KR20200055037A - 키메라 항원 수용체 t 세포 요법을 위한 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

키메라 항원 수용체 t 세포 요법을 위한 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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KR20200055037A
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cells
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amphiphilic
tumor
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다렐 제이. 어바인
러위앤 마
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 개시내용은 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드, 지질 (디아실 지질), 링커 (친수성 중합체, 친수성 아미노산, 폴리사카라이드)를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 설명하고, 예를 들어, CAR 발현 세포의 증식을 자극하기 위해, 구축물을 사용하는 방법 및 조성물이 청구된다.

Description

키메라 항원 수용체 T 세포 요법을 위한 조성물 및 그의 용도
관련 정보 단락
본 출원은 2017년 9월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/560,588의 우선일의 이익을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
면역요법을 이용한 암의 임상 치료에서 극적인 진보가 일어나고 있다. 현재까지 개발된 가장 강력한 치료법 중 하나는 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포 또는 CAR-T)를 사용한 입양 세포 요법이다. CAR-T는 항원-결합 도메인을 T 세포 수용체 복합체로부터의 CD3 시그널링 쇄, 및 T 세포 활성화 동안 지지 시그널을 제공하는 다수의 널리 공지된 공동-수용체 중 하나로부터의 공동자극성 도메인과 융합시킴으로써 형성된 합성 항원 수용체로 형질도입된 환자로부터의 자가 림프구이다. CAR-T 세포는 혈액 악성종양에서 극적인 완전 반응을 보였으며, FDA는 최근에 B 세포 백혈병의 치료를 위한 CAR-T 요법을 승인하였다.
그러나, CAR-T 세포는 현재, 환자에게 단순히 주입되고, 생체내 종양 세포의 접촉을 제외하고는 부가적인 자극을 받지 않으며, 이들의 완전한 이펙터 기능을 촉진시키기 위해 T 세포에 정상적으로 제공되는 많은 주요 시그널링 큐가 결여된다. 또한, CAR-T 세포는 일부 환자에서 기능적으로 지속되지 않으며, 고형 종양에서 일반적으로 불량한 반응을 나타낸다. 따라서, CAR-T 세포 요법을 개선시키는 작용제가 필요하다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드가, 인간 혈청 알부민에 결합하고 상주 항원 제시 세포 (APC)의 막으로 분할되는 양친매성 접합체의 사용에 의해 림프절에 효율적으로 전달되며, 이로써 천연 시토카인/수용체 공동-자극 시그널과 함께 세포 표면 상에 CAR-T 세포 리간드를 공동-디스플레이한다는 발견을 기반으로 한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이러한 양친매성 접합체의 이중 특성 (즉, 림프절 표적화 및 막 삽입)이 조합하여, CAR-T 세포에 대한 부스터 백신을 가능하게 하여 CAR-T 세포를 생체내에서 효율적으로 확장시키고, 그의 기능성을 증가시키며, 항종양 활성을 증강시키는 것으로 여겨진다.
태그 또는 종양-연관 항원 중 하나를 포함하는 양친매성 리간드 접합체는 태그 또는 종양-연관 항원 결합 도메인, 또는 둘 다를 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포의 증식을 활성화시키고 유도한 것으로 입증되었다. 특히, 이러한 양친매성 리간드 접합체는 생체내에서 이러한 활성을 유지하였으므로, 대상체에게 투여된 후 CAR-T 세포의 확장 및 활성화를 허용하였다. 추가로, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체의 투여는 또한, 종양내로의 CAR-T 침윤을 상당히 증가시켰으며, 종양-침윤성 CAR-T 세포는 체크포인트 억제제 PD1 및 TIM3의 표면 발현에도 불구하고 종양 세포에 대항하여 증강된 반응성을 나타냈다. CAR-T 세포 요법과 함께 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체로 처리하면, 종양 성장이 현저하게 지연되었고 생존이 연장되었다.
본 개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체가 고형 종양에서 나타난 CAR-T 세포의 불량한 반응을 극복한다는 발견을 기반으로 한다. 본원에 입증된 바와 같이, 종양-연관 항원을 발현하는 CAR-T 세포의 투여는 대조군 및 CAR-T 세포 단독과 비교해서, 양친매성 리간드 접합체와 조합하여 투여될 때 고형 종양의 종양 성장을 지연시킬 수 있었고 종양-보유 마우스의 생존을 증가시킬 수 있었다.
추가로, 본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체와 조합되는 CAR-T 세포 요법의 증강된 효능이 림프충만 조건에서 유지된다는 발견을 기반으로 한다. 현재의 CAR-T 세포 요법은 심각한 독성과 연관되는 림프고갈을 필요로 한다. 본원에 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체와 조합되는 CAR-T 세포 요법은 종양 성장을 지연시켰고, 림프충만 종양-보유 마우스의 생존을 증가시켰다. 이와 같이 지연된 종양 성장 및 증가된 생존은 동일한 치료 레지멘을 받은 림프고갈된 마우스와 거의 동등한 수준이었다. 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 이들 결과는 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체의 투여가 CAR-T 세포 요법 전에 림프고갈에 대한 필요성을 무효화하며, 이로써 대상체에서 독성을 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 한 측면에서 본 개시내용은 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드 및 CAR 리간드에 작동가능하게 연결된 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다. 일부 측면에서, 지질은 생리학적 조건 하에서 세포 막에 삽입된다. 일부 측면에서, 지질은 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합한다. 일부 측면에서, 지질은 생리학적 조건 하에서 세포 막에 삽입되고 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합한다. 일부 측면에서, 양친매성 리간드 접합체는 림프절로 트래픽킹되어 상주 항원 제시 세포 (APC)의 세포 막 내로 삽입되는 지질을 포함하며, 이로써 천연 시토카인/수용체 공동-자극 시그널과 함께 세포 표면 상에 CAR-T 세포 리간드를 공동-디스플레이한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 디아실 지질을 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 12-30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 14-25개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 16-20개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 18개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 양친매성 리간드 접합체는 링커를 통해 지질에 작동가능하게 연결된 CAR 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 링커는 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 링커는 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 링커를 통해 디아실 지질에 작동가능하게 연결된 CAR 리간드를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 디아실 지질은 12-30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함하고, 여기서 링커는 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50이다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 태그인 CAR 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 태그는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 양친매성 리간드 접합체는 종양-연관 항원, 또는 그의 단편인 CAR 리간드를 포함한다. 예시적인 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, k 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFr vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 α 2, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CALX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-α, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, TEM1, 및/또는 TEM8 중 하나 이상을 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 작동가능하게 연결된 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 종양-연관 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)의 단편에 작동가능하게 연결된 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다. 일부 측면에서, 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이고, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 PEG-2000이다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 지질을 포함하며, 여기서 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 PEG-2000을 통해 CAR 리간드에 연결된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 작동가능하게 연결된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 종양-연관 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)의 단편에 작동가능하게 연결된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 PEG-2000을 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 작동가능하게 연결된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 PEG-2000을 통해 종양-연관 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)의 단편에 작동가능하게 연결된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 CAR에 결합하는 CAR 리간드를 포함하며, 여기서 CAR은 공동-자극 도메인을 포함한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 CAR에 결합하는 CAR 리간드를 포함하며, 여기서 CAR은 이중특이적 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 이중특이적 결합 도메인은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)을 포함한다. 일부 측면에서, 이중특이적 결합 도메인은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII) 및 제2 종양 연관 항원 결합 도메인 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)을 포함한다. 일부 측면에서, 이중특이적 결합 도메인은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, 이중특이적 결합 도메인은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편을 포함한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 태그를 포함하는 CAR 리간드를 포함하고, CAR은 태그 결합 도메인을 포함한다. 다른 측면에서, CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이고, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 태그에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 태그는 태그 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 태그에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 태그는 태그 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 태그에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 태그는 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 태그에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 태그는 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 종양-연관 항원 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 종양-연관 항원은 종양-연관 항원 결합 도메인 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2, EGFRvII)을 포함하는 CAR에 결합한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 종양-연관 항원 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 디아실 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 제공하며, 여기서 종양-연관 항원 또는 그의 단편은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 제1 또는 제2 종양-연관 항원 중 하나를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 양친매성 리간드 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 및 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 면역원성 조성물은 아주반트를 포함하며, 여기서 아주반트는, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 측면에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 패턴 인식 수용체에 결합한다. 일부 측면에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CpG를 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체에 대한 리간드이다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체는 링커를 포함하며, 여기서 링커는 올리고뉴클레오티드 링커이다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드 링커는 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2이다. 일부 측면에서, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체의 지질은 디아실 지질이다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 12-30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 14-25개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 16-20개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 디아실 지질은 18개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함한다.
다른 측면에서, 면역원성 조성물은 아주반트를 포함하며, 여기서 아주반트는 시클릭 디-GMP (CDG)이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, CAR(-) T 세포의 증식은 대상체에서 증가되지 않는다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 종양의 크기의 감소 또는 저하 또는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 또는 저하시키거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR-T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 암을 가진 대상체에서 항종양 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR-T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR-T 세포, 및 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서 면역 반응은 T-세포 매개된 면역 반응 또는 항종양 면역 반응이다. 일부 측면에서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR-T 세포, 및 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 바이러스에 감염된 세포 집단 또는 조직인 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이다. 일부 측면에서, 면역 반응은 T-세포 매개된 면역 반응이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 항원의 발현 또는 상승된 발현과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR-T 세포, 및 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 항원은 바이러스 항원 또는 암 항원이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, 상기 방법은 CAR-T 세포를 투여받기 전에 대상체에게 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 CAR-T 세포를 투여받은 후에 대상체에게 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 CAR-T 세포를 투여하는 것과 동시에 대상체에게 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
전술한 또는 관련 측면 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 림프절로 트래픽킹된다. 일부 측면에서, 양친매성 리간드 접합체는 서혜 림프절 및 액와 림프절로 트래픽킹된다. 일부 측면에서, 양친매성 리간드 접합체는 림프절로 트래픽킹될 때 항원 제시 세포의 막 내로 삽입된다. 일부 측면에서, 항원 제시 세포는 수질 대식세포, CD8+ 수지상 세포, 및/또는 CD11b+ 수지상 세포이다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, CAR 리간드는 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 또는 적어도 25일 동안 림프절 내에 보유된다.
CAR 리간드가 태그이고 CAR이 태그 결합 도메인을 포함하는 전술한 측면 중 임의의 것에서, 상기 방법은 태그부착된 단백질의 제형을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 태그 결합 도메인은 태그부착된 단백질에 결합한다. 일부 측면에서, 태그부착된 단백질의 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 태그 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CART 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CAR-T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여와 공동으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 측면에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CAR-T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 후에 대상체에게 투여된다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, CAR-T 세포는 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 투여된다. 다른 측면에서, CAR-T 세포는 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 후에 투여된다. 또 다른 측면에서, CAR-T 세포는 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여와 공동으로 투여된다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물은 비-종양 배액 림프절에서 비경구적으로 투여되거나, 종양-배액 림프절에서 비경구적으로 투여되거나, 또는 종양내로 투여된다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, 대상체는 암을 가진다. 전술한 측면 중 임의의 것에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위해 조성물 백신을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 종양-연관 항원 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, CAR은 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이다. 일부 측면에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다.
전술한 측면 중 임의의 것에서, 키트는 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 포함한다. 일부 측면에서, 아주반트는 본원에 기재된 바와 같은 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위한, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서의, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 키트는 태그부착된 단백질의 제형, 및 상기 태그부착된 단백질의 제형의 투여에 대한 지침서를 포함하며, 여기서 CAR은 태그부착된 단백질에 결합하는 태그 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 키트는 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 포함한다. 일부 측면에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다.
도 1a는 PEG-2000 링커를 통해 작은 분자 (상부), 짧은 선형 펩티드 (중앙) 또는 단백질 도메인 (하부)에 접합된 지질 꼬리 (예를 들어, DSPE)를 포함하는 양친매성 리간드 접합체의 개략도를 제공한다.
도 1b는 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드를 포함하는 양친매성 리간드 접합체로 장식된 항원 제시 세포와 CAR-T 세포 사이의 상호작용을 예시하는 개략도를 제공한다.
도 2a는 막횡단 항-FITC CAR의 도메인 구조 및 배향의 개략도를 제공한다.
도 2b는 1차 마우스 T 세포 내로의 레트로바이러스 형질도입 후 항-FITC CAR 표면 발현 정도를 도시하는 유동 세포계수 데이터의 그래프를 제공한다.
도 2c는 표시된 바와 같이 다양한 농도의 DSPE-PEG-FITC로 장식된 K562 세포와의 상호작용 후 항-FITC CAR-T 세포에 의해 생산된 IFNγ의 정량화를 도시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 2d는 10:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서, FITC-CAR-T 세포와의 공동-배양 후 6시간에 DSPE-PEG-FITC 코팅된 DC2.4 세포의 세포 사멸의 백분율을 도시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 3a는 표시된 바와 같이 다양한 용량 하에 DSPE-PEG-FITC 또는 FITC 단독으로 백신접종한 그 다음날부터 마우스로부터 제거된 림프절 내에서의 DSPE-PEG-FITC 잔류 정도 (방사 효율로서 측정됨)를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 3b는 피하 주사 후 24시간에 배액 서혜 림프절 내의 상이한 림프계 집단에 의한 DSPE-PEG-FITC 흡수를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 3c는 피하 주사 후 3가지 상이한 APC에 의한 다양한 용량에서의 DSP-PEG-FITC의 흡수를 도시하는 유동 세포계수 데이터의 그래프를 제공한다.
도 4는 PBS, c-디-GMP (CDG), DSPE-PEG-FITC 또는 DSPE-PEG-FITC + CDG에 의해 프라이밍된 서혜 림프절 내에서의 FITC CAR-T 세포의 증식 지수를 도시하는 그래프를 제공한다. 백신접종후 1일에 PBS 및 CDG 단독의 효과를 평가하였다.
도 5는 림프절 세포 집단에서, CDG의 수반 하에 또는 수반 없이, 항원 제시 세포 표면 상의 DSPE-PEG-FITC 디스플레이를 도시하는 그래프를 제공한다. 림프절은 DSPE-PEG-FITC 백신접종 +/- CDG 후 24시간 및 3일에 수집되었다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 6은 CDG의 수반 하에 또는 수반 없이 DSPE-PEG-FITC 흡수 CD11c+ 세포 상의 다양한 공동-자극성 분자의 평균 형광 강도 (MFI)를 도시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 7은 실험 타임라인을 도시하는 개략도 (상단) 및 림프고갈된 CD45.2 마우스에서 2 라운드의 DSPE-PEG-FITC 백신접종을 받은 CD45.1 FITC CAR-T 세포의 백분율을 제시하는 그래프 (하단)를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 8은 실험 타임라인을 도시하는 개략도 (상단) 및 림프충만 CD45.2 마우스에서 2 라운드의 DSPE-PEG-FITC 백신접종을 받은 CD45.1 FITC CAR-T 세포의 백분율을 제시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 9는 반복된 DSPE-PEG-FITC 백신접종에 대항한 시간 경과에 따른 항체 반응을 제시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 10a는 DSPE-PEG에 접합된 EGFRvIII 펩티드를 제시하는 개략도를 제공한다.
도 10b는 DSPE-PEG-EGFRvIII로의 면역화 후 뮤린 T 세포 상에서의 EGFRvIII CAR의 표면 발현을 제시한다.
도 10c는 세포 트레이스 바이올렛 추적에 의해 결정된 바와 같이 DSPE-PEG-EGFRvIII 백신접종 후 48시간에 림프절 내에서의 EGFRvIII CAR T 세포의 증식을 제시한다.
도 11a는 세포 표면 상에 발현된 EGFRvIII의 수반 하에 또는 수반 없이 CT-2A 신경교종 세포와의 상호작용 후 EGFRvIII CAR-T 세포 또는 대조군 T 세포에 의해 생산된 IFNγ의 정량화를 도시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 11b는 EGFRvIII CAR-T 세포 또는 대조군 T 세포와 공동-배양한 후 야생형 EGFR 또는 EGFRvIII을 보유하는 CT-2A 신경교종 세포의 세포 사멸 백분율을 도시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 12는 DSPE-PEG-EGFRvIII ("VAX") 또는 대조군 백신접종을 받은 마우스에서 EGFRvIII CAR T 세포의 백분율을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 13은 시험관내에서 DSPE-PEG-EGFRvIII ("VAX")의 수반 하에 또는 수반 없이 EGFRvIII 발현 표적 세포에 반응하여 순환성 CAR T 또는 비-CAR T 세포 (n = 5)의 시토카인 (IFNγ 및 TNFα) 분비를 제시하는 그래프를 제공한다.
도 14는 실험 타임라인을 도시하는 개략도 (상단), 및 EGFRvIII 발현 CT-2A 세포가 체내 이식되고 DSPE-PEG-EGFRvIII ("PepVIII Vax")가 투여된 마우스에서 종양 mg당 CAR-T 세포의 수에 의해 측정된 바와 같은 EGFRvIII CAR-T 세포의 종양-침윤을 제시하는 그래프를 제공한다.
도 15는 PBS 또는 DSPE-PEG-EGFRvIII ("VAX")에 반응하여 종양 침윤 CAR-T 세포의 시토카인 (IFNγ 및 TNFα) 분비를 제시하는 그래프를 제공한다.
도 16은 PBS 또는 DSPE-PEG-EGFRvIII ("PepVIII Vax")에 반응하여 종양 침윤 CAR-T 세포의 그랜자임 B의 발현 수준 (좌측) 및 Ki67에 의해 결정된 바와 같은 증식 (우측)을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 17은 DSPE-PEG-EGFRvIII ("VAX")의 수반 하에 또는 수반 없이 종양 침윤 EGFRvIII CAR T 세포 상에서의 PD-1 및 TIM3의 발현을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 18a는 림프고갈 조건 하에서 EGFRvIII CAR-T +/- DSPE-PEG-EGFRvIII 백신접종 ("VAX")으로 처리된 CT-2A 종양 보유 마우스에서의 종양 용적을 제시하는 그래프를 제공한다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 18b는 도 18a의 CT-2A 종양 보유 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 그래프를 제공한다.
도 19는 FITC와 흑색종-연관련 항원 TRP1 둘 다를 표적화하는 FITC-항원 이중특이적 CAR 설계의 개략도를 제공한다.
도 20은 T 세포 표면 상에서의 FITC-TRP1 CAR 발현을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 21은 DSPE-PEG-FITC 코팅된 K562 세포 또는 B16F10 세포와의 공동-배양 시 FITC-TRP1 이중특이적 CAR T의 IFNγ 분비를 도시하는 그래프를 제공한다. 단일특이적 FITC CAR T 세포 및 TRP1 CAR T 세포가 대조군으로서 포함되었다. ***p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05.
도 22는 시험관내에서 FITC-TRP1 이중특이적 CAR-T 또는 단일특이적 TRP1 CAR T 세포와 공동-배양될 때 TRP1 발현 표적 세포의 세포 사멸 백분율을 도시하는 그래프를 제공한다. 공동-배양은 10:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비 하에 6시간 동안 설정되었다.
도 23은 세포 트레이스 바이올렛 추적에 의해 측정된 바와 같이 DSPE-PEG-FITC 백신접종 후 48시간에 림프절 내에서의 FITC-TRP1 CAR-T 증식을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 24a 및 24b는 FITC-TRP1 이중특이적 CAR-T 요법 단독으로 처리되거나 또는 림프고갈 사전 컨디셔닝의 수반 하에 CAR-T 플러스 DSPE-PEG-FITC 백신접종 ("VAX")으로 처리된 B16F10 종양 보유 마우스의 종양 성장 (도 24a) 및 동물 생존율 (도 24b)을 제시한다.
도 25는 PBS 또는 DSPE-PEG-FITC 백신접종 ("VAX")을 받는 마우스의 말초 혈액 중의 FITC-TRP1 이중특이적 CAR-T의 수를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 26은 PBS 또는 DSPE-PEG-FITC 백신접종을 받는 마우스에서 FITC/TRP1-CAR T 세포의 B16F10 종양으로의 침윤을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 27a 및 27b는 FITC-TRP1 이중특이적 CAR-T 요법 단독으로 처리되거나 또는 CAR-T 플러스 DSPE-PEG-FITC 백신접종 ("VAX")으로 처리된 림프충만 B16F10 종양 보유 마우스의 종양 성장 (도 27a) 및 동물 생존율 (도 27b)을 제시한다.
개요
다양한 질환은 환자에서 진행성 면역억제의 발생을 특징으로 한다. 악성종양을 가진 환자에서의 손상된 면역 반응의 존재가 특히 충분히 입증되었다. 암 환자 및 종양-보유 마우스는 다양한 변경된 면역 기능, 예컨대 지연형 과민증에서의 저하, 용해 기능에서의 저하 및 림프구의 증식성 반응을 나타낸다. 암 환자의 면역 기능을 증대시키는 것은 종양 제어를 위한 유리한 효과를 나타낼 수 있었다.
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법은 혈액 악성종양을 치료하는데 성공적이었다. 그러나, CAR-T 세포는 일부 환자에서 기능적으로 지속되지 않고, 고형 종양에서 일반적으로 불량한 반응을 나타낸다. CAR-T 요법에 대한 현재의 프로토콜은 상당 수의 CAR-T 세포의 주입에 의존하며, 이는 종양에 대항하여 기능적 활성이 소멸되거나 또는 빠르게 상실될 수 있다. 전임상 동물 모델에서, 백신접종을 통해 생체내에서 T 세포를 확장시키는 것이 T 세포 요법의 효능을 강화시키는 가장 효과적인 전략 중 하나인 것으로 공지되어 있지만, 전통적인 백신은 키메라 항원 수용체를 통해 CAR-T를 신장시킬 수 없다.
본 개시내용에 기반하여, CAR-T 활성화 및 증식의 증강은 키메라 항원 수용체의 리간드 및 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 사용하여 달성된다. 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 생체내에서 전달된 CAR-T 세포를 자극함으로써 치료적 CAR-T 세포의 생성에 대한 현재의 접근법을 이용한 경우의 몇 가지 단점에 대한 해결책을 제공하며, 이는 지속적 치료 반응에 필요한 주입된 CAR-T 세포의 양을 감소시킬 수 있고, 환자 림프고갈에 대한 필요성을 완화시킬 수 있다.
정의
본 청구범위 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에 제시된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, "약"은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이며, 그것이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 변할 것이다. 용어 "약"은 그것이 사용되는 문맥을 고려해서 통상의 기술자에게 명확하지 않게 사용되는 경우, 특정한 값의 최대 플러스 또는 마이너스 10%를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아주반트"는 특이적 면역원 또는 항원과 함께, 결과적인 면역 반응을 증대시키거나 또는 달리 변경시키거나 또는 변형시킬 화합물을 지칭한다. 면역 반응의 변형은 항체 및 세포성 면역 반응 중 어느 하나 또는 둘 다의 특이성을 강화 또는 확장시키는 것을 포함한다. 면역 반응의 변형은 또한, 특정 항원-특이적 면역 반응의 저하 또는 억제를 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 시클릭 디뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 바와 같은 면역자극성 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 양친매성 리간드 접합체, 또는 이러한 접합체를 포함하는 조성물의 투여 전에, 투여와 공동으로, 또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 양친매성 리간드 접합체와 동일한 조성물에서 공동-제형화된다.
"아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전 코드에 의해 코딩된 것들 뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합되는 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유하고 있다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산은 통상적으로 공지된 3 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1 문자 기호에 의해 본원에서 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드도 마찬가지로, 통상적으로 허용되는 단일 문자 코드로서 지칭될 수 있다.
"아미노산 치환"은 미리 결정된 아미노산 서열 (출발 폴리펩티드의 아미노산 서열) 내의 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기를 제2의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. "아미노산 삽입"은 적어도 하나의 부가 아미노산이 미리 결정된 아미노산 서열 내로 혼입되는 것을 지칭한다. 삽입은 통상적으로, 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 것이지만, 본 발명의 더 큰 "펩티드 삽입"은, 예를 들어, 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 약 10개, 15개 또는 20개 이하의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 수 있다. 삽입된 잔기(들)는 상기 개시된 바와 같이 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연적으로 발생할 수 있다. "아미노산 결실"은 미리 결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "양친매성 물질" 또는 "양친매성"은 친수성 헤드 기 및 소수성 꼬리를 포함하며, 이로써 양친매성 접합체를 형성하는 접합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드 및 하나 이상의 소수성 지질 꼬리를 포함하며, 이는 본원에서 "양친매성 리간드 접합체"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함하며, 여기서 중합체는 하나 이상의 지질 또는 CAR 리간드에 접합된다.
용어 "완화시키는 것"은 질환 상태, 예를 들어, 암을 예방하거나, 그의 중증도 또는 진행을 감소시키거나, 완화시키거나 또는 치유하는 것을 포함하여, 상기 질환 상태의 치료에 있어서 임의의 치료적으로 유리한 결과를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원성 제형" 또는 "항원성 조성물" 또는 "면역원성 조성물"은 척추동물, 특히 포유동물에게 투여될 때 면역 반응을 유도시킬 제제를 지칭한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 MHC와 복합체를 형성한 외래 항원을 디스플레이하는 세포이다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식한다. APC의 예는 수지상 세포 (DC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 단핵구 (예컨대, THP-1), B 림프모구성 세포 (예컨대, C1R.A2, 1518 B-LCL) 및 단핵구-유래 수지상 세포 (DC)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 APC는 포식 작용에 의해 또는 수용체-매개된 세포내이입에 의해 항원을 내재화한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이중특이적" 또는 "이관능성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148:1547-1553] 참조.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 (i) 적어도 하나의 미리 결정된 CAR 리간드 또는 항원, 또는 미리 결정된 CAR 리간드 및 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인, (ii) 세포외 도메인이 유래되는 폴리펩티드와 상이한 시그널 변환 단백질로부터 유래된 하나 이상의 세포질 도메인을 포함하는 세포내 세그먼트, 및 (iii) 막횡단 도메인을 포함하는 인공 막횡단 단백질 수용체를 지칭한다. "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 종종, "키메라 수용체", "T-바디", 또는 "키메라 면역 수용체 (CIR)"로서 지칭된다.
"CAR 항원"과 상호교환가능하게 사용되는 어구 "CAR 리간드"는 CAR (예를 들어, CAR의 세포외 도메인)에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 자연 또는 합성 분자 (예를 들어, 작은 분자, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물, 핵산), 또는 그의 부분 또는 단편을 의미한다. 일부 실시양태에서, CAR 리간드는 종양-연관 항원, 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, CAR 리간드는 태그이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포 요법에 활용되는 CAR에 기반하여 양친매성 리간드 접합체에 사용하기 적합한 CAR 리간드를 결정할 수 있다.
"세포내 시그널링 도메인"은 세포 내에서의 생물학적 프로세스의 활성화 또는 억제, 예를 들어, 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포의 활성화를 유발시키는 시그널을 전달하는 기능을 하는 것으로 공지된 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 그 예는 ILR 쇄, CD28 및/또는 CD3ζ를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "암 항원"은 (i) 종양-특이적 항원, (ii) 종양-연관 항원, (iii) 종양-특이적 항원을 발현하는 세포, (iv) 종양-연관 항원을 발현하는 세포, (v) 종양 상의 배아 항원, (vi) 자가 종양 세포, (vii) 종양-특이적 막 항원, (viii) 종양-연관 막 항원, (ix) 성장 인자 수용체, (x) 성장 인자 리간드, 및 (xi) 암과 연관되는 임의의 다른 유형의 항원 또는 항원-제시 세포 또는 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "CpG ODN"으로서 지칭되기도 하는 "CG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CG ODN)"는 시토신 뉴클레오티드 (C)에 이어 구아닌 뉴클레오티드 (G)를 함유하는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. 특정 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CG ODN이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공동-자극성 리간드"는 T 세포 상의 동족 공동-자극성 분자에 특이적으로 결합하며, 이로써, 예를 들어, 펩티드가 부하된 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공된 1차 시그널 외에도, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 시그널을 제공하는 항원 제시 세포 (예를 들어, APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공동-자극성 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극성 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (rCAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 공동-자극성 리간드는 또한 특히, 예컨대 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드이나 이에 제한되지는 않는, T 세포 상에 존재하는 공동-자극성 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포괄한다.
"공동-자극성 분자"는 공동-자극성 리간드와 특이적으로 결합하며, 이로써, 예컨대 증식이나 이에 제한되지는 않는, T 세포에 의한 공동-자극성 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동-자극성 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "공동-자극성 시그널"은 1차 시그널, 예컨대 TCR/CD3 라이게이션과 조합하여, T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 초래하는 시그널을 지칭한다.
지명된 폴리펩티드 또는 단백질로부터 "유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 지칭한다. 바람직하게는, 특정한 서열로부터 유래되는 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 그러한 서열 또는 그의 일부분과 본질적으로 동일한 아미노산 서열 (여기서 상기 일부분은 적어도 10-20개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20-30개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 30-50개의 아미노산으로 이루어짐), 또는 서열에 있어서 그의 기원을 갖는 것으로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 달리 확인될 수 있는 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 펩티드로부터 유래된 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 또 다른 아미노산 잔기로 치환되었거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다.
폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 반드시, 출발 분자와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 변이체는, 예를 들어, 변이체 분자의 길이 전반에 걸쳐, 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만, 보다 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 보다 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만 (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 가장 바람직하게는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다.
한 실시양태에서, 출발 폴리펩티드 서열과 이로부터 유래된 서열 사이에 하나의 아미노산 차이가 있다. 이러한 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 출발 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 (즉, 동일한 잔기)의 백분율로서 본원에 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 항원 "교차-제시"는 APC 상의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 통해 T 세포에 대한 외인성 단백질 항원의 제시를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포독성 T 림프구 (CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유도된 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8+ T 세포에 의해 매개된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료상 유효 용량"은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 그러한 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 사용에 유효한 양은 치료되는 장애의 중증도 및 환자 자신의 면역 체계의 일반적인 상태에 좌우될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이펙터 세포" 또는 "이펙터 면역 세포"는 면역 반응, 예를 들어, 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 항원을 특이적으로 인식한다. 면역 이펙터 세포의 예는 자연 킬러 (NK) 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 림프구 (CTL))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역 이펙터 기능" 또는 "면역 이펙터 반응"은 표적에 대한 면역 반응을 촉진시키는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈액 암"은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프계 악성종양 뿐만 아니라 비장 및 림프절의 암을 포함한다. 예시적인 림프종은 B 세포 림프종 (B 세포 혈액 암)과 T 세포 림프종 둘 다를 포함한다. B-세포 림프종은 호지킨 림프종과 대부분의 비-호지킨 림프종 둘 다를 포함한다. B 세포 림프종의 비-제한적 예는 확산성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종 (만성 림프구성 백혈병과 중첩됨), 외투 세포 림프종 (MCL), 버킷 림프종, 종격동 거대 B 세포 림프종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종양 육아종증을 포함한다. T 세포 림프종의 비-제한적 예는 림프절외 T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, 역형성 대세포 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종을 포함한다. 혈액 악성종양은 또한, 백혈병, 예컨대 속발성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병이나 이에 제한되지는 않는다. 혈액 악성종양은 골수종, 예컨대 다발성 골수종 및 무증상성 다발성 골수종을 추가로 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 혈액 및/또는 B 세포 또는 T 세포-연관 암은 용어 혈액 악성종양에 포괄된다.
본원에 사용된 바와 같은, "면역 세포"는 조혈 기원 세포이며 면역 반응에 일정 역할을 한다. 면역 세포는 림프구 (예를 들어, B 세포 및 T 세포), 자연 킬러 세포 및 골수 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "면역자극성 올리고뉴클레오티드"는 면역 반응을 자극 (예를 들어, 유도 또는 증강)할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다.
용어 "면역 반응을 유도하는 것" 및 "면역 반응을 증강시키는 것"은 상호교환가능하게 사용되며, 특정한 항원에 대한 면역 반응 (즉, 수동 또는 적응)의 자극을 지칭한다. CDC 또는 ADCC를 유도하는 것과 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "유도"는 특정한 직접적 세포 사멸 메카니즘의 자극을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "예방을 필요로 하는", "치료를 필요로 하는" 또는 "필요로 하는" 대상체는 적절한 의료 개업의 (예를 들어, 인간의 경우 의사, 간호사 또는 임상 간호사; 비-인간 포유동물의 경우 수의사)의 판단에 의해, 주어진 치료 (예컨대, 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물로의 치료)로부터 합리적으로 혜택을 얻을 것인 대상체를 지칭한다.
용어 "생체내"는 살아있는 유기체에서 발생하는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "연결된", "작동가능하게 연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 DNA 기술을 포함한 적절한 수단에 의해, 2가지 이상의 요소 또는 성분 또는 도메인을 함께 연결하는 것을 지칭한다. 화학적 접합 방법 (예를 들어, 이종이관능성 가교 결합제를 사용하는 방법)은 재조합 DNA 기술의 방법과 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "지질"은 비극성 용매에 가용성이고 물에 불용성인 생체 분자를 지칭한다. 지질은 종종 소수성 또는 양친매성 분자로서 기재되어, 수성 환경에서 소포 또는 막과 같은 구조를 형성할 수 있게 한다. 지질은 지방산, 글리세로지질, 글리세로인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질 (콜레스테롤 포함), 프레놀 지질, 사카로리피드 및 폴리케티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체에 적합한 지질은 생리학적 조건 하에서 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체에 적합한 지질은 생리학적 조건 하에서 세포 막 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 지질은 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합하고 세포 막 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 지질은 디아실 지질이다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 12개 초과의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 탄소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포유동물" 또는 "대상체" 또는 "환자"는 인간 및 비-인간 둘 다를 포함하고, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 뮤린, 소, 말 및 돼지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환) 및 상보적 서열, 및 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 변성 코돈 치환이 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985); and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994). 아르기닌 및 류신의 경우, 제2 염기에서의 변형이 또한 보존적일 수 있다. 용어 핵산은 유전자, 유전자에 의해 코딩된 cDNA 및 mRNA와 상호교환가능하게 사용된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-가닥 DNA; 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA; 단일- 및 이중-가닥 RNA; 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA; 단일-가닥이거나, 또는 보다 전형적으로, 이중-가닥이거나 또는 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA를 포함하거나 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 안정성 또는 다른 이유로 변형된 하나 이상의 변형된 염기 또는 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 특이한 염기, 예컨대 이노신를 포함한다. DNA 및 RNA에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 클로닝, 유전자 요법, 단백질 발현 및 정제, 돌연변이 도입, 이를 필요로 하는 숙주의 DNA 백신접종, 예를 들어 수동 면역화를 위한 항체 생성, PCR, 프라이머 및 프로브 생성 등을 포함한, 다수의 적용에 유용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "비경구 투여", "비경구적으로 투여된" 및 다른 문법적으로 동등한 어구는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 정맥내, 비강내, 안내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 뇌내, 두개내, 경동맥내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 일반적으로 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 유익/유해 비율에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생리학적 조건"은 대상체의 생체내 조건을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생리학적 조건은 중성 pH (예를 들어, 6 내지 8의 pH)를 지칭한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 중합체에도 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은, "작은 분자"은 약 500 달톤 아래의 분자량을 갖는 분자이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 암 또는 감염을 가진 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
용어 "충분한 양" 또는 "에 충분한 양"은 원하는 효과를 초래하기에 충분한 양, 예를 들어, 종양의 직경을 감소시키기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "T 세포"는 세포 표면 상에 T 세포 수용체의 존재에 의해 다른 백혈구와 구별될 수 있는 특정 유형의 백혈구를 지칭한다. TH1, TH2, TH3, TH17, TH9, 및 TFH 세포를 포함한 T 헬퍼 세포 (일명 TH 세포 또는 CD4+ T 세포) 및 하위유형; 세포독성 T 세포 (즉, TC 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 림프구, T-살해 세포, 살해 T 세포); 중심 기억 T 세포 (TCM 세포), 이펙터 기억 T 세포 (TEM 및 TEMRA 세포), 및 상주 기억 T 세포 (TRM 세포)를 포함한 기억 T 세포 및 하위유형; CD4+ FOXP3+ Treg 세포, CD4+FOXP3- Treg 세포, Tr1 세포, Th3 세포, 및 Treg17 세포를 포함한 조절성 T 세포 (일명 Treg 세포 또는 억제 T 세포) 및 하위유형; 자연 킬러 T 세포 (일명 NKT 세포); 점막 연관 불변 T 세포 (MAIT), 및 Vγ9/Vδ2 T 세포를 포함한 감마 델타 T 세포 (γδ T 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 몇 가지 T 세포 하위세트가 있다. 상기 언급되거나 언급되지 않은 T 세포 중 임의의 하나 이상은 본 발명의 사용 방법에 대한 표적 세포 유형일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포 활성화" 또는 "T 세포의 활성화"는 표면 상에 항원-특이적 T 세포 수용체를 발현하는 성숙 T 세포가 그의 동족 항원을 인식하고; 세포 주기에 유입되며, 시토카인 또는 용해성 효소를 분비하고, 세포-기반 이펙터 기능을 수행하기 시작하거나 또는 이러한 기능을 수행하기에 적격해짐으로써 반응하는 세포성 프로세스를 지칭한다. T 세포 활성화는 적어도 2개의 시그널이 완전히 활성화되도록 요구한다. 첫 번째는 항원-주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의한 T 세포 항원-특이적 수용체 (TCR)의 결속 후에 발생하고, 두 번째는 공동-자극성 분자 (예를 들어, CD28)의 후속 결속에 의해 발생한다. 이들 시그널은 핵으로 전달되어 T 세포의 클론 확장, 세포 표면 상의 활성화 마커의 상향조절, 이펙터 세포로의 분화, 세포독성 또는 시토카인 분비의 유도, 아폽토시스의 유도, 또는 그의 조합을 초래한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포-매개된 반응"은 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ 세포) 및 헬퍼 T 세포 (예를 들어, CD4+ 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포에 의해 매개되는 임의의 반응을 지칭한다. T 세포 매개된 반응은, 예를 들어, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.
용어 "T 세포 세포독성"은 CD8+ T 세포 활성화에 의해 매개되는 임의의 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 시토카인 생산, CD8+ T 세포 증식, 그랜자임 또는 퍼포린 생산, 및 감염체의 제거를 포함한다.
"치료용 항체"는 항체, 항체의 단편, 또는 항체로부터 유래되는 구축물이며, 치료 효과를 유발하기 위해 표적 세포 상의 세포 표면 항원에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 이러한 항체를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 항체는 항체, 미니바디 및 디아바디의 단일 쇄 Fc 단편을 포함한다. 암 요법에 유용한 것으로 관련 기술분야에 공지된 치료용 항체 중 임의의 것이, 본원에 기재된 조성물과의 조합 요법에 사용될 수 있다. 치료용 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 치료용 항체는 암 항원을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 치료용 항체는 태그 결합 도메인을 포함하고, 이는 태그를 포함하는 양친매성 리간드 접합체에 의해 인식된다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료용 단백질"은 의약으로서 대상체에게 투여될 수 있는 임의의 폴리펩티드, 단백질, 단백질 변이체, 융합 단백질 및/또는 그의 단편을 지칭한다.
용어 "치료상 유효량"은 질환의 증상을 완화시키는데 유효한 양이다. 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 치료상 유효량은 "예방상 유효량"일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기재된 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료" 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, CAR T 세포 요법을 받고 있는 대상체에게 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체를 투여하는 것을 이용한다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체는 장애 또는 재발 장애의 한 가지 이상의 증상을 예방, 치유, 지연, 중증도 감소 또는 완화시키기 위해, 또는 그러한 치료의 부재 하에 예상되는 것 이상으로 대상체의 생존을 연장시키기 위해, 특정한 항원에 대항하여 증강된 면역 반응을 필요로 하는 대상체 또는 궁극적으로 그러한 장애를 획득할 수 있는 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은, "백신"은 척추동물에게 투여될 수 있는 형태이고; 감염 또는 질환을 예방 및/또는 완화시키고/시키거나 감염 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 감소시키고/시키거나 또 다른 용량의 합성 나노입자의 효능을 증강시키기 위해 면역을 유도하기에 충분한 보호성 면역 반응을 유도시키는, 아주반트와 조합된 본원에 기재된 바와 같은 양친매성 리간드 접합체를 함유하는 제형을 지칭한다. 전형적으로, 백신은 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 현탁되거나 또는 용해되는 통상적인 식염수 또는 완충 수용액 매질을 포함한다. 이러한 형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 감염 또는 질환을 예방, 완화 또는 달리 치료하기 위해 사용된다. 숙주 내로 도입되면, 백신은 항체 및/또는 시토카인의 생산 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포의 활성화 및/또는 다른 세포성 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 반응을 유발한다.
키메라 항원 수용체
일부 측면에서, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체 (CAR) 이펙터 세포와 연계해서 사용되거나 또는 수행되는 조성물 및 방법을 제공한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 유전적으로 조작된 인공 막횡단 수용체로서, 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, 자연 킬러 세포 또는 다른 면역 세포) 상에 리간드에 대한 임의의 특이성을 부여하고 인식 및 리간드와의 결합 시 이펙터 세포의 활성화를 초래한다. 전형적으로 이들 수용체는 모노클로날 항체의 항원 특이성을 T 세포 상에 부여하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, CAR은 3개의 도메인을 함유한다: 1) 전형적으로 시그널 펩티드, 리간드 또는 항원 인식 영역 (예를 들어, scFv) 및 가요성 스페이서를 포함하는 엑토도메인; 2) 막횡단 (TM) 도메인; 3) 전형적으로 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 엔도도메인 (대안적으로 "활성화 도메인"으로서 공지됨). CAR의 엑토도메인은 세포 외부에 상주하고 세포외 공간에 노출됨으로써, 그의 동족 리간드와의 상호작용에 접근할 수 있다. TM 도메인은 CAR이 이펙터 세포의 세포 막에 고정될 수 있게 한다. 세 번째 엔도도메인 ("활성화 도메인"으로서 공지되기도 함)은 CAR이 그의 특이적 리간드에 결합할 때 이펙터 세포 활성화를 도와준다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 활성화는 시토카인 및 케모카인 생산의 유도 뿐만 아니라 세포의 세포 용해 활성의 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 세포독성이 종양 세포를 향하도록 재지향시킨다.
일부 실시양태에서, CAR은 특이적 표적 리간드 또는 항원에 결합하는 리간드- 또는 항원-특이적 인식 도메인 (결합 도메인으로서 지칭되기도 함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 결합 도메인은 단일 쇄 항체 가변 단편 (scFv), 테더된 리간드 또는 공동-수용체의 세포외 도메인이며, 막횡단 도메인에 융합되며, 이는 차례로 시그널링 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 시그널링 도메인은 CD3ζ 또는 FcRγ로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CAR은 단백질, 예컨대 CD28, CD137 (4-1BB로서 공지되기도 함), CD134 (OX40으로서 공지되기도 함) 및 CD278 (ICOS로서 공지되기도 함)로부터 유래된 하나 이상의 공동-자극성 도메인을 포함한다.
표적 세포의 표면 상에서 그의 표적 항원과 CAR의 항원 결합 도메인의 결속은 CAR의 클러스터링을 초래하고 활성화 자극을 CAR 함유 세포에 전달한다. 일부 실시양태에서, CAR의 주요 특징은 면역 이펙터 세포 특이성을 재지향시키며, 이로써 주요 조직 적합성 (MHC) 비의존적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자의 증식, 시토카인 생산, 포식 작용 또는 생산을 촉발시켜, 모노클로날 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용할 수 있는 능력이다. CD3ζ 또는 FcRγ로부터의 시그널링 도메인을 함유하도록 조작된 scFv-기반 CAR이 T 세포 활성화 및 이펙터 기능을 위한 강력한 시그널을 전달하는 것으로 제시된 바 있지만, 이들은 동반되는 공동-자극성 시그널의 부재 하에서는 T 세포 생존 및 확장을 촉진시키는 시그널을 유도하기에 충분하지 않다. 결합 도메인, 힌지, 막횡단 및 CD3ζ 또는 FcRγ로부터 유래된 시그널링 도메인을 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인 (예를 들어, CD28, CD137, CD134 및 CD278로부터 유래된 세포내 공동-자극성 도메인)과 함께 함유하는 새로운 세대의 CAR이 항종양 활성 뿐만 아니라 시험관내 CAR 발현 T 세포에서, 동물 모델에서 및 암 환자에서 증가된 시토카인 분비, 용해 활성, 생존 및 증식을 보다 효과적으로 지시하는 것으로 제시된 바 있다 (Milone et al., Molecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464; Zhong et al., Molecular Therapy, 2010; 18: 413-420; Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360-3365).
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 발현 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)는 질환 또는 병태를 가진 환자로부터 유래되고, 리간드에 대한 임의의 특이성을 갖는 적어도 하나의 CAR을 발현하도록 시험관내에서 유전적으로 변형되는 세포이다. 이러한 세포는 CAR에 대한 리간드의 특이적 결합에 의해 자극 또는 유도되고 동일한 환자의 질환 또는 병태의 치료에 유용한 적어도 하나의 이펙터 기능 (예를 들어, 시토카인의 유도)을 수행한다. 이펙터 세포는 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 헬퍼 T 세포)일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 세포 유형 (예를 들어, 자연 킬러 세포 또는 줄기 세포)이 CAR을 발현할 수 있다는 것과, 키메라 항원 수용체 이펙터 세포가 T 세포 이외의 이펙터 세포를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 또는 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)와 접촉하거나 또는 그에 근접한 경우에 표적 세포 상에서 그의 이펙터 기능 (예를 들어, 세포독성 T 세포 반응)을 발휘하는 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포)이다 (예를 들어, 문헌 [Chang and Chen (2017) Trends Mol Med 23(5):430-450] 참조).
T 세포의 그의 동족 항원에의 연장된 노출은 이펙터 기능의 소진을 초래하여, 감염되거나 또는 형질전환된 세포의 지속성을 가능하게 할 수 있다. 면역 체크포인트 차단을 유도하는 작용제를 사용하여 숙주 이펙터 기능을 자극하거나 또는 활기를 되찾게 하기 위해 최근에 개발된 전략은 몇 가지 암의 치료에 성공하였다. 최근에 만들어진 증거는 T 세포 소진이 또한, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포 (CAR-T 세포)에 의해 오래 지속되는 항종양 활성을 유지하는데 있어서 상당한 장애를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다. 일부 실시양태에서, CAR 형질도입 이전에 환자로부터 수거된 T 세포의 분화 상태, 및 CAR-T 세포를 재도입하기 전에 환자가 겪는 컨디셔닝 레지멘 (예를 들어, 알킬화제, 플루다라빈의 부가 또는 배제, 전신 방사선조사)은 CAR-T 세포의 지속성 및 세포독성 잠재력에 상당한 영향을 미칠 수 있다. T 세포 집단을 자극 (항-CD3/CD28 또는 자극인자 세포를 통해서) 및 확장 (시토카인, 예컨대 IL-2를 통해서)하는 시험관내 배양 조건이 또한, CAR-T 세포의 분화 상태 및 이펙터 기능을 변경시킬 수 있다 (Ghoneim et al., (2016) Trends in Molecular Medicine 22(12):1000-1011).
본 개시내용은 치료적 CAR-T 세포의 생성에 대한 현재의 접근법과 관련된 몇 가지 단점을 해결해 준다. 기존의 치료적 CAR-T 세포 제조 방법은 종종, 입양 세포 전달을 위한 충분한 수의 변형된 세포를 수득하기 위해 시험관내에서의 광범위한 세포 배양을 필요로 하는데, 이 동안에 T 세포의 자연적 실체 또는 분화 상태가 변화될 수 있고 T 세포 기능이 손상될 수 있었다. 더욱이, 환자가 질환 진행을 예방하기 위해 치료가 절실히 필요한 경우, 충분한 양의 CAR-T 세포를 생성하는데 필요한 시간이 환자를 치료할 수 있는 기회와 맞지 않아서, 치료 실패 및 환자의 사망을 초래할 수 있다. 본 개시내용에 의해 제공된 조성물 및 방법은 이러한 장애물을 우회하고, 생체내에서 CAR-T 세포 활성화 및 증식을 자극함으로써 편리하고 보다 생리학적으로 관련된 치료적 접근법을 제공한다. 또한, 현재의 CAR-T 세포 요법 레지멘은 사전에 림프고갈을 필요로 하며, 이는 환자의 건강을 약화시키고 CAR-T 효능을 개선시킬 수 있는 영양 환경을 파괴한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 림프고갈의 부재 하에서도 여전히 생착될 수 있고, 적극적으로 증식될 수 있으며 생체내에서 확장될 수 있도록 입양 전달된 CAR-T 세포를 자극하는 방법을 제공한다.
현재의 CAR-T 세포 요법은 CAR-T 이펙터 기능을 유지하기 위해 조작된 공동-자극성 시그널에만 의존한다. 다른 공동-자극성 시그널 및 자연 자극성 환경의 결여는 불완전한 T 세포 성숙 및 증가된 T 세포 소진으로 이어질 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용은 T 세포를 림프절 내로 동원하는 방법 및 조성물을 제공하며, 면역 세포에 대한 생리학적으로 관련된 활성화 환경 및 아주반트의 공동-투여는 APC를 활성화시켜 최적의 CAR-T 세포 활성화를 위한 완전한 일련의 필수 공동-자극성 시그널을 제공한다.
일부 실시양태에서, 특히 ALL 및/또는 NHL을 치료하는 경우, 적합한 CAR은 CD19 또는 CD20을 표적화한다. 비-제한적 예는 구조: (i) 항-CD19 scFv, CD8 H/TM 도메인, 4-1BB CS 도메인 및 CD3ζ TCR 시그널링 도메인; (ii) 항-CD19 scFv, CD28 힌지 및 막횡단 도메인, CD28 공동-자극성 도메인 및 CD3ζ TCR 시그널링 도메인; 및 (iii) 항-CD20 scFv, IgG 힌지 및 막횡단 도메인, CD28/4-1BB 공동-자극성 도메인 및 CD3ζ TCR 시그널링 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합물 및 방법과의 조합에 적합한 CAR 이펙터 세포는 CD19 또는 CD20을 표적화하며, 킴리아(Kymriah)™ (티사젠렉류셀; 노바티스(Novartis); 이전 CTL019) 및 예스카르타(Yescarta)™ (악시캅타진 실로류셀; 카이트 파르마(Kite Pharma))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
재표적화된 CAR T 세포
일부 실시양태에서, 범용 면역 수용체, 태그, 스위치 또는 이뮤노글로불린 상의 Fc 영역에 결합하는 CAR을 발현하도록 변형된 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)가 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합하다.
일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 범용 면역 수용체 또는 UnivIR을 발현하도록 변형된다. UnivIR의 한 가지 유형은 비오틴-결합 면역 수용체 (BBIR)이다 (예를 들어, 미국 특허 공개 US20140234348 A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 범용 키메라 수용체 및/또는 범용 키메라 수용체를 발현하는 이펙터 세포와 관련된 방법 및 조성물의 다른 예는 국제 특허 출원 WO2016123122A1, WO2017143094A1, WO2013074916A1, US 특허 출원 US20160348073A1 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 범용, 모듈식, 항-태그 키메라 항원 수용체 (UniCAR)를 발현하도록 변형된다. 이러한 시스템은 다중 항원에 대항한 UniCAR 생착된 면역 세포의 재표적화를 허용한다 (예를 들어, US 특허 공개 US20170240612 A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨); 문헌 [Cartellieri et al., (2016) Blood Cancer Journal 6, e458] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 전환가능한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체 이펙터 세포 (CAR-EC) 스위치를 발현하도록 변형된다. 이러한 시스템에서, CAR-EC 스위치는 CAR-EC 상의 키메라 항원 수용체에 의해 결합되는 제1 영역 및 표적 세포 상의 세포 표면 분자에 결합하는 제2 영역을 가지며, 이로써, 결합된 표적 세포에 대해 세포독성인 CAR-EC로부터의 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, CAR-EC는 T 세포이고, 여기서 CAR-EC 스위치는 CAR-EC 활성에 대한 "온-스위치"로서 작용할 수 있다. 스위치의 투여를 감소시키거나 또는 중단함으로써 활성을 "끄기"할 수 있다. 이들 CAR-EC 스위치는 질환 또는 병태, 예컨대 암의 치료를 위해, 본원에 개시된 CAR-EC 뿐만 아니라 기존의 CAR T-세포와 함께 사용될 수 있으며, 여기서 표적 세포는 악성 세포이다. 이러한 치료는 전환가능한 면역요법으로서 본원에 지칭될 수 있다 (미국 특허 공개 US9624276 B2; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 인간 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 수용체 (예를 들어, CD16V-BB-ζ)를 발현하도록 변형된다 (Kudo et al., (2014) Cancer Res 74(1):93-103; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 펩티드 네오-에피토프 (PNE)에 결합하는 범용 면역 수용체 (예를 들어, 전환가능한 CAR, sCAR)를 발현하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 네오-에피토프 (PNE)는 항원을 표적화하는 항체 (항체 스위치) 내의 규정된 상이한 위치에 혼입되었다. 따라서, sCAR-T-세포 특이성은 인간 프로테옴에서 발생하지 않고 PNE에 대항해서만 재지향되므로, sCAR-T-세포와 항체 스위치 사이의 직교 상호작용을 허용한다. 이러한 방식으로, sCAR-T 세포는 완전하게 활성화되도록 항체 스위치의 존재에 엄격하게 의존하므로, 항체 스위치의 부재 하에서는 내인성 조직 또는 항원의 CAR T-세포 표적을 벗어난 인식을 배제한다 (Arcangeli et al., (2016) Transl Cancer Res 5(Suppl 2):S174-S177; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 전환가능한 CAR의 다른 예는 US 특허 출원 US20160272718A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "태그"는 상기 기재된 바와 같은 범용 면역 수용체, 태그, 스위치, 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 태그 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, CAR은 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 또는 말토스 결합 단백질에 결합한다.
항-태그 키메라 항원 수용체 (AT-CAR)
CAR T 세포의 일반화된 임상 적용에는 몇 가지 제한이 있다. 예를 들어, 모든 암 유형에 의해 범용적으로 발현되는 단일 종양 항원이 없기 때문에, CAR 내의 각각의 scFv는 원하는 종양 항원에 대한 특이성을 갖도록 조작될 필요가 있다. 또한, CAR에 의해 표적화된 종양 항원은 종양 회피를 초래하는 치료에 반응하여 하향-조절되거나 또는 돌연변이될 수 있다.
대안으로서, 범용, 항-태그 키메라 항원 수용체 (AT-CAR) 및 CAR-T 세포가 개발되었다. 예를 들어, 인간 T 세포는 항-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) CAR (항-FITC-CAR로서 지칭됨)을 발현하도록 조작되었다. 이러한 플랫폼은 항-FITC scFv (세포 표면 상에 존재함)와 FITC 사이의 높은 친화성 상호작용 뿐만 아니라 임의의 항암-기반 모노클로날 항체, 예컨대 세툭시맙 (항-EGFR), 리툭시맙 (항-CD20) 및 헤르셉틴 (항-Her2)에 FITC 분자 (또는 다른 태그)를 접합시킬 수 있는 능력의 이점을 취한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 적어도 WO 2012082841 및 US20160129109A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 범용 항-태그 키메라 항원 수용체 (AT-CAR)를 발현하도록 변형된다. 이러한 AT-CAR 시스템에서, T 세포는 태그부착된 단백질, 예컨대 항체를 인식하고 이에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 AT-CAR T 세포는 태그-표지된 항체, 예컨대 FITC-표지된 항체를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항종양 항원 항체는 태그 (예를 들어, FITC)와 접합되고, AT-CAR 요법 전에, 동시에 또는 후에 투여된다. 항종양 항원 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
표시된 바와 같이, 태그-결합 도메인의 결합 특이성은 표적 세포에 결합하기 위해 사용되는 단백질과 접합되는 태그의 실체에 의존한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면에서, 태그는 FITC이고, 태그-결합 도메인은 항-FITC scFv이다. 또 다른 한편으론, 본 개시내용의 일부 측면에서, 태그는 비오틴 또는 PE (피코에리트린)이고, 태그-결합 도메인은 항-비오틴 scFv 또는 항-PE scFv이다.
일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 각각의 제형의 단백질은 동일하거나 상이하고, 이러한 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 세툭시맙 (항-EGFR), 니모투주맙 (항-EGFR), 파니투무맙 (항-EGFR), 리툭시맙 (항-CD20), 오말리주맙 (항-CD20), 토시투모맙 (항-CD20), 트라스투주맙 (항-Her2), 젬투주맙 (항-CD33), 알렘투주맙 (항-CD52), 및 베바쿠지맙 (항-VEGF)이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질은 FITC-접합된 항체, 비오틴-접합된 항체, PE-접합된 항체, 히스티딘-접합된 항체 및 스트렙타비딘-접합된 항체를 포함하며, 여기서 항체는 표적 세포에 의해 발현된 TSA 또는 TAA에 결합한다. 예를 들어, 태그부착된 단백질은 FITC-접합된 세툭시맙, FITC-접합된 리툭시맙, FITC-접합된 헤르셉틴, 비오틴-접합된 세툭시맙, 비오틴-접합된 리툭시맙, 비오틴-접합된 헤르셉틴, PE-접합된 세툭시맙, PE-접합된 리툭시맙, PE-접합된 헤르셉틴, 히스티딘-접합된 세툭시맙, 히스티딘-접합된 리툭시맙, 히스티딘-접합된 헤르셉틴, 스트렙타비딘-접합된 세툭시맙, 스트렙타비딘-접합된 리툭시맙, 및 스트렙타비딘-접합된 헤르셉틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, AT-CAR-발현 T 세포의 각각의 집단의 AT-CAR은 동일하거나 상이하고, 이러한 AT-CAR은 태그-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그-결합 도메인은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 태그-결합 도메인은 FITC, 비오틴, PE, 히스티딘 또는 스트렙타비딘에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서 태그-결합 도메인은 항원-결합 단편이고, 항원-결합 단편은 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 예컨대 FITC, 비오틴, PE, 히스티딘 또는 스트렙타비딘에 특이적으로 결합하는 scFv이다. 일부 실시양태에서 막횡단 도메인은 인간 CD8α 쇄의 힌지 및 막횡단 영역이다. 일부 실시양태에서, 활성화 도메인은 CD28의 세포질 영역, CD137 (41BB)의 세포질 영역, OX40, HVEM, CD3ζ 및 FcRε 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 각각의 제형의 태그는 동일하거나 상이하고, 이러한 태그는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 히스티딘, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
태그는 기술, 예컨대 화학적 커플링 및 화학적 가교 결합제를 사용하여 단백질과 접합될 수 있다. 또 다른 한편으론, 융합 단백질로서 태그부착된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 제조할 수 있다. 이어서, 세포주는 태그부착된 단백질을 발현하도록 조작될 수 있고, 태그부착된 단백질은 배양 배지로부터 단리되고 정제되어 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질은 AT-CAR-발현 T 세포의 투여 전에, 또는 투여와 동시에, 또는 투여 후에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, (a) 태그부착된 단백질의 제형을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하며, 여기서 태그부착된 단백질은 상기 대상체 내의 암 세포에 결합하는 것이고; (b) 항-태그 키메라 항원 수용체 (AT-CAR)-발현 T 세포의 치료상 유효한 집단을 상기 대상체에게 투여하며, 여기서 AT-CAR-발현 T 세포는 태그부착된 단백질에 결합하고 암 세포 사멸을 유도하여, 이로써 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
탠덤 CAR (TanCAR) 이펙터 세포
암 치료, 종양 이질성 및 면역편집을 위해 CAR 접근법을 사용하면 CAR 치료에서 벗어날 수 있는 것으로 관찰되었다 (Grupp et al., New Eng. J. Med (2013) 368:1509-1518). 대안적인 접근법으로서, 탠덤 CAR 또는 TanCAR로서 공지된 이중특이적 CAR이, 다수의 암 특이적 마커를 동시에 표적화하려는 시도로 개발되었다. TanCAR에서, 세포외 도메인은 링커에 의해 연결된, 탠덤으로 2개의 항원 결합 특이성을 포함한다. 따라서, 2개의 결합 특이성 (scFv)은 둘 다 단일 막횡단 부분에 연결된다: 하나의 scFv는 막에 병치되고 다른 하나는 원위 위치에 있다. 예시적인 TanCAR로서, 문헌 [Grada et al. (Mol Ther Nucleic Acids (2013) 2, e105)]에는 CD19-특이적 scFv에 이어 Gly-Ser 링커 및 HER2-특이적 scFv를 포함하는 TanCAR이 기재되어 있다. HER2-scFv는 막근방 위치에 있었고, CD19-scFv는 원위 위치에 있었다. TanCAR은 2개의 종양 제한된 항원 각각에 대항하여 별개의 T 세포 반응성을 유도하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 T 세포의 이중특이적 활성화 및 표적화를 매개하는 탠덤 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 본 개시내용이 CAR에 대한 이중 특이성을 언급하지만, 일부 측면에서 CAR은 3개, 4개 또는 그 초과의 종양 항원을 표적화할 수 있다. CAR T 세포를 사용하여 다수의 항원을 표적화하는 것은 T 세포 활성화를 증강시키고/시키거나 항원 손실에 의해 종양 탈출을 상쇄시킬 수 있다. TanCAR은 또한, 다수의 발현된 항원을 표적화할 수 있고/있거나, 넓은 특이성을 갖는 동일한 세포성 산물을 사용하여 다양한 종양을 표적화할 수 있고/있거나 다중특이성으로 인해 동일한 결과를 달성하는 덜 강렬한 시그널링 CAR에 우수한 독성 프로파일을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 2개의 표적화 도메인을 포함하는 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 3개 이상의 표적화 도메인을 포함하는 다중특이적 TanCAR을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 표면에서 제1 CAR 및 제2 CAR을 제공하며, 각각의 CAR은 항원-결합 도메인을 포함하고, 여기서 제1 CAR의 항원-결합 도메인은 제1 종양 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD22, HER2)에 결합하고, 제2 CAR의 항원-결합 도메인은 또 다른 (상이한) 종양 항원에 결합한다. TanCAR은 US20160303230A1 및 US20170340705A1 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 TanCAR은 2개 이상의 종양 항원을 표적화한다. 예시적인 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, k 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFr vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 α 2, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CALX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-α, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, TEM1, 및/또는 TEM8 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD19 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD22 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HER2 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 IL13R-알파2 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 VEGF-A 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 Tem8 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FAP 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 EphA2 및 또 다른 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 종양 항원 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상을 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다: CD19, CD22, HER2, IL13R-알파2, VEGF-A, Tem8, FAP, 또는 EphA2, 및 그의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HER2 및 IL13R-알파2를 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD19 및 CD22를 표적화하는 이중특이적 TanCAR을 제공한다.
키메라 항원 수용체 및 CAR 이펙터 세포를 생성하는 방법
일부 실시양태에서, 대상체의 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 키메라 항원 수용체로 유전적으로 변형된다 (Sadelain et al., Cancer Discov. 3:388-398, 2013). 예를 들어, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)가 제공되고, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 재조합 핵산이 환자-유래 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포) 내로 도입되어 CAR 세포를 생성한다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 유래되지 않은 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 키메라 항원 수용체로 유전적으로 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 "쉽게 사용할 수 있는" 입양 세포 요법으로서 사용되도록 조작된 동종이계 세포, 예컨대 셀렉티스(Cellectis)에 의해 개발된 바와 같은 보변적 키메라 항원 수용체 T 세포 (UCART)이다. UCART는 특정한 암 유형을 가진 가장 많은 수의 환자를 치료하는데 사용되도록 조작된 동종이계 CAR T 세포이다. 셀렉티스에 의해 개발중인 UCART의 비-제한적 예는 하기 종양 항원을 표적화하는 것들을 포함한다: CD19, CD123, CD22, CS1 및 CD38.
관련 기술분야에 공지된 다양한 상이한 방법을 사용하여 본원에 개시된 핵산 또는 발현 벡터 중 임의의 것을 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포) 내로 도입할 수 있다. 핵산을 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포) 내로 도입하는 방법의 비-제한적 예는 리포펙션, 형질감염 (예를 들어, 인산칼슘 형질감염, 고도로 분지된 유기 화합물을 사용한 형질감염, 양이온성 중합체를 사용한 형질감염, 덴드리머-기반 형질감염, 광학적 형질감염, 입자-기반 형질감염 (예를 들어, 나노입자 형질감염) 또는 리포좀 (예를 들어, 양이온성 리포좀)을 사용한 형질감염), 미세 주사, 전기 천공, 세포 압착, 소노포레이션, 원형질체 융합, 임페일펙션, 유체역학적 전달, 유전자 총, 마그네토펙션, 바이러스 형질감염 및 뉴클레오펙션을 포함한다. 더욱이, 관련 기술분야에 공지된 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을 사용하여, CAR 핵산을 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포) 내로 도입하고/하거나 다른 유전적 변형 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같음)을 이펙터 세포 (예를 들어, T) 내로 도입하여 CAR 세포 활성을 증강시킬 수 있다 (CAR T 세포와 연계해서 CRISPR/Cas9 기술을 사용하는 것에 관해서는, 예를 들어, US 9,890,393; US 9,855,297; US 2017/0175128; US 2016/0184362; US 2016/0272999; WO 2015/161276; WO 2014/191128; CN 106755088; CN 106591363; CN 106480097; CN 106399375; CN 104894068을 참조할 수 있음).
각각의 세포가 CAR (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 중 임의의 것)을 발현할 수 있는 본원에 기재된 세포 또는 조성물 중 임의의 것을 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법이 본원에 제공된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 항원-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 항원-결합 도메인이 항원에 결합할 때 T 세포를 자극하기에 충분한 CD3ζ 서열의 세포질 서열, 및 임의적으로, 항원-결합 도메인이 항원에 결합할 때 T 세포의 공동-자극을 제공하는 하나 이상 (예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)의 공동-자극성 단백질의 세포질 서열 (예를 들어, B7-H3, BTLA, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD80, CD160, CD244, ICOS, LAG3, LFA-1, LIGHT, NKG2C, 4-1BB, OX40, PD-1, PD-L1, TIM3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상의 세포질 서열)을 포함하는 세포질 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 링커를 추가로 포함할 수 있다. CAR의 비-제한적 측면 및 특색이 하기에 기재된다. 예시적인 항원-결합 도메인, 링커, 막횡단 도메인, 및 세포질 시그널링 도메인을 포함한, CAR 및 CAR 세포의 부가의 측면이, 예를 들어, 문헌 [Kakarla et al., Cancer J. 20:151-155, 2014; Srivastava et al., Trends Immunol. 36:494-502, 2015; Nishio et al., Oncoimmunology 4(2): e988098, 2015; Ghorashian et al., Br. J. Haematol. 169:463-478, 2015; Levine, Cancer Gene Ther. 22:79-84, 2015; Jensen et al., Curr. Opin. Immunol. 33:9-15, 2015; Singh et al., Cancer Gene Ther. 22:95-100, 2015; Li et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1753-1756, 2014; Gill et al., Immunol. Rev. 263:68-89, 2015; Magee et al., Discov. Med. 18:265-271, 2014; Gargett et al., Front. Pharmacol. 5:235, 2014; Yuan et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1137-1141, 2014; Pedgram et al., Cancer J. 20:127-133, 2014; Eshhar et al., Cancer J. 20:123-126, 2014; Ramos et al., Cancer J. 20:112-118, 2014; Maus et al., Blood 123:2625-2635, 2014; Jena et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 9:50-56, 2014; Maher et al., Curr. Gene Ther. 14:35-43, 2014; Riches et al., Discov. Med. 16:295-302, 2013; Cheadle et al., Immunol. Rev. 257:83-90, 2014; Davila et al., Int. J. Hematol. 99:361-371, 2014; Xu et al., Cancer Lett. 343:172-178, 2014; Kochenderfer et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267-276, 2013; Hosing et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 8:60-70, 2013; Hombach et al., Curr. Mol. Med. 13:1079-1088, 2013; Xu et al., Leuk. Lymphoma 54:255-260, 2013; Gilham et al., Trends Mol. Med. 18:377-384, 2012; Lipowska-Bhalla et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:953-962, 2012; Chmielewski et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:1269-1277, 2013; Jena et al., Blood 116:1035-1044, 2010; Dotti et al., Immunology Reviews 257(1): 107-126, 2013; Dai et al., Journal of the National Cancer Institute 108(7): djv439, 2016; Wang and Riviere, Molecular Therapy-Oncolytics 3: 16015, 2016]; 미국 특허 출원 공개 번호 2018/0057609; 2018/0037625; 2017/0362295; 2017/0137783; 2016/0152723, 2016/0206656, 2016/0199412, 2016/0208018, 2015/0232880, 2015/0225480; 2015/0224143; 2015/0224142; 2015/0190428; 2015/0196599; 2015/0152181; 2015/0140023; 2015/0118202; 2015/0110760; 2015/0099299; 2015/0093822; 2015/0093401; 2015/0051266; 2015/0050729; 2015/0024482; 2015/0023937; 2015/0017141; 2015/0017136; 2015/0017120; 2014/0370045; 2014/0370017; 2014/0369977; 2014/0349402; 2014/0328812; 2014/0322275; 2014/0322216; 2014/0322212; 2014/0322183; 2014/0314795; 2014/0308259; 2014/0301993; 2014/0296492; 2014/0294784; 2014/0286973; 2014/0274909; 2014/0274801; 2014/0271635; 2014/0271582; 2014/0271581; 2014/0271579; 2014/0255363; 2014/0242701; 2014/0242049; 2014/0227272; 2014/0219975; 2014/0170114; 2014/0134720; 2014/0134142; 2014/0120622; 2014/0120136; 2014/0106449; 2014/0106449; 2014/0099340; 2014/0086828; 2014/0065629; 2014/0050708; 2014/0024809; 2013/0344039; 2013/0323214; 2013/0315884; 2013/0309258; 2013/0288368; 2013/0287752; 2013/0287748; 2013/0280221; 2013/0280220; 2013/0266551; 2013/0216528; 2013/0202622; 2013/0071414; 2012/0321667; 2012/0302466; 2012/0301448; 2012/0301447; 2012/0060230; 2011/0213288; 2011/0158957; 2011/0104128; 2011/0038836; 2007/0036773; 및 2004/0043401에 기재되어 있다. 예시적인 항원-결합 도메인, 링커, 막횡단 도메인, 및 세포질 시그널링 도메인을 포함한, CAR 및 CAR 세포의 부가의 측면이 WO 2016/168595; WO 12/079000; 2015/0141347; 2015/0031624; 2015/0030597; 2014/0378389; 2014/0219978; 2014/0206620; 2014/0037628; 2013/0274203; 2013/0225668; 2013/0116167; 2012/0230962; 2012/0213783; 2012/0093842; 2012/0071420; 2012/0015888; 2011/0268754; 2010/0297093; 2010/0158881; 2010/0034834; 2010/0015113; 2009/0304657; 2004/0043401; 2014/0322253; 2015/0118208; 2015/0038684; 2014/0024601; 2012/0148552; 2011/0223129; 2009/0257994; 2008/0160607; 2008/0003683; 2013/0121960; 2011/0052554; 및 2010/0178276에 기재되어 있다.
A. 항원 결합 도메인
키메라 항원 수용체 (CAR) 내에 포함된 항원 결합 도메인은 항원 (예를 들어, 종양 연관 항원 (TAA) 또는 비-암성 세포 상에서 발현되지 않는 항원) 또는 범용 수용체 (예를 들어, 태그)에 특이적으로 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인의 비-제한적 예는: 모노클로날 항체 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, 및 IgD) (예를 들어, 완전한 인간 또는 키메라 (예를 들어, 인간화) 항체), 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편) (예를 들어, 완전한 인간 또는 키메라 (예를 들어, 인간화) 항체의 단편), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, scFv, scFv-Fc, (scFv)2, scFab, 비스-scFv, hc-IgG, BiTE, 단일 도메인 항체 (예를 들어, V-NAR 도메인 또는 VhH 도메인), IgNAR, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다. 이들 항원-결합 도메인을 제조하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 예컨대 이뮤노글로불린 분자 (예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 이뮤노글로불린 분자) 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 (항원-결합) 단편의 적어도 하나의 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의) CDR (예를 들어, 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인으로부터의 3개의 CDR 중 임의의 것 또는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인으로부터의 3개의 CDR 중 임의의 것)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 단일 쇄 항체 (예를 들어, V-NAR 도메인 또는 VHH 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 단일 쇄 항체 중 임의의 것)이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 완전 항체 분자 (예를 들어, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체) 또는 다량체성 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체)이다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 항체 단편 및 다중-특이적 (예를 들어, 이중-특이적) 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체 및 그의 항원-결합 단편의 예는 단일 쇄 Fv (scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 디술피드 연결된 Fv (sdFv), Fv, 및 VL 또는 VH 도메인을 함유하는 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 부가의 항원 결합 도메인은 폴리클로날, 모노클로날, 다중-특이적 (다량체성, 예를 들어, 이중-특이적), 인간 항체, 키메라 항체 (예를 들어, 인간-마우스 키메라), 단일 쇄 항체, 세포 내에서 만든 항체 (즉, 인트라바디), 및 그의 항원-결합 단편이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 IgG1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 예에서, 항원 결합 도메인은 IgG4 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이뮤노글로불린이다.
항원 결합 도메인의 부가의 예는 IgG의 항원-결합 단편 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 항원-결합 단편) (예를 들어, 인간 또는 인간화 IgG, 예를 들어, 인간 또는 인간화 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 항원-결합 단편), IgA의 항원-결합 단편 (예를 들어, IgA1 또는 IgA2의 항원-결합 단편) (예를 들어, 인간 또는 인간화 IgA, 예를 들어, 인간 또는 인간화 IgA1 또는 IgA2의 항원-결합 단편), IgD의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간 또는 인간화 IgD의 항원-결합 단편), IgE의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간 또는 인간화 IgE의 항원-결합 단편), 또는 IgM의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간 또는 인간화 IgM의 항원-결합 단편)이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 식염수 또는 인산염 완충 식염수에서, 약 1 x 10-7 M 이하 (예를 들어, 약 1 x 10-8 M 이하, 약 5 x 10-9 M 이하, 약 2 x 10-9 M 이하, 또는 약 1 x 10-9 M 이하)의 친화도 (KD)로 특정한 항원 (예를 들어, 종양-연관 항원)에 결합할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, CAR에 포함시킬 항원 결합 도메인의 선택은 그를 필요로 하는 대상체에서 표적화될 세포 (예를 들어, 암 세포 또는 종양)의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 의존하고/하거나, 양친매성 리간드 접합체 상에 존재하는 리간드에 의존한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택되거나, 또는 종양-연관 항원 (예를 들어, CD19, CD30, Her2/neu, EGFR 또는 BCMA) 또는 종양-특이적 항원 (TSA)이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 양친매성 리간드 접합체 상의 리간드를 인식한다.
일부 실시양태에서, CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 종양 항원에 결합하는 (예를 들어, 종양 항원 결합 도메인을 포함하는) CAR 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 분자는 고형 종양 (예를 들어, 유방암, 결장암 등)의 종양 항원을 인식하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 분자는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 탠덤 CAR 분자이다. 일부 실시양태에서, CAR 분자는 혈액 악성종양 (예를 들어, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 버킷 림프종 및 변연부 B 세포 림프종, 진성 적혈구증가증, 호지킨병, 비-호지킨병, 다발성 골수종 등)의 종양 항원을 인식하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원 (TSA)이다. TSA는 종양 세포에 대해 독특하고, 체내의 다른 세포 상에서는 발생하지 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 종양-연관 항원 (TAA)이다. TAA는 종양 세포에 대해 독특하지 않고, 대신에, 항원에 대한 면역학적 관용 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포 상에 발현되기도 한다. 종양 상에서의 항원의 발현은 면역 체계가 항원에 반응할 수 있게 해주는 조건 하에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, TAA는 면역 체계가 미성숙하고 반응할 수 없는 태아 발달기 동안 정상 세포 상에 발현되거나, 또는 정상 세포 상에서는 극히 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현된다.
특정 실시양태에서, 종양-연관 항원은 환자의 종양 세포를 시퀀싱하고 종양에서만 발견되는 돌연변이된 단백질을 확인함으로써 결정된다. 이들 항원은 "신생 항원"으로서 지칭된다. 일단 신생 항원이 확인되면, 치료용 항체가 그에 대항하여 생산될 수 있고, 이를 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양 항원은 상피암 항원 (예를 들어, 유방, 위장, 폐), 전립선 특이적 암 항원 (PSA) 또는 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 방광암 항원, 폐 (예를 들어, 소세포 폐) 암 항원, 결장암 항원, 난소암 항원, 뇌암 항원, 위암 항원, 신장 세포 암종 항원, 췌장암 항원, 간암 항원, 식도암 항원, 두경부암 항원, 또는 결장직장암 항원이다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 림프종 항원 (예를 들어, 비-호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종), B-세포 림프종 암 항원, 백혈병 항원, 골수종 (예를 들어, 다발성 골수종 또는 형질 세포 골수종) 항원, 급성 림프모구성 백혈병 항원, 만성 골수성 백혈병 항원, 또는 급성 골수성 백혈병 항원이다.
CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)에 의해 표적화될 수 있는 종양 항원 (예를 들어 종양-연관 항원 (TAA) 및 종양-특이적 항원 (TSA))은 1GH-IGK, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 아시클로필린 C-연관 단백질, 알파-태아 단백질 (AFP), α-악티닌-4, A3, A33 항체에 특이적인 항원, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, BCR-ABL, 베타-카테닌, 베타-HCG, BrE3-항원, BCA225, BTAA, CA125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA195, CA242, CA-50, CAM43, CAMEL, CAP-1, 탄산 탈수 효소 IX, c-Met, CA19-9, CA72-4, CAM 17.1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD68, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK4, CDK4m, CDKN2A, CO-029, CTLA4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1a, 결장-특이적 항원-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-Met, DAM, E2A-PRL, EGFR, EGFRvIII, EGP-1 (TROP-2), EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, 섬유모세포 성장 인자 (FGF), FGF-5, Flt-1, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 항원, Ga733VEpCAM, GAGE, gp100, GRO-β, H4-RET, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG) 및 그의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자 (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, HTgp-175, Ia, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-λ, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), KC4-항원, KSA, KS-1-항원, KS1-4, LAGE-1a, Le-Y, LDR/FUT, M344, MA-50, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), MAGE, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MART-1, MART-2, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MG7-Ag, MOV18, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC13, MUC16, MUM-1/2, MUM-3, MYL-RAR, NB/70K, Nm23H1, NuMA, NCA66, NCA95, NCA90, NY-ESO-1, p15, p16, p185erbB2, p180erbB3, PAM4 항원, 췌장암 뮤신, PD1 수용체 (PD-1), PD-1 수용체 리간드 1 (PD-L1), PD-1 수용체 리간드 2 (PD-L2), PI5, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, Pmel17 전립선 산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, PlGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RCAS1, RS5, RAGE, RANTES, Ras, T101, SAGE, S100, 서비빈(survivin), 서비빈-2B, SDDCAG16, TA-90＼Mac2 결합 단백질, TAAL6, TAC, TAG-72, TLP, 테나신, TRAIL 수용체, TRP-1, TRP-2, TSP-180, TNF-α, Tn 항원, 톰센-프리덴라이히 항원, 종양 괴사 항원, 티로시나제, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관 형성 마커, bc1-2, bc1-6, 및 K-ras, 종양 유전자 마커 및 종양 유전자 산물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32; Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79; Novellino et al. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207] 참조).
일부 실시양태에서, 종양 항원은 인간 만성 질환 또는 암 (예컨대, 자궁 경부암)과 연관된 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 바이러스 항원은 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), HPV 항원 E6 및/또는 E7, C형 간염 바이러스 (HCV), B형 간염 바이러스 (HBV), 또는 시토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된다.
예시적인 암 또는 종양 및 이러한 종양과 연관된 특이적 종양 항원은 급성 림프모구성 백혈병 (etv6, aml1, 시클로필린 b), B 세포 림프종 (Ig-이디오타입), 신경교종 (E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌, γ-카테닌, p120ctn), 방광암 (p21ras), 담도암 (p21ras), 유방암 (MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 자궁 경부 암종 (p53, p21ras), 결장 암종 (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 패밀리), 결장직장암 (결장직장 연관 항원 (CRC)-CO17-1A/GA733, APC), 융모막 암종 (CEA), 상피 세포암 (시클로필린 b), 위암 (HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 간세포암 (α-태아 단백질), 호지킨 림프종 (Imp-1, EBNA-1), 폐암 (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), 림프 세포-유래 백혈병 (시클로필린 b), 흑색종 (p5 단백질, gp75, 종양 태아성 항원, GM2 및 GD2 강글리오시드, 멜란(Melan)-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100), 골수종 (MUC 패밀리, p21ras), 비소세포 폐 암종 (HER2/neu, c-erbB-2), 비인두암 (Imp-1, EBNA-1), 난소암 (MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 전립선암 (전립선 특이적 항원 (PSA) 및 그의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 신장암 (HER2/neu, c-erbB-2), 자궁 경부 및 식도의 편평 세포암, 고환암 (NY-ESO-1), 및 T 세포 백혈병 (HTLV-1 에피토프), 및 바이러스 산물 또는 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 메소텔린 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다 (즉, CAR T 세포는 메소텔린을 특이적으로 인식함). 메소텔린은 난소암, 폐암 및 췌장암을 포함한 다양한 암에서 과다 발현되는 종양 항원이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 CD19 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 HER2 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 EGFR 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다.
일부 실시양태에서, CD19 표적화 또는 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 CAR 이펙터 세포는 킴리아™ (티사젠렉류셀; 노바티스; WO 2016109410 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조) 또는 예스카르타™ (악시캅타진 실로류셀; 카이트; US 20160346326 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조)이다.
B. 링커
(1) 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이의 링커 및/또는 (2) 막횡단 도메인과 세포질 시그널링 도메인 사이의 링커를 임의적으로 포함할 수 있는 CAR이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 약 1개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 8개 아미노산, 약 6개 아미노산, 약 4개 아미노산, 또는 약 2개 아미노산; 약 2개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 8개 아미노산, 약 6개 아미노산, 또는 약 4개 아미노산; 약 4개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 8개 아미노산, 또는 약 6개 아미노산; 약 6개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 10개 아미노산, 또는 약 8개 아미노산; 약 8개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 12개 아미노산, 또는 약 10개 아미노산; 약 10개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 약 14개 아미노산, 또는 약 12개 아미노산; 약 12개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 약 16개 아미노산, 또는 약 14개 아미노산; 약 14개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 18개 아미노산, 또는 약 16개 아미노산; 약 16개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 20개 아미노산, 또는 약 18개 아미노산; 약 18개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 25개 아미노산, 또는 약 20개 아미노산; 약 20개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 30개 아미노산, 또는 약 25개 아미노산; 약 25개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 35개 아미노산, 또는 약 30개 아미노산; 약 30개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 40개 아미노산, 또는 약 35개 아미노산; 약 35개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 50개 아미노산, 또는 약 40개 아미노산; 약 40개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 60개 아미노산, 또는 약 50개 아미노산; 약 50개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 70개 아미노산, 또는 약 60개 아미노산; 약 60개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 약 80개 아미노산, 또는 약 70개 아미노산; 약 70개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 90개 아미노산, 또는 약 80개 아미노산; 약 80개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 100개 아미노산, 또는 약 90개 아미노산; 약 90개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 200개 아미노산, 또는 약 100개 아미노산; 약 100개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 300개 아미노산, 또는 약 200개 아미노산; 약 200개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 400개 아미노산, 또는 약 300개 아미노산; 약 300개 아미노산 내지 약 500개 아미노산 또는 약 400개 아미노산; 또는 약 400개 아미노산 내지 약 500개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
링커의 부가의 예 및 측면은 본원에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있으며, 따라서 그 전문이 본원에 포함된다.
C. 막횡단 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR은 또한, 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포질 도메인 내의 서열과 자연적으로 회합한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 다른 막횡단 도메인 (예를 들어, 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인)에 대한 도메인의 결합을 피하여 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 상호작용을 최소화시키는 하나 이상 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개)의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 자연 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 임의의 막 결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용될 수 있는 막횡단 도메인의 비-제한적 예는 알파, 베타, 또는 제타 쇄의 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD33, CD37, CD64, CD80, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 적어도 그의 막횡단 서열 또는 막횡단 서열의 일부를 포함함).
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성일 수 있다. 예를 들어, 막횡단 도메인이 합성 공급원으로부터 유래되는 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 소수성 잔기 (예를 들어, 류신 및 발린)를 포함할 수 있다 (예를 들어, 주로 포함할 수 있음). 일부 실시양태에서, 합성 막횡단 도메인은 합성 막횡단 도메인의 말단에 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개)의 삼중자를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, CAR의 막횡단 도메인은 CD8 힌지 도메인을 포함할 수 있다.
막횡단 도메인의 부가의 구체적 예는 본원에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.
D. 세포질 도메인
또한 예를 들어, 항원 결합 도메인이 항원에 결합할 때 T 세포를 자극하기에 충분한 CD3ζ의 세포질 서열, 및 임의적으로, T 세포의 공동-자극을 제공하는 공동-자극성 단백질 중 하나 이상의 세포질 서열 (예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40L, CD40, PD-1, PD-L1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD160, LIGHT, BTLA, TIM3, CD244, CD80, LAG3, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 ITAM 서열 중 임의의 것 중 하나 이상의 세포질 서열)을 포함하는 세포질 시그널링 도메인을 포함하는 CAR 분자가 본원에 제공된다. CAR 면역 이펙터 세포의 자극은 CAR 면역 이펙터 세포의 한 가지 이상의 항암 활성을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CAR 면역 이펙터 세포의 자극은 시토카인의 분비를 포함하여 CAR 면역 이펙터 세포의 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 공동-자극성 단백질의 전체 세포내 시그널링 도메인이 세포질 시그널링 도메인 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 공동-자극성 단백질의 세포내 시그널링 도메인의 말단절단된 부분 (예를 들어, CAR 면역 이펙터 세포 내의 이펙터 기능 시그널을 변환시키는 세포내 시그널링 도메인의 말단절단된 부분)을 포함한다. 세포질 시그널링 도메인에 포함될 수 있는 세포내 시그널링 도메인의 비-제한적 예는 항원 수용체 결속 후 시그널 변환을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동-수용체의 세포질 서열 뿐만 아니라 적어도 하나 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개)의 치환을 포함하고 동일하거나 또는 거의 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 2가지 별개의 부류의 세포질 시그널링 서열을 포함할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적 활성화를 개시하는 시그널링 서열 (1차 세포질 시그널링 서열) (예를 들어, CD3ζ 세포질 시그널링 서열), 및 2차 또는 공동-자극성 시그널을 제공하기 위해 항원-비의존적 방식으로 작용하는 공동-자극성 단백질 중 하나 이상의 세포질 서열 (2차 세포질 시그널링 서열).
일부 실시양태에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 시그널링 도메인을 단독으로 포함하거나 또는 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 시그널링 서열(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 예에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 쇄 부분 및 공동자극성 세포질 시그널링 서열을 포함할 수 있다. 공동자극성 세포질 시그널링 서열은 공동자극성 단백질 (예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드)의 세포질 시그널링 서열을 포함한 CAR의 일부분을 지칭한다.
일부 실시양태에서, CAR의 세포질 시그널링 도메인 내의 세포질 시그널링 서열은 무작위 순서로 위치된다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포질 시그널링 도메인 내의 세포질 시그널링 서열은 특이적 순서로 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커 (예를 들어, 본원에 기재된 링커 중 임의의 것)는 상이한 세포질 시그널링 서열 사이에 연결을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극성 단백질 CD28의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극성 단백질 4-1BB의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극성 단백질 CD28 및 4-1BB의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 4-1BB의 세포질 시그널링 서열을 포함하지 않는다.
CAR T 세포의 부가의 변형
또 다른 실시양태에서, CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)의 치료 효능은 메틸시토신 디옥시게나제 유전자 (예를 들어, Tet1, Tet2, Tet3)의 파괴에 의해 증강되며, 이는 PCT 공개 WO 2017/049166에 기재된 바와 같이, 증강된 증식, 이펙터 시토카인 생산의 조절 및 탈과립화와 관련하여 5-히드록시메틸시토신의 저하된 총 수준을 초래하며, 이로써 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포) 증식 및/또는 기능을 증가시킨다. 따라서, 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있고, 여기서 상기 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)에서의 Tet1, Tet2 및/또는 Tet3의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되었다.
또 다른 실시양태에서, CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포)의 치료 효능은 PCT 공개 WO 2016/126608 및 US 공개 번호 2018/0044424에 기재된 바와 같이, CAR을 구성적으로 발현하고 (무조건부 CAR로서 지칭됨), 암을 치료하는데 유용한 또 다른 작용제를 조건부로 발현하는 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)를 사용함으로써 증강된다. 이러한 실시양태에서, 조건부로 발현된 작용제는 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)의 활성화, 예를 들어, 무조건부 CAR의 그의 표적에 대한 결합 시에 발현된다. 한 실시양태에서, 조건부로 발현된 작용제는 CAR (본원에서 조건부 CAR로서 지칭됨)이다. 또 다른 실시 양태에서, 조건부로 발현된 작용제는 면역 반응의 체크포인트 억제제를 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 조건부로 발현된 작용제는 CAR의 효능을 개선 또는 증강시키며, 시토카인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CAR T 세포의 치료 효능은 PCT 공개 WO 2016/069282 및 US 공개 번호 2017/0335331에 기재된 바와 같이, TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자의 발현을 변경 (예를 들어, 하향 조정)할 수 있는 핵산으로 CAR T 세포를 변형시킴으로써 증강된다.
또 다른 실시양태에서, CAR T 세포의 치료 효능은 PCT 공개 WO 2015/112626 및 미국 공개 번호 2016/0340406에 기재된 바와 같이, T 세포에서 CAR 및 T 세포 프라이밍의 하나 이상의 인핸서 ("ETP")를 공동-발현함으로써 증강된다. ETP 성분을 CAR T 세포에 부가하는 것은 증강된 "전문적인" 항원-제시 세포 (APC) 기능을 부여한다. 한 실시양태에서, CAR 및 하나 이상의 ETP는 T 세포에서 일시적으로 공동-발현된다. 따라서, 조작된 T 세포는 안전하고 (CAR/ETP 발현의 일시적 성질을 고려해 보면), APC 기능을 통해 연장된 면역을 유도한다.
또 다른 실시양태에서, CAR T 세포의 치료 효능은 PCT 공개 WO 2016/055551 및 US 공개 번호 2017/0292118에 기재된 바와 같이, T 세포에서 CAR 및 결합 (또는 이량체화) 도메인을 포함하는 억제성 막 단백질 (IMP)을 공동-발현함으로써 증강된다. CAR 및 IMP는 특히 CAR 내에 포함된 제2 결합 도메인을 통해 가용성 화합물에 대해 둘 다가 반응성이 되도록 하며, 이로써, 이량체화 또는 리간드 인식에 의해, IMP에 의해 전달된 억제성 시그널링 도메인 및 CAR에 의해 전달된 시그널 변환 도메인의 공동-국재화를 허용하여, CAR 활성화를 감소시키는 효과를 갖는다. 억제성 시그널링 도메인은 바람직하게는, 프로그래밍된 사멸-1 (PD-1)이며, 이는 IL-2 생산 및 T-세포 증식의 T-세포 수용체 (TCR)-매개된 활성화를 약화시킨다.
또 다른 실시양태에서, CAR T 세포의 치료 효능은 PCT 공개 WO 2017/032777에 기재된 바와 같이, 작은 분자의 부가 시 항원-결합 도메인을 함유하는 CAR의 세포외 부분의 입체 형태에 있어서의 제어된 변동이 수득되는 시스템을 사용하여 증강된다. 이러한 통합된 시스템은 항원과 항원 결합 도메인 사이의 상호작용을 온/오프 상태 사이에서 전환시킨다. CAR의 세포외 부분의 입체 형태를 제어할 수 있게 함으로써, CAR T 세포의 하류 기능, 예컨대 세포독성이 직접적으로 조정될 수 있다. 따라서, CAR은 a) i) 세포외 항원 결합 도메인; 및 ii) 미리 결정된 다가 리간드에 결합하여 하기 2개의 결합 도메인 및 이들에 결합할 수 있는 다가 리간드를 포함하는 다량체를 형성할 수 있는 적어도 제1 다량체화 리간드-결합 도메인 및 제2 다량체화 리간드-결합 도메인을 포함하는 스위치 도메인을 포함하는 적어도 하나의 엑토도메인; b) 적어도 하나의 막횡단 도메인; 및 c) 시그널 변환 도메인 및 임의적으로 공동-자극성 도메인을 포함하는 적어도 하나의 엔도도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 스위치 도메인은 세포외 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치한다.
양친매성 접합체
A. 개요
아주반트 또는 항원 (예를 들어, 펩티드)을 친유성 중합체 꼬리에 연결하여 림프절로의 백신의 국재화를 촉진시키는 것을 수반하는 양친매성 물질 백신 기술이 개발되었다 (Liu et al. (2014) Nature 507:519-522). 이러한 양친매성 물질-항원 (예를 들어, amph-펩티드)은 또한, 세포 막 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al. (2011) Angewandte Chemie-Intl. Ed. 50:7052-7055] 참조). 따라서, 본 개시내용은 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)를 자극하고, 확장시키고, 활성화시키는데 사용하기 위한 CAR 리간드를 포함하는 양친매성 접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 접합체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 접합체는 특이적 표적, 예컨대 종양-연관 항원에 대항한 특이적 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 접합체는 생체내에서 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)의 증식을 자극한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 양친매성 접합체는 본원에서 양친매성 리간드 접합체로서 지칭된 CAR 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체는 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이는 본원에서 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체로서 지칭된다.
도 1a에 제시된 바와 같이, 친유성 모이어티 또는 "지질 꼬리" (예를 들어, DSPE)가 링커 (예를 들어, PEG-2000)를 통해 CAR 리간드에 연결 (예를 들어, 공유적으로 연결)되는 다양한 양친매성 리간드 접합체 구조가 개시되어 있다. 이러한 디자인의 모듈성은 작은 분자 (예를 들어 FITC), 짧은 펩티드 (예를 들어, CAR에 특이적인 에피토프를 제공하는 선형 펩티드), 또는 모듈식 단백질 도메인 (예를 들어, CAR에 특이적인 입체 형태적 에피토프를 제공하는 폴딩된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 리간드가 지질에 (예를 들어, 공유적으로) 연결될 수 있게 하여, 맞춤형 특이성을 갖는 양친매성 리간드 접합체를 생성한다.
이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체는 지질 꼬리 부분이 항원 제시 세포 (APC)의 막 내로 삽입되는 림프절에 주로 전달되어, APC를 CAR 리간드로 장식하는 것으로 여겨진다 (도 1b). 내장된 CAR 리간드는 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포) (이는 본 개시내용의 양친매성 리간드 접합체의 투여 전에, 투여 후에, 또는 그의 투여와 공동으로 투여됨)의 표면 상에 발현된 CAR에 대한 특이적 표적으로서 기능하여, CAR 발현 세포를 CAR 리간드-장식된 APC로 동원시켜 준다. CAR과 상기 내장된 CAR-리간드의 상호작용은 CAR을 통해 자극성 시그널을 제공하는 반면, APC는 다른 자연적으로 발생하는 공동-자극성 시그널을 부가적으로 제시하여, 최적의 CAR 발현 세포 활성화, 연장된 생존 및 효율적인 기억 형성을 초래한다.
B. 지질 접합체
특정 실시양태에서, US 2013/0295129 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 지질 접합체 (예를 들어, 양친매성 접합체)가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 세포 막 내로 삽입되는 소수성 꼬리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 생체내에서 림프절에 접합체를 효율적으로 표적화하기 위해 알부민-결합 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 소수성 꼬리를 포함하는 알부민-결합 지질을 포함하며, 여기서 소수성 꼬리는 세포 막 내로 삽입되고, 접합체는 생체내에서 림프절에 효율적으로 표적화된다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 내인성 알부민에 결합하며, 이는 항원 제시 세포에 의한 알부민의 여과로 인해 이들이 축적되는 림프관 및 배액 림프절을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 항원성 펩티드 또는 분자 아주반트를 포함하며, 이로써 강건한 면역 반응을 유도 또는 증강시킨다. 일부 실시양태에서, 지질 접합체는 CAR 리간드를 포함하며, 이로써 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR 이펙터 세포, 예를 들어, CAR-T 세포)의 확장, 증식 및/또는 활성화를 유도 또는 증강시킨다. CAR 리간드를 포함하는 지질 접합체는 상기 정의된 바와 같은 "양친매성 리간드 접합체"로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 림프절에 효율적으로 표적화된 지질 접합체는 "림프절-표적화 접합체"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 림프절-표적화 접합체는 고도로 친유성인 알부민-결합 도메인 (예를 들어, 알부민-결합 지질), 및 카고, 예컨대 CAR 리간드 또는 분자 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 림프절-표적화 접합체는 3개의 도메인, 즉 고도로 친유성인 알부민-결합 도메인 (예를 들어, 알부민-결합 지질), 카고, 예컨대 CAR 리간드 또는 분자 아주반트, 및 접합체의 용해도를 촉진시키고 세포성 원형질막 내로 삽입할 수 있는 지질의 능력을 감소시키는 극성 블록 링커를 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 접합체의 일반적인 구조는 L-P-C이며, 여기서 "L"은 알부민-결합 지질이고, "P"는 극성 블록이며, "C"는 카고, 예컨대 CAR 리간드 또는 분자 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 카고 자체는 또한, 극성 블록 도메인으로서 작용할 수 있으며, 별도의 극성 블록 도메인이 필요하지 않다. 따라서, 특정 실시양태에서, 접합체는 단지 2가지 도메인, 즉 알부민-결합 지질 및 카고를 갖는다.
일부 실시양태에서, 접합체의 카고는 CAR 리간드이며, 이로써 양친매성 리간드 접합체가 생성된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체는 아주반트와 함께 투여되거나 또는 제형화되며, 여기서 아주반트는 카고로서, 분자 아주반트, 예컨대 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 또는 펩티드 항원을 포함하는 양친매성 리간드이다.
(i) 지질
일부 실시양태에서, 양친매성 접합체의 지질 성분은 소수성 꼬리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 꼬리는 세포 막 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 지질은 선형, 분지형, 또는 시클릭이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 12개 초과의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 13개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 14개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 15개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 16개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 17개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 18개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 19개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 20개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 21개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 22개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 23개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 24개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 25개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 26개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 27개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 28개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 29개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 30개의 탄소이다. 일부 실시양태에서, 지질은 그 길이가 적어도 17개 내지 18개의 탄소이지만, 림프절에 대한 우수한 알부민 결합 및 적당한 표적화를 나타내는 경우에는 더 짧을 수도 있다.
림프절-표적화 접합체는 림프를 통해 전달 부위로부터 림프절로 트래픽킹될 수 있는 양친매성 리간드 접합체 및 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성은 대상체의 혈액에서 알부민과 회합할 수 있는 접합체의 능력에 부분적으로 의존한다. 따라서, 림프절-표적화된 접합체는 전형적으로, 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합할 수 있는 지질을 포함한다. 림프절을 표적화하는데 적합한 지질은 알부민에 결합할 수 있는 지질, 또는 이러한 지질을 포함한 지질 접합체의 능력에 기반하여 선택될 수 있다. 알부민에 결합할 수 있는 지질 또는 지질 접합체의 능력을 시험하는데 적합한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 복수 개의 지질 접합체가 수용액에서 자발적으로 미셀을 형성하게 한다. 미셀은 알부민, 또는 알부민을 포함한 용액, 예컨대 소 태아 혈청 (FBS)과 함께 인큐베이션된다. 샘플은, 예를 들어, ELISA, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 결합이 발생했는지를 결정하는 다른 방법에 의해 분석될 수 있다. 알부민, 또는 알부민을 포함한 용액, 예컨대 소 태아 혈청 (FBS)의 존재 하에, 미셀이 해리되고 지질 접합체가 상기 논의된 바와 같이 알부민에 결합하는 경우, 지질 접합체는 림프절-표적화 접합체로서 선택될 수 있다.
림프절 표적화 지질 접합체에 사용하는데 바람직한 지질의 예는 선형 불포화 및 포화 지방산, 분지형 포화 및 불포화 지방산, 및 지방산 유도체, 예컨대 지방산 에스테르, 지방산 아미드, 및 지방산 티오에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는 8-30개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산; 디아실 지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 및 스테로이드산, 예컨대 담즙산, 지질 A 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 지질은 포화된다. 일부 실시양태에서, 지질은 8-30, 12-30, 15-25, 또는 16-20개의 탄소를 포함하는 적어도 하나의 지질 꼬리를 포함한다.
특정 실시양태에서, 지질은 디아실 지질 또는 양쪽 꼬리가 있는 지질이다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질 내의 꼬리는 약 8개 내지 약 30개의 탄소를 함유하며, 포화 또는 불포화될 수 있거나, 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화된다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 약 8개 내지 약 30개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 12개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 13개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 14개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 15개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 16개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 17개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 18개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 19개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 20개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 21개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 22개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 23개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 24개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 25개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 26개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 27개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 28개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 29개의 탄소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 포화되고 각각의 꼬리는 30개의 탄소를 포함한다. 꼬리는 에스테르 결합 연결, 아미드 결합 연결, 티오에스테르 결합 연결 또는 그의 조합을 통해 헤드 기에 커플링될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 디아실 지질은 포스페이트 지질, 당지질, 스핑고지질 또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 US 9,107,904 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 합성된다. 일부 실시양태에서, 디아실 지질은 하기에 제공된 바와 같이 합성된다:
Figure pct00001
바람직하게는, 림프절-표적화 접합체는 그 길이가 8개 이상의 탄소 단위인 지질을 포함한다. 지질 단위의 수를 증가시키면, 지질이 세포의 원형질막 내로 삽입되는 것을 감소시켜, 지질 접합체가 알부민에 자유롭게 결합하여 림프절로 트래픽킹할 수 있는 것으로 여겨진다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 지질은 2개의 C18 탄화수소 꼬리로 구성된 디아실 지질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 림프절 표적화 지질 접합체를 제조하는데 사용하기 위한 지질은 단일 쇄 탄화수소 (예를 들어, C18)가 아니다.
(ii) 분자 아주반트
특정 실시양태에서, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체는 양친매성 리간드 접합체와 함께 사용된다. 올리고뉴클레오티드 접합체는 전형적으로, 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 함유한다.
특정 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 패턴 인식 수용체 (PRR)에 대한 리간드로서 작용할 수 있다. PRR의 예는 선천성 면역 반응의 개시에 있어서 일정 역할을 하고 또한 이후의 보다 항원 특이적 적응 면역 반응에 영향을 주는 시그널링 분자의 톨-유사 패밀리를 포함한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 패밀리 시그널링 분자, 예컨대 톨-유사 수용체 9 (TLR9)에 대한 리간드로서 작용할 수 있다.
예를 들어, 메틸화되지 않은 CpG 부위는 인간에서 형질 세포양 수지상 세포 및 B 세포 상의 TLR9에 의해 검출될 수 있다 (Zaida, et al., Infection and Immunity, 76(5):2123-2129, (2008)). 따라서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 하나 이상의 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 (CG 또는 CpG, 상호교환가능하게 사용됨) 디뉴클레오티드 모티프를 포함할 수 있다. 'p'는 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, DNA의 포스포디에스테르 골격을 지칭하고, CG를 포함한 일부 올리고뉴클레오티드는 변형된 골격, 예를 들어 포스포로티오에이트 (PS) 골격을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 연속적으로 배열되거나 또는 개재 뉴클레오티드(들)에 의해 분리된 2개 이상의 CG 디뉴클레오티드를 함유할 수 있다. CpG 모티프(들)는 올리고뉴클레오티드 서열의 내부에 있을 수 있다. 다수의 뉴클레오티드 서열은 CG 디뉴클레오티드(들)의 수 및 위치에 있어서의 변동 뿐만 아니라 CG 이량체를 플랭킹하는 정확한 염기 서열에 있어서의 변동으로 TLR9를 자극한다.
전형적으로, CG ODN은 그의 서열, 2차 구조 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 영향에 기반하여 분류된다. 5가지 클래스는 클래스 A (유형 D), 클래스 B (유형 K), 클래스 C, 클래스 P 및 클래스 S이다 (Vollmer, J & Krieg, A M, Advanced drug delivery reviews 61(3): 195-204 (2009); 본원에 참조로 포함됨). CG ODN은 유형 I 인터페론 (예를 들어, IFNα)의 생산을 자극하고 수지상 세포 (DC)의 성숙을 유도할 수 있다. 일부 클래스의 ODN은 또한, 간접 시토카인 시그널링을 통한 자연 킬러 (NK) 세포의 강력한 활성화제이다. 일부 클래스는 인간 B 세포 및 단핵구 성숙의 강력한 자극인자이다 (Weiner, G L, PNAS USA 94(20): 10833-7 (1997); Dalpke, A H, Immunology 106(1): 102-12 (2002); Hartmann, G, J of Immun. 164(3):1617-2 (2000); 이의 각각이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에 따르면, 친유성-CpG 올리고뉴클레오티드 접합체는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용된다. 친유성-CpG 올리고뉴클레오티드는 하기로써 나타내며, 여기서 "L"은 친유성 화합물, 예컨대 디아실 지질이고, "Gn"은 구아닌 반복 링커이며, "n"은 1, 2, 3, 4 또는 5를 나타낸다.
5'-L-GnTCCATGACGTTCCTGACGTT-3'
다른 PRR 톨-유사 수용체는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 및 짧은 이중-가닥 RNA를 각각 인식할 수 있는 TLR3 및 TLR7, 및 시토졸에서 RNA-감지 수용체로서 가장 잘 공지되어 있는 레티노산-유도성 유전자 I (RIG-I)-유사 수용체, 즉 RIG-I 및 흑색종 분화-연관 유전자 5 (MDA5)를 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 TLR3, TLR7 또는 RIG-I-유사 수용체, 또는 그의 조합에 대한 기능적 리간드를 함유한다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드의 예 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Bodera, P. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 5(1):87-93 (2011)] 참조; 본원에 참조로 포함됨).
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 카고는 둘 이상의 면역자극성 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 5개 뉴클레오티드 염기 길이, 10개 뉴클레오티드 염기 길이, 15개 뉴클레오티드 염기 길이, 20개 뉴클레오티드 염기 길이, 25개 뉴클레오티드 염기 길이, 30개 뉴클레오티드 염기 길이, 35개 뉴클레오티드 염기 길이, 40개 뉴클레오티드 염기 길이, 45개 뉴클레오티드 염기 길이, 50개 뉴클레오티드 염기 길이, 60개 뉴클레오티드 염기 길이, 70개 뉴클레오티드 염기 길이, 80개 뉴클레오티드 염기 길이, 90개 뉴클레오티드 염기 길이, 95개 뉴클레오티드 염기 길이, 98개 뉴클레오티드 염기 길이, 100개 뉴클레오티드 염기 길이 또는 그 초과를 포함한 2 내지 100개 뉴클레오티드 염기 길이일 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단은 극성 블록 또는 지질과 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 극성 블록 또는 지질에 연결된다.
올리고뉴클레오티드는 전형적으로 헤테로시클릭 염기 (핵산 염기), 헤테로시클릭 염기에 부착된 당 모이어티, 및 당 모이어티의 히드록실 작용기를 에스테르화하는 포스페이트 모이어티를 포함하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드일 수 있다. 주요 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 헤테로시클릭 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌, 및 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보스 또는 데옥시리보스 당을 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 대응물과 비교하여, 표적 수용체에 대한 안정성, 반감기, 또는 특이성 또는 친화성을 개선시키기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유사체로 구성된다. 화학적 변형은 핵염기, 당 모이어티, 뉴클레오티드 연결 또는 그의 조합의 화학적 변형을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "변형된 뉴클레오티드" 또는 "화학적으로 변형된 뉴클레오티드"는 헤테로시클릭 염기, 당 모이어티 또는 포스페이트 모이어티 구성분 중 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드로 정의된다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드의 전하는 동일한 핵염기 서열의 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드와 비교해서 감소된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 낮은 음전하, 비-전하 또는 양전하를 가질 수 있다.
전형적으로, 뉴클레오시드 유사체는 표준 폴리뉴클레오티드 염기에 대한 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성에 의해 수소 결합할 수 있는 염기를 지원하며, 여기서 상기 유사체 골격은 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA) 내의 염기 사이에 서열-특이적 방식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 특정 실시양태에서, 유사체는 실질적으로 하전되지 않은 인 함유 골격을 갖는다.
(iii) 키메라 항원 수용체 리간드
일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 항원성 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 종양-연관 항원 또는 그의 일부분이다. 일부 실시양태에서, CAR 리간드는 작은 분자, 펩티드 또는 단백질 도메인, 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 상기 리간드는 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR-T 세포) 상의 CAR에 결합한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)에 상보적인 양친매성 리간드 접합체를 활용한다. 일부 실시양태에서, CAR 리간드는 상기 기재된 CAR 중 어느 하나에 결합한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는, 예를 들어, 5개 아미노산, 10개 아미노산, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 25개 아미노산, 30개 아미노산, 35개 아미노산, 40개 아미노산, 45개 아미노산, 또는 50개 아미노산을 포함한 2-100개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 50개 초과 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 >100개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 단백질/펩티드는 선형, 분지형 또는 시클릭이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 D 아미노산, L 아미노산, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 또는 단백질은 이러한 펩티드 또는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서 극성 블록 또는 지질에 접합된다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 면역 체계가 단백질 또는 펩티드에 대한 항체 및 T-세포 반응을 발생할 수 있는 능력을 유도 또는 증가시킬 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 암 항원은 전형적으로 암 세포에 의해 우선적으로 발현되는 (즉, 비-암 세포보다는 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는) 항원이고, 일부 경우에는 암 세포에 의해서만 발현되는 항원이다. 암 항원은 암 세포 내에서 또는 암 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 암 항원은 CD19, TRP-1, TRP-2, MART-1/멜란-A, gp100, 아데노신 데아미나제-결합 단백질 (ADAbp), FAP, 시클로필린 b, 결장직장 연관 항원 (CRC)-C017-1A/GA733, 암배아 항원 (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, 전립선 특이적 항원 (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), T 세포 수용체/CD3-제타 쇄, 및 CD20일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 암 항원은 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-05), GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9, BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 패밀리, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아 단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌, γ-카테닌, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 결장 폴립증 단백질 (APC), 포드린, 코넥신 37, Ig-이디오타입, p15, gp75, GM2 강글리오시드, GD2 강글리오시드, 인간 유두종 바이러스 단백질, 종양 항원의 Smad 패밀리, lmp-1, P1A, EBV-코딩된 핵 항원 (EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, CD20, 또는 c-erbB-2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 정맥내 주입을 위한 킴리아™ (티사젠렉류셀; 노바티스) 현탁화제 (이전에는 CTL019)과 조합하여 사용된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 CAR 리간드가 CD19, 또는 그의 항원성 부분인 양친매성 리간드 접합체를 포함한다. 이러한 조성물은 암, 예를 들어, B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)의 치료를 위해, CD19-특이적 CAR-T 세포 (예를 들어, CD19-특이적 CAR-T 세포 집단), 예컨대 킴리아™ (티사젠렉류셀; 노바티스)와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다.
적합한 항원은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 상업 정부 및 과학적 출처로부터 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 항원은 전체 불활성화된 또는 방사선조사된 종양 세포이다. 항원은 종양으로부터 유래된 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드일 수 있다. 항원은 이종 발현 시스템에서 폴리펩티드 항원을 코딩하는 DNA를 발현함으로써 생산된 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 항원은 항원성 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA일 수 있다. DNA는 벡터 DNA, 예컨대 플라스미드 DNA의 형태일 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원은 단일 항원으로서 제공될 수 있거나 또는 조합하여 제공될 수 있다. 항원은 또한, 폴리펩티드 또는 핵산의 복합 혼합물로서 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체의 CAR 리간드는 태그이며, 이는 상기 기재된 바와 같이, 태그 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합한다. 일부 실시양태에서, 태그는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 또는 말토스 결합 단백질이다.
일부 실시양태에서, CAR은 종양 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드는 종양 항원 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, CAR은 태그 결합 도메인 (예를 들어, AT-CAR)을 포함하고, CAR 리간드는 태그이다. 일부 실시양태에서, CAR은 탠덤 CAR이고, CAR 리간드는 탠덤 CAR 상에 존재하는 항원 결합 도메인 중 적어도 하나에 결합한다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적이고, 종양 항원 결합 도메인 및 태그 결합 도메인을 포함하며, CAR 리간드는 태그이다. 일부 실시양태에서, CAR은 이중특이적이고, 종양 항원 결합 도메인 및 태그 결합 도메인을 포함하며, CAR 리간드는 종양 항원 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, CAR은 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드는 제1 또는 제2 종양-연관 항원이다.
(iv) 극성 블록/링커
접합체가 림프절로 효율적으로 트래픽킹되기 위해서는, 접합체가 가용성으로 유지되어야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 접합체의 용해도를 증가시키기 위해 카고와 지질 사이에 극성 블록 링커가 포함된다. 극성 블록은 지질이 주사 부위에 인접한 조직 내의 세포와 같은 세포의 원형질막 내로 삽입될 수 있는 능력을 감소시키거나 방지한다. 극성 블록은 또한, PS 골격를 함유하는 카고, 예컨대 합성 올리고뉴클레오티드의 능력이, 투여 부위에서 세포외 매트릭스 단백질과 비-특이적으로 회합하는 것을 감소시키거나 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 알부민에 결합할 수 있는 그의 능력을 방해하지 않으면서 접합체의 용해도를 증가시킨다. 이러한 특징의 조합은 접합체가 혈청 또는 간질액에 존재하는 알부민에 결합할 수 있게 하고, 알부민이 림프절로 트래픽킹되어 이러한 림프절 내에 보유될 때까지 순환계에 유지될 수 있게 하는 것으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, 카고는 극성 블록으로서 기능하므로, 별도의 극성 블록이 필요하지 않다.
극성 블록의 길이 및 조성은 선택된 지질 및 카고에 기반하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 접합체의 경우, 올리고뉴클레오티드 자체는 접합체, 예를 들어, 10, 15, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드의 용해성을 보장하기에 충분히 극성일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 부가의 극성 블록 링커가 필요하지 않다. 그러나, 아미노산 서열에 따라, 일부 지질화된 펩티드는 본질적으로 불용성일 수 있다. 이러한 경우에, 극성 올리고뉴클레오티드의 효과를 모방하는 극성 블록을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 극성 블록은 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 지질 접합체, 예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체 및 양친매성 리간드 접합체 중 임의의 것의 일부로서 사용되며, 이는 세포 막 삽입/알부민 상에서의 우선적 분할을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 적합한 극성 블록은 올리고뉴클레오티드, 예컨대 상기 논의된 것들; 폴리(에틸렌 글리콜) (MW: 500 Da 내지 20,000 Da), 폴리아크릴아미드 (MW: 500 Da 내지 20,000 Da), 폴리아크릴산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 친수성 중합체; 친수성 아미노산의 스트링, 예컨대 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 또는 그의 조합; 덱스트란 (MW: 1,000 Da 내지 2,000,000 Da)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리사카라이드; 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 별도의 성분이든 카고 자체이든 간에 극성 블록은 극성 블록의 분자량에 기반하여 전반적 지질 접합체에 대한 용해도를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 지질 접합체가 알부민 결합을 위해 가용성이 되도록 하기 위해서는 2,000 Da의 분자량을 갖는 극성 블록이 충분하다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 300 내지 약 20,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 15,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,500 내지 약 10,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 2,000 내지 약 5,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 2,500 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 3,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 3,500 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 4,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 1,000 내지 약 5,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 5,000 내지 약 10,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 극성 블록은 약 15,000 내지 약 20,000 Da의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 소수성 지질 및 링커/카고는 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 비-절단가능한 연결 또는 절단가능한 연결이다. 일부 실시양태에서, 비-절단가능한 연결은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합을 포함하고, 절단가능한 연결은 디술피드 결합, 산-절단가능한 연결, 에스테르 결합, 무수물 결합, 생분해성 결합 또는 효소-절단가능한 연결을 포함한다.
a. 에틸렌 글리콜 링커
특정 실시양태에서, 극성 블록은 하나 이상의 에틸렌 글리콜 (EG) 단위, 보다 바람직하게는 2개 이상의 EG 단위 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG))이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 지질 접합체는 카고 (즉, CAR 리간드 또는 분자 아주반트), 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자에 의해 연결된 소수성 지질, 또는 그의 유도체 또는 유사체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 지질 접합체는 PEG에 연결된 CAR 리간드를 함유하며, 이는 차례로 소수성 지질 또는 지질-Gn-ON 접합체에 공유적으로 연결되거나 또는 올리고 미셀과 혼성화되는 단백질-올리고 접합체의 형성을 통해 연결된다. EG 단위의 정확한 수는 지질 및 카고에 의존하지만, 전형적으로, 극성 블록은 약 1 내지 약 100, 약 20 내지 약 80, 약 30 내지 약 70, 또는 약 40 내지 약 60 EG 단위를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 극성 블록은 약 45 내지 55 EG 단위를 갖는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 극성 블록은 48 EG 단위를 갖는다.
일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 300 - 20,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 1,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 1,500 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 2,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 2,500 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 3,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 3,500 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 4,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 5,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 6,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 7,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 8,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 9,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 10,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 11,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 12,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 13,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 14,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 15,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 16,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 17,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 18,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 19,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 분자는 약 20,000 달톤의 분자량을 갖는다.
b. 올리고뉴클레오티드 링커
상기 논의된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 극성 블록은 올리고뉴클레오티드이다. 극성 블록 링커는 임의의 서열을 가질 수 있고, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 서열은 무작위 서열일 수 있거나, 또는 그의 분자성 또는 생화학적 특성 (예를 들어, 고도로 극성임)을 위해 특이적으로 선택된 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 극성 블록 링커는 하나 이상의 일련의 연속 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U), 또는 그의 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 극성 블록 링커는 일련의 연속 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U), 또는 그의 유사체로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 구아닌, 예를 들어 1 내지 10개의 구아닌이다. 카고, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드와 지질 꼬리 사이의 구아닌의 수를 변경하면, 혈청 단백질의 존재 하에 미셀 안정성이 제어되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 링커 내의 구아닌의 수는 혈청 단백질, 예컨대 알부민에 대한 접합체의 원하는 친화도에 기반하여 선택될 수 있다. 카고가 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 지질 꼬리가 디아실 지질인 경우, 구아닌의 수는 혈청의 존재하에 수용액에서 형성된 미셀의 해리 능력에 영향을 미친다: 안정화되지 않은 미셀 (리포-G0T10-CG)의 20%는 무손상인 반면, 나머지 80%는 파괴되고 FBS 성분에 결합되었다. 구아닌의 존재 하에서, 무손상 미셀의 백분율은 36% (리포-G2T8-CG)에서 73% (리포-G4T6-CG)로 증가하였고, 최종적으로 90% (리포-G6T4-CG)에 도달하였다. 구아닌의 수를 8개 (리포-G8T2-CG) 및 10개 (리포-G10T0-CG)로 증가시키는 것은 미셀 안정성을 추가로 증강시키지 않았다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 림프절-표적화 접합체 내의 링커는 0, 1 또는 2개의 구아닌을 포함할 수 있다. 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 3개 이상의 연속 구아닌을 포함하는 링커는 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 특성을 갖는 미셀 안정화 접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다.
C. 면역원성 조성물
본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 지질 접합체는 면역원성 조성물에 사용되거나 또는 백신 내의 성분으로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 아주반트, 항원 또는 그의 조합을 포함한다. 아주반트와 항원의 조합이 백신으로서 지칭될 수 있다. 대상체에게 조합하여 투여될 때, 아주반트와 항원은 별도의 제약 조성물로 투여될 수 있거나, 또는 동일한 제약 조성물로 함께 투여될 수 있다. 조합하여 투여될 때, 아주반트가 지질 접합체일 수 있거나, 항원이 지질 접합체일 수 있거나, 또는 아주반트와 항원 둘 다가 지질 접합체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 면역원성 조성물은 단독으로 또는 아주반트와 조합하여 투여되는 양친매성 리간드 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 명반 (예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄); 큐. 사포나리아(Q. saponaria) 나무 껍질로부터 정제된 사포닌, 예컨대 QS21 (HPLC 분별법으로 21번째 피크에서 용리되는 당지질; 안티제닉스, 인크. (Antigenics, Inc.; 매사추세츠주 우스터)); 폴리[디(카르복실아토페녹시)포스파젠 (PCPP 중합체; 바이러스 연구소 (Virus Research Institute; 미국)), Flt3 리간드, 레슈마니아(Leishmania) 신장 인자 (정제된 레슈마니아 단백질; 코릭사 코포레이션 (Corixa Corporation; 워싱턴주 시애틀)), ISCOMS (혼합된 사포닌, 지질을 함유하고 항원을 보유할 수 있는 기공과 함께 바이러스 크기의 입자를 형성하는 면역자극 복합체; CSL (호주 멜버른)), Pam3Cys, SB-AS4 (명반 및 MPL을 함유하는 스미스클라인 비참(SmithKline Beecham) 아주반트 시스템 #4; SBB (벨기에)), 미셀을 형성하는 비-이온성 블록 공중합체, 예컨대 CRL 1005 (이들은 폴리옥시에틸렌 쇄에 의해 플랭크된 소수성 폴리옥시프로필렌의 선형 쇄를 함유함; 백셀, 인크. (Vaxcel, Inc.; 조지아주 노크로스)), 및 몬타나이드 IMS (예를 들어, IMS 1312; 가용성 면역자극제와 조합된 수계 나노입자; 세픽(Seppic))이나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 TLR 리간드, 예컨대 상기 논의된 것들이다. 일부 실시양태에서, TLR3을 통해 작용하는 아주반트는 이중-가닥 RNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, TLR4를 통해 작용하는 아주반트는 리포폴리사카라이드, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPLA; 리비 이뮤노켐 리서치, 인크. (Ribi ImmunoChem Research, Inc.; 몬태나주 해밀턴)) 및 무라밀 디펩티드 (MDP; 리비) 및 트레오닐-무라밀 디펩티드 (t-MDP; 리비)의 유도체; OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 디사카라이드; OM 파르마 SA (OM Pharma SA; 스위스 메이린))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, TLR5를 통해 작용하는 아주반트는 플라젤린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, TLR7 및/또는 TLR8을 통해 작용하는 아주반트는 단일-가닥 RNA, 올리고리보뉴클레오티드 (ORN), 합성 저분자량 화합물, 예컨대 이미다조퀴놀린아민 (예를 들어, 이미퀴모드 (R-837), 레시퀴모드 (R-848))을 포함한다. 일부 실시양태에서, TLR9를 통해 작용하는 아주반트는 바이러스 또는 박테리아 기원의 DNA, 또는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 예컨대 CpG ODN을 포함한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 아주반트 클래스는 포스포로티오에이트 함유 분자, 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 유사체, 및 포스포로티오에이트 골격 연결을 함유하는 핵산이다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 오일 에멀젼 (예를 들어, 프로인트 아주반트); 사포닌 제형; 비로좀 및 바이러스-유사 입자; 박테리아 및 미생물 유도체; 면역자극성 올리고뉴클레오티드; ADP-리보실화 독소 및 해독된 유도체; 명반; BCG; 미네랄 함유 조성물 (예를 들어, 미네랄 염, 예컨대 알루미늄 염 및 칼슘 염, 수산화물, 인산염, 황산염 등); 생체 접착제 및/또는 점막 접착제; 미세 입자; 리포좀; 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 제형; 폴리포스파젠; 무라밀 펩티드; 이미다조퀴놀론 화합물; 및 표면 활성 물질 (예를 들어, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 면역 조정제, 예컨대 시토카인, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-.감마.), 대식세포 집락 자극 인자, 및 종양 괴사 인자로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 상기 기재된 바와 같은, 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 STING (STimulator of Interferon Genes: 인터페론 유전자의 자극인자) 효능제이다. 면역 세포에서의 STING 시그널링 경로는 선천성 면역 반응의 중심 매개체이며, 자극될 때, 면역 활성을 증폭시키고 강화시키는 다양한 인터페론, 시토카인 및 T 세포 동원 인자의 발현을 유도한다. 최근 연구에 따르면, STING 효능제는, 예를 들어, 문헌 [Dubensky, T., et al., Therapeutic Advances in Vaccines, Vol. 1(4): 131-143 (2013); and Hanson, M., et al., The Journal of Clinical Investigation, Vol. 125 (6): 2532-2546 (2015); 본원에 참조로 포함됨]에 기재된 바와 같이, 효과적인 아주반트이며 면역 반응을 효율적으로 이끌어 낸다.
일부 실시양태에서, STING 효능제는 시클릭 디뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 시클릭 디뉴클레오티드는 cdAMP, cdGMP, cdIMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, 및 c-GMP-IMP, 및 그의 유사체 (포스포로티오에이트 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용하기 적합한 시클릭 디뉴클레오티드는, 예를 들어, US 특허 번호 7,709,458 및 7,592,326; WO 2007/054279; US 2014/0205653; 및 문헌 [Yan et al. Bioorg. Med. Chem Lett. 18: 5631 (2008)] (그의 각각이 본원에 참조로 포함됨)에 일부 상세히 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, STING 효능제는 화학적으로 합성된다. 특정 실시양태에서, STING 효능제는 자연적으로 발생하는 시클릭 디뉴클레오티드의 유사체이다. 본 개시내용에 사용하기 적합한, 시클릭 디뉴클레오티드의 유사체를 포함한 STING 효능제는 US 특허 번호 7,709,458 및 7,592,326; 및 US 2014/0205653에 제공된다.
폴리펩티드를 제조하는 방법
일부 실시양태에서, 양친매성 접합체에 사용하기 위한 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 종양 연관 항원)는 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 숙주 세포에서 제조된다. 그렇게 하기 위해, 펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자가 제조된다. 이러한 DNA 분자를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드를 코딩하는 서열은 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절제될 수 있다. 또 다른 한편으론, DNA 분자는 화학적 합성 기술, 예컨대 포스포르아미데이트 방법을 사용하여 합성될 수 있었다. 또한, 이들 기술의 조합이 사용될 수 있었다.
폴리펩티드를 제조하는 방법은 또한, 적절한 숙주에서 펩티드를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 벡터는 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다. DNA 분자가 벡터 내로 삽입되기 전 또는 후에, 이러한 작동 연결에 영향을 미치는 방법은 널리 공지되어 있다. 발현 제어 서열은 프로모터, 활성화제, 인핸서, 작동인자, 리보솜 뉴클레아제 도메인, 출발 시그널, 정지 시그널, 캡 시그널, 폴리아데닐화 시그널, 및 전사 또는 번역의 제어와 관련된 다른 시그널을 포함한다.
이로써 생성된, DNA 분자를 갖는 벡터를 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킨다. 이러한 형질전환은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
다수의 이용가능하고 널리 공지된 숙주 세포 중 임의의 것이 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합할 수 있다. 특정한 숙주의 선택은 관련 기술분야에 의해 인식되는 다수의 요인에 의존한다. 이들은, 예를 들어, 선택된 발현 벡터와의 상용성, DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회수 용이성, 발현 특징, 생체 안전성 및 비용을 포함한다. 이들 인자의 균형은 모든 숙주가 특정한 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적일 수 없다는 이해에 부딪쳐야 한다. 이러한 일반적인 지침 내에서 유용한 미생물 숙주는 박테리아 (예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 종), 효모 (예컨대, 사카로미세스(Saccharomyces) 종) 및 다른 진균, 곤충, 식물, 배양 중인 포유동물 (인간 포함) 세포, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 숙주를 포함한다.
다음으로, 형질전환된 숙주를 배양 및 정제한다. 숙주 세포는 통상적인 발효 조건 하에서 배양되어 원하는 화합물이 발현되도록 할 수 있다. 이러한 발효 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 마지막으로, 펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 배양물로부터 정제된다.
화합물은 또한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 고상 합성 기술이 사용될 수 있다. 적합한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 문헌 [Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527]에 기재된 것들을 포함한다. 고상 합성은 개별 펩티드를 만드는 바람직한 기술인데, 이는 비용 면에서 가장 효과적으로 작은 펩티드를 만드는 방법이기 때문이다. 유도체화된 펩티드를 함유하거나 또는 비-펩티드 기를 함유하는 화합물은 널리 공지된 유기 화학 기술에 의해 합성될 수 있다.
분자 발현/합성의 다른 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지되어 있다.
상기 기재된 핵산 분자는, 예를 들어, 벡터로 형질도입된 세포에서 그들의 발현을 지시할 수 있는 벡터 내에 함유될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드 돌연변이 체에 외에도, 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터, 및 이들 벡터로 형질감염된 세포가 특정 실시양태이다.
사용하기에 적합한 벡터는 박테리아에 사용하기 위한 T7-기반 벡터 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987] 참조), 포유동물 세포에 사용하기 위한 pMSXND 발현 벡터 (문헌 [Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988]), 및 곤충 세포에 사용하기 위한 바큘로바이러스-유래 벡터 (예를 들어, 클론테크 (Clontech; 캘리포니아주 팔로 알토)로부터의 발현 벡터 pBacPAKS)를 포함한다. 이러한 벡터에서 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 삽입물은, 예를 들어, 발현이 추구되는 세포 유형에 기반하여 선택되는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, T7 프로모터는 박테리아에 사용될 수 있고, 폴리헤드린 프로모터는 곤충 세포에 사용될 수 있으며, 시토메갈로바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터는 포유동물 세포에 사용될 수 있다. 또한, 고등 진핵 생물의 경우에는, 조직-특이적 및 세포 유형-특이적 프로모터가 널리 이용가능하다. 이들 프로모터는 신체 내의 주어진 조직 또는 세포 유형에서 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 그들의 능력에 대해 그렇게 명명된다. 통상의 기술자는 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있는 수많은 프로모터 및 다른 조절성 요소를 잘 알고 있다.
삽입된 핵산 분자의 전사를 용이하게 하는 서열 외에도, 벡터는 복제 기점, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 다른 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 네오 마이신 내성 (neor) 유전자는 그것이 발현되는 세포에 G418 내성을 부여하므로, 형질감염된 세포의 표현형 선택을 허용한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 조절성 요소 또는 선택이능한 마커가 특정한 실험 상황에서 사용하기에 적합한지의 여부를 쉽게 결정할 수 있다.
사용하기에 적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 레트로 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 벡터, 헤르페스 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 및 소 유두종 바이러스 벡터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
폴리펩티드 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자를 함유하고 발현하는 원핵 또는 진핵 세포가 또한 사용하기에 적합하다. 세포는 형질감염된 세포, 즉 핵산 분자, 예를 들어 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 세포이다. 이러한 세포의 자손은 또한, 본원에 개시된 방법에 사용하기 적합한 것으로 간주된다.
발현 시스템의 정확한 성분은 중요하지 않다. 예를 들어, 폴리펩티드 돌연변이체는 원핵 생물 숙주, 예컨대 박테륨 이. 콜라이, 또는 진핵 생물 숙주, 예컨대 곤충 세포 (예를 들어, Sf21 세포), 또는 포유동물 세포 (예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포, 또는 HeLa 세포)에서 생산될 수 있다. 이들 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; 버지니아주 마나사스)을 포함한 많은 공급처로부터 입수가능하다. 발현 시스템을 선택하는데 있어서, 성분들이 서로 상용성인 것만이 중요하다. 장인 또는 통상의 기술자는 그러한 결정을 할 수 있다. 더욱이, 발현 시스템을 선택하는데 있어서 지침이 필요한 경우, 숙련된 전문가와 상담할 수 있다 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993; and Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987).
발현된 폴리펩티드는 일상적인 생화학적 절차를 사용하여 발현 시스템으로부터 정제될 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 지질과 접합될 수 있다.
제약 조성물 및 투여 방식
일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 함께 (동시에 또는 순차적으로) 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트 (예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체)는 함께 (동시에 또는 순차적으로) 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체, 아주반트 (예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체), 및 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 함께 (동시에 또는 순차적으로) 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 별도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트 (예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체)는 별도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체, 아주반트 (예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체) 및 CAR 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포)는 별도로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 양친매성 리간드 접합체를 제약상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 아주반트와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제 (예를 들어, CDG)이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 별도의 제약 조성물에 제형화된다.
일부 실시양태에서, 허용되는 제형 물질은 바람직하게는, 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 특정 실시양태에서, 제형 물질(들)은 s.c. 및/또는 I.V. 투여를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어, 이러한 조성물의 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적합한 제형 물질은 아미노산 (예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항미생물제; 항산화제 (예컨대, 아스코르브산, 아황산 나트륨 또는 아황산 수소 나트륨); 완충제 (예컨대, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트레이트, 인산염 또는 다른 유기산); 증량제 (예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제 (예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 모노사카라이드; 디사카라이드; 및 다른 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린); 착색제, 풍미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저 분자량 폴리펩티드; 염 형성 반대 이온 (예컨대, 나트륨); 보존제 (예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제 (예컨대, 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증강제 (예컨대, 수크로스 또는 소르비톨); 등장성 증강제 (예컨대, 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)). 특정 실시양태에서, 제형은 PBS; 20 mM NaOAC, pH 5.2, 50 mM NaCl; 및/또는 10 mM NAOAC, pH 5.2, 9% 수크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 최적 제약 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 포맷 및 원하는 투여량에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된다. 예를 들어, 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 양친매성 접합체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물 중 1차 비히클 또는 담체는 본질적으로 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적합한 비히클 또는 담체는 주사용 물, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있으며, 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 공통적인 다른 물질이 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식염수는 등장성 인산염 완충 식염수를 포함한다. 특정 실시양태에서, 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가의 예시적인 비히클이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 pH 약 7.0-8.5의 트리스 완충제, 또는 pH 약 4.0-5.5의 아세테이트 완충제를 포함하며, 이는 소르비톨 또는 그에 대한 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체를 포함하는 조성물은, 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의적인 제형 작용제와 혼합함으로써 저장을 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다 (상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조). 추가로 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체를 포함하는 조성물은 적절한 부형제, 예컨대 수크로스를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 흡입을 위해, 또는 소화관을 통한 전달, 예컨대 경구로 전달하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
일부 실시양태에서, 제형 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 조성물을 생리적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 비경구 투여가 고려되는 경우, 치료 조성물은 제약상 허용되는 비히클 중에 양친매성 접합체를 포함하는 발열원이 없고 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 주사용 비히클은 멸균 증류수이고, 여기서 양친매성 접합체는 적절하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제형화된다. 일부 실시양태에서, 제제는 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 산물의 제어식 또는 지속 방출을 제공할 수 있는 작용제, 예컨대 주사가능한 미세 구, 생 침식성 입자, 중합체성 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀을 수반하는 원하는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 히알루론산이 또한 사용될 수 있으며, 순환계에서 지속 시간을 촉진시키는 효과를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 분자를 도입하기 위해 체내 이식가능한 약물 전달 장치가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체는 흡입용 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체를 포함하는 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명하는 PCT 출원 번호 PCT/US94/001875에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 제형은 경구로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방식으로 투여되는 양친매성 접합체는 고체 투여 형태, 예컨대 정제 및 캅셀제의 배합에 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체 이용률이 최대화되고 미리 전신 분해되는 것이 최소화되는 위장관 내의 일정 시점에서 제형의 활성 부분이 방출되도록 캡슐을 설계할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 접합체의 흡수를 촉진시키기 위해 적어도 하나의 부가 작용제가 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 희석제, 향미제, 저 융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와 혼합하여 유효량의 양친매성 접합체를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제를 멸균수 또는 또 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액을 단위 용량 형태로 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산 칼슘, 탄산 나트륨 또는 중탄산 나트륨, 락토스 또는 인산 칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
지속 또는 제어식 전달 제형에 양친매성 접합체를 수반하는 제형을 포함한 부가의 제약 조성물이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 다양한 다른 지속 또는 제어식 전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생 침식성 미세 입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제를 제형화하는 기술이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 제약 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체성 미세 입자의 제어식 방출을 설명하는 PCT 출원 번호 PCT/US93/00829 참조. 일부 실시양태에서, 지속 방출 제제는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태로 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919 및 EP 058,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)]), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (상기 문헌 [Langer et al.] 참조) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속 방출 조성물은 또한, 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 관련 기술분야에 공지된 몇 가지 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)]; EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949 참조.
일부 실시양태에서, 생체내 투여에 사용되는 제약 조성물은 멸균성이다. 일부 실시양태에서, 멸균은 멸균성 여과 막을 통한 여과에 의해 달성된다. 조성물이 동결건조되는 특정 실시양태에서, 이러한 방법을 사용한 멸균은 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 시행된다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장된다. 일부 실시양태에서, 비경구 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 배치된다.
일부 실시양태에서, 일단 제약 조성물이 제형화되면, 이를 용액, 현탁액, 젤, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수되거나 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장한다. 일부 실시양태에서, 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태 (예를 들어, 동결건조된 형태)로 저장된다.
일부 실시양태에서, 단일 용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 및 다중 챔버의 미리 채워된 시린지 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.
일부 실시양태에서, 치료적으로 이용될 양친매성 접합체를 포함하는 제약 조성물의 유효량은, 예를 들어, 치료 상황 및 목적에 따라 달라질 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 실시양태에 따른 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 부분적으로, 전달된 분자, 양친매성 접합체가 사용되는 적응증, 투여 경로 및 환자의 크기 (체중, 체 표면적 또는 기관 크기) 및/또는 상태 (연령 및 일반적인 건강 상태)에 따라 다양할 것이란 사실을 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 임상의는 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시켜 최적의 치료 효과를 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여 빈도는 사용된 제형에서 양친매성 접합체의 약동학적 파라미터를 고려할 것이다. 일부 실시양태에서, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 단일 용량으로서 투여되거나, 또는 시간 경과에 따라 2회 이상의 용량 (이는 동일한 양의 원하는 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로 투여되거나, 또는 체내 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가 개선은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 이루어지며, 이들에 의해 일상적으로 수행되는 작업의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 용량-반응 데이터를 사용하여 적절한 투여량을 확실히 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 경구로; 정맥내, 복강내, 뇌내 (뇌실질내), 뇌실내, 근육내, 피하, 안구내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해; 지속 방출 시스템에 의해; 또는 체내 이식 장치에 의해서이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 볼루스 주사에 의해 투여되거나, 또는 주입에 의해 연속적으로 투여되거나, 또는 체내 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조합 요법의 개별 요소는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 그 위로 원하는 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화된 막, 스폰지 또는 또 다른 적절한 물질의 체내 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 체내 이식 장치가 사용되는 일부 실시양태에서, 이러한 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 체내 이식될 수 있고, 원하는 분자의 전달은 확산, 서방출 볼루스 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체외 방식으로 양친매성 접합체를 포함하는 제약 조성물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 환자로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관을 양친매성 접합체를 포함하는 제약 조성물에 노출시키고, 그 후에 그러한 세포, 조직 및/또는 기관을 환자에게 다시 연속해서 체내 이식한다.
일부 실시양태에서, 양친매성 접합체는 이러한 접합체를 발현시키고 분비하기 위해 본원에 기재된 것들과 같은 방법을 사용하여 유전적으로 조작시킨 특정 세포를 체내 이식함으로써 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 자가, 이종 또는 이종 발생성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 불멸화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역학적 반응의 기회를 저하시키기 위해, 주변 조직의 침윤을 피하기 위해 세포를 캡슐화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화 물질은 전형적으로, 단백질 산물(들)의 방출을 허용하지만 환자의 면역 체계에 의한 또는 주변 조직으로부터의 다른 유해한 요인에 의한 세포의 파괴를 방지하는 생체 적합성, 반투과성 중합체성 인클로저 또는 막이다.
사용 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 생체내 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)를 확장시키거나 또는 활성화시키는 방법으로서, 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 생체내 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)의 증식을 자극하는 방법으로서, 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
세포의 확장, 활성화 및 증식을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 명시된 위치 (예를 들어, 림프절, 혈액, 종양)에 있는 세포의 수는 세포를 단리하고 유동 세포계수법을 통해 이들을 분석함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 적절한 마커, 예컨대 활성화 마커 (예를 들어, CD80, CD86, 41BBL, ICOSL 또는 OX40L) 및/또는 증식 마커 (예를 들어, Ki67)로 염색된다. 일부 실시양태에서, 세포의 수는 염료 (예를 들어, 크리스탈 바이올렛)를 세포 내로 도입하고 시간 경과에 따른 염료의 희석을 측정함으로써 측정되며, 여기서 희석은 세포 증식을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항원의 발현 또는 상승된 발현과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포), 및 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 양친매성 지질 접합체를 투여받기 전에 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양친매성 지질 접합체를 투여받은 후에 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 양친매성 지질 접합체를 순차적으로 또는 동시에 투여받는다.
CAR이 태그 결합 도메인을 포함하는 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 태그부착된 단백질의 제형을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 태그 결합 도메인은 태그부착된 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 단백질은 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 태그 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포) 및 양친매성 리간드 접합체의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포) 및 양친매성 리간드 접합체와 공동으로 (동시에 또는 순차적으로) 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 태그부착된 단백질의 제형은 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR T 세포) 및 양친매성 리간드 접합체의 투여 후에 대상체에게 투여된다.
암 및 암 면역요법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체는 비정상적인 아폽토시스 또는 분화 프로세스 (예를 들어, 세포 증식성 장애 (예를 들어, 과다증식성 장애) 또는 세포 분화성 장애, 예컨대 암)와 연관된 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 암의 비-제한적 예는 하기에 기재되어 있다.
세포 증식성 및/또는 분화성 장애의 예는 암 (예를 들어, 암종, 육종, 전이성 장애 또는 조혈 신생물성 장애, 예를 들어 백혈병)을 포함한다. 전이성 종양은 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암 및 간암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 원발성 종양 유형으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 본원에 사용된 조성물은 암 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명자들은 자율 성장 능력을 갖는 세포 (즉, 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적 상태 또는 병태)를 지칭하기 위해 용어 "암" (또는 "암성"), "과다증식성" 및 "신생물성"을 사용할 수 있다. 과다증식성 및 신생물성 질환 상태는 병리학적인 것으로 (즉, 질환 상태인 것으로 규명되거나 또는 이를 구성하는 것으로) 분류될 수 있거나, 또는 비-병리학적인 것으로 (즉, 정상적인 것으로부터 벗어나긴 하지만 질환 상태와 연관되지 않은 것으로) 분류될 수 있다. 상기 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 발암 프로세스, 전이성 조직 또는 악성 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. "병리학적 과다증식성" 세포는 악성 종양 성장을 특징으로 하는 질환 상태에서 발생한다. 비-병리학적 과다증식성 세포의 예는 상처 복구와 연관된 세포의 증식을 포함한다.
용어 "암" 또는 "신생물"은 폐, 유방, 갑상선, 림프선 및 림프 조직, 위장 기관 및 비뇨 생식관에 영향을 미치는 것을 포함한, 다양한 기관계의 악성종양 뿐만 아니라 일반적으로 악성종양, 예컨대 대부분의 결장암, 신장 세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암을 포함하는 것으로 간주되는 선암종을 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "암종"은 관련 기술분야에 인정된 것으로, 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨 생식기 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함한 상피 또는 내분비 조직의 악성종양을 지칭한다. 양친매성 리간드 접합체는 신장 암종 또는 흑색종을 포함한 임의의 유형의 암, 또는 임의의 바이러스성 질환이 있거나, 이러한 암 또는 질환이 있는 것으로 의심되거나, 또는 발병할 위험이 높은 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 암종은 자궁 경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소의 조직으로부터 형성되는 암종을 포함한다. 이러한 용어는 또한 암종 육종을 포함하며, 이는 암종성 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함한다. "선암종"은 선상 조직으로부터 유래되거나 또는 종양 세포가 인식가능한 선상 구조를 형성하는 암종을 지칭한다.
증식성 장애의 부가 예는 조혈 신생물성 장애를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈 신생물성 장애"는, 예를 들어, 골수성, 림프성 또는 적혈구 계통 또는 그의 전구체 세포로부터 발생하는, 조혈 기원의 과형성/신생물성 세포를 수반하는 질환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 질환은 분화 불량성 급성 백혈병 (예를 들어, 적혈모구성 백혈병 및 급성 거핵모구성 백혈병)으로부터 발생한다. 부가의 예시적인 골수성 장애는 급성 전골수성 백혈병 (APML), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)을 포함하나 이에 제한되지는 않고 (문헌 [Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97]에서 고찰됨); 림프성 악성종양은 B-계통 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 및 T-계통 ALL을 포함하는 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 모발 세포 백혈병 (HLL) 및 발덴스트롬 매크로글로불린혈증 (WM)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부가 형태의 악성 림프종은 비호지킨 림프종 및 그의 변이체, 말초 T 세포 림프종, 성체 T 세포 백혈병/림프종 (ATL), 피부 T 세포 림프종 (CTCL), 거대 과립 림프구성 백혈병 (LGF), 호지킨병 및 리드-스턴버그병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 종양 성장 및 크기를 감소시키기에 충분한 양친매성 접합체의 양, 또는 치료상 유효량은 선택된 특정한 화합물 또는 조성물 뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 병태의 성질, 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 수 있을 것이며, 궁극적으로 환자의 주치의 또는 약사의 재량에 따를 것임을 인지할 것이다. 본 방법에 사용되는 화합물이 제공되는 시간의 길이는 개별적으로 다양할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양의 크기의 감소 또는 저하 또는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 또는 저하시키거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR 이펙터 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 가진 대상체에서 항종양 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR 이펙터 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 항원에 대해 표적화된 이펙터 CAR 세포 (예를 들어, CAR-T 세포), 및 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 T-세포 매개된 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항종양 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다.
본원에서 치료에 대한 언급은 언급된 암 및 증상의 치료 뿐만 아니라 예방으로 확장된다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다.
감염성 질환
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 양친매성 지질 접합체는 급성 또는 만성 감염성 질환을 치료하는데 유용하다. 바이러스 감염은 주로 T-세포에 의해 제거되기 때문에, T-세포 활성의 증가는 감염성 바이러스 인자의 보다 신속하거나 철저한 제거가 동물 또는 인간 대상체에게 유리한 상황에서 치료적으로 유용하다.
최근에, CAR-T 세포 요법은 PCT 공개 번호 WO 2015/077789; 문헌 [Hale et al., (2017) Engineering HIV-Resistant, Anti-HIV Chimeric Antigen Receptor T Cells. Molecular Therapy, Vol. 25(3): 570-579; Liu et al., (2016). ABSTRACT. Journal of Virology, 90(21), 9712-9724; Liu et al., (2015). ABSTRACT. Journal of Virology, 89(13), 6685-6694; Sahu et al., (2013). Virology, 446(1-2), 268-275]에 기재된 바와 같이, 바이러스 감염, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 치료하는데 있어서의 그 유용성에 관하여 조사되었다.
따라서, 일부 실시양태에서 양친매성 리간드 접합체는 면역결핍 (예를 들어, HIV), 유두종 (예를 들어, HPV), 헤르페스 (예를 들어, HSV), 뇌염, 인플루엔자 (예를 들어, 인간 인플루엔자 바이러스 A), 및 감기 (예를 들어, 인간 리노 바이러스) 바이러스 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 국소 또는 전신 바이러스 감염을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체를 포함한 제약 제형은 바이러스성 피부 질환, 예컨대 헤르페스 병변 또는 대상 포진, 또는 생식기 사마귀를 치료하기 위해 국소적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체는 AIDS, 인플루엔자, 감기 또는 뇌염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 전신 바이러스성 질환을 치료하기 위해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 바이러스 감염을 가진 대상체에서 생체내 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)의 증식을 증가시키는 방법으로서, 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 CAR은 바이러스 펩티드 결합 도메인 (예를 들어, HIV Env 결합 도메인)을 포함하고, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 바이러스 펩티드 (예를 들어, HIV Env)를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 바이러스 감염을 가진 대상체에서 생체내 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)를 확장시키는 방법으로서, 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 CAR은 바이러스 펩티드 결합 도메인 (예를 들어, HIV Env 결합 도메인)을 포함하고, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 바이러스 펩티드 (예를 들어, HIV Env)를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 바이러스 감염의 감소를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR 이펙터 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 가진 대상체에서 항바이러스 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 양친매성 지질 접합체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR 이펙터 세포 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 요법)을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법을 제공한다.
본원에서 치료에 대한 언급은 언급된 감염 및 증상의 치료 뿐만 아니라 예방으로 확장된다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다.
키트
적어도 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는 적합한 용기 내에, 양친매성 리간드 접합체, 하나 이상의 대조군, 및 다양한 완충제, 시약, 효소 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 표준 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 아주반트 (예를 들어, 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 STING 효능제 (예를 들어, CDG))를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트는 동일한 바이알 내에 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트는 별도의 바이알 내에 있다.
일부 실시양태에서, 용기는 양친매성 리간드 접합체를 놓아둘 수 있고, 일부 경우에는 적합하게 등분될 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 웰, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 다른 용기 수단이다. 부가의 성분이 제공될 때, 키트는 이러한 화합물을 놓아둘 수 있는 부가의 용기를 함유할 수 있다. 키트는 또한, 양친매성 리간드 접합체를 함유하기 위한 수단, 및 상업적 판매를 위해 밀폐된 임의의 다른 시약 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지하는 사출 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 용기 및/또는 키트는 사용 지침서 및/또는 경고가 수반된 라벨링을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CDG이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 확장시키기 위해 조성물 백신을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 확장시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CDG이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 확장시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CDG이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포의 증식을 증가시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 이러한 키트는 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포의 증식을 증가시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CDG이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포의 증식을 증가시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 본원에 기재된 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 STING 효능제이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CDG이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키트 중 임의의 것은 양친매성 리간드 접합체에 존재하는 CAR 리간드에 결합하는 CAR을 포함하는 CAR-T 세포를 추가로 포함한다.
개시내용의 다른 실시양태
본 섹션 전반에 걸쳐, 용어 실시양태는 'E'로서 약칭되며, 그 뒤에 서수가 표시된다. 예를 들어, E1은 실시양태 1과 동등하다.
E1. 대상체에서 생체내 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 확장시키거나 또는 CAR T 세포의 증식을 증가시키는 방법으로서, CAR T 세포를 확장시키기에 충분한 양으로 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 것인 방법.
E2. 양친매성 리간드 접합체가 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합하는 것인, 실시양태 1의 방법.
E3. CAR(-) T 세포의 증식이 대상체에서 증가되지 않는 것인, 실시양태 2의 방법.
E4. 종양의 크기의 감소 또는 저하 또는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 또는 저하시키거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있고, 여기서 조성물은 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 것인 방법.
E5. 암을 가진 대상체에서 항종양 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있고, 여기서 조성물은 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 것인 방법.
E6. 대상체에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 것인 방법.
E7. 면역 반응이 T-세포 매개된 면역 반응 또는 항종양 면역 반응인, 실시양태 6의 방법.
E8. 표적 세포 집단 또는 표적 조직이 종양 세포 또는 종양 조직인, 실시양태 6 또는 7의 방법.
E9. 항원의 발현 또는 상승된 발현과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, 및 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 것인 방법
E10. 대상체가 CAR T 세포를 투여받기 전에 상기 조성물을 투여받는 것인, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.
E11. 대상체가 CAR T 세포를 투여받은 후에 상기 조성물을 투여받는 것인, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.
E12. 상기 조성물 및 CAR T 세포가 동시에 투여되는 것인, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.
E13. CAR T 세포가 하나의 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법.
E14. 하나의 공동-자극 도메인이 CD28 또는 4-1BB인, 실시양태 13의 방법.
E15. 양친매성 리간드 접합체가 림프절로 트래픽킹되는 것인, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법.
E16. 양친매성 리간드 접합체가 서혜 림프절 및 액와 림프절로 트래픽킹되는 것인, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법.
E17. 양친매성 리간드 접합체가 림프절로의 트래픽킹 시 항원 제시 세포의 막 내로 삽입되는 것인, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
E18. 항원 제시 세포가 수질 대식세포, CD8+ 수지상 세포, 및/또는 CD11b+ 수지상 세포인, 실시양태 17의 방법.
E19. CAR 리간드가 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 또는 적어도 25일 동안 림프절 내에 보유되는 것인, 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나의 방법.
E20. 조성물이 아주반트를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법.
E21. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 20의 방법.
E22. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 패턴 인식 수용체에 결합하는 것인, 실시양태 21의 방법.
E23. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 CpG를 포함하는 것인, 실시양태 22의 방법.
E24. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 톨-유사 수용체에 대한 리간드인, 실시양태 21의 방법.
E25. 링커가 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나의 방법.
E26. 링커가 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인, 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나의 방법.
E27. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 방법.
E28. 링커가 올리고뉴클레오티드 링커인, 실시양태 21 내지 24 중 어느 하나의 방법.
E29. 올리고뉴클레오티드 링커가 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2인, 실시양태 28의 방법.
E30. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 21 내지 24, 28 및 29 중 어느 하나의 방법.
E31. CAR 리간드가 종양 연관 항원이고, CAR이 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나의 방법.
E32. CAR 리간드가 태그이고, CAR이 태그 결합 도메인을 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나의 방법.
E33. 태그가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 32의 방법.
E34. 태그부착된 단백질의 제형을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 태그 결합 도메인은 태그부착된 단백질에 결합하는 것인, 실시양태 32 또는 33의 방법.
E35. 태그부착된 단백질의 단백질이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 실시양태 34의 방법.
E36. 태그 결합 도메인이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 실시양태 34 또는 35의 방법.
E37. 태그부착된 단백질의 제형이 CAR T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여 전에 대상체에게 투여되는 것인, 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나의 방법.
E38. 태그부착된 단백질의 제형이 CAR T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여와 공동으로 대상체에게 투여되는 것인, 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나의 방법.
E39. 태그부착된 단백질의 제형이 CAR T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여 후에 대상체에게 투여되는 것인, 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나의 방법.
E40. CAR T 세포가 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여 전에 투여되는 것인, 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 방법.
E41. CAR T 세포가 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여되는 것인, 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 방법.
E42. CAR T 세포가 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 투여와 공동으로 투여되는 것인, 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 방법.
E43. 대상체가 암을 가진 것인, 실시양태 1 내지 3 및 6 내지 42 중 어느 하나의 방법.
E44. 대상체가 인간인, 실시양태 1 내지 43 중 어느 하나의 방법.
E45. 양친매성 리간드 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드, 지질, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 조성물.
E46. 링커가 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 45의 조성물.
E47. 링커가 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인, 실시양태 45의 조성물.
E48. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 45 내지 47 중 어느 하나의 조성물.
E49. CAR 리간드가 태그인, 실시양태 45 내지 48 중 어느 하나의 조성물.
E50. 태그가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 49의 조성물.
E51. 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 조성물, 및 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물.
E52. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 51의 면역원성 조성물.
E53. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 패턴 인식 수용체에 결합하는 것인, 실시양태 52의 면역원성 조성물.
E54. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 CpG를 포함하는 것인, 실시양태 53의 면역원성 조성물.
E55. 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 톨-유사 수용체에 대한 리간드인, 실시양태 52의 면역원성 조성물.
E56. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 52 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
E57. 링커가 올리고뉴클레오티드 링커인, 실시양태 52 내지 56 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
E58. 올리고뉴클레오티드 링커가 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2인, 실시양태 57의 면역원성 조성물.
E59. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E60. 아주반트, 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는, 실시양태 59의 키트.
E61. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 60의 키트.
E62. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E63. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포를 확장시키기 위해 조성물 백신을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E64. 아주반트, 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포를 확장시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는, 실시양태 63의 키트.
E65. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 64의 키트.
E66. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포를 확장시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E67. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포의 증식을 증가시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E68. 아주반트, 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포의 증식을 증가시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는, 실시양태 67의 키트.
E69. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 66 또는 68의 키트.
E70. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR T 세포의 증식을 증가시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E71. 대상체에서 생체내 CAR T 세포를 확장시키는데 사용하기 위한, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 조성물, 실시양태 51 내지 58 중 어느 하나의 면역원성 조성물, 또는 실시양태 59 내지 70 중 어느 하나의 키트의 용도.
E72. 대상체에서 생체내 CAR T 세포의 증식을 증가시키는데 사용하기 위한, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 조성물, 실시양태 51 내지 58 중 어느 하나의 면역원성 조성물, 또는 실시양태 59 내지 70 중 어느 하나의 키트의 용도.
E73. 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 조성물, 실시양태 51 내지 58 중 어느 하나의 면역원성 조성물, 또는 실시양태 59 내지 70 중 어느 하나의 키트의 용도.
E74. 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서의, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 조성물의 용도로서, 여기서 약물은 조성물, 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것인 용도.
E75. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 접합된 지질을 포함하는 것인 조성물.
E76. 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이고, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 PEG-2000인, 실시양태 75의 조성물.
E77. 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하고, 여기서 아주반트는, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인 면역원성 조성물.
E78. 양친매성 리간드 접합체 및 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하고, 여기서 CAR 리간드는 태그이고, 여기서 아주반트는, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인 면역원성 조성물.
E79. 양친매성 리간드 접합체가 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합하는 것인, 실시양태 4 내지 44 중 어느 하나의 방법.
E80. 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체가 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합하는 것인, 실시양태 21 내지 24 및 27 내지 44 중 어느 하나의 방법.
E81. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 비-종양 배액 림프절에서 비경구적으로 투여하거나, 종양-배액 림프절에서 비경구적으로 투여하거나, 또는 종양내로 투여하는 것을 포함하는, 실시양태 1 내지 44 중 어느 하나의 방법.
E82. 표적 세포 집단 또는 표적 조직이 바이러스에 감염된 세포 집단 또는 조직인, 실시양태 6의 방법.
E83. 바이러스가 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)인, 실시양태 82의 방법.
E84. 면역 반응이 T-세포 매개된 면역 반응인, 실시양태 82 또는 83의 방법.
E85. 항원이 바이러스 항원 또는 암 항원인, 실시양태 9의 방법.
E86. 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트로서, 여기서 양친매성 리간드 접합체는 지질, CAR 리간드, 및 임의적으로 링커를 포함하는 것인 키트.
E87. 아주반트, 및 CAR T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는, 실시양태 86의 키트.
E88. 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인, 실시양태 87의 키트.
E89. 양친매성 리간드 접합체가 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는 것인, 실시양태 59 내지 70 및 86 내지 88 중 어느 하나의 키트.
E90. 양친매성 리간드 접합체가 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인, 실시양태 59 내지 70 및 86 내지 88 중 어느 하나의 키트.
E91. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 59 내지 70 및 86 내지 90 중 어느 하나의 키트.
E92. 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체가 올리고뉴클레오티드 링커를 포함하는 것인, 실시양태 61, 65, 69 또는 88 중 어느 하나의 키트.
E93. 올리고뉴클레오티드 링커가 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2인, 실시양태 92의 키트.
E94. CAR 리간드가 종양 연관 항원이고, CAR이 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 실시양태 59 내지 70 및 89 내지 93 중 어느 하나의 키트.
E95. CAR 리간드가 태그이고, CAR이 태그 결합 도메인을 포함하는 것인, 실시양태 59 내지 70 및 89 내지 93 중 어느 하나의 키트.
E96. 태그가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 95의 키트.
E97. 태그부착된 단백질의 제형, 및 상기 태그부착된 단백질의 제형의 투여에 대한 지침서를 추가로 포함하며, 여기서 태그 결합 도메인은 태그부착된 단백질에 결합하는 것인, 실시양태 95 또는 96의 키트.
E98. 태그부착된 단백질의 단백질이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 실시양태 97의 키트.
E99. 양친매성 리간드 접합체가 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하는 것인, 실시양태 77 또는 78의 면역원성 조성물.
E100. 양친매성 리간드 접합체가 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인, 실시양태 77 또는 78의 면역원성 조성물.
E101. 지질이 디아실 지질인, 실시양태 77, 78, 99 또는 100의 면역원성 조성물.
E102. CAR 리간드가 종양 연관 항원 또는 바이러스 항원인, 실시양태 77 또는 99 내지 101의 면역원성 조성물.
E103. 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체가 올리고뉴클레오티드 링커를 포함하는 것인, 실시양태 77, 78 또는 99 내지 102의 면역원성 조성물.
E104. 올리고뉴클레오티드 링커가 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2인, 실시양태 103의 면역원성 조성물.
E105. 태그가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 78, 99 내지 101, 103 및 104 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가 제한으로서 해석되지 않아야 된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 명백히 참조로 포함된다.
실시예
하기는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 구체적 실시양태의 예이다. 본 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 물론 약간의 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다.
실시예 1: DSPE-PEG-FITC 및 DSPE-PEG-펩티드/단백질 리간드의 생성
일부 환자 집단에서 CAR-T 세포의 열악한 지속성 및 고형 종양에서 최적의 반응을 유도하기 위한 CAR-T 요법의 실패로 인해, 보다 강력한 CAR-T 세포 확장 및 증강된 기능성이 CAR 자체를 통한 자극에 의해 달성될 수 있다고 가정되었다. 이를 달성하기 위해, 알부민-결합 인지질-중합체가 기존에 기재된 바와 같이 활용되었다 (Liu, H., Moynihan, K. D., Zheng, Y., Szeto, G. L., Li, A. V., Huang, B., Irvine, D. J. (2014). Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature, 507(7493), 519-522). 구체적으로, CAR에 대한 작은 분자, 펩티드 또는 단백질 리간드는 도 1a에 제시된 바와 같이 중합체-지질 꼬리에 부착되어 양친매성 물질 백신을 형성한다.
초기에, 표적 변경가능한 CAR이 이용되었으며, 여기서 키메라 항원 수용체는 작은 분자 플루오레세인 (FITC)을 인식하고, 이는 FITC-접합된 항종양 항체를 통해 종양을 표적화한다 (Ma, J. S., Kim, J. Y., Kazane, S. A., Choi, S. H., Yun, H. Y., Kim, M. S., Cao, Y. (2016). Versatile strategy for controlling the specificity and activity of engineered T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 113(4), E450-458). 동족 리간드는 FITC-폴리(에틸렌 글리콜 (PEG)-DSPE ("DSPE-PEG-FITC")이다. 도 1b는 상응하는 양친매성 물질 백신으로 코팅된 항원 제시 세포에 의한 CAR T 세포의 자극을 제시하는 개략도를 제공한다.
DSPE-PEG-FITC 백신을 생성하기 위해, PE(포스포에탄올아민) 지질 (예를 들어, DSPE)을 500 μL CHCl3 및 500 μL DMF에 용해시키고, 3 당량의 트리에틸아민 및 1.2 당량의 플루오레세인-PEG2000-NHS (크리에이티브 PEG 워크스 인크.(Creative PEG Works Inc.))를 부가하며 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 양친매성 플루오레세인 PEG 양친매성 물질은 C4 칼럼 (바이오베이직-4, 200 mm x 4.6 mm, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)), 용출제로서의 100 mM 트리에틸아민-아세트산 완충제 (TEAA, pH 7.5)-메탄올 (0-30분, 10-100%)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 정제되었다. 최종 산물을 H2O에 용해시키고, UV-Vis 분광법 (플루오레세인, 490 nm에서 흡광 계수 70,000 M-1cm-1, pH 9)에 의해 정량화하며 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 명확히 규명하였다. DSPE-PEG-펩티드/단백질 리간드를 생성하기 위해, N-말단 시스테인-변형된 펩티드 또는 단백질 리간드를 DMF에 용해시키고, 2 당량의 말레이미드-PEG2000-DSPE (레이산 바이오, 인크.(Laysan Bio, Inc.))와 혼합하며, 이러한 혼합물을 24시간 동안 25℃ 하에 교반시켰다. 생체 접합은 본질적으로, HPLC 분석에 의해 완료된 것으로 판단되었다. 펩티드 양친매성 물질은 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 명확히 규명되었다. 이어서 펩티드 접합체를 10x ddH2O에 희석시키고 분말로 동결건조시키며, H2O에 재용해시키고 -80℃ 하에 저장하였다.
실시예 2: DSPE-PEG-FITC 코팅된 세포에 의한 항-FITC CAR-T 세포의 시험관내 활성화
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포에 대한 양친매성 리간드 접합체의 효과를 결정하기 위해, 양친매성 리간드 접합체를 제공하는 항원 제시 세포 (APC)와의 공동-배양 후 CAR-T 세포의 시험관내 자극을 평가하였다. 구체적으로, 항-FITC CAR을 발현하는 모델 CAR-T 세포는 Myc 에피토프 태그 코딩 영역 및 CD8 막횡단 도메인, CD28 시그널링 도메인, 및 CD3z 시그널링 도메인을 포함하는 CAR 코딩 영역과 동일 프레임 내에서 융합된 항-FITC (플루오레세인) scFV (4m5.3) 코딩 영역을 포함하는 DNA 벡터를 1차 마우스 T 세포 내로 레트로바이러스 형질도입함으로써 생성되었다. Myc-태그부착된 항-FITC CAR의 도메인 구조 및 배향이 도 2a에 도시되어 있다. 1차 마우스 T 세포에서의 Myc-태그부착된 항-FITC CAR의 표면 발현은 상기와 같이 형질도입된 세포를 형광 표지된 항-Myc 항체와 함께 인큐베이션하고 유동 세포계수법에 의해 형광 세포를 정량화함으로써 정량화되었다 (도 2b).
그 다음, 모델 표적 세포인 K562 세포를, PEG-2000 링커를 통해 FITC에 공유적으로 연결된 친유성 모이어티 (즉, DSPE)를 포함하는 양친매성 리간드 접합체의 효율적인 막 삽입에 관하여 시험하였다. 저 용량 (즉, 25 nM)의 DSPE-PEG-FITC에서, 혈청 농도의 증가는 표면 삽입을 거의 완전히 폐지하였다. 그러나, 고 용량 (500 nM)에서 DSPE-PEG-FITC는 높은 수준의 세포 표면 장식을 유지하였다 (데이터는 제시되지 않음).
림프절에서 항원 제시 세포를 모방하기 위해, 수지상 세포 (DC2.4)를 증가 농도의 DSPE-PEG-FITC로 장식한 다음, 0시간, 48시간 및 96시간 동안 항-FITC CAR T-세포와 공동-배양하였다. 항-FITC CAR T-세포를 자극할 수 있는 FITC-장식된 DC2.4 세포의 능력을 CAR-T 세포에 의한 IFNγ 분비에 의해 모니터링하였다. 대부분의 FITC 분자가 24시간 내에 내재화되는 것으로 보이지만, CAR-T 세포에 의한 IFNγ의 강한 유도는 0 및 48시간에 관찰된 후 96시간에 감소하였고 (데이터는 제시되지 않음), 용량 의존적 활성화가 관찰되었다 (도 2c). 추가로, FITC-장식된 DC2.4 세포가 10:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서 6시간 동안 FITC-CAR-T 세포와 공동-배양되는 경우, FITC-CAR-T 세포가 DSPE-PEG-FITC와 함께 투여될 때 DC2.4 세포는 사멸되었다 (도 2d). 또한, 이전에 보고된 바와 같이 (문헌 [Ma et al., 2016]), FITC-CAR T 세포를 FITC-접합된 항-CD19 항체의 존재하에 CD19+ 표적 세포와 공동-배양하면, IFNγ 분비에 의해 결정된 바와 같이 강력한 CAR-T 활성화가 초래되었지만, 대조군 항체는 그렇지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 전반적으로, 이들 결과는 양친매성 리간드 접합체가 CAR-T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 림프절 (LN)로의 DSPE-PEG-FITC 트래픽킹, APC에 의한 보유 및 흡수
실시예 2의 결과에 기반하여, 양친매성 리간드 접합체 DSPE-PEG-FITC가 림프절 (LN)에서 항원 제시 세포를 코팅하여 생체내에서 FITC-CAR-T 세포를 프라이밍할 수 있었는지의 여부를 결정하였다. 림프절로의 DSPE-PEG-FITC 트래픽킹 및 APC에 의한 보유 및 흡수를 평가하기 위해, C57BL/6 마우스는 다양한 용량의 DSPE-PEG-FITC를 투여받았다. 구체적으로, 서혜 LN, 액와 LN 및 장골 LN은 2 nmol, 5 nmol, 또는 10 nmol 용량의 DSPE-PEG-FITC를 마우스의 꼬리 정맥 내로 투여한 후 24시간에 수거하였다. 유리 FITC가 대조군으로서 사용되었다. 마우스를 희생시키고, FITC 시그널의 LN 잔류를 모니터링하기 위해 IVIS 영상화 (여기 465 nm, 방출 520 nm)에 대해 상이한 시점에서 LN을 제거하였다. 가장 효율적인 배액은 서혜 LN에 이어 액와 LN으로 이어졌다 (데이터는 제시되지 않음). 고 용량에서, DSPE-PEG-FITC는 또한 장골 LN으로 배액하는 것으로 관찰되었다.
FITC 시그널은 4일 후에 최저 용량 (2 nmol)에서 거의 손실되었지만, 시그널은 고 용량 (10 nmol)의 DSPE-PEG-FITC에서 21일 초과하여 유지되었다 (도 3a). 유리 FITC 시그널은 24시간 내에 손실되었다 (도 3a). LN 세포의 유동 세포계수법 분석 결과, CD8+ 및 CD11b+ 수지상 세포 (DC)에서 뿐만 아니라 대식세포에서는 DSPE-PEG-FITC가 상당히 흡수된 것으로 밝혀졌지만, T 세포 또는 B 세포에서는 최소한의 축적만 나타났다 (도 3b 및 3c). LN의 공초점 영상화는 DSPE-PEG-ITC가 초기에는, 1일 후 모낭간 영역에 축적되었지만, 시간 경과에 따라 T 세포 영역 내의 CD11c+ DC 상으로 분할되었고, 항-FITC 항체로 밝게 염색된 이들 LN으로부터 FITC+ CD11c+ 세포가 분류되었다는 것을 제시하였다 (데이터는 제시되지 않음).
전반적으로, 이러한 결과는 양친매성 리간드 접합체가 림프절 내의 항원 제시 세포 상에서 발현된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: LN에 보유된 DSPE-PEG-FITC는 CAR T-세포 증식을 강건하게 자극한다
림프절 항원 제시 세포 상에 축적되는 DSPE-PEG-FITC가 CAR T 세포 프라이밍으로 이어질지의 여부 및 이러한 자극 효과가 제1일에서 얼마 동안 지속될 것인지를 평가하기 위해, PBS, c-디-GMP (25 ug), DSPE-PEG-FITC (10 nmol), 또는 DSPE-PEG-FITC (10 nmol) + c-디-GMP (25 ug)를 야생형 C57Bl/6 마우스 내로 투여하였다. 다양한 시점 이후에, 도 7a 내의 타임라인에 표시된 바와 같이, 2x106개의 CTV-표지된 CAR-T 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 각각의 마우스 내로 옮겼다. CAR-T 세포를 1:1 비 하의 CAR+ 세포와 CAR- 세포의 혼합물이 되도록 적정하였다. 또 다른 48시간 후, 마우스를 희생시키고 FACS 분석을 위해 LN을 제거하였다. 도 7b의 대표적인 결과에서 입증된 바와 같이, 백신접종 후 7일까지, FITC-CAR-T는 입양 전달 후 48시간에 림프절에서 효율적으로 자극되었고, 강력한 T 세포-촉진 아주반트인 시클릭-디-GMP (CDG, STING 효능제)의 공동-투여는 14일까지 DSPE-PEG-FITC 자극을 상당히 연장시켰다 (도 7b). CAR-T 세포의 최소 증식은 PBS 또는 아주반트 단독을 투여받은 대조군 마우스에서 관찰되었다. 이들 결과는 생체내에서 CAR-T 세포 증식을 유도할 수 있는 양친매성 리간드 접합체의 능력을 나타낸다.
추가로, CDG 공동-투여는 대식세포 및 CD11c+CD11b+ DC를 포함한 다수의 APC 세포 표면 상에서 DSPE-PEG-FITC의 지속 기간 및 접근성을 상당히 증가시켰다 (도 5). 또한, CDG 공동-투여는 DSPE-PEG-FITC 단독과 비교하여 몇 가지 공동-자극성 분자, 즉 CD80, CD86, 41BBL, ICOSL 및 OX40L의 발현 수준을 증가시켰다 (도 6). 백신접종 후 24시간 및 3일에 발현을 측정하였다.
실시예 5: 장기간 CAR-T 세포 확장에 대한 DSPE-PEG-FITC의 효과
CAR-T 세포의 장기간 생체내 확장에 대한 DSPE-PEG-FITC의 효과를 추적하기 위해, CD45.1/CD45.2 유사유전자형 이식 모델을 활용하였다. 구체적으로, 림프고갈된 CD45.2 수용자 마우스는 제0일에 다양한 용량의 CD45.1 공여자 FITC CAR-T 세포 (0.25x106개; 0.05x106개; 0.01x106개)를 투여받았다. 24시간 후, 마우스는 PBS를 투여받았거나 또는 25 ug CDG의 수반 하에 또는 수반 없이 10 nmol DSPE-PEG-FITC로 백신접종을 받았다. 도 7은 실험의 타임라인을 제공한다. 순환성 CAR-T 세포의 백분율은 백신접종 후 7일 및 14일에 수집된 말초 혈액의 FACS 분석에 의해 결정되었다. CAR T 세포는 CD3+CD8+/Myc 태그+ 집단으로 정의되었다.
DSPE-PEG-FITC로 단독으로 또는 CDG와 조합하여 백신접종 후 극적인 종방향 CD45.1 CAR-T 확장이 관찰되었다. 구체적으로, 0.25x106개 군은 >70%를 차지하였고, 0.05x106개 군은 제1 백신접종 후 7일에 말초 CD8+ T 세포의 >50%를 차지하였으며, 이는 10x106개의 생체외 확장된 CAR-T 세포가 전달된 마우스보다 유의미하게 더 많았다 (도 7). 제2 부팅에서는, 0.01x106개 군이 또한, 제14일 정도에 50%에 도달하였다.
추가로, DSPE-PEG-FITC의 효능은 림프충만 마우스에서 평가되었다. 림프고갈 레지멘은 입양 세포 요법의 효능을 증강시키지만, 심각한 독성과 연관이 있다. 림프구 고갈된 환경에서 DSPE-PEG-FITC에 의한 강력한 CAR-T 부스팅을 고려해 볼 때, DSPE-PEF-FITC가 림프충만 마우스에서 CAR-T 세포를 상당한 수준으로 확장시킬 수 있었는지의 여부가 그 다음으로 고려되었다. 구체적으로, 다수 용량의 CD45.1 FITC CAR-T 세포를 림프충만 CD45.2 수용자 마우스 내로 전달한 후, 동일한 백신접종 계획 및 도 8에 제시된 상기 기재된 후속 분석을 수행하였다. 그 결과가 또한, 도 8에 제시되는데, 이는 10x106개의 CAR-T만을 투여받은 대조군 마우스는 ~5% 순환성 CD8+ T 세포 집단을 가진 반면, 0.25x106개의 CAR-T + DSPE-PEG-FITC를 투여받은 마우스는 제14일까지 ~10%에 도달하였고, ~20%는 1x106개의 CAR-T 군에서 달성되었다는 것을 나타낸다. 한 가지 우려는 반복 백신접종이 DSPE-PEG와 접합될 때 FITC에 대항하여 항체를 유도할 수 있으므로, 림프절에서 CAR에 대한 그의 자극을 차단할 수 있다는 것이었다. 그러나, DSPE-PEG가 T 세포 도움의 공급원을 제공하지 않았기 때문에, FITC가 DSPE-PEG 또는 운반체 단백질 OVA와 접합될 때 항체 반응이 관찰되지 않았다 (도 9).
전반적으로, 이들 결과는 아주반트 (즉, CDG)와 조합한 DSPE-PEG-FITC 백신이 생체내에서 강력한 CAR-T 부스터 백신으로서 작용하였다는 것을 표시하였다.
실시예 6: 종양-특이적 항원을 갖는 양친매성 물질 백신의 효능
다음으로, 상기 실시예에 기재된 동일한 부스터 백신 개념이 진실된 종양 항원-특이적 CAR에 사용될 수 있었는지의 여부를 평가하였다. 구체적으로, EGFRvIII로부터 유래된 짧은 선형 에피토프를 인식하는 뮤린 EGFRvIII-특이적 CAR 139scFv가 활용되었다 (Sampson, et al. (2014). EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res, 20(4), 972-984). 뮤린 T 세포를 이러한 CAR로 형질도입하고, 하기 방법에 의해 양친매성-EGFRvIII 펩티드 백신 분자를 합성하였다: 디메틸포름아미드 (DMSO)에 용해된 c-말단 시스테인-변형된 EGFRvIII 펩티드를 2.5 당량의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG2k) 및 1 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 및 촉매 량의 트리에틸아민과 혼합하였다. 이 혼합물을 실온 하에 24시간 동안 교반시킨 후, HPLC로 정제하고 H2O에 용해시켰다. DSPE-PEG-EGFRvIII 양친매성 물질 백신의 개략도가 도 10a에 제시되어 있고, 도 10b는 T 세포 상에서의 항-EGFRvIII CAR의 발현을 제시한다.
DSPE-PEG-FITC와 유사하게, 시험관내에서 세포 막에 삽입된 DSPE-PEG-EGFRvIII, 및 DSPE-PEG-EGFRvIII-코팅된 세포는 EGFRvIII-CAR-T 세포를 자극하였다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 2x106개 세포 트레이스 바이올렛 (CTV) 표지된 EGFRvIII-CAR-T 세포의 정맥 주사 후 24시간에 마우스를 10 ug의 DSPE-PEG-EGFRvIII 및 아주반트 (25 ug의 시클릭-디-GMP)로 면역화하면, 48시간 후 생체내에서 배액 서혜 림프절에서 광범위한 CAR-T 세포 증식이 촉발되었다 (도 10c). 백신 부스팅의 치료 효과를 시험하기 위해, 뮤린 CT-2A 신경교종 세포를 EGFRvIII로 형질도입하고 EGFRvIII-CAR-T 세포와 공동-배양하였다. CAR-T 세포는 EGFRvIII 발현 CT-2A 신경교종 세포의 존재 하에 IFNγ를 분비하였다 (도 11a). 추가로, 시험관내에서 6시간 동안 1:10 비로 EGFRvIII-CAR-T와 야생형 EGFR 또는 EGFRvIII을 발현하는 CT-2A 신경교종 세포를 공동-배양하면, EGFRvIII-CAR-T 세포에 의해 EGFRvIII 발현 CT-2A 신경교종 세포는 효율적으로 사멸되었지만, 야생형 EGFR 발현 CT-2A 신경교종 세포는 그렇지 못하였다 (도 11b).
DSPE-PEG-EGFRvIII 양친매성 물질 백신의 효능을 추가로 조사하기 위해, 생체내 모델을 활용하였다. 구체적으로, 야생형 CD45.2 C57Bl/6 마우스에 4x106개 EGFRvIII 발현 CT-2A 세포를 체내 이식하였다. 제7일에, CT-2A-mEGFRvIII 종양-보유 마우스는 거의 치사량에 가까운 방사선을 조사받았고, 연속해서 CD45.1 마우스로부터 생산된 상이한 용량의 EGFRvIII CAR-T 세포를 주입받은 다음, 10 ug의 DSPE-PEG-EGFRvIII + 25 ug의 CDG를 수반하거나 또는 수반하지 않았다. 10x106개의 CAR-T 세포를 투여받은 군에서는, 순환성 CAR-T 세포가 말초 혈액 CD8+ T 세포의 ~40%를 차지하였다 (도 12). 더 낮은 세포 수를 투여받은 마우스는 최소 순환성 CAR-T 세포를 가졌지만, DSPE-PEG-EGFRvIII + CDG를 투여받은 군에서는 극적인 EGFRvIII CAR-T 확장이 달성되었다 (도 12).
EGFRvIII CAR T 기능에 대한 양친매성 리간드 접합체의 영향을 평가하기 위해, 백신접종 후 7일에 수집된 말초 혈액을 사용함으로써 세포내 시토카인 염색 (ICS)을 수행하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 1x 골지플러그의 존재하에 6시간 동안 96-웰 플레이트에서 1:1 비로 EGFRvIII 발현 CT-2A 세포와 혼합하였다. 이어서, 세포를 표면 염색하고, 고정시키며 투과시킨 다음, 항-IFNγ 및 항-TNFα 항체로 추가로 염색하여, 반응 표적 세포에서 백신 부스팅되거나 부스팅되지 않은 EGFRvIII CAR T 세포의 시토카인 생산을 평가하였다. DSPE-PEG-EGFRvIII 부스팅된 EGFRvIII CAR-T 세포는 상당히 증강된 기능성을 가졌으며, 대다수의 순환성 CAR-T가 표적 종양 세포에 반응하였다 (도 13). 더욱이, 백신접종 후 제7일에는, DSPE-PEG-EGFRvIII + CDG 부스팅된 군에서 종양으로의 CAR-T 침윤이 상당히 증가된 것으로 관찰되었으며, 이는 종양 mg당 CAR-T 세포의 수를 분석하는 FACS에 의해 결정되었다 (도 14). 또한, 종양 침윤 CAR-T 세포는 백신접종 후 7일에 종양 세포에 대항하여 증강된 반응성을 나타냈다. 구체적으로, 도 15는 종양 침윤 CAR-T 세포에 의한 시토카인 분비 수준이 PBS와 비교해서 DSPE-PEG-EGFRvIII + CDG의 존재 하에 증강되었다는 것을 제시하는 반면, 도 16은 종양 침윤 CAR-T 세포에서는 세포독성의 지표인 그랜자임 B의 수준이 증가되었고, 증식의 지표인 Ki67도 증가되었다는 것을 제시한다. 흥미롭게도, 이러한 증강된 반응성은 PD1 및 TIM3의 표면 발현에도 불구하고 발생하였다 (도 17). CAR-T와 DSPE-PEG-EGFRvIII + CDG 둘 다를 투여받은 동물은 종양 성장이 현저히 지연되었고 (도 18a), 생존이 연장되었다 (도 18b). 특히, DSPE-PEG-FITC 백신접종된 마우스와 유사하게, 매주 4회 백신접종 후 EGFRvIII에 대항하여 항체 반응이 유발되지 않았으며, 각각의 백신접종 후 약간의 체중 감소 만이 관찰되었으며, 이는 독성이 관리가능한 수준임을 나타냈다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7: DSPE-PEG-FITC로 백신접종된 이중특이적 CAR T 세포의 설계 및 효능
CAR T 세포에 대한 대리 펩티드 리간드의 사용은 효과적이지만, 일부 CAR은 3차원 구조적 에피토프를 인식하며 (문헌 [De Oliveira, et al. (2013). A CD19/Fc fusion protein for detection of anti-CD19 chimeric antigen receptors. J Transl Med, 11, 23. doi:10.1186/1479-5876-11-23]), 그에 대하여 간단한 대리 리간드를 식별하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 이러한 제한을 없애고 그의 결합 도메인의 본질 또는 그의 특이성에 관계없이 임의의 CAR을 부스팅하기 위한 수단을 제공하기 위해, 탠덤 scFv-기반 이중특이적 CAR을 설계하였다. 구체적으로, 항-FITC scFV 4m5.3을 N-말단 시그널 펩티드 바로 다음에 (G4S)4 펩티드 링커를 통해 종양-표적화 CAR의 N-말단 세포외 도메인에 첨부하였다 (도 19). 이러한 접근법의 타당성을 평가하기 위해, 1차 마우스 T 세포에서 잘 발현되는 흑색종-연관 항원 TRP1과 FITC 둘 다를 표적화하는 이중특이적 뮤린 CAR을 활용하였다. 도 20은 T 세포 상에서 이중특이적 CAR의 발현을 제시한다. 이러한 이중특이적 CAR의 반응 특이성을 확인하기 위해, FITC/TRP1-CAR T 세포를 시험관내에서 6시간 동안 10:1 이펙터:표적 비에서 DSPE-PEG-FITC-코팅된 표적 세포 또는 TRP1 발현 B16F10 세포와 공동-배양하였고, FITC/TRP1-CAR T는 IFNγ 분비에 의해 표시된 바와 같이 구체적이고 강력하게 항원 둘 다에 반응하였다 (도 21). 추가로, FITC/TRP1-CAR T 세포는 10:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서 6시간 동안 세포를 공동-배양함으로써 결정된 바와 같이, 단일-특이적 TRP1-CAR T 세포와 동등하게 TRP1+ 표적 세포를 사멸시켰다 (도 22). 생체내에서, DSPE-PEG-FITC 백신접종은 백신접종 후 48시간에 세포 트레이스 바이올렛 트래픽킹에 의해 결정된 바와 같이, FITC/TRP1 이중특이적 CAR-T 증식을 강건하게 자극하였다 (도 23).
DSPE-PEG-FITC + CDG를 사용한 이중특이적 CAR-T의 치료 잠재력을 평가하기 위해, 야생형 C57Bl/6 마우스에 5x105개의 B16F10 종양 세포를 체내 이식하였다. 5일 후, 종양 보유 동물은 500cGy 방사선조사로의 림프고갈 치료를 받고, 그 다음날 10x106개 FITC/TRP1 CAR-T 세포의 정맥내 주사를 받았다. CAR-T 세포 단독은 대조군 T 세포와 비교해서 종양 성장에 약간의 영향을 미쳤지만, CAR-T와 백신 (10 nmol DSPE-PEG-FITC + 25 ug CDG) 둘 다를 투여받은 마우스는 종양 성장이 극적으로 지연되었고 (도 24a), 생존이 현저하게 연장되었다 (도 24b). 이는 순환성 CAR-T 수준 증가 (도 25) 및 종양 침윤 증강 (도 26)과 일치하였다. 백신접종을 받은 동물 군에서 체중 감량이 또한 제어되었다 (데이터는 제시되지 않음).
강력한 CAR-T 확장 및 DSPE-PEG-FITC + CDG 부스팅을 통한 기능적 증강에 의해 동기화되어, 림프고갈 사전 컨디셔닝을 수반하지 않은 종양 보유 마우스에서 CAR-T 플러스 DSPE-PEG-FITC + CDG의 치료 효능을 평가하였다. 생체내 추적을 용이하게 하기 위해, 유사한 백신접종 계획에 따라, CD45.1 FITC/TRP1 CAR-T 세포를 B16F10 흑색종을 동반한 CD45.2 수용자 마우스 내로 전달하였다. CAR-T 단독을 투여받은 마우스는 대조군 T 세포를 투여받은 마우스와 거의 구별할 수 없을 정도의 종양 성장을 나타낸 반면, CAR-T와 DSPE-PEG-FITC + CDG 둘 다의 백신접종을 이용한 조합 처리는 종양 성장을 현저하게 지연시켰고 동물 생존을 증가시켰으며 (도 27a 및 27b), 동물 체중에 미치는 영향은 최소화하였다 (데이터는 제시되지 않음).
비록 DSPE-PEG-FITC가 우선적으로 림프절로 트래픽킹되어 이에 축적되고, 림프절에 상주하는 APC 내로 혼입되지만, 적은 백분율의 양친매성 물질이 말초 혈액 내로 누출되어 방관자 세포 내로 삽입되어 새로운 CAR-T 표적이 되게 할 수 있다. 림프 배액로부터 빠져 나온 양친매성 물질에 의해 야기된 이러한 의도하지 않은 독성을 분석하기 위해, FITC CAR-T 세포를 자극하기 위해 심하게 결함이 있는 림프관을 갖는 NSG 마우스 내로 DSPE-PEG-FITC를 정맥내 주사하였다. 그럼에도 불구하고, FITC CAR-T 증식의 자극은 무시할만한 수준이었다 (데이터는 제시되지 않음).
전반적으로, 이들 결과는 CAR-T 세포 요법이 양친매성 물질 백신의 사용으로 고형 종양에서 유효하다는 것을 나타냈다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> COMPOSITIONS FOR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL THERAPY AND USES THEREOF <130> MITN-043PC <140> PCT/US2018/051764 <141> 2018-09-19 <150> US 62/560,588 <151> 2017-09-19 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: EGFRvIII peptide conjugated to DSPE-PEG <400> 1 Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: lipophilic-CpG oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> at least one "g" is present and up to 4 "g" may be present or absent <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Lipophilic compound <400> 2 gggggtccat gacgttcctg acgtt 25

Claims (76)

  1. 하기를 포함하는 양친매성 리간드 접합체:
    키메라 항원 수용체 (CAR) 리간드; 및
    CAR 리간드에 작동가능하게 연결된 지질.
  2. 제1항에 있어서, 지질이 생리학적 조건 하에서 세포 막 내에 삽입되거나, 생리학적 조건 하에서 알부민에 결합하거나, 또는 둘 다 하는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지질이 디아실 지질인 양친매성 리간드 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 디아실 지질이 12-30개의 탄화수소 단위, 14-25개의 탄화수소 단위, 16-20개의 탄화수소 단위, 또는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함하는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 링커를 통해 지질에 작동가능하게 연결되는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 링커가 친수성 중합체, 친수성 아미노산의 스트링, 폴리사카라이드, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  7. 제5항에 있어서, 링커가 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인 양친매성 리간드 접합체.
  8. 링커를 통해 디아실 지질에 작동가능하게 연결된 CAR 리간드를 포함하는 양친매성 리간드 접합체로서, 여기서 디아실 지질은 12-30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함하고, 여기서 링커는 "N" 연속 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하며, 여기서 N은 25 내지 50인 양친매성 리간드 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 태그인 양친매성 리간드 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 태그가 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 피코에리트린 (PE), 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 종양-연관 항원, 또는 그의 단편인 양친매성 리간드 접합체.
  12. 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 작동가능하게 연결된 지질을 포함하는 양친매성 리간드 접합체.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이고, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 PEG-2000인 양친매성 리간드 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 CAR에 결합하고, CAR이 공동-자극 도메인을 포함하는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  15. 제14항에 있어서, CAR이 이중특이적 결합 도메인을 포함하는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 이중특이적 결합 도메인이 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하거나 또는 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 양친매성 리간드 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 이중특이적 결합 도메인이 태그 결합 도메인 및 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드가 태그인 양친매성 리간드 접합체.
  18. 제15항에 있어서, 이중특이적 결합 도메인이 제1 종양-연관 항원 결합 도메인 및 제2 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드가 제1 또는 제2 종양-연관 항원, 또는 그의 단편인 양친매성 리간드 접합체.
  19. 제14항에 있어서, CAR이 태그 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드가 태그인 양친매성 리간드 접합체.
  20. 제14항에 있어서, CAR이 종양-연관 항원 결합 도메인을 포함하고, CAR 리간드가 종양-연관 항원 또는 그의 단편인 양친매성 리간드 접합체.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  22. 제21항의 조성물, 및 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인 면역원성 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 패턴 인식 수용체에 결합하는 것인 면역원성 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 CpG를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 톨-유사 수용체에 대한 리간드인 면역원성 조성물.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 올리고뉴클레오티드 링커인 면역원성 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 링커가 "N" 연속 구아닌을 포함하며, 여기서 N은 0 내지 2인 면역원성 조성물.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 디아실 지질인 면역원성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 디아실 지질이 12-30개의 탄화수소 단위를 포함하는 아실 쇄를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  31. 제22항에 있어서, 아주반트가 시클릭 디-GMP (CDG)인 면역원성 조성물.
  32. 대상체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, CAR(-) T 세포의 증식이 대상체에서 증가되지 않는 것인 방법.
  34. 종양의 크기의 감소 또는 저하 또는 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나 또는 저하시키거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR-T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법.
  35. 암을 가진 대상체에서 항종양 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 CAR-T 세포 요법을 받고 있거나 또는 받은 적이 있는 것인 방법.
  36. 대상체에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR-T 세포, 및 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 면역 반응이 T-세포 매개된 면역 반응 또는 항종양 면역 반응인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직이 종양 세포 또는 종양 조직인 방법.
  39. 항원의 발현 또는 상승된 발현과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 상기 항원에 대해 표적화된 CAR-T 세포, 및 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 CAR T 세포를 투여받기 전에 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여받는 것인 방법.
  41. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 CAR-T 세포를 투여받은 후에 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여받는 것인 방법.
  42. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물, 및 CAR-T 세포가 동시에 투여되는 것인 방법.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 리간드 접합체가 림프절로 트래픽킹되는 것인 방법.
  44. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 리간드 접합체가 서혜 림프절 및 액와 림프절로 트래픽킹되는 것인 방법.
  45. 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 리간드 접합체가 림프절로의 트래픽킹 시 항원 제시 세포의 막 내로 삽입되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 항원 제시 세포가 수질 대식세포, CD8+ 수지상 세포, 및/또는 CD11b+ 수지상 세포인 방법.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 또는 적어도 25일 동안 림프절 내에 보유되는 것인 방법.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 리간드가 태그이고, CAR이 태그 결합 도메인을 포함하고, 방법이 태그부착된 단백질의 제형을 투여하는 것을 추가로 포함하고, 태그 결합 도메인이 태그부착된 단백질에 결합하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 태그부착된 단백질의 단백질이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 태그 결합 도메인이 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 태그부착된 단백질의 제형이 CAR-T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  52. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 태그부착된 단백질의 제형이 CAR-T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여와 공동으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  53. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 태그부착된 단백질의 제형이 CAR-T 세포, 및 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 후에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-T 세포가 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 투여되는 것인 방법.
  55. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-T 세포가 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여 후에 투여되는 것인 방법.
  56. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-T 세포가 양친매성 리간드 접합체, 조성물, 또는 면역원성 조성물의 투여와 공동으로 투여되는 것인 방법.
  57. 제32항 내지 제34항 및 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 가진 것인 방법.
  58. 제32항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  59. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  60. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  61. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 용기, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위해 조성물 백신을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  62. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위해, 상기 의약을 단독으로 또는 아주반트 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 조합하여 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  63. 제59항 또는 제61항에 있어서, 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  64. 제60항, 제62항 및 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인 키트.
  65. CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 CAR-T 세포를 활성화시키거나, 확장시키거나 또는 그의 증식을 증가시키기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  66. 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  67. 개체에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체, 제21항의 조성물, 또는 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
  68. 제32항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 리간드 접합체, 조성물 또는 면역원성 조성물을 비-종양 배액 림프절에서 비경구적으로 투여하거나, 종양-배액 림프절에서 비경구적으로 투여하거나, 또는 종양내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  69. 제36항에 있어서, 표적 세포 집단 또는 표적 조직이 바이러스에 감염된 세포 집단 또는 조직인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 바이러스가 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)인 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 면역 반응이 T-세포 매개된 면역 반응인 방법.
  72. 제39항에 있어서, 항원이 바이러스 항원 또는 암 항원인 방법.
  73. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 양친매성 리간드 접합체를 포함하는 조성물을 포함하는 의약, 임의적인 제약상 허용되는 담체, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  74. 제73항에 있어서, 태그부착된 단백질의 제형, 및 상기 태그부착된 단백질의 제형의 투여에 대한 지침서를 추가로 포함하며, 여기서 CAR이 태그부착된 단백질에 결합하는 태그 결합 도메인을 포함하는 것인 키트.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 아주반트, 및 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 개체에서 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위해 상기 아주반트를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  76. 제75항에 있어서, 아주반트가, 링커의 수반 하에 또는 수반 없이, 지질에 접합된 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 및 임의적으로 극성 화합물을 포함하는 양친매성 올리고뉴클레오티드 접합체인 키트.
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