CN114258305A - Iii型nkt细胞及相关组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及III型自然杀伤T(NKT)细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)、药物组合物及其制备方法和用途，尤其是它们作为治疗各种癌症的治疗剂的用途。还公开了经修饰的III型NKT细胞，例如表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞受体模拟抗体(TCRm)或其组合、药物组合物、其制备方法和用途。

Description

III型NKT细胞及相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2019年8月21日提交的第62/889664号美国临时专利申请的优先权，将其全部公开内容并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及III型自然杀伤T(NKT)细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，尤其是经修饰的细胞、III型NKT细胞的药物组合物、制备方法，以及所述细胞或其药物组合物用于治疗或预防疾病和病症，包括各种癌症的治疗用途。
背景技术
自然杀伤T(NKT)细胞是一种T细胞亚群，具有常规T细胞和自然杀伤(NK)细胞的特征。NKT细胞通常出现在胸腺中，来自经历T细胞受体(TCR)基因重排的CD4+CD8+皮质胸腺细胞。NKT细胞传统上被定义为CD1d限制性脂质抗原反应性T细胞，并被分类为I型和II型NKT细胞(Godfrey et al.，Immunity 2018；48(3):453-73；Dhodapkar and Kumar，JImmunol.2017；198(3):1015-21)。根据其TCR库(repertoire)、抗原特异性和CD1d依赖性，NKT细胞也被分为三类：I型、II型和III型NKT细胞(Godfrey et al.，Nat RevImmunol.2004；4(3):231-37)。
I型或不变NKT(iNKT)细胞表达不变的TCRα链(小鼠的TRAV11和TRAJ18，人的TRAV10和TRAJ18)和数量有限的非不变TCRβ链。当通过I类主要组织相容性复合体(MHC)样CD1d分子递呈时，I型NKT细胞也识别鞘糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)抗原。II型NKT细胞具有更多样化和更不明确的TCR库，并识别由CD1d分子递呈的非α-GalCer分子(如磺胺肽)。III型NKT或NKT样细胞具有多样的TCR库并识别独立于CD1d的分子。
I型NKT细胞已被深入研究，并因多种多样的分泌细胞因子的亚群而具有促进或抑制细胞介导的免疫的矛盾能力而闻名。目前尚未确定II型NKT细胞群的特异性标志物，II型NKT细胞的功能作用尚不清楚，但在鼠类研究中主要被认为具有免疫抑制作用(Dhodapkarand Kumar，J Immunol.2017；198(3):1015-21；Marrero et al.，Front Immunol.2015；6:316；Kato et al.，Front Immunol.2018；9:314)。到目前为止，III型NKT细胞是在小鼠和人中的异质性最强且特征最少的细胞(Farr et al.Proc Natl Acad Sci USA.2014；111(35):12841-46；Yu et al.J Clin Invest.2011；121(4):1456-70)。
与iNKT细胞一样，III型NKT细胞在胸腺中的发育不依赖于MHC I类或II类分子。分子和功能证据表明，小鼠CD1d非限制性III型NKT细胞被独特地程序化为具有先天性(如NK细胞)和适应性免疫(如T细胞)的混合功能，远远优于iNKT细胞。全球基因组表达显示III型NKT细胞和NK细胞之间的相似性高于III型NKT细胞和iNKT细胞之间的相似性(Farretal.Proc Natl Acad Sci USA.2014；111(35):12841-46)。
已假定III型NKT细胞在抗肿瘤和抗病毒免疫应答中发挥重要作用(Lu et al.JImmunol.1994；153(4):1687-96；Kokordelis et al.J Acquir Immune DeficSyndr.2015；70(4):338-46)。在包括肺癌、结直肠癌和胃癌在内的人癌症中，高水平的III型NKT与患者存活的改善相关(Panet al.Tumor Biol.2014:35(1):701-7；Bojarska Junaket al.Oncol Rep.2010:24(3):803-10；Penget et al.Oncotarget.2016:7(34):55222-30)。
双阴性T(DNT)细胞是CD3+CD56-、CD4-CD8-成熟T细胞。已经证明，来自AML患者或健康捐赠者的离体扩增的DNT细胞诱导针对原发性AML细胞和化疗耐药性白血病的有效细胞毒性和IFN-γ产生，并降低患者源性异种移植(PDX)模型中的白血病负荷(Lee et al.ClinCancer Res.2018；24(2):370-82；Lee et al.Clin Cancer Res.2019；25(7):2241-53)。此外，来自健康供体的异基因DNT不会引起异种移植物抗宿主病(GvHD)，支持使用DNT细胞作为现成常备的(off-the-shelf)细胞疗法。然而，DNT细胞中介导有效抗急性髓系白血病(AML)活性的细胞组分尚不清楚。
急性髓性白血病(AML)，也称为急性骨髓性白血病，是一种髓系血细胞癌，其特征在于异常白细胞的快速生长，所述异常白细胞积聚在骨髓中并且干扰正常血细胞的生成。作为一种急性白血病，AML进展迅速，如果不治疗，通常在数周或数月内死亡。AML是成人白血病中最常见的一种形式，尤其是在老年人中，男性比女性更常见。估计2018年美国有19520例AML新病例和10670例死亡(Siegel et al.，CA Cancer J Clin.2018；68:7-30)。这种疾病在占患者大多数的老年人中尤其难以治疗；因此，5年总生存率只有大约27％(美国国家癌症研究所。SEER癌症统计事实：急性髓系白血病(AML))。
近几十年来，AML分子个体发育的数据已经详细阐明了因果途径，并导致了改进的化疗和靶向药物开发(Lindsley et al.，Blood 2015；125:1367-1376；Papaemmanuil etal.，N Engl J Med.2016；374:2209-2221)。然而，这种疗法可以产生中等的总体响应和/或较低的完全响应率。因此，仍然需要有效的癌症疗法，特别是针对AML等难治性癌症的疗法。
发明内容
本发明涉及III型自然杀伤T(NKT)细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)。在一些实施方案中，本文公开的III型NKT细胞为CD3+CD56+III型NKT细胞(例如，CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞、CD3+CD4-CD8-CD56+细胞或其混合物)。在一些实施方案中，本文公开的III型NKT细胞是经修饰的，例如表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞受体模拟抗体(TCRm)或其组合。
本发明还涉及使用本文公开的III型NKT细胞的方法和组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，本文公开的III型NKT细胞可用作治疗剂，例如用于治疗或预防癌症(例如，急性髓系白血病(AML))。在一些实施方案中，本文公开的III型NKT细胞可分离(例如，从生物样品中，例如从患者或供体中)，培养和/或扩增成细胞群。在一些实施方案中，本文公开的III型NKT细胞存在和/或用于药物组合物中。
还提供了包含本文公开的III型NKT细胞的药物组合物。在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本文公开的任何实施方案的分离的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述细胞为CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+或CD3+CD4-CD8-CD56+细胞，各自任选从受试者或供体的生物样品中分离。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的根据本文所公开的任何实施方案的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞，或包含治疗有效量的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的疗法的方法，包括：
a)从生物样品中分离一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞；和
b)在生长培养基中培养一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞以产生扩增的细胞群。
在一些实施方案中，该方法还包括修饰一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞以表达CAR、TCR或TCRm。在一些实施方案中，该修饰包括将编码CAR、TCR或TCRm的一个或多个多核苷酸引入一个或多个细胞。
在任一方面中，分离细胞可用于治疗或预防的癌症包括但不限于实体瘤或血液系统恶性肿瘤；B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤；急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。
通过以下附图说明、具体实施方式、实施例和权利要求书，可以更好地理解本发明的其他方面或优点。
附图说明
图1A是流式细胞仪分析图，显示了培养前后双阴性T细胞(DNT)的表型。使用去除CD4和CD8细胞的鸡尾酒试剂从健康供体的PBMC中富集DNT细胞，并在抗CD3抗体包被板(OKT3；5μg/mL)和IL-2(250IU/mL)中培养3天。在第7、10和14天添加可溶性抗CD3抗体(0.1μg/mL)。在第3、7和10天添加新鲜培养基和IL-2。作为对照，DNT细胞用Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28活化3天，然后用IL-2(50IU/mL)培养。
图1B是流式细胞术分析图，显示了CD3+CD4-CD8-群体上门控的DNT培养物中的抗AML细胞毒性和IFNγ产生。细胞表面CD107a的表达表明细胞毒性。CD19 CAR-T(37％CAR+)和PMA/离子霉素作为对照。其他靶细胞包括K562(红白血病)、K562CD19(CD19转染的K562)、Nalm-6(B-ALL、B细胞前体白血病)、Raji(伯基特淋巴瘤)和U937(AML)。
图2A是显示在不同效应物：靶(E/T)比率下使用CD19 CAR-T细胞的基于荧光素酶的杀伤测定的示例性优化的图表。
图2B是显示使用CD19 CAR-T细胞的基于荧光素酶的杀伤分析的示例性优化的图表。CD19+靶细胞包括Daudi(伯基特淋巴瘤)、Nalm-6(B-ALL)和Raji(伯基特淋巴瘤)。
图2C是显示CD19 CAR-T细胞在识别CD19+靶细胞后释放IFN-γ的图表。
图2D是显示使用IGF1R CAR-T和ROR1 CAR-T对肉瘤细胞系进行基于荧光素酶的杀伤分析的示例性验证的图表。
图2E是使用IGF1R CAR-T和ROR1 CAR-T对肉瘤细胞系进行的基于荧光素酶的杀伤测定的示例性验证图。
图2F是显示IGF1R CAR-T和ROR1 CAR-T细胞在识别抗原表达肉瘤细胞系后释放IFN-γ的图表。
图3A是显示T细胞克隆2A(DNT)、3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)表型的图表。表型分别表明是CD3+CD4-CD8-CD56-DNT、CD3+CD4+CD56+NKT和CD3+CD8+CD56+NKT细胞。
图3B是显示使用TCR Vβ库试剂盒和iNKT TCR Vα24-Jα18(iTCR)抗体的2A、3F和4E克隆的T细胞受体(TCR)Vβ库的频率的图表。灰色斑点线，同型抗体；实线，抗iTCR抗体。
图3C是显示在基于4-h荧光素酶的杀伤测定中2A、3F和4E克隆对U937 AML靶细胞的裂解的图表。用慢病毒编码人源化荧光素酶和截短型神经生长因子受体(ΔNGFR)(hfflucN)转导靶细胞，并用生物素标记的抗NGFR抗体和抗生物素微球富集NGFR+细胞。
图3D是酶联免疫吸附测定(ELISA)中识别一组AML细胞系(包括KG-1、Molm-13、Molm-14、MV4:11、U937)后，2A、3F和4E克隆产生IFN-γ的图表。在24小时收集来自T细胞和靶细胞共培养物的上清液，以测量IFN-γ水平。
图3E是流式细胞术分析图，通过CD107a表达水平和细胞内IFN-γ显示2A、3F和4E克隆对受试AML细胞系的细胞毒性。
图4A是显示2A、3F和4E克隆对表达荧光素酶的AML细胞的细胞毒性的图表。HL-60mx，选择对米托蒽醌耐药的HL-60。
图4B是显示在ELISA IFN-γ测定中2A、3F和4E克隆对表达荧光素酶的AML细胞释放IFN-γ的曲线图。
图4C是显示2A、3F和4E克隆对肉瘤细胞系(SaOs2、TC71、Rh30)的细胞毒性的图表。
图4D是显示2A、3F和4E克隆对表达荧光素酶的AML细胞系(HL60、KG-1、Molm-13、Molm-14、MV4:11、THP-1、U937)的五个独立细胞毒性测定的统计分析的图表。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001，ns，不显著。
图4E是显示2A、3F和4E克隆对表达荧光素酶的AML细胞(HL60、KG-1、Molm-13、Molm-14、MV4:11、THP-1、U937)释放IFN-γ的两个独立ELISA测定的统计分析的图表。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001。
图5A为流式细胞术分析图，显示使用CD3+CD56+NKT细胞分离试剂盒纯化后，两名健康献血者PBMC中CD3+CD56+III型NKT细胞的百分比。
图5B是显示CD3+CD56+III型NKT细胞和CD4+、CD8+和CD4-CD8-细胞在用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28活化纯化的CD3+CD56+NKT细胞后对CD3+CD56+和CD3+CD56-群体进行设门后的百分比的图表。
图5C是显示培养的CD3+CD56+NKT细胞中iNKT TCR Vα24-Jα18阳性细胞百分比的图表。
图5D是显示在不同效应细胞：靶细胞(E/T)比率下对2A、3F和4E克隆以及来自健康献血者1(NKT1)的CD3+CD56+NKT细胞进行的基于荧光素酶的细胞裂解测定的图表。
图5E是显示在识别U937 AML、Nalm-6(B-ALL)或Jurkat(T-ALL)细胞后2A、3F和4E克隆以及NKT1细胞产生IFN-γ的图表。
图6A是流式细胞仪分析图，显示使用CD3+CD56+NKT细胞分离试剂盒纯化后，来自两名健康献血者(PBMC3和PBMC4)的PBMC中CD3+CD56+NKT细胞的百分比。
图6B为第3天用Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28活化纯化的CD3+CD56+NKT细胞(NKT3珠)并在第15天用OKT3(muromonab-CD3，Orthoclone OKT3)扩增后CD3+CD56+NKT细胞的百分比。
图6C是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者2(NKT2)分离，用Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28活化，并用OKT3扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。
图6D是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者9、10、11和12分离，用Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28活化，并用OKT3扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。OKT3购自BioCell。
图6E是显示CD3+CD56+NKT细胞对表达荧光素酶的AML(HL60、KG-1、Molm-13、Molm-14、THP-1、U937)和B细胞恶性肿瘤(Daudi、Raji、Nalm-6)在E/T比为30:1、10:1和3.3:1时细胞毒性的统计分析的图表。CD3+CD56+NKT细胞(NKT1、NKT2、NKT9、NKT10、NKT11、NKT12)来自于六名健康献血者，用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28活化，并用OKT3扩增。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001。
图6F是显示CD3+CD56+NKT细胞对荧光素酶表达的AML(HL60、KG-1、Molm-13、Molm-14、THP-1、U937)和B细胞恶性肿瘤(Daudi、Raji、Nalm6)在E/T比为15:1,5:1和1.67:1时细胞毒性的统计分析的图表。CD3+CD56+NKT细胞(NKT9、NKT10、NKT11、NKT12)是从四名健康献血者中分离，用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28活化，并用OKT3扩增。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001，ns，不显著。
图7A是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者2分离，从冷冻瓶中解冻，在OKT3包被的T25培养瓶中用IL-2活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。该测定在OKT3活化后第17天和第22天使用NKT2。
图7B是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者2和17中分离，在OKT3包被的T25培养瓶中用IL-2活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。该测定在OKT3活化后第41天使用NKT2并且在OKT3活化后第18天使用NKT17。
图7C是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者20、21和22中分离，在OKT3包被的且含有IL-2的T25培养瓶中活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。
图7D是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者27、30和31中分离，在OKT3包被的24孔板并含有IL-2中被活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。OKT3购自Miltenyi Biotec。
图7E是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者30、31和32中分离，在OKT3包被的24孔板且含有IL-2中被活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。
图7F是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD3+CD56+NKT细胞(从健康献血者35中分离，在OKT3包被的24孔板且含有IL-2中被活化，并用OKT3+IL-2扩增)针对一组AML细胞系的细胞毒性的图表。
图7G为表1，显示从9名健康供体(n＝9)分离的CD3+CD56+NKT细胞的细胞毒性统计分析。
图7H是显示CD3+CD56+NKT细胞对荧光素酶表达的AML(HL60、KG-1、Molm-13、THP-1、U937)和B细胞恶性肿瘤(Daudi、Raji、Nalm6)的细胞毒性的统计分析的图表，合并E/T比率为20:1、6.7:1、2.2:1(n＝4)和15:1、5:1、1.7:1(n＝5)。这些CD3+CD56+NKT细胞在OKT3包被的24孔板且含有IL-2中被活化，并用OKT3和IL-2扩增。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001。
图8A是显示在酶联免疫吸附测定(ELISA)中从健康供体2、17和18分离的CD3+CD56+NKT细胞对一组AML细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的响应的图表。3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆作为对照。
图8B是显示在酶联免疫吸附测定(ELISA)中从健康供体20、21和22分离的CD3+CD56+NKT细胞对一组AML细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的响应的图表。
图8C是显示在酶联免疫吸附测定(ELISA)中从健康供体26、27和29分离的CD3+CD56+NKT细胞对一组AML细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的响应的图表。3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆作为对照。
图8D是显示从9名健康供体分离的CD3+CD56+NKT细胞对一组AML细胞(HL60、KG-1、Molm-13、MV4:11、THP-1、U937)和B细胞恶性肿瘤(Daudi、Raji、Nalm6)产生干扰素-γ(IFN-γ)的统计分析的图表。结果计算为平均值±标准偏差。*，p<0.05，***，p<0.01，***，p<0.001，***，p<0.0001。
图9A是流式细胞仪图，显示11名健康献血者培养后的CD3+CD56+NKT细胞百分比及其CD4+、CD8+和CD4-CD8-百分比。CD3+CD56+NKT细胞的设门是基于同型抗体对照。
图9B是流式细胞仪图，显示10名健康供体的PBMC中CD3+CD56+NKT细胞百分比以及CD3+CD56+NKT细胞分离后的纯度。CD3+CD56+NKT细胞的设门是基于同型抗体对照。CD4+和CD8+细胞的设门是基于CD3+CD56+群体。
图10A是显示基于荧光素酶的杀伤测定中，iNKT细胞在不同E/T比率下对α-GalCer抗原致敏的AML细胞的细胞毒性的图表。
图10B是流式细胞仪分析图，显示iNKT细胞的CD3+和iTCR+标志物表达。
图10C是流式细胞仪图，显示在细胞表面表达可变数量CD1d分子的AML细胞。灰色斑点线，同型抗体；实线，抗人CD1d PE。
图11A是显示iNKT1、iNKT2和iNKT12细胞(从健康献血者1、2和12分离，用抗原α-GalCer致敏辐照自体PBMC阴性部分刺激，并用α-GalCer致敏辐照同种异体PBMC扩增)在不同E/T比率下，在基于荧光素酶的杀伤测定中，对α-GalCer抗原致敏的AML细胞进行细胞毒性研究的图表。
图11B是显示在不同E/T比率下，基于荧光素酶的杀伤测定中，iNKT2和iNKT12细胞对α-GalCer抗原致敏的CD1d-CML(K562)、B-ALL(Nalm-6)和CD1d+(MV4:11，U937)AML细胞的细胞毒性的图表。
图11C是显示在酶联免疫吸附测定(ELISA)中，通过抗人CD1d抗体(50μg/mL，克隆42.1，BD Biosciences)阻断iNKT1细胞对α-GalCer抗原刺激产生干扰素-γ(IFN-γ)响应的图表。
图11D是显示在基于5:1的E/T比率的荧光素酶的杀伤测定中，抗人CD1d抗体(10μg/mL，克隆42.1，BD Biosciences；克隆51.1，BioLegend)阻断iNKT1和iNKT12细胞对α-GalCer抗原致敏的AML(THP-1)细胞的细胞毒性的图表。
图11E是显示分别在E/T比率为5:1和30:1的基于荧光素酶的杀伤测定中,抗人CD1d抗体(40μg/mL，克隆42.1，BD Biosciences；克隆51.1，BioLegend)阻断iNKT1和iNKT12细胞对α-GalCer抗原致敏的AML(THP-1)细胞的细胞毒性的图表。
图11F是显示基于荧光素酶的杀伤测定中，抗人CD1d抗体(30μg/mL，克隆51.1，BioLegend)阻断NKT30、NKT31和4E(CD8+NKT)细胞分别在E/T比例为15:1、15:1和30:1，针对α-GalCer抗原致敏的AML(Molm-13、U937)细胞的细胞毒性的图表。
图12A是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN中的gRNA2)AML细胞系在不同E/T比率下基于荧光素酶的杀伤测定中对iNKT2和iNKT12细胞呈现α-GalCer抗原的影响的图表。使用野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN细胞作为对照。
图12B是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2)AML细胞系在不同E/T比率下基于荧光素酶的杀伤测定中对iNKT2和iNKT12细胞呈现α-GalCer抗原的影响的图表。
图12C是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1和MV4:11-hfflLucN中的gRNA2)AML细胞系基于在酶联免疫吸附测定(ELISA)中对α-GalCer抗原递呈至iNKT2和iNKT12细胞释放IFN-γ影响的图表。野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN细胞以及CD1d-Nalm-6-hfflucN细胞作为对照。
图12D是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN中的gRNA2)AML细胞系在基于荧光素酶的杀伤测定中对iNKT1、iNKT2和iNKT12细胞呈现α-GalCer抗原影响的图表。iNKT1，E/T为5:1；iNKT2，E/T为15:1；iNKT12，E/T为30:1、10:1和3.3:1。野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN以及CD1d-Nalm6-hfflucN细胞作为阳性和阴性对照。
图12E是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN中的gRNA2)AML细胞系在酶联免疫吸附测定(ELISA)中对向CD3+CD56+NKT2和NKT17细胞递呈α-GalCer抗原产生IFN-γ影响的图表。3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆作为对照。
图12F是显示CD1d敲除(U937 hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN中的gRNA2)AML细胞系在不同E/T比率下对基于荧光素酶的杀伤测定中向CD3+CD56+NKT21和NKT22细胞递呈α-GalCer抗原的影响的图表。野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN以及CD1d-Raji-hfflucN、Nalm6-hfflucN和K562-hfflucN细胞作为阳性和阴性对照。
图12G是显示在酶联免疫吸附测定(ELISA)中CD3+CD56+NKT21和NKT22细胞识别CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN中的gRNA2)AML细胞系产生IFN-γ的图表。野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN以及CD1d-Raji-hfflucN、Nalm6-hfflucN和K562-hfflucN细胞作为阳性和阴性对照。
图12H是显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA1、gRNA2、gRNA3+1、gRNA4+1、MV4:11-hffLucN细胞中的gRNA2)AML细胞系中细胞表面表达CD1d的流式细胞术分析图。野生型U937-hfflucN和MV4:11-hfflucN以及表达CD1d-荧光素酶的K562和Nalm-6细胞作为阳性和阴性对照。
图12I是流式细胞仪分析图，显示CD1d敲除(U937-hffLucN细胞中的gRNA3+1)衍生细胞克隆表面表达CD1d。
图12J是流式细胞术分析图，显示CD1d敲除(U937 hffLucN细胞中的gRNA4+1)衍生细胞克隆表面表达CD1d。
图13是流式细胞术分析图，显示了培养后CD3+CD56+NKT30和NKT35的表型。所有表型分析均在CD3+CD56+NKT细胞设门后进行。
图14A是流式细胞术分析图，显示CD19 CAR慢病毒转导的2A(DNT)、3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆中的CAR表达。灰色阴影点线，仅链霉亲和素PE；实线，生物素蛋白L加链霉亲和素PE。
图14B是显示在基于荧光素酶的杀伤测定中，CD19 CAR慢病毒转导的2A(DNT)、3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆对一组靶细胞的细胞毒性的图表。
具体实施方式
本发明部分基于对III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可能具有抗癌活性的认识。因此，在某些方面，本发明提供了使用III型NKT细胞治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法和组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，III型NKT细胞包括或由CD3+CD56+III型NKT细胞组成。在一些实施方案中，III型NKT细胞包括或由CD3+CD4+CD56+细胞组成。在一些实施方案中，III型NKT细胞包括或由CD3+CD8+CD56+细胞组成。在一些实施方案中，III型NKT细胞包括或由CD3+CD4-CD8-CD56+细胞组成。在一些实施方案中，III型NKT细胞包括或由CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞组成。在一些实施方案中，使用本发明的III型NKT细胞治疗可防止或减少可能由替代疗法治疗引起的不良脱靶效应和/或毒性(例如，正常髓系细胞再生障碍)。
在一些实施方案中，本文所述的示例性III型NKT细胞能够治疗和/或预防癌症(例如，AML，例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性AML。在一些实施方案中，癌症是复发性AML，例如在造血干细胞移植后。在一些实施方案中，癌症是表达由III型NKT细胞和/或由III型NKT细胞表达的构建物(例如，嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或T细胞受体模拟抗体(TCRm)或其组合)靶向的抗原的癌症。在一些实施方案中，癌症是在没有细胞的情况下对治疗具有抗性或难治性的癌症。本文描述并举例说明了此类示例性癌症。
在一些实施方案中，本文所述的示例性III型NKT细胞以未经修饰的形式存在和/或使用。在一些实施方案中，III型NKT细胞可以未经修饰的形式用于治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，未经修饰的III型NKT细胞可用作现存常备的癌症疗法，以治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，癌症为AML(例如，难治性或复发性AML)。
在一些实施方案中，本文所述的示例性III型NKT细胞经过修饰，然后以修饰的形式呈现和/或使用。在一些实施方案中，修饰III型NKT细胞，例如，以表达CAR、TCR、TCRm或其组合。在一些实施方案中，III型NKT细胞可以修饰的形式用于治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，经修饰的III型NKT细胞可用作现存常备的癌症疗法，以治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，癌症为AML(例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症是表达由III型NKT细胞和/或由III型NKT细胞表达的构建物(例如，CAR、TCR、TCRm或其组合)靶向的抗原的癌症。
在一些实施方案中，表达靶抗原的癌症是B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，表达靶抗原的癌症为AML、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞性肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。在一些实施方案中，表达靶抗原的癌症为AML。在一些实施方案中，表达靶抗原的癌症在没有细胞的情况下对治疗具有抗性或难治性。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，或包含治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括：(a)从生物样品中分离一个或多个III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)；和(b)在生长培养基中培养所述一个或多个细胞以产生扩增的细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括修饰一个或多个细胞以表达CAR、TCR或TCRm。在一些实施方案中，修饰包括将编码CAR、TCR或TCRm的一个或多个多核苷酸引入一个或多个细胞。在一些实施方案中，引入一个或多个多核苷酸包括电穿孔、转导和/或转染。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸包含mRNA和/或DNA。在一些实施方案中，DNA包含转座子DNA。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸包含一个或多个载体。在一些实施方案中，一个或多个载体包含一个或多个病毒载体。在一些实施方案中，一个或多个载体包含一个或多个慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的经扩增的细胞群，或包含治疗有效量的经扩增的细胞群的药物组合物。在一些实施方案中，经扩增的细胞群包括本文所述和/或通过本文所述方法制备的任何示例性经扩增的细胞群。在一些实施方案中，经扩增的细胞群包括经扩增的III型NKT细胞群(例如，经扩增的CD3+CD56+III型NKT细胞群)。在一些实施方案中，经扩增的细胞群包括经扩增的CD3+CD56+III型NKT细胞群。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
在本文所述方法的一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症为急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，在没有细胞的情况下，癌症对治疗具有抗性或难治性。
在本文所述方法的一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD56+III型NKT细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD8+CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，从生物样品中分离III型NKT细胞。在一些实施方案中，生物样品来自受试者(例如，癌症患者)。在一些实施方案中，生物样品来自供体(例如，健康供体)。在一些实施方案中，生物样品包括血液、骨髓、淋巴结组织、脾组织、肿瘤组织、一个或多个诱导多能干细胞和/或一个或多个外周血单核细胞。在一些实施方案中，血液包括外周血和/或脐带血。在一些实施方案中，III型NKT细胞从一个或多个外周血单核细胞分离。
在本文所述方法的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码CAR的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR至少包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域能够结合CD19、IGF1R、ROR1、BCMA、CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1、LILRB4、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、EGFRvIII、EGFR、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、GPC3或PD-L1。在一些实施方案中，抗原结合域能够结合CD19、IGF1R或ROR1。
在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合IGF1R。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合ROR1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合BCMA。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD123。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD33。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD38。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD138。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CLL-1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合LILRB4。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GD2。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD20。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD22。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD30。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合MSLN。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFRvIII。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFR。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合HER2。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合MUC1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EPCAM。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合PSMA。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合SLAMF7。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GPC3。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合PD-L1。
在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19，并且癌症是B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL))。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19，并且癌症为B-ALL、NHL或CLL。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合ROR1，并且癌症是尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤或卵巢癌。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合BCMA，并且癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1或LILRB4，并且癌症为AML。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFRvIII或EGFR，并且癌症是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GPC3，并且癌症是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导域包含至少一种刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在本文所述方法的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，TCR至少包括α链和β链。在一些实施方案中，α链和/或β链能够结合抗原。在一些实施方案中，抗原是细胞内抗原。在一些实施方案中，抗原为NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。
在一些实施方案中，TCR的α链和/或β链能够结合NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合NY-ESO-1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合WT1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合MAGE-A3。
在一些实施方案中，抗原为NY-ESO-1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合NY-ESO-1，并且癌症为神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，抗原为WT1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合WT1，并且癌症为AML。
在本文所述方法的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体模拟抗体(TCRm)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码TCRm的多核苷酸。在一些实施方案中，TCRm至少包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域能够结合复合抗原。在一些实施方案中，复合抗原包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子。
在一些实施方案中，HLA分子为I类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是II类HLA分子。
在一些实施方案中，肽包含甲胎蛋白(AFP)肽。在一些实施方案中，复合抗原包含AFP肽和HLA-A2分子。在一些实施方案中，癌症是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，肽包含优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)肽。在一些实施方案中，PRAME肽包含ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复合抗原包含PRAME肽和HLA-A*0201分子。在一些实施方案中，癌症为B-ALL、AML、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠腺癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，肽包含WT1肽。在一些实施方案中，复合抗原包含WT1肽和HLA-A2分子。在一些实施方案中，癌症为AML。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，TCRm的细胞内信号传导域包含至少一种刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在本文所述方法的一些实施方案中，III型NKT细胞进一步修饰以包含外源性细胞因子、生长因子、抗体或抗原结合片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含双特异性T细胞接合器(BiTE)。
在一些实施方案中，本文进一步提供包含分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防需要的受试者癌症的药物组合物，其包含分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)和至少一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物中的III型NKT细胞为CD3+CD56+III型NKT细胞(例如，CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞、CD3+CD4-CD8-CD56+细胞或其混合物)。在一些实施方案中，药物组合物中的III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的III型NKT细胞为CD3+CD8+CD56+细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的III型NKT细胞为CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。
在一些实施方案中，本文还提供了III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)或包含它们的药物组合物的治疗用途。
示例性实施方案是分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，用于治疗或预防有需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，该用途包括向受试者给予治疗有效量的细胞或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一个示例性实施方案是使用分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)治疗或预防需要它们的受试者的癌症。在一些实施方案中，该用途包括向受试者给予治疗有效量的细胞或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受载体的药物组合物。
另一个示例性实施方案是使用分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)制备药物，用于治疗或预防有需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，药物包含治疗有效量的细胞，或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症为急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，在没有细胞的情况下，癌症对治疗具有抗性或难治性。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD56+III型NKT细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD8+CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，从生物样品中分离III型NKT细胞。在一些实施方案中，生物样品来自受试者(例如，癌症患者)。在一些实施方案中，生物样品来自供体(例如，健康供体)。在一些实施方案中，生物样品包括血液、骨髓、淋巴结组织、脾组织、肿瘤组织、一个或多个诱导多能干细胞和/或一个或多个外周血单核细胞。在一些实施方案中，血液包括外周血和/或脐带血。在一些实施方案中，III型NKT细胞从一个或多个外周血单核细胞分离。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码CAR的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR至少包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域能够结合CD19、IGF1R、ROR1、BCMA、CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1、LILRB4、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、EGFRvIII、EGFR、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、GPC3或PD-L1。在一些实施方案中，抗原结合域能够结合CD19、IGF1R或ROR1。
在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合IGF1R。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合ROR1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合BCMA。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD123。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD33。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD38。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD138。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CLL-1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合LILRB4。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GD2。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD20。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD22。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD30。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合MSLN。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFRvIII。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFR。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合HER2。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合MUC1。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EPCAM。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合PSMA。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合SLAMF7。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GPC3。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合PD-L1。
在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19，并且癌症是B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL))。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD19，并且癌症为B-ALL、NHL或CLL。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合ROR1，并且癌症是尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤或卵巢癌。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合BCMA，并且癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1或LILRB4，并且癌症为AML。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合EGFRvIII或EGFR，并且癌症是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，抗原结合域和/或CAR能够结合GPC3，并且癌症是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导域包含至少一种刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，TCR至少包括α链和β链。在一些实施方案中，α链和/或β链能够结合抗原。在一些实施方案中，抗原是细胞内抗原。在一些实施方案中，抗原为NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。
在一些实施方案中，TCR的α链和/或β链能够结合NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合NY-ESO-1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合WT1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合MAGE-A3。
在一些实施方案中，抗原为NY-ESO-1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合NY-ESO-1，并且癌症为神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，抗原为WT1。在一些实施方案中，α链、β链和/或TCR能够结合WT1，并且癌症为AML。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体模拟抗体(TCRm)。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个编码TCRm的多核苷酸。在一些实施方案中，TCRm至少包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域能够结合复合抗原。在一些实施方案中，复合抗原包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子。
在一些实施方案中，HLA分子为I类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是II类HLA分子。
在一些实施方案中，肽包含甲胎蛋白(AFP)肽。在一些实施方案中，复合抗原包含AFP肽和HLA-A2分子。在一些实施方案中，癌症是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，肽包含优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)肽。在一些实施方案中，PRAME肽包含ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复合抗原包含PRAME肽和HLA-A*0201分子。在一些实施方案中，癌症为B-ALL、AML、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠腺癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，肽包含WT1肽。在一些实施方案中，复合抗原包含WT1肽和HLA-A2分子。在一些实施方案中，癌症为AML。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，TCRm的细胞内信号传导域包含至少一种刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在本文所述细胞和用途的一些实施方案中，III型NKT细胞进一步修饰以包含外源性细胞因子、生长因子、抗体或抗原结合片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含双特异性T细胞接合器(BiTE)。
某些说明性实施方案
为了更容易理解本公开，在整个详细描述中定义了某些术语。除非本文另有定义，否则与本发明相关的所有科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本文引用的所有参考文献也全部并入本文作为参考。如果引用的参考文献与本文的公开内容相冲突，则以本说明书为准。
如本文所用，单词的单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定；作为示例，术语“一”、“一个”和“一种”被理解为单数或复数。举例来说，“一个元素”指一个或多个元素。术语“或”应指“和/或”，除非具体上下文另有说明。除非上下文另有指示，否则所有范围都包括端点和两者之间的所有点。
本文在数值和范围的上下文中使用的术语“约”或“大约”是指近似或接近所述值或范围的值或范围，以便实施方案可以按照预期执行，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。这至少部分是由于核酸成分的不同性质、年龄、种族、性别、解剖和生理变化以及生物系统的不精确性。因此，这些术语涵盖超出了系统误差产生的值。在一些实施方案中，“约”或“大约”表示数值的正负10％。
NKT细胞
在某些方面，本发明提供了III型自然杀伤T(NKT)细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，以及使用本文所述III型NKT细胞的方法和组合物。
如本文所用，术语“自然杀伤T细胞”或“NKT细胞”是指既展现常规T细胞特定又展现自然杀伤(NK)细胞特征的T细胞或T细胞群。例如，在一些实施方案中，NKT细胞是既具有T细胞受体又具有NK细胞受体的成熟淋巴细胞。在一些实施方案中，NKT细胞在胸腺中从经历T细胞受体(TCR)基因重排的CD4+CD8+皮质胸腺细胞产生。
文献中有两种NKT细胞分类。NKT细胞的一种经典分类是指NKT细胞是一个非常规T细胞亚群，该亚群识别I类MHC样CD1d分子递呈的脂质抗原，并将NKT细胞分为I型和II型NKT细胞(Godfrey et al.Nat Immunol.2010；11(3):197-206；Dhodapkar and Kumar.JImmunol.2017；198(3):1015-21；Godfrey et al.Immunity.2018；48(3):453-73)。NKT细胞的另一种分类包括I型、II型和III型NKT(NKT样)细胞(Godfreyet al.Nat RevImmunol.2004；4(3):231-237；Farr et al.Proc Natl Acad Sci USA.2014；111(35):12841-6)。
如本文所用，术语“I型NKT细胞”或“不变NKT细胞”或“iNKT细胞”是指表达不变或半不变TCR库并结合与I类MHC样CD1d分子相关的鞘糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)的NKT细胞或NKT细胞群。在一些实施方案中，I型NKT细胞表达不变TCRα链和有限数量的非不变TCRβ链。在一些实施方案中，I型NKT细胞表达半不变的Vα链(例如，小鼠的Vα14-Jα18TCR，人的Vα24-Jα18)，与有限的Vβ链库(例如，小鼠的Vβ8.2、Vβ7和Vβ2，以及人的Vβ11)配对。在一些实施方案中，当由I类MHC样CD1d分子递呈时，I型NKT细胞识别鞘糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)或其合成类似物。
如本文所用，术语“II型NKT细胞”或“多样性NKT细胞”是指表达变异TCR库且不结合鞘糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)的NKT细胞或NKT细胞群。相反，在一些实施方案中，当由I类MHC样CD1d分子递呈时，II型NKT细胞识别至少一种非α-GalCer分子(例如，磺胺肽)。在一些实施方案中，II型NKT细胞可产生IL-4和/或IFN-γ。
如本文所用，术语“III型NKT细胞”是指既具有常规T细胞又具有自然杀伤(NK)细胞特征的CD1d非限制性或CD1d非依赖性NKT细胞，例如人的CD3+CD56+或小鼠的NK1.1+CD3+。
值得注意的是，我们在临时申请中将CD3+CD56+NKT细胞称为II型NKT细胞，因为我们的数据显示CD3+CD56+NKT细胞识别所有受试的CD1d+AML细胞系，但不识别CD1d-B-ALL和淋巴瘤细胞。此外，目前尚不清楚CD3+CD56+细胞是否是CD1d限制性的(Krijgsman etal.Front Immunol.2018；9:367)，尽管CD1d缺陷小鼠中可能存在CD1d非限制性NKT细胞(Farr et al.Proc Natl Acad Sci USA.2014；111(35):12841-6)。根据本PCT申请中CRISPR介导的CD1d敲除AML细胞的最终数据，CD3+CD56+NKT细胞应更名为III型NKT细胞。临时申请中使用CD3+CD56+NKT细胞的方法和组合物在本PCT申请中保持不变。
在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)是单个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)是同质细胞群。在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)是异质细胞群。在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)引起、刺激和/或促进至少一种细胞因子(例如，IL-4和/或IFN-γ)的产生。在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)具有细胞毒性。在一些实施方案中，NKT细胞(例如，III型NKT细胞)可展现针对各种细胞的细胞毒性，包括本文所述和举例说明的癌细胞或细胞系(例如，AML细胞或细胞系)。在一些实施方案中，NKT细胞是I型或II型NKT细胞。在一些实施方案中，NKT细胞是III型NKT细胞。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞可表达任意数量或组合的细胞表面标志物。例如，在一些实施方案中，III型NKT细胞可在细胞表面表达CD3和CD56。在一些实施方案中，CD3和CD56细胞表面标志物可单独表达，或与一个或多个额外细胞表面标志物(例如，CD4+、CD8+、CD4-CD8-等)组合表达。
如本文所用，术语“CD3+CD56+”可用于描述在其细胞表面上至少表达CD3和CD56的任何细胞(例如，任何III型NKT细胞)。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞为CD3+CD56+细胞。在一些实施方案中，CD3+CD56+细胞还可表达一个或多个额外的细胞表面标志物(例如，CD4或CD8)。
如本文所用，术语“CD3+CD4+CD56+”可用于描述在其细胞表面上至少表达CD3、CD4和CD56的任何细胞(例如，任何III型NKT细胞)。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞为CD3+CD4+CD56+细胞。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞是CD3+CD4+CD56+细胞和至少一种额外细胞类型(例如，CD3+CD8+CD56+细胞、CD3+CD4-CD8-CD56+)的混合物。在一些实施方案中，CD3+CD4+CD56+细胞还可表达一个或多个额外的细胞表面标志物。
如本文所用，术语“CD3+CD8+CD56+”可用于描述在其细胞表面上至少表达CD3、CD8和CD56的任何细胞(例如，任何III型NKT细胞)。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞为CD3+CD8+CD56+细胞。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞是CD3+CD8+CD56+细胞和至少一种额外细胞类型(例如，CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD4-CD8-CD56+细胞)的混合物。在一些实施方案中，CD3+CD8+CD56+细胞还可表达一个或多个额外的细胞表面标志物。
如本文所用，术语“CD3+CD4-CD8-CD56+”可用于描述在其细胞表面上至少表达CD3、CD56和CD4-CD8-的任何细胞(例如，任何III型NKT细胞)。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞为CD3+CD4-CD8-CD56+细胞。在一些实施方案中，本文所述方法和组合物中使用的III型NKT细胞是CD3+CD4-CD8-CD56+细胞和至少一种额外细胞类型(例如，CD3+CD4+CD56+细胞、CD3+CD8+CD56+细胞)的混合物。在一些实施方案中，CD3+CD4-CD8-CD56+细胞还可表达一个或多个额外的细胞表面标志物。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可从生物样品中获得或分离。在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞可从一个或多个外周血单核细胞获得或分离。
在一些实施方案中，生物样品来自人(例如，胎儿、新生儿、儿童或成人)。在一些实施方案中，生物样品来自非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(如哺乳动物和非哺乳动物)，如小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在一些实施方案中，生物样品来自需要治疗的受试者(例如癌症患者，例如AML患者)。在一些实施方案中，生物样品来自供体(例如，健康供体)。在一些实施方案中，生物样品包括血液(例如，外周血和/或脐带血)、骨髓、淋巴结组织、脾组织、肿瘤组织、一个或多个诱导多能干细胞和/或一个或多个外周血单核细胞。在一些实施方案中，生物样品和/或血液包括外周血和/或脐带血。在一些实施方案中，通过单采和/或白细胞单采(例如，从受试者或供体)收集生物样品和/或血液。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可从人生物样品中分离。在一些实施方案中，III型NKT细胞是分离的III型NKT细胞。
如本文所用，术语“分离”是指从其源环境(例如，自然环境，如果是自然产生的)移除的材料。例如，存在于活生物体中的自然产生的多核苷酸、多肽或细胞未被分离，但与活生物体中的部分或全部共存物质分开的相同多核苷酸、多肽或细胞被分离。
本文所用的“分离细胞”是指已从其源环境的一个或多个(例如，大多数)组分(例如，细胞培养物或生物样品的组分)中鉴定和分离的细胞或细胞群(例如，III型NKT细胞或细胞群)。在一些实施方案中，进行分离以使其充分去除可能干扰细胞适合所需应用(例如，用于III型NKT细胞或细胞群的治疗用途)的组分。在一些实施方案中，进行分离以使其充分分离表达特定标志物或标志物集(例如，CD3和CD56)的细胞与表达替代标志物或标志物集的细胞。分离细胞的方法为本领域所知，包括但不限于通过阳性和/或阴性选择技术进行分离，或通过细胞分选，例如，使用抗体结合微球，使用流式细胞仪和针对细胞表面标志物的单克隆抗体混合物(cocktail)进行分离，本文描述并举例说明示例性分离和隔离技术。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可通过基于亲和力的分离方法分离或分开。在一些实施方案中，亲和分离的示例性技术可包括磁分离(例如，使用抗体包裹的磁珠)、亲和色谱、加入到单克隆抗体或与单克隆抗体结合使用的细胞毒性剂(例如，补体和细胞毒素)和“淘洗”将抗体连接到固体基质(如平板)或任何其他合适的技术。在一些实施方案中，分离技术还可包括使用荧光活化细胞分选仪，其可具有不同程度的复杂度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。应理解的是，可采用能够分离或分开III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)的任何技术。
在一些实施方案中，各种分离或分开方法中使用的亲和试剂可以是III型NKT细胞上细胞表面标志物的特定受体或配体。在一些实施方案中，抗体可与标记(label)结合，在一些实施方案中，标记可用于分离或分开。在一些实施方案中，标记可包括磁珠(例如，可允许直接分离)、生物素(例如，可通过结合例如载体的抗生物素或链霉亲和素去除)、荧光色素(例如，可与荧光活化细胞分选仪一起使用，例如藻红蛋白、荧光素、德克萨斯红或其组合)，等等。
在一些实施方案中，利用抗体的细胞分离可包括将抗体添加到细胞悬浮液中，例如，持续足以结合可用的细胞表面标志物的一段时间。培养可持续不同的时间。例如，在一些实施方案中，培养可持续约2分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟或更长。对于本发明的这一方面，可以考虑预期任何导致用抗体进行特异性标记且具有最小非特异性结合的时间长度。
在一些实施方案中，III型NKT细胞的染色强度可通过流式细胞术进行监测，例如，激光检测荧光色素的定量水平(可与抗体结合的细胞表面抗原量成比例)。在一些实施方案中，流式细胞术或FACS还可用于基于抗体染色强度以及诸如细胞大小和光散射等其他参数分离细胞群。
在一些实施方案中，III型NKT细胞基于其至少一种细胞表面标志物的表达而分离。分离的细胞可收集在维持细胞活力的任何适当培养基中。在一些实施方案中，含有细胞的培养物可含有细胞对其有反应的血清、细胞因子或生长因子。在一些实施方案中，细胞因子或生长因子可促进细胞存活、生长、功能或其组合。在一些实施方案中，细胞因子和生长因子可包括多肽和非多肽因子。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可经修饰，例如，以表达能够结合靶抗原的构建体。在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞受体模拟抗体(TCRm)或其任何组合。
在一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，可使用抗原结合域来工程化CAR，使得当CAR在细胞(例如，III型NKT细胞)上表达时，CAR和/或细胞结合靶抗原(例如，CD19或本文所述的另一示例性抗原)。在一些实施方案中，使用当前可用的实验方案，将CAR序列克隆到细胞或细胞群(例如，III型NKT细胞或III型NKT细胞群)中并进行扩增。在一些实施方案中，细胞或细胞群包含一个或多个编码CAR的多核苷酸。在一些实施方案中，细胞或细胞群来自供体或患者(例如，患有或怀疑患有癌症的患者，例如，AML或本文所述的另一示例性癌症)。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，并且当细胞或细胞群来自患者时，可将经CAR修饰的细胞或细胞给予同一患者和/或需要此类治疗的另一患者。在一些实施方案中，当用作治疗剂且当细胞或细胞群来自供体时，可将经CAR修饰的细胞或细胞群给予需要此类治疗的任何患者。
如本文所用，当用于描述细胞或细胞群时，术语“表达CAR”和“经CAR修饰”是指这样的细胞或细胞群，其经人工工程化以包含编码CAR肽序列的一个或多个多核苷酸并可转录、翻译，并在细胞表面表达CAR肽。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包括III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包括CD3+CD56+III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包括CD3+CD4+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包括CD3+CD8+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包括CD3+CD4-CD8-CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞或细胞群包含细胞的混合物，例如，CD3+CD4+CD56+和CD3+CD8+CD56+细胞的混合物或CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞的混合物。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达CAR的细胞或细胞群可包括来自受试者的经CAR修饰的NKT细胞或经CAR修饰的NKT细胞群。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达CAR的细胞或细胞群可包括来自供体的经CAR修饰的NKT细胞或经CAR修饰的NKT细胞群。
在一些实施方案中，经CAR修饰的细胞或细胞群可与表达靶抗原(例如CD19)的细胞(例如恶性癌细胞)结合并杀死它们。本文提供用于制备和给予所公开的基于CAR的免疫疗法的方法和组合物。例如，第2015/0344844和2017/0218337号美国公布文本中还公开了用于制备基于CAR的免疫疗法的示例性方法，这两种方法均通过引用并入本文以用于此类方法。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指一种多肽或一组多肽，当其由细胞表达时，为细胞提供对靶抗原表达细胞(例如恶性肿瘤细胞)的特异性以及细胞内信号。在一些实施方案中，CAR至少包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。在一些实施方案中，CAR至少包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域，其包含源自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导域。这些结构域可位于单个多肽或一组多肽中。在一些实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，共刺激分子为4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10和/或DAP12。
在一些实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域，其包含：(i)源自刺激分子的功能信号传导域；(ii)源自刺激分子的功能性信号传导域和源自共刺激分子的功能性信号传导域；或(iii)源自刺激分子的功能性信号传导域和源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导域。在一些实施方案中，CAR包含CAR融合蛋白N端的可选先导序列。在一些实施方案中，CAR进一步包含细胞外抗原结合域N端的先导序列，其中先导序列在CAR的细胞加工和定位到细胞膜期间任选地从抗原结合域切割。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体(也称为纳米体)。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)或Fab片段。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗原结合片段包含scFv。
如本文所用，术语“抗体”是指识别并结合(例如，特异性结合)靶标的任何功能性免疫球蛋白分子，如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质，或通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点的上述组合。术语“抗体”包括具有来自任何来源物种的序列的抗体，例如小鼠、兔、山羊、骆驼、羊驼、非人灵长类动物和人。该术语还包括人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和任何含有抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要其表现出所需的结合和/或生物活性。在一些实施方案中，抗体具有结合(例如，特异性结合)癌细胞上表达的靶抗原(例如，CD19)的能力。抗体可使用任何合适的技术产生，例如，重组表达、杂交瘤技术、核糖体展示、噬菌体展示、基因改组文库、半合成或全合成文库或其任何组合。术语“抗体”包括全长抗体以及其抗原结合域和抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的CAR和/或其他构建体中使用的抗体是全长或完整抗体。在一些实施方案中，本文所述的CAR和/或其他构建体中使用的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，在本文所述的CAR和/或其他构建体中使用的抗体是抗体的抗原结合域或抗原结合片段。
“全长”或“完整”抗体通常包括至少两条重(H)链和两条轻(L)链，它们通过二硫键相互连接。编码抗体链的免疫球蛋白基因的公认类别包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。在一些实施方案中，抗体包含κ轻链。在一些实施方案中，抗体包含λ轻链。κ或λ轻链可从任何物种的任何κ或λ轻链序列中选择。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们依次定义了免疫球蛋白类别，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG的四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的恒定区不同，并表现出不同的效应器功能。
可用于本文所述CAR和/或其他构建体中的抗体还包括抗原结合片段。如本文所使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个片段，其保持例如特异性结合靶抗原(例如CD19)和/或提供全长抗体的功能的能力(例如，特异性结合CD19的能力)。抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。片段也可存在于较大的大分子中，例如双特异性抗体。此类抗体片段的示例包括Fab片段，至少包含VL、CL、VH和CH1域的单价片段；F(ab)2片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；Fd片段，由VH和CH1域组成；Fv片段，由抗体单臂的VL和VH域组成；单域抗体(dAb)片段，由VH域或VL域组成；孤立的互补决定区(CDR)；和半抗体(half body)，仅由一条重链和一条轻链组成，而不是两条重链和两条轻链在独立臂上的典型配对。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法连接，例如通过人工肽接头使其成为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链可变片段(scFv))(参见，例如，Bird etal.，Science 1988；242(4877):423-6；Huston et al.，PNAS 1988；85(16):5879-83)。此类单链抗体包括一个或多个抗原结合片段或抗体的一部分。抗原结合片段的其他示例包括双特异性T细胞接合器(BiTEs)，由单个肽链上的不同抗体的两个scFv或来自四个不同基因的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，抗原结合片段为Fab片段或scFv。在一些实施方案中，抗原结合片段为scFv。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域包含细胞结合剂。在一些实施方案中，CAR的抗原结合域和/或细胞结合剂包含DARPin、Duobody、双环肽、纳米体、Centyrin、MSH(黑素细胞刺激素)、受体Fc融合分子、T细胞受体结构、天然配体(例如，在成熟的非恶性和/或恶性B细胞(包括浆细胞)中表达的受体，例如，B细胞成熟抗原(BCMA)的示例性配体包括但不限于B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL))、类固醇激素(例如雄激素或雌激素)、生长因子、集落刺激因子(例如EGF)或其他非抗体支架。在一些实施方案中，非抗体支架可大致分为两种结构类别，即域大小的化合物(约6-20kDa)和限制性肽(约2-4kDa)。示例性域大小的支架包括但不限于Affibody、Affilin、Anaticalin、Atrimer、DARPin、FN3支架(例如Adnectin和Centyrin)、Fynomers、Kunitz域、ProNectin、O-体和受体Fc融合蛋白，而示例性限制肽包括Avimer、双环肽和Cys结。在一些实施方案中，CAR的抗原结合域和/或细胞结合剂包括Affibody、Affilin、Anaticalin、Atrimer、DARPin、FN3支架(例如Adnectin或Centyrin)、Fynomer、Kunitz域、ProNectin、O-体、受体Fc融合蛋白、Avimer、双环肽和/或Cys结。非抗体支架在Vazquez-Lombardi et al.，Drug Dis Today 2015；20(10):1271-83中进行了综述。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合域能够结合CD19、IGF1R、ROR1、BCMA、CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1、LILRB4、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、EGFRvIII、EGFR、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、GPC3或PD-L1。在一些实施方案中，抗原结合域能够结合CD19、IGF1R或ROR1。
本文使用的术语“CD19”是指任何天然形式的人B淋巴细胞抗原CD19(CD19)。该术语包括全长CD19(例如，UniProt参考序列：P15391；SEQ ID NO:1)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD19。该术语还包括人CD19的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD19的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD19可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“IGF1R”是指任何天然形式的人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)。该术语包括全长IGF1R(例如，UniProt参考序列：P08069；SEQ ID NO:2)以及可由细胞加工产生的任何形式的人IGF1R。该术语还包括人IGF1R的功能性变体或片段，包括但不限于保留人IGF1R的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。IGF1R可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“ROR1”是指任何天然形式的人非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(ROR1)。该术语包括全长ROR1(例如，UniProt参考序列：Q01973；SEQ ID NO:3)以及可由细胞处理产生的任何形式的人ROR1。该术语还包括人ROR1的功能性变体或片段，包括但不限于保留人ROR1的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。ROR1可从人分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“BCMA”是指任何天然形式的人B细胞成熟抗原(BCMA)。该术语包括全长BCMA(例如，UniProt参考序列：Q02223；SEQ ID NO:4)以及可由细胞处理产生的任何形式的人BCMA。该术语还包括人BCMA的功能性变体或片段，包括但不限于保留人BCMA的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。BCMA可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“CD123”是指任何天然形式的人白细胞介素-3受体亚基α(CD123)。该术语包括全长CD123(例如，UniProt参考序列：P26951；SEQ ID NO:5)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD123。该术语还包括人CD123的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD123的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD123可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CD33”是指任何天然形式的人髓系细胞表面抗原CD33(CD33)。该术语包括全长CD33(例如，UniProt参考序列：P20138；SEQ ID NO:6)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD33。该术语还包括人CD33的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD33的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD33可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CD38”是指任何天然形式的人ADP核糖环化酶/环ADP核糖水解酶1(CD38)。该术语包括全长CD38(例如，UniProt参考序列：P28907；SEQ ID NO:7)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD38。该术语还包括人CD38的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD38的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD38可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CD138”是指任何天然形式的人syndecan-1(CD138)。该术语包括全长CD138(例如，UniProt参考序列：P18827；SEQ ID NO:8)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD138。该术语还包括人CD138的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD138的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD138可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CLL-1”是指任何天然形式的人C型凝集素样分子1(CLL-1)。该术语包括全长CLL-1(例如，UniProt参考序列：Q5QGZ9；SEQ ID NO:9)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CLL-1。该术语还包括人CLL-1的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CLL-1的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CLL-1可从人身上分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“LILRB4”是指任何天然形式的人白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员4(LILRB4)。该术语包括全长LILRB4(例如，UniProt参考序列：Q8NHJ6；SEQ ID NO:10)以及可由细胞处理产生的任何形式的人LILRB4。该术语还包括人LILRB4的功能性变体或片段，包括但不限于保留人LILRB4的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。LILRB4可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“GD2”是指任何天然形式的人神经节苷脂G2(GD2)。该术语包括全长GD2(例如，(2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)噁烷-2-基]氧基-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-二羟基-2-(羟基甲基)-6-[(E)-3-羟基-2-(十八酰基氨基)十八-4-烯氧基]噁烷-3-基]氧基-3-羟基-6-(羟基甲基)噁烷-4-基]氧基-3-氨基-6-羧基-4-羟基噁烷-2-基]-2,3-二羟基丙氧基]-5-氨基-4-羟基-6-(1,2,3-三羟基丙基)噁烷-2-羧酸，以及可由细胞加工产生的任何形式的人GD2。该术语还包括保留人GD2的一个或多个生物功能的人GD2的功能变体、片段或类似物(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型神经节苷脂，否则包含变体、片段和类似物)。GD2可从人分离，也可通过合成方法生产。
本文使用的术语“CD20”是指任何天然形式的人B淋巴细胞抗原CD20(CD20)。该术语包括全长CD20(例如，UniProt参考序列：P11836；SEQ ID NO:11)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD20。该术语还包括人CD20的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD20的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD20可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CD22”是指任何天然形式的人B细胞受体CD22(CD22)。该术语包括全长CD22(例如，UniProt参考序列：P20273；SEQ ID NO:12)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD22。该术语还包括人CD22的功能性变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人CD22的一个或多个生物功能的亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD22可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“CD30”是指任何天然形式的人肿瘤坏死因子受体超家族成员8(CD30)。该术语包括全长CD30(例如，UniProt参考序列：P28908；SEQ ID NO:13)以及可由细胞处理产生的任何形式的人CD30。该术语还包括人CD30的功能性变体或片段，包括但不限于保留人CD30一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。CD30可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“MSLN”指任何天然形式的人间皮素(MSLN)。该术语包括全长MSLN(例如，UniProt参考序列：Q13421；SEQ ID NO:14)以及可由细胞处理产生的任何形式的人MSLN。该术语还包括人MSLN的功能性变体或片段，包括但不限于保留人MSLN的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。MSLN可以从人分离，也可以通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“EGFRvIII”是指任何天然形式的人表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)。该术语包括全长EGFRvIII(例如，UniProt参考序列：P00533-3；SEQ ID NO:15)以及可由细胞处理产生的任何形式的人EGFRvIII。该术语还包括人EGFRvIII的功能性变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人EGFRvIII的一种或多种生物功能的亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。EGFRvIII可从人身上分离，或可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“EGFR”是指任何天然形式的人表皮生长因子受体(EGFR)。该术语包括全长EGFR(例如，UniProt参考序列：P00533；SEQ ID NO:16)以及可由细胞处理产生的任何形式的人EGFR。该术语还包括人EGFR的功能性变体或片段，包括但不限于保留人EGFR的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。EGFR可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“HER2”是指任何天然形式的人表皮生长因子受体2(HER2)。该术语包括全长HER2(例如，UniProt参考序列：P04626；SEQ ID NO:17)以及可由细胞处理产生的任何形式的人HER2。该术语还包括人HER2的功能性变体或片段，包括但不限于保留人HER2的一个或多个生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。HER2可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“MUC1”是指任何天然形式的人粘蛋白-1(MUC1)。该术语包括全长MUC1(例如，UniProt参考序列：P15941；SEQ ID NO:18)以及可由细胞处理产生的任何形式的人MUC1。该术语还包括人MUC1的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人MUC1的一个或多个生物功能的亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。MUC1可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
本文中使用的术语“EPCAM”是指任何天然形式的人上皮细胞粘附分子(EPCAM)。该术语包括全长EPCAM(例如，UniProt参考序列：P16422；SEQ ID NO:19)以及可由细胞处理产生的任何形式的人EPCAM。该术语还包括人EPCAM的功能变体或片段，包括但不限于保留人EPCAM的一个或多个生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。EPCAM可从人分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“PSMA”是指任何天然形式的人蛋白酶体亚基α-1型(PSMA)。该术语包括全长PSMA(例如，UniProt参考序列：P25786；SEQ ID NO:20)以及可由细胞处理产生的任何形式的人PSMA。该术语还包括人PSMA的功能性变体或片段，包括但不限于保留人PSMA的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。PSMA可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“SLAMF7”是指人SLAM家族成员7(SLAMF7)的任何原生形式。该术语包括全长SLAMF7(例如，UniProt参考序列：Q9NQ25；SEQ ID NO:21)以及可由细胞处理产生的任何形式的人SLAMF7。该术语还包括人SLAMF7的功能性变体或片段，包括但不限于保留人SLAMF7的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。SLAMF7可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“GPC3”是指任何天然形式的人glypican-3(GPC3)。该术语包括全长GPC3(例如，UniProt参考序列：P51654；SEQ ID NO:22)以及可由细胞处理产生的任何形式的人GPC3。该术语还包括人GPC3的功能性变体或片段，包括但不限于保留人GPC3的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。GPC3可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文中使用的术语“PD-L1”是指任何天然形式的人程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)。该术语包括全长PD-L1(例如，UniProt参考序列：Q9NZQ7；SEQ ID NO:23)以及可由细胞处理产生的任何形式的人PD-L1。该术语还包括人PD-L1的功能性变体或片段，包括但不限于保留人PD-L1的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。PD-L1可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导域包含至少一个刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一个共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，TCR可使用抗原结合α链和/或β链进行工程化，使得当TCR在细胞(例如，III型NKT细胞)上表达时，TCR和/或细胞结合靶抗原(例如，WT1或本文所述的另一示例性抗原)。在一些实施方案中，使用当前可用的实验方案将TCR序列克隆到细胞或细胞群(例如，III型NKT细胞或III型NKT细胞群)中并进行扩增。在一些实施方案中，细胞或细胞群包含一个或多个编码TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，细胞或细胞群来自供体或患者(例如，患有或怀疑患有癌症的患者，例如，AML或本文所述的另一示例性癌症)。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，并且当细胞或细胞群来自患者时，可将经TCR修饰的细胞或细胞群给予同一患者和/或需要此类治疗的另一患者。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，并且当细胞或细胞群来自供体时，可将经TCR修饰的细胞或细胞群给予需要此类治疗的任何患者。
如本文所用，当用于描述细胞或细胞群时，术语“表达TCR”和“经TCR修饰”是指这样的细胞或细胞群，其经人工工程化以包含编码TCR肽序列的一个或多个多核苷酸且可转录、翻译，并在细胞表面表达TCR肽。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包括III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包括CD3+CD56+III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包括CD3+CD4+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包括CD3+CD8+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包括CD3+CD4-CD8-CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCR的细胞或细胞群包含细胞的混合物，例如，CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞的混合物。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达TCR的细胞或细胞群可包括来自受试者的经TCR修饰的NKT细胞或经TCR修饰的NKT细胞群。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达TCR的细胞或细胞群可包括来自供体的经TCR修饰的NKT细胞或经TCR修饰的NKT细胞群。
在一些实施方案中，经TCR修饰的细胞或细胞群可结合表达靶抗原(例如WT1)的细胞(例如恶性癌细胞)并杀死它们。本文提供用于制备和给予所公开的基于TCR的免疫疗法的方法和组合物。例如，第9115372号美国专利中还公开了用于制备基于TCR的免疫疗法的示例性方法，其通过引用并入本文以用于此类方法。
本文中使用的术语“T细胞受体”和“TCR”是指多肽或一组多肽，当其由细胞表达时，为细胞提供对靶抗原表达细胞(例如恶性肿瘤细胞)的特异性以及细胞内信号。在一些实施方案中，TCR至少包括α链和β链。这些链可位于单个多肽或一组多肽中。在一些实施方案中，α链和/或β链能够结合抗原。
在一些实施方案中，TCR包括α链和β链。在一些实施方案中，α链和β链均包括恒定区(c)和可变区(v)。在一些实施方案中，可变区决定抗原特异性。在一些实施方案中，可变区识别靶抗原，例如，抗原配体，其包含由主要组织相容性复合体(MHC)分子(也称为人白细胞抗原(HLA)分子)递呈在靶细胞上的蛋白质的短连续氨基酸序列。在一些实施方案中，还涉及由T细胞表达的辅助粘附分子，例如用于II类MHC的CD4和用于I类MHC的CD8。在一些实施方案中，TCR的信号转导通过相关的不变CD3复合物。在一些实施方案中，CD3复合物包含形成两个异二聚体(CD3δε和CD3γε)和一个同源二聚体(CD3ζζ)的不同CD3蛋白质。
在一些实施方案中，TCR的α链和/或β链能够结合抗原。在一些实施方案中，α链和/或β链能够结合NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。
本文使用的术语“NY-ESO-1”指任何天然形式的人癌症/睾丸抗原NY-ESO-1(NY-ESO-1)。该术语包括全长NY-ESO-1(例如，UniProt参考序列：P78358；SEQ ID NO:24)以及可由细胞处理产生的任何形式的人NY-ESO-1。该术语还包括人NY-ESO-1的功能性变体或片段，包括但不限于保留人NY-ESO-1的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。NY-ESO-1可从人中分离，或可通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语“WT1”是指任何天然形式的人肾母细胞瘤蛋白(WT1)。该术语包括全长WT1(例如，UniProt参考序列：P19544；SEQ ID NO:25)以及可由细胞处理产生的任何形式的人WT1。该术语还包括人WT1的功能变体或片段，包括但不限于保留人WT1的一个或多个生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。WT1可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
本文使用的术语“MAGE-A3”是指任何天然形式的人黑色素瘤相关抗原3(MAGE-A3)。该术语包括全长MAGE-A3(例如，UniProt参考序列：P43357；SEQ ID NO:26)以及可由细胞处理产生的任何形式的人MAGE-A3。该术语还包括人MAGE-A3的功能变体或片段，包括但不限于保留人MAGE-A3的一种或多种生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。MAGE-A3可从人分离，也可通过重组或合成方法生产。
在一些实施方案中，III型NKT细胞经修饰以表达T细胞受体模拟抗体(TCRm)。在一些实施方案中，TCRm可使用抗原结合域进行工程化，使得当TCRm在细胞(例如，III型NKT细胞)上表达时，TCRm和/或细胞结合靶抗原(如本文所述例如，复合抗原，例如，包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子的复合抗原)。在一些实施方案中，使用当前可用的实验方案将TCRm序列克隆到细胞或细胞群(例如，III型NKT细胞或III型NKT细胞群)中并进行扩增。在一些实施方案中，细胞或细胞群包含一个或多个编码TCRm的多核苷酸。在一些实施方案中，细胞或细胞群来自供体或患者(例如，患有或怀疑患有癌症的患者，例如，AML或本文所述的另一示例性癌症)。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，并且当细胞或细胞群来自患者时，可将经TCRm修饰的细胞或细胞群给予同一患者和/或需要此类治疗的另一患者。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，并且当细胞或细胞群来自供体时，可将经TCRm修饰的细胞或细胞群给予需要此类治疗的任何患者。
如本文所用，当用于描述细胞或细胞群时，术语“表达TCRm”和“经TCRm修饰”是指这样的细胞或细胞全，其经人工工程化以包含编码TCRm肽序列的一个或多个多核苷酸且可转录、翻译，并在细胞表面表达TCRm肽。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包括III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包括CD3+CD56+III型NKT细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包括CD3+CD4+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包括CD3+CD8+CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包括CD3+CD4-CD8-CD56+细胞或细胞群。在一些实施方案中，表达TCRm的细胞或细胞群包含细胞的混合物，例如，CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+和CD3+CD4-CD8-CD56+细胞的混合物。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达TCRm的细胞或细胞群可包括来自受试者的经TCRm修饰的NKT细胞或经TCRm修饰的NKT细胞群。在一些实施方案中，当用作治疗剂时，给予受试者的表达TCRm的细胞或细胞群可包括来自供体的经TCRm修饰的NKT细胞或经TCRm修饰的NKT细胞群。
在一些实施方案中，经TCRm修饰的细胞或细胞群可结合表达靶抗原(如本文所述,例如，复合抗原，例如，包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子的复合抗原)的细胞(例如，恶性癌细胞)并杀死它们。本文提供用于制备和给予所公开的基于TCRm的免疫疗法的方法和组合物。例如，第2019/092876号美国公布文本中还公开了用于制备基于TCRm的免疫疗法的示例性方法，其通过引用并入本文以用于此类方法。
本文中使用的术语“T细胞受体模拟抗体”和“TCRm”是指多肽或一组多肽，当其由细胞表达时，为细胞提供对靶抗原表达细胞(例如恶性肿瘤细胞)的特异性以及细胞内信号。在一些实施方案中，TCRm至少包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。在一些实施方案中，TCRm至少包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域，其包含源自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导域。这些结构域可位于单个多肽或一组多肽中。在一些实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，共刺激分子为4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10和/或DAP12。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)或Fab片段。在一些实施方案中，抗原结合域和/或抗原结合片段包含scFv。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域包含细胞结合剂。在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域和/或细胞结合剂包含DARPin、Duobody、双环肽、纳米体、Centyrin、MSH(黑素细胞刺激素)、受体Fc融合分子、T细胞受体结构、天然配体(例如，在成熟的非恶性和/或恶性B细胞(包括浆细胞)中表达的受体，例如，B细胞成熟抗原(BCMA)的示例性配体包括但不限于B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL))、类固醇激素(例如雄激素或雌激素)，生长因子，集落刺激因子(如EGF)，或其他非抗体支架。在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域和/或细胞结合剂包含Affibody、Affilin、Anticalin、Atrimer、DARPin、FN3支架(例如Adnectin或Centyrin)、Fynomer、Kunitz域、ProNectin、O体、受体Fc融合蛋白、Avimer、双环肽和/或Cys结。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域能够结合包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子的复合抗原。
在一些实施方案中，HLA分子为I类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是I类HLA结合肽。在一些实施方案中，I类HLA结合肽的长度约为9或10个氨基酸。示例性I类HLA结合肽包括但不限于：NY-ESO-1衍生的HLA-A*0201结合肽SLLMWITQC(SEQ ID NO:29)；NY-ESO-1衍生的HLA-A*0201结合肽SLLMWITQV(SEQ ID NO:30)；WT1衍生的HLA-A*0201结合肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:31)；MAGE-A3衍生的HLA-A*0201结合肽KVAELVHFL(SEQ ID NO:32)；MAGE-A3衍生的HLA-A*0201结合肽EVDPIGHLY(SEQ ID NO:33)；MAGE-A4衍生的HLA-A*2402结合肽NYKRCFPVI(SEQ ID NO:34)；MART-1衍生的HLA-A*0201结合肽AAGIGILTV(SEQ IDNO:35)；和HPV E7衍生的HLA-A*0201结合肽YMDLQPET(SEQ ID NO:36)。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域能够结合包含HLA分子的复合抗原，HLA分子具有以下氨基酸序列：SLLMWITQC(SEQ ID NO:29)；SLLMWITQV(SEQ ID NO:30)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO:31)；KVAELVHFL(SEQ ID NO:32)；EVDPIGHLY(SEQ ID NO:33)；NYKRCFPVI(SEQ ID NO:34)；AAGIGILTV(SEQ ID NO:35)；和/或YMDLQPET(SEQ ID NO:36)。
在一些实施方案中，HLA分子为II类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是II类HLA结合肽。在一些实施方案中，II类HLA结合肽的长度约为13至25个氨基酸。示例性II类HLA结合肽包括但不限于：NY-ESO-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽LKEFTVSGNILTIRL(SEQ IDNO:37)；NY-ESO-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽LPVPGVLLKEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:38)；MAGE-A3衍生的HLA-DRB1*1101结合肽TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:39)；和MART-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR(SEQ ID NO:40)。
在一些实施方案中，TCRm的抗原结合域能够结合包含HLA分子的复合抗原，HLA分子具有以下氨基酸序列：LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:37)；LPVPGVLLKEFTVSGNILTI(SEQID NO:38)；TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:39)；和/或RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR(SEQ IDNO:40)。
除HLA分子外，在一些实施方案中，复合抗原包含肽。在一些实施方案中，肽包含AFP肽。在一些实施方案中，复合抗原包含AFP肽和HLA-A2分子。
本文使用的术语“AFP”或“AFP肽”是指任何天然形式的人甲胎蛋白(AFP)。该术语包括全长AFP(例如，UniProt参考序列：P02771；SEQ ID NO:27)以及可由细胞处理产生的任何形式的人AFP。该术语还包括人AFP的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留人AFP的一个或多个生物功能的亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。AFP可从人分离，也可通过重组或合成方法产生。
在一些实施方案中，肽包含优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)肽。在一些实施方案中，PRAME肽包含ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复合抗原包含PRAME肽和HLA-A*0201分子。
本文中使用的术语“PRAME”或“PRAME肽”是指任何天然形式的人优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)。该术语包括全长PRAME(例如，UniProt参考序列：P78395；SEQ ID NO:28)以及可由细胞处理产生的任何形式的人PRAME。该术语还包括人PRAME的功能变体或片段，包括但不限于保留人PRAME的一个或多个生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。PRAME可从人分离，也可通过重组或合成方法生产。
在一些实施方案中，肽包含WT1肽。在一些实施方案中，复合抗原包含WT1肽和HLA-A2分子。
本文中使用的术语“WT1”或“WT1肽”指任何天然形式的人肾母细胞瘤蛋白(WT1)。该术语包括全长WT1(例如，UniProt参考序列：P19544；SEQ ID NO:25)以及可由细胞处理产生的任何形式的人WT1。该术语还包括人WT1的功能变体或片段，包括但不限于保留人WT1的一个或多个生物功能的剪接变体、等位基因变体和亚型(即，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白质，否则包含变体和片段)。WT1可从人身上分离，也可通过重组或合成方法生产。
在一些实施方案中，TCRm的细胞内信号传导域包含至少一个刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链。在一些实施方案中，至少一种刺激分子包含CD3ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导域还包括至少一个共刺激分子的功能性信号传导域。在一些实施方案中，至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
在一些实施方案中，本发明的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)进一步经修饰以包含外源性细胞因子、生长因子、抗体或抗原结合片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含双特异性T细胞接合器(BiTE)。
表1.示例性靶抗原氨基酸序列
Figure BDA0003513318790000441
Figure BDA0003513318790000451
Figure BDA0003513318790000461
Figure BDA0003513318790000471
Figure BDA0003513318790000481
Figure BDA0003513318790000491
Figure BDA0003513318790000501
Figure BDA0003513318790000511
Figure BDA0003513318790000521
Figure BDA0003513318790000531
Figure BDA0003513318790000541
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Figure BDA0003513318790000561
治疗方法、用途和组合物
本文所述的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)可用于各种治疗和预防应用。例如，在一些实施方案中，本文所述的III型NKT细胞可用于治疗或预防癌症。本文所述的III型NKT细胞可以其本身或以任何合适的药物组合物给予。
因此，在某些方面，本发明提供通过向受试者给予治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法。在某些方面，本发明进一步提供如下制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的疗法的方法：(a)从生物样品中分离一个或多个III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)；和(b)在生长培养基中培养所述一个或多个细胞以产生扩增的细胞群。在某些方面，本发明还提供通过向受试者给予治疗有效量的扩增细胞群(例如，包含III型NKT细胞的扩增细胞群(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞))治疗或预防有需要的受试者癌症的方法，如本文所述和/或通过本文所述方法制备)。还提供所公开的III型NKT细胞的用途，例如用于治疗或预防癌症。还公开了包含治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)的药物组合物，其可用于本文提供的治疗方法和用途。
示例性实施方案是治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，或给予包含治疗有效量的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一个示例性实施方案是制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的疗法的方法，包括：(a)从生物样品中分离一个或多个III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)；和(b)在生长培养基中培养所述一个或多个细胞以产生扩增的细胞群。
另一示例性实施方案是治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的扩增细胞群(例如，包含III型NKT细胞的扩增细胞群(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，如本文所述和/或通过本文所述方法制备)，或包含治疗有效量的扩增细胞群(例如，包含III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，如本文所述和/或通过本文所述方法制备)和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一示例性实施方案是分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)，其用于治疗或预防有需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，该用途包括向受试者给予治疗有效量的细胞或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一示例性实施方案是使用分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)治疗或预防有需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，该用途包括向受试者给予治疗有效量的细胞或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一个示例性实施方案是分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)在制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，药物包含治疗有效量的细胞，或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所用，术语“治疗”及其同源词指疾病、病症或状况(例如癌症)或其至少一种可识别症状的改善。术语“治疗”包括但不限于癌症的一个或多个症状的完全治疗或完全改善。在一些实施方案中，“治疗”是指至少一个可测量物理参数的至少部分改善，不一定是受试者可辨别的。在一些实施方案中，“治疗”指在物理上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或两者中抑制疾病、病症或状况的进展。在一些实施方案中，“治疗”指减缓疾病、病症或状况的进展或逆转其进展。如本文所用，“治疗”及其同源词还包括延迟特定疾病、病症或状况的发作或降低获得特定疾病、病症或状况的风险。在一些实施方案中，“治疗”是指向怀疑患有疾病、病症或状况(例如，癌症或癌前状况)的受试者给予本文公开的III型NKT细胞、细胞群或组合物。在一些实施方案中，受试者和/或来自怀疑患有癌症和/或癌前疾病的受试者的样本可包括一个或多个异常、恶性和/或癌前细胞。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，是指需要治疗的任何人或非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)。哺乳动物的非限制性示例包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在一些实施方案中，受试者是人。
本文使用的术语“供体”是指捐献生物样本(例如血液样本)用于需要治疗的受试者和/或用于为需要治疗的受试者准备疗法(例如本文公开的III型NKT细胞疗法)的任何人或非人动物。在一些实施方案中，供体是人。
本文使用的术语“癌症”是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，如不受控制的增殖、永生化、转移潜能、快速生长和增殖率和/或某些形态特征。癌细胞可呈肿瘤或肿块的形式，但这些细胞可单独存在于受试者体内，也可作为独立细胞在血流中循环，如白血病或淋巴瘤细胞。术语“癌症”包括所有类型的癌症和癌转移，包括血液系统恶性肿瘤、实体瘤、肉瘤、癌瘤以及其他实体和非实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。在一些实施方案中，癌症是AML。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性癌症(例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性AML。在一些实施方案中，癌症表达靶抗原。
本文使用的术语“靶抗原”是指III型NKT细胞和/或III型NKT细胞表达的构建体(例如，CAR、TCR或TCRm)靶向的任何抗原。如本文所用，术语“抗原”与“抗原决定簇”和“表位”同义，是指抗原结合部分(例如，CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)与之结合形成抗原结合部分抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如，氨基酸的连续延伸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)。有用的抗原决定簇可见于例如癌细胞内或表面上、经病毒感染的细胞内或表面上、其他病变的细胞内或表面上、游离于血清中/或细胞外基质(ECM)中。
本文公开了示例性靶抗原，包括但不限于CD19、IGF1R、ROR1、BCMA、CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1、LILRB4、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、EGFRvIII、EGFR、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、GPC3、PD-L1、NY-ESO-1、WT1和MAGE-A3。靶抗原可包括全长抗原(例如，本文公开的任何示例性抗原)以及可由细胞处理产生的任何形式的抗原。靶抗原还包含抗原的功能性变体或片段(例如，本文公开的任何示例性抗原)，包括但不限于剪接变体、等位基因变体和保留抗原的一个或多个生物功能的亚型(即，除非上下文指示该术语仅用于指野生型抗原，否则包含变体和片段)。在一些实施方案中，靶抗原是全长抗原的功能片段。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为CD19。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合CD19。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD19的癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症为B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为ROR1。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合ROR1。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达ROR1的癌症。在一些实施方案中，癌症为尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤或卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为BCMA。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合BCMA。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达BCMA的癌症。在一些实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的(例如，难治性或复发性多发性骨髓瘤)。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1或LILRB4。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1或LILRB4。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD123的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD33的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD38的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD138的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CLL-1的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达LILRB4的癌症。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的(例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症是复发性AML，例如在造血干细胞移植后。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为EGFRvIII或EGFR。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合EGFRvIII或EGFR。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达EGFRvIII的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达EGFR的癌症。在一些实施方案中，癌症为胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为GPC3。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合GPC3。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达GPC3的癌症。在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为NY-ESO-1。在一些实施方案中，NY-ESO-1由HLA分子递呈，例如HLA-A*0201分子。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合NY-ESO-1。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达NY-ESO-1的癌症。在一些实施方案中，癌症为神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为WT1。在一些实施方案中，WT1由HLA分子递呈，例如HLA-A2分子。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合WT1。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达WT1的癌症。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的(例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症是复发性AML，例如在造血干细胞移植后。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，靶抗原为IGF1R、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、PD-L1或MAGE-A3。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合域(例如，NKT细胞表达的CAR或TCRm的抗原结合域)能够结合IGF1R、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、PD-L1或MAGE-A3。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达IGF1R的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达GD2的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD20的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD22的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达CD30的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达MSLN的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达HER2的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达MUC1的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达EPCAM的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达PSMA的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达SLAMF7的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达PD-L1的癌症。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达MAGE-A3的癌症。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
示例性靶抗原还包括复合抗原(例如，包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子的复合抗原)。在一些实施方案中，靶抗原是包含肽和HLA分子的复合抗原
在一些实施方案中，HLA分子为I类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是I类HLA结合肽。在一些实施方案中，I类HLA结合肽的长度约为9或10个氨基酸。本文公开了示例性I类HLA结合肽，包括但不限于：NY-ESO-1衍生的HLA-A*0201结合肽SLLMWITQC(SEQ ID NO:29)；NY-ESO-1衍生的HLA-A*0201结合肽SLLMWITQV(SEQ ID NO:30)；WT1衍生的HLA-A*0201结合肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:31)；MAGE-A3衍生的HLA-A*0201结合肽KVAELVHFL(SEQ IDNO:32)；MAGE-A3衍生的HLA-A*0201结合肽EVDPIGHLY(SEQ ID NO:33)；MAGE-A4衍生的HLA-A*2402结合肽NYKRCFPVI(SEQ ID NO:34)；MART-1衍生的HLA-A*0201结合肽AAGIGILTV(SEQID NO:35)；和HPV E7衍生的HLA-A*0201结合肽YMDLQPET(SEQ ID NO:36)。在一些实施方案中，HLA分子包含SLLMWITQC(SEQ ID NO:29)；SLLMWITQV(SEQ ID NO:30)；RMFPNAPYL(SEQID NO:31)；KVAELVHFL(SEQ ID NO:32)；EVDPIGHLY(SEQ ID NO:33)；NYKRCFPVI(SEQ IDNO:34)；AAGIGILTV(SEQ ID NO:35)；和/或YMDLQPET(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HLA分子为II类HLA分子。在一些实施方案中，HLA分子是II类HLA结合肽。在一些实施方案中，II类HLA结合肽的长度约为13至25个氨基酸。本文公开了示例性II类HLA结合肽，包括但不限于：NY-ESO-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:37)；NY-ESO-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽LPVPGVLLKEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:38)；MAGE-A3衍生的HLA-DRB1*1101结合肽TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:39)；和MART-1衍生的HLA-DRB1*0401结合肽RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中，HLA分子包含LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:37)；LPVPGVLLKEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:38)；TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:39)；和/或RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽包含AFP肽。在本文所述方法和用途的一些实施方案中，复合抗原包含AFP肽和HLA分子，例如HLA-A2分子。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合包含AFP肽和HLA分子(例如HLA-A2分子)的复合抗原。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达复合抗原的癌症。在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在一些实施方案中，肽包含PRAME肽。在一些实施方案中，PRAME肽包含ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。在本文所述方法和用途的一些实施方案中，复合抗原包含PRAME肽和HLA分子，例如HLA-A*0201分子。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合包含PRAME肽和HLA分子(例如，HLA-A*0201分子)的复合抗原。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达复合抗原的癌症。在一些实施方案中，癌症为B-ALL、AML、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠腺癌或乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的。
在一些实施方案中，肽包含WT1肽。在本文所述方法和用途的一些实施方案中，复合抗原包含WT1肽和HLA分子，例如HLA-A2分子。在一些实施方案中，NKT细胞和/或抗原结合部分(例如，由NKT细胞表达的CAR、TCR或TCRm的抗原结合部分)能够结合包含WT1肽和HLA分子(例如，HLA-A2分子)的复合抗原。在一些实施方案中，NKT细胞或相关组合物可用于治疗或预防表达复合抗原的癌症。在一些实施方案中，癌症为AML。在一些实施方案中，癌症是难治的或复发的(例如，难治性或复发性AML)。在一些实施方案中，癌症是复发性AML，例如在造血干细胞移植后。
在本文所述方法和用途的一些实施方案中，NKT细胞被配制和/或用作药物组合物。相应地，在某些方面，本发明提供包含分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)的药物组合物。示例性实施方案是一种药物组合物，例如用于治疗或预防有需要的受试者的癌症，其包含分离的III型NKT细胞(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞)。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。药物组合物还可包含一种或多种适合于治疗或预防例如癌症的额外治疗剂(例如，抗癌剂、用于治疗的特定癌症的标准护理剂等)。药物组合物还可包含一种或多种非活性载体、赋形剂和/或稳定剂组分等。本领域已知药物组合物的配制方法和合适的制剂(例如，用于静脉内、全身或其他给药模式)(参见，例如"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA)。适当的制剂可能取决于给药途径。
如本文所用,“药物组合物”是指NKT细胞或细胞群(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞或细胞群)的制剂，并且任选包含适于给予受试者的一种或多种额外组分，例如生理上可接受的载体和/或赋形剂。本文提供的药物组合物呈这样的形式：允许给药并随后提供活性成分的预期生物活性和/或实现治疗效果。本文提供的药物组合物不包含对将给予该制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”和“生理上可接受的载体”可互换使用，是指不会对受试者造成显著刺激且不会消除所给予的组合物中NKT细胞或细胞群或任何额外治疗剂的生物活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物和/或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可选择载体以最小化受试者的不良副作用和/或最小化活性成分的降解。这些制剂中的任何一种也可包括佐剂。
如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。例如，用于肠外给药的制剂可含有辅料，例如无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂(包括例如聚山梨酯20)。包括在本发明的药物组合物中的某些组分可被视为药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物可通过本领域已知的多种方法给药。根据所需结果，给药途径和/或方式可能有所不同。在一些实施方案中，给药为肿瘤内、脑室内、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮。在一些实施方案中，药学上可接受的载体适于肿瘤内、脑室内、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或输注)。
NKT细胞或细胞群(例如，CD3+CD56+III型NKT细胞或细胞群)可单独给药或与至少一种额外治疗剂(例如，抗癌剂、治疗特定癌症的标准护理剂等)组合给药，并可以任何可接受的剂型、剂量或剂量方案给药。当与额外治疗剂组合给药时，可根据其标准剂量和/或剂量方案给予额外治疗剂。或者，与标准剂量和/或剂量方案相比，可以更高或更低的量和/或频率给予额外治疗剂。在一些实施方案中，以较低的量和/或频率给予额外治疗剂。
如本文所用，术语“试剂/药剂(agent)”指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。术语“治疗剂”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。本文所述NKT细胞和细胞群是示例性治疗剂。额外治疗剂(例如，可与本文所述NKT细胞或细胞群联合给药的那些)可包括适合于所治疗的特定适应症(例如癌症)的任何活性成分，例如具有互不产生不利影响的互补活性的活性成分。
在本发明的药物组合物中通常使用治疗有效剂量的NKT细胞或细胞群。NKT细胞或细胞群可通过本领域已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
可调整NKT细胞或细胞群单独或与至少一种额外治疗剂组合的剂量方案，以提供最佳期望响应(例如，治疗性响应)。例如，一次可使用一种或两种药剂的单次剂量(singlebolus)，在预定时间段内可使用若干分剂量，或一种或两种药剂的剂量可按比例减少或增加，如治疗情况的迫切性所示。对于任何特定受试者，可根据个人需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整具体的剂量方案。肠胃外组合物可以剂量单位形式配制，以便于给药和剂量均匀性。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含经计算以产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药学上可接受的载体。
包含NKT细胞或细胞群和/或任何额外治疗剂的组合物的剂量值可基于活性剂的独特特性和要实现的特定治疗效果来选择。医生或兽医可在低于达到预期治疗效果所需水平的水平开始使用药物组合物中所用的NKT细胞或细胞群，并逐渐增加剂量，直到达到预期效果。一般而言，用于治疗癌症的本发明组合物的有效剂量可因许多不同因素而异，包括给药方式、靶点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、其他药物的给药，以及治疗是预防性的还是治疗性的。所选剂量水平还可取决于多种药动学因素，包括所用本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的受试者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。可滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。
如本文所用，术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指这样的量，该量足以可测量地减少至少一种与医疗状况或疾病相关的症状或可测量参数，使导致特定身体功能损害的疾病或病症中的身体功能正常化，或改善疾病的一个或多个临床测量参数，或减缓疾病的一个或多个临床测量参数的进展。例如，治疗有效量可足以治疗、预防、降低严重程度、延迟发病和/或降低癌症的一个或多个症状的发生风险。治疗有效量以及治疗有效给药频率可通过本领域已知并在此讨论的方法来确定。在本文所述组合物和方法的一些实施方案中，以当作为单一药剂给药时治疗有效的量给予NKT细胞或细胞群。在一些其它实施方案中，以当药剂组合使用时治疗有效的量各自给予NKT细胞或细胞群和至少一种额外治疗剂。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量是杀死受试者中的癌细胞群或其一部分所需的量。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量是减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增所需的量。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量是减少或减缓受试者中肿瘤生长所需的量。
在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量为约1x107至约5x109个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量为约1x107、约2x107、约3x107、约4x107、约5x107、约6x107、约7x107、约8x107或约9x107个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量为约1x108、约2x108、约3x108、约4x108、约5x108、约6x108、约7x108、约8x108或约9x108个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量为约1x109、约2x109、约3x109、约4x109或约5x109个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量小于约1x107个细胞。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群的治疗有效量大于约5x109个细胞。在一些实施方案中，一次向受试者给予细胞、细胞群或药物组合物。在一些实施方案中，在多个场合(例如，每小时、每天、每周、每两周、每月或每年)向受试者给予细胞、细胞群或药物组合物。
本文所述NKT细胞或细胞群的治疗有效剂量通常提供治疗益处而不引起实质性毒性。NKT细胞或细胞群的毒性和治疗效果可通过标准药学操作确定，例如在细胞培养或动物模型中。细胞培养测定和动物研究可用于确定LD50(致群体的50％死亡的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50之比。在一些实施方案中，NKT细胞或细胞群展现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于调配适合人使用的剂量范围。在一些实施方案中，剂量位于循环浓度范围内，循环浓度包括毒性最小或无毒性的ED50。剂量可在该范围内根据各种因素而变化，例如，所使用的剂型、所使用的给药途径、受试者的状况等。主治医师可根据受试者的情况选择确切的制剂、给药途径和剂量。
在一些实施方案中，一次性给予NKT细胞、细胞群或药物组合物。在一些实施方案中，多次给予NKT细胞、细胞群或药物组合物。单次剂量之间的间隔可以是，例如，每小时、每天、每周、每两周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，基于受试者中给药药剂(例如NKT细胞或细胞群)的测量水平，以维持相对一致的药剂浓度。NKT细胞或细胞群的给药剂量和频率也可因治疗是预防性还是治疗性的而异。在预防性应用中，可在较长时间内以相对不频繁的间隔给予相对较低的剂量。一些受试者可能在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较高的剂量和相对较短的间隔，直到疾病进展减少或终止，和/或直到受试者的一个或多个疾病症状部分或完全改善。此后，可给予受试者较低的剂量方案，例如预防性剂量方案。
在一些实施方案中，还提供用于本文所述的治疗性和预防性应用的试剂盒和制品。在一些实施方案中，本发明提供包含NKT细胞或细胞群的试剂盒或制品。在一些实施方案中，试剂盒或制品还包括一种或多种额外组分，包括但不限于：使用说明；其他试剂，例如治疗剂(例如抗癌剂)；用于制备NKT细胞或细胞群供给药的装置、容器或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者给予NKT细胞或细胞群的装置、容器或其他材料。使用说明可包括治疗性应用指南，包括建议剂量和/或给药方式，例如，在患有或怀疑患有癌症的受试者中。在一些实施方案中，试剂盒包含NKT细胞或细胞群，以及关于在治疗和/或预防癌症中使用NKT细胞或细胞群的说明。
实施例
以下实施例提供本发明的说明性实施方案。所提供的实施例不以任何方式限制本公开。
材料和方法
细胞培养：除SaOS2-hfflucN(骨肉瘤)、Rh30-hfflucN(肺泡横纹肌肉瘤)和TC71-hfflucN(尤文氏肉瘤)细胞系外，K562(红白血病)、K562CD19(CD19转染的K562)、Daudi(B细胞伯基特淋巴瘤)、Raji(B细胞伯基特淋巴瘤)、Nalm-6(B细胞前体白血病)、HL-60(急性髓系白血病、AML)、HL-60mx(米托蒽醌耐药选择株)、KG-1(AML)、Molm-13(AML)、Molm-14(AML)、MV4:11(AML)、THP-1(AML)，U937(AML)及其荧光素酶表达对应物均保存在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。如前所述，SaOS2-hfflucN、Rh30-hfflucN和TC71-hfflucN是表达人源化萤火虫荧光素酶和ΔNGFR的慢病毒转导细胞系(Huang et al.,Mol Ther.2008；16(3):580-9；Huang et al.,PLoS ONE.2015；10(7):e0133152)。
DNT细胞分离和培养：如前所述，双阴性T细胞(DNT)通过使用去除CD4和CD8的鸡尾酒试剂(Stemcell Technologies)从PBMC中去除CD4+和CD8+细胞进行分离，并在抗CD3抗体包被的培养板(OKT3；5μg/mL)中于补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素和链霉素的RPMI 1640(人T细胞培养基)和250IU/mL IL-2(Proleukin,NovartisPharmaceuticals)中培养3天(Lee et al.,Clin Cancer Res.2018；24(2):370-82)。在第7、10和14天，添加可溶性抗CD3(0.1μg/mL)。在第3、7和10天，添加新鲜培养基和IL-2。扩增后10至20天收获DNT，用于后续实验。
CD3+CD56+NKT分离和培养：使用CD3+CD56+NKT细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-093-064)从PBMC中分离NKT细胞。将CD3+CD56+NKT细胞与Dynabeads人T-活化剂CD3/CD28磁珠(Invitrogen，目录号11131D)一起在人T细胞培养基中的24孔板中培养3天。去除CD3/CD28磁珠后，将CD3+CD56+NKT细胞在补充有人IL-2(50IU/mL，Proleukin，NovartisPharmaceuticals)、IL-7(10ng/mL，Peprotech，目录号200-07)和IL-15(10ng/mL，Peprotech，目录号200-15)的人T细胞培养基中培养。如前所述，使用OKT3在T25细胞培养瓶中扩增CD3+CD56+NKT细胞(Zhou et al.,Cancer Res.2005；65(3):1079-98)。如DNT细胞培养一节所述，NKT细胞培养和扩增的替代方法是使用初始OKT3包被的培养瓶或板以及随后的可溶性OKT3。
iNKT细胞分离和培养：使用抗iNKT微球(Miltenyi Biotec，目录号130-094-842)从PBMC中分离iNKT细胞，在48孔或24孔板于人T细胞培养基中培养，其中该人T细胞培养基具有经辐照的PBMC阴性部分且补充有α-GalCer(100ng/mL，DiagnoCine，目录号KRN7000)。iNKT细胞的扩增在24孔板或T25培养瓶中进行，其中含有经辐照的PBMC、α-GalCer(100ng/mL)和IL-2(50IU/mL)。
慢病毒产生和转导：如前所述，构建了表达人源化萤火虫荧光素酶和ΔNGFR(hfflucN)的基于HIV-1的双向载体，并在293T细胞中产生慢病毒(Huang et al.,MolTher.2008；16(3):580-9；Huang et al.,PLoS ONE.2015；10(7):e0133152)。基于先前描述的慢病毒载体，构建表达CD19 CAR的慢病毒载体，其包含抗CD19抗体的单链可变区、CD8α铰链和跨膜区以及4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ链(Tammana et al.,Hum Gene Ther.2010；21:75-86)。白血病细胞系用hfflucN慢病毒在聚凝胺(8μg/ml)存在下，在32℃以1170g进行离心(spin)转导1小时，然后通过FACS分选或通过抗NGFR生物素和抗生物素微球(MiltenyiBiotec)富集用于NGFR表达。通过使用Synergy 2微孔板阅读器(BioTek)对NGFR表达和hffluc生物发光活性进行流式细胞术分析，验证所有转导的细胞系。慢病毒CD19 CAR转导T细胞在6孔非组织培养板中进行，该板事先包被有逆转录连接蛋白，并在32℃以1170g离心2小时。
基于荧光素酶的杀伤测定：当进行抗体阻断测定时，表达荧光素酶的靶细胞(1x104/50μL/孔)与50μL T细胞按不同效应T细胞：靶细胞(E/T)比率，一式四份在96孔平底白色聚苯乙烯微孔板(Corning，目录号3912)中，或一式三份在96孔U底白色聚苯乙烯微孔板(Corning，分类号3789)中温育。通过添加每孔50μL培养基或1％Triton X-100代替T细胞，建立自发或最大杀伤。在37℃培养4小时后，向每个孔中添加10μL D-荧光素(1:10的30mg/mL储备液)或50μL(1:50的30mg/mL储备液)。使用Synergy 2微孔板阅读器(BioTek)测量荧光素酶活性。特异性细胞裂解百分比计算如下：
％特异性裂解＝(自发死亡RLU–样本RLU)/(自发死亡RLU-最大死亡RLU)x 100。RLU＝相对发光单位。
流式细胞术：使用Miltenyi MACSQuant或BD Accuri C6或BD FACSCelesta流式细胞仪进行流式细胞术分析。使用Flowjo软件7或10分析流式细胞数据。用生物素化蛋白L(GenScript，目录号M00097)和链霉亲和素PE(BioLegend，目录号405203)检测表面CAR表达。
基于CD107a脱颗粒的细胞毒性和细胞内INF-γ染色测定：通过添加CD107a-PE-Cy7或mIgG1，k-PE-Cy7，在5x104个肿瘤细胞和1x106个T细胞共培养5小时期间测量脱颗粒。PMA(50ng/mL)和离子霉素(1μg/mL)作为阳性对照。温育1小时后，向培养物中添加GolgiPlus和Golgi Stop(BD Biosciences)。在额外的4小时温育后，洗涤细胞一次，并在4℃用CD3-FITC、CD4-PE/CD8-PE、CD56-APC或同型对照染色20分钟。洗涤细胞，在4℃在Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD Biosciences)中温育20分钟，然后用Perm/Wash缓冲液洗涤。然后在4℃用IFN-γ-Pac Blue或mIgG1、k-Pac Blue对细胞染色20分钟，洗涤，并重新悬浮在Perm/Wash缓冲液中。最后在Miltenyi-MACSQuant流式细胞仪上分析细胞。
细胞因子释放测定：细胞因子释放测定是通过将1-5x105个T细胞与每孔2x104个靶细胞在96孔圆形或平底板中一式二份共培养进行的。24小时后，使用IFN-γELISA试剂盒(BioLegend，目录号430108)对上清液进行测定。
CD1d抗体阻断试验：抗人CD1d单克隆抗体(来自BD Biosciences的克隆42.1和来自BioLegend的克隆51.1)和同型对照抗体用于阻断α-GalCer抗原对iNKT细胞的CD1d限制性递呈(Ishihara et al.,J Immunol.2000；165(3):1659-64；Mangan et al.,JImmunol.2013；191(1):30-34；Jahnke et al.,Front Immunol.2019；10:1542)。浓度为10-50μg/mL的抗人CD1d和同型对照抗体与α-GalCer抗原致敏的靶细胞在37℃预温育1小时，然后在基于荧光素酶的4小时杀伤测定或24小时ELISA测定中添加一式三份的NKT细胞。
使用CRISPR-Cas9系统删除基因组CD1d：使用来自微生物聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的RNA引导的Cas9核酸酶敲除AML细胞中的CD1d(Ran et al.,NatureProtocols.2013；8(11):2281-08)。Guide RNA1、2、3和4经设计以靶向人CD1d的第一外显子(gRNA1、2和3)和第二外显子(gRNA4)。将靶向20个碱基对的寡核苷酸亚克隆到lentiCRISPRv2载体中。
统计分析：数据以平均值±标准偏差(SD)计算，并使用两样本t检验(双尾、不等方差)进行分析，p值<0.05被视为显著性差异。
结果
图1A显示，去除人CD4和CD8鸡尾酒试剂去除了90％以上的CD4和CD8 T细胞，第0天剩余<10％的CD4+和CD8+T细胞及约15％的CD3+CD56+和CD3-CD56+细胞。培养两周后，DNT表型为95％的CD4-CD8-细胞、1.1％的CD4+细胞和4.0％的CD8+T细胞。44％的CD3+CD56+NKT细胞仍存在于CD4-CD8-细胞群中，而CD3/CD28-珠粒实验方案的比例为11％。
图1B显示，响应于U937 AML细胞，21.64％的DNT细胞上调了CD107a的表达，而响应于K562 CML、CD19转染的K562(K562CD19)、Nalm-6 B-ALL和Raji B-NHL细胞的DNT细胞则为<＝2.32％。响应于U937AML细胞，DNT细胞也能特异性产生IFN-γ(2.49％,而对K562、K562CD19、Nalm-6和Raji细胞则为<＝0.19％)。相反，CD19 CAR-T细胞特异性识别B细胞肿瘤株和K562CD19。产生DNT培养物，其中近50％是CD4-CD8-细胞群中的CD3+CD56+NKT细胞，以及约10％或更高的CD4+和CD8+T细胞。CD4+、CD8+T细胞、CD3-CD56+NK细胞和CD3+CD56+NKT细胞也与DNT细胞平行扩增。
基于流式细胞术的CD107a测定通常使用一个效应物：靶(E/T)比率来测试T细胞效力。建立了一种基于非放射性荧光素酶的杀伤测定，用不同的E/T比率测试T细胞效力。
图2A和图2B显示CD19 CAR-T特异性杀伤CD19+K562CD19、Nalm-6、Daudi和Raji细胞。作为对照，模拟T细胞不能杀伤靶细胞。基于荧光素酶的杀伤测定结果与IFN-γ释放测定结果一致(图2C)。使用胰岛素样生长因子受体(IGF1R)CAR-T和酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)CAR-T也验证了基于荧光素酶的杀伤测定(Huang et al.Plos ONE.2015；10(7):e0133152)。图2D和图2E显示IGF1R CAR-T特异性杀伤IGF1R+Rh30、SaOS2、TC71和K562细胞，而ROR1 CAR-T特异性杀伤ROR1+SaOS2和TC71细胞。IFN-γ释放测定也证实了IGF1R CAR-T和ROR1 CAR-T对肉瘤细胞的抗原特异性识别(图2F)。
从DNT培养物中生长克隆，以评估单个DNT和NKT细胞克隆的抗AML活性。大约30个克隆分别从DNT培养物的96孔板中的3、3和16个板的30、3和0.3个细胞/孔中通过有限稀释得到，并且10个克隆是可扩展的。如图3A所示，流式细胞术分析表明，2A、3F和4E克隆的表型分别为CD3+CD4-CD8-CD56-、CD3+CD4+CD8-CD56+和CD3+CD4-CD8+CD56+，分别被命名为DNT、CD4+NKT和CD8+NKT细胞。此外，图3B显示2A、3F和4E克隆对Vβ8、Vβ18和Vβ5.3呈表型阳性，而对iNKT TCR(Vα24-Jα18)则呈表型阴性。
图3C显示，在基于4小时荧光素酶的细胞毒性测定中，4E(CD8+NKT)克隆在所有三种效应物/靶(E/T)比率中对U937 AML细胞的杀伤作用都比2A(DNT)克隆更有效。3F(CD4+NKT)克隆不杀伤AML。所有克隆都不杀伤CD19+Nalm-6(B-ALL)、CD19转染的K562(红白血病)或K562白血病细胞。
图3D显示，3F(CD4+NKT)克隆对AML细胞系(包括U937-hfflucN、KG-1、Molm-13、Molm-14、MV4:11和U937)产生强烈的、大约分别是4E(CD8+NKT)和2A(DNT)克隆的37倍和15倍的IFN-γ应答。此外，4E(CD8+NKT)克隆产生的IFN-γ大约是2A(DNT)克隆对AML细胞系应答的2.5-4倍(Molm-13除外)。
流式细胞术的CD107a-IFN-γ测定用于评估响应于肿瘤细胞刺激的T细胞毒性和细胞内IFN-γ水平。图3E显示，在所有检测的表达荧光素酶的AML细胞(KG-1、Molm-13、Molm-14、MV4:11和U937)中，4E(CD8+NKT)和2A(DNT)克隆在CD107a的表达方面具有相同的细胞毒性，而3F(CD4+NKT)克隆比4E(CD8+NKT)和2A(DNT)克隆产生更多的IFN-γ。另外还建立并测试了表达荧光素酶的其他AML细胞系(HL60、Molm-13、Molm-14和MV4:11)。
图4A和图4C显示，4E(CD8+NKT)细胞对表达荧光素酶的HL60、Molm-13、Molm-14、MV4:11和U937细胞的细胞毒性高于2A(DNT)。图4B显示，响应于表达荧光素酶的HL60、Molm-13、Molm-14、MV4:11和U937细胞，3F(CD4+NKT)细胞比2A(DNT)产生更多的IFN-γ。响应于大多数AML细胞系，4E(CD8+NKT)细胞也比2A(DNT)细胞产生更多的INF-γ。如图4C所示，CD8+NKT细胞不能杀伤某些表达荧光素酶的肉瘤细胞系(Rh30、SaOS2和TC71)。
图4D和图4E分别显示基于5次和2次独立测定得出的统计结论，即在所有测试E/T比率下，4E(CD8+NKT)都比2A(DNT)克隆更有效地杀伤AML细胞，而响应于AML细胞系，3F(CD4+NKT)克隆产生的IFN-γ几乎是2A(DNT)克隆的10000倍(p<0.0001)。4E(CD8+NKT)细胞产生的IFN-γ水平也高于2A(DNT)克隆(p<0.01)。这些结果表明，CD4+NKT和CD8+NKT细胞都是有效的抗AML效应细胞。
为了评估多克隆NKT细胞是否能在功能上模仿4E(CD8+NKT)克隆，最初使用CD3+CD56+NKT细胞分离试剂盒从四名健康供体中分离CD3+CD56+NKT细胞。然后将分离的CD3+CD56+NKT细胞在含有CD3/CD28微珠的24孔板中活化3天，去除微珠后与IL-2一起培养，并在含有OKT3、异体PBMC、EBV-LCL(EB病毒转化的淋巴母细胞系)和IL-2的T25培养瓶中扩增。图5A和图6A显示，CD3+CD56+NKT细胞占PBMC的6-10％，分离后富集到58-88％。图5B和图6B显示，在CD3/CD28珠粒活化和随后用抗CD3抗体(OKT3)和IL-2扩增后，两种培养物中60-82％的细胞仍保持CD3+CD56+。图5C显示，来自两种培养物的NKT1细胞的iNKT TCR染色呈阴性，表明CD3+CD56+NKT细胞中没有iNKT细胞的污染。图5D和图6C显示，来源于供体1和供体2的活化和培养的CD3+CD56+NKT1和NKT2与4E(CD8+NKT)克隆一样有效，以E/T比率依赖性方式杀伤所有AML细胞系。图5E显示，响应于U937 AML细胞，NKT1细胞特异性产生IFN-γ。图6D显示，四种额外的CD3+CD56+NKT细胞(NKT9、NKT10、NKT11、NKT12)杀伤所有AML细胞系，尽管在该实验中对K562 CML、Raji B-NHL和Nalm-6 B-all细胞有一点杀伤背景。如图6E和图6F所示，与B细胞恶性肿瘤相比，在该条件下制备的CD3+CD56+NKT细胞显著杀伤AML细胞(p<0.001，不包括1.67:1的E/T)。
为了证明从健康献血者分离的CD3+CD56+NKT细胞可重复地杀伤AML细胞系，我们使用OKT3包被的培养瓶或板和IL-2活化CD3+CD56+NKT细胞3天，并将其与IL-2一起在培养基中培养4天，然后用可溶性OKT3重新刺激它们3天。图7A和图7B显示，在培养后第17、22和41天，NKT2对表达荧光素酶的AML细胞(HL60、MV4:11、THP-1和U937)表现出强大的细胞毒性，而NKT2对K562 CML、Daudi B-NHL、Raji B-NHL和Nalm-6 B-ALL细胞系没有或有低背景杀伤。
在相同的培养条件下，又分离出9种CD3+CD56+NKT细胞，并与OKT3和IL-2在培养中扩增。图7C、图7D、图7E和图7F显示，所有9种NKT细胞(NKT17、NKT20、NKT21、NKT22、NKT27、NKT30、NKT31、NKT32、NKT35)均以E/T比率依赖性方式杀伤所有受试的表达荧光素酶的AML细胞系(HL60、KG1、Molm-13、MV4:11、THP-1和U937)，而它们显示对Daudi B-NHL、Raji B-NHL和Nalm-6 B-ALL无杀伤或较低水平杀伤以及对K562 CML细胞的不同水平的杀伤。图7G和图7H显示统计结论，即使用替代制备方法制备的来自9名健康供体的CD3+CD56+NKT细胞在所有E/T比率下，相比于B细胞恶性肿瘤优先杀伤所有6种AML细胞系(p<0.0001)。
如图8A、图8B、图8C和图8D所示，与表达荧光素酶的B细胞恶性肿瘤(包括Daudi、Raji和Nalm-6细胞)共培养(平均值±SD，138.94±211.62)相比，这些CD3+CD56+NKT细胞(n＝9)与表达荧光素酶的所有AML细胞系共培养后产生的IFN-γ细胞因子水平高大约3000倍(平均值±SD，3053.6±1988.8)(p<0.0001)。CD3+CD56+NKT细胞不识别表达荧光素酶的肉瘤细胞系(Rh30、SaOS2和TC71)。此外，响应于AML细胞刺激由NKT细胞产生的干扰素-γ水平与对照3F(CD4+NKT)克隆相当。
图9A显示，来自10名健康供体的PBMC中CD3+CD56+NKT的百分比范围为2.65-11.3％(平均值±SD，5.67±2.68)，微珠选择后其富集纯度范围为58.7-93.9％(平均值±SD，79.72±12.14)。图9B显示，培养2-4周后，CD3+CD56+NKT细胞百分比依然很高(平均值±SD，78.54±9.706，n＝11)，证明培养条件对CD3+CD56+NKT细胞百分比的影响甚微。此外，如图9B所示，培养后的CD3+CD56+NKT细胞群由CD4+、CD8+和CD4-CD8-细胞组成。
为了评估iNKT细胞是否也能杀伤AML细胞，以及其细胞毒性能否由α-GalCer增强并与CD1d表达相关，从一名健康供体中分离、活化和扩增iNKT细胞。图10A显示，来自供体1的iNKT1细胞在缺乏α-GalCer抗原的情况下不会杀伤AML细胞系和B细胞白血病及淋巴瘤细胞系。与CD3+CD56+NKT细胞天然的抗AML活性相反，iNKT介导的抗AML细胞毒性仅在α-GalCer存在时被证实。图10B显示所有三种培养物中的iNKT细胞均表达细胞表面标志物CD3+和iTCR+。图10C显示，除HL60和U937外，所有受试AML细胞系均为CD1d+且CD1d表达通常与细胞毒性相关。这些结果表明，CD3+CD56+NKT细胞可能以CD1d限制性方式识别AML细胞。
为了进一步证明iNKT细胞在缺乏α-GalCer抗原的情况下不能杀伤AML细胞，我们从健康供体中制备了另两种iNKT细胞(iNKT2和iNKT12)。图11A和图11B显示，iNKT2和iNKT12以及iNKT1细胞杀伤用α-GalCer抗原而非DMSO致敏的CD1d+AML细胞(HL60、MV4:11、THP-1和U937)。所有三种iNKT细胞最低限度地杀伤用α-GalCer抗原致敏的CD1d-K562 CML和Nalm-6 B-ALL细胞，这表明与CD3+CD56+NKT细胞不同，iNKT细胞对AML细胞没有天然的细胞毒性。
抗人CD1d单克隆抗体(来自BD Biosciences的克隆42.1和来自BioLegend的克隆51.1)在10μg/mL浓度下已用于阻断CD1d限制性向iNKT细胞递呈α-GalCer抗原(Ishiharaet al.,J Immunol.2000；165(3):1659-64；Mangan et al.,J Immunol.2013；191(1):30-34；Jahnke et al.,Front Immunol.2019；10:1542)。图11C、图11D和图11E显示，在ELISA和基于荧光素酶的杀伤测定中，来自克隆42.1和51.1的抗人CD1d抗体在50μg/mL(图11C)、10μg/mL(图11D)和30μg/mL(图11E)都不能显著阻断CD1d介导的向iNKT细胞的抗原递呈。此外，30μg/mL也未能阻断NKT30、NKT31和4E(CD8+NKT)介导的对Molm-13和U937 AML细胞的杀伤(图11F)。
为了进一步分析CD3+CD56+NKT细胞介导的AML细胞的识别是否依赖于AML细胞上的CD1d分子，应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除表达荧光素酶的U937和MV4:11AML细胞中的CD1d分子。图12A、图12B、图12C和图12D显示，表达荧光素酶的U937中gRNA3+1或4+1的慢病毒转导或者表达荧光素酶的MV4:1AML细胞中gRNA2的慢病毒转导消除了iNKT2和iNKT12以及iNKT1识别用α-GalCer抗原致敏的靶细胞时的细胞毒性和IFN-γ产生。这三种iNKT细胞识别用α-GalCer抗原致敏的对照U937和MV4:11细胞，而不识别用α-GalCer抗原致敏的CD1d-Nalm-6细胞。与野生型U937细胞相比，表达荧光素酶的U937细胞中gRNA 1或gRNA2的慢病毒转导不能完全消除iNKT细胞毒性和IFN-γ产生。
我们还评估了CD3+CD56+NKT细胞是否识别CD1d敲除的AML细胞。图12E、图12F和图12G显示，在杀伤和IFN-γELISA测定中，CD3+CD56+NKT2、NKT17、NKT21和NKT22以及3F(CD4+NKT)克隆均识别CD1d敲除的AML细胞(U937-hffLucN-gRNA3+1、4+1或MV4:11-hffLucN-gRNA2)。
图12H、图12I和图12J显示，与野生型对应细胞和CD1d-K562和Nalm-6对照细胞相比，CD1d gRNA3+1、4+1敲除的U937或gRNA2敲除的MV4:11细胞中的CD1d表达在细胞表面完全呈阴性。gRNA1或gRNA2敲除的U937细胞中的CD1d表达仍呈阳性。来自gRNA3+1或4+1U937细胞的20个单细胞克隆对于CD1d细胞表面表达均为阴性。CD1d敲除的流式细胞术分析与iNKT细胞功能测定密切相关。我们的数据表明，CD3+CD56+NKT介导的AML细胞的先天识别可能不需要靶细胞上的CD1d表达。
如图13所示，培养后的CD3+CD56+NKT30和NKT35的表型。两种NKT细胞均表达NK细胞和T细胞的标志物，如CD56、NKG2D、DNAM-1、CD16、NKG2C、NKB1(KIR3DL1)、CD158b(KIR2DL2/L3)、CD159a(NKG2A)、CD3、CD45RO、FAS、TCRαβ、TCRγδ、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、HLA-ABC和HLA-DR。
为了评估经CAR或TCR修饰的CD3+CD56+NKT细胞是否能够重新定向NKT细胞特异性靶向癌细胞，用CD19 CAR慢病毒上清液对2A(DNT)、3F(CD4+NKT)和4E(CD8+NKT)克隆进行离心转导。图14A显示2A、3F和4E克隆中的CAR基因转移效率。2A(～30％)和3F(～26％)克隆中的CAR基因转导效率高于4E克隆(～4％)，这可能是因为它们的生长速度不同。图14B显示，用CD19 CAR转导的2A和4E克隆均能杀伤CD19+Nalm-6 B-ALL和K562CD19靶细胞。颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素以及CD4和CD8分子在CD3+CD56+NKT细胞中的表达支持这样一种观点，即对这些细胞中的CAR或TCR进行基因修饰能重新定向其针对细胞表面或细胞内抗原的细胞毒性特异性，用于癌症治疗。
上述实施方案和实施例仅用于说明，并不旨在限制本发明的范围。本领域的普通技术人员将认识到，在不改变本发明的精神或范围的情况下可以进行的众多修改和变化。此类修改和变化包含在本发明的范围内。
序列表
<110> 阿克索治疗公司
<120> III型NKT细胞及相关组合物和方法
<130> 197513.00002
<150> 62/889,664
<151> 2019-08-21
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
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Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
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Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
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Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
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Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
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Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
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<212> PRT
<213> 智人
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305 310 315 320
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370 375 380
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385 390 395 400
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln
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Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val
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Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
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<213> 智人
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Leu Gln Pro Ala Leu Pro Gln Ile Val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu
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Asp Gln Asp Gly Ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Gln Gln Thr Pro Ser Thr
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Thr Gly Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ser Thr Leu Pro Ala Gly
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Glu Gly Pro Lys Glu Gly Glu Ala Val Val Leu Pro Glu Val Glu Pro
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Thr Pro His Thr Glu Asp Gly Gly Pro Ser Ala Thr Glu Arg Ala Ala
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Gly Ala Ser Gln Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val
245 250 255
Ile Ala Gly Gly Leu Val Gly Leu Ile Phe Ala Val Cys Leu Val Gly
260 265 270
Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu
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Pro Ala Pro Ser His Val Trp Arg Pro Ala Ala Leu Phe Leu Thr Leu
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Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ile Gly Leu Gly Val Leu Ala Ser Met Phe
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Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
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<213> 智人
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His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
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Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
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<213> 智人
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1115 1120 1125
Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp
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Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly
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Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu
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Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg
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Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr
1190 1195 1200
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Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser
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Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu
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<213> 智人
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Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala
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Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr
20 25 30
Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys
35 40 45
Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala
50 55 60
Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg
65 70 75 80
Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp
85 90 95
Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly
100 105 110
Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp
115 120 125
Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile
130 135 140
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145 150 155 160
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Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala
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Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile
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Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
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<213> 智人
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20 25 30
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Asn Val Ser Ile Gly Ile Val Gly Lys Asp Leu Glu Phe Thr Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 智人
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1 5 10 15
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Ile Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Asp Ser
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Ser Met Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu
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<213> 智人
<400> 22
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Phe Leu Val His
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<213> 智人
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Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
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Glu Thr
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<213> 智人
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Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly
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Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
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Gly Gln Arg Arg
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<213> 智人
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435 440 445
Leu
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<212> PRT
<213> 智人
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325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
500 505
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Asn Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu
1 5 10 15
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn
1 5 10 15
Ile Leu Thr Ile
20
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly
1 5 10 15
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<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr
1 5 10 15
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20
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5 10

Claims (35)

1.分离的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞，其用于治疗或预防有需要的受试者的癌症。
2.根据权利要求1所述的使用的细胞，其中所述癌症为实体瘤或血液恶性肿瘤；B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤；急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌；并且其中任选所述癌症在没有所述细胞的情况下对治疗具有抗性或难治性。
3.根据权利要求1或2所述的使用的细胞，其中所述细胞为CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+或CD3+CD4-CD8-CD56+细胞，各自任选从受试者或供体的生物样本中分离。
4.根据权利要求3所述的使用的细胞，其中所述生物样本包含血液、骨髓、淋巴结组织、脾组织、肿瘤组织、一种或多种诱导多能干细胞和/或一种或多种外周血单核细胞；并且其中所述血液任选包括外周血和/或脐带血。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞从一种或多种外周血单核细胞分离。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)且包含一个或多个编码所述CAR的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的使用的细胞，其中所述CAR至少包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。
8.根据权利要求7所述的使用的细胞，其中所述抗原结合域能够结合CD19、IGF1R、ROR1、BCMA、CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1、LILRB4、GD2、CD20、CD22、CD30、MSLN、EGFRvIII、EGFR、HER2、MUC1、EPCAM、PSMA、SLAMF7、GPC3或PD-L1。
9.根据权利要求7或8所述的使用的细胞，其中所述抗原结合域能够结合CD19，并且所述癌症为B细胞恶性肿瘤，例如B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)；或者其中抗原结合域能够结合ROR1，并且所述癌症为尤文氏肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤或卵巢癌；或者其中抗原结合域能够结合BCMA，并且所述癌症为多发性骨髓瘤；或者其中所述抗原结合域能够结合CD123、CD33、CD38、CD138、CLL-1或LILRB4，并且所述癌症为AML；或者其中所述抗原结合域能够结合EGFRvIII或EGFR，并且所述癌症为胶质母细胞瘤；其中所述抗原结合域能够结合GPC3，并且所述癌症为肝细胞肝癌。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的使用的细胞，其中所述抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架；其中所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体；其中所述抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)；其中所述细胞内信号传导域包括至少一种刺激分子的功能性信号传导域。
11.根据权利要求10所述的使用的细胞，其中所述至少一种刺激分子包含与T细胞受体复合体相关联的ζ链或CD3ζ链；其中所述细胞内信号传导域还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域；并且其中所述至少一种共刺激分子任选包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞经修饰以表达T细胞受体(TCR)且包含一个或多个编码TCR的多核苷酸；其中所述TCR至少包括α链和β链。
13.根据权利要求12所述的使用的细胞，其中所述α链和/或β链能够结合抗原，并且其中所述抗原为细胞内抗原、NY-ESO-1、WT1或MAGE-A3。
14.根据权利要求13所述的使用的细胞，其中所述抗原为NY-ESO-1并且所述癌症为神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌；或者其中抗原为WT1并且所述癌症为AML。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞经修饰以表达T细胞受体模拟抗体(TCRm)并且包含一个或多个编码TCRm的多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的使用的细胞，其中所述TCRm至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；其中所述抗原结合域任选能够选择性结合包含肽和人白细胞抗原(HLA)分子的复合抗原；并且其中所述HLA分子任选为I类或II类HLA分子。
17.根据权利要求16所述的使用的细胞，其中所述肽包含甲胎蛋白(AFP)肽。
18.根据权利要求17所述的使用的细胞，其中所述复合抗原包含AFP肽和HLA-A2分子；并且其中所述癌症为肝细胞肝癌。
19.根据权利要求16所述的使用的细胞，其中所述肽包含在黑色素瘤优先表达的抗原(PRAME)肽；其中所述PRAME肽任选包含SEQ ID NO:41；其中所述复合抗原任选包含PRAME肽和HLA-A*0201分子；并且其中所述癌症为B-ALL、AML、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠腺癌或乳腺癌。
20.根据权利要求16所述的使用的细胞，其中所述肽包含WT1肽并且任选包含HLA-A2分子；并且其中所述癌症为AML。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的使用的细胞，其中所述抗原结合域包含抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白质支架；并且其中所述抗体任选为单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体或单域抗体；任选其中所述抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞内信号传导域包含至少一种刺激分子的功能性信号传导域；其中所述至少一种刺激分子任选包含与T细胞受体复合物相关联的ζ链或CD3ζ链；并且其中所述细胞内信号传导域任选还包括至少一种共刺激分子的功能性信号传导域。
23.根据权利要求22所述的使用的细胞，其中所述至少一种共刺激分子包含4-1BB、CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、DAP10或DAP12。
24.根据权利要求6至23中任一项所述的使用的细胞，其中所述细胞经进一步修饰以包含外源性细胞因子、生长因子、抗体或抗原结合片段或其任何组合，其中所述抗体或抗原结合片段任选包含双特异性T细胞接合器(BiTE)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的分离的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞在制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物包含治疗有效量的细胞，或包含治疗有效量的细胞和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
27.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述癌症为实体肿瘤或血液恶性肿瘤；B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤；急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤因肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。
28.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的分离的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞和药学上可接受的载体。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述细胞为CD3+CD4+CD56+、CD3+CD8+CD56+或CD3+CD4-CD8-CD56+细胞，各自任选从受试者或供体的生物样品中分离。
30.一种治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1至24中任一项所述的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞，或包含治疗有效量的根据权利要求1至24中任一项所述的CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症选自以下组：实体瘤、血液系统恶性肿瘤、B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤、急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，尤因肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌、乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤和结肠腺癌；并且其中任选所述癌症在没有所述细胞的情况下对治疗具有抗性或难治性。
32.一种制备用于治疗或预防有需要的受试者的癌症疗法的方法，其包括：
a、从生物样品中分离一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞；和
b、在生长培养基中培养一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞以产生扩增的细胞群。
33.根据权利要求32所述的方法，其还包括修饰所述一个或多个CD3+CD56+III型自然杀伤T细胞以表达CAR、TCR或TCRm，其中所述修饰包括将编码所述CAR、TCR或TCRm的一个或多个多核苷酸引入所述一个或多个细胞；其中引入一个或多个多核苷酸任选包括电穿孔、转导和/或转染；其中所述任选一个或多个多核苷酸包含mRNA和/或DNA；并且其中所述DNA任选包含转座子DNA。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或多个多核苷酸包含一个或多个载体，其中所述一个或多个载体包含一个或多个病毒载体、慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述癌症为实体瘤或血液恶性肿瘤；B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑色素瘤；急性髓系白血病(AML)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、尤因肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、套细胞癌、乳腺癌或乳腺腺癌、肺腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌或肝细胞肝癌、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、T细胞淋巴瘤或结肠腺癌。
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