JP2024500748A - 腫瘍浸潤リンパ球の処理 - Google Patents
腫瘍浸潤リンパ球の処理 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024500748A JP2024500748A JP2023536943A JP2023536943A JP2024500748A JP 2024500748 A JP2024500748 A JP 2024500748A JP 2023536943 A JP2023536943 A JP 2023536943A JP 2023536943 A JP2023536943 A JP 2023536943A JP 2024500748 A JP2024500748 A JP 2024500748A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- population
- util
- mtil
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 477
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 341
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 316
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 72
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 380
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 214
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 202
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 146
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 139
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 97
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 claims description 72
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 72
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 64
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 56
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 51
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 46
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 46
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 42
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 42
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 39
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 35
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 28
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 27
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 23
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 21
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 21
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 21
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 18
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 17
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 11
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 10
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 10
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 8
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 8
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims description 8
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 claims description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 2
- 241000824799 Canis lupus dingo Species 0.000 claims description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 2
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 claims description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 47
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 47
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract description 19
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 17
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 421
- 239000000463 material Substances 0.000 description 205
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 137
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 129
- 230000008569 process Effects 0.000 description 103
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 77
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 67
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 67
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 63
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 58
- 239000000306 component Substances 0.000 description 52
- 239000000047 product Substances 0.000 description 51
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 51
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 50
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 45
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 39
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 36
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 33
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 33
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 32
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 30
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 30
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 30
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 30
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 29
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 29
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 26
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 21
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 description 19
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 19
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- -1 but not limited to Substances 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 18
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 16
- 239000012129 DRAQ7 reagent Substances 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 13
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 13
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 13
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 13
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 13
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 13
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 13
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 12
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 11
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 11
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 11
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 11
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 10
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 9
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 9
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 7
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 7
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 7
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 7
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 7
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 7
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000003777 tissue processing method Methods 0.000 description 6
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000037845 Cutaneous squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 5
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 5
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 5
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 5
- 102100036678 Interleukin-27 subunit alpha Human genes 0.000 description 5
- 108010052014 Liberase Proteins 0.000 description 5
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 5
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 5
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 5
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 5
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 5
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 5
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 5
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108090000835 CX3C Chemokine Receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100039196 CX3C chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 239000003570 air Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 4
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 4
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004555 blood preservation Methods 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001010621 Homo sapiens Interleukin-21 Proteins 0.000 description 3
- 101000852998 Homo sapiens Interleukin-27 subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000004433 Thermoplastic polyurethane Substances 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 3
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 3
- 229920002457 flexible plastic Polymers 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000000162 organ preservation solution Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002803 thermoplastic polyurethane Polymers 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- LGDFHDKSYGVKDC-UHFFFAOYSA-N 8-hydroxyquinoline-5-sulfonic acid Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 LGDFHDKSYGVKDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101001076386 Homo sapiens Interleukin-1 family member 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000998122 Homo sapiens Interleukin-37 Proteins 0.000 description 2
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102100026015 Interleukin-1 family member 10 Human genes 0.000 description 2
- 108091007973 Interleukin-36 Proteins 0.000 description 2
- 102100033502 Interleukin-37 Human genes 0.000 description 2
- 241001505307 Jembrana disease virus Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108700031757 NKTR-214 Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 2
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101100244562 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) oprD gene Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 101100082060 Xenopus laevis pou5f1.1 gene Proteins 0.000 description 2
- YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N [Nitrilotris(methylene)]trisphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 229960005310 aldesleukin Drugs 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920003231 aliphatic polyamide Polymers 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940121413 bempegaldesleukin Drugs 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 108700023159 delta Opioid Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000048124 delta Opioid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 229920006012 semi-aromatic polyamide Polymers 0.000 description 2
- 201000010106 skin squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000004067 Flatfoot Diseases 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102100021186 Granulysin Human genes 0.000 description 1
- 101710168479 Granulysin Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100232904 Homo sapiens IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 description 1
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241001124569 Lycaenidae Species 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001296119 Panteles Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940122117 Potassium channel agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000009459 flexible packaging Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 1
- 108090000681 interleukin 20 Proteins 0.000 description 1
- 102000004114 interleukin 20 Human genes 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 229940029358 orthoclone okt3 Drugs 0.000 description 1
- 229950002610 otelixizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002907 paramagnetic material Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012335 pathological evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000036316 preload Effects 0.000 description 1
- 238000011112 process operation Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000002108 rapid electrokinetic patterning Methods 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229950010127 teplizumab Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012431 visual particle testing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
- C12N2500/62—DMSO
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Abstract
本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離及び凍結保存し、治療用TIL集団を産生するための方法を提供し、TIL集団の増殖前の切除腫瘍の無菌脱凝集、濃縮、及び凍結保存のためのキット及び半自動デバイスの使用を介した方法を含む。本発明はまた、TIL、例えば、UTILの増殖及び/又は安定化のための方法、TILを伴う組成物、並びにTILを伴う治療方法を提供する。【選択図】図65
Description
関連出願及び参照による組み込み
本出願は、全て2020年12月18日に出願された米国特許出願第63/127,639号、同第63/127,591号、同第63/127,608号、同第63/127,631号、及び同第63/127,665号に対する優先権を主張するものである。
本出願は、全て2020年12月18日に出願された米国特許出願第63/127,639号、同第63/127,591号、同第63/127,608号、同第63/127,631号、及び同第63/127,665号に対する優先権を主張するものである。
2019年12月20日に出願された米国特許出願第62/951,559号、2020年2月27日に出願された米国特許出願第62/982,470号、2020年7月2日に出願された米国特許出願第29/740,293号、2020年7月2日に出願された米国特許出願第63/047,431号、及び2020年12月18日に出願され、かつ2021年6月24日にWO2021/123832として公開されたPCT/GB2020/053315を参照し、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
2017年1月13日に出願された英国特許出願第GB1700621.4号、2018年1月12日に出願された欧州特許出願第EP18701791.8号、2018年1月12日に出願され、2018年7月19日にPCT公開第2018/130845号として公開された国際特許出願第PCT/GB2018/050088号、2019年12月20日に出願された米国特許出願第62/951,559号を参照し、これらは、本明細書によって組み込まれる参照である。
2019年3月1日に出願された英国特許出願第GB1902763.0号、2019年3月27日に出願された英国特許出願第GB1904249.8号、及び2020年2月28日に出願され、2020年9月10日にWO2020/177920として公開された国際特許出願第PCT/EP2020/000053号を参照する。
上記の出願、Biomarker Predictive of Tumour Infiltrating Lymphocyte Therapy and the Uses Thereof、WO2019145711A1、PCT/GB2019/050188、Tumor Infiltrating Lymphocyte Therapy and Uses Thereof USA、PCT/GB2020/051790及び米国特許出願第 62/878,001号、Receptors Providing Targeted Costimulation for Adoptive Cell Therapy、WO2020/152451、米国特許出願第 62/951,770号及びGB1900858.0、Cells Expressing Recombinant Growth Factor Receptors、WO2017/103596A1、米国特許出願第 16/061,435号及び欧州特許出願公開第EP3390436号、並びにChimeric Growth Factor Receptors、WO2019243835A1、PCT/GB2019/051745、それらに引用されている又はそれらの遂行中の全ての文書(「出願に引用されている文書」)及び出願に引用されている文書に引用又は参照されている全ての文書、並びに本明細書に引用又は参照されている全ての文書(「本明細書に引用されている文書」)、並びに本明細書に引用されている文書に引用又は参照されている全ての文書は、本明細書又は参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文書に述べられているあらゆる製品についてのあらゆる製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートとともに、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実践において用いられ得る。より具体的には、全ての参照される文書は、個々の文書が各々参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に参照により組み込まれる。
本発明は、腫瘍の半自動的な無菌組織処理を介して切除腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離、増殖、及び凍結し、それによって、治療用TIL集団を産生するための方法及びデバイスを提供する。
T細胞は、骨髄に常駐する造血幹細胞に由来するが、その後、胸腺に移動し、胸腺内で成熟する。成熟過程の間、T細胞は、一連の選択事象を受け、それによって、T細胞の多様なレパートリーを生成する。次いで、これらの細胞は、末梢循環に放出され、適応免疫システムの一部として特定の機能を果たす。
T細胞は、細胞の均質な群ではないが、多くの系統から構成され、その主なタイプは、2つの更なる細胞マーカーの発現によって定義される。CD4発現T細胞は、概してヘルパー(Th)と呼ばれ、細胞間接触によって、及びサイトカインと呼ばれるメディエーター分子の産生を通じて、免疫系の多くの機能を調整すると考えられる。CD8 T細胞は、細胞傷害性(Tc)と考えられ、標的細胞を直接死滅を実施する細胞であると考えられる。これらの活性は、全て、T細胞受容体/抗原/MHC相互作用を通じて制御され、結果として、標的細胞上のペプチド/MHCの正常な認識時に、CD4及びCD8 T細胞は、サイトカイン産生及び細胞傷害性活性を通じて協働して作用し、ウイルス感染及び腫瘍細胞を含む標的細胞を排除する。
T細胞は、無傷のタンパク質(抗原)を認識しないが、主要組織適合性複合体(MHC)と呼ばれる特定のタンパク質によって標的細胞の表面上に提示される短いタンパク質断片に応答する。成熟過程の間、T細胞は、MHC分子によって提示されるこれらの短いタンパク質(ペプチド)抗原を認識する抗原特異的T細胞受容体(TCR)をその細胞表面上に発現する。したがって、正しいMHC分子と関連付けられた標的細胞の表面上に正しいペプチドが提示されるときのみ、T細胞は、そのエフェクター機能を活性化することになる。したがって、腫瘍特異的T細胞の頻度は腫瘍内で豊富であり、腫瘍特異的T細胞、すなわち、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の理想的な供給源となる(Andersen et al.,Cancer Res.2012 Apr 1;72(7):1642-50.doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2614.Epub 2012 Feb 6)。
当然ながら、これは非常に簡略化された考え方であり、T細胞機能の短い概要を表す。適応免疫応答は、単独では作用しないが、T細胞の必要な活性部位への効率的な輸送を促進し、正しい免疫応答が開始され、免疫応答が制御され、必要となった後に停止されることを確保するために、広範囲の免疫及び非免疫細胞との広範な相互作用を必要とする。したがって、製造されたTILが腫瘍に対する免疫応答を開始する患者においても、次いで、患者自身の免疫系及び腫瘍微小環境によって支持又は減衰され得る。
腫瘍特異的TILは、原発がん又は転移性がんを有する患者の腫瘍から単離されたT細胞である。ほとんどのがん患者において、循環腫瘍特異的T細胞が血液中にほとんど検出されない。しかしながら、皮膚黒色腫などの特定のがんは、腫瘍成長の自然な経過中、特に腫瘍エリア内で、抗腫瘍活性を有するかなりの数のT細胞を誘導する能力を有するため、免疫原性であると考えられる(Muul et al.,J Immunol.1987 Feb 1;138(3):989-95)。「腫瘍に特異的なT細胞として選択された」腫瘍反応性T細胞は、腫瘍材料から単離され、エクスビボで高い数に増殖され得る。報告によると、これらの細胞は、抗腫瘍反応性を含有しており、これは、患者への再注入時、腫瘍の破壊及び臨床的奏効を結果的にもたらし得る(Dudley et al.,Science.2002 Oct 25;298(5594):850-4.Epub 2002 Sep 19)。その後の試験では、T細胞特性の重要性が確認され、「若い」急速に成長する細胞である「Young TIL」の有益性が確認され、それによって、細胞は、全く「特異性について選択されていない」ことが確認された。注目すべきことに、これは、TIL又はCD8選択TILにおいて約50%の優れた奏効率を生じさせる(Besser et al.,Anticancer Res.2009 Jan;29(1):145-54;Dudley et al.,Clin Cancer Res.2010 Dec 15;16(24):6122-31.doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-1297.Epub 2010 Jul 28)。
Andersenらによる研究(Cancer Res.2012 Apr 1;72(7):1642-50.doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2614.Epub 2012 Feb 6)は、末梢血中のT細胞と比較して、黒色腫特異的T細胞(既知のがん抗原に対して)が腫瘍内で濃縮されることを特定した。これは、単離されたTIL集団が、末梢血から単離され、IL2又は静脈内IL-2単独の同様のレベルで増殖したT細胞を使用した黒色腫患者における早期試験と比較して、腫瘍特異的T細胞が濃縮され、結果的に増強された抗腫瘍活性をもたらすことを支持する(LAK cells-Bordignon et al.,Haematologica.1999 Dec;84(12):1110-49)。
米国特許第10,398,734号は、TILを増殖させ、治療用TIL集団を産生するための方法に関する。’734特許の腫瘍はバルク腫瘍として出荷され、バルク腫瘍内のTILは、急速に酸素欠乏となり、経時的に進行性に悪化する。’734特許の腫瘍はまた、内部細胞集団が悪化した断片にも処理される。更に、製造に使用されるTILは、組織断片から増殖されたTILのみであり、内部に保持されたいかなるTILでもない。したがって、結果として生じる細胞集団は、腫瘍環境の完全な多様性を反映しない場合がある。
TILを採取することは、外殖培養及びTIL集団の増殖の前に、バルク腫瘍としての固形組織の無菌脱凝集を必要とする。固形組織の脱凝集中の状態及び細胞を採取するためにかかる時間は、最終細胞化材料の生存及び回収に実質的な影響を与える。従来的な方法を使用して得られる固形組織由来細胞懸濁液は、多くの場合、多種多様な異なる細胞タイプ、脱凝集培地、組織片、及び/又は流体を含む。これは、例えば、再生医療の製造、養子細胞療法、ATMP、診断的インビトロ研究、及び/又は科学研究の前に、細胞タイプの選択的標的化及び/又は単離の使用を必要とし得る。
現在、選択又は濃縮技術は、概して、サイズ、形状、密度、接着、強力なタンパク質間相互作用(すなわち、抗体-抗原相互作用)のうちの1つを利用する。例えば、いくつかの実例では、選択は、成長支持環境を提供することによって、及び半永久的又は永久的な、磁気又は非磁気の固相又は半固相基体への結合と関連付けられた培養条件又はより複雑な細胞マーカー相互作用を制御することによって行われ得る。
濃縮、単離、又は選択のために、任意の選別技術、例えば、親和性クロマトグラフィー、又は当該技術分野で既知の任意の他の抗体依存性分離技術が使用され得る。当該技術分野で既知の任意のリガンド依存性分離技術は、細胞の物理的特性に依存する陽性分離技術及び陰性分離技術の両方とともに使用され得る。特に強力な選別技術は、磁気細胞選別である。細胞を磁気的に分離する方法は、例えば、Thermo Fisher、Miltenyi Biotech、Stemcell Technologies、Cellpro Seattle、Advanced Magnetics、Boston Scientific、又はQuad Technologiesから市販されている。例えば、モノクローナル抗体は、Dynal M 450又は類似の磁気粒子のような磁気ポリスチレン粒子に直接結合され、例えば、細胞分離に使用され得る。Dynabeads技術は、カラムベースではなく、細胞が付着したこれらの磁気ビーズが、サンプルチューブ内の液相動態を享受し、磁気ラック上にチューブを配置することによって細胞が単離される。
試料からの細胞の濃縮、選別、及び/又は検出は、例えば、多糖類の有機コーティングを有するコロイド超常磁性微粒子と併せてモノクローナル抗体を使用することを含む(例えば、磁気活性化細胞選別(MACS)技術(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach,Germany))。粒子(例えば、ナノビーズ又はマイクロビーズ)は、モノクローナル抗体に直接コンジュゲートされるか、抗免疫グロブリン、アビジン、若しくは抗ハプテン特異的マイクロビーズと組み合わせて使用されるか、又は選択的結合特性を有する他の哺乳類分子で被覆され得る。
上記に説明されるものなどの磁気粒子選択技術は、特定の表面マーカーに対して抗体又は他の部分を被覆した磁気ナノ粒子をインキュベートすることによって、細胞が陽性又は陰性分離されることを可能にする。これは、このマーカーを発現する細胞を磁気ナノ粒子に付着させる。その後、細胞溶液が、強い磁界の固形又は可撓性コンテナ内に配置される。このステップでは、細胞は、ナノ粒子(マーカーを発現する)に付着し、カラム上に留まるが、一方、他の細胞(マーカーを発現しない)は、流れ通る。この方法によると、細胞は、特定のマーカーに対して陽性又は陰性分離され得る。
陽性選択の場合、磁気カラムに付着した関心対象のマーカーを発現する細胞は、磁界からカラムを除去した後に、別個の容器に押し流される。
陰性選択の場合、使用される抗体又は選択部分は、関心対象ではない細胞上に存在することが知られている表面マーカーに向けられる。カラム上への細胞/磁気ナノ粒子溶液の適用後、これらの抗原を発現する細胞は、カラムに結合し、通過する画分は、それが関心対象の細胞を含有するため、収集される。これらの細胞は、ナノ粒子に結合された選択抗体又は部分によって非標識化されるため、それらは「非接触」である。公知の手動又は半自動の固形組織処理ステップは、労働集約的であり、当該技術分野の知識を必要とする。
加えて、材料が治療目的で使用される場合、処理は、細胞培養物の取り扱い中、厳格に制御された環境条件、例えば、脱凝集の一部として、若しくはその前の組織処理、酵素消化及び保存デバイスへの移送、又は脱凝集/細胞化及び生組織収率のためのインキュベーション条件を必要とする。典型的には、このプロセスは、同じ活動を安全かつ同時に汚染のリスクを最小化するために、複数の実験室及び組織処理機器の部品、並びに危険封じ込め又は組織処理施設の無菌環境のいずれか内に収容される臨界段階を含む科学技術の技能及び知識を有する人員を必要とする。
組織からの所望の産物の生存性及び回収は、細胞の組織収集、脱凝集、及び採取中の条件によって影響され得る。本発明は、上記に説明された満たされていない必要性を達成する該処理を行う装置/デバイスを含む、改善された組織処理を提供する必要性から発生する。
本出願におけるいずれの文書の引用又は識別も、かかる文書が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
組織からの所望の産物の生存性及び回収は、細胞の組織収集、脱凝集、及び採取中の条件によって影響され得る。本発明は、上記に説明された満たされていない必要性を達成する該処理を行う装置/デバイスを含む、改善された組織処理を提供する必要性から発生する。
本出願におけるいずれの文書の引用又は識別も、かかる文書が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
Andersen et al.,Cancer Res.2012 Apr 1;72(7):1642-50.doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2614.Epub 2012 Feb 6
Muul et al.,J Immunol.1987 Feb 1;138(3):989-95
Dudley et al.,Science.2002 Oct 25;298(5594):850-4.Epub 2002 Sep 19
Besser et al.,Anticancer Res.2009 Jan;29(1):145-54
Dudley et al.,Clin Cancer Res.2010 Dec 15;16(24):6122-31.doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-1297.Epub 2010 Jul 28
Cancer Res.2012 Apr 1;72(7):1642-50.doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-2614.Epub 2012 Feb 6
LAK cells-Bordignon et al.,Haematologica.1999 Dec;84(12):1110-49
本発明は、治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球(UTIL)集団を単離するための方法に関し、方法は、
(a)対象から腫瘍を切除すること、
(b)切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、
(c)脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、最小限の細胞損傷で凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集すること、
(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、
(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含み得る。
(a)対象から腫瘍を切除すること、
(b)切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、
(c)脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、最小限の細胞損傷で凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集すること、
(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、
(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含み得る。
脱凝集は、物理的脱凝集、酵素脱凝集、又は物理的及び酵素的脱凝集を含み得る。有利な実施形態では、脱凝集腫瘍は、細胞化又は精製される。
本発明では、相互接続され、特定の別個の機能を有するコンテナのセットは、処理するために、任意選択的に、脱凝集及び細胞化腫瘍を濃縮するが、安定化するために、無菌的閉鎖系を維持する。本質的に、本発明は、切除腫瘍の処理中に必要とされる時間及び汚染又はオペレータ曝露の危険性を最小化するための、急速滅菌前環境を提供する。
無菌キットは、閉鎖固形組織処理を可能にし、特に、プロセスが組織回収/精製部位内で実施され、その最終的な有用性について最終細胞処理の前に保存を必要とするときに、標準的な非閉鎖組織処理と比較して、最終細胞化産物の汚染の危険性を排除する。加えて、オペレータの安全性は、ウイルスなどの感染性生物を含有し得る、生物学的有害物質との直接接触の低減に起因して増大する。キットはまた、最終的に処理された細胞化材料の全部又は一部が、その究極の有用性のために処理される前に、輸送又は保存のいずれかのために安定化されることを可能にする。
本発明は、切除腫瘍が、切除時に、又は必要に応じて切除後に、細胞化腫瘍の回収手順又は生存率に影響せずに、処理されることを可能にすることになる。
いくつかの実施形態では、不要になった試薬、細胞片、非脱凝集腫瘍組織及び脂肪などの不純物を低減するための、物理的精製の形態を介した任意選択的な濃縮が採用され得る。無菌キットは、安定化前に、この目的のために、任意選択の濃縮モジュールを有し得る。単一細胞又は小細胞数の凝集体は、5μm未満の粒子及び流体、又は約200μm以上の不完全に脱凝集された材料を除外することによって、脱凝集後の安定化のために濃縮され得るが、これは、組織及び脱凝集の効率に応じて変動することになり、組織特異的キットの形態の様々な実施形態は、組織又は脱凝集腫瘍の最終的な有用性に依存して採用され得る。
別の実施形態では、ステップ(c)の後に単一細胞懸濁液が提供される。
別の実施形態では、第1のUTIL集団は、100万~2000万個のUTIL、2000万~4000万個のUTIL、4000~6000万個のUTIL、6000~8000万個のUTIL、8000万~1億個のUTIL、1億~1億2500万個のUTIL、1億2500万~1億5000万個のUTIL、1億5000万~2億個のUTIL、又は2億~2億5千万個のUTILを含む、約100万~2億5000万個のUTILを必要とする。
別の実施形態では、ステップ(e)は、切除腫瘍出発材料からのUTILの成長、その後のステップ(f)の急速増殖を更に含み得る。
別の実施形態では、ステップ(e)は、約2週間実施され得、ステップ(f)は、約2週間実施され得る。
別の実施形態では、追加のステップ(h)は、第2のUTIL集団を懸濁させることを伴う。懸濁することは、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及び/又はジメチルスルホキシド(DMSO)中であり得る。
本発明はまた、本明細書に開示される方法のいずれかによって得られた治療用凍結保存UTIL集団を含み得る。治療用集団は、約5×109~5×1010個のT細胞を含み得る。
本発明はまた、本明細書に開示される治療用集団の凍結保存バッグも包含する。凍結保存バッグは、静脈内注入で使用するためのものであり得る。
本発明はまた、本明細書に開示される治療用集団又は本明細書に開示される凍結保存バッグを投与することを含み得る、がんを治療するための方法も包含する。本発明はまた、がんの治療に使用するための本明細書に開示される治療用集団、医薬組成物、又は凍結保存バッグも包含する。がんは、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮細胞がん(HNSCC)を含む、肺がん(非小細胞肺がん(NSCLC)を含む)、黒色腫、卵巣がん、腎がん、又は腎細胞がんであり得る。
別の実施形態では、無菌キットの1つ以上の可撓性コンテナは、弾性変形可能な材料を含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナは、1つ以上の封止可能な開口部を含む。脱凝集モジュール及び/又は安定化モジュールの1つ以上の可撓性コンテナはまた、ヒートシール可能な溶着を含み得る。
別の実施形態では、無菌キットの1つ以上の可撓性コンテナは、内部に丸みを帯びた縁を含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナは、その中に固形腫瘍を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む。
別の実施形態では、無菌キットの濃縮モジュールの1つ以上の可撓性コンテナは、細胞化脱凝集固形腫瘍の保持物を保持するフィルタを含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールの1つ以上の可撓性コンテナは、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む。
別の実施形態では、無菌キットは、デジタル、電子、又は電磁タグ識別子を更に含む。タグ識別子は、脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスで使用される1つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連し得る。
別の実施形態では、同じ可撓性コンテナは、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの1つ以上の一部を形成し得る。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールは、処理される組織の受け取りのための第1の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュールは、脱凝集のための培地を含む第2の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの任意選択の濃縮モジュールは、濃縮された濾液を受容するための第1の可撓性コンテナ及び第3の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第2の可撓性コンテナを含み、第2の可撓性コンテナは、消化培地及び安定化培地を含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールは、安定化培地を含む第4の可撓性コンテナを含む。
別の実施形態では、無菌キットの安定化モジュールはまた、保存する及び/又は凍結保存を受けるための第1の可撓性コンテナ及び/又は第3の可撓性コンテナを含む。
本発明はまた、治療用凍結保存TIL集団を単離するための方法を提供し、方法は、
(a)対象から腫瘍を切除すること、
(b)切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、
(c)脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、
(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及びTIL活性化因子を用いて第1のTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、
(g)第2のTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含む。
特定の非限定的な実施形態では、TIL活性化因子は、抗原提示細胞(APC)、又は人工抗原提示細胞(aAPC)、又は抗原断片、複合体、若しくは抗体を含む。
(a)対象から腫瘍を切除すること、
(b)切除腫瘍を単回使用無菌キットに保存することであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、
(c)脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、
(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及びTIL活性化因子を用いて第1のTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、
(g)第2のTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含む。
特定の非限定的な実施形態では、TIL活性化因子は、抗原提示細胞(APC)、又は人工抗原提示細胞(aAPC)、又は抗原断片、複合体、若しくは抗体を含む。
別の実施形態では、自動デバイスは、本発明の実施形態における自動デバイス内などの、自動処理中に、無菌キットがスキャンされ、認識され得るように、無菌キットの認識用の無線周波数識別タグリーダーを更に備える。極めて重要なことに、タグは、自動処理に必要な条件及びステップに関する情報を提供するため、キットを単純にスキャンすることによって、組織を処理するためにキットとともに使用される任意の自動システムは、更なる介入又は汚染なしで行われ得る。組織試料が脱凝集モジュールに配置されると、例えば、処理開始前に、手動又は自動で封止され得る。
自動デバイスのプログラム可能プロセッサはまた、タグを介して無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにコントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行し得る。自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/又は安定化モジュールと通信し制御するように適合可能である。換言すれば、キットは、そのようなデバイスに挿入されたときに腫瘍を処理するための特定の完全自動方法を実行するために使用される自動デバイスによって読み取り可能である。
自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び/又は生物学的分解を可能にし得る。この分解は、固形組織材料の物理的又は酵素的分解であり得る。固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、及びそれらの混合物からなる群から選択される1つ以上の培地酵素溶液によるものであり得る。
別の実施形態では、プログラム可能プロセッサは、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御する。いくつかの実施形態では、脱凝集表面は、機械的ピストンによって制御される。
別の実施形態では、プログラム可能プロセッサは、安定化モジュールを制御して、コンテナ内の濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存する。これは、デバイスに挿入されるキットのタグを読み取ることによって決定される、プログラム可能な温度設定、条件を使用して達成され得る。
別の実施形態では、プロセスの異なる機能を行うために、デバイス及び/又はキットの追加の構成要素のうちの1つ以上が提供され、任意の組み合わせで利用可能であり得る。これは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための1つ以上の弁、並びに/又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための1つ以上のクランプを含み得る。
別の実施形態では、自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されるか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合される。これは、UTILが、安定化モジュールで使用されるタイプ又は安定化プロセスに応じて、最終的な利用の前に、短期間(数分から数日)保存されるか、又は長期間(数日から数年)保存されることを可能にする。
別の実施形態では、自動デバイスは、ユーザインターフェースを更に含む。インターフェースは、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含み得る。
別の実施形態では、自動デバイスは、輸送可能であるように適合され、したがって、ホイール、タイヤ、及び/又はハンドルなどの容易な操作性及び/又は補助動作を可能にする寸法を含み得る。
本発明はまた、治療用凍結保存UTIL集団を単離するための半自動無菌組織処理方法を提供し、方法は、
(a)無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定するステップであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、決定するステップ、
(b)対象から腫瘍を切除するステップ、
(c)無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に腫瘍を配置するステップ、
(d)1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって腫瘍を処理するステップであって、
切除腫瘍が無菌脱凝集され、それによって、脱凝集腫瘍を産生し、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集モジュール、
脱凝集腫瘍が、脱凝集固形組織材料を除去し、非脱凝集組織及び濾液を分離するために濾過される、任意選択の濃縮モジュール、
脱凝集腫瘍が凍結保存される、安定化モジュールと通信し、それらを制御することによって、処理するステップ、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施するステップ、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生するステップ、
(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存するステップを含む。
(a)無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定するステップであって、無菌キットが、
固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、
脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、
脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、
モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、
モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、決定するステップ、
(b)対象から腫瘍を切除するステップ、
(c)無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に腫瘍を配置するステップ、
(d)1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって腫瘍を処理するステップであって、
切除腫瘍が無菌脱凝集され、それによって、脱凝集腫瘍を産生し、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集モジュール、
脱凝集腫瘍が、脱凝集固形組織材料を除去し、非脱凝集組織及び濾液を分離するために濾過される、任意選択の濃縮モジュール、
脱凝集腫瘍が凍結保存される、安定化モジュールと通信し、それらを制御することによって、処理するステップ、
(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施するステップ、
(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生するステップ、
(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存するステップを含む。
バッグなどの可撓性コンテナは、組織材料を処理するために使用され得る。処理は、組織を分離又は破壊し得る処置を含み得、例えば、物理的破壊は、攪拌、例えば、穏やかな攪拌を使用して達成され得、生物学的及び/又は酵素的分解は、酵素消化、及び/又はバッグ内の組織材料の構成要素の抽出を含み得る。
組織を処理するためのバッグなどの可撓性コンテナは、製造中に封止される可撓性コンテナの少なくとも3つの縁、及び使用中に組織材料が挿入される可撓性コンテナ上の開放縁を有する、封止可能なポリマーから作製された1つ以上の層を含み得る。1つ以上のコネクタが、チューブを通して可撓性コンテナを少なくとも1つの要素に結合するために使用され得る。可撓性コンテナに組織が配置された後、開放縁に近接する可撓性コンテナの区分が、封止又は溶着されて、封止を形成し得る。封止は、少なくとも3mmの幅を有し、開放縁と実質的に平行に位置付けられ、可撓性コンテナの開放縁から離隔され得る。いくつかの事例では、封止は、約5mmよりも大きい幅を有し得る。例えば、バッグの開放縁に近接して位置付けられた少なくとも5mmの封止を有するように、組織が内側に配置された後、バッグが封止され得る。封止は、開放縁に平行であり得、バッグの開放縁から離隔され得る。
可撓性コンテナは、突出部を有し、封止に近接して位置付けられ、可撓性コンテナの開口縁から封止よりも更に離隔されたクランプを使用して更に固設され得る。
いくつかの事例では、封止及び可撓性コンテナは、可撓性コンテナが、使用中に可撓性コンテナに適用される100Nの力に耐え得るように構築される。そのような封止とともにクランプを使用することは、いくつかの事例で、使用される材料のタイプ及び/又は封止の構造に応じて、有利であり得る。したがって、バッグなどの可撓性コンテナの使用中、封止及びクランプの組み合わせは、可撓性コンテナに適用される100Nの力に耐えることができ得る。
いくつかの事例では、封止及び可撓性コンテナは、可撓性コンテナが、使用中に可撓性コンテナに適用される75Nの力に耐え得るように構築される。そのような封止とともにクランプを使用することは、いくつかの事例で、使用される材料のタイプ及び/又は封止の構造に応じて、有利であり得る。したがって、バッグなどの可撓性コンテナの使用中、封止及びクランプの組み合わせは、可撓性コンテナに適用される75Nの力に耐えることができ得る。
可撓性コンテナは、組織材料の脱凝集などの処理中に組織を保持するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグなどの可撓性コンテナは、組織材料の脱凝集、脱凝集組織材料の濾過、並びに/又は非脱凝集組織及び濾液の分離に使用され得る。
バッグなどの可撓性コンテナは、弾性変形可能な材料から形成され得る。バッグなどの可撓性コンテナに使用するための材料は、限定されるものではないが、熱溶着に起因する密閉性などの密閉性、無線周波数エネルギーの使用、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性(例えば、-150℃又は-195℃)、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子、特定のガス(例えば、酸素及び/若しくは二酸化炭素)に対する高い透過速度、並びに/又は規制要件の遵守を含む、1つ以上の特性に対して選択され得る。
バッグなどの可撓性コンテナは、インジケータを含み得る。インジケータは、試料、試料が由来する患者を識別するために、及び/又は治療プロセスを通して特定の試料の進捗を追跡するために使用され得る。いくつかの事例では、インジケータは、試料の進捗を追跡するために自動又は半自動システムによってスキャンされ得る。
マークは、バックが配置されるべき場所、処置されるべき場所、封止されるべき場所、又は組織を含むバッグに対して講じられ得る任意の他の措置を識別するために、バッグなどの可撓性コンテナに使用され得る。各バッグは、封止のための複数のマークを含み得る。
バッグの開放端は、組織がバッグに挿入された後に封止され得る。任意のシールは、所定の圧力、所定の温度、及び所定の時間枠で動作する封止デバイス(例えば、ヒーターシーラー)を使用して形成され得る。
いくつかの事例では、バッグなどの可撓性コンテナは、脱凝集デバイスも含み得る脱凝集要素の一部として使用するための脱凝集コンテナとして使用され得る。いくつかの実施形態では、培地及び/又は酵素は、デバイスの脱凝集要素内のバッグに添加され得る。例えば、バッグは、可撓性コンテナ内に配置された組織材料を機械的に粉砕するデバイスとともに使用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグなどの可撓性コンテナ内の組織は、脱凝集中にせん断され得る。特に、可撓性コンテナは、組織材料をせん断するように構成され得る。
可撓性コンテナは、哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び/又は任意選択の濃縮のための半自動又は自動プロセスにおいて使用され得る。
組織からの所望の材料の抽出のためのキットは、少なくともいくつかの組織が処置されて処理された流体を形成する脱凝集要素と、所望の材料を形成するために処理された流体の少なくともいくつかを濃縮することができる濃縮要素(例えば、フィルタ)と、所望の材料の一部分を保存することができる安定化要素と、組織の供給源、プロセスに対する組織の状態、又は識別子のうちの少なくとも1つを提供することができる、脱凝集要素、濃縮要素、又は安定化要素のうちの少なくとも1つに位置付けられたインジケータタグと、を含み得る。
所望の材料は、特定のサイズの生物学的材料又は構成要素であり得る。例えば、所望の材料は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)であり得る。
脱凝集要素及び安定化要素によって実施される様々なプロセスにおいて、異なるタイプの培地が使用され得る。例えば、凍結保存培地は、キットに提供され、コントロールレート凍結を行うために安定化要素で使用され得る。
脱凝集要素が第1の可撓性コンテナを含み得、安定化要素が第2の可撓性コンテナを含み得るデバイスで使用するためのキット。
哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化のための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び本明細書に説明される可撓性コンテナを含むキットを含み得る。自動デバイスは、インジケータタグリーダーを更に含み得る。例えば、インジケータタグリーダーは、任意の要素(例えば、キット中の組織材料の脱凝集、濃縮、又は安定化)に位置付けられ得る。
いくつかの事例では、自動デバイスは、キット内の可撓性コンテナ内の試料を認識する無線周波数識別タグリーダーを更に含み得る。
自動デバイスは、QRコード(登録商標)などのインジケータタグを介して、バッグなどのキットの構成要素上に位置付けられたインジケータを認識することができるプログラム可能プロセッサを含み得る。どの試料がバッグの中にあるかを決定した後、プログラム可能プロセッサは、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプを定義するプログラムを実行し、それらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを提供する。
自動デバイスで使用するためのキットは、脱凝集可撓性コンテナ又はバッグを含み得る。プログラム可能プロセッサは、脱凝集要素及び脱凝集可撓性コンテナを制御して、固形組織の物理的及び/又は生物学的分解を可能にし得る。
プログラム可能プロセッサは、脱凝集可撓性コンテナに近接して位置付けられた脱凝集表面が、脱凝集可撓性コンテナ内の固形組織を機械的に粉砕及びせん断し得るように、自動デバイスの要素を制御し得、任意選択的に、脱凝集表面は、機械的ピストンである。
システムの脱凝集要素は、脱凝集可撓性コンテナ内の組織が固形組織の物理的及び酵素的分解を可能にするように、プロセッサによって制御され得る。コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される1つ以上の培地酵素溶液が、組織の酵素的分解を補助するために脱凝集可撓性コンテナに提供され得る。
システムは、脱凝集可撓性コンテナ及び安定化可撓性コンテナ並びにプログラム可能プロセッサを含むキットを含み得る。プログラム可能プロセッサは、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの1つ以上を制御するように適合され得る。
プログラム可能プロセッサは、安定化コンテナ内の濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存するために、安定化要素を制御し得る。いくつかの実施形態では、所定の温度がプログラムされ得る。
自動デバイスは、複数の組み合わせで追加の構成要素を含み得る。構成要素は、任意選択の濃縮要素への脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び/若しくは安定化要素のうちの1つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び/若しくは安定化要素のうちの1つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、要素内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮要素内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮要素内の接線流濾過プロセスを制御するための1つ以上の弁、並びに/又は各要素の入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための1つ以上のクランプを含み得る。
自動デバイスは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されるプログラム可能プロセッサを含み得る。一実施形態では、プログラム可能プロセッサは、制御された凍結ステップを実行し得る。
いくつかの事例では、自動デバイスは、ユーザインターフェースを含み得る。自動デバイスのインターフェースは、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含み得る。
本明細書に説明される自動デバイスは、輸送可能であるように適合され得る。
自動組織処理方法は、キットの構成要素と関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、処理ステップのための条件及び関連付けられた条件を自動的に決定することを含み得る。使用中に、組織試料が、少なくとも1つの開放縁を有するキットの可撓性コンテナに配置され得る。組織を可撓性コンテナ内に位置付けた後、開放端が封止され得る。使用中、組織は、インジケータと関連付けられた情報を通信し、可撓性コンテナの近くの条件及び/又は位置を制御することによって、1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって処理され得る。更に、キットへの材料の追加は、インジケータと関連付けられた情報に基づいて制御され得る。処理された組織の少なくともいくつかは、濾過された流体が生成されるように濾過され得る。濾過された流体の少なくともいくつかは、凍結保存可撓性コンテナに提供されて、濾過された流体中に存在する所望の材料を安定化し得る。
本明細書に説明される処理は、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み得る。いくつかの事例では、組織のこの処理は、組織試料から所望の材料の抽出を結果的にもたらし得る。例えば、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、組織試料から抽出され得る。
本明細書に説明される方法で使用するためのバッグなどの可撓性コンテナは、ヒートシール可能な材料を含み得る。
凍結保存キットを使用した組織材料からの組織処理及び抽出は、所望の材料の単離を結果的にもたらし得る。特に、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの材料は、所望の材料であってもよい。
いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び/又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のための自動及び/又は半自動プロセスにおける単回使用であってもよい。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び/又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグなどの可撓性コンテナは、収集バッグを含み、凍結保存バッグは、熱可塑性、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)、例えば、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド(すなわち、OriGen Biomedical EVOフィルム)などのコポリマーなどのブレンド、EVAを含む材料、及び/又は共押出された封止可能なプラスチック層を含み得る。本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、エチレンビニルアセテート(EVA)などの所定の材料及び/又はEVAを含む材料から作製された組織を受容するためのバッグを含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性のために選択され得る。一実施形態では、収集バッグを含むバッグは、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドから実質的に作製され得る。例えば、収集バッグ及び/又は関連付けられたチューブなどの凍結保存キット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、ヒートシールに関連し得る。
バッグで使用するための材料は、特定の特性及び/又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの密閉性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
いくつかの実施形態では、材料は、バッグの少なくとも1つの層を形成するために、共押出材料で使用するための特定の特性のために選択され得る。層は、構築されたときに、バッグの内部層が比較的生体適合性である、すなわち、バッグの内面上の材料が安定し、バッグの内容物中に浸出しないように、構築され得る。
例えば、収集バッグ、凍結保存バッグ、及び/又は関連付けられたチューブなどのキット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、封止、例えば、ヒートシールに関連し得る。
収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び/又はチューブは、概して、閉鎖及び/又は封止された血液並びに/又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル(PVC)を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、PVCは、溶着及び/又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、収集バッグの少なくとも1つの端は、組織を受容するために開放され得る。特に、一実施形態では、例えば、生検からの組織試料は、例えば、上端などの開放端を通してバッグ内に配置され得る。いくつかの事例では、生検試料は、動物(例えば、イヌ又はネコなどの家畜)又はヒトからのがん性組織であってもよい。
組織がバッグ内に位置付けられた後、バッグが封止され、次いで、処理され得る。処理は、例えば、バッグ内の組織の攪拌、例えば、穏やかな攪拌、抽出、及び/又は酵素消化を含み得る。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの所望の材料の組織処理及び抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を識別するためのインジケータ、並びに/又は収集バッグがクランプされる、封止される、デバイスによって作用される、及び/若しくは器具の定位置に固定され得る場所を示すマークを含み得る。
いくつかの実施形態では、バッグは、封止可能な材料から形成され得る。例えば、バッグは、限定されるものではないが、脂肪族又は半芳香族ポリアミド(例えば、ナイロン)を含む合成ポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)及びそれらのブレンド、熱可塑性ポリウレタン(TPU)、ポリエチレン(PE)、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのポリマー、並びに/又はポリマーの組み合わせを含む材料から形成され得る。バッグの部分は、熱、無線周波数エネルギー、高周波(HF)エネルギー、誘電体エネルギー、及び/又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーで封止及び/又は溶着され得る。
収集バッグは、処理及び/又は脱凝集バッグとして使用され得る。収集バッグは、約4cm~約12cmの範囲の幅、及び約10cm~約30cmの範囲の幅を有し得る。例えば、処理で使用するための収集バッグは、約7.8cmの幅及び約20cmの長さを有し得る。特に、バッグは、例えば、EVAポリマー若しくはそのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、並びに/又は1つ以上のポリアミド(ナイロン)を使用して、ヒートシール可能であり得る。
インジケータとしては、限定されるものではないが、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答(QR)コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはBluetooth(登録商標)トラッカーなどのトラッカー、及び/又は当該技術分野で既知の任意のインジケータが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び/又は接着され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び/又は複数のバッグ上に配置され得る。収集バッグ及び/又は凍結保存キットは、数値コード及び/又はQRコード(登録商標)などの複数のインジケータを含み得る。
インジケータ、例えば、QRコード(登録商標)、スマートタグなどのタグ、及び/又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び/又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。異なるタイプの培地が、これらのプロセスでは、例えば、酵素培地、腫瘍消化培地、及び/又はコントロールレート凍結を可能にし得る凍結保存培地に使用され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キット及び/又はその構成要素は、自動デバイスによって読み取り可能であり得るインジケータを含み得る。次に、デバイスは、そのようなデバイスに挿入されたときに、組織を処理するための特定の完全自動方法を実行し得る。本発明は、試料処理、特に自動処理において特に有用である。いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び/又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のための自動及び/又は半自動プロセスにおける単回使用であってもよい。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び/又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
更に、バッグが封止され、クランプされ、及び/又は物体に固定され得る場所を示すために、組織収集バッグなどの、バッグ上の様々な場所にマークが配置され得る。いくつかの実施形態では、バッグが、クランプされ、封止され、及び/又は器具などの物体に固定される場所を示すマークは、使用前にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、1つ以上のマークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。
位置決め部は、バッグ内の組織材料が使用中に適切に処置され得る、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するように使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。
QRコード(登録商標)などのインジケータの使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。
本発明は、以下の番号付きの段落で論じられるように、治療用細胞集団を伴い、提供する。
1.治療用腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団であって、
a)集団中のT細胞が、少なくとも25%のエフェクターメモリー(EM)T細胞を含むか、若しくは集団中のCD4 T細胞が、少なくとも25%のEM CD4 T細胞を含むか、若しくは集団中のCD8 T細胞が、少なくとも25%のEM CD8 T細胞を含むか、又は
b)集団中のT細胞が、少なくとも20%のセントラルメモリー(CM)T細胞を含むか、若しくは集団中のCD4 T細胞が、少なくとも20%のCM CD4 T細胞を含むか、若しくは集団中のCD8 T細胞が、少なくとも20%のCM CD8 T細胞を含むか、又は
c)集団中のEM及びCM T細胞の合わせた割合が、T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは集団中のEM及びCM CD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは集団中のEM及びCM CD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の少なくとも40%を構成するか、又は
(d)UTIL集団中のエフェクターT細胞の割合が、T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中のエフェクターCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中のエフェクターCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(e)集団中の幹細胞メモリーT細胞の割合が、T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(f)集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーT細胞の合わせた割合が、T細胞の15%以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の15%以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の15%以下である、治療用TIL集団。
a)集団中のT細胞が、少なくとも25%のエフェクターメモリー(EM)T細胞を含むか、若しくは集団中のCD4 T細胞が、少なくとも25%のEM CD4 T細胞を含むか、若しくは集団中のCD8 T細胞が、少なくとも25%のEM CD8 T細胞を含むか、又は
b)集団中のT細胞が、少なくとも20%のセントラルメモリー(CM)T細胞を含むか、若しくは集団中のCD4 T細胞が、少なくとも20%のCM CD4 T細胞を含むか、若しくは集団中のCD8 T細胞が、少なくとも20%のCM CD8 T細胞を含むか、又は
c)集団中のEM及びCM T細胞の合わせた割合が、T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは集団中のEM及びCM CD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは集団中のEM及びCM CD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の少なくとも40%を構成するか、又は
(d)UTIL集団中のエフェクターT細胞の割合が、T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中のエフェクターCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中のエフェクターCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(e)集団中の幹細胞メモリーT細胞の割合が、T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは集団中の幹細胞メモリーCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(f)集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーT細胞の合わせた割合が、T細胞の15%以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の15%以下であるか、若しくは集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の15%以下である、治療用TIL集団。
2.EM細胞が、CD62L-/CD45RO+、若しくはCCR7lo/CD62Llo、若しくはCX3CR1hi/CD27lo、若しくはCD127hi、若しくはCD27-/CD45RA-によって特徴付けられるか、又はCM細胞が、CD62L+/CD45RO+、若しくはCCR7hi/CD62Lhi、若しくはCX3CR1lo/CD27hi、若しくはCD127hi、若しくはCD27+/CD45RA-によって特徴付けられるか、又はエフェクター細胞が、CD62L-/CD45RO-によって特徴付けられるか、又は幹細胞メモリー細胞が、CD62L+/CD45RO-によって特徴付けられる、段落1に記載の治療用TIL集団。
3.治療用凍結保存非修飾(U)又は修飾(M)腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を単離するための方法であって、
(a)(i)切除腫瘍を凍結保存し、凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
(ii)切除腫瘍を脱凝集し、脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
(iii)切除腫瘍を凍結保存し、腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
(iv)切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、腫瘍断片を凍結保存して、
精製された切除腫瘍産物を得ることと、
(b)IL-2を含む細胞培養培地中で精製された切除腫瘍産物を培養することによって第1の増殖を実施して、第1のUTIL又はMTIL集団を産生することと、
(c)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL又はMTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のUTIL又はMTIL集団を産生することと、
(d)第2のUTIL又はMTIL集団を採取及び/又は凍結保存することと、を含む、方法。
(a)(i)切除腫瘍を凍結保存し、凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
(ii)切除腫瘍を脱凝集し、脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
(iii)切除腫瘍を凍結保存し、腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
(iv)切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、腫瘍断片を凍結保存して、
精製された切除腫瘍産物を得ることと、
(b)IL-2を含む細胞培養培地中で精製された切除腫瘍産物を培養することによって第1の増殖を実施して、第1のUTIL又はMTIL集団を産生することと、
(c)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL又はMTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のUTIL又はMTIL集団を産生することと、
(d)第2のUTIL又はMTIL集団を採取及び/又は凍結保存することと、を含む、方法。
4.(a’)対象から腫瘍を切除して、切除腫瘍を得ることを更に含む、段落3に記載の方法。
5.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD4 T細胞が、少なくとも25%のエフェクターメモリー(EM)CD4 T細胞を含むか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD8 T細胞が、少なくとも25%のEM CD8 T細胞を含むか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のT細胞が、少なくとも25%のEM T細胞を含む、段落3又は4に記載の方法。
6.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD4 T細胞が、少なくとも20%のセントラルメモリー(CM)CD4 T細胞を含むか、あるいは第1のUTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD8 T細胞が、少なくとも20%のCM CD8 T細胞を含むか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のT細胞が、少なくとも20%のCM T細胞を含む、段落3又は4に記載の方法。
7.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM CD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成するか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM CD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成するか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM T細胞の合わせた割合が、T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成する、段落3又は4に記載の方法。
8.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターT細胞の割合が、T細胞の10%以下である、段落3又は4に記載の方法。
9.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中の幹細胞メモリーCD4 T細胞の割合が、CD4 T細胞の10%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL集団中の幹細胞メモリーCD8 T細胞の割合が、CD8 T細胞の10%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中の幹細胞メモリーT細胞の割合が、T細胞の10%以下である、段落3又は4に記載の方法。
10.第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD4 T細胞の合わせた割合が、CD4 T細胞の15%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD8 T細胞の合わせた割合が、CD8 T細胞の15%以下であるか、あるいは第1のUTIL若しくはMTIL集団又は第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーT細胞の合わせた割合が、T細胞の15%以下である、段落3又は4に記載の方法。
11.EM細胞が、CD62L-/CD45RO+、若しくはCCR7lo/CD62Llo、若しくはCX3CR1hi/CD27lo、若しくはCD127hi、若しくはCD27-/CD45RA-によって特徴付けられるか、又はCM細胞が、CD62L+/CD45RO+、若しくはCCR7hi/CD62Lhi、CX3CR1lo/CD27hi、若しくはCD127hi、若しくはCD27+/CD45RA-によって特徴付けられるか、又はエフェクター細胞が、CD62L-/CD45RO-によって特徴付けられるか、又は幹細胞メモリー細胞が、CD62L+/CD45RO-によって特徴付けられる、段落5~10のいずれか1つに記載の方法。
12.脱凝集することが、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落3~11のいずれか1つに記載の方法。
13.脱凝集腫瘍が、細胞化される、請求項3~12のいずれか1つに記載の方法。
14.単一細胞懸濁液が、精製された切除腫瘍産物から得られ、ステップ(b)で使用されるか、又はステップ(a)からの精製された切除腫瘍産物が、単一細胞懸濁液を含む、段落3~13のいずれか1つに記載の方法。
15.第1のUTIL又はMTIL集団が、約100万~2000万個のUTIL又はMTILを含む、段落3~14のいずれか1つに記載の方法。
16.ステップ(b)が、第1の集団を産生するためにUTIL又はMTILを成長させることを含み、ステップ(c)の第2の増殖ステップが、急速増殖を含む、段落1~15のいずれか1つに記載の方法。
17.ステップ(b)が、約2週間実施され、ステップ(c)が、約2週間実施される、段落16に記載の方法。
18.ステップ(b)及び/又はステップ(c)で培養することが、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、又はそれらの組み合わせを添加することを含む、段落3~17のいずれか1つに記載の方法。
19.(e)第2のUTIL又はMTIL集団を懸濁させて、懸濁UTIL又はMTILを得ることを更に含む、段落3~18のいずれか1つに記載の方法。
20.懸濁することが、緩衝生理食塩水、及び/又はヒト血清アルブミン、及び/又はジメチルスルホキシド(DMSO)を含む組成物中で行われる、段落19に記載の方法。
21.(f)懸濁UTIL又はMTILを凍結保存することを更に含む、段落18又は19に記載の方法。
22.第2のUTIL若しくはMTIL集団の、又はそれらからの、又はそれら由来の凍結保存UTIL若しくはMTIL、あるいは懸濁UTIL又はMTILを解凍して、解凍UTIL又はMTILを得る最終ステップを更に含む、段落3~21のいずれか1つに記載の方法。
23.解凍UTIL又はMTILが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落22に記載の方法。
24.TILが、非修飾又はUTILである、段落3~23のいずれか1つに記載の方法、又は段落1若しくは2に記載の治療用集団。
25.TILが、修飾又はMTILである、段落3~23のいずれか1つに記載の方法、又は段落1若しくは2に記載の治療用集団。
26.TILが、遺伝子操作方法によるMTILである、請求項vのいずれか1つに記載の方法、又は段落1若しくは2に記載の治療用集団。
27.TILを遺伝子操作方法に供し、そこからMTILを得ることを含むステップを含む、段落3~23又は26のいずれか1つに記載の方法。
28.遺伝子操作方法が、CRISPR法、又はTALE若しくはTALEN法、又は亜鉛フィンガー法、又はトランスフェクション法、又は形質導入法、又はトランスポゾンシステム法を含む、段落26又は27に記載の方法又は治療用集団。
29.段落3~28のいずれか1つに記載の方法によって得られるか、又は得ることができる、段落1、2、又は24~28のいずれか1つに記載の治療用集団。
30.段落3~28のいずれか1つに記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存UTIL集団。
31.段落3~28のいずれか1つに記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存MTIL集団。
32.集団が、約5×109~約5×1010個のT細胞を含む、段落1、2、24~28、29、30、又は31に記載の治療用集団。
33.段落1、2、24~28、29、30、31、又は32に記載の治療用集団を含む内容物を収容する凍結保存バッグ。
34.バッグが、封止されている、段落33に記載の凍結保存バッグ。
35.静脈内注入で使用するための段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグ、あるいは段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグを含むか、又は段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32に記載の治療用集団を含む内容物を収容する、静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器。
36.段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の薬学的に許容される賦形剤及び治療用集団、段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物を含む、医薬製剤。
37.患者又は対象におけるがんを治療するための方法であって、方法は、
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、又は
(vi)(i)~(v)のいずれか1つを含む薬剤の有効量を投与することを含み、
患者又は対象が、がんのために、及び/又は投与のために治療される必要がある、方法。
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、又は
(vi)(i)~(v)のいずれか1つを含む薬剤の有効量を投与することを含み、
患者又は対象が、がんのために、及び/又は投与のために治療される必要がある、方法。
38.がんの治療のための薬剤を調製するための
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、
患者又は対象に薬剤を投与することを含み、薬剤が、
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、
患者又は対象が、がんのために、及び/又は投与を受けるために治療される必要がある、使用。
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、
患者又は対象に薬剤を投与することを含み、薬剤が、
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)段落33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)段落35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、
患者又は対象が、がんのために、及び/又は投与を受けるために治療される必要がある、使用。
39.がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮細胞がん[HNSCC]を含む)、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、腎がん、又は腎細胞がんである、段落37又は38に記載の方法又は使用。
40.患者又は対象が、ヒトである、段落37又は38に記載の方法又は使用。
41.患者又は対象が、非ヒト哺乳動物である、段落37又は38に記載の方法又は使用。
42.非ヒト哺乳動物が、霊長類、齧歯類、ラット、マウス、家畜化哺乳類、家畜化ネコ、家畜化イヌ、家畜化ウマ、モルモット、実験動物、又はコンパニオンアニマルである、段落41に記載の方法又は使用。
43.患者又は対象が、二次性徴を有する成人又は個人である、段落37~42のいずれか1つに記載の方法又は使用。
44.患者又は対象が、二次性徴を有する成人でも、個人でもないか、又は子供であるか、若しくは身体的に成熟していない哺乳動物である、段落37~41のいずれか1つに記載の方法。
45.投与が、複数回実施されるか、又は時間経過にわたって複数回実施され、時間経過が、1週間であり、かつ投与が、1週間に2回、3回、4回、若しくは5回であるか、時間経過が、1か月であり、かつ投与が、1か月に2回、4回のうちの3回であるか、又は時間経過が、3か月、6か月、9か月、若しくは12か月であり、かつ時間経過が、1か月に1回、若しくは週に1回である、及び/あるいは有効量が、先行段落のいずれかに列挙されるTILの量を含む、及び/あるいは投与が、静脈内である、段落37~44のいずれか1つに記載の方法又は使用。
46.キットであって、
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物と、
賦形剤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、又は(v)を含有及び/又は混合するためのコンテナと、任意選択的に、混合及び/又は投与のための説明書と、を含む、キット。
(i)段落36の製剤、又は
(ii)段落1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか1つに記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物と、
賦形剤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、又は(v)を含有及び/又は混合するためのコンテナと、任意選択的に、混合及び/又は投与のための説明書と、を含む、キット。
したがって、本出願人が権利を留保し、これにより、あらゆる既知の製品、その製品を作製するプロセス、又はその製品を使用する方法の放棄を開示するように、いずれの既知の製品、プロセス、又は方法も本発明に包含しないことが本発明の目的である。本出願人が権利を留保し、これにより、あらゆる前述の製品、その製品を作製するプロセス、又はその製品を使用する方法の放棄を開示するように、本発明が、USPTO(米国特許法第112条、第1段落)又はEPO(EPC第83条)の記載要件及び実施可能要件を満たさないいずれの製品、製品を作製するプロセス、又は製品を使用する方法も本発明の範囲内に包含することを意図しないことに更に留意されたい。本発明の実施に際して、EPC第53(c)条並びにEPC第28(b)規則及び第28(c)規則に準拠することが有利であり得る。本出願の系統若しくは任意の他の系統における又は任意の第三者のあらゆる以前に申請された出願における出願人のあらゆる付与された特許の主題であるいずれの実施形態も明白に放棄する全ての権利が明白に留保される。本明細書のいかなる内容も保証と解釈されてはならない。
本開示において、特に特許請求の範囲及び/又は段落において、「含む(comprises)」、「含まれる(comprised)」、「含む(comprising)」などの用語が、米国特許法におけるそれに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む(includes)」、「含まれる(included)」、「含む(including)」などを意味することができ、「から本質的になる(consisting essentially of)」及び「から本質的になる(consists essentially of)」などの用語が、米国特許法におけるそれに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、明白に列挙されていない要素を考慮するが、先行技術で見つけられる要素又は本発明の基本的な特徴又は新規の特徴に影響を及ぼす要素を排除することに留意されたい。
これら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態に開示されているか、又はそれから明白であり、それらによって包含される。
特許又は出願ファイルは、少なくとも1つのカラー図面を含有する。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報の写しは、要求時、かつ必要な料金の支払い時に、特許庁によって提供されることになる。
以下の発明を実施するための形態は、一例として提示されており、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定するようには意図されておらず、添付図面と併せて最も良く理解され得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
「抗CD3抗体」という用語は、抗体又はそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、成熟ヒトT細胞のT細胞抗原受容体のCD3受容体に対して配向されるヒト、ヒト化、キメラ、マウス、又は哺乳動物抗体を含む。抗CD3抗体は、ムロモナブとしても知られるOKT-3を含む。抗CD3抗体はまた、T3及びCD3イプシロンとしても知られるUHCT1クローンも含む。他の抗CD3抗体は、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブを含む。
「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び状態の個体差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に説明される腫瘍浸潤リンパ球(例えば、二次TIL又は遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球)を含む医薬組成物は、104~1011個の細胞/kg体重(例えば、105~106、105~1010、105~1011、106~1010、106~1011、107~1011、107~1010、108~1011、108~1010、109~1011、又は109~1010個の細胞/kg体重)の用量で投与され得、それらの範囲内の全ての整数値を含む。腫瘍浸潤リンパ球(いくつかの場合、遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球を含む)組成物もまた、これらの用量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球(いくつかの場合、遺伝子的なものを含む)免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することによって投与され得る(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988を参照されたい)。特定の患者の最適な用量及び治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
本明細書で使用される際、「併用」、「併用する」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与する」、「同時に」、及び「同時」という用語は、対象への2つ以上の活性医薬品成分(本発明の好ましい実施形態では、例えば、複数のTILとの組み合わせにおける少なくとも1つのカリウムチャネルアゴニスト)の投与を包含し、そのため、両方の活性医薬品成分及び/又はそれらの代謝物が対象内に同時に存在する。併用は、別個の組成物における同時投与、別個の組成物の異なる時点における投与、又は2つ以上の活性医薬品成分が存在する組成物における投与を含む。別個の組成物における同時投与、及び両方の薬剤が存在する組成物における投与が好ましい。
本明細書で使用される場合、「細胞化される又は細胞化」は、固形組織によって、複数の細胞系統/タイプから一般的に作製される多細胞材料が、1つの細胞に限定されないが、非常に少数の様々な系統又は細胞タイプの複数の細胞、すなわち、細胞塊又は細胞凝集体を含む、少数の細胞に分解される、脱凝集のプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖された系を指す。細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系が、本発明の方法とともに用いられ得る。閉鎖系としては、例えば、限定されるものではないが、閉鎖されたG-Rexコンテナ又は細胞培養バッグが挙げられる。腫瘍セグメントが閉鎖系に追加されると、システムは、TILが患者に投与される準備ができるまで外部環境に開放されない。有利な実施形態では、閉鎖系は、PCT公開第2018/130845号に開示されているシステムである。
本明細書で使用される場合、「凍結保存培地」は、細胞の凍結保存に使用され得る任意の培地を指す。そのような培地は、2%~10%のDMSOを含む培地を含み得る。例示的な培地としては、CryoStor CS10、HypoThermosol、Bloodstor BS-55、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書の「凍結保存TIL」という用語は、一次、バルク、又は増殖(REP TIL)のいずれかであるTILが、約-190℃~-60℃の範囲で処置され、保存されることを意味する。凍結保存の一般的な方法はまた、実施例を含む、本明細書の他の箇所にも説明されている。明確にするために、「凍結保存TIL」は、一次TILの供給源として使用され得る凍結組織試料と区別可能である。
本明細書で使用される場合、「枯渇」は、固相に結合された1つのマーカー結合断片によって標識される望ましくない細胞から所望の細胞を分離する陰性選択のプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「脱凝集又は脱凝集する」は、単一細胞又は小細胞数の凝集体への固形組織の変換を指し、スフェロイドとしての単一細胞は、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm以上の範囲の直径を有し、これは、大抵7~20μmである。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患治療を含むがこれに限定されない、意図される用途に効果をもたらすのに十分である、本明細書に説明される化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途(インビトロ又はインビボ)、又は治療される対象及び疾患状態(例えば、対象の体重、年齢、及び性別)、疾患状態の重症度、若しくは投与の様式に応じて変化し得る。用語はまた、標的細胞に特定の応答を誘導することになる用量(例えば、血小板の接着及び/又は細胞遊走の低減)にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、投与される組織、及び化合物が輸送される物理的送達システムに応じて変化することになる。
本明細書で使用される場合、「操作される」は、組織由来細胞機能をその本来の機能から変化させて、その最終的な有用性に対して新しい又は改善された機能を有するように変化させる、核酸材料又は因子のいずれかの追加を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素培地」は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物などの酵素活性を有する培地を指す。
本明細書で使用される場合、「濾液」は、フィルタ、メッシュ、又は膜を通過する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「可撓性コンテナ」は、1つ以上の異なるタイプのフィルムを有する複数のフォーマットの可撓性梱包システムを指す。各フィルムタイプは、プロセスのステップに応じて、滅菌流体、固形組織由来細胞材料、及びコンテナの完全性の物理的、化学的、及び機能的特徴を保持するための特定の特性を提供するように選択される。
当分野で抗凍結剤とも呼ばれる「凍結溶液」又は「凍結保存溶液」は、抗凍結添加剤を含有する溶液である。これらは、一般的に、凍結損傷(すなわち、氷の形成に起因する)を最小化するために、凍結中に細胞が曝露される物理的ストレスを修飾する、透過性かつ非毒性の化合物であり、最も一般的には、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール、グリセロール、2-メチル-2,4-ペンタンジオール(MPD)、プロピレングリコール、スクロース、及びトレハロースのうちの1つ以上の体積%である。
「血液悪性腫瘍」という用語は、限定されるものではないが、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含む、造血及びリンパ組織の哺乳動物がん及び腫瘍を指す。血液悪性腫瘍はまた、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響する血液悪性腫瘍を指す。
「IL-2」(本明細書では「IL2」とも称される)という用語は、インターロイキン-2として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、IL-2の全ての形態を含む。IL-2は、例えば、Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88及びMalek,Annu. Rev.Immunol.2008,26,453-79に説明されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に好適な組換えヒトIL-2のアミノ酸配列は、表2(配列番号3)に与えられる。例えば、IL-2という用語は、アルデスロイキン(PROLEUKIN、単回使用バイアル当たり2200万IUで複数の供給業者から市販されている)などのIL-2のヒトの組換え形態、並びにCellGenix,Inc.、Portsmouth,N.H.,USA(CELLGRO GMP)又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick,N.J.,USA(Cat.No.CYT-209-b)によって商業的に供給される組換えIL-2の形態、及び他のベンダーからの他の商業的均等物を包含する。アルデスロイキン(デス-アラニル-1、セリン-125ヒトIL-2)は、およそ15kDaの分子量を有するIL-2の非グリコシル化ヒト組換え形態である。IL-2という用語はまた、Nektar Therapeutics、South San Francisco,Calif.,USAから入手可能なペグ化IL2プロドラッグNKTR-214を含む、本明細書に説明されるIL-2のペグ化形態も包含する。本発明における使用に好適なNKTR-214及びペグ化IL-2は、米国特許出願公開第2014/0328791 A1号及び国際特許出願公開第2012/065086 A1号に説明される。本発明における使用に好適なコンジュゲートIL-2の代替的な形態は、米国特許第4,766,106号、同第5,206,344号、同第5,089,261号、及び同第4902,502号に説明されている。本発明における使用に好適なIL-2の製剤は、米国特許第6,706,289号に説明されている。
「IL-4」(本明細書では「IL4」とも称される)という用語は、Th2 T細胞によって、並びに好酸球、好塩基球、及びマスト細胞によって産生されるインターロイキン4として知られるサイトカインを指す。IL-4は、Th2 T細胞へのナイーブヘルパーT細胞(Th0細胞)の分化を制御する。Steinke and Borish,Respir. Res.2001,2,66-70。IL-4による活性化時、Th2 T細胞は、その後、ポジティブフィードバックループで追加のIL-4を産生する。IL-4はまた、B細胞の増殖及びクラスII MHC発現を刺激し、B細胞からIgE及びIgG1発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に好適な組換えヒトIL-4は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick、N.J.,USA(Cat.No.CYT-211)及びThermoFisher Scientific,Inc.、Waltham,Mass.,USA(ヒトIL-15組換えタンパク質、Cat.No.Gibco CTP0043)を含む、複数の供給業者から市販されている。
「IL-7」(本明細書では「IL7」とも称される)という用語は、間質細胞及び上皮細胞から、並びに樹状細胞から得られ得る、インターロイキン7として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指す。Fry and Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7は、T細胞の発生を刺激し得る。IL-7は、胸腺内のT細胞の発生及び末梢内の生存に重要な一連のシグナルにおいて、IL-7受容体アルファ及び共通ガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるIL-7受容体に結合する。本発明における使用に好適な組換えヒトIL-7は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick,N.J.,USA(Cat.No.CYT-254)及びThermoFisher Scientific,Inc.、Waltham,Mass.,USA(ヒトIL-15組換えタンパク質、Cat.No.Gibco PHC0071)を含む、複数の供給業者から市販されている。
「IL-12」(本明細書では「IL12」とも称される)という用語は、インターロイキン-12として知られるT細胞成長因子を指す。インターロイキン(IL)-12は、2つのジスルフィド結合グリコシル化タンパク質サブユニットからなる分泌ヘテロ二量体サイトカインであり、それらのおよその分子量に対してp35及びp40と指定される。IL-12は、主に抗原提示細胞によって産生され、T細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞の表面上に発現される2鎖受容体複合体に結合することによって、細胞媒介性免疫を駆動する。IL-12受容体ベータ-1(IL-12Rpi)鎖は、IL-12のp40サブユニットに結合し、IL-12とその受容体との間の一次相互作用を提供する。しかしながら、細胞内シグナル伝達を付与するのは、第2の受容体鎖であるIL-12RP2のIL-12p35ライゲーションである。抗原提示と同時にIL-12シグナル伝達は、インターフェロンガンマ(IFNy)産生によって特徴付けられるTヘルパー1(Th1)表現型に向かってT細胞分化を引き起こすと考えられる。Thl細胞は、いくつかの細胞内病原体に対する免疫を促進し、補体固定抗体アイソタイプを生成し、腫瘍免疫監視に寄与すると考えられる。したがって、IL-12は、防御免疫機構を宿主とする有意な構成要素であると考えられる。IL-12は、IL-23、IL-27、IL-35、IL-39も含むIL-12サイトカインファミリーの一部である。
「IL-15」(本明細書では「IL15」とも称される)という用語は、インターロイキン-15として知られるT細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、IL-15の全ての形態を含む。IL-15は、例えば、Fehniger and Caligiuri,Blood 2001,97,14-32に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。IL-15は、IL-2と、β及びγのシグナル伝達受容体サブユニットを共有する。組換えヒトIL-15は、12.8kDaの分子量を有する114アミノ酸(及びN末端メチオニン)を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick,N.J.,USA(Cat.No.CYT-230-b)及びThermoFisher Scientific,Inc.、Waltham,Mass.,USA(ヒトIL-15組換えタンパク質、Cat.No.34-8159-82)を含む、複数の供給業者から市販されている。
「IL-18」(本明細書では「IL18」とも称される)という用語は、インターロイキン-15として知られるT細胞成長因子を指す。インターロイキン-18(IL-18)は、その構造、受容体ファミリー及びシグナル伝達経路に起因して、IL-1サイトカインファミリーに属する炎症促進性サイトカインである。関連サイトカインとしては、IL-36、IL-37、IL-38が挙げられる。
「IL-21」(本明細書では「IL21」とも称される)という用語は、インターロイキン-21として知られる多面発現サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、IL-21の全ての形態を含む。IL-21は、例えば、Spolski and Leonard,Nat. Rev.Drug. Disc.2014,13,379-95に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。IL-21は、ナチュラルキラーT細胞及び活性化ヒトCD4+T細胞によって主に産生される。組換えヒトIL-21は、15.4kDaの分子量を有する132アミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-21は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick,N.J.,USA(Cat.No.CYT-408-b)及びThermoFisher Scientific,Inc.、Waltham,Mass.,USA(ヒトIL-21組換えタンパク質、Cat.No.14-8219-80)を含む、複数の供給業者から市販されている。
「液体腫瘍」という用語は、本質的に流体である細胞の異常な質量を指す。液体腫瘍がんとしては、限定されるものではないが、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられる。液体腫瘍から得られたTILはまた、本明細書では骨髄浸潤リンパ球(MIL)とも呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「磁気粒子」における「磁気」は、磁性粒子の全てのサブタイプを指し、これは、当業者に周知の方法、特に強磁性粒子、超常磁性粒子、及び常磁性粒子で調製され得る。「強磁性」材料は、磁界に強く感受性であり、磁界が除去されたときに磁気特性を保持することができる。「常磁性」材料は、弱い磁気感受性のみを有し、磁界が除去されたとき、それらの弱い磁気力は迅速に失われる。「超常磁性」材料は、磁気的に感受性が高い、すなわち、それらは、磁界に配置されたときに強磁性となるが、常磁性材料のように、その磁気力は急速に失われる。
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、特定の細胞型によって特異的に発現される細胞抗原を指す。好ましくは、マーカーは、細胞表面マーカーであり、その結果、生存細胞の濃縮、単離、及び/又は検出が実施され得る。
本明細書で使用される場合、「マーカー結合断片」は、細胞の所望の標的分子、すなわち、抗原に優先的に結合する任意の部分を指す。部分という用語は、例えば、抗体又は抗体断片を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、当業者に周知の方法によって生成され得るポリクローナル又はモノクローナル抗体を指す。抗体は、任意の種、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトの抗体であってもよい。治療目的のために、非ヒト抗原結合断片が使用される場合、これらは、当該技術分野で公知の任意の方法でヒト化され得る。抗体はまた、修飾抗体(例えば、オリゴマー、還元、酸化、及び標識抗体)であってもよい。「抗体」という用語は、無傷の分子と、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、及び一本鎖抗体などの抗体断片との両方を含む。加えて、「マーカー結合断片」という用語は、細胞の所望の標的分子に優先的に結合する抗体又は抗体断片以外の任意の部分を含む。好適な部分は、限定なしで、所望の標的分子に結合するアプタマーとして知られるオリゴヌクレオチド(Hermann and Pantel,2000:Science 289:820-825)、炭水化物、レクチン、又は任意の他の抗原結合タンパク質(例えば、受容体-リガンド相互作用)を含む。
「培地」は、細胞培養、細胞死を低減するために使用される細胞の取り扱い及び安定化の当該技術分野で公知の様々な溶液を意味し、限定されるものではないが、以下の1つ以上の培地、臓器保存液、選択的溶解溶液、PBS、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、イスコフ培地、X-VIVO(商標)、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、PLASMALYTE(商標)溶液、結晶性溶液及びIV液、コロイド溶液及びIV液、5%デキストロース水溶液(D5W)、ハルトマン溶液が挙げられる。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養(例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト)又は幹細胞(例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはT細胞増殖)用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、抗生物質、接着因子、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、代謝阻害剤又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ThermoFisher Scientific又はSigma-Aldrichから市販されている。
本明細書で使用される場合、「微小環境」という用語は、全体として、又は微小環境内の細胞の個々の部分集団として、固形又は血液腫瘍微小環境を指し得る。腫瘍微小環境は、本明細書で使用される場合、Swartz,et al.,Cancer Res.,2012,72,2473に説明されるように、「細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び腫瘍の形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を育成し、優性転移が成長するための適所を提供する機械的合図」の複雑な混合物を指す。腫瘍は、T細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスは稀である。
本明細書で使用される場合、「陰性分離」という用語は、固相に結合された1つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団ではない。
本明細書で使用される場合、「非標識」又は「非接触」は、固相に結合された1つのマーカー結合断片によって結合されない細胞を指す。非標識、非接触細胞画分は、所望の標的細胞を含有する。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」は、望ましくない細胞型を除去するために使用される固相に結合される1つのマーカー結合断片に特異的に結合される細胞を指す。
「OKT-3」(本明細書では「OKT3」とも称される)は、成熟T細胞のT細胞抗原受容体中のCD3受容体に対して向けられたヒト、ヒト化、キメラ、又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオ後続品又はそのバリアントを指し、OKT-3(30ng/mL、MACS GMP CD3 Pure、Miltenyi Biotech,Inc.、San Diego,Calif.,USA)及びムロモナブ若しくはバリアント、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、又はそのバイオ後続品などの市販形態を含む。
本明細書で使用される場合、「粒子」は、コロイド粒子、微粒子、ナノ粒子、又はビーズなどの固相を指す。そのような粒子の生成のための方法は、当該技術分野で周知である。粒子は、磁気粒子であってもよく、又は他の選択的特性を有してもよい。粒子は、溶液若しくは懸濁液中であってもよく、又は本発明における使用前に凍結乾燥状態であってもよい。次いで、凍結乾燥粒子は、本発明に関して処理される試料に接触する前に、簡便な緩衝液中で再構成される。
「末梢血単核細胞」及び「PBMC」という用語は、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞)及び単球を含む丸い核を有する末梢血細胞を指す。末梢血単核細胞は、照射された同種末梢血単核細胞であることが好ましい。PBMCは、抗原提示細胞の一種である。
「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むことが意図される。活性医薬品成分に対するそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来的な薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬品成分と互換性がない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬品成分もまた、説明される組成物及び方法に組み込まれ得る。
本明細書における「細胞集団」(TILを含む)という用語は、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、概して、1×106~1×1012の数の範囲であり、異なるTIL集団は、異なる数を含む。
本明細書で使用される場合、「陽性分離」という用語は、固相に結合された1つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団である。
本明細書で使用される場合、「陰性分離」は、固相に結合された1つのマーカー結合断片によって結合される細胞の活性分離を指し、これらの細胞は、細胞の必須集団ではない。
本明細書で使用される場合、「純度」は、標的集団又は本来の固形組織からの所望の集団の割合を指す。
「急速増殖」は、1週間にわたって少なくとも約3倍(又は4、5、6、7、8、若しくは9倍)、より好ましくは、1週間にわたって少なくとも約10倍(又は20、30、40、50、60、70、800、若しくは90倍)、より好ましくは、1週間にわたって少なくとも約100倍(又は200、300、400、500、600、700、800、若しくは900倍)、あるいは最も好ましくは1週間にわたって少なくとも約1000倍又は2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、若しくは9000倍)の抗原特異的TILの数の増加を意味する。いくつかの急速増殖プロトコルが以下に概説される。
「再生医療」、「養子細胞療法」、又は「先進療法医薬品」は、本明細書に互換的に使用され、適用後の哺乳動物の健康を改善することを目的とした、細胞材料の一部又は全部の作用、又は細胞材料の一部又は全部の支持作用のいずれかによって、1つ以上の哺乳動物の治療目的に使用される細胞材料を指す。治療用細胞は、直接的に使用され得るか、又はこれらの作用を提供するために更なる処理、増殖、及び/若しくは操作を必要とし得る。
本明細書で使用される場合、「試料」は、任意の比率で細胞を含有する試料を指す。好ましくは、これらの細胞は生存可能である。いくつかの事例では、これらの細胞はまた、その後の核酸又はタンパク質抽出に使用され得る固定又は凍結細胞であり得る。試料は、動物、特にマウス、ラット、又はヒトなどの哺乳動物からのものであってもよい。細胞を含有する任意の圧縮性固形組織が使用され得る。本発明は、主に、固形腫瘍組織からの造血及びがん細胞の単離を通して例示される。しかしながら、本発明は、任意の哺乳動物固形組織から幅広い細胞を単離するための方法に関する。
本明細書で使用される場合、「固相」は、別の基材、例えば、粒子、発蛍光団、ビオチンのようなハプテン、ポリマー、又は培養皿及びマイクロタイタープレートなどのより大きな表面に結合された、マーカー結合断片、例えば、抗体の結合を指す。いくつかの事例では、結合は、例えば、抗原結合断片が培養皿のより大きい表面に結合される場合、抗原結合断片の直接的な固定化を結果的にもたらす。他の場合、この結合は、間接的な固定化を結果的にもたらし、例えば、磁気ビーズに直接的又は間接的に(例えば、ビオチンを介して)結合された抗原結合断片は、該ビーズが磁界に保持される場合、固定化される。更なる場合、抗原結合断片の他の分子への結合は、直接的又は間接的な固定化をもたらさないが、例えば、マーカー結合断片が、化学的又は物理的部分に結合され、次いで、例えば、FACS選別のようなフローサイトメトリー法、又は蛍光顕微鏡法を介して、標識細胞及び非標識細胞の識別を可能にする場合、本発明による細胞の濃縮、分離、単離、及び検出を可能にする。
本明細書で使用される場合、「固形組織」は、その三次元、すなわち、幾何学的本体としての長さ、幅、及び厚さが、複数の個々の細胞ベースの単位のサイズより大きく、多くの場合、組織の構造を構成するコラーゲン又は類似の基質などの結合材料を含有し、それによって、該固形組織が、チューブを通って流れることができないか、あるいはシリンジ又は類似の小さい導管若しくはレセプタクルによって収集されることができない、すなわち、500μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、10cm、20cm、30cmの範囲の寸法を有する、動物由来哺乳動物固形組織片を指す。
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない、異常な組織の塊を指す。固形腫瘍は、良性である可能性も悪性である可能性もある。「固形腫瘍がん」という用語は、悪性、新生物、又はがん性固形腫瘍を指す。固形腫瘍がんとしては、限定されるものではないが、肺、乳房、前立腺、結腸、直腸、及び膀胱のがんなどの、肉腫、がん、及びリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(がん細胞)及びがん細胞が分散され、支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む、相互依存性の組織区画を含む。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん(例えば、頭頸部扁平上皮細胞がん[HNSCC]を含む)、神経膠芽腫、卵巣がん、肉腫、膵がん、膀胱がん、乳がん、三重陰性乳がん、及び非小細胞肺がんから選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織(がん細胞)及びがん細胞が分散され、支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む、相互依存性の組織区画を含む。
本明細書における「解凍された凍結保存TIL」とは、以前に凍結保存され、次いで、限定されるものではないが、細胞培養温度又はTILが患者に投与され得る温度を含む室温以上に戻るように処置されたTILの集団を意味する。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、並びに/又は疾患に起因する疾患及び/若しくは有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の観点で治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患の任意の治療をカバーし、(a)疾患に罹患し易いが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象において疾患が発生することを防止すること、(b)疾患を阻害すること、すなわち、その発症又は進行を停止すること、並びに(c)疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと、及び/又は1つ以上の症状を緩和することを含む。「治療」はまた、疾患又は病態の非存在下であっても、薬理学的効果を提供するために、薬剤の送達を包含することを意味する。例えば、「治療」は、疾患状態の非存在下で免疫応答を誘発するか、又は免疫を付与することができる組成物の送達、例えば、ワクチンの場合を包含する。
本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「TIL」とは、対象の血流を離れ、腫瘍へと移行した白血球として元々得られた細胞集団を意味する。TILとしては、限定されるものではないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Thi及びThi 7 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、並びにMlマクロファージが挙げられる。TILは、一次及び二次TILの両方を含む。「一次TIL」は、本明細書に概説される患者組織試料から得られるもの(「新鮮に採取された」と称される場合もある)であり、「二次TIL」は、限定されるものではないが、バルクTIL及び増殖TIL(「REP TIL」又は「REP後 TIL」)を含む、本明細書に論じられるように増殖又は急速に増殖した任意のTIL細胞集団である。TIL細胞集団は、遺伝子修飾TILを含み得る。TILは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤して治療に影響するその能力によって機能的にのいずれかで定義され得る。TILは、概して、以下のバイオマーカーのうちの1つ以上を発現することによって分類され得る。CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD62L、CD95、PD-1、及びCD25。追加的及び代替的に、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義され得る。TILは、効力によって更に特徴付けられ得、例えば、TILは、それらが産生するTCRの関与に応答して、例えば、インターフェロン(IFN)放出が、約50pg/mL超、約100pg/mL超、約150pg/mL超、若しくは約200pg/mL超である場合、又はより好ましくは、個々の細胞が、フローサイトメトリーによるTCR誘導刺激後に、CD137、CD107a、INF-γ TNF-α、及びIL-2について細胞内染色を通じて有効性であり得る場合、効能があるか、又は機能的であると考えられ得る。
本明細書で使用される場合、「保持物」は、フィルタ、メッシュ、又は膜を通過しない材料を指す。
本明細書で使用される場合、「最終的な有用性」とは、再生医療、養子細胞療法、ATMP、診断的インビトロ研究又は科学研究の製造又は直接使用を指す。
本発明は、転移性がん患者の腫瘍から単離され得る、特定の非修飾TIL(UTIL)における腫瘍浸潤リンパ球(TIL)に関し、これは、同じがん患者から生成され、かつ同じがん患者に戻された自己TILを伴う。本発明はまた、治療用凍結保存TIL又はUTIL集団を単離するための方法、並びに本明細書に説明される方法によって切除腫瘍を処理するための単回使用の無菌キットを含むデバイスの使用を介して得られるか、又は得ることができるTIL及びUTILに関する。
一般に、TILは、最初に患者腫瘍試料から得られ(「一次TIL」)、次いで、本明細書に説明される更なる操作のためにより大規模な集団に増殖され、凍結保存され、本明細書に概説されるように再刺激され、TILヘルスの指標として表現型及び代謝パラメータについて任意選択的に評価される。
患者腫瘍試料は、当該技術分野で公知の方法を使用して、一般に、腫瘍及びTIL細胞の混合物を含有する試料を得るための外科的切除、針生検、又はその他の手段を介して得られ得る。概して、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤腫瘍、又は転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍からのものであってもよい。腫瘍試料はまた、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍などの液体腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定されるものではないが、乳房、卵巣、子宮頸部、膵臓、前立腺、結腸直腸、肺、脳、腎臓、胃、及び皮膚を含む任意のがんタイプ(限定されるものではないが、扁平上皮がん、基底細胞がん、及び黒色腫を含む)のものであり得る。いくつかの実施形態では、TILは、悪性黒色腫腫瘍が特に高レベルのTILを有すると報告されているため、悪性黒色腫腫瘍から得られる。
産生は、一般に、2段階プロセスを伴う。段階1では、初期腫瘍材料が解剖され、脱凝集モジュールを有する無菌キット内に配置され、酵素的に消化及び/又は断片化され、脱凝集モジュール内の腫瘍を均質化して、単一細胞懸濁液を提供する。均質化された細胞は、もはや必要とされなくなった試薬、細胞片、非脱凝集組織などの構成要素を除去するために、別個の濃縮モジュール内の無菌キット内で更に精製され得るが、細胞は、TIL製造のための出発材料を安定化し、段階2が必要とされるまで無菌キットの安定化モジュール内で保存するために直接凍結保存され得る。段階2は、概して、切除腫瘍出発材料からのTILの成長(2週間)、その後のTIL細胞の急速増殖プロセス(急速増殖プロトコル「REP」-2週間)を伴う。最終産物が、洗浄され、緩衝生理食塩水、8.5%のHAS、及び10%のDMSO中で懸濁する前に採取され、凍結保存されて、更なる修飾なしで単回投与として注入する前に解凍される固形無菌産物を形成する。
治療には、治療活性に潜在的に寄与する3つの別個の要素が存在する。コア要素は、TIL、すなわち、腫瘍由来T細胞であり、これは、T細胞がその正常な機能の一部として利用される様々な方法によって、腫瘍細胞を標的化及び排除し得る。これらの方法は、直接的な方法(すなわち、ペルフォリン媒介性細胞傷害)及び間接的な方法(すなわち、サイトカイン産生)を含む。これらの方法のうち、インビボの抗腫瘍効果にとって最も重要なのがどちらであるかは不明であるが、マウスモデルは、インターフェロンガンマの産生が効果的な治療に重要であることを示唆している。療法に寄与する2つの他の要素は、コンディショニング前化学療法及び高用量静脈内IL-2である。これら2つの要素は、注入後の患者におけるT細胞の生着を支持することによって作用すると考えられ、最初に、競合及び制御する免疫細胞を除去するコンディショニング化学療法を経て、その後、T細胞の生存を支持するIL-2構成要素が続く。
細胞療法産物の構造は、成長支持細胞培養培地及びT細胞支持成長因子インターロイキン-2(IL-2)によって、酵素消化された腫瘍塊から直接TILを成長させることによって作り出される。これは、腫瘍特異的T細胞が、腫瘍細胞混合物から選択的に生存し、成長することを可能にするが、一方、腫瘍抗原を認識しないT細胞は、刺激されず、選択的に失われることになる。産物は、T細胞が患者の自身のがん組織に由来しており、急速に増殖してCD3表面マーカーによって定義される純粋なT細胞集団及びT細胞を形成している、自己T細胞ベースの産物を含む。
簡潔には、TIL、特にUTILは、腫瘍生検を出発材料として使用して、二段階プロセスで産生され得る。第1段階(概して2~3時間にわたって実施される)では、キット及び半自動デバイスの使用を介した解剖、酵素消化、及び均質化を使用した腫瘍材料の初回収集及び処理が行われ、単一細胞懸濁液を産生し、これは、キットの安定化モジュールを使用して直接凍結保存されて、後続の製造及び数日又は数年後に行われ得る段階2のための出発材料を安定化させ得る。第2段階は、4週間にわたって実施され得、これは、第1段階の産物の解凍及び腫瘍出発材料からのTILの成長(約2週間)から始まり、その後に細胞の量、ひいては用量を増加させるためのTIL細胞の急速増殖プロセス(約2週間)が続く、連続的プロセスであり得る。TIL、特にUTILは、液体細胞懸濁液として製剤化する前に濃縮され、洗浄され得る。無菌医薬品は、更なる修飾なしで単回投与として静脈内注入前に解凍されることになるバッグ内に凍結保存され得る。
一実施形態では、本発明のバッグは、収集バッグ及び/又は凍結保存バッグである。バッグ及び任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び/又はチューブは、概して、閉鎖及び/又は封止された血液並びに/又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル(PVC)を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、PVCは、溶着及び/又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのコポリマー(すなわち、OriGen Biomedical EVOフィルム)、並びに/又はEVAを含む材料などの、所定の材料から作製された組織を受容するためのバッグの少なくとも一部分を含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性及び/又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの市場性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約2.5mm~約7.5mmの範囲の幅を有し得る。概して、封止140は、組織材料がバッグ140内に配置された後で形成され、約5mmの幅を有し得る。封止は、シールピール試験(すなわち、ASTM F88/F88M)、及び/又は破裂試験(すなわち、ASTM F1140/F1140M若しくはASTM F2051/F2054M)を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に100ニュートンの力に耐え得、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に75ニュートンの力に耐えて、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び/又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約8秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。8秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の2~3秒間圧力が適用され得る。
いくつかの実施形態では、バッグは、約10cm~約50cmの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約15cm~約30cmの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約18cm~約22cmの範囲の長さを有し得る。
チューブのうちのいくつかは、溶着可能であってもよい。溶着可能なチューブは、ポリマー材料、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)から作製され得る。
限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、約10cm~約40cmの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約15cm~約30cmの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約18cm~約22cmの範囲の長さを有し得る。
凍結保存バッグは、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)などの抗凍結剤を用いた凍結保存に好適である必要があり得る。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、バッグが約5ml~約45mlの範囲の体積の材料を保持し得るように構築され得る。特に、凍結保存バッグは、約10ml~約35mlの範囲の材料の体積を収容することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、約15ml~約30mlの範囲で保存される材料の体積を収容し得る凍結保存バッグを含む。凍結保存バッグは、所望の所定の体積が達成されるようにサイズ決めされていてもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、約4cm~約11cmの範囲の幅、及び約10cm~約18cmの範囲の長さを有し得る。例えば、凍結保存バッグは、約5.8cm~約9.8cmの範囲の幅、及び約12cm~約16cmの範囲の長さを有し得る。特に、凍結保存バッグの一実施形態は、約7.8cmの幅及び約14cmの長さを有し得る。
使用前に、凍結保存キット及び/又はその特定の構成要素は、滅菌され得る。バッグを形成するために使用される材料は、ヒートシール可能であり得る。バッグで使用するための材料としては、限定されるものではないが、EVA、ポリアミド(例えば、ナイロン)、及びそれらの組み合わせなどのポリマーを含み得る。開放バッグは、封止及び/又はクランプを使用してバッグを閉鎖した後の処理及び/又は脱凝集に使用され得る。
フィルタは、インラインフィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、生物学的フィルタ、及び/又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所望の材料を形成するために、処理された組織から所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、所望の材料が形成されるように、約200μm未満の平均サイズを有する成分を有し得る。例えば、所望の材料は、約170μm未満の平均サイズを有するTIL(腫瘍浸潤リンパ球)を含み得る。
フィルタは、フィルタの後、所望の材料が、約15μm~約500μmの範囲のサイズを有する成分を有する安定化要素の方向にチューブ内に流れるように、チューブから入る処理された組織組成物が濃縮され得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後に安定化要素の方向にチューブに入る組織組成物が、約50μm~約300μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約150μm~約200μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、濃縮要素のフィルタは、処理された組織から、約5μm~約200μmの所定のサイズ範囲外の材料を除去して、所望の材料を形成し得る。例えば、所望の材料は、約5μm~約200μmの範囲の平均サイズを有するTILを含み得る。弁は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁は、収集バッグから約20cmに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグに添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグに添加するために、無針弁に挿入され得る。弁を介して提供される材料としては、例えば、腫瘍消化培地、並びに/又はDMSOなどの抗凍結剤若しくは凍結保存培地、並びに/又は55%のDMSO及び5%のデキストラン凍結保存培地(例えば、BloodStror 55-5)などのそれらの溶液が挙げられる。
シリンジは、無針弁290、292を通じて、それぞれ、55%のDMSO及び5%のデキストラン凍結保存培地などの、腫瘍消化培地及び55%のDMSO溶液を提供するために使用され得る。処理中、材料は、所定の時間に凍結保存キットに選択的に提供され得る。更に、クランプは、腫瘍消化培地などの提供される材料の流れを制御するために使用され得る、及び/又はDMSO溶液などの抗凍結剤は、収集バッグ、フィルタ、及び/又は凍結保存バッグなどのデバイスに所定の時間に提供され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも10cmのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ199は、封止可能及び/又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、PVC(ポリビニルクロリド)、及び/又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約1.5mm~約4.5mmの範囲の内径、及び約2.1mm~約6.1mmの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約2.9mm~約3.1mmの範囲の内径を有し、約4.0mm~約4.2mmの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット191で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約1cm~約30cmの範囲の長さを有する。
クランプは、フィルタ内への酵素培地及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。例えば、クランプは、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への酵素培地及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。別のクランプ198は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び/又は防止する。
脱凝集産物材料が特定の実施形態では適切に保存され得ることを確保するために、2つ以上のバッグが一緒に結合され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、組織、例えば、固体哺乳動物組織からの細胞及び/又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のための自動デバイスを含み得る。本発明で使用するための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び凍結保存キットを含み得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キットは、単回使用であり得る。本発明は、半自動無菌組織処理方法に更に関する。
いくつかの実施形態では、収集バッグなどのバッグは、収集キットに使用され得る。バッグは、組織試料などの試料の添加を可能にする開放端を有する。コネクタは、収集キット内のチューブにバッグを結合し得る。チューブ材料は、封止可能及び/又は溶着可能であってもよい。例えば、チューブは、熱、無線周波数などのエネルギーを使用して封止され得る。チューブ材料は、PVAから作製され得る。
いくつかの実施形態では、チューブは、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物を含む、1つ以上の培地酵素溶液の添加を可能にするために弁に結合され得る。例えば、弁は、無針弁であり得る。凍結保存キットに使用されるチューブは、約2.0mm~約4mmの範囲のチューブの内径を有する約3.0mm~約5.0mmの範囲の外径を有するチューブを含み得る。特に、チューブは、4.1+/-0.1mmの外形及び約3.0+/-0.1mmの内径を有し得る。チューブの長さは、収集キットの構成に依存し得る。例えば、収集キットの実施形態は、約10cm~約20cmの範囲の長さを有するチューブを含み得る。
収集キットのいくつかの実施形態では、プロトタイプは、組織及び/又は酵素培地の移動を阻害及び/又は防止するための1つ以上のクランプを含み得る。特に、酵素培地及び/又は組織は、濾過ステップの前にフィルタ内に移動するのを阻害され得る。
治療には、治療活性に潜在的に寄与し得る3つの別個の要素が存在する。コア要素は、T細胞がその正常な機能の一部として利用される様々な機序によって腫瘍細胞を排除する潜在性を有する、UTILなどのTILである。
これらの機序は、[a]緊密な関与によって標的細胞に入り、細胞死を誘発する、細胞死を誘導する、細胞毒素(例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシン)を放出することによる、並びに[b]アポトーシスを誘導するFASリガンド媒介細胞傷害性を結合することなどのT細胞と標的との間の細胞表面相互作用による、直接的な細胞傷害性と、二次エフェクター細胞を動員及び刺激して、腫瘍細胞死に関与及びそれを誘導する能力を有する、間接的な方法(例えば、サイトカイン産生)を含む。
TIL、特にUTILは、自己産物であり、その結果、製造された各バッチは、指定された患者に単回投与を提供する。サブバッチ又はバッチのプーリングは存在しない。医薬品は、解凍後の単回静脈内注入に対し、125~270mLの8.5%のヒト血清アルブミン及び10%のDMSOを有する生理食塩水ベースの溶液中に凍結保存された、T細胞の小規模の無菌的に調製されたバッチ(5×109~5×1010)である。
本発明には、米国特許第10,398,734号(「’734特許」)と比較して数個の利点がある。’734特許の最初のステップは、TILが培養される断片に腫瘍バルクを形質転換することである。対照的に、本発明は、TILを腫瘍から解放し、これは、細胞懸濁液が調製される無菌キット中の切除後の無菌条件下で保存及び脱凝集され、細胞懸濁液が調製され、結果的に得られたTILを凍結することによって凍結保存する。本発明は、腫瘍の内側に存在する多様性を表す多様なTIL集団を提供する。また、それらは均質な懸濁液であるため、培養物内で増殖されるTILは、その多様性を保持することになり、腫瘍内に存在する多様ながん細胞集団に対処する可能性が最も高い。
対照的に、’734特許の製造プロセスは、出荷中に内部細胞集団の劣化、及び処理開始前の任意の更なる遅延を既に経験している組織の断片を用いて開始する。加えて、製造に使用されるTILは、内部に保持されるいかなるTILでもなく、組織断片から増殖するTILのみとなり、その結果、結果的に得られる細胞集団は、腫瘍環境の完全な多様性を反映しない場合がある。
別の差異は、閉鎖された製造処理への進入は、’734特許のプロセスよりも本発明の過程においてはるかに早く起こり、汚染の可能性がより少ないことである。特に、腫瘍組織の崩壊は、‘734特許が生物学的安全キャビネット内の開放動作で発生すると説明する広範な断片化プロセスではなく、本出願の閉鎖された処理系で発生する。
本発明の出発材料は、無菌キット内の無菌条件下で保存されるため、凍結保存腫瘍細胞懸濁液上で実行され得る完全な製造プロセスは、高容量及び高効率でスケジュールされ、実行され得る。対照的に、’734特許は、非凍結組織から始まるため、断片化及び「成長」ステップは、容量利用効率の低い待機ベースで実行される。’734特許において、この中間凍結ステップを除去すると、製造プロセス全体が短縮されるが、プロセス全体が待機ベースで実行されることを意味し、つまり、製造停止時間は、いかなる遅延も存在することができないため、’734特許の製造施設に重大な結果をもたらし、製造に必要な停止期間を計画することは、プロセス中の全ての産物が完了されること、及び新しい手術が停止されることを必要とすることになる。
本出願のプロセスの利点は、切除腫瘍の形態の組織が、TIL療法の要件の前に収集され、輸送され、処理され、凍結保存され、そして製造が必要とされるまで、及び必要とされる場合、無菌キットに保存され得、それにより、初期段階の疾患を有する患者が、代替療法を受けている間に採取され、保存され得ることである。結果として、腫瘍収集及びその後の製造のタイミング又は地理位置への影響はほとんど又は全くない。それに対して、‘734特許では、これは不可能であり、細胞が凍結して保持され得る前に、医薬品の完全製造を行わなければならない。
上述のように、これらは、REP培養の播種に必要な非常に異なる数の細胞、100~2000万個(本発明)対2500万~2億個(’734特許)に反映されるように、REP培養を開始するために異なる細胞集団を生成することになる、非常に異なる培養プロセスである。本発明では、初期TIL増殖中、培養播種は、塊(すなわち、新生細胞)からの増殖に対して、細胞懸濁液(すなわち、常駐T細胞と新生T細胞との混合物となる、脱凝集細胞及び凍結保存細胞から成長する細胞)を使用し、これは、REPが新生T細胞と単に播種されるものではないことを意味する。加えて、本発明は、固形及び可撓性の閉鎖されたコンテナの両方を利用することができ、可撓性コンテナは、‘734特許で定義されるようないくつかの塊ではなく、誘導される腫瘍懸濁液の量に基づいて、より最適な環境を可能にする]。
転移性腫瘍材料は、外科手術室内の標準的な外科診療を使用して外科的に除去される。脱凝集前に、異物が除去され(すなわち、肉眼的に定義される非腫瘍材料)、腫瘍材料が滅菌バッグに移される。
以下は、腫瘍出発材料受け入れ試験に関与し得る。第1に、ソース組織が腫瘍材料であることが確認される。第2に、脱凝集組織の代表的な試料が、微生物負荷について評価され、存在する場合、抗生物質感受性が定義される(製造は、抗生物質による危険性の下で実施され得る)が、最終材料は、微生物成長に対して陰性でなければならない。第3に、TIL及び腫瘍細胞の量及び生存率が、フローサイトメトリーによって評価され得る。
本発明の方法は、対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生するステップを含み、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される。有利な実施形態では、半自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、脱凝集可撓性コンテナ内の表面が固形組織を機械的に粉砕及びせん断することを可能にする脱凝集を制御し得る(例えば、PCT公開第2018/130845号を参照されたい)。脱凝集表面は、例えば、機械的ピストンによって制御され得る。
酵素消化のために、細胞懸濁液(T細胞及び腫瘍細胞の両方を含有する)が、DNase1及びコラゲナーゼ(IV型)の酵素混合物を使用して、切除転移性腫瘍から生成される。繰り返される機械的圧迫の組み合わせは、酵素がアクセスするための追加の表面を露出し、酵素反応は、任意選択の凍結保存前に固形組織を細胞懸濁液に構成するプロセスを高速化する。1つの実施形態では、脱凝集ステップの完了時に、DMSOベースの抗凍結剤が、コントロールレート凍結サイクルの直前に添加される。いくつかの実施形態では、固形組織の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼH1、ペプシン、又はそれらの任意の混合物などの、1つ以上の培地酵素溶液の選択及び提供によるものであり得る。切除転移性腫瘍の酵素消化は、半自動デバイスの脱凝集可撓性コンテナ内で起こり得る。
例として、本発明の方法の別の実施形態では、脱凝集プロセスが酵素消化で補充される場合、酵素消化のための培地製剤は、細胞間境界を分解させるタンパク質分解を補助する酵素を補充されなければならない。
限定されるものではないが、臓器保存液、選択的溶解溶液、PBS、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、イスコフ培地、XVIVO(商標)、AIM-V(商標)、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、PLASMALYTE(商標)溶液、結晶性溶液及びIV液、コロイド溶液及びIV液、5%デキストロース水溶液(D5W)、ハルトマン溶液、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、AIM-V(商標)、イスコフ培地、XVIVO(商標)を含む、細胞培養又は細胞取り扱いの技術分野で公知の様々な液体製剤が、固形組織の細胞脱凝集及び酵素消化に使用される液体製剤として使用され得、各々は、追加の細胞支持因子、例えば、胎児仔血清、ヒト血清若しくは血清代替物、又は細胞回収及び生存若しくは特異的細胞枯渇を補助するための他の栄養素若しくはサイトカインを任意選択的に補充され得る。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養(例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト)又は幹細胞(例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはT細胞)用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、金属イオン、抗生物質、接着因子、脱接着因子、界面活性剤、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ThermoFisher、Lonza、若しくはSigma-Aldrich、又は類似の培地製造業者及び供給業者から市販されている。
酵素消化に必要な液体製剤は、少なくとも0.1mMから最大50mM、2~7mM、理想的には5mMの最適範囲で存在する十分なカルシウムイオンを有していなければならない。
消化される固形組織は、酵素消化の前にEDTA及びEGTAを洗浄及び除去する前に、接着因子及び阻害タンパク質を除去するために、キレート剤EGTA及びEDTAを含有する液体製剤による脱凝集後に洗浄され得る。
酵素消化に必要な液体製剤は、最小限のキレート剤EGTA及びEDTAでより最適であり、これは、酵素安定性及び活性に必要なカルシウムイオンを除去することによって酵素活性を重度に阻害し得る。加えて、β-メルカプトエタノール、システイン及び8-ヒドロキシキノリン-5-スルホン酸塩は、他の既知の阻害物質である。
解離、酵素消化、及び均質化を使用した腫瘍材料の処理は、TIL、特にUTILの単一細胞懸濁液を産生し、これは、IL-2におけるTIL、特にUTILの細胞懸濁液の第1の増殖を介して、後続の処理のための出発材料を安定化して、第1のTIL、特にUTIL集団を得るために、直接凍結保存され得る。
方法はまた、脱凝集腫瘍、例えば、細胞懸濁液を凍結保存するステップを含む。対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生するステップを実施するのと同じ日に脱凝集腫瘍を凍結保存することが実施され、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される。例えば、凍結保存は、腫瘍を脱凝集するステップの2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、又は22時間後に実施される。半自動デバイスの脱凝集モジュールにおける酵素脱凝集から得られた単一細胞懸濁液としての脱凝集腫瘍の凍結保存は、懸濁液を8℃~少なくとも-80℃の温度で冷却又は維持することによって実施される。脱凝集は、5分程度の速さであるが、ほぼ通常45分~1時間であり、凍結保存は、60分~150分程度の速さであり得る。一実施形態では、方法は、凍結保存脱凝集腫瘍を保存することを含む。好ましい実施形態に説明されるように、デバイスは、凍結保存用の少なくとも1つの細胞コンテナを備え、コンテナは、弾性変形可能な材料から製造された可撓性コンテナである。デバイスのこの実施形態では、最終コンテナが、-20~-190℃の冷凍庫に直接移されるか、又はデバイスと関連付けられるか、若しくは別個に供給される(例えば、Planer Products又はAsymptote Ltdによって製造される)コントロールレート凍結装置内により最適に位置し、濃縮された脱凝集固形組織コンテナを含有するために採用された凍結チャンバ及び可撓性保管コンテナの温度は、低温ガス(通常、窒素、例えば、Planer products)を注入することによって、又は制御された冷却表面から熱を除去することによって、制御される。両方の方法は、凍結溶液及び産物の所望の生存率に基づいて、凍結される特定の細胞に必要な速度で、1℃未満又はより好ましくは0.1℃の凍結プロセスの誤差で正確に制御する能力を結果的にもたらす。この凍結保存プロセスは、氷核形成温度を考慮に入れなければならず、氷核形成温度は、理想的には、凍結溶液の融解温度に可能な限り近い温度である。水溶液中の結晶成長に続いて、水が氷として系から除去され、残留する非凍結溶液の濃度が増加する。温度が低下すると、より多くの氷が形成され、残留する非凍結画分が減少し、濃度が更に増加する。水溶液には、氷が濃縮水溶液と共存する、大きな温度範囲が存在する。最終的に、温度低下を通じて、溶液は、ガラス転移状態に到達し、その時点で、凍結溶液及び細胞は、粘性溶液から、この温度を下回る固体様状態に移動するが、細胞は、更なる生物学的変化を経ず、それゆえ、必要になるまで数十年間にわたって安定化される。
氷核形成及び結晶成長は、凍結溶液及び細胞微小環境への熱の放出を伴い、凍結流体が相変化を受けている間の温度変化に抵抗する場合でも、細胞及び凍結溶液の冷却を維持することが望ましい。脱凝集が酵素脱凝集を含むか否か、及び所与の酵素、酵素濃度、及び組織タイプに対する酵素消化の最適温度に応じて、凍結保存の開始時の温度は、限定なしで、40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、及び20℃、すなわち、哺乳動物の体温から室温までの範囲の温度を含み、限定されるものではないが、限定なしで19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、及び2℃などの冷凍温度を含む、室温を下回る温度を更に含む。極低温冷却のための標的温度は、限定なしで、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-85℃、-90℃、及びその間の温度、並びに液体窒素蒸気保管の温度(-195.79℃)までの低温を含む。特定の実施形態では、本発明に従って使用される方法及びデバイスは、生理学的温度又は消化温度から凍結保存温度までの時間を最小化するように設計又はプログラムされる。特定の実施形態では、凍結保存のための本発明に従って使用される方法及び装置は、有利には、培地が結晶化する際に、細胞を含む環境に、環境内に、環境の周囲に、又は環境内における熱放出が最小化又は回避される条件下で冷却するために設計及びプログラムされる。特定の実施形態では、凍結保存のための本発明に従って使用される方法及び装置は、有利には、培地が結晶化する際に、例えば、培地の核形成及び結晶化が温度変化に抵抗する熱を放出する場合でも、凍結保存培地の所定の温度変化速度を維持することによって、細胞を含む環境に、環境内に、環境の周囲に、又は環境内における熱放出が最小化又は回避される条件下で冷却するために設計及びプログラムされる。特定の実施形態では、温度変化速度を調節又はプログラミングすることは、所定の温度変化速度を維持するために、凍結保存試料からの熱抽出速度を調節することを含む。特定の実施形態では、凍結保存試料の冷却速度は、凍結保存試料の温度を測定し、フィードバックプロセスによる相変化による熱抽出速度を調整することによって維持される。特定の実施形態では、凍結保存試料の冷却速度は、相変化を予測し、相変化の予想される時点における熱抽出速度を増加させることによって維持される。特定の実施形態では、脱凝集温度から極低温標的温度まで連続冷却するように方法が設計される、及び/又はデバイスがプログラムされる。例示的なプログラムされた冷却速度としては、限定なしで、-0.5℃/分、-1℃/分、-1.5℃/分、-2℃/分、又は-2.5℃/分が挙げられる。冷却速度は、プログラム標的であり、冷却サイクルにわたって変化し得る。冷却速度は、例えば、±0.1℃/分、±0.2℃/分、±0.3℃/分、±0.4℃/分、又は±0.5℃/分だけ変化し得る。本発明の一実施形態では、凍結保存温度は、-80℃±10℃であり、デバイスは、1℃/分、1.5℃/分、2℃/分、1℃/分±0.5℃/分、1.5℃/分±0.5℃/分、又は2℃/分±0.5℃/分だけ温度を低減するようにプログラムされる。
TILの正確な制御された冷却が望ましいことは明らかであろう。したがって、TILからの熱伝達の最適化された測定及び制御のために、表面対体積比を最適化し、カセットを用いて凍結保存コンテナを収容し、熱伝達を容易にし、温度センサを最適に位置決めすることが有利である。
凍結保存は、限定されるものではないが、i)解凍及びTIL増殖によって後で使用するための処理された腫瘍試料の凍結保存、ii)腫瘍細胞の解凍及び使用によって後で使用するための処理された腫瘍試料の凍結保存、iii)後の解析のための処理された腫瘍試料の凍結保存、iv)解凍及びREP増殖によって後で使用するためのREP増殖前培養物の凍結保存、v)解凍及びREP増殖によって後で使用するためのREP増殖前培養物の一部分(例えば、限定されるものではないが、REP前培養物からの所定の部分若しくは所定の量を上回る過剰な細胞)の凍結保存、vi)後続のREP増殖前又はREPにおいて後で使用するためのREP後培養物の凍結保存、又はvii)解凍及び対象への投与によって後で使用するためのREP後培養物の凍結保存を含む、TIL製造全体を通して用いられ得る。
凍結保存TIL中間体、産物、及び試料は、使用前に解凍時に洗浄され得る。特定の実施形態では、凍結保存腫瘍消化物が解凍され、成長培地中で希釈され、1回以上洗浄される。特定の実施形態では、洗浄は、遠心分離及び成長培地の変化を含む。特定の実施形態では、洗浄は、濾過及び成長培地の変化を含む。特定の実施形態では、洗浄培地が混合され、次いで、バッグ又は皿などの閉鎖されたTILコンテナから引き出され、新鮮な培地で交換される。洗浄は、TIL、洗浄培地、並びにチューブ及び弁によって相互接続される他の構成要素用の閉鎖系又はコンテナで自動化され得る。
特定の実施形態では、TILの割合、TIL部分集団を増加させる。TIL生存率、及び/又はTIL効力を増加させるために、解凍、希釈、及び任意選択の洗浄時に、凍結保存TILは、増殖前(すなわち、REP増殖前)に培養物中で保持される。特定の実施形態では、保持時間は、CD3によって測定される総生存細胞又は増殖倍率を最大化するように選択される。特定の実施形態では、保持時間は、2~4時間、4~6時間、6~9時間、9~12時間、12~18時間、又は18~24時間を含むか、又はそれらからなり得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクルの増加が可能である、若いTILを得ることを提供し、そのため、古いTIL(すなわち、対象/患者への投与前により多くの複製ラウンドを更に経たTIL)よりも、追加的な治療上の利益を提供し得る。若いTILの特徴は、文献、例えば、Donia,at al.,Scandinavian Journal of Immunology,75:157-167(2012)、Dudley et al.,Clin Cancer Res,16:6122-6131(2010)、Huang et al.,J Immunother,28(3):258-267(2005)、Besser et al.,Clin Cancer Res,19(17):OF1-OF9(2013)、Besser et al.,J Immunother 32:415-423(2009)、Robbins,et al.,J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al.,J Immunother,30:123-129(2007)、Zhou,et al.,J Immunother,28:53-62(2005)、及びTran,et al.,J Immunother,31:742-751(2008)に説明されており、それらの全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
T及びBリンパ球の多様な抗原受容体は、限定されるが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント:V(可変)、D(多様性)、J(結合)、及びC(定常)は、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流用途を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を呈し、かつ増加させるTILを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって得られるTILは、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。一部の実施形態では、本方法によって得られたTILは、新鮮に採取されたTIL及び/又は提供されるもの以外の他の方法を使用して調製されたTILと比較して、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。一部の実施形態では、本方法によって得られたTILは、新鮮に採取されたTIL及び/又はTILと比較して、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、第1の増殖で得られるTILは、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び/又はT細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン重鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン軽鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、T細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体のうちの1つにある。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)アルファ及び/又はベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)アルファの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)ベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、TCRab(すなわち、TCRα/β)の発現の増加が存在する。
本発明の方法はまた、IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のTIL、特にUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施するステップを含む。上記に説明されるステップから結果的に得られる細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に好都合である条件下で、IL-2を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、不活化ヒトAB血清を含む培地中の2mLのウェルで、6000IU/mLのIL-2を用いてインキュベートされる。この一次細胞集団は、ある日数、概して3~14日間培養され、バルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、7~14日間培養され、バルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、10~14日間培養され、バルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、約11日間培養され、バルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞を結果的にもたらす。
好ましい実施形態では、TILの増殖は、以下及び本明細書に説明される初期バルクTIL増殖ステップ、続いて、以下及び本明細書に説明される第2の増殖(急速増殖プロトコル(REP)ステップ、その後の再刺激REPステップを含む)を使用して実施され得る。
有利な実施形態では、凍結保存脱凝集腫瘍組織が、解凍され、インラインの100~270μmフィルタを通る濾過、及び20mLの再懸濁前の50mL遠心分離チューブ内の遠心分離前に、T細胞培地(以下の添加剤に10%のFBS及び3000IU/mLのIL-2を補充したImmetacyte用に製造されたT細胞培養培地契約)中で1:9で再懸濁される。HLA-A、B、C、及びCD58+、並びにDRAQ7-細胞の数を定量化するために、フローサイトメトリー解析のために試料が採取され得る。いくつかの実施形態では、これは、代替的な手動(限定されるものではないが、血球細胞計など)、又は限定されるものではないが、NucleoCounter(商標)、Guava(登録商標)、自動血液解析及びカウンタ、限定されるものではないが、Scepter(商標)などのピペットベースの細胞カウンタなどの、代替的な自動総生存細胞計数デバイスを使用して播種され得る。
一実施形態では、再懸濁された凍結保存脱凝集腫瘍組織は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に好都合である条件下で、IL-2を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、不活化ヒトAB血清を含む培地中の2mLのウェルで(又はいくつかの場合、本明細書に概説されるように、人工抗原提示[aAPC]細胞集団の存在下で)、6000IU/mLのIL-2を用いてインキュベートされる。この一次細胞集団は、ある日数、概して10~14日間培養され、バルクTIL集団、概して約1×108個のバルクTIL細胞を結果的にもたらす。いくつかの実施形態では、第1の増殖中の成長培地は、IL-2又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ILは、組換えヒトIL-2(rhIL-2)である。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、1mgバイアルに対して20~30×106IU/mgの比活性を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、1mgバイアルに対して20×106IU/mgの比活性を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、1mgバイアルに対して25×106IU/mgの比活性を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、1mgバイアルに対して30×106IU/mgの比活性を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、4~8×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、5~7×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、IL-2保存溶液は、6×106IU/mgのIL-2の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約10,000IU/mLのIL-2、約9,000IU/mLのIL-2、約8,000IU/mLのIL-2、約7,000IU/mLのIL-2、約6000IU/mLのIL-2、又は約5,000IU/mLのIL-2を含む。いくつかの実施形態では、第1の細胞培養培地は、約9,000IU/mLのIL-2~約5,000IU/mLのIL-2を含む。いくつかの実施形態では、第1の細胞培養培地は、約8,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。いくつかの実施形態では、第1の細胞培養培地は、約7,000IU/mLのIL-2~約6,000IU/mLのIL-2を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約6,000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL、又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL、又は約8000IU/mLのIL-2を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-12、約400IU/mLのIL-12、約300IU/mLのIL-12、約200IU/mLのIL-12、約180IU/mLのIL-12、約160IU/mLのIL-12、約140IU/mLのIL-12、約120IU/mLのIL-12、又は約100IU/mLのIL-12を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-12~約100IU/mLのIL-12を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約400IU/mLのIL-12~約100IU/mLのIL-12を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約300IU/mLのIL-12~約100IU/mLのIL-12を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約200IU/mLのIL-12を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-12を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-12を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-12を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15、又は約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約300IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-18、約400IU/mLのIL-18、約300IU/mLのIL-18、約200IU/mLのIL-18、約180IU/mLのIL-18、約160IU/mLのIL-18、約140IU/mLのIL-18、約120IU/mLのIL-18、又は約100IU/mLのIL-18を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-18~約100IU/mLのIL-18を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約400IU/mLのIL-18~約100IU/mLのIL-18を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約300IU/mLのIL-18~約100IU/mLのIL-18を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約200IU/mLのIL-18を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-18を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-18を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-18を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約20IU/mLのIL-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21、又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
培養培地については、限定されるものではないが、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、及びIL-21などの、インターロイキンの組み合わせも企図される。IL-23、IL-27、IL-35、IL-39、IL-18、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-アルファ、IFN-ベータ、IFN-ガンマ、又はそれらの組み合わせなどの他のサイトカインもまた、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、及びIL-21とともに企図される。限定されるものではないが、IL-4(aIL4)、抗IL-4(aIL4R)、抗IL-5R(aIL5R)、抗IL-5(aIL5)、抗IL13R(aIL13R)、又は抗IL13(aIL13)などの、Th2ブロッキング試薬などの抗体も企図される。
いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、又は14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、1日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、2日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、3日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、4日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、5日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、6日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、7日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、8日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、9日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、10日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、11日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、12日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、13日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、1日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、2日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、3日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、4日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、5日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、6日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、7日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、8日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、9日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、10日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、11日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、12日~13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、1日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、2日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、3日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、4日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、5日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、6日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、7日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、8日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、9日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、10日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、11日~12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、1日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、2日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、3日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、4日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、5日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、6日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、7日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、8日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、9日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、10日~11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、11日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、REP 10日目は、エレクトロポレーションの3日後である。
いくつかの実施形態では、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-21の組み合わせが第1の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-21、並びにそれらの任意の組み合わせが第1の増殖中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、IL-2、IL-15、及びIL-21の組み合わせが第1の増殖中に組み合わせとして用いられる。
いくつかの実施形態では、第1の増殖は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、TIL増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例示的なG-REX-10若しくはG-REX-100、又は有利にはWO2018/130845のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
有利には、第2のTIL集団と称される、第1の増殖から得られたTIL集団は、第2の増殖(REPとも称される増殖を含み得る)に供され得る。同様に、遺伝子修飾TILが療法で使用されることになる場合、第1のTIL集団(バルクTIL集団とも称される)又は第2のTIL集団(いくつかの実施形態では、REP TIL集団と称される集団を含み得る)は、増殖前、又は第1の増殖後、かつ第2の増殖の前に、好適な治療のための遺伝子修飾に供され得る。
レンチウイルスは、分裂及び非分裂細胞の両方を形質導入するその能力に起因して、効率的な遺伝子導入ビヒクルである。レンチウイルス遺伝子療法ベクターの最も徹底的に調査されたものは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型に由来するが、HIV-2、SIV、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、カプリン関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ビスナウイルス、及びジェンブラナ病ウイルス(JDV)を含む、他の霊長類及び非霊長類レンチウイルスに基づく遺伝子療法ベクターも開発されている。
複製欠損ウイルスベクターは、潜在的に致命的なウイルスを有する患者の感染を予防するために不可欠である。レンチウイルスベクターは、より安全かつより効率的になるように開発されてきた。最近の第3世代のベクターは、毒性及び病原性を補助する全てのアクセサリー遺伝子を除去したが、残りの遺伝子を分割し、これは、3つのプラスミドにわたる導入遺伝子の発現に重要である。例えば、米国特許公開第2006/0024274号を参照されたい。
EIAV遺伝子導入ベクターは、インビトロで増殖細胞及びG1停止細胞の形質導入に効果的であることが示された。Mitrophanous,et al.,1999. Stable gene transfer to the nervous system using a non-primate lentiviral vector. Gene Ther. 6: 1808-1818、Olsen,J.C.,1998,Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. Gene Ther. 5: 1481-1487、Olsen,J.C.,2001,EIAV,CAEV and Other Lentivirus Vector Systems,Somat Cell Mol Genet,Vol.26,Nos.1/6,131-45。
Heemskerk,B.et al.,2008,Adoptive cell therapy for patients with melanoma,using tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered to secrete interleukin-2. Human gene therapy,19(5),496-510は、IL-2を発現してTILの生存を延長するように遺伝子操作されたTILを説明する。患者TILを、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)に基づくレトロウイルスベクターを用いて第1の増殖中にトランスフェクトし、その後、治療に十分な数を得るために第2の増殖に続いた。
簡潔には、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)由来のMFG骨格を、5’長い末端反復(LTR)プロモーターの制御下でヒトIL-2遺伝子のcDNAコピーとともに含有する、SBIL2ベクターは、PG13パッケージング細胞株においてシュードタイプ化され、これは、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)エンベロープタンパク質を提供する。統合されたレトロウイルスIL-2 DNAの3つのコピーを含有した安定プロデューサークローン(PG13SBIL2#3)を生成した。臨床GMPグレードのSBIL2レトロウイルス上清は、Indiana University(Indianapolis,IN)のNational Gene Vector Laboratoryによって産生された。TIL形質導入について、6ウェルの非組織培養プレート(Becton Dickinson、Franklin Lakes,NJ)を、Retronectin(CH-296、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]中25μg/ml、GMPグレード、Takara Bio、Otsu,Japan)で被覆し、PBS-2%ヒト血清アルブミン(HSA)でブロッキングし、32℃かつ10%のCO2で、解凍されたSBIL2ウイルス上清(5ml/ウェル)で4時間、プリロードした。TILを、37℃かつ5%のCO2で18~24時間、3ml/ウェルで添加し、第2のSBIL2装填プレートに移し、追加の18~24時間培養し、その後、TILを採取し、新鮮な培地に再懸濁させた。
Zhang,L.et al.,2015,Tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered with an inducible gene encoding interleukin-12 for the immunotherapy of metastatic melanoma,Clinical Cancer Research 21(10),2278-2288.は、腫瘍部位でIL-12を選択的に分泌するように遺伝子操作されたTILを説明している。TILに、活性化T細胞(NFAT)プロモーター、活性化T細胞プロモーターの核因子によって駆動される一本鎖IL-12をコードする遺伝子を担持するMSGV1 γ-レトロウイルスベクターを形質導入した。
MSGV-1は、マウス幹細胞ウイルス長い末端反復を利用するMSGVベクターに由来し、延長されたgag領域及びKozak配列を含有する。ヒト一本鎖IL-12をコードする遺伝子を、NFAT応答性プロモーターによって駆動され、MSGV-1ベクター内に5’LTR方向に逆転して挿入された、IL-12 p40、リンカーG6S、及びIL-12 p35の順序で合成した。高力価のPG13細胞ベースの産生細胞株が生成され、レトロウイルス上清が、適正製造規範(GMP)条件下で、NCI Surgery Branch Vector Production Facility(Bethesda,MD)によって産生された。ベクター上清を試験し、臨床適用のための組換えガンマ-レトロウイルスベクターの産生について現在要求される全ての米国食品医薬品局のガイドラインに合格した。
形質導入手順は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、30ng/mlの抗CD3 mAbのOrthoclone OKT3(Centocor Ortho Biotech、Raritan,NJ)、3000IU/mlの組換えヒトIL-12、及び4Gy照射同種PBMCフィーダー細胞を、各TILに対して200個のフィーダー細胞の比率で刺激することによって開始された。細胞を、RetroNectin(CH-296、Takara Bio Inc.、Otsu,Japan)被覆した非組織培養6ウェルプレートを使用して、4日目及び/又は5日目に形質導入のために採取した。ベクター上清を、2000gで2時間、32℃で遠心分離することによって、コーティングされたプレート上に「スピン装填」した。レトロウイルスベクター上清をウェルから吸引し、2×106個の刺激TIL細胞を各ウェルに加え、続いて1000gで10分間遠心分離した。プレートを37℃で一晩インキュベートし、細胞を2回目の形質導入のために翌日採取した。最初の21人の患者の細胞は、2つの形質導入を受けた。12人の患者の細胞は、1つのみの形質導入を受けた。
Jones,S.et al.,2009,Lentiviral vector design for optimal T cell receptor gene expression in the transduction of peripheral blood lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes. Human gene therapy,20(6),630-640は、形質導入されたTリンパ球に遺伝子を発現し、有効な抗腫瘍T細胞を構築するためのレンチウイルスベクターで使用するためのプロモーターの開発を説明している。
TILを、外科標本から得た。-180℃で保存された凍結ストックからPBLを解凍し、300IU/mlでAIM-V及びインターロイキン-2(IL-2、Cetus、Emeryville,CA)中で培養物に入れた。OKT3刺激について、細胞は、抗CD3抗体、OKT3(Ortho Biotech、Bridgewater,NJ)を50ng/mlで培地中に最初に配置したか、又は形質導入後、培養培地の初期交換時にOKT3培地中に配置した。PBL又はTILの形質導入について、1×106個の細胞を、ウイルス上清及びポリブレン(最終濃度、8μg/ml)を用いて、24ウェルの組織培養処理プレート中で1mlの最終体積に調整した。細胞を、プレートの遠心分離により、1000×g、32℃で1.5時間形質導入した。プレートを37℃の加湿された5%のCO2インキュベーターに一晩配置し、培地を翌日に交換した。TILは、OKT3(50ng/ml)、IL-2(5000IU/ml)、及び3つの異なるドナーからの照射された同種末梢血単核細胞を使用して、上記に説明されたように急速増殖プロトコル(REP)に供された(TIL:フィーダー比、1:100)。REPの6日後、TILは説明されるように形質導入され、培養物に戻された。
Beane,J.D.et al.,2015,Clinical Scale Zinc Finger Nuclease-mediated Gene Editing of PD-1 in Tumor Infiltrating Lymphocytes for the Treatment of Metastatic Melanoma. Molecular therapy:23(8),1380-1390は、PD-1特異的亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)媒介性遺伝子編集をコードするmRNAのエレクトロポレーションによるPD-1の臨床スケール遺伝子編集を説明する。
養子細胞輸送のための十分な数の形質導入T細胞を生成するために、TILは、REPを使用して急速に増殖するように誘導された。46 簡潔には、1×107個のTILを、1×109個の同種の照射された(5,000rad)末梢血単核細胞(PBMC)と組み合わせ、これらの細胞を、30ng/mlのOKT3を含有する400mlのT細胞培地中に懸濁した。細胞を、G-REX100フラスコ中で37℃及び5%のCO2で培養した。5日後、200mlの培地を吸引し、交換した。REPの開始後7日目に、TILを採取し、Hyclone Electroporation Buffer(Hyclone Laboratories、Logan,UT)で2回洗浄した。次いで、細胞を計数し、1×108/mlの濃度でエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をMaxCyte CL-2処理アセンブリに移し、120μg/mlのPD-1 ZFN mRNA(又はGFPトランスフェクトTIL/GFPのGFP mRNA)と混合した。エレクトロポレーションを、MaxCyteのプロトコルに従って実施した。エレクトロポレーション後、TILを処理アセンブリからT-175フラスコに移し、37℃で20分間インキュベーターに入れた。このインキュベーションステップの後、TILを、1×106/mlの濃度でAIM-V培地に再懸濁した。次いで、細胞を、上記の説明のように一晩の低温インキュベーションのために、30℃のインキュベーターセットに入れた。翌日、TILを37℃のインキュベーターに移し、REPの10日目(エレクトロポレーションの3日後)までそのまま放置した。
特定の実施形態では、フィーダー細胞は、複数のドナーからのPBMCのプールを含む。特定の実施形態では、PBMCは、複数のドナーの血液試料のFicoll密度勾配遠心分離によって得られたバフィーコート細胞(白血球)を含む。特定の実施形態では、複数のドナーのバフィーコート細胞を含むPBMCがプールされる。特定の実施形態では、プールされるドナー調製物の数は、2~15以上であってもよく、ドナーの好ましい数は、5~10、10~15、8~12、又は9~11である。特定の実施形態では、10人のドナーからのPBMCがプールされる。
自動アフェレーシスプロセスを使用してPBMCを得ることにより、PBMCの回復及び生存率が改善され、ドナーの数が低減され得ることが見出された。アフェレーシス産物、特定の実施形態では、PBMCは、アフェレーシスからの白血球を含む。好適なアフェレーシス産物を生成するための例示的な非限定的なシステムは、Sefia Cell Processing System(Cytiva)である。特定の実施形態では、PBMCは、商業的に得られる。特定の実施形態では、複数のドナーのアフェレーシス産物を含むPBMCがプールされる。特定の実施形態では、プールされるドナー産物の数は、2~15個以上とすることができる。より好ましい実施形態では、好ましいドナー数は、2~8、2~6、又は2~4人のドナーである。特定の実施形態では、PBMCは、3人のドナーからのアフェレーシス産物を含む。
特定の実施形態では、PBMCは、凍結保存される。凍結保存は、事前スクリーニング及びPBMC在庫維持を可能にし、TIL製造に必要なドナー数を低減する。
脱凝集腫瘍組織が解凍される。いくつかの実施形態では、第1の増殖から得られたTILは、選択のために表現型が決定されるまで保存される。いくつかの実施形態では、第1のTILから得られたTILは、保存されず、第2の増殖に直接進む。したがって、方法は、追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のTIL、特にUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生するステップを含む。いくつかの実施形態では、第1の増殖から得られたTILは、第1の増殖後、かつ第2の増殖前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から11日後の凍結保存から約3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、又は14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約3日~21日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約4日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約4日~10日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約7日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から約14日後に起こる。いくつかの実施形態では、REP培養の播種は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21日後に起こる。
いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、又は14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から1日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1のTIL増殖は、2日~14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から3日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から4日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から5日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から6日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から7日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から8日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から9日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から10日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から11日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から12日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から13日~14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から14日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から1日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から2日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から3日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から4日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から5日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から6日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から7日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から8日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から9日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から10日~11日後に起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、凍結保存脱凝集腫瘍組織の解凍から11日後に起こる。
いくつかの実施形態では、第1の増殖からのTIL又はTILの一部分は、凍結保存される。特定の実施形態では、TILは、2つ以上の部分に分割され、1つ以上の部分が第2の増殖に進み、1つ以上の部分が、後の第2の増殖で使用されるように凍結保存される。特定の実施形態では、第1の増殖の終了時に細胞数が決定され、それに応じて培養物が分割される。特定の実施形態では、第1の増殖からのTILの平均効力が決定され、それに応じて培養物が分割される。特定の実施形態では、所定の最小数又は最適な数のTILが第2の増殖に進み、残りのTILが凍結保存され、その後、解凍され、更なる第2の増殖で使用される。特定の実施形態では、残留TILの数及び/又は活性に応じて、凍結保存TILは、代替的に、第1の増殖に続いて第2の増殖に使用され得る。
いくつかの実施形態では、TILは、第1の増殖後、かつ第2の増殖前に保存されず、TILは、第2の増殖に直接進む。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に説明されるように、閉鎖系で起こる。いくつかの実施形態では、第1の増殖からのTIL、第2のTIL集団は、移行期間なしで、第2の増殖に直接進む。
いくつかの実施形態では、第1の増殖から第2の増殖への移行は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、TIL増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10、G-REX-100、又はXuri WAVEバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
いくつかの実施形態では、TIL細胞集団は、採取及び初期バルク処理後に数において増殖される。この更なる増殖は、本明細書では第2の増殖と称され、これは、概して、当該技術分野では、急速増殖プロセスと称される増殖プロセスを含み得る。第2の増殖は、概して、ガス透過性又はガス交換コンテナ中で、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗CD3抗体を含む、いくつかの構成要素を含む培養培地を使用して達成される。
いくつかの実施形態では、TILの第2の増殖又は第2のTIL増殖は、当業者に公知の任意のTIL培養フラスコ又はコンテナを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、又は14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約7日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約8日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約9日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約10日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約11日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約12日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約13日~約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約14日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約7日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約8日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約9日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約10日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約11日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約12日~約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約7日~約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約8日~約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約9日~約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約10日~約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約11日~約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約12日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約13日間にわたって継続することができる。いくつかの実施形態では、第2のTIL増殖は、約14日間にわたって継続することができる。
一実施形態では、第2の増殖は、本開示の方法を使用してガス透過性コンテナ内で実施され得る。例えば、TILは、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-15(IL-15)、又はインターロイキン-12(IL-12)の存在下で、非特異的T細胞受容体刺激を使用して急速に増殖され得る。非特異的T細胞受容体刺激物には、例えば、抗CD3抗体、例えば、約30ng/mlのOKT3、マウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil(Raritan,N.J.)若しくはMiltenyi Biotech(Auburn,Calif.)から市販されているもの)、又はクローンUHCT-1(BioLegend(San Diego,Calif.,USA)から市販されているもの)を挙げることができる。TILを、任意選択的に300IU/mLのIL-2又はIL-15などのT細胞増殖因子の存在下で、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチド、例えば、0.3μMのMART-1:26-35(27L)又はgpl00:209-217(210M)などの、ベクターから任意選択的に発現され得る、がんの1つ以上の抗原を、エピトープなどのその抗原部分を含んで、第2の増殖中に含めることによって、インビトロでTILの更なる刺激を誘導するように増殖し得る。他の好適な抗原には、例えば、NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼがん抗原、MAGE-A3、SSX-2、及びVEGFR2、又はそれらの抗原部分が挙げられる。TILはまた、HLA-A2を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原での再刺激によって急速に増殖する場合もある。あるいは、TILを、例えば、照射自己リンパ球又は照射HLA-A2+同種リンパ球及びIL-2で更に再刺激することができる。いくつかの実施形態では、再刺激は、第2の増殖の一部として生じる。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、照射自己リンパ球の存在下で、又は照射HLA-A2+同種リンパ球及びIL-2を用いて生じる。
一実施形態では、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約100IU/mL、約200IU/mL、約300IU/mL、約400IU/mL、約500IU/mL、約600IU/mL、約700IU/mL、約800IU/mL、約900IU/mL、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL、又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL、又は約8000IU/mLの間のIL-2を含む。
一実施形態では、細胞培養培地は、OKT3抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT3抗体を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL、及び約1μg/mLのOKT3抗体を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL、及び50ng/mL~100ng/mLのOKT3抗体を含む。
いくつかの実施形態では、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-21の組み合わせが第2の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-21、並びにそれらの任意の組み合わせが第2の増殖中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、IL-2、IL-15、及びIL-21の組み合わせが第2の増殖中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、IL-2、IL-15、及びIL-21、並びにそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、第2の増殖は、IL-2、OKT-3、及び抗原提示フィーダー細胞を含む補充された細胞培養培地中で行うことができる。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、補充された細胞培養培地で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、IL-2、OKT-3、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC、抗原提示フィーダー細胞とも称される)を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、IL-2、OKT-3、及び抗原提示フィーダー細胞(すなわち、抗原提示細胞)を含む。
いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-15、約400IU/mLのIL-15、約300IU/mLのIL-15、約200IU/mLのIL-15、約180IU/mLのIL-15、約160IU/mLのIL-15、約140IU/mLのIL-15、約120IU/mLのIL-15、又は約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約500IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約400IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約300IU/mLのIL-15~約100IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約200IU/mLのIL-15を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-15を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約180IU/mLのIL-15を含む。
いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約20IU/mLのIL-21、約15IU/mLのIL-21、約12IU/mLのIL-21、約10IU/mLのIL-21、約5IU/mLのIL-21、約4IU/mLのIL-21、約3IU/mLのIL-21、約2IU/mLのIL-21、約1IU/mLのIL-21、又は約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約20IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約15IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約12IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約10IU/mLのIL-21~約0.5IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約5IU/mLのIL-21~約1IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地は、約2IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約0.5IU/mLのIL-21を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、IL-21を更に含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約1IU/mLのIL-21を含む。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞(APC)は、PBMCである。一実施形態では、急速増殖及び/又は第2の増殖におけるTIL対PBMC及び/又は抗原提示細胞の比率は、約1対25、約1対50、約1対100、約1対125、約1対150、約1対175、約1対200、約1対225、約1対250、約1対275、約1対300、約1対325、約1対350、約1対375、約1対400、又は約1対500である。一実施形態では、急速増殖及び/又は第2の増殖におけるTIL対PBMCの比率は、1対50と1対300との間である。一実施形態では、急速増殖及び/又は第2の増殖におけるTIL対PBMCの比率は、1対100と1対200との間である。
一実施形態では、REP及び/又は第2の増殖は、バルクTILが、150mlの培地において、100倍又は200倍を超える不活化フィーダー細胞、30mg/mLのOKT3抗CD3抗体、及び3000IU/mLのIL-2と混合されているフラスコ内で実施される。細胞が代替的な成長チャンバに移されるまで、培地交換が行われる(通常、新鮮な培地による呼吸作用を介した2/3の培地交換)。代替的な成長チャンバは、以下でより完全に論じられるように、G-REXフラスコ及びガス透過性コンテナを含む。
いくつかの実施形態では、第2の増殖(REPプロセスと呼ばれるプロセスを含み得る)は、実施例及び図で論じられるように、7~14日に短縮される。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、11日に短縮される。
一実施形態では、REP及び/又は第2の増殖は、上記に説明されたT-175フラスコ及びガス浸透性バッグ(Tran,et al.,J.Immunother.2008,31,742-51、Dudley,et al.,J.Immunother.2003,26,332-42)又はガス浸透性培養器(G-Rexフラスコ)を使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第2の増殖(急速増殖と称される増殖を含む)は、T-175フラスコ内で実施され、150mLの培地中に懸濁された約1×106個のTILが、各T-175フラスコに添加され得る。TILは、1対1のCM及びAIM-V培地の混合物中で培養され、3000IU/mLのIL-2、及び30ng/mlの抗CD3を補充され得る。T-175フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を使用して5日目に交換され得る。いくつかの実施形態では、7日目において、2つのT-175フラスコからの細胞は、3Lのバッグ内で組み合わせられ得、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM Vが、300mlのTIL懸濁液に添加された。各バッグ内の細胞数を毎日又は2日毎に計数し、細胞数を0.5~2.0×106個の細胞/mLに保つために新鮮な培地を添加した。
一実施形態では、第2の増殖は、100cmガス透過性シリコンボトムを有する500mLの容量のガス透過性フラスコ(G-Rex100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton,Minn.,USAから市販)で実施され得、5×106個又は10×106個のTILが、400mLの50/50培地中でPBMCを用いて培養され、5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2、及び30ng/mlの抗CD3(OKT3)を補充され得る。G-Rex100フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされ得る。5日目に、250mLの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、1500rpm(491×g)で10分間遠心分離され得る。TILペレットは、5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮な培地を用いて再懸濁され、元のG-Rex100フラスコに再び添加され得る。TILがG-Rex100フラスコ中で連続的に増殖されるとき、7日目に、各G-Rex100中のTILは、各フラスコ中に存在する300mLの培地中に懸濁され得、細胞懸濁液は、3つのG-Rex100フラスコを播種するために使用され得る3つの100mLアリコートに分割され得る。次いで、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vが、各フラスコに添加され得る。G-Rex100フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされ得、4日後、3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vが、各G-REX100フラスコに添加され得る。細胞は、培養の14日目に採取され得る。
一実施形態では、第2の増殖(REPと称される増殖を含む)は、バルクTILが、150mlの培地において、100倍又は200倍を超える不活化フィーダー細胞、30mg/mLのOKT3抗CD3抗体、及び3000IU/mLのIL-2と混合されているフラスコ内で実施される。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替的な成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の2/3は、新鮮な培地による呼吸作用によって交換される。いくつかの実施形態では、代替的な成長チャンバは、以下でより完全に論じられるように、G-REXフラスコ及びガス透過性コンテナを含む。
一実施形態では、第2の増殖(REPと称される増殖を含む)が実施され、TILが優れた腫瘍反応性のために選択されるステップを更に含む。当該技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第2016/0010058 A1号に説明される方法は、優れた腫瘍反応性に対するTILの選択に使用され得る。
任意選択的に、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で公知の標準アッセイを使用して、第2の増殖(REP増殖と称される増殖を含む)の後に実施され得る。例えば、トリパンブルー排除アッセイが、死細胞を選択的に標識し、生存率評価を可能にする、バルクTILの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、TIL試料が計数され、Cellometer K2自動細胞カウンタ(Nexcelom Bioscience、Lawrence,Mass.)を使用して生存率が決定され得る。
いくつかの実施形態では、TILの第2の増殖(REPと称される増殖を含む)は、上記に説明されるT-175フラスコ及びガス透過性バッグ(Tran K Q,Zhou J,Durflinger K H,et al.,2008,J Immunother.,31:742-751、及びDudley M E,Wunderlich J R,Shelton T E,et al.2003,J Immunother.,26:332-342)又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、フラスコを使用して実施される。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。いくつかの実施形態では、第2の増殖は、T-175フラスコ内で実施され、約1×106個のTILは、約150mLの培地中に懸濁され、これは、各T-175フラスコに添加される。TILは、1対100の比率で、「フィーダー」細胞として照射された(50Gy)同種PBMCを用いて培養され、細胞を、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充された、CM及びAIM-V培地(50/50培地)の1対1の混合物で培養した。T-175フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、培地の半分は、3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を使用して、5日目に交換される。いくつかの実施形態では、7日目において、2つのT-175フラスコからの細胞は、3Lのバッグ内で組み合わせられ、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM-Vが、300mLのTIL懸濁液に添加される。各バッグ内の細胞数が毎日又は2日毎に計数され得、細胞数を約0.5~約2.0×106個の細胞/mLに保つために新鮮な培地が添加され得る。
いくつかの実施形態では、第2の増殖(REPと称される増殖を含む)は、100cm2のガス透過性シリコンボトムを有する500mLの容量のフラスコ(G-Rex100、Wilson Wolf)で実施され、約5×106個又は10×106個のTILは、400mLの50/50培地中、1対100の比率で、照射された同種PBMCを用いて培養され、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を補充される。G-Rex100フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、5日目に、250mLの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、1500rpm(491g)で10分間遠心分離される。次いで、TILペレットは、3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮な50/50培地を用いて再懸濁され、元のG-Rex100フラスコに再び添加され得る。TILがG-Rex100フラスコ中で連続的に増殖される実施形態では、7日目に、各G-Rex100中のTILは、各フラスコ中に存在する300mLの培地中に懸濁され、細胞懸濁液は、3つのG-Rex100フラスコを播種するために使用される3つの100mLアリコートに分割された。次いで、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vが、各フラスコに添加される。G-Rex100フラスコは、5%のCO2中、37℃でインキュベートされ、4日後、3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vが、各G-Rex100フラスコに添加される。細胞は、培養の14日目に採取される。
T及びBリンパ球の多様な抗原受容体は、限定されるが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント:V(可変)、D(多様性)、J(結合)、及びC(定常)は、免疫グロブリン及びT細胞受容体(TCR)の結合特異性及び下流用途を決定する。本発明は、T細胞レパートリーの多様性を呈し、かつ増加させるTILを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって得られるTILは、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、第2の増殖で得られるTILは、T細胞レパートリーの多様性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び/又はT細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン重鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリン軽鎖中にある免疫グロブリン中にある。いくつかの実施形態では、多様性は、T細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるT細胞受容体のうちの1つにある。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)アルファ及び/又はベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)アルファの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、T細胞受容体(TCR)ベータの発現の増加が存在する。いくつかの実施形態では、TCRab(すなわち、TCRα/β)の発現の増加が存在する。
いくつかの実施形態では、第2の増殖培養培地(例えば、CM2又は第2の細胞培養培地とも称される)は、IL-2、OKT-3、及び抗原提示フィーダー細胞(APC)を含む。
いくつかの実施形態では、第2の増殖は、閉鎖系バイオリアクターで実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、TIL増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10若しくはG-REX-100、又は有利にはWO2018/130845のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
一実施形態では、本明細書に説明される第2の増殖手順、及びREPと称される手順は、REP TIL増殖中及び/又は第2の増殖中、過剰なフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健常血液ドナーからの標準的な全血単位から得られた末梢血単核細胞(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準的な方法を使用して得られる。
一般に、同種PBMCは、照射又は熱処理のいずれかを介して不活性化され、REP手順で使用され、これは、照射同種PBMCの複製不全を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、PBMCは、14日目の生存細胞の総数が、REPの0日目及び/又は第2の増殖の0日目(すなわち、第2の増殖の開始日)に培養に入れられた初期生存細胞数未満である場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるTIL増殖手順における使用のために受け入れられる。
いくつかの実施形態では、PBMCは、7日目及び14日目のOKT3及びIL-2の存在下で培養された生存細胞の総数が、REPの0日目及び/又は第2の増殖の0日目(すなわち、第2の増殖の開始日)に培養に入れられた初期生存細胞数から増加していない場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるTIL増殖手順における使用のために受け入れられる。いくつかの実施形態では、PBMCは、30ng/mlのOKT3抗体及び3000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、PBMCは、7日目及び14日目のOKT3及びIL-2の存在下で培養された生存細胞の総数が、REPの0日目及び/又は第2の増殖の0日目(すなわち、第2の増殖の開始日)に培養に入れられた初期生存細胞数から増加していない場合、複製不全とみなされ、本明細書に説明されるTIL増殖手順における使用のために受け入れられる。いくつかの実施形態では、PBMCは、5~60ng/mlのOKT3抗体及び1000~6000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、PBMCは、10~50ng/mlのOKT3抗体及び2000~5000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、PBMCは、20~40ng/mlのOKT3抗体及び2000~4000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、PBMCは、25~35ng/mlのOKT3抗体及び2500~3500IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、PBMCである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態では、第2の増殖におけるTIL対抗原提示フィーダー細胞の比率は、約1対25、約1対50、約1対100、約1対125、約1対150、約1対175、約1対200、約1対225、約1対250、約1対275、約1対300、約1対325、約1対350、約1対375、約1対400、又は約1対500である。一実施形態では、第2の増殖におけるTIL対抗原提示フィーダー細胞の比率は、1対50と1対300との間である。一実施形態では、第2の増殖におけるTIL対抗原提示フィーダー細胞の比率は、1対100と1対200との間である。
一実施形態では、本明細書に説明される第2の増殖手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞対約100×106個のTILの比率を必要とする。別の実施形態では、本明細書に説明される第2の増殖手順は、約2.5×109個のフィーダー細胞対約50×106個のTILの比率を必要とする。更に別の実施形態では、本明細書に説明される第2の増殖手順は、約25×106個のTILに対して約2.5×109個のフィーダー細胞を必要とする。
一実施形態では、本明細書に説明される第2の増殖手順は、第2の増殖中、過剰なフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健常血液ドナーからの標準的な全血単位から得られた末梢血単核細胞(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準的な方法を使用して得られる。一実施形態では、人工抗原提示(aAPC)細胞が、PBMCの代わりに使用される。
一般に、同種PBMCは、照射又は熱処理のいずれかを介して不活性化され、TIL増殖手順で使用される。
一実施形態では、人工抗原提示細胞は、PBMCの交換として、又はPBMCとの組み合わせとして第2の増殖で使用される。
本明細書に説明される増殖方法は、概して、当該技術分野で公知のように、高用量のサイトカイン、特にIL-2を有する培養培地を使用する。
あるいは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる国際公開第2015/189356号及び国際公開第2015/189357号に一般的に概説されているように、IL-2、IL-15、及びIL-21のうちの2つ以上の組み合わせで、TILSの急速増殖及び又は第2の増殖のためのサイトカインの組み合わせを使用することが、追加的に可能である。したがって、可能な組み合わせとしては、IL-2及びIL-15、IL-2及びIL-21、IL-15及びIL-21、並びにIL-2、IL-15、及びIL-21が挙げられ、後者は、多くの実施形態で特定の使用を見出す。サイトカインの組み合わせの使用は、特に、リンパ球、特にその中で説明されるT細胞の生成に好都合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明される増殖方法で使用される培養培地(REPと称されるものを含む)はまた、抗CD3抗体も含む。IL-2と組み合わせた抗CD3抗体は、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、完全長抗体、並びにFab及びF(ab’)2断片で見られ、前者が概して好ましく、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるTsoukas et al.,J.Immunol.1985,135,1719を参照されたい。
当業者によって理解されるように、本発明における使用を見出すいくつかの好適な抗ヒトCD3抗体が存在し、これは、限定されるものではないが、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ抗体を含む、様々な哺乳動物からの抗ヒトCD3ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。特定の実施形態では、OKT3抗CD3抗体が使用される(Ortho-McNeil、Raritan,N.J.又はMiltenyi Biotech、Auburn,Calif.から市販されている)。
第2の増殖ステップの後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、TILは、1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上の増殖ステップの後に採取される。いくつかの実施形態では、TILは、2つの増殖ステップの後に採取される。
TILは、例えば、遠心分離によることを含む、任意の適切かつ滅菌された様式で採取され得る。TIL採取のための方法は、当該技術分野で周知であり、任意のそのような公知の方法が本プロセスに用いられ得る。いくつかの実施形態では、TILは、自動システムを使用して採取される。
細胞ハーベスター及び/又は細胞処理システムは、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer、及びInotech Biosystems International,Inc.を含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースのハーベスターが、本方法で用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞ハーベスター及び/又は細胞処理システムは、膜ベースの細胞ハーベスターである。いくつかの実施形態では、細胞採取は、LOVOシステム(Fresenius Kabiによって製造される)などの、細胞処理システムを介して行われる。「LOVO細胞処理システム」という用語はまた、滅菌及び/又は閉鎖系環境中のスピニング膜又はスピニングフィルタなどの膜又はフィルタを通して細胞を含む溶液をポンピングすることができ、ペレット化なしで上清又は細胞培養培地を除去するための連続的な流れ及び細胞処理を可能にする、任意の供給業者によって製造された任意の器具又はデバイスを指す。いくつかの実施形態では、細胞ハーベスター及び/又は細胞処理システムは、閉鎖滅菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び/又は他の細胞処理ステップを実施し得る。
いくつかの実施形態では、採取は、閉鎖系バイオリアクターから実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、本明細書に説明されるように、TIL増殖に用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10若しくはG-REX-100、又は有利にはWO2018/130845のデバイスである。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
細胞は、患者への投与で使用するためにコンテナに移される。いくつかの実施形態では、上記に説明される増殖方法を使用して治療上十分な数のTILが得られると、TILは、患者への投与で使用するためにコンテナに移される。
一実施形態では、本開示のAPCを使用して増殖されたTILは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して増殖されたTILは、当該技術分野で公知の任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、T細胞は、単回の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは約30~60分持続する。他の好適な投与経路としては、腹腔内、くも膜下腔内、及びリンパ内が挙げられる。
一実施形態では、本開示の方法を使用して増殖されたTILは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して増殖されたTILは、当該技術分野で公知の任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、T細胞は、単回の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは約30~60分持続する。他の好適な投与経路としては、腹腔内、くも膜下腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。
任意の好適な用量のTILが投与され得る。いくつかの実施形態では、約2.3×1010個~約13.7×1010個のTILが投与され、特に、がんが黒色腫である場合、平均で約7.8×1010個のTILが投与される。一実施形態では、約1.2×1010個~約4.3×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、約3×1010個~約12×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、約4×1010個~約10×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、約5×1010個~約8×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、約6×1010個~約8×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、約7×1010個~約8×1010個のTILが投与される。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約2.3×1010個~約13.7×1010個である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約7.8×1010個のTILであり、特に、がんが黒色腫である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約1.2×1010個~約4.3×1010個のTILである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約3×1010個~約12×1010個のTILである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約4×1010個~約10×1010個のTILである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約5×1010個~約8×1010個のTILである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約6×1010個~約8×1010個のTILである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約7×1010個~約8×1010個のTILである。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの数は、約1×106個、2×106個、3×106個、4×106個、5×106個、6×106個、7×106個、8×106個、9×106個、1×107個、2×107個、3×107個、4×107個、5×107個、6×107個、7×107個、8×107個、9×107個、1×108個、2×108個、3×108個、4×108個、5×108個、6×108個、7×108個、8×108個、9×108個、1×109個、2×109個、3×109個、4×109個、5×109個、6×109個、7×109個、8×109個、9×109個、1×1010個、2×1010個、2×1010個、3×1010個、4×1010個、5×1010個、6×1010個、7×1010個、8×1010個、9×1010個、1×1011個、2×1011個、3×1011個、4×1011個、5×1011個、6×1011個、7×1011個、8×1011個、9×1011個、1×1012個、2×1012個、3×1012個、4×1012個、5×1012個、6×1012個、7×1012個、8×1012個、9×1012個、1×1013個、2×1013個、3×1013個、4×1013個、5×1013個、6×1013個、7×1013個、8×1013個、及び9×1013個である。一実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの数は、1×106~5×106個、5×106~1×107個、1×107~5×107個、5×107~1×108個、1×108~5×108個、5×108~1×109個、1×109~5×109個、5×109~1×1010個、1×1010~5×1010個、5×1010~1×1011個、5×1011~1×1012個、1×1012~5×1012個、及び5×1012~1×1013個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの濃度は、例えば、医薬組成物のw/w、w/v又はv/vにおいて、100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%、又は0.0001%未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの濃度は、医薬組成物のw/w、w/v又はv/vにおいて、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25% 19%、18.75%、18.50%、18.25% 18%、17.75%、17.50%、17.25% 17%、16.75%、16.50%、16.25% 16%、15.75%、15.50%、15.25% 15%、14.75%、14.50%、14.25% 14%、13.75%、13.50%、13.25% 13%、12.75%、12.50%、12.25% 12%、11.75%、11.50%、11.25% 11%、10.75%、10.50%、10.25% 10%、9.75%、9.50%、9.25% 9%、8.75%、8.50%、8.25% 8%、7.75%、7.50%、7.25% 7%、6.75%、6.50%、6.25% 6%、5.75%、5.50%、5.25% 5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%超である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの濃度は、医薬組成物のw/w、w/v又はv/vにおいて、約0.0001%~約50%、約0.001%~約40%、約0.01%~約30%、約0.02%~約29%、約0.03%~約28%、約0.04%~約27%、約0.05%~約26%、約0.06%~約25%、約0.07%~約24%、約0.08%~約23%、約0.09%~約22%、約0.1%~約21%、約0.2%~約20%、約0.3%~約19%、約0.4%~約18%、約0.5%~約17%、約0.6~約16%、約0.7%~約15%、約0.8%~約14%、約0.9%~約12%、又は約1%~約10%の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの濃度は、医薬組成物のw/w、w/v又はv/vにおいて、約0.001%~約10%、約0.01%~約5%、約0.02%~約4.5%、約0.03%~約4%、約0.04%~約3.5%、約0.05%~約3%、約0.06%~約2.5%、約0.07%~約2%、約0.08%~約1.5%、約0.09%~約1%、約0.1%~約0.9%の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの量は、10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009 g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g、又は0.0001g以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物で提供されるTILの量は、0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g、又は10g超である。
本発明の医薬組成物で提供されるTILは、幅広い用量範囲にわたって有効である。正確な用量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、並びに担当医の選好及び経験に依存することになる。TILの臨床的に確立された用量もまた、適切な場合、使用され得る。TILの用量などの本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、治療されるヒト又は哺乳動物、障害又は状態の重症度、投与速度、活性医薬品成分の性質、及び処方医師の裁量に依存することになる。
いくつかの実施形態では、TILは、単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば、静脈内注射によってもよい。いくつかの実施形態では、TILは、複数回投与で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回以上であってもよい。用量は、月に1回、2週間に1回、週に1回、又は隔日でもよい。TILの投与は、必要に応じた長さで継続することができる。
いくつかの実施形態では、TILの有効用量は、約1×106個、2×106個、3×106個、4×106個、5×106個、6×106個、7×106個、8×106個、9×106個、1×107個、2×107個、3×107個、4×107個、5×107個、6×107個、7×107個、8×107個、9×107個、1×108個、2×108個、3×108個、4×108個、5×108個、6×108個、7×108個、8×108個、9×108個、1×109個、2×109個、3×109個、4×109個、5×109個、6×109個、7×109個、8×109個、9×109個、1×1010個、2×1010個、3×1010個、4×1010個、5×1010個、6×1010個、7×1010個、8×1010個、9×1010個、1×1011個、2×1011個、3×1011個、4×1011個、5×1011個、6×1011個、7×1011個、8×1011個、9×1011個、1×1012個、2×1012個、3×1012個、4×1012個、5×1012個、6×1012個、7×1012個、8×1012個、9×1012個、1×1013個、2×1013個、3×1013個、4×1013個、5×1013個、6×1013個、7×1013個、8×1013個、及び9×1013個である。いくつかの実施形態では、TILの有効用量は、1×106~5×106個、5×106~1×107個、1×107~5×107個、5×107~1×108個、1×108~5×108個、5×108~1×109個、1×109~5×109個、5×109~1×1010個、1×1010~5×1010個、5×1010~1×1011個、5×1011~1×1012個、1×1012~5×1012個、及び5×1012~1×1013個の範囲内である。
いくつかの実施形態では、TILの有効用量は、約0.01mg/kg~約4.3mg/kg、約0.15mg/kg~約3.6mg/kg、約0.3mg/kg~約3.2mg/kg、約0.35mg/kg~約2.85mg/kg、約0.15mg/kg~約2.85mg/kg、約0.3mg~約2.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1.7mg/kg、約0.15mg/kg~約1.3mg/kg、約0.3mg/kg~約1.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1mg/kg、約0.55mg/kg~約0.85mg/kg、約0.65mg/kg~約0.8mg/kg、約0.7mg/kg~約0.75mg/kg、約0.7mg/kg~約2.15mg/kg、約0.85mg/kg~約2mg/kg、約1mg/kg~約1.85mg/kg、約1.15mg/kg~約1.7mg/kg、約1.3mg/kg~約1.6mg/kg、約1.35mg/kg~約1.5mg/kg、約2.15mg/kg~約3.6mg/kg、約2.3mg/kg~約3.4mg/kg、約2.4mg/kg~約3.3mg/kg、約2.6mg/kg~約3.15mg/kg、約2.7mg/kg~約3mg/kg、約2.8mg/kg~約3mg/kg、又は約2.85mg/kg~約2.95mg/kgの範囲内である。
いくつかの実施形態では、TILの有効用量は、約1mg~約500mg、約10mg~約300mg、約20mg~約250mg、約25mg~約200mg、約1mg~約50mg、約5mg~約45mg、約10mg~約40mg、約15mg~約35mg、約20mg~約30mg、約23mg~約28mg、約50mg~約150mg、約60mg~約140mg、約70mg~約130mg、約80mg~約120mg、約90mg~約110mg、又は約95mg~約105mg、約98mg~約102mg、約150mg~約250mg、約160mg~約240mg、約170mg~約230mg、約180mg~約220mg、約190mg~約210mg、約195mg~約205mg、又は約198~約207mgの範囲内である。
有効量のTILは、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所的、移植、又は吸入による、鼻腔内及び経皮経路を含む類似の有用性を有する薬剤の許容される投与モードのいずれかによって、単回又は複数回投与のいずれかで投与され得る。
本発明はまた、本発明のTIL、特にUTILを使用する診断及び予後アッセイの実施に有用なキットも含む。本発明のキットは、緩衝液、サイトカイン、フラスコ、培地、産物コンテナ、試薬、及び説明書を含む。
腫瘍からのTIL成長、急速増殖プロセスのセットアップ、照射されたPBMCフィーダーが増殖していないことの確認、並びにWAVEバイオリアクター(例えば、https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/rocking-bioreactors/consumables-and-accessories/single-use-readytoprocess-wave-cellbag-bioreactors-p-00346#overview)への静止培養物の移動、製剤化、及び充填をセットアップする非限定的な多段階実施形態が以下に提示される。
ステップ1(0日目)では、凍結保存脱凝集腫瘍組織が、解凍され、インラインの100~270μmフィルタを通る濾過、及び20mLの再懸濁前の50mL遠心分離チューブ内の遠心分離前に、10%のFBS及び3000IU/mLのIL-2を補充されたT細胞培養培地中で1:9で再懸濁される。HLA-A、B、C、及びCD58+、並びにDRAQ7-細胞の数を定量化するために、フローサイトメトリー解析SOPのために試料が採取される。
ステップ2では、次いで、細胞懸濁液が、細胞培養コンテナ内で、添加された抗微生物剤及び抗真菌剤(Amphotericin B及びGentamicin)並びにインターロイキン-2(IL-2)1000IU/mLを補充されたCM-T(10%ウシ胎児血清を補充されたT細胞培地)中に、≧0.25×106~≦0.75×106個のHLA-A、B、C、及びCD58+並びにDRAQ7-細胞/mLで播種される。T細胞は、5日目からCM-Tで2週間にわたって成長させられ、培地の半分が除去され、10%ウシ胎児血清、Amphotericin B及びGentamicin、並びにIL-2を補充された新鮮な培地CM-Tで交換される。これは、細胞が≦0.1x106~2x106個のCD45+ CD3+ Annexin-V-ve DRAQ7-ve細胞/mLで維持されることを確保するために、5日目~10日目に2/3日毎に繰り返される。PH Eur 2.6.27によるTIL培養上清の微生物試験(5~7日目)は、微生物成長がないことを確認する。フローサイトメトリー解析(7~10日目)は、CD45+ CD3+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞の濃度を定量化する。
ステップ3では、複数の同種ドナー(健常血液提供に由来するバフィーコート)からのFicoll(密度1.078g/ml)を用いて、4×109個の照射されたPBMC(25~50Gy)を単離する。フローサイトメトリー解析は、CD45+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞を定量化する。照射されたPBMCの微生物試験は、微生物成長を決定する。
ステップ4では、急速増殖プロセスの開始に利用可能なTILの量が定量化される(12日目)。フローサイトメトリー解析は、CD45+ CD3+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞を定量化する。
ステップ5では、フィーダーの培養混合物(照射されたFicoll単離されたPBMC)が調製され、閉鎖された静止細胞培養バッグ内で、≧3~≦5×109個の照射されたPBMC-CD45+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞、7~9%ヒトAB血清、2000~4000IU/mLのIL-2、並びに20~40ng/mlのOKT-3抗体を含有する3LのT細胞混合培地中でサプリメントで成長させられる。
ステップ6では、TILを添加する前に、フィーダーの培養混合物(照射されたFicoll単離されたPBMC)の代表的な試料が、対照フラスコのために採取される。
ステップ7では、TILがREP培養物に添加される:≧1~≦20x106個の腫瘍由来TIL-CD45+ CD3+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞。
ステップ8では、静止培養物が、乾燥インキュベーター中で、3.5~6%の二酸化炭素を用いて、35~38.5℃で6日間インキュベートされる。CD45+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞の数及び生存率は、14日目及び18日目に、TILなしのREP混合物を含有する対照フラスコ(ステップ6で収集)で評価されて、照射されたフィーダーが増殖していないことを確認する。フローサイトメトリー解析は、CD45+ Annexin-V-、及びDRAQ7-細胞を定量化する。
ステップ9では、WAVEバイオリアクターバッグが、35~38.5℃、3.5~6%の二酸化炭素、1.7LのTCMで、1~2時間プレコンディショニングされ、TCMは、7-9%ヒトAB血清及び2000~4000IU/mLのIL-2を補充されている。
ステップ10では、TILは、WAVEバイオリアクターシステムに移され、増殖される。
ステップ11では、2000~4000IU/mLのIL-2を補充された灌流フィード1×TCM 10Lバッグが接続される。
ステップ12(19~22日目)では、19日目~22日目に灌流速度が調整される。
ステップ13(24日目)では、灌流が停止され、廃棄物及びフィードが接続解除される。
ステップ14では、TILが濃縮され、洗浄される。
ステップ15では、最終製剤は、総容量範囲125~270mLの輸血バッグ中に、10%のDMSO及び8.5%のHSAを含有するPBS中に懸濁された細胞で作製される。
ステップ16では、TILを含有する最終産物バッグの試料が、QCアッセイ及び保持試料のために取得される。新鮮な医薬品のQCアッセイとしては、微生物試験、並びに色及び可視粒子試験が挙げられる。保持試料は、細胞用量、生存率表現型及び効力、微生物試験及びエンドトキシン解析のために調製される。
ステップ17では、最終産物コンテナが標識され、最終産物標識と重ね合わせられる。
ステップ18では、-1℃/分~-60℃でコントロールレート凍結による凍結保存、及び≦-130℃の保存への移送が存在する。凍結保存医薬品に対するQCアッセイとしては、抗CD3断片を発現する細胞株との共培養後のCD137+、IFN-γ+、TNFα+、又はCD107a+の組み合わせについて、CD2+発現CD45+ DRAQ7-を評価するために、qPCRによるマイコプラズマ試験、T細胞用量及び生存率試験、動態発色LAL試験及び効力試験を使用して測定されるエンドトキシン試験が挙げられる。
本発明は、脱凝集システム又はデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、脱凝集デバイスは、個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイスの形態である。いくつかの実施形態では、脱凝集デバイスは、脱凝集プロセス中に熱制御を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存システム又はデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、脱凝集及び凍結保存のためのデバイスが提供され、熱制御が提供される。別の態様では、本発明は、1つ以上の可撓性コンテナ、又は本発明の脱凝集/凍結保存システム若しくはデバイスにおいて、脱凝集、凍結保存、若しくは脱凝集及び凍結保存の両方に適合された1つ以上の可撓性コンテナを含む複数のコンテナを提供する。いくつかの実施形態では、1つ以上のコンテナ又は複数のコンテナは、相互接続され、閉鎖系における使用に好適である。上述の態様は、本明細書に添付される特許請求の範囲に表される。本発明の例を提供する以下の詳細な説明を考慮して、本発明のより多くの利点及び利益が、当業者に容易に明らかになるであろう。
特定の実施形態では、脱凝集装置は、1つ以上の可動表面、例えば、プレート及び/又はパドルを含み、組織試料に圧縮及びせん断力を加えるように設計される。一実施形態では、消化装置は、互いに移動することができる第1の表面及び第2の表面を含む。特定の実施形態では、表面は、試料に圧力を加えるように配設される対向する表面である。一実施形態では、表面のうちの少なくとも1つは、試料に圧力を加えるように、表面の方向に対して垂直な方向に移動される。一実施形態では、表面は、平行に整列され、試料が繰り返し圧縮され、次いで、表面間で周期的様式で弛緩されるように、繰り返し又は周期的様式で一緒に及び離れて移動するように設計される。本発明の実施形態では、試料の圧縮及び弛緩は、試料中のせん断力を結果的にもたらす。
一実施形態では、第1及び第2の表面のうちの1つは、他の表面が移動されている間、静止状態に保持される。別の実施形態では、第1及び第2の表面の両方が移動する。一実施形態では、組織試料は、組織試料、及び任意選択的に脱凝集流体又は溶液を収容する可撓性及び/又は弾性コンテナに収容される。特定の実施形態では、コンテナは、表面が移動する際に、第1の表面と第2の表面との間の体積の変化に対応する。特定の実施形態では、コンテナは、弾性であり、組織試料及び対向する表面の範囲内の脱凝集流体を閉じ込める。特定の実施形態では、コンテナは、可撓性であり、周囲の気圧は、対向する表面の範囲内の組織試料及び脱凝集流体の閉じ込めを支援する。特定の実施形態では、気圧は、大気圧である。特定の実施形態では、気圧は、包囲チャンバ内で加えられ、圧力は、周囲よりも大きい。
特定の実施形態では、脱凝集デバイスは、並んで配設された、対向する表面の2つ以上のセットを含む。いくつかのそのような実施形態では、1つの表面は、セットに共通であり、例えば、任意選択的に保持された単一のプレートであるが、一方、各セットの第2の表面は、並んで位置し、静止プレートに対して圧力を加える。第2の表面は、トレッディング運動で交互に圧力を加え得る。特定のそのような実施形態では、組織試料及び脱凝集流体を静止表面と移動表面との間の空間内に閉じ込めるが、一方で、コンテナの内容物が移動表面の間で前後に流れることを可能にする、可撓性コンテナが用いられる。特定の実施形態では、コンテナは、内容物のそのような前後の動きを制限又は防止するように適合される。一実施形態では、コンテナを横切る封止は、一方側から他方側への内容物の流れを遮断する。一実施形態では、コンテナを横切るバッフルは、一方側から他方側への内容物の流れを制限する。
トレッディング表面は、任意の適切な機構によって作動され得る。デバイス100として、本明細書では、可撓性コンテナに対してトレッディング表面を交互に移動させるように設計された横方向バーシステムの一例が開示される。トレッディング表面は、ばね付きであり、ばねは、コンテナの厚さの変化及びコンテナ内の粒子サイズの変化を可能にしながら、コンテナに対してトレッディング表面を押し付けるように設計されている。特定の実施形態では、ばねは、予荷重される。また、デバイス200として、本明細書では、2つのトレッディング表面を特徴とするカム作動設計の例が開示される。デバイス200では、予荷重されたばねは、可撓性コンテナに対してトレッディング表面を押し、カム機構は、一方のトレッディング表面を周期的に上昇させ、次いで、他方を可撓性コンテナから遠ざける。別の実施形態では、1つ以上のロッカーアーム又はレバーが、コンテナからトレッディング表面を持ち上げるために用いられる。更に別の実施形態では、トレッディング表面は、油圧で上下する。更に別の実施形態では、トレッディング表面は、空気圧で上下する。200デバイスでは、脱凝集コンテナに交互に接触する2つのトレッディング表面が存在するが、特定の実施形態では、作動機構は、システムが静止しているときを含めて、移動表面の全てが同時に圧力を加えることを可能にする。そのような特徴は、脱凝集プロセスの最後に、脱凝集コンテナの内容物を空にするのに有用である。例えば、中間位置に位置するか、又は1つが上昇し、かつ1つが下降するトレッディング表面の代わりに、トレッディング表面の全てが脱凝集コンテナに対して下降し、付着したチューブを通してその内容物を、任意選択的に濾過して、二次受容コンテナ、例えば、凍結保存コンテナに絞り出す。
本明細書に例示される完全閉鎖脱凝集及び凍結保存システムでは、特徴付けられた自動脱凝集、続いて、手動濾過、並びにシリンジ及びチューブの封止された系による、凍結保存コンテナ及び自動凍結保存への移送が存在する。有利には、脱凝集腫瘍組織は、脱凝集コンテナから凍結保存コンテナに手動で移送されるが、脱凝集及び凍結保存ステップは、両方のステップを順次管理するようにプログラムされた同じ自動デバイスによって実施される。他の実施形態では、脱凝集手順は、終結時に、脱凝集腫瘍組織が脱凝集コンテナから凍結保存コンテナに自動的に移動されるように設計される。特定の実施形態では、接続管に接触する蠕動ポンプ及び弁は、内容物の流れを制御する。特定の実施形態では、脱凝集装置のトレッディング表面は、脱凝集コンテナから脱凝集腫瘍溶液を、任意選択的にフィルタを通じて、凍結保存コンテナ、内容物の流れを制御する弁に押し出すか、又は絞り出すように配設される。そのような実施形態では、閉鎖系における材料の任意の移送とともに、脱凝集及び凍結保存が、本明細書に例示されるのと同じデバイスによって制御及び実施されることが好ましい。
いくつかの脱凝集システムは、力、消化時間、及び速度(RPM又はサイクル/分)を含む変数に関して試験され、最適化されている。最大60N及びそれを上回る力、最大60分及びそれを上回る消化時間、並びに最大240RPM及びそれを上回る速度を含む、力、時間、及び速度の変数の組み合わせについて、いくつかの組織タイプを使用した結果及び推定が決定される。本発明の特定の実施形態では、力は、20~100N、又は30~80N、又は40~60N、又は10~20N、又は20~30N、又は30~40N、又は40~50N、又は40~45N、又は45~50N、又は50~55N、又は55~60N、又は60~65N、又は65~70N、又は70~75N、又は75~80Nである。典型的なトレッディング足は、約20~50cm2の表面積を有する。30cm2のトレッディング表面に基づいて、トレッディング圧力は、0.5~6.5N/cm2、又は1~4N/cm2、又は1~3N/cm2、又は1~2N/cm2、又は1.5~2.5N/cm2、又は2~3N/cm2、又は2.5~3.5N/cm2、又は1.5N/cm2±0.5N/cm2、又は2N/cm2±0.5N/cm2、又は2.5N/cm2±0.5N/cm2、又は3N/cm2±0.5N/cm2、又は4N/cm2±0.5N/cm2、又は5N/cm2±0.5N/cm2である。公称圧力が、圧力センサを使用して測定され得、好ましくは、脱凝集コンテナの厚さを補正する。特定の実施形態では、脱凝集デバイスは、圧力センサを組み込む。本発明の特定の実施形態では、消化時間は、90分以下、又は75分以下、又は60分以下、又は50分以下、又は5~120分、又は15~100分、又は30~90分、又は40~60分、又は5~10分、又は10~20分、又は20~30分、又は30~40分、又は40~45分、又は45~50分、又は50~60分、又は60~65分、又は65~70分、又は40分±5分、又は45分±5分、又は50分±5分、又は55分±5分、又は60分±5分、又は65分±5分、又は70分±5分である。特定の実施形態では、脱凝集デバイスが、60~360RPM、又は120~340RPM、又は180~300RPM、又は210~270RPM、又は80~160RPM、又は120~200RPM、又は160~240RPM、又は200~280RPM、又は240~320RPM、又は280~360RPM、又は60RPM±20 RPM、又は80RPM±20RPM、又は100RPM±20RPM、又は120RPM±20RPM、又は140RPM±20RPM、又は160RPM±20RPM、又は180RPM±20RPM、又は200RPM±20RPM、又は220RPM±20RPM、又は240RPM±20RPM、又は260RPM±20RPM、又は280RPM±20RPM、又は300RPM±20RPM、又は320RPM±20RPM、又は340RPM±20RPM、又は360RPM±20RPMで動作する。
特定の実施形態では、物理的脱凝集は、連続的である。特定の実施形態では、物理的脱凝集は、定期的又は一時的である。例えば、温度上昇が脱凝集試料で観察される場合、温度上昇を低減若しくは防止するか、又は温度が設定点に平衡化することを可能にするために、物理的脱凝集を一時的に減速又は停止することが有利であり得る。理論に拘束されるものではないが、温度上昇は、脱凝集デバイスによる試料の物理的操作、デバイスの能動的トレッディング機構からの熱伝達、脱凝集プロセスが有効である間、試料から冷凍ユニットへの低減された物理的接触又は熱伝達、又は他の理由を通じて発生し得る。特定の実施形態では、定期的又は一時的な脱凝集は、脱凝集デバイスに有益であり得る。本明細書に開示されるカム駆動デバイスでは、カム機構の寿命は、カム回転の方向を随時定期的に逆転させることによって改善され得、したがって、カムの両側に摩耗を分散させることによってカムの寿命を延長する。本発明の実施形態では、物理的脱凝集の活性期間は、限定なしで、15~30秒、20~40秒、30~60秒、45~75秒、60~90秒、少なくとも20秒、少なくとも30秒、少なくとも40秒、少なくとも1分、少なくとも1.5分、又は少なくとも2分を含む。非活性の持続時間は、限定なしで、1~10秒、10~20秒、20~30秒、30~40秒、40~60秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、60秒、90秒、120秒、又はその間の持続時間であり得る。非活性の持続時間は、脱凝集デバイスが方向を逆転するために必要な程度に短くてもよい。
いくつかの実施形態では、表面は、互いに対して横方向に移動するように配設された対向する表面である。特定のそのような実施形態では、横方向運動は、直線の横方向運動を含む。特定のそのような実施形態では、横方向運動は、環状の横方向運動を含む。特定の実施形態では、直線及び環状の横方向運動の両方が存在する。
一実施形態では、対向する表面は、平坦である。一実施形態では、表面のうちの少なくとも1つは、凸状領域を含み、他の表面に対して揺動運動で移動されるように配設される。凸状表面及び揺動運動の一態様は、蠕動様作用を提供することである。
本発明によると、表面の移動は制御され、そのような制御は、限定されるものではないが、速度、試料圧縮、システム圧力、持続時間、及びサイクル頻度を含む、表面移動の1つ以上の態様の制御を含む。特定の実施形態では、プレート移動の1つ以上の態様は、一定である。特定の実施形態では、プレート移動の1つ以上の態様は、脱凝集の状態に依存する。特定の実施形態では、脱凝集の状態は、例えば、時間、分、及び秒で測定される早期、中期、後期、又はより精密な時間などの、1つ以上の所定の段階などの、脱凝集手順の時間によって定義される。特定の実施形態では、脱凝集の状態は、腫瘍片のサイズ分布によって定義される。例えば、本発明の実施形態では、圧力は、腫瘍片のサイズが低減するにつれて増加する。
脱凝集デバイスの例及び代替例
図41を参照すると、閉鎖され、かつ少なくとも初期に無菌の略平坦で比較的薄い試料コンテナバッグ10内の個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイス100が示されている。デバイスは、例えば、Via Freeze(商標)として知られる市販の冷凍庫、又は図41に概略的に示され、概して冷凍庫40として本明細書に説明される、温度のコントロールレート変化を提供する、コントロールレート温度変化冷凍庫、解凍器、又は加温器などの、温度制御されたデバイスに取り外し可能に挿入され得る部品のアセンブリから形成されたハウジング110を含む。実際には、ハウジングは、例示されていないカバーを含むことになる。使用において、デバイス及びバッグは、組織、例えば、切除腫瘍、切除腫瘍の一部、又は針生検などを脱凝集し、次いで、バッグ10から脱凝集試料を移す必要性なしで、その後の解析のために結果的に得られた細胞懸濁液を凍結保存するために、閉鎖系を提供する。
図41を参照すると、閉鎖され、かつ少なくとも初期に無菌の略平坦で比較的薄い試料コンテナバッグ10内の個々の細胞又は細胞塊への組織の脱凝集のためのトレッディングデバイス100が示されている。デバイスは、例えば、Via Freeze(商標)として知られる市販の冷凍庫、又は図41に概略的に示され、概して冷凍庫40として本明細書に説明される、温度のコントロールレート変化を提供する、コントロールレート温度変化冷凍庫、解凍器、又は加温器などの、温度制御されたデバイスに取り外し可能に挿入され得る部品のアセンブリから形成されたハウジング110を含む。実際には、ハウジングは、例示されていないカバーを含むことになる。使用において、デバイス及びバッグは、組織、例えば、切除腫瘍、切除腫瘍の一部、又は針生検などを脱凝集し、次いで、バッグ10から脱凝集試料を移す必要性なしで、その後の解析のために結果的に得られた細胞懸濁液を凍結保存するために、閉鎖系を提供する。
ハウジング110は、10~300rpmの出力速度を有する電動モータ及びギヤボックスを含むモータユニット114を取り付けられるシャーシ112を有する。モータ及びギヤボックス114の出力シャフトは、結果的にトレッディング機構120に枢動可能に接続される接続ロッド118を駆動するクランク116を有し、クランク116の各回転毎に1回のトレッディングサイクルを通じて移動することになり、すなわち、トレッディングサイクルは、0.2~6秒である。より詳細には、このトレッディング機構は、2つの対向する平行な水平バー126及び128をそれぞれ枢動可能に装着するシャーシ112に堅固に装着された2つの離隔された枢動点122及び124を含む、平行四辺形の4つのバーリンケージを有する。水平バーの各々は、2つの平行なトレッディングバー130及び132を有し、枢動点122及び124の各側の1つが枢動可能に連結され、一緒に平行四辺形のリンケージを形成する。接続ロッド118は、上部水平バーの延長部に簡便に枢動可能に保持され、それにより、その延長部の移動が、トレッディングバー130及び132の周期的上下運動(示される配向の)を引き起こす。各トレッディングバー130及び132には、足アセンブリ134及び136が接続されており、上述の周期的運動によって、順次の様式で、クランク116の運動とともに上下に移動することになり、すなわち、一方の足が上昇するとき、他方が下降することになり、その逆も同様である。
足アセンブリ134及び136は、各々、平坦に面するソールプレート138及び140を含み、各プレートは、それぞれ、コイル状の金属ばね146によって、上部足フレーム142及び144にばね装着されている。上記に説明される配置、又は使用される場合、同等の配置では、ばね146は、予荷重される。この場合、合わせた予荷重は、各足に対して、好ましくは40~80N、より好ましくは30~70N、好ましくは約60Nである。合わせたばね速度は、移動1mm当たり1~5N、好ましくは、約3N/mmであり、意図される足の移動は、約8~12mm、好ましくは、約10mmである。加えて、各足の表面積は、約20~50cm2、好ましくは約35cm2であることが意図される。これは、ゼロ(足がバッグから持ち上げられるか、又は実質的に荷重がないとき)~最大約6N/cm2(約9psi)のバッグに対する想定圧力を結果的にもたらす。好ましい想定圧力は、約2N/cm2(約3psi)である。しかしながら、バッグが、少なくともトレッディングプロセスの開始時に、均質な材料を含有しない場合があることを考慮すると、加えられた力が週通することになる材料の塊が存在することになり、そのため、圧力は、例えば、トレッディングプロセスの終了に向かって及ぼされるバッグ10の最小限の圧力抵抗を提供するために理想的な状況である「想定」として説明される。
シャーシの底部には、可撓性バッグ10のための受容エリア148があり、受容エリア148に隣接しているのは、熱伝達プレート150である。エリア148は、シャーシの前面(図41に示される前面)を介して、プレート150上に試料処理バッグ10が摺動可能な余地があるように十分な大きさである。プレートは、バッグ10が位置する上面151と、使用時に外部から影響を受ける加熱又は冷却に対して露出される下面152と、を含む。上面151は、各足のソールプレート138及び140と略平行であり、その結果、ソールプレートは、表面151と略平行に移動する。別の言い方をすると、平坦なソールプレートは、表面151に対して略垂直方向に移動し、これは、機構120上の顕著な横力を防止する。プレート150は、金属、好ましくはアルミニウム、銅、金若しくは銀、又はそれらの金属を含有する合金から形成される。熱コンダクタンスは、好ましくは100を上回り、より好ましくは20℃で測定される200W/m Kを上回る。プレート150の材料の厚さは、約3mm以下であり、低熱量を提供し、したがって、プレートの反対側の温度変化に追従するようにバッグ10の内容物のより迅速な反応を提供する。
更に図42及び図43を参照すると、デバイスは、矢印Cによって示されるように、この例では時計回りに、モータユニット114に電流を供給して、クランク116を駆動することによって動作する。クランクは、接続ロッド118に、上記に説明されたトレッディング機構120を動作させる。機構120に最大の力が加えられる、クランクのストロークの上部及び底部は、各足アセンブリ134及び136の最下部の位置と一致することに留意されたい。足アセンブリは、矢印U及びDの方向に上下に移動して、試料バッグ10を順次揉み込み、その結果、バッグ10の内容物は、それぞれのトレッディング足から離れて一方側に移動する機会を有する。バッグ内の潜在的固形組織試料が、トレッディング足から離れて移動し得るため、かつ各足のソールプレート138及び140がばねで荷重されており、足がそのストロークの底部にあるときでも、足への追加的な弾性移動の余裕があるため、より大きい組織塊が脱凝集されることが意図されるときに、機構が動かなくなる可能性が低い。順次のトレッディング動作はまた、バッグ10の破裂の可能性を低減する。
図44は、上記に説明されたデバイス100の平面図であるが、この図では、バッグ10は定位置にない。特に、離隔され、かつ平面で見た集合エリアを有する足アセンブリ134及び136の相対的に並んだ位置が見られ、このエリアは、平坦に置かれたときにバッグ10のエリアとほぼ等しいが、バッグ10のエリアのプラス又はマイナス約10%のエリアにおける差異は、有用性を有する。
図45は、上記に説明されたデバイス100と構成が類似しているデバイス100’の別の平面図を示すが、この代替例では、モータユニット114のモータ113は、モータ113がデバイス100’の後壁111を越えて突出しないように、90度ギヤボックス115の使用によって、そのギヤボックス115の出力シャフトに対して横方向に配置される。したがって、このデバイス100’は、必要に応じて、より小さい冷凍庫容積に収まり得る。
上述の脱凝集処理の間、足アセンブリ134及び136によって及ぼされる力は、熱伝達プレート150によって反応される。これは、試料バッグ10が、処理中にプレート150の接触表面151に対して押し付けられ、試料バッグ10とプレートの表面151との間に良好な表面接触を提供し、結果として改善された熱エネルギー伝達を提供することを意味する。
図46、図47、及び図48は、上述の可撓性試料バッグ10の異なる実施形態を示す。使用中のバッグは、デバイス100又は100’の受容エリア148内で所定の位置に摺動され、上述された2つの足134及び136の下に位置する。したがって、バッグは、約12mmの厚さの略平坦な構造を有し、その中に組織試料を収めるように、ある程度の追加の順応性を有する。図46から分かるように、バッグ10の1つの構造は、外周部14のみで封止されたプラスチック材料の2つの層から形成されて、中央空洞12、及び空洞12へのアクセスのためのポート16を形成するように示されている。バッグは、EVAから形成され得る。使用時に、ポート16、又はそれらのうちの少なくとも1つは、必要に応じて小片に刻まれ、かつシリンジによってバッグ空洞12内に通過した試料を受け入れるのに十分な大きさ、すなわち、直径約10mm以上であることが好ましい。しかしながら、大きい組織試料がバッグに入れられ得、かつバッグが再封止されるように、ポートの反対側のバッグの端にいわゆる「ジップロック(登録商標)」アクセスを含めることもできる。「ジップロック(登録商標)」は、継目を作製するために、1回以上にわたって折り畳まれ、弾性チャネルの内側に折り畳まれるか、又は別のクランプ(図示せず)によって保持されて、漏出の可能性を低減し得る。バッグ10は、代替として、開放され得、組織が添加され得る。次いで、バッグは、その内容物が定位置にある状態でヒートシールされ得る。バッグ10は、使用中のデバイス内のバッグを位置決めし、それを、トレッディング中に定位置に保持するための、カム開口18を含む。図面は、1つの空洞12を有するバッグ10を示すが、2つ以上の空洞、例えば、2つ、3つ、4つ、又は5つの空洞を有するバッグを提供することも可能であり、例えば、複数の空洞の各々が、細長く、初期に開放されたヒートシール可能な端と、その他端に脱凝集酵素などの試薬の導入のための、かつ脱凝集が完了又は実質的に完了すると、脱凝集試料を回収するための封止可能なポートと、を有する。
図47は、カム開口18内に収まるフレーム上のペグ24によって位置決めフレーム20内に装着された図46のバッグ10を示す。フレーム20は、デバイス100/100’内でバッグ10を定位置に位置決めして保持する代替的な方式である。フレーム20は、トレッディング中にバッグを定位置に位置決めして保持するためにデバイスと協働する位置決め孔22を含む。フレームは、滑らかに丸みを帯びた内側縁23を有する内側開放窓26を有し、使用時に空洞12並びにトレッディング足134及び136を収容する。フレーム20は、デバイス100/100’へのバッグ10の装填及びそれらからの取り出しを容易にする。
図48は、2つの略対称的な半分を有する代替的なフレーム20’を示し、各半分がフレーム20の構造と類似している。各フレーム半分は、フレーム20’に成形された可撓性シェル30を追加的に有し、それにより、2つの半分が、バッグ10を包む二枚貝の殻のように一緒になる。上部及び底部の可撓性シェルは、バッグ10の内側が使用時に破裂した場合に、堤防として作用する。この特徴は、感染性組織試料にとって特に有用である。
図示しない更に別の代替例では、単純なバッグインバッグ配置が、漏出を収容するように用いられ得る。更に別の代替例では、バッグは、例えば、以下に説明されるように凍結後、試料全体を使用せずに試料のアリコートを除去され得るように、弾性の(少なくとも室温で)別個のウェルを有する基部を含み得る。あるいは、封止可能なバッグは、試料の分離を可能にするために、複数の部分に更にヒートシールされ得る。
バッグ10に入れられた試料の処理は、一例では、WO2018/130845に説明されるステップに主に従い得る。この配置では、組織を収容する封止バッグTOは、ポート16を介してバッグ内に導入される組織の分解を加速するために、コラゲナーゼ及びプロテアーゼなどの消化酵素を含有し得る水溶液中に懸濁される。ここで、バッグが、プレート150上に配置され、例えば、外部熱源から約35°Gに加温されて、組織消化速度を加速する。本明細書で提案される1つの重要な差異は、単一の試料処理バッグが用いられ、消化酵素は、脱凝集前又は脱凝集中にバッグ内のポート16のうちの1つを通して導入され得ることである。熱伝達プレート150は、その下側でプレートを加熱して、酵素作用のためのバッグ内で所望の温度を提供することによって、熱エネルギーをバッグ内に導入するために使用され得る。その熱は、電気的に加熱された加温プレート、又はプレート150の中又は上における電気加熱要素から好都合にもたらされ得る。脱凝集作用の量は、多くのパラメータ、例えば、初期組織試料のサイズ、密度、及び弾性に依存することになり、それゆえ、脱凝集のための時間及びトレッディング速度は、顕著に変動することになる。長過ぎる、又は過度に激しいトレッディングは、細胞生存率の低下につながり得る。したがって、モータユニット速度及び脱凝集周期が重要である。この問題に対処する1つの選択肢は、類似の試料を脱凝集するために必要な時間及び出力速度を含むルックアップテーブルに従って処理を時間調整することである。別の選択肢は、脱凝集処理を実施するのに必要な経時的な瞬時電力又は電気エネルギーを測定すること、又はプレート150若しくは機構の別の部品に及ぼされる力若しくは応力を測定すること、及び所定の閾値に到達した後に停止して、試料が十分に脱凝集されたことを示すことである。電力/力/応力が低減するほど、脱凝集が完了に近い。別の選択肢は、バッグを通して光吸光度を測定することであり、吸光度が大きいほど、試料が脱凝集を完了するのに近い。脱凝集が完了すると、バッグの内容物が移送され得、細胞又は他の関心対象の構築物が分離され、デバイス100/100’内で凍結するために新鮮なバッグに戻され得る。あるいは、かつ好ましくは、脱凝集材料全体が、凍結するためにバッグ及びデバイス内に残され得る。抗凍結剤は、ポート16を通してバッグ内に導入される。
本方法とWO2018/130845に説明される方法との間の別の差異は、抗凍結剤が導入されると、バッグ内に脱凝集試料及び抗凍結剤を含むデバイスがデバイスに装着され(又は留まり)、デバイス全体が上記のように冷凍庫40内に装着される。冷凍庫の基部は低温であり、そのため、熱伝達プレート150を介してバッグ10から熱エネルギーを取り出す。氷の形成を制御し、バッグが冷却されている間の試料の過冷却を防止するために、バッグは、脱凝集よりも遅い速度ではあるが、上記に説明された様式で、足134及び136によって揉み込まれて、氷核形成を制御し、それにより、解凍後の細胞の生存率を高める。電気エネルギーは、冷凍庫、例えば、冷凍庫40(図41)の内側の機構120の運動を維持するように、ワイヤコンダクタを介してモータユニット114に供給され得る。
デバイスが冷凍庫から除去可能であるため、使用後の清浄化がより容易になる。
使用に必要とされるとき、バッグ10内の凍結した脱凝集試料は、プレート150の更なる外部加熱によって、及び/又は約37℃に維持された加温水浴にデバイス100/100’を部分的に浸漬することによって、デバイス100/100’内で急速に解凍され得、抗凍結剤が除去される。各場合で、バッグは、解凍中に揉み込まれ得る。酵素が依然として存在する場合、それらは、必要に応じて、例えば、濾過によって、除去され得る。一般的に、酵素は、低温でその作用が停止されるため、凍結保存中に細胞にほとんど又は全く影響しなかったことになる。全てのプロセス操作、加温、脱凝集、冷却、凍結、及びその後の解凍は、同じ封止された可撓性バッグ10内の試料で行われ、単一のデバイスで実施され得る。これは、時間及び空間の効率性のみならず、単一のレコードが、プロセス、例えば、温度、持続時間、脱凝集速度、凍結プロトコル中に試料に起こった全ての事を補足することを可能にし、処理機械間で制御されていない環境で試料があまりにも多くの時間を費やすなどのエラーの機会を低減する。
組織試料処理及び凍結に使用される装置及び技術のより具体的な例が以下に与えられる。
図49は、EVA又はPVGフィルムなどの熱可塑性材料から形成され、組織試料Tを受け入れるための開口部11を有する、バッグ10の例を示す。バッグは、1つ以上の分岐17、圧縮弁19、及び標準的なルアータイプコネクタ15を含む1つ以上のポート16(図46)に取り付けられたチューブ13を含む。示される単一のチューブラインは、単に例示に過ぎず、バッグ10は、複数のポート16を介して接続される追加の平行チューブを含み得る。
組織Tがバッグ10の内側にあると、開口部11は、図50で閉鎖及び封止されて示され、同じ図に一点鎖線で開放されて示される機械クランプ封止9によって、及び/又は図51aに示されるヒートシール機械50を使用するヒートシールによって封止されて、ヒートシールされた閉鎖片(例えば、複数の平行片)8を生成し得、各方法は、封止空洞12を形成する(図46、図47、及び図49)。
バッグ10を封止するための代替的又は追加的手段が図51b及び図51cに示される。図51cに示されるように、封止8におけるヒートシール後のバッグ10は、一対のねじ66によって一緒に強制される上部バー62及び底部バー64を含む、2部品クランプ60内でクランプされ得る。図51bは、分解状態にあるクラップ60を示すが、使用時に、ねじ66は、バッグ10の挿入前に残りのクランプから完全に取り外される必要はない。上部バー62は、クランプされたときに相補的なくさび形状の形成部61が位置するテーパ状の凹部68を有する。凹部及びくさびは、くさび65の頂点でクランプ力を集中させ、平坦なクランプ面によって達成され得るよりも高いクランプ力を頂点で提供する。更により多くのクランプ力について、頂点65は、その頂上に小さいチャネル67を有し、これは、上部バーにおいて、相補的な隆起形成部69によって使用時に合致される。特定の実施形態では、力は、ヒートシール8の必要性を否定するのに十分である。特定の実施形態では、ヒートシール又は他のバッグ封止機構は、例えば、脱凝集装置の外側の試料含有バッグの取り扱いを提供するために望ましい。特定の実施形態では、クランプデバイスは、封止の完全性を確保する。クランプ力は、容易に曲がらない上部及び底部バーの厚さ及び剛性によって更に増強され、そのため、ねじ66によって及ぼされるクランプ力を維持する。図51cは、クランプ状態にあるクランプ60を示す。突出部63は、トレッディングデバイス100/100’又は200の特徴と合致して(以下に説明されるように)、クランプの動き、結果としてトレッディング中のクランプされたバッグ10の動きを阻害する。クランプ60の外周及び高さは、試料受容エリア148(又は248 図62及び以下の項目)の相補的な部位に収まるサイズ及び形状であり、そのため、トレッディング中にクランプされたバッグ10の更なる場所を提供する。例示されていないが、クランプ60は、図47及び図48に示されるように、追加のフレーム20、20’も組み込み得、それにより、クランプは、フレームの一端に堅固に装着され、ポート16(図46及び図49)がフレームの他端に支持される。
図52を参照すると、使用時に、封止されると、消化酵素Eが、例えば、分岐接続17に取り付けられたシリンジ5を使用して酵素をバッグ内に注入することによって、チューブ13を介して空洞12内に導入され得る。バッグを直立配向に保持することによって、空気は、図53に示されるシリンジ5のピストンを引き込むことによって空洞12から除去され得る。酵素E及び組織Tの初期混合は、図54に示されるように手で行われ得る。
次いで、脱凝集のためのトレッディングデバイス100内へのバッグ10の装填は、図55に例示されるように、フレーム20/20’及びバンディングカバー30の有無のいずれかで、始まり得る
次いで、脱凝集プロセスが、上記に説明されるように行われる。完了すると、数分~数時間、例えば、約10分~7時間、好ましくは40分~1時間かかり得るが、脱凝集液化試料は、例えば、上記に説明される上記に説明されるバッグセット、及び図56に示されるように、ブランチ17に接続された追加の試料アリコートバッグ7を使用して、アリコートに細分化され得る。その事例では、シリンジ5は、バッグ10から矢印Fの方向に液化試料を取り出すために使用され、弁19a及び19bが開放され、試料アリコートバッグ7に隣接する弁19cが閉鎖される。十分な試料がシリンジ5内に引き込まれると、弁19bが閉鎖され、弁19aは開放したままであり、弁19cは開放される。次いで、シリンジは、図57の矢印Fの方向に液体を試料アリコートバッグ7内に押し込むために使用される。アリコートバッグ7のチューブ13は、クランプヒートシール機械55によってヒートシールされ得、図58に示される。そのプロセスは、十分なアリコートが得られるまで、又は試料がなくなるまで繰り返され得、バッグは、既に部分的に分割されて、各区画の封止をより単純にし得る。
上記に説明されたように、試料バッグ10は、トレッディングデバイス100(図55)に留まり得、次いで、トレッディングデバイスは、コントロールレート温度変化デバイス、この場合、図59に示されるように冷凍庫40に装填され得る。その技術は、トレッディングが凍結中に継続することを可能にするが、氷結晶形成を阻害するために、実際には、バッグ10は、凍結する前に除去され得、次いで、冷凍庫40が、トレッディング中に熱伝達プレートを通して試料を冷却するためだけに作用する。代替的に、アリコート試料バッグ7が、試料バッグ10全体の代わりになり得る。別の代替例では、冷凍庫40は、図60に示されるように、冷凍庫40の上部に蓋が開放され、そのため基部150が冷却される状態でトレッディングデバイス100を装着することによって、約4℃まで未処理又は処理済み試料を穏やかに冷却するために使用され得る。別の代替例では、図61に示されるように、冷凍庫の蓋が定位置にある状態で、基部150を取り出し、冷凍庫内にそれを配置することを可能にする。示されていない更に別の代替例では、バッグ10又は7は、冷凍庫40内で直接凍結され得る。
本発明は、上記の実施形態によって限定されているとはみなされないが、当業者にとって容易に明らかであるように、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更することができる。例えば、上記に説明されたトレッディング機構は、低温条件において摺動表面よりも動かなくなる可能性が低い、完全に枢動する機械的相互接続を提供するため好ましいが、その機構は、2つ以上の足を順次的にトレッディングするための任意の機械的に均等な手段で置き換えられ得る。説明される平坦な足は、トレッディング運動が、上下ではなく、左右であるローラー足と置き換えられ得る。説明されるトレッディング、又はその機械的均等物は、脱凝集を最適化し、細胞回収を最大化するために、好ましくは毎秒各足に対して2又は3回のトレッディング速度であり、定常的なトレッディングであるが、トレッディングは、異なる細胞型に対して、より速くてもよく、若しくはより遅くてもよく、又は断続的であってもよい。
デバイス100/100’は、冷凍庫内に置かれ、極端に低温(例えば、マイナス80℃以下)に供されることが意図されるため、金属部品、特にばね146のような部品の使用は、ポリマー部品が低温ではるかに剛直になるため、好ましい。また、ピストン及びシリンダのような緊密に嵌合する部品は、非常に低温で動かなくなるか、又は嵌合不良となる場合があるため、説明される機構120のような単純な枢動可能なリンケージが好ましい。
図62、図63、及び図64は、上記に説明されたデバイス100とサイズ及び機能において類似した代替的なトレッディングデバイス200を示す。デバイス200は、以下でより詳細に説明される特定の差異を有する。
図62を参照すると、デバイス100とデバイス200との間の主な差異は、デバイス200がデバイス100の機構120とは異なるトレッディング機構220を有することである。2つのトレッディング足234、236は、トレッディング運動の速度を監視及び制御するためのフィードバックをコントローラ221(図63)に提供する回転エンコーダを有する電気モータユニット214の一部である24ボルトDC電気モータ213(図63)によって、図42及び図43に示される運動に類似した、周期的交互トレッディング運動で駆動される。モータは、歯付きベルト222を介してカムシャフト224を駆動する。カムシャフトは、180度でオフセットされる一対のカム230、232を含み、この事例では、各々、カムフォロアの単純な調和運動を提供するために、サイクロイド形状で輪郭付けられる。各カムは、カムの輪郭の上に乗る関連付けられたエラストマーフォロアホイール225、227、ばね付きフォロアキャリッジ226、228と力伝達関係にあるフォロアホイール軸221、223を含むカムフォロアアセンブリを移動させるように動作可能である。各キャリッジ226,228は、線形ガイド229内で摺動し、それぞれの足234、236は、キャリッジに接続される。各アセンブリは、それぞれのカムが戻りばね231の付勢力に対してモータによって回転する際に、足と一緒に、カム輪郭をトレッディング状態から離れて乗るため、フォロアホイールのそれぞれの1つによって上向きに強制される。カムが更に回転し、カム輪郭が後退すると、各フォロアアセンブリと関連付けられたばね231は、トレッディング力によってアセンブリ及び足を押し下げる。
それによって、トレッディング力は、駆動モータの電源ではなく、関連付けられたフォロアアセンブリばね231のばね定数に制限される。1. バッグに加えられる力は、機構が足を上に駆動し、ばねがそれらを押し下げるため、使用時に、ばねによって制限される。これは、以下を確保する。
a.モータが失速することができない(腫瘍サイズ又は組織に関係なく)こと、
b.試料が過剰な力で圧縮されず、バッグが裂けないこと、
c.バッグに加えられる最大圧力が、バッグ製造中に試験された圧力よりも低いこと、及び
d.以下に説明されるように、ヒンジ付きバッグ受容エリア248は、必ずしも足の事前位置決めをすることなく、試料バッグ及び使用される任意のクランプを受け入れることができること。言い換えると、ヒンジ付き試料エリア248が足に対して閉鎖されるため、足は、バッグを受け入れるときに任意の位置にあり得、必要に応じて、任意の試料は、その時点で、ヒンジ付きエリアが足に対して閉鎖されるため、足によって圧縮され得る。
a.モータが失速することができない(腫瘍サイズ又は組織に関係なく)こと、
b.試料が過剰な力で圧縮されず、バッグが裂けないこと、
c.バッグに加えられる最大圧力が、バッグ製造中に試験された圧力よりも低いこと、及び
d.以下に説明されるように、ヒンジ付きバッグ受容エリア248は、必ずしも足の事前位置決めをすることなく、試料バッグ及び使用される任意のクランプを受け入れることができること。言い換えると、ヒンジ付き試料エリア248が足に対して閉鎖されるため、足は、バッグを受け入れるときに任意の位置にあり得、必要に応じて、任意の試料は、その時点で、ヒンジ付きエリアが足に対して閉鎖されるため、足によって圧縮され得る。
また図63及び図64を参照すると、デバイス200は、デバイスハウジング210から2つの足234、236の上部まで延在する可撓性封止膜241を更に含み、これは、足の裏とトレッディング機構220の残りの部分との間に耐油性及びダストシールを提供する。その配置は、圧縮バッグが稼働中に裂けた場合、機構の汚染を抑制する。膜241が好ましいが、足は、バッグエリア248から機構220を分割するパーティションに装着されたリップシールなどの封止において摺動し得、必要とされる場合、機構の汚染の類似の抑制を達成する。
デバイス200は、熱伝達プレート150と同じ機能を果たす熱伝達プレート250を更に含む。しかしながら、このプレート250は、ヒンジ255(図64)でハウジングの一方側にヒンジで連結され、その結果、踏まれるバッグの挿入及び除去(図46、図47、及び図48に示される)がより容易になる。熱伝達プレート250は、品質管理のために、プレート250及びバッグ受容エリア248の温度がコントローラによって監視及び記録されることを可能にする温度センサ256を含む。プレート250は、上記に説明された表面151及び152と同じ機能を有する第1の表面251及び第2の表面252を有する。
各足は、デバイス200の熱伝達プレート250に対して高さが調節可能であり、その動きの表示もコントローラによって監視される。したがって、モータが回っていることを回転エンコーダが示す場合でも、歯付きベルト222の故障などの機械的故障が、コントローラによって依然として検出され得、警報を鳴らすなどの好適な措置が実装され得る。
デバイス200は、デバイス100と同じ外部寸法を有し、デバイスのハウジング210は、上記に説明され、図61に例示されるように、定位置に冷凍庫の蓋がある状態でコントロールレートフリーザー40の内側で摺動することを意図される。
便宜上、上部、下部、上、及び下などの用語、並びに足、トレッド、及びトレッディングなどのより記述的な用語が、図面に示される本発明を説明するために使用されているが、実際には、示されるデバイスは、例えば、その新しい配向において、それらの用語が反転又はあまり記述的ではないものとなるように、任意の様式で配向され得る。したがって、そのような用語又は同等の用語によって配向に関する限定が解釈されるべきではない。
本発明は、閉鎖された可撓性バッグ(10)内における個々の細胞又は細胞塊への組織試料の脱凝集のためのデバイス(100/100’)を提供し、デバイスは、機械的脱凝集機構(120)と、組織試料バッグ受容エリア(148)と、を含み、該デバイスは、熱エネルギーをエリア(148)に、又はそこから伝達するための熱伝達プレート(150)を更に含み、プレートは、エリア(148)に隣接する第1のプレート表面(151)と、エリア(148)から離れて面する外部の熱的影響に曝露される対向する表面(152)と、を有する。
収集時の腫瘍組織の凍結保存は、腫瘍収集から製造を分離する能力を結果的にもたらした。これは、UTIL製造が、腫瘍消化物の解凍から最終的なTIL採取洗浄、医薬品製剤、充填、ラベル貼り、及び凍結保存まで、単一の製造プロセスとして計画され、実施され得る。
最終産物の凍結保存は、コンディショニング化学療法の前に全てのリリース試験が実施され、患者の治療が、最終産物製造から外されることを可能にした。
フローサイトメトリーを使用して、製造された産物を特徴解析し、定量化した。TILは、出発材料の代表的な試料の病理評価によって、転移性腫瘍に由来する培養物であった細胞表面マーカーCD3を発現するT細胞として定義される。生存率は、早期細胞死マーカーAnnexin-V及び/又は生存率染料DRAQ7(トリパンブルー又はPIに相当)に結合しない全てのCD3+細胞のパーセンテージに基づく。純度は、生存造血細胞集団(CD45+、Annexin-V-ve、及びDRAQ7-ve)内の生存T細胞(CD3+、Annexin-V-ve、及びDRAQ7-ve)のパーセンテージとして定義される。
高速増殖プロトコル(REP)前の細胞の大部分は、CD3を発現するT細胞である。研究及び臨床バッチでは、CD3+CD8+及びCD3+CD4+TILの変数分布が観察され、これらは、腫瘍反応性細胞を含有する部分集団からなることになる。TILは、抗CD3を有するREPで増殖されるため、最終産物は、ほぼ排他的に生存可能なCD3+ T細胞(>94%)を含有する。
理論上、最終産物は、腫瘍細胞を依然として含有することができるが、これは、腫瘍細胞のT細胞成長及びT細胞媒介性死滅を強力かつ選択的に促進する培養条件に起因して非常に可能性が低い。数百回のTIL注入の臨床データは、細胞学による腫瘍細胞の存在を示さなかった。最終的に仕様を設定するためにデータを照合するために、造血系起源IPCアッセイではない全ての生存細胞物質を識別するための試験が組み込まれており、がんバイオマーカーの頻度についても試験することになる。
TIL細胞医薬品は、8.5%ヒト血清アルブミン及び10%のDMSOを含有する約125~270mlの緩衝等張生理食塩水中の懸濁液である。存在する細胞の数は、培養条件及び製造再現性と併せて、培養で増殖される各個人のTIL細胞の能力に依存する。
図1を参照すると、デバイスの脱凝集モジュールが開示される。デバイスは、酵素消化を伴う一実施形態では、脱凝集及び消化のための可撓性コンテナ1aを備え得る。開放端1bは、コンテナ1aへの固形腫瘍組織材料の移動を可能にする。吊り下げ孔1cは、コンテナ1aが吊り下げられ、輸送又は使用中に支持されることを可能にする。デバイスの無菌状態を維持するために、標的熱溶着場所1dは、熱溶着装置13c又は他の同等の手段を使用してコンテナ1aが封止されることを可能にする。コンテナ1aは、図2a~図2c又は図3a若しくは図3bに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ1aの内部表面上に丸みを帯びた縁1eを有し得る。チューブ1fは、培地3aが、滅菌フィルタ2aを介してコンテナ1aに移されることを可能にする。滅菌フィルタ2aは、培地3aの移送を容易にするために、後続のモジュールで封止の穿刺を可能にするスパイクを含む。チューブ1gは、消化酵素3bが、滅菌フィルタ2bを介してコンテナ1aに移されることを可能にする。滅菌フィルタ2bは、コンテナ1a内への消化酵素3bの移送を容易にするために、封止の穿刺を可能にするスパイクを含む。特に酵素消化を伴う固形腫瘍組織の脱凝集後、脱凝集混合物は、インキュベーションの段階に入る前に、滅菌フィルタ4bを含むフィルタユニット4aを介して、チューブ1hから移される。フィルタユニット4aは、濾過プロセスの有用性に影響せずに、変形を可能にするように可撓性であり得る。フィルタ4bは、非脱凝集組織を除去する。チューブクランプ5aは、培地3aが滅菌フィルタ2aを介して可撓性コンテナ1aに入ることを可能にする。酵素消化を伴う一実施形態では、チューブクランプ5bは、酵素3bが滅菌フィルタ2bを介して可撓性コンテナ1aに入ることを可能にする。チューブクランプ5cは、可撓性コンテナ1aの内容物が、フィルタユニット4aを介して、図2a~図2c、又は図3a若しくは図3bに識別される1つ以上の例に通過することを可能にする。
図2aによると、滅菌フィルタ2cは、脱凝集腫瘍組織の凍結保存に必要な培地3a及び/又は凍結溶液3cの導入を可能にする。フィルタ4dは、細胞/組織塊の追加のサイズ分離に必要とされ得る。フィルタ4dは、濾過プロセスの有用性に影響せずに、変形を可能にするように可撓性であり得るフィルタユニット4c内に包囲される。一実施形態では、フィルタ4eは、細胞を保持するのに必要とされ得るが、培地及び細胞断片が洗浄されることを可能にする。フィルタ4dは、同様にフィルタユニット4c内に包囲される。一実施形態では、チューブクランプ5dは、フィルタユニット4a及び4cを通過した、コンテナ1aからの材料が、コンテナ1aに戻ることを停止するように定位置にある。一実施形態では、チューブクランプ5eは、フィルタユニット4a、4c、及び4eを通過した、コンテナ1aからの廃棄物が、廃棄物コンテナ6aに入ることを可能にするが、滅菌フィルタ2cを介して培地3a又は3cが入ることを停止するように、定位置にある。チューブクランプ5fは、フィルタユニット4a、4c、及び4eを通過した、コンテナ1aからの材料が、チューブクランプ5eを介して廃棄物が廃棄物コンテナ6aを通過する前に、培地3a又は3cの供給源に戻ること、又は図3a又は図3bに例示された例のうちの1つに移ることを停止する。廃棄物が枯渇すると、チューブクランプ5e及び5dは、閉鎖され、チューブクランプ5fは、培地3a又は3cが、フィルタ4e内の細胞を図3a又は図3bに例示される例のうちの1つに移すことを可能にする。廃棄物コンテナ6aは、使用及び/又は輸送中に廃棄物コンテナ6aを支持するための吊り下げ孔を有する。
図2bは、デバイスの濃縮モジュールを例示する。チューブクランプ5gは、コンテナ1aの内容物が、フィルタユニット4aを介して、濃縮モジュールの可撓性コンテナ7aに入ることを可能にする。チューブクランプ5hは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット8aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ5iを介してコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁8cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ8bを通過することを可能にする。チューブクランプ5iは、コンテナ7aの内容物が開放チューブクランプ5hを介してフィルタユニット8aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁8cによって制御される圧力によってフィルタ8bを通過することを可能にする。細胞濃縮が発生した後、チューブクランプ5hが閉鎖され、チューブクランプ5jが開放されて、コンテナ7aの内容物が図3a又は図3bに例示された例のうちの1つに通過することを可能にする。廃棄物コンテナ6aは、使用及び/又は輸送中に廃棄物コンテナ6aを支持するための吊り下げ孔6bを有する。濃縮モジュールのコンテナ7aは、使用及び/又は輸送中にコンテナ7aを支持するための吊り下げ孔7bを有する。コンテナ7aは、図3a又は図3bに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ7aの内部表面上に丸みを帯びた縁7cを有し得る。チューブ7dは、コンテナ7aが、フィルタユニット4a及びフィルタユニット8aを介して、コンテナ1aの内容物を受容することを可能にする。チューブ7eは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット8aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ5iを介してコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁8cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ8bを通過することを可能にする。チューブ7fは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット8aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁8cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ8bを通過することを可能にする。
図2cは、濃縮モジュールの別の実施形態を例示する。チューブクランプ5gは、コンテナ1aの内容物が、フィルタユニット4aを介して、可撓性コンテナ7aに入ることを可能にする。チューブクランプ5hは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット9aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ5iを介してコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁9cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ9bを通過することを可能にする。チューブクランプ5iは、コンテナ7aの内容物が開放チューブクランプ5hを介してフィルタユニット9aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁9cによって制御される圧力によってフィルタ9bを通過することを可能にする。細胞濃縮が発生した後、チューブクランプ5hが閉鎖され、チューブクランプ5jが開放されて、コンテナ7aの内容物が図3a又は図3bに例示された例のうちの1つに通過することを可能にする。廃棄物コンテナ6aは、使用及び/又は輸送中に廃棄物コンテナ6aを支持するための吊り下げ孔6bを有する。濃縮モジュールのコンテナ7aは、使用及び/又は輸送中にコンテナ7aを支持するための吊り下げ孔7bを有する。コンテナ7aは、図3a又は図3bに例示される例への移送の一部として発生し得る損失を低減するためにコンテナ7aの内部表面上に丸みを帯びた縁7cを有し得る。チューブ7dは、コンテナ7aが、フィルタユニット4a及びフィルタユニット9aを介して、コンテナ1aの内容物を受容することを可能にする。チューブ7eは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット9aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞が開放チューブクランプ5iを介してコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁9cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ9bを通過することを可能にする。チューブ7fは、コンテナ7aの内容物がフィルタユニット9aを通過し、セルを保持及び濃縮することを可能にするが、一方で、濃縮された細胞がコンテナ7aに戻る前に、廃棄物及び破片が、弁9cによって制御される圧力によって廃棄物コンテナ6a内へフィルタ9bを通過することを可能にする。フィルタユニット9aは、濃縮細胞がコンテナ7aに戻る前に、弁9cによって制御される圧力によって、フィルタ9bを介して廃棄物培地及び破片を廃棄物コンテナ6a内に除去するために、コンテナ7aの内容物の濾過を容易にする。フィルタ9bは、細胞培地の改善された精製のために、廃棄物が廃棄物コンテナ6aに到達する前に溶出しなければならない距離を増加させるが、改善されたフィルタ9bの輸送及び保存を容易にするために、コイルに巻かれ得る。
図3aは、安定化モジュールの例を例示する。チューブクランプ5kは、フィルタユニット4aを介して図1に例示されるように、若しくはフィルタユニット4cを介して図2aに例示されるようにコンテナ1aの内容物が、又はフィルタユニット8aを介して図2bに例示されるように、若しくはフィルタユニット9aを介して図2cに例示されるようにコンテナ7aの内容物が、安定化モジュールのコンテナ10aに移されることを可能にする。安定化モジュールのコンテナ10aは、使用及び/又は輸送中にコンテナ10aを支持するための吊り下げ孔10bを有する。コンテナ10aは、チューブ10e又は10fからの移送の一部として発生し得る損失を低減するために、コンテナ7aの内部表面上に丸みを帯びた縁10cを有し得る。チューブ10eは、コンテナ10aの内容物がコネクタ10hを介して引き込まれることを可能にする。チューブ10fは、滅菌スパイクが無菌カバー10gを介して導入されることを可能にして、コンテナ10aの内容物が引き込まれることを可能にする可撓性膜を含有する。
図3bは、安定化モジュールの別の実施形態を例示する。チューブクランプ5lは、フィルタユニット4aを介して図1に例示されるように、若しくはフィルタユニット4cを介して図2aに例示されるようにコンテナ1aの内容物が、又はフィルタユニット8aを介して図2bに例示されるように、若しくはフィルタユニット9aを介して図2cに例示されるようにコンテナ7aの内容物が、安定化モジュールのコンテナ11aに移されることを可能にする。安定化モジュールのコンテナ11aは、使用及び/又は輸送中にコンテナ10aを支持するための吊り下げ孔11bを有する。コンテナ10aは、チューブ11fからの移送の一部として発生し得る損失を低減するために、コンテナ7aの内部表面上に丸みを帯びた縁10cを有し得る。チューブクランプ5mは、培地3cが滅菌フィルタ2cを介して可撓性コンテナ11aに入ることを可能にする。チューブクランプ5nは、チューブクランプ5o、5p、5q、5r、5s、及び5tの開放又は閉鎖状態に応じて、コンテナ11aの内容物が凍結保存コンテナ12aのうちの1つに入ることを可能にする。チューブクランプ5o、5p、5q、5r、5s、及び5tは、コンテナ11aの内容物が、凍結保存コンテナ12aのうちの1つに入ることを可能にする。チューブ11dは、コンテナ11aが、フィルタユニット4aを介して図1に例示されるように、若しくはフィルタユニット4cを介して図2aに例示されるようにコンテナ1aの内容物を、又はフィルタユニット8aを介して図2bに例示されるように、若しくはフィルタユニット9aを介して図2cに例示されるようにコンテナ7aの内容物を受容することを可能にする。チューブ11eは、凍結保存培地3cがコンテナ11a内に移されることを可能にする。チューブ11fは、コンテナ11aの内容物が凍結保存コンテナ12aに移されることを可能にし、単一細胞懸濁液としての最終的な脱凝集UTIL産物が、急速増殖プロセスにおける将来の使用のために保存される。凍結保存コンテナ12aは、凍結保存コンテナ12aからのTILの無菌移送を可能にするための固定具12bを有する。凍結保存コンテナ12aは、保存されるUTIL細胞懸濁液の体積に好適である空間12cを有する。凍結保存コンテナ12aはまた、チューブ11fを凍結保存コンテナ12aに溶着するための標的場所12dを有する。
図4は、デバイス及びキットの別の例を例示する。ペグ13aは、培地3a、3b、及び3cが吊り下げられることを可能にする。ペグ13bは、コンテナ1aを吊り下げるための重量センサに接続され、利用される実施形態に応じて、コンテナ7a、10a、及び/又は11aのうちの1つ以上を含み得る。重量センサは、材料の自動処理を制御する決定段階を定義するために使用される。コンテナ1a内への切除固形腫瘍組織の導入後に、熱溶着装置13cが、コンテナ1aを標的部位で封止するために使用され得る。脱凝集モジュール13dは、脱凝集を可能にするために閉鎖及び係止され得る開口部を有し、消化酵素が固形腫瘍組織の脱凝集に使用される消化を可能にするために、温度を1℃の公差で0℃~40℃であるように制御し得る。脱凝集モジュール13dはまた、時間に対する光分布の変化を決定して、変化を識別し、それによって、数秒から数時間の期間にわたって発生する脱凝集プロセスの完了を識別することによって、固形組織分解のレベルを評価するための内蔵センサを有する。脱凝集モジュール13dはまた、コンテナ1aと直接接触し、脱凝集モジュール13dの筐体の背面に押し付ける、脱凝集表面13fを含み得、これは、酵素が利用される脱凝集及び消化の間に閉鎖及び係止され得る。最終製剤モジュール13eは、利用される実施形態に応じて、コンテナ10a又は11aのいずれかの温度制御を可能にする筐体を有し、これは、0℃~周囲環境温度の温度を1℃の公差に制御することができる。チューブクランプ13g及び13jは、チューブロケータ13i内に配設されて、入力ポート及び出力ポートとして作用し、利用される実施形態に応じて、コンテナ1a、10a、又は11aの間の脱凝集腫瘍産物の輸送を容易にする。蠕動チューブポンプ13hは、入力及び出力ポートとして作用するチューブクランプ13gと13jとの間の培地3a又は3cの移送を制御する。チューブ弁13kは、図2b及び図2cに例示されるように、濃縮モジュール内の弁8c及び9cを介して圧力を制御することを支援する。ペグ13lは、利用される実施形態に応じて、廃棄物コンテナ6a及び/又は凍結保存コンテナ12aの吊り下げを可能にする。実施形態はまた、図3bに例示されるように、凍結保存コンテナ12aをデバイスに接続するのに必要なチューブ溶着装置13mを含み得る。実施形態はまた、図3bに例示されるように、凍結保存コンテナ12aをデバイスに接続解除するためのチューブカッター13nを含み得る。コントロールレート冷却モジュール13oは、凍結保存プロセスを支援するために、8℃~少なくとも-80℃の間の任意の温度で冷却又は維持することができる。
本発明の方法は、以下のプロセスに従って例示される。方法の本質的な特徴以外に、本明細書に列挙される様々な任意選択のステップが独立して組み合わせられて、達成されるサンプリングのタイプ及び結果と関連付けられた関連する技術的利点を達成し得ることが明確に記載されている。
半自動無菌組織処理方法は、任意選択的に本明細書に説明されるキットに従って、無菌処理キット上のデジタルタグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及び1つ以上の更なる組織処理ステップ、並びにそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、無菌処理キットの可撓性プラスチックコンテナ内に組織試料を配置することと、脱凝集モジュール、任意選択の濃縮モジュール、及び安定化モジュールと通信して制御することによって、1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、を含む。
本質的に、プロセスは、生検/組織試料、好ましくは、切除腫瘍を受容することになる開放端バッグ(脱凝集モジュールの一部である第1の可撓性コンテナ)を得ることを含み得、これは、以下のコンテナに、1つ以上の導管を介して既に接続されているか、又は手動オペレータ制御無菌接続を介して接続され得る。
I.消化培地(脱凝集モジュールの一部である第2の可撓性コンテナ)を有し、安定化溶液を有するか、又は有しない(安定化モジュールの一部でもある同じ第2の可撓性コンテナ)単一のコンテナ
II.消化溶液を有する1つのコンテナ(脱凝集モジュールの一部である第2の可撓性コンテナ)、及び安定化溶液を有する別のコンテナ(安定化モジュールの一部である第4の可撓性コンテナ)
生検の追加及び開放端バッグの封止において、消化培地は、導管又は無菌接続(導管/ポート、請求項1)を介して追加され得、組織材料が処理される。
ここで、組織が単一又は少数の凝集細胞懸濁液である時点の消化の完了時、細胞は、任意選択的に、ステップ4の前に濾過され得る(濾過のための任意選択の濃縮モジュールは、試料を含有する第1の可撓性コンテナを含み、濃縮された濾液を受容するための第3のコンテナに濾過される)。
安定化培地が同一の可撓性コンテナ内に存在しない場合、安定化溶液を有するコンテナが、取り付けられた導管又は競合する手動オペレータ制御無菌接続を開放することによって追加され、開放される該接続は、両方の場合において、プロセスが継続する前に安定化溶液が追加されることを可能にする。
元の可撓性コンテナ内の、又は任意選択的に複数の保存安定化コンテナに細分化され得る、単一又は少数の凝集細胞懸濁液は、その後、デバイス上で安定状態に維持される、並びに/又は、除去、輸送、保存、及び/若しくはそれらの最終的な利用における使用の前に、凍結保存を受けることになる。安定化モジュールはまた、保存/凍結/保存で使用される第1又は第3のコンテナを含む。
プロセスの1つの更なる非限定的な例では:
a)必要な組織材料(本発明の一部ではない)を収集するための生検又は外科手術などの別個の手順による組織試料の採取は、初期可撓性プラスチックコンテナ(例えば、図1のコンテナ1a参照)内に配置される。
b)本発明の以下の例のうちの1つ以上を使用する脱凝集前に、培地(例えば、図1の培地3a参照)が脱凝集チャンバ内に移されるか、又は一例では、酵素(例えば、図1の酵素3b参照)を入れて収集することも行って、重量センサなどの機構(例えば、図1のモジュール13dの一部としての13b参照)が、直接的なオペレータ入力又は固形組織の重量のいずれかによって決定される、追加する必要な培地の量を評価する。
c)単回使用の可撓性脱凝集コンテナ、固形組織、培地、及び一例では、酵素は、物理的脱凝集プロセス中に、視覚的な変化がなくなるまで、固形組織を分解するのに必要な1~10分の最適な時間を含む、最小で数秒間、最大で数時間、組み合わせられる(図5及び表1参照)。脱凝集デバイスは、脱凝集モジュール内のセンサ(図1、13d参照)を介して脱凝集及びフィードバックにかかる時間に応じて、可変の速度及び時間を使用して組織を圧縮するように設計される。
d)酵素が存在する一実施形態では、これは、30℃~37℃の最適温度におけるインキュベーション期間を必要とするが、少なくとも1分~数時間の間、0℃~40℃程度に低くてもよいが、より好ましくは15~45分である。
e)ステップc、及び組織が変化を停止するか、又は参照例が液体細胞懸濁液に脱凝集されるかのいずれか一方が起こるまで、酵素ステップd)が繰り返され得る実施形態では、脱凝集モジュール脱凝集モジュールのセンサによって監視される(図1、13d参照)。
f)一実施形態では、不完全に脱凝集された組織では、関連材料及び不純物が除去され、以下の実施形態のうちの1つ以上を使用して、脱凝集組織及び培地を通過させることによって細胞懸濁液の濃縮を可能にする。
i. 少なくとも>0.1μm~1000μm、ただし、最も好ましくは50~250μm、より好ましくは100μm~200μmの孔を有する、1つ以上の機械的フィルタの直接通過(図2aに例示される)。
ii. 細胞整列密度保持溶液(例えば、Ficoll-paque GE Healthcare)を有するか、又は有していない、遠心分離及び/又は沈殿を使用する密度ベースの分離。
iii. 流体流と流れを遮る材料が、サイズ及び形状に基づいて細胞及び不純物の分解及び分画を増強する、流体力学的濾過
iv. 適用された場(例えば、流れ、電気、重力、遠心力)が、選択流(例えば、接線流濾過、中空繊維流濾過、非対称流濾過、遠心流濾過)に対して垂直又は逆方向に作用する、流動場分離法。その場合、力に最も応答する細胞又は不純物は、流れが最低、したがって長い保持時間である壁に駆動されるが、一方で、力に最も応答しない細胞又は不純物は、流れに対して層状のままであり、迅速に溶出する(図2b及び図2cに例示される接線流濾過)。
v.細胞又は不純物の集団に合わせて調整された、又はそれらと調和した1つ以上の音響周波数が、必要な細胞又は不純物を入力流への接線経路で駆動するために使用される、音響電気泳動。
g)一実施形態では、脱凝集濃縮組織産物は、例えば、以下に挙げられる新鮮な培地中で再懸濁されることになる(培地3aを使用する図2a)。
i.上記に説明された、独立した標的化濃縮手順を実施するための細胞濃縮培地
ii.直接的な細胞培養又は低温保存培地(BioLife Solutions製のHypoThermosol(登録商標)など)。
h)g)再懸濁された脱凝集固形組織由来産物が、その最終的な利用に使用される前の数時間から数日間の保存のために、実施形態の最終産物コンテナ(図3aに例示される)のうちの1つに移される。
i)そうでなければ、ステップf)の後、実施形態の適用(図3bに例示される)は、脱凝集固形組織由来産物が抗凍結剤(図3b、培地3c)中で再懸濁を受ける場合、BioLife Solution製のCryoStor(登録商標)凍結溶液などの、脱凝集固形組織由来産物の数日から数年間の保存のための凍結溶液(図3b、培地3c)を適用することになる。
j)この段階で、脱凝集固形組織由来産物は、凍結溶液(図4、モジュール13e)中に再懸濁され、1つ以上の可撓性凍結保存コンテナ(図3a、コンテナ12aに例示される)に移され、デバイスの一実施形態では、コントロールレート凍結プロセス(図4、モジュール13o)がある。
k)その後、バッグは、独立した保存又は分布のために、デバイス及び無菌処理キットから分離され得る。
a)必要な組織材料(本発明の一部ではない)を収集するための生検又は外科手術などの別個の手順による組織試料の採取は、初期可撓性プラスチックコンテナ(例えば、図1のコンテナ1a参照)内に配置される。
b)本発明の以下の例のうちの1つ以上を使用する脱凝集前に、培地(例えば、図1の培地3a参照)が脱凝集チャンバ内に移されるか、又は一例では、酵素(例えば、図1の酵素3b参照)を入れて収集することも行って、重量センサなどの機構(例えば、図1のモジュール13dの一部としての13b参照)が、直接的なオペレータ入力又は固形組織の重量のいずれかによって決定される、追加する必要な培地の量を評価する。
c)単回使用の可撓性脱凝集コンテナ、固形組織、培地、及び一例では、酵素は、物理的脱凝集プロセス中に、視覚的な変化がなくなるまで、固形組織を分解するのに必要な1~10分の最適な時間を含む、最小で数秒間、最大で数時間、組み合わせられる(図5及び表1参照)。脱凝集デバイスは、脱凝集モジュール内のセンサ(図1、13d参照)を介して脱凝集及びフィードバックにかかる時間に応じて、可変の速度及び時間を使用して組織を圧縮するように設計される。
d)酵素が存在する一実施形態では、これは、30℃~37℃の最適温度におけるインキュベーション期間を必要とするが、少なくとも1分~数時間の間、0℃~40℃程度に低くてもよいが、より好ましくは15~45分である。
e)ステップc、及び組織が変化を停止するか、又は参照例が液体細胞懸濁液に脱凝集されるかのいずれか一方が起こるまで、酵素ステップd)が繰り返され得る実施形態では、脱凝集モジュール脱凝集モジュールのセンサによって監視される(図1、13d参照)。
f)一実施形態では、不完全に脱凝集された組織では、関連材料及び不純物が除去され、以下の実施形態のうちの1つ以上を使用して、脱凝集組織及び培地を通過させることによって細胞懸濁液の濃縮を可能にする。
i. 少なくとも>0.1μm~1000μm、ただし、最も好ましくは50~250μm、より好ましくは100μm~200μmの孔を有する、1つ以上の機械的フィルタの直接通過(図2aに例示される)。
ii. 細胞整列密度保持溶液(例えば、Ficoll-paque GE Healthcare)を有するか、又は有していない、遠心分離及び/又は沈殿を使用する密度ベースの分離。
iii. 流体流と流れを遮る材料が、サイズ及び形状に基づいて細胞及び不純物の分解及び分画を増強する、流体力学的濾過
iv. 適用された場(例えば、流れ、電気、重力、遠心力)が、選択流(例えば、接線流濾過、中空繊維流濾過、非対称流濾過、遠心流濾過)に対して垂直又は逆方向に作用する、流動場分離法。その場合、力に最も応答する細胞又は不純物は、流れが最低、したがって長い保持時間である壁に駆動されるが、一方で、力に最も応答しない細胞又は不純物は、流れに対して層状のままであり、迅速に溶出する(図2b及び図2cに例示される接線流濾過)。
v.細胞又は不純物の集団に合わせて調整された、又はそれらと調和した1つ以上の音響周波数が、必要な細胞又は不純物を入力流への接線経路で駆動するために使用される、音響電気泳動。
g)一実施形態では、脱凝集濃縮組織産物は、例えば、以下に挙げられる新鮮な培地中で再懸濁されることになる(培地3aを使用する図2a)。
i.上記に説明された、独立した標的化濃縮手順を実施するための細胞濃縮培地
ii.直接的な細胞培養又は低温保存培地(BioLife Solutions製のHypoThermosol(登録商標)など)。
h)g)再懸濁された脱凝集固形組織由来産物が、その最終的な利用に使用される前の数時間から数日間の保存のために、実施形態の最終産物コンテナ(図3aに例示される)のうちの1つに移される。
i)そうでなければ、ステップf)の後、実施形態の適用(図3bに例示される)は、脱凝集固形組織由来産物が抗凍結剤(図3b、培地3c)中で再懸濁を受ける場合、BioLife Solution製のCryoStor(登録商標)凍結溶液などの、脱凝集固形組織由来産物の数日から数年間の保存のための凍結溶液(図3b、培地3c)を適用することになる。
j)この段階で、脱凝集固形組織由来産物は、凍結溶液(図4、モジュール13e)中に再懸濁され、1つ以上の可撓性凍結保存コンテナ(図3a、コンテナ12aに例示される)に移され、デバイスの一実施形態では、コントロールレート凍結プロセス(図4、モジュール13o)がある。
k)その後、バッグは、独立した保存又は分布のために、デバイス及び無菌処理キットから分離され得る。
更なる実施形態では、本発明の使い捨てキットは、組織試料の半自動無菌処理のための自動デバイスとともに使用され得る。図6及び図7は、本発明の使い捨てキットを図示する。
図6は、脱凝集及び安定化に使用されるプロセスのモジュールの一部である、異なる出発溶液用の複数の可撓性コンテナを使用する、半自動無菌組織処理方法を図示する。
プロセスステップ1-ユーザは、デバイスにログインし、デバイスを使用して無菌キット上のタグをスキャンして、使用される自動処理ステップを転送する。デバイスプロセッサは、タグを認識し、その特定のキットに関連する特定の処理命令を実施するために必要な情報を提供する。
プロセスステップ2-消化培地収容可撓性バッグ(脱凝集モジュールの一部)及び凍結/安定化溶液収容可撓性バッグ(安定化モジュールの一部)は、各々、デバイスに吊り下げられるか、又は固設される。
プロセスステップ3-処理のための生検又は組織試料は、開放端を介して、無菌キットの可撓性コンテナ(両方のモジュールの一部)内に配置され得る。
プロセスステップ4-試料を含む可撓性コンテナは、次いで、開放端(初期処理中に試料を添加するために使用される)を閉鎖するために熱溶着を使用して封止され得る。
プロセスステップ5-次いで、ユーザは、プロセッサのユーザインターフェースと相互作用して、組織試料が存在することを確認し、必要に応じて、任意の更なる組織材料固有情報を入力し得る。
プロセスステップ6-消化培地及び凍結/安定化溶液の可撓性コンテナは、試料を収容する可撓性コンテナと接続され、その後、自動処理のためにデバイス内に配置され得る。
プロセスステップ7-デバイスは、試料の脱凝集及び結果として生じる細胞の安定化/凍結保存を行うキット情報に従ってサイクルを実行する。
プロセスステップ8-安定化/凍結されたとき、キットの使用済み培地及び凍結/安定化コンテナを接続解除して廃棄する。可撓性コンテナ内の単一又は複数の細胞溶液に処理された組織は、その最終的な利用の前に、保存又は輸送コンテナに移す前に接続解除される。
別の実施形態では、図7は、無菌処理キットのモジュールと方法との間で共有され得るプロセスで使用される培地を含む可撓性コンテナを図示する。
プロセスステップ1-ユーザは、デバイスにログインし、デバイスを使用して無菌キット上のタグをスキャンして、使用される自動処理ステップを転送する。
プロセスステップ2-培地及び凍結/安定化溶液の両方を含む可撓性バッグ(脱凝集/安定化モジュールの一部)が、デバイスに吊り下げられるか、又は別様に固設される。
プロセスステップ3-処理のための生検又は組織試料は、開放端を介して、無菌キットの更なる可撓性コンテナ(両方のモジュールの一部)内に配置され得る。
プロセスステップ4-試料を含む可撓性コンテナは、次いで、開放端を閉鎖するために熱溶着を使用して封止され得る。
プロセスステップ5-次いで、ユーザは、プロセッサのユーザインターフェースと相互作用して、組織試料が存在することを確認し、必要に応じて、任意の組織材料固有情報を入力し得る。
プロセスステップ6-消化培地及び凍結/安定化溶液の可撓性コンテナは、試料を収容する可撓性コンテナと接続され、その後、自動処理のためにデバイス内に配置され得る。
プロセスステップ7-デバイスが、任意選択的に凍結保存を介して、試料の脱凝集及び結果として生じる細胞の安定化を可能にするようにサイクルする。
プロセスステップ8-凍結/安定化が完了したとき、ユーザは、キットの使用済み可撓性コンテナを接続解除して廃棄する。残りの可撓性コンテナ内の単一又は複数の細胞溶液に処理された組織は、その最終的な利用の前に、保存又は輸送コンテナに移す前に接続解除される。
例として、本発明の方法の別の実施形態では、脱凝集プロセスが酵素消化で補充される場合、酵素消化のための培地製剤は、上記に説明されるように細胞間境界を分解させるタンパク質分解を補助する酵素を補充されなければならない。
限定されるものではないが、臓器保存液、選択的溶解溶液、PBS、DM EM、HBSS、DPBS、PM I、イスコフ培地、XVIVO(商標)、AIM-V(商標)、乳酸リンゲル溶液、リンゲル酢酸塩、生理食塩水、PLASMALYTE(商標)溶液、結晶性溶液及びIV液、コロイド溶液及びIV液、5%デキストロース水溶液(D5W)、ハルトマン溶液、DM EM、HBSS、DPBS、RPMI、AIM-V(商標)、イスコフ培地、XVIVO(商標)を含む、細胞培養又は細胞取り扱いの技術分野で公知の様々な液体製剤が、固形組織の細胞脱凝集及び酵素消化に使用される液体製剤として使用され得、各々は、追加の細胞支持因子、例えば、胎児仔血清、ヒト血清若しくは血清代替物、又は細胞回収及び生存若しくは特異的細胞枯渇を補助するための他の栄養素若しくはサイトカインを任意選択的に補充され得る。培地は、上述の培地のような標準細胞培地、又は、例えば、初代ヒト細胞培養(例えば、エンドテリア細胞、肝細胞、若しくはケラチノサイト)又は幹細胞(例えば、樹状細胞成熟、造血増殖、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、若しくはT細胞)用の特殊培地であってもよい。培地は、当該技術分野で周知のサプリメント又は試薬、例えば、アルブミン及び輸送タンパク質、アミノ酸及びビタミン、金属イオン、抗生物質、接着因子、脱接着因子、界面活性剤、成長因子及びサイトカイン、ホルモン、又は可溶化剤を有し得る。様々な培地が、例えば、ThermoFisher、Lonza、若しくはSigma-Aldrich、又は類似の培地製造業者及び供給業者から市販されている。
酵素消化に必要な液体製剤は、少なくとも0.1mMから最大50mM、2~7mM、理想的には5mMの最適範囲で存在する十分なカルシウムイオンを有していなければならない。
消化される固形組織は、酵素消化の前にEDTA及びEGTAを洗浄及び除去する前に、接着因子及び阻害タンパク質を除去するために、キレート剤EGTA及びEDTAを含有する液体製剤による脱凝集後に洗浄され得る。
酵素消化に必要な液体製剤は、最小限のキレート剤EGTA及びEDTAでより最適であり、これは、酵素安定性及び活性に必要なカルシウムイオンを除去することによって酵素活性を重度に阻害し得る。加えて、b-メルカプトエタノール、システイン及び8-ヒドロキシキノリン-5-スルホン酸塩は、他の既知の阻害物質である。
好ましい実施形態に説明されるように、凍結保存用の最終的な細胞コンテナは、弾性変形可能な材料から製造された可撓性コンテナである。デバイスのこの実施形態では、最終コンテナが、-20~-190℃の冷凍庫に直接移されるか、又はデバイスと関連付けられるか、若しくは別個に供給される(例えば、Planer Products又はAsymptote Ltdによって製造される)コントロールレート凍結装置内により最適に位置し、濃縮された脱凝集固形組織コンテナを含有するために採用された凍結チャンバ及び可撓性保管コンテナの温度は、低温ガス(通常、窒素、例えば、Planer products)を注入することによって、又は制御された冷却表面から熱を除去することによって、制御される。両方の方法は、凍結溶液及び産物の所望の生存率に基づいて、凍結される特定の細胞に必要な速度で、1℃未満又はより好ましくは0.1℃の凍結プロセスの誤差で正確に制御する能力を結果的にもたらす。この凍結保存プロセスは、氷核形成温度を考慮に入れなければならず、氷核形成温度は、理想的には、凍結溶液の融解温度に可能な限り近い温度である。水溶液中の結晶成長に続いて、水が氷として系から除去され、残留する非凍結溶液の濃度が増加する。温度が低下すると、より多くの氷が形成され、残留する非凍結画分が減少し、濃度が更に増加する。水溶液には、氷が濃縮水溶液と共存する、大きな温度範囲が存在する。最終的に、温度低下を通じて、溶液は、ガラス転移状態に到達し、その時点で、凍結溶液及び細胞は、粘性溶液から、この温度を下回る固体様状態に移動するが、細胞は、更なる生物学的変化を経ず、それゆえ、必要になるまで数十年間にわたって安定化される。
本発明の方法によって達成される脱凝集細胞産物は、当業者に公知の全ての方法に従って、培養及び/又は解析(特徴解析)され得る。
本明細書に開示される方法によって取得可能なTILは、当業者に公知の研究、診断、組織バンク、バイオバンク、薬理学的又は臨床用途などの、後続のステップに使用され得る。次いで、TILは、本用途に最適化された培地、例えば、通常、限定されるものではないが、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21などの成長因子、又は抗体でコーティングされたプレート若しくはポリスチレンビーズなどの刺激条件を含有する、T細胞混合培地(Cellular Therapeutics)を使用して培養物中に取り込まれ得る。本発明では、単離された細胞を培養コンテナ内に播種し、1~40℃、通常37℃の温度で、加湿雰囲気(1~20%、通常5%のCO2、80~99%、通常95%の空気)などの当業者によって標準的に使用される手順を使用して数週間維持し、サプリメントが添加され、10%のFBS及び3000IU/mLのIL-2を補充され得る。
濃縮されたTILは、療法、例えば、細胞療法、又は疾患の予防における医薬組成物として、細胞培養の前及び/又は後に使用され得る。医薬組成物は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の治療及び/又は予防に使用され得、これは、哺乳動物への薬学的有効量の医薬組成物の投与を含む可能性がある。
そのようなTIL培養物は、様々ながんの治療のための医薬品として製剤化されることに加えて、例えば、細胞機能、腫瘍細胞死滅、細胞シグナル伝達、バイオマーカー、細胞経路、核酸、及びドナー、組織、細胞又は核酸の状態を識別するために使用され得る他の細胞又は組織関連因子を研究するために使用され得る。
疾患は、固形組織由来細胞の存在を通じて、及び/又は関連する場所、すなわち、腫瘍又は疾患の部位における関連する細胞の濃度を増加させることを通じて、治療及び/又は予防され得る、任意の疾患であり得る。治療及び/又は予防的に治療される疾患は、例えば、がん又は変性障害などの任意の障害であってもよい。治療は、濃縮細胞、操作細胞、若しくは増殖細胞、又はこれらの任意の組み合わせの移植であってよく、身体の関連する部位に投与されるか、又は全身的に供給され得る。
本開示の医薬組成物は、治療される(又は予防される)疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子によって決定されることになるが、適切な用量は、臨床試験によって決定され得る。
本明細書に説明されるように、本発明は、特に哺乳動物組織における組織などの材料の受け取り、処理、保存、及び/又は単離を可能にするキットを提供する。更に、本発明は、可撓性コンテナ、例えば、バッグ、フィルタ、弁、ブラケット、クランプ、コネクタ、及び/又はチューブなどの導管などの、キットの構成要素を提供する。特に、バッグは、凍結保存キットの様々な構成要素間の組織材料の流れを可能にするように適合された、1つ以上のチューブ又はチューブの区分に結合され得る。
凍結保存キット及び/又は収集バッグを使用した細胞への組織の処理は、自動及び/又は半自動のデバイス及び方法を含み得る。
更に、当該技術分野の通常の知識とともに本明細書に説明されるバッグ、キット、デバイス、及びプロセスを利用することによって、本開示の更なる実施形態が容易に識別され得る。当業者であれば、既知の変形を容易に理解するであろう。
意匠特許出願第29/740,293号は、組織収集に好適な組織収集バッグを提供する。本発明の組織収集バッグの上部は、組織、例えば、動物(例えば、イヌ若しくはネコなどの家畜)又はヒトがん組織などの組織生検を受容するために開放されている。組織収集バッグは、その中に収集された組織を有して封止され、その中で処理される、その中にそのように封止された組織に対して、例えば、処理は、攪拌及び/若しくは圧縮、例えば、その中の組織の穏やかな攪拌及び/若しくは圧縮、並びに/又は酵素消化を含み得る。有利には、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの所望の材料からの内部の組織処理及び抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を示すための印、及び/又は収集バッグが、攪拌を適用するための器具においてクランプ若しくは固定され得る場所を示すための印、及び/又は収集バッグが、例えば、ヒートシールによって封止され得る場所を示す印(処理のための器具の一部であり得る)を含み得る。有利には、処理の適用前に、収集バッグは、処理及び/又は封止、例えば、ヒートシールのために、器具にクランプ又は固定される。特定の例示では、チューブは、必ずしも本発明の設計の一部とみなされないことを示すために、点線又は点刻で示され得るが、特定の実施形態では、本発明の設計の一部とみなされてもよい。点線又は点刻は、チューブが存在してもよく、又は存在しなくてもよいと解釈され、一方又は両方として主張されてもよく、すなわち、図面全体を通して、チューブが本発明の設計の一部を形成してもよい(また、必ずしも本発明の設計の一部ではない場合もある)。加えて、特定の例示は、印なし、試料が得られた患者を示し得る印、試料が得られた患者及び組織収集バッグが器具にクランプ又は固定され得る場所を示す印、並びに試料が得られた患者、組織収集バッグが器具内にクランプ又は固定され得る場所、及び組織収集バッグが封止、例えば、ヒートシールされる場所を示し得る印を示すが、本発明の設計が、その変形例を含み得ること、例えば、本発明の設計は、試料が得られた患者及び組織収集バッグがヒートシールされ得る場所を示す印を含むが、組織収集バッグが器具にクランプ又は固定され得る場所を示す印なしでもよく、本発明の設計は、組織収集バッグがヒートシールされ得る場所を示し得る印、及び/又は組織収集バッグが器具内にクランプ若しくは固定され得る場所を示し得る印を含み得るが、試料が得られた患者を示す印なしでもよい(患者の印が、使用される際に組織収集バッグ上に印字され得、それに対して、クランプ若しくは固定、又はヒートシールに関する印が、使用開始前に組織収集バッグ上に既に存在し得る場合を含む)ことが理解されるべきである。任意の関連付けられたチューブを含む組織収集バッグは、略クリア、透明、若しくは半透明、又は望ましい任意の色とすることができる。任意の関連付けられたチューブを含む組織収集バッグは、概して、閉鎖又は封止された、血液収集、組織培養、バイオプロセス、又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似の方式で製作され得る。本発明における関連付けられたチューブは、溶着及び/若しくは封止に有利である所望の材料と同等の、ポリ塩化ビニル(PVC)又はPVCを含む材料を含む、任意の所望の材料から構築され得る。組織を受容するための本発明の組織収集バッグの一部分は、ヒートシールに有利である所望の材料と同等の、エチレンビニルアセテート(EVA)又はEVAを含む材料を含む、任意の所望の材料から作製され得る。
図11Aに示されるように、組織を処置する、例えば、組織の脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のためのキット2の実施形態。治療される組織は、固形真核性の、特に、試料及び/又は生検からの組織などの、哺乳動物組織を含み得る。キット2は、収集バッグ4及び凍結保存バッグ6などの、バッグ4、6などの構成要素を含む。図11A~図11Dに図示されるキットは、治療のための自動又は半自動デバイスで使用され得る。
いくつかの実施形態では、キット構成要素は、本発明の実施形態における自動デバイス内などの自動及び/又は半自動治療中にスキャン及び認識され得るように、コード、文字、単語、名称、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイックレスポンス(QR)コード、スマートトラッカー及び/若しくはBluetooth(登録商標)トラッカーなどのトラッカー、無線周波数タグなどのタグ、並びに/又は他のデジタル認識可能な識別タグなどの、インジケータを含み得る。例えば、タグは、自動的に治療されるために必要な条件及び/又はステップについての情報を提供し得る。例えば、バッグなどのキット構成要素をスキャンすることは、キットとともに使用される自動システムが、更なる介入及び/又は汚染なしで組織を治療することを可能にし得る。特に、デバイスの脱凝集要素における治療のために収集バッグ内に配置された組織試料。収集バッグは、治療開始前に封止され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグは、治療開始前に、熱、無線周波数エネルギー、高周波(HF)エネルギー、誘電体エネルギー、及び/又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーを使用して手動及び/又は自動で封止され得る。
いくつかの実施形態では、加熱バーのバーを有するヒートシーラー(例えば、Van der Staehl MS-350、Uline H-190 Impulse Sealer、又は当該技術分野で公知の類似のシーラー)は、バッグ上の封止を作成するために使用され得る。
特定の実施形態では、ヒートシーラーを使用するとき、それは、約100℃未満、かつ約0.8bar~約2.8barの範囲の圧力で封止を形成するために有利であり得る。この上昇した温度及び圧力は、約8秒間適用され得、その後、温度は、低下し得るが、いくつかの実施形態では、圧力は、約2~3秒間適用され続ける。温度、圧力、及び時間の値は、バッグを形成する材料、特に封止を形成する材料の配合に基づいて変化することになる。例えば、別の材料は、シーラーが約210°F(98.9℃)を上回る温度に最短で約3秒間で到達することを必要とし得、その後、加熱バーは、加熱バーを取り外す前に5秒間冷却することを可能にされ得る。
封止される材料の位置付けは、形成された封止の強度にとって重要であり得る。例えば、封止される材料の不完全な封止、折り目、チャネル、及び/又は間隙は、封止の強度を低減させ得る。
封止は、シールピール試験(すなわち、ASTM F88/F88M)、及び/又は破裂試験(すなわち、ASTM F1140/F1140M若しくはASTM F2051/F2054M)を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に100ニュートンの力に耐え得、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に75ニュートンの力に耐えて、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
図11Aに示されるように、キット2は、収集バッグ5が処理され得る脱凝集要素4、フィルタ9が位置し得る濃縮要素8、及び凍結保存バッグ7が所望の材料を保存するために使用される安定化要素6を含む。収集バッグ5などのキット2の構成要素では、組織が治療される。例えば、収集バッグ5は、真核細胞に由来する固形組織の脱凝集に使用され得る。組織は、処理後の結果として生じる組織の大部分が単一細胞及び/又は小数の細胞凝集体であり得るような様式で治療され得る。更に、処理は、特に、キット及び/又は収集バッグ内で行われ得る。
治療された組織の濃縮は、フィルタ9の濃縮要素8で行われ得る。フィルタ9は、チューブ11に入る濾過された組成物(すなわち、所望の材料)が、所定のサイズを有する成分を有し得るように選択され得る。フィルタ9は、チューブ11に入る所望の材料組成物が、約200μm未満の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの成分を有し得るように選択され得る。例えば、一実施形態では、所望の材料は、約170μm未満の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含み得る。
いくつかの実施形態では、所望の材料は、約15μm~約500μmの範囲内の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含み得る。例えば、フィルタ9は、一実施形態では、チューブ11に入る組織組成物が、約200μmの平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。特に、濾過後にフィルタを出てチューブ11に入る所望の材料は、約170μm未満の平均サイズを有する成分を有し得る。
いくつかの実施形態では、フィルタ9は、チューブ11に入る濾過された組成物が、約50μm~約300μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタ9は、一実施形態では、チューブ11に入る組織組成物が、約150μm~約200μmの範囲の平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。
図11Aに示されるように、組織を治療するためのシステムの安定化要素6は、凍結保存バッグ7が保存及び/又は輸送のために組織組成物を安定化するために使用され得る場所にある。
図11Bは、弁12、13を有するキット2を図示する。弁は、無針弁であってもよい。弁12、13は、腫瘍消化培地、抗凍結剤、及び/又は凍結保存培地などの、酵素培地を提供するために使用され得る。特に、弁12は、酵素培地をチューブ10に提供するために使用され得る。酵素培地は、収集バッグ4に移動して、バッグ5内に配置された組織の処理を補助し得る。
弁13は、DMSO溶液が凍結保存バッグ7に移動し得るように、DMSO溶液などの抗凍結剤をチューブ11に提供するために使用され得る。いくつかの実施形態では、DMSO溶液などの抗凍結剤は、DMSO溶液と濾過された材料との合わせた組成物が凍結保存バッグ7に入るように、チューブ11に入る濾過された材料と混合し得る。チューブ11に入る濾過された材料は、所定の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、濾過された組成物中の成分の平均サイズは、約200μm未満であり得る。
いくつかの実施形態では、図11Cに示されるように、キット2は、弁12、13を通して提供される材料が、フィルタ9内に流れ込むのを阻止及び/又は防止されることを確保するために、フィルタ9の周りにクランプ14を含む。弁13は、抗凍結剤がフィルタ9からチューブ11に入る濾過された材料と混合し得るように、チューブ11に抗凍結剤を提供するために使用され得る。例えば、クランプ14は、フィルタ9の方向に抗凍結剤の流れを阻止及び/又は防止するように位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、濾過された溶液がフィルタ9から流れ始めた後、クランプ14は、抗凍結剤と濾過された材料との合わせた組成物が安定化要素6で凍結保存バッグ7に入るように解放されることになる。チューブ11に入る濾過された材料は、所定の平均サイズを有する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、濾過された組成物中の成分の平均サイズは、約200μm未満であり得る。
キット2の実施形態は、図11Dに示されるように凍結保存バッグ7上のポート16を含み得る。ポートは、凍結保存バッグ7から材料を添加及び/又は除去するために使用され得る。例えば、試験試料は、凍結保存バッグから除去され得る。
図12Aは、キットで使用するためのバッグ22の実施形態の斜視図を示す。バッグ22は、コネクタ24、開放区分26、封止区分21、及び位置決め部23を含み得る。コネクタ24は、バッグ22をチューブ25に結合するために使用され得る。位置決め部23は、バッグ22の開口部であり得る。
収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。バッグ、例えば、収集バッグ及び/若しくは凍結保存バッグ、並びに/又はチューブは、概して、閉鎖及び/又は封止された血液並びに/又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。
本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、収集バッグを含み、凍結保存バッグは、熱可塑性、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)、例えば、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド(すなわち、OriGen Biomedical EVOフィルム)などのコポリマーなどのブレンド、EVAを含む材料、及び/又は共押出された封止可能なプラスチック層を含み得る。
バッグに使用するための材料は、特定の特性及び/又は特性の選択、例えば、熱溶着に起因する密閉性などの密閉性、無線周波数エネルギーの使用、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性(例えば、-150℃又は-195℃)、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子、特定のガス(例えば、酸素及び/若しくは二酸化炭素)に対する高い透過速度、並びに/又は規制要件の遵守に対して選択され得る。例えば、バッグに使用される材料は、ASTM D-638に概説される引張強度の試験方法に従って試験されたとき、約2500psi(172bar)超の引張強度を有するように選択され得る。特に、バッグなどの可撓性コンテナの実施形態は、ASTM D-638に概説される引張強度の試験方法に従って試験されたとき、約2800psi(193bar)超の引張強度を有する使用材料を有する。
いくつかの実施形態では、材料は、バッグの少なくとも1つの層を形成するために、共押出材料で使用するための特定の特性のために選択され得る。層は、構築されたときに、バッグの内部層が比較的生体適合性である、すなわち、バッグの内面上の材料が安定し、バッグの内容物中に浸出しないように、構築され得る。
例えば、収集バッグ、凍結保存バッグ、及び/又は関連付けられたチューブなどのキット構成要素のための材料を選択するために使用され得る関心対象の特性は、封止、例えば、ヒートシールに関連し得る。
封止は、シールピール試験(すなわち、ASTM F88/F88M)、及び/又は破裂試験(すなわち、ASTM F1140/F1140M若しくはASTM F2051/F2054M)を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に100ニュートンの力に耐え得、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に75ニュートンの力に耐えて、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、特に収集バッグ及び/又は保存バッグの寸法は、治療及び/又は処理を実施するために使用されるデバイスに固有であり得る。バッグサイズは、治療を実施するために使用されるデバイスの構成及び/又はサイズに基づいて調整されるべきである。バッグの境界を越えて延在する任意の構成要素、例えば、ポート、コネクタなどの配置及び/又はサイズには、特別な注意が払われるべきである。ポートなどの構成要素は、治療及び/又は処理を実施するために使用されるデバイスの動作と干渉し得る。更に、特に、製造された封止などの封止材料に関して、バッグの厚さが機械の要件と適合することを確保するように注意が払われるべきである。
本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル(PVC)を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、PVCは、溶着及び/又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、図12A~図12E、図13A~図13E、図14、図20A~図20E、図21A~図21E、図22A~図22D、図27A、図28、図33、及び図34に図示されるように、収集バッグの少なくとも1つの端が、組織を受容するために開放され得る。特に、一実施形態では、例えば、生検からの組織試料は、例えば、上端などの開放端を通してバッグ内に配置され得る。いくつかの事例では、生検試料は、動物(例えば、イヌ又はネコなどの家畜)又はヒトからのがん性組織であってもよい。
図12Aに示されるように、バッグ22は、組織収集バッグとして使用され得る。例えば、組織がバッグ内に位置付けられた後、バッグが封止され、次いで、処理され得る。処理は、例えば、バッグ内の組織の攪拌、例えば、穏やかな攪拌、抽出、及び/又は酵素消化を含み得る。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの所望の材料の組織処理及びそこからの抽出は、閉鎖系におけるものであってもよい。有利な又は好ましい実施形態は、組織が収集された患者を示すためのインジケータ、並びに/又は収集バッグがクランプされる、封止される、デバイスによって作用される、及び/若しくは器具の定位置に固定され得る場所を示すマークを含み得る。
いくつかの実施形態では、バッグ22は、封止可能な材料から形成され得る。例えば、バッグ22は、限定されるものではないが、脂肪族又は半芳香族ポリアミド(例えば、ナイロン)を含む合成ポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)及びそれらのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、熱可塑性ポリウレタン(TPU)、ポリエチレン(PE)などのポリマー、並びに/又はポリマーの組み合わせを含む材料から形成され得る。バッグの部分は、熱、無線周波数エネルギー、高周波(HF)エネルギー、誘電体エネルギー、及び/又は当該技術分野で既知の任意の他の方法などのエネルギーで封止及び/又は溶着され得る。
収集バッグは、処理及び/又は脱凝集バッグとして使用され得る。収集バッグは、約4cm~約12cmの範囲の幅、及び約10cm~約30cmの範囲の幅を有し得る。
例えば、処理で使用するための収集バッグは、約7.8cmの幅及び約20cmの長さを有し得る。特に、バッグは、例えば、EVAポリマー及びそのブレンド、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、並びに/又は1つ以上のポリアミド(ナイロン)を使用して、ヒートシール可能であり得る。
図12Aに図示されるように、バッグ22は、本発明の処理のためにその中に組織を封止するための組織収集バッグとして使用され得る。
図12Bは、組織収集バッグとして使用するためのバッグ22の実施形態の斜視図を示す。組織は、バッグ内に封止され、次いで、処理され得る。図12Bに示されるバッグ22は、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別し得る患者識別子などのインジケータ27、28でマークされ得る。
インジケータとしては、限定されるものではないが、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答(QR)コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはBluetooth(登録商標)トラッカーなどのトラッカー、及び/又は当該技術分野で既知の任意のインジケータが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び/又は接着され得る。例えば、インジケータは、図12Bに示されるように、キットの少なくとも1つの構成要素の表面上に直接印刷され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び/又は複数のバッグ上に配置され得る。例えば、図12Bに示されるように、バッグ22は、複数のインジケータ28(数字コード)、27(QRコード(登録商標))を含む。
図12Cは、組織収集バッグとして使用するためのバッグの斜視図を示す。組織は、処理のためにバッグ22に挿入され得る。インジケータは、組織試料及び/又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するために使用され得る。図12Cに示されるように、インジケータ27、28は、プロセスにおいて試料を追跡する、試料を位置決めする、及び/又は試料の状態を追跡するために使用されるQRコード(登録商標)及び識別番号を含む。例えば、いくつかの実施形態では、インジケータは、実験室の任意の所与の位置で、試料を位置決めするために使用され得る。インジケータは、使用前及び/又は使用中にバッグ上に配置され得、例えば、バッグが試料とともに使用するために取り出されているときに、患者インジケータがバッグ上に印字されてもよい。更に、バッグ22は、マーク29を含み得る。マークは、封止、クランプ、及び/又は器具が位置付けられるべき場所を示すために使用され得る。
インジケータ、例えば、QRコード(登録商標)、スマートタグなどのタグ、及び/又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び/又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。異なるタイプの培地が、これらのプロセスでは、例えば、酵素培地、腫瘍消化培地、及び/又はコントロールレート凍結を可能にし得る凍結保存培地に使用され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キット及び/又はその構成要素は、自動デバイスによって読み取り可能であり得るインジケータを含み得る。次に、デバイスは、そのようなデバイスに挿入されたときに、組織を処理するための特定の完全自動方法を実行し得る。本発明は、試料処理、特に自動処理において特に有用である。
いくつかの事例では、本明細書に説明される凍結保存キット及び/又はその構成要素は、単回使用であり得る。凍結保存キット及び/又はその構成要素は、細胞又は細胞凝集体の脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のための自動及び/又は半自動プロセスで使用され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグなどの凍結保存キットで使用するためのバッグは、いくつかの実施形態では、複数のプロセスに使用され得る。例えば、収集バッグは、異なる場所で繰り返し封止されて、生検試料及び/又は固形組織などの組織試料の処理のための別個の区画を作り出し得る。
更に、バッグが封止され、クランプされ、及び/又は物体に固定され得る場所を示すために、組織収集バッグなどの、バッグ上の様々な場所にマークが配置され得る。いくつかの実施形態では、バッグが、クランプされ、封止され、及び/又は器具などの物体に固定される場所を示すマークは、使用前にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、1つ以上のマークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約2.5mm~約7.5mmの範囲の幅を有し得る。概して、封止140は、組織材料がバッグ140内に配置された後で形成され、約5mmの幅を有し得る。
封止は、シールピール試験(すなわち、ASTM F88/F88M)、及び/又は破裂試験(すなわち、ASTM F1140/F1140M若しくはASTM F2051/F2054M)を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に100ニュートンの力に耐え得、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に75ニュートンの力に耐えて、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び/又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約8秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。8秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の2~3秒間圧力が適用され得る。
図12Dは、本発明の処理のための、内部に組織を封止するための組織収集バッグの実施形態の斜視図を示す。インジケータ27、28は、ユーザが使用中に患者を容易に識別し得るように、バッグ22上に位置付けられる。更に、これらのインジケータは、バッグ内の材料を識別するために、及びバッグ内の材料に対する特定の治療方法の間の進捗を追跡するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、治療中にバッグ内に、約0.1ml~約25mlの範囲の培地の体積、及び約0.1ml~約10mlの範囲の組織の体積を保持する。治療中のバッグ内の組織の体積に対する培地の体積の比率は、約1.0~約2.5の範囲であるべきである。いくつかの実施形態では、組織の体積に対する培地の体積の比率は、約1.7~約2.3の範囲内である。特に、組織の体積に対する培地の体積の比率は、約2.0~約2.2の範囲内である。
図12Dに示されるように、マーク29は、バッグ22の開口端26に近接して位置付けられる。使用中、マーク29は、組織試料及び/又は生検試料を治療するために使用される方法に基づいて、バッグ上に位置付けられ得る。マークは、例えば、使用されるか、若しくは使用されるべき処理方法、及び/又は使用される機器に基づいて、使用中にバッグ上に配置され得る。いくつかの実施形態では、マークは、製造中にバッグ上に位置付けられ得る。例えば、封止及び/又はクランプの場所に対するマークの位置付けは、処理方法及び/又は治療される組織の体積に基づいて変化し得る。
図12Eは、組織収集バッグの斜視図を示す。組織は、バッグ22の処理に封止され得る。コネクタ24は、バッグへのアクセスを提供し得る。示されるように、コネクタ24は、チューブ25を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに接続され得る。ポート20は、使用中、バッグ22から試料を採取する、及び/又はバッグ22から材料を提供するために使用され得る。
図13Aは、組織収集に使用されるバッグの正面図を示す。組織は、使用中にバッグ内に封止され得る。バッグ30は、封止された縁31を有して製造され得る。図13Aに示されるように、封止された縁31は、3つの縁上に位置し得、第4の縁は、開放区分36を含み得る。
バッグ30上の位置決め部33は、バッグを位置付けるために使用され得る。例えば、1つ以上の位置決め部は、バッグが使用中に適切に処置され得る、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するように使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。
図13Bに示されるように、バッグ30は、試料、例えば、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するインジケータを識別するために使用されるインジケータ36、37を有し得る。QRコード(登録商標)などのインジケータ37の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。
図13Cは、組織収集バッグの正面図を示す。組織は、バッグ内に封止され、その中で治療及び/又は処理され得る。バッグ30は、試料、例えば、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するインジケータを識別するために使用されるインジケータ37、38を有し得る。QRコード(登録商標)などのインジケータ37の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。位置決め部33は、治療のためにバッグ30を位置付けるために使用され得る。コネクタ34は、組織、治療された組織などが、チューブ35を通じて他のデバイスに結合することを可能にし得る。
図13Dは、試料を識別するために使用されるインジケータ37、38を有する組織収集バッグの正面図を図示する。QRコード(登録商標)などのインジケータ37の使用は、特定の試料のプロセスステップを追跡することを可能にし得、それにより、所与のプロセスを通して試料を追うことができる。マーク39及び/又は位置決め部33は、処理及び/又は治療中にバッグの位置付けを制御するために使用され得る。使用中にバッグを位置付ける、封止する、及び/又はクランプする場所を示すために、開放端に近接して配置されるマーク。バッグ30は、封止された縁31を有して製造され得る。図13Dに示されるように、封止された縁31は、3つの縁上に位置し得、第4の縁は、開放区分36を含み得る。
図13Eは、組織が内部に配置された後に封止されることができる組織収集バッグの正面図を示す。コネクタ34及びポート32は、バッグへのアクセスを提供し得る。1つ以上のポートは、ポートが培地及び/若しくは試薬の入力並びに/又はバッグからの試料の抽出を可能にするように、収集バッグ上に位置付けられ得る。
示されるように、コネクタ34は、チューブ35を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに結合され得る。マーク及びインジケータは、使用に応じてバッグの1つ以上の側に配置され得る。特に、図13Eの場合に示されるように、位置決め部33、マーク39、及び/又はインジケータ37、38は、攪拌の適用、例えば、ヒートシール(処理のための器具の一部であり得る)による封止、処理及び/又は抽出のための材料の添加などの処理のためにバッグ30を位置付けるために使用され得る。有利には、処理の適用前に、収集バッグは、処理及び/又は封止、例えば、ヒートシールのために、器具にクランプ又は固定される。
図14は、組織収集バッグの背面図を示す。特に、バッグ40は、その中に位置付けられ、処理される組織を有して封止されることができる。封止は、開放端46に近接して、かつそれに実質的に平行に位置付けられ得る。示されるように、コネクタ44は、チューブ46を使用して、フィルタ、バッグなどの他のデバイスに接続され得る。バッグ40は、封止された縁41を有して製造され得る。図14に示されるように、封止された縁41は、3つの縁上に位置し得、第4の縁は、開放区分46を含み得る。位置決め部43は、製造された封止された縁41によって取り囲まれ得る。
図15は、内部に組織を封止し、バッグの使用中に組織の処理を可能にすることができる、組織収集で使用するためのバッグ50の側面図を図示する。バッグ50は、コネクタ52によってチューブ54に結合され得る。
図16Aは、封止されていない組織収集バッグの上面図を示す。バッグ60は、封止された部分66及び開放部分64を含み得る。コネクタ62は、バッグ60を通して視認可能である。組織をバッグ内に配置した後、バッグ60の開放された上部分が封止され得る。
図16Bは、処理のために内部に組織を封止するための封止された縁66を有する組織収集バッグ60の底面図を示す。コネクタ62は、バッグ60上で視認可能である。
図17Aは、部分的に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ70は、封止された部分76及び開放部分74を含み得る。コネクタ72は、バッグ70を通して視認可能である。組織をバッグ内に配置した後、バッグ70の開放された上部分が封止され得る。
図17Bは、処理のために内部に組織を封止するための組織収集バッグの底面図を示す。コネクタ72は、バッグ70上で視認可能である。
図18Aは、部分的に開放されたバッグの上面図を図示する。組織は、バッグ80の開放端84を通して挿入され得る。コネクタ82は、バッグ80の底部に位置付けられて示される。
図18Bは、組織の収集及び/又は処理のための完全に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ80の開放端84は、治療、単離、及び/又は分離などの処理のための組織を受容し得る。封止された縁86は、製造中に作成され得る。
図19Aは、バッグの側部上に封止された縁96を有する、部分的に開放されたバッグ90の上面図を図示する。示されるように、組織は、バッグ90の開放端94を通して挿入され得る。コネクタ92は、バッグ90の底部に位置付けられて示される。
図19Bは、バッグの側部上に封止された縁96を有する、組織の収集及び/又は処理のための完全に開放されたバッグの上面図を示す。バッグ90の開放端94は、治療、単離、及び/又は分離などの処理のための組織を受容し得る。コネクタ92は、バッグ94の底部に位置付けられて示される。
図20A~図20Eは、組織収集バッグの実施形態の正面図を示す。図20Aに示されるように、封止された縁101及び開放端102を有するバッグ100は、チューブ105及び/又はコネクタ104を介してデバイス(図示せず)に接続され得る。例えば、コネクタ104は、バッグ100内に位置付けられるが、一方で、y-コネクタ106は、チューブに沿って位置付けられ得る。図20Bは、ユーザが組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別し得るように、インジケータ107、108を含むバッグ100の更なる実施形態を示す。
加えて、マーク109及びインジケータ107、108を含むバッグ100の実施形態が図20Cに図示される。位置決め部103の使用は、バッグ内の組織の一貫した処理を可能にする、バッグの一貫した位置付けを可能にし得る。インジケータ107、108は、試料及び/又は患者情報のいずれかで試料を識別する。いくつかの事例では、インジケータは、組織試料及び/又は生検試料などの試料を識別及び/又は追跡するために使用され得る。図20Dは、複数のインジケータ107、108及びマーク109を有するバッグ100を図示する。マークは、バッグ100が封止されるべき場所を示し得る。例えば、マーク109は、バッグ100が、封止される、クランプされれる、及び/又は別のデバイスに結合されるべき場所を示し得る。封止するためのマークは、バッグの開口縁に近接して位置付けられ得、例えば、そのようなマークは、開口縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。
示されるように、バッグ100は、コネクタ104及びチューブ105を含み得る。
示されるように、バッグ100は、コネクタ104及びチューブ105を含み得る。
図20Eに示される実施形態では、バッグ100は、ポート110及びコネクタ104を含む。ポートは、材料の添加及び/又は試料からの材料の除去を可能にし得る。例えば、組織の処理中、試料は、処理全体を通して複数回採取され得る。更に、ポート110は、バッグ100内への培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にし得る。
図21Aは、組織の収集及び/又は処理のためのバッグ100の正面図を示す。組織は、開放端102を通してバッグ100内に配置され得る。コネクタ104は、バッグ100をチューブ105及びクランプ112に結合するために使用され得る。
図21B~図21Eは、バッグ100の追加の実施形態の正面図を示す。図21B~図11Dは、インジケータ107、108及び/又はマーク109を含む様々な構成を示す。バッグは、コード、文字、単語、名前、英数字コード、数字、画像、バーコード、クイック応答(QR)コード、タグ、スマートトラッカータグ若しくはBluetooth(登録商標)トラッカーなどのトラッカー、及び/又は当該技術分野で既知の任意のインジケータなどのインジケータを含み得る。いくつかの実施形態では、インジケータは、キットの構成要素の表面に印刷、エッチング、及び/又は接着され得る。インジケータはまた、接着剤を使用してバッグ上に位置付けられ得、例えば、ステッカー又はトラッカーが、バッグ上及び/又は複数のバッグ上に配置され得る。収集バッグ及び/又は凍結保存キットは、数値コード及び/又はQRコード(登録商標)などの複数のインジケータを含み得る。
インジケータ、例えば、QRコード(登録商標)、スマートタグなどのタグ、及び/又はトラッカーは、バッグ内の試料を識別するために、並びに装置が凍結保存キットで実施される脱凝集、濃縮、及び/又は安定化プロセスのタイプに従って特定のプログラムを実行するように、デバイスのプロセッサに命令するために使用され得る。
図21Eは、材料の収集、処理、治療、及び/又は分離に使用されるバッグ100の別の実施形態の正面図を図示する。治療される組織は、バッグ100内に封止され得る。チューブ105は、コネクタ104を通してバッグ100をクランプ112に結合し得る。ポート114は、入力及び/又はバッグ100からの除去を可能にし得る。例えば、ポートは、サンプリングを可能にする、及び/又は凍結保存キットのバッグなどの可撓性コンテナ内への培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にし得る。
図22Aは、処理のために内部に組織を封止するための封止された縁121を有する組織収集バッグ120の別の実施形態の正面図を示す。バッグ120は、チューブ125に結合された位置決め部123及びコネクタ124を含む。
図22Bは、封止された縁121及び開放端122を有する組織収集バッグ120の正面図を示す。インジケータ127、128は、自動システムによって容易にアクセスされ得るように、バッグ120上に位置付けられ得る。位置決め部123を画定する開口部は、封止された縁121によって取り囲まれ得る。インジケータは、組織試料又は生検が採取されたか、又は得られた患者を識別するために使用され得る。
図22Cに示されるように、バッグ120は、インジケータ127、128及びマーク129を含む。図22Dは、複数のマーク129を有する収集バッグ120を図示する。封止のマークは、バッグの開放縁に近接して位置付けられ得る。そのようなマークは、開放縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。
図23は、バッグ130の底部が、コネクタ134から出ているチューブ135とともにページの上部に示されるように位置付けられた、封止されたバッグ130の正面図を図示する。バッグ130は、バッグ130の封止された部分131上にインジケータ137を含む。封止された部分上のインジケータは、バッグ130の封止中及び/又は封止後に位置付けられ得る。一般的に、バッグは、組織が提供された後に封止される。バッグ130の表面上のインジケータ138は、バーコードであってもよい。位置決め部133は、コネクタ134に近接して位置付けられ得る。
収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどのバッグ、並びに任意の関連付けられたチューブは、概して、クリア、透明、半透明、望ましい任意の色、又はそれらの組み合わせであってもよい。組織収集バッグ及び/又はチューブは、概して、閉鎖及び/又は封止された血液並びに/又は凍結保存バッグ及び関連付けられたチューブの製作と類似した方式で製作され得る。本発明におけるチューブは、限定されるものではないが、ポリ塩化ビニル(PVC)を含む、任意の所望の材料から構築され得る。例えば、PVCは、溶着及び/又は封止に有利であるため、所望の材料であってもよい。
本発明の組織収集バッグなどの収集バッグは、ポリオレフィンポリマー、エチレンビニルアセテート(EVA)、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンドなどのコポリマー(すなわち、OriGen Biomedical EVOフィルム)、並びに/又はEVAを含む材料などの、所定の材料から作製された組織を受容するためのバッグの少なくとも一部分を含み得る。バッグで使用するための材料は、特定の特性及び/又は特性の選択、例えば、ヒートシール性などの市場性、ガス透過率、可撓性、例えば、低温可撓性、弾性、例えば、低温弾性、耐薬品性、光学的透明度、細胞傷害性などの生体適合性、溶血活性、浸出に対する抵抗力、少ない微粒子を有することに関して選択され得る。
図24に示されるように、バッグ140は、マークを含むエリアが封止される場合、区画143がバッグ140内に形成され得るように配置される複数のマーク141、142を含み得る。バッグ140は、使用中に試料用の区画の形成に使用され得るバッグの製造中に形成される、予め溶着された区分145を有する。図24は、複数の区画を有するように形成されることができる収集バッグの実施形態を図示する。各区画は、複数の封止及び/又は溶着(例えば、ヒートシールされた)の配置によってバッグ内に形成され得る。例えば、腫瘍懸濁液を収集バッグ内に配置した後、開放端は、溶着して閉じられてもよく、溶着線142などの追加のマーク141は、熱などのエネルギーを使用して、区画を形成するために溶着され得る。
バッグ140上の位置決め部143は、バッグが、RFヒートシーラー及び/又はインジェクタのような封止デバイスなどの器具に対して正しく位置付けられることを確保する。
封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を用いて使用中に形成され得る。使用中に形成される封止は、約2.5mm~約7.5mmの範囲の幅を有し得る。概して、封止140は、組織材料がバッグ140内に配置された後で形成され、約5mmの幅を有し得る。
封止は、シールピール試験(すなわち、ASTM F88/F88M)、及び/又は破裂試験(すなわち、ASTM F1140/F1140M若しくはASTM F2051/F2054M)を使用して強度について試験され得る。
いくつかの実施形態では、バッグ又は可撓性コンテナは、適切に封止されたときに使用中に100ニュートンの力に耐え得、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設され得る。バッグ又は可撓性コンテナの実施形態は、適切に封止されたときに使用中に75ニュートンの力に耐えて、治療及び/又は処理のためにデバイス内に位置付けられたときにクランプで更に固設されるように構築され得る。
バッグ、例えば、収集バッグ及び/又は凍結保存バッグなどの可撓性コンテナ上に封止又は溶着を形成するとき、バッグに使用される材料に応じて、所定の温度、圧力、及び時間で熱及び/又は圧力を適用するために、封止デバイスが使用され得る。例えば、いくつかのヒートシーラーは、約8秒間の熱及び圧力の適用を必要とし得る。8秒後、デバイス上で加熱がオフにされ得るが、追加の2~3秒間圧力が適用され得る。
いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。したがって、バッグ140内に配置された組織は、別個の区画144、146、147に分割され得る。示されるように、各区画144、146、147は、それぞれ、ポート148、149、150を含む。各ポートは、区画への直接的なアクセスを可能にし得る。これは、試料の個別の追加、バンキング、及び/又は試験を可能にする。例えば、封止された収集バッグは、複雑な試料の適合性及び/又は微生物学的特性に対するTILのバンキング及び試験を容易にし得る。このタイプの検査は、消化された材料の小さいアリコートが凍結されることを必要とし得るため、それにより、消化された材料の小さいアリコートは、別々に解凍され得る。いくつかの実施形態では、図24に図示されるバッグ140は、収集バッグ及び/又は凍結保存バッグとして使用され得る。
図25は、収集バッグの実施形態の正面図を示す。この実施形態では、収集バッグ152は、約150mm(すなわち、15cm)の長さ、及び約90mm(すなわち、9cm)の幅を有する。バッグ152は、位置決め部160として作用する開口部を含む。1つ以上の位置決め部が、バッグの配向を制御して、バッグが、使用中に処理及び/又は治療のために適切に位置付けられること、例えば、器具に近接して位置付けることを確保するために使用され得る。いくつかのシステムでは、位置決め部は、自動システムにおいて、本明細書に説明されるバッグの使用を容易にし得る。特に、位置決め部は、自動システムを通してバッグを移動させるために使用され得る。封止156は、約5mmである。封止は、溶着ゾーンを作成するために、エネルギー、例えば、熱を使用して、使用中に形成され得る。封止は、約2.5mm~約7.5mmの範囲の幅を有し得る。概して、封止156は、組織材料がバッグ152内に配置された後で形成される。図25に示されるように、バッグ152は、バッグの製造中に形成される予め溶着された区分158を有する。
図26に示されるように、収集バッグは、チューブ及び弁に結合され得る。いくつかの実施形態では、バッグは、約10cm~約50cmの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約15cm~約30cmの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約18cm~約22cmの範囲の長さを有し得る。図26に示されるバッグ162は、約20cmの長さを有する。本明細書に説明される使用のための収集バッグは、約6.8cm~約8.8cmの範囲の幅を有し得る。図26に示されるように、バッグ162は、約7.8cmの幅を有する。限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁164は、チューブ166によって結合されたバッグ162から約20cmに位置付けられる。チューブ166は、別の要素又は構成要素が追加される前に、少なくとも10cmにわたって無針弁164から延在する。
図27Aに図示されるように、開放バッグ170は、使用前にチューブ172、174、176に結合される。バッグ170は、封止可能な材料から構築され得る。特に、バッグは、例えば、ベンチトップヒートシールデバイスなどのヒートシーラーを使用して封止可能であり得る。チューブのうちのいくつか、例えば、チューブ174は、溶着不能であってもよい。限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁178は、チューブ174、176の端に位置付けられる。
いくつかの実施形態では、バッグは、約10cm~約50cmの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約15cm~約30cmの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約18cm~約22cmの範囲の長さを有し得る。図27Aに示されるバッグ170は、約20cmの長さを有する。
図27Bは、例えば、バッグ内の材料の堆積後に封止された収集バッグの実施形態の正面図を示す。バッグ180は、封止可能な材料から構築される。特に、バッグは、例えば、ベンチトップヒートシールデバイスなどのヒートシーラーを使用して封止可能であり得る。封止は、バッグの開口縁に近接して位置付けられ得、いくつかの事例では、マークは、開口縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止は、開口縁と実質的に平行であり得る。
チューブのうちのいくつか、例えば、チューブ182、184、186は、溶着可能であってもよい。溶着可能なチューブは、ポリマー材料、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)から作製され得る。
限定されるものではないが、無針弁を含む弁が、チューブに沿った点に使用され得る。例えば、無針弁188は、チューブ184、186の端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、バッグは、約10cm~約40cmの範囲の長さを有し得る。特に、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグは、約15cm~約30cmの範囲の長さを有し得る。例えば、バッグは、約18cm~約22cmの範囲の長さを有し得る。図27Aに示されるバッグ180は、約20cmの長さを有する。
図28に示されるように、凍結保存キットの実施形態は、上向きに示され、開放バッグ190及び凍結保存バッグ192を含む。示されるように、凍結保存バッグ192は、インジケータ193、194を含み得る。凍結保存バッグは、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)などの抗凍結剤を用いた凍結保存に好適である必要があり得る。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、バッグが約5ml~約45mlの範囲の体積の材料を保持し得るように構築され得る。特に、凍結保存バッグは、約10ml~約35mlの範囲の材料の体積を収容することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、約15ml~約30mlの範囲で保存される材料の体積を収容し得る凍結保存バッグを含む。凍結保存バッグ192は、所望の所定の体積が達成されるようにサイズ決めされていてもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグは、約4cm~約11cmの範囲の幅、及び約10cm~約18cmの範囲の長さを有し得る。例えば、凍結保存バッグは、約5.8cm~約9.8cmの範囲の幅、及び約12cm~約16cmの範囲の長さを有し得る。特に、図28に図示される凍結保存バッグの一実施形態は、約7.8cmの幅及び約14cmの長さを有し得る。
使用前に、凍結保存キット及び/又はその特定の構成要素は、滅菌され得る。例えば、バッグ190、192は、滅菌され得る。バッグ190、192を形成するために使用される材料は、ヒートシール可能であり得る。バッグで使用するための材料としては、限定されるものではないが、EVA、ポリアミド(例えば、ナイロン)、及びそれらの組み合わせなどのポリマーを含み得る。開放バッグ190は、封止及び/又はクランプ(図示せず)を使用してバッグを閉鎖した後の処理及び/又は脱凝集に使用され得る。
キット191は、弁195、196、クランプ197、198、チューブ199、及びフィルタ200を更に含む。フィルタ200は、インラインフィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、生物学的フィルタ、及び/又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所望の材料を形成するために、処理された組織から所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、所望の材料が形成されるように、約200μm未満の平均サイズを有する成分を有し得る。例えば、所望の材料は、約170μm未満の平均サイズを有するTIL(腫瘍浸潤リンパ球)を含み得る。
フィルタは、フィルタの後、所望の材料が、約15μm~約500μmの範囲のサイズを有する成分を有する安定化要素の方向にチューブ内に流れるように、チューブから入る処理された組織組成物が濃縮され得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後に安定化要素の方向にチューブに入る組織組成物が、約50μm~約300μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約150μm~約200μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、濃縮要素のフィルタは、処理された組織から、約5μm~約200μmの所定のサイズ範囲外の材料を除去して、所望の材料を形成し得る。例えば、所望の材料は、約5μm~約200μmの範囲の平均サイズを有するTIL(腫瘍浸潤リンパ球)を含み得る。弁195、196は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁195は、収集バッグ190から約20cmに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグ190に添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグ190に添加するために、無針弁195に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも10cmのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ199は、封止可能及び/又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、PVC(ポリビニルクロリド)、及び/又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約1.5mm~約4.5mmの範囲の内径、及び約2.1mm~約6.1mmの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約2.9mm~約3.1mmの範囲の内径を有し、約4.0mm~約4.2mmの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット191で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約1cm~約30cmの範囲の長さを有する。例えば、図28に図示されるように、個々のチューブ要素の長さは、約5cm~約20cmで変化し得る。
図28に図示されるクランプ197、198は、フィルタ内への酵素培地及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。例えば、クランプ197は、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への酵素培地及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。クランプ198は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び/又は防止し得る。
図29は、図28に示されるキット191に類似した凍結保存キットの実施形態の上面図を示すが、キット201は、下向きである。図29は、収集バッグ202が閉鎖され得る位置を図示する。
図30は、閉鎖された収集バッグ206及び凍結保存バッグ208を含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。いくつかの実施形態では、凍結保存バッグ208は、サンプリングを可能にし、凍結保存バッグ内への培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にするポート215、216を含み得る。凍結保存キット205は、フィルタ214、弁209、210、クランプ211、212、及びチューブ222を含み得る。
フィルタ214は、インラインフィルタ、生物学的フィルタ、血液投与フィルタなどの血液フィルタ、及び/又はインライン塊除去フィルタであってもよい。フィルタは、所定のサイズを上回る材料を除去するように構成され得る。例えば、組織塊は、フィルタを使用して脱凝集組織から分離され得る。フィルタは、フィルタ後にチューブに入る組織組成物が、約15μm~約500μmの範囲のサイズを有する成分を有し得るように選択され得る。いくつかの実施形態では、フィルタは、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約50μm~約300μmの範囲のサイズを有する成分を有するように構成され得る。例えば、フィルタは、実施形態では、濾過された後にチューブに入る組織組成物が、約150μm~約200μmの範囲の平均サイズを有する成分を有するように構成され得る。特に、濾過された後のチューブに入る組織組成物は、約170μm未満の平均サイズを有する成分を有し得る。
弁209、210は、収集バッグから所定の距離に配置され得る。例えば、無針弁209は、収集バッグ206から約20cmに位置付けられ得る。無針弁などの弁が、材料を収集バッグ206に添加するために使用され得る。例えば、酵素培地は、培地を収集バッグ206に添加するために、無針弁209に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、そのような弁の後、凍結保存キットのための追加の構成要素上に空間が溶着することを可能にする所定の量のチューブが存在し得る。例えば、いくつかの弁の後、少なくとも10cmのチューブが次の要素の前に位置付けられ得る。チューブ222は、封止可能及び/又は溶着可能であり得る。例えば、チューブのための材料としては、限定されるものではないが、PVC、及び/又は当該技術分野で公知の他の材料が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、チューブは、コネクタに収まるようにサイズ決めされ得る。例えば、チューブは、約1.5mm~約4.5mmの範囲の内径、及び約2.1mm~約6.1mmの範囲の外径を有し得る。例えば、凍結保存キットの実施形態は、約2.9mm~約3.1mmの範囲の内径を有し、約4.0mm~約4.2mmの範囲の外径を有するチューブを含み得る。凍結保存キット205で使用されるチューブは、長さが変化し得、個々のチューブ要素は、約1cm~約30cmの範囲の長さを有する。例えば、図30に図示されるように、個々のチューブ要素の長さは、約5cm~約20cmで変化し得る。
図30に図示されるクランプ211、212は、フィルタ内への酵素培地及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。例えば、クランプ211は、所望の濾過ステップの前のフィルタ内への培地酵素溶液及び/又は消化された組織の移動を阻害及び/又は防止するために使用され得る。クランプ212は、フィルタ内への抗凍結剤の望ましくない移動を阻害及び/又は防止し得る。
図31は、閉鎖された収集バッグ226及び凍結保存バッグ228を含む、上向きの凍結保存キットの実施形態の側面図を示す。凍結保存バッグ228は、ポート242を含み得る。ポート242は、凍結保存バッグ228へのアクセスを提供する。弁232、238及びクランプ234、236は、フィルタ230の周りに位置付けられ、凍結保存キット224内の流体の移動を制御するために使用され得る。
図32は、凍結保存キットの実施形態の端面図を示す。封止されたバッグ226及びフィルタ230は視認可能である。封止されたバッグ226は、チューブ、弁、及び/又はクランプを使用してフィルタ230に結合され得る。
図33は、収集バッグの実施形態の上面図を示す。バッグ232は、開放して示され、インジケータ234、236及びマーク238、240を含む。マークは、バッグの部分が封止及び/又はクランプされるべき場所を示すために使用され得る。封止のマークは、バッグの開放縁に近接して位置付けられ得る。そのようなマークは、開放縁から所定の距離に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、封止のためのマークは、開口縁と実質的に平行であり得る。
バッグ232は、位置決め部244及びコネクタ246を含む。コネクタ246は、バッグ232をチューブ248に結合する。コネクタ246は、チューブ248が、クランプ254、256及び/又はポート258、260を含むチューブ250、252に分割することを可能にし得る。
図34は、収集バッグ264、クランプ266、268、フィルタ270、チューブ272、ポート274、276、弁278、コネクタ280、及び凍結保存バッグ282を含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。収集バッグ及び関連付けられたチューブは、少なくともいくつかのEVA材料を使用して形成され得る。いくつかの実施形態では、収集バッグ及び/又はチューブは、EVAから形成され得る。クランプ266、268は、ピンチクランプであってもよい。コネクタ280は、4方向コネクタであり、弁278、例えば、無針弁に、並びに凍結保存バッグ282に結合されたチューブにフィルタ270からのチューブを結合するために使用され得る。
図35は、収集バッグ284、ポート286、クランプ288、296、弁290、292、フィルタ298、及び凍結保存バッグ294を含む凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。図示されるように、弁290、292は、処理中にキットで使用するための材料を受容することができる無針弁であり得る。例えば、弁290、292を介して提供される材料としては、例えば、腫瘍消化培地、並びに/又はジメチルスルホキシド(DMSO)などの抗凍結剤若しくは凍結保存培地、並びに/又は55%のDMSO及び5%のデキストラン凍結保存培地(例えば、BloodStor 55-5)などのそれらの溶液が挙げられる。シリンジ300、302は、無針弁290、292を通じて、それぞれ、55%のDMSO及び5%のデキストラン凍結保存培地などの、腫瘍消化培地及び55%のDMSO溶液を提供するために使用され得る。処理中、材料は、所定の時間に凍結保存キットに選択的に提供され得る。更に、クランプは、腫瘍消化培地などの提供される材料の流れを制御するために使用され得る、及び/又はDMSO溶液などの抗凍結剤は、収集バッグ、フィルタ、及び/又は凍結保存バッグなどのデバイスに所定の時間に提供され得る。
図36Aは、消化装置などのデバイスに固設されることができる凍結保存キットの実施形態の正面図を示す。示されるように、収集バッグ304は、使用中に少なくとも部分的にブラケット306によって包囲される。ブラケットは、処理が効率的な様式で発生し得るように、収集バッグ304を位置付け得る。図36Aは、溶着310を有し、溶着310に対する圧力を低減するために使用中に溶着310に近接するクランプ312を利用する、収集バッグ304を図示する。使用中に導入される組織は、組織がデバイスからのパドル314、316を使用して治療され得るように、収集バッグ304内に実質的に均等に分布され得る。凍結保存バッグ330は、複数の区分332を有し、各々が、独自のポート334を有する。
ブラケットを使用して固設された収集バッグの実施形態の側面図が図36Bに図示される。ブラケット336は、収集バッグを固設するために使用され得る。ブラケット336は、ヒンジ338、上側340、下側342、クランプ344、突出部346、及びラッチ348を含む。使用中、クランプ344は、収集バッグ上の溶着に近接して位置付けられ得る(図36A)。ブラケット336上の突出部346は、それが収集バッグの表面の近位に位置付けられ、使用中に収集バッグ内に突き出るように構築される。いくつかの実施形態では、突出部346は、組織の処理が収集バッグの長さに沿って実質的に同様であることを確保するために、使用中に組織及び/又は培地の移動を低減及び/又は阻害し得る。例えば、突出部は、パドル間の組織の摺動を低減及び/又は阻害するように構築され得る(図36Aに示される)。ブラケット336はまた、収集バッグが固設されていることを確保するためのラッチ348を含み得る。
図36Cは、収集バッグとともに使用するための隆起350を含むクランプ344の分解図を示す。特に、使用中、クランプ344は、溶着及び/又は封止の不具合のリスクを低減するために、収集バッグ上の溶着に近接して位置付けられ得る。
図37は、収集バッグ354、フィルタ356、弁362、364、クランプ358、360、チューブ368、及び凍結保存バッグ366を含む凍結保存キットの実施形態の上面図を示す。凍結保存キット352の様々な構成要素間のチューブ長さは、変化し得る。
図38は、収集バッグ354、フィルタ356、弁362、364、クランプ358、360、チューブ368、及び凍結保存バッグ366を含む、下向きに位置付けられた凍結保存キットの実施形態の図を示す。
脱凝集産物材料が特定の実施形態では適切に保存され得ることを確保するために、2つ以上のバッグが一緒に結合され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、組織、例えば、固体哺乳動物組織からの細胞及び/又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集、濃縮、及び/又は安定化のための自動デバイスを含み得る。本発明で使用するための自動デバイスは、プログラム可能プロセッサ及び凍結保存キットを含み得る。いくつかの実施形態では、凍結保存キットは、単回使用無菌キットであり得る。本発明は、半自動無菌組織処理方法に更に関する。
いくつかの実施形態では、収集バッグなどのバッグは、収集キットに使用され得る。バッグは、組織試料などの試料の添加を可能にする開放端を有する。コネクタは、収集キット内のチューブにバッグを結合し得る。チューブ材料は、封止可能及び/又は溶着可能であってもよい。例えば、チューブは、熱、無線周波数などのエネルギーを使用して封止され得る。チューブ材料は、PVAから作製され得る。
いくつかの実施形態では、チューブは、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物を含む、1つ以上の培地酵素溶液の添加を可能にするために弁に結合され得る。例えば、弁は、無針弁であり得る。
凍結保存キットに使用されるチューブは、約2.0mm~約4mmの範囲のチューブの内径を有する約3.0mm~約5.0mmの範囲の外径を有するチューブを含み得る。特に、チューブは、4.1+/-0.1mmの外形及び約3.0+/-0.1mmの内径を有し得る。チューブの長さは、収集キットの構成に依存し得る。例えば、収集キットの実施形態は、約10cm~約20cmの範囲の長さを有するチューブを含み得る。
収集キットのいくつかの実施形態では、プロトタイプは、組織及び/又は酵素培地の移動を阻害及び/又は防止するための1つ以上のクランプを含み得る。特に、酵素培地及び/又は組織は、濾過ステップの前にフィルタ内に移動するのを阻害され得る。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
1.単回使用無菌キットであって、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、該モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、該モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、単回使用無菌キット。
2.1つ以上の可撓性コンテナが、弾性変形可能な材料を含む、段落1に記載の単回使用無菌キット。
3.脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、1つ以上の封止可能な開口部を含む、段落1又は2に記載の単回使用無菌キット。
4.脱凝集モジュールの可撓性コンテナが、ヒートシール可能な溶着を含む、段落3に記載の単回使用無菌キット。
5.1つ以上の可撓性コンテナが、内部に丸みを帯びた縁を含む、段落1~4のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
6.脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、その中に固形組織を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む、段落1~5のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
7.濃縮モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、細胞化脱凝集固形組織の保持物を保持するフィルタを含む、段落1~6のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
8.安定化モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む、段落1~7のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
9.キットが、デジタル、電子、又は電磁タグインジケータを更に含む、段落1~8のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
10.タグインジケータが、脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、それらのプロセスで使用される1つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連する、段落9の単回使用無菌キット。
11.同じ可撓性コンテナが、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの1つ以上の一部を形成し得る、段落1~10のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
12.脱凝集モジュールが、処理される組織の受け取りのための第1の可撓性コンテナを含む、段落1~11のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
13.脱凝集モジュールが、脱凝集のための培地を含む第2の可撓性コンテナを含む、段落1~12のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
14.任意選択の濃縮モジュールが、濃縮された濾液を受容するための第1の可撓性コンテナ及び第3の可撓性コンテナを含む、段落1~13のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
15.脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第2の可撓性コンテナを含み、第2のコンテナが、消化培地及び安定化培地を含む、段落1~14のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
16.安定化モジュールが、安定化培地を含む第4の可撓性コンテナを含む、段落1~15のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
17.安定化モジュールはまた、保存する及び/又は凍結保存を受けるための第1の可撓性コンテナ及び/又は第3の可撓性コンテナを含む、段落1~16のいずれかに記載の単回使用無菌キット。
18.哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び任意選択の濃縮のための半自動プロセスにおける、段落1~17のいずれかに記載の単回使用無菌キットの使用。
19.哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化のための自動デバイスであって、プログラム可能プロセッサと、段落1~17のいずれかの単回使用無菌キットと、を備える、自動デバイス。
20.単回使用キットを認識する無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落19に記載の自動デバイス。
21.プログラム可能プロセッサが、タグを介して単回使用無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにそれらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行することができる、段落19又は20に記載の自動デバイス。
22.プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び安定化モジュールのうちの1つ以上と通信し制御するように適合されている、段落19~21のいずれかに記載の自動デバイス。
23.プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び/又は生物学的分解を可能にする、段落22に記載の自動デバイス。
24.プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び/又は酵素的分解を可能にする、段落23に記載の自動デバイス。
25.固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される1つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落24に記載の自動デバイス。
26.プログラム可能プロセッサが、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落19~25のいずれかに記載の自動デバイス。
27.プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化モジュールを制御して、濃縮された脱凝集固形組織をコンテナ内で凍結保存する、段落19~25のいずれかに記載の自動デバイス。
28.デバイスは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための1つ以上の弁、並びに/又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための1つ以上のクランプの追加の構成要素のうちの1つ以上を任意の組み合わせで更に備える、段落19~27のいずれかに記載の自動デバイス。
29.プログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、段落19~28のいずれかに記載の自動デバイス。
30.ユーザインターフェースを更に備える、段落19~29のいずれかに記載の自動デバイス。
31.インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落23に記載の自動デバイス。
32.自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、段落19~31のいずれかに記載の自動デバイス。
33.半自動無菌組織処理方法であって、任意選択的に段落1~17のいずれかに記載のキットに従って、無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、無菌処理キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に組織試料を配置することと、脱凝集モジュール、任意選択の濃縮モジュール、及び安定化モジュールと通信して制御することによって、1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、を含む、方法。
腫瘍材料、凍結保存、及びTIL製造の収集のための手順
TIL製造のための出発材料は、適格患者からの自己TIL及び腫瘍細胞を含有する、脱凝集され凍結保存された細胞懸濁液である。腫瘍出発材料の収集及び処理のための例示的なフロー図(図65)が提供される。
TIL製造のための出発材料は、適格患者からの自己TIL及び腫瘍細胞を含有する、脱凝集され凍結保存された細胞懸濁液である。腫瘍出発材料の収集及び処理のための例示的なフロー図(図65)が提供される。
腫瘍が外科的に切除され、次いで、トリミングされて、視認可能な壊死組織、視認可能な健常(非がん性)組織、脂肪組織、及び過剰な血液を除去する。トリミングされた腫瘍重量は、2グラム以上(≧2グラム)であるべきである。7gを超える重量の腫瘍は、より小さい部分に分割され、個別に脱凝集され得る。
各腫瘍断片は、培地、コラゲナーゼ、及びDNAseを含有する個々の滅菌バッグ内に配置される。例示的な試薬が以下の表に示される。
次いで、バッグがヒートシールされ、その内容物が脱凝集されて、腫瘍及びTILを含有する均質な細胞懸濁液を生成する。脱凝集は、腫瘍組織への酵素アクセスを確保し、それによって、酵素消化を加速するために、定義された持続時間にわたって定義された圧縮圧力で、所定の数の繰り返される物理的圧縮事象を引き渡すプログラムを実行する、本明細書に説明されるTiss-U-Storデバイスなどのデバイスによって実施される。サイクル数、圧力、温度、及び持続時間は、各個々の腫瘍毎に記録される。
次いで、均質化された細胞懸濁液が、200μmのフィルタ(Baxter、RMC2159)を使用して無菌濾過され、濾液が凍結保存バッグ中に無菌で通過する。BloodStor 55-5(Biolife Solutions、Bothell、WA)が、5%のDMSOを達成するために無菌添加される。次いで、細胞懸濁液が、定義された冷却プログラムを有するTiss-U-Storデバイスを使用して凍結保存され、測定された温度プロファイルが、各腫瘍部分に由来する各個々の細胞懸濁液について記録される。凍結保存細胞懸濁液は、液体窒素の気相中に保存される。
凍結保存細胞懸濁液の推奨保存条件は、≦-130℃である。
細胞懸濁液は、凍結保存細胞懸濁液が≦-130℃で維持されることを確保することが検証されたコンテナに包装された、資格要件を満たした宅配便によって、臨床現場からGMP細胞療法製造所に輸送される。
(Tiss-u-Stor)
切除腫瘍は、重量及び状態について評価される。各腫瘍断片について、異物が除去され、断片が計量される。CS50Nバッグが開放され、最大約7gの腫瘍が添加され、次いで、バッグが封止される。15mlのEDM消化培地が、無針ポートを介してシリンジによって1mlのEDM当たり2μlのゲンタマイシン/アンホテリシンを伴ってバッグに添加され、その後、バッグからシリンジ内への空気の除去に続く。
切除腫瘍は、重量及び状態について評価される。各腫瘍断片について、異物が除去され、断片が計量される。CS50Nバッグが開放され、最大約7gの腫瘍が添加され、次いで、バッグが封止される。15mlのEDM消化培地が、無針ポートを介してシリンジによって1mlのEDM当たり2μlのゲンタマイシン/アンホテリシンを伴ってバッグに添加され、その後、バッグからシリンジ内への空気の除去に続く。
脱凝集バッグ中の腫瘍組織及び脱凝集培地は、温度制御された組織脱凝集装置内に配置される。温度は、周囲温度から1.5℃/分の速度で35℃まで上昇し、35℃で合計約45分間維持され、その間、脱凝集装置は、240サイクル/分でアクティブである。
脱凝集されると、腫瘍材料は、インラインフィルタを通して二次凍結バッグに濾過される。1.5mlのBlood stor(DMSO)が無針ポートを介して注射され、空気が除去される。
試験のために、2mlの懸濁液が引き込まれる。
任意選択の凍結保存について、凍結バッグが、凍結カセットに装填され、凍結カセットがVia freeze内に配置される。次いで、Via freezeが、-80℃、好ましくは、-2℃/分の速度で、35℃から-80℃まで直接的に冷却される。
次いで、凍結された凍結バッグが液体窒素倉庫に移される。
TIL製造
英国(UK)で培養に使用される自己組織は、適切な同意、Chain of Identity、Chain of Custody、ドナーがB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIV-1&2、HTLV-1&2、及びSyphilisに対して陰性であることを確認するスクリーニングとともに、英国の人体組織管理庁によって確立されたHTA-GD-20、Guide to Quality and Safety Assurance for Human Tissue and Cells for Patient Treatmentに準拠するべきである。
英国(UK)で培養に使用される自己組織は、適切な同意、Chain of Identity、Chain of Custody、ドナーがB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIV-1&2、HTLV-1&2、及びSyphilisに対して陰性であることを確認するスクリーニングとともに、英国の人体組織管理庁によって確立されたHTA-GD-20、Guide to Quality and Safety Assurance for Human Tissue and Cells for Patient Treatmentに準拠するべきである。
製造は、切除腫瘍に由来するTIL及び腫瘍細胞を含有する凍結保存細胞懸濁液からの外殖及び増殖を伴う。腫瘍が約7g超である場合、切除プロセスは、複数の凍結保存細胞懸濁液を生成し、各細胞懸濁液は、2~7gの腫瘍断片に由来する。典型的には、1つのTIL外殖のために1つの細胞懸濁液のみが解凍される必要があるが、一方で、残りの凍結保存細胞懸濁液は、GMP管理下に留まり、推奨保存条件(液体窒素の気相)で保持される。
特定の実施形態では、細胞懸濁液は、脱凝集後、凍結保存前に濾過されている。例示的な製造手順が図66に示される。例示的な製造原材料が、以下の表に提供される。
T細胞培地(TCM)は、アルブミン(ヒト)、ヒトホロトランスフェリン、及び動物起源コレステロールを含有する。アルブミン及びトランスフェリンを製造するために使用されるソース血漿は、米国から調達され、ドナーは、外来性感染物質について試験される。
コレステロールは、オーストラリア/ニュージーランドを起源とするヒツジの毛皮から調達され、これは、伝達性海綿状脳症(TSE)の症例が報告された国からの反すう動物起源材料を禁止するUSDA規制に準拠している。
ウシ胎児血清(FBS)は、オーストラリア/ニュージーランドから調達され、伝達性海綿状脳症(TSE)の症例が報告された国からの反すう動物起源材料を禁止するUSDA規制に準拠している。FBSは、21CFRパート113.47に準拠して試験され、具体的には、ブルータングウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシRSウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、細胞変性剤、血液吸着剤を含む。FBSは、56℃で30分間、熱不活性化され、0.1μmで三重濾過されて、2つの直交ウイルス除去ステップを提供する。
ヒトAB血清は、FDA登録施設(1121958)であるValley Biomedicalから調達される。各ドナーユニットは、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎ウイルス(HBV)核酸増幅試験(NAT)、抗ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型及び2型、HIV-1 NAT、抗C型肝炎ウイルス(HCV)、HCV NAT、並びにFDA承認方法による梅毒の試験について試験される。血清は、56℃で30分間、熱不活性化され、0.1μmで濾過される。
照射されたバフィーコートの調達、調製、出荷、及び保管:スコットランド国立輸血サービス(SNBTS)は、ドナーをスクリーニングし、血液成分を収集し、バフィーコートを調製及び照射する。SNBTSは、血液、血液成分、及び組織を調達、処理、試験、保管、及び流通のために、Blood,Safety and Quality Regulations(2005)に従って、英国の人体組織管理庁(ライセンス番号11018)により認可されている。
健常ドナーのスクリーニングは、米国連邦規則集(CFR)タイトル21パート1271.75に説明される要件を満たすか、又は超過し、ドナーが英国に居住していることは例外とする。これは、孤発性クロイツフェルト-ヤコブ病(sCJD)又はバリアントクロイツフェルト-ヤコブ病(vCJD)の理論上のリスクを提示するが、英国は、堅牢な国家監視プログラムを有する。1990年5月~2018年12月31日(National CJD Research & Surveillance Unit,2018)を対象とした最新の年次報告書は、英国におけるsCJDの発生が、ウシ海綿状脳症(BSE)のない国を含む、世界の他の場所で観察されたものと同等であることを確認する。2017年~2020年4月5日まで、vCJDの症例は報告されておらず、2012年1月1日以降、国内で識別された症例は2例のみであった(NCJDRSU Monthly Report,2020)。この厳格な監視ネットワークは、輸血伝染したvCJD感染を排除しており、2007年以降は報告されていない(National CJD Research & Surveillance Unit,2018)。例示的な適格ドナー検査(表7)は、21CFRパート1271.85の要件を満たし、必須ではないE型肝炎試験を追加する。
認可された血液施設は、重篤な好中球減少症の患者を治療するのに好適である臨床グレードの照射されたバフィーコートを調製する。バフィーコートを調製するために、血液が遠心分離されて、赤血球層、バフィーコート層、及び血漿層の3つの層を形成する。10人のドナーからのバフィーコートが25~50Gyの照射で照射されて、細胞成長を停止させる。臨床グレードの照射されたバフィーコートが調製され、温度モニタを含む制御された温度シッパーを使用して翌日宅配便によってGMP製造施設に出荷される。出荷は、製造プロセスで使用する1日前に行われる。
受け取り時に、バフィーコートは、製造で使用されるまで15~30℃で保持される。
照射されたフィーダー細胞調製
最大10個の固有のドナーからのバフィーコートがプールされ、次いで、Ficoll勾配密度遠心分離によって遠心分離されて、末梢血単核細胞(PBMC)を採取する。約4×109個の生存白血球が、閉鎖された静止細胞培養バッグ内で、約8%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2、及び30ngのOKT-3を補充したTCM中に再懸濁される。PBMCは、仕様に従ってリリースされる。
最大10個の固有のドナーからのバフィーコートがプールされ、次いで、Ficoll勾配密度遠心分離によって遠心分離されて、末梢血単核細胞(PBMC)を採取する。約4×109個の生存白血球が、閉鎖された静止細胞培養バッグ内で、約8%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL-2、及び30ngのOKT-3を補充したTCM中に再懸濁される。PBMCは、仕様に従ってリリースされる。
PBMCは、無菌性及びマイコプラズマについても試験される。ステップ3を開始する直前に(12日目、図86)、培地、IL-2、及びOKT3を含む製剤化されたフィーダー細胞の試料が除去される。この試料は、13日目、17日目、及び18日目にインキュベートされて解析され、フィーダー細胞が増殖しないことを確認する。
アルブミン(ヒト)は、ヒト血清アルブミン(HSA)としても知られ、米国ドナーから調達される。全ての血漿献血は、個別に試験され、HBsAg、抗HIV1、抗HIV2、及び抗HCV抗体に非反応性である。各血漿プールが試験され、NATによってHBsAg、抗HIV1、抗HIV2、及びHCV-RNAに対して陰性であることが判明した。HSA産物は、米国及び欧州薬局方の生産及び試験基準を満たすGMP規制に従って製造される。
TIL成長
細胞懸濁液は、10%のFBS、10μg/mLのGentamicin(Life Technologies、Grand Island,NY)を有する0.25μg/mLのAmphotericin B、及びインターロイキン-2(IL-2、アルデスロイキン)3000IU/mL(Clinigen、Nurnberg,Germany)を補充されたTCM内に約0.25×106~0.75×106個の生存細胞/mLで播種し、標準培養条件(37℃、5%のCO2)で培養される。
細胞懸濁液は、10%のFBS、10μg/mLのGentamicin(Life Technologies、Grand Island,NY)を有する0.25μg/mLのAmphotericin B、及びインターロイキン-2(IL-2、アルデスロイキン)3000IU/mL(Clinigen、Nurnberg,Germany)を補充されたTCM内に約0.25×106~0.75×106個の生存細胞/mLで播種し、標準培養条件(37℃、5%のCO2)で培養される。
5日目に、培地の半分が除去され、10%のFBS、0.50μg/mLのAmphotericin B、20μg/mLのGentamicin、及び6000IU/mLのIL-2を補充されたTCMで交換される。
7日目に、細胞濃度が>1.5×106個の生存細胞/mLである場合、TIL増殖培養物が、3倍の体積で希釈されて、約0.1×106~2.0×106個の生存細胞/mLを維持する。細胞濃度が≦1.5×106個の生存細胞/mLである場合、培地の半分が交換される。いずれの選択肢においても、培地は、10%のFBS、0.50μg/mLのAmphotericin B、20μg/mLのGentamicin、及び6000IU/mLのIL-2を補充されたTCMである。
10日目に、細胞濃度が>1.5×106個の生存細胞/mLである場合、TIL増殖培養物が、3倍の体積で希釈されて、約0.1×106~2.0×106個の生存細胞/mLを維持する。細胞濃度が≦1.5×106個の生存細胞/mLである場合、培地の半分が交換される。いずれの選択肢においても、追加される培地は、10%のFBS、0.50μg/mLのAmphotericin B、20μg/mLのGentamicin、及び6000IU/mLのIL-2を補充されたTCMである。
TIL活性化
TILは、抗CD3抗体(OKT3)を使用して活性化されて、同種末梢血単核細胞(PBMC)からの照射されたフィーダー細胞のFC受容体に結合されたときにCD3特異的刺激を提供する。フィーダーは、添加される抗CD3(OKT-3)を支持するための追加の共刺激の天然源を提供する。
TILは、抗CD3抗体(OKT3)を使用して活性化されて、同種末梢血単核細胞(PBMC)からの照射されたフィーダー細胞のFC受容体に結合されたときにCD3特異的刺激を提供する。フィーダーは、添加される抗CD3(OKT-3)を支持するための追加の共刺激の天然源を提供する。
12日目に、TIL成長ステップ2からの1~20×106個の生存T細胞が、約30±10ng/mLのOKT3、約8%のヒトAB血清、及び3000±1000IU/mLのIL-2を使用して、2.0~4.0×109個の生存照射フィーダー細胞(セクション8.1.4.4)に添加される。TIL活性化培養物が、標準細胞培養条件で6日間インキュベートされる。
TIL増殖
18日目に、活性化TILは、約8%のヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を補充されたT細胞培地を含有するバイオリアクターに、活性化TIL細胞懸濁液を無菌添加することによって、増殖し続ける。
18日目に、活性化TILは、約8%のヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を補充されたT細胞培地を含有するバイオリアクターに、活性化TIL細胞懸濁液を無菌添加することによって、増殖し続ける。
19日目に、TIL増殖は、採取まで3000IU/mLのIL-2を補充されたT細胞培地の連続的な供給が提供される。
TILは、SEFIATMを使用して細胞を洗浄することによって採取される。細胞は、遠心分離により濃縮され、次いで、1%ヒト血清アルブミン(HSA)を補充されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して、2~4回洗浄される。次いで、細胞がPBS+1%のHSA中に約50~60mLまで再懸濁される。
洗浄及び濃縮された細胞は、凍結バッグ内に無菌で移され、ロットリリース試験のために一部分が除去され、試料が保持される。医薬品(DP)を製剤化するために、次いで、TILが、2~8℃に冷却され、例えば、16%のHSA及び20%のDMSOを含有する抗凍結剤を用いて1:1で製剤化して、PBSにおいて、約10%のDMSO及び8.5%のHSA中に懸濁された、≧5×109個の生存細胞の製剤化産物を達成する。ロットリリース試験のために一部分が除去され、試料が保持される。凍結バッグが-80℃まで冷却される。
TIL製造プロセス
以下の表は、プロセス変動の例を示す。
以下の表は、プロセス変動の例を示す。
以下の表は、医薬品データを示す
凍結保存された細胞懸濁液及び新鮮細胞懸濁液を比較して、代表的な収率は、同様の原薬収率(図67A)、生存率(図67B)、及びT細胞率(図67C)として構成された。
凍結保存の最適化-腫瘍材料の代替として、単離されたPBMCを、Tiss-U-Storプロセス及び材料を使用して消化した。市販の凍結保存剤(CPA)を、解凍後生存率が最大化された試薬を決定するために、様々な条件にわたって評価した(図68)。2つのCPA、Cryostor10、及び幹細胞バンカーDMSOを含まない解凍後の生存率も同様であった。次いで、CryoStorベースのDMSOを、DMSOベースの抗凍結保存剤であるBloodstor 55-5と比較し、より高度に濃縮されたBloodStor産物を、それが、より濃縮され、したがって、より小さい凍結バッグを可能にしたため、選択した。次いで、4℃で10分間材料を保持し、次いで、-1℃/分の速度で温度を低下させるか、又は-2℃/分の速度で35℃から-80℃まで直接的に低下させるプロトコルに従って、凍結保存を比較した。解凍後の生存率は、使用された2つの凍結保存プロトコル間で同様であった(図69)。
冷却中、氷核形成は熱を放出する。放出された熱が溶液を加温するように見える現象である過冷却は、より低い解凍後回収と関連付けられる。温度データは、両方のプロトコル(図70)を使用して凍結保存中に試験物品から記録された。-1℃/分のプロトコルを使用して、両方の独立した実行で過冷却が観察されたが、一方で、-2℃/分の冷却プロトコルは、過冷却イベントを一度も記録せず、第2の独立した実行では、過冷却イベントは、代替的なプロトコル(図70)に対して少ない熱を放出することが観察された。
凍結保存されたDPは、≦-130℃における保存及び輸送のために、気相LN2に移される。
試料の無菌性が試験され、保持された試料が、Coolcell(登録商標)(Biocision、Larkspur,CA)を使用して-80℃で凍結され、次いで、保存目的のために気相LN2に移される。
本発明は、肺がんをTILで治療する方法を包含する。疾患適応コホートとして非小細胞肺がん(NSCLC)が有利に企図される。小細胞肺がん(SCLC)又は燕麦細胞がん、肺カルチノイド腫瘍、腺様嚢胞がん、リンパ腫、及び肉腫、並びに転移性肺がんの治療も企図される。本明細書に説明される方法によって産生されるTILは、有利に企図される。しかしながら、他の方法によって単離されたTILもまた、肺がんを治療するために企図される。一般的に、生検又は外科的切除中に肺がん腫瘍から収集され、インターロイキン-2(IL-2)、OKT-3、及び任意選択の抗原提示細胞(APC)を用いて大きな数に成長し、患者に再び注入される任意のTILは、肺がんを治療するために意図され得る。
NSCLCの治療としては、限定されるものではないが、外科手術、化学療法、放射線、ネオアジュバント治療、標的化治療、及び免疫療法が挙げられる。これらの方法の全ては、本発明のTILと組み合わせられ得る。
肺がんに対する化学療法治療計画は、薬物の組み合わせを含み得る。薬物の中でも、最も一般的に使用されるものは、シスプラチン(Platinol)又はカルボプラチン(Paraplatin)にドセタキセル(Taxotere)を加えたもの、ゲムシタビン(Gemzar)、パクリタキセル(Taxolなど)、ビノレルビン(Navelbineなど)、又はペメトレキセド(Alimta)である。
標的化治療としては、特定の遺伝子の変化又は欠損を遮断する薬物が挙げられる。そのような遺伝子変化又は欠損としては、限定されるものではないが、ALK遺伝子変化、EFGR遺伝子変化、BRAF遺伝子変化、MET(間葉上皮移行)遺伝子欠損、神経栄養因子チロシン受容体キナーゼ(NTRK)遺伝子欠損、ROS1遺伝子変化、RET(トランスフェクション中の再構成)遺伝子変化、又はMET(間葉上皮移行)遺伝子変化が挙げられる。
ALK遺伝子変化を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Alectinib(Alecensa)、Brigatinib(Alunbrig)、Ceritinib(Zykadia)、Crizotinib(Xalkori)、及びLorlatinib(Lorbrena)が挙げられる。
EFGR遺伝子変化を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Afatinib(Gilotrif)、Dacomitinib(Vizimpro)、Erlotinib(Tarceva)、Gefitinib(Iressa)、Necitumumab(Portrazza)、及びOsimertinib(Tagrisso)が挙げられる。
BRAF遺伝子変化を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、ダブラフェニブ(Tafinlar)及びトラメチニブ(Mekinist)が挙げられる。
MET(間葉上皮移行)遺伝子欠損を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、カプマチニブ(Tabrecta)が挙げられる。
神経栄養因子チロシン受容体キナーゼ(NTRK)遺伝子欠損を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Entrectinib(Rozlytrek)及びLarotrectinib(Vitrakvi)が挙げられる。
ROS1遺伝子変化欠損を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Ceritinib(Zykadia)、Crizotinib(Xalkori)、Entrectinib(Rozlytrek)、及びLorlatinib(Lorbrena)が挙げられる。
RET(トランスフェクション中の再構成)遺伝子変化を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Pralsetinib(Gavreto)及びSelpercatinib(Retevmo)が挙げられる。
MET(間葉上皮移行)遺伝子変化を遮断する薬物としては、限定されるものではないが、Capmatinib(Tabrecta)が挙げられる。
免疫療法としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、チェックポイント阻害剤、治療ワクチン、及び養子T細胞移植が挙げられる。具体的なモノクローナル抗体及びチェックポイント阻害剤が以下に企図されている。
本明細書に説明される組成物及び方法は、非小細胞肺がん(NSCLC)を治療するための方法において使用され得る。一実施形態では、NSCLCは、抗PD-1(Programmed death 1)抗体を用いた治療に対して難治性である。
いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、治療未経験である。いくつかの実施形態では、NSCLCは、抗PD-1抗体で治療されていない。いくつかの実施形態では、NSCLCは、抗PD-L1抗体で治療されていない。いくつかの実施形態では、NSCLCは、化学療法剤で以前に治療されている。いくつかの実施形態では、NSCLCは、化学療法剤で以前に治療されているが、化学療法剤でもはや治療されていない。いくつかの実施形態では、NSCLC患者は、抗PD-1/PD-L1未経験である。いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、PD-L1の低発現を有する。いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、治療未経験のNSCLCを有するか、又は化学療法後治療であるが、抗PD-1/PD-L1未経験である。いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、治療未経験のNSCLC、又は化学療法後治療であるが、抗PD-1/PD-L1未経験であり、PD-L1の低発現を有する。いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、ベースラインで巨大病変を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ベースラインで巨大病変を有し、PD-L1の低発現を有する。いくつかの実施形態では、NSCLC対象は、治療未経験のNSCLCを有するか、又は化学療法後であるが、PD-L1の低発現を有する、及び/若しくはベースラインで巨大病変を有する抗PD-1/PD-L1未経験である。いくつかの実施形態では、巨大病変は、最大腫瘍直径が横断面又は冠状面のいずれかにおける測定で7cm超である場合に示される。いくつかの実施形態では、巨大病変は、20mm以上の短軸直径を有する腫脹したリンパ節が存在するときに示される。いくつかの実施形態では、化学療法は、NSCLCに対する標準治療薬を含む。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIII又はステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIIIのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、がん遺伝子駆動性腫瘍を有し、がん遺伝子に直接的に向けられた少なくとも1つの有効な標的化療法で治療された。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIII又はステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、例えば、抗PD-1及び/又は抗PD-L1などの、例えば、PD-1阻害剤又はPD-L1阻害剤で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIIIのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、例えば、抗PD-1及び/又は抗PD-L1を含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、例えば、抗PD-1及び/又は抗PD-L1を含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIIIのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、抗PD-1含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、抗PD-1含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIIIのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、抗PD-L1含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、ステージIVのNSCLC(扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有し、抗PD-L1含む全身療法で以前に治療された。いくつかの実施形態では、治療される対象は、がん遺伝子駆動性腫瘍を有し、がん遺伝子に直接的に向けられた少なくとも1つの有効な標的化療法で治療された。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、組織学的又は病理学的に確定診断されたステージIII又はステージIVのNSCLC(扁平上皮、非扁平上皮、腺がん、大細胞がん)を有する。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、免疫療法未経験である。いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば、アジュバント又はネオアジュバント設定における全身療法を含むか、又は根治的化学放射線療法の一部として、最大で3回の事前の全身抗がん療法を受けていてもよい。いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば、EGFR、ALK、及び/又はROSにおける突然変異を含む、がん遺伝子突然変異を有する。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば、抗PD-1及び/又は抗PD-L1などのPD-1阻害剤又はPD-L1阻害剤を用いた全身療法を、<3回の事前ラインの全身療法の一部として、既に受けている。いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば、EGFR、ALK、及び/又はROSにおける突然変異を含む、がん遺伝子突然変異を有する。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、TIL調製で使用するための、切除後の少なくとも約1.5cmの直径の少なくとも1つの切除可能病変(又は凝集病変)を有する。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、最初の研究治療(すなわち、非骨髄性リンパ球枯渇(NMA-LD)又はペムブロリズマブの開始)の前に、最小限の持続時間の1つ以上の事前の抗がん療法からのウォッシュアウト期間を有した。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、上皮成長因子受容体(EGFR)、MEK、BRAF、ALK、ROS1、及び/又は他の標的化薬剤(例えば、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、及び/又はロラチニブ)による標的化療法、並びにTIL治療の開始前の少なくとも14日間の治療前の最小限のウォッシュアウトを有した。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、アジュバント、ネオアジュバント、又は根治的化学療法及び/若しくは化学放射線療法を有し、治療開始前の少なくとも21日間の治療前の最小限のウォッシュアウトを有した。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば、抗PD-1及び抗PD-L1などのPD-1阻害剤又はPD-L1阻害剤、他のmAb、並びに/又はワクチンによる事前チェックポイント標的化療法と、非骨髄性リンパ球枯渇(NMA-LD)の開始前の21日以上の最小限のウォッシュアウト期間を有した。
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)及びプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)阻害剤を用いた併用療法も企図される。
一実施形態では、PD-1阻害剤は、当該技術分野で公知の任意のPD-1阻害剤又はPD-1ブロッカーであってもよい。特に、以下の段落でより詳細に説明されるPD-1阻害剤又はブロッカーのうちの1つである。阻害剤、拮抗薬、及びブロッカーという用語は、PD-1阻害剤を参照して本明細書において互換的に使用される。疑義を避けるために記すと、抗体であるPD-1阻害剤に対する本明細書の参照は、化合物若しくは抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、又はそれらのバイオ後続品を指し得る。疑義を避けるために付言すると、本明細書におけるPD-L阻害剤への言及はまた、小分子化合物又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和化合物、水和物、共結晶、又はそのプロドラッグを指し得る。
好ましい実施形態では、PD-1阻害剤は、抗体(すなわち、抗PD-1抗体)、Fab断片を含むその断片、又はその単鎖可変断片(scFv)である。いくつかの実施形態では、PD-1阻害剤は、ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態では、PD-1阻害剤はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、PD-1阻害剤は、PD-1との結合について競合する、及び/又はPD-1上のエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、PD-1との結合について競合する、及び/又はPD-1上のエピトープに結合する。
抗PD-1治療薬としては、限定されるものではないが、Pembrolizumab(以前はMK-3475又はラムロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標))、Nivolumab(Opdivo)、Cemiplimab(Libtayo)、JTX-4014、Spartalizumab(PDR001)、Camrelizumab(SHR1210)、Sintilimab(IBI308)、Tislelizumab(BGB-A317)、Toripalimab(JS001)、Dostarlimab(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、及び/又はAMP-514が挙げられる。
抗PD-L1治療薬としては、限定されるものではないが、Atezolizumab(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)、Durvalumab(Imfinzi)、KN035、AUNP12、CA-170、及び/又はBMS-986189が挙げられる。一実施形態では、
別の実施形態では、TAFINLAR(登録商標)(ダブラフェニブ)を用いた治療も企図される。
別の実施形態では、CD152(分化152のクラスター)阻害剤としても知られるCTLA4又はCTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)も企図される。一実施形態では、阻害剤は、Yervoyというブランド名で販売されている、Ipilimumabである。
例示的な研究は、安全性導入期で始まる。安全性導入期は、TIL安全性の適格性基準を満たす進行固形腫瘍を有する3人の対象を評価する。安全性導入期事象(SLE)は、スポンサー及び少なくとも1人の研究者を含み得る安全性レビューチーム(SRT)によって評価される。SLEの発生率は、研究の進行を決定する。最初の3人の対象がSLEを経験しなかった場合、登録が拡大する。最初の3人の対象で1人の対象がSLEを経験した場合、追加の3人の対象を治療するために、安全性導入期が拡大される。最初の3人の対象で2人以上の対象がSLEを経験した場合、継続される研究の実施について更なる議論のために治験が停止される。
安全性導入期の完了後、疾患適応コホートが、各指標における安全性及び予備的TIL有効性を更に評価するために、独立して開き、登録する。各疾患適応コホートは、独立に登録され、登録完了まで進行する。登録は、NSCLCを有する9人の対象が、約5×109個を超えるTIL細胞で治療されるまで継続し、安全性導入期中に投与された対象を含む。疾患適応コホートを、疾患適応を有する第9の対象が治療され、追跡されてから3か月後に発生する中間解析(IA)によって、又はその時点で、疾患適応で治療された9~約15人の対象まで、更に拡大する決定がなされる。一次解析(PA)は、疾患適応コホートにおいて、最後の対象が治療されてから6か月後に行われ、6か月間続く。
第1のステップでは、スクリーニングは、同意から20(21)日以内である。第2のステップでは、腫瘍切除の登録は、同意から30日以内である。第3のステップでは、ベースラインは、リンパ球枯渇(LD)化学療法から10日以内である。第4のステップでは、約60mg/kg×2日(-7日目及び-6日目)でシクロホスファミド、及び約25mg/m2×5日(-7日目~-3日目)でフルダラビンを伴い得るLD化学療法を伴う。第5のステップでは、TIL/IL-2の投与及び観察期間が企図され、TIL投与後の12時間間隔で、最大8回まで、忍容性に応じて、約5×109個のT細胞(0日目)及びインターロイキン-2(IL-2)の約600,000IU/kgのIV投与の最低用量で、TILの単回IV投与を伴い得る。第6のステップでは、治療後の評価が、28日目に企図される。第7のステップでは、約6週目に始まる、疾患評価及び生存期間が企図される。LD化学療法の投与における変化は、軸骨格又は骨盤骨格に対する放射線療法の既往歴に基づいて、又は研究医療モニターと議論された、対象に特異的な併存疾患に対して必要に応じて実施され得る。シクロホスファミド60mg/kgの調整は、LD化学療法後のより急速な回復を確保にするために、30mg/kgまで低減され得る。
本発明は、子宮頸がんをTILで治療する方法を包含する。疾患適応コホートとして子宮頸がんが有利に企図される。本明細書に説明される方法によって産生されるTILは、有利に企図される。しかしながら、他の方法によって単離されたTILもまた、子宮頸がんを治療するために企図される。一般的に、生検又は外科的切除中に子宮頸がん腫瘍から収集され、インターロイキン-2(IL-2)、OKT-3、及び任意選択の抗原提示細胞(APC)を用いて大きな数に成長し、患者に再び注入される任意のTILは、子宮頸がんを治療するために意図され得る。
子宮頸がんは、子宮頸部内の、又は子宮頸部に由来する悪性腫瘍である。子宮頸がんは、世界中の女性における死因の第4位である。米国では、毎年10,000件を超える新規症例が識別されている。子宮頸がん患者は、疾患の初期段階では症状を経験しないことがある。女性における子宮頸がんの危険因子としては、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染歴、喫煙、及び他の因子が挙げられる。しかしながら、現在認識されているリスクカテゴリーの全ての患者が、子宮頸がんを発症するわけではない。子宮頸がんの症状は、異常な膣出血及び骨盤エリアの疼痛を含む。子宮頸がんは、例えば、扁平上皮細胞がん、及び腺がん、腺扁平上皮がん、小細胞がん、神経内分泌腫瘍、又は他のがん型であり得る。
子宮頸がんなどのがんに対する従来の治療選択肢としては、手術、放射線療法、及び化学療法が挙げられる。全てのがん、及び全ての子宮頸がんが、診断時に切除可能であるとは限らない。進行期にある子宮頸がん腫瘍などの腫瘍は、多くの場合、放射線療法又は化学療法治療を必要とする。
子宮頸がんを治療する方法はまた、子宮頸がんを治療するための治療薬と組み合わせて本発明のTILを組み合わせることを含み得る。いくつかの場合、化学療法剤は、抗微小管剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、小胞体ストレス誘導剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの場合、化学療法剤は、タキサンである。いくつかの場合、化学療法剤は、nab-パクリタキセル、5-フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン、シスプラチン、及びカペシタビンからなる群から選択される。いくつかの場合、グルココルチコイド受容体調節因子が経口投与される。いくつかの場合、グルココルチコイド受容体調節因子は、経皮適用、噴霧懸濁液、又はエアロゾルスプレーによって投与される。対象におけるがん性腫瘍の腫瘍負荷を低減させるための非ステロイド選択性グルココルチコイド受容体調節因子(SGRM)も企図される。非ステロイドグルココルチコイド受容体調節因子(GRM)も企図されており、限定されるものではないが、米国特許第5,696,127号、同第6,570,020号、及び同第6,051,573号に開示されるGR拮抗薬化合物、米国特許出願第2002/0077356号に開示されるGR拮抗薬化合物、Bradley et al.,J.Med. Chem.45,2417-2424(2002)、例えば、4.アルファ.(S)-ベンジル-2(R)-クロロエチニル-1,2,3,4,4.アルファ、9,10,10.アルファ.(R)-オクタヒドロ-フェナントレン--2,7-ジオール(「CP 394531」)及び4.アルファ.(S)-ベンジル-2(R)-プロップ-1-イニル-1,2,3,4,4.アルファ.,9,10,10.アルファ.(R)-oc-タヒドロ-フェナントレン-2,7-ジオール(「CP 409069」)、並びに6置換-1,2-ジヒドロ-N-保護-キノリンなどのステロイド受容体に対する高親和性、高選択性拮抗薬である非ステロイド化合物を説明するPCT国際出願第96/19458号に開示されている化合物を含む。
本発明の方法で利用され得る追加の化合物、及びそのような化合物を同定及び作製する方法について、6置換-1,2-ジヒドロ-N-1保護-キノリンなどのステロイド受容体に対する高親和性、高選択性調節因子(拮抗薬)である非ステロイド化合物を説明する米国特許第4,296,206号(上記参照)、米国特許第4,386,085号(上記参照)、米国特許第4,447,424号、同第4,477,445号、同第4,519,946号、同第4,540,686号、同第4,547,493号、同第4,634,695号、同第4,634,696号、同第4,753,932号、同第4,774,236号、同第4,808,710号、同第4,814,327号、同第4,829,060号、同第4,861,763号、同第4,912,097号、同第4,921,638号、同第4,943,566号、同第4,954,490号、同第4,978,657号、同第5,006,518号、同第5,043,332号、同第5,064,822号、同第5,073,548号、同第5,089,488号、同第5,089,635号、同第5,093,507号、同第5,095,010号、同第5,095,129号、同第5,132,299号、同第5,166,146号、同第5,166,199号、同第5,173,405号、同第5,276,023号、同第5,380,839号、同第5,348,729号、同第5,426,102号、同第5,439,913号、及び同第5,616,458号、並びにWO96/19458を参照されたい。いくつかの実施形態では、がんを治療するための併用療法は、融合アザデカリン骨格を有するGRM、ヘテロアリールケトン融合アザデカリン骨格、又はオクタヒドロ融合アザデカリン骨格を伴う。
特定の実施形態では、化学療法剤は、経験的最適化を条件として、米国食品医薬品局(FDA)又は他の規制機関によって承認された用量及びスケジュールによってガイドされ得る用量及びスケジュールで投与される。いくつかの場合、化学療法剤は、約100~1000mg、例えば、約200mg~800mg、約300mg~700mg、又は約400mg~600mg、例えば、約200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、又は700mgの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば、毎週、5日毎、4日毎、隔日から、毎日、1日2回、又は1日3回まで変化し得る。一実施形態では、化学療法剤は、治療期間全体又は一部分について、毎日約100mg~600mg、例えば、約100mg、200mg、260mg、300mg、400mg、若しくは600mg、隔日、又は4日毎に、経口投与又は静脈内投与で投与される。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、タキサンであり、例えば、本発明の方法に従って、任意の標準用量、例えば、FDAによって承認された用量で使用され得る。様々な実施形態では、タキサンは、nab-パクリタキセルであり、これは、28日サイクルの1日目、8日目、及び15日目に、30分間かけて、体表面積1平方メートル当たり80mg~125mgの範囲の用量で静脈内注入される。
いくつかの場合、SGRMの有効量は、1~100mg/kg/日の1日の用量であり、SGRMは、少なくとも1つの化学療法剤とともに投与される。いくつかの実施形態では、SGRMの1日の用量は、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100mg/kg/日である。いくつかの場合、グルココルチコイド受容体調節因子は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、又は80週間投与される。
PD-1:PD-L1軸は、他のチェックポイント軸と同様に、腫瘍微小環境中のT細胞の抗腫瘍機能を抑制する。抗PD-1、抗PD-L1、及び抗CTLA4抗体は、それらが阻害性免疫シグナルを崩壊させるため、広範な進行固形腫瘍の適応で承認されている。TIL ACTとの併用CPI療法のいくつかの臨床試験が進行中である(Kverneland AH et al Oncotarget 2020)。
抗PD1治療薬は、本発明のTILと組み合わせて投与され得る。抗PD-1治療薬としては、限定されるものではないが、Pembrolizumab(以前はMK-3475又はラムロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標))、Nivolumab(Opdivo)、Cemiplimab(Libtayo)、JTX-4014、Spartalizumab(PDR001)、Camrelizumab(SHR1210)、Sintilimab(IBI308)、Tislelizumab(BGB-A317)、Toripalimab(JS001)、Dostarlimab(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、及び/又はAMP-514が挙げられる。
抗PD-L1治療薬は、本発明のTILと組み合わせて投与され得る。抗PD-L1治療薬としては、限定されるものではないが、Atezolizumab(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)、Durvalumab(Imfinzi)、KN035、AUNP12、CA-170、及び/又はBMS-986189が挙げられる。
CTLA4又はCTLA-4治療薬は、本発明のTIL及び抗CD47抗体と組み合わせて投与され得る。CD152(分化152のクラスター)阻害剤としても知られるCTLA4又はCTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)が企図される。一実施形態では、阻害剤は、Yervoyというブランド名で販売されている、Ipilimumabである。
例示的な研究は、安全性導入期で始まる。安全性導入期は、TIL安全性の適格性基準を満たす進行固形腫瘍を有する3人の対象を評価する。安全性導入期事象(SLE)は、スポンサー及び少なくとも1人の研究者を含み得る安全性レビューチーム(SRT)によって評価される。SLEの発生率は、研究の進行を決定する。最初の3人の対象がSLEを経験しなかった場合、登録が拡大する。最初の3人の対象で1人の対象がSLEを経験した場合、追加の3人の対象を治療するために、安全性導入期が拡大される。最初の3人の対象で2人以上の対象がSLEを経験した場合、継続される研究の実施について更なる議論のために治験が停止される。
安全性導入期の完了後、疾患適応コホートが、各指標における安全性及び予備的TIL有効性を更に評価するために、独立して開き、登録する。各疾患適応コホートは、独立に登録され、登録完了まで進行する。登録は、子宮頸がんを有する9人の対象が、約5×109個を超えるTIL細胞で治療されるまで継続し、安全性導入期中に投与された対象を含む。疾患適応コホートを、疾患適応を有する第9の対象が治療され、追跡されてから3か月後に発生する中間解析(IA)によって、又はその時点で、疾患適応で治療された9~約15人の対象まで、更に拡大する決定がなされる。一次解析(PA)は、疾患適応コホートにおいて、最後の対象が治療されてから6か月後に行われ、6か月間続く。
第1のステップでは、スクリーニングは、同意から20(21)日以内である。第2のステップでは、腫瘍切除の登録は、同意から30日以内である。第3のステップでは、ベースラインは、リンパ球枯渇(LD)化学療法から10日以内である。第4のステップでは、約60mg/kg×2日(-7日目及び-6日目)でシクロホスファミド、及び約25mg/m2×5日(-7日目~-3日目)でフルダラビンを伴い得るLD化学療法を伴う。第5のステップでは、TIL/IL-2の投与及び観察期間が企図され、TIL投与後の12時間間隔で、最大8回まで、忍容性に応じて、約5×109個のT細胞(0日目)及びインターロイキン-2(IL-2)の約600,000IU/kgのIV投与の最低用量で、TILの単回IV投与を伴い得る。第6のステップでは、治療後の評価が、28日目に企図される。第7のステップでは、約6週目に始まる、疾患評価及び生存期間が企図される。LD化学療法の投与における変化は、軸骨格又は骨盤骨格に対する放射線療法の既往歴に基づいて、又は研究医療モニターと議論された、対象に特異的な併存疾患に対して必要に応じて実施され得る。シクロホスファミド60mg/kgの調整は、LD化学療法後のより急速な回復を確保にするために、30mg/kgまで低減され得る。
本発明は、頭頸部がん、有利には、扁平上皮がん(HNSCC)をTILで治療する方法を包含する。疾患適応コホートとしてHNSCCが有利に企図される。本明細書に説明される方法によって産生されるTILは、有利に企図される。しかしながら、他の方法によって単離されたTILもまた、HNSCCなどの頭頸部がんを治療するために企図される。一般的に、生検又は外科的切除中に頭頸部がん腫瘍から収集され、インターロイキン-2(IL-2)、OKT-3、及び任意選択の抗原提示細胞(APC)を用いて大きな数に成長し、患者に再び注入される任意のTILは、HNSCCなどの頭頸部がんを治療するために意図され得る。
頭頸部扁平上皮細胞がん(HNSCC)は、世界で6番目に多い非皮膚がんであり、年間約600,000の症例の発生及び約50%の死亡率を有する。HNSCCの主な危険因子は、タバコの使用、アルコールの摂取、及びヒトパピローマウイルス(HPV)による感染である。その疫学及び病因に関する知識の進歩にもかかわらず、多くのタイプのHNSCCの生存率は、過去40年間でほとんど改善していない。HNSCC患者の全5年生存率は約50%に過ぎず、この数値は30年を超えても変化していない。
本発明はまた、本発明のTILを、HNSCCを治療するための公知の治療薬と組み合わせて投与することも企図する。
治療方法は、HNSCC関連遺伝子の遺伝子産物の活性のうちの1つ以上を調節する薬剤と細胞を接触させることを含み得る。HNSCC関連遺伝子としては、限定されるものではないが、TP63、CCND1、CCNE1、MYC、YAP1、HRAS、PIK3CA、PIK3CG、NOTCH1、NOTCH 2、NOTCH 3、IRF6、CDKN2A、TP53、CASP8、PTEN、FAT1、RIPK4、EZH1、EZH2、MED1、MLL2、CDH1、FBXW7、PCLO、RIMS2、RB1、NSD1、EP300、NFE2L2が挙げられ得る。例示的な異常な機能獲得HNSCC遺伝子としては、TP63、CCND1、CCNE1、MYC、YAP1、HRAS、PIK3CA、PIK3CG、又はNFE2L2が挙げられ得る。例示的な異常な機能喪失HNSCC遺伝子としては、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、IRF6、CDKN2A、TP53、CASP8、PTEN、FAT1、RIPK4、EZH1、EZH2、MED1、MLL2、CDH1、FBXW7、PCLO、RIMS2、RB1、NSD1、又はEP300が挙げられ得る。タンパク質活性を調節する薬剤としては、核酸若しくはタンパク質、これらのタンパク質の天然由来の同族リガンド、ペプチド、ペプチド模倣体、又は他の小分子が挙げられる。例えば、薬剤は、差次的に発現が不十分な遺伝子のうちの1つ以上のタンパク質活性を刺激する。
化学療法剤は、アルキル化剤、抗血管形成剤、抗ホルモン(抗アンドロゲンなど)、抗代謝産物、細胞周期阻害剤、成長因子阻害剤、挿入抗生物質、有糸分裂阻害剤、又はトポイソメラーゼ阻害剤であり得る。化学療法剤がアルキル化剤である場合、アルキル化剤は、アルキルスルホン酸塩(ブスルファンなど)、窒素マスタード(クロラムブシル、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、又はウラシルマスタードなど)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、ダカルバジン、ロムスチン、セムスチン、又はストレプトゾシン)であり得る。化学療法剤が代謝拮抗薬である場合、代謝拮抗薬は、葉酸類似体(メトトレキサートなど)、プリン類似体(メルカプトプリン又はチオグアニンなど)、又はピリミジン類似体(5-FU又はシタラビンなど)であり得る。化学療法剤が抗ホルモンである場合、抗ホルモンは、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、フルオキシメステロン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸マジェストロール、プレドニゾン、タモキシフェン、又はテスタロンプロピオネートであり得る。
他の実施形態では、化学療法剤は、Adriamycin、Alkeran、Ara-C、Bevacizumab、BiCNU、Busulfan、CCNU、Calcitriol、Carboplatinum、Cetuximab(Erbitux(商標))、Cisplatin、Cisplatinum、Cytoxan、Daunorubicin、DTIC、Erlotinib、5-FU、Fludarabine、Gemcitabine(Gemzar)、Herceptin、Hydrea、Idarubicin、Ifosfamide、Irinotecan(Camptosar、CPT-11)、Leustatin、Methotrexate、Mithramycin、Mitomycin、Mitoxantrone、Navelbine、Nitrogen Mustard、Rituxan STI-571、Taxol(又はドセタキセルなどの他のタキサン類)、Topotecan(Hycamtin)、Taxotere、Velban、Vincristine、VP-16、Xeloda(Capecitabine)、又はZevelinであり得る。
組成物、例えば、ポリペプチド及び有機化合物は、約0.1~約250mg/kg/日の用量で、経口又は注射を介して投与され得る。成人ヒトの用量範囲は、概して、約5mg~約17.5g/日、好ましくは約5mg~約10g/日、最も好ましくは約100mg~約3g/日である。別個の単位で提供される錠剤又は他の単位剤形の提示は、簡便に、そのような用量で、又はその倍数として有効である量、例えば、約5mg~約500mg、通常は約100mg~約500mgを含有する単位を含有し得る。核酸、例えば、DNA構築物は、0.005~50mg/kgの体重の範囲内の用量で投与される。あるいは、核酸分子の場合、静脈内用量は、106~1022個のコピーの範囲内である。
用いられる用量は、対象の年齢及び性別、治療される正確な障害又は症状、並びにその重症度を含む、多くの因子に依存することになる。また、投与経路は、状態及びその重症度に応じて変化し得る。
頭頸部細胞がん(HNSCC)又はその関連する前がん病変の細胞成長を阻害する薬剤は、抗体、アンチセンス化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子であり得る。有利には、アンチセンス又はポリヌクレオチドは、短ヘアピンRNA(shRNA)又は短鎖干渉RNA(siRNA)であり得る。小分子は、HNSCC関連遺伝子の活性を阻害することができる約100~約1000ダルトンの分子量を有する分子であり得る。
数多くの抗がん剤及び療法が、本方法及び組成物との組み合わせに利用可能である。以下は、照射と併用され得る抗がん剤(抗腫瘍剤)の非網羅的リストである。Acivicin、Aclarubicin、Acodazole Hydrochloride、Acrinine、Adozelesin、Aldesleukin、Altretamine、Ambomycin、Ametantrone Acetate、Aminoglutethimide、Amsacrine、Anastrozole、Anthramycin、Asparaginase、Asperlin、Azacitidine、Azetepa、Azotomycin、Batimastat、Benzodepa、Bicalutamide、Bisantrene Hydrochloride、Bisnafide Dimesylate、Bizelesin、Bleomycin Sulfate、Brequinar Sodium、Bropirimine、Busulfan、Cactinomycin、Calusterone、Caracemide、Carbetimer、Carboplatin、Carmustine、Carubicin Hydrochloride、Carzelesin、Cedefingol、Chlorambucil、Cirolemycin、Cisplatin、Cladribine、Crisnatol Mesylate、Cyclophosphamide、Cytarabine、Dacarbazine、Dactinomycin、Daunorubicin Hydrochloride、Decitabine、Dexormaplatin、Dezaguanine、Dezaguanine Mesylate、Diaziquone、Docetaxel、Doxorubicin、Doxorubicin Hydrochloride、Droloxifene、Droloxifene Citrate、Dromostanolone Propionate、Duazomycin、Edatrexate、Eflomithine Hydrochloride、Elsamitrucin、Enloplatin、Enpromate、Epipropidine、Epirubicin Hydrochloride、Erbulozole、Esorubicin Hydrochloride、Estramustine、Estramustine Phosphate Sodium、Etanidazole、Ethiodized Oil 1131、Etoposide、Etoposide Phosphate、Etoprine、Fadrozole Hydrochloride、Fazarabine、Fenretinide、Floxuridine、Fludarabine Phosphate、Fluorouracil、Flurocitabine、Fosquidone、Fostriecin Sodium、Gemcitabine、Gemcitabine Hydrochloride、Gold Au 198、Hydroxyurea、Idarubicin Hydrochloride、Ifosfamide、Ilmofosine、Iproplatin、Irinotecan Hydrochloride、Lanreotide Acetate、Letrozole、Leuprolide Acetate、Liarozole Hydrochloride、Lometrexol Sodium、Lomustine、Losoxantrone Hydrochloride、Masoprocol、Maytansine、Mechlorethamine Hydrochloride、Megestrol Acetate、Melengestrol Acetate、Melphalan、Menogaril、Mercaptopurine、Methotrexate、Methotrexate Sodium、Metoprine、Meturedepa、Mitindomide、Mitocarcin、Mitocromin、Mitogillin、Mitomalcin、Mitomycin、Mitosper、Mitotane、Mitoxantrone Hydrochloride、Mycophenolic Acid、Nocodazole、Nogalamycin、Ormaplatin、Oxisuran、Paclitaxel、Pegaspargase、Peliomycin、Pentamustine、Peplomycin Sulfate、Perfosfamide、Pipobroman、Piposulfan、Piroxantrone Hydrochloride、Plicamycin、Plomestane、Porfimer Sodium、Porfiromycin、Prednimustine、Procarbazine Hydrochloride、Puromycin、Puromycin Hydrochloride、Pyrazofurin、Riboprine、Rogletimide、Safmgol、Safingol Hydrochloride、Semustine、Simtrazene、Sparfosate Sodium、Sparsomycin、Spirogermanium Hydrochloride、Spiromustine、Spiroplatin、Streptonigrin、Streptozocin、Strontium Chloride Sr 89、Sulofenur、Talisomycin、Taxane、Taxoid、Tecogalan Sodium、Tegafur、Teloxantrone Hydrochloride、Temoporfin、Teniposide、Teroxirone、Testolactone、Thiamiprine、Thioguanine、Thiotepa、Tiazofurin、Tirapazamine、Topotecan Hydrochloride、Toremifene Citrate、Trestolone Acetate、Triciribine Phosphate、Trimetrexate、Trimetrexate Glucuronate、Triptorelin、Tubulozole Hydrochloride、Uracil Mustard、Uredepa、Vapreotide、Verteporfin、Vinblastine Sulfate、Vincristine Sulfate、Vindesine、Vindesine Sulfate、Vinepidine Sulfate、Vinglycinate Sulfate、Vinleurosine Sulfate、Vinorelbine Tartrate、Vinrosidine Sulfate、Vinzolidine Sulfate、Vorozole、Zeniplatin、Zinostatin、Zorubicin Hydrochloride。
例示的な研究は、安全性導入期で始まる。安全性導入期は、TIL安全性の適格性基準を満たす進行固形腫瘍を有する3人の対象を評価する。安全性導入期事象(SLE)は、スポンサー及び少なくとも1人の研究者を含み得る安全性レビューチーム(SRT)によって評価される。SLEの発生率は、研究の進行を決定する。最初の3人の対象がSLEを経験しなかった場合、登録が拡大する。最初の3人の対象で1人の対象がSLEを経験した場合、追加の3人の対象を治療するために、安全性導入期が拡大される。最初の3人の対象で2人以上の対象がSLEを経験した場合、継続される研究の実施について更なる議論のために治験が停止される。
安全性導入期の完了後、疾患適応コホートが、各指標における安全性及び予備的TIL有効性を更に評価するために、独立して開き、登録する。各疾患適応コホートは、独立に登録され、登録完了まで進行する。登録は、HNSCCを有する9人の対象が、約5×109個を超えるTIL細胞で治療されるまで継続し、安全性導入期中に投与された対象を含む。疾患適応コホートを、疾患適応を有する第9の対象が治療され、追跡されてから3か月後に発生する中間解析(IA)によって、又はその時点で、疾患適応で治療された9~約15人の対象まで、更に拡大する決定がなされる。一次解析(PA)は、疾患適応コホートにおいて、最後の対象が治療されてから6か月後に行われ、6か月間続く。
第1のステップでは、スクリーニングは、同意から20(21)日以内である。第2のステップでは、腫瘍切除の登録は、同意から30日以内である。第3のステップでは、ベースラインは、リンパ球枯渇(LD)化学療法から10日以内である。第4のステップでは、約60mg/kg×2日(-7日目及び-6日目)でシクロホスファミド、及び約25mg/m2×5日(-7日目~-3日目)でフルダラビンを伴い得るLD化学療法を伴う。第5のステップでは、TIL/IL-2の投与及び観察期間が企図され、TIL投与後の12時間間隔で、最大8回まで、忍容性に応じて、約5×109個のT細胞(0日目)及びインターロイキン-2(IL-2)の約600,000IU/kgのIV投与の最低用量で、TILの単回IV投与を伴い得る。第6のステップでは、治療後の評価が、28日目に企図される。第7のステップでは、約6週目に始まる、疾患評価及び生存期間が企図される。LD化学療法の投与における変化は、軸骨格又は骨盤骨格に対する放射線療法の既往歴に基づいて、又は研究医療モニターと議論された、対象に特異的な併存疾患に対して必要に応じて実施され得る。シクロホスファミド60mg/kgの調整は、LD化学療法後のより急速な回復を確保にするために、30mg/kgまで低減され得る。
本発明は、皮膚がんをTILで治療する方法を包含する。非黒色腫皮膚がん及び皮膚扁平上皮がんが有利に企図される。本明細書に説明される方法によって産生されるTILは、有利に企図される。しかしながら、他の方法によって単離されたTILもまた、皮膚がんを治療するために企図される。一般的に、生検又は外科的切除中に皮膚がん腫瘍から収集され、インターロイキン-2(IL-2)、OKT-3、及び任意選択の抗原提示細胞(APC)を用いて大きな数に成長し、患者に再び注入される任意のTILは、皮膚がんを治療するために意図され得る。
皮膚がんは、米国において最も一般的ながんである(Guy et al 2015,Am.J.Prey.Med.48:183-7)。2012年、米国において、基底細胞がん及び扁平上皮がんを含む、推定540万症例の非黒色腫皮膚がんが診断された(Rogers et al 2015,JAMA Dermatol.,Published online Apr.30,2015)。皮膚扁平上皮細胞がん(CSCC)は、米国において基底細胞がん(BCC)に次いで2番目に多い悪性腫瘍である(Karia et al 2013,J.Am.Acad.Dermatol.68:957-966)。CSCCの危険因子としては、UV曝露、高齢、及び免疫抑制が挙げられる(Alam et al 2001,New Engl.J.Med.344(975-983)、Madan 2010,Lancet 375:673-685)。CSCC又はBCCの診断を受けている個人の大半は、非常に良好な予後を有するが、CSCCは、BCCよりもアグレッシブな再発のより強い傾向を有する。CSCCと診断された個人は、BCCと診断された個人とは異なり、年齢が一致する対照と比較して増加した死亡率を有する(Rees et al 2015,Int.J.Cancer 137:878-84)。
外科的切除は、CSCCの臨床管理の中核である。一次目標は、がんの完全切除であり、許容可能な美容的転帰は、二次目標である。CSCCの予後不良と関連付けられた因子としては、腫瘍サイズ>2cm、腫瘍深度>2mm、神経周囲浸潤、宿主免疫抑制、及び再発性病変が挙げられる。切除不能な局所再発又は転移性疾患を発症する少数のパーセンテージの患者について、治療選択肢は、限定されている。患者は、術後放射線療法を施され得る。化学療法は、安全性及び忍容性の懸念に起因して、多くの患者にとって魅力的な選択肢ではない。
最も一般的な臨床サブタイプは、結節性BCCである。あまり一般的ではない臨床サブタイプは、表在性、形態形成(線維化)、及び線維上皮である。ほとんどの患者は、手術によって治癒するが、少数パーセンテージの患者は、切除不能な局所進行又は転移性疾患を発症する。事実上、全てのBCCは、ヘッジホッグシグナル伝達経路の異常シグナル伝達を特徴とし、最も一般的には、腫瘍抑制因子である、タンパク質パッチホモログ(PTCH)をコードする遺伝子内の孤発性機能喪失突然変異に起因する。PTCH突然変異は、G-タンパク質共役受容体スムーズンド(SMO)のパッチ媒介性阻害の喪失を結果的にもたらし、それによって、制御不能な細胞増殖を結果的にもたらす下流シグナル伝達を増強する(Sekulic et al 2016,Cell 164:831)。BCCにおけるSMOの発がん性役割の認識は、一般にヘッジホッグ阻害剤(HHI)と呼ばれる、経口的に利用可能なSMOの阻害剤である、ビスモジブ及びソニデギブの開発につながった。HHIの有害な副作用に加えて、1つのHHI(ビスモデギブ)で進行する患者について、別のHHI(ソネデギブ)によるその後の治療は、腫瘍阻害を結果的にもたらさなかったことが見出された(Danial et al 2016,Clin.Cancer Res.22:1325-29)。HHI療法で疾患の進行を経験した患者、又は事前HHI療法に不耐性である患者において、BCCのために承認された薬剤はない。
PD-1:PD-L1軸は、他のチェックポイント軸と同様に、腫瘍微小環境中のT細胞の抗腫瘍機能を抑制する。抗PD-1、抗PD-L1、及び抗CTLA4抗体は、それらが阻害性免疫シグナルを崩壊させるため、広範な進行固形腫瘍の適応で承認されている。TIL ACTとの併用CPI療法のいくつかの臨床試験が進行中である(Kverneland AH et al Oncotarget 2020)。
抗PD1治療薬は、本発明のTILと組み合わせて投与され得る。抗PD-1治療薬としては、限定されるものではないが、Pembrolizumab(以前はMK-3475又はラムロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標))、Nivolumab(Opdivo)、Cemiplimab(Libtayo)、JTX-4014、Spartalizumab(PDR001)、Camrelizumab(SHR1210)、Sintilimab(IBI308)、Tislelizumab(BGB-A317)、Toripalimab(JS001)、Dostarlimab(TSR-042、WBP-285)、INCMGA00012(MGA012)、AMP-224、及び/又はAMP-514が挙げられる。
抗PD-L1治療薬は、本発明のTILと組み合わせて投与され得る。抗PD-L1治療薬としては、限定されるものではないが、Atezolizumab(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)、Durvalumab(Imfinzi)、KN035、AUNP12、CA-170、及び/又はBMS-986189が挙げられる。
CTLA4又はCTLA-4治療薬は、本発明のTIL及び抗CD47抗体と組み合わせて投与され得る。CD152(分化152のクラスター)阻害剤としても知られるCTLA4又はCTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)が企図される。一実施形態では、阻害剤は、Yervoyというブランド名で販売されている、Ipilimumabである。
表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤もまた、本発明のTILを用いて皮膚がんを治療するために企図される。いくつかのEGFR阻害剤は、タンパク質キナーゼ阻害剤である。
以下の表に、いくつかの利用可能なEGFR阻害剤が例示される。
EGFR=上皮成長因子受容体、PDGFR=血小板由来成長因子受容体、VEGFR=血管内皮成長因子受容体
現在、B-RAF陽性転移性黒色腫の治療に有効である小分子突然変異B-RAF阻害剤であるベムラフェニブ及びダブラフェニブに大きな関心がある。B-RAFは、特異的トレオニンキナーゼタンパク質である。
非黒色腫皮膚がんの適応症、特に皮膚扁平上皮がん(cSCC)(Migden MR et al Lancet Oncol 2020)及びメルケル細胞がん(MCC)(Nghiem PT et al NEJM 2016)におけるCPIの有効性に関するデータは、これらの適応症におけるセミプリマブ及びペムブロリズマブの承認につながった。cSCC及びMCCにおけるUV駆動突然変異は、黒色腫に見られるような同様のがんネオ抗原の発生につながり得る。PD-1阻害に失敗した患者は、良い選択肢を有していない。
例示的な研究は、安全性導入期で始まる。安全性導入期は、TIL安全性の適格性基準を満たす進行非黒色腫皮膚がんを有する3人の対象を評価する。安全性導入期事象(SLE)は、スポンサー及び少なくとも1人の研究者を含み得る安全性レビューチーム(SRT)によって評価される。SLEの発生率は、研究の進行を決定する。最初の3人の対象がSLEを経験しなかった場合、登録は、合計で9人から18人の対象まで拡大し、最低9人は、cSCC(皮膚扁平上皮細胞がん)の治療を受ける。最初の3人の対象で1人の対象がSLEを経験した場合、非黒色腫皮膚がんを有する追加の3人の対象を治療するために、安全性導入期が拡大される。最初の3人の対象で2人以上の対象がSLEを経験した場合、継続される研究の実施について更なる議論のために治験が停止される。
安全性導入期の完了後、コホートは、拡大し、cSCCを有する最低9人の対象を登録する。登録は、cSCCを有する9人の対象が、約5×109個を超えるTIL細胞で治療されるまで継続し、安全性導入期中に投与された対象を含む。登録を、最大約15人のcSCCを有する対象、又は以下の時点まで、又は以下の時点で、コホートにおいて、治療されたメルケル細胞がん(MCC)を有する合計約9~15人の対象に更に拡大する決定がなされた:cSCCを有する第9の対象が治療及び追跡されてから3か月後に行われる中間解析(IA)。一次解析(PA)は、コホートにおいて最後の対象が治療されてから6か月後に行われ、6か月間続く。
第1のステップでは、スクリーニングは、同意から20(21)日以内である。第2のステップでは、腫瘍切除の登録は、同意から30日以内である。第3のステップでは、ベースラインは、リンパ球枯渇(LD)化学療法から10日以内である。第4のステップでは、約60mg/kg×2日(-7日目及び-6日目)でシクロホスファミド、及び約25mg/m2×5日(-7日目~-3日目)でフルダラビンを伴い得るLD化学療法を伴う。第5のステップでは、TIL/IL-2の投与及び観察期間が企図され、TIL投与後の12時間間隔で、最大8回まで、忍容性に応じて、約5×109個のT細胞(0日目)及びインターロイキン-2(IL-2)の約600,000IU/kgのIV投与の最低用量で、TILの単回IV投与を伴い得る。第6のステップでは、治療後の評価が、28日目に企図される。第7のステップでは、約6週目に始まる、疾患評価及び生存期間が企図される。LD化学療法の投与における変更は、例えば、患者の年齢に関連する、LD化学療法後の回復不良数の履歴又はその疑いに基づいて実施され得る。シクロホスファミド60mg/kgの調整が300~500mg/m2に低減されて、LD化学療法と関連付けられた回復数を増加させ得る。IL-2の投与における変更は、中間及び低用量レジメンを含む、高齢対象に対して実装され得る。
治療用量は、少なくとも0.01mg/kg体重、少なくとも0.05mg/kg体重、少なくとも0.1mg/kg体重、少なくとも0.5mg/kg体重、少なくとも1mg/kg体重、少なくとも2mg/kg体重、少なくとも2.5mg/kg体重、少なくとも5mg/kg体重、少なくとも7.5mg/kg体重、少なくとも10mg/kg体重、少なくとも15mg/kg体重、少なくとも20mg/kg体重、少なくとも25mg/kg体重、少なくとも30mg/kg体重、少なくとも35mg/kg体重、少なくとも40mg/kg体重、少なくとも45mg/kg体重、少なくとも50mg/kg体重、少なくとも55mg/kg体重、少なくとも60mg/kg体重、少なくとも65mg/kg体重、少なくとも70mg/kg体重、少なくとも75mg/kg体重、少なくとも80mg/kg体重、少なくとも85mg/kg体重、少なくとも90mg/kg体重、少なくとも95mg/kg体重、少なくとも100mg/kg体重、少なくとも110mg/kg体重、少なくとも120mg/kg体重、少なくとも130mg/kg体重、少なくとも140mg/kg体重、少なくとも150mg/kg体重、少なくとも160mg/kg体重、少なくとも170mg/kg体重、少なくとも180mg/kg体重、少なくとも190mg/kg体重、少なくとも200mg/kg体重、少なくとも210mg/kg体重、少なくとも220mg/kg体重、少なくとも230mg/kg体重、少なくとも240mg/kg体重、少なくとも250mg/kg体重、少なくとも260mg/kg体重、少なくとも270mg/kg体重、少なくとも280mg/kg体重、少なくとも290mg/kg体重、少なくとも300mg/kg体重、少なくとも310mg/kg体重、少なくとも320mg/kg体重、少なくとも330mg/kg体重、少なくとも340mg/kg体重、少なくとも350mg/kg体重、少なくとも360mg/kg体重、少なくとも370mg/kg体重、少なくとも380mg/kg体重、少なくとも390mg/kg体重、少なくとも400mg/kg体重、少なくとも410mg/kg体重、少なくとも420mg/kg体重、少なくとも430mg/kg体重、少なくとも440mg/kg体重、少なくとも450mg/kg体重、少なくとも460mg/kg体重、少なくとも470mg/kg体重、少なくとも480mg/kg体重、少なくとも490mg/kg体重、及び少なくとも500mg/kg体重であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、500mg/kg体重以下である。当業者であれば、そのようなガイドラインは、例えば、抗体断片の使用、又は抗体コンジュゲートの使用において、活性薬剤の分子量に対して調整されることになることを理解するであろう。用量はまた、局所投与、例えば、鼻腔内投与、吸入など、又は全身投与、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内などのために変化し得る。有利には、用量は、約1~10mg/kg(有利には約1mg/kg若しくは2mg/kg)、又は代替的に、必要に応じて、約200mg~約240mgの約2週間毎の頻度の固定用量であり得る。
数多くの抗がん剤及び療法が、本方法及び組成物との組み合わせに利用可能である。以下は、照射と併用され得る抗がん剤(抗腫瘍剤)の非網羅的リストである。Acivicin、Aclarubicin、Acodazole Hydrochloride、Acrinine、Adozelesin、Aldesleukin、Altretamine、Ambomycin、Ametantrone Acetate、Aminoglutethimide、Amsacrine、Anastrozole、Anthramycin、Asparaginase、Asperlin、Azacitidine、Azetepa、Azotomycin、Batimastat、Benzodepa、Bicalutamide、Bisantrene Hydrochloride、Bisnafide Dimesylate、Bizelesin、Bleomycin Sulfate、Brequinar Sodium、Bropirimine、Busulfan、Cactinomycin、Calusterone、Caracemide、Carbetimer、Carboplatin、Carmustine、Carubicin Hydrochloride、Carzelesin、Cedefingol、Chlorambucil、Cirolemycin、Cisplatin、Cladribine、Crisnatol Mesylate、Cyclophosphamide、Cytarabine、Dacarbazine、Dactinomycin、Daunorubicin Hydrochloride、Decitabine、Dexormaplatin、Dezaguanine、Dezaguanine Mesylate、Diaziquone、Docetaxel、Doxorubicin、Doxorubicin Hydrochloride、Droloxifene、Droloxifene Citrate、Dromostanolone Propionate、Duazomycin、Edatrexate、Eflomithine Hydrochloride、Elsamitrucin、Enloplatin、Enpromate、Epipropidine、Epirubicin Hydrochloride、Erbulozole、Esorubicin Hydrochloride、Estramustine、Estramustine Phosphate Sodium、Etanidazole、Ethiodized Oil 1131、Etoposide、Etoposide Phosphate、Etoprine、Fadrozole Hydrochloride、Fazarabine、Fenretinide、Floxuridine、Fludarabine Phosphate、Fluorouracil、Flurocitabine、Fosquidone、Fostriecin Sodium、Gemcitabine、Gemcitabine Hydrochloride、Gold Au 198、Hydroxyurea、Idarubicin Hydrochloride、Ifosfamide、Ilmofosine、Iproplatin、Irinotecan Hydrochloride、Lanreotide Acetate、Letrozole、Leuprolide Acetate、Liarozole Hydrochloride、Lometrexol Sodium、Lomustine、Losoxantrone Hydrochloride、Masoprocol、Maytansine、Mechlorethamine Hydrochloride、Megestrol Acetate、Melengestrol Acetate、Melphalan、Menogaril、Mercaptopurine、Methotrexate、Methotrexate Sodium、Metoprine、Meturedepa、Mitindomide、Mitocarcin、Mitocromin、Mitogillin、Mitomalcin、Mitomycin、Mitosper、Mitotane、Mitoxantrone Hydrochloride、Mycophenolic Acid、Nocodazole、Nogalamycin、Ormaplatin、Oxisuran、Paclitaxel、Pegaspargase、Peliomycin、Pentamustine、Peplomycin Sulfate、Perfosfamide、Pipobroman、Piposulfan、Piroxantrone Hydrochloride、Plicamycin、Plomestane、Porfimer Sodium、Porfiromycin、Prednimustine、Procarbazine Hydrochloride、Puromycin、Puromycin Hydrochloride、Pyrazofurin、Riboprine、Rogletimide、Safmgol、Safingol Hydrochloride、Semustine、Simtrazene、Sparfosate Sodium、Sparsomycin、Spirogermanium Hydrochloride、Spiromustine、Spiroplatin、Streptonigrin、Streptozocin、Strontium Chloride Sr 89、Sulofenur、Talisomycin、Taxane、Taxoid、Tecogalan Sodium、Tegafur、Teloxantrone Hydrochloride、Temoporfin、Teniposide、Teroxirone、Testolactone、Thiamiprine、Thioguanine、Thiotepa、Tiazofurin、Tirapazamine、Topotecan Hydrochloride、Toremifene Citrate、Trestolone Acetate、Triciribine Phosphate、Trimetrexate、Trimetrexate Glucuronate、Triptorelin、Tubulozole Hydrochloride、Uracil Mustard、Uredepa、Vapreotide、Verteporfin、Vinblastine Sulfate、Vincristine Sulfate、Vindesine、Vindesine Sulfate、Vinepidine Sulfate、Vinglycinate Sulfate、Vinleurosine Sulfate、Vinorelbine Tartrate、Vinrosidine Sulfate、Vinzolidine Sulfate、Vorozole、Zeniplatin、Zinostatin、Zorubicin Hydrochloride。
本発明及びその利点が詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置き換え、及び変更を本明細書に加えることができることを理解されたい。
本発明は、以下の実施例で更に例示されており、これらの実施例は例示のみを目的としており、決して本発明を限定するようには意図されていない。
実施例1
図39は、使用中のバッグ400の実施形態を示す。図示されるように、バッグ400は、トレー406などのデバイス404内のクランプ402などの固設要素によって固設される。組織408は、バッグ400の透明な側部を通して視認可能である。チューブ410は、バッグ400に結合される。
図39は、使用中のバッグ400の実施形態を示す。図示されるように、バッグ400は、トレー406などのデバイス404内のクランプ402などの固設要素によって固設される。組織408は、バッグ400の透明な側部を通して視認可能である。チューブ410は、バッグ400に結合される。
実施例2
図40は、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグ420の実施形態を図示する。図示されるように、バッグ420は、デバイス及びトレー424からの固設要素422によって固設される。組織材料424は、バッグ420の透明な側部を通して視認可能である。チューブ426は、バッグ420に結合される。示されるように、トレイ406内のバッグ400の位置は、固定要素428、特にテープを使用して更に固設される。組織424は、バッグ420の透明な側部を通して視認可能である。図40に示されるように、バッグは、バッグ及び/又は組織424の内部にアクセスするためのポート430を含み得る。
図40は、本明細書に説明される本発明で使用するためのバッグ420の実施形態を図示する。図示されるように、バッグ420は、デバイス及びトレー424からの固設要素422によって固設される。組織材料424は、バッグ420の透明な側部を通して視認可能である。チューブ426は、バッグ420に結合される。示されるように、トレイ406内のバッグ400の位置は、固定要素428、特にテープを使用して更に固設される。組織424は、バッグ420の透明な側部を通して視認可能である。図40に示されるように、バッグは、バッグ及び/又は組織424の内部にアクセスするためのポート430を含み得る。
実施例3-脱凝集及び凍結保存
TIL075を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=1.4g。S1を、自動手順によって脱凝集した。S2=19.4g。S2を分割し、1つの部分(約7.7g)を自動手順によって脱凝集し、第2の部分(約12g)を手動で脱凝集した。
TIL075を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=1.4g。S1を、自動手順によって脱凝集した。S2=19.4g。S2を分割し、1つの部分(約7.7g)を自動手順によって脱凝集し、第2の部分(約12g)を手動で脱凝集した。
手動脱凝集:腫瘍試料を、より小さい2~4mm3の断片に切断し、抗生物質を含む80mlの消化培地を収容するボトルに添加した。ボトルを振盪機に配置し、37℃で一晩(約14時間)脱凝集した。次いで、消化物をネットウェル及び100μM細胞ストレーナーを通してFalcon50チューブに濾過した。濾過された消化物の10%を無菌試験のために確保した。残りを遠心分離し、12mlのCS10中に再懸濁し、12のクライオバイアルに分割した。
Tiss-U-Stor脱凝集:2つのCS50Nバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。S1 1.4gmの試料及びS2の7.7gm部分をCS50Nバッグ内に配置し、バッグを封止した。15mlの脱凝集培地と30ulの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをViaFreezeに装填されたTissue Disaggregatorに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から1.5℃/分の速度で35℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、35℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を240サイクル/分に設定した。ViaFreezeの温度は、その後、凍結保存ステップまで35℃のままであった。
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。CS50バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。1.5mlのBlood-stor(DMSO)を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにViaFreezeに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ViaFreezeの温度を35℃から-2℃/分で-80℃まで上昇させた。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例4-脱凝集及び凍結保存
TIL077を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=4.6g。S2=4.6g。
TIL077を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=4.6g。S2=4.6g。
Tiss-U-Stor脱凝集:2つのCS50Nバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。S1=4.6gmの試料及びS2=4.6gmの試料をCS50Nバッグ内に配置し、バッグを封止した。15mlの脱凝集培地と30ulの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをViaFreezeに装填されたTissue Disaggregatorに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から1.5℃/分の速度で35℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、35℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を240サイクル/分に設定した。ViaFreezeの温度は、その後、凍結保存ステップまで35℃のままであった。図71は、脱凝集記録を示す。
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。CS50バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。1.5mlのBlood-stor(DMSO)を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにViaFreezeに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ViaFreezeの温度を35℃から-2℃/分で-80℃まで上昇させた。図71は、凍結保存記録を示す。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例5-脱凝集及び凍結保存
TIL078を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=11g。S2=2g。
TIL078を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。腫瘍試料を計量し、以下のように処理した。S1=11g。S2=2g。
Tiss-U-Stor脱凝集:2つのCS50Nバッグを滅菌はさみで開き、ポートなしの端を切断した。腫瘍材料を分割し、6.4gmの試料を2つのCS50Nバッグの各々の中に配置し、バッグを封止した。15mlの脱凝集培地と30μlの抗生物質が組み合わせられ、バッグの無針ポートを通してシリンジを使用して封止されたバッグの各々に添加される。バッグをViaFreezeに装填されたTissue Disaggregatorに移し、脱凝集プロトコルを開始した。脱凝集プロトコルは、周囲温度から1.5℃/分の速度で35℃までの温度上昇、及び脱凝集装置がアクティブである間、35℃における温度保持を求めた。脱凝集速度を240サイクル/分に設定した。ViaFreezeの温度は、その後、凍結保存ステップまで35℃のままであった。図72は、凍結保存記録を示す
バッグセットアップは、インラインフィルタを通して二次クライオバッグまでのチューブによる直接接続を含む。CS50バッグ内の脱凝集材料を、凍結バッグ内に濾過し、チューブ接続を封止した。1.5mlのBlood-stor(DMSO)を、クライオバッグの無針ポートを通してゆっくりと添加し、バッグを最適な熱伝達用に設計されたカセット内に配置し、カセットを脱凝集装置の代わりにViaFreezeに戻した。
脱凝集後凍結保存プロトコルを実施した。凍結サイクルは、ViaFreezeの温度を35℃から-2℃/分で-80℃まで上昇させた。図72は、凍結保存記録を示す。凍結バッグを液体窒素倉庫に移した。
実施例6-脱凝集及び凍結保存
TIL081を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。ソフトウェアを更新して、単一のプロトコルに脱凝集及び凍結保存を含めた。図73は、脱凝集及び凍結保存記録を示す。上記の実施例にあるように、脱凝集装置は、約53分間アクティブであった。(図73A、図73B)。脱凝集組織を、脱凝集バッグからフィルタを通して凍結バッグに移し、凍結冷却が開始された時点における脱凝集プロセスの開始から約90分以内に凍結保存のためにViaFreezeに戻した。
TIL081を、転移性黒色腫腫瘍片(試料)から製造した。ソフトウェアを更新して、単一のプロトコルに脱凝集及び凍結保存を含めた。図73は、脱凝集及び凍結保存記録を示す。上記の実施例にあるように、脱凝集装置は、約53分間アクティブであった。(図73A、図73B)。脱凝集組織を、脱凝集バッグからフィルタを通して凍結バッグに移し、凍結冷却が開始された時点における脱凝集プロセスの開始から約90分以内に凍結保存のためにViaFreezeに戻した。
クライオバイアルを液体窒素から除去し、細胞懸濁液がちょうど溶解されるまで、37℃の水浴中に配置した。細胞懸濁液を15mLのファルコン中に配置し、PBSで10mLまで満たし、400gで10分間遠心分離した。上清をデカンターに移した。
細胞培養について、細胞ペレットを、予め加温された培地中に、最初は小容量、すなわち、2~3mLで再懸濁した。接着細胞株(すなわち、腫瘍株、HEK293)を、以下の表に従って、培地を有する組織フラスコに添加した。非接着細胞株(すなわち、T細胞、TIL、Jurkat細胞)を、0.5~1×106個の細胞の密度でプレーティングした。フラスコを、加湿された37℃のインキュベーター内に配置し、培地を2~3日毎に交換した。
実施例8-凍結保存脱凝集腫瘍からの製造。
製造プロセス
出発材料の解凍
VIAThaw CB1000 Thawingシステムを使用して、凍結バッグに保存された凍結保存試料の加熱を制御した。凍結保存細胞懸濁液を解凍し、次いで、Life Technologies(Paisley、英国)によって製造されたT細胞培地(TCM)中で希釈した。TCMは、80%のRosewll Park Memorial Institute(RPMI)1640培地及び20%のAIM Vを含有する。細胞懸濁液を70~100μmのフィルタを通して濾過し、遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、10%照射ウシ胎児血清(FBS)(Life Technologies、Auckland,New Zealand)を補充されたTCM中に再懸濁した。
製造プロセス
出発材料の解凍
VIAThaw CB1000 Thawingシステムを使用して、凍結バッグに保存された凍結保存試料の加熱を制御した。凍結保存細胞懸濁液を解凍し、次いで、Life Technologies(Paisley、英国)によって製造されたT細胞培地(TCM)中で希釈した。TCMは、80%のRosewll Park Memorial Institute(RPMI)1640培地及び20%のAIM Vを含有する。細胞懸濁液を70~100μmのフィルタを通して濾過し、遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、10%照射ウシ胎児血清(FBS)(Life Technologies、Auckland,New Zealand)を補充されたTCM中に再懸濁した。
Origin CS50バッグ中の脱凝集凍結保存腫瘍(約16.5ml)を、VIAThaw CB1000 Thawing Systemの解凍トレー内に配置した。凍結バッグを約0℃に加温した。
実施例9-効力
共培養ベースの効力方法は、OKT3発現標的細胞株によって活性化されたT細胞のパーセンテージを定量化する。インビボにおけるTIL産物の作用機序は、インビボでTCRに結合するpMHC-HLAを通したTILペプチド提示を伴う。効力アッセイは、OCT3抗原結合ドメインを発現するK562細胞株との共培養によって特異的に活性化されたときに、CD137、IFN-γ、TNFα、又はCD107aのいずれかに対して陽性の生存T細胞を、総生存T細胞で除算して定義される、強力なT細胞のパーセンテージを定量化する。T細胞の効力を定量化するために使用されるマーカーとしては、DRAQ7、CD45、CD2、CD107a、CD137、TNF-α、及びIFN-γが挙げられる。
共培養ベースの効力方法は、OKT3発現標的細胞株によって活性化されたT細胞のパーセンテージを定量化する。インビボにおけるTIL産物の作用機序は、インビボでTCRに結合するpMHC-HLAを通したTILペプチド提示を伴う。効力アッセイは、OCT3抗原結合ドメインを発現するK562細胞株との共培養によって特異的に活性化されたときに、CD137、IFN-γ、TNFα、又はCD107aのいずれかに対して陽性の生存T細胞を、総生存T細胞で除算して定義される、強力なT細胞のパーセンテージを定量化する。T細胞の効力を定量化するために使用されるマーカーとしては、DRAQ7、CD45、CD2、CD107a、CD137、TNF-α、及びIFN-γが挙げられる。
効力を測定するために、ITIL-168 DS細胞が、以下の3つの細胞株のうちの1つを使用して約5時間共培養される:条件1-刺激なし-バックグラウンド細胞活性、条件2-K562細胞株-バックグラウンドTCR非依存反応性、条件3-OKT-3に対するScFvを発現するK562細胞株-TCR誘導T細胞刺激。
培養された細胞は、フローサイトメトリーによって解析され、生存白血球上でゲーティングされて、4つの活性化マーカーのうちの少なくとも1つを発現するT細胞を定量化する。安定性試験について、凍結保存DP細胞が解凍され、洗浄され、一晩静置される。
ITIL-168 TCR効力は、以下のように計算される:ステップ1)非特異的刺激に起因する%効力が条件2から得られ、ステップ2)CD3特異的及び非特異的刺激に起因する%効力が条件3から得られ、ステップ3)CD3特異的刺激に起因する%効力が条件3-条件2として計算される。
条件2及び条件3の両方について、%効力の結果は、100%から、CD137-/IFN-γ-/TNFα-/CD107a-である全てのT細胞(すなわち、バックグラウンド)のパーセンテージを差し引いたものである。この集団は、少なくとも1つのマーカーを産生しない。
実施例10-TIL成長及び急速増殖
TIL製造プロセスは、腫瘍切除、脱凝集、凍結保存、並びに任意選択の梱包及び出荷の後に開始する。出荷梱包及び出荷は、制御された条件下で、資格要件を満たした荷主におけるTumour Processing HubからInstilの製造施設へのものであり得る。凍結保存腫瘍及びT細胞は、制御された条件を使用して解凍され、10%のFBS、Amphotericin B、Gentamicin、Vancomycin、及びIL-2(本明細書ではICMTと称される)を補充された、80%のRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地、及び20%のAIM Vから構成されるT細胞培地(TCM)中で希釈される。
TIL製造プロセスは、腫瘍切除、脱凝集、凍結保存、並びに任意選択の梱包及び出荷の後に開始する。出荷梱包及び出荷は、制御された条件下で、資格要件を満たした荷主におけるTumour Processing HubからInstilの製造施設へのものであり得る。凍結保存腫瘍及びT細胞は、制御された条件を使用して解凍され、10%のFBS、Amphotericin B、Gentamicin、Vancomycin、及びIL-2(本明細書ではICMTと称される)を補充された、80%のRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地、及び20%のAIM Vから構成されるT細胞培地(TCM)中で希釈される。
細胞は、閉鎖されたバッグ内で遠心分離することによって洗浄され、ICMT中に再懸濁され、試料は、細胞計数のために採取される。細胞懸濁液は、0.25×106個の生存細胞/mLを標的化するICMTとともに培養バッグ内に播種され、プロセスの最大8日目まで、制御された条件下でインキュベートされる。8日目に、細胞計数のための試料が採取され、等量のICMTが培養バッグに添加され、制御された条件下でインキュベートされる。11日目に、細胞計数が行われ、等量のICMTが培養バッグに添加され、制御された条件下でインキュベートされる。13日目に、細胞計数が行われ、TILが、バッグ内の遠心分離によって濃縮されて、1×106~20×106個の生存T細胞を提供する。
また、13日目に、8%ヒトAB血清及びIL-2(本明細書ではWTCMと称される)を含有するTCMを有する抗CD3及び照射されたフィーダー細胞(同種PBMC)を使用して、1×106~20×106個の生存成長TILが活性化される。TIL活性化培養物が、静止培養バッグ内で、制御された条件下で最大6日間インキュベートされる。インキュベーションの19日目に、細胞計数が実施され、活性化されたTILが、WTCMを含有するバイオリアクター内に播種される。細胞は、制御された条件下で最大6日間インキュベートされる。20日目、TIL増殖は、採取標的用量がプロセスの27日目の前又はそれまでに達成されるまで、IL-2を補充されたTCMの連続的な供給が提供される。
採取用量が達成されると、細胞が計数され、1%ヒト血清アルブミン(HSA)を補充されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で遠心分離によって洗浄及び濃縮される。次いで、医薬品(DP)バッグ中のTILが2~8℃に冷却され、16%のHSA及び20%のDMSOを含有する抗凍結剤を用いて1:1で製剤化されて、8.5%のHSA及び10%のDMSOを含有するPBS中のDPの最終製剤を提供する。ロットリリース試験、参照試料、及びバックアップ試料のために、試料体積が除去される。
製剤化されたDPは、産物が指定された温度に到達するまで、予め定義されたプログラムを使用して、CRF中で凍結保存される。次いで、投与のための≦-130℃におけるクリニックへの輸送前に、凍結保存DPが液体窒素倉庫に移される。
実施例11
GMP条件下でフルスケール実行を実施した。これらの実行で使用されるITIL-168プロセスは、凍結保存腫瘍消化物、TIL成長段階(段階1)に対する0.25×106個の生存細胞/mLの播種の標的、TIL成長からTIL急速増殖フェーズ(REP)への連続処理、並びに最終産物の自動製剤化及び最終医薬品の凍結保存を含んだ。
GMP条件下でフルスケール実行を実施した。これらの実行で使用されるITIL-168プロセスは、凍結保存腫瘍消化物、TIL成長段階(段階1)に対する0.25×106個の生存細胞/mLの播種の標的、TIL成長からTIL急速増殖フェーズ(REP)への連続処理、並びに最終産物の自動製剤化及び最終医薬品の凍結保存を含んだ。
ITIL-168は、少なくとも1つの以前の療法ラインから再発したか、又は難治性である、進行黒色腫を有する成人患者の治療のための腫瘍浸潤リンパ球(TIL)療法である。ITIL-168は、患者のがん組織からエクスビボで単離及び増殖された自己T細胞の単回注入から構成され、静脈内に投与される。プロセスの改善は、経時的に識別され、実装されており、改善されたプロセスは、ITIL-168と呼ばれる。表は、プロセスの変形例及び実装を要約している。
2つのプロセス開発実行で使用されるITIL-168製造プロセスの概要が表15に示される。実行1(TIL065)及び実行2(Biopartners 9251)と標識された2つのプロセス開発実行を、GMP条件下でフルスケールで実施し、ベンダーであるBiopartnersから調達した患者及び腫瘍からそれぞれ収集した過剰な腫瘍を使用した。
これら2つのプロセス開発実行の間、バイオバーデン及び最終産物の無菌性、エンドトキシン、マイコプラズマ、及び外観試験のプロセス内試験は、これらの実行が、プロセス改善後の製造プロセス性能及び産物品質の評価を主目的としており、プロセス検証実行前のGMP条件下で製造オペレータのための訓練実行として機能するため、実施されなかった。
TIL成長及びREPは、表12及び表13に示される材料を使用して、実施例10にあるように実施された。
両方の実行(実行1及び実行2)について、総CD3+細胞数を、バッチ製造記録(BMR)に基づき、1日目、8日目、11日目、及び13日目にTIL成長段階又は段階1に関して、並びに13日目、19日目、22日目、及び25日目に、TIL急速増殖フェーズ(REP)又は段階2に関して測定した。図76A及び図76Bは、それぞれ、TIL成長段階(段階1)及びTIL REP段階(段階2)全体を通して2つの実行に対する総CD3+細胞数を示す。図76Bに示されるデータは、両方の実行について、>1×1010個のCD3+細胞が、REP段階の終了までに達成され、その結果、両方のロットが、5×109~5×1010個のCD3+細胞の用量許容基準を満たすことを実証する。
生存率(生存CD3+細胞のパーセンテージ)もまた、1日目、8日目、11日目、13日目、及び25日目の両方の実行に対して測定された。図76Cは、製造プロセス中及びREP段階の終了に向かって生存率が増加し、両方の実行が、>70%の最終産物基準を満たしたことを示す。
急速増殖フェーズ(REP)の増殖倍率を、2回の実行についての細胞数データから計算した。加えて、用量、生存率、効力、T細胞表現型、及びT細胞部分集団などの最終産物品質特性もまた、2つのプロセス開発実行について評価された。
表16に提示されたデータは、プロセス改善の後、ITIL-168製造プロセスが過去のプロセスと同様に実施され、仕様要件を満たす最終産物品質特性を結果的にもたらすことを実証する。
Biopartners 9251から調製されたTIL065及びTILの2つのTIL調製物を評価して、T細胞部分集団の相対的割合を決定した。TIL065(図79A)及びBiopartners 9251(図79B)TIL調製物中のCD4+細胞及びCD8+細胞の両方のうち、細胞は、主にセントラルメモリー(CM、CD45+CD62+)及びエフェクターメモリー(EM、CD45+CD62-)であった。図79Cは、T細胞の大部分が、CD4+又はCD8+T細胞に関与することを示す。
実施例12-投与
療法
対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンのリンパ球枯渇化学療法レジメンを受けた。療法は、制御性T細胞などの抑制細胞の影響を低減し、リンパ球成長促進サイトカイン(例えば、IL-7及びIL-15)の発現を増加させるように設計される。リンパ球枯渇化学療法の前及びその間に、水和レジメンを開始した。抗微生物薬及び抗真菌薬の予防投与を、リンパ球枯渇化学療法を開始する前に開始した。発熱及び好中球減少を評価し、管理した。非ステロイド制吐療法を、リンパ球枯渇化学療法の前に開始し、必要に応じて継続した。
療法
対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンのリンパ球枯渇化学療法レジメンを受けた。療法は、制御性T細胞などの抑制細胞の影響を低減し、リンパ球成長促進サイトカイン(例えば、IL-7及びIL-15)の発現を増加させるように設計される。リンパ球枯渇化学療法の前及びその間に、水和レジメンを開始した。抗微生物薬及び抗真菌薬の予防投与を、リンパ球枯渇化学療法を開始する前に開始した。発熱及び好中球減少を評価し、管理した。非ステロイド制吐療法を、リンパ球枯渇化学療法の前に開始し、必要に応じて継続した。
リンパ球枯渇化学療法を以下のように施した。投与されるシクロホスファミド及びフルダラビンの用量を、ベースラインビジットで取得された体重の評価に基づいて計算した。肥満対象(ボディマス指数>35)では、実際の体重を使用した。シクロホスファミドの用量は体重に基づき、フルダラビンの用量は体表面積に基づく。用量は、用量バンディングの慣行に従って、四捨五入され得る。以下の表は、推奨用量、投与経路、注入量、及び持続時間を示す。
対象は、TIL注入前に抗ヒスタミン剤及びアセトアミノフェンを前投薬された。注入バッグの内容物を、非白血球枯渇フィルタ(例えば、>/=170ミクロンのインライン/チューブフィルタ)を使用して注入した。対象は、注入後の支援のために、最大8回の静脈内IL-2投与を受けた。IL-2は、0日目に開始し4日目まで継続するTIL注入の完了後に投与された。
実施例13-治療結果
合計で44人の転移性皮膚黒色腫患者が腫瘍切除、及びTIL成長製造の開始を受けた(段階1)。これら44人の患者のうち、42人の個々の患者ロットがステージ1を完了させ、2人の失敗した試行を伴った。31人の患者ロットがREP製造(段階2)に進んだ。1ロットがTILの脱成長ステージ1の製造に失敗し、改訂されたステージ1製造プロセスを実装し、ステージ2製造の成功を可能にした。その後、患者は治療された。残りの12ロットは、以下の理由により、REP開始のために選択されなかった:8ロットは、患者の状態の断続的な臨床的悪化に起因してTIL療法に不適合となり、2人の患者は、他の療法の臨床的改善に起因してTILがもはや不要となり、1人の患者は、治療のための資金を確保することができず、1ロットは、切除標本上の腫瘍組織の欠如に起因して、製造に失敗した。4つの患者ロットが製造に成功したが、患者は、TIL療法に臨床的に不適合であるとみなされ、したがって、治療されなかった。
合計で44人の転移性皮膚黒色腫患者が腫瘍切除、及びTIL成長製造の開始を受けた(段階1)。これら44人の患者のうち、42人の個々の患者ロットがステージ1を完了させ、2人の失敗した試行を伴った。31人の患者ロットがREP製造(段階2)に進んだ。1ロットがTILの脱成長ステージ1の製造に失敗し、改訂されたステージ1製造プロセスを実装し、ステージ2製造の成功を可能にした。その後、患者は治療された。残りの12ロットは、以下の理由により、REP開始のために選択されなかった:8ロットは、患者の状態の断続的な臨床的悪化に起因してTIL療法に不適合となり、2人の患者は、他の療法の臨床的改善に起因してTILがもはや不要となり、1人の患者は、治療のための資金を確保することができず、1ロットは、切除標本上の腫瘍組織の欠如に起因して、製造に失敗した。4つの患者ロットが製造に成功したが、患者は、TIL療法に臨床的に不適合であるとみなされ、したがって、治療されなかった。
切除された44個の腫瘍のうち、2個が製造に失敗し、95%の製造成功率を得た。27人の患者が、標準製造プロセスを利用して作製されたTIL産物で治療された。TIL製造完了時に、これらの患者のうちの6人は、全治療レジメンに臨床的に不適合であるとみなされ、顕著に低い用量のコンディショニング化学療法及び注入後IL-2を受け、したがって、解析から除外された。1人の患者は、標準TIL成長製造ステップ(段階1)を開始する基準を満たさなかった腫瘍切除を受けた。したがって、非常に低い最終細胞用量(1.7×109)であるにもかかわらず、急速増殖プロトコル(段階2)及び最終産物製剤を可能にした修正段階1が開始された。この産物は、修正製造プロセスを使用して産生され、低用量の細胞が得られたため、MSライセンスプロセスを代表するとはみなされず、したがって、臨床データは解析から除外された。
残りの21人の患者の人口統計、ベースライン患者特性、治療の詳細及び処置、並びに臨床有効性及び安全性転帰を収集し、解析した。解析終了日までに、これらの患者の潜在的な追跡期間の中央値は、TIL注入日から52.2か月(範囲:4.6、98.8か月)であった。
これら21人の患者のうち、過半数(71%)が男性であり、TIL治療時の年齢中央値は45歳であった(範囲:16、68)。ベースラインでは、全ての患者が、黒色腫の初回診断から中央値39か月(範囲:8、177)で、ステージIVの転移性皮膚黒色腫を有していた。患者の過半数(67%)が、4つ以上の疾患部位で報告された病変を有し、7人(33%)がTIL治療時に脳転移が記録された。事前全身療法の中央値は、2(範囲:1、9)であった。患者の52パーセント(52%)がBRAF突然変異を有し、その全員が、MEK阻害剤の有無にかかわらず、BRAF阻害剤を受け、進行していた。2人を除く全ての患者(90%)は、少なくとも1つの事前チェックポイント阻害剤を有し、12人(57%)がPD-1阻害剤(ニボルマブ又はペムブロリズマブのいずれか)を受けていた。加えて、8人(38%)がイピリムマブを受け、ニボルマブ又はペムブロリズマブのいずれかを順次投与され、4人(19%)がイピリムマブ及びニボルマブを同時に受けた。TIL産生のための腫瘍切除の前に、20人(95%)は、再発性又は難治性の進行性黒色腫を有し、1人(5%)は、耐容性に起因してTIL療法の前に治療を中止した。
TILを受ける直前に、患者のうちの10人(48%)が血清ラクトースデヒドロゲナーゼ(LDH)値の上昇を示し、7人(33%)が正常範囲上限(ULN)の1~2倍、3人(14%)がULNの2倍よりも高かった。標的病変の病変寸法(SLD)の総和で測定されたベースライン腫瘍量は、20人の患者で利用可能であり、ベースラインSLDの中央値は、100mm(範囲:13、281)であった。
TIL治療
TIL治療
全21人の患者が、TIL注入前に、コンディショニング化学療法として、2用量のシクロホスファミド及び5用量のフルダラビンを受けた。注入されたTIL細胞の総数の中央値は、31.9×109個(範囲:7.9×109、62.5×109)であった。IL-2投与の総数の中央値は、8(範囲:4、11)であった。患者は、10日間(範囲:7、15)の中央値で入院した。治療期間中、3人(14%)の患者がICUに入院した。
TIL治療期間中に臨床的に有意なAEが報告された。コンディショニング化学療法期間中に報告された一般的なAE(≧10%)は、好中球減少(43%)及び悪心(19%)であり、これらの化学療法剤の副作用プロファイルと概ね一致している。
TIL注入後に発症した一般的なAEとしては、血小板減少症(62%)、発熱(57%)、悪寒(43%)、頻脈(29%)、好中球減少(29%)、肺水腫(24%)、血管漏出(24%)、発疹(19%)、心房細動(14%)、心臓血管の不安定性(14%)、胸部感染(14%)、及び浮腫(14%)が挙げられる(表21)。これらのAEは、他のTIL試験で報告されたものと一致している(Dafniら、2019、Rohaanら、2018)。
製造プロセスがステージ1で失敗したが、修正製造プロセスから生成された産物で治療された患者は、腎不全、流体過剰、及び敗血症の可能性によって悪化した広範な腫瘍量に起因して、TIL療法後6日目に死亡した。
治療期間中、末梢血数を測定した。好中球、血小板、リンパ球、白血球数、及びヘモグロビンの減少の傾向が、コンディショニング化学療法の開始時に観察された。血球数及びヘモグロビンレベルは、一般に、TIL注入の1~4日後にそれらの最下点に達した。ベースラインレベルへの血球数回復は、概して、TIL注入日の約7日後に観察された。
堅牢性を改善し、集中型製造による多施設臨床試験を可能にするために、製造プロセスにおける最近の変更が実装された。この更新では、消化された腫瘍材料は、安定性を延長するために凍結保存される。重要なことに、事前の凍結保存で作製された産物で治療された4人の患者において、観察されたAEプロファイルは、連続して治療された他の患者(表22)、及び他のTIL産物の臨床試験で報告されたものと概ね一致していた。
21人の患者のうちの15人が、標的病変の放射線学的測定を含んだ連続CT及び/又はMRIスキャンによる疾患評価を受けた。これらの患者のうち、定量的奏効率(奏効の確認は不要)は53%であり、CRを達成した2人(13%)、PRを達成した6人(40%)を含む(表23)。
定量的及び定性的奏効の両方に基づく全患者の奏効率は、CRを達成した3人(14%)及びPRを達成した9人(43%)を含む57%であった。2人の追加の患者が、BRAF阻害剤ダブラフェニブに対する抵抗性を発現し、TIL治療に参照される前に療法中に疾患進行を経験していた。ダブラフェニブは、TIL療法の直前に中止され、多くの場合、ダブラフェニブの中断を伴う急速腫瘍成長を防止するために、TILの約1~2週間後に再開された。これら2人の患者の各々は、TIL後に定性的奏効を達成した(1人が持続性CR、1人がPR)。両患者は、その後、TIL後の奏効において、ダブラフェニブを1回中止した。これらの患者の両方がダブラフェニブに難治性となった疾患を有していたため、TIL後に経験した臨床的利益が、ダブラフェニブの一時的な再開ではなくTILに起因したと結論付けることは妥当である。したがって、これらの患者を奏効者として含めて、奏効の感度解析を実施した。この感度解析では、奏効率は14/21(67%)であり、完全奏効者4名(19%)及び部分奏効者10名(48%)であった(表24)。
奏効は、年齢、疾患部位数、事前療法ライン数、事前BRAF阻害剤、事前PD-1阻害剤、ベースライン脳転移、及びベースライン腫瘍量を含む、重要なベースライン及び疾患特性による部分集団間で概して一貫していた。特に、ITIL-168の製造プロセスに最も類似の製造プロセスで治療された4人の患者において、全体的な奏効率(75%)及びCR率(25%)は、より広範な集団と一致していた。CT及び/又はMRIスキャンに基づく定量的奏効を有する15人の患者のうち、14人は詳細な腫瘍測定値を有し、ベースラインからの腫瘍減少の最大パーセンテージをウォーターフォールプロットで提示した(図74)。1人の患者は、PDの最良総合効果を有したが、任意の治療後の標的病変の測定値が報告されず(新たな病変の観察によって決定される進行)、したがって、プロットには示されなかった。
定量的奏効データ当たりの無増悪生存期間(PFS)の中央値(N=15)は、6.7か月であり、解析終了時点では、4人の患者がいかなる後続治療もなしで、継続中の奏効(2人のCR及び2人のPR)を有していた。定量的及び定性的奏効データの両方に基づくPFS時間の中央値(N=21)は、6.7か月であり、5人の対象が、いかなるその後の療法もなしで、継続中の奏効(3人のCR及び2人のPR)を有していた。全21人の治療を受けた患者の全生存(OS)期間の中央値は、21.3か月であった(図75A)。定量的奏効データを有する15人の患者のOS時間の中央値は、16か月であった(図75B)。しかしながら、奏効者に対するOS時間の中央値(定量的奏効のみ、N=8)には到達しなかったが、非奏効者に対するOS時間の中央値(N=7)は、6.5か月であった(図75C)。
実施例14-凍結保存腫瘍消化物からのTIL
実施例14-凍結保存腫瘍消化物からのTIL
転移性黒色腫腫瘍を21人の対象から切除し、脱凝集し、TILを調製した。対象のうちの4人の脱凝集腫瘍組織を凍結保存し、次いで、TIL調製前に解凍した。対象に注入し、応答転帰を評価した。臨床応答が図77に図示される。表25は、凍結保存ステップを受けなかったTIL調製物との脱凝集後の凍結保存を含んだTIL調製物に対する治療応答を提示する。
表26TILの調製及び投与前にPD-1阻害剤による治療を受けた対象を表す表25の応答の部分集団を示す。
表27は、脱凝集後の凍結保存を含んだTIL調製物(凍結)対成長及び増殖前に凍結保存ステップを受けなかったTIL調製物(新鮮)で治療された対象の人口統計を提示する。
表28は、TIL調製及び投与前にPD-1阻害剤による治療を受けた対象の部分集団についての、脱凝集後の凍結保存を含んだTIL調製物対凍結保存ステップを受けなかったTIL調製物で治療された対象の人口統計を提示する。
表29は、脱凝集後の凍結保存を含んだTIL調製物対凍結保存を受けなかったTIL調製物で治療された対象におけるIL-2投与の人口統計を提示する。
表30は、TIL調製及び投与前にPD-1阻害剤による治療を受けた対象の部分集団についての、脱凝集後の凍結保存を含んだTIL調製物対凍結保存を受けなかったTIL調製物で治療された対象におけるIL-2投与の人口統計を提示する。
実施例15-T細胞部分集団の特徴解析
固定可能な生存率染料eF450を使用した生/死の染色。TILを2X PBSで洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁し、1μLの固定可能な生存率染料eF450を添加した。混合物をパルスボルテックスし、4℃で20~30分間インキュベートした。10mlのPEF(PBS+2mMのEDTA+0.5%のFCS)を添加し、細胞をペレットまで500g×3分間遠心分離した。上清を注ぎ出し、細胞を750μLのPEF中に再懸濁した。染色のために40μLの細胞を15ウェルに添加した。
固定可能な生存率染料eF450を使用した生/死の染色。TILを2X PBSで洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁し、1μLの固定可能な生存率染料eF450を添加した。混合物をパルスボルテックスし、4℃で20~30分間インキュベートした。10mlのPEF(PBS+2mMのEDTA+0.5%のFCS)を添加し、細胞をペレットまで500g×3分間遠心分離した。上清を注ぎ出し、細胞を750μLのPEF中に再懸濁した。染色のために40μLの細胞を15ウェルに添加した。
抗体による細胞の表面染色。ウェルを、4℃で5分間、各ウェルに2μLの抗ヒトFcRを添加することによって遮断した。マスターミックスを、以下の抗体から作製した:i.CD45RO-FITC(2μL/ウェル)、ii.CD8-PE-Vio770(0.5μL/ウェル)、iii.CD62L-APC(2μL/ウェル)、iv.CD4-APC-Cy7(2μL/ウェル)。6.5μLの混合物をウェルの各々に添加した。2μLの以下の抗体の各々を、指示されたように適切なウェルに添加した。
4℃で20~30分間のインキュベーション後、150μLのPEFを添加し、細胞をペレット細胞に遠心分離した(500g、3分、RT)。上清を除去し、細胞を100μLのPFA(4%)中に再懸濁し、10分間、4℃でインキュベートした。PFAを除去し、細胞を100μLのPEF中に再懸濁し、解析まで4℃で保存した。
実施例16
脱凝集後に凍結保存を受けたTIL調製物中のT細胞部分集団の相対的割合を、凍結保存されなかったTIL調製物中のT細胞部分集団と比較した。
脱凝集後に凍結保存を受けたTIL調製物中のT細胞部分集団の相対的割合を、凍結保存されなかったTIL調製物中のT細胞部分集団と比較した。
エフェクター細胞及び幹細胞メモリー亜集団は、凍結保存されなかったTIL調製物と比較して、凍結保存を受けたTIL調製物の範囲にわたって実質的に低減された。総T細胞(図81A)、CD4+ T細胞(図81B)、及びCD8+ T細胞(図81C)について関係が観察された。
腫瘍消化物クライオバイアルを液体窒素倉庫から取り出され、細胞懸濁液がちょうど溶解されるまで、37℃の水浴中で解凍される(D1)。細胞懸濁液が、15mLのファルコンに取り出され、最大10mLのPBSで満たされ、400gで5分間遠心分離され、上清がデカンターに移される。
細胞ペレットが、予め加温された適切なT細胞培地中に再懸濁され、細胞計数が、トリパンブルーを使用して生存率を決定するために実施される。細胞は、1×106個の細胞/mLの密度で再懸濁される。
活性化なしで培養される細胞は、0.5×106個の細胞/mlで再懸濁され、2ml(1×106個の細胞)は、IL-2(3000IU/mL)を有する24ウェル組織培養プレートのウェル中に配置される。細胞は、2~3日毎にIL-2(3000IU/mL)の添加による形質導入まで、加湿された37℃インキュベーター中で培養される。
細胞のD3及びD4で形質導入される細胞に関して、細胞の活性化は、D1で起こる。細胞のD7及びD8で形質導入される細胞に関して、細胞の活性化は、D5で起こる。
TIL活性化のために、0.5×106個の細胞/mLが、3000IU/mLのIL-2を有する24ウェル組織培養プレート中に配置される。10μLのT細胞TransACT(TM)が、TIL懸濁液(1:1の比率)の1×106個の細胞毎に添加され、細胞は、37℃のインキュベーター中で48時間インキュベートされる。
形質導入初日(D3又はD7)
24ウェルプレートから細胞を15mLのファルコンチューブに収集し、10mLのTCMで満たし、400gで5分間スピンさせる。トリパンブルーを使用して細胞を計数し、1×106個の細胞/mLで再懸濁する。
24ウェルプレートから細胞を15mLのファルコンチューブに収集し、10mLのTCMで満たし、400gで5分間スピンさせる。トリパンブルーを使用して細胞を計数し、1×106個の細胞/mLで再懸濁する。
各形質導入法では、96ウェル平底プレートで1×105個の細胞(100μL)/ウェルが使用される。24ウェルプレートに形質導入する場合、1×106個の細胞/ウェル(500μL)を配置する。6ウェルプレートに形質導入する場合、5×106個の細胞/ウェル(2mL)を配置する。
最終の条件毎に100μl/105個の細胞(又は24ウェル及び6ウェルプレートに対する適切な密度及び体積)のTCM中に再懸濁することによって、レンチウイルス(MOI5)及びIL-2(3000IU/mL)のマスターミックスを調製する。分注損失を考慮するために、ウェルの数+1についてマスターミックス量を調製する。
NT細胞(MOCK)について、96ウェル平底プレート内で、100μL毎にTCM及びIL-2(3000IU/mL)のマスターミックスを調製する。24ウェル及び6ウェルプレートについて、それぞれ、IL-2(3000IU/mL)を用いて、500μL及び2mLで、MOCK T細胞を再懸濁する。
Eppendorf又は15mLのファルコンチューブ中の細胞から上清を除去し、条件に応じて、1×105個の細胞当たり、適切な100μLのマスターミックス(又は24ウェル及び6ウェルプレートの適切な密度及び体積)中で細胞を再懸濁する。
各条件を適切に再懸濁し、細胞を、それに応じて、非TC平坦底の96ウェル、24ウェル、又は6ウェルのプレート上に移す。
96ウェルプレートの形質導入では、蒸発を防止するために、周囲のウェルに200μLのPBSを添加する。
加湿された37℃のインキュベーター内で細胞を一晩インキュベートする。
形質導入2日目(D4又はD8)
96ウェル平底プレートから上下に再懸濁して細胞を収集し、96ウェルU底プレートに移す。(24ウェル又は6ウェルプレートからの収集は、15mLのファルコンで実施される。) プレートを400gで5分間スピンさせ、TCMで細胞を洗浄する。
96ウェル平底プレートから上下に再懸濁して細胞を収集し、96ウェルU底プレートに移す。(24ウェル又は6ウェルプレートからの収集は、15mLのファルコンで実施される。) プレートを400gで5分間スピンさせ、TCMで細胞を洗浄する。
各形質導入法では、96ウェル平底プレートで1×105個の細胞(100μL)/ウェルを使用する。24ウェルプレートに形質導入する場合、1×106個の細胞/ウェル(500μL)を配置する。6ウェルプレートに形質導入する場合、5×106個の細胞/ウェル(2mL)を配置する。
最終の条件毎に100μl/105個の細胞(又は24ウェル及び6ウェルプレートに対する適切な密度及び体積)のTCM中に再懸濁することによって、レンチウイルス(MOI5)及びIL-2(3000IU/mL)のマスターミックスを調製する。分注損失を考慮するために、ウェルの数+1についてマスターミックス量を調製する。
NT細胞(MOCK)について、96ウェル平底プレートに対して、100μL毎にTCM及びIL-2(3000IU/mL)のマスターミックスを調製する。24ウェル及び6ウェルプレートについて、それぞれ、IL-2(3000IU/mL)を用いて、500μL及び2mLで、MOCK T細胞を再懸濁する。
Eppendorf又はファルコンチューブ中の細胞から上清を除去し、条件に応じて、1×105個の細胞当たり、適切な100μLのマスターミックス(又は24ウェル及び6ウェルプレートの適切な密度及び体積)中で細胞を再懸濁する。
各条件を適切に再懸濁し、細胞を、それに応じて、非TC平坦底の96ウェル、24ウェル、又は6ウェルのプレート上に移す。96ウェルプレートの形質導入では、蒸発を防止するために、周囲のウェルに200μLのPBSを添加する。加湿された37℃のインキュベーター内で細胞を一晩インキュベートする。
翌日、細胞を新しい96ウェル丸底プレート、24ウェル又は6ウェルプレートに移し、IL-2(3000IU/mL)を有する新鮮な培地中で、加湿された37℃のインキュベーターで72時間インキュベートする。
96ウェルプレートの最終体積は、200μL/ウェルであり、24ウェルプレートの最終体積は、2mL/ウェルであり、6ウェルプレートの最終体積は、5mL/ウェルである。IL-2(3000IU/mL)は、2~3日毎に添加される。
細胞は、D3+D4形質導入についてはD8で、D7+D8形質導入についてはD12で、形質導入効率について染色される。
TILの成長
モック及び形質導入細胞は、96ウェルU底プレートに、それらがREP内に配置されるまで維持される。
モック及び形質導入細胞は、96ウェルU底プレートに、それらがREP内に配置されるまで維持される。
細胞維持のために、2~3日毎に培地の半分が除去され、新鮮なTCM及びIL-2(3000IU/mL)で交換される。96ウェルプレートの場合、100μlの培地を除去し、200μLの最終体積に交換する。24ウェルプレートの場合、1mLの培地を除去し、2mLの最終体積に交換する。6ウェルプレートの場合、1mLの培地を除去し、2mLの最終体積に交換する。
REPは、D13(12日間の成長)から始まる。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
1.治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球(UTIL)集団を単離するための方法であって、(a)対象から切除された腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、細胞懸濁液が凍結保存され得るように、腫瘍が十分に脱凝集される、産生することと、低温に冷却又は維持することによってステップ(a)と同じ日に脱凝集腫瘍を凍結保存することと、(c)凍結保存脱凝集腫瘍を任意選択的に保存することと、(d)IL-2を含む細胞培養培地中で脱凝集腫瘍を培養することによって第1の増殖を実施して、第1のUTIL集団を産生することと、(e)第1のUTIL集団を追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生することと、(f)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存することと、を含む、方法。
2.脱凝集が、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落1に記載の方法。
3.冷却することが、コントロールレートである、段落1又は2に記載の方法。
4.コントロールレート凍結が、約-60℃まで約-2℃/分である、段落3に記載の方法。
5.脱凝集腫瘍が、細胞化される、段落1~5のいずれか1つに記載の方法。
6.脱凝集腫瘍が、精製される、段落1~5のいずれか1つに記載の方法。
7.単一細胞懸濁液が、ステップ(a)の後に提供される、段落1~6のいずれか1つに記載の方法。
8.第1のUTIL集団が、約100万~2000万個のUTILである、段落1~7のいずれか1つに記載の方法。
9.ステップ(d)は、腫瘍出発材料からのUTILの成長、その後のステップ(e)の急速増殖を更に含む、段落1~8のいずれか1つに記載の方法。
10.ステップ(d)が、約2週間実施され、ステップ(e)が、約2週間実施される、段落9に記載の方法。
11.ステップ(d)及び/又はステップ(e)が、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、又はそれらの組み合わせを添加することを更に含む、段落1~10のいずれか1つに記載の方法。
12.第2のUTIL集団を懸濁するステップ(g)を更に含む、段落1~11のいずれか1つに記載の方法。
13.懸濁することが、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及びジメチルスルホキシド(DMSO)中で行われる、段落12に記載の方法。
14.ステップ(f)が、凍結保存することであり、UTILを解凍する最終ステップを更に含む、段落1~13のいずれか1つに記載の方法。
15.解凍UTILが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落14に記載の方法。
16.段落1~15のいずれか1つに記載の方法によって得られた、治療用凍結保存未修飾腫瘍浸潤リンパ球(UTIL)集団。
17.集団が、約5×109~5×1010個のT細胞を含む、段落16に記載の治療用集団。
18.段落16又は17の治療用集団の凍結保存バッグ。
19.静脈内注入で使用するための、段落18に記載の凍結保存バッグ。
20.段落14若しくは15の治療用集団、又は段落18若しくは19の凍結保存バッグを投与することを含む、がんを治療するための方法。
21.がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮細胞がん(HNSCC)を含む、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、腎がん、又は腎細胞がんである、段落20に記載の方法。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
1.治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球(UTIL)集団を単離するための方法であって、(a)対象から腫瘍を切除すること、(b)単回使用無菌キット内に切除腫瘍を保存することであって、単回使用無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、(c)脱凝集モジュール内で切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含む、方法。
2.脱凝集が、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、段落1に記載の方法。
3.脱凝集腫瘍が、細胞化される、段落1又は2に記載の方法。
4.単一細胞懸濁液が、ステップ(c)の後に提供される、段落1~3のいずれか1つに記載の方法。
5.第1のUTIL集団が、約100万~2000万個のUTILである、段落1~4のいずれか1つに記載の方法。
6.ステップ(e)は、切除腫瘍出発材料からのUTILの成長、その後のステップ(f)の急速増殖を更に含む、段落1~5のいずれか1つに記載の方法。
7.ステップ(e)が、約2週間実施され、ステップ(f)が、約2週間実施される、段落6に記載の方法。
8.ステップ(e)及び/又はステップ(f)が、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、又はそれらの組み合わせを添加することを更に含む、段落1~7のいずれか1つに記載の方法。
9.第2のUTIL集団を懸濁するステップ(h)を更に含む、段落1~7のいずれか1つに記載の方法。
10.懸濁することが、緩衝生理食塩水、ヒト血清アルブミン、及びジメチルスルホキシド(DMSO)中で行われる、段落9に記載の方法。
11.ステップ(g)が、凍結保存することであり、UTILを解凍する最終ステップを更に含む、段落1~9のいずれか1つに記載の方法。
12.解凍UTILが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、段落10に記載の方法。
13.段落1~11のいずれか1つに記載の方法によって得られた治療用凍結保存UTIL集団。
14.集団が、約5×109~5×1010個のT細胞を含む、段落13に記載の治療用集団。
15.段落13又は14の治療用集団の凍結保存バッグ。
16.静脈内注入で使用するための、段落15に記載の凍結保存バッグ。
17.第13項若しくは第14項の治療用集団、又は第15項若しくは第16項の凍結保存バッグを投与することを含む、がんを治療する方法。
18.がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮細胞がん[HNSCC]を含む)、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、腎がん、又は腎細胞がんである、段落17に記載の方法。
19.無菌キットの1つ以上の可撓性コンテナが、弾性変形可能な材料を含む、段落1に記載の方法。
20.無菌キットの脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、1つ以上の封止可能な開口部を含む、段落1に記載の方法。
21.無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性コンテナが、ヒートシール可能な溶着を含む、段落20に記載の方法。
22.無菌キットの1つ以上の可撓性コンテナが、内部に丸みを帯びた縁を含む、段落1に記載の方法。
23.無菌キットの脱凝集モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、その中に固形腫瘍を機械的に粉砕及びせん断するように適合された脱凝集表面を含む、段落1に記載の方法。
24.無菌キットの濃縮モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、細胞化脱凝集固形組織の保持物を保持するフィルタを含む、段落1に記載の方法。
25.無菌キットの安定化モジュールの1つ以上の可撓性コンテナが、溶液中又は凍結保存状態における生存細胞の保存のための培地製剤を含む、段落1に記載の方法。
26.無菌キットが、デジタル、電子、又は電磁タグ識別子を更に含む、段落1に記載の方法。
27.無菌キットのタグ識別子が、脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化プロセスのタイプ、コントロールレート凍結に好適な任意選択の凍結溶液を含む、該プロセスで使用される1つ以上のタイプの培地を定義する特定のプログラムに関連する、段落26に記載の方法。
28.同じ可撓性コンテナが、脱凝集モジュール、安定化モジュール、及び任意選択の濃縮モジュールのうちの1つ以上の一部を形成し得る、段落1に記載の方法。
29.無菌キットの脱凝集モジュールが、処理される組織の受け取りのための第1の可撓性コンテナを含む、段落1の方法。
30.無菌キットの脱凝集モジュールが、脱凝集のための培地を含む第2の可撓性コンテナを含む、段落1の方法。
31.無菌キットの任意選択の濃縮モジュールが、濃縮された濾液を受容するための第1の可撓性コンテナ及び第3の可撓性コンテナを含む、段落1の方法。
32.無菌キットの脱凝集モジュール及び安定化モジュールの両方が、第2の可撓性コンテナを含み、第2のコンテナが、消化培地及び安定化培地を含む、段落1に記載の方法。
33.無菌キットの安定化モジュールが、安定化培地を含む第4の可撓性コンテナを含む、段落1に記載の方法。
34.無菌キットの安定化モジュールはまた、保存する及び/又は凍結保存を受けるための第1の可撓性コンテナ及び/又は第3の可撓性コンテナを含む、段落1に記載の方法。
35.治療用凍結保存非修飾腫瘍浸潤リンパ球(UTIL)集団を単離するための方法であって、(a)対象から腫瘍を切除すること、(b)プログラム可能プロセッサ及び単回使用無菌キットを含む、哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化のための自動デバイス内に切除腫瘍を保存することであって、単回使用無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、保存すること、(c)切除腫瘍を無菌脱凝集し、それによって、脱凝集腫瘍を産生することであって、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、産生すること、(d)安定化モジュール内で脱凝集腫瘍を凍結保存すること、(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施すること、(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生すること、(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存することを含む、方法。
36.自動デバイスが、単回使用キットの認識のための無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落35に記載の方法。
37.自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、タグを介して無菌キットを認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びに該プロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するキットプログラムを実行することができる、段落36に記載の方法。
38.自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び安定化モジュールのうちの1つ以上と通信し制御するように適合されている、段落35に記載の方法。
39.自動デバイスのプログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び/又は生物学的分解を可能にする、段落38に記載の方法。
40.プログラム可能プロセッサが、脱凝集モジュールを制御して、固形組織材料の物理的及び/又は酵素的分解を可能にする、段落39に記載の方法。
41.固形組織材料の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、及びそれらの混合物からなる群から選択される1つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落40に記載の方法。
42.プログラム可能プロセッサが、固形組織を機械的に粉砕及びせん断する脱凝集可撓性コンテナ内の脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落35に記載の方法。
43.プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化モジュールを制御して、濃縮された脱凝集固形組織をコンテナ内で凍結保存する、段落35に記載の方法。
44.自動デバイスは、任意選択の濃縮モジュールへの脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集モジュールで完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集モジュール、濃縮モジュール、及び/若しくは安定化モジュールのうちの1つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、モジュール内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮モジュール内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮モジュール内の接線流濾過プロセスを制御するための1つ以上の弁、並びに/又は各モジュールの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための1つ以上のクランプのうちの1つ以上を任意の組み合わせで更に備える、段落35に記載の方法。
45.自動デバイスのプログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化モジュール内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、段落35に記載の方法。
46.自動デバイスが、ユーザインターフェースを更に備える、段落35に記載の方法。
47.インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落46に記載の方法。
48.自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、段落35に記載の方法。
49.治療用凍結保存UTIL集団を単離するための半自動無菌組織処理方法であって、(a)無菌処理キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグ識別子から、無菌脱凝集組織処理ステップ及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定するステップであって、無菌キットが、固形哺乳動物組織を含む材料の受け取り及び処理のための脱凝集モジュールと、脱凝集固形組織材料の濾過並びに非脱凝集組織及び濾液の分離のための任意選択の濃縮モジュールと、脱凝集産物材料を任意選択的に更に処理及び/又は保存するための安定化モジュールと、を備え、モジュールの各々が、間における組織材料の流れを可能にするように適合された1つ以上の導管によって接続された1つ以上の可撓性コンテナを備え、モジュールの各々が、1つ以上の可撓性コンテナへの培地及び/又は試薬の無菌入力を可能にする1つ以上のポートを備える、決定するステップと、(b)対象から腫瘍を切除するステップと、(c)無菌キットの脱凝集モジュールの可撓性プラスチックコンテナ内に腫瘍を配置するステップと、(d)1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって腫瘍を処理するステップであって、切除腫瘍が無菌脱凝集され、それによって、脱凝集腫瘍を産生し、切除腫瘍が、細胞損傷なしで凍結保存され得る場合、十分に脱凝集される、脱凝集モジュール、脱凝集腫瘍が、脱凝集固形組織材料を除去し、非脱凝集組織及び濾液を分離するために濾過される、任意選択の濃縮モジュール、脱凝集腫瘍が凍結保存される、安定化モジュールと通信し、それらを制御することによって、処理するステップと、(e)IL-2を含む細胞培養培地で脱凝集腫瘍を培養して、第1のUTIL集団を産生することによって、第1の増殖を実施するステップと、(f)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて第1のUTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生するステップと、(g)第2のUTIL集団を採取及び/又は凍結保存するステップと、を含む、方法。
実施例18: TIL製造
以下のプロセスは、限定されるものではないが、子宮頸部、頭頸部、肺腺がん(NSCLC)、皮膚扁平上皮細胞がん、及び黒色腫を含む、固形腫瘍からのTIL調製のために開発されている。
以下のプロセスは、限定されるものではないが、子宮頸部、頭頸部、肺腺がん(NSCLC)、皮膚扁平上皮細胞がん、及び黒色腫を含む、固形腫瘍からのTIL調製のために開発されている。
2つのcSCC及び2つの子宮頸部腫瘍を、本明細書に説明されるプロトコルに従って脱凝集し、治療用TIL組成物を調製した。腫瘍量及び細胞数を含む腫瘍細胞の特徴、並びに脱凝集後の特徴が以下に示される。
腫瘍細胞を1日目に播種し、増殖培養で成長させ、本明細書に説明される成長プロトコルに従って13日目にREPに進行させた。成長が図84A及び以下の成長細胞培養表に図示される。CD3+成長は、開始%CD3純度とは相関しない(上記の腫瘍特性表)。
成長産物を13日目にREPに移し、25日目まで急速増殖を進めた。REPは、図84Bにおいて4つの腫瘍調製について図示され、CD3+細胞の増殖倍率は、表Dの成長及びREPについて示されている。REP成長は、成長増殖又は播種されたCD3+細胞の数と相関しない。これはまた、組み合わせられた成長-REP手順を図示する図84A及び図84Bから観察され得る。
生存CD45+細胞のCD3+の割合は、採取時までに、REP中の全てのドナー腫瘍について>90%のCD3+純度まで増加した。(図84C)。これは、より不良な成長能を示す腫瘍でも同様であった。
最終産物を解析して、白血球亜集団を全生存細胞の割合として決定した。T細胞:CD3+CD19-、CD16+NK細胞:CD56+CD16+、CD16-NK細胞:CD56+CD16-、単球:CD11b+CD14+。T細胞の割合は、3つの産物について99%以上であった。US30A-9665子宮頸部腫瘍の産物では、T細胞の割合は、約96%であり、NK細胞が約4%を占めた。
TIL産物を解析して、CD2+表現型を決定した(表E)。細胞の大部分は、CD2+エフェクターメモリー(CD2_EM)である。
TIL産物を解析して、CD4+/CD8+/DP/DN細胞の割合を決定した(表F)。cSSC腫瘍US23A-CC16のTIL産物は、CD8+細胞に向かって歪んだが、一方で、子宮頸部腫瘍US30B~9569のTIL産物は、CD4+細胞に向かって歪んだ。cSSC腫瘍US23B-CC17からの細胞は、CD4+及びCD8+集団の間でより均等に分割される。子宮頸部腫瘍US30A-9665からの細胞は、CD4+集団とCD8+集団との間で相当に均等に分割されるが、最大集団は、二重陰性(DN)であった。
[001090] 効力は、本明細書に説明されるCD107a及びIFNγマーカーを使用して決定された。効力は、OKT3細胞の存在下における活性化の尺度である。最高効力(65%、US23A、cSCC)は、最高CD8 CM(2.7%)及びCD8 EM(66.4%)と相関する。最低効力(41%、US30B、子宮頸部)は、非常に低いCD8 CM(0.6%)及びCD8 EM(9.2%)並びに高いCD4 CM(3.2%)及びCD4 EM(79%)に相関する。US30A(子宮頸部)における高DN集団は、効力に対する相関性をほとんど示さなかった。
最終産物属性は、最終産物属性表に示されている。プロセスは、高い細胞生存率及び高いCD3+純度によって特徴付けられる。
実施例19-NSCLC
NSCLC TILは、同じ手順によって調製された。1、8、11、及び13日目の成長培養中のCD3+細胞は、表Jの13、19、22、及び25日目のNSCLS成長表及びREPに提示される。プロセスは、高い細胞生存率及び高いCD3+純度によって特徴付けられる。
NSCLC TILは、同じ手順によって調製された。1、8、11、及び13日目の成長培養中のCD3+細胞は、表Jの13、19、22、及び25日目のNSCLS成長表及びREPに提示される。プロセスは、高い細胞生存率及び高いCD3+純度によって特徴付けられる。
実施例20-小規模製造
凍結保存され消化された腫瘍調製物を解凍し、細胞の回収を決定した。5つの切除NSCLC腫瘍(LM-CHTN-006、LM-CHTN-111、SR-21-0182、SR-21-TM4、SR-21-TM6)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86A)。6つの切除子宮頸部腫瘍(Cer-CHTN-044、CER-CHTN-073、Cer-UK-9643、Cer-UK-9671、Cer-UK-11906、Cdr-UK-11907)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86B)。4つの切除NSCLC腫瘍(LM-CHTN-006、NSCLC-Bio-02LS、LM-SR-21-0553、LM-SR-21-0557)及び4つの切除子宮頸部腫瘍(Cervix 9581、Cer-CHTN-044、OM-M1211845A、及び11976 CERVIX QC V2 03_SEP_2021)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86C)。
凍結保存され消化された腫瘍調製物を解凍し、細胞の回収を決定した。5つの切除NSCLC腫瘍(LM-CHTN-006、LM-CHTN-111、SR-21-0182、SR-21-TM4、SR-21-TM6)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86A)。6つの切除子宮頸部腫瘍(Cer-CHTN-044、CER-CHTN-073、Cer-UK-9643、Cer-UK-9671、Cer-UK-11906、Cdr-UK-11907)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86B)。4つの切除NSCLC腫瘍(LM-CHTN-006、NSCLC-Bio-02LS、LM-SR-21-0553、LM-SR-21-0557)及び4つの切除子宮頸部腫瘍(Cervix 9581、Cer-CHTN-044、OM-M1211845A、及び11976 CERVIX QC V2 03_SEP_2021)を消化し、凍結保存し、解凍し、回収細胞の生存率を決定した(図86C)。
Tiss-U-Stor1を使用した腫瘍消化の例示的な方法は、以下のとおりである。
材料及び機器:
手順
腫瘍情報を記録する。
腫瘍情報を記録する。
20mlの1×PBSに80ulのGentamycin/Amphotericin(及び利用可能な場合は80ulのバンコマイシンVancomycin)を添加することによって、抗生物質洗浄溶液(4度で保存)を調製する。良く混合する。100mmの滅菌ペトリ皿(又は複数の組織が処理される場合、6wのTCプレート)上に5mlを分配する。
滅菌ピンセットを使用して、腫瘍を穏やかに洗浄/リンスする。
CS50Nバッグの全ての開放ポートを閉鎖する。
CS50Nバッグを滅菌はさみを用いてポートなしの端に可能な限り近くで切断して、開放する。
開放されたバッグに腫瘍組織を追加する。
ヒートシーラーを使用して2回封止する。
バッグの外部を滅菌し、BSCフードに戻す。
必要な数の15mlのEDMアリコートを収集する。
各15mlのEDMアリコートに30ulのGentamycin/Amphotericinを添加し、穏やかに混合する。
30ulのVancomycinを各15mlのEDMアリコートに添加し、穏やかに混合する。
15mlのEDM/G/A/Vを30mlのシリンジに取り、各CS50Nバッグの無針ポートに取り付ける。
EDM/G/A/Vを含むシリンジをバッグ内に押し込む。シリンジ内に空気を除去する。
腫瘍及びEDM/Aを収容する封止されたCS50Nバッグを収集する。
試料を装填し、ホワイトクランプで固設する。蓋を閉鎖してラッチを固設する。
ViaFreezeの蓋を取り外し、Tissue DisaggregatorをViaFreezeの上部に固設されるまで配置する。
Tiss-U-Storプロトコル1(35度で45分間、240rpm)を選択する。
バッチの詳細を入力し、STARTを押す。
45分後、組織脱凝集装置を除去する。ユニットを開放して、バッグを取り出し、検査する。
脱凝集装置サイクルの保持を35℃で合計45分間確認する。消化装置は、240rpmでアクティブである(消化中の温度が35度より高くなっていないことを確認する)。
消化バッグの外部を滅菌し、BSCフードに戻す。
滅菌30MLシリンジを使用して消化物を移し、消化物を70ミクロンの細胞ストレーナーに通し、50MLの円錐チューブ内に収集する。
10%のFBSを含む5mlの1×PBSでバッグを洗浄し、洗浄液をフィルタを通して円錐チューブに通す。
ViCellによって生存細胞を計数する。
細胞数に基づいて、新鮮な使用(フロー解析、及び/又は必要に応じて成長)のために適切な量を2mlのEppendorf(Ep)チューブに分離し、大半を400gで10分間遠心分離する。
(任意選択)2mlの上清を新しい2mlのEpチューブに保存して、明確に標識化し(試料ID、試料タイプ、日付、オペレータのイニシャル)、将来の使用のために-80度の冷凍庫で保存する。
ペレットに触れることなく、残りの上清を慎重に吸引する。
細胞ペレットを1,000万個の細胞/ml/バイアル(又は必要に応じて他の適切な濃度)でCS10 CryoStorにおいて再懸濁し、-80度で凍結する。
全てのクライオバイアルに、試料ID、試料タイプ、日付、オペレータイニシャルを明確に標識化する。
24時間後に凍結バイアルをLNタンクに移し、シェアポイントでTO-RESEARCH Tissue Procurement Info Listを更新する。
小規模TIL製造のための例示的な方法は、以下のとおりである。
必要な培地
1日目
培地1: TCM+10%IRR-FBS(ICM-T)、10ug/mL Gentamicin+0.25ug/mL AmpB+50ug/mLバンコマイシン+3000IU/mL IL2
8、11日目
培地2: TCM+10%IRR-FBS(ICM-T)、20ug/mL Gentamicin+0.5ug/mL AmpB+100ug/mLバンコマイシン+6000IU/mL IL2
13日目(洗浄緩衝液)
培地3: TCM
13、19日目
培地4: TCM+8%ヒトAB血清(WTCM)、3000IU/mL IL2
22日目
培地5: TCM+3000IU/mL IL2
研究小規模産生プロトコル:
1)1日目:培地1を用いて、PL07バッグ(0.5E6個の生存細胞/ml)内で播種する。
2)8日目:供給(100%の1日の体積の新鮮な培地2を加える)。
3)11日目:供給(100%の1日の体積の新鮮な培地2を加える)。
4)13日目:1TIL(生存、AnnexinV-、CD45+、CD3+)を有するEV120バッグ内でREP:200 irPBMC(生存、AnnexinV-、CD45+)
5)19日目:G-Rex(6w)又はG-Rex(6M)に移し、上清の75%を新鮮な培地4と交換する。
6)22日目:上清の75%を新鮮な培地5と交換する。
7)25日目:細胞を採取する。凍結腫瘍消化物のバイアルを解凍する(1日目)
1日目
培地1: TCM+10%IRR-FBS(ICM-T)、10ug/mL Gentamicin+0.25ug/mL AmpB+50ug/mLバンコマイシン+3000IU/mL IL2
8、11日目
培地2: TCM+10%IRR-FBS(ICM-T)、20ug/mL Gentamicin+0.5ug/mL AmpB+100ug/mLバンコマイシン+6000IU/mL IL2
13日目(洗浄緩衝液)
培地3: TCM
13、19日目
培地4: TCM+8%ヒトAB血清(WTCM)、3000IU/mL IL2
22日目
培地5: TCM+3000IU/mL IL2
研究小規模産生プロトコル:
1)1日目:培地1を用いて、PL07バッグ(0.5E6個の生存細胞/ml)内で播種する。
2)8日目:供給(100%の1日の体積の新鮮な培地2を加える)。
3)11日目:供給(100%の1日の体積の新鮮な培地2を加える)。
4)13日目:1TIL(生存、AnnexinV-、CD45+、CD3+)を有するEV120バッグ内でREP:200 irPBMC(生存、AnnexinV-、CD45+)
5)19日目:G-Rex(6w)又はG-Rex(6M)に移し、上清の75%を新鮮な培地4と交換する。
6)22日目:上清の75%を新鮮な培地5と交換する。
7)25日目:細胞を採取する。凍結腫瘍消化物のバイアルを解凍する(1日目)
試薬:
TCM
IRR-FBS
TIL(ICM-T)用の照射された細胞培地
アリコートされたIL-2ストック
(1×106IU/ml)
抗生物質:
Gentamicin/Amphotericin溶液(500×)
Vancomycinアリコート(50mg/mL)
Bactec Peds Plus
Bactec Lytic
凍結腫瘍消化物を解凍する(1日目)
各腫瘍消化物バイアルについて15MLの円錐チューブを標識化し、2mlの予め加温された(37度水浴)培地1を加える。
TCM
IRR-FBS
TIL(ICM-T)用の照射された細胞培地
アリコートされたIL-2ストック
(1×106IU/ml)
抗生物質:
Gentamicin/Amphotericin溶液(500×)
Vancomycinアリコート(50mg/mL)
Bactec Peds Plus
Bactec Lytic
凍結腫瘍消化物を解凍する(1日目)
各腫瘍消化物バイアルについて15MLの円錐チューブを標識化し、2mlの予め加温された(37度水浴)培地1を加える。
腫瘍消化物バイアルをLNから取り出し、小さい塊が残るまで37度の水浴で直ちに解凍する。
外部を滅菌し、バイアルをBSCに置く。
1mlの非常に穏やかに予め加温された培地1を、各バイアルに滴加する。
5mlの血清用ピペットを使用して、バイアルから合計2mlの細胞懸濁液を移し、非常に穏やかに、2mlの培地1を収容する合致する標識付きの15mlの円錐チューブに滴加する。
15mlの円錐チューブ内の細胞懸濁液に、6mlの予め加温された培地1を非常に穏やかに加える。
400gで10分間遠心分離する。
細胞ペレットに触れることなく、上清を慎重に吸引する。
凍結細胞数に基づいて、5mlの培地1に細胞を穏やかに再懸濁し、NC200によって計数する。
後続の用途のために適切な細胞数を分離する。
TIL成長(1日目)
手順
解凍された腫瘍消化物からの生存細胞数に基づいて、所望の数の細胞を新しい15mlの円錐チューブに移し、培地を合計1~10mlで満たす。
手順
解凍された腫瘍消化物からの生存細胞数に基づいて、所望の数の細胞を新しい15mlの円錐チューブに移し、培地を合計1~10mlで満たす。
400gで10分間遠心分離し、ペレットに触れることなく上清を吸引する。
0.5×106個の細胞/mlの密度で適切な容器において培地1中にペレットを再懸濁する。
培養バッグから気泡を除去する。
37℃の5%のCO2でインキュベートする
8日目に、100%の1日の体積の新鮮な培地2を加え、次いで、NC200によって計数する。
11日目に、100%の1日の体積の新鮮な培地2を加え、次いで、NC200によって計数する。
13日目まで培養を続ける。
TILの急速培養(13~25日目)
REP(13日目)
TIL部分
成長培養物を完全に収集する。
REP(13日目)
TIL部分
成長培養物を完全に収集する。
400gで10分間遠心分離する。上清を吸引する。
細胞ペレットを培地3中に再懸濁し、NC200によって計数する
(AnnexinV-CD45+CD3+/生存)%を特徴解析するためのフローのために0.2E6個の生存細胞を分離する
13日目の細胞収率、及びREP内への(生存AnnxinV- CD45+ CD3+)細胞の総数を計算する。
30ng/mLのOKT3を用いて、培地4中でTILを調製する。
irPBMC部分
照射装置をオンにし、初期ウォームアッププログラム(30分)及びDOSE QA(2分)を実行する。
照射装置をオンにし、初期ウォームアッププログラム(30分)及びDOSE QA(2分)を実行する。
3人のドナーのPBMCを、解凍直前まで37Cの水浴中で解凍する。
バイアルの外部を滅菌し、バイアルをBSCフードに置く。
1mlの予め加温された培地4を、各バイアルに滴加する。
細胞懸濁液全体を、2mlの予め加温された培地4を収容する50mlの円錐チューブに移し、滴下する。
6mlの予め加温された培地4を円錐チューブに穏やかに追加する。
400gで10分間遠心分離し、上清を吸引する。
細胞ペレットを培地4中に再懸濁する。
NC200によってPBMCを計数する。
3人のドナーのPBMCを1:1:1の比率で、50mlの円錐チューブに組み合わせる。
チューブに用量ステッカーを配置する。
直ちにPBMCを照射する(シェルフ3、25Gry)。
照射が行われたとき、全ての照射された細胞を収集し、400gで10分間沈降させる。
上清を吸引除去し、培地4中で穏やかにかつ完全に再懸濁させ、NC200によって計数する。
(AnnexinV-CD45+/生存)%をフロー特性解析するために0.2E6個の生存細胞を分離する
30ng/mLのOKT3を含む培地4中に照射されたフィーダーを調製する。
REPセットアップ
irPBMCを含むTILを1(CD3+ TIL):200のirPBMCの比率でEV120バッグ内に入れ、容器毎に容積を、30ng/mL OKT3を含む培地4で充填する。
irPBMCを含むTILを1(CD3+ TIL):200のirPBMCの比率でEV120バッグ内に入れ、容器毎に容積を、30ng/mL OKT3を含む培地4で充填する。
培養バッグから気泡を除去する。
EV120バッグをインキュベーター(37C、5%のCO2、95%の湿度)内に配置する。
対照培養物として、irPBMCのみのTC25フラスコをセットアップする。
19日目に、NC200によって細胞密度を計数する。
19日目に、いかなる洗浄もなしで細胞を収集し、G-Rex(6w)又はG-Rex 6Mに移す。
移植後、培養物を3時間インキュベートする。
75%体積の上清を除去する。
75%体積の新鮮な培地4を加える。
22日目に、NC200によって細胞密度を計数する。
22日目に、75%体積の上清を除去し、75%体積の新鮮な培地5を加える。
25日目、全ての細胞を採取する。
細胞を400gで10分間沈降させ、上清を吸引除去する。
細胞を50mLのHarvest Wash Buffer(PBS+5%HAS)中に再懸濁させる。
NC200によって細胞密度を計数する。
フロー特性解析のために0.2E6個のセルを分離する。
細胞を400gで10分間沈降させ、上清を吸引除去する。
細胞をCS10で凍結保存する。
1、13、及び25日目のフロー解析
解析物:DRAQ7、Annexin V、CD45、CD3、CD2、CD4、CD8a、CD56
解析物:DRAQ7、Annexin V、CD45、CD3、CD2、CD4、CD8a、CD56
0.2E6個の細胞を96w U底プレート内に収集する。
100ulのFBS染色緩衝液で洗浄する。500gで3分間沈降させ、上清をデカンターに移す。
50ulのヒトFcブロック試薬(BDブリリアント染色緩衝液で1:50希釈された)中に細胞を再懸濁させる。
室温で10分間インキュベートする。
以下に示されるように調製された50ulの抗体カクテルを加え、ピペットで良く混合する。
暗所で4度で20分間インキュベートする。
抗体インキュベーション中、Abcコンペンセーションビーズ及び個々の抗体を用いてコンペンセーション試料を調製する。生/死の混合細胞を用いて、DRAG7及びAnnexin V単色対照を調製する。
100ulのFBS染色緩衝液で洗浄する。500gで3分間沈降させ、上清をデカンターに移す。
10ugのAnnexin V-PEを用いて、100ulの1×Annexin V結合緩衝液中に細胞を再懸濁させる
暗所で室温で15分間インキュベートする。
100ulの1×Annexin V結合緩衝液で洗浄する。500gで3分間沈降させ、上清をデカンターに移す。
1×Annexin V結合緩衝液中で調製された1:100希釈されたDRAQ7溶液中に細胞を再懸濁させる。
直ちに、Novocyte又はFortessaで解析する。
手順によって調製された5つのNCSLC腫瘍からのTILの生存率が図87Aに示され、NSCLC TIL製造表に要約されている。成長及びREP中の生存細胞、並びに生存細胞の%CD3を決定した(図88)。
手順によって調製された6つの子宮頸部腫瘍からのTILの生存率が図87Bに示され、子宮頸がんTIL製造表に要約されている。成長及びREP中の生存細胞、並びに生存細胞の%CD3を決定した(図89)。
NSCLC腫瘍から調製されたTIL中のCD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+(DP)、及びCD4-CD8-(DN)細胞の割合が図90に示されている。全てのTIL調製物は、相当数のCD8+細胞を含有し、5つのTIL培養物のうちの4つは、経時的なCD8+細胞の実質的な増加を実証した。
本発明は、以下の番号付き段落によって更に説明される。
1.組織を処理するための可撓性コンテナであって、封止可能なポリマーから作製された1つ以上の層であって、可撓性コンテナの少なくとも3つの縁が、製造中に封止されている、1つ以上の層と、組織材料が使用中に挿入される、可撓性コンテナ上の開放縁と、チューブを通して可撓性コンテナを少なくとも1つの要素に結合するように構成された1つ以上のコネクタと、を備え、開放端に近接する区分は、組織材料が可撓性コンテナ内に位置付けられて封止を形成した後に封止される、可撓性コンテナ。
2.封止が、開放端に平行で、かつ可撓性コンテナの開放縁から離隔された少なくとも3mmの幅のエリアを含む、段落1に記載の可撓性コンテナ。
3.突出部を有し、封止に近接して位置付けられ、可撓性コンテナの開口縁から封止よりも更に離隔されたクランプを更に備える、段落1に記載の可撓性コンテナ。
4.使用中に封止とクランプとの組み合わせが、可撓性コンテナに適用される100Nの力に耐えるように構成されている、段落3に記載の可撓性コンテナ。
5.使用中に封止とクランプとの組み合わせが、可撓性コンテナに適用される75Nの力に耐えるように構成されている、段落3に記載の可撓性コンテナ。
6.封止が、開放端に平行で、かつ可撓性コンテナの開放縁から離隔された少なくとも5mmの幅のエリアを含む、段落1に記載の可撓性コンテナ。
7.可撓性コンテナが、組織材料の脱凝集に使用される、段落1に記載の可撓性コンテナ。
8.可撓性コンテナが、組織材料の脱凝集、脱凝集組織材料の濾過、並びに非脱凝集組織及び濾液の分離に使用される、段落1に記載の可撓性コンテナ。
9.弾性変形可能な材料を更に含む、段落1に記載の可撓性コンテナ。
10.1つ以上のインジケータを更に含む、段落1に記載の可撓性コンテナ。
11.1つ以上のマークを更に含む、段落1に記載の可撓性コンテナ。
12.封止が、所定の圧力、所定の温度、及び所定の時間枠で動作するヒートシーラーを使用して形成されている、段落1に記載の可撓性コンテナ。
13.可撓性コンテナが、可撓性コンテナ内に配置された組織材料を機械的に粉砕するデバイスで使用されるように構成されている、段落1に記載の可撓性コンテナ。
14.可撓性コンテナが、組織材料をせん断するように構成されている、段落1に記載の可撓性コンテナ。
15.哺乳動物細胞又は細胞凝集体の無菌脱凝集、安定化、及び任意選択の濃縮のための半自動又は自動プロセスにおける、段落1に記載の可撓性コンテナの使用。
16.組織からの所望の材料の抽出のためのシステムであって、キットであって、脱凝集可撓性コンテナ、安定化可撓性コンテナ、及び組織源、組織の状態、又は識別子のうちの少なくとも1つを提供することができる、脱凝集可撓性コンテナ又は安定化可撓性コンテナのうちの少なくとも1つに位置付けられた少なくとも1つのインジケータタグを含む、キットと、脱凝集可撓性コンテナ内で少なくともいくつかの組織を治療して、処理された流体を形成することができる脱凝集要素と、処理された流体のうちの少なくともいくつかを濃縮して、所望の材料を形成することができる濃縮要素と、安定化可撓性コンテナ内に所望の材料の一部分を保存することができる安定化要素と、安定化要素における組織源、又は組織の状態のうちの少なくとも1つを提供することができる、脱凝集要素又は安定化要素のうちの少なくとも1つに位置付けられた少なくとも1つのインジケータタグリーダーと、を備える、システム。
17.所望の材料が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、段落15に記載のシステム。
18.1つ以上のタイプの培地が、脱凝集要素及び安定化要素によってプロセスで使用される、段落15に記載のシステム。
19.コントロールレート凍結することができる、安定化要素で使用するための凍結保存培地を更に含む、段落15に記載のシステム。
20.脱凝集可撓性コンテナが、使用中に封止される開放端を有する脱凝集バッグを備え、安定化可撓性コンテナが、安定化バッグである、段落15に記載のシステム。
21.哺乳動物固形組織からの細胞又は細胞凝集体の半自動無菌脱凝集及び/又は濃縮及び/又は安定化のための自動デバイスであって、プログラム可能プロセッサと、脱凝集可撓性コンテナとして、段落1~15のいずれかの可撓性コンテナのうちの少なくとも1つを含むキットと、を備える、自動デバイス。
22.インジケータタグリーダーを更に備える、段落21に記載の自動デバイス。
23.キットの構成要素を認識する無線周波数識別タグリーダーを更に備える、段落21に記載の自動デバイス。
24.プログラム可能プロセッサが、タグを介してキットの構成要素を認識し、その後、脱凝集、濃縮、及び安定化プロセスのタイプ、並びにそれらのプロセスに必要なそれぞれの培地タイプを定義するプログラムを実行することができる、段落21に記載の自動デバイス。
25.プログラム可能プロセッサが、自動デバイスの脱凝集要素を制御して、脱凝集可撓性コンテナにおける固形組織の物理的及び/又は生物学的分解を可能にする、段落21に記載の自動デバイス。
26.プログラム可能プロセッサが、脱凝集可撓性コンテナ内に位置付けられた固形組織を機械的に粉砕及びせん断する、脱凝集可撓性コンテナに近接する脱凝集表面を制御し、任意選択的に、脱凝集表面が、機械的ピストンである、段落25に記載の自動デバイス。
27.プログラム可能プロセッサが、自動デバイスの脱凝集要素を制御して、脱凝集可撓性コンテナにおける固形組織の物理的及び/又は酵素的分解を可能にする、段落21に記載の自動デバイス。
28.固形組織の酵素的分解は、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼHI、ペプシン、又はそれらの混合物から選択される1つ以上の培地酵素溶液によるものである、段落27に記載の自動デバイス。
29.デバイスが、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの少なくとも2つを備え、プログラム可能プロセッサが、脱凝集要素、濃縮要素、及び安定化要素のうちの1つ以上と通信して制御するように適合されている、段落21に記載の自動デバイス。
30.プログラム可能プロセッサが、任意選択的にプログラム可能な温度を使用して、安定化要素を制御して、濃縮された脱凝集固形組織を凍結保存コンテナ内で凍結保存する、段落29に記載の自動デバイス。
31.デバイスは、任意選択の濃縮要素への脱凝集固形組織の移送前に、脱凝集プロセスが脱凝集要素で完了したか否かを認識することができるセンサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び/若しくは安定化要素のうちの1つ以上のコンテナに必要とされる培地の量を決定し、それぞれのコンテナ間の材料の移送を制御するための重量センサ、脱凝集要素、濃縮要素、及び/若しくは安定化要素のうちの1つ以上のコンテナ内の温度を制御するためのセンサ、要素内の各コンテナの入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つの気泡センサ、入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための少なくとも1つのポンプ、任意選択的に蠕動ポンプ、濃縮要素内の圧力を評価するための圧力センサ、濃縮要素内の接線流濾過プロセスを制御するための1つ以上の弁、並びに/又は各要素の入力ポートと出力ポートとの間の培地の移送を制御するための1つ以上のクランプの追加の構成要素のうちの1つ以上を任意の組み合わせで更に備える、段落29に記載の自動デバイス。
32.プログラム可能プロセッサは、コンテナが除去されるまで安定化要素内の最適な保存温度範囲を維持するように適合されているか、又は制御された凍結ステップを実行するように適合されている、段落29に記載の方法。
33.ユーザインターフェースを更に備える、段落21~32のいずれかに記載の自動デバイス。
34.インターフェースが、ユーザを入力パラメータにガイドするか、事前にプログラムされたステップを確認するか、エラーを警告するか、又はそれらの組み合わせである命令を表示するディスプレイ画面を含む、段落26に記載の自動デバイス。
35.自動デバイスが、輸送可能であるように適合されている、段落21に記載の自動デバイス。
36.自動組織処理方法であって、キットと関連付けられたデジタル、電子、又は電磁タグインジケータから、処理ステップのための条件及びそれらの関連付けられた条件を自動的に決定することと、組織試料をキットの可撓性コンテナ内に配置することと、
可撓性コンテナの少なくとも1つの縁を封止することと、インジケータと通信し、可撓性コンテナを制御することによって、1つ以上の組織処理ステップを自動的に実行することによって、組織試料を処理することと、処理された組織試料の少なくとも一部分を濾過して、濾過された流体を生成することと、濾過された流体の少なくとも一部を、凍結保存可撓性コンテナに提供することと、を含む、方法。
37.処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含む、段落31に記載の方法。
38.処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み、所望の材料の抽出を結果的にもたらす、段落31に記載の方法。
39.処理が、可撓性コンテナ内の組織試料の少なくとも一部分の攪拌、抽出、及び酵素消化を含み、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の抽出を結果的にもたらす、段落31に記載の方法。
40.可撓性コンテナが、ヒートシール可能な材料を含む、段落31に記載の方法。
41.可撓性コンテナが、EVA、ビニルアセテート及びポリオレフィンポリマーブレンド、又はポリアミドのうちの少なくとも1つを含む、段落31に記載の方法。
本発明の好ましい実施形態について詳細に説明したが、上の段落によって定義される本発明が、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく多くの明らかな変形が可能であるため、上の説明に記載される特定の詳細に限定されるものではないことを理解されたい。
Claims (51)
- 治療用腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団であって、
a)前記集団中のT細胞が、少なくとも25%のエフェクターメモリー(EM)T細胞を含むか、若しくは前記集団中のCD4 T細胞が、少なくとも25%のEM CD4 T細胞を含むか、若しくは前記集団中のCD8 T細胞が、少なくとも25%のEM CD8 T細胞を含むか、又は
b)前記集団中のT細胞が、少なくとも20%のセントラルメモリー(CM)T細胞を含むか、若しくは前記集団中のCD4 T細胞が、少なくとも20%のCM CD4 T細胞を含むか、若しくは前記集団中のCD8 T細胞が、少なくとも20%のCM CD8 T細胞を含むか、又は
c)前記集団中のEM及びCM T細胞の合わせた割合が、前記T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは前記集団中のEM及びCM CD4 T細胞の合わせた割合が、前記CD4 T細胞の少なくとも40%を構成するか、若しくは前記集団中のEM及びCM CD8 T細胞の合わせた割合が、前記CD8 T細胞の少なくとも40%を構成するか、又は
(d)UTIL集団中のエフェクターT細胞の割合が、前記T細胞の10%以下であるか、若しくは前記集団中のエフェクターCD4 T細胞の割合が、前記CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは前記集団中のエフェクターCD8 T細胞の割合が、前記CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(e)前記集団中の幹細胞メモリーT細胞の割合が、前記T細胞の10%以下であるか、若しくは前記集団中の幹細胞メモリーCD4 T細胞の割合が、前記CD4 T細胞の10%以下であるか、若しくは前記集団中の幹細胞メモリーCD8 T細胞の割合が、前記CD8 T細胞の10%以下であるか、又は
(f)前記集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーT細胞の合わせた割合が、前記T細胞の15%以下であるか、若しくは前記集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD4 T細胞の合わせた割合が、前記CD4 T細胞の15%以下であるか、若しくは前記集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD8 T細胞の合わせた割合が、前記CD8 T細胞の15%以下である、治療用TIL集団。 - 前記EM細胞が、CD62L-/CD45RO+、若しくはCCR7lo/CD62Llo、若しくはCx3Cr1hi/CD27lo、若しくはCD127hi、若しくはCD27-/CD45RA-によって特徴付けられるか、又は前記CM細胞が、CD62L+/CD45RO+、若しくはCCR7hi/CD62Lhi、若しくはCx3Cr1lo/CD27hi、若しくはCD127hi、若しくはCD27+/CD45RA-によって特徴付けられるか、又は前記エフェクター細胞が、CD62L-/CD45RO-によって特徴付けられるか、又は前記幹細胞メモリー細胞が、CD62L+/CD45RO-によって特徴付けられる、請求項1に記載の治療用TIL集団。
- 治療用凍結保存腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を単離するための方法であって、
(a)(i)切除腫瘍を凍結保存し、前記凍結保存腫瘍を脱凝集するか、又は
(ii)切除腫瘍を脱凝集し、前記脱凝集腫瘍を凍結保存するか、又は
(iii)切除腫瘍を凍結保存し、前記腫瘍を複数の腫瘍断片に処理するか、又は
(iv)切除腫瘍を複数の腫瘍断片に処理し、前記腫瘍断片を凍結保存して、
精製された切除腫瘍産物を得ることと、
(b)IL-2を含む細胞培養培地中で前記精製された切除腫瘍産物を培養することによって第1の増殖を実施して、第1のTIL集団を産生することと、
(c)追加のIL-2、OKT-3、及び抗原提示細胞(APC)を用いて前記第1のTIL集団を培養することによって第2の増殖を実施して、第2のTIL集団を産生することと、
(d)前記第2のTIL集団を採取及び/又は凍結保存することと、を含む、方法。 - (i)(a)(i)、(a)(ii)、(a)(iii)、(a)(iv)、又は(d)のうちのいずれかで凍結保存することが、
(i1)培地が結晶化する際の、細胞を含む環境への、環境内への、環境の周囲の、若しくは環境における熱放出が最小化若しくは回避される条件下で冷却するか、又は
(i2)脱凝集温度から約-80℃まで連続的に冷却するか、又は
(i3)約-2℃/分の速度で連続的に冷却するか、又は
(i4)約-2℃/分の速度で脱凝集温度から約-80℃まで連続的に冷却するか、又は
(i5)脱凝集温度から約-80℃まで、若しくは約-2℃/分の速度で脱凝集温度から約-80℃まで、連続的に冷却することを含み、脱凝集温度は、腫瘍が切除された動物の正常な体温、又は室温若しくは20℃若しくは25℃、又は正常なヒトの体温、約35℃若しくは36℃若しくは36.1℃~約37℃若しくは37.1℃若しくは37.2℃若しくは37.3℃、若しくは約38.3℃以下を含むか、あるいは
(ii)(a’)前記切除腫瘍を得るために対象から腫瘍を切除するか、又は前記切除腫瘍を得るために対象から腫瘍を切除することを更に含み、(a)(i)、(a)(ii)、(a)(iii)、(a)(iv)、又は(d)のうちのいずれかで凍結保存することが、(i1)、(i2)、(i3)、(i4)、又は(i5)のうちのいずれかを含む、請求項3に記載の方法。 - 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD4 T細胞が、少なくとも25%のエフェクターメモリー(EM)CD4 T細胞を含むか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD8 T細胞が、少なくとも25%のEM CD8 T細胞を含むか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のT細胞が、少なくとも25%のEM T細胞を含む、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD4 T細胞が、少なくとも20%のセントラルメモリー(CM)CD4 T細胞を含むか、あるいは前記第1のUTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のCD8 T細胞が、少なくとも20%のCM CD8 T細胞を含むか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のT細胞が、少なくとも20%のCM T細胞を含む、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM CD4 T細胞の合わせた割合が、前記CD4 T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成するか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM CD8 T細胞の合わせた割合が、前記CD8 T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成するか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のEM及びCM T細胞の合わせた割合が、T細胞の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%を構成する、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターCD4 T細胞の割合が、前記CD4 T細胞の10%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターCD8 T細胞の割合が、前記CD8 T細胞の10%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクターT細胞の割合が、前記T細胞の10%以下である、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中の幹細胞メモリーCD4 T細胞の割合が、前記CD4 T細胞の10%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL集団中の幹細胞メモリーCD8 T細胞の割合が、前記CD8 T細胞の10%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中の幹細胞メモリーT細胞の割合が、前記T細胞の10%以下である、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD4 T細胞の合わせた割合が、前記CD4 T細胞の15%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーCD8 T細胞の合わせた割合が、前記CD8 T細胞の15%以下であるか、あるいは前記第1のUTIL若しくはMTIL集団又は前記第2のUTIL若しくはMTIL集団中のエフェクター及び幹細胞メモリーT細胞の合わせた割合が、前記T細胞の15%以下である、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記EM細胞が、CD62L-/CD45RO+、若しくはCCR7lo/CD62Llo、若しくはCx3Cr1hi/CD27lo、若しくはCD127hi、若しくはCD27-/CD45RA-によって特徴付けられるか、又は前記CM細胞が、CD62L+/CD45RO+、若しくはCCR7hi/CD62Lhi、若しくはCx3Cr1lo/CD27hi、若しくはCD127hi、若しくはCD27+/CD45RA-によって特徴付けられるか、又は前記エフェクター細胞が、CD62L-/CD45RO-によって特徴付けられるか、又は前記幹細胞メモリー細胞が、CD62L+/CD45RO-によって特徴付けられる、請求項5~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱凝集することが、物理的脱凝集、酵素的脱凝集、又は物理的及び酵素的分解を含む、請求項3~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱凝集腫瘍が、細胞化される、請求項3~12のいずれか一項に記載の方法。
- 単一細胞懸濁液が、前記精製された切除腫瘍産物から得られ、ステップ(b)で使用されるか、又はステップ(a)からの前記精製された切除腫瘍産物が、単一細胞懸濁液を含む、請求項3~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のUTIL又はMTIL集団が、約100万~2000万個のUTIL又はMTILを含む、請求項3~14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記第1の集団を産生するためにUTIL又はMTILを成長させることを含み、ステップ(c)の前記第2の増殖が、急速増殖を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、約2週間実施され、ステップ(c)が、約2週間実施される、請求項16に記載の方法。
- ステップ(b)及び/又はステップ(c)で培養することが、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、又はそれらの組み合わせを添加することを含む、請求項3~17のいずれか一項に記載の方法。
- (e)前記第2のUTIL又はMTIL集団を懸濁させて、懸濁UTIL又はMTILを得ることを更に含む、請求項3~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記懸濁することが、緩衝生理食塩水、及び/又はヒト血清アルブミン、及び/又はジメチルスルホキシド(DMSO)を含む組成物中で行われる、請求項19に記載の方法。
- (f)前記懸濁UTIL又はMTILを凍結保存することを更に含む、請求項18又は19に記載の方法。
- 第2のUTIL若しくはMTIL集団の、又はそれらからの、又はそれら由来の凍結保存UTIL若しくはMTIL、あるいは前記懸濁UTIL又はMTILを解凍して、解凍UTIL又はMTILを得る最終ステップを更に含む、請求項3~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記解凍UTIL又はMTILが、更なる修飾なしで単回投与として注入する準備ができている、請求項22に記載の方法。
- 前記TILが、非修飾又はUTILである、請求項3~23のいずれか一項に記載の方法、又は請求項1若しくは2に記載の治療用集団。
- 前記TILが、修飾又はMTILである、請求項3~23のいずれか一項に記載の方法、又は請求項1若しくは2に記載の治療用集団。
- 前記TILが、遺伝子操作方法によるMTILである、請求項3~23のいずれか一項に記載の方法、又は請求項1若しくは2に記載の治療用集団。
- TILを遺伝子操作方法に供し、そこからMTILを得ることを含むステップを含む、請求項3~23又は26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子操作方法が、CRISPR法、又はTALE若しくはTALEN法、又は亜鉛フィンガー法、又はトランスフェクション法、又は形質導入法、又はトランスポゾンシステム法を含む、請求項26又は27に記載の方法又は治療用集団。
- 請求項3~28のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる、請求項1、2、又は24~28のいずれか一項に記載の治療用集団。
- 請求項3~28のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存UTIL集団。
- 請求項3~28のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるか、又は得られる、治療用凍結保存MTIL集団。
- 前記集団が、約5×109~約5×1010個のT細胞を含む、請求項1、2、24~28、29、30、又は31に記載の治療用集団。
- 請求項1、2、24~28、29、30、31、又は32に記載の治療用集団を含む内容物を収容する凍結保存バッグ。
- 前記バッグが、封止されている、請求項33に記載の凍結保存バッグ。
- 静脈内注入で使用するための請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグ、あるいは請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグを含むか、又は請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32に記載の治療用集団を含む内容物を収容する、静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器。
- 請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の薬学的に許容される賦形剤及び治療用集団、請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物を含む、医薬製剤。
- 患者又は対象におけるがんを治療するための方法であって、
(i)請求項36に記載の製剤、又は
(ii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物、又は
(vi)(i)~(v)のいずれか1つを含む薬剤を投与することを含み、
前記患者又は対象が、前記がんのために、及び/又は前記投与のために治療される必要がある、方法。 - がんの治療のための薬剤を調製するための
(i)請求項36に記載の製剤、又は
(ii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物の使用であって、
患者又は対象に前記薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
(i)請求項36に記載の製剤、又は
(ii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物を含み、
前記患者又は対象が、がんのために、及び/又は前記投与を受けるために治療される必要がある、使用。 - 前記がんが、膀胱がん、乳がん、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、子宮頸がん、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮細胞がん[HNSCC]を含む)、肺がん、黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、腎がん、又は腎細胞がんである、請求項37又は38に記載の方法又は使用。
- 前記患者又は対象が、ヒトである、請求項37又は38に記載の方法又は使用。
- 前記患者又は対象が、非ヒト哺乳動物である、請求項37又は38に記載の方法又は使用。
- 前記非ヒト哺乳動物が、霊長類、齧歯類、ラット、マウス、家畜化哺乳類、家畜化ネコ、家畜化イヌ、家畜化ウマ、モルモット、実験動物、又はコンパニオンアニマルである、請求項41に記載の方法又は使用。
- 前記患者又は対象が、二次性徴を有する成人又は個人である、請求項37~42のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記患者又は対象が、二次性徴を有する成人でも、個人でもないか、又は子供であるか、若しくは身体的に成熟していない哺乳動物である、請求項37~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が、複数回実施されるか、又は時間経過にわたって複数回実施され、前記時間経過が、1週間であり、かつ前記投与が、1週間に2回、3回、4回、若しくは5回であるか、前記時間経過が、1か月であり、かつ前記投与が、1か月に2回、4回のうちの3回であるか、又は前記時間経過が、3か月、6か月、9か月、若しくは12か月であり、かつ前記時間経過が、1か月に1回、若しくは週に1回である、及び/あるいは前記有効量が、先行請求項のいずれかに列挙されるTILの量を含む、及び/あるいは前記投与が、静脈内である、請求項37~44のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- キットであって、
(i)請求項36に記載の製剤、又は
(ii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団、又は
(iii)請求項1、2、24~28、29、30、31、若しくは32のいずれか一項に記載の治療用集団を含む製剤、又は
(iv)請求項33若しくは34に記載の凍結保存バッグの内容物、又は
(v)請求項35に記載の静脈内注入バッグ、コンテナ、若しくは容器の内容物と、
賦形剤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、又は(v)を含有及び/又は混合するためのコンテナと、任意選択的に、混合及び/又は投与のための説明書と、を含む、キット。 - 前記第1のTIL集団が、凍結保存されている、請求項37~45のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 非小細胞肺がん(NSCLC)を治療することを更に含む、請求項37~45のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 子宮頸がんを治療することを更に含む、請求項37~45のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 頭頸部がんを治療することを更に含む、請求項37~45のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 皮膚がんを治療することを更に含む、請求項37~45のいずれか一項に記載の方法又は使用。
Applications Claiming Priority (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063127639P | 2020-12-18 | 2020-12-18 | |
US202063127665P | 2020-12-18 | 2020-12-18 | |
US202063127631P | 2020-12-18 | 2020-12-18 | |
US202063127591P | 2020-12-18 | 2020-12-18 | |
US202063127608P | 2020-12-18 | 2020-12-18 | |
US63/127,608 | 2020-12-18 | ||
US63/127,639 | 2020-12-18 | ||
US63/127,591 | 2020-12-18 | ||
US63/127,665 | 2020-12-18 | ||
US63/127,631 | 2020-12-18 | ||
PCT/IB2021/000878 WO2022130015A2 (en) | 2020-12-18 | 2021-12-17 | Processing of tumor infiltrating lymphocytes |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024500748A true JP2024500748A (ja) | 2024-01-10 |
Family
ID=80628553
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023536943A Pending JP2024500748A (ja) | 2020-12-18 | 2021-12-17 | 腫瘍浸潤リンパ球の処理 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4263807A2 (ja) |
JP (1) | JP2024500748A (ja) |
AU (1) | AU2021400069A1 (ja) |
CA (1) | CA3205462A1 (ja) |
WO (1) | WO2022130015A2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201700621D0 (en) | 2017-01-13 | 2017-03-01 | Guest Ryan Dominic | Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue |
WO2021123832A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Instil Bio (Uk) Limited | Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof |
Family Cites Families (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4296206A (en) | 1980-04-30 | 1981-10-20 | United States Of America | Irreversible anti-glucocorticoids |
US4978657A (en) | 1981-01-09 | 1990-12-18 | Roussel Uclaf | Novel 11β-substituted-19-nor-steroids |
ZA8231B (en) | 1981-01-09 | 1982-11-24 | Roussel Uclaf | New 11 -substituted steroid derivatives, their preparation, their use as medicaments, the compositions containing them and the new intermediates thus obtained |
FR2528434B1 (fr) | 1982-06-11 | 1985-07-19 | Roussel Uclaf | Nouveaux 19-nor steroides substitues en 11b et eventuellement en 2, leur procede de preparation et leur application comme medicament |
FR2522328B1 (fr) | 1982-03-01 | 1986-02-14 | Roussel Uclaf | Nouveaux produits derives de la structure 3-ceto 4,9 19-nor steroides, leur procede de preparation et leur application comme medicaments |
FR2639045B2 (fr) | 1982-03-01 | 1994-07-29 | Roussel Uclaf | Nouveaux produits derives de la structure 3-ceto-delta-4,9-19-nor steroides et leur application comme medicaments |
DE3438994A1 (de) | 1984-10-22 | 1986-04-24 | Schering AG, Berlin und Bergkamen, 1000 Berlin | Antigestagene, glukokortikoide und prostaglandine zur geburtseinleitung oder fuer den schwangerschaftsabbruch |
FR2576025B1 (fr) | 1985-01-14 | 1987-01-23 | Roussel Uclaf | Nouveaux steroides substitues en position 10, leur procede et les intermediaires de preparation, leur application comme medicaments, les compositions pharmaceutiques les contenant |
AU580843B2 (en) | 1985-02-07 | 1989-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | 11``-phenyl-gonanes, their manufacture and pharmaceutical preparations containing them |
DE3506785A1 (de) | 1985-02-22 | 1986-08-28 | Schering AG, Berlin und Bergkamen, 1000 Berlin | 11ss-n,n-dimethylaminophenyl-estradiene, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische praeparate |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5380840A (en) | 1985-09-12 | 1995-01-10 | The Upjohn Company | Triazinylpiperazinyl steroids |
FR2598421B1 (fr) | 1986-05-06 | 1988-08-19 | Roussel Uclaf | Nouveaux produits 19-nor ou 19-nor d-homo steroides substitues en position 11b par un radical phenyle portant un radical alkynyle, leur procede de preparation, leur application comme medicaments et les compositions les renfermant |
DE3761308D1 (de) | 1986-07-23 | 1990-02-08 | Akzo Nv | 18-phenylestrane-derivate. |
DE3625315A1 (de) | 1986-07-25 | 1988-01-28 | Schering Ag | 11ss-(4-isopropenylphenyl)-estra-4,9-diene, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische praeparate |
US4774236A (en) | 1986-09-17 | 1988-09-27 | Research Triangle Institute | 17α-(substituted-methyl)-17β-hydroxy/esterified hydroxy steroids and pharmaceutical compositions containing them |
US4861763A (en) | 1986-09-17 | 1989-08-29 | Research Triangle Institute | 17 α-(substituted-methyl)-17β-hydroxy/esterified hydroxy steroids and their progestational use |
US4921638A (en) | 1986-11-05 | 1990-05-01 | The Upjohn Company | 17β-cyano-9α,17α-dihydroxyandrost-4-en-3-one |
DE3708942A1 (de) | 1987-03-18 | 1988-09-29 | Schering Ag | 19,11ss-ueberbrueckte steroide, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische praeparate |
DE3723788A1 (de) | 1987-07-16 | 1989-01-26 | Schering Ag | 11(beta)-phenyl-4,9,15-estratriene, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische praeparate |
FR2618783B1 (fr) | 1987-07-30 | 1991-02-01 | Roussel Uclaf | Nouveaux 17-aryle steroides, leurs procedes et des intermediaires de preparation comme medicaments et les compositions pharmaceutiques les renfermant |
JP2785023B2 (ja) | 1987-12-30 | 1998-08-13 | ルセル―ユクラフ | 17α位置を置換された17β―OH―19―ノルステロイドの新誘導体、その製造方法、その薬剤としての使用及びそれを含有する製薬組成物 |
DE3820948A1 (de) | 1988-06-16 | 1989-12-21 | Schering Ag | 10ss, 11ss-ueberbrueckte steroide |
US4954490A (en) | 1988-06-23 | 1990-09-04 | Research Triangle Institute | 11 β-substituted progesterone analogs |
US5348729A (en) | 1988-11-30 | 1994-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Evaluative means for detecting inflammatory reactivity |
US5089261A (en) | 1989-01-23 | 1992-02-18 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US4902502A (en) | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
DD289541A5 (de) | 1989-08-04 | 1991-05-02 | ��@�K@�������������@�K@��������������@��������k�� | Verfahren zur herstellung von 11beta-aryl-16 alpha, 17 alph-cyclohexanoestra-4,9-dienen |
US5276023A (en) | 1989-08-08 | 1994-01-04 | Roussel Uclaf | 19-nor-steroid esters |
FR2651233B1 (fr) | 1989-08-23 | 1991-12-13 | Roussel Uclaf | Nouveaux acides omega-phenylamino alcanouiques substitues sur le noyau aromatique par un radical derive de 19-norsterouides, leur procede de preparation, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant. |
US5173405A (en) | 1990-01-23 | 1992-12-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Use of arsenite to reversibly block steroid binding to glucocorticoid receptors in the presence of other steroid receptors |
US5616458A (en) | 1990-03-14 | 1997-04-01 | Board Of Regents, University Of Tx System | Tripterygium wilfordii hook F extracts and components, and uses thereof |
DE4042004A1 (de) | 1990-12-22 | 1992-06-25 | Schering Ag | 14(beta)-h-, 14- u. 15-en-11(beta)-aryl-4-estrene |
US5439913A (en) | 1992-05-12 | 1995-08-08 | Schering Aktiengesellschaft | Contraception method using competitive progesterone antagonists and novel compounds useful therein |
US6051573A (en) | 1994-06-28 | 2000-04-18 | Alcon Laboratories, Inc. | Treatment of GLC1A glaucoma with non-steroidal glucocorticoid antagonists |
NZ300739A (en) | 1994-12-22 | 2000-05-26 | Ligand Pharm Inc | Steroid receptor modulator compounds |
US5693646A (en) | 1994-12-22 | 1997-12-02 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | Steroid receptor modulator compounds and methods |
JP4578678B2 (ja) | 1997-12-22 | 2010-11-10 | オックスフォード バイオメディカ(ユーケー)リミテッド | ウマ伝染性貧血ウイルス(eiav)系 |
DE10038639A1 (de) | 2000-07-28 | 2002-02-21 | Schering Ag | Nichtsteroidale Entzündungshemmer |
IL180679A0 (en) | 2000-10-27 | 2009-02-11 | Pfizer Prod Inc | Process for the preparation of non-steroidal glucocorticoid receptor modulators |
ES2382636T3 (es) | 2000-10-31 | 2012-06-12 | Surmodics Pharmaceuticals, Inc. | Método para producir composiciones para la administración mejorada de moléculas bioactivas |
PT2637694T (pt) | 2010-11-12 | 2021-05-05 | Nektar Therapeutics | Conjugados de uma fração de il-2 e um polímero |
EP2961415B1 (en) | 2013-03-01 | 2021-01-06 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor |
EP3838288A1 (en) | 2014-06-11 | 2021-06-23 | polybiocept GmbH | Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy |
GB201522097D0 (en) | 2015-12-15 | 2016-01-27 | Cellular Therapeutics Ltd | Cells |
GB201700621D0 (en) | 2017-01-13 | 2017-03-01 | Guest Ryan Dominic | Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue |
JOP20190224A1 (ar) | 2017-03-29 | 2019-09-26 | Iovance Biotherapeutics Inc | عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي |
GB201801067D0 (en) | 2018-01-23 | 2018-03-07 | Price Nicola Kaye | Biomarkers predictive of tumour infiltrating lymphocyte therapy and uses thereof |
CA3094957A1 (en) * | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
WO2019217753A1 (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
GB201810181D0 (en) | 2018-06-21 | 2018-08-08 | Immetacyte Ltd | Cells expressing chimeric recominant growth factor receptors |
SG11202101787XA (en) * | 2018-09-20 | 2021-04-29 | Iovance Biotherapeutics Inc | Expansion of tils from cryopreserved tumor samples |
BR112021008549A2 (pt) * | 2018-11-05 | 2022-01-04 | Iovance Biotherapeutics Inc | Método de tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor |
GB201900858D0 (en) | 2019-01-22 | 2019-03-13 | Price Nicola Kaye | Receptors providing targeted costimulation for adoptive cell therapy |
CN113508284A (zh) | 2019-03-01 | 2021-10-15 | 阿西姆普托特有限公司 | 封闭组织解离和低温贮藏 |
WO2021123832A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Instil Bio (Uk) Limited | Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof |
-
2021
- 2021-12-17 CA CA3205462A patent/CA3205462A1/en active Pending
- 2021-12-17 EP EP21865324.4A patent/EP4263807A2/en active Pending
- 2021-12-17 JP JP2023536943A patent/JP2024500748A/ja active Pending
- 2021-12-17 WO PCT/IB2021/000878 patent/WO2022130015A2/en active Application Filing
- 2021-12-17 AU AU2021400069A patent/AU2021400069A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022130015A2 (en) | 2022-06-23 |
AU2021400069A1 (en) | 2023-07-06 |
CA3205462A1 (en) | 2022-06-23 |
EP4263807A2 (en) | 2023-10-25 |
WO2022130015A3 (en) | 2022-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11767510B2 (en) | Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof | |
TWI831776B (zh) | 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途 | |
US20230012086A1 (en) | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy | |
JP2023126265A (ja) | 凍結保存腫瘍浸潤リンパ球の再刺激 | |
TW201919662A (zh) | 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法 | |
JP2024500748A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の処理 | |
JP2023554425A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の処理 | |
EP4262828A1 (en) | Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics | |
TW202242100A (zh) | 腫瘤浸潤淋巴細胞之處理 | |
TW202317756A (zh) | 分離腫瘤浸潤淋巴球之方法及其用途 | |
TW202310857A (zh) | 腫瘤浸潤淋巴球之處理 | |
WO2023115011A1 (en) | Processing of tumor infiltrating lymphocytes | |
TW202237828A (zh) | 腫瘤浸潤淋巴細胞之處理 | |
TW202136502A (zh) | 用於分離腫瘤浸潤淋巴細胞之裝置及方法及其用途 | |
Prophete | The Effect of K562-IL21-2 Plasma Membrane Particles on the Proliferation of Natural Killer Cells to Fight Cancer |