なる細胞質内シグナル伝達配列間に連結を形成することができる。

一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質内シグナル伝達配列と共刺激タンパク質ＣＤ２８の細胞質内シグナル伝達配列とを含むように設計される。一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質内シグナル伝達配列と共刺激タンパク質４−ＩＢＢの細胞質内シグナル伝達配列とを含むように設計される。一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質内シグナル伝達配列と共刺激タンパク質ＣＤ２８および４−１ＢＢの細胞質内シグナル伝達配列とを含むように設計される。一部の実施形態では、細胞質内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞質内シグナル伝達配列を含まない。
ＣＡＲＴ細胞のさらなる改変

別の実施形態では、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１７／０４９１６６に記載されているように、増殖の増進、エフェクターサイトカイン産生および脱顆粒の調節に関連して、５−ヒドロキシメチルシトシンの総レベルの低下をもたらし、それによって、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）増殖および／または機能を増加させる、メチルシトシンジオキシゲナーゼ遺伝子（例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３）の破壊によって向上される。したがって、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＣＡＲを発現するように操作することができ、この場合の前記エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能は、低下または消失されている。

別の実施形態では、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／１２６６０８および米国特許出願公開第２０１８／００４４４２４に記載されているように、ＣＡＲを構成的に発現し（非条件的ＣＡＲと呼ばれる）、がんの処置に有用な別の遺伝子を条件的に発現する、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用することによって、向上される。そのような実施形態では、条件的に発現される作用因子は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化時に、例えば、非条件的ＣＡＲのその標的への結合時に、発現される。一実施形態では、条件的に発現される作用因子は、ＣＡＲ（本明細書では条件的ＣＡＲと呼ばれる）である。別の実施形態では、条件的に発現される作用因子は、免疫応答のチェックポイント阻害剤を阻害する。別の実施形態では、条件的に発現される作用因子は、ＣＡＲの有効性を改善または向上させ、サイトカインを含むことができる。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／０６９２８２および米国特許出願公開第２０１７／０３３５３３１号に記載されているように、ＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、ベータ−２ミクログロブリン、ＨＬＡ分子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１およびＦＡＳからなる群から選択される内在性遺伝子の発現を変更（例えば、下方調節）することができる核酸を用いてＣＡＲＴ細胞を改変することによって、向上される。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１５／１１２６２６および米国特許出願公開第２０１６／０３４０４０６号に記載されているように、ＣＡＲとＴ細胞プライミングの１つまたは複数のエンハンサー（「ＥＴＰ」）とをＴ細胞に共発現させることによって、向上される。ＣＡＲＴ細胞へのＥＴＰ成分の付加は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能の強化をもたらす。ある実施形態では、ＣＡＲおよび１つまたは複数のＥＴＰは、Ｔ細胞に一過性に共発現される。したがって、これらの操作されたＴ細胞は、安全であり（ＣＡＲ／ＥＴＰ発現の一過的性質を考えると）、ＡＰＣ機能によって長期免疫を誘導する。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／０５５５５１および米国特許出願公開第２０１７／０２９２１１８号に記載されているように、ＣＡＲと結合（または二量体化）ドメインを含む阻害性膜タンパク質（ＩＭＰ）とをＴ細胞に共発現させることによって、向上される。ＣＡＲおよびＩＭＰは、両方とも、特に、ＣＡＲの中に含まれている第２の結合ドメインによって、可溶性化合物に対して反応性にされ、それによって、ＩＭＰにより担持されている阻害シグナル伝達ドメインの、およびＣＡＲ活性化を低下させる効果があるＣＡＲにより担持されているシグナル伝達ドメインの、二量体化またはリガンド認識による、共局在が可能になる。阻害シグナル伝達ドメインは、好ましくは、ＩＬ−２産生およびＴ細胞増殖のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介活性化を減弱させるプログラム死−１（ＰＤ−１）である。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の治療有効性は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１７／０３２７７７に記載されているような、抗原結合ドメインを含有するＣＡＲの細胞外部分の立体構造の制御された多様性が小分子の付加により得られるシステムを使用して、向上される。この統合システムによって、抗原と抗原結合ドメイン間の相互作用のオン／オフ状態間の切替えがなされる。ＣＡＲの細胞外部分の立体構造を制御することができることにより、細胞傷害性などのＣＡＲＴ細胞の下流の機能を直接モジュレートすることができる。したがって、ＣＡＲは、ａ）ｉ）細胞外抗原結合ドメインと、ｉｉ）少なくとも第１の多量体形成性リガンド結合ドメインおよび第２の多量体形成性リガンド結合ドメインを含むスイッチドメインであって、所定の多価リガンドに結合して、前記２つの結合ドメインとそれらが結合することができる多価リガンドとを含む多量体を形成することができる、スイッチドメインとを含む、少なくとも１つのエクトドメイン；ｂ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン；およびｃ）シグナル伝達ドメインと必要に応じて共刺激ドメインとを含む少なくとも１つのエンドドメインを含み、スイッチドメインが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置することを、特徴とし得る。
ＩＩ．腫瘍関連抗原標的化抗体

一部の態様では、本開示は、腫瘍抗原を標的とする抗体とともに使用または実行される免疫調節融合タンパク質を提供する。

治療用モノクローナル抗体は、標的化腫瘍選択的抗原またはエピトープによる腫瘍選択的処置を可能にする薬学的活性薬剤のクラスとして考案された。

抗体およびそれらの抗原結合性断片を産生する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，２４７，３０１号、同第７，９２３，２２１号および米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号に開示されており、これらの全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の方法において使用することができる治療用抗体は、臨床試験におけるまたは臨床使用のための開発における使用が認可されている、当技術分野で認知されている抗がん抗体のいずれかを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、１つより多くの抗がん抗体を本開示の併用療法に含めることができる。

抗がん抗体の非限定的な例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性乳がんまたは転移性乳がんを処置するために使用されるトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．によるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））；結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、乳がん、転移性乳がん、非小細胞肺がんまたは腎細胞癌を処置するために使用されるベバシズマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＡＶＡＳＴＩＮ（商標））；非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ球性白血病を処置するために使用されるリツキシマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＲＩＴＵＸＡＮ（商標））；乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がんまたは卵巣がんを処置するために使用されるペルツズマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））；結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、膵臓がん、食道がん、腎細胞がん、前立腺がん、子宮頸がん、または膀胱がんを処置するために使用することができる、セツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．によるＥＲＢＩＴＵＸ（商標））；結腸直腸がん、頭頸部がん、ならびに他の可能性のあるがん標的を処置するために使用される、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＩｍＣｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）；形質転換を伴うおよび伴わない、ＣＤ２０陽性、濾胞性、非ホジキンリンパ腫であり得る、非ホジキンリンパ腫であって、疾患がリツキシマブに反応せず、化学療法後に再発した、非ホジキンリンパ腫を処置するために使用される、トシツモマブおよびトシツモマブとヨウ素Ｉ１３１（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．によるＢＥＸＸＡＲＸＭ）；Ｉｎ^１１１イブリツモマブ（ｉｂｉｒｔｕｍｏｍａｂ）チウキセタン；Ｙ^９０イブリツモマブチウキセタン；再発性濾胞性リンパ腫、再発性もしくは難治性、低悪性度もしくは濾胞性非ホジキンリンパ腫、または形質転換型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を含み得る、リンパ腫もしくは非ホジキンリンパ腫を処置するために使用される、Ｉｎ^１１１イブリツモマブチウキセタンおよびＹ^９０イブリツモマブチウキセタン（ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．によるＺＥＶＡＬＩＮ（商標））；非小細胞肺がんまたは子宮頸がんを処置するために使用されるＥＭＤ７２００（ＥＭＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）；ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を処置するために使用されるＳＧＮ−３０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈ．による、ＣＤ３０抗原に標的化された遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；非小細胞肺がんを処置するために使用されるＳＧＮ−１５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ドキソルビシンにコンジュゲートされているＬｅｗｉｓｙ関連抗原に標的化された遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置するために使用されるＳＧＮ−３３（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ３３抗原に標的化されたヒト化抗体）；多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫を処置するために使用されるＳＧＮ−４０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ４０抗原に標的化されたヒト化モノクローナル抗体）；非ホジキンリンパ腫を処置するために使用されるＳＧＮ−３５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、オーリスタチンＥにコンジュゲートされているＣＤ３０抗原に標的化された遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；腎がんおよび上咽頭癌を処置するために使用されるＳＧＮ−７０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ７０抗原に標的化されたヒト化抗体）；ＳＧＮ−７５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＳＧＮ７０抗体およびオーリスタチン誘導体から構成されるコンジュゲート）；ならびに黒色腫または転移性黒色腫を処置するために使用されるＳＧＮ−１７／１９（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、メルファランプロドラッグにコンジュゲートされた、抗体と酵素とを含有する融合タンパク質）。

本開示の方法において使用される治療用抗体が上記のものに限定されないことを理解されたい。例えば、以下の認可された治療用抗体も、本開示の方法において使用することができる：未分化大細胞型リンパ腫およびホジキンリンパ腫のためのブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（商標））、黒色腫のためのイピリムマブ（ＭＤＸ−１０１；ＹＥＲＶＯＹ（商標））、慢性リンパ球性白血病のためのオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））、結腸直腸がんのためのパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標））、慢性リンパ球性白血病のためのアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標））、慢性リンパ球性白血病のためのオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））、急性骨髄性白血病のためのゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標））。

本明細書で開示される方法における使用に好適な抗体、例えば、これらに限定されないが、ＯＸ４０を標的とし、腫瘍部位の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、腫瘍拒絶を増強する、０Ｘ８６；ＣＤ１３７を標的とし、定着腫瘍の退縮ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大および維持を生じさせる、ＢＭＳ−６６３５１３；およびＣＤ２５を標的とし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの一過性枯渇を生じさせ、腫瘍退縮を増進し、エフェクターＴ細胞の数を増加させる、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標））は、免疫細胞により発現される分子も標的にすることができる。これらの抗体についてのより詳細な論述は、例えば、Ｗｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１０；１０：３１７−２７において見出すことができる。

腫瘍抗原（例えば、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫およびこれらの組合せなどの、異なる種類のがんに関連する腫瘍抗原）を標的とする他の治療用抗体を同定することができる。例えば、以下の腫瘍抗原を、本明細書で開示される方法において治療用抗体により標的化することができる。

腫瘍抗原は、上皮がん抗原、（例えば、乳房、消化器、肺）、前立腺特異的がん抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱がん抗原、肺（例えば、小細胞肺）がん抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、または結腸直腸がん抗原であることがある。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、Ｂ細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫もしくは形質細胞性骨髄腫）抗原、急性リンパ性白血病抗原、慢性骨髄系白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。記載の腫瘍抗原が例示的なものに過ぎないこと、および任意の腫瘍抗原が、本明細書で開示される方法における使用の標的になり得ることを、理解されたい。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、多発性骨髄腫および一部のＢ細胞リンパ腫を含む、ほとんどのまたは全てのヒト腺癌：膵臓、結腸、乳房、卵巣、肺、前立腺、頭頸部に見られる、ムチン−１タンパク質またはペプチド（ＭＵＣ−１）である。クローン病または潰瘍性大腸炎のどちらかである、炎症性腸疾患を有する患者は、結腸直腸癌を発症するリスクが高い。ＭＵＣ−１は、Ｉ型膜貫通型糖タンパク質である。ＭＵＣ−１の主要細胞外部分は、免疫原性エピトープを含む２０アミノ酸からなる多数のタンデムリピートを有する。一部のがんでは、それが、免疫系により認識される非グリコシル化形態で露出している（Ｇｅｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９９０；２６５：１５２８６−１５２９３）。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、黒色腫および結腸がんに関連する突然変異Ｂ−Ｒａｆ抗原である。これらの突然変異の圧倒的多数は、Ｂ−Ｒａｆの活性化セグメント内の残基５９９のバリンからグルタミン酸への変化をもたらす、ヌクレオチド１７９６におけるＴ−Ａの単一ヌクレオチド変化を示す。Ｒａｆタンパク質はまた、その発がん型が全てのヒトがんのおおよそ３分の１に存在する、活性化Ｒａｓタンパク質のエフェクターとして間接的にがんに関連している。正常な非突然変異Ｂ−Ｒａｆは、細胞膜から核にシグナルを中継する細胞シグナル伝達に関与する。このタンパク質は、通常は、シグナルを中継する必要があるときにのみ活性である。対照的に、突然変異型Ｂ−Ｒａｆは、常に活性であり、シグナル伝達の中継を妨げることが報告されている（（ＭｅｒｃｅｒａｎｄＰｒｉｔｃｈａｒｄ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（２００３）１６５３（１）：２５−４０；Ｓｈａｒｋｅｙｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００４）６４（５）：１５９５−１５９９）。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒト上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）抗原である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する細胞を有するがんは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ^＋がんと呼ばれる。例示的なＨＥＲ−２／ｎｅｕ^＋がんとしては、前立腺がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、肝臓がん（例えば、肝細胞腺癌）、腸がん、および膀胱がんが挙げられる。

ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と４０％相同性を有するおおよそ６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、高疎水性膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）、およびＥＧＦＲと８０％相同性を有するおおよそ５８０ａａのカルボキシ末端細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕのヌクレオチド配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号ＡＨ００２８２３（ヒトＨＥＲ−２遺伝子、プロモーター領域およびエクソン１）；Ｍ１６７９２（ヒトＨＥＲ−２遺伝子、エクソン４）；Ｍ１６７９１（ヒトＨＥＲ−２遺伝子、エクソン３）；Ｍ１６７９０（ヒトＨＥＲ−２遺伝子、エクソン２）；およびＭ１６７８９（ヒトＨＥＲ−２遺伝子、プロモーター領域およびエクソン１）で入手可能である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号ＡＡＡ５８６３７で入手可能である。これらの配列に基づいて、当業者は、有効な免疫応答を生じさせる適切なエピトープを見つけるために公知のアッセイを使用してＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を開発することができるだろう。例示的なＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原としては、ｐ３６９−３７７（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ由来のＨＬＡ−Ａ２ペプチド）；ｄＨＥＲ２（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ｌｉ−ＫｅｙＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッド（ＧｅｎｅｒｅｘＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ペプチドＰ４（アミノ酸３７８−３９８）；ペプチドＰ７（アミノ酸６１０−６２３）；ペプチドＰ６（アミノ酸５４４−５６０）およびＰ７の混合物；ペプチドＰ４、Ｐ６およびＰ７の混合物；ＨＥＲ２［９_７５４］；などが挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗原である。ＥＧＦＲ抗原は、ＥＧＦＲバリアント１抗原、ＥＧＦＲバリアント２抗原、ＥＧＦＲバリアント３抗原および／またはＥＧＦＲバリアント４抗原であることがある。ＥＧＦＲを過剰発現する細胞を有するがんは、ＥＧＦＲ^＋がんと呼ばれる。例示的なＥＧＦＲ^＋がんとしては、肺がん、頭頸部がん、結腸がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、脳がんおよび膀胱がんが挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）抗原である。ＶＥＧＦＲは、がん誘導血管新生の調節因子であると考えられている。ＶＥＧＦＲを過剰発現する細胞を有するがんは、ＶＥＧＦＲ^＋がんと呼ばれる。例示的なＶＥＧＦＲ^＋がんとしては、乳がん、肺がん、小細胞肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、白血病、およびリンパ球性白血病が挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アンドロゲン非依存性前立腺がんに高頻度に発現される、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および／または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、黒色腫に関連する腫瘍特異性抗原である糖タンパク質１００（ｇｐ１００）である。

ある特定の実施形態は、腫瘍抗原は、がん胎児性（ＣＥＡ）抗原である。ＣＥＡを過剰発現する細胞を有するがんは、ＣＥＡ^＋がんと呼ばれる。例示的なＣＥＡ^＋がんとしては、結腸直腸がん、胃がんおよび膵臓がんが挙げられる。例示的なＣＥＡ抗原としては、ＣＡＰ−１（すなわち、ＣＥＡａａ５７１−５７９）、ＣＡＰ１−６Ｄ、ＣＡＰ−２（すなわち、ＣＥＡａａ５５５−５７９）、ＣＡＰ−３（すなわち、ＣＥＡａａ８７−８９）、ＣＡＰ−４（ＣＥＡａａ１−１１）、ＣＡＰ−５（すなわち、ＣＥＡａａ３４５−３５４）、ＣＡＰ−６（すなわち、ＣＥＡａａ１９−２８）およびＣＡＰ−７が挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、糖鎖抗原１０．９（ＣＡ１９．９）である。ＣＡ１９．９は、ＬｅｗｉｓＡ血液型物質に関するオリゴ糖であり、結腸直腸がんに関連している。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、黒色腫がん抗原である。黒色腫がん抗原は、黒色腫の処置に有用である。例示的な黒色腫がん抗原としては、ＭＡＲＴ−１（例えば、ＭＡＲＴ−１２６−３５ペプチド、ＭＡＲＴ−１２７−３５ペプチド）；ＭＡＲＴ−１／メランＡ；ｐＭｅｌ１７；ｐＭｅｌ１７／ｇｐ１００；ｇｐ１００（例えば、ｇｐ１００ペプチド２８０−２８８、ｇｐ１００ペプチド１５４−１６２、ｇｐ１００ペプチド４５７−４６７）；ＴＲＰ−１；ＴＲＰ−２；ＮＹ−ＥＳＯ−１；ｐ１６；ベータ−カテニン；ｍｕｍ−１；などが挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、突然変異型または野生型ｒａｓペプチドである。突然変異型ｒａｓペプチドは、突然変異型Ｋ−ｒａｓペプチド、突然変異型Ｎ−ｒａｓペプチドおよび／または突然変異型Ｈ−ｒａｓペプチドであることがある。ｒａｓタンパク質の突然変異は、典型的には、１２位（例えば、グリシンのアルギニンもしくはバリンでの置換）、１３位（例えば、グリシンの代わりにアスパラギン）、６１位（例えば、グルタミンからロイシンへ）および／または５９位で起こる。突然変異型ｒａｓペプチドは、肺がん抗原、消化器がん抗原、ヘパトーマ抗原、骨髄系がん抗原（例えば、急性白血病、骨髄異形成）、皮膚がん抗原（例えば、黒色腫、基底細胞、扁平細胞）、膀胱がん抗原、結腸がん抗原、結腸直腸がん抗原、および腎細胞がん抗原として有用であり得る。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、突然変異型および／または野生型ｐ５３ペプチドである。ｐ５３ペプチドは、結腸がん抗原、肺がん抗原、乳がん抗原、肝細胞癌がん抗原、リンパ腫がん抗原、前立腺がん抗原、甲状腺がん抗原、膀胱がん抗原、膵臓がん抗原および卵巣がん抗原として使用することができる。

さらなる腫瘍抗原が当技術分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ロイシン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｍ）、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、チロシナーゼ、プロステイン、ＰＳＭＡ、ｒａｓ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＡＧ−７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＢＲＣＩ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、およびメソテリンを含む。

ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原としての機能を果たすことができるいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子は、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を含むが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ−２／ＮｅｕＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に特有である真に腫瘍特異性の免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、大した成果もなくモノクローナル抗体での受動免疫療法の標的として使用されている。

腫瘍抗原は、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であることもある。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞上に出現しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有のものではなく、それどころか、抗原に対する免疫学的寛容状態を誘導することができない条件下では正常細胞上にも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系による抗原への応答を可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり応答することができない胎児発生中に正常細胞上に発現される抗原であることもあり、またはそれらは、通常は正常細胞上に極低レベルで存在するが腫瘍細胞上にははるかに高レベルで発現される抗原であることもある。

ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／メランＡ（ＭＡＲＴ−１）、Ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異性多系統抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ５；過剰発現される胎児性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現されるがん遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座の結果として生じる特有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン−バーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きい、タンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４_（７９１Ｔｇｐ７２_｝アルファ−フェトプロテイン（ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｍ）、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｉ、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質、シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが挙げられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、患者の腫瘍細胞をシークエンシングすることおよび腫瘍にのみ見られる突然変異タンパク質を同定することにより決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と呼ばれる。ネオ抗原が同定されたら、それに対する治療用抗体を産生させ、本明細書に記載される方法において使用することができる。

治療用抗体は、抗体の断片；抗体を含む複合体；または抗体を含むコンジュゲートであることがある。そのような抗体は、必要に応じて、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体であることもある。
ＩＩ．免疫チェックポイント遮断

一部の態様では、本開示は、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント遮断薬とともに使用または実行される免疫調節融合タンパク質を提供する。

Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能は、「免疫チェックポイント」と呼ばれる、共刺激および阻害性シグナルによって、バランスがとられている。Ｔ細胞エフェクター機能を調節する阻害性リガンドおよび受容体は、腫瘍細胞上に過剰発現される。その後、共刺激受容体のアゴニスト、または阻害シグナルのアンタゴニストによって、抗原特異的Ｔ細胞応答が増幅されることになる。腫瘍細胞を直接標的とする治療用抗体とは対照的に、免疫チェックポイント遮断薬は、内因性抗腫瘍活性を増強する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法における使用に好適な免疫チェックポイント遮断薬は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えば、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４またはＴＩＭ３を標的とする、抗体である。これらのリガンドおよび受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２−２６４，２０１２において概説されている。

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨げるまたは阻害する、抗体またはその抗原結合性部分である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨げるまたは阻害する小分子である。

ある特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子（免疫チェックポイント遮断薬）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示のある特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫治療のための方法であって、ＰＤ−１受容体とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を妨げる抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野において公知の抗体は、本明細書で開示される方法における使用に好適である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ＰＤ−１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ−１を標的とする抗体であって、臨床試験中である抗体としては、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５、Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。本明細書で開示される方法における使用に好適な他の抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号において開示されている抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害することによって免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野において公知の抗体は、本明細書で開示される方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体であって、臨床試験中である抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号において開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書で開示される方法における使用に好適であることは、当業者には理解されるであろう。

ある特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示のある特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫治療のための方法であって、ＣＴＬＡ−４を標的とし、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨げる、抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を、対象に投与するステップを含む方法を提供する。ＣＴＬＡ−４を標的とする例示的な抗体としては、ＦＤＡにより認可されているイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、および現在ヒトで治験されているトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４を標的とする他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、同第６，６８２，７３６８号、ならびに米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号、同第２００２／００８６０１４号および同第２００５／０２０１９９４号において開示されている。ＣＴＬＡ−４に結合し、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書で開示される方法における使用に好適であることは、当業者には理解されるであろう。

ある特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示のある特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫治療のための方法であって、ＬＡＧ３を標的とし、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨げる、抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を、対象に投与するステップを含む方法を提供する。ＬＡＧ３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒトで治験されているＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ３を標的とする他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号において開示されている。ＬＡＧ３に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書で開示される方法における使用に好適であることは、当業者には理解されるであろう。

ある特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の成分である。ある特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４である。したがって、本開示のある特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫治療のための方法であって、Ｂ７−Ｈ３またはＨ４を標的とする抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。Ｂ７ファミリーは、いずれの定義された受容体も有さないが、これらのリガンドは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞上で上方調節される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を強化することができることを示している。Ｂ７−Ｈ３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒトで治験されているＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）である。ＬＡＧ３を標的とする他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１４９２３６号において開示されている。Ｂ７−Ｈ３またはＨ４に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書で開示される方法における使用に好適であることは、当業者には理解されるであろう。

ある特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示のある特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫治療のための方法であって、ＬＡＧ３を標的とし、ガレクチン９とのその相互作用を妨げる、抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を、対象に投与するステップを含む方法を提供する。ＴＩＭ３を標的とする好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／００２２６２３号において開示されている。ＴＩＭ３に結合し、ガレクチン９とのその相互作用を妨げ、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書で開示される方法における使用に好適であることは、当業者には理解されるであろう。

本明細書で開示される方法における使用に好適な免疫チェックポイントを標的とする抗体が上記のものに限定されないことを理解されたい。さらに、標的化が、例えば、Ｔ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）産生の増加に反映されるような、抗腫瘍免疫応答の刺激をもたらすのであれば、他の免疫チェックポイント標的も、本明細書に記載される方法においてアンタゴニストまたは抗体により標的化され得ることは、当業者には理解されるであろう。
ＩＶ．がんワクチン

一部の態様では、本開示は、がんワクチンとともに使用または実行される免疫調節融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、がんワクチンは、腫瘍関連抗原などの特異的標的に対する特異的免疫応答を刺激する。

ある特定の実施形態では、がんワクチンは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に組換え遺伝子を送達するためのウイルス、細菌または酵母ベクターを含む。

ある特定の実施形態では、がんワクチンは、自家または同種異系腫瘍細胞を使用する。ある特定の実施形態では、これらの腫瘍細胞は、ＭＨＣ、共刺激分子またはサイトカインの発現のために改変され得る。

ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、患者の腫瘍細胞をシークエンシングすることおよび腫瘍にのみ見られる突然変異タンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と呼ばれる。ネオ抗原が同定されたら、それをワクチンの抗原として使用することができ、またはそのネオ抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を生じさせるために使用することができる。

ある特定の実施形態では、ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインで形質導入されたまたはアジュバント化合物が負荷された照射腫瘍細胞、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞ワクチンＧＶＡＸ（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，２２２（１）：２８７−２９８，２００８）を含む。ある特定の実施形態では、ワクチンは、必要に応じてアジュバントと組み合わせて、免疫原性組成物の形態で１つまたは複数の腫瘍関連抗原を含む。例えば、ＨＰＶ−１６がんタンパクに対するワクチン接種は、外陰部上皮内新生物について肯定的な臨床転帰をもたらした（ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６１（１９），１８３８−１８４７，２０１２）。また、単一用量シクロホスファミド後のがんワクチンＩＭＡ９０１へのマルチペプチド免疫応答は、より長い患者生存期間と関連付けられている（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，１８（８）：１２５４−６１，２０１２）。あるいは、ＤＮＡベースの手法を使用して、１つまたは複数の腫瘍関連抗原で患者を免疫することができる。マウス黒色腫において抗チロシナーゼ関連タンパク質−１モノクローナル抗体と組み合わせてＤＮＡワクチンを使用すると、改善された腫瘍免疫が観察される（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６８（２３），９８８４−９８９１，２００８）。

他のワクチン手法は、腫瘍関連抗原とともに培養することができる樹状細胞などの患者免疫細胞を利用して、免疫系を刺激するおよび目的の抗原を標的とする抗原提示細胞を産生する。この手法を使用する、現存するＦＤＡ認可がん処置ワクチンは、転移性前立腺がんを有する一部の男性での使用が認可されているＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）である。このワクチンは、ほとんどの前立腺がん細胞上に見られる抗原である前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に対する免疫応答を刺激する。このワクチンは、特定の患者の免疫細胞を単離すること、および樹状細胞をＰＡＰとともに培養して、免疫系を刺激するおよびＰＡＰを標的とする抗原提示細胞を産生することによって、作出される。これらのおよび他のがんワクチンを、本明細書に記載の他の処置と組み合わせて使用することができる。
Ａ．両親媒性ワクチン

一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質との使用に好適ながんワクチンは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２９５１２９号に記載されているような、両親媒性ワクチンである。両親媒性ワクチンは、ｉｎｖｉｖｏでペプチドまたはアジュバントをリンパ節に効率的に標的化するために、アルブミン結合脂質とペプチド抗原または分子アジュバントとを併せ持つ。脂質コンジュゲートは、内在性アルブミンに結合し、このアルブミンによりリンパ管および流入領域リンパ節に標的化され、抗原提示細胞によるアルブミンの濾過によってそこに蓄積する。脂質コンジュゲートが抗原ペプチドまたは分子アジュバントを含む場合、コンジュゲートは、強固な免疫応答を誘導または強化する。

リンパ節標的化コンジュゲートは、高親油性のアルブミン結合ドメイン（例えば、アルブミン結合脂質）；分子アジュバントまたはペプチド抗原などのカーゴ；およびコンジュゲートの溶解性を促進し、脂質の細胞原形質膜への挿入能力を低下させる、極性ブロックリンカーの、３つのドメインを通常は含む。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲートの一般構造は、Ｌ−Ｐ−Ｃであり、この構造式中の「Ｌ」は、アルブミン結合脂質であり、「Ｐ」は、極性ブロックであり、「Ｃ」は、分子アジュバントまたはポリペプチドなどのカーゴである。一部の実施形態では、カーゴ自体も極性ブロックドメインとしての機能を果たすことができ、別の極性ブロックドメインは必要とされない。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、アルブミン結合脂質およびカーゴの、２つのドメインしか有さない。

本明細書で開示される方法における使用に好適なコンジュゲートのカーゴは、典型的には、分子アジュバント、例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチド、またはペプチド抗原である。しかし、カーゴは、リンパ節への効率的輸送を必要とする、他のオリゴヌクレオチド、ペプチド、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくは他の免疫調節化合物、色素、ＭＲＩ造影剤、フルオロフォアまたは小分子薬であることもある。

ある特定の実施形態では、脂質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、脂質に直接コンジュゲートされているかまたは脂質にコンジュゲートされているリンカーに連結されている、免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態は、脂質に直接コンジュゲートされているかまたは脂質にコンジュゲートされているリンカーに連結されている抗原ペプチドを含む、脂質−ペプチドコンジュゲートに関する。
脂質

脂質コンジュゲートは、疎水性脂質を通常は含む。脂質は、直鎖状、分岐状または環状であることがある。脂質は、好ましくは、長さ少なくとも１７〜１８炭素であるが、それが良好なアルブミン結合、およびリンパ節への適切な標的化を示す場合にはより短くてもよい。リンパ節標的化コンジュゲートは、送達部位からリンパ液によってリンパ節に輸送することができる、脂質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび脂質−ペプチドコンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、活性は、対象の血液中のアルブミンと会合するコンジュゲートの能力に一部は依拠する。そのために、リンパ節に標的化されたコンジュゲートは、生理条件下でアルブミンに結合することができる脂質を通常は含む。リンパ節への標的化に好適な脂質は、脂質のまたは脂質を含む脂質コンジュゲートの、アルブミンに結合する能力に基づいて選択することができる。脂質または脂質コンジュゲートの、アルブミンに結合する能力を試験するための好適な方法は、当技術分野において公知である。

例えば、ある特定の実施形態では、複数の脂質コンジュゲートに水溶液中で自発的にミセルを形成させる。ミセルは、アルブミン、またはアルブミンを含む溶液、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とともに、インキュベートされる。試料は、例えば、ＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィー、または結合が起こったかどうかを判定するための他の方法により、分析することができる。アルブミン、またはアルブミンを含む溶液、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下で、ミセルが解離し、脂質コンジュゲートが上述のようにアルブミンと結合した場合、脂質コンジュゲートを、リンパ節標的化コンジュゲートとして選択することができる。

リンパ節標的化脂質コンジュゲートにおける使用に好ましい脂質の例としては、直鎖状飽和および不飽和脂肪酸、分岐状飽和および不飽和脂肪酸、ならびに脂肪酸誘導体、例えば、脂肪酸エステル、脂肪酸アミドおよび脂肪酸チオエステルを含むがこれらに限定されない、８〜３０炭素の脂肪族尾部を有する脂肪酸、ジアシル脂質、コレステロール、コレステロール誘導体、およびステロイド酸、例えば胆汁酸、リピドＡ、またはこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

ある特定の実施形態では、脂質は、ジアシル脂質であるか、または２つの尾部を持つ脂質である。一部の実施形態では、ジアシル脂質における尾部は、約８〜約３０個の炭素を含有し、飽和していることもあり、不飽和であることもあり、またはこれらの組合せであることもある。尾部を、エステル結合連結、アミド結合連結、チオエステル結合連結、またはこれらの組合せによって、頭部基とカップリングさせることができる。特定の実施形態では、ジアシル脂質は、リン酸脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、またはこれらの組合せである。

好ましくは、リンパ節標的化コンジュゲートは、長さ８炭素単位またはそれを超える炭素単位数である脂質を含む。脂質単位の数を増加させることで、細胞の原形質膜への脂質の挿入を低減することができ、それによって、脂質コンジュゲートは、アルブミンへの自由な結合およびリンパ節への自由な輸送を維持することが可能になると考えられる。

例えば、脂質は、２つのＣ１８炭化水素尾部で構成されているジアシル脂質であり得る。

ある特定の実施形態では、リンパ節標的化脂質コンジュゲートの調製に使用するための脂質は、単鎖炭化水素（例えば、Ｃ１８）でもコレステロールでもない。コレステロールコンジュゲーションは、ＣｐＧなどの分子アジュバントの免疫調節およびペプチドの免疫原性を強化するために調査されてきたが、リポタンパク質とはよく会合するがアルブミンとは然程しないコレステロールコンジュゲートは、最適なアルブミン結合コンジュゲートと比較してワクチンで不十分なリンパ節標的化および低い免疫原性を示す。
分子アジュバント

ある特定の実施形態では、脂質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートがワクチンにおいて使用される。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、免疫刺激オリゴヌクレオチドを通常は含有する。

ある特定の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンドとしての機能を果たすことができる。ＰＲＲの例としては、自然免疫応答の開始に関与し、後のより抗原特異的な適応免疫応答にも影響を与える、シグナル伝達分子のＴｏｌｌ様ファミリーが挙げられる。したがって、オリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）などのＴｏｌｌ様ファミリーシグナル伝達分子のリガンドとしての機能を果たすことができる。

例えば、非メチル化ＣｐＧ部位は、ヒトの場合、形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞上のＴＬＲ９により検出され得る（Ｚａｉｄａ，ｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，７６（５）：２１２３−２１２９，（２００８））。したがって、オリゴヌクレオチドの配列は、１つまたは複数の非メチル化シトシン−グアニン（ＣＧまたはＣｐＧ、これらは同義的に使用される）ジヌクレオチドモチーフを含むことができる。「ｐ」は、より詳細に下で論じられる、ＤＮＡのホスホジエステル骨格を指し、ＣＧを含む一部のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有することもある。

ある特定の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、隣接して配置されているかまたは介在ヌクレオチドにより隔てられている、１つより多くのＣＧジヌクレオチドを含有することができる。ＣｐＧモチーフは、オリゴヌクレオチド配列の内部に存在することができる。非常に多くのヌクレオチド配列が、ＣＧジヌクレオチドの数および位置、ならびにＣＧ二量体に隣接する正確な塩基配列が多様である、ＴＬＲ９を刺激する。

典型的に、ＣＧＯＤＮは、それらの配列、二次構造、およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する効果に基づいて分類される。５つのクラスは、クラスＡ（Ｄ型）、クラスＢ（Ｋ型）、クラスＣ、クラスＰ、およびクラスＳである（参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｊ＆Ｋｒｉｅｇ，ＡＭ，Ａｄｖａｎｃｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｒｅｖｉｅｗｓ６１（３）：１９５−２０４（２００９））。ＣＧＯＤＮは、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮα）の産生を刺激し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導することができる。ＯＤＮの一部のクラスは、間接的なサイトカインシグナル伝達によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の強力な活性化因子でもある。一部のクラスは、ヒトＢ細胞および単球成熟の強力な刺激因子である（Ｗｅｉｎｅｒ，ＧＬ，ＰＮＡＳＵＳＡ９４（２０）：１０８３３−７（１９９７）；Ｄａｌｐｋｅ，ＡＨ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０６（１）：１０２−１２（２００２）；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ，ＪｏｆＩｍｍｕｎ．１６４（３）：１６１７−２（２０００）、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。

一部の実施形態によれば、親油性ＣｐＧオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチド抗原への免疫応答を強化するために使用される。親油性ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、
５’−Ｌ−Ｇ_ｎＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’
（式中、「Ｌ」は、ジアシル脂質などの親油性化合物であり、「Ｇ_ｎ」は、グアニンリピートリンカーであり、「ｎ」は、１、２、３、４または５を表す）により表される。

他のＰＲＲＴｏｌｌ様受容体は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および短い二本鎖ＲＮＡをそれぞれ認識することができる、ＴＬＲ３およびＴＬＲ７；ならびにサイトゾル中のＲＮＡ感知受容体として最も公知のレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）様受容体、すなわち、ＲＩＧ−Ｉおよび黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）を含む。したがって、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、もしくはＲＩＧ−Ｉ様受容体の機能的リガンド、またはこれらの組合せを含有する。

免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびそれらの製造方法の例は、当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｅｒａ，Ｐ．ＲｅｃｅｎｔＰａｔＩｎｆｌａｍｍＡｌｌｅｒｇｙＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．５（１）：８７−９３（２０１１）を参照されたい。

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴは、２つまたはそれより多くの免疫刺激配列を含む。

オリゴヌクレオチドは、例えば、長さ５ヌクレオチド塩基、長さ１０ヌクレオチド塩基、長１５ヌクレオチド塩基、長さ２０ヌクレオチド塩基、長さ２５ヌクレオチド塩基、長さ３０ヌクレオチド塩基、長さ３５ヌクレオチド塩基、長さ４０ヌクレオチド塩基、長さ４５ヌクレオチド塩基、長さ５０ヌクレオチド塩基、長さ６０ヌクレオチド塩基、長さ７０ヌクレオチド塩基、長さ８０ヌクレオチド塩基、長さ９０ヌクレオチド塩基、長さ９５ヌクレオチド塩基、長さ９８ヌクレオチド塩基、長さ１００ヌクレオチド塩基またはそれを超える長さを含む、長さ２〜１００ヌクレオチド塩基の間であることができる。

オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端を、極性ブロックまたは脂質にコンジュゲートさせることができる。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端は、極性ブロックまたは脂質に連結される。

オリゴヌクレオチドは、複素環式塩基（核酸塩基）と、複素環式塩基に結合されている糖部分と、糖部分のヒドロキシル官能基をエステル化するリン酸部分とを通常は含むＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであることもある。主な天然に存在するヌクレオチドは、複素環式塩基としてのウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンと、ホスホジエステル結合により連結されているリボースまたはデオキシリボースとを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ対応物と比較して、安定性、半減期、または標的受容体に対する特異性もしくは親和性を向上させるように化学的に改変されたヌクレオチドアナログで構成されている。化学的改変は、核酸塩基、糖部分、ヌクレオチド連結またはこれらの組合せについての化学的改変を含む。本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」または「化学的に改変されたヌクレオチド」は、複素環式塩基、糖部分またはリン酸部分構成要素のうちの１つまたは複数についての化学的改変を有するヌクレオチドを定義する。ある特定の実施形態では、改変ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低減される。例えば、オリゴヌクレオチドは、低い負電荷を有することもあり、電荷を有さないこともあり、または正電荷を有することもある。

典型的に、ヌクレオシドアナログは、標準ポリヌクレオチド塩基にワトソン−クリック型の塩基対合により水素結合することができる塩基を担持しており、アナログ骨格は、オリゴヌクレオチドアナログ分子と標準ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間のそのような水素結合を配列特異的に可能にする形で塩基を提示する。ある特定の実施形態では、アナログは、実質的に非荷電の、リン含有骨格を有する。
ペプチド抗原

本明細書で開示される方法における使用に好適なペプチドコンジュゲートは、腫瘍関連抗原またはその一部分などの、抗原タンパク質またはポリペプチドを通常は含む。

ペプチドは、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む、２〜１００アミノ酸であることがある。一部の実施形態では、ペプチドは、５０アミノ酸を超えることもある。一部の実施形態では、ペプチドは、＞１００アミノ酸であることもある。

タンパク質／ペプチドは、直鎖状、分岐状または環状であることがある。ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸、またはこれらの組合せを含むことができる。ペプチドまたはタンパク質を、そのペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端で極性ブロックまたは脂質とコンジュゲートさせることができる。

タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質またはペプチドに対する抗体およびＴ細胞応答を生じさせる免疫系の能力を誘導することまたは増加させることができる、任意のタンパク質またはペプチドであることができる。がん抗原は、がん細胞によって通常は優先的に発現される抗原であり（すなわち、それは、非がん細胞上より高レベルでがん細胞に発現され）、一部の事例では、それは、がん細胞によってのみ発現される。がん抗原は、がん細胞内に発現されることもあり、またはがん細胞の表面に発現されることもある。がん抗原は、これらに限定されないが、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、およびＣＤ２０であり得る。がん抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−０５）、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶにコードされた核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ＣＤ２０、またはｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択することができる。さらなるがん抗原としては、本明細書に記載される腫瘍抗原が挙げられる。

好適な抗原は、当技術分野において公知であり、商業的な政府のおよび科学的な供給元から入手することができる。ある特定の実施形態では、抗原は、全不活性化または照射腫瘍細胞である。抗原は、腫瘍に由来する精製されたまたは部分的に精製されたポリペプチドであることもある。抗原は、ポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを異種発現系に発現させることにより産生された組換えポリペプチドであることもある。抗原は、抗原タンパク質の全てまたは一部をコードするＤＮＡであることもある。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態であることもある。

ある特定の実施形態では、抗原は、単一抗原として提供されることがあり、または組み合わせて提供されることがある。抗原は、ポリペプチドまたは核酸の複合混合物として提供されることもある。
極性ブロック／リンカー

コンジュゲートがリンパ節に効率的に輸送されるには、コンジュゲートは、可溶性のままであるほうがよい。そのために、極性ブロックリンカーをカーゴと脂質の間に含めて、コンジュゲートの可溶性を増加させることができる。極性ブロックは、注射部位に隣接する組織における細胞などの細胞の原形質膜への脂質の挿入能力を低下させる、または阻む。極性ブロックは、投与部位で細胞外マトリックスタンパク質と非特異的に会合しないように、ＰＳ骨格を有する合成オリゴヌクレオチドなどのカーゴの能力を低下させることまたは阻むことができる。極性ブロックは、アルブミンと結合するコンジュゲートの能力を阻むことなく、コンジュゲートの可溶性を増加させる。特性のこの組合せによって、コンジュゲートは、血清または間質液中に存在するアルブミンに結合することが可能になり、アルブミンがリンパ節に輸送され、そこに滞留されるまで、循環血中に残存することが可能になると考えられる。

極性ブロックの長さおよび組成を、選択される脂質およびカーゴに基づいて調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの場合、オリゴヌクレオチド、例えば、長さ１０、１５、２０ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数であるオリゴヌクレオチド、自体が、コンジュゲートの可溶性を確保するのに十分なほど極性であることもある。そのために、ある特定の実施形態では、追加の極性ブロックリンカーは、必要とされない。しかし、アミノ酸配列に依存して、一部の脂質化ペプチドは、本質的に不溶性であり得る。これらの場合、極性オリゴヌクレオチドの効果を模倣する極性ブロックを含めることが望ましいことがある。

極性ブロックは、本明細書で開示される方法における使用に好適な脂質コンジュゲートのいずれか、例えば、細胞膜挿入／アルブミンへの優先的分配を低減する、脂質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび脂質−ペプチドコンジュゲート、の一部として使用することができる。好適な極性ブロックとしては、上述のものなどのオリゴヌクレオチド；ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ：５００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ）、ポリアクリルアミド（ＭＷ：５００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ）、ポリアクリル酸を含むがこれらに限定されない、親水性ポリマー；セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンまたはこれらの組合せなどの、一連の親水性アミノ酸；デキストラン（ＭＷ：１，０００Ｄａ〜２，０００，０００Ｄａ）を含むがこれに限定されない、多糖；またはこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

疎水性脂質およびリンカー／カーゴは、共有結合で連結される。共有結合は、切断不能な連結であることもあり、または切断可能な連結であることもある。切断不能な連結としては、アミド結合またはリン酸結合を挙げることができ、切断可能な連結としては、ジスルフィド結合、酸により切断可能な連結、エステル結合、無水物結合、生分解性結合、または酵素により切断可能な連結を挙げることができる。
ａ．エチレングリコールリンカー

ある特定の実施形態では、極性ブロックは、１つまたは複数のエチレングリコール（ＥＧ）単位、より好ましくは、２つまたはそれより多くのＥＧ単位（すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはその誘導体もしくはアナログにより連結されている、タンパク質またはペプチド（例えば、ペプチド抗原）と疎水性脂質を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法における使用に好適なタンパク質コンジュゲートは、タンパク質抗原を含有し、このタンパク質抗原は、ＰＥＧに連結されており、そしてまたそのＰＥＧが、疎水性脂質、または脂質−Ｇｎ−ＯＮコンジュゲートに、共有結合で連結されているか、またはオリゴミセルにハイブリダイズするタンパク質−オリゴコンジュゲートの形成によって連結されている。ＥＧ単位の正確な数は、脂質およびカーゴに依存するが、通常は、極性ブロックは、約１〜約１００ＥＧ単位の間、約２０〜約８０ＥＧ単位の間、約３０〜約７０ＥＧ単位の間、または約４０〜約６０ＥＧ単位の間であり得る。ある特定の実施形態では、極性ブロックは、約４５〜約５５の間のＥＧ単位を有する。例えば、ある特定の実施形態では、極性ブロックは、４８ＥＧ単位を有する。
ｂ．オリゴヌクレオチドリンカー

上述の通り、ある特定の実施形態では、極性ブロックは、オリゴヌクレオチドである。極性ブロックリンカーは、任意の配列を有することができ、例えば、オリゴヌクレオチドの配列は、ランダム配列であることもあり、またはその分子量もしくは生化学的特性（例えば、高い極性）のために特異的に選択された配列であることもある。ある特定の実施形態では、極性ブロックリンカーは、１列または複数列の連続したアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそのアナログを含む。ある特定の実施形態では、極性ブロックリンカーは、１列の連続したアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそのアナログからなる。

ある特定の実施形態では、リンカーは、１個または複数のグアニン、例えば、１〜１０個の間のグアニンである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのカーゴと脂質尾部との間のグアニンの数を変更することで血清タンパク質の存在下でのミセル安定性が制御されることが判明している。したがって、リンカー中のグアニンの数を、アルブミンなどの血清タンパク質に対するコンジュゲートの所望の親和性に基づいて選択することができる。カーゴが、ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドであり、脂質尾部がジアシル脂質である場合、グアニンの数は、水溶液中で形成されたミセルが血清の存在下で解離する能力に影響を与える：非安定化ミセル（リポ−Ｇ_０Ｔ_１０−ＣＧ）の２０％は無傷であったが、残りの８０％は、破壊され、ＦＢＳ成分と結合した。グアニンの存在下では、無傷ミセルのパーセンテージは、３６％（リポ−Ｇ_２Ｔ_８−ＣＧ）から７３％（リポ−Ｇ_４Ｔ_６−ＣＧ）へと増加し、最終的に９０％（リポ−Ｇ_６Ｔ_４−ＣＧ）に達した。グアニンの数を８（リポ−Ｇ_８Ｔ_２−ＣＧ）および１０（リポ−Ｇ_１０Ｔ_０−ＣＧ）に増加させても、ミセル安定性はさらに向上しなかった。

したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法における使用に好適なリンパ節標的化コンジュゲートにおけるリンカーは、０、１または２個のグアニンを含有することができる。より詳細に下で論じられるように、３個またはそれより多くの連続したグアニンを含むリンカーを使用して、本明細書で開示される方法における使用に好適である特性を有するミセル安定化コンジュゲートを形成することができる。
Ｂ．免疫原性組成物

本明細書で開示される方法における使用に好適なコンジュゲートは、免疫原性組成物においてまたはワクチンの成分として使用することができる。典型的に、本明細書で開示される免疫原性組成物は、アジュバント、抗原、またはこれらの組合せを含む。アジュバントと抗原の組合せをワクチンと呼ぶことができる。組み合わせて対象に投与する場合、アジュバントと抗原を別々の医薬組成物で投与することができ、またはそれらを同じ医薬組成物で投与することができる。組み合わせて投与される場合、アジュバントが脂質コンジュゲートであることもあり、抗原が脂質コンジュゲートであることもあり、またはアジュバントおよび抗原が両方とも脂質コンジュゲートであることもある。

本明細書で開示される方法における使用に好適な免疫原性組成物は、単独で投与される、またはアジュバントと組み合わせて投与される抗原である脂質コンジュゲート、例えば、抗原ポリペプチド−脂質コンジュゲートを含むことができる。アジュバントは、限定ではないが、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；Ｑ．ｓａｐｏｎａｒｉａ木の樹皮から精製されたサポニン、例えば、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画を用いて２１番目のピークで溶出する糖脂質；Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰポリマー、ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）、Ｆｌｔ３リガンド、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長因子（精製Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質；ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、ＩＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質を含有する、免疫刺激複合体であって、抗原を保持することができる細孔を有するウイルスサイズの粒子を形成する免疫刺激複合体；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＳＢ−ＡＳ４（ミョウバンおよびＭＰＬを含有する、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍアジュバント系＃４；ＳＢＢ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、例えばＣＲＬ１００５（これらは、ポリオキシエチレン鎖が隣接している疎水性ポリオキシプロピレン直鎖を含有する；Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＭＳ（例えば、可溶性免疫刺激薬と組み合わせられた水性ナノ粒子であるＩＭＳ１３１２、Ｓｅｐｐｉｃ）であり得る。

アジュバントは、上述のものなどのＴＬＲリガンドであることもある。ＴＬＲ３を介して作用するアジュバントとしては、限定ではないが、二本鎖ＲＮＡが挙げられる。ＴＬＲ４を介して作用するアジュバントとしては、限定ではないが、リポ多糖の誘導体、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ；ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）およびトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４（リピドＡに関連するグルコサミン二糖；ＯＭＰｈａｒｍａＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられる。ＴＬＲ５を介して作用するアジュバントとしては、限定ではないが、フラジェリンが挙げられる。ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介して作用するアジュバントとしては、一本鎖ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、合成低分子量化合物、例えば、イミダゾキノリンアミン（例えば、イミキモド（Ｒ−８３７）、レシキモド（Ｒ−８４８））が挙げられる。ＴＬＲ９を介して作用するアジュバントとしては、ウイルスもしくは細菌を起源とするＤＮＡ、または合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えば、ＣｐＧＯＤＮが挙げられる。別のアジュバントクラスは、ホスホロチオエート含有分子、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチドアナログ、およびホスホロチオエート骨格連結を含有する核酸である。

アジュバントは、油乳剤（例えば、フロイントアジュバント）；サポニン製剤；ビロソームおよびウイルス様粒子；細菌および微生物の派生物；免疫刺激オリゴヌクレオチド；ＡＤＰ−リボシル化毒素および無毒化誘導体；ミョウバン；ＢＣＧ；無機物含有組成物（例えば、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）；生体接着剤および／または粘膜接着剤；微小粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；ポリホスファゼン；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；ならびに界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）であることもある。

アジュバントとしては、免疫調節物質、例えば、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−ガンマ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子も挙げることができる。
キット

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質および使用説明書を少なくとも含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、好適な容器に、免疫調節融合タンパク質、１つまたは複数の対照、ならびに当技術分野において周知の様々な緩衝剤、試薬、酵素および他の標準的な成分を含む。一部の実施形態では、キットは、免疫療法と組み合わせて使用するための説明書をさらに含む。

一部の実施形態では、容器は、免疫調節融合タンパク質を中に入れることができ、一部の事例では好適に分取することができる、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段である。追加の成分を備える場合、キットは、この化合物を入れることができる追加の容器を含むことができる。キットは、免疫調節融合タンパク質を収容するための手段および任意の他の試薬容器を商用販売のために厳重に密封された状態で含むこともできる。そのような容器としては、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができる。容器および／またはキットは、使用説明および／または警告が書かれたラベル付けを含むことができる。

一部の実施形態では、本開示は、免疫療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、がんワクチン、抗腫瘍関連抗原抗体、および／または免疫チェックポイント遮断）を受ける個体におけるがんの進行を処置するまたは遅らせるための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、必要に応じた薬学的に許容される担体を含む容器と、組成物を投与するための説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。

一部の実施形態では、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受ける個体におけるがんの進行を処置するまたは遅らせるための、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質、必要に応じた薬学的に許容される担体を含む医薬と、医薬を単独でまたは免疫療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、がんワクチン、抗腫瘍関連抗原抗体、および／または免疫チェックポイント遮断）と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書とを含むキットを提供する。
他の実施形態−コラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質

別の態様では、本開示は、Ｉｇ結合ドメインとコラーゲン結合ドメインとを含むコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質を提供する。本開示により提供されるコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質は、投与されたときにＩｇＧ（例えば、免疫調節ＩｇＧ）におよびコラーゲンに結合することによってＩｇＧを腫瘍内に局在させるかまたは隔離する。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、上記のコラーゲン結合ドメインである。例示的なＩｇＧ結合ドメインとしては、二量体化Ｚドメイン（本明細書で「ＺＺ」とも呼ばれる、プロテインＡの５つのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つ）（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇｅｔａｌ．，（１９９５）ＪＭｏｌＲｅｃｏｇｎｉｔ８：２７０−２７８）、プロテインＧの二量体化ＩｇＧ結合ドメイン（本明細書では「ＳｐＧ２」と呼ばれる）（Ｊｕｎｇｅｔａｌ．，（２００９）ＡｎａｌＣｈｅｍ８１：９３６−９４２）、Ｓｓｏ７ｄ酵母ディスプレイライブラリーから単離されたＩｇＧ結合因子（Ｇｅｒａｅｔａｌ．，（２０１１）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４０９：６０１−６１６）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）酵母ディスプレイライブラリーから単離されたＩｇＧ結合因子（Ｈａｃｋｅｌｅｔａｌ．，（２０１０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４０１：８４−９６）、およびＩｇＧＦｃ領域に結合するように設計された２つの小ペプチド（本明細書では「Ｆｃ−ＩＩＩ−４Ｃ」および「ＲＲＧＷ」と呼ばれる）（Ｇｏｎｇｅｔａｌ．，（２０１５）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ２７：１５６９−１５７３；Ｔｓａｉｅｔａｌ．，（２０１４）ＡｎａｌＣｈｅｍ８６：２９３１−２９３８）が挙げられる。

一部の実施形態では、コラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質は、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用に好適である。一部の実施形態では、コラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質は、治療用抗体（例えば、免疫調節抗体）と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、コラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質は、がんの処置のために治療用抗体と組み合わせて投与される。

本開示をその特定の実施形態に関して説明してきたが、本開示の真の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変化を加えることができ、均等物を代わりに用いることができることは当業者には理解されるはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスのステップ（単数または複数）を本開示の目的、趣旨および範囲に適応させるために多くの変更を加えることができる。そのような変更形態は、本開示の範囲に記載の範囲に入るように意図されている。
（実施例１）
哺乳動物細胞におけるコラーゲン結合融合タンパク質の組換え発現

哺乳動物細胞にコラーゲン結合免疫調節分子を発現させる能力を評価するために、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）に融合した５種類のＨｉｓタグ付きコラーゲン結合ポリペプチド（コラーゲンイメージングプローブ（ＣＮＡ３５−Ｇｌｕｃ）、細菌コラゲナーゼＣｏｌＧドメインｓ３ａ／ｓ３ｂ（ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ）、マウス胎盤増殖因子−２のヘパリン結合ドメイン（ＰＬＧＦ２ＨＢＤ−Ｇｌｕｃ）、細菌コラゲナーゼＣｏｌＨドメインｓ３（ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃ）、およびマウスタンパク質ルミカン（ルミカン−Ｇｌｕｃ））を、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に一過的に発現させた。これらの構築物のアミノ酸配列を配列番号１２８〜１３２に示す。手短に述べると、ＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（細胞培養物１リットル当たり２０ｍＬ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のポリエチレンイミン（細胞培養物１リットル当たり２ｍｇ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（１，０００，０００細胞／ｍＬの密度で）に、滅菌濾過したプラスミドＤＮＡ（細胞培養物１リットル当たり１ｍｇ）をトランスフェクトした。以前に記載された（Ｚｈｕｅｔａｌ．２０１５）ようにｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＴＡ９９を精製した。ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎ（タカラバイオ株式会社）を使用して、ＨＥＫ２９３上清からＨｉｓタグ付きタンパク質を単離した。次いで、１ＭＮａＯＨで４時間、前処理してエンドトキシンを除去し、滅菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で平衡させた、ＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによりサイトカイン融合タンパク質をさらに精製した。精製後、全てのタンパク質について滅菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）への緩衝液交換を行い、０．２マイクロメートル滅菌濾過（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を行い、発色ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ）を使用して最小レベルのエンドトキシン（１注射当たり＜０．１ＥＵ）を含有することを確認した。それらの分子量を確認するために、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１％ＭＥＳ泳動緩衝液を用いて、タンパク質をＮｏｖｅｘＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｈａｒｐＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒと同時に泳動させた。全てのタンパク質を４℃で保管したが、治療のための注射の前に、サイトカイン融合タンパク質を室温に温めて、可逆的低温変性を示すルミカンを回復させた。得られた溶離物中のＨｉｓタグ付きコラーゲン結合融合タンパク質の相対発現レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、およびＴＡＬＯＮ精製溶離物のサイズ排除クロマトグラフィー後に吸光光度分析により評価した。

ＨＥＫ細胞溶解物から精製したＨｉｓタグ付きタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判定したところ、ＨＥＫ２９３細胞における単独でのＧｌｕｃ（１９．８ｋＤａ）ならびにＧｌｕｃ融合コラーゲン結合ポリペプチドＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ（４６．１ｋＤａ）、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃ（３２．８ｋＤａ）およびルミカン−Ｇｌｕｃ（５６．６ｋＤａ）の一過性発現が達成された。各融合タンパク質のそれぞれの予想分子量でまたはその付近でタンパク質染色が観察された（データを示さない）。しかし、ＨＥＫ細胞溶解物から精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、ＣＮＡ３５−Ｇｌｕｃ（５４．４ｋＤａ）についても、ＰＬＧＦ２ＨＢＤ−Ｇｌｕｃ（２２．８ｋＤａ）についても、発現は観察されなかった（データを示さない）。

組換え発現させ、精製したＨｉｓタグ付きタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー中に吸光光度分析により判定したところ、ＨＥＫ２９３細胞においてＧｌｕｃ、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃ、およびルミカン−Ｇｌｕｃの一過性発現が達成された。２８０ｎｍでのＵＶ線吸収（Ａ２８０）の単量体ピークが、各融合タンパク質について観察された（データを示さない）。ＣＮＡ３５−Ｇｌｕｃについても、ＰＬＧＦ２ＨＢＤ−Ｇｌｕｃについても、吸収ピークは検出されなかった。

ルミカンに加えて、他の哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチドをコラーゲン結合融合タンパク質として発現させることができる。哺乳動物白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ−１）タンパク質の細胞外ドメインは、コラーゲンに結合することが公知である（Ｌｅｂｂｉｎｋｅｔａｌ．，（２００６）ＪＥｘｐＭｅｄ２０３（６）：１４１９−１４２５）。組換え発現タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー中に吸光光度分析により判定したところ、上記のようなＨＥＫ２９３におけるＨｉｓタグ付きマウスＬＡＩＲ−１の細胞外ドメイン（配列番号１８１に示すアミノ酸配列）の一過性発現が達成された。２８０ｎｍでのＵＶ線吸収（Ａ２８０）により測定したところ、ＬＡＩＲ−１は、単量体ピークとして溶離された。

これらの結果は、原核生物または哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチドを含むコラーゲン結合融合タンパク質が、哺乳動物細胞に発現されることを実証する。ＨＥＫ２９３細胞におけるＨｉｓタグ付きコラーゲン結合融合タンパク質ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃおよびルミカン−Ｇｌｕｃならびに単独でのＧｌｕｃの発現は、達成されたが、ＣＮＡ３５−Ｇｌｕｃの発現もＰＬＧＦ２ＨＢＤ−Ｇｌｕｃの発現も観察されなかった。さらに、Ｈｉｓタグ付きＬＡＩＲ−１の細胞外ドメインをＨＥＫ２９３細胞に発現させ、精製した。これらの結果は、原核生物または哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチド（例えば、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ、ＣｏｌＨｓ３、ルミカンまたはＬＡＩＲ）を含むコラーゲン結合免疫調節分子が、哺乳動物細胞に発現することを示唆している。
（実施例２）
組換えコラーゲン結合融合タンパク質はｉｎｖｉｔｒｏでコラーゲンに結合する

コラーゲンに結合するコラーゲン結合免疫調節分子の能力を評価するために、実施例１で説明したように発現させ、精製したコラーゲン結合融合タンパク質を、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＶコーティングプレートに結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡにより試験した。手短に述べると、コラーゲンＩ（Ｇｉｂｃｏ）およびコラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティング９６ウェルプレートを、ＰＢＳ＋０．１％重量／体積ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％重量／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴＡ）で１時間、室温でブロックし、次いで、ＰＢＳＴＡ中の様々な濃度のルミカンとともに３時間、室温でインキュベートした。ルミカンは、低温により媒介されたその変性を元に戻すために、１０分間、３７℃で予温しておいた。ウェルをＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで、ＰＢＳＴＡ中、１：４０００希釈でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナル抗６ｘＨｉｓ（ａｂ１１８７、Ａｂｃａｍ）とともに１時間、室温でインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで１０分間、１−ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、その後、１Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度（５７０ｎｍでの基準吸光度で補正した）を測定した。ＭＳＡを滴定したウェルは、陰性対照としての役割を果たした。

精製されたＨｉｓタグ付きコラーゲン結合融合タンパク質ルミカン−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、およびＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃを、コラーゲンＩコーティングプレートにおいてＥＬＩＳＡにより評価した。図１Ａに示すように、ルミカン−ＧｌｕｃおよびＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃのみが、それぞれ、１３０ｎＭおよび１３９ｎＭのＫＤでコラーゲンＩに結合した。ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃは、Ｇｌｕｃバックグラウンド結合よりも特異的にコラーゲンＩに結合しなかった。

精製されたＨｉｓタグ付きコラーゲン融合タンパク質ルミカン−Ｇｌｕｃ、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、およびＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃを、コラーゲンＩＶコーティングプレートにおいてＥＬＩＳＡにより評価した。図１Ｂに示すように、ルミカン−Ｇｌｕｃは、６００ｎＭのＫＤでコラーゲンＩＶに結合した。ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃも、ＣｏｌＨｓ３−Ｇｌｕｃも、Ｇｌｕｃバックグラウンド結合よりも特異的にコラーゲンＩＶに結合しなかった。

精製されたＨｉｓタグ付きマウスＬＡＩＲ−１（ｍＬＡＩＲ１−Ｈｉｓと表示した）およびＨｉｓタグ付きビオチン化ルミカン（Ｌｗｔ−Ｈｉｓ−ｂと表示した）を、Ｉ型コラーゲンへの結合についてＥＬＩＳＡにより濃度の関数として評価した。結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた抗ＨＩＳ抗体を使用してＥＬＩＳＡにより判定した。図１Ｃに示すように、ＬＡＩＲ−１およびルミカンは、Ｉ型コラーゲンへの同様の結合親和性を有した。ウシ血清アルブミンでブロックしたプレートへの結合もＥＬＩＳＡにより評価した。どちらのタンパク質についても結合は観察されなかった。これは、Ｉ型コラーゲンへの測定された結合が特異的であったことを示す。

上記の哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチドのコラーゲン結合活性をさらに実証するために、実施例１で説明した精製されたＨｉｓタグ付きＬＡＩＲ−１およびルミカンコラーゲン結合ポリペプチドの、コラーゲンに競合的に結合する能力を、試験した。手短に述べると、コラーゲンＩ（Ｇｉｂｃｏ）９６ウェルプレートを、ＰＢＳ＋０．１％重量／体積ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％重量／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴＡ）で１時間、室温でブロックし、次いで、ＰＢＳＴＡ中、５０ｎＭのビオチン化ルミカンの存在下、室温で、３時間、様々な濃度のＬＡＩＲとともにインキュベートした。ルミカンおよびＬＡＩＲは、低温により媒介されたその変性を元に戻すために、１０分間、３７℃で予温しておいた。ウェルをＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで、ＰＢＳＴＡ中、１：４００希釈でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルストレプトアビジン−ＨＲＰとともに１時間、室温でインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで１０分間、１−ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、その後、１Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度（５７０ｎｍでの基準吸光度で補正した）を測定した。ＭＳＡを滴定したウェルは、陰性対照としての役割を果たした。コラーゲンコーティングプレートにおける様々な濃度のＬＡＩＲの存在下でルミカン結合を検出する競合ＥＬＩＳＡの結果を、図１Ｄに示す。

精製後のコラーゲン結合ポリペプチドの安定性を評価するために、凍結状態から解凍した後の溶液中のルミカンのコラーゲン結合活性を試験した。手短に述べると、凍結からの解凍後、異なる条件：３７℃、３週間（青色）；４℃、３週間（灰色）；４℃、２週間、その後、３７、１週間（赤色）で、様々な賦形剤（トレハロース（Ｔ）、ＢＳＡ（Ｂ）、コラーゲン（Ｃ）、単独のタンパク質（Ｐ））とともにインキュベートしたルミカンのコラーゲンＩ親和性（Ｋ_Ｄ）。凍結から解凍後の、賦形剤（トレハロース、ウシ血清アルブミン、およびコラーゲン）の存在下での、コラーゲンＩへのルミカンの結合親和性を、前に説明したようにＥＬＩＳＡにより判定した。親和性（Ｋ_Ｄ）の結合は、使用した賦形剤を問わず維持された。しかし、ルミカンを測定前に３７℃に温めなかった場合、結合親和性は、おおよそ５０分の１に低減された（データを示さない）。

これらの結果は、原核生物（例えば、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ）または哺乳動物（例えば、ルミカン）コラーゲン結合ポリペプチドを含むコラーゲン結合融合タンパク質が、コラーゲンＩに結合することを実証する（図１Ａ）。これらの結果は、哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチド（例えば、ルミカン）を含むコラーゲン結合融合タンパク質が、コラーゲンＩとコラーゲンＩＶの両方に結合することも実証する（図１Ｂ）。さらに、これらの結果は、ＬＡＩＲ−１およびルミカンの細胞外ドメインが、コラーゲンＩへの結合について競合することを実証する（図１Ｃ、１Ｄ）。これらの結果は、原核生物または哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチド（例えば、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ、ルミカン、およびＬＡＩＲ−１）を含むコラーゲン結合免疫調節分子が、コラーゲンに結合することを示唆している。
（実施例３）
組換えコラーゲン結合融合タンパク質は腫瘍内注射後に滞留する

Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンは、それぞれ、腫瘍を取り囲む厚い線維性被膜、および血管周囲基底膜の成分である。マウス腫瘍におけるＩ型およびＩＶ型コラーゲンの発現を評価するために、０日目に１，０００，０００個の４Ｔ１、ＭＣ３８またはＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をマウスに接種した。１０日目に腫瘍を切除し、１０％中性緩衝ホルマリン中で一晩固定し、次いでパラフィンに包埋し、５マイクロメートル厚の切片にした（ＣｒｙｏＳｔａｒＮＸ７０）。腫瘍断面を免疫組織化学的検査によりＩ型およびＩＶ型コラーゲンの存在について評定した。手短に述べると、Ｉ型コラーゲンに対するウサギ抗体（ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ）およびＩＶ型コラーゲンに対するウサギ抗体（ａｂ６５８６、Ａｂｃａｍ）を、０．１％体積／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水中、１：５００希釈で用いて、切片を染色し、その後、ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（ａｂ６７２１、Ａｂｃａｍ）を使用して二次染色した。４Ｔ１（左側）、ＭＣ３８（中央）およびＢ１６Ｆ１０（右側）腫瘍の断面は、Ｉ型コラーゲン（上部）およびＩＶ型コラーゲン（下部）について陽性染色を示した（データを示さない）。したがって、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンは、いくつかの同種マウス腫瘍モデルにおいて多量に発現される。

コラーゲン結合免疫調節分子の腫瘍内滞留を評価するために、実施例２でコラーゲンＩに結合したコラーゲン結合融合タンパク質（ルミカン−ＧｌｕｃおよびＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ）を、腫瘍内注射部位において会合状態で残存するそれらの能力について、ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングにより試験した。手短に述べると、５×１０^５個の４Ｔ１細胞（マウス乳癌細胞）をＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に注射し、その後、腫瘍細胞注射後７日目に、単独のＧｌｕｃ、ＧｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃ、またはルミカン−Ｇｌｕｃを腫瘍内注射した。腫瘍内注射後直ちに、各マウスを、ｉｎｖｉｖｏ生物発光イメージング（落射照明、自動露出設定）によりモニターした。

単独のＧｌｕｃを注射したマウスからの生物発光シグナルは、注射のおおよそ３６時間後にはバックグラウンドレベルに低下した（データを示さない）。ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃを注射したマウスからのシグナルは、注射のおおよそ８．５日および＿＿後にはバックグラウンドレベルに低下した（データを示さない）。ルミカン−Ｇｌｕｃを注射したマウスからのシグナルは、実験期間（注射後おおよそ１６．５日、データを示さない）の間、バックグラウンドレベル未満に低下しなかった。

これらの結果は、コラーゲン結合融合タンパク質ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂ−Ｇｌｕｃおよびルミカン−Ｇｌｕｃが、ある期間にわたって腫瘍内注射部位に物理的に滞留することを実証する。これらの結果は、原核生物または哺乳動物コラーゲン結合ポリペプチド（例えば、ＣｏｌＧｓ３ａ／ｓ３ｂまたはルミカン）を含むコラーゲン結合免疫調節分子が、腫瘍内滞留および限られた全身播種を示すことを示唆している。
（実施例４）
コラーゲン結合融合タンパク質の腫瘍内滞留は分子量およびコラーゲン結合活性に依存する

いくつかの因子がコラーゲン結合融合タンパク質の腫瘍内滞留を決定付ける可能性がある：コラーゲンに対する親和性、コラーゲン濃度、拡散または対流によるサイズ依存性逃避、およびタンパク質代謝回転。６０ｋＤａ未満のタンパク質として、ルミカン（３７ｋＤａ）は、血管内皮を横断する高度の透過性に直面し、循環血液に吸収されやすく、これらのことが、注射部位からの分布および腫瘍内滞留の減少の原因となり得る（ＭｃＬｅｎｎａｎｅｔａｌ．，（２００５）ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｏｄａｙＴｅｃｈｎｏｌ２：８９−９６；Ｅｇａｗａｅｔａｌ．，（２０１３）ＳｃｉＲｅｐ３：１９３２）。

コラーゲン結合免疫調節分子の腫瘍内滞留および全身への分布に対する分子量の効果を評価するために、６７ｋＤａマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）タンパク質に融合したコラーゲン結合ポリペプチドルミカンの腫瘍内注射後の滞留を、ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングにより判定した。手短に述べると、Ｂ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯの腫瘍接種のために、５０ｕＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させた１０^６個の細胞をメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。融合タンパク質を、ｐＨ８に調整したＰＢＳ中の５モル過剰のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＮＨＳＥｓｔｅｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間標識した。ＰＤ１０ＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して過剰な色素を除去し、各タンパク質についての標識度（ＤＯＬ）を算出した。滞留研究で比較したタンパク質は、等モル量の色素を含有した。ルミカン−ＭＳＡ（配列番号１２６）およびＭＳＡ（配列番号１８３）については、０．１１ｎｍｏｌの各構築物（１１０ｕｇのルミカン−ＭＳＡおよび７１．７ｕｇのＭＳＡを投与した）を、接種の５日後に、Ｂ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯ腫瘍を担持しているマウスに腫瘍内注射した。

融合タンパク質滞留を評定するために、示した時点で、自動露出落射照明蛍光設定でＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ１００（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いてマウスをイメージングした。この時間の間、マウスは、消化器バックグラウンド蛍光を最小にするために、アルファルファ不含のカゼイン飼料（ＴｅｓｔＤｉｅｔ）で維持した。総放射効率を決定するための画像解析は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。蛍光シグナル対ノイズを最大にするために、チロシナーゼ関連タンパク質−２を欠いているＢ１６Ｆ１０細胞であるＢ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯを使用して色素沈着がない腫瘍に接種した。

蛍光標識ルミカン、ルミカン−ＭＳＡ、またはＭＳＡを腫瘍内注射し、マウスを総放射効率について経時的にモニターした。ルミカン（３７ｋＤａ）からの蛍光シグナルは、注射後最初の５時間の間、ルミカンのより小さい分子量にもかかわらずＭＳＡ（６７ｋＤａ）からの蛍光シグナルよりも大幅に保持された。これらのデータは、ルミカンの腫瘍内滞留が、少なくとも一部はそのコラーゲン結合活性に依存していることを示唆している。ルミカン−ＭＳＡからの蛍光シグナルもまた、ＭＳＡからの蛍光シグナルよりも大幅に保持された（図２Ａ）。ルミカン−ＭＳＡ（１０４ｋＤａ）は、ルミカン（３７ｋＤａ）より有意に大きく、それらは、各々、同一のコラーゲン結合部位を有するが、より小さいルミカン構築物のより迅速なクリアランスに恐らく起因して、ルミカン−ＭＳＡのほうが単独のルミカンより高度に滞留する（図２Ａ）。

全身への分布に対する分子量の効果をさらに評価するために、ＭＳＡに融合した蛍光標識ルミカンを注射したマウスの血清からの蛍光の量を経時的に判定した。蛍光標識ＭＳＡを比較対照として使用した。注射後の血清蛍光を評定するために、示した時点で、小体積の血液（＜１０ｕＬ）を毛細管作用によって尾の先端からガラス製ミクロヘマトクリットヘパリンコーティングチューブ（ＶＷＲ）に採取した。チューブの一方の末端をパラフィルムで封止し、重力による血餅からの血清の分離を可能にするために４℃で遮光して直立状体で保管した。平台型ＴｙｐｈｏｏｎＴｒｉｏＶａｒｉａｂｌｅＭｏｄｅＩｍａｇｅｒ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）（励起レーザー：６３３ｎｍ；発光フィルター：６７０ＢＰ；ＰＭＴ：４５０〜５００Ｖ）を使用してチューブをスキャンし、Ｆｉｊｉ画像解析ソフトウェアを使用して血清蛍光を定量した。

図２Ｂに示すように、ルミカン−ＭＳＡを注射したマウスの血清からの蛍光シグナルは、注射用量の％として、ＭＳＡを注射したマウスの血清からの蛍光シグナルと比較して、ある期間にわたって低かった。これらの結果は、ルミカン−ＭＳＡが、単独でのＭＳＡより少ない全身への分布を示すことを実証する。

Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンとルミカンの共局在を腫瘍内投与後に免疫蛍光イメージングにより評定した。手短に述べると、蛍光標識ルミカンの腫瘍内注射後にＢ１６Ｆ１０腫瘍を切除した。腫瘍を過ヨウ素酸塩−リシン−パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩保存し、次いでＰＢＳ中の３０％スクロースで８時間、４℃で凍結保護し、次いで、ドライアイスを用いて１００％ＯＣＴ化合物を含有するクリオモルド（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋＵＳＡＩｎｃ．）中でゆっくりと凍結させた。凍結した腫瘍モールドを５０マイクロメートル厚の切片にし（ＣｒｙＳｔａｒＮＸ７０）、切片を抗原回復の前に１時間、室温で乾燥させた。抗原回復のために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム中、６０℃で組織切片を１時間加熱し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、２ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼで３０分間、室温で処理した。切片をイムノミックス（０．２％重量／体積ウシ血清アルブミンと、０．０５％重量／体積アジ化ナトリウムと０．３％体積／体積Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０と１０％体積／体積ロバ血清とを含有するＰＢＳ）で洗浄し、次いで、冷アセトンで１０分間、−２０℃で透過処理し、次いでイムノミックス中で１時間、室温でブロックした。染色は、Ｉ型コラーゲンに対するウサギ抗体（ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ）およびＩＶ型コラーゲンに対するウサギ抗体（ａｂ６５８６、Ａｂｃａｍ）をイムノミックス中１：２００希釈で用いて、一晩、室温で、加湿チャンバ内で行った。数回のＰＢＳ洗浄後、イムノミックス中１：５００希釈でＡＦ４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて、一晩、室温で、加湿チャンバ内で、切片を染色した。数回の洗浄後、切片をＰＢＳ中の１％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ褪色防止剤入り封入剤に封入した。切片を共焦点顕微鏡法によりイメージングした。Ｉ型またはＩＶ型コラーゲンの蛍光シグナルとルミカンの蛍光シグナルを重ね合わせることにより、ルミカンは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内にＩ型およびＩＶ型両方のコラーゲンと高度に共局在すると判定した（データを示さない）。

これらの結果は、コラーゲンへの親和性と分子量増加の両方が、コラーゲン結合融合タンパク質の腫瘍内滞留および全身への分布の原因となることを実証する。これらの結果は、コラーゲン結合免疫調節分子のコラーゲンへの親和性および分子量を増加させることが、腫瘍内滞留を増加させ、全身への分布を減少させ、それによって治療効果を高めることを示唆している。
（実施例５）
結合したコラーゲンへの近接はコラーゲン結合融合タンパク質のペイロード活性を低下させる

ペイロード活性に対するコラーゲン結合の効果を評価するために、ＣｏｌＧ−Ｇｌｕｃと比較したルミカン−Ｇｌｕｃの腫瘍内生物発光を、ｉｎｖｉｖｏで比較した。手短に述べると、等モル量（０．３ｎｍｏｌ）のルミカン−ＧｌｕｃまたはＧｏｌＧ−ＧｌｕｃをＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍担持マウスに腫瘍内注射した。等モル（０．３ｎｍｏｌ）注射にもかかわらず、ＣｏｌＧ−Ｇｌｕｃと比較して少ない腫瘍内生物発光がルミカン−Ｇｌｕｃで観察された。具体的には、ＣｏｌＧ−Ｇｌｕｃを注射したマウスの４／５は、バックグラウンドより高い検出可能な生物発光を有したが、ルミカン−Ｇｌｕｃを注射したマウスの１／５しかバックグラウンドより高い検出可能な生物発光を有さなかった（データを示さない）。興味深いことに、生物発光シグナルは、腫瘍の外側でしか検出されず、恐らくこれは、腫瘍から漏出した構築物からのものであった。コラーゲンに結合した構築物からの腫瘍内生物発光の欠如は、酵素がコラーゲンのすぐ近くに追いやられると最適に機能しないことを示唆している。この結果は、コラーゲンを任意の将来のペイロードからよりよく分離するのを助けるためにＭＳＡのようなスペーサータンパク質が必要であることを告げている。

コラーゲンは、不溶性タンパク質であり、したがって近位の可溶性タンパク質の表面吸着のような固相挙動の影響を受けやすいので、ＭＳＡがペイロードとルミカンの間の大きい親水性スペーサータンパク質としての役割を果たして、ペイロードの吸着および機能変性を防ぐ。本発明者らの局在手法の場合、任意の可溶性ペイロードをルミカンによって固液界面に追いやり、コラーゲン線維上に吸着させることがあり、したがって、それを（Ｇｌｕｃで見られるように）機能的に不活性にさせる可能性がある。本発明者らのペイロードのコラーゲン上への吸着を防止するために、本発明者らは、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を、ペイロードとコラーゲンの間の大きいスペーサータンパク質としてルミカンに作動可能に連結させた。
（実施例６）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおける免疫調節コラーゲン結合分子と抗腫瘍抗原抗体の相乗効果

抗腫瘍抗原抗体とインターロイキン−２（ＩＬ−２）の間の相乗作用は、十分に特徴付けられている（Ｚｈｕｅｔａｌ．，（２０１５）ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２７：４８９−５０１）。コラーゲン結合分子にＩＬ−２を融合させることの効果を、ルミカン−ＭＳＡのＣ末端に融合したＩＬ−２を調製することにより評価した。コラーゲン原線維に結合したときのＩＬ−２への受容体の立体的接近を確保するために、およびまた構築物の分子量を増加させ、それによって腫瘍からの拡散流量を低減させるために、ＭＳＡを組み込んだ。同等に生物活性の比較対照として、ＩＬ−２をＭＳＡとの融合体（ＭＳＡ−ＩＬ２）として発現させることで、コラーゲン結合の効果を、野生型ＩＬ−２のような小さいサイトカインの腫瘍滞留のサイズベースの改善から大きく切り離すことを可能にした。それ故、実施例１で説明した方法を使用して、ＩＬ−２を、単独のＭＳＡとの融合体として、またはルミカン−ＭＳＡのＣ末端への融合体として発現させた。Ｈｉｓタグ付きサイトカイン融合タンパク質を、実施例１で説明したようにＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂により精製した。４時間、１ＭＮａＯＨで前処理してエンドトキシンを除去して、その後、滅菌ＰＢＳ中で平衡させた、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ）を使用して、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、サイトカイン−融合タンパク質をさらに精製した。精製後、タンパク質について滅菌ＰＢＳへの緩衝液交換を行い、０．２マイクロメートル膜フィルター（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により滅菌濾過し、発色ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ）を使用して最小限のエンドトキシン（１用量当たり＜０．１ＥＵ）を含有することを確認した。

タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー中に２８０ｎｍでの吸光度により評価したとき、＞９０％単量体発現を実証した（データを示さない）。加えて、細胞増殖を誘導するタンパク質の能力を評価した。未コーティングの組織培養プレートまたはＩＶ型コラーゲンでコーティングされた組織培養プレートのどちらかに、ＣＴＬＬ−２細胞を５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を様々な濃度のＭＳＡ−ＩＬ２、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２またはルミカンで４８時間刺激した。ＷＳＴ−１ベースの比色アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）により製造業者の説明書に従って細胞増殖を判定した。ルミカンは、増殖をもたらさなかったが、ＭＳＡ−ＩＬ２およびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２での処置は、ＩＶ型コラーゲンの存在または非存在にかかわらず、同様のレベルの細胞増殖をもたらした（データを示さない）。したがって、ＭＳＡ−ＩＬ２およびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２は、同等の生物活性を有する。

加えて、腫瘍内注射後のＩＬ−２融合体の血清レベルを、実施例４で説明したように定量した。蛍光標識ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＭＳＡ−ＩＬ２をＢ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯ腫瘍に注射し、注射後、異なる時点で、血清蛍光レベルを定量した。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を注射したマウスの血清からの蛍光シグナルは、注射用量の％として測定したとき、ＭＳＡ−ＩＬ２を注射したマウスの血清からの蛍光シグナルと比較して、ある期間にわたって低かった（データを示さない）。これらの結果は、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２がｉｎｖｉｖｏで腫瘍内コラーゲンに結合し、結果として、単独でのＭＳＡ−ＩＬ２より少ない全身への分布を示すことを実証する。

免疫調節コラーゲン結合分子と腫瘍抗原標的化抗体の組合せの抗腫瘍有効性を特徴付けるために、サイトカインＩＬ−２に融合したコラーゲン結合ポリペプチドを含む融合タンパク質を、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいてマウスモノクローナル抗ＴＹＲＰ１抗体（ＴＹ９９）との相乗作用について評定した。

手短に述べると、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中の１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射した。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍が樹立したマウスを、全身的に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって１００μｇ／用量の抗ＴＹＲＰ−１抗体（ＴＡ９９）でおよび腫瘍内注射（ｉ．ｔｕ．）によって１３μｇ／用量のコラーゲン結合ＩＬ−２融合タンパク質ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で処置した。ＭＳＡ−ＩＬ２（配列番号１２１）（９μｇ／用量）またはルミカン（配列番号１８２）（４μｇ／用量）を注射したマウスを比較対照として使用した。ＩＬ−２融合タンパク質（ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（配列番号１２０）またはＭＳＡ−ＩＬ２）を注射したマウスには、０．１１ｎｍｏｌ／用量のＩＬ−２の等価物を施した。２０％全体重減少または１００ｍｍ^２（長さ×幅）を超える腫瘍面積のどちらかである安楽死エンドポイントで、動物を安楽死させた。

ＭＳＡ−ＩＬ２で、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で、単独でのルミカンで、またはＴＡ９９と組み合わせてルミカンで処置した腫瘍を有するマウスの生存パーセントを図３Ａ〜３Ｂに示す。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２または単独でのＭＳＡ−ＩＬ２を投与したマウスの単剤療法は、わずかな生存利益しか付与しなかった（図３Ａ）。ＴＡ９９とルミカンの組合せは、生存利益をもたらさなかった（図３Ｂ）が、ＴＡ９９とＭＳＡ−ＩＬ−２またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２のどちからとの組合せの投与は、マウスに対する相乗的生存利益を示した（図３Ｂ）。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せは、ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せと比較して大きい生存利益を付与した（図３Ｂ）。

処置の中止後、数匹のマウスは、メラノサイト特異的Ｔ細胞応答を示す、限局性皮膚色素脱失または白斑を発症した。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＴＡ９９を注射したほぼ全てのマウスは、注射部位に限局された白斑の斑点を発症した（１７匹のうちの１６匹のマウス）が、ＭＳＡ−ＩＬ２およびＴＡ９９で処置したマウスは、１７匹のうちの１匹しかこの副作用を示さなかった。まとめると、これらの観察は、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２がＩＬ−２を腫瘍内に固定し、抗腫瘍Ｔ細胞応答および全生存率を増加させることによりＴＡ９９とのＩＬ−２の相乗作用を強化することを示す。

ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ−２の腫瘍内注射が、ＴＡ９９と組み合わせて使用したときの転帰の改善に必要であるかどうかを判定するために、本発明者らは、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を他の身体部位に注射したときのこの組合せの有効性を評価した。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を腫瘍周囲に（ｐｅｒｉ．ｔｕ）（すなわち、病変に隣接して）（図３Ｃ）または結節内に（すなわち、腫瘍流入領域鼠径部リンパ節内へ）（図３Ｄ）投与したとき、有効性は減弱された。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を、尾の付け根（腫瘍部位に対して２ｃｍ末梢側）に皮下投与したとき、組合せの全ての生存利益が減少した（図３Ｃ）。

これらの結果は、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による担腫瘍マウスの処置が相乗的抗腫瘍効果をもたらすこと、およびＩＬ−２の腫瘍内局在がこの併用療法の最大の有効性に必要であることを示す。
（実施例７）
免疫調節コラーゲン結合分子と抗腫瘍抗原抗体の相乗効果はＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞およびＩＦＮγに依存している

高用量ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖およびエフェクター機能を支援するが、好中球増加および好酸球増加も促進する（Ｍａｃｄｏｎａｌｄｅｔａｌ．，（１９９０）ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ７６（２）：１６８−１７３；Ｌｉｅｔａｌ．，（１９９６）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０（４）：３６１−３７２）。免疫細胞に対するＩＬ−２の公知の多様な効果を考えて、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の治療有効性への異なる白血球型の寄与を抗体媒介細胞枯渇により判定した。最初の処置の前日に始めて最後の処置の１週間後までの枯渇抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によって、免疫細胞サブセットまたはＩＦＮγを枯渇させた。ＴＡ９９およびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を図３Ｂに記載の通り投与した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞または好中球は、それぞれ、４００μｇの抗ＣＤ８α（２．４３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）または抗Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）抗体を４日おきに使用して枯渇させた。マクロファージまたは可溶性ＩＦＮγは、それぞれ、３００μｇの抗ＣＳＦ１Ｒ（ＡＦＳ９８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）または２００μｇの抗ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を１日おきに使用して枯渇させた。好酸球は、１ｍｇの抗ＩＬ−５（ＴＲＦＫ５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を使用して枯渇させた。

免疫細胞サブセットの寄与を評定するために、交差提示樹状細胞（ＤＣ）が欠損している６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）またはＢａｔＦ３^−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｓ（Ｃ）−Ｂａｔｆ３^{ｔｍ１ｋｍｍ}／Ｊ；ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）の右側腹部に、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中の１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射した。ＷＴマウスにおけるナチュラルキラー（ＮＫ）の枯渇は、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の有効性を変えなかった（図４）。野生型マウスにおける好中球、好酸球またはマクロファージの枯渇もまた、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の有効性を変えなかった（データを示さない）。これは、腫瘍制御について全責任を負う単一自然細胞集団がなかったことを示す。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞（抗ＣＤ８α）、交差提示ＤＣ（ＢａｔＦ３^−／−）およびＩＦＮγ（抗ＩＦＮγ）の枯渇は、処置の有効性を変えなかった。これは、それらが腫瘍拒絶に不可欠であったことを示す（図４）。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。

これらの結果は、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による担腫瘍マウスの処置が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞およびＩＦＮγに依存している相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
（実施例８）
免疫調節コラーゲン結合分子と抗腫瘍抗原抗体の組合せは、防御記憶を確立し、全身性腫瘍特異的細胞免疫を誘導する

上に示したようなＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による処置後に観察された永続的な無病生存および適応免疫の成分への依存は、治癒した無腫瘍マウスが腫瘍再投与に対して耐性である可能性があることを示唆した。ＴＡ９９と組み合わせてルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で処置して治癒した無腫瘍マウスが、＿＿であるかどうかを判定するために、図３Ｂに示した実験からの治癒したＣ５７ＢＬ／６マウスの対側側腹部への接種により１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０細胞を１００日目に再投与した。ＴＡ９９と組み合わせてルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で処置した長期生存者の大多数が、対側側腹部に接種したＢ１６−Ｆ１０の再投与を拒絶した（マウス９／１５匹）。

細胞媒介免疫による腫瘍根絶には全身性の免疫活性化が必要である（Ｓｐｉｔｚｅｒｅｔａｌ．，（２０１７）Ｃｅｌｌ１６８：４８７−５０２）のだが、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による処置後に観察された白斑の厳密に限局された斑点（実施例６を参照されたい）は、処置した腫瘍病変の外側での腫瘍特異的Ｔ細胞応答の評価を促した。ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による処置が、全身性の抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するかどうかを判定するために、図３Ｂに記載のマウスの処置の４日後に採取した脾細胞を使用してＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴを行った。ＭＳＡ−ＩＬ２またはルミカンとの組合せでのＴＡ９９による処置を比較対照として使用した。Ｂ１６Ｆ１０標的細胞での刺激に反応してのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を定量した。ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでのＴＡ９９による処置は、ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでの処置より、ＩＦＮγを発現する多くの末梢脾細胞を生じさせた。具体的には、ＴＡ９９＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２での処置は、脾細胞１，０００，０００個当たりおおよそ２０ＳＦＵをもたらしたが、ＴＡ９９＋ＭＳＡ−ＩＬ２での処置、ＴＡ９９＋ルミカンでの処置、または無処置は、脾細胞１，０００，０００個当たりおおよそ７ＳＦＵをもたらした。

脾細胞上の細胞内ＩＦＮγ染色が、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって生じたことを確認するために、図３Ｂに記載のマウスの処置の４日後に脾細胞を採取した。採取した脾細胞を、照射Ｂ１６−Ｆ１０または４Ｔ１とともに１２時間、ブレフェルジンＡの存在下でシミュレーションし、その後、表面マーカー（ＣＤ４、ＣＤ３およびＣＤ８）および細胞内ＩＦＮγについて染色した（マウスｎ＝５／群）。図５Ａは、フローサイトメトリーにより判定したときの生ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＩＦＮγ＋細胞の定量を示す。テューキー多重比較検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによりデータを解析した。

図５Ａに示す結果は、４Ｔ１腫瘍細胞ではなく照射Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞での刺激が、脾細胞におけるＩＦＮγの発現を誘導したことを実証する。これは、脾細胞における末梢Ｂ１６Ｆ１０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＴＡ９９との組合せでのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２による担腫瘍マウスの処置によって誘導されたことを確証する。これらの結果は、腫瘍コラーゲン固定ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでのＴＡ９９による担腫瘍マウスの処置が、非固定ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでの処置より大きい腫瘍特異的全身性応答を誘導したことも示す。

ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでのＴＡ９９による処置によって誘導される末梢エフェクター（例えば、末梢腫瘍特異的Ｔ細胞）の、外因性サイトカインの支援がわずかである遠位の未処置腫瘍病変を制御する能力を判定するために、１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０細胞を皮下接種してマウスの両方の側腹部に腫瘍を樹立し、右側のまたは同側の腫瘍のみにＴＡ９９を全身（ｉ．ｐ．）投与およびＩＬ−２（ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２またはＭＳＡ−ＩＬ２として）を腫瘍内（ｉ．ｔｕ）投与した。図５Ｂは、未注射対側腫瘍についてのおよび腫瘍内注射した同側腫瘍についての平均腫瘍面積を経時的に示す。図５Ｂに示した結果は、注射後に同側腫瘍から対側病変へと漏出し得る、ＴＡ９９とＭＳＡ−ＩＬ２の組合せが、幾らかの対側腫瘍制御を付与したが、大部分のマウスが腫瘍負荷で死んだことを実証する。対照的に、同側腫瘍に単離される、ＴＡ９９とルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せは、同側腫瘍成長と対側腫瘍成長の両方を停止させ、その結果、数匹のマウスにおいて永続的治癒に至った。これらの結果は、腫瘍コラーゲン結合によってＩＬ−２を固定することにより惹起される全身性の抗腫瘍応答が、拡散したＩＬ−２刺激よりも、播種性疾患を制御および根絶する点で優れていることを示す。
（実施例９）
コラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質での担腫瘍マウスの処置はＩＬ−１２関連体重減少を誘導しない

上記実施例で示したようなＩＬ−２のコラーゲン固定による抗腫瘍治療効果の改善の観察後、もう１つの用量制限サイトカインであるＩＬ−１２をコラーゲンに固定することの効果を評価した。ＩＬ−１２は、有効な抗腫瘍応答に非常に重要であることが公知の経路である１型細胞媒介免疫において主要調節因子としての役割を果たす（Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，（２０１７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２９２：１３９２５−１３９３３）。有望な前臨床研究にもかかわらず、重度の毒性および致死率により、ＩＬ−１２を全身投与する早期臨床試験が中止された（Ｌａｓｅｋｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６３（５）：４１９−４３５）。ＮＫ細胞およびＴ細胞のＩＬ−１２刺激により誘導されるＩＦＮγは、毒性に関連付けられたが、ＩＬ−１２は、その有効性とも密接に結び付けられている（Ｌｅｏｎａｒｄｅｔａｌ．，（１９９７）Ｂｌｏｏｄ９０：２５４１−２５４８）。

したがって、実施例１および６で説明した方法を使用して、ＩＬ−１２を、単独のＭＳＡとの融合体として、またはルミカン−ＭＳＡのＮ末端との融合体（ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン）として発現させ、精製した。手短に述べると、マウスＩＬ−１２を、ｐ４０とｐ３５の間に１５アミノ酸のグリシン−セリンリンカーを有する一本鎖形式（ｓｃＩＬ１２）で発現させた。ＩＬ−１２のコラーゲン固定バージョンを生成するために、ｓｃＩＬ１２をＭＳＡスペーサーによってルミカンのＮ末端に融合させた。これを、これ以降、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１２３）と呼ぶ。ＩＬ−１２の非固定バージョンであるＩＬ１２−ＭＳＡ（配列番号１２２）を比較対照として使用した。ＩＬ１２−ＭＳＡおよびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー中に２８０ｎｍでの吸光度により評価したとき、＞９０％単量体発現を実証した（データを示さない）。

加えて、腫瘍内注射後のＩＬ−１２融合体の血清レベルを、実施例４で説明したように定量した。蛍光標識ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンおよびＩＬ１２−ＭＳＡをＢ１６Ｆ１０−Ｔｒｐ２ＫＯ腫瘍に注射し、注射後、異なる時点で、血清蛍光レベルを定量した。ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンを注射したマウスの血清からの蛍光シグナルは、注射用量の％として測定したとき、ＩＬ１２−ＭＳＡを注射したマウスの血清からの蛍光シグナルと比較したところ、ある期間にわたって低かった（データを示さない）。これらの結果は、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンがｉｎｖｉｖｏで腫瘍内コラーゲンに結合し、結果として、単独でのＩＬ１２−ＭＳＡより少ない全身への分布を示すことを実証する。

コラーゲン結合による腫瘍へのＩＬ−１２の滞留がＩＬ−１２媒介毒性を改善するかどうかを判定するために、ルミカン−ＭＳＡに融合したＩＬ−１２をマウス黒色腫腫瘍モデルにおいて評価した。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に、１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を接種した。これらのマウスのベースラインからの体重変化を、ＰＢＳ（ｎ＝６）、１７．８μｇ／用量のＩＬ１２−ＭＳＡ（ｎ＝７）もしくは２３．１μｇ／用量のＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｎ＝７）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射、または１７．８μｇ／用量のＩＬ１２−ＭＳＡ（ｎ＝７）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射のいずれかでの６日目および１２日目の処置後にモニターした。ＩＬ−１２融合タンパク質（ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンまたはＩＬ１２−ＭＳＡ）を注射したマウスには、１４０ｐｍｏｌ／用量のＩＬ−１２の等価物を施した。

図６Ａに示すように、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスにおけるＩＬ１２−ＭＳＡの腫瘍内投与は、全身性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）毒性についての非侵襲的読出し情報である、有意な体重減少を招いた。腹腔内注射によるＩＬ１２−ＭＳＡの全身投与は、同一の体重減少プロファイルをもたらした。対照的に、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの等モル腫瘍内注射は、体重減少を引き起こさなかった。まとめると、これらの結果は、コラーゲン結合による腫瘍内滞留に向けた努力の非存在下での局所投与が、ＩＬ−１２媒介毒性を軽減する上で不十分であること、およびコラーゲン固定が、ＩＬ−１２の明白な全身毒性を抑制するために十分な腫瘍内封じ込めをもたらし、その結果、治療指数が改善されたことを実証する。

図６Ａにおけるように処置した動物の生存率も評価した。実施例６で説明した基準に従ってマウスを安楽死させた。図６Ｂに示すように、ＩＬ１２融合体での処置は、未処置対照マウスまたはルミカンで処置したマウスよりも生存期間を延ばした。ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンでの処置は、ＩＬ１２−ＭＳＡと比較して生存期間を若干延ばす結果となった。

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を処置するために使用するＩＬ１２の用量のタイトレーションを行って、毒性および抗腫瘍有効性に対する用量依存効果を判定した。上で説明したように０日目にＢ１６Ｆ１０腫瘍を接種したマウスを、５日目に、異なる用量のＩＬ１２−ＭＳＡまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの腫瘍内注射で処置した。未処置対照マウスには、ＰＢＳの腫瘍内注射を施した。用量の効果を腫瘍面積（例えば、有効性の尺度）および体重変化％（例えば、毒性の尺度）によって評価した。評価したＩＬ１２−ＭＳＡおよびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの用量は、１４０ｐｍｏｌＩＬ１２、１４ｐｍｏｌＩＬ１２、１．４ｐｍｏｌＩＬ１２、または０．１４ｐｍｏｌＩＬ１２の等価質量を含んだ。ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンは、試験したいずれの用量でも毒性を示さなかったが、ＩＬ１２の１．４または０．１４ｐｍｏｌ用量で有効性低下を明示した（データを示さない）。その一方で、ＩＬ１２−ＭＳＡは、用量減少に伴って毒性低下と有効性低下の両方を明示した（データを示さない）。それ故、他の治療剤との組合せでのＩＬ１２融合体を評価するために、１４ｐｍｏｌのＩＬ１２を、許容可能な毒性指数を有し、その上、治療有効性を維持すると定義した。
（実施例１０）
マウス腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＩＬ−２融合タンパク質とコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の相乗的抗腫瘍効果

ＩＬ−１２の抗腫瘍効果を増強するための組合せについて理論が立てられてきたが、安全性の懸念が、それらの実現を大きく妨げてきた（Ｌａｓｅｋｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６３（５）：４１９−４３５）。実施例９における処置関連体重減少の非存在により示されるような、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの治療指数の改善は、他の治療剤と組み合わせてのこのサイトカインの評価を促した。ＩＬ−２およびＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を刺激するために相補的シグナル伝達経路の関与をもたらすことが公知である（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｒｏｕｔ（２００２）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ２：５１３−５２４）。加えて、ＩＬ−２は、ＩＬ−１２受容体サブユニットベータ２の発現を上方調節し（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ９５：３１８３）、ＩＬ−１２は、高親和性ＩＬ−２受容体ＣＤ２５の表面発現を持続させる（Ｓｔａｒｂｅｃｋ−Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（２０１３）ＪＥｘｐＭｅｄ２１１：１０５−１２０）。相反するポジティブフィードバックにより、ＩＬ−２およびＩＬ−１２は、互いの効果を増大させ、延長する（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９６）ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８８：３８−４３）。有望な有効性にもかかわらず、この組合せをめぐるいくつかの臨床試験は、打ち切られている（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｒｏｕｔ（２００２）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ２：５１３−５２４；Ｇｏｌｌｏｂｅｔａｌ．，（２００３）ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２１：２５６４−２５７３；Ａｄｄｉｓｏｎｅｔａｌ．，（１９９８）ＧｅｎｅＴｈｅｒ５：１４００−１４０９；Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，（２００１）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６６：１１５６−１１６８）。注目すべきことに、ＩＬ−２とＩＬ−１２の組合せは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの産生も有意に増進させる（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｒｏｕｔ（２００２）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ２：５１３−５２４）。

ＩＬ−２またはＩＬ−１２を含む免疫調節コラーゲン結合分子の組合せの治療効果を評価するために、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンを、本質的に実施例９で説明したようにマウス黒色腫腫瘍モデルにおいて組み合わせて試験した。しかし、上記の組合せでは、非コラーゲン固定サイトカインの投与から生じる公知の毒性があるので、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンおよびＩＬ１２−ＭＳＡ−ＩＬ−１２の投薬量を、実施例９において前に投与したものの１／１０〜１４ｐｍｏｌ／用量に低減した。実施例６におけるように、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を投与したマウスには１３μｇ／用量を施した。ＭＳＡ−ＩＬ２を投与したマウスには、９μｇ／用量を施した。ＩＬ−２融合タンパク質（ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２またはＭＳＡ−ＩＬ２）を注射したマウスには、０．１１ｎｍｏｌ／用量のＩＬ−２の等価物を施した。

低減用量（１４ｐｍｏｌ／用量）の単独でのＩＬ１２−ＭＳＡまたは単独でのＭＳＡ−ＩＬ２の腫瘍内投与は、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスにおいて体重減少も有意な腫瘍成長遅延ももたらさなかった（データを示さない）。対照的に、ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでのＩＬ１２−ＭＳＡの投与は、体重減少および生存期間の延長をもたらした（図７）。対照的に、コラーゲン固定バージョンであるＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンおよびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２を使用する併用処置は、ＩＬ１２−ＭＳＡとＭＳＡ−ＩＬ２の組合せよりも大幅に生存期間を延長させ、付随する体重減少をもたらさなかった（図７）。

これらの結果は、コラーゲン結合ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せでの担腫瘍マウスの処置が、非コラーゲン結合ＩＬ１２−ＭＳＡとＭＳＡ−ＩＬ２の組合せでの処置よりも大幅なマウスの生存期間の延長をもたらしたことを実証する。さらに、これらの結果は、コラーゲン結合ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せでのマウスの処置が、ＩＬ−１２とＩＬ−２の併用投与に関連する処置関連毒性を防止することを示し、それによってこのサイトカイン組合せについての治療法を提供する。
（実施例１１）
コラーゲン結合ＩＬ−２融合タンパク質とコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の相乗効果はＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞に依存している

ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の腫瘍内併用療法の有効性を担う免疫細胞型を、本質的に実施例７で説明したような抗体媒介細胞枯渇によって判定した。図８Ａに示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞および交差提示樹状細胞は、有効性に不可欠である。これらの細胞型の枯渇が、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せで腫瘍内処置した担腫瘍マウスの生存期間を短縮させるからである。対照的に、ＮＫ細胞、好中球、好酸球またはマクロファージの枯渇は、生存転帰に有意な影響を与えなかった（図８Ｂ）。ＩＬ−２とＩＬ−１２の同時刺激により増幅されることが公知のサイトカインであるＩＦＮγ（Ｇｏｌｌｏｂｅｔａｌ．，（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６２（８）：４４７２−４４８１）の抗体媒介枯渇も、生存期間を有意に変えなかった（図８Ａ）が、この効果の欠如は、ＩＦＮγの不十分な枯渇に起因する可能性があった。

担腫瘍マウスにおいてＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せによりもたらされる抗腫瘍有効性への免疫細胞型の寄与をさらに評価するために、腫瘍浸潤免疫細胞の免疫表現型検査を行った。０日目に１，０００，０００個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をマウスに接種し、５日目にＰＢＳ、ＩＬ１２−ＭＳＡとＭＳＡ−ＩＬ２、またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２のうちのいずれかの腫瘍内注射で処置した。１１日目に腫瘍を切除した。腫瘍の免疫細胞浸潤を以前に記載されたように分析した。（Ｍｏｙｎｉｈａｎｅｔａｌ．，（２０１６）ＮａｔＭｅｄ２２：１４０２−１４１０）；Ｚｈｕｅｔａｌ．，（２０１５）ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２７：４８９−５０１）。手短に述べると、摘出した腫瘍を計量し、小片に解離させ、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼおよびディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と２５ｕｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）とを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で３０分間、３７℃でインキュベートした。さらなる機械的解離を使用して、染色のための単個細胞浮遊液を生じさせた。細胞をＢＤＦＡＣＳＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で分析し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（ＦｌｏｗＪｏ，Ｉｎｃ）を使用してデータを解析した。細胞を表面および細胞内マーカーについて染色して以下の細胞型を描出した：
ＮＫ細胞（生ＣＤ４５^＋ＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋）
Ｔｒｅｇ細胞（生ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＮＫ１．１⁻ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）
ＣＤ４細胞（生ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＮＫ１．１⁻ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻ＣＤ２５^＋／−ＦｏｘＰ３⁻）
ＣＤ８Ｔ細胞（生ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＮＫ１．１⁻ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋）
単球／マクロファージ（生ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻ＣＤ１１ｃ⁻Ｆ４／８０^＋）
ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣ（生ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＭＨＣＩＩ^＋ＣＤ１１ｃ^＋）
ＣＤ１１ｂ⁻ＤＣ（生ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ⁻ＭＨＣＩＩ^＋ＣＤ１１ｃ^＋）
好中球（生ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋）

図８Ｃに示すように、ＰＢＳでの処置に対するＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せ（ルミカンバージョン）で処置したマウスからの腫瘍浸潤物中のＣＤ８＋Ｔ細胞の変化倍率は、ＰＢＳでの処置に対するＩＬ１２−ＭＳＡ＋ＭＳＡ−ＩＬ２（ＭＳＡバージョン）で処置したマウスからの変化倍率より高い。さらに、ルミカン−ＭＳＡサイトカイン融合体で処置した腫瘍は、最初の処置の６日後にＭＳＡサイトカイン融合体で処置した腫瘍と比較して、多い浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を有し（図８Ｄ）、ＰＤ−１のより高度な表面発現を有した（図８Ｅ）。

処置に反応しての腫瘍特異的Ｔ細胞の産生を、処置の６日後に単離した脾細胞においてＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによりさらに評価した。Ｂ１６Ｆ１０標的細胞での刺激に反応してのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を定量した。ルミカン−ＭＳＡサイトカイン融合体での処置は、ＭＳＡサイトカイン融合体についての脾細胞１，０００，０００個当たりおおよそ１５ＳＦＵまたは未処置動物についての脾細胞１，０００，０００個当たりおおよそ２ＳＦＵと比較して、脾細胞１，０００，０００個当たりおおよそ２０ＳＦＵを生じさせた。したがって、ルミカン−ＭＳＡサイトカイン融合体での処置は、無処置またはＭＳＡ−サイトカイン融合体での処置と比較して末梢腫瘍特異的Ｔ細胞の数の増加をもたらした。

これらの結果は、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せによってもたらされる抗腫瘍有効性（例えば、生存期間の延長）が、ＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞に依存していることを実証する。さらに、これらの結果は、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せでの担腫瘍マウスの腫瘍内処置が、少なくとも一部は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を誘導することおよび末梢腫瘍特異的Ｔ細胞の産生を誘導することにより、抗腫瘍有効性をもたらすことを実証する。
（実施例１２）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＩＬ−２融合タンパク質とコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質と抗ＰＤ−１抗体の組合せの相乗効果

実施例１１で説明したようなルミカン−サイトカイン処置に反応しての腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞上の表面ＰＤ−１の上方調節が、マウス黒色腫腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−１抗体（クローン２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）とＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せの抗腫瘍有効性の評価を促した。手短に述べると、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、０日目に、１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を接種した。担腫瘍マウスを、５日目および１１日目に、実施例１０に記載の投薬量でのルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２とＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの組合せまたはＭＳＡ−ＩＬ２とＩＬ１２−ＭＳＡの組合せで腫瘍内処置し、抗ＰＤ−１抗体（２００μｇ／用量）で腹腔内処置した。ベースラインからの体重変化パーセントおよび生存パーセントをモニターした。これらを図９に示す。

図９に示すように、ＩＬ１２−ＭＳＡおよびＭＳＡ−ＩＬ２とまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンおよびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２と組み合わせて抗ＰＤ−１抗体を含めることにより、前に観察された体重減少傾向は変更されなかった（図７）。しかし、抗ＰＤ−１抗体の追加は、ＩＬ１２−ＭＳＡ＋ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せで処置したマウスについての生存転帰を改善したが、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せで処置したマウスについての生存率をさらには改善しなかった。

限局性白斑は、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ１２−ＭＳＡ、およびＭＳＡ−ＩＬ２で処置したマウス（注射部位に白斑を有したマウス１／５匹）と比較して、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン、およびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で処置したマウス（注射部位に白斑を有したマウス４／５匹）におけるほうが高頻度に発生した。さらに、抗ＰＤ−１処置の非存在下でのＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２処置からの生存者と比較して、サイトカイン（ＩＬ１２−ＭＳＡ＋ＭＳＡ−ＩＬ２、またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２）および抗ＰＤ−１処置からの多くの生存者が、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を用いるその後の腫瘍再投与から防御された。ルミカン−ＭＳＡサイトカイン＋抗ＰＤ−１で処置したマウスの４／４匹、およびＭＳＡサイトカイン＋抗ＰＤ−１で処置したマウスの２／２匹は、再投与した腫瘍を拒絶したが、ルミカン−ＭＳＡサイトカインのみで処置したマウスは１／３匹しか再投与を拒絶しなかった。

これらの結果は、抗ＰＤ−１とＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２の組合せでの担腫瘍マウスの処置が、処置誘導白斑および有効な免疫学的記憶の発生を増加させたことを実証し、ひいては局部的ＩＬ−２およびＩＬ−１２処置から生じるＴ細胞応答の強化における相乗効果を実証する。
（実施例１３）
マウス乳癌および結腸癌腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＩＬ−２融合タンパク質とコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質と抗ＰＤ−１抗体の組合せの相乗効果

コラーゲン結合ＩＬ−２およびＩＬ−１２融合タンパク質と抗ＰＤ−１抗体の組合せの抗腫瘍効果をＥＭＴ６乳癌モデルにおいてさらに評定した。手短に述べると、０日目に、１×１０^６個のＥＭＴ６マウス乳癌細胞（ＡＴＣＣ）または１×１０^６個のＭＣ３８マウス結腸癌細胞（米国国立がん研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を５０μＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させ、メスのＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。ＥＭＴ６腫瘍担持マウスを、５日目、１１日目および１７日目に、実施例１０に記載の投薬量での、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２＋ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ．）で、単独での抗ＰＤ−１抗体（ｉ．ｐ．、２００μｇ／用量）で、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ）と組み合わせて抗ＰＤ−１抗体で処置した。ＭＣ３８腫瘍担持マウスを、５日目、１１日目および１７日目に、実施例１０に記載の投薬量での、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２＋ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ．）の組合せで、単独での抗ＰＤ−１抗体（ｉ．ｐ．、２００μｇ／用量）で、またはルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２＋ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ）と組み合わせて抗ＰＤ−１抗体（ｉ．ｐ．、２００μｇ／用量）で処置した。各腫瘍モデルについて、腫瘍面積（ｍｍ^２）および生存パーセントを経時的にモニターした。これらを図１０Ａ〜１０Ｂに示す。ログランクマンテル−コックス検定によって生存率統計量を決定した。

図１０Ａに示すように、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとの組合せでの抗ＰＤ−１抗体による、ＥＭＴ６乳癌腫瘍を担持しているマウスの処置は、単独での抗ＰＤ−１抗体による担腫瘍マウスの処置よりも大幅な、腫瘍病変の消散（測定可能な腫瘍面積の非存在により示されるような）および生存期間の延長をもたらした。

図１０Ｂに示すように、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２およびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとの組合せでの抗ＰＤ−１抗体による、ＭＣ３８結腸癌腫瘍を担持しているマウスの処置は、単独での抗ＰＤ−１抗体によるまたは単独でのＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２組合せによる担腫瘍マウスの処置よりも大幅な、腫瘍面積の減少および生存期間の延長をもたらした。

これらの結果は、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン＋ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２との組合せでのＰＤ−１抗体による担腫瘍マウスの処置が、ＥＭＴ６乳癌モデルとＭＣ３８結腸癌モデルの両方において相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
（実施例１４）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質とがんワクチンの相乗効果

抗腫瘍処置を相乗的に増強するコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の能力をさらに評価するために、がんワクチンとの組合せでのコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの抗腫瘍効果をＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおいて評定した。手短に述べると、０日目に、５０μＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させた１×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）をメスの６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下接種した。Ｂ１６−Ｆ１０関連抗原ＴＹＲＰ−１に由来するペプチドおよび改変ｇｐ１００ペプチド（ＥＧＰ）に融合した９０μｇのリンパ節標的化部分と５０μｇの環状ジヌクレオチドアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とを含むがんワクチンを、５日目にプライム用量、そして１１日目および１７日目にブースト用量で、尾の付け根に皮下投与した。環状ジヌクレオチドアジュバントおよびがんワクチンの皮下投与を、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答のプライミングについて評価した。手短に述べると、末梢血を１６日目に採取し、６時間、ペプチド抗原Ｔｒｐ１およびＥＧＰで刺激した。インキュベーションの最後の４時間にブレフェルジンＡを含めた。その後、末梢血細胞を表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮγについて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。生ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージを評価した。単独でのまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンとの組合せでのワクチン接種は、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞のプライミングを改善した（データを示さない）。

５、１１および１７日目にＰＢＳ（ｎ＝１２）もしくはＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝１０；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝１０）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射、または単独でのワクチン（ｎ＝７）、またはワクチンとＩＬ１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝７；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝７）で処置した、各マウスのベースラインからの体重変化、腫瘍面積、およびマウスの生存率を、経時的にモニターした（図１１、左側から右側へ）。

図１１に示すように、単独でのワクチン接種は、ＰＢＳで処置したマウスと比較して体重に影響を与えず（左側パネル）、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍成長を若干遅らせ（中央パネル）、マウスの生存期間を若干延長させた（右側パネル）。対照的に、ＩＬ１２−ＭＳＡまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンのどちらかを使用する、ＩＬ−１２とがんワクチンの併用投与は、腫瘍成長の相乗的低減（中央パネル）および生存期間の延長（右側パネル）をもたらした。ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンと組み合わせて投与したがんワクチンは、ＩＬ１２−ＭＳＡとの組合せより長く生存期間を延長した。加えて、ワクチンとＩＬ１２−ＭＳＡは、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンでは未検出であった処置誘導体重減少を招いた（右側パネル）。

これらの結果は、コラーゲン固定ＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン）との組合せでのがんワクチンの担腫瘍マウスへの投与が、単独でのがんワクチンまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの投与よりも大幅に腫瘍成長を減少させ、生存パーセントを増加させる、相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを実証する。これらの結果は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）の腫瘍内コラーゲン固定が、がんワクチンの腫瘍制御を相乗的に改善することを示す。
（実施例１５）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＩＬ１２融合タンパク質とＣＡＲ−Ｔ細胞の相乗効果

抗腫瘍処置を相乗的に増強するコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の能力をさらに評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せでのコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの抗腫瘍効果をＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおいて評定した。手短に述べると、０日目に、５０μＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させた０．５×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）をメスの６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下接種した。共刺激ＣＤ２８およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合したＴＡ９９の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されているＣＡＲを発現するようにＣＤ３＋脾細胞に形質導入することにより、Ｂ１６Ｆ１０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成した。ＣＡＲ−Ｔ細胞移植を確実にするために、１０，０００，０００個のＣＡＲ−Ｔ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射の前日に全身照射によって全てのマウスをプレコンディショニングした。５および１１日目に、ＰＢＳ（ｎ＝９）もしくはＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝６；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）、または単独でのＣＡＲ−Ｔ（ｎ＝１２）、またはＣＡＲ−ＴとＩＬ１２（ＩＬ１２−ＭＳＡについてｎ＝７；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射で処置したマウスのベースラインからの体重変化、腫瘍面積、および生存率を、経時的にモニターした（図１２、左側から右側へ）。

図１２に示すように、単独でのＣＡＲ−Ｔ細胞またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（２．３ｕｇ／用量）での処置は、腫瘍面積を減少させ（中央パネル）、生存期間を延長させた（右側パネル）。しかし、担腫瘍マウスへのＣＡＲ−Ｔ細胞とＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの組合せの投与は、単独でのＣＡＲ−Ｔ細胞またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンのどちらかでの処置よりも大幅に腫瘍面積を低減し、生存期間を延長させる、永続的な腫瘍退縮をもたらした。ＩＬ１２−ＭＳＡとの組合せでのＣＡＲ−Ｔ細胞による処置もまた、腫瘍を退縮させ、生存期間を若干延ばす結果となった。しかし、この併用処置は、処置後の動物体重減少の大きな低減により示されるような有意な毒性も明示した。そのような毒性は、ＣＡＲ−Ｔ細胞とＩＬ−１２−ＭＳＡ−ルミカンの組合せについては観察されなかった。

これらの結果は、コラーゲン固定ＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン）との組合せでの腫瘍抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の担腫瘍マウスへの投与が、単独でのＣＡＲ−Ｔ細胞またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの投与よりも大幅に腫瘍成長を減少させ、生存パーセントを増加させる、相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを実証する。これらの結果は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）の腫瘍内コラーゲン固定が、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍制御を相乗的に改善することを示す。
（実施例１６）
ＰＤ−１チェックポイント遮断との組合せでのコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質のネオアジュバント投与はマウス乳房腫瘍切除モデルにおいて転移再発を防止する

抗腫瘍処置を相乗的に増強するコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の能力をさらに評価するために、抗ＰＤ−１抗体（クローン２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）との組合せでのコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンの抗腫瘍効果を４Ｔ１マウス乳房腫瘍切除モデルにおいて評定し、抗ＰＤ−１と組み合わせたｓｃＩＬ１２と比較した。手短に述べると、０日目に、１００μＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させた０．５×１０^６個のルシフェラーゼ発現４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞（ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、メスの６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に注射した。原発病変の外科的切除の前に、マウスをＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンまたはｓｃＩＬ１２で腫瘍内処置し、抗ＰＤ−１で全身処置した（ネオアジュバント療法）。ネオアジュバント療法（ｉ．ｐ．投与した抗ＰＤ−１、２００μｇ／用量＋ｉ．ｔｕ．投与したＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン、４．６μｇ／用量（３０ｐｍｏｌＩＬ１２／用量）またはｓｃＩＬ１２、１．９μｇ／用量（３０ｐｍｏｌＩＬ１２／用量））を７および１３日目に投与し、１６日目に原発腫瘍を外科的に切除した。術後、マウスをｉｎｖｉｖｏイメージング（ＩＶＩＳ）により転移についてモニターした。図１３は、７および１３日目にＩＬ−１２（ｓｃＩＬ１２についてｎ＝５；ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンについてｎ＝５）の腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射および抗ＰＤ−１の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で処置したマウスの、ネオアジュバント処置中の全体重変化（左側パネル）、原発腫瘍成長および重量（中央パネル）ならびに生存率（右側パネル）を示す。矢印は、処置の時点を示し、×印は、手術の時点を示す。

図１３に示すように、ＩＬ−１２のどちらかのバージョン（ｓｃＩＬ１２またはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン）と抗ＰＤ−１抗体の組合せは、体重減少の非存在に基づいて毒性でないことが明白であった（左側パネル）。しかし、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンでのネオアジュバント療法は、非固定バージョンｓｃＩＬ−１２より大きい原発腫瘍縮小に至った（中央パネル）。手術後、マウスをｉｎｖｉｖｏ生物発光イメージングにより転移についてモニターした。ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンは、マウスの転移成長を防いだが、ｓｃＩＬ−１２で処置した数匹のマウスは再発した。

これらの結果は、コラーゲン固定ＩＬ−１２（ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン）との組合せでの抗ＰＤ−１抗体の担腫瘍マウスへの投与が、非コラーゲン結合ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ１２）と抗ＰＤ−１抗体の組合せの投与よりも大幅に、原発腫瘍成長を減少させ、腫瘍の外科的切除後の生存パーセントを増加させる、相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを実証する。これらの結果は、ネオアジュバント設定としてのコラーゲン固定ＩＬ−１２が術後転帰を改善することを実証する。
（実施例１７）
コラーゲン結合ケモカイン融合タンパク質は免疫細胞の遊走および腫瘍浸潤を誘導する

Ｔ細胞浸潤は、永続的な抗腫瘍免疫に重要である。Ｔ細胞浸潤とＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５の腫瘍細胞誘導発現との間には相関関係が存在する。Ｓｐｒａｎｇｅｒｅｔａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ５２３：２３１−２３５（２０１５）；Ｓｐｒａｎｇｅｒｅｔａｌ．（２０１６）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１３，Ｅ７７５９−Ｅ７７６８（２０１６）。ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）は、ＣＣＲ１に高い親和性で結合し、ＣＣＲ５に低い親和性で結合することによって、Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球の動員を媒介する。ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）は、全般的な白血球動員を媒介するＣＣＲ５に結合する。ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）は、いくつかのケモカイン受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５）に結合し、それによって単球、Ｔ細胞、好酸球および他の免疫細胞を誘引する。Ｔ細胞動員ケモカインはまた、生産的免疫細胞媒介退縮を被る腫瘍におけるほうが高頻度に見られる。Ｌｉａｎｇｅｔａｌ．，（２０１６）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１３：５０００−５００５；Ｓｃｈｌｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，（２０１２）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８９：５６０２−５６１１；Ｂｒｅｗｉｔｚｅｔａｌ．，（２０１７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４６：２０５−２１９；Ｋａｎｅｇａｓａｋｉｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７４：５０７０−５０７８；Ｗｉｔｔｒｕｐ（２０１７）ＴｒｅｎｄｓＣａｎｃｅｒＲｅｓ３：６１５−６２０。

哺乳動物細胞にコラーゲン結合ケモカインを発現させる能力を評価するために、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５に融合したルミカンを含む３種のＨｉｓタグ付きコラーゲン結合サイトカインをヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に一過的に発現させた。手短に述べると、ＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（細胞培養物１リットル当たり２０ｍＬ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のポリエチレンイミン（細胞培養物１リットル当たり２ｍｇ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（１，０００，０００個細胞／ｍＬの密度で）に、滅菌濾過したプラスミドＤＮＡ（細胞培養物１リットル当たり１ｍｇ）をトランスフェクトした。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を以前に記載された（Ｚｈｕｅｔａｌ．２０１５）ように使用して、ＴＡ９９を精製した。ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎ（タカラバイオ株式会社）を使用して、ＨＥＫ２９３上清からＨｉｓタグ付きタンパク質を単離した。次いで、１ＭＮａＯＨで４時間、前処理してエンドトキシンを除去し、その後、滅菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で平衡させた、ＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによりサイトカイン融合タンパク質をさらに精製した。精製後、全てのタンパク質について滅菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）への緩衝液交換を行い、０．２マイクロメートル滅菌濾過（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を行い、発色ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ）を使用して最小レベルのエンドトキシン（１注射当たり＜０．１ＥＵ）を含有することを確認した。それらの分子量を確認するために、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１％ＭＥＳ泳動緩衝液を用いて、タンパク質をＮｏｖｅｘＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＳｈａｒｐＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒと同時に泳動させた。得られた溶離物中のＨｉｓタグ付きコラーゲン結合融合タンパク質の相対発現レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（データを示さない）。

各融合タンパク質の予想分子量でのまたはその付近でのタンパク質染色の存在により示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって判定したとき、ＨＥＫ２９３細胞におけるルミカン、ルミカンＤ２１３Ａ（配列番号１２５）、ルミカン−Ｇｌｕｃ、ルミカン−ＣＣＬ３（配列番号１５３）、ルミカン−ＣＣＬ４（配列番号１５６）、およびルミカン−ＣＣＬ５（配列番号１６０）の一過性発現が達成された。

これらの結果は、ケモカインを含むコラーゲン結合融合タンパク質を発現させることができ、哺乳動物細胞から精製することができることを実証する。

上記のように生成したルミカン−ケモカイン融合タンパク質の炎症を誘導する（例えば、免疫細胞遊走）能力を評価するために、ｉｎｖｉｖｏ炎症性腹膜炎アッセイを、以前に記載されたように行った（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔｅｔａｌ．，（２００３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１００：１８８５−１８９０）。手短に述べると、腹腔は、コラーゲンを多く含むおよび血管系を多く含む中皮によって覆われている。腹腔内注射すると、マトリックス結合構築物（例えば、コラーゲン結合ケモカイン融合タンパク質）は、この内膜に付着する。ルミカン−ケモカインの場合、中皮への局在は、隣接する血管から腹腔への免疫細胞血管外漏出を媒介する濃度勾配を生じさせ得る。これらの浸潤物をｅｘｖｉｖｏ免疫表現型検査のために腹腔内洗浄により回収する。したがって、２００ｕＬの滅菌ＰＢＳ中の１ｎｍｏｌ当量のルミカン−Ｇｌｕｃ、ルミカン−ＣＣＬ３、ルミカン−ＣＣＬ４またはルミカン−ＣＣＬ５のいずれかを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、これらのマウスを注射の１８時間後に屠殺した。腹腔を、腔内の５ｍＬの氷冷ＰＢＳを穏やかに揉み、洗浄液をプールすることにより、３回洗浄した。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用して、回収した細胞の数を数えた。

ＣＣＬ３、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５を含むルミカン−ケモカイン融合タンパク質は、ルミカン−ＧＬｕｃの注射と比較して全細胞浸潤を媒介することができた（データを示さない）。浸潤物を表面マーカー染色により免疫表現型検査したとき、ルミカン−ＣＣＬ３、ルミカン−ＣＣＬ４またはルミカン−ＣＣＬ５で処置したマウスからの洗浄液は、ＰＢＳまたはルミカン−Ｇｌｕｃで処置したマウスからの洗浄液と比較して非常に豊富なマクロファージ、続いて好中球、ＮＫ細胞、ＤＣ、Ｂ細胞およびＴ細胞を含有した（データを示さない）。

これらの結果は、コラーゲン結合ケモカイン（例えば、ルミカン−ＣＣＬ３、ルミカン−ＣＣＬ４またはルミカン−ＣＣＬ５）のｉ．ｐ．投与が、マウスの腹腔へのＴ細胞をはじめとする免疫細胞の遊走を誘導することを実証する。これらの結果は、ルミカン−ケモカイン融合タンパク質の腫瘍内投与が炎症（例えば、免疫細胞浸潤）を誘導することによって免疫応答性腫瘍を模倣することも示唆している。

腫瘍環境でルミカン−ケモカインを使用して炎症を誘導する治療効果を評定するために、ルミカン−ＣＣＬ３（ＬｕｍＣＣＬ３）およびルミカン−ＣＣＬ５（ＬｕｍＣＣＬ５）を、本明細書に記載の４Ｔ１乳房腫瘍モデルおよびＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルの両方において試験した。ＩＦＮαの存在または非存在下、ルミカン−ＧＬｕｃ（２０ｕｇ／用量）でのまたはルミカン−ＣＣＬ３（５．５ｕｇ／用量）とルミカン−ＣＣＬ４（５．４ｕｇ／用量）とルミカン−ＣＣＬ５（５．５ｕｇ／用量）の組合せでの担腫瘍マウスの腫瘍内処置を、７日目および１３日目に行った。ＩＦＮα（５０ｕｇ／用量）の腹腔内投与を、９日目および１５日目に行った。

図１４Ａに示すように、全身性ＩＦＮαの存在下でのルミカン−ＣＣＬ３とルミカン−ＣＣＬ４とルミカン−ＣＣＬ５の組合せの腫瘍内注射は、４Ｔ１腫瘍成長を少し遅らせた。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおいて投与した同じ処置は、別々にまたは組み合わせて投与したＩＦＮａおよびルミカン−ケモカインが同等に成長を遅らせるということを明確に示した（図１４Ｂ）。ルミカン−ケモカインが腫瘍細胞の生存能に直接影響を及ぼすかどうかを判定するために、漸増濃度の融合タンパク質ルミカン−ＧＬｕｃ（ＬｕｍＧＬｕｃ）、ルミカン−ＣＣＬ３（ＬｕｍＣＣＬ３）、ルミカン−ＣＣＬ５（ＬｕｍＣＣＬ５）を細胞培養下の４Ｔ１細胞またはＢ１６Ｆ１０とともに４８時間インキュベートした。１０ｕＬの細胞増殖検出試薬ＷＳＴ−１（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）とのさらに４時間のインキュベーション後、増殖を４５０ｎｍでの吸光度（基準７００ｎｍ）により測定した。図１４Ｃおよび１４Ｄに示すように、ルミカンサイトカインは、４Ｔ１細胞に関してもＢ１６Ｆ１０細胞に関しても増殖に影響を与えなかった。これは、ｉｎｖｉｖｏで観察されたいずれの腫瘍成長遅延も、免疫媒介殺腫瘍効果から生じ、直接的殺腫瘍効果から生じなかったことを示す。
（実施例１８）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＣＣＬ１１ケモカイン融合タンパク質とがんワクチンの相乗効果

好酸球は、Ｔ細胞化学誘引物質を分泌し、腫瘍血管系を正常化することによって、腫瘍内浸潤を容易にすることが公知である。Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，ｅｔａｌ．，（２０１５）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ１６：６０９−６１７。ケモカインＣＣＬ１１（エオタキシン（ｅｏｘｔａｘｉｎ））は、好酸球を動員することが公知である（Ｍｅｎｚｉｅｓ−Ｇｏｗｅｔａｌ．，（２００２）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６９（５）：２７１２−２７１８）。したがって、実施例１４に記載のがんワクチンと組み合わせて、ＣＣＬ１１−ルミカン融合タンパク質（配列番号１７２）を、好酸球を腫瘍に動員するならびにそれによって全身性ＴＮＦαおよびＩＦＮγの存在下でのその後の腫瘍制御を媒介するその能力について試験した。手短に述べると、０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に３×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。ワクチン接種を、５日目にプライムならびに１１および１７日目にブーストで尾の付け根の皮下に（ｓ．ｃ．）施した。ワクチン接種を９０ｕｇのＴＴＲ−Ｔｒｐ１−ＥＧＰおよび５０ｕｇの環状ジヌクレオチドから構成して、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をプライミングした。ＣＣＬ１１−ルミカン（５ｕｇ／用量／マウス）、ＴＮＦα（５．８ｐｍｏｌ／用量／マウス）およびＩＦＮγ（６．３ｐｍｏｌ／用量／マウス）での腫瘍内処置を１１、１７、２３および２９日目に投与した。腫瘍面積（平均＋ＳＤ）を１日おきに経時的に測定した。

図１５に示すように、Ｂ１６Ｆ１０特異的がんワクチンＴＮＦαおよびＩＦＮγとの組合せでのＣＣＬ１１−ルミカンによる担腫瘍マウスの処置は、単独でがんワクチンまたは全身性ＴＮＦαおよびＩＦＮγとの組合せでのがんワクチンよりも大幅に腫瘍面積を減少させた。
（実施例１９）
マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるコラーゲン結合ＣＣＬ１１ケモカイン融合タンパク質とがんワクチンの相乗効果

抗腫瘍処置を相乗的に増強するコラーゲン結合ケモカイン融合タンパク質の能力をさらに評価するために、ＭＳＡ−ＩＬ２（３０μｇ／用量）、およびインテグリンのアルファ−Ｖクラスを標的とする腫瘍標的化抗体（２．５Ｆ−Ｆｃ；Ｋｗａｎｅｔａｌ．，（２０１７）ＪＥｘｐＭｅｄ２１５（９）：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１６０８３１を参照されたい）との組合せでの、コラーゲン結合ケモカイン融合タンパク質ＣＣＬ１１−ルミカンの抗腫瘍効果を、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおいて評定した。手短に述べると、５０μＬの滅菌ＰＢＳに再浮遊させた０．５×１０^６個のＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）を、０日目にメスの６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍標的化抗体２．５Ｆ−ＦｃおよびＭＳＡ−ＩＬ２を、５、１１および１７日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ＣＣＬ１１−ルミカン（５ｕｇ／用量／マウス）での腫瘍内処置を５および１１日目に施した。腫瘍成長を経時的に１日おきにモニターした。これを個々の腫瘍面積（ｍｍ^２）として図１６Ａに示す。

図１６Ｂに示すように、腫瘍標的化抗体２．５Ｆ−ＦｃおよびＭＳＡ−ＩＬ−２との組合せでのＣＣＬ１１−ルミカンによる担腫瘍マウスの処置は、ＣＣＬ１１のない処置（単独でのルミカン）よりも大幅に腫瘍面積を減少させた。

まとめると、実施例１７、１８および１９で示した結果は、ルミカン−ケモカインが限局性炎症を誘導し、局所投与部位に免疫細胞を動員すること、およびルミカン−ケモカインを他の抗腫瘍治療法と組み合わせて使用して、それらの効果を増強することができ、相乗的腫瘍制御をもたらすことができることを示す。
（実施例２０）
コラーゲン結合抗体融合タンパク質の組換え発現

哺乳動物細胞にコラーゲン結合抗体融合タンパク質を発現させる能力を評価するために、５種類の異なる抗体に融合したルミカン（４４２０−ルミカン（配列番号１４２および１４３；抗フルオレセイン）、ＬＯＢ１２．３−ルミカン（配列番号１４６および１４７；抗４−１ＢＢ）、３／２３−ルミカン（配列番号１８４および１８５；抗ＣＤ４０）、２Ｃ１１−ルミカン（配列番号１５０および１５１；抗ＣＤ３）、およびＯＸ８６−ルミカン（配列番号１４８および１４９；抗ＯＸ４０）を生成し、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３Ｆ）細胞に一過的に発現させた。全てのＩｇＧ−ルミカン融合体を単一のプラスミドにコードした（データを示さない）。全てのＩｇＧ−ルミカン構築物を、短いリンカー（（Ｇ４Ｓ）_３）でルミカン（ＬＵＭ）に融合されている、先ず、マウスカッパ定常領域（ｍＫ）を有する軽鎖（ＶＬ）、続いて、Ｔ２Ａペプチド（配列番号１５２；Ｔ２Ａ）、そして最後に、マウスＩｇＧ２ｃ定常領域（ｍＩｇＧ２ｃ）を有する重鎖（ＶＨ）として、発現させた。Ｔ２Ａペプチドは、ペプチドの最後の２つの残基間の結合形成をリボソームにスキップさせ、単一オープンリーディングフレーム内での２つの異なるタンパク質の発現を可能にする。フューリン切断部位（Ｆ）をＴ２Ａペプチドの上流に含めて、Ｔ２Ａペプチドを軽鎖の末端から除去できるようにした。加えて、Ｔ２Ａペプチドの切断効率を増加させることが示されているＧＳＧリンカー（ＧＳＧ）（Ｃｈｎｇｅｔａｌ．，（２０１５）ｍＡｂｓ７（２）：４０３−４１２）を、Ｔ２Ａペプチドの上流に含めた。軽鎖および重鎖は両方とも、分泌経路へのタンパク質の輸送を確実にするためのリーダー配列を含む。全ての構築物は、Ｆｃガンマ受容体への結合とＣ１ｑの結合の両方を切断する、ＬＡＬＡ−ＰＧエフェクター機能サイレンシング突然変異（Ｌｏｅｔａｌ．，（２０１７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２９２：３９００−３９０８）を用いて得た。

還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）両方の条件下で予測分子量に位置するタンパク質バンドを明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示された通り、単独でのまたはルミカンに融合した抗フルオレセイン抗体（４４２０）の発現および精製が達成された（データを示さない）。同様に、還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）両方の条件下で予測分子量に位置するタンパク質バンドを明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示された通り、アゴニストＩｇＧ−ルミカン融合タンパク質ＬＯＢ１２．３−ルミカン（抗４−１ＢＢ）、３／２３−ルミカン（抗ＣＤ４０）、２Ｃ１１−ルミカン（抗ＣＤ３）およびＯＸ８６−ルミカン（抗ＯＸ４０）の発現が達成された（データを示さない）。組換えプロテインＡ樹脂（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））を製造業者の推奨基準に従って使用して、全てのＩｇＧ−ルミカン融合タンパク質を精製した。

これらの結果は、コラーゲン結合抗体融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ルミカン）が、哺乳動物細胞に発現すること、およびコラーゲン結合ポリペプチド融合が精製に影響を与えないことを実証する。
（実施例２１）
組換えコラーゲン結合抗体融合タンパク質はｉｎｖｉｔｒｏでコラーゲンに結合し、ｉｎｖｉｖｏで腫瘍内に滞留する

コラーゲンに結合するコラーゲン結合抗体融合タンパク質の能力を評価するために、実施例２０で説明したように発現させて精製したＩｇＧ−ルミカン融合タンパク質を、コラーゲンＩコーティングプレートに結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡにより試験した。手短に述べると、コラーゲンＩ（Ｇｉｂｃｏ）コーティング９６ウェルプレートを、ＰＢＳ＋１％重量／体積ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％重量／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴＡ）で１時間、室温でブロックし、次いで、ＰＢＳＴＡ中の様々な濃度のルミカンとともに２時間、室温でインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで、ＰＢＳＴＡ中、１：１０００希釈（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ２ｃ重鎖（ａｂ９８７２２、Ａｂｃａｍ）とともに１時間、室温でインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで１０分間、１−ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、その後、１Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度（５７０ｎｍでの基準吸光度で補正した）を測定した。精製されたコラーゲン結合抗体融合タンパク質ＬＯＢ１２．３−ルミカン（抗４−１ＢＢ）、３／２３−ルミカン（抗ＣＤ４０）、２Ｃ１１−ルミカン（抗ＣＤ３）およびＯＸ８６−ルミカン（抗ＯＸ４０）を、コラーゲンＩコーティングプレートにおいてＥＬＩＳＡにより評価した。図１７Ａに示すように、全てのＩｇＧ−ルミカン融合タンパク質は、同様の測定親和性でコラーゲンに結合する能力を保持する。これらの結果は、ＩｇＧの重鎖に融合したルミカンが、コラーゲンＩに結合する能力を保持することを実証する。

ｉｎｖｉｖｏで腫瘍内に滞留する４４２０−ルミカン融合タンパク質および４４２０抗体の能力も評価した。両方のタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、次いで、製造業者の説明書に従ってＮＨＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。０日目に、メスの６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０^６個の４Ｔ１乳癌細胞を皮下注射した。７日目に、３匹のＰＢＳ対照マウスに加えて、３匹のマウス各々に等モル量の蛍光標識４４２０抗体および４４２０−ルミカンを腫瘍内注射した。０、０．５、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１００、１２４および１４８時間の時点でＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍ装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光を測定することによって、腫瘍内滞留を評価した（図１７Ｂ）。

図１７Ｂに示すように、蛍光標識４４２０抗体（４４２０ＬＡＬＡ−ＰＧ）を注射したマウスからの蛍光シグナルは、４４２０−ルミカン融合タンパク質（４４２０−ＬＵＭＬＡＬＡ−ＰＧ）からのシグナルよりも迅速にかつ大幅に減少した。

これらの結果は、コラーゲン結合抗体融合タンパク質（例えば、４４２０−ルミカン融合タンパク質）がある期間にわたって、腫瘍内注射部位に物理的に滞留することを実証する。これらの結果は、治療用抗体または抗原結合性断片を含むコラーゲン結合免疫調節分子が、腫瘍内滞留およびわずかな全身播種を示すことを示唆している。
（実施例２２）
コラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質の組換え発現

直接ルミカン融合体として抗体を再生する必要なく事実上あらゆるＩｇＧを腫瘍内に局在させる戦略として、いくつかの異なるＩｇＧ結合タンパク質をルミカンに融合させた。本明細書に記載の他のルミカン融合タンパク質と同様に、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）スペーサーを使用して、ルミカン−コラーゲン結合がＩｇＧ結合ドメインの機能性に確実に干渉しないようにした。二量体化Ｚドメイン（本明細書で「ＺＺ」と呼ばれる、プロテインＡの５つのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つ）（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇｅｔａｌ．，（１９９５）ＪＭｏｌＲｅｃｏｇｎｉｔ８：２７０−２７８）、プロテインＧの二量体化ＩｇＧ結合ドメイン（本明細書では「ＳｐＧ２」と呼ばれる）（Ｊｕｎｇｅｔａｌ．，（２００９）ＡｎａｌＣｈｅｍ８１：９３６−９４２）、Ｓｓｏ７ｄ酵母ディスプレイライブラリーから単離されたＩｇＧ結合因子（Ｇｅｒａｅｔａｌ．，（２０１１）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４０９：６０１−６１６）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）酵母ディスプレイライブラリーから単離されたＩｇＧ結合因子（Ｈａｃｋｅｌｅｔａｌ．，（２０１０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ４０１：８４−９６）、およびＩｇＧＦｃ領域に結合するように設計された２つの小ペプチド（本明細書では「Ｆｃ−ＩＩＩ−４Ｃ」および「ＲＲＧＷ」と呼ばれる）（Ｇｏｎｇｅｔａｌ．，（２０１５）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ２７：１５６９−１５７３；Ｔｓａｉｅｔａｌ．，（２０１４）ＡｎａｌＣｈｅｍ８６：２９３１−２９３８）を含む、いくつかの異なるＩｇＧ結合因子を、スクリーニングのために選択した。加えて、４ｍ５．３とのルミカン−ＭＳＡ融合体もクローニングし、発現させた。４ｍ５．３は、フルオレセインへのフェムトモル結合親和性を有するｓｃＦｖである（Ｍｉｄｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．，（２００４）ＪＭｏｌＢｉｏｌ３４３：６８５−７０１）。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の分野から借用した広範なカップリング戦略（Ｃａｒｔｅｒ＆Ｌａｚａｒ（２０１７）ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ１７：１９７−２２３）を用いて、フルオレセインを抗体にコンジュゲートすることができる。４ｍ５．３−ＭＳＡ−ルミカンと蛍光標識抗体の使用は、ＩｇＧを腫瘍に局在させるための代替戦略として役立つ。この構築物は、任意のフルオレセイン（もしくはＦＩＴＣ）標識タンパク質または小分子に巧みに強く結合し、それを巧みに局在させる、一般化戦略としても役立つ。

哺乳動物細胞にコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質を発現させる能力を評価するために、８種類の異なるＩｇＧ結合ポリペプチドに融合したルミカン（ルミカン−ＭＳＡ−Ｆｃ−ＩＩＩ−４Ｃ（配列番号１３６；１０５．７ｋＤａ）、ルミカン−ＭＳＡ−Ｆｎ３（配列番号１３７；１１３．７ｋＤａ）、ルミカン−ＭＳＡ−ＳｐＧ２（配列番号１３８；１１７．７ｋＤａ）、ＺＺ−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１３５；１１７．５ｋＤａ）、ＷＧＲＲ−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１４０；１０４．６ｋＤａ）、ＲＲＧＷ−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１３９；１０４．６ｋＤａ）、Ｓｓｏ７ｄ−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１３４；１１１．５ｋＤａ）、および４ｍ５．３−ＭＳＡ−ルミカン（配列番号１３３；１３２．２ｋＤａ））を生成し、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に一過的に発現させた。全てのルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質にＨｉｓタグを付けて、ＴＡＬＯＮＭｅｔａｌＡｆｆｉｎｉｔｙＲｅｓｉｎ（タカラバイオ株式会社）を製造業者の説明書に従って使用するＨＥＫ２９３溶解物からの精製を助長した。

還元および非還元両方の条件下で予測分子量に位置するタンパク質バンドを明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示された通り、８種類のルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質全ての発現および精製が達成された（データを示さない）。

これらの結果は、Ｈｉｓタグ付きコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ルミカン）が哺乳動物細胞に発現することおよびそれらのタンパク質を精製することができることを実証する。
（実施例２３）
組換えコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質はｉｎｖｉｔｒｏでコラーゲンおよびＩｇＧに結合する

コラーゲンに結合するコラーゲン結合ＩｇＧ結合融合タンパク質の能力を評価するために、実施例２２で説明したように発現させて精製したルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質を、コラーゲンＩコーティングプレートおよびコラーゲンＩＶコーティングプレートに結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡにより試験した。手短に述べると、ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を一晩、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（１００μＬ、２．５μｇ／ｍＬ、ＢｉｏＸＣｅｌｌＣ１．１８．４）で、一晩、４℃でコーティングした。次いで、プレートを、ＰＢＳ＋１％重量／体積ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０５％重量／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（ＰＢＳＴＡ）で１時間、室温でブロックし、次いで、ＰＢＳＴＡ中の様々な濃度のルミカンとともに２時間、室温でインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴＡで洗浄し、次いで、ＰＢＳＴＡ中、１：２０００希釈（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）でのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナル抗６ｘＨｉｓ（ａｂ１１８７、Ａｂｃａｍ）とともに１時間、室温でインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳＴＡで洗浄し、１０分間、１−ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、その後、１Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度（５７０ｎｍでの基準吸光度で補正した）を測定した。

精製されたルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質ルミカン−ＭＳＡ−Ｆｎ３、ルミカン−ＭＳＡ−ＳｐＧ２、ＺＺ−ＭＳＡ−ルミカン、および４ｍ５．３−ＭＳＡ−ルミカンをコラーゲンＩコーティングプレートおよびコラーゲンＩＣコーティングプレートにおいてＥＬＩＳＡにより評価した。ルミカンを比較対照として使用した。図１８Ａに示すように、全てのルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質は、同様の測定親和性でコラーゲンに結合する能力を保持する。これらの結果は、様々なＩｇＧ結合ポリペプチドに融合したルミカンが、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＶに結合する能力を保持することを実証する。

実施例２２からの精製されたルミカンＩｇＧ結合融合タンパク質を、ＥＬＩＳＡによって測定してマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＣ１．１８．４）に結合するそれらの能力について試験した。手短に述べると、１−ｓｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）に加えて、ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｈｉｓ二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８７）を使用して、ＩｇＧ結合ルミカン融合体を検出した。

図１８Ｂに示すように、試験した全てのルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質は、様々な親和性（Ｋ_Ｄ）でマウスＩｇＧ２ａに結合する。

まとめると、これらの結果は、ルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質がコラーゲンＩとコラーゲンＩＶの両方に結合し、かつＩｇＧに結合することを実証する。これらの結果は、ＩｇＧ（例えば、治療用抗体）と組み合わせて使用したルミカン−ＩｇＧ結合融合タンパク質が、コラーゲンとＩｇＧの両方に結合し、局所投与部位にＩｇＧを滞留させることを示唆している。
（実施例２４）
コラーゲン結合ルミカンは腹腔内注射後に腹腔内に滞留する

上述の実施形態は、腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）投与時に腫瘍内に滞留するルミカンの有用性を実証した。腹腔は、コラーゲンを多く含む中皮によって覆われてもいる。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射時にルミカンを腹腔内に停留させる能力を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに単独でのガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ；２０μｇ／用量）またはルミカンに融合したガウシアルシフェラーゼ（ルミカン−Ｇｌｕｃ；４０μｇ／用量）を腹腔内注射した。注射後直ちに、マウスをｉｎｖｉｖｏ蛍光（落射照明、自動露出）によりイメージングした。注射の２４時間後、マウスを再びイメージングした。

ルミカン−ＧＬｕｃは、腔内に滞留するが、単独でのＧＬｕｃは、注射直後に腹膜内に迅速に拡散し、低い初期シグナルをもたらす（データを示さない）。ルミカンの滞留が注射の２４時間後に腔内で観察された。

腹腔のこの内膜または大網に埋め込まれた腫瘍も同様にコラーゲンを多く含む。ルミカンのｉ．ｐ．投与が、大網を好む腫瘍上への蓄積をもたらすかどうかを判定するために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で蛍光標識したルミカンを、マウス大網組織に卵巣腫瘍微小コロニーを有するマウスに投与した。手短に述べると、ヒト卵巣腫瘍細胞系であるＯＶＣＡ４３３細胞をマウスに腹腔内注射し、３週間放置して大網上に微小コロニーを形成した。２０ｕｇの標識ルミカンを腹腔内注射した。切除した大網組織を蛍光顕微鏡法によりイメージングした。標識ルミカンを担腫瘍マウスに腹腔内注射した。注射後１時間、６時間および２４時間の時点でマウスの大網をイメージングのために切除した。

図１９に示すように、大網を覆う卵巣腫瘍を担持しているマウスにルミカンを腹腔内注射すると、ルミカンは、これらの腫瘍微小コロニーに優先的に蓄積する。注射の１時間後（左側パネル）、ルミカンからの蛍光シグナル（黄色で示す）は、一様に分布していた。注射の６時間後（中央）、それは、大網内の腫瘍微小コロニー（赤色で示す）の周囲のみに大部分が滞留していた（中央パネル）。ルミカンの滞留は、２４時間の時点（右側パネル）で大きい腫瘍の周囲で観察された。これらの結果は、ルミカンのｉ．ｐ．投与が、コラーゲンを多く含む位置に蓄積し得ること、およびルミカンが、腹腔内注射を含むいくつかの投与方法に適していることを実証する。
（実施例２５）
哺乳動物細胞における自己複製ＲＮＡからのコラーゲン結合ＩＬ−１２融合タンパク質の発現

ＲＮＡを使用してコラーゲン結合免疫調節分子の発現を評価するために、単独でのまたは蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）に融合したＩＬ１２−ＭＳＡおよびＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンをコードする自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）を、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞に発現するそれらの能力について試験した。この実施例で使用したレプリコンは、アルファウイルスに由来した。レプリコンは、カプシド構造タンパク質を欠失していたが、非構造タンパク質を保持する。非構造タンパク質は、ＲＮＡベースのＲＮＡ複製およびＲＮＡ転写に対応する。Ａｂ１ｃ１は、野生型レプリコンと比較してｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでより強固な発現を示す突然変異型レプリコンである。Ａｂ１ｃ１レプリコンは、細胞内でのレプリコンの存在およびサブゲノム転写を延長する、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３遺伝子の４つの突然変異を含有する。

手短に述べると、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した０．５×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞に、ＮＥＯｎＮトランスフェクション試薬（電気穿孔）およびＡｂ１ｃ１レプリコンを使用してトランスフェクトした。ｍＣｈｅｒｒｙを検出するための光学的設定を使用して２４時間後にＦＡＣＳ分析によりトランスフェクション効率を検出した。トランスフェクションの２４時間後の細胞上清および市販のＩＬ−１２ＥＬＩＳＡ（製造業者の説明書に従って追跡した）を使用して、ＩＬ−１２の発現を定量した。フローサイトメトリーによるｍＣｈｅｒｒｙの判定によりＢ１６Ｆ１０細胞においてレプリコンの発現を評価した（図２０Ａ）。市販のＩＬ−１２ＥＬＩＳＡを使用してＢ１６Ｆ１０細胞においてＩＬ−１２を定量した（図２０Ｂ）。

図２０Ａに示すように、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした、ｍＣｈｅｒｒｙ＋Ｂ１６Ｆ１０細胞を、フローサイトメトリーにより観察した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質は、これらの複製物のＣ末端にコードされ、そのため、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の検出は、コードされたタンパク質の完全長発現のしるしである。

図２０Ｂに示すように、細胞上清は、Ａｂ１ｃ１−ＧＩＭ対照ではなく、ＩＬ−１２をコードしている複製物をトランスフェクトしたＢ１６Ｆ１０細胞からの、これらの構築物の発現を示す。

これらの結果は、ルミカン−融合タンパク質の送達が、示したようなレプリコンを含む、注射以外の投与方法を使用して達成可能であることを実証する。
（実施例２６）
Ｂｒａｆ^{ｖ６００ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}マウスモデルにおけるコラーゲン結合サイトカイン融合タンパク質と抗ＰＤ−１抗体とＴＡ９９の相乗効果

処置が困難なマウス黒色腫モデルにおいて抗ＰＤ−１遮断との組合せでのルミカン−サイトカインの有効性を評価するための、Ｂｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}遺伝子改変マウスモデル（ＧＥＭＭ）（Ｓｐｒａｎｇｅｒｅｔａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ５２３：２３１−２３５；Ｍｏｍｉｎｅｔａｌ．，（２０１９）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１，ｅｅａｗ２６１４）。このＧＥＭＭにおける黒色腫は、発がん性Ｂｒａｆ^{Ｖ６００Ｅ}の活性化と腫瘍抑制因子Ｐｔｅｎの両方の対立遺伝子の欠失とを推進する、メラノサイトにおけるタモキシフェン調節Ｃｒｅ発現により誘導される。Ｂｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}黒色腫は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍よりも少ないネオ抗原および大きい不均一性を有する。このモデルは、若干のＴ細胞浸潤を有するが、腫瘍成長は、ＰＤ−１および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）の二重チェックポイント遮断によってわずかにしか緩徐化されない。同書。

抗ＰＤ−１チェックポイント遮断と並行してのコラーゲン結合ＩＬ−２およびＩＬ−１２での処置が、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍で観察された（図９、１０および１３）ように、進行中の応答を再活性化することおよび新たなＴ細胞応答をプライミングすることができるかどうか、ならびに新規Ｔ細胞プライミングおよび幾らかのアブスコパル効果を、腫瘍標的化抗体ＴＡ９９のような免疫原性細胞死を指示する作用因子を含めることによって増強することができるかどうかを判定するために、０日目にＢｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}マウスの右側腹部への４−ヒドロキシタモキシフェンの適用により黒色腫を誘導した。誘導後、平坦な黒色色素病変が形成される。病変は、治療しないと進行して大きい塊になる（データを示さない）。２５日目に、担腫瘍マウスをＰＢＳ対照（ｉ．ｔｕ）で、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ）＋ＴＡ９９（ｉ．ｐ．）＋抗ＰＤ−１（ｉ．ｐ．）で、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカン（ｉ．ｔｕ）＋抗ＰＤ−１（ｉ．ｐ．）で、ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｔｕ）＋ＴＡ９９（ｉ．ｐ．）＋抗ＰＤ−１（ｉ．ｐ．）で、またはＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｔｕ）＋抗ＰＤ−１（ｉ．ｐ．）で、２５、３１、３７、４３、４９、５５および６１日目に処置する。

図２１Ａに示すように、ＭＳＡ−ＩＬ２（ｉ．ｔｕ）＋ＩＬ１２−ＭＳＡ（ｉ．ｔｕ）＋ＴＡ９９（ｉ．ｐ．）＋抗ＰＤ−１（ｉ．ｐ．）で処置したＢｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}担腫瘍マウスは、病変発生抑制を示す。

図２１Ｂに示すように、ＴＡ９９を伴う抗ＰＤ−１ならびにコラーゲン結合ＩＬ−２およびＩＬ−１２で処置したＢｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}担腫瘍マウスの全生存率と、ＴＡ９９を伴わない抗ＰＤ−１ならびにコラーゲン結合ＩＬ−２およびＩＬ−１２で処置したＢｒａｆ^{ｖ６００Ｅ}／Ｐｔｅｎ^{ｆｌ／ｆｌ}担腫瘍マウスの全生存率は、同等である。したがって、ＴＡ９９は、有効性に必要な成分でなかった。これらの結果は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびチェックポイント遮断が有効な腫瘍アゴニスト併用処置であり得ることを肯定する（図９、１０および１３）。

このモデルにおける腫瘍制御を、コラーゲン固定サイトカインの代わりに非固定サイトカインを使用して達成することも、重度の潜在的致死性の毒性という犠牲を払ってだが、できるだろう。ＩＬ１２−ＭＳＡおよびＭＳＡ−ＩＬ２で処置したマウスの３分の１は、体重の＞２０％減少のため安楽死させたが、処置関連毒性で死んだ、ＩＬ１２−ＭＳＡ−ルミカンおよびルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２で処置したマウスはいなかった（図２１Ｂ）。これらの結果は、コラーゲン結合融合タンパク質が、この強力な腫瘍アゴニスト併用処置で全生存率を安全に向上させることができることを実証する（図２１Ｂ）。
（実施例２７）
ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍へのＬＡＩＲ結合能

この実施例では、切除したＢ１６Ｆ１０に結合するＬＡＩＲの能力を測定する。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、検出可能なコラーゲンをほとんど有さず、そのため腫瘍へのＬＡＩＲの結合能についてのより低い推定値として役立つ。手短に述べると、Ｃ５７／マウスに１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞を左側腹部に皮下注射して接種した。７日後、腫瘍を注意深く切除し、全ての残存皮膚および皮下脂肪から剥離した。次いで、切除した腫瘍を、穏やかな界面活性剤（ＰＢＳ＋０．１％体積／体積Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）中で２時間、３７℃でインキュベートし、次いで、解凝集させた／７０マイクロメートルフィルターに押し通した（図２２Ａ）。図２２Ｂに示すように、マトリックスは、腫瘍量の３分の１を構成する。

製造業者の説明書に従って行ったヒドロキシプロリンアッセイ（ＭＡＫ００８−１ＫＴ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）により確認したところ、濾過画分は、細胞外マトリックス（すなわち、細胞画分）を欠いていたが、フィルターを通過しなかった画分（すなわち、マトリックス画分）は、マトリックスを多く含んでいた（図２２Ｃ）。ヒドロキシプロリン（４−ヒドロキシプロリン）は、プロリンの翻訳後ヒドロキシル化により形成される非タンパク質原性アミノ酸である。ヒドロキシプロリンは、ヘリックス構造を安定させるために役立つ、コラーゲンの主成分である。ヒドロキシプロリンは、主としてコラーゲンのみに存在するため、ヒドロキシプロリンレベルの測定値をコラーゲン含量の指標として使用する。このアッセイでは、酸化されたヒドロキシプロリンと４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）の反応であって、存在するヒドロキシプロリンに比例して発色（５６０ｎｍ）生成物を生じさせる結果となる反応により、ヒドロキシプロリン濃度を検出する。

次いで、各腫瘍のマトリックス画分を抗原過剰濃度（１０μＭ）または抗原枯渇濃度（１０μＭ）のどちらかのＡＦ６４７標識ＬＡＩＲ中でインキュベートして、マトリックス画分中のＬＡＩＲ結合部位を定量した。定常状態に達するまで、溶液の蛍光を経時的にモニターした。図２２Ｄに示すように、蛍光の減少が、１μＭの標識ＬＡＩＲで観察され、これは、マトリックス画分中のコラーゲンへの結合による槽からのＬＡＩＲ枯渇に対応する。溶液濃度の２０％低下は、腫瘍マトリックスへの０．２ｎｍｏｌ取込みを示す。したがって、１×１０^６個の細胞接種からの７日目のＢ１６Ｆ１０腫瘍は、０．２ｎｍｏｌのＬＡＩＲ結合部位を有する（図２２Ｄ）。この数は、ヒドロキシプロリン含量により測定したときの腫瘍のコラーゲン含量と相関する（図２２Ｅ）。この実験は、Ｂ１６１０マトリックスはコラーゲンを多く含むのでＬＡＩＲがＢ１６１０に結合することができることを示す。
（実施例２８）
ＬＡＩＲを使用するコラーゲン結合融合タンパク質は、ルミカンの使用と比較して同様の利益をもたらす

ルミカン同様、ＬＡＩＲは、コラーゲンＩ型に結合することができる。ＬＡＩＲサイトカイン融合タンパク質を使用して、コラーゲン結合融合タンパク質が、融合したサイトカインの有効性を増強することができるかどうかを判定した。ＬＡＩＲ−サイトカイン融合タンパク質であるＬＡＩＲ−ＭＳＡ−ＩＬ２（配列番号１８６）を、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２（実施例１）について説明したように発現させ、精製した。実施例６で説明したように行ったＢ１６Ｆ１０黒色腫マウスモデルにおいて、ＬＡＩＲ−ＭＳＡ−ＩＬ２は、腫瘍サイズを低減させる点でルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２と少なくとも同様に効果的である（図３Ｂを図２３Ａと比較されたい）。ＬＡＩＲ−ＭＳＡＩＬ−２はまた、ルミカン−ＭＳＡ−ＩＬ２と腹腔内ＴＡ９９の組合せで処置したマウスにおける生存期間に匹敵するレベルにマウス生存期間を延長させた（図３Ｂおよび３Ｃを図２３Ｂと比較されたい）。これらの結果は、ルミカン、ＬＡＩＲ、またはそれらのクラス内の他のコラーゲン結合タンパク質を使用してこのコラーゲン結合戦略を利用することができることを実証する。
（実施例２９）
ＬＡＩＲ操作は、より親和性の高いコラーゲン結合因子とより親和性の低いコラーゲン結合因子の両方を生じさせる

この実施例では、ＬＡＩＲのより親和性の高いバリアントとより親和性の低いバリアントを操作するために酵母ディスプレイプラットフォームを利用する。手短に述べると、エラープローンＰＣＲを使用してマウスＬＡＩＲ遺伝子を増幅させて、ＬＡＩＲ突然変異体のライブラリーを生成する。ＲＪＹ２００酵母（ＥＢＹ１００、ＡＴＣＣ、の社内改変バージョン）を線状化ｐＣＴＣＯＮ２ベクター（４１８４３、Ａｄｄｇｅｎｅ）で形質転換し、エラープローンＰＣＲ産物を回収し、ｉｎｖｉｖｏ相同組換え事象に付して最終ディスプレイプラスミドを生成する。ＬＡＩＲ突然変異体が、Ａｇａ２タンパク質に融合され、膜結合Ａｇａ１タンパク質へのジスルフィド連結によって酵母表面に結合されるように、ｐＣＴＣＯＮ２プラスミドをフォーマットする。ＬＡＩＲ遺伝子の後には、突然変異型ＬＡＩＲタンパク質の完全発現についての探索を可能にするｃ−ｍｙｃタグも続く。表面での発現を誘導したら、標識抗原とｃ−ｍｙｃタグに対する抗体（ＡＣＭＹＣ、Ｅｘａｌｐｈａ）とで、酵母を染色することができる。次いで、ｃ−ｍｙｃ染色強度により判定してＬＡＩＲ発現クローンを、ＦＡＣＳを使用してより低いまたはより高い親和性について選別することができる。（Ｃｈａｏｅｔａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（２）：７５５−７６８）。

ＬＡＩＲ天然リガンドであるコラーゲンＩは可溶性でないので、可溶性コラーゲンペプチド模倣物（ＣＲＰ、コラーゲン関連ペプチド）をＦＡＣＳアッセイのための抗原として使用した。この模倣物のタンパク質配列は、ＧＣＯ−（ＧＰＯ）_１０−ＧＣＯＧ−ＮＨ２であり、式中のＯは、ヒドロキシプロリンアミノ酸を表す。コラーゲンＩと同様、これらのペプチドは、溶液中で自発的にヘリックス構造を形成する。架橋試薬（ｃａｔ＃、会社）を使用して、これらのヘリックス構造を適所にロックした。精製後、架橋したペプチドを本発明者らの抗原（ＣＲＰ−ＸＬ）として使用した。このペプチドをビオチン化形式（ＣＲＰ−ＸＬ−ビオチン）と非ビオチン化形式（ＣＲＰ−ＸＬ）の両方で使用したことに留意されたい。（これらのペプチドおよびトリプルヘリックス形式へのそれらの官能化に関する詳細な説明は、ＣａｍｂＣｏｌｌａｂＩｎｃ．から得ることができる）。

２つの異なる戦略を使用して、高親和性コラーゲン結合突然変異体と低親和性コラーゲン結合突然変異体を単離した。低親和性突然変異体を選択するために、平衡選別を利用した。この戦略では、ＬＡＩＲ発現を酵母ライブラリーの表面で誘導した。ライブラリーを、平衡に達するまで、逐次的に、ＣＰＰ−ＸＬ−ビオチンおよびニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ（ＡＣＭＹＣ、Ｅｘａｌｐｈａ）、続いて二次抗体（ストレプトアビジン−ＡＦ６４７（Ｓ２１３７４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびヤギ抗ニワトリＡＦ４８８（Ａ−１１３９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。弱いＡＦ６４７シグナルを提示するかまたはＡＦ６４７シグナルを提示しないがＡＦ４８８に対して陽性である（これは、それらがＬＡＩＲを発現するがコラーゲン模倣物に結合しないことを示す）酵母を、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａマシンで選別した。数ラウンドの選別後、酵母をミニプレップしてディスプレイプラスミドを単離し、細菌コロニーに形質転換し、シークエンシングに供した。高頻度に見られるクローン（シークエンシング中に他のものより高い頻度（少なくとも２倍）で出現したクローン）、および／またはコラーゲン結合ポケットに突然変異を有するクローンを、下流の解析に選択した。（Ｂｒｏｎｄｉｊｋｅｔａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１５：１３６４−１３７３）。これらの変異体を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）との融合体として可溶性発現させ、ＥＬＩＳＡアッセイでコラーゲンＩに結合するそれらの能力について試験した。図２４Ａ〜Ｅおよび２５Ａ〜Ｃに示すように、弱結合クローン（図２４Ｆ、２４Ｄ）は、ＬＡＩＲ結合ポケットに突然変異を有する。配列番号１８７〜１９２。

より親和性の高い突然変異体を単離するために、動的選別戦略を利用した。発現の誘導後、酵母ライブラリーを、上で説明したようにＣＲＰ−ＸＬ−ビオチンで標識した。平衡に達した後、酵母クローンを洗浄し、次いで、３００：１の過剰ＣＲＰ−ＸＬ（非ビオチン化）中で３〜５日間インキュベートした。非標識ＣＲＰ−ＸＬは、ＬＡＩＲ結合のために解離ＣＲＰ−ＸＬ−ビオチンを置き換えることになる（図２６Ｃ〜Ｄ）。解離速度が最も遅いクローン、すなわち最高親和性クローン、のみが標識されたままとなる。次いで、ＦＡＣＳを使用して、最高ＡＦ６４７シグナルを有する酵母クローンを選別した。数ラウンドの選別後、高親和性クローンを競合アッセイでの下流の解析に選択した。単離された酵母クローンをＣＲＰ−ＸＬ−ビオチンで標識し、次いで非標識ＣＲＰ−ＸＬとともにインキュベートした。試料を経時的に採取し、ＡＦ６４７シグナルについて解析した（図２６Ｅ〜Ｆ）。図２６Ｇに示すように、高親和性突然変異体ＬＡＩＲであるＬＡＩＲ３０．２Ｋ１．Ｂは、ＷＴＬＡＩＲより遅い解離速度を有する。このクローンに見られる突然変異は、ＬＡＩＲ結合ポケットの外側に位置する（図２６Ｂ、配列番号１９３）。これらの結果は、コラーゲンへの様々な結合親和性を有する突然変異型ＬＡＩＲを単離することができたことを示す。これらのＬＡＩＲ１バリアントは、コラーゲンを多く含む腫瘍への異なる結合親和性を有する治療剤を含む免疫調節融合タンパク質を操作する機会を提供する。
略式配列表

Claims

（ｉ）免疫調節ドメインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）必要に応じて、リンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
前記免疫調節ドメインが、前記リンカーにより、または前記リンカーなしで前記コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質。
Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い、請求項１に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、約５〜１００ｋＤａ、約１０〜８０ｋＤａ、約２０〜６０ｋＤａ、約３０〜５０ｋＤａの、または約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａもしくは約１００ｋＤａのＭＷを有する、請求項１から２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、コラーゲンに結合する１つまたは複数のロイシンリッチリピートを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、コラーゲンに結合する２、３、４、５、６、７、８、９または１０のロイシンリッチリピートを含む、請求項４に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのヒトプロテオグリカンクラスＩＩメンバーからの１つまたは複数のロイシンリッチリピートを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択される、請求項６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ヒトＳＬＲＰを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択される、請求項９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項１０に記載の免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、コラーゲンに結合する、Ｉｇ様ドメインを有するヒトＩ型糖タンパク質、またはその細胞外部分を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記Ｉ型糖タンパク質が、Ｉ型コラーゲンへの結合についての結合についてルミカンと競合する、請求項１３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ヒトＩ型糖タンパク質が、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される、請求項１３から１４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ヒトＩ型糖タンパク質が、ＬＡＩＲ１である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ヒトＩ型糖タンパク質が、ＬＡＩＲ１であり、前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む、請求項１３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、免疫細胞による応答を活性化、強化または促進するポリペプチドを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、免疫細胞による応答を阻害、低下または抑制するポリペプチドを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞が、自然リンパ系細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびこれらの組合せから選択されるリンパ系細胞である、請求項２１から２２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞が、単球、好中球、顆粒球、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞およびこれらの組合せから選択される骨髄系細胞である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞による前記応答が、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞傷害性の増加、ならびにこれらの組合せを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、サイトカイン、ケモカイン、活性化リガンド／受容体、阻害性リガンド／受容体、またはこれらの組合せから選択される１つまたは複数を含む、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つまたは複数のサイトカインを含む、請求項２６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−２１およびこれらの組合せから選択されるヒト共通ガンマ鎖受容体インターロイキンである、請求項２７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項２８に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１２（ｐ３５）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１２ファミリーメンバーである、請求項２７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体である、請求項３０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１ファミリーメンバーである、請求項２７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１８である、請求項３２に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびこれらの組合せから選択される、請求項２７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つまたは複数のケモカインを含む、請求項２６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＬＩＦ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびこれらの組合せから選択される、請求項３５に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシンおよびこれらの組合せから選択される、請求項３５に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つまたは複数の活性化リガンド／受容体を含む、請求項２６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリー、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、Ｂ７リガンドファミリー、およびＴ細胞受容体から選択される、請求項３８に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０およびこれらの組合せから選択されるＴＮＦスーパーファミリーリガンドである、請求項３９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリー受容体であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項３９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバー、またはＩＣＯＳリガンド、ＣＤ８０およびＣＤ８６ならびにこれらの組合せから選択されるＢ７ファミリーメンバーである、請求項３９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項３９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記活性化リガンド／受容体が、Ｔ細胞受容体であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体および抗ＣＤ３ε抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項３９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つまたは複数の阻害性リガンド／受容体を含む、請求項２６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性リガンド／受容体が、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびチェックポイント阻害剤から選択される、請求項４５に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性リガンド／受容体が、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項４６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性リガンド／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＢＴＬＡ抗体から選択される抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項４６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性リガンド／受容体が、チェックポイント阻害剤であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４７抗体および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される抗体または抗原結合性断片を含む、請求項４６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、リンカーを介して前記コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されている、請求項１から４９のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、コラーゲン原線維上への前記免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さまたは質量のものである、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、前記融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供する、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの前記免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドである、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、ヒト血清アルブミンまたはその断片である、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項１から５６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
≧６０ｋＤａである、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）少なくとも１つのサイトカインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
前記サイトカインが、前記リンカーを介して前記コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い、請求項６０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む、請求項６０から６１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項６２に記載の免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される、請求項６０から６１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１である、請求項６５に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む、請求項６６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項６６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項６６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項６６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ、ＩＬ−２１およびこれらの組合せから選択されるヒト共通ガンマ鎖受容体インターロイキンである、請求項６０から７０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項７１に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１２（ｐ３５）、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１２ファミリーメンバーである、請求項６０から７０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体である、請求項７３に記載の免疫調節融合タンパク質。
第２のサイトカインを含み、前記第２のサイトカインが、ＩＬ−２である、請求項７４に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３およびこれらの組合せから選択されるヒトＩＬ−１ファミリーメンバーである、請求項６０から７０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびこれらの組合せから選択される、請求項６０から７０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、コラーゲン原線維上への前記免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さもしくは質量のものであり、および／または前記融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供し、および／または受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの前記免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする、請求項６０から７７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、ヒト血清アルブミンまたはその断片である、請求項６０から７７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む、請求項６０から７７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項６０から８０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項６０から８０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）少なくとも１つのケモカインと、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
前記ケモカインが、前記リンカーを介して前記コラーゲン結合ドメインに作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い、請求項８３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む、請求項８３から８４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項８５に記載の免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される、請求項８３から８４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１である、請求項８８に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む、請求項８９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項８９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項８９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項８９に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＬＩＦ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびこれらの組合せから選択される、請求項８３から９３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシンおよびこれらの組合せから選択される、請求項８３から９３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、コラーゲン原線維上への前記免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さもしくは質量のものであり、および／または前記融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供し、および／または受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの前記免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする、請求項８３から９５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、ヒト血清アルブミンまたはその断片である、請求項８３から９５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む、請求項８３から９５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項８３から９８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項８３から９８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む活性化リガンド／受容体に結合するアゴニスト抗体と、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
前記コラーゲン結合ドメインが、前記Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質。
Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い、請求項１０１に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む、請求項１０１から１０２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項１０３に記載の免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される、請求項１０１から１０２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１である、請求項１０６に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む、請求項１０７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１０７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１０７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１０７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記アゴニスト抗体が、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される、請求項１０１から１１１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記アゴニスト抗体が、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される、請求項１０１から１１１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記抗体が、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体、および抗ＣＤ３ε抗体から選択される、請求項１０１から１１１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項１０１から１１４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項１０１から１１４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む阻害性リガンド／受容体に結合するアンタゴニスト抗体と、
（ｉｉ）Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに特異的に結合し、Ｉ型コラーゲンにＫ_Ｄ≦５００ｎＭで結合する、コラーゲン結合ドメインであって、等電点ｐＩ＜１０、および≧５ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する、コラーゲン結合ドメインと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
前記コラーゲン結合ドメインが、前記Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質。
Ｉ型および／またはＩＶ型コラーゲンに対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンＣまたはフィブリノゲンから選択される細胞外マトリックス成分に対する前記コラーゲン結合ドメインのＫ_Ｄより低い、請求項１１７に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ルミカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、コンドロアドヘリン、アスポリン、ＰＲＥＬＰ、オステオアドヘリン／オステオモジュリン、オプチシン、オステオグリシン／ミメカン、ポドカン、パールカン、およびニドゲンから選択されるヒトＳＬＲＰを含む、請求項１１７から１１８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記ＳＬＲＰが、ルミカンである、請求項１１９に記載の免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、および糖タンパク質ＩＶから選択される、請求項１１７から１１８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、ＬＡＩＲ１である、請求項１２２に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜１２２を含む、請求項１１１に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失を含むＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１２３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が増加されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１２３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記コラーゲン結合ドメインが、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質のコラーゲン結合親和性と比較してコラーゲンへの結合親和性が減少されたＬＡＩＲ１バリアントを含む、請求項１２３に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記アンタゴニスト抗体が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４７抗体、および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される、請求項１１７から１２７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトＩＬ−２と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−２が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の前記一本鎖融合体が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトＣＣＬ−３と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−３が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトＣＣＬ−４と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−４が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトＣＣＬ−５と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＣＣＬ−５が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）ヒトエオタキシンと、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
エオタキシンが、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質。
ルミカンが、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３１から１３６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
ＬＡＩＲ１が、配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号９８のアミノ酸配列を含むＬＡＩＲ１タンパク質と比較して１つもしくは複数のアミノ酸置換、付加もしくは欠失、必要に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多くのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を含む、請求項１３１から１３６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、コラーゲン原線維上への前記免疫調節ドメインの吸着を低減するのに十分な長さもしくは質量のものであり、および／または前記融合タンパク質に組織からの拡散を低減するのに十分な分子量を提供し、および／または受容体／リガンド会合を促進するための、コラーゲン原線維からの前記免疫調節ドメインの立体的分離を可能にする、請求項１３１から１３８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、ヒト血清アルブミンまたはその断片である、請求項１３１から１３８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記リンカーが、Ｆｃドメイン、またはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含む、請求項１３１から１３８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項１３１から１４１のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項１３１から１４２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
（ｉ）Ｆｃドメインを含むかまたはＦｃＲ相互作用が低減された突然変異型Ｆｃドメインを含むアゴニスト抗体であって、抗ＣＤ３抗体、抗４−１−ＢＢ抗体、抗ＣＤ４０抗体および抗ＯＸ４０抗体から選択される、アゴニスト抗体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ルミカンまたはＬＡＩＲ１が、前記Ｆｃドメインまたは突然変異型ＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏで拡散または対流によるサイズ依存性逃避を低減するのに十分な質量のものである、請求項１４４に記載の免疫調節融合タンパク質。
投与時にｉｎｖｉｖｏでＩ型および／またはＩＶ型コラーゲンに結合することによって、前記免疫調節融合タンパク質の全身曝露を低減する、請求項１４４から１４５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記請求項のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
請求項１４８に記載の核酸を含む発現ベクター。
請求項１４９に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
免疫調節融合タンパク質を産生する方法であって、請求項１５０に記載の細胞を、前記免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で維持するステップを含む方法。
前記免疫調節融合タンパク質を得るステップをさらに含む、請求項１５１に記載の方法。
対象における免疫細胞による応答を活性化、強化または促進する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
対象における免疫細胞による応答を阻害、低減または抑制する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
前記免疫細胞が、自然リンパ系細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびこれらの組合せから選択されるリンパ系細胞である、請求項１５３から１５４のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫細胞が、単球、好中球、顆粒球、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞およびこれらの組合せから選択される骨髄系細胞である、請求項１５３から１５４のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫細胞による前記応答が、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞傷害性の増加、ならびにこれらの組合せを含む、請求項１５３から１５６のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫細胞による前記応答が、腫瘍微小環境で発生する、請求項１５３から１５７のいずれか一項に記載の方法。
腫瘍成長を低減または阻害する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
対象におけるがんを処置する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
抗腫瘍免疫応答が、前記対象において前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物の投与後に誘導される、請求項１５９から１６０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗腫瘍免疫応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の一方または両方によるＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２の産生を含むＴ細胞応答である、請求項１６１に記載の方法。
腫瘍微小環境への免疫細胞の浸潤が、前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物の投与後に増加される、請求項１５９から１６２のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物の投与後に、腫瘍微小環境内の調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の量が低減されるか、または腫瘍微小環境内でのＴ細胞疲弊が軽減される、請求項１５９から１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または医薬組成物が、腫瘍内投与される、請求項１５３から１６４のいずれか一項に記載の方法。
必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または請求項１４７に記載の医薬組成物を含む容器と、前記融合タンパク質または医薬組成物を投与するための説明書を含む添付文書とを含むキット。
必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または請求項１４７に記載の医薬組成物を含む容器と、前記抗体または医薬組成物を単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書とを含むキット。
必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための医薬を製造するための、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または請求項１４７に記載の医薬組成物の使用。
必要な対象におけるがんの進行を処置するもしくは遅らせるまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害するための医薬の製造における、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または請求項１４７に記載の医薬組成物。
医薬として使用するための、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および必要に応じた薬学的に許容される担体、または請求項１４７に記載の医薬組成物。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量と、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合性断片を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）、または腫瘍ネオ抗原である、請求項１５６に記載の方法。
前記腫瘍抗原標的化抗体が、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３またはＣＤ３８に特異的に結合する、請求項１７１から１７２のいずれか一項に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、請求項１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量と、がんワクチンを含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
前記がんワクチンが、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍抗原で免疫されて前記対象に投与される細胞の集団である、請求項１７４に記載の方法。
前記がんワクチンが、１つまたは複数の腫瘍関連抗原を含むペプチドである、請求項１７４に記載の方法。
前記がんワクチンが、腫瘍関連抗原と、脂質と、必要に応じたリンカーとを含む両親媒性ペプチドコンジュゲートであって、生理条件下でアルブミンに結合する両親媒性ペプチドコンジュゲートである、請求項１７４に記載の方法。
前記がんワクチンが、アジュバントをさらに含む、請求項１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１７９に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、請求項１から１４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質または請求項１４７に記載の医薬組成物の有効量と、養子細胞療法薬を含む第２の組成物の有効量とを投与するステップを含み、それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
前記養子細胞療法薬が、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む、請求項１８１に記載の方法。
前記ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む、請求項１８１から１８２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原結合ドメインが、疾患に関連する腫瘍抗原に結合する、請求項１８３に記載の方法。
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０およびＢＣＭＡから選択される、請求項１８３に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞である、請求項１８２から１８５のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１８２から１８５のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物が、腫瘍内投与される、請求項１８２から１８５のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物、および前記第２の組成物が、同時にまたは逐次的に投与される、請求項１７１から１８８のいずれか一項に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、
（ｉ）ヒトＩＬ−２と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−２が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を投与するステップを含み、
それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法であって、必要な対象に、
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の前記一本鎖融合体が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、≧６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を投与するステップを含み、
それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する方法。
（ｉ）ヒトＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の一本鎖融合体と、
（ｉｉ）ヒトルミカン、ヒトＬＡＩＲ１、またはヒトＬＡＩＲ１バリアントと、
（ｉｉｉ）Ｎ＝１〜１０００、１０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、１００〜５００、または２００〜４００である、長さ「Ｎ」アミノ酸を有する親水性ポリペプチドであるリンカーと
を含む、免疫調節融合タンパク質であって、
ＩＬ−１２（ｐ３５）／ＩＬ−１２（ｐ４０）の前記一本鎖融合体が、前記リンカーを介してルミカンまたはＬＡＩＲ１に作動可能に連結されており、前記融合タンパク質が、＞６０ｋＤａである、
免疫調節融合タンパク質の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１９０に記載の方法。
腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合性断片の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１９０から１９２のいずれか一項に記載の方法。
がんワクチンを含む組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１９０から１９３のいずれか一項に記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項１９０から１９４のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１９５に記載の方法。
養子細胞療法薬を含む第２の組成物の有効量を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含み、それによって前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するまたはがんを処置する、請求項１９０から１９６のいずれか一項に記載の方法。
前記養子細胞療法薬が、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む、請求項１９７に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１９８に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または医薬組成物が、腫瘍内投与される、請求項１９０から１９９のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質または前記医薬組成物、および前記第２の組成物が、同時にまたは逐次的に投与される、請求項１９０から２００のいずれか一項に記載の方法。