ES2871349T3 - Expansión selectiva y controlada de células NK educadas - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para expandir células asesinas naturales (NK) de una especificidad KIR dada, dicho método comprende: (a) seleccionar un donante que tenga células NK educadas de dicha especificidad KIR dada, en donde las células NK educadas expresan KIR específico para moléculas del HLA de clase I propias; (b) proporcionar células leucocitarias de dicho donante, en donde dichos leucocitos comprenden células NK; (c) poner en contacto dichas células NK del donante con un estimulador de uno o ambos receptores compatibles CD94/NKG2C y CD94/NKG2A; y (d) expandir selectivamente células NK que tienen dicha especificidad KIR, células que son positivas para NKG2C y negativas para NKG2A, para producir una población de células que comprenden dichas células NK expandidas.
Description
DESCRIPCIÓN
Expansión selectiva y controlada de células NK educadas
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia. Más específicamente, la presente invención se refiere a la terapia basada en células NK contra el cáncer, inmunodeficiencia, enfermedades infecciosas y autoinmunitarias. Se proporcionan métodos para expandir una población de células NK citolíticas, que pueden usarse para terapia. Sin embargo, tales métodos pueden además tener usos no terapéuticos, por ejemplo, en la investigación.
Antecedentes de la invención
Células asesinas naturales
Las células asesinas naturales (NK) representan un componente importante de la inmunidad innata. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las células infectadas por virus y responden a la formación de tumores.
La función de las células NK está regulada por una amplia gama de receptores de superficie celular codificados por la línea germinal que median las señales de activación o inhibición. Muchos receptores de células NK se aparean con sus homólogos activadores e inhibidores, que comparten el mismo ligando, aunque con diferentes afinidades de unión. Ejemplos de tales receptores apareados son los heterodímeros de tipo lectina CD94/NKG2A (inhibidores) y CD94/NKG2C (activadores), los cuales se unen a la molécula de antígeno leucocitario humano no clásico (HLA)-E. De manera similar, el grupo de genes del receptor similar a la inmunoglobulina de células asesinas (KIR), ubicado dentro del complejo del receptor de leucocitos en el cromosoma 19, codifica catorce genes KIR con inhibidores (2DL1-3, 2DL5, 3DL1-3), activadores (2DS1-5, 3DS1) o potencial de señalización dual (KIR2DL4). El grupo de genes KIR se divide en haplotipos del grupo A, dominados por KIR inhibidores, y haplotipos del grupo B, que contienen un número variable de KIR activadores e inhibidores. La expresión de KIR es muy variable entre los individuos y está determinada por la variación en el contenido de genes KIR, el número de copias, los polimorfismos extensos en los genes KIR y los mecanismos probabilísticos que implican la regulación epigenética de la transcripción.
Entre los KIR inhibidores, cinco tienen especificidades bien definidas para distintos grupos de alelos HLA de clase I; KIR2DL3 y KIR2DL1 se unen a HLA-C1 y HLA-C2, respectivamente, KIR2DL2 se une a HLA-C1 y -C2, KIR3DL1 se une a HLA-Bw4 y KIR3DL2 muestra una unión dependiente de péptidos a HLA-A3/A11.
Las células NK deben someterse a un proceso educativo, conocido además como licenciamiento o armado, para volverse funcionalmente competentes. La adquisición de la función efectora completa depende de la interacción con las moléculas propias del MHC de clase I, lo que tiene importantes consecuencias para la funcionalidad del repertorio de células NK en individuos con diferentes fondos de HLA.
Por tanto, aunque las interacciones inhibidoras entre KIR y sus ligandos análogos anulan la fase efectora de una respuesta de células NK, se requieren además para la educación funcional de las células NK. La fuerza de las interacciones inhibidoras durante el desarrollo de las células NK, y posiblemente a lo largo de la vida útil de la célula, determina el potencial funcional general de la célula NK cuando se enfrenta a dianas que carecen del ligando HLA de clase I correspondiente.
En Gumá y otros, The CD94/NKG2C killer lectin-like receptor constitutes an alternative activation pathway for a subset of CD8+T cells; Eur. J. Immunol. 2005 35: 2071-2080 se informa que los subconjuntos de células T y NK CD94/NKG2C+ se dividieron en respuesta a la estimulación con una línea celular tumoral deficiente en HLA de clase I transfectada con HLA-E.
Además Gumá y otros, Expansion of CD94/NKG2C+ NK cells in response to human cytomegalovirus-infected fibroblasts Blood 2006 107: 3264-3631 analizan el aumento de células NK CD94/NKG2C+ en individuos sanos infectados con citomegalovirus humano (HCMV).
Della Chiesea y otros, Phenotypic and functional heterogeneity of human NK cells developing after umbilical cord blood transplantation: a role for human cytomegalovirus; Blood 2012119(2): 399-410 observaron una maduración más rápida de las células NK junto con la expansión de las células NK NKG2C+ en pacientes que experimentaban reactivación del citomegalovirus. Lopez-Vergés y otros, Expansion of a unique CD57+NKG2Chi natural killer cell subset during acute human cytomegalovirus infection; PNAS 2011 108(36): 14725-14732 describen que durante la infección por CMV humano hay una expansión preferencial de las células NK que expresan el receptor activador NKG2C. Según López-Vergés y otros, las células NK "sin licencia" proliferaron mejor y más eficientemente que las células NK educadas. Estos resultados respaldaron sus hallazgos anteriores en ratones de que las células NK sin educación, que carecen de receptores específicos de MHC propio, controlaban la replicación del CMV de ratón in vivo mejor que las células NK que expresan receptores inhibidores para la clase I de MHC propio. ( Orr MT, Murphy WJ, Lanier LL.
Unlicensed' natural killer cells domínate the response to cytomegalovirus infection. Nat Immunol. Abril de 2010; 11(4): 321-7. Epub 201028 de febrero).
Los diferentes grupos de células NK alorreactivas que tienen en cuenta la incompatibilidad de KIR/HLA de clase I se analizan en Moretta y otros, Killer Ig-like receptor-mediated control of natural killer cell alloreactivity in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation Blood 2011 117 (3): 764-771. Estas células NK alorreactivas se generan en receptores de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas (HSCT) y el subconjunto de NK alorreactivas es detectable de 6 a 7 semanas después del trasplante y, en la mayoría de los casos, el patrón de los KIR expresados es similar al encontrado originalmente en el donante.
Dado que estas células NK aparecen después de 6 a 7 semanas, su efecto antileucémico puede ocurrir solo después de este punto, lo que puede representar una limitación importante, lo que resulta en recaídas leucémicas.
La incompatibilidad de KIR-HLA se analiza además en Leung y otros Determinants of Antileukemia Effects of Allogenic NK Cells, The Journal of Immunology 2004 172: 644-650 donde explican que la potencia de los efectos antileucemia aumenta con un número creciente de pares de incompatibilidades de receptor-ligando, se especula que un donante con un mayor número de pares de incompatibilidades puede ser un mejor donante. Los autores abogan por el modelo receptor-ligando, que abarca la potencial alorreactividad de las células NK no educadas en el donante.
Se sugiere por Miller y otros en Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer; Blood 2005 105: 3051-3057 que las células NK haploidénticas pueden persistir y expandirse in vivo y pueden tener un papel en el tratamiento de cánceres seleccionados usadas solas o como complemento de HCT. Miller y otros demuestran que las células NK humanas transferidas adoptivamente derivadas de donantes relacionados haploidénticos pueden expandirse in vivo, lo que sugiere además que la selección prospectiva de donantes con ligandos KIR no compatibles está justificada cuando sea posible.
En Bjorklund y otros, NK cells expressing inhibitory KIR for non-self-ligands remain tolerant in HLA-matched sibling stem cell transplantation; Blood 2010 115: 2686-2694 los autores discuten la principal contribución de las células NK NKG2A+ a la respuesta funcional temprana después del trasplante. Los receptores NKG2A se expresan temprano durante la diferenciación de las células NK y se expresan en la mayoría de las células NK CD56brillante Según este artículo, las células NK NKG2A+ predominan en las respuestas funcionales en donantes con bajas frecuencias generales de expresión de KIR.
En la actualidad, existe la necesidad de una destrucción de células tumorales más específica y potente en el tratamiento del cáncer. También existe la necesidad de tratamiento contra el cáncer para aquellos pacientes que son refractarios a la quimioterapia convencional, o para aquellos con una indicación de trasplante alogénico de células madre pero que carecen de un donante de células madre, o que amenazan con una recaída después de un trasplante de sangre de cordón cuando no hay linfocitos del donante disponible para infusión de linfocitos de donantes.
Resumen de la invención
Un objetivo principal de la presente invención es expandir selectivamente, de forma controlada, células NK altamente citolíticas de una especificidad KIR dada. Estas células pueden transferirse a los pacientes y permitir una potente destrucción de las células tumorales.
La presente invención presenta una estrategia basada en la estimulación de receptores inhibidores y activadores emparejados en células NK, lo que aprovecha el papel previamente desconocido de la educación en la supervivencia y proliferación de células estimuladas de esta manera. La estrategia inventada es única, ya que produce células con cuatro propiedades beneficiosas para reconocer células cancerosas 1) Enriquece las células con el receptor activador NKG2C para un ligando ampliamente expresado en tumores (HLA-E). 2) Enriquece las células que son negativas para el receptor inhibidor NKG2A. 3) La estrategia expande las células con un patrón de expresión predecible de KIR inhibidores y, por lo tanto, se personaliza para adaptarse al HLA de clase I del paciente, lo que promueve la alorreactividad mediada por células NK o reconocer células diana de HLA de clase I negativas. 4) Las células expandidas se someten a un proceso de diferenciación y se vuelven altamente citolíticas y muy potentes para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCc ).
Más específicamente, el método presentado en la presente descripción puede usarse en la terapia de diversas enfermedades de inmunodeficiencia y cánceres que incluyen, pero sin limitarse a, cánceres linfoides refractarios que incluyen linfoma maligno, leucemia linfoide aguda de adultos y niños, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásico, linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), linfohistiocitosis hemofagocítica familiar (FHL), infecciones y enfermedades autoinmunitarias.
El método presentado en la presente descripción es útil además para pacientes que son refractarios a la quimioterapia convencional o en aquellos con indicación de trasplante alogénico de células madre pero que carecen de un donante de células madre o amenazan con una recaída después del trasplante de sangre del cordón umbilical cuando no hay linfocitos de donantes disponibles para infusión de linfocitos de donantes.
Los donantes se seleccionan en función de su estado de ligando KIR y los leucocitos se separan de ellos, por ejemplo, se realiza la aféresis de un donante para obtener un gran número de leucocitos. Después puede realizarse opcionalmente el aislamiento de células NK, o puede usarse una preparación que contenga leucocitos, por ejemplo, PBMC u otra fracción celular que contenga leucocitos.
Las células NK se expanden después en presencia de la molécula HLA-E u otro estimulador de NKG2C, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (mAb), contra NKG2C. Como se describe con más detalle más abajo, aunque se prefiere usar HLA-E, el ligando natural para el receptor NKG2C, se pueden usar otros estimuladores, es decir, cualquier estimulador del receptor NKG2C o NKG2A. Como se describe además con más detalle más abajo, el ligando HLA-E se usa o se proporciona (se presenta a las células) en una forma en la que se reconoce y puede unirse a los receptores NKG2C y NKG2A de la superficie celular. La proliferación que sigue a la estimulación a través de NKG2C conduce a la acumulación preferencial de células NK que expresan KIR autoespecíficos. No hay otra forma de enriquecer una población KIR determinada de manera tan eficiente.
Estas células enriquecidas pueden luego transferirse a un paciente. La transferencia de células NK a través de barreras HLA desencadena la alorreactividad y permite la muerte del tumor. La transferencia de las células a pacientes con HLA compatible donde las células diana carecen de la molécula de HLA de clase I relevante produce un alto grado de especificidad, ya que todas las demás células "normales" están a salvo.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para obtener selectivamente células NK NKG2A' NKG2C+ diferenciadas citolíticas (comúnmente denominadas de tipo memoria) con una especificidad KIR dada. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprende tales células NK NKG2A' NKG2C+ diferenciadas citolíticas con una especificidad KIR dada.
Otro objeto de la presente invención es utilizar las células NK NKG2A'NKG2C+ diferenciadas citolíticas con una especificidad KIR dada para la terapia.
Otro objetivo es modificar genéticamente las células NK NKG2A'NKG2C+ diferenciadas citolíticas con una especificidad KIR dada para expresar receptores quiméricos, receptores de quimiocinas, para el reconocimiento optimizado de los tipos celulares deseados en distintas configuraciones clínicas que incluyen cáncer, enfermedades infecciosas, inmunodeficiencias y autoinmunidad.
Otro objeto es combinar células NK NKG2A'NKG2C+ diferenciadas citolíticas con una especificidad de KIR dada y anticuerpos específicos de tumor para lograr una mejor ADCC en los entornos clínicos mencionados anteriormente. Otro objeto es combinar células NK NKG2A'NKG2C+ diferenciadas citolíticas con estrategias de ingeniería genética, que incluye transferencia de receptores de antígenos quiméricos, receptores de células T mediante electroporación de ARNm, vectores lentivirales, vectores retrovirales, tecnologías de transposones.
Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán obvios para el lector y se pretende que estos objetos y ventajas estén dentro del alcance de la presente invención.
Para abordar estos diversos objetos, la presente invención en un primer aspecto proporciona un método in vitro para expandir células NK naturales de una especificidad KIR dada adecuado para transferir a un paciente para la terapia de dicho paciente, dicho método comprende:
(a) seleccionar un donante que tenga células NK educadas de dicha especificidad KIR dada y que expresen KIR específico para moléculas de HLA de clase I propias, dicha especificidad KIR dada que se selecciona con respecto al tipo de HLA de clase I del paciente, y opcionalmente con respecto a la condición a ser tratada; (b) proporcionar células leucocitarias de dicho donante, en donde dichos leucocitos comprenden células NK; (c) poner en contacto dichas células NK del donante con un estimulador de uno o ambos receptores emparejados CD94/NKG2C y CD94/NKG2A; y
(d) expandir selectivamente células NK que tienen dicha especificidad KIR, células que son positivas para NKG2C y negativas para NKG2A, para producir una población de células que comprenden dichas células NK expandidas.
Otros aspectos de la invención incluyen una población celular que puede obtenerse mediante dicho método, una composición farmacéutica que comprende dicha población celular y el uso de dicha población celular en terapia, más particularmente para la transferencia a un paciente para tratar una afección que responde a la terapia con células NK citolíticas.
El nuevo método de expansión de la presente invención puede tener además usos fuera del ámbito terapéutico/médico (es decir, usos no médicos) y, por ejemplo, puede usarse para generar células NK para investigación o para investigar reacciones inmunitarias que involucran células NK, etc. En este caso, puede que no sea necesario generar células NK con referencia a un paciente particular como tal (es decir, "ajustadas" a un paciente o receptor celular previsto), pero no obstante, puede seleccionarse una especificidad de KIR determinada o deseada.
Por consiguiente, en su forma más amplia, puede verse que la invención proporciona un método in vitro para expandir células asesinas naturales (NK) de una especificidad KIR dada, dicho método comprende:
(a) seleccionar un donante que tenga células NK educadas de dicha especificidad KIR dada, en donde las células NK educadas expresan KIR específico para moléculas de clase I de HLA propias;
(b) proporcionar células leucocitarias de dicho donante, en donde dichos leucocitos comprenden células NK; (c) poner en contacto dichas células NK del donante con un estimulador de uno o ambos receptores emparejados CD94/NKG2C y CD94/NKG2A; y
(d) expandir selectivamente células NK en que tienen dicha especificidad KIR, células que son positivas para NKG2C y negativas para NKG2A, para producir una población de células que comprenden dichas células NK expandidas.
Como se señaló anteriormente, el método de la invención implica generar células NK citolíticas de una especificidad de KIR dada, cuya especificidad está determinada por el donante. Por lo tanto, la especificidad de KIR es una especificidad seleccionada, deseada, definida o predeterminada, y el donante se elige teniendo esto en cuenta, teniendo en cuenta el tipo de HLA de clase I del paciente (el receptor previsto de las células NK expandidas). Por lo tanto, para asegurar que las células NK obtenidas sean reactivas (citolíticamente activas contra) las células diana en el paciente, en muchos casos se selecciona al donante para que tenga una incompatibilidad con e1HLA de clase I en uno o más grupos de alelos de HLA de clase I, más particularmente en uno o más alelos HLA de clase I relevantes para el KIR de las células del donante. En otras palabras, el donante no es compatible en uno o más alelos correspondientes con los alelos HLA de clase I que se unen al KIR inhibidor expresados en las células NK del donante. Sin embargo, como se indicó anteriormente, en algunas situaciones una compatibilidad puede ser aceptable (es decir, el donante puede ser compatible con el paciente en HLA de clase I), donde las células diana no expresan o solo expresan cantidades bajas o mínimas (despreciables o insignificantes) de moléculas de HLA de clase I.
Se entenderá como "células diana" las células en el paciente a las que se desea dirigir las células NK, por ejemplo, células que se eliminarán o abrogarán, por ejemplo, células cancerosas o tumorales, o células infectadas o células inmunitarias indeseables. Por supuesto, la célula diana dependerá de la afección a tratar.
Como se describe y explica más adelante, las células NK que se expanden selectivamente son células NK educadas, es decir, células NK que expresan KIR autoespecífico, es decir, KIR específico para moléculas propias de HLA de clase I ("propias" con respecto al donante). Por lo tanto, se entenderá que los leucocitos del donante comprenden al menos algunas células NK que se educan, y son estas células NK educadas las que se expanden selectivamente para producir una población de células que comprenden células NK educadas citolíticas de una especificidad KIR dada (es decir, deseada) que son NKG2C+NKG2A-. Dichas células serán altamente específicas contra células diana no compatibles con HLA, o células diana que carecen de HLA de clase I. Pueden seleccionarse donantes que tengan una mayor proporción de células NK educadas, o células NK aumentadas de una especificidad KIR deseada, en base, por ejemplo, a su historia clínica pasada, por ejemplo, como se detalla más abajo, los donantes expuestos a CMV demuestran niveles aumentados de células NK que expresan moléculas propias de HLA de clase I.
La expansión selectiva de las células NK NKG2C+NKG2A- de la especificidad KIR dada deseada significa que la población celular resultante obtenida por el método comprende una cantidad o proporción aumentada del tipo de células NK citolíticas deseado. En otras palabras, la proporción o cantidad de las células NK NKG2C+NKG2A-deseadas de la especificidad de KIR dada se incrementa selectivamente. La población celular resultante se enriquece así en tales células. Por lo tanto, se entenderá que "expandir selectivamente" significa enriquecer la población celular en las células deseadas, como se especificó anteriormente. Por tanto, la población celular puede comprender predominantemente células NK NKG2C+NKG2A- de la especificidad KIR determinada seleccionada. Dicha población de células enriquecidas puede comprender, por ejemplo, al menos 50, 60, 70, 80 o 90 % de las células NK NKG2C+NKG2A- como porcentaje del total de células en la población celular (es decir, del total de células en el producto celular resultante).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Caracterización de repertorios KIR de células NK humanas. (A) Panel de citometría de flujo de 14 colores para la evaluación de la expresión de KIR2DL1, KIR2DL2/S2, KIR2DL3, KIR3DL1/S1, KIR2DS4, KIR3DL2 en subconjuntos de células NK CD56dim que expresan NKG2A, NKG2C y/o CD57. Se muestran ejemplos representativos de tinciones en donantes de haplotipo A homocigotos y de haplotipo B/X de KIR. (B)
Frecuencia de células NK CD56dim que expresan los 7 KIR analizados y las 128 combinaciones posibles de los mismos en 199 donantes sanos. La presencia de un KIR en una combinación se representa mediante un código de color debajo del gráfico: 2DL1 (azul oscuro), 2DL2/S2 (violeta), 2DL3 (rojo), 2DS1 (azul claro), 2DS4 (naranja), 3DL1 (verde), 3DL2 (negro). Los puntos rojos representan valores atípicos estadísticos definidos por el criterio de Chauvenet.
Figura 2. Disección del origen de los subconjuntos KIR expandidos. (A) Estratificación de la cohorte en individuos CMV-seronegativos (arriba, n=48) y CMV-seropositivos (abajo, n=151). Los puntos rojos representan valores atípicos estadísticos como se define en la Figura 1B. (B) Frecuencia de donantes con uno o más valores atípicos. Estratificación basada en serología para CMV.
Figura 3. Influencia de moléculas análogas (auto) de HLA de clase I en la expresión de KIR en las células expandidas. (A) gráfico representativo de la expresión de KIR2DL1 y KIR2DL3 en subconjuntos de células NK n Kg 2C'NKG2A' (fila superior) y NKG2C+NKg 2a _ (fila inferior) CD56dim Se muestran tres donantes (donantes seropositivos para Hc Mv ) con diferentes genotipos de HLA: C1/C1 (izquierda), C1/C2 (centro) y C2/C2 (derecha). La codificación de colores ilustra KIR y sus ligandos de HLA afines. (B) Se muestran dos ejemplos extremos de repertorios KIR en donantes homocigotos para C1/C1 y C2/C2 con sesgo hacia la expresión de KIR2DL3 y KIR2DL1, respectivamente superpuestos en los 48 repertorios aleatorios en individuos seronegativos al HCMV (n=48). (C) El efecto agregado de HLA de clase I (barras blancas C1/C1, barras gris claro C1/C2 y barras gris oscuro C2/C2) en la expresión de KIR en todos los donantes se examinó mediante trazado de las frecuencias de KIR2DL1 (arriba) y KIR2DL3 (abajo) en distintos subconjuntos de células NK: NKG2A+ (izquierda), NKG2C'NKG2A' (centro) y NKG2C+n Kg 2A' (derecha). Los donantes se estratificaron según la serología del HCMV y los antecedentes de HLA. (D) El efecto de1HLA de clase I sobre la expresión de KIR en individuos con y sin evidencia de expansión de células NK. (E) Células NK marcadas con CFSE y cultivadas durante 7 a 14 días con 20 ng/ml de IL-15 sola o junto con células HLA-E 721.221 wt o 721.221 irradiadas. El día 7 o 14 se evaluó la expresión de KIR y NKG2/C en las células.
Figura 4. Especificidad de las células expandidas. Se expusieron células NK expandidas por el método descrito en la presente descripción de un donante homocigoto HLA-C1 a células 721.221 transfectadas con HLA-C1 (C1 ) o HLA-C2 (C2 ). La desgranulación se controló como expresión superficial de CD107a.
Figura 5. Una huella fenotípica y funcional diferenciada distingue las expansiones dentro del compartimento de células NK NKG2C-. (A) Tinción representativa de las moléculas de superficie indicadas en expansiones de células NK en los subconjuntos de células NK NKG2C+. (B-C) Tinción representativa de la expresión de CD107a en el subconjunto indicado después de dos horas de estimulación con RAJI y rituximab. En B-C todas las comparaciones se realizaron con el subconjunto de células NK KIR+ relevante.
Figura 6 Alto potencial citolítico de células NK expandidas de acuerdo con la presente invención. Las células NK de donantes homocigotos HLA-C 1 o HLA-C2 se expandieron como se describe en esta invención y después se estimularon con células de tipo silvestre HLA de clase I negativas 721.221 (221.wt), la línea celular de linfoma de células B Raji en presencia o ausencia del ant-CD20mAb Rituximab (ritux). La desgranulación se controló como expresión superficial de CD107a.
Figura 7. Reconocimiento específico de blastos leucémicos no compatibles con HLA. Se estimularon células NK expandidas de acuerdo con la presente invención de un donante HLA-C1/C1 con células blásticas leucémicas de dos pacientes con distintos tipos de HLA. La desgranulación de células NK se controló mediante la expresión superficial de CD107a.
Figura 8. Expansión selectiva y controlada de células NK educadas. Las células NK se aislaron y cocultivaron con células 721.221 irradiadas transfectadas con HLA-E y la secuencia líder de HLA-A (221.AEH) en IL-15 durante 14 días. Los gráficos representativos de FACS que muestran el repertorio KIR en células NK de (A) un donante C1/C1 y (B) un donante C2/C2 en el día 0 y el día 14. (B) Resumen de la expansión (panel izquierdo) y sesgo (panel medio y derecho) en experimentos de cocultivo de células NK/221.AEH de donantes seropositivos para HCMV (n=14).
Figura 9. Especificidad y eficacia de las células NK expandidas. La muerte mediada por células NK se evaluó en un ensayo basado en citometría de flujo mediante el seguimiento de la actividad de la caspasa-3 y la tinción de un marcador de células vivas/muertas (DCM) en blastos de PHA después de la coincubación con células NK en una relación E:T de 5:1 durante 4 horas. (A) Gráficos representativos que muestran la muerte de blastos de PHA en configuraciones compatibles y no compatibles de HLA-C. (B) Eliminación de blastos de PHA no compatibles por células NK expandidas Día 14) en comparación con células NK estimuladas con IL-15 durante la noche (Día 0).
Figura 10. Las células NK expandidas selectivamente lisan eficazmente los blastos primarios de niños con leucemia linfoblastoide aguda. Las células NK expandidas se probaron contra los blastos primarios de ALL de 24 niños en un ensayo de destrucción basado en FACS en una relación E:T de 5:1 durante 4 horas. (A) Gráficos
representativos de FACS que muestran la estrategia de activación para detectar blastos de ALL primarios después del cocultivo con células NK. Las células NK se tiñeron con violeta CellTrace y se excluyeron del análisis. Los marcadores para identificar los blastos de ALL se determinaron de acuerdo con el fenotipo de enfermedad residual mínima (panel NOPHO) en el momento del diagnóstico. (B) Gráficos representativos que ilustran la muerte de subtipos de blastos de ALL. (C) Resumen que muestra la muerte de los blastos de ALL primarios con el genotipo HLA-C indicado por células NK expandidas que expresan KIR2DL1.
Figura 11. Reconocimiento de las neoplasias mieloides de alto riesgo. A) muestra un ejemplo de destrucción específica de blastos CD34+ de pacientes con síndrome mielodisplásico (MDS) (izquierda) y leucemia mieloide aguda (AML). (B) Eliminación específica de AML compatible y no compatible (n=2, un paciente era C1/C1 y uno C2/C2) y blastos MDS (n=3, todos C1/C1).
Figura 12. Reconocimiento del melanoma maligno. Muestra los resultados de un ensayo de liberación de Cr51 estándar contra una variedad de líneas de células de melanoma obtenidas de ATCC.
Figura 13. Reconocimiento selectivo de dianas HLA-C2/C2 por células NK KIR2DL3+KIR2DS1+. A) muestra un ejemplo de destrucción y especificidad de células blásticas de ALL primarias por células NK que expresan KIR2DL3 y KIR2DS1. B) muestra células NK expandidas que se probaron frente a un panel de dianas primarias de ALL con el genotipo HLA-C indicado.
Descripción detallada de la invención y modalidades preferidas de la misma
Los donantes no compatibles KIR/HLA para el tratamiento del cáncer se han discutido previamente en el contexto de HSCT alogénico o la terapia con células NK adoptivas, donde el paciente, en la mayoría de los casos, después de la expansión in vivo de las células NK, obtiene patrones de expresión de KIR similares a los del donante y esto no es hasta aproximadamente 6 semanas después del trasplante/terapia celular. Durante dicha expansión in vivo, no es posible expandir selectivamente las células NK de una manera controlada como proponen hacer los inventores de la presente invención antes de administrar las células NK al paciente. Una expansión in vivo no es una expansión controlada en la que es posible elegir selectivamente las células NK más apropiadas para el mejor tratamiento. Se han usado células NK expandidas in vitro para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, sin embargo, estas células no se expandieron en presencia de células alimentadoras que expresan h LA-E y, en consecuencia, dichas células expandidas serán NKG2A+. Debido a la presencia del receptor inhibidor NKG2A, tales células no serán tan eficaces y potentes como las células NK que se presentan en la presente descripción para matar tumores.
El documento WO 99/28748 describe el uso de HLA-E para detectar, separar y reconocer toxinas con células CD94/NKG2+. Se cree que las células NK tienen una actividad de células antitumorales y, según los inventores, puede proporcionarse un marcador para el progreso de la terapia, o un pronóstico simple, mediante control del número de células NK y opcionalmente su estado de activación. La invención descrita en el documento WO 99/28748 proporciona métodos para seleccionar células NK que se unen a HLA-E de una población de células mixtas. Las células seleccionadas pueden expandirse in vitro y devolverse al paciente. Dicho tratamiento puede ser eficaz en algunas infecciones graves o cáncer donde una deficiencia en el crecimiento de estas células se asocia con un mal pronóstico. Igarashi y otros, Enhanced cytotoxicity allogeneic NK cells with killer immunoglobulin-like receptor ligand incompatibility against melanoma and renal cell carcinoma cells; Blood 2004 104: 170-177 y el documento WO 2006/050270 describen los efectos de poblaciones de células NK no compatibles con ligando KIR contra tumores sólidos. Estas publicaciones describen además poblaciones de células NK enriquecidas clonadas de la sangre de pacientes con cáncer o donantes sanos homocigotos para los alelos HLA-C en el grupo 1 o grupo 2. La estrategia propuesta en Igarashi y otros, implica la expansión de células NK en células alimentadoras que expresan determinadas moléculas de HLA de clase I.
Siegler y otros Good manufacturing practice-compliant cell sorting and large-scale expansion of single KIR-positive alloreactive human natural killer cells for multiple infusions to leukemia patients Cytotherapy 2010 12: 750-763 expanden las células NK alorreactivas de un solo KIR.
Sin embargo, la estrategia enseñada por Igarashi y otros y Siegler y otros difieren de la invención actual ya que su estrategia generará células que expresan NKG2A y no considera el estado de educación del donante.
HLA-E es un ligando para la activación del receptor de células NK NKG2C, así como para el receptor inhibidor de células NK NKG2A. Se ha sugerido previamente que la interacción HLA-E con NKG2C podría contribuir a impulsar la proliferación de células NKG2C+ en pacientes infectados por CMV. Sin embargo, HLA-E no se ha utilizado previamente para la expansión selectiva controlada in vitro de células NK con una especificidad de KIR determinada.
La unión de HLA-E se ha usado anteriormente para detectar células NKG2+, sin embargo, esto no ha sido selectivo para diferentes tipos de células NKG2. En el documento WO 99/28748 HLA-E se usa en el diagnóstico del cáncer al contar el número de células NK, pero no le da al lector ninguna pista sobre cómo usar HLA-E para la expansión
selectiva de las células NK. En el documento WO 99/28748 tienen una población mixta de NKG2C y NKG2A, que no es aplicable en esta invención donde es importante obtener células NK NKG2A-NKG2C+. NKG2C actúa como un receptor de activación y, por lo tanto, es conveniente con células NK positivas a NKG2C en el presente método, ya que esto promoverá la muerte de las células tumorales. Sin embargo, NKG2A es un receptor inhibidor y los inventores de la presente invención describen una estrategia sobre cómo seleccionar células negativas para NKG2A. Si tanto NKG2A como NKG2C están presentes en las células NK, NKG2A y el efecto inhibidor dominarán. Por lo tanto, es importante seleccionar únicamente células NK que sean positivas para NKG2C y negativas para NKG2A. Esta es solo una pequeña subpoblación de las células NK y los inventores describen una estrategia novedosa e inventiva para seleccionar estas células específicas y enriquecerlas en números elevados.
Hasta ahora nadie ha pensado en seleccionar este determinado subconjunto de células NK para este tipo de terapia, anteriormente se han buscado donantes con una gran población de células NK con incompatibilidad con KIR. El método inventado abre una forma de generar dichas células a partir de cualquier donante y generará una expansión más controlada de potentes células NK para la terapia.
Los inventores de la presente invención han revelado que la educación de células NK promueve la supervivencia y expansión de las células NK NKG2C+ in vitro. Esto es contrario a los hallazgos anteriores presentados por Lopéz-Vargas y otros quienes alegan que tal expansión sería impulsada por células NK sin educación menos restringidas (que carecen de receptores inhibidores para sí mismos).
La presente invención presenta una nueva forma de expandir selectivamente células NK altamente citolíticas de una especificidad de KIR dada. Esta expansión está personalizada para adaptarse al tipo de HLA de clase I del paciente, lo que promueve así la alorreactividad mediada por células NK. Se expanden células citolíticas NK que son reactivas con las células diana en el paciente que se va a tratar. El método para expandir las células NK que se presenta en la presente descripción es nuevo y se basa en el descubrimiento de que la educación mediante KIR inhibidores autoespecíficos promueve la supervivencia y expansión de las células NK estimuladas a través de NKG2C. La invención es en parte contraria a las expectativas lógicas ya que 1) hay datos contradictorios sobre la expresión de KIR en células NK NKG2C+ y 2) implica la estimulación de células NK totales que contienen una mezcla de células NK NKG2A+ y NKG2C+ donde se sabe que la interacción inhibidora domina cuando la estimulación ocurre en la misma célula. En escenarios donde la expresión de HLA-E está ausente o es baja, los protocolos de expansión in vitro producen altas frecuencias de células NK NKG2A. Por tanto, la presencia de HLA-E en el cultivo tiene dos propósitos al mismo tiempo: 1) estimula la expansión de células NKG2C+ NK que expresan los KIR autoespecíficos y 2) inhibe la expansión de células NK NKG2A+ con un repertorio más amplio de los KIR.
Esta forma completamente nueva de expandir las células NK con una especificidad determinada permite una destrucción de células tumorales más específica y potente. Las células NK de la presente invención pueden usarse eficazmente en terapia, que incluye pero no se limita a la terapia contra el cáncer, que incluye, pero no se limita a, neoplasias linfoides refractarias tales como linfoma maligno, leucemia linfoide aguda de adultos y niños, ya que se seleccionan para tener cierta especificidad de KIR y al mismo tiempo se seleccionan para ser NKG2a negativos y, por lo tanto, serán asesinas muy potentes de tumores. Además, el uso de estas células NK expandidas en el tratamiento podría llenar un vacío para los pacientes que son refractarios a la quimioterapia convencional o en aquellos con indicación para un trasplante alogénico de células madre pero que carecen de un donante de células madre o que amenazan con una recaída después del trasplante de sangre del cordón umbilical cuando no hay linfocitos del donante, están disponibles para infusión de linfocitos de donantes. Otra aplicación importante de las células es en el entorno de apareamientos de ligandos de KIR (incluidos los autólogos y totalmente compatibles con HLA) cuando el alcance es orientarse a células que tienen niveles bajos o ausentes de la molécula de HLA de clase I relevante (reconocida por la expansión selectiva de KIR+). Ejemplos de tales situaciones incluyen, pero no se limitan a, melanoma metastásico y neuroblastoma.
CMV sesga los repertorios de KIR humanos
Los inventores de la presente invención han determinado patrones de expresión en células NK en una cohorte de 204 donantes sanos mediante citometría de flujo de 14 colores (Figura 1A). Se realizó un análisis exploratorio imparcial de las frecuencias de expresión de los tamaños relativos de las 128 combinaciones posibles de los siete KIR analizados (Figura 1B). Entre las 25 472 frecuencias de expresión de KIR en los 204 donantes, los inventores identificaron 71 valores atípicos estadísticos (en 60 donantes) de una distribución gaussiana, según lo determinado por el criterio de Chauvenet (Figura 1B, puntos rojos). La expresión de KIR en la superficie celular de las células NK es estocástica y la coexpresión de, por ejemplo, dos KIR puede calcularse a partir de sus frecuencias individuales de acuerdo con la regla del producto, al asumir la asociación aleatoria de dos eventos independientes. Sin embargo, la expresión de KIR de los valores atípicos se desvió significativamente de la regla del producto, lo que sugiere que tales subconjuntos representaban células que habían sufrido una expansión "similar a clonal" in vivo (Figura 1C).
Debido a que se sabe que el CMV causa cambios dinámicos en el compartimento de las células NK tanto en ratones como en seres humanos, los inventores estratificaron la presente cohorte en base a la seropositividad para CMV (Figura 2A). Sorprendentemente, los valores atípicos que representan expansiones de subconjuntos específicos se
encontraron casi exclusivamente en individuos seropositivos para CMV (Figura 2A y B). Solo dos de los 48 donantes seronegativos para CMV mostraron valores atípicos.
Estos resultados revelan el potencial del fenotipado KIR de alta resolución para rastrear la adaptación de las células NK a la infección viral. Curiosamente, en individuos sanos, la aparición de expansión de células NK se correlacionó fuertemente con una infección anterior por CMV.
El CMV induce la expansión de las células NK que expresan KIR autoespecífico
Debido a que la mayoría de los subconjuntos expandidos expresaron al menos un KIR inhibidor de la unión de HLA-C, específicamente, KIR2DL1, KIR2DL2/S2 o KIR2DL3 (Figura 1B), los inventores a continuación examinaron si había alguna influencia de las moléculas de HLA de clase I análogas (auto) en la expresión de KIR en las células expandidas. De hecho, las células NK NKG2C+NKG2A- expandidas en donantes seropositivos para CMV mostraron una expresión casi clonal de KIR específica para moléculas de HLA de clase I propias (en lo sucesivo, KIR autoespecíficos) (Figura 3A). Sorprendentemente, en algunos donantes, tales "clones" representaron más de 60 % del compartimento completo de células NK CD56dim (Figura 3B). Para analizar el impacto global de tales expansiones de células NK en el repertorio KIR, los donantes se estratificaron en función de la serología de HCMV además de sus fondos de HLA. Los individuos seropositivos para CMV mostraron un sesgo sorprendente para KIR autoespecíficos que fue más pronunciado en el subconjunto de células NK NKG2C+NKG2A-(Figura 3C). Por lo tanto, los donantes de HLA-C1/C1 tenían altas frecuencias de células NK que expresaban KIR2DL3 como su único KIR inhibidor, mientras que los donantes de HLA-C2/C2+ tenían altas frecuencias de células NK que expresaban KIR2DL1 como su único KIR inhibidor. Por el contrario, los donantes seronegativos para CMV exhibieron patrones de expresión de KIR esencialmente aleatorios sin evidencia de desviación del repertorio independientemente del subconjunto de células NK que se analizó (Figura 3C). Además, independientemente del estado serológico del CMV, no hubo sesgo para la expresión de KIR autoespecíficos en el compartimento de células NK más inmaduras NKG2A+ CD56dim (Figura 3C, paneles de la izquierda).
La educación de las células NK es esencial para la expansión de las células NK NKG2C+in vitro
Para delinear la contribución de la expansión de las células NK al sesgo de los repertorios de KIR, los inventores estratificaron los donantes seropositivos para HCMV en aquellos con y sin evidencia de expansión de células NK. Este análisis reveló que el sesgo para la expresión de KIR autoespecíficos fue más pronunciado en donantes con expansión de células NK, debido a un efecto de la expansión de células NK en el sesgo del repertorio de KIR observado asociado con HCMV (Figura 3D).
Se sabe desde antes que la educación de células NK a través de KIR autoespecíficos sintoniza la respuesta de las células NK a las células diana, que incluyen la citólisis y la producción de citocinas. Por el contrario, estudios previos sugieren que la educación de las células NK no influye en la respuesta de las células NK a las citocinas, medida por la proliferación o la producción de citocinas. Sin embargo, los inventores hicieron la sorprendente observación de que la mayoría de las células NK que proliferaron extensamente en respuesta a células 721.221 transfectadas con HLA-E (221.AEH) en IL-15 expresaron NKG2C en combinación con un KIR autoespecífico (Figura 3E). Por el contrario, no se observó tal expansión polarizada de células NK después de la estimulación con células 721.221 de tipo silvestre (221.wt). Por tanto, los datos demuestran que la educación mediada por KIR está promoviendo la expansión de las células NK estimuladas a través de NKG2C.
Estos resultados muestran que la expresión de KIR autoespecíficos es un requisito necesario para la expansión eficaz de las células NK NKG2C+ in vitro.
La presente invención permite generar rápidamente células NK con una especificidad dada in vitro. Estas células pueden usarse para terapia basada en células NK guiada por el HLA de clase I del paciente.
En la presente invención, las células NK se expanden selectivamente in vitro para ganar células NK de una especificidad de KIR dada. Esta expansión in vitro, así como el uso de estas células NK específicas en terapia, son novedosas.
El donante se selecciona en función de su estado de ligando KIR. Por tanto, el donante se selecciona para que tenga células NK de una especificidad KIR deseada o seleccionada. En particular, el donante se selecciona para tener células NK que expresan KIR (específicamente KIR inhibidor) que responden a (es decir, que se unen) ligandos (moléculas del HLA de clase I) que son diferentes a los ligandos (moléculas de1HLA de clase I) proporcionados por las células diana en el paciente a tratar. Por tanto, existe una incompatibilidad al menos parcial en e1HLA de clase I entre las células NK del donante y las células diana en el paciente. Generalmente, esto significa que hay una falta de compatibilidad entre el HLA de clase I del donante y del paciente. Sin embargo, como se indicó anteriormente, puede obtenerse además una situación en la que los ligandos KIR para las células NK no son compatibles con e1HLA de clase I de las células diana cuando las células diana no expresan moléculas de HLA de clase I. Por consiguiente, en una modalidad, el donante se elige para ser incompatible con el receptor. En otras modalidades, el donante puede ser compatible con el receptor. Los principales ligandos de KIR son HLA-C1 (ligando para KIR2DL2/3), HLA-C2 (ligando para KIR2DL1), HLA-Bw4 (ligando para KIR3DL1) y HLA-A3/A11 (ligando para KIR3DL2). En la Tabla 1 se presenta
una lista no limitante de incompatibilidades adecuadas. Por consiguiente, en algunas modalidades, el donante puede tener al menos parcialmente incompatibilidades con el paciente en uno o más grupos de alelos de1HLA de clase I, particularmente en alelos HLA-C o alelos HLA-B. Como descubrieron los inventores de la presente invención, es esencial tener células NK educadas y esto debe tenerse en cuenta al seleccionar un donante, por lo que no se consideran donantes HLA-A3/A11, ya que las células NK KIR3DL2 no están educadas y, por lo tanto, no conducirán una expansión como se describe en la presente invención y por lo tanto no puede usarse de acuerdo con la presente invención. Esto no excluye que KIR3DL2 se coexprese en las células expandidas o contribuya a la expansión de formas aún no reveladas. Muy a menudo, el protocolo implica la selección de donantes que son homocigotos para HLA-C1 o HLA-C2. Sin embargo, es posible además generar células a partir de donantes HLA-C1/C2.
Tabla 1. Incompatibilidades de acuerdo con la presente invención
Una vez que se selecciona un donante, se obtienen leucocitos como se conoce en la técnica. Si se desea, cuando se obtienen los leucocitos, el aislamiento de células NK se realiza como se conoce en la técnica. Por ejemplo, Miltenyi dispone de un sistema para separar células NK. Las células también pueden expandirse directamente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas como se conoce en el estado de la técnica. En tales aplicaciones, el aislamiento de células NK puede realizarse al final de los cultivos como se conoce en la técnica. Por tanto, en general, el método implica separar o aislar leucocitos del donante y, opcionalmente, aislar las células NK de los mismos. El método puede realizarse en células NK aisladas o en una fracción o preparación de células leucocitarias que contiene células NK. La separación de células NK es estándar y bien conocida en la técnica y puede realizarse mediante selección negativa y/o positiva de células NK, por ejemplo, mediante el uso de marcadores celulares para células NK y/o agotamiento de otros tipos de células (no NK) de la población celular. Alternativamente, si las células NK no se aíslan para llevar a cabo el método de expansión, pueden aislarse o enriquecerse después de la etapa de expansión. Por ejemplo, las células NK pueden aislarse de la población de células expandidas mediante el uso de técnicas estándar como se discutió anteriormente. Alternativamente, las células T y/o B pueden agotarse de la población celular expandida, nuevamente mediante el uso de técnicas estándar fácilmente disponibles en la técnica. En términos generales, será necesario el aislamiento o el enriquecimiento de las células NK cuando las células del donante no son compatibles con el HLA de clase I del paciente (es decir, cuando haya una incompatibilidad al menos parcial con el HLA de clase I entre el donante y el receptor).
La etapa de expansión (etapa (c)) implica poner en contacto las células con el estimulador NKG2C y/o NKG2A. Se entenderá que esta etapa implica por tanto poner en contacto (o incubar) las células en condiciones que promuevan o permitan la expansión celular. Tales condiciones (es decir, las condiciones requeridas para la expansión de las células NK) son bien conocidas en la técnica y esencialmente la invención radica en usar y modificar tales condiciones del estado de la técnica, lo que proporciona un estimulador de los receptores NKG2C y NKG2A apareados, para sesgar la expansión hacia células NKG2C+NKG2- educadas de especificidad KIR dada. Como es bien conocido en la técnica, pueden proporcionarse señales adicionales para la expansión de células NK a través de una multitud de receptores, que incluyen, pero sin limitarse a, NKG2D, NKp46, CD2, 2B4, DNAM-1 y CD137, o una combinación de los mismos. Los estímulos para tales receptores pueden proporcionarse por células alimentadoras apropiadas o por complejos de moléculas estimulantes o ligandos del receptor, por ejemplo, en perlas. Como se indicó anteriormente, las técnicas para esto están bien establecidas.
Se cultivan leucocitos (por ejemplo, PBMC) o células NK aisladas con el estimulador NKG2C y/o NKG2A en las condiciones apropiadas, como se mencionó anteriormente. Pueden añadirse adicionalmente citocinas, que incluyen, pero sin limitarse a, IL-5, IL-15, IL-12, IL-18, IL-2, IL-7, IL-21 o IFN-alfa o una combinación con uno o más de estas citocinas. Estas citocinas u otros agentes pueden usarse para estimular la proliferación y/o promover la apoptosis. En algunas modalidades, las células se cultivan con IL-15.
Las células NK se expanden en presencia del estimulador mediante cualquier procedimiento técnico adecuado. El estimulador de NKG2C y/o NKG2A puede ser cualquier ligando, natural o sintético, que pueda unirse y estimular uno o ambos de estos receptores o sus monómeros constituyentes. En otras palabras, el estimulador es un agonista de los receptores NKG2C y/o NKG2A. Por tanto, el estimulador puede ser un ligando o agonista para CD94, o para NKG2C y/o NKG2. Como se indicó anteriormente, el estimulador es preferentemente el ligando natura1HLA-E. Como se señaló anteriormente, el HLA-E debe proporcionarse en una forma en la que sea capaz de estimular las células y, de nuevo, esto se comprende bien en la técnica. Por tanto, el HLA-E puede proporcionarse en complejo con péptidos de secuencia líder. Por ejemplo, los péptidos de secuencia líder pueden derivarse de moléculas HLA-A, HLA-B, HLAC o HLA-G. Se conoce en la técnica cómo insertar una secuencia que codifica el péptido líder en construcciones genéticas que expresan HLA-E de modo que el HLA-E se exprese en una forma de complejo capaz de unirse y estimular los receptores NKG2C/NKG2A. Las líneas celulares que expresan tales construcciones son conocidas y están disponibles, por ejemplo, la línea celular 221AEH usada en los Ejemplos más abajo. Dichas líneas celulares pueden usarse como células alimentadoras para proporcionar HLA-E a las células NK del donante.
En otras modalidades, pueden usarse multímeros de HLA-E, por ejemplo, tetrámeros o pentámeros, junto con cualquier péptido relevante que proporcione una señal a CD94/NKG2A y/o CD94/NKG2C. Dichos multímeros pueden recubrirse sobre un soporte sólido apropiado, por ejemplo, perlas o soportes o recipientes de plástico, por ejemplo, placas o bolsas, para proporcionar los efectos de estimulación/inhibición combinados deseados, como se describió anteriormente.
En otras modalidades más, el estimulador puede ser un anticuerpo que se une a uno o más de CD94, NKG2C o NKG2A. Se entenderá que será un anticuerpo agonista, es decir, un anticuerpo que es capaz de estimular el receptor. Pueden usarse combinaciones de tales anticuerpos, por ejemplo, puede usarse un anticuerpo que se une a NKG2C junto con un anticuerpo que se une a NKG2A. Preferentemente, el anticuerpo es anti-NKG2C o anti-NKG2C junto con anti-NKG2A.
Por lo tanto, la etapa de expandir las células NK puede lograrse mediante métodos que incluyen, pero sin limitarse a, a) el uso de una línea de células alimentadoras diseñada por diferentes medios para expresar HLA-E (que incluye, entre otros, 721.221.HLA-E o K562-HLA-E, o variantes de estas líneas celulares modificadas para expresar (o sobreexpresar) agonistas que estimulan, por ejemplo, receptores de IL-15 y/o IL-21, o ligandos para activar receptores tales como PVR, CD48 o ICAM-1) o b) placas o bolsas recubiertas con complejos HLA-E solubles o en combinación con complejos receptores de citocinas o c) placas o bolsas recubiertas con mAb anti-NKG2C y/o mAb anti-CD94 y/o anti-NKG2C y/o anti-NKG2A o d) perlas recubiertas con complejos HLA-E solubles y/o mAb anti-CD94 y/o anti-NKG2C y/o anti-NKG2A. La construcción HLA-E usada en las modalidades descritas en a-b usa la molécula genérica o una construcción modificada con estabilidad mejorada y/o unión a las moléculas CD94/NKG2A/C en base a cambios en los péptidos de la secuencia líder. Estos incluyen, pero no se limitan a, moléculas de HLA acopladas al líder HLA-A y HLA-G y modificaciones peptídicas de las mismas. Los leucocitos (PBMC) o las células NK aisladas pueden cultivarse en condiciones conocidas en la técnica y como se describe en la presente descripción.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier tipo de anticuerpo, o cualquier fragmento o derivado de anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede tener una sola especificidad. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, clase o subtipo conveniente o deseado. Además, el anticuerpo puede ser natural, derivatizado o sintético. El término anticuerpo, como se usa en la presente descripción, incluye por tanto todos los tipos de moléculas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.
Más particularmente, el "anticuerpo" puede ser:
(a) cualquiera de las diversas clases o subclases de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgD o IgE derivadas de cualquier animal, por ejemplo, cualquiera de los animales usados convencionalmente, por ejemplo, ovejas, conejos, cabras o ratones o yema de huevo
(b) anticuerpos monoclonales o policlonales
(c) anticuerpos o fragmentos de anticuerpos intactos, monoclonales o policlonales, fragmentos aquellos que contienen la región de unión del anticuerpo, por ejemplo, fragmentos desprovistos de la porción Fc (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), los llamados fragmentos de "media molécula" obtenidos por escisión reductora de los enlaces disulfuro que conectan los componentes de la cadena pesada en el anticuerpo intacto. Fv puede definirse como un fragmento que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas.
(d) anticuerpos producidos o modificados por ADN recombinante u otras técnicas sintéticas, que incluyen anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o estructuras similares a anticuerpos fabricadas sintéticamente o alteradas. Se incluyen además derivados funcionales o "equivalentes" de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios. Un anticuerpo monocatenario puede definirse como una molécula modificada por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unida por un conector polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada. Se incluyen además intracuerpos monocatenarios (Sv).
Los métodos para preparar tales fragmentos de anticuerpos y anticuerpos sintéticos y derivatizados son bien conocidos en la técnica. Se incluyen además fragmentos de anticuerpos que contienen las regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables de los anticuerpos. Estos pueden definirse como la región que comprende las secuencias de aminoácidos en las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo que forman la estructura de bucle tridimensional que contribuye a la formación del sitio de unión al antígeno. Las c Dr pueden usarse para
generar anticuerpos injertados con CDR. Como se usa en la presente descripción, "CDR injertada" define un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos en la que al menos partes de una o más secuencias en los dominios ligeros y/o variables han sido reemplazadas por partes análogas de secuencias de CDR de un anticuerpo que tiene una especificidad de unión diferente para un antígeno dado. Un experto en la técnica puede producir fácilmente tales anticuerpos injertados con CDR mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.
Puede prepararse un anticuerpo quimérico mediante combinación del dominio variable de un anticuerpo de una especie con las regiones constantes de un anticuerpo derivado de una especie diferente. Las células expandidas pueden después infundirse a pacientes para ser tratados, por ejemplo, pacientes con cáncer, enfermedades infecciosas, pacientes inmunodeficientes o pacientes con enfermedades autoinmunitarias y dado que los donantes se seleccionan de tal manera que la transferencia de células NK se realiza sobre barreras de1HLA, esto desencadenará alorreactividad. Las células pueden infundirse además en entornos compatibles con HLA siempre que el alelo HLA de clase I relevante sea bajo o esté ausente. Las células pueden infundirse mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica o como se describe en la presente descripción.
Hacer la transferencia junto con mAb terapéuticos puede mejorar aún más la especificidad celular deseada. Los mAb adecuados incluyen, pero no se limitan a, Rituximab (anti-CD20), GA 101 (anti-CD20), mabcampath (anti-CD52), mylotarg y cetuximab. La modificación genética del producto de células expandidas puede mejorar aún más la especificidad deseada. Las modificaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, la expresión de receptores de quimiocinas tales como CXCR5, CCR5 y CCR2 y receptores de antígenos quiméricos tales como CD19 unido a CD3zeta y 41-BB y TcR específicos para antígenos tumorales que incluyen pero no se limitan a CD20.
Otra modalidad implica la coexpresión de la activación de KIR en las células NK expandidas. Los inventores han expandido con éxito células NK que expresan, por ejemplo, KIR2DL3 (que reconoce HLA-C1) junto con KIR2DS1 activador (que reconoce HLA-C2). Estas células pueden generarse con la invención aquí descrita y muestran una destrucción muy potente de células leucémicas HLA-C2/C2 con HLA no compatibles. En una modalidad, el protocolo se combina con ligandos para la activación de KIR (que incluye pero no se limita a HLA-C2) para estimular aún más la expansión de tales células.
En una modalidad, tales células NK que expresan una combinación deseada inhibidores y activadores de KIR se infunden a pacientes con cáncer, enfermedades infecciosas, pacientes inmunodeficientes o pacientes con enfermedades autoinmunitarias y dado que los donantes se seleccionan de tal manera que se realiza la transferencia de células NK sobre las barreras del HLA, esto desencadenará la alorreactividad.
Las células NK obtenidas mediante el presente método tienen una especificidad KIR personalizada, basada en el donante seleccionado, y la mayoría de las células carecen del receptor inhibidor de NKG2A (NKG2A"NKG2C+). Cuando las células NK expandidas in vitro se infunden a un paciente, serán altamente citolíticas ya que las células tienen una especificidad KIR personalizada, son positivas para NKG2C, carecen del receptor inhibidor NKG2A y están diferenciadas.
Cuando se estimulan las células NK con HLA-E, esto generará una proliferación que promueve las células que carecen de NKG2A y, al mismo tiempo, solo proliferarán las células NK educadas y potentes para matar tumores. Esta es una nueva forma de expandir las células NK efectivas.
Ejemplo 1
Expansión in vitro de células NK
Las células NK aisladas obtenidas del donante se cultivan junto con IL-15 y las células de la línea de células alimentadoras 721.221 transfectadas con un HLA-E híbrido que contiene la secuencia seña1HLA-A2 (221.AEH) (Lee y otros, 1998). Las células NK se cultivan a una densidad de 2-10x106 células/ml durante 12-14 días en X-vivo 15 (BioWhittaker) complementado con IL-15 y 5 % de suero AB humano a 5 % de CO2, 37 °C (35-38 °C).
Ejemplo 2
La especificidad de las células expandidas
En el ejemplo que se muestra en la Figura 4, las células NK se expandieron de acuerdo con el ejemplo 1 de un donante HLA-C1/C1 y las células generadas fueron solo positivas para KIR2DL3. Estas células respondieron mucho cuando fueron estimuladas por células 721.221 transfectadas con HLA-C2 pero no respondieron cuando fueron estimuladas por células 721.221 transfectadas con el ligando análogo para KIR2DL3, a saber HLA-C1. Los resultados revelan la marcada especificidad de las células NK expandidas.
Ejemplo 3
Las células expandidas muestran un fenotipo diferenciado y tienen un alto potencial citolítico
La expansión de las células NK de acuerdo con el ejemplo 1 está asociada con la diferenciación de las células NK, un proceso durante el cual las células acumulan moléculas efectoras como Perforina y Granzima B, se vuelven más sensibles a la estimulación de las células diana y altamente citolíticas contra numerosas dianas tumorales. Las células se vuelven además muy potentes para mediar la ADCC contra las células cancerosas recubiertas de anticuerpos (Figura 5 y 6).
Ejemplo 4
La expansión de las células NK en condiciones de GMP produce un gran número de células que reconocen blastos leucémicos no compatibles
Se realiza aféresis del donante para obtener gran cantidad de leucocitos. El aislamiento de células NK se realiza en un laboratorio de GMP mediante el uso del equipo y el dispositivo de Miltenyi. Las células aisladas se tratan como en el ejemplo 1. Las células NK positivas individuales expandidas KIR2DL3 NKG2C+ muestran una muerte específica contra blastos HLA-C2/C2 no compatibles pero no frente a blastos HLA-C1/C1 compatibles (Figura 7).
Ejemplo 5
Las células expandidas de acuerdo con el ejemplo 1 se formulan en una solución salina fisiológica complementada con albúmina de suero humano al 5 % y se introducen en una bolsa de transferencia para su envío a la clínica inmediatamente después de su liberación. Las células se infunden a un paciente que padece leucemia linfoide aguda. Las células NK NKG2A'NKG2C+ con especificidad KIR dada mejoran la especificidad tumoral en este tratamiento. Ejemplo 6
Expansión selectiva y controlada de células NK educadas
Las células NK se aislaron y se cultivaron conjuntamente con células 721.221 irradiadas, se transfectaron con HLA-E y la secuencia líder de h LA-A (221.AEH) en IL-15 durante 14 días. En la Figura 8 se muestran gráficos FACS representativos que muestran el repertorio KIR en células NK de (A) un donante C1/C1 y (B) un donante C2/C2 en el día 0 y el día 14. (B) muestra un resumen de la expansión (panel izquierdo) y el sesgo (panel central y derecho) en experimentos de cocultivo de células NK/221.AEH de donantes seropositivos para HCMV (n=14). Después de 14 días de expansión, las células NK muestran un repertorio de KIR profundamente sesgado, con una expresión media de 90 % de KIR específicos propios.
Esta figura (en particular, el panel del medio en (B)) ilustra cómo el protocolo genera células NK con KIR específicos. Dichas células serán altamente específicas contra dianas no compatibles con HLA o dianas que carecen de1HLA de clase I.
Ejemplo 7
Especificidad y eficacia de las células NK expandidas
La muerte mediada por células NK se evaluó en un ensayo basado en citometría de flujo mediante el seguimiento de la actividad de la caspasa-3 y la tinción de un marcador de células vivas/muertas (DCM) en blastos de PHA después de la coincubación con células NK en una relación E:T de 5:1 durante 4 horas. La Figura 9 muestra (A) gráficos representativos que muestran la muerte de blastos de PHA en configuraciones compatibles y no compatibles con HLA-C. (B) muestra la muerte de blastos PHA no compatibles por células NK expandidas (día 14) en comparación con células NK estimuladas con IL-15 durante la noche (día 0). Las células NK expandidas muestran una destrucción más potente de blastos PHA no compatibles que las células NK activadas a corto plazo.
Esta figura ilustra la especificidad de las células NK expandidas. En relación con otras estrategias para expandir las células NK, el protocolo inventado genera células que muestran una alta especificidad contra dianas compatibles. Debido al moldeado único del repertorio KIR durante el cultivo en combinación con la expresión preferencial de NKG2C activador en lugar de NKG2A inhibidor, las células generadas son altamente efectivas contra dianas no compatibles con alta expresión tanto de HLA de clase I como de HLA-E.
Ejemplo 8
Las células NK expandidas selectivamente lisan eficazmente los blastos primarios de niños con leucemia linfoblastoide aguda
Las células NK expandidas se probaron contra los blastos primarios de ALL de 24 niños en un ensayo de destrucción basado en FACS en una relación E:T de 5:1 durante 4 horas. La Figura 10 muestra (A) gráficos de FACS
representativos que muestran la estrategia de activación para detectar blastos de ALL primarios después del cocultivo con células NK. Las células NK se tiñeron con violeta CellTrace y se excluyeron del análisis. Los marcadores para identificar los blastos de ALL se determinaron de acuerdo con el fenotipo de enfermedad residual mínima (panel NOPHO) en el momento del diagnóstico. (B) muestra gráficos representativos que ilustran la muerte de subtipos de blastos de ALL. (C) muestra un resumen de la destrucción de los blastos de ALL primarios con el genotipo HLA-C indicado por células NK expandidas que expresan KIR2DL1.
Esta figura ilustra la eficacia de las células NK expandidas contra blastos de leucemia linfoide primaria. Esto es particularmente relevante, ya que se ha demostrado que las células de ALL son resistentes a las células NK en general y a las células NK92 (las células vendidas por CoNKwest) en particular.
Ejemplo 9
Reconocimiento de las neoplasias mieloides de alto riesgo
La muerte mediada por células NK se evaluó en un ensayo basado en citometría de flujo mediante el seguimiento de la actividad de caspasa-3 y la tinción de un marcador de células vivas/muertas (DCM) en blastos CD34+ después de la coincubación con células NK en una relación E:T 5:1 durante 4 horas. La Figura 11 (A) muestra un ejemplo de destrucción específica de blastos CD34+ de pacientes con síndrome mielodisplásico (MDS) (izquierda) y leucemia mieloide aguda (AML). (B) Eliminación específica de AML compatible y no compatible (n=2, un paciente era C1/C1 y uno C2/C2) y blastos MDS (n=3, todos C1 / C1).
Ejemplo 10
Reconocimiento del melanoma maligno
Se probaron células NK expandidas con dos especificidades distintas en un ensayo de liberación de Cr51 estándar contra una variedad de líneas celulares de melanoma obtenidas de ATCC (ver Figura 12). El nivel de destrucción a las proporciones E:T 5:1 y 2,5:1 estaba en el intervalo de la línea celular altamente sensible a NK K562.
Ejemplo 11
Reconocimiento selectivo de dianas HLA-C2/C2 por células NK KIR2DL3+KIR2DS1
La muerte mediada por células NK se evaluó en un ensayo basado en citometría de flujo mediante el seguimiento de la actividad de la caspasa-3 y la tinción de un marcador de células vivas/muertas (DCM) en todos los blastos después de la coincubación con células NK en una relación E:T de 5:1 durante 4 horas. La Figura 13 A) muestra un ejemplo de destrucción y especificidad de células blásticas de ALL primarias por células NK que expresan KIR2DL3 y KIR2DS1. B) Las células Nk expandidas se probaron frente a un panel de dianas primarias de LLA con el genotipo HLA-C indicado.
Claims (13)
1. Un método in vitro para expandir células asesinas naturales (NK) de una especificidad KIR dada, dicho método comprende:
(a) seleccionar un donante que tenga células NK educadas de dicha especificidad KIR dada, en donde las células NK educadas expresan KIR específico para moléculas de1HLA de clase I propias;
(b) proporcionar células leucocitarias de dicho donante, en donde dichos leucocitos comprenden células NK;
(c) poner en contacto dichas células NK del donante con un estimulador de uno o ambos receptores compatibles CD94/NKG2C y CD94/NKG2A; y
(d) expandir selectivamente células NK que tienen dicha especificidad KIR, células que son positivas para NKG2C y negativas para NKG2A, para producir una población de células que comprenden dichas células NK expandidas.
2. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 para expandir células asesinas naturales (NK) de una especificidad KIR dada, en donde las células NK expandidas son adecuadas para la transferencia a un paciente para terapia, en donde la etapa (a) comprende además seleccionar al donante con respecto al tipo de HLA de clase I del paciente y, opcionalmente, con respecto a la afección a tratar, dada la especificidad KIR, en donde las células NK expandidas se transfieren a un paciente para su uso
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho método comprende además aislar o enriquecer las células NK, donde las células NK se aíslan de los leucocitos del donante antes de la etapa de contacto (c) o las células NK se aíslan o enriquecen de la población celular resultante de la etapa (d).
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el estimulador es:
(i) un ligando para uno cualquiera o más de los componentes heterodímeros de los receptores CD94/NKG2C y CD94/NKG2A; o
(ii) se selecciona de uno o más de HLA-E, un anticuerpo contra CD94 o uno o más anticuerpos contra NKG2C y/o NKG2A, en donde dichos anticuerpos son capaces de estimular el receptor; o
(iii) HLA-E y/o un anticuerpo contra NKG2C, en donde dicho HLA-E
(a) se proporciona en forma de complejo con un péptido de secuencia líder; o
(b) se expresa a partir de una línea de células alimentadoras; o
(c) es un multímero de HLA-E; o
(d) es un multímero de HLA-E recubierto sobre un soporte sólido.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde:
(i) el donante es al menos parcialmente no compatible en el HLA de clase I con el paciente; o (ii) el donante es parcial o totalmente no compatible con el paciente en uno o más grupos de alelos del HLA de clase I seleccionados de HLA-C1, HLA-C2, Bw4 o Bw6; o
(iii) cuando el paciente tiene una afección en la que las células diana para las células NK expresan cantidades bajas o nulas de la molécula HLA de clase I reconocida por el KIR de las células NK del donante, el donante es compatible en el HLA de clase I con el paciente; o
(iv) el donante es homocigoto para HLA-C1, HLA-C2, Bw4 o Bw6, o heterocigoto para HLA-C1/C2 o Bw6/Bw4.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5 parte (iv), en donde el paciente es homocigoto para HLA-C1, HLA-C2 o Bw6.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el donante exhibe una cantidad aumentada de células NK educadas que expresan KIR específico para moléculas de1HLA de clase I propio.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el donante es seropositivo para CMV.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células del donante se ponen en contacto adicionalmente con una o más citocinas.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las citocinas se seleccionan de IL-5, IL-15, IL-12, IL-18, IL-2, IL-7, IL-21 e IFN-alfa.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la citocina es IL-15.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células del donante se ponen en contacto adicionalmente con uno o más ligandos para estimular la activación de KIR expresado en las células del donante.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además una etapa de formular las células NK expandidas en una composición farmacéutica.
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