KR20210118426A - 양자 세포 요법을 위한 표적화된 공자극을 제공하는 수용체 - Google Patents

양자 세포 요법을 위한 표적화된 공자극을 제공하는 수용체 Download PDF

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KR20210118426A
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로버트 호킨스
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인스틸 바이오 유케이 리미티드
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Abstract

본 발명은 양자 세포 요법 (ACT)에서 유용한 키메라 공자극성 항원 수용체 (CoStAR)를 포함하는 세포에 관한 것이다. CoStAR은 정의된 항원에 대한 세포 활성 증강 반응의 조절인자로서 작용할 수 있다. 본 발명은 또한 CoStAR 단백질, CoStAR을 코딩하는 핵산, 및 이의 치료적 용도를 제공한다.

Description

양자 세포 요법을 위한 표적화된 공자극을 제공하는 수용체
관련 출원 및 참조로의 편입
2019년 1월 22일 출원된 GB 특허 출원 일련 번호 제1900858.0호, 및 2019년 12월 20일 출원된 US 제62/951,770호를 참조한다.
전술된 출원, 및 그에서 또는 그들 심사 동안 인용된 모든 문헌 ("출원 인용 문헌") 및 출원 인용 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌, 및 본 명세서에서 인용 또는 참조된 모든 문헌 ("본 명세서에서 인용된 문헌"), 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌은 본 명세서 또는 본 명세서에서 참조로 편입시킨 임의 문서에서 언급된 임의 제품에 대한 임의의 제조사 설명서, 기술서, 제품 사양서, 및 제품 시트와 함께, 본 명세서에 참조로 편입되고, 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다. 보다 특히, 모든 참조 문헌은 각각의 개별 문헌이 특별하게 개별적으로 참조로 편입시킨다고 표시한 것과 동일한 정도로 참조로 편입된다.
서열 진술
본 출원은 전자 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 양자 세포 요법 (ACT)에서 유용한 키메라 공자극성 항원 수용체 (CoStAR)를 포함하는 세포에 관한 것이다. CoStAR은 정의된 항원에 대한 세포 활성 증강 반응의 조절인자로서 작용할 수 있다. 본 발명은 또한 CoStAR 단백질, CoStAR을 코딩하는 핵산, 및 이의 치료적 용도를 제공한다.
암 퇴행을 매개하기 위해서 자기유래 T-세포를 사용하는 양자 세포 요법 (ACT)은 초기 임상 시험에서 많은 가능성을 보여주었다. 몇몇 일반 접근법은 예컨대 생체외에서 확장시킨 천연 발생 종양 반응성 또는 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 사용을 취하였다. 추가로, T-세포는 정의된 종양 항원을 향해서 그들을 재표적화시키기 위해서 유전자 변형될 수 있다. 이것은 펩티드 (p)-주요 조직적합성 복합체 (MHC) 특이적 T-세포 수용체 (TCR) 또는 종양 특이적 단일 사슬 항체 단편 (scFv) 및 T-세포 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ) 간 합성 융합체의 유전자 전달을 통해서 수행될 수 있고, 후자는 키메라 항원 수용체 (CAR)라고 한다.
TIL 및 TCR 전달은 흑색종을 표적으로 할 때 특히 양호한 것으로 입증되었고 (Rosenberg et al. 2011; Morgan 2006), 그에 반해 CAR 요법은 일정 B-세포 악성종의 치료에서 많은 가능성을 보여주었다 (Grupp et al. 2013).
백혈병에서 CAR 요법의 성공은 CAR 구성체로 공자극성 도메인 (예를 들어, CD28 또는 CD137)의 도입 덕분이고, 그로부터의 신호는 CD3ζ에 의해 제공되는 신호와 상승작용하여 항종양 활성을 증강시킨다. 이러한 관찰의 기본은 T-세포 활성화의 고전적인 신호1/신호2 패러다임과 관련된다. 여기서 TCR 복합체에 의해 제공되는, 신호 1은 공자극성 수용체 예컨대 CD28, CD137 또는 CD134에 의해 제공되는 신호 2와 상승작용하여서 신호 1 단독과 연관된 활성화 유도 세포 사멸 (AICD)없이 세포가 클론 확장, IL2 생산 및 장기간 생존을 겪을 수 있게 한다. 더 나아가서, 신호 2의 관여는 신호 1을 통해서 생성된 신호를 증강시켜서 항-종양 반응 동안 직면하게 되는 것들 같은 낮은 화합력 상호작용에 대해 세포가 더 잘 반응할 수 있게 한다.
표적화된 공자극은 비-CAR-기반 T 세포 요법에 대해 유리한 효과를 가질 것이다. 예를 들어, 키메라 TCR로 공자극성 도메인의 도입은 pMHC를 향하는 T-세포의 반응을 증강시키는 것으로 확인되었다 (Govers 2014). 종양 침윤성 림프구 (TIL)가 종양 인식을 매개하기 위해서 그들의 내생성 TCR을 활용하지만, 내생성 TCR을 조작하는 것은 가능하지 않았다. 따라서, TIL은 종양 세포가 매우 적은 공자극성 리간드를 발현하므로 실질적인 제한이 있다. TIL, 또는 실제로 임의의 다른 양자 T-세포 요법 산물의 표적화된 공자극을 유도하는 능력이 유리할 것이다.
신규한 CoStAR 및 CoStAR을 포함 또는 발현하는 세포는 CAR 및 비-CAR 기반 T-세포 요법에 비슷하게 유리하다. 본 발명은 정의된 질환-연관, 예를 들어 종양-연관, 항원과의 관여 시에 T-세포에 공자극성 신호를 제공하도록 신규한 키메라 공자극성 수용체를 발현하는 세포를 사용한다. 분할 신호 1 및 신호 2가 조작된 T-세포에서 항원 특이적 반응을 구동시키는데 사용되었다는 몇몇 보고가 존재하였다 (Alvarez-Vallina & Hawkins 1996). 그러나, 어떠한 것들도 전체 길이 CD28 분자를 활용하지 않았다. 절두된 형태와 반대로 전체 길이 수용체, 예컨대 CD28을 사용하는 것이 특별히 유리하다. 전체 길이 CD28은 수용체가 이의 천연 형태로 기능할 수 있게 하는 이량체이고, 실제로, 키메라 항원 수용체는 단량체로서 발현될 때 최적으로 기능하는데 실패한다 (Bridgeman et al. 2010). 본 발명은 또한 정의된 항원 예컨대 질환 연관 또는 종양 연관 항원와 관여 시 신호 2를 유도하는 표적화된 공자극성 수용체를 제공한다. 전체 길이 CD28 분자는 수용체의 B7 패밀리의 결합 구성원에서 이의 천연 기능에 핵심적인 모티프를 함유하지만; 이것은 직렬로 CD28 및 CD3ζ 수용체를 보유하는 CAR의 관점에서 잠재적으로 위험하고, B7에 의한 CAR의 결찰은 T-세포 활성화를 촉발시킬 수 있고, 신호 2 수용체를 단독으로 보유하는 수용체에 대해 유리한 품질이 존재한다.
본 발명자는 T-림프구 (T-세포)가 정의된 종양 연관 항원과의 관여 시 T-세포 활성화를 증가시키기 위해서 CoStAR (공자극성 항원 수용체)를 발현시키도록 조작될 수 있다는 것을 보여주었다. 본 발명자는 조작된 세포가 또한 종양 연관 항원 CEA와 관여 시 CoStAR을 통해 신호 2를 수용하도록 허용할 때 신호 1 미토겐 (OKT3)에 의한, IFNγ 및 IL-2 분비로 측정한, T-세포의 활성화가 증강된다는 것을 보여주었다. 따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
(i) 종양 연관 항원 특이적 도메인, 예를 들어, 단일 사슬 항체 단편;
(ii) 전체 길이 공자극성 수용체 신호전달 사슬 또는 도메인
을 포함하는 재조합 공자극성 항원 수용체 (CoStAR)를 제공한다.
본 발명은 또한
(i) 종양 연관 항원 특이적 도메인, 예를 들어, 단일 사슬 항체 단편;
(ii) 전체 길이 공자극성 수용체 신호전달 사슬 또는 도메인
을 포함하는 재조합 공자극성 항원 수용체를 포함하는, T 세포 또는 NK 세포를 포함한, 세포, 예를 들어, 림프구를 제공한다.
본 명세서에서 기술되는 CoStAR은 이의 지정된 종양 항원에 대한 CoStAR의 결합이 수용체 활성화를 일으키고, 재조합 TCR, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 내생성 TCR을 통해 제공되는 동시발생 신호 1 매개 신호를 증가시키기 위한 공자극성 신호를 제공하도록 디자인된다. 종양 항원은 종양 연관 항원 예컨대 암-정소 또는 종양-태아 항원 패밀리의 분자 예컨대 CEA 또는 5T4 유래의 것들일 수 있고 단일 사슬 항체 단편을 사용하여 표적화될 수 있다. 대안적으로, 종양 항원은 MHC를 통해서 펩티드로서 제시된 것일 수 있고 pMHC 특이적 단일 사슬 항체 단편 또는 단일 사슬 TCR을 사용하여 표적화될 수 있다.
일정 구현예에서, 신호전달 도메인 또는 신호전달 사슬은 제한없이 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6을 포함하여, 전체 길이 (신호 펩티드가 없는 전체 단백질 서열) 공자극성 수용체를 포함한다. 공자극성 도메인은 단독으로 하나의 수용체 도메인, 또는 직렬로 다수의 수용체 도메인 (즉, 융합 수용체)로 이루어질 수 있어서 각각의 도메인은 직접적으로 또는 최대 50 아미노산 길이의 가요성 링커를 통해서 연결된다. 일정 구현예에서, 신호전달 도메인은 전체 길이 공자극성 수용체의 단편을 포함하고, 여기서 단편은 이량체화에 효과적이다. 신호전달 도메인에 단일 사슬 항체 단편을 연결하는 링커일 수 있다. 존재하면 이러한 링커는 1-50 아미노산 길이일 수 있다. 림프구는 종양 침윤성 림프구 (TIL), T 조절 세포 (Treg) 또는 초대 T 세포, 또는 NK 세포를 포함하는, T 세포일 수 있다. CoStAR 이외에도, 림프구, T 또는 NK 세포는 재조합 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함할 수 있다.
충분한 경험의 개체는 성숙 단백질로부터 신호 펩티드가 절단되는 정확한 지점을 확인하는 것을 정확하게 결정하는 것이 어렵다고 알고 있고, 예측 소프트웨어를 적용할 수 있지만, 성숙 단백질의 상류 서열의 인공 스플라이싱은 신호 펩티드 펩티다제에 대한 신규한 부위를 생성시킬 수 있고, 따라서, 이 문헌에서 용어 '전체 길이'는 키메라 수용체로 공자극성 도메인의 최적 스플라이싱에 핵심적인 과정으로서, 성숙 단백질의 바로 N-말단에서 최대 5 아미노산 결실 또는 돌연변이를 갖는 전체 성숙 단백질을 의미한다. 이것은 이전에 공개된 서열 예컨대 이용된 CD8 경막 도메인과 함께, 오직 CD28의 세포내 도메인만이 사용된 [Lanitis et al (2013)]에서 사용되는 것, 및 모티프 IEV까지 절두된, 절두된 CD28 수용체를 사용한 [Krause et al. (1998)]에서 사용된 것과 분명한 차이이다.
제2 양태에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서에서 기술된 CoStAR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 제2 양태에 따른 핵산 서열, 및 존재한다면, TCR 및/또는 CAR 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 림프구로 CoStAR을 코딩하는 핵산 또는 벡터를 도입시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 양태에 따른, 림프구, 또는 T 또는 NK 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 제3 양태에 따른 벡터, 또는 제1 양태에 따른 림프구 (T 또는 NK 세포 포함)를, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물을 비롯하여 이의 치료적 용도를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 양자 세포 요법에서의 사용을 포함하여, 제1 양태에 따른 세포, 예를 들어, T 또는 NK 세포를 포함한, 림프구, 또는 제3 양태에 따른 벡터를 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 암의 치료 방법에서의 사용을 포함하여, 제1 양태에 따른, T 또는 NK 세포를 포함한 림프구, 또는 제3 양태에 따른 벡터를 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약물의 제조에서, 제1 양태에 따른 림프구의 용도, 또는 제3 양태에 따른 벡터의 용도를 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 암의 치료에서 사용을 위한, 제1 양태에 따른 림프구, 제3 양태에 따른 벡터 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, CoStAR 수용체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 전체 길이 CD28 수용체를 포함한다. 일 구현예에서, CoStAR은 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및 인간 CD137로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:4로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 CD134로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:5로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 CD2로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:6으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 CD29으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:7로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 GITR로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:8로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 IL2Rγ로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:9로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 인간 CD40으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:10으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 인간 CD150으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:11로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 세포내 도메인, 또는 인간 CD2 및 인간 CD40으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:12로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로부터 선택된 하나의 다른 모이어티에 융합된 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 모이어티 중 하나의 변이체는 상기 열거된 융합 서열에 비해서 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 최대 10개 N-말단 아미노산 잔기가 결여된다.
예시로 제공되고, 기술된 특별한 구현예에만 오로지 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌, 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 최고로 이해될 수 있다.
도 1 - 단일 공자극성 및 융합 공자극성 도메인 수용체의 구조적 조직도. 청구항에 개시된 CoStAR 수용체의 대표적인 개략도가 도시된다. 첫째로 단일 공자극성 수용체 기반의 CoStAR, 및 둘째로 제2 공자극성 도메인에 융합된 전체 길이 공자극성 수용체 신호전달 도메인으로 이루어진 융합 CoStAR.
도 2 - 잠재적 CoStAR 구성의 게놈 조직도 - CoStAR은 도면에 도시되고 청구항에 기술된 바와 같은, 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서 도메인, 및 공자극성 도메인으로 이루어진다. CoStAR은 A) 단일 (Ai) 또는 융합 (Aii) 공자극성 수용체로 이루어진 CoStAR과 함께 프로모터로부터 단독으로 발현될 수 있고; B) CoStAR의 직접 염색이 가능하도록 N 또는 C 말단에 에피토프 태그 (예를 들어, His 태그, DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 등)를 갖게 발현될 수 있고; C) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 사용하여 이격된 마커 유전자와 함께 발현될 수 있고; D) 제2 프로모터로부터 발현되는 마커 유전자와 함께 발현될 수 있고; E) 2A 절단 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 사용하여 이격된 관심 단백질 예컨대 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 함께 발현될 수 있고; F) 제2 프로모터로부터 발현된 관심 단백질 예컨대 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체와 함께 발현될 수 있다. CoStAR 및 마커 유전자/키메라 항원 수용체/T-세포 수용체/다른 관심 단백질이 양쪽 배향 또는 서로에 대해 3' (3-프라임) 또는 5' (5-프라임)에서 발현될 수 있다는 충분한 지식은 개체에게 자명할 것이다.
도 3 - LS174T 및 LoVo 종양 제시 항원에 반응하는 T-세포 내 CoStAR의 기능적 활성. 도너 1 (A & D), 도너 2 (B) 및 도너 3 (C & E)으로부터의 정상 도너 T-세포 개체군은 암배 항원을 표적으로 하고 CD34 자성 선택을 사용하여 이식유전자에 대해 농축시키기 위해서 자성으로 분류시킨 CoStAR을 발현시키도록 렌티바이러스로 조작하였다. T-세포는 야생형의 비조작된 CEA+ 종양 세포 (비활성화 종양) 또는 표시된 이펙터 대 표적 비율로 세포 표면 앵커링된 항-CD3 단일 사슬 항체 단편을 발현하도록 조작된 CEA+ 종양 세포 (활성화 종양)와 혼합하였고 IL-2는 ELISA를 통해서 상청액에서 측정하였다. 데이터는 LS174T 세포 (A, B & C) 및 LoVo (D & E)를 사용하여 수득하였다.
도 4 - T-세포 증식에 대한 CoStAR의 효과. 5x105 형질도입 및 비형질도입 T-세포는 6.25x103 야생형 LoVo 또는 LoVo-OKT3 세포와 IL-2의 존재 (A) 또는 부재 (B) 하에서 혼합되었고 세포 계측은 3일 후에 하였다. 동일 세포 비율 하의 다른 어세이에서, 2 도너로부터의 T-세포를 증식 염료로 로딩하였고 세포가 겪은 증식 주기의 수는 유세포측정을 사용하여 6일 후에 염료 희석을 통해서 결정하였다.
도 5 - 초대 인간 T-세포에서 CoStAR 융합 수용체의 IL-2 활성. 7 도너로부터의 정상 도너 CD8+ T-세포 (대조군 CoStAR이 3 도너인 것 제외)는 표시된 CEA-표적화 CoStAR을 렌티바이러스로 형질도입시켰고 IL-2 생산은 LoVo-OKT3 세포의 존재 하에서 밤새 자극 후에 평가하였다. IL-2 양성 세포의 비율은 CD34 음성 (CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+ (CoStAR 형질도입) 개체군 둘 모두에서 세포내 흐름 염색을 사용해 결정하였다. 별표는 * p<0.05인 대응 윌콕슨 (Wilcoxon) 부호 순위 검정을 사용한 형질도입 및 비형질도입 개체군 간 유의한 편차를 보여준다.
도 6A-6D - 초대 인간 T-세포에서 CoStAR 활성의 다중 매개변수 분석. 정상 도너 CD8+ T-세포는 CoStAR을 표적화하는 표시된 CEA-를 렌티바이러스로 형질도입시켰고 IL-2 생산은 LoVo-OKT3 세포의 존재 하에서 밤새 자극 후에 평가하였다. IL-2 (7 도너) (도 6A), IFNγ (7 도너) (도 6B), bcl-xL (5 도너) (도 6C) 및 CD107a (6 도너) (도 6D) 양성 세포의 비율은 CD34 음성 (CoStAR 비형질도입) 및 CD34+ (CoStAR 형질도입) 개체군 둘 모두에서 세포내 흐름 염색을 사용하여 결정하였다. 대조군은 CoStAR을 표적화하는 비-특이적 CA125이고 모든 예에서 3 도너로부터 유래된다. 히트 맵은 정의된 조건 하에서 특정 판독치에 대해 양성인 세포의 백분율과 관련된 색상 강도를 갖는 모든 도너의 평균이다.
도 7 - CD40은 CD28-기반 CoStAR로부터의 IL-2 생산을 증강시킨다. 건강한 3 도너로부터의 초대 인간 T-세포는 세포외 도메인 절두된 CD28 (Tr CD28), 전체 길이 CD28 (FL CD28), 또는 CEA 특이적 scFv (MFE23)를 보유하는 CD28.CD40-기반 CoStAR로 형질도입시키거나 또는 비형질도입인 채로 두었다. 형질도입된 세포는 CD34 마커 유전자를 사용하여 선택하였고 분석 전에 확장시켰다. T-세포는 ELISA에 의한 IL-2 생산의 분석 전에 20시간 동안 CEA+ LoVo 세포를 발현하는 OKT3과 8:1의 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다.
도 8 - CoStAR-매개 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포는 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드 (C7)를 보유하는 DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 에피토프-태그된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR이 형질도입되었다. T-세포는 OKT3 발현, CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3과 혼합되었다. 형질도입된 세포의 수는 7일 내지 21일 마다 계측하였고, 각 계측 후에 신선한 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
도 9 - (A 내지 I) CoStAR-매개 T-세포 확장에 대한 신호전달 도메인 및 표적 항원의 효과. T-세포는 CA125, FolR 또는 CEA 특이적 scFv, 또는 FolR 특이적 결합 펩티드 (C7)를 보유하는 DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 에피토프-태그된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR이 형질도입되었다. T-세포는 OKT3 발현, CA125+/FolR+/CEA- 세포주 OVCAR3과 혼합되었다. 형질도입된 세포의 수는 7일 내지 21일 마다 계측하였고, 각 계측 이후에 신선한 OVCAR3 세포를 첨가하였다.
도 10 - (A 및 B) CD40 기반 CoStAR은 TCR-전달의 모델에서 T-세포의 공자극을 증강시킨다. 건강한 3 도너로부터의 초대 인간 T-세포는 MFE (개방 또는 밀폐 원형) 또는 CA125 (개방 사각형) 특이적 scFv를 보유하는 DYKDDDK-태그된 CD28 또는 CD28.CD40 기반 CoStAR이 더해진 CEA 특이적 TCR이 형질도입되었다. T-세포는 CEA+/CA125- H508 세포와 1:1의 이펙터:표적 비율로 혼합하였고, 세포내 사이토카인 염색을 수행하여서 TCR+/CoStAR+, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ 및 TCR-/CoStAR- 개체군에서 반응하는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포의 수를 결정하였다. 양측 ANOVA (Tukey 검정)를 수행하여 활성의 유의한 편차를 결정하였다: *p>0.05, ** p>0.01, *** p>0.001, **** p>0.0001.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 공통으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
공자극성 항원 수용체 (CoStAR)
본 명세서는 (i) 질환- 또는 종양-연관 항원 결합 도메인; 및 (ii) 자극성 수용체 단백질의 세포외 리간드-결합 절편, 및 (iii) 수용체 단백질의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 세포내 절편, 및 (iv) 임의로 제2 수용체 단백질의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 절편을 포함하는 재조합 공자극성 항원 수용체 (CoStAR)을 제공한다. 일정 구현예에서, 세포외 절편 및 제1 세포내 절편은 동일한 수용체 단백질의 절편을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포외 절편 및 제1 세포내 절편은 상이한 수용체 단백질의 절편을 포함한다. 본 발명의 구현예에서, 세포외 절편 및 제1 세포내 절편 간 개재 경막 도메인이 존재한다. 선택적 제2 세포내 절편 및/또는 선택적 제3 세포내 절편을 포함한 구현예는 세포내 절편 사이에 스페이서를 더 포함할 수 있다. 단순한 형태에서, 본 발명의 CoStAR은 이의 동족 항원에 대한 scFv의 관여 및/또는 이의 동족 리간드에 대한 CD28의 관여에 의존하여 공자극성 신호를 전달하는 전체 길이 CD28에 융합된 단일 사슬 항체 단편 (scFv)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "전체 길이 단백질" 또는 "전체 길이 수용체"는 수용체 단백질, 예컨대, 예를 들어, CD28 수용체 단백질을 의미한다. 용어 "전체 길이"는 이의 신호 펩티드가 절단되었을 때 성숙한 수용체 단백질의 N-말단에서, 최대 약 5 또는 최대 10 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산이 결여된 수용체 단백질을 포괄한다. 예를 들어, 수용체 N-말단 신호 펩티드의 특이적 절단 부위가 정의될 수 있지만, 정확한 절단점에서의 가변성이 관찰되었다. 용어 "전체 길이"는 수용체 N-말단 신호 펩티드의 아미노산의 존재 또는 부재를 시사하지 않는다. 일 구현예에서, 용어 "전체 길이" (예를 들어, 본 발명의 일정 양태에 따른 전체 길이 CD28)는 이의 신호 펩티드가 절단되었을 때 성숙한 수용체 단백질의 N-말단에서 최대 약 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 아미노산이 결여된 N-말단 신호 펩티드가 결여된 성숙한 수용체 단백질 (예를 들어, 본 발명의 일정 양태에 따른 CD28)을 포괄한다. SEQ ID NO. 2는 신호 펩티드를 포함하는 성숙한 CD28 단백질을 표시한다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 다양한 양태에 따른 "전체 길이" CD28 수용체는 신호 펩티드를 포함하지 않고, 최대 약 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 아미노산이 성숙한 수용체 단백질의 N-말단 (예를 들어, N-말단 잔기 N, K, I, L 및/또는 V)에서 결여될 수 있다. 이것은 예시적인 융합체, 예를 들어 SEQ ID No. 4-12 (이들은 박스 영역으로 표시된 성숙한 수용체 단백질의 N-말단에서 최대 약 5, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 아미노산이 결여될 수 있음을 유의)로 표시된다.
CoStAR은 모듈 형태를 가지며, 질환-연관 항원, 예를 들어, 종양 연관 항원 항원에 결합하는 항체로부터 수득된 scFv와 함께, 하나 이상의 단백질로부터 수득된 세포외, 경막, 및 세포내 도메인을 포함하도록 구축될 수 있다.
본 발명에 따라서, 일 구현예에서, CoStAR은 질환-연관, 예를 들어, 종양-연관, 항원 수용체, 예컨대 제한없이 종양-연관 항원 특이적 scFv, 및 이의 동족 리간드에 결합할 수 있고 세포내 신호를 제공할 수 있는 제1 공자극성 수용체 단백질을 포함한다. 일정 구현예에서, 제1 공자극성 수용체는 전체 길이 단백질에 비해서 작을 수 있지만 동족 리간드에 결합하고 신호를 전달하기에 충분하다. 일정 구현예에서, 제1 공자극성 수용체 도메인은 전체 길이, 예컨대 제한없이, 전체 길이 CD28이다. 따라서, 항원 특이적 결합 도메인 및 리간드 특이적 수용체 둘 모두는 각각 동족 항원 및 리간드에 결합할 수 있다. 도 1은 CostAR 구성체의 2개 구현예를 도시한다. 양쪽 CoStAR은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서, 및 세포외 리간드 결합 절편 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 전체 길이 공자극성 수용체 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, CoStAR은 항원 결합 도메인, 선택적 스페이서, 공자극성 수용체 단백질의 세포외 리간드-결합 부분, 경막 도메인, 및 제2, 상이한 공자극성 수용체 단백질의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포외 리간드-결합 부분은 CD28 절두, 예를 들어, SEQ ID NO:13와 같이 아미노산 IEV 이후 C-말단 CD28 절두를 포함하고 세포내 신호전달 도메인이 후속된다. 일정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD40 유래이다. 세포외 리간드-결합 및 세포내 신호전달 도메인을 분리시키는 경막 도메인은 제한없이, CD28, CD40 유래일 수 있다. 도 1의 좌측 구성체와 비교하여, 도 1의 우측 구성체는 추가적인 제2 세포내 수용체 신호전달 도메인 및 선택적 스페이서를 더 포함한다. 추가 구현예에서, CoStAR은 추가적 공자극성 도메인, 예를 들어, 제3, 세포내 공자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 이러한 측면에서 제1 (CD3ζ 단독), 제2 (1 공자극성 도메인 + CD3ζ), 또는 제3 세대 (1 초과 공자극성 도메인　+ CD3ζ)로 분류된, 일정 키메라 항원 수용체 (CAR)와 유사할 수 있다.
본 발명의 CoStAR에 유용한 공자극성 수용체 단백질은, 제한없이, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6을 포함하고, 그들 천연 형태에서, 세포외 리간드 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, CD2는 T 세포의 표면에 존재하는 세포 부착 분자인 것을 특징으로 하고 T 세포 활성화에 필요한 세포내 신호를 개시시킬 수 있다. CD27은 B 세포 상에서 그의 발현이 B 세포에서 항원-수용체 활성화를 유도시키는 것인 TNF 수퍼패밀리 (TNFSF)에 속하는 II형 경막 당단백질인 것을 특징으로 한다. CD28은 T 세포 상의 단백질 중 하나이고 항원-제시 세포 상의 CD80 (B7.1) 및 CD86 (B7.2) 리간드에 대한 수용체이다. CD137 (4-1BB) 리간드는 대부분의 백혈구 및 일부 비-면역 세포 상에 존재한다. OX4 리간드는 많은 항원-제시 세포 예컨대 DC2 (수지상 세포), 마크로파지, 및 B 림프구 상에서 발현된다. 일 구현예에서, 공자극성 수용체 단백질은 본 명세서에 정의된 바와 같은 전체 길이 CD28이다.
본 발명의 구현예에서, CoStAR은 치료적 활성을 갖는 세포의 치료적 개체군, 예를 들어, 종양 침윤성 림프구 (TIL)에서 프로모터의 제어 하에서 단독으로 발현될 수 있다. 대안적으로, CoStAR은 키메라 항원 수용체 (CAR) 및/또는 T-세포 수용체 (TCR), 예를 들어, SEQ ID NO:3-12에 기재된 바와 같은, 치료적 이식유전자와 함께 발현될 수 있다 (최대 약 5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 아미노산이 성숙한 수용체 단백질의 N-말단에서 결여될 수 있음을 유의). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 또한 최대 약 5, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 아미노산이 성숙한 수용체 단백질의 N-말단에서 결여된 이들 서열 중 하나를 포함하는, 임의의 SEQ ID NO:3-12에 표시된 바와 같은 서열을 갖는 CoStar 구성체에 관한 것이다. 적합한 TCR 및 CAR은 문헌에 충분히 공지된 것들로서, 예를 들어, 각각 골수종 또는 B-세포 악성종을 치료하는데 성공적으로 사용된, HLA-A*02-NYESO-1 특이적 TCR (Rapoport et al. Nat Med 2015) 또는 항-CD19scFv.CD3ζ 융합 CAR (Kochenderfer et al. J Clin Oncol 2015)이 있다. 본 명세서에 기술된 CoStAR은 임의의 기지 CAR 또는 TCR과 함께 발현될 수 있어서 세포에 조절가능한 성장 스위치를 제공하여서 시험관내 또는 생체내 세포 확장, 및 항암 활성에 대해 TCR 또는 CAR의 형태로 통상의 활성화 기전을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CoStAR을 포함하는 양자 세포 요법에서 사용을 위한 세포 및 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 TCR 및/또는 CAR을 제공한다. CD28을 포함하는 예시적인 CoStAR은 세포외 항원 결합 도메인 및 세포외, 경막 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 제한없이, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술피드 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단일-사슬 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (2가 디아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이적 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지는 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함한, 항체 단편을 의미한다. 항원 결합 도메인은 부모 항체 또는 부모 항체 단편 (예를 들어, 부모 scFv)이 결합하는 동일 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 (FR)에 그라프트된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다.
항원 결합 도메인은 제한없이 종양-연관 항원 (TAA) 및 감염성 질환-연관 항원을 포함하는, 임의의 질환-연관 항원에 특이적이게 만들 수 있다. 일정 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 이중특이적이다. 항원은 버킷 림프종, 신경아세포종, 흑색종, 골육종, 신장 세포 암종, 유방암, 전립선암, 폐 암종, 및 결장암을 포함한, 대부분의 인간 암에서 확인되었다. TAA는 제한없이, CD19, CD20, CD22, CD24, CD33, CD38, CD123, CD228, CD138, BCMA, GPC3, CEA, 폴레이트 수용체 (FRα), 메소테린, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, ULBP 및 HER-2를 포함한다. TAA는 신생항원, 펩티드/MHC 복합체, 및 HSP/펩티드 복합체를 더 포함한다.
일정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 정의된 종양 특이적 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 T-세포 수용체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 세포의 표면 상에서 쌍을 형성하는 αβ 또는 γδ 사슬로 구성된 이종이량체 수용체를 의미한다. 각각의 α, β, γ, 및 δ 사슬은 2개 Ig-유사 도메인으로 구성된다: 상보성 결정 영역 (CDR)을 통해 항원 인식을 부여하는 가변 도메인 (V)과 이어서, 펩티드 및 경막 (TM) 영역을 연결하여 세포막에 앵커링된 불변 도메인 (C). TM 영역은 CD3 신호전달 기구의 불변 서브유닛과 회합된다. 각각의 V 도메인은 3개 CDR을 갖는다. 이들 CDR은 주요 조직적합성 복합체 (pMHC)에 의해 코딩되는 단백질에 결합된 항원성 펩티드간 복합체와 상호작용한다 (Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).
일정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 발현된 단백질의 천연 리간드 또는 이의 종양-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, CD71로도 알려진, 트랜스페린 수용체 1 (TfR1)은 세포 철 항상성 및 증식의 핵심 조절인자인 동종이량체 단백질이다. TfR1은 광범위하게 다양한 세포에서 낮은 수준으로 발현되지만, 과발현이 불량한 예후와 연관된 악성 세포를 포함하여, 신속하게 증식하는 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 트랜스페린 또는 이의 트랜스페린 수용체-결합 단편을 포함한다.
일정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 정의된 종양 연관 항원, 예컨대 제한없이 FRα, CEA, 5T4, CA125, SM5-1 또는 CD71에 특이적이다. 일정 구현예에서, 종양 연관 항원은 종양-특이적 펩티드-MHC 복합체일 수 있다. 이러한 일정 구현예에서, 펩티드는 신생항원이다. 다른 구현예에서, 종양 연관 항원은 펩티드-열충격 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 구현예에서, CoStAR 세포외, 경막 및 세포내 도메인 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:1로 표시된 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 생물학적 분자를 포함하여, 분자의 이종성 개체군의 존재 하에서 표적의 존재를 결정하는 표적 및 항체 또는 항체 모이어티 간 결합을 의미한다. 예를 들어, (에피토프일 수 있는) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 이의 결합에 비해서 더 큰 친화성, 화합성, 보다 신속하게, 및/또는 더 긴 지속기간으로 표적에 결합하는 항체 모이어티이다. 일부 구현예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 이의 결합 친화성에 비해 적어도 약 10배의 결합 친화성으로 항원의 하나 이상의 항원성 결정부 (예를 들어, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 단백질 복합체)와 반응한다.
스페이서 도메인
본 발명의 CoStAR은 임의로 항원 결합 도메인 및 공자극성 수용체 사이에 스페이서 영역을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "스페이서"는 공자극성 단백질의 외부 리간드 결합 도메인으로부터 항원 결합 도메인을 분리시키는 CoStAR의 세포외 구조적 영역을 의미한다. 스페이서는 표적화된 항원 및 수용체 리간드에 접근하는 탄력성을 제공한다. 일정 구현예에서, 긴 스페이서가 적용되어, 예를 들어 막-근위 에피토프 또는 글리코실화된 항원을 표적화한다 (참조: Guest R.D. et al. The role of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens. J.　Immunother. 2005;28:203-211; Wilkie S. et al., Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J.　Immunol. 2008;180:4901-4909). 다른 구현예에서, CoStAR은 예를 들어 막 원위 에피토프를 표적화하기 위해 짧은 스페이서를 보유한다 (참조: Hudecek M. et al., Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013;19:3153-3164; Hudecek M. et al., The nonsignalling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol. Res. 2015;3:125-135). 일정 구현예에서, 스페이서는 제한없이 IgG1, IgG2, 또는 IgG4를 포함하여 IgG 힌지의 전체 또는 일부를 포함하거나 또는 IgG 힌지로부터 유래된다. "Ig 힌지로부터 유래된다"란, IgG 힌지에 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 포함하는 스페이서를 의미힌다. 일정 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 항체 불변 도메인, 예컨대 제한없이 CH2 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, CH2 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 스페이서에서, CH2 도메인은 Fc 수용체에 결합하지 않도록 변형된다. 예를 들어, 골수성 세포에서 Fc 수용체 결합은 CAR T 세포 기능성을 손상시키는 것으로 확인되었다. 일정 구현예에서, 스페이서는 CD28, CD8, 또는 힌지 영역을 포함하는 다른 단백질로부터의 Ig-유사 힌지의 전부 또는 일부를 포함한다. 스페이서를 포함하는 본 발명의 일정 구현예에서, 스페이서는 1 내지 50 아미노산 길이이다.
신호전달 도메인
상기 논의된 바와 같이, 일정 구현예에서, CoStAR은 제한없이, CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6의 세포외 리간드 결합 및 세포내 신호전달 부분을 포함할 수 있는 전체 길이 제1 공자극성 수용체를 포함한다. 다른 구현예에서, 공자극성 수용체는 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 하나의 세포외 리간드 결합 도메인 및 상기 언급된 단백질 중 다른 것의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 일정 구현예에서, CoStAR의 신호전달 부분은 단일 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, CoStAR의 신호전달 부분은 제2 세포내 신호전달 도메인 예컨대 제한없이: CD2, CD27, CD28, CD40, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAM)을 포함한다. 일정 구현예에서, 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 동일하다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 상이하다. 일정 구현예에서, 공자극성 수용체는 이량체화될 수 있다. 이론에 국한되지 않지만, CoStAR은 신호 개시를 위한 다른 부속 분자와 이량체화되거나 또는 회합되는 것으로 여겨진다. 일정 구현예에서, CoStAR은 경막 도메인 상호작용을 통해서 부속 분자와 이량체화되거나 또는 회합된다. 일정 구현예에서, 부속 분자와 이량체화 또는 회합은 공자극성 수용체의 세포외 부분 및/또는, 세포내 부분에서 공자극성 수용체 상호작용에 의해 보조된다.
경막 도메인
경막의 주요 기능은 T 세포 막에서 CoStAR을 앵커링시키는 것이지만, 일정 구현예에서, 경막 도메인은 CoStAR 기능에 영향을 미친다. 일정 구현예에서, 경막 도메인은 전체 길이 제1 공자극성 수용체 도메인에 의해 포함된다. CoStAR 구성체가 한 수용체의 세포외 도메인 및 제2 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 본 발명의 구현예에서, 경막 도메인은 세포외 도메인 또는 세포내 도메인의 것일 수 있다. 일정 구현예에서, 경막 도메인은 CD4, CD8α, CD28, 또는 ICOS로부터의 것이다. Gueden 등은 증가된 CAR T 세포 지속성 및 전체 항-종양 효능과 ICOS 경막 도메인의 사용을 연관시켰다 (Guedan S. et al., Enhancing CAR T　cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 2018;3:96976). 일 구현예에서, 경막 도메인은 세포막에 걸쳐진 소수성 α 헬릭스를 포함한다.
본 발명에 따른 CoStAR 신호전달 도메인의 예는 SEQ ID NO. 3-12로서 제공된다.
변이체
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 항체 모이어티 또는 다른 모이어티의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 모이어티의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 모이어티의 아미노산 서열 변이체는 항체 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 적절한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 모이어티의 아미노산 서열 내 잔기의 결실, 및/또는 삽입, 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의 조합은 최종 구성체에 도달하도록 만들어질 수 있지만, 단 최종 구성체는 바람직한 특징, 예를 들어, 항원-결합성을 보유한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는 항체 결합 도메인 모이어티가 제공된다. 돌연변이 변화를 위한 관심 부위는 항체 결합 도메인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VR) 및 프레임워크 (FR)를 포함한다. 아미노산 치환은 관심 결합 도메인으로 도입될 수 있고 그 산물은 바람직한 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 결합 또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일정 구현예에서, 아미노산 치환은 하나 이상의 제1 공-자극성 수용체 도메인 (세포외 또는 세포내), 제2 공자극성 수용체 도메인, 또는 세포외 공-수용체 도메인으로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CoStAR 단백질 및 특히 본 명세서에 개시된 성분 부분을 비롯하여, 이의 변이체, 즉 CoStAR 단백질 및 특히 본 명세서에 개시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 성분 부분을 포괄한다. 특정 서열을 언급시 용어 "유사성 백분율", "동일성 백분율", 및 "상동성 백분율"은 University of Wisconsin의 GCG 소프트웨어 프로그램 BestFit에 기재된 바와 같이 사용된다. 다른 알고리즘, 예를 들어, BLAST, psiBLAST 또는 TBLASTN ([Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]의 방법을 사용), FASTA ([Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]의 방법을 사용)이 사용될 수 있다.
특정 아미노산 서열 변이체는 1 아미노산, 2, 3, 4, 5-10, 10-20 또는 20-30 아미노산의 삽입, 첨가, 치환, 또는 결실이 기준 서열과 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 잔기가 삽입, 결실, 또는 치환된 기준 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5, 10, 15, 최대 20, 최대 30 또는 최대 40 잔기가 삽입, 결실, 또는 치환될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 보존성 치환이 기준 서열과 상이할 수 있다. 보존성 치환은 유사한 성질을 갖는 상이한 아미노산으로 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 지방족 잔기는 다른 지방족 잔기로 치환될 수 있거나, 비극성 잔기는 다른 비극성 잔기로 치환될 수 있거나, 산성 잔기는 다른 산성 잔기로 치환될 수 있거나, 염기성 잔기는 다른 염기성 잔기로 치환될 수 있거나, 극성 잔기는 다른 극성 잔기로 치환될 수 있거나 또는 방향족 잔기는 다른 방향족 잔기로 치환될 수 있다. 보존성 치환은 예를 들어, 하기 군 내의 아미노산 간에 있을 수 있다:
보존성 치환은 하기 표에 표시된다.
Figure pct00001
아미노산은 공통 측쇄 성질에 따라서 상이한 클래스로 분류될 수 있다: a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. 중성 친수성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; c. 산성: Asp, Glu; d. 염기성: His, Lys, Arg; e. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존성 치환은 이들 클래스의 하나의 구성원을 다른 클래스로 교체하는 것을 수반할 것이다.
세포
본 발명에서 사용하는 세포는 양자 세포 요법에 유용한 임의의 림프구, 예컨대 T-세포 또는 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, 감마/델타 T-세포 또는 T 조절 세포일 수 있다. 세포는 환자에 대해 동종이계 또는 자기유래일 수 있다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개 면역력에서 중심 역할을 하는 림프구 유형이다. 그들은 세포 표면 상에 T-세포 수용체 (TCR)의 존재에 따라서, 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포 (NK 세포)와 구별될 수 있다. 하기에 요약된 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 존재한다. 세포독성 T 세포 (TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. CTL은 그들 표면에서 CD8 분자를 발현한다.
이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는, MHC 클래스 I과 회합된 항원에 결합하여 그들 표적을 인식한다. 조절 T 세포에 의해 분비되는 IL-10, 아데노신, 및 다른 분자를 통해서, CD8+ 세포는 자가면역 질환, 예컨대 실험적 자가면역 뇌척수염을 예방하는, 아네르기 상태로 불활성화될 수 있다.
기억 T 세포는 감염이 해결된 후에 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 서브세트이다. 그들은 그들 동족 항원에 재노출 시 다수의 이펙터 T 세포로 신속하게 확장되어서, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역계에 제공한다. 기억 T 세포는 3개 서브타입을 포함한다: 중심 기억 T 세포 (TCM 세포) 및 2개 유형의 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포). 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다. 조절 T 세포 (Treg 세포)는 이전에 억제인자 T 세포 알려져 있었고, 면역학적 내성의 유지에 핵심적이다. 그들의 주요 역할은 면역 반응의 종료를 향해서 T 세포-매개 면역력을 정지시키는 것이고, 흉선에서 음성 선택의 과정을 탈출하는 자기-반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
CD4+ Treg 세포의 2개 주요 클래스 - 천연 발생 Treg 세포 및 적응성 Treg 세포가 기술되었다. 천연 발생 Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로도 알려짐)는 흉선에서 발생하고 TSLP로 활성화된 골수성 (CD11c+) 및 형질세포양 (CD123+) 수지상 세포 둘 모두와 발생 중인 T 세포 간 상호작용과 연관되었다. 천연 발생 Treg 세포는 FoxP3이라고 하는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별될 수 있다. 적응성 Treg 세포 (Tr1 세포 또는 Th3 세포라고도 알려짐)는 정상 면역 반응 동안 기원할 수 있다.
자연 살해 세포 (또는 NK 세포)는 선천성 면역계의 일부를 형성하는 세포용해성 세포의 유형이다. NK 세포는 MHC 독립적 방식으로 바이러스 감염된 세포로부터의 선천성 신호에 대해 신속한 반응을 제공한다. NK 세포 (선천성 림프구 세포 그룹에 속함)는 대형 과립 림프구 (LGL)로서 정의되고 B 및 T 림프구를 발생시키는 공통 림프구 전구체로부터 분화된 제3 종류의 세포를 구성한다.
일정 구현예에서, 본 발명의 치료적 세포는 CoStAR을 발현하도록 조작된 자기유래 세포를 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명의 치료적 세포는 CoStAR을 발현하도록 조작된 동종이계 세포를 포함한다. CoStAR을 발현하는 자기유래 세포는 수령 동종항원의 TCR-매개 인식에 기인하여 이식편 대 숙주 질환 (GVDH)을 피하는데 유리할 수 있다. 또한, CoStAR 수령체의 면역계는 주입된 CoStAR 세포를 공격하여 거부를 초래할 수 있다. 일정 구현예에서, GVHD를 예방하고, 거부를 감소시키기 위해서, 내생성 TcR은 게놈 편집을 통해서 동종이계 CoStAR 세포로부터 제거된다.
핵산
본 발명의 일 양태는 본 명세서에 기술된 임의의 CoStAR, 폴리펩티드, 또는 단백질 (기능성 부분 및 이의 기능성 변이체 포함)을 코딩하는, 본 발명의 핵산 서열을 제공한다. 본 발명에서 사용되는, 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", 및 "핵산"은 서로 동의어이고자 한다. 수많은 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다. 또한, 폴리펩티드를 발현시키려는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 용법, 예를 들어, 코돈 최적화를 반영하기 위해서 여기에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 통상의 기술을 사용해 만들 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 그들은 단일 가닥일 수 있거나 또는 이중 가닥일 수 있다. 그들은 또한 그들 내에 합성 또는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 많은 상이한 유형의 변형이 당분야에 공지되어 있다. 이들은 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가, 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 골격을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 폴리뉴클레오티드는 당분야에서 이용가능한 임의 방법으로 변형될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 변형은 관심 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 증강시키기 위해 수행될 수 있다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 용어 "변이체", "상동체", 또는 "유도체"는 서열에 대해서 또는 서열로부터 하나 (또는 그 이상)의 핵산의 임의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실, 또는 첨가를 포함한다.
핵산 서열은 SEQ ID NO:2로 표시된 단백질 서열 또는 이의 변이체를 코딩할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된 코돈 최적화된 인간 CD28 핵산 서열 또는 이의 변이체 (도 1에 표시)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 CoStAR을 코딩하는 핵산 서열 및 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 추가 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다.
핵산 서열은 둘 이상의 핵산 서열의 공-발현을 허용하는 서열에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 구성체는 내부 프로모터, 내부 리보솜 진입 서열 (IRES) 서열 또는 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 절단 부위는 자기-절단될 수 있어서, 폴리펩티드가 생산될 때, 임의의 외부 절단 활성에 대한 필요없이 별개 단백질로 즉시 절단된다. 구제역 바이러스 (FMDV) 및 2A 자기-절단성 펩티드를 포함하여, 다양한 자기-절단 부위가 공지되어 있다. 공발현 서열은 내부 리보솜 진입 서열 (IRES)일 수 있다. 공발현 서열은 내부 프로모터일 수 있다.
벡터
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터를 제공한다.
이러한 벡터는 핵산 서열(들) 또는 핵산 구성체(들)를 숙주 세포로 도입시키는데 사용될 수 있어서 본 발명의 제1 양태에 따른 하나 이상의 CoStAR(들), 및 임의로, 하나 이상의 다른 관심 단백질 (POI), 예를 들어 TCR 또는 CAR을 발현한다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존-기반 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조한다.
레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 그들이 이식유전자 또는 이식유전자들의 장기간, 안정한 통합, 및 딸 세포에서 이의 전파를 가능하게 하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구이다. 벡터는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한 림프구를 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입되는 벡터를 제공한다. CoStAR, 및 임의로 TCR 또는 CAR을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CoStAR 및 TCR/CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결시키고, 발현 벡터로 구성체를 도입시켜서 달성된다.
추가의 프로모터 엘리먼트, 예를 들어, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 상류 영역 30-110 bp에 위치하지만, 다수의 프로모터가 또한 출발 부위의 하류에 기능성 엘리먼트를 함유하는 것으로 최근에 확인되었다. 프로모터 엘리먼트 사이의 공간은 흔히 탄력적이어서, 프로모터 기능은 엘리먼트가 서로에 대해서 반전되거나 또는 이동하게 될 때 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 엘리먼트 사이의 공간은 활성이 하락하기 시작하기 전에 50 bp 까지 떨어져 증가될 수 있다.
적합한 프로모터의 일례는 최초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 그에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 항상성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 제한없이 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 최초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 비롯하여, 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 제한없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하여, 다른 항상성 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다.
벡터는 진핵생물 세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 바람직한 핵산 서열의 발현의 조절을 위해 유용한 프로모터를 함유한다. 바이러스 벡터 기술은 당분야에 충분히 공지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있고, 또한, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 제6,326,193호를 참조한다. 일부 구현예에서, 구성체는 SEQ ID NO:3-12 (도 2에 도식적으로 표시)로 표시되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 프로모터의 제어 하에서 다수 이식 유전자 (예를 들어, CoStAR 및 TCR 및/또는 CAR 등)의 발현을 허용하는 다중-시스트론 구성체이다. 일부 구현예에서, 이식유전자 (예를 들어, CoStAR 및 TCR 및/또는 CAR 등)는 자기-절단 2A 펩티드에 의해 이격된다. 본 발명의 핵산 구성체에 유용한 2A 펩티드의 예는 F2A, P2A, T2A 및 E2A를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 구성체는 2개 프로모터를 포함하는 다중-시스트론 구성체로서, 한 프로모터는 CoStAR의 발현을 구동시키고 나머지 프로모터는 TCR 또는 CAR의 발현을 구동시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 프로모터 구성체는 단일-방향이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 프로모터 구성체는 이-방향성이다. CoStAR 폴리펩티드 또는 이의 일부분의 발현을 평가하기 위해서, 세포에 도입시키려는 발현 벡터는 또한 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여서 바이러스 벡터를 통해서 형질감염 또는 형질도입시키고자 하는 세포의 개체군으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 한다.
세포의 공급원
확장 및 유전자 변형 전에 세포의 공급원 (예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)은 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이의 유전자이식 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위 유래 조직, 복수, 흉수 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함하여, 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일 양태에서, T 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 농도구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심 용리를 통해서, 적혈 세포를 용해시키고 단핵구를 고갈시켜서 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
T 세포, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포의 특별한 서브개체군은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 더욱 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, T 세포는 바람직한 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 시간 기간 동안, 항-CD3/항-CD28-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 인큐베이션시켜 단리된다. 일 양태에서, 시간 기간은 약 30분이다. 추가 양태에서, 시간 기간은 30분부터 36시간 이상 및 그 사이에 존재하는 모든 정수값의 범위이다. 추가 양태에서, 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 시간 기간은 10시간 내지 24시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 시간 기간은 24시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간은 종양 조직 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤성 림프구 (TIL)을 단리하는 것과 같이, 다른 세포 유형과 비교하여 소수의 T 세포가 존재하는 임의 상황에서 T 세포를 단리하는데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획의 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용하는 시간을 단순히 단축 또는 연장시키고/시키거나 (본 명세서에서 더욱 기술하는 바와 같이) T 세포에 대한 비드의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 서브개체군은 배양 개시 시 또는 과정 중 다른 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 또는 감소시켜서, T 세포의 서브개체군은 배양 개시시 또는 다른 바람직한 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 다수 라운드의 선택이 또한 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일정 양태에서, 선택 절차를 수행하고 활성화 및 확장 과정에서 "비선택" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택" 세포는 또한 추가의 선택 라운드가 수행될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 개체군의 농축은 음성적으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 수행될 수 있다. 한 방법은 음성적으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 유세포측정 또는 음성 자성 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택을 통해 CD4+ 세포에 대해 농축하기 위해서, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일정 양태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, CD137, PD1, TIM3, LAG-3, CD150 및 FoxP3+ 를 발현하는 조절 T 세포에 대해서 농축하거나 또는 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일정 양태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
본 명세서에 기술된 방법은 예를 들어, 본 명세서에 기술된, 예를 들어, 음성 선택 기술을 사용하여, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 조절 세포-고갈 개체군, CD25+ 고갈 세포인 T 세포의 특이적 서브개체군의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게, T 조절 고갈 세포의 개체군은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
표적 항원에 특이적으로 결합하는 CoStAR 이펙터 세포의 특이적 서브개체군은 양성 선택 기술에 의해 농축될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이펙터 세포는 바람직한 abTCR 이펙터 세포의 양성 선택을 위해 충분한 시간 기간 동안 표적 항원-접합된 비드와 인큐베이션시켜서 농축된다. 일부 구현예에서, 시간 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위 (이들 값 사이의 모든 범위 포함)이다. 일부 구현예에서, 시간 기간은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 6시간이다. 일부 구현예에서, 시간 기간은 10시간 내지 24시간이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 시간 기간은 24시간이다. 이종성 세포 개체군에서 낮은 수준으로 존재하는 이펙터 세포의 단리를 위해서, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대 24시간의 사용이 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형과 비교하여 소수의 이펙터 세포가 존재하는 임의 상황에서 이펙터 세포를 단리하는데 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 상황에서 다수 라운드의 선택이 또한 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 이후에 냉동될 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 이후에, 세포는 냉동 용액에 현탁될 수 있다. 많은 냉동 용액 및 매개변수가 당분야에 공지되어 있고 본 상황에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어, 헤스판 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용하는 것을 포함하고, 다음으로 세포는 분 당 1℃의 속도로 -80℃ 까지 냉동시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장된다. 다른 제어된 냉동 방법을 비롯하여 -20℃ 또는 액체 질소에서 즉각적인 비제어적 냉동이 사용될 수 있다.
동종이계 CoStAR
본 명세서에 기술된 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 동종이계 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 동종이계 T 세포, 예를 들어, 내생성 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 결여된 동종이계 T 세포일 수 있다.
기능성 내생성 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어, 이의 표면 상에서 임의의 기능성 TCR을 발현시키지 않도록 조작될 수 있거나, 기능성 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현시키지 않도록 조작 (예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 엡실론, 및/또는 TCR 제타를 발현시키지 않도록 (또는 감소된 발현을 나타내도록) 조작)될 수 있거나 또는 이의 표면 상에 매우 적은 기능성 TCR을 생산시키도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어, TCR의 하나 이상의 서브유닛의 돌연변이 또는 절두 형태의 발현에 의해서, 실질적으로 손상된 TCR을 발현시킬 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 부정적 면역 반응을 유발시키지 않을 것임을 의미한다.
본 명세서에 기술된 T 세포는 예를 들어 이의 표면 상에 기능성 HLA를 발현시키지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 1 및/또는 HLA 클래스 II가 하향 조절되도록 조작될 수 있다. 일부 양태에서, HLA의 하향 조절은 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)의 발현을 감소 또는 제거시켜서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 결여될 수 있다. 기능성 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한, 임의의 적합한 수단을 통해서 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 군집된 규칙 간격 짧은 회문형 반복부 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (CRISPR), 전사-활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 동종이계 세포는 억제성 분자를 발현시키지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현시키는 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의 방법으로 조작된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 억제성 분자를 발현시키지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현시키는, 예를 들어, 면역 이펙터 반응을 상승시키는 CoStAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는, 세포일 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, Gal9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제를 통한, 억제성 분자의 억제는, CAR-발현 세포 성능을 최적화시킬 수 있다. 구현예에서, 억제성 핵산, 예를 들어, 억제성 핵산, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA, 군집된 규칙 간격 짧은 회문형 반복부 (CRISPR), 전사-활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것이 사용될 수 있다.
내생성 TCR 또는 HLA를 억제하기 위한 siRNA 및 shRNA
일부 구현예에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서, TCR 및/또는 HLA, 및/또는 본 명세서에 기술된 억제성 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, Gal9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제시킬 수 있다.
T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어, 예컨대 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성할 수 있다. TCR의 성분의 발현을 하향 조절시키는 예시적인 shRNA는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0321667호에 기술되어 있다. HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 유전자의 발현을 하향 조절시키는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2007/0036773호에 기술되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하기 위한 CRISPR
본 명세서에서 사용되는 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 CRISPR"은 군집된 규칙 간격 짧은 회문형 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부 세트를 포함하는 시스템을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 의미한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자, 및/또는 본 명세서에 기술된 억제성 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCNl), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 침묵화 또는 돌연변이시키는데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 의미한다.
천연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 시퀀싱된 유박테리아 게놈의 대략 40% 및 시퀀싱된 고세균의 90%에서 존재한다 (Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172). 이러한 시스템은 외래 유전 엘리먼트 예컨대 플라스미드 및 파지에 대한 내성을 부여하는 원핵생물 면역계의 유형이고 적응 면응력의 형태를 제공한다 (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845).
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 번호 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화시킬 수 있고 확장시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 T 세포의 표면 상에서 공자극성 분자를 자극하는 리간드 및 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제를 그에 부착된 표면과 접촉시켜 확장시킬 수 있다. 특히, T 세포 개체군은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 예컨대 표면 상에 고정된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와 접촉시키거나, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성인자 (예를 들어, 브리오스타틴)와 접촉시켜서 자극시킬 수 있다. T 세포의 표면 상의 부속 분자의 공자극을 위해서, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 개체군은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극시키기 위해서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함하고, 당분야에 일반적으로 공지된 다른 방법처럼 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(l-2):53-63, 1999).
일부 구현예에서, 확장은 당업자에게 공지된 플라스크 또는 용기, 또는 가스-투과성 용기를 사용해 수행될 수 있고, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일, 약 7일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 14일, 또는 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
일정 구현예에서, 확장은 인터루킨-2 (IL-2) 또는 인터루킨-15 (IL-15)의 존재 하에서 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 수행될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 예를 들어 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/mL의 OKT3, 마우스 단일클론 항-CD3 항체 (Ortho-McNeil, Raritan, N.J. 또는 Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.에서 상업적으로 입수가능) 또는 UHCT-1 (BioLegend, San Diego, Calif., USA에서 상업적으로 입수가능)을 포함할 수 있다. CoStAR 세포는 임의로 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에서, 임의로 벡터로부터 발현될 수 있는, 그의 항원성 부분을 포함하여, 암의 하나 이상의 항원, 예컨대 에피토프(들), 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3.mu.M MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)을 포함하여 시험관 내에서 확장시킬 수 있다. 다른 적합한 항원은 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 이의 항원성 부분을 포함할 수 있다. CoStAR 세포는 또한 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상에서 펄스된 암의 동일 항원(들)으로 재자극하여 신속하게 확장시킬 수 있다. 대안적으로, CoStAR 세포는 예를 들어, 예를 들어, 조사된, 자기유래 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 더 자극될 수 있다. 일부 구현예에서, 자극은 확장의 일부로서 일어난다. 일부 구현예에서, 확장은 조사된, 자기유래 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2의 존재 하에서 일어난다.
일정 구현예에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL, 또는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일정 구현예에서, 세포 배양 배지는 OKT3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 약 1 ㎍/mL 또는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 또는 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT3 항체를 포함한다.
일정 구현예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21의 조합은 확장 동안 조합으로서 적용된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21을 비롯하여 이의 임의 조합은 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21의 조합은 확장 동안 조합으로서 적용된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21을 비롯하여 이의 임의 조합이 포함될 수 있다.
일정 구현예에서, 확장은 IL-2, OKT-3, 및 항원-제시 피더 세포를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다.
일정 구현예에서, 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15, 또는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15, 또는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15 또는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15 또는 약 200 IU/mL의 IL-15, 또는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21, 또는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-제시 피더 세포 (APC)는 PBMC이다. 일 구현예에서, 확장에서 CoStAR 세포 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비율은 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500, 또는 1 대 50 내지 1 대 300, 또는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
일정 양태에서, T 세포에 대한 제1 자극성 신호 및 공자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있을 수 있거나 또는 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태) 또는 별도 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 표면에 커플링될 수 있고 나머지 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 양태에서, 공자극성 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고 제1 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 커플링된다. 일정 양태에서, 양쪽 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 양태에서, 작용제는 가용성 형태일 수 있고, 그 다음으로 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체를 발현하는 세포 또는 작용제에 결합하게 될 다른 결합제에 가교된다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장시키는데 사용을 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대해서 미국 특허 출원 공개 번호 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일 양태에서, 2개 작용제는 동일한 비드 상에, 즉, "시스"로, 또는 별도 비드 상에, 즉, "트랜스"로 고정된다. 예로서, 제1 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 공자극성 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고; 양쪽 작용제는 등가의 분자량으로 동일한 비드에 함께 고정된다. 일 양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해서 비드에 결합된 각 항체의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 일정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율이 사용되어 1:1의 비율을 사용해 관찰된 확장에 비해 T 세포 확장의 증가가 관찰된다. 일 특정 양태에서, 약 1에서 약 3배의 증가가 1:1의 비율을 사용해 관찰된 확장과 비교하여 관찰된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 및 이 사이에 존재하는 모든 정수값 범위이다. 본 발명의 일 양태에서, 항-CD3 항체에 비해서 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 다시 말해서, CD3:CD28의 비율은 1 미만이다. 본 발명의 일정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1 초과이다. 일 특정 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:100의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:75의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 추가 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:50의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:30의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 바람직한 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:10의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:3의 CD3:CD28 비율이 사용된다. 역시 일 양태에서, 비드에 결합된 항체의 3:1의 CD3:CD28 비율이 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 이 사이의 임의의 정수 값인 입자 대 세포의 비율이 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극시키는데 사용될 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있듯이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 작은 크기 비드는 오직 소수 세포에 결합할 수 있지만, 더 큰 비드는 많은 것들에 결합할 수 있다. 일정 양태에서, 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1 및 이 사이의 임의의 정수값의 범위이고 추가 양태에서 비율은 1:9 내지 9:1 및 이 사이의 임의의 정수값을 포함하고, T 세포를 자극시키는데 또한 사용될 수 있다. T 세포 자극을 일으키는 T 세포에 대한 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자의 비율은 상기 언급된 바와 같이 다양할 수 있지만, 일정 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 바람직한 비율은 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 일 양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비율이 사용된다. 일 특정 양태에서, 바람직한 입자 대 세포 비율은 1:5 이다. 추가 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극일에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가 입자가 1:1 내지 1:10의 최종 비율 (첨가일의 세포 계측수 기반)로, 최대 10일 까지 매일 또는 이후 2일마다 세포에 첨가된다. 일 특정 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극의 제1일에 1:1이고, 자극의 제3일 및 제5일에 1:5 까지 조정된다. 일 양태에서, 입자는 제1일에 1:1의 최종 비율까지, 그리고 자극의 제3일 및 제5일에 1:5 까지 매일 또는 2일 마다 첨가된다. 일 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극의 제1일에 2:1이고 자극의 제3 및 제5일에 1:10 까지 조정된다. 일 양태에서, 입자는 제1일에 1:1의 최종 비율까지, 그리고 자극의 제3 및 제5일에 1:10 까지 매일 또는 2일 마다 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에서 사용에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 다양할 것이다. 일 양태에서, 사용에 가장 전형적인 비율은 제1일에 1:1, 2:1 및 3:1의 근처이다.
본 발명의 추가 양태에서, 세포, 예컨대 T 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포를 이후에 분리시킨 다음에, 세포가 배양된다. 대안적인 양태에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가 양태에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자기력을 인가하여 농축되어, 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 일으켜서, 세포 자극을 유도한다.
CoStAR 세포의 제조
바이러스- 및 비-바이러스-기반 유전자 조작 도구를 사용하여, CoStAR T　세포를 생성시켜서, 치료 유전자의 영구적 또는 일시적 발현을 일으킬 수 있다. 레트로바이러스-기반 유전자 전달은 숙주 세포 게놈으로 CAR을 영구적으로 통합시키는데 사용된, 원숙된, 충분히-특징규명된 기술이다 (Scholler J., e.g. Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T　cells. Sci. Transl. Med. 2012;4:132ra53; Rosenberg S.A. et al., Gene transfer into humans―immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N.　Engl. J. Med. 1990;323:570-578).
비-바이러스 DNA 형질감염 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, Singh 등은 CAR T 세포를 조작하기 위해서 개발된 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) (SB) 트랜스포존 시스템의 사용 (Singh H., et al., Redirecting Specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 2008;68:2961-2971)을 기술하고, 임상 시험에서 사용하고 있다 (참조: 예를 들어, ClinicalTrials.gov: NCT00968760 및 NCT01653717). 동일한 기술은 CoStAR 세포를 조작하는데 적용가능하다.
다중 SB 효소가 이식유전자를 전달하는데 사용되어 왔다. Mates는 1세대 트랜스포사제와 비교했을 때 효율이 대략 100배 증강된 초활성 트랜스포사제 (SB100X)를 기술한다. SB100X는 조혈 줄기 또는 전구체 세포에서 농축된 인간 CD34(+) 세포에 35-50%의 안정된 유전자 전달을 지원하고 (Mates L. et al., Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genet. 2009;41:753-761), 다수 이식유전자가 다중시스트론 단일 플라스미드 (예를 들어, Thokala R. et al., Redirecting specifity of T　cells using the Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+ tumors. PLoS ONE. 2016;11:e0159477) 또는 복수 플라스미드 (예를 들어, Hurton L.V. et al., Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T　cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016;113:E7788-E7797)로부터 전달될 수 있다. 이러한 시스템은 본 발명의 CoStAR과 사용된다.
Morita 등은 더 큰 이식유전자를 통합시키기 위한 piggyBac 트랜스포존 시스템을 기술한다 (Morita D. et al., Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBac transposon-engineered T　cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2017;8:131-140). Nakazawa 등은 HER2-합성 키메라 항원 수용체를 발현하는 EBV-특이적 세포독성 T-세포를 생성시키기 위한 시스템의 사용을 기술한다 (Nakazawa Y et al, PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor. Mol. Ther. 2011;19:2133-2143). Manuri 등은 CD-19 특이적 T 세포를 생성시키는 시스템을 사용하였다 (Manuri P.V.R. et al., piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T　cells for the treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 2010;21:427-437).
트랜스포존 기술은 쉽고 경제적이다. 한가지 잠재적인 단점은 현재 적용되는 보다 긴 확장 프로토콜이 T 세포 분화, 손상된 활성, 및 주입된 세포의 나쁜 지속성을 일으킬 수 있다. Monjezi 등은 더 높은 통합 효율을 통해서 이들 단점을 최소화시킨 미니서클 벡터의 개발을 기술한다 (Monjezi R. et al., Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. leukemia. 2017;31:186-194). 이들 트랜스포존 기술은 본 발명의 CoStAR에 사용될 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 하나 이상의 추가 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 본 발명의 벡터 또는 CoStAR 발현 세포를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 기술된 CoStAR 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기술된 임의의 구현예에 따른 CoStAR을 코딩하는 핵산 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기술된 CoStAR을 발현하는 이펙터 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 이러한 제제는 예를 들어 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한" 또는 "약학적으로 상용성"은 생물학적으로 또는 달리 비바람직한 것이 아닌 재료를 의미하고, 예를 들어, 재료는 이것이 함유되는 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하거나 또는 임의의 유의한 비바람직한 생물학적 효과를 초래하지 않고 환자에게 투여되는 약학 조성물에 유입될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 바람직하게 독성학 및 제조 검사의 필수 표준을 충족하고/하거나 미국 식약청이 만든 비활성 성분 가이드에 포함된다.
본 발명의 일 양태는 재조합 CoStAR을 발현하는 변형된 T 세포의 개체군을 제공한다. 적합한 개체군은 상기 기술된 방법으로 제조될 수 있다.
변형된 T 세포의 개체군은 약물로서 사용을 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포의 개체군은 암 면역요법, 예를 들어, 양자 T 세포 요법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 암의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포의 개체군의 용도, 암의 치료를 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포의 개체군을 제공하고, 암의 치료 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포의 개체군을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
변형된 T 세포의 개체군은 자기유래일 수 있는데, 다시 말해서, 변형된 T 세포는 본래 그들이 이후에 투여되는 동일 개체로부터 수득되었다 (즉, 도너 및 수령 개체가 동일). 개체에게 투여를 위한 변형된 T 세포의 적합한 개체군은 개체로부터 수득된 T 세포의 초기 개체군을 제공하는 단계, 개체에서 cAMP PDE 또는 이의 단편 및 암 세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계, 및 변형된 T 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
변형된 T 세포의 개체군은 동종이계일 수 있는데, 즉 변형된 T 세포는 본래 그들이 이후에 투여되는 개체에 대해 상이한 개체 (즉, 도너 및 수령 개체 상이)로부터 수득되었다. 도너 및 수령 개체는 GVHD 및 다른 비바람직한 면역 효과를 피하기 위해서 HLA 일치일 수 있다. 수령 개체에게 투여를 위한 변형된 T 세포의 적합한 개체군은 도너 개체로부터 수득된 T 세포의 초기 개체군을 제공하는 단계, 수령 개체에서 암 세포에 특이적으로 결합하는 CoStAR을 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계, 및 변형된 T 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
변형된 T 세포의 투여 후에, 수령 개체는 수령 개체에서 암 세포에 대해 T 세포 매개 면역 반응을 나타낼 수 있다. 이것은 개체에서 암 병태에 대한 유리한 효과일 수 있다.
암 병태는 악성 암 세포의 비정상적 증식을 특징으로 할 수 있고, 백혈병, 예컨대 AML, CML, ALL 및 CLL, 림프종, 예컨대 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 다발성 골수종, 및 고형암 예컨대 육종, 피부암, 흑색종, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 직결장암, 자궁경부암, 간암, 두경부암 식도암, 췌장암, 신장암, 부신암, 위암, 고환암, 담낭 및 담도의 암, 갑상선암, 흉선암, 골암, 및 뇌암을 비롯하여, 원발부위 불명 암 (CUP)을 포함할 수 있다.
개체 내에서 암 세포는 개체의 정상 체세포와 면역학적으로 구별될 수 있다 (즉, 암성 종양이 면역원성일 수 있음). 예를 들어, 암 세포는 암 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 대해 개체에서 전신 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 면역 반응을 유발시키는 종양 항원은 암 세포에 특이적일 수 있거나, 또는 개체에서 하나 이상의 정상 세포와 공유될 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 치료에 적합한 개체는 포유동물, 예컨대 설치류 (예를 들어, 기니 피그, 햄스터, 래트, 마우스), 쥐과동물 (예를 들어, 마우스), 갯과 동물 (예를 들어, 개), 고양잇과 동물 (예를 들어, 고양이), 말류 (예를 들어, 말), 영장류, 원숭이류 (예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이 (예를 들어, 마모셋, 바분), 유인원 (예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 기본), 또는 인간일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다. 다른 바람직한 구현예에서, 비-인간 포유동물, 특히 인간에서 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 통상 사용되는 포유동물 (예를 들어, 쥣과동물, 영장류, 돼지, 고양이, 또는 토끼 동물)이 사용될 수 있다.
치료 방법
용어 "치료적 유효량"은 개체에서 질환 또는 장애를 "치료하는"데 유효한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 암의 경우에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기 또는 무게를 감소시킬 수 있고/있거나; 말초 장기로 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 중지)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게 중지)시키고/시키거나; 어느 정도까지, 종양 성장을 억제시키고/시키거나; 어느 정도까지, 암과 연관된 하나 이상의 증상을 경감시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물이 성장을 방지할 수 있고/있거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 세포증식억제성일 수 있고/있거나 세포독성일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 성장 억제량이다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선시키는 양이다. 감염성 질환, 예컨대 바이러스 감염의 경우에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CoStAR 또는 CoStAR을 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 병원체에 감염된 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 병원체-유래 항원의 생산 또는 방출을 감소시킬 수 있고/있거나; 미감염된 세포로 병원체의 확산을 억제 (즉, 어느 정도로 둔화시키고 바람직하게 중지)시키고/시키거나; 감염과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 경감시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다.
본 발명의 방법에서 사용을 위한 CoStAR을 발현하는, T 및 NK 세포를 포함하는, 세포는 환자 자신의 말초 혈액 (자기유래)으로부터, 또는 도너 말초 혈액 (동종이계), 또는 미관련 도너로부터의 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포 이식의 상황에서, 생체외에서 생성시킬 수 있다. 대안적으로, T-세포 또는 NK 세포는 T-세포 또는 NK 세포로 유도성 전구체 세포 또는 배아 전구체 세포의 생체외 분화로부터 유래될 수 있다. 이들 예에서, CoStAR 및, 임의로, CAR 및/또는 TCR을 발현하는 T-세포는 바이러스 벡터의 형질도입, DNA 또는 RNA의 형질감염을 포함한, 많은 수단 중 하나를 통해서, CoStAR 및, 임의로, CAR 및/또는 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입시켜 생성된다.
본 발명의 CoStAR을 발현하고, 임의로, TCR 및/또는 CAR을 발현하는, T 또는 NK 세포는 혈액학적 암 또는 고형 종양의 치료를 위해서 사용될 수 있다.
질환의 치료를 위한 방법은 본 발명의 T 또는 NK 세포를 포함한, 세포 또는 벡터의 치료적 용도에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 벡터, 또는 T 또는 NK 세포는 질환과 연관된 적어도 하나의 증상을 축소, 감소 또는 개선시키고/시키거나 질환의 진행을 둔화, 감소 또는 차단시키기 위해서, 질환 또는 병태가 존재하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 암 세포의 T-세포 매개 사멸을 초래 또는 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 따른, 벡터, 또는 T 또는 NK 세포는 하나 이상의 추가의 치료제와 환자에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료제는 환자에게 공동-투여될 수 있다. "공동-투여"란, 하나 이상의 추가적 치료제 및 본 발명의 벡터, 또는 T 또는 NK 세포를 벡터, 또는 T 또는 NK 세포가 하나 이상의 추가적 치료제의 효과를 증강시킬 수 있거나, 또는 그 반대일수도 있도록 충분히 가까운 시간에 투여되는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 벡터 또는 세포가 첫번째로 투여될 수 있고 하나 이상의 추가적 치료제가 두번째로 투여될 수 있거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 대안적으로, 벡터 또는 세포 및 하나 이상의 추가적 치료제는 동시에 투여될 수 있다. 유용할 수 있는 하나의 공동-투여 치료제는 IL-2이고, 이것이 현재 투여된 세포의 활성을 증가시키기 위해 현행 세포 요법에서 현재 사용되고 있기 때문이다. 그러나, IL-2 치료는 독성 및 내약성 문제와 연관된다.
언급된 바와 같이, 환자에게 투여를 위해서, CoStAR 이펙터 세포는 환자에 대해 동종이계일 수 있거나 또는 자기유래일 수 있다. 일정 구현예에서, 동종이계 세포는 GVHD 및/또는 CoStAR 세포에 대한 환자의 면역 반응을 최소화시키고 예방하기 위해서, 예를 들어 유전자 편집을 통해서 더욱 유전자 변형된다.
CoStAR 이펙터 세포는 표적 항원과 연관된 암 및 신생물성 질환을 치료하는데 사용된다. 본 명세서에 기술된 임의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 암 및 신생물성 질환은 혈관화되지 않았거나, 또는 아직 실질적으로 혈관화되지 않은 종양을 비롯하여, 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비고형 종양 (예컨대, 혈액학적 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CoStAR 이펙터 세포로 치료하려는 암의 유형은 제한없이, 암종, 아세포종, 및 육종, 및 일정 백혈병 또는 림프구 악성종, 양성 및 악성 종양, 및 악성종 예를 들어, 육종, 암종, 및 흑색종을 포함한다. 성인 종양/암 및 소아 암/종양이 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적 (또는 혈행성) 암의 예는 급성 백혈병 (예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병 (예컨대 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 다혈구증, 림프종, 호지킨 질환, 비호지킨 림프종 (무통성 및 고급형), 다발성 골수종, 형질세포종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성 증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한, 백혈병을 포함한다.
고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성일 수 있거나 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 그들을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다 (예컨대, 육종, 암종, 및 림프종). 육종 및 암종같은 고형 종양의 예는 부신피질암종, 담관암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 기타 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 위암, 림프 악성종, 췌장암, 유방암, 폐암s, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선암 (예를 들어, 갑상선 수질 암종 및 갑상선 유도 암종), 갈색세포종 피지선 암종, 유도 암종, 유도 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 빌름스 종양, 자궁경부암 (예를 들어, 자궁경부 암종 및 전암 자궁경부 이형성증), 직결장암, 항문, 항문관, 또는 항문직장의 암, 질암, 외음부의 암 (예를 들어, 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 및 섬유육종), 음경암, 구강인두암, 식도암, 두부암 (예를 들어, 편평 세포 암종), 경부암 (예를 들어, 편평 세포 암종), 고환암 (예를 들어, 정상피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 라이디히 세포 종양, 섬유종, 섬유선종, 선종 종양, 및 지방종), 방광 암종, 신장암, 흑색종, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막 암종), 요로상피 암 (예를 들어, 편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종, 요관암, 및 방광암), 및 CNS 종양(예컨대, 신경교종 (예컨대, 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교아세포종 (다형성 교아세포종이라고도 함), 성상세포종, CNS 림프종, 생식세포종, 수아세포종, 신경초종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청각신경종, 희돌기교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이)를 포함한다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 표시될 때, 투여하려는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태의 개체 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본 명세서에 기술된 T 세포를 포함하는 약학 조성물은 그 범위 내 모든 정수값을 포함하여, 104 내지 109 세포/체중 kg, 일부 예에서, 105 내지 106 세포/체중 kg의 용량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 진술할 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 용량으로 다수회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 알려진 주입 기술을 사용해 투여될 수 있다 (참조:, 예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
병용 요법
본 명세서에 기술된 CoStAR-발현 세포는 다른 기지의 작용제 및 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용시 "병용하여" 투여된다는, 둘 (또는 그 이상)의 상이한 치료가 장애를 앓는 대상체의 과정 동안 대상체에게 전달된다는 것을 의미하며, 예를 들어, 둘 이상의 치료는 대상체가 장애를 진단받은 이후 및 장애가 치유 또는 제거되었거나 또는 치료가 다른 이유로 중단되기 전에 전달된다. 일부 구현예에서, 한 치료의 전달은 여전히 두번째의 전달이 시작될 때 일어나서, 투여 기간의 중복이 존재한다. 이것은 때때로 본 명세서에서 "동시" 또는 "동시발생 전달"이라고 한다. 다른 구현예에서, 한 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종결된다. 양쪽 경우의 일부 구현예에서, 치료는 병용 투여때문에 더 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 더 효과적인데, 예를 들어, 동등한 효과가 더 적은 제2 치료에서 확인되거나, 또는 제2 치료가 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에서 투여된 경우에 확인되는 것에 비해서 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 제1 치료에서 확인된다. 일부 구현예에서, 전달은 장애와 관련된 증상, 또는 다른 매개변수의 감소가 다른 치료 부재 하에서 전달된 한 치료에서 관찰된 것에 비해서 더 크도록 한다. 2개 치료의 효과는 부분적으로 가산적일 수 있거나, 전체로 가산적일 수 있거나, 또는 더 가산적일 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 두번째가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 될 수 있다.
본 명세서에 기술된 CoStAR-발현 세포 및 적어도 하나의 추가적 치료제는 동시에, 동일 또는 별도 조성물로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 본 명세서에 기술된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고, 추가 작용제가 두번째로 투여될 수 있거나, 또는 투여 순서는 반전될 수 있다.
CoStAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 모달리티는 활동적 장애 기간 동안, 또는 관해 또는 덜 활동적인 질환의 기간 동안 투여될 수 있다. CoStAR 요법은 다른 치료 전에, 치료와 동시에, 치료 후에, 또는 장애의 관해 동안 투여될 수 있다.
병용 투여될 때, 요법 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2, 또는 제3 작용제), 또는 전부는 예를 들어, 단일요법으로서, 개별적으로 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량에 비해 더 높거나, 더 낮거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 일정 구현예에서, CoStAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2, 또는 제3 작용제), 또는 전부의 투여되는 양 또는 용량은 예를 들어, 단일요법으로서, 개별적으로 사용되는 각 작용제의 양에 비해서 적다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 구현예에서, 바람직한 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 일으키는, CoStAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2, 또는 제3 작용제), 또는 전부의 양 또는 용량은 동일한 치료 효과를 달성하는데 필요한, 예를 들어, 단일요법으로서, 개별적으로 사용되는 각 작용제의 양 또는 용량에 비해서 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮음).
추가 양태에서, 본 명세서에 기술된 CoStAR-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역황폐화제 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 조사, 펩티드 백신, 예컨대 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기술된 것과 병용하여 치료 용법에서 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예컨대 다른 항암제, 항알레르기제, 항-구토제 (또는 제토제), 진통제, 세포보호제, 및 이의 조합과 병용된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CoStAR-발현 세포는 화학요법제와 병용하여 사용될 수 있다. 예시적인 화학요법제는 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신 (예를 들어, 리포솜 독소루비신)), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체 (예를 들어, 알렘투주맙, 젬투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙), 항대사제 (예를 들어, 폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 푸린 유사체, 및 아데노신 디아미나제 억제제 (예를 들어, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질 (GITR) 효현제, 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신, 또는 보르테조밉), 면역조절제 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유사체 (예를 들어, 레날리도미드)를 포함한다.
병용 요법에서 사용이 고려되는 일반적인 화학요법제는 부설판 (Myleran®), 부설판 주사 (Busulfex®), 클라드리빈 (Leustatin®), 사이클로포스파미드 (Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사 (DepoCyt®), 다우노루비신 히드로클로라이드 (Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (DaunoXome®), 덱사메타손, 독소루비신 히드로클로라이드 (Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드 (Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트 (Fludara®), 히드록시우레아 (Hydrea®), 이다루비신 (Idamycin®), 미톡산트론 (Novantrone®), 젬투주맙 오조가미신 (mylotarg®)을 포함한다.
구현예에서, 병용 요법에서 사용이 고려되는 일반적인 화학요법제는 아나스트로졸 (Arimidex®), 비칼루타미드 (Casodex®), 블레오마이신 술페이트 (Blenoxane®), 부설판 (Myleran®), 부설판 주사 (Busulfex®), 카페시타빈 (Xeloda®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (Paraplatin®), 카르무스틴 (BiCNU®), 클로람부실 (Leukeran®), 시스플라틴 (Platinol®), 클라드리빈 (Leustatin®), 사이클로포스파미드 (Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈 시토신 아라비노시드 (Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사 (DepoCyt®), 다카르바진 (DTIC-Dome®), 닥티노마이신 (악티노마이신 D, 코스메간), 다우노루비신 히드로클로라이드 (Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀 (Taxotere®), 독소루비신 히드로클로라이드 (Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드 (Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트 (Fludara®), 5-플루오로우라실 (Adrucil®, Efudex®), 플루타미드 (Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (Hydrea®), 이다루비신 (Idamycin®), 이포스파미드 (IFEX®), 이리노테칸 (Camptosar®), L-아스파라기나제 (ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (Alkeran®), 6-머캅토푸린 (Purinethol®), 메토트렉세이트 (Folex®), 미톡산트론 (Novantrone®), 킬로타르그, 파클리탁셀 (Taxol®), 피닉스 (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 임플란트와 폴리페프로산 20 (Gliadel®), 타목시펜 시트레이트 (Nolvadex®), 테니포시드 (Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (Tirazone®), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (Hycamptin®), 빈블라스틴 (Velban®), 빈크리스틴 (Oncovin®), 및 비노렐빈 (Navelbine®)을 포함한다.
치료는 예를 들어 종양 퇴행, 종양 무게 또는 크기 수축, 진행까지 시간, 생존 지속기간, 무진행 생존, 전체 반응률, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성을 통해 평가될 수 있다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법은 예를 들어, 방사선학 영상법을 통한 반응의 측정을 포함하는 것이 적용될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 절들에 더욱 기술된다:
1. 종양-연관 항원 특이적 결합 도메인에 융합된 전체 길이 공자극성 수용체를 포함하는 키메라 공자극성 수용체 (CoStAR)로서, 전체 길이는 리더 서열이 결여되고 성숙 단백질의 바로 N-말단에서 최대 5 아미노산 결실 또는 돌연변이를 갖는 전체 성숙 단백질을 의미하고, 과정은 키메라 수용체로 공자극성 도메인의 최적 스플라이싱을 위해 중요하다.
2. 제1 절의 CoStAR에 있어서, 상기 공자극성 수용체는 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6의 군으로부터 선택된다.
3. 제1 절 및 제2 절에 요약된 CoStAR 융합 수용체로서, 공자극성 도메인은 단일 수용체 형태로 융합된 둘 이상의 공자극성 수용체 도메인으로 이루어지고, 연결 영역은 직접 융합이거나 또는 링커 영역 예컨대 최대 50 아미노산 길이의 링커를 함유한다.
4. 전술한 절 중 어느 하나의 CoStAR에 있어서, 상기 항원 특이적 결합 도메인은 하기 I-V로부터 유래된다:
I. 제한없이, 암배 항원 (CEA), 5T4, 멜라노트랜스페린 (CD228), 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP/CSPG4), CD71, 폴레이트 수용체 또는 CA125를 포함하는 종양 연관 항원에 결합하는 단일 사슬 항체 단편; 또는
II. 종양 특이적 펩티드 (p)-주요 조직적합성 (MHC) 복합체에 결합하는 단일 사슬 항체 단편; 또는
III. 종양 특이적 pMHC 복합체 항원 특이적 단일 사슬 T-세포 수용체 (scTCR); 또는
IV. 천연 항원 결합 폴리펩티드 예컨대, 제한없이, 트랜스페린; 또는
V. 항체 (예를 들어, Fc 결합 도메인 예컨대, 제한없이, CD16, CD32 또는 CD64)에 결합하는 도메인, 또는 항원 인식의 다른 간접 방법.
5. 관심 단백질 (POI) 예컨대 마커 유전자 (예를 들어, DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 에피토프 태그, CD34, CD19 등), 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR) 또는 양자 세포 요법을 위한 면역치료적 사용의 다른 수용체에 융합된 전술한 절 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
6. 제5 절에 따른 융합 단백질에 있어서, 폴리펩티드 및 관심 단백질 사이에 자기-절단 펩티드를 포함한다.
7. 핵산 서열, 예컨대:
I. 제1 절 및 제2 절에 따른, 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 코딩할 수 있는, SEQ ID No 1로 표시된 것; 또는
II. 융합 단백질, 예컨대 제5 절에 따른 SEQ ID No 3 내지 12로 표시된 것같은 펩티드에 융합된 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
8. 제7 절에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
9. 제8 절에 따른 벡터에 있어서, 관심 이식유전자를 또한 포함한다.
10. 제9 절에 따른 벡터에 있어서, 관심 이식유전자는 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 양자 세포 요법을 위한 면역치료 사용의 다른 수용체를 코딩하여서, 벡터가 표적 세포를 형질도입시키는데 사용될 때, 표적 세포는 제1 절에 따른 폴리펩티드, 및 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 관심 면역요법의 다른 수용체를 공-발현시킨다.
11. 제1 절에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포.
12. 제11 절에 따른 세포에 있어서, 제1 절에 요약된 폴리펩티드 및 POI를 세포 표면에 공발현시킨다.
13. 제7 절에 따른 핵산 서열을 포함하는 세포.
14. 제11 절 내지 제13 절 중 어느 하나에 따른 세포에 있어서, T 세포이다.
15. 제8 절 내지 제10 절 중 어느 하나에 따른 벡터를 세포에 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 제11 절 내지 제14 절 중 어느 하나에 따른 세포를 제조하기 위한 방법.
16. 하기 단계를 포함하는, POI를 발현시키는 세포를 선택하기 위한 방법:
I. 제10 절에 따른 벡터가 형질감염 또는 형질도입된 세포의 표면 상에서 POI 에피토프의 발현을 검출하는 단계; 및
II. POI 에피토프를 발현하는 것으로 확인된 세포를 선택하는 단계.
17. 제16 절에 따른 방법을 사용하여 세포의 개체군으로부터 POI를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, POI를 발현하는 세포에 대해 농축된 세포의 정제된 개체군을 제조하기 위한 방법.
18. 제17 절에 따른 방법에 있어서,
I. 제7 절에 따른 벡터로 조직 또는 세포 도너로부터 단리된 세포의 개체군의 생체외 형질도입 또는 형질감염; 및
II. 제16 절에 따른 방법을 통해 세포의 형질도입/형질감염 개체군으로부터 POI를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
19. 제1 절에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 농축시켜서, POI를 발현하는 세포에 대해 농축된 세포 개체군.
20. 세포 표면에서 제1 절에 따른 폴리펩티드의 발현의 검출 단계를 포함하는, 생체내에서 형질도입된 세포를 추적하기 위한 방법.
21. 제11 절 내지 제14 절 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 제19 절에 따른 세포 개체군을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법.
22. 제21 절에 따른 방법에 있어서, 하기 단계를 포함한다:
I. 제9 절에 따른 벡터를 대상체로부터 단리된 세포의 샘플에 형질도입 또는 형질감염시키는 단계, 및
II. 환자에게 형질도입/형질감염된 세포를 복귀시키는 단계.
23. 제22 절의 방법에 있어서, 암을 치료하기 위한 방법.
24. 제11절 내지 제14절 또는 제19절에 있어서, 양자 세포 전달에서 사용을 위한, 세포, 또는 세포 개체군.
25. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이룽럴진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD137로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 4로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
26. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD134로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 5 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
27. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD2로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 6으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
28. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인으로서; 및
II. 인간 CD29로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 7로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
29. 하기 I-II에 융합된, 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 GITR로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 8로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
30. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 IL2Rγ로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 9로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
31. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD40으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 10으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
32. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD150으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 11로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
33. 하기 I-II에 융합된, 제4 절에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인으로 이루어진 CoStAR 수용체:
I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID No 2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
II. 인간 CD2 및 인간 CD40로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID No 12로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 더욱 입증된다.
실시예 1 - CoStAR을 발현하는 T-세포의 생산
재료 및 방법
구성체 디자인 - MFE23 CoStAR은 전체 인간 CD28 핵산 서열에 융합된 온코스타틴 M1 리더 서열을 갖는 MFE23 유래된 단일 사슬 항체 단편 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. CoStAR 뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화시켰고 유전자는 Genewiz Inc에서 합성하였다. 구성체는 XbaI 및 NheI 부위를 통해 pSF.Lenti (Oxford Genetics)에 클로닝하였다.
렌티바이러스 생산 - 렌티바이러스 생산은 10 ㎍의 각각의 플라스미드와, 10 ㎍의 이식유전자를 함유하는 pSF.Lenti 렌티바이러스 플라스미드를 함께 50 mM CaCl2 를 함유하는 혈청 무함유 RPMI에서 혼합하여, 3-플라스미드 패키징 시스템 (Cell Biolabs, San Diego, USA)을 사용해 수행하였다. 혼합물은 75 ㎠ 플라스크에서 293T 세포의 50% 합류 단층에 적가하였다. 바이러스 상청액은 형질감염 후 48시간 및 72시간에 수집하였고, 풀링하였으며, 제조사의 설명서에 따라서 LentiPac 렌티바이러스 상청액 농축 (GeneCopoeia, Rockville, Maryland, USA) 용액을 사용해 농축하였다. 렌티바이러스 상청액은 10배로 농축시켰고 4 ㎍/mL 폴리브렌 (Sigma-Aldrich, Dorset, UK)의 존재 하에서 초대 인간 T-세포를 직접적으로 감염시키는데 사용하였다. 말초 혈액 단핵 세포는 렌티바이러스 상청액의 첨가 전에 제조사의 설명서에 따라서 T-세포 활성화 및 확장 비드 (Invitrogen)로 24시간 동안 활성화 전에 정상의 건강한 도너로부터 단리하였다.
세포 형질도입은 CEA.hFc 단백질 및 2차 항-hFc-PE를, 항-CD34-APC를 더하거나 또는 항-CD34-PE 항체 단독으로 사용하여 감염 후 96시간에 평가하였다. 다음으로 세포는 x10 도너 불일치의 조사된 PBMC 피더를 1:20-1:200 비율로 1 ㎍/mL PHA 및 200 IU/ml IL-2가 첨가된 RPMI + 10% FCS 중에서 사용하여 더욱 확장시켰다. 14일 후에 세포는 이전처럼 염색하였고 어세이에 준비를 위해 저장하였다.
기능성 어세이는 CoStAR 양성 또는 음성 세포를 야생형 또는 OKT3 조작된 CEA-양성 LoVo 또는 LS174T 세포와 혼합하여 수행하였다. 간략하게, T-세포는 LoVo 세포와 다양한 비율로 96-웰 플레이트에서 혼합하였고 IFNγ 또는 IL-2를 ELISA를 통해 측정하였다. 나머지 세포는 450 nm에서 흡광도 판독 전에 30분 동안 WST-1 시약 (Sigma, UK)의 1:10 희석물과 인큐베이션시켰다. 세포독성%는 다음의 방정식을 사용해 결정하였다 = 100 - ((실험 판독치 - T-세포 단독)/(종양 단독)) x100.
증식 어세이는 얼음에서 5분 동안 5 부피의 냉 T-세포 배지 중에서 세포를 인큐베이션시키기 전에 1x107 세포/mL의 농도로 37℃에서 10분 동안 10 μM eFluor450 증식 염료 (eBioscience, UK)를 T-세포에 먼저 로딩하여 수행하였다. 다음으로 세포는 과도하게 세척하여서 미결합된 염료를 제거하였고 종양 세포를 함유하는 공배양물에 첨가하였다. 세포는 2일, 6일 및 10일에 제거하였고, DRAQ7의 1:200 희석물을 첨가하였고 세포는 MACSQuant 세포측정기 및 MACSQuantify 소프트웨어를 사용해 분석하였다.
증식 어세이를 위한 세포 계측은 웰로부터 세포를 취하고 항-CD2 PerCP eFluor710 항체 (eBioscience, UK)로 20분 동안 암실에서 염색하고 나서, DRAQ7 염색을 수행하고 MACSQuant 분석기를 사용해 계측하여 수행하였다.
결과 - 초대 인간 T-세포는 NHSBT로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다. T-세포는 Ficoll-매개된 단리 및 T-세포 음성 단리 키트 (StemCell Technologies)를 통해서 단리하였다. 단리된 T-세포는 인간 T-세포 활성화 및 확장 비드 (Invitrogen, UK)로 활성화시켰다. 세포를 농축된 렌티바이러스 입자와 인큐베이션시켰고 수 일 동안 확장시켰다. 렌티바이러스는 MFE.CoStAR.2A.tCD34 구성체의 DNA 서열 (2A 절단 서열을 통해서 절두된 인간 CD34와 공발현된 전체 길이 인간 CD28에 융합된 MFE23.scFv)을 함유하였다. 성공적으로 형질도입된 세포는 재료 및 방법에 요약된 바와 같이 조사된 피더를 사용해 더 확장시켰다. 도너 1 형질도입은 22.69% (17.15 CD34+/CoStAR+와 5.53% CD34-/CoStAR+)에서 측정되었고, 도너 2는 20.73%에서 측정되었고, 도너 3은 13.34%에서 측정되었다. 세포는 CoStAR 양성이 90% 초과인 T-세포 개체군을 수득하기 위해서 항-CD34 항체를 사용해 CoStAR 발현에 대해 농축되었다.
T-세포 활성에 대한 CoStAR의 영향을 시험하기 위해 생리적으로 관련된 시험관내 모델을 생성시키기 위해서, 비-형질도입 및 형질도입 세포는 CEA+ 종양 세포주 LoVo 및 LS174T에 대해 시험되었다. 불일치된 종양 주에 반응하여 T-세포의 활성화를 가능하게 하기 위해서, 우리는 종양 세포를 조작하여서 합성 경막 도메인을 통해 세포막에 앵커링된 항-CD3 단일 사슬 항체 단편을 발현하고 IRES 엘리먼트를 사용해 GFP 마커 유전자로부터 분할시켜 유세포측정을 사용해 형질도입된 세포를 가시화시켰다.
LoVo 및 LS174T의 단일 세포 클론은 대량 형질감염체로부터 생산시켰다. 비-형질도입 및 CoStAR 형질도입된 T-세포는 다양한 이펙터:표적 비율로 야생형 비-형질도입 또는 OKT3-조작된 LS174T 또는 LoVo 세포와 혼합하였다. 24시간 후에 공배양 배지는 IL-2 ELISA 측정을 위해 취하였다. 활성화 의존적 IL-2 분비는 OKT3 조작된 LS174T 세포에 반응하여 3 도너로부터의 CoStAR+ 및 CoStAR- T-세포 개체군으로부터 관찰되었고 비-조작된 종양 세포에 반응하여 형질도입 및 비-형질도입된 T 세포로부터는 오직 배경치 IL-2 분비만이 확인되었다 (도 3 A-C). OKT3 조작된 종양 세포에 대한 CoStAR 증강된 IL-2 분비는 시험된 모든 3 도너에서 확인되었다. 효과는 8:1 및 16:1의 E:T 비율에서 가장 분명하였고 더 높은 E:T 비율에서 IL-2 분비가 너무 낮아서 정확하게 측정할 수 없었다. 더 낮은 이펙터 대 표적 비율에서 IL-2 분비는 비-형질도입된 세포로부터 포화된 것으로 보였다. 이들 관찰은 유사한 결과의 LS174T에 대해 시험된 3 도너 중 2와 LoVo 세포에서 반복하였다 (도 3D & E).
T-세포 확장에 대한 CoStAR의 영향을 결정하기 위해서, 형질도입 또는 비-형질도입 T 세포는 야생형 또는 OKT3-GFP 조작된 LoVo 세포와 혼합하였고 3일 후 총 세포수를 계측하였다. CoStAR은 IL-2의 존재 (도 4A) 및 IL-2의 부재 (도 4B) 하에서 야생형 LoVo 세포가 아닌 LoVo-OKT3에 반응하여 조작된 T-세포의 생존 및/또는 증식을 증강시켰다. 이러한 현상을 더욱 조사하기 위해서, 세포 증식 분석은 각 개체군이 6일 동안 겪은 세포 주기의 수를 계측하기 위해서 증식 염료를 사용해 2 도너로부터의 T-세포에서 수행하였다 (도 4C & D). 더 많은 비율의 CoStAR 조작된 세포는 LoVo-OKT3에 반응하여 비-조작된 세포와 비교해 6일 동안 5, 6, 또는 7의 증식 주기를 겪었지만, CoStAR 형질도입 및 비-형질도입된 세포는 야생형 LoVo에 반응하여 동일한 기간 동안 평균 대략 2 주기를 겪었다.
N-말단의 추가의 공자극성 도메인에 융합된 CD28로 이루어진 다양한 융합 수용체를 생성시켰다. CD137, CD2, CD29, CD134, CD150, CD40, GITR로부터 수득된 공자극성 도메인 및 IL-2 수용체 γ 사슬 (IL2Rγ)로부터의 신호전달 도메인이 선택되었다. 유도성 공자극의 이전 연구에서 사용된 것과 가까운 수용체가 포함되었다. 이러한 수용체는 CD28(IEV)로 명명되었고 절두되어서 CD28의 C-말단 모티프는 아미노산 3가 'IEV'이다. 서열은 새로 Genewiz에서 생성시켜서 2A 자기-절단 펩티드에 의해 융합 CoStAR로부터 이격된 CD34 마커 유전자와 함께 EF1α 프로모터 하의 렌티바이러스 벡터에 클로닝되었다. 초대 CD8+ T-세포는 EasySep 비드 (StemCell Technologies)를 사용해 단리하였고 렌티바이러스 입자의 첨가 전에 항-CD3/항-CD28 활성화/확장 Dynabead로 활성화시켰다. 짧은 확장 기간 이후에 세포는 LoVo 또는 LoVo-OKT3 세포와 혼합하였고, 항-CD107a 항체 및 브레펠딘 및 모넨신을 포함시켰고, 16시간 인큐베이션 후에, 고정시켰고 마커 유전자 (CD34)에 대한 항체를 비롯하여 IL-2, IFNγ 및 bcl-xL에 대한 항체로 염색시켰다. 분석은 MACSQuant 분석기 및 MACSQuantify 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 도 5는 CD34- (CoStAR 비-형질도입) 및 CD34+ (CoStAR 형질도입)로부터의 IL-2 반응을 보여준다. 통계 분석은 변이체 CoStAR 수용체를 보유했을 때 시험된 모든 수용체가 IL-2를 생산하는 세포에 비례하여 유의한 증가를 유도시켰다는 것을 입증하였다. 하기의 다른 3 판독치를 동시발생적으로 측정하였다: 정상 신호 1 조건 하에서 방출되지만 공자극에 의해 증강되는 사이토카인, IFNγ; 탈과립화 마커, CD107a; 및 공자극에 의해 상향조절된 항아폽토시스 단백질, bcl-xL. CoStAR의 관여는 다양한 정도로 분석된 모든 이펙터 기능을 증강시켰다. CD28.CD2 및 CD28.CD40 융합체 수용체는 시험된 모든 수용체의 가장 강건한 반응을 유발시키는 것으로 나타났다 (도 6 참조).
실시예 2
개체군 기반 사이토카인 분비에 대한 CD28 및 CD28.CD40 기반 CoStAR의 효과를 비교하였다. 3 도너로부터의 초대 T-세포는 CD28(IEV) 절두된 CoStAR, 전체 길이 CD28 CoStAR 또는 CD28.CD40 CoStAR (SEQ ID NO. 10로 표시된 바와 같으나, N 말단 N 및 K 잔기가 결여된 전체 길이 CD28을 가짐)이 형질도입되었거나 또는 형질도입되지 않은 채로 남겨두었다. T-세포는 CD34 마커 유전자를 사용해 CoStAR 발현에 대해 농축시켰고, 확장 후에 세포를 LoVo-OKT3 세포와 혼합하였고 IL-2 분비는 ELISA로 분석하였다 (도 7 참조). 비-형질도입 세포는 평균 0.80 ng/mL의 IL-2를 생산하였고, CD28(IEV) 및 전체 길이 CD28 CoStAR은 각각 4.6 및 5.0 ng/mL의 IL-2를 생산하였다. 그러나, CD28.CD40은 3 도너 전반에서 평균 29.0 ng/mL의 IL-2를 유도하였고 따라서 기본 CD28-기반 CoStAR에 CD40의 도입에 대한 분명한 이득을 입증하였다.
다음으로 T-세포 확장에 대한 CoStAR의 효과를 분석하였다. 7 도너로부터의 T-세포는 항-CA125 (196-14) 또는 항-폴레이트 수용체 (MOV-19) scFv, 또는 항-폴레이트 수용체 펩티드 (C7) 항원 결합 도메인을 갖는 CD28 또는 CD28.CD40 CoStAR이 형질도입되었다. 추가의 세포는 불일치 대조군으로서 항-CEA scFv를 보유하는 CD28 CoStAR이 형질도입되었다. 다음으로 세포는 막 결합된 OKT3 (OvCAR-OKT3)을 발현하도록 조작된 CA125+/폴레이트 수용체+/CEA- 세포주 OvCAR3과 혼합되었다. T-세포 계측은 7일, 14일, 및 21일 후에 하였고, 신선한 OvCAR-OKT3을 7일 및 14일에 첨가하였다. 항-CA125 scFv를 보유하는 세포의 제한된 확장이 관찰 (평균 확장 배수: CD28: 15.1; CD28.CD40: 69.1)되었으나, scFv로 폴레이트 수용체를 표적화하는 세포는 CD28 및 CD28.CD40 코호트 둘 모두에서 확장되었다 (평균 확장 배수: CD28: 186.7; CD28.CD40: 1295.0). C7 펩티드가 폴레이트 수용체를 표적화하는데 사용되었을 때 더 제한된 확장이 확인되었다 (평균 확장 배수: CD28: 71.5; CD28.CD40: 28.0). 수용체를 표적화하는 대조군 CEA는 제한된 확장을 입증하였다 (평균 확장 배수: 28.0).
신호 1 및 신호 2의 상승작용을 더욱 잘 이해하기 위해서 T-세포는 세포 표면 CEA 단백질에 대해 표적화된 CD28 또는 CD28.CD40 CoStAR 뿐만 아니라 HLA-A*02의 상황에서 CEA 펩티드 (691-699)를 인식하는 쥣과 불변 도메인 변형된 TCR을 갖게 조작되었다. 대조군으로서 세포는 또한 CA125 특이적 CD28 CoStAR이 형질도입되었다. T-세포는 HLA-A*02+/CEA+ H508 세포와 혼합되었고 사이토카인 생산은 세포내 유세포측정 염색을 통해 분석되었다. 유세포측정 게이팅은 쥐과 TCRβ 불변 도메인 (TCR 조작된 세포를 표지)을 비롯하여 DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 에피토프 태그 (CoStAR 조작된 세포를 표지)에 대한 항체를 사용해 수행하였다. 따라서, TCR-/CoStAR-, TCR+/CoStAR-, TCR-/CoStAR+ 및 TCR+/CoStAR+ 세포를 각 공배양 웰에서 분석하는 것이 가능하였다. 다음으로, 사이토카인 생산은 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에서 각 서브개체군에서 그래프화하였다 (도 9). CD4+ 세포에서, CD28.CD40 CoStAR은 TCR 자극 단독 시에 CD137 및 TNFα 생산을 증강시켰지만, CD4+ 세포에서 TCR 반응은 CD8에 대한 TCR의 의존성에 기인하여 불충분하였다. CD8+ 세포에서 IL-2 및 CD107a에서 보다 강건한 이펙터 활성이 존재하였고 특히 CD28.CD40 CoStAR 그룹에서 더 강력한 유도를 보였다. 수용체를 더욱 잘 비교하기 위해서, 단지 TCR+/CoStAR+ 그룹에서 이펙터 활성은 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 그래프화하였다 (도 10). CD4+ 세포에서 CD137의 유도는 CEA 또는 불일치된 표적화 CD28 CoStAR과 비교하여 CD28.CD40에 의해 유의하게 증강되었다. CD8+ 세포에서 CD137 유도는 CEA 또는 불일치된 표적화 CD28 CoStAR과 비교하여 유의하게 증가되었지만, CD107a 유도는 대조군 CoStAR과 비교하여 증가되었다. 따라서, CD28.CD40은 광범위한 모델 및 이펙터 활성에 걸쳐 증강된 이펙터 활성을 보여준다.
참조문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
서열
SEQ ID NO:1: 굵은체로 강조된 오픈 리딩 프레임을 갖는 전체 인간 CD28 mRNA 전사물 변이체 전사물.
유전자좌 NM_006139 4900 bp mRNA 선형 PRI 07-OCT-2016
정의 호모 사피언스 CD28 분자 (CD28), 전사물 변이체 1, mRNA.
수탁번호 NM_006139
기원
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
SEQ ID NO:2: 하기 I-IV를 갖는 인간 CD28 단백질 서열:
I. 굵은체로 강조된 신호 펩티드 (이것은 본 발명에 따라서 사용될 때 서열로부터 결실될 수 있음); 및
II. 밑줄 표시된 경막 영역; 및
III. 세포외 영역은 신호 펩티드와 경막 영역 사이에 위치되고 세포질 영역에 이어서 경막 영역이 후속되고;
IV. 박스 표시 영역은 본 발명의 임의 양태에서 존재할 수 있거나 또는 부재할 수 있거나 또는 돌연변이될 수 있는 성숙 단백질의 처음 5 아미노산을 나타낸다. 또한, 이들 잔기 (즉, N, K, I, L 또는 V)의 1, 2, 3, 4, 또는 5는 본 발명에 따라 사용될 때 서열로부터 결실될 수 있다.
Figure pct00008
하기 SEQ ID NO:3 내지 12는 하기 I-III에 표시된 대로인, SEQ ID NO:2 (돌연변이될 수도 있거나 또는 돌연변이되지 않을 수도 있지만 도식의 단순함을 위해 이의 본래 형태로 남겨둠)의 박스 표시 영역에서 인간 CD28 단백질에 융합될 수 있는 CoStAR 신호전달 도메인의 예시적 서열이다:
I. 이중 밑줄 표시 영역은 CD28 유래 영역을 나타내고;
II. 밑줄 표시 영역은 제2 공자극성 수용체 유래 영역이고;
III. 이탤릭체 서열은 제3 공자극성 수용체 유래 영역이다.
박스 표시 영역은 본 발명의 임의 양태에서 존재할 수 있거나 또는 부재할 수 있거나 또는 돌연변이될 수 있는 성숙한 CD28 단백질의 처음 5 아미노산을 나타낸다는 것을 유의한다. 또한, 이들 잔기 (즉, N, K, I, L 또는 V)의 1, 2, 3, 4, 또는 5는 본 발명에 따라서 사용될 때 서열로부터 결실될 수 있다.
SEQ ID NO:3: 절두된 세포질 도메인 CD28 변이체
Figure pct00009
SEQ ID NO:4: CD28.CD137 융합체
Figure pct00010
SEQ ID NO:5: CD28.CD134 융합체
Figure pct00011
SEQ ID NO:6: CD28.CD2 융합체
Figure pct00012
SEQ ID NO:7: CD28.CD29 융합체
Figure pct00013
SEQ ID NO:8: CD28.GITR 융합체
Figure pct00014
SEQ ID NO:9: CD28.IL2Rγ 융합체
Figure pct00015
SEQ ID NO:10: CD28.CD40 융합체
Figure pct00016
SEQ ID NO:11: CD28.CD150 융합체
Figure pct00017
SEQ ID NO:12: CD28.CD2.CD40 융합체
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQ ID NO:13: 절두된 세포외 도메인 CD28(IEV) 변이체
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> Immetacyte Ltd <120> RECEPTORS PROVIDING TARGETED COSTIMULATION FOR ADOPTIVE CELL THERAPY <130> P37029WO1 <150> US62/951,770 <151> 2019-12-20 <150> GB1900858.0 <151> 2019-01-22 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4900 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (223)..(885) <223> Acession No. NM_006139 <220> <221> sig_peptide <222> (223)..(276) <220> <221> transmembrane <222> (456)..(537) <400> 1 taaagtcatc aaaacaacgt tatatcctgt gtgaaatgct gcagtcagga tgccttgtgg 60 tttgagtgcc ttgatcatgt gccctaaggg gatggtggcg gtggtggtgg ccgtggatga 120 cggagactct caggccttgg caggtgcgtc tttcagttcc cctcacactt cgggttcctc 180 ggggaggagg ggctggaacc ctagcccatc gtcaggacaa ag atg ctc agg ctg 234 Met Leu Arg Leu 1 ctc ttg gct ctc aac tta ttc cct tca att caa gta aca gga aac aag 282 Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val Thr Gly Asn Lys 5 10 15 20 att ttg gtg aag cag tcg ccc atg ctt gta gcg tac gac aat gcg gtc 330 Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp 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Gln Glu Asp 355 360 365 Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln 370 375 380 <210> 13 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(98) <223> CD28 Extracellular truncation <400> 13 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Tag <400> 14 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp His 1 5

Claims (35)

  1. 신호전달 도메인에 연결된 종양-연관 항원 특이적 결합 도메인에 융합된 제1 공자극성 수용체의 세포외 리간드 결합 단편 및 제2 공자극성 수용체의 세포내 신호전달 단편을 포함하는, 키메라 공자극성 수용체 (CoStAR).
  2. 제1항에 있어서, 종양-연관 항원 특이적 결합 도메인에 융합된 전체 길이 공자극성 수용체를 포함하고, 상기 공자극성 수용체 전체 길이는 리더 서열이 결여되고 성숙 단백질의 바로 N-말단에 최대 5 아미노산 결실 또는 돌연변이를 갖는 전체 성숙 단백질을 포함하는 것인, CoStAR.
  3. 종양-연관 항원 특이적 결합 도메인에 융합된 전체 길이 공자극성 수용체를 포함하고, 상기 공자극성 수용체 전체 길이는 리더 서열이 결여되고 성숙 단백질의 바로 N-말단에 최대 5 아미노산 결실 또는 돌연변이를 갖는 전체 성숙 단백질을 포함하는 것인, 키메라 공자극성 수용체 (CoStAR).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공자극성 수용체는 CD2, CD9, CD26, CD27, CD28, CD29, CD38, CD40, CD43, CD46, CD49d, CD55, CD73, CD81, CD82, CD99, CD100, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD150 (SLAM), CD270 (HVEM), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), 또는 EphB6의 군으로부터 선택되는 것인 CoStAR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극성 도메인은 직접 융합이거나 또는 링커 영역 예컨대 최대 50 아미노산 길이의 링커를 함유하는 것인 연결 영역에 의해서, 단일 수용체 형태에 융합된 둘 이상의 공자극성 수용체 도메인을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 CoStAR.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 특이적 결합 도메인은
    I. 제한없이, 암배 항원 (CEA), 5T4, 멜라노트랜스페린 (CD228), Her2, EGFR, GPC3, 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP/CSPG4), CD71, SM5-1, 폴레이트 수용체 또는 CA125를 포함하는, 종양 연관 항원에 결합하는 단일 사슬 항체 단편; 또는
    II. 종양 특이적 펩티드 (p)-주요 조직적합성 (MHC) 복합체에 결합하는 단일 사슬 항체 단편; 또는
    III. 종양 특이적 pMHC 복합체 항원 특이적 단일 사슬 T-세포 수용체 (scTCR); 또는
    IV. 천연 항원 결합 폴리펩티드 예컨대, 제한없이, 트랜스페린; 또는
    V. 항체에 결합하는 도메인 (예를 들어, Fc 결합 도메인 예컨대, 제한없이, CD16, CD32 또는 CD64), 또는 항원 인식의 다른 간접 방법
    으로부터 선택되는 것인, CoStAR.
  7. 관심 단백질 (POI), 예컨대 마커 유전자 (예를 들어, DYKDDDDK (SEQ ID NO:14) 에피토프 태그, CD34, CD19 등), 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR) 또는 양자 세포 요법을 위한 면역치료적 사용의 다른 수용체에 융합된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  8. 제8항에 있어서, 폴리펩티드 및 관심 단백질 사이에 자기-절단 펩티드를 포함하는 것인 융합 단백질.
  9. I. 제1항 또는 제2항에 따른, 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 또는
    II. 융합 단백질, 예컨대 SEQ ID NO: 3 내지 12로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    를 코딩할 수 있는 핵산 서열, 예컨대, SEQ ID NO:1로 표시된 것.
  10. 제10항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 관심 이식유전자를 또한 포함하는 것인 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 관심 이식유전자는 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 양자 세포 요법을 위한 면역치료적 사용의 다른 수용체를 코딩하여서, 벡터가 표적 세포를 형질도입시키는데 사용될 때, 표적 세포는 제1항에 따른 폴리펩티드, 및 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 면역치료적 관심의 다른 수용체를 공발현시키는 것인 벡터.
  13. 제1항에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  14. 제13항에 있어서, 제1항의 폴리펩티드 및 POI를 세포 표면에서 공발현시키는 것인 세포.
  15. 제10항에 따른 핵산 서열을 포함하는 세포.
  16. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포인 세포.
  17. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포의 제조 방법.
  18. 하기 단계를 포함하는, POI를 발현하는 세포의 선택 방법:
    I. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질도입시킨 세포의 표면 상에서 POI 에피토프의 발현을 검출하는 단계; 및
    II. POI 에피토프를 발현하는 것으로 확인된 세포를 선택하는 단계.
  19. 제19항에 따른 방법을 사용하여 세포의 개체군으로부터 POI를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, POI를 발현하는 세포에 대해 농축된 세포의 정제된 개체군의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    I. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 조직 또는 세포 도너로부터 단리된 세포의 개체군의 생체외 형질도입 또는 형질감염 단계; 및
    II. 제18항에 따른 방법에 의해 세포의 형질도입/형질감염된 개체군으로부터 POI를 발현하는 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
  21. 제1항에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 농축되고, 따라서 POI를 발현하는 세포에 대해 농축된 것인 세포 개체군.
  22. 세포 표면에서 제1항에 따른 폴리펩티드의 발현의 검출 단계를 포함하는, 생체내에서 형질도입된 세포의 추적 방법.
  23. 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법에 있어서, 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제21항에 따른 세포 개체군을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 치료 방법.
  24. 제24항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 치료 방법:
    I. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 대상체로부터 단리된 세포의 샘플을 형질도입 또는 형질감염시키는 단계, 및
    II. 형질도입/형질감염된 세포를 환자에게 복귀시키는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 암을 치료하기 위한 것인 치료 방법.
  26. 질환의 치료 및/또는 양자 세포 전달에서 사용을 위한 것인 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 제21항에 따른 세포 개체군.
  27. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD137로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:4로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는, CoStAR 수용체.
  28. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD134로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:5로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는, CoStAR 수용체.
  29. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD2로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:6으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  30. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD29로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:7로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  31. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 GITR로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:8로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  32. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 IL2Rγ로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:9로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  33. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD40으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:10으로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  34. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD150으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:11로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
  35. I. 전체 길이 인간 CD28, 예컨대 SEQ ID NO:2로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 또는 그로 이루어진 융합 신호전달 도메인; 및
    II. 인간 CD2 및 인간 CD40으로부터의 세포내 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:12로 표시된 것 또는 단백질 수준에서 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체
    에 융합된, 제6항에 따른 종양 연관 항원 결합 도메인을 포함하는 CoStAR 수용체.
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