CN104126009B - 嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内结构域作为胞内结构域；编码所述嵌合抗原受体的核酸；表达所述嵌合抗原受体的细胞；和制备所述细胞的方法。

Description

嵌合抗原受体
技术背景
本发明涉及编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细胞，它们可用于肿瘤的过继免疫基因治疗领域。
背景技术
作为肿瘤的治疗策略，可以预期将能够结合特异性抗原的T细胞受体(TCR)的基因引入任何T细胞，以制备靶向目标抗原的T细胞。根据该策略，已经尝试了过继免疫基因治疗，其使用靶向许多肿瘤抗原的TCR基因，所述抗原例如，WT1、MART1、gp100、CEA、CD19和mHAG HA-2抗原。
作为新的肿瘤过继免疫基因治疗，注意力已经集中在基因-修饰的T细胞治疗上。基因修饰的T细胞治疗包括：将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入T细胞，其中CAR对肿瘤细胞表面抗原具有特异性并具有激活T细胞的能力；离体培养由此获得的引入基因的T细胞；然后将所述细胞注入患者中。该治疗据信具有比抗体药物更强更持久的抗肿瘤效果，并因此非常期待其临床效果。
CAR的代表性结构包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段(scFv)、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3ζ的胞内结构域。具有这种构造的CAR称为第一代CAR。单链可变片段部分的基因分离自例如产生识别靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。表达CAR的T细胞独立于肿瘤细胞上的主要组织相容性抗原I型的表达而直接识别肿瘤细胞表面抗原，并且在同时，激活T细胞并因此表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。
为了增强第一代CAR激活T细胞的能力的目的，已经开发出第二代CAR，其中将作为T细胞的共刺激分子的CD28的胞内结构域与第一代CAR相连接。作为进一步改善的形式，也已经开发出第三代CAR，其中将衍生自作为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的CD137 (4-1BB)或CD134 (OX40)的胞内结构域串联连接到第一代CAR上。因此，已经报道了靶向肿瘤抗原的许多CAR分子(非专利文献1)。然而，用作当前报道的第二代和第三代CAR的胞内结构域的共刺激分子是有限的。已知当连接到CAR上时，衍生自T细胞的每种共刺激分子的胞内结构域并不能一致地强烈刺激T细胞以破坏靶肿瘤细胞。例如，已经报道连接有胞内结构域衍生自CD137的胞内结构域的第二代CAR表现出的细胞毒活性的程度仅与第一代CAR相同，也就是说，该胞内结构域在改善CAR的功能中无效(非专利文献2)。因此，需要找寻新的当连接CAR时是有效的共刺激分子。
作为在T细胞亚群即调节性T细胞上表达的基因而被发现的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)是在细胞表面上的跨膜蛋白受体，并且是TNF受体超家族一个成员(非专利文献3)。已经证明GITR组成型地存在于非活化的T细胞上。GITR结合到称为GITR配体(以下称为GITRL)的另一跨膜蛋白上。已经证明GITR的激动性抗体消除调节性T细胞的免疫抑制活性，这表明GITRL发挥经由GITR而控制调节性T细胞的活性的功能性作用(参见非专利文献4)。
引用文献列表
非专利文献
非专利文献1: Current Opinion in Immunology, 第21卷, 第215-223页(2009)
非专利文献2: J. Immunology, 第172卷, 第104-113页(2004)
非专利文献3: Immunol. Rev., 第182卷, 第18-32页(2001)
非专利文献4: Immunity, 第16卷, 第311-323页(2002)。
发明概述
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供编码CAR的核酸和表达CAR的细胞，所述CAR特异性结合到靶抗原上并将针对靶细胞的高细胞毒活性赋予细胞。
解决问题的方法
本发明人集中地作出努力以解决上述问题，结果发现了表达具有GITR胞内结构域的CAR的细胞特异性结合到靶抗原胞内结构域，并具有针对靶细胞的高细胞毒活性。因此，完成了本发明。
本发明主要涉及以下方面。
[1] 编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内结构域。
[2] 根据[1]的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述抗原是肿瘤抗原。
[3] 根据[1]的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。
[4] 根据[1]的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述胞内结构域进一步包括CD3ζ胞内结构域。
[5] 根据[4]的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的C-末端侧。
[6] 嵌合抗原受体，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。
[7] 根据[6]的嵌合抗原受体，其中所述抗原是肿瘤抗原。
[8] 根据[6]的嵌合抗原受体，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变片段。
[9] 根据[6]的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域进一步包括CD3ζ胞内结构域。
[10]根据[9]的嵌合抗原受体，其中所述GITR的胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的C-末端侧。
[11]制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，所述方法包括将根据[1]至[5]中任一项的核酸引入细胞的步骤。
[12] 根据[11]的制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。
[13]嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了根据[1]至[5]中任一项的核酸。
[14] 根据[13]的嵌合抗原受体表达细胞，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。
发明效果
根据本发明，提供嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的细胞，它们可用于靶向抗原例如肿瘤抗原的过继免疫基因治疗领域。当将本发明的嵌合抗原受体引入细胞时，所述嵌合抗原受体在细胞中的表达量高，并且所述细胞表现出高细胞毒活性。
附图简述
[图1] 图1显示制备用于各实施例的CAR的程序。抗CEA (癌胚抗原)单克隆抗体的scFv显示为“CEA-scFv”，铰链区显示为“CD8铰链”，CD28跨膜结构域显示为“CD28 TM”，CD28胞内结构域显示为“CD28 ICD(胞内结构域)”，CD3ζ胞内结构域显示为“CD3ζ”，末端重复序列显示为 “LTR”，剪接供体序列显示为“SD”，剪接受体序列显示为“SA”，包装信号序列显示为“ψ”。
[图2] 图2显示用于各实施例的CAR的结构。结合抗原的抗体的scFv显示为“scFv”，间隔结构域(spacer domain)显示为“间隔结构域”，CD28跨膜结构域显示为“CD28TM”，CD28胞内结构域显示为“CD28 ICD”，GITR跨膜结构域显示为“GITR TM”，GITR胞内结构域显示为“GITR ICD”，CD3ζ胞内结构域显示为“CD3ζ”。在本说明书中，CDR结构分别缩写为(1) z、(2) 28z、(3) z28、(4) Gz、(5) zG、(6) 28Gz、(7) G28z、(8) zG28、(9) 28zG和(10)z28G。
[图3] 图3显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图4] 图4显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图5] 图5显示CEA与引入CAR的细胞的结合率。
[图6] 图6显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度。
[图7] 图7显示引入CAR的细胞的细胞毒活性。
[图8] 图8显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图9] 图9显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图10] 图10显示引入CAR的细胞的细胞毒活性。
[图11] 图11显示CEA与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图12] 图12显示标记的CEA与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图13] 图13显示产生细胞因子IFNγ的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图14] 图14显示细胞因子IFNγ的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图15] 图15显示产生细胞因子TNFα的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图16] 图16显示细胞因子TNFα的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图17] 图17显示EGFR (表皮生长因子受体)与引入CAR的细胞的结合率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图18] 图18显示标记的EGFR与引入CAR的细胞的结合的荧光强度，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图19] 图19显示产生细胞因子的细胞比率，相对于逆转录病毒拷贝数。
[图20] 图20显示细胞因子的产量，相对于逆转录病毒拷贝数。
具体实施方式
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，新近认识到其表达与细胞癌化相关。检测，例如，肿瘤抗原的免疫学检测可用于区分癌化细胞及其母细胞。本发明中的肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(仅在肿瘤细胞中存在、而在其它正常细胞中不存在的抗原)和肿瘤相关抗原(也存在于其它器官和组织或异质和同种异体的正常细胞中的抗原，或在发育和分化过程中表达的抗原)。
如本文所用，“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)”是指作为糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关基因)的产物的蛋白。GITR是在细胞表面上的跨膜蛋白受体，并且是TNF受体(TNFR)超家族的一个成员。显示GITR组成型地存在于非活化的T细胞上，并结合称为GITR配体(GITRL)的另一跨膜蛋白。GITR的氨基酸序列描述于NCBI参考序列(NCBI RefSeq): NP_004186.1, Curr. Biol.,第9卷, 第4期, 第215-218页(1999)。
如本文所用，“单链可变片段(scFv)”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scFv的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的多种方法是已知的，包括描述于以下文献的方法：美国专利号4694778；Science, 第242卷, 第423-442页(1988)；Nature, 第334卷, 第54454页(1989)；和Science, 第242卷, 第1038-1041页(1988)。
如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区，其独立于其它区而折叠成为特定结构。
(1) 本发明的CAR
本发明的CAR特征在于，它从N-末端侧开始依次包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，并且所述胞内结构域包括GITR的胞内结构域。本发明的CAR在细胞中高水平表达。本发明的表达CAR的细胞具有高增殖率，产生大量细胞因子，并且针对在表面上具有CAR所结合的抗原的细胞具有高细胞毒活性。
(a) 胞外结构域
用于本发明的CAR的“能够结合抗原的胞外结构域”是包含可以结合靶抗原的寡肽或多肽的结构域，并且包括例如抗体的抗原结合结构域和受体的配体结合结构域。该结构域结合抗原(例如细胞表面上存在的抗原)并与之相互作用，并因此将特异性赋予表达CAR的细胞。本发明中的胞外结构域的特别有用的实例包括衍生自抗体(H链和L链)和TCR的可变区(TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ)、CD8α、CD8β、CD11A、CD11B、CD11C、CD18、CD29、CD49A、CD49B、CD49D、CD49E、CD49F、CD61、CD41和CD51的胞外结构域。完整蛋白可被有效使用，然而，具体地讲，可以使用能够结合抗原或配体的结构域，例如，抗体Fab片段、抗体可变区[H链的V区(VH)和L链的V区(VL)]或受体的胞外结构域。尤其是，优选可使用scFv。
本发明CAR的胞外结构域可以是仅结合一个抗原或配体的胞外结构域，或者结合2个或更多个抗原或配体的胞外结构域。另外，本发明同时包括包含一个胞外结构域的CAR和包含2个或更多个胞外结构域的CAR。
胞外结构域可以选自识别靶抗原的抗体或与该抗原相互作用的分子。抗原的实例包括病毒抗原、细菌(尤其是感染性细菌)抗原、寄生虫抗原、在靶细胞上与特定病况相关的细胞表面标志物(例如肿瘤抗原)和免疫相关细胞的表面分子。
作为本发明的一个方面，提供能够结合衍生自以下病毒的抗原的CAR：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒例如HIV-1和HIV-LP)、小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、疱疹性口炎病毒、狂犬病毒、伊波拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、乙肝病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科[例如1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)和疱疹病毒]、痘病毒科(例如天花病毒、痘苗病毒和痘病毒)或丙肝病毒。
作为本发明的另一方面，提供能够结合衍生自以下细菌菌株的抗原的CAR：葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌或沙门氏菌。尤其是，提供能够结合衍生自例如以下感染性细菌的抗原的CAR：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、嗜肺性军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌菌株(例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、禽分枝杆菌(M. avium)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansaii)或M. gordonea)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌(Group AStreptococcus)、B组链球菌(Group B Streptococcus) (无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或破伤风梭菌(Clostridium tetani)。
作为本发明的另一方面，提供能够结合例如以下肿瘤抗原的CAR：5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT (或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190 minor bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、NY-Eso-1或NY-Eso-B。也提供了能够结合细胞表面粘附分子、在自身免疫性疾病中出现的炎性细胞表面分子或导致自身免疫的TCR的CAR。
(b) 胞内结构域
用于本发明的胞内结构域是当相同分子内存在的胞外结构域结合抗原(或与之相互作用)时可将信号传递到细胞内的分子。
本发明的CAR特征在于它包含GITR的胞内结构域作为胞内结构域。GITR的胞内结构域包括具有相同功能的其变体。术语“变体”是指包含一个或几个至多个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体，条件是所述变体基本上保留原始序列所具有的相同功能。本发明所用的GITR的胞内结构域的实例包括包含GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1)的氨基酸编号193-241 (SEQ ID No.: 28)的胞内结构域。
对于本发明的CAR，除了GITR的胞内结构域之外，衍生自其它多肽的胞内结构域也可使用。这样的胞内结构域的实例包括衍生自TCR复合物和共刺激分子的胞质序列和具有与这些序列相同功能的任何变体。
已知仅经由TCR复合物产生的信号不足以激活T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。天然T细胞激活由2类不同胞质信号转导序列传递，也就是说，经由TCR复合物的启动抗原-依赖性初级激活的序列(初级胞质信号转导序列)和以抗原-非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级胞质信号转导序列)。在优选的方面，本发明的CAR包含初级胞质信号转导序列和/或次级胞质信号转导序列作为胞内结构域。
初级胞质信号转导序列调节TCR复合物的初级激活。刺激激活的初级胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM) [Nature,第338卷, 第383-384页(1989)]。另一方面，以抑制方式起作用的初级胞质信号转导序列包含信号转导基序，其已知是基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM) [J Immunol.,第162卷, 第2期, 第897-902页(1999)]。在本发明中，可以使用具有ITAM或ITIM的胞内结构域。
可用于本发明的具有ITAM的胞内结构域的实例包括具有衍生自以下的ITAM的胞内结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。具体地讲，ITAM的实例包括具有以下序列的肽：CD3ζ (NCBI RefSeq: NP_932170.1)的氨基酸编号51-164 (SEQ ID No.: 26)、FcεRIγ (NCBI RefSeq: NP_004097.1)的氨基酸编号45-86、FcεRIβ (NCBI RefSeq: NP_000130.1)的氨基酸编号201-244、CD3γ (NCBI RefSeq: NP_000064.1)的氨基酸编号139-182、CD3δ (NCBI RefSeq: NP_000723.1)的氨基酸编号128-171、CD3ε (NCBI RefSeq: NP_000724.1)的氨基酸编号153-207、CD5 (NCBI RefSeq: NP_055022.2)的氨基酸编号402-495、CD22 (NCBI RefSeq: NP_001762.2)的氨基酸编号707-847、CD79a (NCBI RefSeq: NP_001774.1)的氨基酸编号166-226、CD79b (NCBI RefSeq:NP_000617.1)的氨基酸编号182-229和CD66d (NCBI RefSeq: NP_001806.2)的氨基酸编号177-252，及其与这些肽具有相同功能的变体。根据本文所述的NCBI RefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸编号是根据各蛋白的全长前体(包含信号肽序列等)而编号。
包含可用于本发明的次级胞质信号转导序列的胞内结构域的实例包括衍生自以下的序列：CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS和CD154。其具体实例包括具有以下序列的肽：CD2 (NCBI RefSeq: NP_001758.2)的氨基酸编号236-351、CD4 (NCBIRefSeq: NP_000607.1)的氨基酸编号421-458、CD5 (NCBI RefSeq: NP_055022.2)的氨基酸编号402-495、CD8α (NCBI RefSeq: NP_001759.3)的氨基酸编号207-235、CD8β(GenBank: AAA35664.1)的氨基酸编号196-210、CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1)的氨基酸编号181-220 (SEQ ID No.: 25)、CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP_001552.2)的氨基酸编号214-255、CD134 (OX40, NCBI RefSeq: NP_003318.1)的氨基酸编号241-277和ICOS (NCBI RefSeq: NP_036224.1)的氨基酸编号166-199，及其与这些肽具有相同功能的变体。
本发明包括仅包含GITR的胞内结构域作为胞内结构域的CAR，以及除GITR的胞内结构域之外还包含一个或多个(例如2或3个)胞内结构域的CAR。特别优选的实例包括包含GITR的胞内结构域和CD3ζ的胞内结构域作为胞内结构域的CAR，以及包含GITR的胞内结构域、CD3ζ的胞内结构域和CD28的胞内结构域作为胞内结构域的CAR。本发明也包括包含串联连接的两个或更多个相同胞内结构域的CAR。一方面，本发明提供其中GITR的胞内结构域配置在CD3ζ的胞内结构域的C-末端侧的CAR，即包含从N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域和GITR的胞内结构域的CAR。本发明也包括：通过将CD28的胞内结构域进一步添加到上述CAR而得到的CAR，即包含自N-末端侧开始依次连接的CD28的胞内结构域、CD3ζ的胞内结构域和GITR的胞内结构域的CAR；以及包含自N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域、GITR的胞内结构域和CD28的胞内结构域的CAR。作为另一方面，本发明也包括其中GITR的胞内结构域配置在C-末端侧的CAR。
在包含多个胞内结构域的CAR中，可在胞内结构域之间插入寡肽接头或多肽接头以连接各结构域。优选地，可使用长度为2-10个氨基酸的接头。尤其是，可使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头。
(c)跨膜结构域和间隔结构域
本发明的CAR包含跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或者可以经人工设计。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以得自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可以使用以下的跨膜结构域：T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR。经人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选的是在合成的跨膜结构域的每端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体。任选地，可将短的寡肽接头或多肽接头(例如长度2-10个氨基酸的接头)配置在跨膜结构域和胞内结构域之间，如上(b)所述。尤其是，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
作为本发明的一个方面，具有CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1)的氨基酸编号153-180 (SEQ ID No.: 24)序列的跨膜结构域可用作跨膜结构域。另一方面，可使用具有GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1)的氨基酸编号162-183 (SEQ ID No.: 27)序列的跨膜结构域。
在本发明的CAR中，可将间隔结构域配置在胞外结构域和跨膜结构域之间，或配置在胞内结构域和跨膜结构域之间。间隔结构域是指用于连接跨膜结构域与胞外结构域和/或连接跨膜结构域与胞内结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域包含至多300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，和最优选25-50个氨基酸。
间隔结构域优选地具有促进CAR与抗原结合并增强信号向细胞内转导的序列。预期促进结合的氨基酸的实例包括半胱氨酸、带电荷氨基酸以及在潜在糖基化位点中的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可以用作构成间隔结构域的氨基酸。
作为间隔结构域，可使用完整或部分的：CD8α (NCBI RefSeq: NP_001759.3)铰链区的氨基酸编号118-178 (SEQ ID No.: 23)、CD8β (GenBank: AAA35664.1)的氨基酸编号135-195、CD4 (NCBI RefSeq: NP_000607.1)的氨基酸编号315-396或CD28 (NCBI RefSeq:NP_006130.1)的氨基酸编号137-152。另外，作为间隔结构域，可使用部分的抗体H链或L链的恒定区(CH1区或CL区，例如，具有SEQ ID No.: 34所示的氨基酸序列的肽)。此外，间隔结构域可以是人工合成序列。
可以设计本发明的CAR，以便形成聚合物，尤其是二聚体。例如，将半胱氨酸插入到间隔结构域和/或跨膜结构域，以使CAR多聚化(二聚化)。
此外，在本发明的CAR中，可将信号肽序列连接到N-末端。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的N-末端上，并且长度为15-30个氨基酸。因为上述作为胞内结构域的许多蛋白分子具有信号肽序列，所以该信号肽可用作本发明CAR的信号肽。
(2) 编码CAR的核酸
本发明提供编码以上(1)所述的CAR的核酸。可通过常规方法，自指定CAR的氨基酸序列，容易地制备编码CAR的核酸。编码氨基酸序列的碱基序列可得自上述每个域的氨基酸序列的NCBI RefSeq ID或GenBenk检索号，并且可使用标准分子生物学和/或化学程序制备本发明的核酸。例如，可根据碱基序列合成核酸，并且可通过将使用聚合酶链式反应(PCR)得自cDNA文库的DNA片段组合来制备本发明的核酸。
可将本发明的核酸连接到另一核酸，以便在合适启动子控制之下表达。启动子的实例包括组成型地促进基因表达的启动子，通过药物等(例如四环素或多柔比星)的作用而诱导基因表达的启动子。为了达到核酸的有效转录，也可将本发明的核酸连接到与启动子协作的其它调节元件或转录起始位点，例如包含增强子序列或终止子序列的核酸。除了本发明的核酸之外，也可掺入可为证实核酸表达的标志物的基因(例如抗药性基因、编码报道酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。
本发明提供组合物，其包含作为活性成分的本发明的核酸以及药学上可接受的赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药学上可接受的赋形剂的实例包括磷酸缓冲盐水(例如0.01 M磷酸盐、0.138 M NaCl、0.0027 M KCl、pH 7.4)、含无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐)的水溶液、盐水、乙二醇或乙醇的溶液、以及有机酸的盐(乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐)。也可使用佐剂例如润湿剂或乳化剂以及pH缓冲剂。作为药学上可接受的赋形剂，可以适当使用描述于以下文献的赋形剂：Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N.J. 1991) (其通过引用结合到本文中)。可将本发明的组合物配制成适合胃肠外给药(例如注射或输注)的已知形式。此外，本发明的组合物可包含制剂添加剂，例如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及在贮存期间用于延长有效期的防腐剂。组合物可以呈干燥形式，在使用前用合适的无菌液体重配。对于细颗粒-介导的给药，颗粒例如显微大小的金颗粒可包被DNA。
当将本发明的核酸引入离体的细胞时，除了上述赋形剂之外，可将本发明的核酸与促进核酸向细胞内转移的物质混合，所述物质例如，用于引入核酸的试剂，例如脂质体或阳离子型脂质。或者，也可使用携带本发明核酸的载体，如稍后所述。尤其是，含有合适载体所携带的本发明核酸的适于活体给药形式的组合物适于体内基因治疗。
可给予包含本发明核酸作为活性成分的组合物，用于治疗例如癌症[血癌(白血病)、实体瘤等]、炎性疾病/自身免疫性疾病(哮喘、湿疹)、肝炎、以及诱因为病毒(例如流感和HIV)、细菌或真菌的感染性疾病，例如，结核病、MRSA、VRE或深部真菌病，这取决于由核酸编码的CAR所结合的抗原。可将包含本发明核酸作为活性成分的组合物通过胃肠外给予(例如注射或输注)而皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内给予，或给予输入淋巴管，但是给药途径并未具体限制。
(3)制备表达CAR的细胞的方法
制备本发明的表达CAR的细胞的方法包括将以上(2)所述的编码CAR的核酸引入细胞的步骤。该步骤离体进行。例如，可用携带本发明核酸的病毒载体或非病毒载体来离体转化细胞，以制备本发明的表达CAR的细胞。
在本发明的方法中，可使用来自哺乳动物的细胞(例如人细胞)或来自非人哺乳动物(例如猴、小鼠、大鼠、猪、马或狗)的细胞。用于本发明方法的细胞不受具体限制，任何细胞都可使用。例如，可使用采集、分离、纯化或诱导自体液、组织或器官例如血(外周血、脐带血等)或骨髓的细胞。可使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞[树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)]、脐带血单核细胞、成纤维细胞、脂肪细胞前体、肝细胞、皮肤角质细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、多种癌细胞株或神经干细胞。在本发明中，尤其是，使用T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群是优选的。T细胞的实例包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞。含T细胞和T细胞前体细胞的细胞群包括PBMC。上述细胞可采集自活体，经采集自活体的细胞培养物扩繁而获得，或建立为细胞株。当希望将所产生的CAR表达细胞或分化自所产生的CAR表达细胞的细胞移植到活体中时，优选将核酸引入采集自该活体本身或其同种活体的细胞中。
可将编码本发明CAR的核酸插入载体，并且可将该载体引入细胞。例如，可使用病毒载体例如逆转录病毒载体(包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、Epstein-Barr病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力因而无法在感染细胞中自我复制的病毒载体。
另外，非病毒载体也可与脂质体和缩合剂一起用于本发明，所述缩合剂例如以下文献所述的阳离子型脂质：WO 96/10038、WO 97/18185、WO 97/25329、WO 97/30170和WO97/31934 (其通过引用结合到本文中)。也可通过磷酸钙转导、DEAE-葡聚糖、电穿孔或粒子轰击，将本发明的核酸引入细胞。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可通过根据载体所具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒，来进行本发明的方法。包装细胞的实例包括PG13 (ATCC CRL-10686)、PA317 (ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12 (美国专利号5,278,056)和Psi-Crip [Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America, 第85卷, 第6460-6464页(1988)]。也可使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。根据逆转录病毒而产生的许多种类的逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞是许多公司广泛市售的。
在将核酸引入细胞的步骤中，也可使用改善引入效率的功能性物质[例如WO 95/26200和WO 00/01836 (其通过引用结合到本文中)]。改善引入效率的物质的实例包括具有与病毒载体结合能力的物质，例如，纤连蛋白和纤连蛋白片段。优选地，可使用具有肝素结合位点的纤连蛋白片段，例如，作为RetroNetcin (注册商标, CH-296, 由TAKARA BIOINC.制造)市售的片段。另外，可以使用polybrene (其是合成的聚阳离子，具有改善逆转录病毒感染细胞的效率的作用)、成纤维细胞生长因子、V型胶原、聚赖氨酸或DEAE-葡聚糖。
在本发明的优选方面，功能性物质可以以固定在合适固相上的状态使用，所述固相例如细胞培养容器(板、培养皿、瓶或袋)或载体(微珠等)。
(4)表达CAR的细胞
本发明的表达CAR的细胞是这样的细胞：其中已引入以上(2)所述的编码CAR的核酸并且由以上(3)所述的制备方法而表达。
本发明的细胞经由CAR结合特异性抗原，从而将信号传递到细胞中，作为结果，所述细胞被激活。表达CAR的细胞的激活因宿主细胞和CAR胞内结构域的种类不同而异，并且可根据例如以下而得以证实：细胞因子的释放，细胞增殖率的改善，细胞表面分子的改变等作为指标。例如，自活化的细胞的细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)的释放导致表达抗原的靶细胞的破坏。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子的改变刺激其它免疫细胞，例如，B细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可用作疾病的治疗药。所述治疗药包含表达CAR的细胞作为活性成分，并且可进一步包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括上述用于包含本发明核酸作为活性成分的组合物的药学上可接受的赋形剂、不同细胞培养基和等渗氯化钠。给予表达CAR的细胞所针对的疾病不受具体限制，只要该疾病显示出对该细胞的敏感性即可。疾病的实例包括癌症[血癌(白血病)、实体瘤等]、炎性疾病/自身免疫性疾病(哮喘、湿疹)、肝炎、以及诱因为病毒(例如流感和HIV)、细菌或真菌的感染性疾病，例如，结核病、MRSA、VRE或深部真菌病。给予本发明的表达CAR的细胞以治疗上述疾病，其中本发明的表达CAR的细胞与希望减少或消除的细胞所具有的抗原(即肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原等)结合，以治疗所述疾病。本发明的细胞也可用于在骨髓移植或暴露给辐射之后预防感染性疾病，用于以缓解复发性白血病等为目的的供体淋巴细胞输注。包含表达CAR的细胞作为活性成分的治疗药可以通过胃肠外给予(例如注射或输注)而皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内给予，或给予输入淋巴管，但是给药途径不受具体限制。
实施例
以下通过实施例更具体地解释本发明，但本发明并不受以下实施例的限定。
在本文所述的程序中，根据以下文献所述的方法进行基本程序：MolecularCloning: A Laboratory Manual 第3版, 编辑：T. Maniatis等人, 出版：Cold SpringHarbor Laboratory，2001 (其通过引用结合到本文中)。
实施例1 抗CEA-CAR表达载体的制备
首先，进行PCR，使用SEQ ID NO: 1所示的3MSCV5引物和SEQ ID NO: 2所示的3MSCV3引物，使用pMSCVneo (由Clontech制造)作为模板，以扩增MSCV3’ LTR位点。由此得到的扩增片段用限制酶XhoI和EcoRI切割，并克隆到pM载体[pM载体，描述于Gene Therapy第7卷, 第797-804页(2000)]的XhoI-EcoRI位点中，以制备pMS-MC。此外，将pMEI-5载体(由TAKARA BIO INC.制造)用限制酶MluI和XhoI切割，并插入到pMS-MC的MluI-XhoI位点中，以制备pMS3-MC。PMS3-MC含有衍生自MMLV的5’LTR、衍生自MMLV的SD、衍生自MMLV的ψ、衍生自人EF1α基因的SA和由衍生自MSCV的U3区组成的3’LTR以及衍生自MMLV的其它区，其顺序是从5’端开始。
如图1A和1B所示，制备了SEQ ID NO: 3所示的碱基序列的人工合成基因(在图1A中，称为抗CEA-28z-CAR)和SEQ ID NO: 4所示的碱基序列的人工合成基因(在图1B中，称为抗CEA-z28-CAR)。这些人工合成基因编码一个分子的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由以下组成：结合癌抗原CEA (癌胚抗原)的抗CEA单克隆抗体的scFv (其氨基酸序列由SEQ ID NO: 22所示)、具有SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列的CD8α链铰链结构域、具有SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，具有SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列的CD28胞内结构域和具有SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的CD3ζ胞内结构域。在图1中，抗CEA单克隆抗体的scFv被称为“CEA-scFv”，铰链结构域被称为“CD8铰链”，跨膜结构域被称为“CD28 TM”，CD28胞内结构域被称为“CD28 ICD (胞内结构域)”，CD3ζ胞内结构域被称为“CD3ζ”，末端重复序列被称为“LTR”，剪接供体序列被称为“SD”，剪接受体序列被称为“SA”，包装信号序列被称为“ψ”。将包含这些人工合成基因的核酸片段克隆到用BglII-BamHI消化的pMS3-MC载体，以制备：表达CAR的pMS3-CEA-28z-CAR载体，其中CD28胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的N-末端侧；以及表达CAR的pMS3-CEA-z28-CAR载体，其中CD3ζ胞内结构域配置在CD28胞内结构域的N-末端侧。
实施例2 携带GITR基因的CAR表达载体的制备
制备SEQ ID NO: 5所示的人工合成基因。该人工合成基因编码具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的GITR跨膜结构域和具有SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列的GITR胞内结构域。使用该人工合成基因作为模板，进行PCR，使用SEQ ID NO: 6所示的28TM-G-F引物和SEQ ID NO: 7所示的G-z-R引物，以获得扩增的DNA片段A；进行PCR，使用SEQ ID NO: 8所示的z-G-F引物和SEQ ID NO: 9所示的G-MC-R引物，以获得扩增的DNA片段B；进行PCR，使用SEQ ID NO: 10所示的28SD-G-F引物和SEQ ID NO: 7所示的G-z-R引物，以获得扩增的DNA片段C；进行PCR，使用SEQ ID NO: 11所示的铰链-G-F引物和SEQ ID NO: 12所示的G-28SD-R引物，以获得扩增的DNA片段D；和进行PCR，使用SEQ ID NO: 8所示的z-G-F引物和SEQ ID NO: 13所示的G-28SD-R2引物，以获得扩增的DNA片段E。
使用实施例1中制备的pMS3-CEA-28z-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQ IDNO: 14所示的28TM-R引物和SEQ ID NO: 15所示的z-F引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段A，使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (由Clontech制造)，以制备pMS3-CEA-Gz-CAR载体。
同样，使用实施例1中制备的pMS3-CEA-z28-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQID NO: 16所示的z-R引物和SEQ ID NO: 17所示的END-MC-F引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段B，以制备pMS3-CEA-zG-CAR载体。该载体表达的CEA-zG-CAR的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 29。
使用pMS3-CEA-28z-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQ ID NO: 18所示的28SD-R引物和SEQ ID NO: 15所示的z-F引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段C，以制备pMS3-CEA-28Gz-CAR载体。
使用pMS3-CEA-28z-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQ ID NO: 19所示的铰链-R引物和SEQ ID NO: 20所示的28SD-F引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段D，以制备pMS3-CEA-G28z-CAR载体。
使用pMS3-CEA-z28-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQ ID NO: 16所示的z-R引物和SEQ ID NO: 21所示的28SD-F2引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段E，以制备pMS3-CEA-zG28-CAR载体。该载体表达的CEA-zG28-CAR的氨基酸序列示于SEQ IDNO: 30。
使用pMS3-CEA-28z-CAR载体作为模板，进行PCR，使用SEQ ID NO: 16所示的z-R引物和SEQ ID NO: 17所示的END-MC-F引物。向由此获得的扩增产物中克隆扩增的DNA片段B，以制备pMS3-CEA-28zG-CAR载体。
由所制备的载体表达的CAR结构分别对应于图2中所示的结构(2)至(9)。也就是说，pMS3-CEA-28z-CAR载体表达具有(2) 28z的结构的CAR，pMS3-CEA-z28-CAR载体表达具有(3) z28的结构的CAR，pMS3-CEA-Gz-CAR载体表达具有(4) Gz的结构的CAR，pMS3-CEA-zG-CAR载体表达具有(5) zG的结构的CAR，pMS3-CEA-28Gz-CAR载体表达具有(6) 28Gz的结构的CAR，pMS3-CEA-G28z-CAR载体表达具有(7) G28z的结构的CAR，pMS3-CEA-zG28-CAR载体表达具有(8) zG28的结构的CAR，和pMS3-CEA-28zG-CAR载体表达具有(9) 28zG的结构的CAR。
实施例3 逆转录病毒溶液的制备
用实施例1和2中制备的质粒载体转化大肠杆菌JM109，以获得转化体。使用QIAGENPlasmid Midi Kit (由Qiagen制造)，纯化这些转化体所携带的质粒DNA，并将其作为用于转染的DNA进行以下步骤。
将由此制备的用于转染的DNA以及Retrovirus Packaging Kit Eco (由TAKARABIO INC.制造)中含有的pGP载体和pEeco载体转染到293T细胞中。根据该试剂盒的产品方案进行该操作。从由此获得的各转化细胞得到含有亲嗜性病毒的上清液，并用0.45 μm滤器(Milex HV, 由Millipore制造)过滤。使用该上清液，通过使用polybrene的方法，用亲嗜性病毒感染PG13细胞(ATCC CRL-10686)。回收由此获得的细胞培养上清液，并用0.45 μm滤器过滤，以获得逆转录病毒溶液，用于表达抗CEA-CAR。根据病毒表达的CAR结构，各病毒分别称为(2) CEA-28z，(3) CEA-z28，(4) CEA-Gz，(5) CEA-zG，(6) CEA-28Gz，(7) CEA-G28z，(8) CEA-zG28，和(9) CEA-28zG。
实施例4 抗CEA-CAR逆转录病毒感染人PBMC - 1
外周血单核细胞(PBMC)分离自获得知情同意后采集的人外周血，通过标准方法，使用RetroNectin (注册商标, 由TAKARA BIO INC.制造)，用实施例3中制备的用于表达抗CEA-CAR的各种逆转录病毒溶液对PBMC感染两次，以制备表达各种抗CEA-CAR的PBMC。对于每种逆转录病毒溶液，制备3组PBMC，并使用3个系列稀释液(2倍、4倍和8倍稀释液)的逆转录病毒溶液进行感染。第二次病毒感染后5天，使用FastPure DNA Kit (由TAKARA BIOINC.制造)自感染的细胞提取基因组DNA。使用Provirus Copy Number Detection PrimerSet, Human (由TAKARA BIO INC.制造)和CycleavePCR Core Kit (由 TAKARA BIO INC.制造)，测定掺入基因组的逆转录病毒的拷贝数。
另外，第二次病毒感染后3天，将使用Biotin-Labeling Kit-NH2 (由DOJINDOLABORATORIES制造)进行了生物素标记的CEA蛋白加入到感染的细胞中，接着用链霉抗生物素-PE (藻红蛋白: 由Becton Dickinson制造)和FITC-标记的抗人CD8抗体(由BectonDickinson制造)染色。使用流式细胞仪，对染色的细胞测定在FITC-阳性细胞中的PE-阳性细胞比率，也就是说，在CD8-阳性细胞中对于结合CEA的CAR而言阳性的细胞比率。另外，测定荧光染料PE的平均荧光强度。平均荧光强度反映出在抗CEA-CAR-阳性细胞中的抗CEA-CAR的表达量。结果证实了，在所有细胞中，细胞表面上的CAR是阳性的。尤其是，与用(4)CEA-Gz感染的细胞相比，用(5) CEA-zG感染的细胞具有较高的抗CEA-CAR阳性率和较高的平均荧光强度。关于用(2) CEA-28z、(3) CEA-z28和(5) CEA-zG感染的细胞，抗CEA-CAR-阳性率(纵轴)和掺入基因组的逆转录病毒拷贝数(横轴)之间的关系示于图3，衍生自生物素标记的CEA蛋白阳性细胞的PE的平均荧光强度(纵轴)和掺入基因组的逆转录病毒拷贝数(横轴)之间的关系示于图4。如图3和图4所示，发现与其它引入抗CEA-CAR的没有GITR胞内结构域的PBMC相比，其中引入抗CEA-zG-CAR [(5) CEA-zG]的PBMC具有较高的抗CEA-CAR-阳性率并且也具有较高的抗CEA-CAR表达量。
实施例5 抗CEA-CAR逆转录病毒感染人PBMC - 2
在获得知情同意后采集人PBMC，通过标准方法，使用RetroNectin (注册商标, 由TAKARA BIO INC.制造)，用实施例3中制备的用于表达抗CEA-CAR的逆转录病毒溶液对PBMC感染两次，所述病毒溶液为：(2) CEA-28z的4倍、6倍或8倍稀释液，(5) CEA-zG的未稀释的溶液或2倍或4倍稀释液，或(9) CEA-28zG或(8) CEA-zG28的2倍、4倍或8倍稀释液，以制备表达各抗CEA-CAR的PBMC。第二次病毒感染后6天，回收感染的细胞，并按照与实施例4相同的方式对其测定掺入基因组的病毒拷贝数。选择具有相对接近的逆转录病毒拷贝数的抗CEA-CAR-表达细胞[(2) CEA-28z: 0.27拷贝，(5) CEA-zG: 1.3拷贝，(9) CEA-28zG: 0.81拷贝，(8) CEA-zG28: 0.65拷贝]，然后对其进行染色并按照与实施例4相同的方式测量其在CD8-阳性细胞中的抗CEA-CAR阳性细胞比率和PE的平均荧光强度。图5显示抗CEA-CAR阳性率，图6显示阳性细胞的PE平均荧光强度。如图5和图6所示，发现与用(2) CEA-28z感染的细胞相比，用(5) CEA-zG、(9) CEA-28zG和(8) zG28感染的细胞具有较高的表达抗CEA-CAR的细胞比率并且也具有较高的抗CEA-CAR表达量。
另外，第二次病毒感染后11天，回收感染的细胞并通过Calsein释放测定，在96孔板上测量细胞毒活性。当将Calsein-AM (由DOJINDO LABORATORIES制造)掺入CEA-阳性细胞株MKN-45和CEA-阴性细胞株MKN-1 (这两种都可得自RIKEN BioResource Center)之后，加入1.0 × 105细胞/mL细胞株悬液，其量为100 μL/孔。另外，将如上所述的引入抗CEA-CAR的PBMC和作为对照的未引入载体的PBMC (NGMC)悬浮，并将100 μL悬液加入孔中，使ET比例为30、10、3或1。向孔中加入100 μL培养基以代替PBMC的孔作为低对照(Low control)，或加入100 μL 0.1% Triton X-100以代替PBMC的孔作为高对照(High control)，进行制备。制备了细胞和对照之后，将96孔板在用5.0% CO2气体平衡的CO2培养箱中在37ºC孵育4小时。然后对100 μL上清液在λex=490 nm和λem=515 nm处测定荧光强度，并测量释放的Calsein的量。通过下式求出细胞毒活性(细胞溶解)，结果见图7。
细胞毒活性(%)=100×(各孔测量值-低对照测量值)/(高对照测量值–低对照测量值)
如图7所示，在CEA-阳性细胞株MKN-45中观察了引入抗CEA-CAR的PBMC的细胞毒活性。尤其是，引入(5) CEA-zG的PBMC、引入(9) CEA-28zG的PBMC和引入(8) CEA-zG28的PBMC表现出强的细胞毒活性，并且发现具有GITR的胞内结构域的CAR可用于治疗癌症。
实施例6 CEA-zG28的再次制备和逆转录病毒溶液的制备
因为在用于实施例5的CEA-zG28的CD28胞内结构域的编码区中发现移码，制备了其中该移码已被修复的质粒DNA，并使用QIAGEN Plasmid Midi Kit (由Qiagen制造)将其纯化。使用该纯化的质粒DNA作为用于转染的DNA，按照与实施例3相同的方式制备病毒溶液。由此获得的逆转录病毒溶液称为(8) CEA-zG28_r。
实施例7 抗CEA-CAR逆转录病毒载体感染人PBMC-3
在获得知情同意后采集人PBMC，用实施例6中制备的(8) CEA-zG28_r或(9) CEA-28zG的未稀释的溶液或2倍、4倍或8倍稀释液感染所述PBMC，然后按照与实施例4相同的方式，对其测量掺入基因组的病毒拷贝数、在CD8-阳性细胞中的抗CEA-CAR阳性细胞比率和PE的平均荧光强度。图8显示相对于拷贝数的抗CEA-CAR阳性率。图9显示相对于拷贝数的PE平均荧光强度。如图8和图9所示，证实了用(8) CEA-zG28_r感染的细胞表达抗CEA-CAR。
另外，第二次病毒感染后6天，选择具有相对接近的逆转录病毒拷贝数的抗CEA-CAR表达细胞[(9) CEA-28zG: 2.22拷贝，(8) CEA-zG28_r: 2.12拷贝]并回收，然后按照与实施例5相同的方式测定针对CEA-阳性细胞株MKN-45和CEA-阴性细胞株MKN-1的细胞毒活性。结果见图10。如图10所示，每种引入抗CEA-CAR的PBMC都表现出针对CEA-阳性细胞株MKN-45的类似的细胞毒活性。
实施例8 抗CEA-CAR逆转录病毒载体感染人PBMC-4
制备实施例3中制备的(5) CEA-zG和(9) CEA-28zG的未稀释的溶液和2倍、4倍和8倍稀释液，以及实施例3中制备的(2) CEA-28z的未稀释的溶液和2倍、4倍、8倍和16倍稀释液。在获得知情同意后采集人PBMC，通过标准方法，使用上述逆转录病毒载体稀释液和RetroNectin (注册商标)，对所述PBMC感染两次，以制备表达各抗CEA-CAR的PBMC。第二次病毒感染后5天，回收感染的细胞，并按照与实施例4相同的方式对其测定掺入基因组的病毒拷贝数、在CD8-阳性细胞中的抗CEA-CAR阳性细胞比率和PE的平均荧光强度。图11显示相对于拷贝数的抗CEA-CAR阳性率。图12显示相对于拷贝数的PE平均荧光强度。如图11和图12所示，相对于拷贝数的表达抗CEA-CAR的细胞比率在所有情况下都是类似的，和(5) CEA-zG表现出相对于拷贝数的最高的PE平均荧光强度，也就是说，最高表达量。
另外，第二次病毒感染后6天，回收感染的细胞，并如下所述地在96孔板中对其进行胞内细胞因子染色。将如上所述的引入抗CEA-CAR的PBMC悬浮在含胞内转运抑制剂布雷菲德菌素A (由Sigma制造)的培养基中，至1.0 × 106细胞/mL。将该悬液以100 μL/孔的量加入板中。此外，将100 μL 1.0 × 106细胞/mL CEA-阳性细胞株MKN-45的悬液加入孔中，并共培养5小时。共培养的细胞用APCcy7-标记的抗人CD8抗体(由Becton Dickinson制造)染色，用IntraPrep试剂(由Beckman Coulter制造)处理，然后再用PE-标记的抗人IFNγ抗体(由Beckman Coulter制造)和APC-标记的抗人TNFα抗体(由eBioscience制造)染色。使用流式细胞仪，对染色的细胞测定在CD8-阳性细胞中的IFNγ产生细胞比率和荧光染料PE的平均荧光强度，并且也测定在CD8-阳性细胞中的TNFα产生细胞比率和荧光染料APC的平均荧光强度。平均荧光强度反映了在抗CEA-CAR阳性细胞中IFNγ和TNFα的胞内细胞因子量。
图13显示IFNγ产生细胞比率(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系。图14显示PE平均荧光强度(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系。如图13所示，与(2)CEA-28z相比，(9) CEA-28zG表现出较低的IFNγ产率。然而，如图14所示，证实了(9) CEA-28zG表现出IFNγ产量相当于(2) CEA-28z的产量。也就是说，对于IFNγ产生细胞中的IFNγ产量，在引入(9) CEA-28zG的细胞中较高。
同样，图15显示TNFα产生细胞比率(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系，和图16显示APC平均荧光强度(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系。如图15所示，与(2) CEA-28z相比，(9) CEA-28zG表现出较低TNFα产率。然而，如图16所示，(9) CEA-28zG表现出较高的TNFα产量。也就是说，类似于IFNγ的情况，引入(9) CEA-28zG的细胞导致在TNFα产生细胞中较高的TNFα产量。
因此，发现了可以通过在具有CD28胞内结构域的CAR中进一步装载GITR胞内结构域而产生具有增强的产生细胞因子的能力的细胞。
实施例9 抗EGFR-CAR表达逆转录病毒载体的制备
制备了SEQ ID NO: 31所示的碱基序列的人工合成基因。该人工合成基因编码是抗EGFR-CAR的EGFR-z，即一分子的嵌合蛋白，其由以下组成：具有SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列的人IgG前导序列、具有SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列的结合癌抗原EGFR (表皮生长因子受体)的抗EGFR单克隆抗体的scFv、具有SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列的人IgG-LC (轻链恒定区)结构域、具有SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的CD28跨膜结构域和具有SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的CD3ζ胞内结构域。将包含该人工合成基因的核酸片段克隆到用NotI-XhoI消化的pMS3-MC载体中，以制备表达仅具有CD3ζ胞内结构域作为胞内结构域的(1) EGFR-z的pMS3-EGFR-LC-z-CAR。CAR的结构对应于图2中的(1)。
实施例10 携带GITR基因的抗EGFR-CAR表达载体的制备
根据实施例9中制备的pMS3-EGFR-LC-z-CAR，制备表达具有SEQ ID NO: 35所示的氨基酸序列的(2) EGFR-28z的pMS3-EGFR-LC-28z-CAR。同样，制备了表达具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的(5) EGFR-zG的pMS3-EGFR-LC-zG-CAR，表达具有SEQ ID NO: 37所示的氨基酸序列的(9) EGFR-28zG的pMS3-EGFR-LC-28zG-CAR，表达具有SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列的(10) EGFR-z28G的pMS3-EGFR-LC-z28G-CAR，和表达具有SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列的(7) EGFR-G28z的pMS3-EGFR-LC-G28z-CAR。这些CAR的结构分别对应于图2中的(2)、(5)、(9)、(7)和(10)。
实施例11 逆转录病毒溶液的制备
按照与实施例3相同的方式，自实施例9和10中制备的质粒载体制备病毒溶液。根据病毒所表达的CAR的结构，相应的病毒命名为(1) EGFR-z，(2) EGFR-28z，(5) EGFR-zG，(9) EGFR-28zG，(10) EGFR-z28G和(7) EGFR-G28z。
实施例12 抗EGFR-CAR逆转录病毒载体感染人PBMC
在获得知情同意后采集人PBMC，通过标准方法，使用RetroNectin (注册商标)，用实施例11中制备的各病毒溶液的未稀释的溶液或2倍、4倍或8倍稀释液对所述PBMC感染两次，以制备表达各抗EGFR-CAR的PBMC。
第二次病毒感染后5天，将其C末端被His-标签修饰的重组人EGFR (由SinoBiological制造)加入到感染的细胞中，然后加入生物素标记的抗His-标签抗体(由Miltenyi Biotec K.K.制造)。然后，将细胞用链霉抗生物素-PE (藻红蛋白: 由BectonDickinson制造)和FITC-标记的抗人CD8抗体(由Becton Dickinson制造)染色。使用流式细胞仪，对染色的细胞测定在FITC-阳性细胞中的PE-阳性细胞比率，即在CD8-阳性细胞中的结合EGFR的CAR阳性细胞比率。另外，测定了荧光染料PE的平均荧光强度。此外，在第二次病毒感染后5天回收感染的细胞，并按照与实施例4相同的方式对其测定掺入基因组的病毒拷贝数。图17显示相对于逆转录病毒拷贝数的抗EGFR-CAR阳性细胞比率。图18显示相对于逆转录病毒拷贝数的PE平均荧光强度。如图17和图18所示，证实了所有抗EGFR-CAR的表达。
另外，第二次病毒感染后6天，回收感染的细胞，除了使用EGFR-阳性细胞株Hela之外，按照与实施例8相同的方式对其进行胞内细胞因子染色。除了IFNγ和TNFα之外，用FITC-标记的抗人IL-2 (由Becton Dickinson制造)对IL-2进行染色。使用流式细胞仪，对染色的细胞测定产生各细胞因子的细胞比率和荧光染料的平均荧光强度。平均荧光强度反映了在抗CEA-CAR-阳性细胞中IL-2、IFNγ和TNFα的胞内细胞因子量。
图19显示产生各细胞因子的细胞比率(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系。图20显示平均荧光强度(各细胞因子的产量)(纵轴)相对于逆转录病毒拷贝数(横轴)的关系。如图19和图20所示，发现与CAR表达量相比，携带GITR的胞内结构域的CAR趋向于表现出较高细胞因子产量。
工业应用性
根据本发明，提供了特异性结合靶抗原并将针对靶细胞的高细胞毒活性赋予细胞的CAR、编码该CAR的核酸和表达该CAR的细胞。该CAR、核酸和细胞可用于靶向抗原(例如肿瘤抗原)的过继免疫基因治疗领域。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1: 3MSCV5引物
SEQ ID NO:2: 3MSCV3引物
SEQ ID NO:3:抗CEA-28z-CAR片段序列
SEQ ID NO:4:抗CEA-z28-CAR片段序列
SEQ ID NO:5: GITR跨膜区和胞质结构域编码序列
SEQ ID NO:6: 28TM-G-F引物
SEQ ID NO:7: G-z-R引物
SEQ ID NO:8: z-G-F引物
SEQ ID NO:9: G-MC-R引物
SEQ ID NO:10: 28SD-G-F引物
SEQ ID NO:11: 铰链-G-F引物
SEQ ID NO:12: G-28SD-R引物
SEQ ID NO:13: G-28SD-R2引物
SEQ ID NO:14: 28TM-R引物
SEQ ID NO:15: z-F引物
SEQ ID NO:16: z-R引物
SEQ ID NO:17: END-MC-F引物
SEQ ID NO:18: 28SD-R引物
SEQ ID NO:19: 铰链-R引物
SEQ ID NO:20: 28SD-F引物
SEQ ID NO:21: 28SD-F2引物
SEQ ID NO:22:抗CEA scFv
SEQ ID NO:23: 人CD8 α链铰链区
SEQ ID NO:24: 人CD28跨膜结构域
SEQ ID NO:25: 人CD28胞质结构域
SEQ ID NO:26: 人CD3ζ链胞质结构域
SEQ ID NO:27: 人GITR跨膜结构域
SEQ ID NO:28: 人GITR胞质结构域
SEQ ID NO:29: 抗CEA-zG-CAR序列
SEQ ID NO:30: 抗CEA-zG28-CAR序列
SEQ ID NO:31: 抗EGFR-LC-z-CAR编码序列
SEQ ID NO:32: 人IgG前导序列
SEQ ID NO:33: 抗EGFR单克隆抗体scFv序列
SEQ ID NO:34: 人IgG CL序列
SEQ ID NO:35: 抗EGFR-28z-CAR序列
SEQ ID NO:36: 抗EGFR-zG-CAR序列
SEQ ID NO:37: 抗EGFR-28zG-CAR序列
SEQ ID NO:38: 抗EGFR-z28G-CAR序列
SEQ ID NO:39: 抗EGFR-G28z-CAR序列。

Claims (10)

1.编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞内结构域为自N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体简称GITR的胞内结构域；自N-末端侧开始依次连接的CD28的胞内结构域、CD3ζ的胞内结构域和GITR的胞内结构域；或者，自N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域、GITR的胞内结构域和CD28的胞内结构域。
2.权利要求1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述抗原是肿瘤抗原。
3.权利要求1的编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变区片段。
4.嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞内结构域为自N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体简称GITR的胞内结构域；自N-末端侧开始依次连接的CD28的胞内结构域、CD3ζ的胞内结构域和GITR的胞内结构域；或者，自N-末端侧开始依次连接的CD3ζ的胞内结构域、GITR的胞内结构域和CD28的胞内结构域。
5.权利要求4的嵌合抗原受体，其中所述抗原是肿瘤抗原。
6.权利要求4的嵌合抗原受体，其中所述能够结合抗原的胞外结构域是结合抗原的抗体的单链可变区片段。
7.制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，所述方法包括将权利要求1-3中任一项的核酸引入细胞的步骤，该步骤离体进行。
8.权利要求7的制备嵌合抗原受体表达细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。
9.嵌合抗原受体表达细胞，其中引入了权利要求1-3中任一项的核酸。
10.权利要求9的嵌合抗原受体表达细胞，其中所述细胞是T细胞或含有T细胞的细胞群。
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