TWI831776B - 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途 - Google Patents

腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI831776B
TWI831776B TW108114792A TW108114792A TWI831776B TW I831776 B TWI831776 B TW I831776B TW 108114792 A TW108114792 A TW 108114792A TW 108114792 A TW108114792 A TW 108114792A TW I831776 B TWI831776 B TW I831776B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
til population
til
amplification
population
days
Prior art date
Application number
TW108114792A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202014195A (zh
Inventor
賽西爾 夏提爾科陶德
克里 理堤皮海
Original Assignee
美商艾歐凡斯生物治療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商艾歐凡斯生物治療公司 filed Critical 美商艾歐凡斯生物治療公司
Publication of TW202014195A publication Critical patent/TW202014195A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI831776B publication Critical patent/TWI831776B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供用於擴增TIL及產生TIL治療性族群之改善及/或縮短方法，包括在密閉系統中擴增TIL族群之新穎方法，該方法導致在較短期間內改善TIL的療效和表型且增加代謝健康，同時允許減少微生物污染也降低成本。該方法可包含基因編輯至少一部分的TIL以增強彼等之治療療效。該TIL可用於治療性處置方案(regimen)。

Description

腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途
本文描述用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)及產生治療性TIL族群之方法。此外，本文揭示用於基因編輯TIL之方法及經基因編輯的TIL於治療疾病諸如癌症中之用途。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療大體積、難治性癌症對於預後不良患者代表一種強大的治療方案。Gattinoni,et al. ,Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。成功免疫治療需要大量的TIL，而商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增的技術、後勤及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2的TIL擴增然後「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al. ,Science 2002, 298, 850-54；Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008 ,26, 5233-39；Riddell,et al. ,Science 1992, 257, 238-41；Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003 ,26, 332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如，200倍)的經照射的通常來自多個供體之異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量的IL-2。Dudley,et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。經歷REP程序的TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的TIL製造過程受限於長度、成本、無菌性考量及其他本文所述之因子使得將該過程商業化之潛力嚴重受限，且由於這些和其他原因，在目前尚無可用的商業過程。有提供適用於商業規模製造且經法規核准用於多個臨床中心的人患者之TIL製造過程及基於該過程之療法的迫切需求。再者，有可增加患者反應率及反應強健度之更有效TIL療法的強烈需求。
本發明提供用於擴增TIL及產生治療性TIL族群之方法。根據例示性實施例，至少一部分的治療性TIL族群係經基因編輯以增強彼等之治療效應。
在一實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生； (f) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (g) 在該方法期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
在一些實施例中，方法進一步包含使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施例中，冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存培養基執行。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。在一些實施例中，PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至細胞培養。在一些實施例中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，步驟(e)之收集係使用基於膜之細胞處理系統執行。
在一些實施例中，步驟(e)之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施例中，步驟(d)之細胞培養基進一步包含IL-15及/或IL-21。
在一些實施例中，IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-15濃度係約500 IU/mL至約100 IU/mL。
在一些實施例中，IL-21濃度係約20 IU/mL至約0.5 IU/mL。
在一些實施例中，步驟(f)之輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。在一些實施例中，冷凍保存培養基包含7%至10%二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，步驟(c)之第一期間及步驟(e)之第二期間各自個別地於一段10天、11天或12天的期間內執行。
在一些實施例中，步驟(c)之第一期間及步驟(e)之第二期間各自個別地於一段11天的期間內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約22天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約20天至約22天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約15天至約20天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約20天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約10天至約15天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在22天或少於22天內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在20天或少於20天內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在15天或少於15天內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在10天或少於10天內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)及冷凍保存在22天或少於22天內執行。
在一些實施例中，步驟(e)所收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施例中，步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤的TIL產率增加。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係於步驟(d)之第二期間添加至TIL而無需打開系統。
在一些實施例中，當投予至個體時，步驟(d)之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生、增加的多株性、增加的平均IP-10及/或增加的平均MCP-1。
在一些實施例中，當投予至個體時，步驟(d)之第三TIL族群提供至少5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，步驟(d)之該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該治療性TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施例中，獲自該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
在一些實施例中，微生物污染之風險相較於開放系統減少。
在一些實施例中，來自步驟(g)之該TIL係輸注至患者。
在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，在該第一擴增、該第二擴增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一族群、該第二族群及該第三族群中一或多者之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一擴增之TIL或來自該第二擴增之TIL或來自該第一及第二擴增之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於步驟(c)之前、步驟(d)之前或步驟(e)之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該細胞培養基從該第一擴增的起始日開始包含OKT-3且該基因編輯係於該TIL已暴露至該OKT-3之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ及PKA。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現，該免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
在一些實施例中，該基因編輯包含使用可編程之核酸酶以在該一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。
在一些實施例中，該基因編輯包含一或多種選自下列之方法：CRISPR方法、TALE方法、鋅指方法及彼等之組合。
在一些實施例中，該基因編輯包含CRISPR方法。
在一些實施例中，該CRISPR方法係CRISPR/Cas9方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含TALE方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含鋅指方法。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生； (f) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 可選地使用冷凍保存過程將得自步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存； (h) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該患者；及 (i)在該方法步驟(a)至(f)期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
在一些實施例中，步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對步驟(h)之投予治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對步驟(h)之投予治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施例中，抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施例中，PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至細胞培養。
在一些實施例中，在步驟(h)之投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向患者投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)。
在一些實施例中，該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
在一些實施例中，方法進一步包含始於步驟(h)之向患者投予TIL細胞之後當天使用高劑量IL-2方案(regimen)治療患者的步驟。
在一些實施例中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在一些實施例中，步驟(d)之該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該治療性TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施例中，該治療性TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施例中，癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌及NSCLC所組成之群組。
在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。
在一些實施例中，癌症係HNSCC。
在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。
在一些實施例中，癌症係NSCLC。
在一些實施例中，在該第一擴增、該第二擴增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一族群、該第二族群及該第三族群中一或多者之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一擴增之TIL或來自該第二擴增之TIL或來自該第一及第二擴增之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於步驟(c)之前、步驟(d)之前或步驟(e)之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該細胞培養基從該第一擴增的起始日開始包含OKT-3且該基因編輯係於該TIL已暴露至該OKT-3之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ及PKA。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現，該免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
在一些實施例中，該基因編輯包含使用可編程之核酸酶以在該一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。
在一些實施例中，該基因編輯包含一或多種選自下列之方法：CRISPR方法、TALE方法、鋅指方法及彼等之組合。
在一些實施例中，該基因編輯包含CRISPR方法。
在一些實施例中，該CRISPR方法係CRISPR/Cas9方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含TALE方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含鋅指方法。
在另一實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a) 將來自患者所切除的腫瘤之經處理的腫瘤片段加入密閉系統以獲得第一TIL族群； (b) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(a)轉變至步驟(b)無需打開該系統而發生； (c) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 將得自步驟(d)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(d)轉移至步驟(e)無需打開該系統而發生；及 (f)在該方法期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
在一些實施例中，步驟(d)所收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施例中，方法進一步包含使用冷凍保存過程將包含經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施例中，冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存培養基執行。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
如請求項68之方法，其中該PBMC係於步驟(c)之第9至14天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，步驟(d)之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，第二細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施例中，步驟(e)之輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，步驟(b)之第一期間及步驟(c)之第二期間各自個別地於一段10天、11天或12天的期間內執行。
在一些實施例中，步驟(b)之第一期間及步驟(c)之第二期間各自個別地於一段11天的期間內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約22天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約20天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(e)在一段約10天至約15天的期間之內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(e)在22天或少於22天內執行。
在一些實施例中，步驟(a)至(e)及冷凍保存在22天或少於22天內執行。
在一些實施例中，步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤的TIL產率增加。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係於步驟(c)之第二期間添加至TIL而無需打開系統。
在一些實施例中，步驟(d)之該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中在該治療性TIL族群中獲得之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施例中，在該治療性TIL族群中獲得之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
在一些實施例中，微生物污染之風險相較於開放系統減少。
在一些實施例中，來自步驟(e)之TIL係輸注至患者。
在一些實施例中，密閉容器包含單一生物反應器。
在一些實施例中，密閉容器包含G-REX-10。
在一些實施例中，密閉容器包含G-REX-100。
在一些實施例中，在步驟(d)中，抗原呈現細胞(APC)係以25:1至100:1之APC:TIL比例添加至第二TIL族群之細胞培養。
在一些實施例中，細胞培養具有2.5×109 個APC對100×106 個TIL之比例。
在一些實施例中，在步驟(c)中，抗原呈現細胞(APC)係以25:1至100:1之APC:TIL比例添加至第二TIL族群之細胞培養。
在一些實施例中，細胞培養具有2.5×109 個APC對100×106 個TIL之比例。
在一些實施例中，在該第一擴增、該第二擴增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一族群、該第二族群及該第三族群中一或多者之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一擴增之TIL或來自該第二擴增之TIL或來自該第一及第二擴增之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於步驟(b)之前、步驟(c)之前或步驟(d)之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該細胞培養基從該第一擴增的起始日開始包含OKT-3且該基因編輯係於該TIL已暴露至該OKT-3之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ及PKA。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現，該免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
在一些實施例中，該基因編輯包含使用可編程之核酸酶以在該一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。
在一些實施例中，該基因編輯包含一或多種選自下列之方法：CRISPR方法、TALE方法、鋅指方法及彼等之組合。
在一些實施例中，該基因編輯包含CRISPR方法。
在一些實施例中，該CRISPR方法係CRISPR/Cas9方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含TALE方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含鋅指方法。
在另一實施例中，本發明提供根據本文所述之任何擴增方法擴增之治療性TIL族群(例如用於治療個體之癌症)，其中該治療性TIL族群經永久基因編輯。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之經擴增的TIL族群，其中該經擴增的TIL族群係可藉由方法獲得之第三TIL族群，該方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自個體所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生； (f) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生； (g) 可選地使用冷凍保存過程將得自步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存；及 (h) 在該方法期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
在一些實施例中，上述方法進一步包含一或多個本文所述之任何方法及組成物中引述之特徵。
在一些實施例中，在該第一擴增、該第二擴增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一族群、該第二族群及該第三族群中一或多者之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於來自該第一擴增之TIL或來自該第二擴增之TIL或來自該第一及第二擴增之TIL進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行。
在一些實施例中，該基因編輯係於步驟(c)之前、步驟(d)之前或步驟(e)之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行。
在一些實施例中，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行。
在一些實施例中，該細胞培養基從該第一擴增的起始日開始包含OKT-3且該基因編輯係於該TIL已暴露至該OKT-3之後進行。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
在一些實施例中，該一或多個免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ及PKA。
在一些實施例中，該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現，該免疫檢查點基因係選自包含下列之群組：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
在一些實施例中，該基因編輯包含使用可編程之核酸酶以在該一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。
在一些實施例中，該基因編輯包含一或多種選自下列之方法：CRISPR方法、TALE方法、鋅指方法及彼等之組合。
在一些實施例中，該基因編輯包含CRISPR方法。
在一些實施例中，該CRISPR方法係CRISPR/Cas9方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含TALE方法。
在一些實施例中，該基因編輯包含鋅指方法。
在另一實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含OKT-3及/或4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 可選地添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子之表現。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含OKT-3及/或4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 可選地添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生； (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群；及 (k) 投予治療有效劑量的來自該輸注袋的該經收集的TIL族群至該患者； 其中該電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子之表現。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之經擴增的TIL族群，其中該經擴增的TIL族群係可藉由方法獲得之經收集的TIL族群，該方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含OKT-3及/或4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 可選地添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子之表現。
在一些實施例中，該方法包含藉由在包含IL-2、OKT-3及4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行該第一擴增，其中該OKT-3及該4-1BB促效抗體可選地從第0天或第1天開始存在於該細胞培養基中。
在另一實施例中，本發明提供一種冷凍保存組成物，其包含用於治療癌症個體之TIL族群、包含DMSO之冷凍保護劑培養基及電解質溶液。
在一些實施例中，該冷凍保存組成物可進一步包含一或多種穩定劑(例如HSA)及一或多種淋巴細胞生長因子(例如IL-2)。
在一些實施例中，該包含DMSO之冷凍保護劑培養基及該電解質溶液係以約1.1:1至約1:1.1之比例存在。
在一些實施例中，該冷凍保存組成物包含：約30 mL至約70 mL之量的該包含DMSO之冷凍保護劑培養基、約30 mL至約70 mL之量的該電解質溶液、約0.1 g至約1.0 g之量的HSA及約0.001 mg至約0.005 mg之量的IL-2。
I. 介紹
利用快速擴增規程(REP)離體(ex vivo )培養之TIL的過繼性細胞療法已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的REP規程對於將被輸注至患者的TIL之健康少有深入了解。T細胞從它們的初始狀態(naïve)到效應T細胞的成熟過程期間經歷重大代謝偏移(見Chang,et al. ,Nat. Immunol. 2016, 17, 364，特此明白將全文併入，且特別是關於厭氧及有氧代謝之標誌的討論)。例如，初始T細胞依賴粒線體呼吸來產生ATP，然而成熟、健康的效應T細胞諸如TIL具有高度醣解性，依賴有氧醣解作用來提供它們增生、遷移、活化及抗腫瘤療效所需的生物能基質。
先前文獻報告，在TIL轉移之前限制醣解作用及促進粒線體代謝是所欲的，因為高度依賴醣解作用的細胞在過繼性轉移時將經歷營養素剝奪，此可導致大部分轉移細胞死亡。因此，先前技術揭示促進粒線體代謝可能促進活體內(in vivo)壽命且事實上建議在誘導免疫反應之前使用醣解作用抑制劑。見Chang, et al.,Nat. Immunol. 2016, 17(364)。
本發明在一些實施例中進一步關於用於評估及定量此代謝健康增加的方法。因此，本發明提供測定TIL族群相對健康之方法，使用一或多種常規代謝評估，包括但不限於醣解作用的速率及量、氧化磷酸化、備用呼吸量(SRC)及醣解儲備。
另外，本發明在一些實施例中進一步關於用於評估及定量此代謝健康增加的方法。因此，本發明提供測定TIL族群相對健康之方法，使用一或多種常規代謝評估，包括但不限於醣解作用的速率及量、氧化磷酸化、備用呼吸量(SRC)及醣解儲備。
此外，可選的額外評估包括但不限於ATP產生、粒線體質量及葡萄糖攝取。
本發明進一步在一些實施例中關於使用基因編輯技術以增強TIL的治療效應。雖然過繼性轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)提供有希望及有效療法，仍有可增加患者反應率及反應強健性之更有效TIL療法的強烈需求。如本文所述，本發明之實施例提供擴增TIL成基因編輯的治療性族群之方法以提供增強治療效應。II. 定義
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬領域之技藝人士所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案係以參照方式被整體納入。
用語「活體內(in vivo )」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「體外(in vitro )」係指發生在個體身體以外的事件。體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「離體(ex vivo )」係指涉及在從個體身體移除之細胞、組織及/或器官上所進行處理或執行程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療的方法回到個體體內。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL (bulk TIL)及擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞族群可包括基因修飾的TIL。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106 至1×1010 ，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108 個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109 至1.5×1010 個用於輸注的細胞族群。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的冷凍保存TIL (thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL族群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至患者的溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
用語「冷凍保存培養基」係指任何可用於冷凍保存細胞的培養基。該培養基可包括包含7%至10% DMSO的培養基。例示性培養基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及彼等之組合。用語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷凍保存培養基。CS10培養基可以其商品名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10培養基是不含血清、不含動物組分的包含DMSO之培養基。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人中為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7hi )及CD62L (CD62hi )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞」係指人或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo )且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至患者為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。較佳地，周邊血液單核細胞係經照射的異體周邊血液單核細胞。PBMC是一種抗原呈現細胞。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人、人化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人、人化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。抗CD3抗體亦包括UHCT1株(BioLegend, San Diego, CA, USA之市售品)，亦稱為T3及CD3ε。
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如Nelson,J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及Malek,Annu.Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人IL-2)係非糖基化人重組形式的IL-2，分子量為大約15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214(可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2配方係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir. Res. 2001, 2, 66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1 。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall,Blood 2002, 99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001, 97, 14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard,Nat. Rev. Drug.Disc. 2014, 13, 379-95，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及活化的人CD4+ T細胞產生。重組人IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及患者(個體)病況差異判定。通常說明本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(例如繼代TIL或基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)的醫藥組成物可以104 至1011 細胞/kg體重(例如105 至106 、105 至1010 、105 至1011 、106 至1010 、106 至1011 、107 至1011 、107 至1010 、108 至1011 、108 至1010 、109 至1011 或109 至1010 細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)組成物亦可以這些劑量投予多次。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因的)可使用在免疫治療中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。對特定患者而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測患者的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz,et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一些實施例中，可提供TIL族群，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之rTIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施例中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於個體中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二或更多種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(體外或活體內)或所欲治療之個體及疾病病況(例如個體的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展或進展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二或更多個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施例中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考抗體的胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL、擴增TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖9步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TILS可進一步藉由效力表徵-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TILS可被認為有效。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散培養基、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習用醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所涵蓋之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、配方、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、配方、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施例可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施例中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。III. 基因編輯過程 A. 概覽：TIL擴增+基因編輯
本發明之實施例係關於擴增TIL族群之方法，該方法包含一或多個基因編輯至少一部分的TIL以增強彼等之治療效應的步驟。如本文中所使用，「基因編輯(gene-editing、gene editing)」及「基因體編輯(genome editing)」係指一種基因修飾類型，其中細胞基因體中的DNA係經永久修飾，例如細胞基因體內的DNA係經插入、刪除、修飾或置換。在一些實施例中，基因編輯造成DNA序列的表現被靜默(有時稱為基因剔除)或被抑制/減少(有時稱為基因敲低)。在其他實施例中，基因編輯造成DNA序列的表現被增強(例如造成過度表現)。根據本發明之實施例，基因編輯技術係用於增強治療性TIL族群的有效性。
一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如，稱為過程2A之例示性TIL擴增方法係描述於下)的任何實施例進行，其中該方法進一步包含基因編輯至少一部分的TIL。根據額外實施例，一種用於擴增TIL成治療性TIL族群之方法係根據PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633(全文以引用方式併入本文)所述之方法的任何實施例進行，其中該方法進一步包含基因編輯至少一部分的TIL。因此，本發明之實施例提供根據本文所述之任何實施例擴增的治療性TIL族群，其中至少一部分的治療性族群經基因編輯，例如至少一部分轉移至輸注袋的治療性TIL族群係經永久基因編輯。B. 在TIL擴增期間的基因編輯時間點
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3(例如，OKT-3可從擴增過程的起始日開始存在於培養基中)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生； (d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生； (f) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (g) 在該方法期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
如上述實施例之步驟(g)所述，基因編輯過程可在TIL擴增方法期間的任何時間進行，也就是說基因編輯可在擴增方法的任何步驟之前、之期間或之後於TIL進行；例如，在上述方法概述之任何步驟(a)至(f)期間或在上述方法概述之任何步驟(a)至(f)之前或之後。根據某些實施例，TIL係在擴增方法期間收集(例如擴增方法為了至少一部分的TIL「暫停」)且所收集的TIL經基因編輯過程處理，且在一些情況下後續再導入回擴增方法(例如回到培養基中)以持續擴增過程，使得至少一部分的最終轉移至輸注袋之治療性TIL族群經永久基因編輯。在一實施例中，基因編輯過程可在擴增之前藉由活化TIL、於經活化的TIL執行基因編輯步驟及根據本文所述之過程擴增經基因編輯的TIL進行。
應注意的是，擴增過程的替代實施例可與上述方法不同；例如替代實施例可不具有相同步驟(a)至(g)，或可具有不同數量的步驟。無論特定實施例為何，基因編輯過程可在TIL擴增方法期間的任何時間進行。例如，替代實施例可包括超過兩次擴增，且基因編輯有可能在第三或第四擴增等期間於TIL進行。
根據一實施例，基因編輯過程係於來自該第一族群、該第二族群及該第三族群中一或多者之TIL進行。例如，基因編輯可於第一TIL族群或於自第一族群收集之一部分的TIL進行，且在基因編輯過程之後，該些TIL後續可放回擴增過程中(例如放回培養基中)。替代地，基因編輯可分別於來自第二或第三族群之TIL或於自第二或第三族群收集之一部分的TIL進行，且在基因編輯過程之後，該些TIL後續可放回擴增過程中(例如放回培養基中)。根據另一實施例，基因編輯係於TIL仍在培養基中且擴增仍在進行時執行，意即它們不需要自擴增「移出」以進行基因編輯。
根據另一實施例，基因編輯過程係於來自該第一擴增之TIL或來自該第二擴增之TIL或來自該第一及第二擴增之TIL進行。例如，在第一擴增或第二擴增期間，基因編輯可於自培養基收集之TIL進行，且在基因編輯過程之後，該些TIL後續可放回擴增方法中，例如重導入回培養基中。
根據另一實施例，基因編輯過程係於第一擴增之後及第二擴增之前於至少一部分的TIL進行。例如，在第一擴增之後，基因編輯可於自培養基收集之TIL進行，且在基因編輯過程之後，該些TIL後續可放回擴增方法中，例如重導入回第二擴增之培養基中。
根據替代實施例，基因編輯過程係於步驟(c)之前(例如任何步驟(a)至(b)之前、之期間或之後)、步驟(d)之前(例如任何步驟(a)至(c)之前、之期間或之後)、步驟(e)之前(例如任何步驟(a)至(d)之前、之期間或之後)或步驟(f)之前(例如任何步驟(a)至(e)之前、之期間或之後)進行。
應注意關於OKT-3，根據某些實施例，細胞培養基可從第一擴增的起始日(第0天)或從第1天開始包含OKT-3，以使基因編輯係於TIL在第0天及/或第1天在細胞培養基中暴露至OKT-3之後進行。根據另一實施例，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行。替代地，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基可包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行。
亦應注意關於4-1BB促效劑，根據某些實施例，細胞培養基可從第一擴增的起始日(第0天)或從第1天開始包含4-1BB促效劑，以使基因編輯係於TIL在第0天及/或第1天在細胞培養基中暴露至4-1BB促效劑之後進行。根據另一實施例，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含4-1BB促效劑且該基因編輯係於該4-1BB促效劑導入該細胞培養基之前進行。替代地，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基可包含4-1BB促效劑且該基因編輯係於該4-1BB促效劑導入該細胞培養基之後進行。
亦應注意關於IL-2，根據某些實施例，細胞培養基可從第一擴增的起始日(第0天)或從第1天開始包含IL-2，以使基因編輯係於TIL在第0天及/或第1天在細胞培養基中暴露至IL-2之後進行。根據另一實施例，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含IL-2且該基因編輯係於該IL-2導入該細胞培養基之前進行。替代地，在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基可包含IL-2且該基因編輯係於該IL-2導入該細胞培養基之後進行。
如上所討論，OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2中一或多者可從第一擴增的第0天或第1天開始包括於細胞培養基中。根據一實施例，OKT-3係從第一擴增的第0天或第1天開始包括於細胞培養基中，及/或4-1BB促效劑係從第一擴增的第0天或第1天開始包括於細胞培養基中，及/或IL-2係從第一擴增的第0天或第1天開始包括於細胞培養基中。根據一實例，細胞培養基從第一擴增的第0天或第1天開始包含OKT-3及4-1BB促效劑。根據另一實例，細胞培養基從第一擴增的第0天或第1天開始包含OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2。當然，OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2中一或多者可在擴增過程期間的一或多個額外時間點添加至細胞培養基，如本文所述之各種實施例所示。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群。
根據一實施例，前述方法可用於提供經收集的自體TIL族群以治療人癌症個體。C. 免疫檢查點
根據本發明之具體實施例，TIL族群係藉由基因修飾TIL族群中一或多個免疫檢查點基因來基因編輯。換句話說，在TIL內編碼一或多個TIL免疫檢查點之DNA序列係經永久修飾，例如在TIL基因體內經插入、刪除或置換。免疫檢查點係由淋巴細胞表現之分子，其經由抑制或刺激途徑調節免疫反應。以癌症為例，免疫檢查點途徑通常被活化以抑制抗腫瘤反應，即惡性細胞表現某些免疫檢查點抑制抗腫瘤免疫力且有利癌細胞生長。見例如Marin-Acevedoet al., Journal of Hematology & Oncology (2018) 11:39。因此，某些抑制檢查點分子作用為本發明之免疫治療的目標。根據具體實施例，TIL係經基因編輯以阻斷或刺激某些免疫檢查點途徑且藉此增強身體對抗腫瘤的免疫活性。
如本文中所使用，免疫檢查點基因包含編碼免疫檢查點分子之DNA序列。根據本發明之具體實施例，在TIL擴增方法期間基因編輯TIL造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，基因編輯可造成抑制性受體諸如PD-1或CTLA-4的表現被靜默或減少以增強免疫反應。
最廣泛研究的檢查點包括計畫性細胞死亡受體1 (PD-1)及細胞毒性T淋巴細胞相關分子4 (CTLA-4)，它們是免疫細胞上的抑制性受體，當與抑制性配體交互作用時抑制關鍵效應功能(例如活化、增生、細胞介素釋放、細胞毒性等)。除PD-1及CTLA-4以外的許多檢查點分子已成為免疫治療的潛在目標，如以下更詳細討論。
藉由永久基因編輯本發明之TIL而可被靜默或抑制的免疫檢查點基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、BAFF (BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。例如，在本發明之TIL中可被靜默或抑制的免疫檢查點基因可選自包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Cish、TGFβ及PKA之群組。BAFF (BR3)係描述於Bloom,et al. ,J. Immunother. ,2018 ，印刷中。根據另一實例，在本發明之TIL中可被靜默或抑制的免疫檢查點基因可選自包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合之群組。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中該電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制選自由PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子之表現。 1. PD-1
計畫性死亡受體(PD1或PD-1，亦稱為PDCD1)係研究最多的誘導檢查點阻斷的目標之一，為T細胞調節子CD28超家族的一個成員。其配體PD-L1及PD-L2表現在多種腫瘤細胞上，包括黑色素瘤。PD-1與PD-L1的交互作用抑制T細胞效應功能，導致在慢性刺激環境中的T細胞耗竭及在腫瘤微環境中誘導T細胞的細胞凋亡。PD1亦在腫瘤特異性逃脫免疫監控中發揮作用。
根據具體實施例，PD1在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑PD1的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可涉及使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如PD1)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或減少TIL中PD1的表現。 2. CTLA-4
CTLA-4表現係於T細胞活化時在活化的T細胞上被誘導且競爭結合抗原呈現細胞活化抗原CD80及CD86。CTLA-4與CD80或CD86的交互作用造成T細胞抑制，作用為維持免疫反應的平衡。然而，抑制CTLA-4與CD80或CD86的交互作用可延長T細胞活化且因此增加對癌症抗原的免疫反應水準。
根據具體實施例，CTLA-4在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑CTLA-4的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如CTLA-4)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中CTLA-4的表現。 3. LAG-3
淋巴細胞活化基因3(LAG-3、CD223)係由T細胞及天然殺手(NK)細胞在第II型主要組織相容性複合體(MHC)接合之後表現。雖然其機制仍不清楚，但其調節對T細胞功能造成負調節效應，藉以預防組織傷害及自體免疫。LAG-3及PD-1經常在TIL上共表現及上調，導致免疫耗竭及腫瘤生長。因此，LAG-3阻斷改善抗腫瘤反應。見例如Marin-Acevedoet al., Journal of Hematology & Oncology (2018) 11:39。
根據具體實施例，LAG-3在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑LAG-3的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如LAG-3)媒介雙股或單股斷裂產生。根據具體實施例，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中LAG-3的表現。 4. TIM-3
T細胞免疫球蛋白3 (TIM-3)係T細胞的直接負調節子且表現於NK細胞及巨噬細胞上。TIM-3藉由誘導骨髓來源抑制細胞(MDSC)擴增而間接促進免疫抑制。已發現其水準在功能異常及耗竭T細胞中特別高，暗示其在惡性病中有重要角色。
根據具體實施例，TIM-3在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑TIM-3的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如TIM-3)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中TIM-3的表現。 5. Cish
Cish是細胞介素傳訊抑制因子(SOCS)家族的成員，藉由CD8+T細胞之TCR刺激誘導且抑制該CD8+T細胞對腫瘤的功能親合力。基因刪除CD8+T細胞中的Cish可增強CD8+T細胞擴增、功能親合力及細胞介素多功能性，導致已建立之腫瘤顯著及持久的消退。見例如Palmeret al. ,Journal of Experimental Medicine , 212 (12): 2095 (2015)。
根據具體實施例，Cish在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑Cish的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如Cish)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中Cish的表現。 6. TGFβ
TGFβ傳訊途徑在調節細胞生長、分化、細胞凋亡、移動性及入侵性、細胞外基質產生、血管生成及免疫反應中具有多種功能。TGFβ傳訊失調常見於腫瘤，在腫瘤起始、發展及轉移上具有關鍵角色。在微環境層面，TGFβ途徑促成在整個致癌作用期間產生較佳的腫瘤生長及轉移微環境。見例如Neuzilletet al. ,Pharmacology & Therapeutics , Vol. 147, pp. 22-31 (2015)。
根據具體實施例，TGFβ在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或減少TGFβ的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如TGFβ)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中TGFβ的表現。
在一些實施例中，TGFβR2(TGFβ受體2)可藉由使用CRISPR/Cas9系統或藉由使用所屬技術領域中已知之方法使用TGFβR2顯性陰性細胞外陷阱靜默TGFβR2而抑制。 7. PKA
蛋白激酶A (PKA)係廣為周知的絲胺酸-蘇胺酸蛋白激酶超家族成員。PKA(亦稱為cAMP依賴性蛋白激酶)係多單位蛋白激酶，其經由cAMP結合時活化來媒介G蛋白偶合受體的信號傳導。其涉及從代謝到離子通道活化、細胞生長及分化、基因表現及細胞凋亡的各式各樣細胞性過程的控制。重要的是，已知PKA涉及許多腫瘤的起始及進展。見例如Sapioet al., EXCLI Journal ; 2014; 13: 843-855。
根據具體實施例，PKA在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑PKA的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如PKA)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中PKA的表現。 8. CBLB
CBLB(或CBL-B)係E3泛素-蛋白質接合酶且係T細胞活化之負調節子。Bachmaier,et al., Nature , 2000, 403, 211-216; Wallner, et al.,Clin. Dev. Immunol. 2012, 692639。
根據具體實施例，CBLB在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑CBLB的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如CBLB)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中PKA的表現。在一些實施例中，CBLB係使用TALEN基因剔除靜默。在一些實施例中，CBLB係使用TALE-KRAB轉錄抑制子基因敲入靜默。關於這些方法的更多細節可見Boettcher and McManus,Mol. Cell Review ,2015, 58, 575-585。 9. TIGIT
具有Ig及ITIM(免疫受體酪胺酸基底抑制模體)結構域之T細胞免疫受體或TIGIT係一種跨膜糖蛋白受體，其具有Ig樣V型結構域及在其細胞質結構域中之ITIM。Khalil,et al. ,Advances in Cancer Research ,2015 , 128, 1-68；Yu,et al .,Nature Immunology ,2009 , Vol. 10, No. 1, 48-57。TIGIT係由一些T細胞及天然殺手細胞表現。此外，已顯示TIGIT在特別是來自黑色素瘤個體之抗原特異性CD8+T細胞及CD8+TIL上過度表現。研究顯示TIGIT途徑造成腫瘤免疫逃避且已顯示TIGIT抑制增加T細胞因應多株及抗原特異性刺激的活化及增生。Khalil,et al. ,Advances in Cancer Research ,2015 , 128, 1-68。另外，共阻斷TIGIT與PD-1或TIM3已在小鼠模型顯示對抗實質腫瘤的協同效應。Id ；亦見Kurtulus,et al .,The Journal of Clinical Investigation ,2015 , Vol. 125, No. 11, 4053-4062。
根據具體實施例，TIGIT在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法靜默或減少。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由靜默或阻抑TIGIT的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在免疫檢查點基因(諸如TIGIT)媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於靜默或阻抑TIL中TIGIT的表現。D. 過度表現共刺激受體或黏著性分子
根據本發明之額外實施例，在TIL擴增方法期間基因編輯TIL造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，基因編輯可造成刺激受體的表現受到增強，這表示相較於未經基因修飾的刺激受體的表現，其係過度表現。可藉由永久基因編輯本發明之TIL來展現增強表現之免疫檢查點基因的非限制性實例包括某些趨化激素受體及介白素，諸如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。 1. CCR
為了使過繼性T細胞免疫治療有效，必須藉由趨化激素使T細胞適當移動至腫瘤中。由腫瘤細胞分泌之趨化激素、存在於周邊的趨化激素與T細胞所表現的趨化激素受體之間的匹配對於使T細胞成功移動至腫瘤床中來說是重要的。
根據具體實施例，本發明之基因編輯方法可用於增加TIL中某些趨化激素受體的表現，諸如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及CX3CR1中一或多者。CCR之過度表現可能有助於促進TIL在過繼性轉移後的效應功能及增生。
根據具體實施例，CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及CX3CR1中一或多者在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法增強。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由增強CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3及CX3CR1中一或多者的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在趨化激素受體基因媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於增強TIL中某些趨化激素受體的表現。
在一實施例中，CCR4及/或CCR5黏著性分子係使用如本文所述之γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入TIL族群中。在一實施例中，CXCR2黏著性分子係使用如Forget,et al., Frontiers Immunology 2017 ,8 , 908或Peng,et al. ,Clin. Cancer Res. 2010 ,16 , 5458所述之γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入TIL族群中，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制PD-1及可選地LAG-3之表現，且進一步其中CXCR2黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集TIL族群中。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制PD-1及可選地LAG-3之表現，且進一步其中CCR4及/或CCR5黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集TIL族群中。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制PD-1及可選地LAG-3之表現，且進一步其中選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合所組成之群組的黏著性分子係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集TIL族群中。 2. 介白素
根據額外實施例，本發明之基因編輯方法可用於增加某些介白素的表現，諸如IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21中一或多者。某些介白素已證實可放大T細胞的效應功能且媒介腫瘤控制。
根據具體實施例，IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21中一或多者在TIL中的表現係根據本發明之組成物及方法增強。例如，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法可根據本文所述之方法(例如過程2A或圖20及21所示之方法)的任何實施例進行，其中方法包含藉由增強IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15及IL-21中一或多者的表現來基因編輯至少一部分的TIL。如以下更詳細地描述，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在介白素基因媒介雙股或單股斷裂產生。例如，CRISPR方法、TALE方法或鋅指方法可用於增強TIL中某些介白素的表現。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)系統、轉錄活化子樣效應物(TALE)系統或鋅指系統以抑制PD-1及可選地LAG-3之表現，且進一步其中選自由IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及彼等之組合所組成之群組的介白素係藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集TIL族群中。E. 基因編輯方法
如上所討論，本發明之實施例提供經由基因編輯以增強治療效應之經基因修飾的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。本發明之實施例包含經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL族群之基因編輯，以促進一或多種蛋白質的表現及抑制一或多種蛋白質的表現以及彼等之組合。本發明之實施例亦提供用於擴增TIL成治療性族群之方法，其中該方法包含基因編輯TIL。有數種可用來基因修飾TIL族群之基因編輯技術，彼等適用於本發明。
在一些實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al. ,Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull,et al. ,J. Virology 1998, 72 , 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al. ,Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括穩定併入基因以產生或抑制(例如靜默)一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J. 1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。可使用其他所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，電穿孔方法係無菌電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以在TIL中誘導孔洞形成的步驟，包含施加至少三次具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同，以使得經誘導的孔洞持續相對長的期間，且使得TIL的存活性得以維持。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面包覆及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology 1973, 52, 456-467；Wigler,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N -[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n ,n ,n -三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體配方的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al. ,Biotechniques 1991, 10, 520-525及Felgner,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,1987, 84, 7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
根據實施例，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。該等可編程核酸酶藉由在特定基因座導入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，即彼等依賴辨識基因體內特定DNA序列以將核酸酶結構域靶向此位置且在靶向序列媒介產生雙股斷裂。DNA中的雙股斷裂後續吸引內源性修復機轉至斷裂部位，以藉由非同源末端聯結(NHEJ)或同源引導修復(HDR)媒介基因體編輯。因此，斷裂修復可導致導入破壞(例如靜默、阻抑或增強)目標基因產物的插入/刪除突變。
經開發而能夠進行定點基因體編輯的主要核酸酶類型包括鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。這些核酸酶系統可基於彼等之DNA辨識模式大致分為兩大類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA交互作用達成特異性DNA結合，然而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由與目標DNA直接鹼基配對的短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA交互作用來靶向特定DNA序列。見例如Coxet al. ,Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2。
可用於本發明之TIL擴增方法之基因編輯方法的非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，彼等之實施例在以下更詳細描述。根據一實施例，用於擴增TIL成治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中一或多者基因編輯至少一部分的TIL，以產生可提供增強治療效應的TIL。根據一實施例，可藉由體外比較經基因編輯的TIL與未經修飾的TIL來評估彼等之改善的治療效應，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之體外效應功能、細胞介素輪廓等。
在本發明之一些實施例中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例的合適流式電穿孔系統實例係市售MaxCyte STX系統。有數種可供選擇之市售電穿孔儀器可能適用於本發明，諸如可得自BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra (Cellectricon)之AgilePulse系統或ECM 830、Nucleofector (Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell (BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96 (Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。 1. CRISPR方法
用於擴增TIL成治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/ US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/ 012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
CRISPR代表「叢聚規律間隔短迴文重複(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」。使用CRISPR系統進行基因編輯的方法在本文中亦稱為CRISPR方法。CRISPR系統可分成二大類：第1類及第2類，且進一步分為不同類型及亞型。CRISPR系統的分類係基於能夠切割特定核酸之效應物Cas蛋白質。在第1類CRISPR系統中，效應物模組係由多蛋白質複合體組成，然而第2類系統僅使用一種效應物蛋白質。第1類CRISPR包括第I、III及IV型且第2類CRISPR包括第II、V及VI型。雖然根據本發明可使用任何這些類型的CRISPR系統，有三種類型的CRISPR系統併入根據本發明較適用之RNA及Cas蛋白質：第I型(以Cas3為例)、第II型(以Cas9為例)及第III型(以Cas10為例)。第II型CRISPR是最廣為表徵的系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物的結構域)的天然防衛機制。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA及各種Cas蛋白質(包括Cas9)，藉由切碎並摧毀外來入侵者的DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR是具有二個獨特特徵的DNA特化區域：有核苷酸重複及間隔子存在。核苷酸的重複序列分布在整個CRISPR區域，且在重複序列之間穿插有短區段的外來DNA(間隔子)。在第II型CRISPR/Cas系統中，間隔子係整合在CRISPR基因座內且經轉錄及處理成短CRISPR RNA (crRNA)。這些crRNA與反式活化crRNA (tracrRNA)黏合且引導Cas蛋白質進行序列特異性切割及靜默致病性DNA。Cas9蛋白質進行的目標辨識需要位在crRNA內的「種子」序列及在crRNA結合區域上游的含有二核苷酸之保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向，可切割幾乎任何DNA序列。因此，根據某些實施例，Cas9作用為在crRNA-tracrRNA辨識時切割DNA之RNA導引型DNA內切核酸酶。天然系統中的crRNA及tracrRNA可被簡化成大約100個核苷酸的單一導引RNA (sgRNA)以用於基因工程改造。sgRNA係合成的RNA，其包括Cas結合所需的支架序列及使用者定義之定義待修飾的基因體目標之大約17至20個核苷酸間隔子。因此，使用者可藉由變更存在於sgRNA中之目標序列來變更Cas蛋白質的基因體目標。CRISPR/Cas系統藉由共遞送表現Cas9內切核酸酶及RNA組分(例如sgRNA)之質體可直接移動至人細胞。可使用Cas蛋白質的不同變體以減少靶向限制(例如Cas9同源基因，諸如Cpf1)。
根據一實施例，經工程改造、可編程、非天然存在的第II型CRISPR-Cas系統包含Cas9蛋白質及至少一個在TIL中靶向及雜交DNA分子目標序列之導引RNA，其中該DNA分子編碼且該TIL表現至少一個免疫檢查點分子且該Cas9蛋白質切割DNA分子，藉此至少一個免疫檢查點分子的表現受到改變；且其中該Cas9蛋白質及該導引RNA在天然中不一起存在。根據一實施例，二或更多個免疫檢查點分子的表現受到改變。根據一實施例，導引RNA包含與tracr序列融合之導引序列。例如，導引RNA可包含crRNA-tracrRNA或sgRNA。根據本發明之態樣，用語「導引RNA」、「單一導引RNA」及「合成的導引RNA」可交換使用且係指包含導引序列之多核苷酸序列，導引序列係在導引RNA內指明目標位點之大約17至20 bp序列。
相較於Cas9具有改善的中靶(on-target)特異性之Cas9變體亦可根據本發明之實施例使用。此類變體可稱為高信度Cas9。根據一實施例，可利用雙切口酶方案，其中靶向反向DNA股之二種切口酶在目標DNA內產製DSB(通常稱為雙切口或雙切口酶CRISPR系統)。例如，此方案可涉及二種Cas9核酸酶結構域中一者的突變，使Cas9從核酸酶變成切口酶。高信度Cas9之非限制性實例包括eSpCas9、SpCas9-HF1及HypaCas9。此類變體可減少或清除非目標DNA位點之非所要變更。見例如Slaymaker IM, et al.Science .2015 Dec 1, Kleinstiver BP, et al.Nature .2016 Jan 6及Ran et al.,Nat Protoc. 2013 Nov; 8(11):2281-2308，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。
此外，根據具體實施例，可使用改善基因遞送Cas9至細胞及改善中靶特異性之Cas9支架，諸如該些揭示於美國專利申請公開案第2016/0102324號者，其以引用方式併入本文中。例如，Cas9支架可包括如(D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A)所定義之RuvC模體及/或如(Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S)所定義之HNH模體，其中X代表20種天然存在胺基酸中任一種且[I/L]代表異白胺酸或白胺酸。HNH結構域負責切口目標dsDNA之一股且RuvC結構域涉及切割dsDNA之另一股。因此，這些結構域各自切口比鄰PAM的原間隔序列內的目標DNA之一股，導致鈍端切割DNA。這些模體可彼此組合以產生更緻密及/或更具特異性的Cas9支架。另外，模體可用來產生被分成二個分開的RuvC及HNH結構域之分裂的Cas9蛋白質(即包含RuvC結構域或HNH結構域之減少或截短形式的Cas9蛋白質或Cas9變體)，該分裂的Cas9蛋白質可一起或分開處理目標DNA。
根據具體實施例，CRISPR方法包含藉由導入Cas9核酸酶及含有對免疫檢查點基因之目標DNA序列具特異性之大約17至20個核苷酸的序列之導引RNA(例如crRNA-tracrRNA或sgRNA)來靜默或減少TIL中一或多個免疫檢查點基因的表現。導引RNA可以RNA之形式遞送或藉由用在啟動子下之導引RNA編碼序列轉形質體來遞送。CRISPR/Cas酶基於sgRNA定義之目標序列在特定位置導入雙股斷裂(DSB)。DSB可在細胞中藉由非同源末端聯結(NHEJ，一種經常在DNA中造成插入或刪除(插入/刪除)的機制)修復。插入/刪除通常導致讀框移位，產生功能喪失等位基因；例如造成目標基因之開放閱讀框(ORF)內的過早終止密碼子。根據某些實施例，結果係在目標免疫檢查點基因內的功能喪失突變。
替代地，CRISPR/Cas酶所誘導之DSB可藉由同源引導修復(HDR)而非NHEJ修復。NHEJ媒介之DSB修復通常中斷基因的開放閱讀框，然而同源引導修復(HDR)可用來產製從單一核苷酸變更到大型插入的特定核苷酸變更。根據一實施例，藉由將含有所欲序列之DNA修復模板與sgRNA及Cas9或Cas9切口酶遞送至TIL，使用HDR來基因編輯免疫檢查點基因。修復模板較佳地含有所欲之編輯以及緊接目標基因上游及下游之額外同源序列(通常稱為左、右同源臂)。
根據具體實施例，Cas9的酶去活化版本(死亡Cas9或dCas9)可靶向轉錄起始位點以藉由阻斷起始來阻抑轉錄。因此，目標免疫檢查點基因可在不使用DSB下受到阻抑。dCas9分子基於sgRNA靶向序列保留與目標DNA結合的能力。根據本發明之一實施例，CRISPR方法包含藉由抑制或預防目標基因之轉錄來靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，CRISPR方法可包含將轉錄阻抑子結構域(諸如Kruppel相關盒(KRAB)結構域)融合至Cas9的酶去活化版本，藉此形成例如靶向免疫檢查點基因轉錄起始位點之dCas9-KRAB，導致抑制或預防基因的轉錄。較佳地，阻抑子結構域靶向轉錄起始位點下游之窗，例如下游約500 bp。此方案稱為CRISPR干擾(CRISPRi)，經由目標RNA的轉錄減少導致強健基因敲低。
根據具體實施例，Cas9的酶去活化版本(死亡Cas9或dCas9)可靶向轉錄起始位點以活化轉錄。此方案稱為CRISPR活化(CRISPRa)。根據一實施例，CRISPR方法包含藉由活化目標基因之轉錄來增加一或多個免疫檢查點基因的表現。根據此類實施例，目標免疫檢查點基因可在不使用DSB下受到活化。CRISPR方法可包含將轉錄活化結構域靶向轉錄起始位點；例如，藉由將轉錄活化子諸如VP64融合至dCas9，藉此形成例如靶向免疫檢查點基因轉錄起始位點之dCas9-VP64，導致活化基因的轉錄。較佳地，活化子結構域靶向轉錄起始位點上游之窗，例如下游約50至400 bp。
本發明之額外實施例可利用已開發用於有效活化哺乳動物細胞中之目標基因的活化策略。非限制性實例包括共表現表位標籤dCas9與抗體-活化子效應物蛋白質(例如SunTag系統)、融合至複數個不同的活化結構域系列之dCas9(例如dCas9-VPR)或共表現dCas9-VP64與經修飾的支架gRNA及額外的RNA結合輔助活化子(例如SAM活化子)。
根據其他實施例，稱為CRISPR輔助理性蛋白質工程改造(CARPE)之CRISPR媒介之基因體編輯方法可根據本發明之實施例使用，如美國專利第9,982,278號所揭示，其係以引用方式併入本文中。CARPE涉及產製「供體」及「目的地」庫，該些庫將來自單股DNA (ssDNA)或雙股DNA (dsDNA)編輯卡匣之定向突變直接併入基因體。供體庫的建構涉及將理性設計之編輯寡核苷酸與雜交目標DNA序列之導引RNA (gRNA)共轉形至細胞中。編輯寡核苷酸係經設計以將PAM之刪除或突變與相鄰基因中一或多個所欲密碼子的突變偶合。這使得整個供體庫得以在單次轉形中產製。供體庫係藉由擴增重組染色體取得，諸如使用來自編輯寡核苷酸之合成特徵，也就是同時併入基因3’端之第二PAM刪除或突變來進行PCR反應。此共價偶合針對PAM刪除之密碼子目標突變。接著將供體庫共轉形至具有目的地gRNA載體之細胞以產生表現理性設計蛋白質庫之細胞族群。
根據其他實施例，稱為可追蹤CRISPR富集重組工程基因體工程改造(GEn-TraCER)之使用CRISPR媒介系統進行可追蹤、精確基因體編輯之方法可根據本發明之實施例使用，如美國專利第9,982,278號所揭示，其係以引用方式併入本文中。GEn-TraCER方法及載體組合編輯卡匣與編碼gRNA之基因在單一載體上。卡匣含有所欲突變及PAM突變。載體則(亦可編碼Cas9)被導入細胞或細胞族群中。此活化CRISPR系統在細胞或細胞族群中的表現，造成gRNA招募Cas9至目標區域，在該處發生dsDNA斷裂，允許PAM突變的整合。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
可藉由CRISPR方法永久基因編輯TIL來增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
用於藉由CRISPR方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,697,359；8,993,233；8,795,965；8,771,945；8,889,356；8,865,406；8,999,641； 8,945,839；8,932,814；8,871,445；8,906,616及8,895,308號，彼等以引用方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體可購自公司諸如GenScript。
在一實施例中，如本文所述之TIL族群的基因修飾可使用如美國專利第US 9,790,490號所述之CRISPR/Cpf1系統執行，其揭露以引用方式併入本文中。CRISPR/Cpf1系統在功能上與CRISPR-Cas9系統不同，其中Cpf1相關CRISPR陣列在不需要額外tracrRNA下被處理成成熟crRNA。使用於CRISPR/Cpf1系統中之crRNA具有間隔子或導引序列及直接重複序列。使用此方法形成之Cpf1p-crRNA複合物本身足以切割目標DNA。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)/Cas9或CRISPR/Cpf1系統以調節至少一種蛋白質的表現。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送叢聚規律間隔短迴文重複(CRISPR)/Cas9或CRISPR/Cpf1系統以抑制PD-1及LAG-3的表現。 2. TALE方法
用於擴增TIL成治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/ 012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由TALE方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
TALE代表「類轉錄活化因子效應物 (Transcription Activator-Like Effector)」蛋白質，其包括TALEN(「類轉錄活化因子效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)」)。使用TALE系統進行基因編輯的方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE是來自植物致病性細菌黃單胞菌屬(Xanthomonas )的天然存在蛋白質，含有由一系列33至35個胺基酸的重複結構域構成的DNA結合結構域，該等重複結構域各辨識單一鹼基對。TALE特異性係由二個被稱為重複可變雙殘基(RVD)的超變異胺基酸判定。模組化TALE重複連接在一起以辨識毗連DNA序列。DNA結合結構域中的特定RVD辨識目標基因座中的鹼基，提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合結構域。TALE的DNA結合結構域與IIS型FokI內切核酸酶的催化結構域融合，以製造一可靶向的TALE核酸酶。為了誘導定點突變，二個藉由14至20個鹼基對間隔基因區域分離的個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚化且產生目標雙股斷裂。
數個利用各種總成方法的大型、系統性研究已指示TALE重複可經組合以辨識幾乎任何使用者定義的序列。使客製化TALE陣列得以快速總成之策略包括Golden Gate分子選殖、高通量固相總成及接合非依賴性選殖技術。客製化設計的TALE陣列亦可經由Cellectis Bioresearch (Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies (Grand Island, NY, USA)的商業途徑獲得。可使用額外網路工具，諸如TAL Effector-Nucleotide Target 2.0，其能夠設計所欲目標的客製化TAL效應物重複陣列且亦提供預期TAL效應物結合位點。見Doyle,et al. ,Nucleic Acids Research ,2012 , Vol. 40, W117-W122。適用於本發明之TALE及TALEN方法的實例係描述於美國專利申請公開案號US 2011/0201118 A1；US 2013/0117869 A1；US 2013/0315884 A1；US 2015/0203871 A1及US 2016/0120906 A1，彼等揭露以引用方式併入本文中。
根據本發明之一實施例，TALE方法包含藉由抑制或預防目標基因之轉錄來靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，TALE方法可包括利用KRAB-TALE，其中該方法包含將轉錄Kruppel相關盒(KRAB)結構域融合至靶向基因轉錄起始位點之DNA結合結構域，導致抑制或預防基因的轉錄。
根據另一實施例，TALE方法包含藉由在目標基因中導入突變來靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。例如，TALE方法可包括將核酸酶效應物結構域諸如Fokl融合至TALE DNA結合結構域，導致TALEN。Fokl的二聚體形式具有活性；因此，方法包含建構TALEN對以定位FOKL核酸酶結構域至相鄰基因體目標位點，它們在該處導入DNA雙股斷裂。雙股斷裂可在Fokl正確定位及二聚化之後完成。一旦導入雙股斷裂之後，DNA修復可經由二種不同機制達成：高信度同源重組對(HRR)(亦稱為同源引導修復或HDR)或易錯非同源末端聯結(NHEJ)。經由NHEJ修復雙股斷裂較佳地導致DNA目標位點刪除、插入或取代，意即NHEJ一般導致在斷裂位點導入小型插入及刪除，通常誘導剔除基因功能之讀框移位。根據具體實施例，TALEN對靶向基因最5’的外顯子，促進早期讀框移位突變或過早終止密碼子。由TALEN導入之基因突變較佳係永久的。因此，根據一實施例，方法包含藉由利用二聚化TALEN誘導定點雙股斷裂來靜默或減少免疫檢查點基因的表現，該定點雙股斷裂經由易錯NHEJ修復，導致目標免疫檢查點基因中一或多個突變。
根據額外實施例，TALEN係用於經由HRR導入基因改變，諸如非隨機點突變、目標刪除或添加DNA片段。導入DNA雙股斷裂使基因編輯能夠在合適供體DNA存在下經由同源重組進行。根據一實施例，方法包含共遞送二聚化TALEN及帶有基因座特異性同源臂之供體質體以誘導定點雙股斷裂及整合一或多個轉殖基因至DNA。
根據另一實施例，如美國專利公開號2011/ 0201118揭示之衍生自FokI及AvrXa7之雜交蛋白質TALEN可根據本發明之實施例使用。此TALEN保留AvrXa7辨識目標核苷酸之特異性及FokI的雙股DNA切割活性。可使用相同方法製備其他具有不同辨識特異性之TALEN。例如，可藉由工程改造具有不同組RVD之核心TALE支架來產製緻密TALEN，以變更DNA結合特異性及靶向特定單一dsDNA目標序列。見美國專利公開號2013/0117869。可將經選擇的催化結構域附接至支架以致效DNA處理，該催化結構域可經工程改造以確保當其融合至核心TALE支架時能夠處理靠近單一dsDNA目標序列的DNA。亦可工程改造肽連接子以將催化結構域融合至支架以產生由單一多肽鏈製成的緻密TALEN，該緻密TALEN不需要二聚化即可靶向特異性單一dsDNA序列。核心TALE支架亦可藉由將催化結構域(其可為TAL單體)融合至其N端來修飾，允許此催化結構域可能與融合至另一TAL單體之另一催化結構域交互作用之可能性，藉此產生很可能處理靠近目標序列之DNA的酶催化性實體。見美國專利公開號2015/0203871。此架構允許僅靶向單一DNA股，經典TALEN架構則無此選項。
根據本發明之一實施例，可使用習知RVD以產生能夠顯著減少基因表現之TALEN。在一實施例中，四種RVD(NI、HD、NN及NG)分別用於靶向腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶。這些習知RVD可用於例如產生靶向PD-1基因之TALEN。使用習知RVD之TALEN實例包括Gautronet al. ,Molecular Therapy: Nucleic Acids Dec. 2017, Vol. 9:312-321 (Gautron)(以引用方式併入本文中)所揭示之T3v1 TALEN及T1 TALEN。T3v1 TALEN及T1 TALEN靶向PD-L1結合部位所在之PDCD1 基因座的第二外顯子且能夠顯著減少PD-1產生。在一實施例中，T1 TALEN藉由使用目標SEQ ID NO:127來達成且T3v1 TALEN藉由使用目標SEQ ID NO:128來達成。
根據另一實施例，TALEN使用非習知RVD修飾以改善彼等對目標基因的活性及特異性，諸如Gautron所揭示。天然存在RVD僅涵蓋超變異胺基酸位置潛在多樣性貯庫的一小部分。非習知RVD提供天然RVD的替代物且具有新穎的內生性靶向特異性特徵，可用於排除TALEN靶向離位(off-site)目標(相對於目標序列含有少數失配之基因體內的序列)。非習知RVD可藉由在如Juillerat,et al .,Scientific Reports 5, Article Number 8150 (2015)(以引用方式併入本文中)所揭示之陣列的定義位置上產製及篩選在二個超變異胺基酸位置含有胺基酸替代組合的TALEN集合來識別。接下來，可選擇區別存在失配位置上之核苷酸的非習知RVD，如此可預防TALEN對離位序列的活性同時仍允許適當處理目標位置。所選擇的非習知RVD接著可用於置換TALEN中的習知RVD。習知RVD已經非習知RVD置換之TALEN實例包括由Gautron所產生的T3v2及T3v3 PD-1 TALEN。這些TALEN相較於使用習知RVD之TALEN具有增加的特異性。
根據額外實施例，可利用TALEN導入基因改變以靜默或減少二個基因的表現。例如，可產製二個分開的TALEN以靶向二個不同的基因且接著一起使用。由二個TALEN在彼等之各別基因座及潛在脫靶位點產生之分子事件可藉由高通量DNA定序表徵。如此能夠分析脫靶位點及識別可能因為使用二個TALEN所導致的位點。基於此資訊，可選擇適當之習知及非習知RVD以工程改造即使一起使用時具有增加特異性及活性之TALEN。例如，Gautron揭示組合使用T3v4 PD-1與TRAC TALEN以產生雙基因剔除CAR T細胞，其維持有效的體外抗腫瘤功能。
在一實施例中，可採用Gautron之方法或本文所述之其他方法基因編輯TIL，接著藉由本文所述之任何程序擴增。在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 使用轉錄活化子樣效應物核酸酶電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育第二TIL族群； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3至14天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 在cytoporation培養基中使用轉錄活化子樣效應物核酸酶電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育第二TIL族群； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約6至9天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約9至11天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 在cytoporation培養基中使用轉錄活化子樣效應物核酸酶電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育該第二TIL族群，其中培育是在約30至40℃、約5% CO2 下執行； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約6至9天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約9至11天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
根據另一實施例，TALEN可經特別設計以允許在目標細胞中能夠靶向特定選擇基因之較高比例的DSB事件。見美國專利公開號2013/0315884。使用此類罕見切割型內切核酸酶增加在轉染細胞中獲得目標基因雙重去活化的機會，允許產生經工程改造的細胞諸如T細胞。另外，TALEN可導入額外催化結構域以增加突變形成及增強目標基因去活化。美國專利公開號2013/0315884中描述的TALEN被成功用於工程改造T細胞以使它們適用於免疫治療。TALEN亦可用於去活化T細胞中各種免疫檢查點基因，包括在單一T細胞中去活化至少二個基因。見美國專利公開號2016/0120906。此外，TALEN可用於去活化編碼免疫抑制劑之目標及T細胞受體的基因，如美國專利公開號2018/0021379(以引用方式併入本文中)所揭示。另外，TALEN可用於抑制β 2-微球蛋白(B2M)及/或第II型主要組織相容性複合體反式活化子(CIITA)的表現，如美國專利公開號2019/0010514(以引用方式併入本文中)所揭示。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
靶向PD-1基因之TALE核酸酶的非限制性實例提供於下表。在這些實例中，目標基因體序列含有二個被15-bp間隔子(以小寫字母表示)分離的17鹼基對(bp)長的序列(稱為半目標，以大寫字母表示)。各半目標係由表中列出之半TALE核酸酶的重複辨識。因此，根據具體實施例，根據本發明之TALE核酸酶辨識及切割選自由SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO: 128所組成之群組的目標序列。TALEN序列及基因編輯方法亦描述於如上討論之Gautron中。
在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 在cytoporation培養基中使用靶向PDCD1 之轉錄活化子樣效應物核酸酶電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育該第二TIL族群，其中培育是在約30至40℃、約5% CO2 下執行； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約6至9天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約9至11天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 在cytoporation培養基中使用靶向SEQ ID NO:128之轉錄活化子樣效應物核酸酶電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育該第二TIL族群，其中培育是在約30至40℃、約5% CO2 下執行； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約6至9天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約9至11天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
在一實施例中，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含下列步驟： (a) 使用CD3及CD28活化珠或抗體活化自患者所切除的腫瘤獲得之第一TIL族群1至5天； (b) 在cytoporation培養基中使用根據SEQ ID NO:135及SEQ ID NO:136之轉錄活化子樣效應物核酸酶mRNA電穿孔基因編輯至少一部分的第一TIL族群以獲得第二TIL族群； (c) 可選地培育該第二TIL族群，其中培育是在約30至40℃、約5% CO2 下執行； (d) 藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第二TIL族群來執行第一擴增以產生第三TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約6至9天以獲得該第三TIL族群； (e) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第四TIL族群，其中該第二擴增執行約9至11天以獲得該第四TIL族群，其中該第四TIL族群係治療性TIL族群； (f) 收集獲自步驟(e)之該治療性TIL族群； (g) 將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及 (h) 其中步驟(a)至(g)中一或多者是在密閉無菌系統中執行。
可藉由TALE方法永久基因編輯TIL來增強之基因的其他非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
用於藉由TALE方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,586,526號，其以引用方式併入本文中。這些揭示的實例包括使用非天然存在之DNA結合多肽，該DNA結合多肽具有二或更多個含有重複RVD之TALE重複單位、由TALE蛋白質之殘基製成之N-cap多肽及TALE蛋白質之全長C端區之片段製成之C-cap多肽。
TALEN設計及設計策略、活性評估、篩選策略及可用以有效地執行TALEN媒介之基因整合及去活化且可根據本發明之實施例使用之方法的實例係描述於Valton,et al. ,Methods ,2014 , 69, 151-170，其係以引用方式併入本文中。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送TALE核酸酶系統以調節至少一種蛋白質的表現。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送TALE核酸酶系統以抑制PD-1及LAG-3的表現。 3. 鋅指方法
用於擴增TIL成治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/ US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/ 012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α螺旋表面上的數個胺基酸一般接觸DNA主溝槽中3 bp，且具有不同的選擇性水準。鋅指具有二個蛋白質結構域。第一結構域是DNA結合結構域，包括真核轉錄因子且含有鋅指。第二結構域是核酸酶結構域，包括FokI限制酶且負責催化切割DNA。
個別ZFN的DNA結合結構域一般含有介於三與六個之間的個別鋅指重複且各可辨識介於9與18個之間的鹼基對。如果鋅指結構域對彼等之意圖目標位點具有特異性，則即使一對總共辨識18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中的單一基因座。一種產生新的鋅指陣列之方法是組合較小的已知特異性之鋅指「模組」。最常見的模組總成過程涉及組合三個各可辨識3個鹼基對DNA序列之分開的鋅指，以產生可辨識9個鹼基對目標位點的3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方式諸如寡聚池工程改造(OPEN)以從隨機分組庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組庫考慮鄰近指之間的上下文依賴(context-dependent)交互作用。經工程改造鋅指可自商業途徑獲得；Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)已與Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)合作開發鋅指建構之專用平台(CompoZr®)。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
可藉由鋅指方法永久基因編輯TIL來增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第6,534,261、6,607,882、6,746,838、 6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、 6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、 7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185及6,479,626號，彼等以引用方式併入本文中。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物的其他實例係描述於Beane,et al. ,Mol. Therapy ,2015, 23 1380-1390，其揭露以引用方式併入本文中。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送鋅指核酸酶系統以調節至少一種蛋白質的表現。
根據一實施例，用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法包含： (a) 藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群； (b) 將該腫瘤片段加入密閉系統； (c) 藉由在包含IL-2及可選地包含4-1BB促效抗體之細胞培養基中培養該第一TIL族群約2至5天來執行第一擴增； (d) 添加OKT-3以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約1至3天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生； (e) 對該第二TIL族群執行無菌電穿孔步驟，其中該無菌電穿孔步驟媒介至少一種基因編輯子(gene editor)之轉移； (f) 使該第二TIL族群靜置約1天； (g) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3抗體、可選地OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(f)轉變至步驟(g)無需打開該系統而發生； (h) 收集獲自步驟(g)的該治療性TIL族群以提供經收集的TIL族群，其中自步驟(g)轉變至步驟(h)無需打開該系統而發生，其中該經收集的TIL族群係治療性TIL族群； (i) 將該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(h)轉移至步驟(i)無需打開該系統而發生；及 (j) 使用基於二甲亞碸之冷凍保存培養基冷凍保存該經收集的TIL族群， 其中電穿孔步驟包含遞送鋅指核酸酶系統以抑制PD-1及LAG-3的表現。IV. TIL 製造過程
含有一些這些特徵的例示性TIL過程(稱為過程2A)係描繪於圖1，且本發明之此實施例的一些優於過程1C的優點係描述於圖2以及圖14。過程1C係顯示於圖3以供比較。基於過程2A之二個用於TIL療法之替代性時間表係顯示於圖4(較高細胞計數)及圖5(較低細胞計數)。過程2A之實施例係顯示於圖6以及圖9。圖13及14進一步提供例示性2A過程與例示性1C過程之比較。
如本文中所討論，本發明可包括關於再刺激冷凍保存的TIL的步驟，以增加彼等的代謝活性及因此在移植至患者中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自患者樣本且經操作以在移植至患者中之前擴增彼等之數量。在一些實施例中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。
在一些實施例中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加彼等之代謝。
在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增(包括稱為REP前之過程以及圖9步驟A所示之過程)縮短至3至14天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖9步驟B所示之過程)縮短至7至14天。在一些實施例中，第一擴增(例如，圖9步驟B所述之擴增)縮短至11天且第二擴增(例如，圖9步驟D所述之擴增)縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4、5及27。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增與第二擴增(例如，如圖9步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合縮短為22天。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖9且參照本文所述之某些實施例。以下及圖9中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣本
一般來說，TIL最初獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存、如本文概述之再刺激及可選地評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
患者腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術部分切除、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3 之間的小片(small pieces)，且約2至3 mm3 特別有用。TIL係自這些片段使用酶催化性腫瘤消化物培養。腫瘤消化物可藉由在酶催化性培養基(例如Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA水解酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中培育，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤放入酶催化性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣執行密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施例中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，碎斷係物理碎斷。在一些實施例中，碎斷係分割。在一些實施例中，碎斷係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖9中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40或更多個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與8 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係約1 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約2 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約3 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約4 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約5 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約6 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約7 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約8 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約9 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約10 mm3 。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA水解酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施例中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，細胞可在樣本收集後可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖9中例示。B. 步驟 B ：第一擴增 1. 年輕TIL
在一些實施例中，本方法提供獲得年輕TIL，該年輕TIL在投予至個體/患者後能夠增加複製循環且因此相較於較老TIL(即在投予至個體/患者之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)；Huang et al.,J Immunother , 28(3):258-267 (2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res , 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al.,J Immunother 32:415-423 (2009)；Robbins, et al.,J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al.,J Immunother , 28:53-62 (2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程1C之方法(如在圖13所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在例如諸如圖9步驟A所述之分割或消化腫瘤片段之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2的血清中培養。在一些實施例中，將腫瘤消化物培育於2 mL孔中的包含去活化人AB血清及6000 IU/mL IL-2的培養基中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常3至14天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養7至14天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養10至14天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養約11天，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一較佳實施例中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖9步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數表徵。
在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養板(Corning Incorporated, Corning, NY)的實施例中，各孔可接種1×106 個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段於含IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)的2 mL完全培養基(CM)中。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施例中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆培育於37℃下5% CO2 的增濕培育箱中，在培養起始後5天，將半數培養基移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數培養基。
在製備腫瘤片段後，將所得細胞(即片段)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施例中，將腫瘤消化物培育於2 mL孔中的包含去活化人類AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞族群存在下)及6000 IU/mL IL-2的培養基中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常10至14天)，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體。在一些實施例中，該IL係重組人IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2儲備溶液具有4至8×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備溶液具有5至7×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備溶液具有6×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備溶液係如實例4所述製備。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。OKT-3抗體可從REP的第0天(即REP起始日)及/或第二擴增的第0天(即第二擴增起始日)開始存在於細胞培養基中。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施例中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆培育於37℃下5% CO2 的增濕培育箱中，在培養起始後5天，將半數培養基移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數培養基。在一些實施例中，CM係實例中所述的CM1，見實例5。在一些實施例中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。
在一些實施例中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖9步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖9步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖9步驟B所述之擴增。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施例中，第一擴增縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖9步驟B所述之擴增。
在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第一擴增期間，包括例如在根據圖9步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖9步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第一擴增(包括稱為REP前的過程；例如根據圖9之步驟B)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4、5及9。在一些實施例中，第一擴增縮短至11天，如實例中所討論且顯示於圖4、5及9。
在一些實施例中，第一擴增(例如根據圖9之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施例中，第一擴增使用在擴增開始時添加至細胞培養基之額外4-1BB促效抗體執行，使用以下描述之任何4-1BB促效劑抗體。C. 步驟 C ：第一擴增至第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自第一擴增的主體TIL族群包括例如獲自例如圖9所示之步驟B的TIL族群可使用本文以下討論的規程立即冷凍保存。替代地，獲自第一擴增的TIL族群(稱為第二TIL族群)可進行第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增)且接著如以下討論進行冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，第一TIL族群(有時稱為主體TIL族群)或第二TIL族群(其在一些實施例中可包括稱為REP TIL族群的族群)可在擴增之前或在第一擴增之後且在第二擴增之前經受基因修飾以用於合適治療。
在一些實施例中，獲自第一擴增(例如圖9所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施例中，獲自第一擴增(例如圖9所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行第二擴增。在一些實施例中，獲自第一擴增的TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至10天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約7天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約14天。
在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的12天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的13天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的2天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天。
在一些實施例中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖9所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行第二擴增而無轉變期。
在一些實施例中，從第一擴增至第二擴增的轉變(例如根據圖9之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。D. 步驟 D ：第二擴增
在一些實施例中，TIL細胞族群於數量上在收集及初始主體處理(例如圖9所示之步驟A及步驟B)及轉變(稱為步驟C)之後擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(REP；如圖9步驟D所示之過程)的擴增過程。第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。
在一些實施例中，TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖9步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施例中，第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖9步驟D所示之過程)執行。例如，TIL可在介白素2 (IL-2)或介白素15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的癌症相同抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射的自體淋巴細胞或用經照射的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施例中，第二擴增在經照射的自體淋巴細胞或經照射的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施例中，細胞培養基包含OKT3抗體。OKT-3抗體可從REP的第0天(即REP起始日)及/或第二擴增的第0天(即第二擴增起始日)開始存在於細胞培養基中。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖9步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖9步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，REP及/或第二擴增係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合。置換培養基(通常經由抽吸新鮮培養基置換2/3培養基)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)縮短至7至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第二擴增縮短至11天。
在一實施例中，REP及/或第二擴增可使用T-175培養瓶及如先前描述之氣體可通透袋子(Tran,et al. ,J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003, 26, 332-42)或氣體可通透培養器皿(G-Rex培養瓶)執行。在一些實施例中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係於T-175培養瓶中執行，且可將懸浮於150 mL的培養基中之約1×106 TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可培養於CM及AIM-V培養基的1比1混合物中，補充有每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3。T-175培養瓶可在37℃下在5% CO2 中培育。一半的培養基可在第5天使用含有每mL 3000 IU的IL-2之50/50培養基交換。在一些實施例中，在第7天可將來自二個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中並將300 mL含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2之AIM V添加至300 ml的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量每天或每二天計算一次，且添加新鮮培養基以保持細胞計數介於0.5與2.0×106 個細胞/mL。
在一實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖9步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106 或10×106 TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中培育。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2之新鮮培養基再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。當TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的培養基中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-Rex 100培養瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL之含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中培育，且在4天之後可將150 mL之含有每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各G-REX 100培養瓶。細胞可在培養的第14天收集。
在一實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合。在一些實施例中，進行置換培養基直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施例中，藉由抽吸新鮮培養基置換掉2/3的培養基。在一些實施例中，替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施例中，存活性係根據例如實例15所述之細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
在一些實施例中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前描述之T-175培養瓶及氣體可通透袋子(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al.,2008 ,J Immunother. , 31:742-751及Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003,J Immunother. , 26:332-342)或氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增使用培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增使用氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增係於T-175培養瓶中執行，且約1×106 TIL懸浮於150 mL的培養基中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經照射(50 Gy)的異體PBMC以1比100的比例培養，且將細胞培養於補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之CM與AIM-V培養基的1比1混合物(50/50培養基)中。T-175培養瓶在37℃下在5% CO2 中培育。在一些實施例中，一半的培養基在第5天使用含有3000 IU/mL的IL-2之50/50培養基更換。在一些實施例中，在第7天將來自2個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中，並將300 mL含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2之AIM-V添加至300 mL的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量可每天或每二天計算一次，且可添加新鮮培養基以保持細胞計數介於約0.5與約2.0×106 個細胞/mL。
在一些實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm2 氣體可通透矽底之培養瓶(G-Rex 100, Wilson Wolf)中執行(圖1)，將約5×106 或10×106 TIL與經照射的異體PBMC以1至100的比例培養於400 mL的補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之50/50培養基中。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中培育。在一些實施例中，在第5天將250mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491g)下離心10分鐘。接著可將TIL團塊用150 mL的含有3000 IU/mL的IL-2之新鮮50/50培養基再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。在將TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增的實施例中，在第7天將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的培養基中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-Rex 100培養瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL之含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中培育，且在4天之後將150 mL之含有3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶。細胞在培養的第14天收集。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施例中，第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施例中，第二擴增(例如根據圖9之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。 1. 餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序(例如包括諸如該些圖9步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，異體PBMC係經由輻照或熱處理去活化，且如實例(特別是實例14)所述用於REP程序，其提供用於評估輻照異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。見例如實施例14。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。見例如實施例13。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約100×106 TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約50×106 TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5×109 餵養細胞對約25×106 TIL。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由輻照或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在例如圖4、5及9中所述之例示性程序。
在一實施例中，在第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。 2. 細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。 3. 抗CD3抗體
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(包括該些稱為REP者，見例如圖9)中之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985, 135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ or Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。
在一些實施例中，抗CD3抗體諸如OKT3可在電穿孔步驟之前2天、3天、4天或5天添加至TIL培養。在一些實施例中，抗CD3抗體諸如OKT3可在電穿孔步驟之前立即添加。在一些實施例中，抗CD3抗體諸如OKT3可在電穿孔步驟之後立即添加。在一些實施例中，抗CD3抗體諸如OKT3可在電穿孔步驟之後2天、3天、4天或5天添加。 4. 4-1BB及OX40促效劑
根據一實施例，在該第一擴增、該第二擴增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB (CD137)促效劑及/或OX40促效劑。基因編輯可於4-1BB促效劑及/或OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行。替代地，基因編輯可於4-1BB促效劑及/或OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB黏連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al. ,PLOS One 2013 ,8, e69677。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施例中，4-1BB促效劑係EU-101 (Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，4-1BB促效劑係由以高親和性及促效性活性與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合來表徵。在一實施例中，4-1BB促效劑係與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB (SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表3中。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8×105 l/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表4所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之醣化位點；位於位置22至96 (VH -VL )、143至199 (CH 1-CL )、256至316 (CH 2)及362至420 (CH 3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’至87’ (VH -VL )及136’至195’ (CH 1-CL )之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218至218、219至219、222至222及225至225、位於IgG2A/B異構體位置218至130、219至219、222至222及225至225、及位於IgG2B異構體位置219至130 (2)、222至222及225至225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130至213’ (2)、IgG2A/B異構體位置218至213’及130至213’及位於IgG2B異構體位置218至213’ (2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al. ,Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表5所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298”)之N-醣化位點；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、262至322 (CH 2)及368至426 (CH 3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、262”至322”及368”至426”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及136’至196’ (CH 1-CL )(及位於位置23”’至88”’及136”’至196”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227至227”及230至230”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135至216’及135”至216”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al. ,Clin. Cancer Res. 2016, available at http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及 NCT01471210。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
在一實施例中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組：1D8、3Elor、4B4 (BioLegend 309809)、H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532)、BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX)、145501 (Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4 (BioLegend 31 1503)、C65-485 (BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl (BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/ 177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/ 078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係如圖22所示的結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物：
在圖22之結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH 3及CH 2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH 及VL 鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories ,2011, 10 , 44；Ahmad,et al. ,Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250；Monnier,et al. ,Antibodies, 2013, 2, 193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表6中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表7中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
在一實施例中，根據圖22之結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表8所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據圖22之結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施例中，根據圖22之結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表8給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施例中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。
OX40 (CD134)促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施例中，OX40促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，OX40促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40黏連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施例中，OX40促效劑係促效性抗OX40人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al. ,J. Immunother. 2009, 182, 1481-89。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al. ,Cancer Res. 2013 ,73, 7189-98。在一較佳實施例中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，OX40促效劑係由以高親和性及促效性活性與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合來表徵。在一實施例中，OX40促效劑係與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施例中，OX40促效劑係與鼠OX40 (SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表9中。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人 TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表10所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301”之N-醣化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；位於位置22至95 (VH -VL )、148至204 (CH 1-CL )、265至325 (CH 2)及371至429 (CH 3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、265”至325”及371”至429”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’ (VH -VL )及134’至194’ (CH 1-CL )(及位於位置23”’至88”’及134”’至194”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230至230”及233至233”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224至214’及224”至214”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
在一些實施例中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。11D4之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表11所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
在一些實施例中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。18D8之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表12所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu119-122之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表13所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu106-222之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
在一些實施例中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al. ,J. Immunother .2006 ,29 , 575-585。在一些實施態樣中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al. ,J. Immunother .2006 ,29 , 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施例中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施例中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括克隆20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之特性係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表6中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表7中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表15所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表15給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施例中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施例中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性抗體克隆Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。E. 步驟 E ：收集 TIL
在第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖9所提供之一、二、三、四或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖9所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，收集(例如根據圖9之步驟E)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注袋
在如圖9以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至患者。在一些實施例中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至患者。
在一實施例中，使用本揭露之APC擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。G. 醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL，平均約7.8×1010 個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010 個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010 至約8×1010 個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、1.25%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5 g、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一些實施例中，TIL的有效劑量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。H. TIL 冷凍保存
如上所討論且例示於如圖9中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施例中，在第二擴增(例如根據圖9步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在 -80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例8及9所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。I. 用於 TIL 製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
如FDA網站上所提供，使用無菌方法的密閉系統係已知且廣為描述。見https://www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm，如上參照且提供於以下相關部分。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。此指南描述使用這些裝置的建議作業及程序。此指南並不涉及無菌連接裝置廠商必須提交給FDA以獲得核准或上市許可證的資料或資訊。也很重要的是應注意，使用經核准或許可的無菌連接裝置於非標示核准之目的，可造成該裝置依據聯邦食品、藥品及化妝品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)被視為攙假及不實標示。
在一些實施例中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到準備將TIL投予至患者或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施例中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施例中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之培養基係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施例中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施例中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。C. 細胞培養
在一實施例中，用於擴增TIL之方法(包括該些以上討論以及圖9例示者)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞培養基。在一些實施例中，培養基係不含血清培養基。在一些實施例中，在第一擴增中之培養基係不含血清。在一些實施例中，在第二擴增中之培養基係不含血清。在一些實施例中，在第一及第二擴增中之培養基皆不含血清。在一實施例中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的培養基的量及培養基類型的數量。在一實施例中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施例中，該方法的期間包含自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在其中含有細胞培養基之第一氣體可通透容器中培養腫瘤組織樣本；自腫瘤組織樣本獲得TIL；在含有細胞培養基之第二氣體可通透容器中擴增TIL數量一段約7至14天例如約11天的期間。在一些實施例中，REP前係約7至14天，例如約11天。在一些實施例中，REP係約7至14天，例如約11天。
在一實施例中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare)。在一實施例中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施例中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施例允許細胞族群自約5×105 細胞/cm2 擴增至介於10×106 與30×106 細胞/cm2 之間。在一實施例中，此係未進行餵養。在一實施例中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的培養基位在約10 cm的高度。在一實施例中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施例中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與培養基混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al. ,J. Immunotherapy, 2012 , 35:283-292。 D. 可選的 TIL 冷凍保存
主體TIL族群或經擴增TIL族群可選地可經冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存發生於治療性TIL族群。在一些實施例中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施例中，冷凍保存發生於圖9的例示性步驟F中的TIL。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施例中，冷凍保存使用冷凍保存培養基執行。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施例中，TIL族群係使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用約1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
根據具體實施例，冷凍保存組成物(在本文中亦稱為「基於二甲亞碸之冷凍保存培養基」)包含根據本發明製備之TIL族群(例如1×106 至9×1013 之量)、適合用於在低溫環境中諸如-70℃至-196℃保存細胞的包含DMSO之冷凍保護劑培養基(例如CryoStor® CS10)及電解質溶液(例如等張溶液諸如PlasmaLyte® A)。在一較佳實施例中，冷凍保護劑培養基及電解質溶液以介於約1.2:1與約1:1.2之間或介於約1.1:1與約1:1.1之間或較佳地約1:1之比例存在。根據一實施例，電解質溶液包含鈉、鉀、鎂、乙酸酯、氯化物及葡萄糖酸鹽、或彼等之組合中一或多者；例如，電解質溶液可包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉、乙酸鈉三水合物、氯化鉀及氯化鎂。根據一實施例，電解質溶液具有介於約7與約8之間、較佳地介於約7.2與約7.6之間或約7.4的pH。較佳地，冷凍保存組成物進一步包含一或多種穩定劑(例如人血清白蛋白)及/或一或多種淋巴細胞生長因子(例如IL-2)。例如，冷凍保護劑培養基及電解質溶液中各者可以約20 mL至約100 mL、或約30 mL至約70 mL、或約40 mL至約60 mL、或約50 mL之量存在於冷凍保存組成物中；人血清白蛋白可以約0.01 g至約2.0 g、或約0.1 g至約1.0 g、或約0.5 g之量存在；且IL-2可以約0.001 mg至約0.005 mg、或約0.0015 mg至約0.0025 mg、或約0.0018 mg之量存在。冷凍保存培養基可選地包含一或多個額外添加劑或賦形劑，諸如pH調整劑、保存劑等。
根據一實施例，含有TIL族群之冷凍保存組成物係由下列構成：
如上於步驟A至E所討論，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施例中，在根據步驟B之第一擴增後的主體TIL族群或在一或多個根據步驟D之第二擴增後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可經受步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL族群可經受基因修飾以用於合適治療。 V. 治療癌症及其他疾病之方法
本文所述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一實施例中，彼等用於治療過度增生性病症。彼等亦可用於治療其他如本文及以下段落所述之病症。
在一些實施例中，過度增生性病症係癌症。在一些實施例中，過度增生性病症係實質腫瘤癌症。在一些實施例中，實質腫瘤癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施例中，實質腫瘤癌係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
在本文中描述之TIL在治療、預防及/或處理所示疾病或病症的療效可使用各種所屬技術領域中已知之模型測試，該等模型提供人疾病治療之指南。例如，用於判定卵巢癌治療療效的模型係描述於例如Mullany,et al. ,Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及Fong,et al. ,J. Ovarian Res. 2009, 2, 12。用於判定胰癌治療療效的模型係描述於Herreros-Villanueva,et al. ,World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294。用於判定乳癌治療療效的模型係描述於例如Fantozzi,Breast Cancer Res. 2006, 8, 212。用於判定黑色素瘤治療療效的模型係描述於例如Damsky,et al. ,Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Meuwissen,et al. ,Genes & Development ,2005, 19, 643-664。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Kim,Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60；及Sano,Head Neck Oncol. 2009, 1, 32。
在一些實施例中，IFN-γ指示過度增生性病症治療的治療療效。在一些實施例中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖20或圖21中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中之細胞介素IFN-γ水準來測量。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL提供經本方法之TIL治療之個體相較於經使用稱為過程1C(如圖13例示)之方法所製備的TIL治療之個體的血液中增加之IFN-γ。在一些實施例中，IFN-γ增加指示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的治療療效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係於來自經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的離體TIL中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血液中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血清中測量。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖20或圖21中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖20或圖21例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改良之多株性及/或增加之多株性指示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖20或圖21體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖9體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。 1.共投方法
在一些實施例中，如本文所述產生之TIL(包括例如衍生自圖20或圖21所述之方法的TIL)可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(lambrolizumab, MK03475或MK-3475, Merck; Keytruda®)、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell cat# BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且破壞PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中的抗體包括BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A (Genentech)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、破壞PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。在一些實施例中，當個體具有的癌症類型為單獨投予抗PD-1抗體所難治時，對於投予根據步驟A至F產生之TIL組合的個體共投抗PD-1抗體。在一些實施例中，當患者具有難治性黑色素瘤時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施例中，當患者具有非小細胞肺癌(NSCLC)時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。 2.可選的患者淋巴細胞耗盡前處理
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，本發明包括用於治療已先經非骨髓清除式化療治療之患者的癌症之TIL族群。在一實施例中，TIL族群係用於輸注投予。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2(阿地介白素，以PROLEUKIN市售)的靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施例中，TIL族群係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL族群之後投予。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之TIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
一般來說，淋巴細胞耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。此類方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother .2011 ,60, 75-85、Muranski,et al. ,Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681、Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008 ,26, 5233-5239及Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005 ,23, 2346-2357中，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100 mg/m2 /天、150 mg/m2 /天、175 mg/m2 /天、200 mg/m2 /天、225 mg/m2 /天、250 mg/m2 /天、275 mg/m2 /天或300 mg/m2 /天之劑量投予。在一些實施例中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一些實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至患者執行。在一些實施例中，氟達拉濱係以25 mg/m2 /天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2 /天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2 /天共五天執行。 3.IL-2 方案
在一實施例中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包含靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體，始於投予治療有效部分的治療性TIL族群之後當天，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸液投予直到耐受為止，最多14劑。在休息9天之後，可重複此時程再投予14劑，最多總共28劑。
在一實施例中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day,et al. ,J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及Eton,et al. ,Cancer 2000, 88, 1703-9，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，漸減IL-2方案包含在6小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在12小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在24小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在72小時內靜脈內投予 4.5×106 IU/m2 。此治療週期可每28天重複一次，最多可達四個週期。在一實施例中，漸減IL-2方案包含第1天18,000,000 IU/m2 ，第2天9,000,000 IU/m2 及第3及4天4,500,000 IU/m2 。
在一實施例中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。 4.過繼性細胞轉移
過繼性細胞轉移(ACT)是一種非常有效的免疫治療形式且涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移至癌症患者。ACT是涉及體外識別具有抗腫瘤活性之淋巴細胞、體外擴增這些細胞至大量及將彼等輸注至荷癌宿主的治療方式。用於過繼性轉移之淋巴細胞可衍生自經切除之腫瘤的基質(腫瘤浸潤性淋巴細胞或TIL)。用於ACT之TIL可如本文所述製備。在一些實施例中，TIL係根據例如圖9描述之方法製備。如果彼等經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)、經混合之淋巴細胞腫瘤細胞培養(MLTC)濃化或使用自體抗原呈現細胞及腫瘤衍生肽選殖，則彼等亦可衍生自或來自血液。其中淋巴細胞源自待輸注荷癌宿主的ACT稱為自體ACT。美國專利公開號2011/0052530關於一種用於執行過繼性細胞療法以促進癌症消退之方法，主要用於治療罹患轉移性黑色素瘤的患者，該案全文以引用方式併入本文中以用於這些方法。在一些實施例中，TIL可如本文所述投予。在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL及/或細胞毒性淋巴細胞可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL及/或細胞毒性淋巴細胞的投予可視需要持續進行。實例
在本文中涵蓋的實施例現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。實例 1 ： 生產冷凍保存TIL療法。
此實例描述根據現行人體細胞組織優良操作規範及現行藥品優良製造規範在G-Rex培養瓶中cGMP製造TIL療法。 設備
設備清單：第0天CM1培養基製備/腫瘤洗滌製備/腫瘤分割：․ 差壓計 ․ 生物安全櫃(BSC) ․ 培育箱 ․ CO2分析儀 ․ 微量吸管(100至1000µL) ․ 吸管輔助器 ․ Baxa Repeater泵 ․ Sebra封管機 ․ 2至8℃冰箱 ․-80℃冷凍器 ․-20℃冷凍器 ․ 計時器
設備清單：CM2製備/第11天REP接種 ․ 差壓計 ․ 生物安全櫃(BSC) ․ 培育箱 ․ 培育箱 ․ CO2分析儀 ․ 乾浴器 ․ 水浴器 ․ CytoTherm ․ 熔接器 ․ Gatherex ․ NC200 NucleoCounter ․ Baxa Repeater泵 ․ Sebra封管機Balance
設備清單：CM2製備/第11天REP接種 ․ 離心機 ․ 微量吸管(100至1000µL) ․ 吸管輔助器 ․ 計時器 ․ 2至8℃冰箱 ․-80℃冷凍器 ․ 控速冷凍器 ․ LN2儲存冷凍器(Quarantine) ․-20℃冷凍器
設備清單：CM4製備/第16天 ․ 差壓計 ․ 生物安全櫃(BSC) ․ 培育箱 ․ 培育箱 ․ CO2分析儀 ․ 熔接器 ․ 熔接器 ․ Gatherex ․ NC200 NucleoCounter ․ Baxa Repeater泵 ․ Sebra封管機Balance ․ 微量吸管(100至1000µL) ․ 吸管輔助器 ․ 2至8℃冰箱 ․-80℃冷凍器
設備清單：第22天調配、填充、冷凍保存 ․ 差壓計 ․ 生物安全櫃(BSC) ․ 培育箱 ․ 培育箱 ․ CO2分析儀 ․ 熔接器 ․ Gatherex ․ NC200 NucleoCounter ․ Baxa Repeater泵 ․ Sebra封管機Balance ․ 微量吸管(20至200µL)吸管輔助器
設備清單：第22天調配、填充、冷凍保存 ․ 吸管輔助器 ․ 2至8℃冰箱 ․-80℃冷凍器 ․ 控速冷凍器 ․ LN2儲存冷凍器 ․ LN2儲存冷凍器(Quarantine) ․ LOVO細胞處理系統 7.0 材料
材料：第0天CM1培養基製備/腫瘤洗滌製備/腫瘤
分割 ․ 無菌拋棄式解剖刀 ․ 50 mL無菌血清吸管 ․ 1 mL無菌血清塑膠吸管 ․ 10 mL無菌血清吸管 ․ 無菌旋蓋式錐形底PP離心管，50mL，28×114mm ․ 25 mL無菌血清吸管 ․ 5 mL無菌血清吸管 ․ MF75系列無菌拋棄式組織培養過濾器，1000 mL，aPES過濾器0.2 µm ․ 血清吸管100 mL ․ 液體2-巰乙醇1000X，55 mM於D-PBS中 ․ Hank氏平衡鈉鹽溶液(1X)，液體，不含氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂 ․ GlutaMAX 1-200 mM (100X)，液體 ․ ART屏障吸管尖，1000µL，無菌個別包裝 ․ 150mm無菌超深培養皿 ․ 6孔超低附著板，9.5cm2 孔生長面積，PS，無菌 ․ Thermo Scientific Samco一般目的移液吸管，7.7mL，無菌 ․ Repeater泵流體轉移組公魯爾鎖端 ․ 長鑷子8”，無菌 ․ 硫酸建它黴素，50mg/mL原液 ․ Scientific拋棄式鑷子，4.5”，不鏽鋼，無菌 ․ 100 mm無菌超深培養皿 ․ Pumpmatic液體分配系統 ․ 硫酸建它黴素，50mg/mL原液 ․ 紅色雙功能注射器蓋 ․ RPMI-1640，1 L瓶 ․ G-Rex 100M培養瓶密閉系統 ․ 無菌尺 ․ 重構IL-2 ․ 人頭頸腫瘤樣本   – N/A ․ 人子宮頸腫瘤樣本   – N/A ․ GemCell人血清AB(熱去活化)   – N/A ․ 人黑色素瘤腫瘤樣本 ․ GemCell人血清AB(熱去活化)
材料：CM2製備/第11天REP接種 ․ 魯爾鎖注射器，60 mL無菌針頭16G×1.5”無菌 ․ 50 mL無菌血清吸管 ․ 1 mL無菌血清塑膠吸管 ․ Nunc無菌內螺紋冷凍小管 ․ 10 mL無菌血清吸管 ․ 離心管15 mL ․ 離心管50 mL ․ 血清吸管100 mL ․ 無菌魯爾鎖注射器1 cc ․ 3 mL注射器，魯爾鎖尖，無菌 ․ 5 mL無菌血清吸管 ․ Nalgene *MF75*系列過濾器單位接受器，250 mL，無菌 ․ Nalgene MF75系列過濾器單位接受器，500mL，無菌 ․ 1000mL Nalgene快流無菌拋棄式過濾器單位，0.22µm PES ․ CryoStor CS-10 ․ 液體2-巰乙醇1000X，55 mM於D-PBS中 ․ GlutaMAX 1-200 mM (100X)，液體 ․ 1,000 µL ART屏障無菌吸管尖，個別包裝 ․ VIA1卡匣 ․ 轉移包容器，1000 mL具偶合器，無菌 ․ 轉移包，300 mL具偶合器 ․ 無菌酒精棉 ․ Repeater泵流體轉移組公魯爾鎖端 ․ CTS AIM V 1L瓶 ․ MACS GMP純CD3 (OKT-3) ․ 硫酸建它黴素，50mg/mL原液 ․ 4”管路具刺穿銷及注射器應接器 ․ 僅魯爾鎖注射器10 mL ․ 管路，四穿刺針公魯爾歧管 ․ Y型重力血液投予組，無注射部位，170µm血液過濾器 ․ Pumpmatic液體分配系統 ․ 10L Labtainer 3埠袋子 ․ 硫酸建它黴素，50mg/mL原液 ․ 100mL注射器 ․ 3000mL培養袋 ․ Origen Cell Connect CC2 ․ 紅色雙功能注射器蓋 ․ RPMI-1640，1L瓶 ․ G-Rex 500M培養瓶密閉系統 ․ 重構IL-2 ․ 同種異體經照射餵養細胞 ․ 同種異體經照射餵養細胞 ․ 人血清AB型(HI) Gemini ․ 人血清AB型(HI) Gemini
材料：CM4製備/第16天 ․ 無菌魯爾鎖注射器，60 mL ․ 1 mL無菌血清塑膠吸管 ․ Nunc無菌內螺紋冷凍小管 ․ 10 mL無菌血清吸管 ․ 離心管15mL ․ 離心管50 mL ․ 血清吸管100 mL ․ 具魯爾鎖無菌注射器3mL ․ 5 mL無菌血清吸管 ․ 僅魯爾鎖注射器10 mL ․ Nalgene *MF75*系列 ․ 無菌過濾器單位接受器，250mL ․ GlutaMAX1-200 mM (100X)，液體 ․ ART屏障吸管尖，1000 µL，無菌個別包裝 ․ VIA1卡匣
材料：CM4製備/第16天 ․ 轉移包容器，1000 mL具偶合器，無菌 ․ 無菌酒精棉 ․ Repeater泵流體轉移組公魯爾鎖端 ․ CTS AIM-V 1000mL   – N/A ․ 血漿轉移組4”管路具母魯爾應接器 ․ 30mL魯爾鎖無菌注射器 ․ CTS AIM V 10L袋子 ․ Pumpmatic液體分配系統 ․ 10L Labtainer 3埠袋子 ․ 紅色雙功能注射器蓋 ․ G-Rex500M培養瓶密閉系統 ․ 重構IL-2
材料：第22天調配、填充、冷凍保存 ․ 無菌魯爾鎖注射器，60 mL ․ 無菌針頭16G×1.5” ․ 50 mL無菌血清吸管 ․ Nunc無菌內螺紋冷凍小管 ․ 10 mL無菌血清吸管 ․ 離心管15 mL ․ 離心管50 mL ․ 無菌魯爾鎖注射器1cc ․ 3 mL注射器，魯爾鎖尖，無菌 ․ 25 mL無菌血清吸管 ․ 5 mL無菌血清吸管 ․ 僅魯爾鎖注射器10 mL ․ 血清吸管100 mL ․ ART屏障無菌吸管尖，200 µL個別包裝 ․ VIA1卡匣 ․ 血漿-Lyte A注射1L ․ LOVO細胞洗滌拋棄式組 ․ LOVO輔助袋套組 ․ 無菌酒精棉 ․ Repeater泵流體轉移組公魯爾鎖端 ․ CTS AIM V 1L瓶 ․ 人類白蛋白25% ․ 血漿轉移組4”管路具母魯爾應接器 ․ 管路，四公魯爾歧管 ․ 重力血液投予 ․ Y型組，無注射部位，170µm血液過濾器 ․ Pumpmatic液體分配系統 ․ 10L Labtainer 3埠袋子 ․ 100mL注射器 ․ 冷凍袋CS750 ․ 3L培養袋 ․ Origen Cell Connect CC2 ․ 紅色雙功能注射器蓋 ․ Cryostor CS10，100mL袋子 ․ 通氣分配穿刺針 ․ 重構IL-2
過程 8.1 第0天CM1培養基製備 8.1.1 檢查室內衛生、管線廓清及材料。確認室內衛生。 8.1.2 確保填寫前處理表。 8.1.3 環境監測。在處理之前，確保前處理環境監測已起始。 8.1.4 製備RPMI 1640培養基 在BSC中，使用適當大小的吸管，自1000 mL RPMI 1640培養基中移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。 8.1.5 在BSC中，添加試劑至RPMI 1640培養基瓶。添加表中顯示之下列試劑至RPMI 1640培養基瓶。記錄添加的體積。 每瓶添加的量：熱去活化人AB血清(100.0 mL)；GlutaMax (10.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/mL (1.0 mL)；2-巰乙醇(1.0 mL) 8.1.6 混合培養基。將來自步驟8.1.5的RPMI 1640培養基瓶加蓋並將瓶渦漩以確保試劑混合徹底。 8.1.7 過濾RPMI培養基。將來自步驟8.1.6的RPMI 1640培養基過濾通過1L 0.22微米過濾器單位。 8.1.8 標示過濾培養基。無菌地將過濾培養基加蓋且標示下列資訊。 8.1.9 自BSC移出非必須材料。將BSC中之培養基試劑傳遞出，BSC中留下硫酸建它黴素及HBSS用於第8.2節的調配洗滌培養基製劑。 8.1.10 儲存未使用的消耗品。將任何剩餘的開封/解凍培養基試劑轉移至適當儲存條件或棄置至廢棄物。 注意：按照過程注意事項5.9指派適當的開封到期日至培養基試劑且標示批次紀錄批號 8.1.11 解凍IL-2等分試樣。解凍一個1.1 mL IL-2等分試樣(6×106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL-2：批號及到期日(注意：確保IL-2標籤已附接)。 8.1.12 將IL-2儲備溶液轉移至培養基。在BSC中，將1.0 mL的IL-2儲備溶液轉移至步驟8.1.8製備的CM1第0天培養基瓶。添加CM1第0天培養基1瓶及IL-2 (6×106 IU/mL) 1.0 mL。 8.1.13 混合及重新標示。將瓶加蓋並渦漩以混合含有IL-2之培養基。重新標示為「完全CM1第0天培養基」且指派新批號。 8.1.14 按照樣本計畫取樣培養基。使用適當大小的吸管移出20.0 mL的培養基並分配至50 mL錐形管。 8.1.15 標示及儲存。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示樣本並在2至8℃下儲存「培養基保留」樣本直到提交至Login進行測試為止。 8.1.16 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.1.17 製備「組織片」錐形管。在BSC中，將25.0 mL的「完全CM1第0天培養基」(在步驟8.1.13中製備)轉移至50 mL錐形管。標示管為「組織片」及批次紀錄批號。 8.1.18 傳遞G-Rex100MCS至BSC中。將G-Rex100MCS (W3013130)無菌地傳遞至BSC中。 8.1.19 製備G-Rex100MCS。在BSC中，關閉所有G-Rex100MCS上的管夾，只剩通氣孔過濾器的管夾打開。 8.1.20 製備G-Rex100MCS。將G-Rex100MCS培養瓶的紅色管線經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組(W3009497)的較大直徑端。 8.1.21 製備Baxa泵。將Baxa泵緊鄰BSC裝設。將repeater泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至repeater泵中。 8.1.22 準備泵送培養基。在BSC內，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS) (W3012720)的注射器並丟棄。 注意：確保不破壞PLDS吸管的無菌性。 8.1.23 準備泵送培養基。將PLDS吸管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸管尖放入「完全CM1第0天培養基」(在步驟8.1.13中製備)中進行抽吸。 打開培養基與G-Rex100MCS之間的所有管夾。 8.1.24 泵送完全CM1培養基至G-Rex100MCS培養瓶中。設定泵速至「高」及「9」並將所有完全CM1第0天培養基泵送至G-Rex100MCS培養瓶中。一旦所有培養基皆轉移後，清除管線並停止泵。 8.1.25 將泵與培養瓶的連接斷開。確保培養瓶上的所有管夾皆關閉，但通氣孔過濾器除外。將repeater泵流體轉移組自紅色培養基管線移除，並將紅色蓋子(W3012845)蓋在紅色培養基管線上。 8.1.26 熱封。將G-Rex100MCS培養瓶自BSC移出，熱封(按照過程注意事項5.12)紅色管線靠近末端魯爾的紅色蓋子。 8.1.27 標示G-Rex100MCS。將G-Rex100MCS培養瓶標示QA提供的過程中「第0天」標籤。在以下附接樣本「第0天」標籤。 8.1.28 監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2 8.1.29 溫熱培養基。將步驟8.1.17製備的標示「組織片段」之50mL錐形管及步驟8.1.27製備的G-Rex100MCS放在培育箱中溫熱≥ 30分鐘。 在以下記錄溫熱時間。記錄溫熱時間是否≥ 30分鐘(是/否)。 [組織片段錐形管或GRex100MCS] 8.1.30 回顧第8.1節。 8.2 第0天腫瘤洗滌培養基製備 8.2.1 添加建它黴素至HBSS。在BSC中，添加5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)至1×500 mL HBSS培養基(W3013128)瓶中。記錄體積。每瓶添加：HBSS (500.0 mL)；硫酸建它黴素50 mg/ml (5.0 mL)。 8.2.2 將HBSS瓶加蓋及渦漩。將步驟8.2.1製備的含建它黴素之HBSS加蓋並將瓶渦漩以確保試劑混合徹底。 8.2.3 過濾溶液。將步驟8.2.1製備的含建它黴素之HBSS過濾通過1L 0.22微米過濾器單位(W1218810)。 8.2.4 無菌加蓋過濾培養基及標示。無菌地將過濾培養基加蓋且標示下列資訊。進行第8.3節。 8.2.5 回顧第8.2節。 8.3 第0天腫瘤處理 8.3.1 獲得腫瘤。獲得來自QAR之腫瘤樣品並立即轉移至在2至8℃下的套件(suite)進行處理。確保在腫瘤運送批次紀錄上記錄所有必需資訊。 8.3.2 記錄腫瘤資訊。 8.3.3 固定腫瘤標籤。固定腫瘤附著。QAR放行貼紙如下。附著腫瘤運送批次紀錄為#5。 8.3.4 將腫瘤分割的必要材料傳遞至BSC中。 8.3.5 打開材料。在BSC內打開所有材料，確保不破壞品項的無菌性。 8.3.6 標示材料。標示三個50ml錐形管：第一個為「鑷子」、第二個為「解剖刀」、第三個為「新鮮腫瘤洗滌培養基」。將5個100 mm培養皿標示為「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」、「繫留」及「不佳」。將一個6孔板標示為「較佳中間片段」。 8.3.7 等分腫瘤洗滌培養基。使用適當大小吸管，將5.0 mL步驟8.2.4製備的「腫瘤洗滌培養基」轉移至一個較佳中間腫瘤片段6孔板的各孔中(總共30.0 mL)。注意：在腫瘤洗滌及分割過程期間，視需要將鑷子及解剖刀儲存在彼等各自之腫瘤洗滌培養基錐形管中。 8.3.8 等分腫瘤洗滌培養基。使用適當大小吸管，將50.0 mL步驟8.2.4製備的「腫瘤洗滌培養基」轉移至每個「洗滌1」、「洗滌2」、「洗滌3」及「繫留」之100 mm培養皿中(總共200.0 mL)。 8.3.9 等分腫瘤洗滌培養基。使用適當大小吸管，將20.0 mL步驟8.2.4製備的「腫瘤洗滌培養基」轉移至每個50 mL錐形管中(總共60.0 mL)。 8.3.10 製備用於腫瘤塊的蓋子。無菌地移除二個6孔板的蓋子。將蓋子利用於選定的腫瘤塊。注意：在整個腫瘤處理期間，不得互換打開的組織培養板及蓋子。 8.3.11 將腫瘤傳遞至BSC中。將腫瘤無菌地傳遞至BSC中。記錄處理開始時間。 8.3.12 腫瘤洗滌1使用8”鑷子(W3009771)，將腫瘤自樣品瓶移出並轉移至步驟8.3.8製備的「洗滌1」培養皿。 注意：保留樣品瓶中的溶液。 8.3.13 腫瘤洗滌1。使用鑷子，溫和洗滌腫瘤以下計時器的時間：樣品且允許其靜置≥ 3分鐘。記錄洗滌時間(MM:SS)。 8.3.14 按照樣本計畫製備生物負載樣本。將20.0 mL(或可用體積)的溶液按照樣本計畫自腫瘤樣品瓶轉移至50mL錐形管。 8.3.15 標示且儲存樣本。用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存步驟8.3.14收集的生物負載樣本直到提交測試為止。 8.3.16 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.3.17 腫瘤洗滌2。使用一支新的鑷子，將腫瘤自「洗滌1」培養皿移出並轉移至步驟8.3.8製備的「洗滌2」培養皿。 8.3.18 腫瘤洗滌2。使用鑷子，藉由輕柔攪拌≥ 3分鐘洗滌腫瘤樣品並允許其靜置。記錄時間。 8.3.19 製備用於所欲腫瘤塊之腫瘤洗滌培養基液滴。使用移液吸管，將4滴來自步驟8.3.9製備的錐形管之腫瘤洗滌培養基放入6孔板向上翻轉的蓋子(2個蓋子)上的6個圓圈之各者中。二個圓圈多放一滴，總共50滴。 8.3.20 腫瘤洗滌3。使用鑷子，將腫瘤自「洗滌2」培養皿移出並轉移至步驟8.3.8製備的「洗滌3」培養皿。 8.3.21 腫瘤洗滌3。使用鑷子，藉由輕柔攪拌洗滌腫瘤樣品並允許其靜置≥ 3分鐘。記錄時間。 8.3.22 製備腫瘤分割培養皿。在150 mm培養皿蓋子下方放置一支尺。 8.3.23 將腫瘤轉移至分割培養皿。使用鑷子，將腫瘤樣品無菌地轉移至150 mm分割培養皿蓋子。 8.3.24 測量腫瘤。將所有腫瘤樣品片端對端排列並記錄大約整體長度及片段數量。將每個腫瘤樣品拍攝清楚照片。 8.3.25 評估腫瘤。評估腫瘤的壞死/脂肪組織。評估是否觀察到＞ 30%的整體腫瘤區域為壞死及/或脂肪組織；如果是的話，聯絡地區管理以確保腫瘤具有適當大小，接著進行步驟8.3.26。評估是否觀察到＜ 30%的整體腫瘤區域為壞死或脂肪組織；如果是的話，則進行步驟8.3.27且不執行清除分割。 8.3.26 如果適用的話：清除分割。如果腫瘤大且觀察到＞30%的組織外部為壞死/脂肪，藉由移除壞死/脂肪組織來執行「清除分割」，同時使用解剖刀及/或鑷子的組合保留腫瘤內部結構。注意：為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。注意：將脂肪、壞死及不相關組織放入不佳培養皿。 8.3.27 分割腫瘤。使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成均勻、適當大小的片段(至多6個中間片段)。注意：為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。注意：確保保持非分割中間片段完全浸沒在「腫瘤洗滌培養基」(在步驟8.2.4中製備)中。 8.3.28 轉移中間腫瘤片段。將各中間片段轉移至來自步驟8.3.8的「繫留」培養皿。 8.3.29 分割腫瘤片段。一次操作一個中間片段，將腫瘤中間片段在分割培養皿中分割成大小大約3×3×3mm的片，將每片上的出血、壞死及/或脂肪組織的量最小化。注意：為了維持腫瘤內部結構，僅使用垂直切割壓力。不以解剖刀進行鋸切動作來切割。 8.3.30 選擇腫瘤塊。選擇至多八(8)個無出血、壞死及/或脂肪組織的腫瘤塊。使用尺作為參考。持續分割直到已獲得8個較佳片，或已分割整個中間片段。將各選定片轉移至步驟8.3.19製備的「腫瘤洗滌培養基」液滴中之一者。 8.3.31 儲存中間片段以預防乾燥。在從中間片段選擇至多八(8)片之後，將中間片段的殘留物放入步驟8.3.7製備的「較佳中間片段」6孔板中的新單一孔。注意：將脂肪或壞死組織放入「不佳」培養皿(在步驟8.3.6中製備)。 8.3.32 重複中間片段分割。進行下一個中間片段的處理，重複步驟8.3.29至8.3.31直到所有中間片段已處理，視需要使用新的解剖刀及鑷子。 8.3.33 判定收集的片數。如果仍有所欲組織，從「較佳中間片段」6孔板選擇額外較佳腫瘤塊以最多50片填滿液滴。記錄所產生的分割片的總數。注意：確保在整個分割期間視需要用洗滌培養基保持腫瘤中間片段的水合。記錄收集的分割片總數量。 8.3.34 將錐形管自培育箱移出。將「組織片」50mL錐形管自培育箱移出。記錄時間於步驟8.1.29。確保錐形管溫熱≥30 min。 8.3.35 製備錐形管。將「組織片」50mL錐形管傳遞至BSC中，確保不破壞開放處理表面的無菌性。 8.3.36 將腫瘤塊轉移至50mL錐形管。使用移液吸管、解剖刀、鑷子或組合，將選定的50個最佳腫瘤片段從較佳培養皿蓋子轉移至「組織片」50 mL錐形管。 注意：如果腫瘤塊在轉移過程中掉落且仍有所欲組織，則添加來自較佳腫瘤中間片段孔的額外腫瘤塊。記錄片數。 8.3.37 製備BSC以進行G-REX100MCS。將所有非必須品項自BSC移出以進行容器接種，保留含有多餘片段的較佳組織板。 8.3.38 將G-REX100MCS自培育箱移出。將含有培養基的G-Rex100MCS自培育箱移出。完成步驟8.1.29。 8.3.39 傳遞培養瓶至BSC中。將G-Rex100MCS培養瓶無菌地傳遞至BSC中。注意：當轉移培養瓶時，不要握住容器的蓋子或底部。拿握側邊來轉移容器。注意：只能利用IPA WIPES來拿握/操作G-Rex培養瓶。 8.3.40 添加腫瘤片段至G-Rex100MCS培養瓶。在BSC中，將G-Rex100MCS培養瓶蓋子拿掉，確保維持內部管路的無菌性。 渦漩含有腫瘤塊的錐形管以懸浮，並將內容物快速倒入G-Rex100MCS培養瓶中。 8.3.41 均勻分布腫瘤塊。確保腫瘤塊均勻分布在培養瓶的膜上。如有需要將培養瓶輕柔來回傾斜，以使腫瘤塊均勻分布。 8.3.42 記錄容器中的腫瘤片段總數。記錄容器底部膜上的腫瘤片段數量以及所觀察到漂浮在容器中的數量。注意：如果接種片段數量不等於步驟8.3.36H中收集的數量，聯絡地區管理，並記錄在第10.0節。 8.3.43 培育G-Rex培養瓶。以下列參數培育G-Rex100MCS：培育G-Rex培養瓶：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2 8.3.44 計算培育窗。執行計算以判定在第11天將G-Rex100MCS移出培育箱的適當時間。計算：培育時間；下限=培育時間+252小時；上限=培育時間+276小時。 8.3.45 環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 8.3.46 丟棄材料。儲存剩餘未溫熱培養基在2至8℃下且標示。在過程已完成後，丟棄任何剩餘溫熱培養基及解凍的IL-2等分試樣。 8.3.47 樣本提交。確保所有第0天樣本提交至Login且轉移於LIMS中。 8.3.48 回顧第8.3節。 8.4 第11天，培養基製備 8.4.1 檢查室內衛生、管線廓清及材料。確認室內衛生、管線廓清及材料在到期日內。 8.4.2 前處理表。設備清單：BSC；Balance；Sebra封管機；GatherexTM 培養基移除及細胞回收裝置；確保QA提供標牌放在適當BSC上；確保QA提供標牌批號及患者ID顯示符合此批次紀錄中的批號及患者。 8.4.3 監測培育箱。監測培育箱。培育箱參數： 溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。注意：第8.4節可與第8.5節同時運行。 8.4.4 溫熱培養基。將3個1000 mL RPMI 1640培養基(W3013112)瓶及3個1000 mL AIM-V (W3009501)瓶在培育箱中溫熱≥ 30分鐘。記錄時間。培養基：RPMI 1640及AIM-V。注意：將額外1個1000 ml AIM-V培養基瓶(W3009501)放在室溫下以供步驟8.5.34使用。將瓶標示「僅用於細胞計數稀釋」及批次紀錄批號。 8.4.5 環境監測。在處理之前，確保按照SOP-00344執行前處理環境監測。 8.4.6 將RPMI 1640培養基自培育箱移出。當時間到達後，移出RPMI 1640培養基。記錄結束培育時間於步驟8.4.4。確保培養基溫熱≥30 min。 8.4.7 製備RPMI 1640培養基。在BSC中，從三個預熱的1000 mL RPMI 1640培養基瓶中的每一瓶移出100.0 mL並放入標示「廢棄物」的適當大小容器。 8.4.8 在BSC中，添加試劑至RPMI 1640培養基瓶。在BSC中，添加下列試劑至三個RPMI 1640培養基瓶中的每一瓶。記錄添加至每一瓶的體積。GemCell熱去活化AB型人血清(100.0 mL)、GlutaMax (10.0 mL)、硫酸建它黴素50 mg/ml (1.0 mL)、2-巰乙醇 (1.0 mL) 8.4.9 過濾培養基。將來自步驟8.4.8的瓶加蓋並渦漩以確保試劑混合徹底。將每一瓶培養基過濾通過分開的1L 0.22微米過濾器單位。 8.4.10 標示過濾培養基。將過濾培養基無菌地加蓋並將每一瓶標示為CM1第11天培養基。 8.4.11 解凍IL-2等分試樣。解凍3×1.1mL等分試樣的IL-2 (6×106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL 2批號及到期日。 注意：確保IL-2標籤已附接。 8.4.12 將AIM-V培養基自培育箱移出。將三瓶AIM-V培養基自培育箱移出。記錄結束培育時間於步驟8.4.4。確保培養基已溫熱≥ 30分鐘。 8.4.13 添加IL-2至AIM-V。在BSC中，使用微量吸管，添加3.0mL解凍的IL-2至一瓶1L預熱AIM-V培養基中。在分配IL-2後用培養基潤洗微量吸管尖端。每個等分試樣使用新的無菌微量吸管尖端。記錄總添加體積。將瓶標示為「含有IL-2的AIM-V」。 8.4.14 轉移材料。將10L Labtainer袋子及repeater泵轉移組無菌地轉移至BSC中。 8.4.15 製備10L Labtainer培養基袋子。關閉10L Labtainer袋子上的所有管線。將repeater泵轉移組的較大直徑管路端經由魯爾鎖連接附接至10L Labtainer袋子的中間母埠。 8.4.16 製備Baxa泵。將Baxa泵緊鄰BSC裝設。將轉移組管路裝入位在BSC外之Baxa泵。 將Baxa泵設定至「高」及「9」。 8.4.17 製備10L Labtainer培養基袋子。在BSC中，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。注意：確保不破壞PLDS吸管的無菌性。 8.4.18 製備10L Labtainer培養基袋子。將PLDS吸管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸管尖放入含有IL-2的AIM-V培養基瓶(在步驟8.4.13中製備)中進行抽吸。打開培養基瓶與10L Labtainer之間的所有管夾。 8.4.19 泵送培養基至10L Labtainer中。在BSC中，使用PLDS，將步驟8.4.13製備的含有IL-2的預熱AIM-V培養基以及二瓶額外的AIM-V轉移至10L Labtainer袋子中。添加三瓶來自步驟8.4.10之過濾的CM1第11天培養基。在添加最終瓶後，清除通往袋子的管線。注意：在添加每瓶培養基之間停止泵。 8.4.20 移除Labtainer袋子的pumpmatic。將PLDS自轉移組移除並將紅色蓋子蓋在BSC中之管線的魯爾上。 8.4.21 混合培養基。輕柔按摩袋子以混合。 8.4.22 標示培養基。在BSC中，將培養基袋子標示下列資訊。到期日為自製備日期起的24小時。 8.4.23 按照樣本計畫取樣培養基。在BSC中，將60mL注射器附接至步驟8.4.22製備的「完全CM2第11天培養基」袋子的可用母埠。移出20.0mL的培養基並放入50mL錐形管中。 將紅色蓋子蓋在「完全CM2第11天培養基」袋子的母埠上。 8.4.24 標示且儲存樣本。用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存培養基保留樣本直到提交至Login測試為止。 8.4.25 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.4.26 密封轉移組管線。在BSC外，熱封(按照過程注意事項5.12)靠近紅色蓋子的轉移組管線上的紅色蓋子。將轉移組保持在袋子上。 8.4.27 製備細胞計數稀釋管。在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V培養基至四個15mL錐形管。將管標示批號及管編號(1至4)。將4支冷凍小瓶標示「餵養細胞」及小瓶編號(1至4)。將小瓶保持在BSC下待步驟8.5.30使用。 8.4.28 將試劑自BSC轉移至2至8℃。將任何剩餘的2-巰乙醇、GlutaMax及人血清自BSC轉移至2至8℃。按照過程注意事項5.9，確保所有試劑標示批次紀錄批號及適當開封到期日。 8.4.29 製備1L轉移包。在BSC外，將1L轉移包接合(按照過程注意事項5.11)至附接至步驟8.4.22製備的「完全CM2第11天培養基」袋子的轉移組。將轉移包標示為「餵養細胞CM2培養基」及批號。 8.4.30 製備1L轉移包。在1L轉移包管路離袋子幾英寸處的管路上作一個記號。將空的轉移包放在磅秤上，使得該記號處以上的管路在磅秤上。 8.4.31 磅秤歸零。將磅秤歸零，並將空的轉移包留在磅秤上。 8.4.32 製備餵養細胞轉移包。將Baxa泵設定至「中」及「4」。將500.0±5.0mL的步驟8.4.22製備的「完全CM2第11天」培養基泵送至細胞CM2培養基轉移包中。測量重量並記錄添加至轉移包的完全CM2培養基體積。 8.4.33 熱封管線。一旦填充之後，按照過程注意事項5.12熱封管線。將含轉移組的CM2第11天培養基袋與餵養細胞培養基轉移包分開，將接合保留在1L轉移包。 8.4.34 如果適用的話：培育餵養細胞培養基轉移包。適用時，將「餵養細胞CM2培養基」轉移包放在培育箱中直到步驟8.6.6使用。 8.4.35 培育完全CM2第11天培養基。將步驟8.4.22製備的「完全CM2第11天培養基」放在培育箱中直到步驟8.7.2使用。 8.4.36 回顧第8.4節。 8.5 第11天，TIL收集 8.5.1 前處理表。監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。 注意：第8.5節可與第8.4及8.6節同時運行。 8.5.2 自培育箱移出G-Rex100MCS。將G- Rex100MCS自培育箱移出前，執行以下檢查以確保符合培育參數。步驟8.3.44 B的下限。步驟8.3.44 C的上限。記錄自培育箱移出的時間。判定下列是否為真：8.3.44 B ≤自培育箱移出的時間＜步驟8.3.44 C?  *如果否，則聯絡地區管理。小心地將G-Rex100MCS自培育箱移出並確保所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)。記錄處理開始時間。 8.5.3 製備300mL轉移包。將300mL轉移包標示為「TIL懸浮液」。 8.5.4 製備300mL轉移包。將重力血液過濾器的TIL懸浮液轉移(單一管線)無菌接合(按照過程注意事項5.11)。參見例如。 8.5.5 製備300mL轉移包。將300mL轉移包放在磅秤上並記錄乾重。 8.5.6 製備1L轉移包。將1L轉移包標示為「上清液」及批號。 8.5.7 接合轉移包至G-Rex100MCS。將來自G-Rex100MCS的紅色培養基移除管線無菌接合(按照過程注意事項5.11)至「上清液」轉移包。將來自G-Rex100MCS的透明細胞移除管線無菌接合至連接至步驟8.5.4製備的「TIL懸浮液」轉移包之血液過濾器頂端的二個穿刺針管線的其中之一。參見例如。 8.5.8 GatheRex設置。將G-Rex100MCS放在GatheRex的左側且將「上清液」及「TIL懸浮液」轉移袋放在右側。 8.5.9 GatheRex設置。將來自G Rex100MCS的紅色培養基移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex100MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。 8.5.10 GatheRex設置。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex100MCS培養瓶的無菌過濾器。注意：在從G-Rex100MCS培養瓶移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。 8.5.11 G-Rex100MCS的體積減少。將約900 mL的培養上清液從G-Rex100MCS轉移至1L轉移包。目視檢查G-Rex100MCS培養瓶以確保培養瓶水平且培養基減少至抽吸液浸管的末端。注意：如果Gatherex提早停止，再次按壓箭頭向右按鍵以重新開始。 8.5.12 製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。 8.5.13 起始TIL收集。記錄TIL收集的開始時間。 8.5.14 起始TIL收集。劇烈拍打培養瓶並渦漩培養基以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。注意：如果細胞沒有脫附，聯絡地區管理。 8.5.15 起始TIL收集。傾斜培養瓶遠離收集管路並允許腫瘤塊沿著邊緣沉降。緩慢地將培養瓶傾向收集管路，使片維持在培養瓶的對側。注意：如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。 8.5.16 TIL收集。放開所有通往TIL懸浮液轉移包的管夾。 8.5.17 TIL收集。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移通過血液過濾器至300mL轉移包中。注意：確定維持傾斜邊緣直到所有細胞及培養基皆已收集。 8.5.18 TIL收集。檢視膜上有無附著細胞。 8.5.19 潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex100MCS的底部。用潤洗培養基覆蓋約1/4的氣體交換膜。注意：如果腫瘤塊阻塞收集管線，藉由按壓細胞收集管線上的「X」來暫停收集。按壓Gatherex上的「放開管夾」按鍵且拿起轉移包並以遞增壓力輕柔擠壓直到片段移除。不得大力擠壓袋子，否則可能造成管線或袋子破裂。一旦阻塞移除之後恢復收集。 8.5.20 關閉G-Rex100MCS上的管夾。確保所有管夾皆已關閉。 8.5.21 熱封。在TIL懸浮液轉移包盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以使整體管路長度維持大約相同。 8.5.22 熱封。按照過程注意事項5.12熱封「上清液」轉移包。維持足夠管線以接合。 8.5.23 計算TIL懸浮液體積。記錄TIL懸浮液轉移包的重量並計算細胞懸浮液的體積。 8.5.24 製備用於取樣之上清液轉移包。將4”血漿轉移組接合(按照過程注意事項5.11)至「上清液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。 8.5.25 製備用於取樣之TIL懸浮液轉移包。將4”血漿轉移組接合(按照過程注意事項5.11)至300mL「TIL懸浮液」轉移包，保留在4”血漿轉移組上的魯爾連接，並轉移至BSC中。 8.5.26 抽取Bac-T樣本。在BSC中，使用適當大小注射器，自1L「上清液」轉移包抽取大約20.0 mL的上清液並分配至標示「Bac-T」之無菌50mL錐形管。保持在BSC中以供步驟8.5.27使用。 8.5.27 按照樣本計畫接種BacT。使用適當大小注射器自步驟8.5.26製備的標示BacT之50mL錐形管移出1.0 mL樣本且接種厭氧瓶。使用瓶標籤上提供的空間記錄瓶接種的時間。重複上述於好氧瓶。注意：此步驟可不按順序執行。 8.5.28 標示且儲存樣本。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在室溫下避光儲存Bac-T樣本直到提交至Login進行測試為止。注意：標籤不可遮蓋瓶上的條碼。 8.5.29 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.5.30 TIL細胞計數樣本。將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。使用分開的3mL注射器，自使用魯爾連接的TIL懸浮液轉移包抽取4×1.0mL細胞計數樣本並放入各別冷凍小瓶。 8.5.31 關閉魯爾連接。將紅色蓋子(W3012845)蓋在管線上。 8.5.32 培育TIL。將TIL轉移包放在培育箱中直到需要為止。 8.5.33 執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。執行未稀釋的初始細胞計數。 8.5.34 記錄細胞計數樣本體積。注意：如果不需要稀釋，「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」= 0。 8.5.35 判定倍增因數。總細胞數樣本體積：8.5.34A+8.5.34B。倍增因數C ÷ 8.5.34A。 8.5.36 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.5.37 記錄來自Nucleoview的檔案名稱、存活性及細胞計數 8.5.38 判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。存活性(8.5.37A+8.5.37B) ÷ 2。存活細胞濃度 (8.5.37C+8.5.37D) ÷ 2 8.5.39 判定計數上限及下限。下限：8.5.38F× 0.9。上限：8.5.38F×1.1。 8.5.40 兩次計數是否皆在允收界限內?  下限：8.5.37 C及D ≥ 8.5.39G。上限：8.5.37 C及D ≤ 8.5.39H。*如果任一結果為「否」，則執行步驟8.5.41至8.5.48中的第二組計數*。 8.5.41 如果適用的話：執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。注意：稀釋根據預期細胞濃度調整。執行 8.5.42 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。 8.5.43 如果適用的話：判定倍增因數。總細胞數樣本體積：8.5.42A+8.5.42B。倍增因數C÷ 8.5.42A D 8.5.44 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0。 8.5.45 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.5.46 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。判定平均存活細胞濃度。 8.5.47 如果適用的話：判定計數上限及下限。下限：8.5.46F×0.9。上限：8.5.46F×1.1。 8.5.48 如果適用的話：計數是否在允收界限內?  下限：8.5.45 C及D ≥ 8.5.47G。上限：8.5.45 C及D ≤ 8.5.47H。注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.5.49以判定平均值。 8.5.49 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度。平均存活細胞濃度(A+B+C+D) ÷ 4 =平均值 8.5.50 調整TIL懸浮液的體積。在移除細胞計數樣本後，計算TIL懸浮液的調整體積。來自步驟8.5.23C之總TIL細胞體積(A)。移除的細胞計數樣本體積(4.0 ml) (B)。調整的總TIL細胞體積C=A-B。 8.5.51 計算總存活TIL細胞。平均存活細胞濃度*：8.5.38 F*或8.5.46 F*或*8.5.49E*；總體積：8.5.50；總存活細胞：C = A×B。*圈起用於判定存活細胞濃度的步驟參考。注意：如果總存活TIL細胞＜ 5×106 個細胞，聯絡地區管理且進行步驟8.7.1。如果總存活TIL細胞＞ 5×106 ，則進行步驟8.5.52。 8.5.52 流動式細胞測量術的計算。如果來自步驟8.5.51C的總存活TIL細胞計數為≥ 4.0×107 ，則計算體積以獲得用於流動式細胞測量術樣本的1.0×107 個細胞。*如果＜4.0×107 個細胞，表中的剩餘欄位為N/A。進行步驟8.7.1。流動式細胞測量術所需的總存活細胞：1.0×107 個細胞。流動式細胞測量術所需之細胞體積：來自8.5.51的存活細胞濃度除以1.0×107 個細胞A。 8.5.53 如果適用的話：自培育箱移出TIL。將TIL懸浮液自培育箱移且記錄結束培育時間於步驟8.5.32。 8.5.54 如果適用的話：如樣本計畫所示移除流動式細胞測量術樣本。使用適當大小的注射器，自TIL懸浮液轉移包移出計算體積(8.5.52 C)的表型分析樣本且放入50mL錐形管中。 8.5.55 如果適用的話：標示及儲存流動式細胞測量術樣本。按照取樣計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存「流動式細胞測量術」樣本直到提交至Login進行測試為止。 8.5.56 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.5.57 如果適用的話：重新計算總存活細胞及體積流。計算在移除以下細胞測量術樣本之後剩餘的總存活細胞及剩餘體積。 8.5.58 如果適用的話：計算TIL體積。計算等於2.0×108 個存活細胞的TIL懸浮液體積。 8.5.59 如果適用的話：計算待移除的TIL體積。計算待移除的TIL細胞過量體積。 8.5.60 如果適用的話：移除過量的TIL。在BSC中，使用適當大小的注射器，自TIL懸浮液轉移包移出計算體積(步驟8.5.59C)。注意：不得重複使用注射器。如果適用的話，使用多個注射器。放入適當大小無菌容器並標示日期及批號。將紅色蓋子蓋在「TIL懸浮液」轉移包管線上。 8.5.61 如果適用的話：將TIL放在培育箱中。將TIL懸浮轉移包放在培育箱中直到需要為止。記錄時間。 8.5.62 如果適用的話：計算。計算移除的總過量TIL。步驟8.5.51A 來自步驟8.5.59C之待移除的TIL體積。計算移除的總過量TIL。 8.5.63 如果適用的話：計算。計算待添加至來自步驟8.5.62C的過量TIL細胞之CS-10培養基之量。冷凍的目標細胞濃度係1.0×108 個細胞/mL。 8.5.64 如果適用的話：離心過量的TIL。離心過量的TIL細胞懸浮液。速度：350×g。時間：10:00分鐘。溫度：室溫。 煞車：全速(9)。加速：全速(9)。 8.5.65 如果適用的話：觀察錐形管。記錄觀察值：有無團塊?上清液是否透明?  *注意：如果任一答案為否，聯絡地區管理。 8.5.66 如果適用的話：添加CS-10。在BSC中，無菌地抽吸上清液。輕柔拍打管底部以將細胞重懸於剩餘流體中。 8.5.67 如果適用的話：添加CS10。緩慢添加步驟8.5.63C中計算的CS10體積 8.5.68 如果適用的話：標示小瓶。用QA提供的標籤標示小瓶。附接樣本標籤。 8.5.69 如果適用的話：填充小瓶。將1.0mL細胞懸浮液等分至適當大小的冷凍小瓶中。注意：不要填充超過10個小瓶的過量TIL。 8.5.70 如果適用的話：填充小瓶。按照SOP-00242，將殘餘體積等分至適當大小的冷凍小瓶中。如果體積≤0.5mL，添加CS10至小瓶直到體積為0.5mL。 8.5.71 如果適用的話：填充小瓶。將一個小瓶填充1.0mL的CS10並標示為「空白」。 8.5.72 如果適用的話：記錄填充的小瓶數量。在以下記錄填充的小瓶數量，但不包括空白。 8.5.73 如果適用的話：環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 TIL冷凍保存樣本 8.5.74 如果適用的話：計算用於冷凍保存的體積。計算要獲得用於冷凍保存的1×107 個細胞所需之細胞體積。 8.5.75 如果適用的話：移出用於冷凍保存之樣本。在BSC中，使用適當大小的注射器，自TIL懸浮液轉移包移出計算體積(步驟8.5.74C)。放入適當大小的錐形管並標示為「冷凍保存樣本1×107 細胞」、日期及批號。將紅色蓋子(W3012845)蓋在TIL懸浮液轉移包上。 8.5.76 如果適用的話：將TIL放在培育箱中。將TIL懸浮轉移包放在培育箱中直到需要為止。 8.5.77 如果適用的話：冷凍保存樣本。根據下列參數，離心「冷凍保存樣本1×107 細胞」：速度：350×g，時間：10:00分鐘，溫度：室溫，煞車：全速(9)，加速：全速(9)。注意：確保在離心機上設定速度及時間的適當單位。 8.5.78 如果適用的話：觀察錐形管。記錄觀察值：有無團塊?上清液是否透明?  *注意：如果任一答案為否，聯絡地區管理。 8.5.79 如果適用的話：添加CS-10。在BSC中，無菌地抽吸上清液。輕柔拍打管底部以將細胞重懸於剩餘流體中。 8.5.80 如果適用的話：添加CS-10。緩慢添加  0.5mL的CS10。記錄添加的體積。 8.5.81 如果適用的話：標示小瓶。用QA配發的標籤標示小瓶。 8.5.82 如果適用的話：填充小瓶。將重懸體積等分至標示的冷凍小瓶中。 8.5.83 如果適用的話：填充空白。將另一個小瓶填充0.5mL的CS10並標示為「空白」。 8.5.84 如果適用的話：記錄填充的小瓶數量，但不包括「空白」。冷凍保存填充約0.5mL的樣本小瓶 8.5.85 如果適用的話：環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 8.5.86 回顧第8.5節 8.6 第11天，餵養細胞 8.6.1 獲得餵養細胞。自LN2冷凍器獲得3袋至少二個不同批號的餵養細胞。將細胞保持在乾冰上直到準備解凍為止。注意：第8.6節可與第8.5節同時執行。 8.6.2 獲得餵養細胞。記錄餵養細胞的細胞資訊。確認獲得至少二個不同批量的餵養細胞。 8.6.3 製備水浴或Cryotherm。製備水浴器或Cytotherm用於餵養細胞解凍。 8.6.4 解凍餵養細胞。將餵養細胞袋放入基於批號之個別夾鏈袋中，並在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解凍約3至5分鐘或直到冰開始消失。在以下記錄計時器的解凍時間。 8.6.5 餵養細胞制具製備。將4S-4M60接合(按照過程注意事項5.11)至CC2 Cell Connect (W3012820)，用4S-4M60歧管的4穿刺針端在(G)處置換為Cell Connect設備的單一穿刺針(B)。將H接合至G。 8.6.6 如果適用的話：自培育箱移出培養基。將步驟8.4.34製備的餵養細胞CM2培養基轉移包自培育箱移出。 8.6.7 附接培養基轉移包。將「餵養細胞CM2培養基」轉移包接合(按照過程注意事項5.11)至CC2魯爾。注意：該袋將用無針注射埠附接至制具側邊。 8.6.8 轉移制具。將含有完全CM2第11天培養基的總成轉移至BSC中。 8.6.9 匯合解凍的餵養細胞。在BSC內，抽取10mL的空氣至100mL注射器中。使用此置換CC2上的60mL注射器。 8.6.10 匯合解凍的餵養細胞。在移除罩蓋之前，用酒精棉擦拭餵養細胞袋上的每個埠。使用CC2的三支穿刺針穿刺三個餵養細胞袋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。 8.6.11 匯合解凍的餵養細胞。打開活栓，使得來自餵養細胞袋的管線打開且通往無針注射埠的管線關閉。 8.6.12 匯合解凍的餵養細胞。抽取餵養細胞袋的內容物至注射器中。所有三個袋子同時抽光。一旦餵養細胞袋已抽光，在維持注射器壓力下，將通往餵養細胞袋的管線夾住。 8.6.13 記錄餵養細胞的體積。不要脫附以下的注射器：來自制具的注射器。記錄注射器中餵養細胞的總體積。 8.6.14 添加餵養細胞至轉移包。轉動活栓，使得通往餵養細胞袋的管線關閉且通往培養基轉移包的管線打開。確保通往培養基轉移包的管線沒有夾住。 8.6.15 添加餵養細胞至轉移包。自注射器分配餵養細胞至「餵養細胞CM2培養基」轉移包。夾住通往含有餵養細胞的轉移包的管線並留下附接至制具的注射器。 8.6.16 混合匯合的餵養細胞。按摩袋子以混合轉移包中匯合的餵養細胞。 8.6.17 標示轉移包。將袋子標示為「餵養細胞懸浮液」及批號。 8.6.18 計算轉移包中的總體積。計算餵養細胞懸浮液的總體積。 8.6.19 移出細胞計數樣本。每個樣本使用分開的3mL注射器，使用無針注射埠從餵養細胞懸浮液轉移包抽取4×1.0mL細胞計數樣本。將各樣本等分至步驟8.4.27標示的冷凍小瓶中。注意：用無菌酒精棉(W3009488)擦拭無針注射埠且在每次細胞計數取樣之間混合餵養細胞懸浮液。 8.6.20 執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至標示批號及「用於細胞計數稀釋」之4.5mL的AIM-V培養基中，稀釋細胞計數樣本。此將給出1:10稀釋。如有需要加以調整。 8.6.21 記錄細胞計數。樣本體積 8.6.22 判定倍增因數 8.6.23 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 8.6.24 記錄來自Nucleoview的檔案名稱、存活性及細胞計數。 8.6.25 判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.6.26 判定計數上限及下限。 8.6.27 兩次計數是否皆在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則執行步驟8.6.28至8.6.35中的第二組計數。 8.6.28 如果適用的話：執行細胞計數。按照SOP-00314及過程注意事項5.14，利用NC-200執行細胞計數及計算。 注意：稀釋可根據預期細胞濃度調整。 8.6.29 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0。 8.6.30 如果適用的話：判定倍增因數。 8.6.31 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0。 8.6.32 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.6.33 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.6.34 如果適用的話：判定計數上限及下限。 8.6.35 如果適用的話：計數是否在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.6.36以找出總平均存活細胞濃度且繼續進行計算。 8.6.36 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度。 8.6.37 調整餵養細胞懸浮液的體積。在移除細胞計數樣本後，計算餵養細胞懸浮液的調整體積。來自步驟8.6.18C的總餵養細胞體積減去移出的4.0 ml。 8.6.38 計算總存活餵養細胞。 如果總存活細胞＜ 5×109 ，則進行步驟8.6.39。如果總存活細胞≥ 5×109 ，則進行步驟8.5.70。 8.6.39 如果適用的話：獲得額外的餵養細胞。自LN2冷凍器獲得額外的餵養細胞袋。將細胞保持在乾冰上直到準備解凍為止。 8.6.40 如果適用的話：獲得額外的餵養細胞。記錄餵養細胞的細胞資訊。 8.6.41 如果適用的話：解凍額外的餵養細胞。將第4個餵養細胞細胞袋放入夾鏈袋中，並在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解凍約3至5分鐘或直到冰開始消失。記錄解凍時間。 8.6.42 如果適用的話：匯合額外的餵養細胞。在BSC中，抽取10 mL的空氣至新的100mL注射器中。使用此置換制具上的注射器。 8.6.43 如果適用的話：匯合額外的餵養細胞。在移除罩蓋之前，用酒精棉擦拭餵養細胞袋上的埠。使用步驟8.6.7所製備的制具之剩餘穿刺針中一者穿刺餵養細胞袋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。 8.6.44 如果適用的話：匯合額外的餵養細胞。打開活栓，使得來自餵養細胞袋的管線打開且通往無針注射埠的管線關閉。 8.6.45 如果適用的話：匯合額外的餵養細胞。抽取餵養細胞袋的內容物至注射器中。記錄體積。 8.6.46 如果適用的話：測量體積。測量注射器中的餵養細胞體積且記錄於下(B)。計算餵養細胞的新總體積。 8.6.47 如果適用的話：添加餵養細胞至轉移包。轉動活栓，使得通往餵養細胞袋的管線關閉且通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的管線打開。確保通往轉移包的管線沒有夾住。自注射器分配餵養細胞至「餵養細胞懸浮液」轉移包。夾住通往轉移包的管線並留下附接至制具的注射器。 8.6.48 如果適用的話：添加餵養細胞至轉移包。按摩袋子以混合餵養細胞懸浮液轉移包中匯合的餵養細胞。 8.6.49 如果適用的話：製備稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V培養基至四個15mL錐形管。將管標示批號及管編號(1至4)。將4支冷凍小瓶標示「額外的餵養細胞」及小瓶編號(1至4)。 8.6.50 如果適用的話：製備細胞計數。每個樣本使用分開的3mL注射器，使用無針注射埠從餵養細胞懸浮液轉移包移出4×1.0mL細胞計數樣本。將各樣本等分至步驟8.6.49標示的冷凍小瓶中。注意：用無菌酒精棉擦拭無針注射埠且在每次細胞計數取樣之間混合餵養細胞懸浮液。 8.6.51 如果適用的話：執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至標示批號及「用於細胞計數稀釋」之4.5mL的AIM-V培養基中，稀釋細胞計數樣本。此將給出1:10稀釋。如有需要加以調整。 8.6.52 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。 8.6.53 如果適用的話：判定倍增因數 8.6.54 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 8.6.55 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的檔案名稱、存活性及細胞計數。 8.6.56 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.6.57 如果適用的話：判定計數上限及下限。 兩次計數是否皆在允收界限內?注意：如果任一結果為「否」，則執行步驟8.5.59至8.5.65中的第二組計數 8.6.59 如果適用的話：執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。注意：稀釋可根據預期細胞濃度調整。 8.6.60 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.6.61 如果適用的話：判定倍增因數。 8.6.62 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.6.63 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數。 8.6.64 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.6.65 如果適用的話：判定計數上限及下限 8.6.66 如果適用的話：計數是否在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.6.67以找出總平均存活細胞濃度且繼續進行計算。 8.6.67 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度。 8.6.68 如果適用的話：調整餵養細胞懸浮液的體積。在移除細胞計數樣本後，計算餵養細胞懸浮液的調整體積。來自步驟8.6.46C的總餵養細胞體積減去移出的4.0 mL。 8.6.69 如果適用的話：計算總存活餵養細胞。 *圈起用於判定存活細胞濃度的步驟參考。 8.6.70 計算餵養細胞的體積。計算要獲得5×109 存活餵養細胞所需之餵養細胞懸浮液的體積。 *圈起適用的步驟 8.6.71 計算過量的餵養細胞體積。計算要移除之過量餵養細胞的體積。向下捨入至最靠近的整數。 *圈起適用的步驟 8.6.72 移除過量餵養細胞。在新的100mL注射器中，抽取10mL的空氣並將注射器附接至制具。 8.6.73 移除過量餵養細胞。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的管線。使用注射器抽取步驟8.6.71C所計算的餵養細胞體積加上來自轉移包之額外的10.0mL至100mL注射器。一旦移除餵養細胞體積，關閉通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。不要移除最終注射器。注意：一旦注射器已填滿，用新的注射器置換。多支注射器可用於移除總體積。使用每支新的注射器時，抽取10mL的空氣。 8.6.74 記錄體積。記錄移除餵養細胞的總體積(包括額外10mL)。 8.6.75 添加OKT3。在BSC中，使用1.0mL注射器及16G針頭，抽取0.15mL的OKT3。 8.6.76 添加OKT3。將注射器的針頭無菌地移除並將注射器附接至無針注射埠。注射OKT3。 8.6.77 添加OKT3。打開通往「餵養細胞懸浮液」轉移包的活栓並添加步驟8.6.73移除的10mL餵養細胞以將OKT3沖過管線。 8.6.78 添加OKT3。將注射器由上翻轉向下並推注空氣以清除通往餵養細胞懸浮液轉移包的管線。 8.6.79 添加OKT3。將剩餘的餵養細胞懸浮液留在注射器中。關閉所有管夾並將制具從BSC移出。 8.6.80 熱封。將餵養細胞懸浮液轉移包熱封(按照過程注意事項5.12)，留下足夠管路以接合。丟棄制具。 8.6.81 回顧第8.6節 8.7 第11天，G-Rex填充及接種 8.7.1 設置G-Rex500MCS。在BSC外，將G-Rex500MCS自包裝移出並檢視培養瓶有無任何裂縫或管路扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。關閉G-Rex500MCS管線上的所有管夾，但通氣孔過濾器管線除外。使用奇異筆在4.5L刻度處畫一條線。 8.7.2 自培育箱移出培養基。自培育箱移出步驟8.4.35製備的「完全CM2第11天培養基」。 8.7.3 準備泵送培養基。將G-Rex500MCS的紅色管線與附接至完全CM2第11天培養基的repeater泵轉移組接合(按照過程注意事項5.11)。 8.7.4 準備泵送培養基。將「完全CM2第11天培養基」袋子吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。 8.7.5 泵送培養基至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」。泵送4.5L的培養基至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶在步驟8.7.1標示的線。 8.7.6 熱封。在靠近步驟8.7.3所產生的接合處熱封G-Rex500MCS的紅色管線(按照過程注意事項5.12)。 8.7.7 標示培養瓶。將培養瓶標示附接樣本第11天QA提供的過程中「第11天」標籤。 8.7.8 如果適用的話：培育培養瓶。在等待接種TIL時，將培養瓶保持在培育箱中。 8.7.9 將餵養細胞懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合(按照過程注意事項5.11)至「餵養細胞懸浮液」轉移包。 8.7.10 添加餵養細胞至G-Rex500MCS。打開餵養細胞懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加餵養細胞懸浮液至培養瓶。確保管線已被完全清除。 8.7.11 熱封。在靠近步驟8.7.9所產生的接合處熱封(按照過程注意事項5.12)紅色管線。 8.7.12 將TIL懸浮液轉移包接合至培養瓶。將G-Rex500MCS紅色管線無菌接合(按照過程注意事項5.11)至「TIL懸浮液」轉移包。 8.7.13 添加TIL至G-Rex500MCS。打開TIL懸浮液與G-Rex500MCS之間的所有管夾並藉由重力饋送添加TIL懸浮液至培養瓶。確保管線已被完全清除。 8.7.14 熱封。在靠近步驟8.7.12所產生的接合處熱封(按照過程注意事項5.12)紅色管線以移除TIL懸浮液袋。 8.7.15 培育G-Rex500MCS。檢查G-Rex500MCS的所有管夾皆已關閉(大過濾器管線除外)，並放在培育箱中。培育箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。 8.7.16 計算培育窗。執行計算以判定在第16天將G-Rex500MCS移出培育箱的適當時間。培育時間(步驟8.7.15)。下限：培育時間+108小時。上限：培育時間+132小時。 8.7.17 環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 8.7.18 提交樣本。提交樣本至Login。 8.7.19 回顧第8.7節 8.8 第11天，過量TIL冷凍保存 8.8.1 如果適用的話：冷凍過量的TIL小瓶。驗證CRF已在冷凍之前設置。執行冷凍保存。 8.8.2 如果適用的話：開始CRF。記錄放入CRF中的小瓶總數(不包括空白)。驗證轉移至CRF中的小瓶數量符合步驟8.5.72或步驟8.5.84、步驟8.5.72C或步驟8.5.84製備的小瓶總數 8.8.3 如果適用的話：起始冷凍配置的自動化部分。記錄起始冷凍配置的自動化部分的開始時間。 8.8.4 如果適用的話：將小瓶從控速冷凍器轉移至適當儲存。在完成冷凍後，將小瓶從CRF轉移至適當儲存容器。 8.8.5 如果適用的話：將小瓶轉移至適當儲存。記錄LN2中的儲存位置。 8.8.6 回顧第8.8節 8.9 第16天，培養基製備 8.9.1 預熱AIM-V培養基。將三個CTS AIM V 10L培養基袋在使用前至少12小時自2至8℃移出並放在室溫下避免光照。驗證各袋子在到期日內。標示各袋的袋子編號(1至3)、批號、日期及「溫熱開始時間HHMM」。記錄溫熱開始時間及日期。 8.9.2 計算來自步驟8.9.1之培養基的溫熱時間。計算來自步驟8.9.1之培養基袋1、2及3的溫熱時間。確保所有袋已溫熱一段介於12與24小時之間的期間。 8.9.3 檢查室內衛生、管線廓清及材料。確認室內衛生、管線廓清及材料。 8.9.4 確保填寫前處理表。 8.9.5 環境監測。在處理之前，確保前處理環境監測已起始。 8.9.6 設置10L Labtainer用於上清液。在BSC中，將流體泵轉移組的較大直徑端使用魯爾接頭附接至10L Labtainer袋子的一個母埠。 8.9.7 設置10L Labtainer用於上清液。標示為「上清液」及批號。 8.9.8 設置10L Labtainer用於上清液。在自BSC移出之前，確保所有管夾關閉。注意：在TIL收集期間(第8.10節)使用上清液袋，該TIL收集可與培養基製備同時執行。 8.9.9 解凍IL-2。每袋CTS AIM V培養基解凍5×1.1mL等分試樣的IL-2(6×106 IU/mL) (BR71424)直到所有冰熔化。記錄IL-2批號及到期日。附接IL-2標籤。 8.9.10 等分GlutaMax。在BSC中，將100.0mL的Glutamax等分至適當大小接受器中。記錄添加至各接受器的體積。 注意：起初遵照步驟8.9.10至步驟8.9.28製備一袋AIM-V培養基。所需的額外袋在步驟8.10.59判定。 8.9.11 標示接受器。標示各接受器為「GlutaMax」。 8.9.12 添加IL-2至GlutaMax。使用微量吸管，添加5.0mL的IL-2至各GlutaMax接受器。確保按照過程注意事項 5.18潤洗吸管尖，並且添加每mL使用新的吸管尖。在以下記錄添加至各Glutamax接受器的體積。 8.9.13 標示接受器。標示各接受器為「GlutaMax+IL-2」及接受器編號。 8.9.14 製備用於調配之CTS AIM V培養基袋。確保CTS AIM V 10L培養基袋(W3012717)在使用前12至24小時在室溫下溫熱且避免光照。記錄結束培育時間於步驟8.9.2。 8.9.15 製備用於調配之CTS AIM V培養基袋。在BSC中，關閉4”血漿轉移組上的管夾，接著使用穿刺針埠連接至該袋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。 8.9.16 製備用於調配之CTS AIM V培養基袋。將repeater泵流體轉移組的較大直徑端經由魯爾連接至4”血漿轉移組。 8.9.17 裝設Baxa泵。將Baxa泵緊鄰BSC裝設。將repeater泵流體轉移組的泵管路部分從BSC移出並安裝至repeater泵中。 8.9.18 準備調配培養基。在BSC中，移除Pumpmatic Liquid-Dispensing System (PLDS)的注射器並丟棄。注意：確保不破壞PLDS吸管的無菌性。 8.9.19 準備調配培養基。將PLDS吸管經由魯爾連接連接至repeater泵流體轉移組的較小直徑端，並將吸管尖放入步驟8.9.13製備的「GlutaMax+IL-2」中進行抽吸。 打開介於接受器與10L袋子之間的所有管夾。 8.9.20 泵送GlutaMax+IL-2至袋中。設定泵速至「中」及「3」並將所有「GlutaMax+IL-2」泵送至10L CTS AIM V培養基袋中。一旦沒有剩餘溶液，清除管線並停止泵。在以下記錄添加至每個Aim V袋之含有IL-2之GlutaMax的體積。記錄/ 8.9.21 移除PLDS。確保所有管夾關閉，並將PLDS吸管從repeater泵流體轉移組移除。移除repeater泵流體轉移組並將4”血漿轉移組蓋上紅色蓋子。 8.9.22 標示袋子。標示所製備的每袋「完全CM4第16天培養基」。 8.9.23 按照樣本計畫移除培養基保留。使用30mL注射器，藉由將注射器附接至4”血漿轉移組移出20.0mL的「完全CM4第16天培養基」，並分配樣本至50mL錐形管中。 注意：僅自所製備的第一袋培養基移除培養基保留樣本。注意：在移除注射器後，確保4”血漿轉移組用管夾夾住或用紅色蓋子蓋住。 8.9.24 附接新的repeater泵流體轉移組。將新的流體泵轉移組的較大直徑端附接至連接至「完全CM4第16天培養基」袋子的4”血漿轉移組上。 8.9.25 標示且儲存樣本。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存培養基保留樣本直到提交至Login進行測試為止。 8.9.26 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.9.27 監測培育箱。監測培育箱。如果適用的話，按照步驟8.9.10監測所製備的額外袋。培育箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。 8.9.28 溫熱完全CM4第16天培養基。在培育箱中溫熱第一袋完全CM4第16天培養基≥ 30分鐘，直到準備使用為止。如果適用的話，按照步驟8.10.59，溫熱額外袋。 8.9.29 製備稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示批次紀錄批號及「用於細胞計數稀釋」之AIM-V培養基至各4×15mL錐形管。將錐形管標示批號及管編號(1至4)。將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。 將小瓶保持在BSC下待步驟8.10.31使用。 8.9.30 回顧第8.9節 8.10 第16天REP分瓶 8.10.1 前處理表。 8.10.2 監測培育箱。監測培育箱。培育箱參數： 溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2 8.10.3 自培育箱移出G-Rex500MCS。將G-Rex500MCS自培育箱移出前，執行以下檢查以確保符合培育參數。 自培育箱移出G-Rex500MCS。 8.10.4 設置1L轉移包。按照過程注意事項5.12將1L轉移包(W3006645)熱封，留下約12”的管線。 8.10.5 製備1L轉移包。將1L轉移包標示為TIL懸浮液。 8.10.6 秤重1L轉移包。將1L轉移包(包括完整管線)放在磅秤上並記錄乾重。 8.10.7 GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色培養基移除管線無菌接合(按照過程注意事項5.11)至步驟8.9.8所製備之10L labtainer袋「上清液」上的repeater泵轉移組。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線無菌接合至步驟8.10.5所製備的TIL懸浮液轉移包。 8.10.8 GatheRex設置。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液labtainer袋及TIL懸浮液轉移包放在右側。 8.10.9 GatheRex設置。將來自G-Rex500MCS的紅色培養基移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。 8.10.10 GatheRex設置。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500 MCS的無菌過濾器。注意：在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。 8.10.11 G-Rex500MCS的體積減少。按照SOP-01777，將約4.5L的培養上清液從G-Rex500MCS轉移至10L Labtainer。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且培養基減少至抽吸液浸管的末端。注意：如果GatheRex提早停止，可再次按壓箭頭向右按鍵以重新開始。 8.10.12 製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。 8.10.13 起始TIL收集。記錄TIL收集的開始時間。 8.10.14 起始TIL收集。劇烈拍打培養瓶並渦漩培養基以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。注意：如果細胞沒有脫附，聯絡地區管理。 8.10.15 起始TIL收集。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。注意：如果細胞收集吸管不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位吸管。 8.10.16 TIL收集。放開所有通往TIL懸浮液轉移包的管夾。 8.10.17 TIL收集。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確定維持傾斜邊緣直到所有細胞及培養基皆已收集。 8.10.18 TIL收集。檢視膜上有無附著細胞。 8.10.19 潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗培養基覆蓋約1/4的氣體交換膜。 8.10.20 關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保G-Rex500MCS上的所有管夾皆關閉。 8.10.21 熱封。在含有TIL的轉移包盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以使整體管路長度維持大約相同。 8.10.22 熱封。將含有上清液之10L Labtainer熱封(按照過程注意事項5.12)並傳遞至BSC中進行步驟8.10.25的樣本收集。 8.10.23 計算TIL懸浮液體積。記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算體積懸浮液。 8.10.24 製備轉移包以進行樣本移除。將4”血漿轉移組接合(按照過程注意事項5.11)至來自步驟8.10.21之TIL懸浮液轉移包，留下盡量靠近袋子附接的母魯爾端。 8.10.25 移除細胞上清液的測試樣本。在BSC中，使用母魯爾埠及適當大小的注射器，自10L labtainer移出10.0 mL的上清液。放入15mL錐形管中並標示「BacT」。保留該管以用於步驟8.10.28之BacT樣本。 8.10.26 移除細胞上清液的測試樣本。使用分開的注射器，移出10.0 mL的上清液並放入15mL錐形管中。保留該管以用於步驟8.10.32之黴漿菌樣本。標示管為「黴漿菌稀釋劑」 8.10.27 關閉上清液袋。將紅色蓋子蓋在魯爾埠上以關閉袋，並傳遞出BSC。 8.10.28 無菌性及BacT測試取樣。在BSC中，使用適當大小的注射器自步驟8.10.25製備的標示BacT之15 mL錐形管移出1.0mL樣本並接種厭氧瓶。 重複上述於好氧瓶。注意：此步驟可不按順序執行。 8.10.29 標示且儲存樣本。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在室溫下避光儲存BacT樣本直到提交至Login進行測試為止。注意：標籤不可遮蓋瓶上的條碼。 8.10.30 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.10.31 移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包的魯爾連接移出4×1.0 mL細胞計數樣本。將樣本放入步驟8.9.29製備的冷凍小瓶。 8.10.32 移出黴漿菌樣本。使用3mL注射器，自TIL懸浮液轉移包移出1.0 mL並放入步驟8.10.26製備的標示「黴漿菌稀釋劑」的15 mL錐形管中。 8.10.33 標示且儲存樣本。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存黴漿菌樣本直到提交至Login進行測試為止。 8.10.34 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.10.35 製備用於接種之轉移包。在BSC中，將repeater泵流體轉移組的大直徑管路端附接至含有TIL之轉移包上的魯爾應接器。使用止血鉗夾住靠近轉移包的管線。將紅色蓋子蓋在轉移組的端上。 8.10.36 將TIL放入培育箱中。將細胞懸浮液從BSC移出並放入培育箱直到需要為止。記錄時間。 8.10.37 執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至步驟8.9.29製備的4.5mL的AIM-V培養基中稀釋細胞計數樣本。此給出1:10稀釋。 8.10.38 記錄細胞計數樣本體積 8.10.39 判定倍增因數。 8.10.40 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 8.10.41 記錄來自Nucleoview的檔案名稱、存活性及細胞計數。 8.10.42 判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.10.43 判定計數上限及下限。 8.10.44 兩次計數是否皆在允收界限內? 8.10.45 如果適用的話：執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。注意：稀釋可根據預期細胞濃度調整。 8.10.46 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.10.47 如果適用的話：判定倍增因數。 8.10.48 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.10.49 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.10.50 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.10.51 如果適用的話：判定計數上限及下限。 8.10.52 如果適用的話：計數是否在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.10.53以判定所收集之所有細胞計數的平均值。 8.10.53 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度。 8.10.54 調整TIL懸浮液的體積。在移除細胞計數樣本後，計算TIL懸浮液的調整體積。來自步驟8.10.23C的總TIL細胞體積減去移出用於測試的5.0 mL。 8.10.55 計算總存活TIL細胞。 8.10.56 計算用於繼代培養之培養瓶。計算要接種的培養瓶總數。注意：將G-Rex500MCS培養瓶的數量進位以求出最近的整數。 注意：欲接種之G-Rex500MCS培養瓶的最大數量為5。如果計算出的欲接種培養瓶數量超過5，使用可用細胞懸浮液的全部體積僅接種5瓶 8.10.57 計算繼代培養之培養瓶數量 8.10.58 QA回顧步驟8.10.38至8.10.57所執行的細胞計數計算。 8.10.59 判定需要的額外培養基袋數量。計算除了步驟8.9.28製備的袋子之外所需的培養基袋數量。 *將所需的培養基袋數量進位至下一個整數。 8.10.60 如果適用的話：製備額外培養基。步驟8.10.59D中計算之所需的每二個G-Rex-500M培養瓶製備一個10L「CM4第16天培養基」袋。進行步驟8.10.62並接種第一GREX-500M培養瓶，同時製備並溫熱額外培養基。 8.10.61 如果適用的話：製備額外培養基袋。製備及溫熱步驟8.10.59D判定的計算數量的額外培養基袋，重複步驟8.9.10至步驟8.9.28。 8.10.62 填充G-Rex500MCS。在檯面上打開G-Rex500MCS並檢視瓶身是否有裂縫或管路是否扭結。確保所有魯爾緊密連接及封閉。用奇異筆在培養瓶外面4500mL刻度處畫一條線。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。 8.10.63 填充G-Rex500MCS。將G-Rex500MCS的紅色培養基管線無菌接合(按照過程注意事項5.11)至步驟8.9.28所製備之培養基袋上的流體轉移組。 8.10.64 準備泵送培養基。將「CM4第16天培養基」吊掛在IV點滴架上。將泵管路裝入Baxa泵。 8.10.65 泵送培養基至G-Rex500MCS中。將Baxa泵設定至「高」及「9」且泵送4500mL的培養基至培養瓶中。泵送4.5L的「CM4第16天培養基」至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶在步驟8.10.62標示的線。一旦已轉移4.5L的培養基，停止泵。 8.10.66 熱封。在靠近步驟8.10.63所產生的接合處熱封(按照過程注意事項5.12)G-Rex500MCS的紅色培養基管線，移除培養基袋子。 8.10.67 重複填充。在溫熱及製備供使用的培養基時，對步驟8.10.56C所計算的每個培養瓶重複步驟8.10.62至8.10.66。 注意：可使用重力填充或多個泵，同時填充多個培養瓶。注意：每袋培養基僅填充二個培養瓶。 8.10.68 記錄並標示填充的培養瓶。在填充時以字母及QA提供的過程中「第16天」標籤標示每個培養瓶。 8.10.69 樣本標示。在以下附接樣本「第16天」標籤。 8.10.70 如果適用的話：培育培養瓶。在等待接種TIL時，將培養瓶保持在培育箱中。 8.10.71 驗證填充的培養瓶數量。記錄填充的培養瓶總數。 8.10.72 計算要添加的細胞懸浮液體積。計算要添加至新的G-Rex500MCS培養瓶之TIL懸浮液的目標體積。 8.10.56C超過5個，使用細胞懸浮液的全部體積僅接種5瓶。 8.10.73 製備用於接種之培養瓶。自培育箱移出步驟8.10.70的G-Rex500MCS。 8.10.74 準備泵送。關閉G-Rex500MCS上的所有管夾，但大過濾器管線除外。將泵管路裝入Baxa泵。 8.10.75 自培育箱移出TIL。將「TIL懸浮液」轉移包從培育箱移出並記錄培育結束時間於步驟8.10.36。 8.10.76 製備用於接種之細胞懸浮液。將來自步驟8.10.75的「TIL懸浮液」轉移包無菌接合(按照過程注意事項5.11)至泵入口管線。 8.10.77 磅秤歸零。將TIL懸浮液袋放在磅秤上。使用設定至「低」及「2」的Baxa泵，自TIL懸浮液袋灌注管線至接合處。將磅秤歸零。 8.10.78 用TIL懸浮液接種培養瓶。將Baxa泵設定至「中」及「5」。泵送步驟8.10.72C所計算之體積的TIL懸浮液至培養瓶中。記錄添加至每個培養瓶中之TIL懸浮液的體積。 8.10.79 熱封。將「TIL懸浮液」轉移包熱封(按照過程注意事項5.12)，留下足夠管路以接合至下一個培養瓶。 使用管線清除器(line stripper)清除G-Rex培養瓶管線中的殘餘TIL懸浮液至容器中。 8.10.80 填充剩餘培養瓶。在每個接種的培養瓶之間，確保混合「TIL懸浮液」轉移包並重複步驟8.10.76至8.10.79以接種所有剩餘培養瓶。依照字母順序填充培養瓶。 8.10.81 監測培育箱。注意：如果培養瓶必須分至兩個培育箱，確保監測兩者。培育箱參數：溫度LED顯示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5 %CO2。 8.10.82 培育培養瓶。記錄每個培養瓶放入培育箱中的時間。 8.10.83 計算培育窗。執行以下計算以判定在第22天將G-Rex500MCS移出培育箱的時間範圍。 8.10.84 環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 8.10.85 樣本提交。確保所有第16天樣本提交至Login。 8.10.86 回顧第8.10節。 8.11 第22天，洗滌緩衝液製備 8.11.1 檢查室內衛生、管線廓清及材料。 8.11.2 確保填寫前處理檢核表。 8.11.3 環境監測。在處理之前，確保前處理環境監測已執行。 8.11.4 製備10 L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾連接將4”血漿轉移組附接至10L Labtainer袋。 8.11.5 製備10 L Labtainer袋。標示「上清液」、批號及首字母/日期。 8.11.6 製備10 L Labtainer袋。轉移出BSC之前關閉所有管夾。注意：每二個所欲收集的G-Rex500MCS培養瓶製備一個10L Labtainer袋。注意：第8.12節使用上清液袋，該節可與第8.11節同時運行。 8.11.7 接合流體轉移組。在BSC外，關閉4S-4M60上的所有管夾。將repeater流體轉移組接合(按照過程注意事項5.11)至4S-4M60的一個公魯爾端。 8.11.8 將材料傳遞至BSC中。將Plasmalyte-A及人類白蛋白25%傳遞至BSC中。將4S-4M60及repeater流體轉移組總成傳遞至BSC中。 8.11.9 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。將三袋Plasmalyte-A用4S-4M60接頭組穿刺。注意：在移除埠罩蓋之前，用酒精拭子(W3009488)擦拭埠罩蓋。注意：在將穿刺針轉向一個方向時維持恆壓。確保不要穿刺埠側邊。 8.11.10 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。將Origen 3000mL收集袋經由魯爾連接連接至repeater泵轉移組的較大直徑端。 8.11.11 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。關閉3000mL Origen袋之未使用管線上的管夾。 8.11.12 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。將Baxa泵緊鄰BSC裝設。將轉移組管路裝入位在BSC外之Baxa泵。將泵設定至「高」及「9」。 8.11.13 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。打開自Plasmalyte-A至3000mL Origen袋的所有管夾。 8.11.14 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。泵送所有Plasmalyte-A至3000 mL Origen袋中。一旦已轉移所有Plasmalyte-A，停止泵。 8.11.15 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。如有需要，藉由逆轉泵及操作袋子的位置，自3000mL Origen袋移除空氣。 8.11.16 泵送Plasmalyte至3000mL袋中。關閉所有管夾。 將3000mL袋子經由魯爾連接自repeater泵流體轉移組移除並將紅色蓋子(W3012845)蓋在通往袋子的管線上。 8.11.17 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。打開通氣的迷你穿刺針。不破壞穿刺針的無菌性，確保藍色蓋子穩固蓋好。 8.11.18 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。用通氣的迷你穿刺針穿刺人類白蛋白25%瓶子的隔膜。注意：確保不破壞穿刺針的無菌性。 8.11.19 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。重覆步驟8.11.17至步驟8.11.18二次，總共穿刺三(3)次人類白蛋白25%瓶子。 8.11.20 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。移除一個通氣的迷你穿刺針的藍色蓋子並將60mL注射器附接至人類血清白蛋白25%瓶子。 8.11.21 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。抽取60mL的人類血清白蛋白25%。注意：可能需要使用超過一瓶人類血清白蛋白25%。如有需要，將注射器與通氣的迷你穿刺針去連接並將注射器連接至在人類血清白蛋白25%瓶子中的下一個通氣的迷你穿刺針。不要移除人類血清白蛋白25%瓶子的通氣的迷你穿刺針。 8.11.22 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。一旦獲得60mL，將注射器自通氣的迷你穿刺針移除。 8.11.23 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。將注射器附接至在步驟8.11.16中填充Plasmalyte-A之3000mL Origen袋子上的無針注射埠。分配所有人類白蛋白25%。注意：每次使用前用酒精棉擦拭無針注射埠。 8.11.24 添加人類白蛋白25%至3000mL袋子。重複步驟8.11.20至步驟8.11.23以獲得最終體積120.0 mL的人類白蛋白25%。 8.11.25 混合袋子。在添加所有人類白蛋白25%後，輕柔混合袋子。 8.11.26 標示袋子。標示為「LOVO洗滌緩衝液」及批號並指定24小時到期日。 8.11.27 製備IL-2稀釋劑。使用10mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋子上的無針注射埠移出5.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。分配LOVO洗滌緩衝液至50mL錐形管中並標示為「IL-2稀釋劑」及批號。注意：每次使用前用酒精棉擦拭無針注射埠。 8.11.28 等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100mL注射器，自無針注射埠抽取70.0 mL的LOVO洗滌緩衝液。注意：每次使用前用酒精棉擦拭無針注射埠。 8.11.29 等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。將紅色蓋子蓋在注射器上並標示為「空白冷凍袋」及批號。注意：將注射器保持在室溫下，直到步驟8.14.3需要為止。 8.11.30 完成洗滌緩衝液製備。關閉LOVO洗滌緩衝液袋上的所有管夾。 8.11.31 解凍IL-2。解凍一個1.1mL的IL-2 (6×106 IU/mL)直到所有冰熔化為止。記錄IL-2批號及到期日。注意：確保IL-2標籤已附接。 8.11.32 IL-2製備。添加50µL IL-2原液(6×106 IU/mL)至標示「IL-2稀釋劑」之50mL錐形管。 8.11.33 IL-2製備。將錐形管重新標示「IL-2 6×104 」、日期、批號及24小時到期日。蓋上蓋子並儲存在2至8˚C下。 8.11.34 冷凍保存製備。將5個冷凍卡匣放在2至8℃下前處理，以進行最終產物冷凍保存。 8.11.35 製備細胞計數稀釋。在BSC中，添加4.5mL的已標示批號及「用於細胞計數稀釋」之AIM-V培養基至4支分開的15mL錐形管。將管標示批次紀錄批號及管編號(1至4)。放在一旁以供步驟8.12.34使用 8.11.36 製備細胞計數。將4支冷凍小瓶標示小瓶編號(1至4)。將小瓶保持在BSC下待步驟8.12.33使用。 8.11.37 回顧第8.11節 8.12 第22天，TIL收集 8.12.1 監測培育箱。監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示：37±2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。注意：第8.12節可與第8.11節同時運行。 8.12.2 自培育箱移出G-Rex500MCS培養瓶。將G-Rex500MCS自培育箱移出前，執行以下檢查以確保符合培育參數。 注意：此步驟必須在每個培養瓶自培育箱移出時執行。 8.12.3 製備TIL收集袋。標示3000mL收集袋為「TIL懸浮液」、批號及首字母/日期。 8.12.4 密封多餘連接。按照過程注意事項5.12，將收集袋上的二個魯爾連接靠近每個連接末端處熱封。 8.12.5 GatheRex設置。將G-Rex500MCS的紅色培養基移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至步驟8.11.5製備之10L labtainer袋。注意：參照過程注意事項5.16關於多個GatheRex裝置的使用。 8.12.6 GatheRex設置。將G-Rex500MCS的透明細胞移除管線(按照過程注意事項5.11)無菌接合至步驟8.12.3製備之TIL懸浮液收集袋。注意：參照過程注意事項5.16關於多個GatheRex裝置的使用。 8.12.7 GatheRex設置。將G-Rex500MCS培養瓶放在GatheRex的左側。將上清液Labtainer袋及匯合的TIL懸浮液收集袋放在右側。 8.12.8 GatheRex設置。將來自G-Rex500MCS的紅色培養基移除管線安裝至GatheRex上的頂部管夾(標示紅色管線)及管路導引器。將來自G-Rex500MCS的透明收集管線安裝至GatheRex上的底部管夾(標示藍色管線)及管路導引器。 8.12.9 GatheRex設置。將來自GatheRex的氣體管線附接至G-Rex500MCS的無菌過濾器。注意：在從G-Rex500MCS移除上清液之前，確保細胞移除管線上的所有管夾皆已關閉。 8.12.10 體積減少。將約4.5L的上清液從G-Rex500MCS轉移至上清液袋。目視檢查G-Rex500MCS以確保培養瓶水平且培養基減少至抽吸液浸管的末端。若有需要重複步驟。注意：如果GatheRex提早停止，可再次按壓箭頭向右按鍵以重新開始。 8.12.11 製備培養瓶以進行TIL收集。在移除上清液後，將所有至紅色管線的管夾關閉。 8.12.12 起始TIL的收集。記錄TIL收集的開始時間。 8.12.13 起始TIL的收集。劇烈拍打培養瓶並渦漩培養基以釋放細胞。檢視培養瓶以確保所有細胞皆已脫附。將「TIL懸浮液」3000mL收集袋放在平坦表面上的乾擦巾上。注意：如果細胞沒有脫附，聯絡地區管理。 8.12.14 起始TIL的收集。傾斜培養瓶以確保管子位在培養瓶邊緣。注意：如果細胞收集管子不是位在側壁與底膜的交接處，當傾斜45度角時扣擊培養瓶通常足以正確地定位管子。 8.12.15 TIL收集。放開所有通往TIL懸浮液收集袋的管夾。 8.12.16 TIL收集。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000mL收集袋中。注意：維持傾斜邊緣直到所有細胞及培養基皆已收集。 8.12.17 TIL收集。檢視膜上有無附著細胞。 8.12.18 潤洗培養瓶膜。潤洗G-Rex500MCS的底部。用潤洗培養基覆蓋約1/4的氣體交換膜。 8.12.19 關閉G-Rex500MCS上的管夾。確保所有管夾皆已關閉。 8.12.20 熱封。在含有TIL的收集袋盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以使整體管路長度維持大約相同。 8.12.21 熱封。熱封(按照過程注意事項5.12)上清液袋子。 8.12.22 完成收集剩餘的G-Rex 500 MCS培養瓶。重複步驟8.12.2及8.12.5至8.12.21，將所有TIL匯合至相同的收集袋。 注意：每個第二培養瓶後必須置換10L上清液袋。注意：參照過程注意事項5.16關於多個GatheRex裝置的使用。 8.12.23 製備LOVO來源袋。獲得新的3000mL收集袋。標示為「LOVO來源袋」、批號及首字母/日期。 8.12.24 製備LOVO來源袋。將「LOVO來源袋」上的管路熱封(按照過程注意事項5.12)，移除母魯爾，留下足夠管線以接合。 8.12.25 秤重LOVO來源袋。將適當大小的塑膠籃放在磅秤上並歸零。將LOVO來源袋(包括埠及管線)放在籃中並記錄乾重 8.12.26 將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。關閉170 µm重力血液過濾器的所有管夾。 8.12.27 將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。將重力血液過濾器的長形末端無菌接合(按照過程注意事項5.11)至LOVO來源袋。 8.12.28 將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。將過濾器的二個來源管線其中一個無菌接合(按照過程注意事項5.11)至「匯合TIL懸浮液」收集袋。 8.12.29 將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。一旦接合完成，將過濾器上未使用的管線熱封(按照過程注意事項5.12)以移除。 8.12.30 將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。打開所有必要管夾並藉由將收集袋吊掛在IV點滴架上抬高TIL懸浮液，以起始TIL重力-流動轉移通過血液過濾器並進入LOVO來源袋。排放時輕柔轉動或揉捏TIL懸浮液袋以保持TIL為均勻懸浮液。 注意：不允許LOVO來源袋吊掛在過濾設備上。將LOVO來源袋平放在平坦表面上的乾擦巾上。 8.12.31 關閉所有管夾。一旦所有TIL皆轉移至LOVO來源袋，關閉所有管夾。 8.12.32 熱封。在盡可能靠近接合處熱封(按照過程注意事項5.12)，以移除重利血液過濾器。 8.12.33 移出細胞計數樣本。在BSC中，每個樣本使用分開的3mL注射器，自LOVO來源袋的無針注射埠移出4×1.0mL細胞計數樣本。將樣本放入步驟8.11.36製備的冷凍小瓶。注意：用酒精棉擦拭無針注射埠且在各樣本之間混合LOVO來源袋。 8.12.34 執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。最初藉由添加0.5mL的細胞懸浮液至步驟8.11.35製備的4.5mL的AIM-V培養基中稀釋細胞計數樣本。此給出1:10稀釋。 8.12.35 記錄細胞計數樣本體積。 8.12.36 判定倍增因數 8.12.37 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.12.38 記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.12.39 判定所執行的細胞計數之平均存活性、存活細胞濃度及總有核細胞濃度。 8.12.40 判定計數上限及下限 8.12.41 兩次計數是否皆在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則執行步驟8.12.42至8.12.49中的第二組計數。 8.12.42 如果適用的話：執行細胞計數。利用NC-200及過程注意事項5.14，執行細胞計數及計算。注意：稀釋可根據預期細胞濃度調整。 8.12.43 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積 8.12.44 如果適用的話：判定倍增因數 8.12.45 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.12.46 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.12.47 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活性、存活細胞濃度及總有核細胞濃度。 8.12.48 如果適用的話：判定計數上限及下限 8.12.49 如果適用的話：計數是否在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.12.50以判定平均值 8.12.50 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度及平均總有核細胞濃度。 8.12.51 QA回顧細胞計數。QA人員回顧步驟8.12.38至8.12.50所執行的計算。 8.12.52 秤重LOVO來源袋。將適當大小的塑膠籃放在磅秤上並歸零。將裝滿的LOVO來源袋放在籃中並記錄重量。計算細胞懸浮液的體積。 8.12.53 計算總存活TIL細胞。 *圈起用於判定存活細胞濃度的步驟參考。 **如果「是」的話，繼續進行。如果「否」，則聯絡地區管理。 8.12.54 計算總有核細胞。 *圈起用於判定總有核細胞濃度的步驟參考。 8.12.55 製備黴漿菌稀釋劑。在BSC中，自一個上清液袋經由魯爾樣本埠移出10.0 mL並放入15mL錐形管。 標示15mL錐形管「黴漿菌稀釋劑」且保持在BSC中以供步驟8.14.69使用。 8.12.56 回顧第8.12節 8.13 LOVO 8.13.1 使用儀器背面左側的開關打開LOVO。注意：步驟8.13.1至8.13.13可與第8.11至8.12節同時執行。 8.13.2 檢查磅秤及壓力感測器。 8.13.3 確保沒有東西吊掛在任何磅秤上且回顧各磅秤的讀數。記錄數值於步驟8.13.5。注意：如果任何磅秤的讀數超過0+/-2 g的範圍，執行磅秤校正 8.13.4 如果所有磅秤皆耐受無重量吊掛，則進行各磅秤(#1至4)上吊掛1-kg重量且回顧讀數。記錄數值於步驟8.13.5。 8.13.5 磅秤檢查。記錄各磅秤顯示的數值。如果數值在範圍內，則持續處理。如果數值不在範圍內，則執行校正。 8.13.6 回顧儀器作業配置螢幕上的壓力感測器讀數且記錄。壓力讀數的可接受範圍為0+/-10 mmHg。如果顯示值超出此範圍，按照機器說明，儲存新的大氣壓設定。 8.13.7 重複步驟。如果執行新的磅秤校正或儲存新的大氣壓設定，則重複步驟8.13.3至8.13.6。 8.13.8 從下拉式選單開始「TIL G-Rex收集(TIL G-Rex Harvest)」規程。 8.13.9 溶液1螢幕顯示：緩衝劑類型為PlasmaLyte 8.13.10至8.13.16 遵守LOVO觸控螢幕提示。 8.13.17 判定最終產物目標體積。 注意：使用來自步驟8.12.54 C的總有核細胞(TNC)值及以下表，判定最終產物目標體積。記錄最終產物體積(mL) 注意：如果來自步驟8.12.53 C之TVC ＞1.5×1011 ，則聯絡地區管理。 8.13.18至8.13.22 遵守LOVO觸控螢幕提示。 8.13.23 裝載拋棄式套組。在裝載拋棄式套組之前，用酒精棉隨後用無棉絨擦巾擦拭壓力感測器埠。裝載拋棄式套組。遵守螢幕指示裝載拋棄式套組。 8.13.24 移除濾液袋。當已裝載標準LOVO拋棄式套組，輕觸Next鍵。顯示容器資訊及位置螢幕(Container Information and Location Screen)。自磅秤移除濾液袋。 8.13.25 確保濾液容器是新的且離開磅秤(New and Off-Scale)。 8.13.26 輸入濾液容量。將LOVO Ancillary Bag無菌接合至現有濾液袋的公魯爾管線上。確保所有管夾打開且流體路徑為透明。輕觸濾液容器容量(Filtrate Container Capacity)輸入欄位。顯示數字鍵盤。輸入新的總濾液容量(5,000mL)。輕觸按鍵以接受輸入。注意：預估濾液體積不應超過5000 mL。 8.13.27 將濾液容器放在檯面上。注意：如果接合期間將管路移出F管夾，將管路放回管夾。將新的濾液容器放在檯面上。不要將濾液袋吊掛在3號磅秤上。3號磅秤在程序期間將是空的。 8.13.28 在變換至濾液容器後，遵守LOVO觸控螢幕提示。 8.13.29 確保套組裝載正確。顯示拋棄式套組乾式檢查(Disposable Kit Dry Checks)覆蓋。檢查套組裝載正確，且所有管夾皆打開。檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且可能的話進行改正。確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。按壓Yes鍵。所有LOVO機械式管夾自動關閉且顯示檢查拋棄式套組安裝(Checking Disposable Kit Installation)螢幕。LOVO進行一系列加壓步驟以檢查套組。 8.13.30 套組檢查結果。如果通過套組檢查，繼續進行至下一步驟。*如果未通過，在檢查完畢後可進行第二次套組檢查。*如果未通過，檢查所有管路有無扭結或其他阻塞且進行改正。*如果未通過，確保套組正確安裝且檢查所有Robert氏管夾。如果第二次套組檢查失敗：聯絡地區管理並準備安裝第10.0節的新套組。重複需要的步驟8.13.23至步驟 8.13.30。 8.13.31 附接PlasmaLyte。顯示連接溶液(Connect Solutions)螢幕。洗滌值將總是為3000 mL。在螢幕上輸入此值。 按照過程注意事項5.11，將PlasmaLyte的3000mL袋子無菌接合至通過管夾1的管路。將PlasmaLyte袋吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。 8.13.32 驗證PlasmaLyte已附接。打開任何塑膠管夾。驗證溶液體積輸入為3000mL。輕觸「Next」鍵。顯示拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)覆蓋。驗證PlasmaLyte已附接且通往PlasmaLyte袋的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開，接著輕觸Yes鍵。 8.13.33 觀察PlasmaLyte正在移動。拋棄式套組灌注開始且顯示灌注拋棄式套組螢幕(Priming Disposable Kit Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過連接至PlasmaLyte袋子的管路。 如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復拋棄式套組灌注(Disposable Kit Prime)。當拋棄式套組灌注成功完成時，顯示連接來源螢幕(Connect Source Screen)。 8.13.34至8.13.35 遵守LOVO觸控螢幕提示。 8.13.36 附接來源容器至管路。將步驟8.12.31製備的LOVO來源袋按照過程注意事項5.11無菌接合至通過管夾S的管路。可能必須將管路自管夾移除。注意：如果移除，確定將來源管路置換成S管夾。 8.13.37 吊掛來源容器。將來源容器吊掛在IV點滴架上，兩個角落袋環皆掛在鈎上。不要將來源吊掛在1號磅秤上。打開所有通往來源袋的管夾。 8.13.38 驗證來源容器已附接。輕觸Next鍵。顯示來源灌注(Source Prime)覆蓋。驗證來源附接至拋棄式套組，且通往來源的管路上之任何接合及塑膠管夾皆打開。輕觸Yes鍵。 8.13.39 證實PlasmaLyte正在移動。來源灌注開始且顯示灌注來源螢幕(Priming Source Screen)。目視觀察PlasmaLyte正在移動通過附接至來源袋的管路。如果流體沒有移動，按壓螢幕上的暫停鍵並判定管夾或接合是否仍然關閉。一旦問題已解決，按壓螢幕上的恢復鍵以恢復來源灌注(Source Prime)。 8.13.40 開始程序螢幕(Procedure Screen)。當來源灌注成功完成時，顯示開始程序螢幕(Start Procedure Screen)。按壓開始，在按壓開始後立即出現「預洗滌循環1 (Pre-Wash Cycle 1)」暫停螢幕。 8.13.41 倒轉過程中袋子(In Process Bag)。將過程中袋子自2號磅秤移除(亦可自過程中頂埠管路導引器移除管路)且將其手動倒轉以允許在拋棄式套組灌注步驟期間添加的洗滌緩衝液塗佈袋子的所有內部表面。重新將過程中袋子吊掛在2號磅秤上(袋子上的標籤朝向左側)。置換管路導引器中的頂埠管路如果其被移除。 8.13.42 倒轉來源袋。在按下開始鍵之前，在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，藉由按摩袋子角落並輕柔攪拌細胞混合來源袋，以產生均質細胞懸浮液。按壓恢復鍵。LOVO開始處理來自來源袋的流體且顯示洗滌循環1螢幕(Wash Cycle 1 Screen)。 8.13.43 來源潤洗暫停。一旦來源容器排空且LOVO已添加洗滌緩衝液至來源袋，顯示潤洗來源暫停(Rinse Source Pause)螢幕。在不將來源袋自IV點滴架移除的情況下，按摩角落並混合均勻。按壓恢復。 8.13.44 混合過程中袋子暫停。要製備用於另一通過旋轉機之通道的細胞，將過程中袋子用洗滌緩衝液稀釋。在添加洗滌緩衝液至過程中袋子後，LOVO將自動暫停且顯示「混合過程中袋子(Mix In Process Bag)」暫停螢幕。在不將袋子自磅秤移除的情況下，輕柔擠壓袋子將產物混合均勻。按壓恢復。 8.13.45 按摩過程中角落暫停。當過程中袋子清空時，將洗滌緩衝液添加至過程中袋子的底埠以潤洗袋子。在添加潤洗液後，LOVO自動暫停且顯示「按摩IP角落(Massage IP corners)」暫停螢幕。當「按摩IP角落」暫停螢幕顯示時，不要移除2號磅秤上的袋子。當過程中袋子仍然吊掛在2號磅秤上時，按摩袋子角落以將任何殘餘細胞帶入懸浮液中。確保袋子沒有在磅秤上晃動並按壓恢復鍵。 8.13.46 等待移除產物螢幕。在LOVO程序結束時，顯示移除產物螢幕(Remove Products Screen)。當此螢幕顯示時，可操作LOVO套組上的所有袋子。注意：不觸碰任何袋子，直到顯示移除產物(Remove Products)為止。 8.13.47 移除滯留物袋。將止血鉗夾住非常靠近滯留物袋上之埠的管路，以防止細胞懸浮液沉降進入管路中。在止血鉗下方熱封(按照過程注意事項5.12)，確定維持足夠管線以在步驟8.13.48中接合。移除滯留物袋。 8.13.48 製備用於調配之滯留物袋。將4”血漿轉移組之母魯爾鎖端接合(按照過程注意事項5.11)至滯留物袋。將滯留物袋轉移至BSC以供步驟8.14.11使用。 8.13.49 移除產物。遵守移除產物螢幕(Remove Products Screen)上之指示。關閉LOVO套組上之所有管夾以預防流體移動。 8.13.50 移除產物。輕觸Next鍵。所有LOVO機械式管夾打開且顯示移除套組螢幕(Remove Kit Screen)。 8.13.51 記錄資料。遵守移除套組螢幕上之指示。輕觸「Next」鍵。所有LOVO機械式管夾關閉且顯示結果摘要螢幕(Results Summary Screen)。將結果摘要螢幕所顯示的資料如實記錄在表中。關閉所有泵及過濾器支持。當LOVO提示時將套組移除。*注意：適用時，所有記錄的時間直接由LOVO結果摘要螢幕記錄為HH:MM:SS格式及(HH:MM:SS)格式 8.13.52至8.13.54 規程選擇透過LOVO關機。遵守LOVO螢幕提示。 8.13.55 回顧第8.13節 8.14 最終調配及填充 8.14.1 目標體積/袋計算。從以下之表，選擇對應來自步驟8.13.22之LOVO滯留物體積的欲填充之CS750袋子數量、每袋之目標填充體積、每袋之移除保留體積及每袋之最終目標體積。 8.14.2 製備CRF空白。計算CS-10及LOVO洗滌緩衝液之體積以調配空白袋。 8.14.3 製備CRF空白。在BSC外，使用步驟8.11.29所製備之LOVO洗滌緩衝液的注射器，經由魯爾連接添加經步驟8.14.2 B計算之體積至任何空的CS750袋。注意：空白CS750袋調配不需要無菌進行。 8.14.4 製備CRF空白。使用適當大小的注射器，添加步驟8.14.2所計算之體積的CS-10至步驟8.14.3所製備的相同CS750袋。將紅色蓋子蓋在CS750袋上。 8.14.5 製備CRF空白。盡可能移除CS-750袋中盡量多的空氣。在盡可能靠近袋子處熱封(按照過程注意事項5.12)CS750袋，移除管路。 8.14.6 製備CRF空白。將CS750袋標示「CRF空白」、批號及首字母/日期。將CRF空白放在冰袋上，直到將其放入CRF中為止。 8.14.7 計算IL-2所需體積。計算欲添加至最終產物之IL-2的體積。 8.14.8 組裝連接設備。將4S-4M60無菌接合(按照過程注意事項5.11)至CC2 Cell Connect，用4S-4M60歧管的4穿刺針端在(G)處置換為Cell Connect設備的單一穿刺針(B)。 8.14.9 組裝連接設備。將CS750冷凍袋無菌接合(按照過程注意事項5.11)至步驟8.14.8所製備之制具之示意圖，將四個公魯爾端(E)中之一者置換成各袋。參考步驟8.14.1以判定需要的袋子數量。 8.14.10 組裝連接設備。將CS-10袋接合(按照過程注意事項5.11)至4S-4M60的穿刺針。將袋子放在二個在2至8℃下處理的冰袋之間以保持CS-10低溫。 8.14.11 將材料傳遞至BSC中。 8.14.12 製備含IL-2之TIL。使用適當大小的注射器，自「IL-2 6×104 」等分試樣移出步驟8.14.7判定之量的IL-2。 8.14.13 製備含IL-2之TIL。將注射器經由魯爾連接連接至步驟8.13.48所製備之滯留物袋並注射IL-2。 8.14.14 製備含IL-2之TIL。自注射器推注空氣通過管線以清除管線。 8.14.15 標示經調配的TIL袋。關閉轉移組上的管夾並將袋子標示為「經調配的TIL」並將袋傳遞出BSC。 8.14.16 如果適用的話：按照樣本計畫取樣。如果有步驟8.11.33所製備之剩餘的「IL-2 6×104 」等分試樣，使用適當大小的注射器根據樣本計畫移出約5 mL樣本保留並分配至50 mL錐形管。 8.14.17 如果適用的話：按照樣本計畫取樣。按照樣本計畫用樣本計畫庫存標籤標示並在2至8℃下儲存直到提交至Login進行測試為止。 8.14.18 如果適用的話：按照樣本計畫取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.14.19 將經調配的TIL袋添加至設備。一旦IL-2已添加，將「經調配的TIL」袋接合(按照過程注意事項5.11)至步驟8.14.10所製備之設備上剩餘的穿刺針(A)。 8.14.20 添加CS10。將經組裝的、附接有經調配的TIL、CS-750袋及CS-10之設備傳遞至BSC中。注意：將CS-10袋及所有CS-750袋放在二個在2至8℃下預處理的冰袋之間。不要將經調配的TIL袋放在冰袋上。 8.14.21 添加CS10。確保設備上的所有管夾皆關閉。 轉動活栓使注射器關閉。 8.14.22 轉換注射器。抽取約10mL的空氣進入100mL注射器並置換設備上的60mL注射器。 8.14.23 添加CS10。轉動活栓使通往CS750袋的管線關閉。打開通往CS-10袋的管夾並抽取步驟8.14.1B所計算之體積至注射器中。注意：將使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。注意：記錄各注射器的體積於步驟8.14.26 8.14.24 添加CS10。關閉通往CS-10之管夾且打開通往經調配的TIL袋之管夾且添加CS-10。注意：以大約10.0mL/分鐘，添加第一個10.0mL之CS10。以大約1.0mL /sec之速率，添加剩餘的CS-10。注意：使用多個注射器以添加適當體積之CS-10。一旦分配之後不要重複使用注射器。 8.14.25 添加CS10。記錄時間。注意：自第一次添加CS-10至開始冷凍的目標時間為30 8.14.26 添加CS10。記錄每次CS10添加之體積及總添加體積。總體積符合步驟8.14.1B所計算之體積 8.14.27 添加CS10。關閉所有通往CS10袋的管夾。 8.14.28 製備CS-750袋。轉動活栓使注射器打開。打開通往經調配的TIL袋之管夾且抽取懸浮液到懸浮液即將到達活栓之前停止。 8.14.29 製備CS-750袋。關閉通往經調配的TIL袋之管夾。轉動活栓使其打開通往空的CS750最終產物袋。 8.14.30 製備CS-750袋。使用新的注射器，藉由將空氣抽出，盡可能移除CS750最終產物袋中盡量多的空氣。 在維持注射器柱塞的壓力下，夾住關閉袋子。 8.14.31 製備CS-750袋。抽取約20mL空氣進入新的100mL注射器並連接至設備。 注意：每個CS-750最終產物袋應在二個冰袋之間以保持經調配的TIL懸浮液低溫。 8.14.32 分配細胞。轉動活栓使通往最終產物袋的管線關閉。自經調配的TIL袋抽取步驟8.14.1計算的體積至注射器中。注意：多支注射器可用於獲得正確體積。 8.14.33 分配細胞。轉動活栓使通往經調配的TIL袋的管線關閉。一次處理一個最終產物袋，將細胞分配至最終產物袋。記錄添加至每個CS750袋之細胞的體積於步驟8.14.35。 8.14.34 分配細胞。用注射器中的空氣清除管線，以使細胞等齊於穿刺針埠的頂部。關閉經填充的袋子上的管夾。每個最終產物袋皆重複步驟8.14.29至步驟8.14.34，在每袋之間輕柔混合經調配的TIL袋。 8.14.35 分配細胞。在以下記錄放入每個最終產物袋中之TIL的體積。 8.14.36 移除最終產物袋中的空氣並取出保留。一旦最後的最終產物袋已填充，關閉所有管夾。 8.14.37 移除最終產物袋中的空氣並取出保留。抽取10mL的空氣進入新的100mL注射器並置換設備上的注射器。 8.14.38 移除最終產物袋中的空氣並取出保留。一次操作單一袋子，抽取每個產物袋的所有空氣加上步驟8.14.1 D所判定之用於保留之產物體積。注意：當移除樣本體積時，倒轉注射器並使用空氣清除通到產物袋頂埠的管線。一旦保留體積及空氣已移除，夾住通往袋子的管線。 8.14.39 記錄移除之體積。記錄自每袋移除之保留體積。 8.14.40 分配保留。將保留分配至50mL錐形管並標示管為「保留」及批號。各袋重複步驟8.14.37至步驟 8.14.39。 8.14.41 製備最終產物以進行冷凍保存。使用止血鉗，靠近袋子夾住管線。移除注射器並將原本安裝注射器的設備上的魯爾連接蓋上紅色蓋子。將設備傳遞出BSC。 8.14.42 製備最終產物以進行冷凍保存。在F處(按照過程注意事項5.12)熱封，移除空的滯留物袋及CS-10袋。 注意：保留設備上用於注射器之魯爾連接。丟棄空的滯留物及CS-10袋。 8.14.43 執行目視檢查。注意：步驟8.14.43至步驟8.14.46可與步驟8.14.47至步驟8.14.68同時執行。 8.14.44 最終產物標籤樣本。標示最終產物袋。在以下附接樣本最終產物標籤。 8.14.45 製備最終產物以進行冷凍保存。將冷凍袋保持在冰袋上或2至8℃下，直到冷凍保存為止。 8.14.46 製備外部標籤。確保QA所配發的將被附接至卡匣的外部標籤符合對應的最終產物標籤。附接QA配發的外部標籤至卡匣。在以下附接樣本外部標籤： 8.14.47 移出細胞計數樣本。使用適當大小的吸管，移除2.0 mL步驟8.14.38所移除的保留並放入欲用於細胞計數之15mL錐形管。 8.14.48 執行細胞計數。按照SOP-00314及過程注意事項5.14，利用NC-200執行細胞計數及計算。注意：僅稀釋一個樣本至適當稀釋以驗證稀釋即已足夠。稀釋額外樣本至適當稀釋因數並繼續進行計數。 8.14.49 記錄細胞計數樣本體積。注意：如果不需要稀釋，「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.14.50 判定倍增因數 8.14.51 選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且按照SOP-00314輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。 注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.14.52 記錄來自Nucleoview的檔案名稱、存活性及細胞計數。 8.14.53 判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.14.54 判定計數上限及下限。 8.14.55 兩次計數是否皆在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則執行步驟8.14.56至8.14.63中的第二組計數 8.14.56 如果適用的話：執行細胞計數。按照SOP-00314及過程注意事項5.14，利用NC-200執行細胞計數及計算。注意：稀釋可根據預期細胞濃度調整。 8.14.57 如果適用的話：記錄細胞計數樣本體積。 8.14.58 如果適用的話：判定倍增因數 8.14.59 如果適用的話：選擇規程並輸入倍增因數。確保已選擇「存活細胞計數測定」規程且輸入所有倍增因數、樣本體積及稀釋劑體積。注意：如果不需要稀釋，輸入「樣本[µL]」= 200，「稀釋[µL]」=0 8.14.60 如果適用的話：記錄來自Nucleoview的細胞計數 8.14.61 如果適用的話：判定所執行的細胞計數之平均存活細胞濃度及存活性。 8.14.62 如果適用的話：判定計數上限及下限。 8.14.63 如果適用的話：計數是否在允收界限內? 注意：如果任一結果為「否」，則持續進行步驟8.14.64以判定平均值。 8.14.64 如果適用的話：判定所執行的所有四次計數之平均存活細胞濃度。 8.14.65 計算流動式細胞測量術樣本。執行計算以確保用於流動式細胞測量術取樣之足夠細胞濃度。 *圈起用於判定存活細胞濃度的步驟參考。**注意：如果「否」，則聯絡地區管理。 8.14.66 經計算之IFN-γ樣本。執行計算以確保用於IFN-γ取樣之足夠細胞濃度。 *圈起用於判定存活細胞濃度的步驟參考。**注意：如果「否」，則聯絡地區管理。 8.14.67 報告結果。填寫與樣本一起提交的表格。 8.14.68 熱封。一旦樣本體積已判定，在盡可能靠近袋子處熱封(按照過程注意事項5.12)最終產品袋，以自設備移除。 8.14.69 按照樣本計畫標示及收集樣本。 *注意：以黴漿菌樣本而言，將經調配的細胞懸浮液體積添加至來自步驟8.12.55之標示「黴漿菌稀釋劑」之15mL錐形管。 **注意：進行步驟8.14.70以進行Bac-T接種。 8.14.70 無菌性及BacT測試取樣。在BSC中，使用適當大小的注射器，自步驟8.14.38所收集之保留的細胞懸浮液移出1.0mL樣本並接種厭氧瓶。重複上述於好氧瓶。注意：Bac-T瓶的儲存在室溫下且避光。 8.14.71 標示且儲存樣本。用樣本計畫庫存標籤標示所有樣本並適當儲存直到轉移至Login為止。注意：進行第8.15節最終產物及樣本的冷凍保存。 8.14.72 簽署進行取樣。確保已填寫LIMS樣本計畫表以移除樣本。 8.14.73 樣本提交。提交所有第22天測試樣本至Login。 8.14.74 環境監測。在處理後，驗證BSC且執行人員監測。 8.14.75 回顧第8.14節 8.15 最終產物冷凍保存 8.15.1 準備控速冷凍器。驗證CRF已在冷凍之前設置。記錄CRF設備。執行冷凍保存。 8.15.2 設置CRF探針。穿刺CRF空白袋上的隔膜。插入6mL小瓶溫度探針。 8.15.3 將最終產物及樣本放入CRF中。將空白袋放入預處理的卡匣中且轉移至CRF架的大約中間位置。將最終產物卡匣轉移至CRF架中且將小瓶轉移至CRF小瓶架中。 8.15.4 將最終產物及樣本放入CRF中。將產物架及小瓶架轉移入CRF中。記錄將產物轉移入CRF的時間及室溫度於步驟8.15.5。注意：將卡匣及小瓶架平均分布於CRF中，允許各層架之間盡可能大的空間。 8.15.5 判定達到4℃±1.5℃所需的時間且進行CRF運行。一旦室溫度達到4℃±1.5℃，開始運行。記錄時間。 8.15.6 CRF完成及儲存。運行完成後停止CRF。將卡匣及小瓶自CRF移除。將卡匣及小瓶轉移至氣相LN2儲存。記錄儲存位置。 處理後摘要 ․ 處理後：最終藥物產品 ○ (第22天)藉由流動式細胞測量術判定第22天REP的CD3+細胞 ○ (第22天)革蘭氏染色法(GMP) ○ (第22天)藉由凝膠法(Gel Clot) LAL測定之細菌內毒素測試(GMP) ○ (第16天)BacT無菌性測定(GMP) ○ (第16天)藉由TD-PCR偵測黴漿菌DNA (GMP) ○ 可接受之外觀屬性(步驟8.14.43) ○ (第22天)BacT無菌性測定(GMP) ○ (第22天)IFN-γ測定實例 2 ： 使用TALE核酸酶基因編輯經冷凍保存的TIL療法
此實例描述使用基因編輯步驟搭配TIL製造過程，諸如圖20所示之過程。
人TIL電穿孔之最佳化執行如下。識別表現＞25% PD1之4至6個衍生自黑色素瘤之REP前TIL細胞系。選定之TIL細胞系經解凍、靜置及活化，一次處理1個細胞系。5百萬個經活化的TIL以下列對照或測試RNA中各者電穿孔：無電穿孔對照(NE)；無RNA對照；綠色螢光蛋白質(GFP) mRNA轉染對照；CD52 TALEN KO對照；PD1 TALEN；LAG-3 TALEN；及TIM-3 TALEN。計數存活細胞且取一等分試樣進行轉染效率測量(GFP表現)。經電穿孔的細胞藉由REP擴增。評估REP後TIL的細胞存活性及擴增倍數(細胞計數器)及目標基因敲低(流式及qPCR)。目標結果係＞80%存活性或在NE的10%以內；＞70%轉染；TIL擴增倍數在NE的30%以內；及＞50%基因剔除。
實施TALEN媒介之PD-1基因剔除至TIL製造過程係執行如下。使用至多6個來自數種可包括黑色素瘤、肉瘤、乳癌及肺癌之組織學的新鮮腫瘤。根據圖20及21顯示的過程執行研究級製備。在每個過程的預定時間點施用來自先前實驗的電穿孔條件。將評估REP後TIL的細胞存活性及擴增倍數(細胞計數器)；細胞表型(流動式細胞測量術)；TCR Vβ貯庫(流式)；T細胞效應功能(再刺激時的IFN-γ生產)；及目標基因敲低(流式及qPCR)。目標結果係：＞80%存活性或在NE的10%以內；＞70%轉染；擴增倍數在NE的30%以內；相較於過程2A產生的TIL維持T細胞系/子集；適當TIL效力；及＞50% PD-1基因剔除。在此實驗之後，將進行一次PD-1敲低TIL的完整規模製備及完整表徵。
亦驗證測試靜默二個除了PD-1以外的額外目標基因。實例 3 ： 在TIL中TALEN媒介之PD-1去活化
此實例描述TALEN媒介之PD-1去活化搭配本文所述之TIL製造過程，諸如圖20或圖21所示之過程。TIL製造過程可包括早期添加OKT-3及/或4-1BB促效劑至細胞培養基，例如圖21之實施例2所示。OKT-3及/或4-1BB促效劑可選地從第一擴增或第二擴增的第0天或第1天開始添加。
TALEN建構及電穿孔可根據Menger, et al.,Cancer Res. , 2016 Apr 15; 76(8):2087-93、Gautron, et al.,et al. ,Molecular Therapy: Nucleic Acids 2017, 9:312-321或美國專利第9,458,439號所描述之方法進行，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。靶向PD-1基因之TALEN將使用例如Daboussi et al.,Nat Commun 2014; 5:3831(以引用方式併入本文中)所描述之固相總成方法產生，或可經商業獲得自Trilink Biotechnologies或如Gautron, et al.,et al. ,Molecular Therapy: Nucleic Acids 2017, 9:312-321所述之其他提供者。可採用在Gautron, et al.,et al. ,Molecular Therapy: Nucleic Acids 2017, 9:312-321及本文他處描述之活化TIL之程序，其中TIL使用Dynabeads人T細胞活化子CD3/CD28珠(可購自Invitrogen)以1:1 CD3+ 珠:細胞之比例活化，或使用人T細胞活化子CD3/CD28抗體複合物諸如Immunocult CD3/CD28活化子(可購自StemCell Technologies)活化。在使用Agile脈衝BTX系統(Harvard Apparatus)電穿孔之前，總共5×106 個TIL/180 μL BTX cytoporation培養基T可與約10至20 μg的體外轉錄TALEN mRNA(mMESSAGE mMACHINE T7套組；Ambion)混合。經電穿孔之細胞可藉由在本文他處描述之REP前及REP方法擴增。評估REP後TIL的細胞存活性及擴增倍數(細胞計數器)及PD-1敲低(流式及qPCR)。目標結果係＞80%存活性或在「無電穿孔」(NE)對照的10%以內；＞70%轉染；TIL擴增倍數在NE的30%以內；及＞50% PD-1基因剔除。可使用所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
脈衝電穿孔最佳化可使用本文所述之方法或如下執行。對TIL執行第一組實驗以判定可轉染細胞的電壓範圍。測試五種不同程式：
TIL可在0.4 cm間隙樣品管中(大約為約106 個細胞/mL)以約20 μg的編碼GFP之質體及對照質體pUC使用不同的電穿孔程式電穿孔。在電穿孔後約24小時，藉由流動式細胞測量術分析電穿孔細胞中的GFP表現來判定轉染效率。在TIL中質體電穿孔所需之最小電壓先前已報告於國際專利申請公開案號WO 2014/184744及美國專利申請公開案號US 2013/0315884 A1(彼等揭露以引用方式併入本文中)且程式3及4各自允許有效的TIL併入TALEN過程。
圖23顯示之TALEN建構體靶向Pdcd1基因的外顯子2(如圖所示)且可用於去活化PD1。
上述實例係經提供以給出如何實施及使用本發明之組成物、系統及方法的實施例的完整揭露及說明給所屬技術領域中具有通常知識者，並非意圖限制發明人對於他們的發明之主張範圍。用於實施本發明之上述模式的修飾為該領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於下列權利要求範圍之內。說明書中所提及的所有專利及公開案指示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文所引證之所有參考文獻皆以引用方式且出於所有目的完整併入本文中，猶如個別公開案或專利或專利申請案係特別且個別明示以全文引用方式併入本文中以用於所有目的。
如所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行許多修改及變化。本文所述之特定實施例及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之用語以及申請專利範圍有權主張之等效物的全部範疇限制。
圖 1 ： 顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施例的圖。
圖 2 ： 顯示用於TIL製造之1C過程與2A過程實施例之間的比較。
圖 3 ： 顯示1C過程時間表。
圖 4 ： 顯示用於較高細胞計數之使用TIL製造過程2A之TIL療法實施例，包括投予及共療法步驟。
圖 5 ： 顯示用於較低細胞計數之使用TIL製造過程2A之TIL療法實施例，包括投予及共療法步驟。
圖 6 ： 顯示2A過程實施例的詳細示意圖。
圖 7a 、 7b 及 7c ： 描繪過程2A實施例的主要步驟，包括冷凍保存步驟。
圖 8 ： 描繪臨床試驗設計，包括用過程1C及過程2A實施例處理之研究世代。
圖 9 ： 例示性過程2A之圖提供步驟A至F之概覽。
圖 10 ： 過程2A資料收集計畫之程序流程圖。
圖 11 ： 快速擴增規程(REP)例示性實施例方案。腫瘤一抵達即經碎斷、放入含IL-2之G-Rex培養瓶進行TIL擴增(REP前擴增)共11天。就三重雞尾酒研究而言，在REP前起始時添加IL-2/IL-15/IL-21。就快速擴增規程(REP)而言，TIL係與餵養細胞及OKT3一起培養，進行額外11天的REP擴增。
圖 12 ： 顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施例的圖。
圖 13 ： 過程1C及過程2A之例示性實施例的步驟A至F之比較表。
圖 14 ： 過程1C實施例與過程2A實施例之詳細比較。
圖 15 ： TIL治療過程實施例之詳細方案。
圖 16 ： 描繪冷凍保存TIL製造過程(22天)之實施例。
圖 17 ：第1代至第2代之過程改良表。
圖 18 ： 本發明之TIL製造過程的實施例。
圖 19 ： 過程2A之程序流程圖。
圖 20 ： 描繪TIL製造過程之實施例，其包括用於基因編輯過程(包括如本文所述之TALEN、鋅指核酸酶及CRISPR方法)之電穿孔步驟。
圖 21 ： 描繪TIL製造過程之實施例，其包括用於基因編輯過程(包括如本文所述之TALEN、鋅指核酸酶及CRISPR方法)之電穿孔步驟。
圖 22 ： 描繪結構I-A及I-B，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，該三價蛋白質接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH3及CH2結構域)連接，該IgG1-Fc用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，藉以穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH及VL鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。
圖 23 ： 描繪靶向Pdcd1基因外顯子2之TALEN建構體。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086

Claims (42)

  1. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自患者的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該患者所切除的腫瘤獲得第一TIL族群；(b)將該多個腫瘤片段加入密閉系統；(c)藉由在包含IL-2及可選地OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行3至12天以獲得該第二TIL族群，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；(d)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、可選地OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行7至12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；(e)收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；(f)將得自步驟(e)之該經收集的TIL族群轉移至輸液 袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；及(g)在該步驟(a)至(d)期間的任何時間，基因編輯至少一部分的該TIL。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程將步驟(f)中包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟，可選地其中該冷凍保存過程使用1：1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存培養基執行。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)，可選地其中該PBMC經照射且為同種異體，可選地其中該PBMC係於步驟(d)之第9至14天中任一天添加至該細胞培養。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
  5. 如請求項1或2之方法，其中步驟(e)之該收集係使用基於膜之細胞處理系統執行，可選地其中步驟(e)之該收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該多個腫瘤片段包含(i)4至50個片段，其中各片段具有27mm3的體積；(ii)30至60 個片段，其總體積為1300mm3至1500mm3；(iii)50個片段，其總體積為1350mm3；或(iv)50個片段，其總質量為1克至1.5克。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
  8. 如請求項1或2之方法，其中步驟(d)之該細胞培養基進一步包含IL-15及/或IL-21。
  9. 如請求項1或2之方法，其中該IL-2濃度係10,000IU/mL至5,000IU/mL。
  10. 如請求項8之方法，其中該IL-15濃度係500IU/mL至100IU/mL。
  11. 如請求項8之方法，其中該IL-21濃度係20IU/mL至0.5IU/mL。
  12. 如請求項1或2之方法，其中步驟(f)之該輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
  13. 如請求項2之方法，其中該冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
  14. 如請求項1或2之方法，其中步驟(c)及步驟(d)各自個別地於10天、11天或12天內執行，或其中步驟(a)至(g)在一段10天至22天的期間內執行。
  15. 如請求項1或2之方法，其中步驟(a)至(g)在10天或少於10天內執行。
  16. 如請求項1或2之方法，其中步驟(a)至(g)及冷凍保存在22天或少於22天內執行。
  17. 如請求項1或2之方法，其中步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL，可選地其中對治療有效劑量為足夠的TIL數量係2.3×1010至13.7×1010個。
  18. 如請求項1或2之方法，其中步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致每個經切除之腫瘤的TIL產率增加，可選地其中該抗原呈現細胞係於步驟(d)之該第二期間且無需打開該系統添加至該TIL。
  19. 如請求項1或2之方法，其中(i)當投予至個體時，步驟(d)之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產 生、增加的多株性、增加的平均IP-10及/或增加的平均MCP-1；(ii)當投予至個體時，步驟(d)之該第三TIL族群提供至少5倍或多於5倍的干擾素-γ產生；(iii)步驟(d)之該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞之子族群，其中在該治療性TIL族群中該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現；及/或(iv)獲自該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
  20. 如請求項1或2之方法，其中微生物污染之風險相較於使用開放系統的擴增TIL之方法減少。
  21. 如請求項1或2之方法，其中來自步驟(f)之該TIL係將被輸注至患者。
  22. 如請求項1或2之方法，其中該多個腫瘤片段包含4個片段。
  23. 如請求項1或2之方法，其中在該第一擴增、該第二擴 增或該第一及第二擴增期間的該細胞培養基進一步包含4-1BB促效劑及/或OX40促效劑，可選地其中該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之後進行，或該基因編輯係於該4-1BB促效劑及/或該OX40促效劑導入該細胞培養基之前進行。
  24. 如請求項1或2之方法，其中該基因編輯係於該第一TIL族群、該第二TIL族群及該第三TIL族群中一或多者進行，可選地其中(i)該基因編輯係於該第一擴增或該第二擴增或該第一及第二擴增之期間進行；(ii)該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行；及/或(iii)該基因編輯係於步驟(c)之前、步驟(d)之前或步驟(e)之前進行。
  25. 如請求項1或2之方法，其中(i)在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之前進行；(ii)在該第一擴增期間及/或在該第二擴增期間的該細胞培養基包含OKT-3且該基因編輯係於該OKT-3導入該細胞培養基之後進行；或(iii)該細胞培養基從該第一擴增的起始日開始包含OKT-3且該基因編輯係於該TIL已暴露於該OKT-3之後進行。
  26. 如請求項1或2之方法，其中該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查 點基因的表現，可選地其中該一或多個免疫檢查點基因係選自由下列所組成之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
  27. 如請求項1或2之方法，其中該基因編輯造成在至少一部分的該治療性TIL族群中增強一或多個基因的表現，該(等)基因係選自包含下列之群組：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2細胞內結構域(ICD)及/或NOTCH配體mDLL1。
  28. 如請求項1或2之方法，其中該基因編輯包含使用可編程之核酸酶以在該一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生，可選地其中該基因編輯包含一或多種選自由下列所組成之群組之方法：CRISPR方法、TALE方法、鋅指方法及彼等之組合。
  29. 如請求項28之方法，其中該基因編輯包含導入靶向該PD-1基因之TALE核酸酶。
  30. 如請求項29之方法，其中靶向該PD-1基因之該TALE核酸酶辨識及切割選自由SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：128所組成之群組的目標序列。
  31. 如請求項28之方法，其中該基因編輯包含導入靶向該PD-1基因及該TIGIT基因之TALE核酸酶。
  32. 如請求項28之方法，其中該基因編輯係於該第一擴增之後及該第二擴增之前進行。
  33. 一種藉由如請求項1至32中任一項之方法所產生的經擴增之治療性TIL族群，其包含一或多個檢查點基因之靜默或減少的表現，該一或多個檢查點基因係選自由下列所組成之群組：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、 IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
  34. 如請求項33之經擴增之治療性TIL族群，其包含該PD-1基因之靜默或減少的表現。
  35. 如請求項34之經擴增之治療性TIL族群，其中該PD-1基因之靜默或減少的表現係藉由導入靶向該PD-1基因之TALE核酸酶達成。
  36. 如請求項35之經擴增之治療性TIL族群，其中該TALE核酸酶辨識及切割選自由SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：128所組成之群組的目標序列。
  37. 如請求項35或36之經擴增之治療性TIL族群，其中於該擴增TIL之方法的該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前導入該TALE核酸酶。
  38. 如請求項33之經擴增之治療性TIL族群，其包含該PD-1基因及該TIGIT基因之靜默或減少的表現。
  39. 如請求項38之經擴增之治療性TIL族群，其中該PD-1基因及該TIGIT基因之靜默或減少的表現係藉由導入靶向 該PD-1基因及該TIGIT基因之TALE核酸酶達成。
  40. 如請求項39之經擴增之治療性TIL族群，其中於該擴增TIL之方法的該第一擴增步驟之後及該第二擴增步驟之前導入該TALE核酸酶。
  41. 一種如請求項33至36中任一項之經擴增之治療性TIL族群於製造藥物之用途，該藥物係用於治療患者之癌症。
  42. 如請求項41之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
TW108114792A 2018-04-27 2019-04-26 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途 TWI831776B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862663885P 2018-04-27 2018-04-27
US62/663,885 2018-04-27
US201862680821P 2018-06-05 2018-06-05
US62/680,821 2018-06-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202014195A TW202014195A (zh) 2020-04-16
TWI831776B true TWI831776B (zh) 2024-02-11

Family

ID=66429655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108114792A TWI831776B (zh) 2018-04-27 2019-04-26 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途

Country Status (14)

Country Link
US (6) US20210130779A1 (zh)
EP (1) EP3784254A1 (zh)
JP (1) JP2021521846A (zh)
KR (1) KR20210005138A (zh)
CN (1) CN112368003A (zh)
AU (1) AU2019257749A1 (zh)
BR (1) BR112020021660A2 (zh)
CA (1) CA3098303A1 (zh)
IL (1) IL278231A (zh)
MA (1) MA52533A (zh)
MX (1) MX2020011134A (zh)
SG (1) SG11202010319RA (zh)
TW (1) TWI831776B (zh)
WO (1) WO2019210131A1 (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
BR112020018658A2 (pt) 2018-03-15 2020-12-29 KSQ Therapeutics, Inc. Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada
EP4048295A1 (en) * 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
MX2022007598A (es) * 2019-12-20 2022-09-23 Instil Bio Uk Ltd Dispositivos y métodos para el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores y usos de los mismos.
WO2021167908A1 (en) * 2020-02-17 2021-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
TW202208617A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
TW202208616A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
EP4263808A2 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
CN114686430A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备til的方法
TW202304480A (zh) * 2021-03-19 2023-02-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）中之與ｃｄ３９／ｃｄ６９選擇及基因剔除相關之ｔｉｌ擴增之方法
JP2024512029A (ja) 2021-03-25 2024-03-18 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用
JP2024512978A (ja) * 2021-03-30 2024-03-21 ネオジェント コーポレーション 免疫細胞組成物を生成するための方法
CA3215830A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Rafael CUBAS Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
CN113244389B (zh) * 2021-07-06 2021-09-17 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种TILs细胞制备方法及在肿瘤治疗的用途
WO2023147488A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023147486A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023143515A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
EP4289939A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-13 Apeiron Biologics AG Population of transfected immune cells and method for their production
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024055018A1 (en) * 2022-09-09 2024-03-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
WO2024055017A1 (en) * 2022-09-09 2024-03-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075195A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Cellectis Method of engineering chemotherapy drug resistant t-cells for immunotherapy
WO2018075664A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5128257A (en) 1987-08-31 1992-07-07 Baer Bradford W Electroporation apparatus and process
EP0398960B1 (en) 1988-01-21 1995-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Transport of molecules across tissue using electroporation
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
CA2019758C (en) 1990-06-25 2001-09-04 Kevin L. Firth Improved electroporation device and method
US5137817A (en) 1990-10-05 1992-08-11 Amoco Corporation Apparatus and method for electroporation
US5173158A (en) 1991-07-22 1992-12-22 Schmukler Robert E Apparatus and methods for electroporation and electrofusion
US5304120A (en) 1992-07-01 1994-04-19 Btx Inc. Electroporation method and apparatus for insertion of drugs and genes into endothelial cells
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5318514A (en) 1992-08-17 1994-06-07 Btx, Inc. Applicator for the electroporation of drugs and genes into surface cells
CA2146559A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 Melanie K. Spriggs Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
GB9317380D0 (en) 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US5691188A (en) 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
EP0769063A1 (en) 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
ATE226641T1 (de) 1995-04-08 2002-11-15 Lg Chemical Ltd Humaner 4-1bb spezifischer humaner antikörper und diesen produzierende zellinie
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US6010613A (en) 1995-12-08 2000-01-04 Cyto Pulse Sciences, Inc. Method of treating materials with pulsed electrical fields
BR9712278A (pt) 1996-10-11 1999-08-31 Bristol Myers Squibb Co Processos e composições para imunomodulação
DK0973928T3 (da) 1997-03-11 2010-08-09 Univ Minnesota DNA-baseret transposonsystem til indføring af nukleinsyre i DNA i en celle
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6475994B2 (en) 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
EP1060261B1 (en) 1998-03-02 2010-05-05 Massachusetts Institute of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
AU2982900A (en) 1999-02-03 2000-08-25 Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US6627442B1 (en) 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
JP2004534721A (ja) 2000-10-31 2004-11-18 ピーアール ファーマシューティカルズ，インク． 生理活性分子の向上した送達のための方法及び組成物
US7550140B2 (en) 2002-06-13 2009-06-23 Crucell Holland B.V. Antibody to the human OX40 receptor
AU2003259294A1 (en) 2002-07-30 2004-02-16 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
WO2004021995A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Departement Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
ITMI20022118A1 (it) 2002-10-04 2004-04-05 Abiogen Pharma Spa Procedimento per la coltura su larga scala di t-linfociti in un sistema omogeneo.
AU2004280623B2 (en) 2003-10-08 2010-12-02 Wilson Wolf Manufacturing, LLC Cell culture methods and devices utilizing gas permeable materials
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
CN101072578A (zh) 2004-10-29 2007-11-14 南加州大学 用共刺激分子的联合癌症免疫疗法
DK2650020T3 (en) 2005-05-06 2017-01-16 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40 immunoglobulin fusion protein and methods for applications.
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
SI1907424T1 (sl) 2005-07-01 2015-12-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana monoklonska protitelesa proti programiranem smrtnem ligandu 1 (PD-L1)
US7596024B2 (en) 2006-07-14 2009-09-29 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Nonvolatile memory
EP1894940A1 (en) 2006-08-28 2008-03-05 Apogenix GmbH TNF superfamily fusion proteins
CL2008000578A1 (es) 2007-02-27 2008-10-10 Genentech Inc Anticuerpo antagonista aislado anti-receptor ox40 humano; molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped; metodo de produccion; composicion que lo comprende; su uso para tratar trastornos mediados por ox40; y metodo para detectar
ES2560871T3 (es) 2007-07-10 2016-02-23 Apogenix Gmbh Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF
US8541185B2 (en) 2007-09-24 2013-09-24 Technion Research & Development Foundation Limited Method of predicting responsiveness to autologous adoptive cell transfer therapy
SI2851374T1 (sl) 2007-12-14 2017-08-31 Bristol-Myers Squibb Company Vezavne molekule k humanemu ox40 receptorju
EP2310409A2 (en) 2008-06-17 2011-04-20 Apogenix GmbH Multimeric tnf receptors
EP2604693B1 (en) 2008-07-21 2016-02-24 Apogenix GmbH TNFSF single chain molecules
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
ES2593049T3 (es) 2009-01-09 2016-12-05 Apogenix Ag Proteínas de fusión que forman trímeros
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
SG181559A1 (en) 2009-12-08 2012-07-30 Wolf Wilson Mfg Corp Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
EP2580331A4 (en) 2010-06-14 2013-11-27 Univ Iowa State Res Found Inc NUCLEASE ACTIVITY OF THE TAL EFFECTOR AND FUSION PROTEIN FOKI
AU2011293558B2 (en) 2010-08-23 2014-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-OX40 antibodies and methods of using the same
CN105481983B (zh) 2010-09-09 2021-09-03 辉瑞公司 4-1bb结合分子
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
RS61854B1 (sr) 2010-11-12 2021-06-30 Nektar Therapeutics Konjugati il-2 dela i polimera
ES2906059T3 (es) * 2011-02-28 2022-04-13 Seattle Childrens Res Institute Endonucleasas de acoplamiento con enzimas de procesamiento de extremos que impulsan la interrupción génica de alta eficiencia
US20120244133A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
DK2694091T3 (da) 2011-04-05 2019-06-03 Cellectis Fremgangsmåde til fremstilling af kompakte tale-nukleaser og anvendelse heraf
US20140234320A1 (en) 2011-06-20 2014-08-21 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
EP2748199B1 (en) 2011-08-23 2019-08-28 Board of Regents, The University of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
SG11201400527XA (en) 2011-09-16 2014-04-28 Univ Pennsylvania Rna engineered t cells for the treatment of cancer
EP2768939B1 (en) * 2011-10-21 2016-08-17 Cell Medica Limited Device for the aseptic expansion of cells
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
CA2872504A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Wilson Wolf Manufacturing Corporation A static animal cell culture and cell recovery
MX370265B (es) 2012-05-25 2019-12-09 Cellectis Métodos para manipular por ingeniería genética célula t alogénica y resistente a inmunosupresores para inmunoterapia.
EP2855671B1 (en) 2012-06-05 2019-02-20 Cellectis Transcription activator-like effector (tale) fusion protein
JP2015519080A (ja) 2012-06-11 2015-07-09 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 養子細胞療法のための改良型細胞培養方法
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
EP3825401A1 (en) 2012-12-12 2021-05-26 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
ES2598115T3 (es) 2012-12-12 2017-01-25 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
ES2859678T3 (es) 2013-03-01 2021-10-04 Us Health Métodos para producir poblaciones enriquecidas de células T reactivas a tumores a partir de un tumor
CA2902448C (en) 2013-03-01 2023-04-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor reactive t cells from peripheral blood
MX2015013288A (es) 2013-03-18 2016-04-07 Biocerox Prod Bv Anticuerpos anti-cd134 (ox40) humanizados y usos de los mismos.
CN105378067A (zh) 2013-05-13 2016-03-02 塞勒克提斯公司 工程化用于免疫治疗的高活性t细胞的方法
US11311575B2 (en) 2013-05-13 2022-04-26 Cellectis Methods for engineering highly active T cell for immunotherapy
US11685935B2 (en) 2013-05-29 2023-06-27 Cellectis Compact scaffold of Cas9 in the type II CRISPR system
CN110564612B (zh) 2013-06-24 2024-07-02 威尔逊沃夫制造公司 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法
JP6616295B2 (ja) 2013-07-15 2019-12-04 アメリカ合衆国 抗ヒトパピローマウイルス抗原ｔ細胞の調製方法
US10233425B2 (en) 2013-09-16 2019-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
EP3083687A2 (en) 2013-12-17 2016-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3102604B1 (en) 2014-02-04 2020-01-15 Pfizer Inc Combination of a pd-1 antagonist and a 4-1bb agonist for treating cancer
AU2015217208B2 (en) 2014-02-11 2018-08-30 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate CRISPR enabled multiplexed genome engineering
PT3116902T (pt) 2014-03-11 2020-04-03 Cellectis Método para gerar células t compatíveis para transplante alogénico
ES2776407T3 (es) 2014-03-20 2020-07-30 H Lee Moffitt Cancer Ct & Res Linfocitos infiltrantes de tumor para terapia celular adoptiva
WO2015157636A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
BR112016024957A2 (pt) * 2014-04-25 2017-10-24 Bluebird Bio Inc métodos aperfeiçoados para fabricação de terapias celulares adotivas
MY180750A (en) 2014-06-11 2020-12-08 Polybiocept Ab Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy
EP3155426B1 (en) 2014-06-13 2023-07-19 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016053338A1 (en) 2014-10-02 2016-04-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating t cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation
EP3034092A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 Université de Lausanne Adoptive immunotherapy for treating cancer
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
FR3040396A1 (fr) 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
US20170152506A1 (en) * 2015-08-28 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Inactivation of lymphocyte immunological checkpoints by gene editing
CN109068658A (zh) * 2015-11-18 2018-12-21 杜克大学 用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞
US10188749B2 (en) * 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
EP3512547B1 (en) 2016-09-14 2020-11-11 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies
MD3532607T2 (ro) 2016-10-26 2024-07-31 Iovance Biotherapeutics Inc Restimularea limfocitelor infiltrante în tumori crioconservate
GB2607227B (en) * 2016-10-27 2023-05-10 Intima Bioscience Inc Viral methods of T cell therapy
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
GB201620415D0 (en) 2016-12-01 2017-01-18 Element Six Tech Ltd Single crystal synthetic diamond material via chemical vapour deposition
US11357841B2 (en) 2017-01-06 2022-06-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
WO2018129332A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
CN110537266B (zh) 2017-04-20 2022-06-17 大日本印刷株式会社 电池用包装材料、其制造方法以及电池
EP3622055A1 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
EP3635097A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of using tumor infiltrating lymphocytes in double-refractory melanoma
PE20211292A1 (es) * 2018-11-05 2021-07-20 Iovance Biotherapeutics Inc Procesos para la produccion de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de estos en inmunoterapia

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075195A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Cellectis Method of engineering chemotherapy drug resistant t-cells for immunotherapy
WO2018075664A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy

Also Published As

Publication number Publication date
US20220403333A1 (en) 2022-12-22
TW202014195A (zh) 2020-04-16
US12031157B2 (en) 2024-07-09
US12024718B2 (en) 2024-07-02
WO2019210131A1 (en) 2019-10-31
US20220010278A1 (en) 2022-01-13
SG11202010319RA (en) 2020-11-27
US20220396769A1 (en) 2022-12-15
US20210130779A1 (en) 2021-05-06
KR20210005138A (ko) 2021-01-13
AU2019257749A1 (en) 2020-10-22
US20220403334A1 (en) 2022-12-22
BR112020021660A2 (pt) 2021-02-02
MA52533A (fr) 2021-03-03
MX2020011134A (es) 2020-11-11
US11866688B2 (en) 2024-01-09
CA3098303A1 (en) 2019-10-31
CN112368003A (zh) 2021-02-12
US20220396768A1 (en) 2022-12-15
IL278231A (en) 2020-11-30
JP2021521846A (ja) 2021-08-30
US11384337B2 (en) 2022-07-12
EP3784254A1 (en) 2021-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI831776B (zh) 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途
TWI833719B (zh) 來自細針抽吸物及小活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞（ｔｉｌ）擴增
KR102686794B1 (ko) 종양 침윤 림프구의 제조 방법 및 면역요법에서의 그의 용도
US20220389381A1 (en) Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
TW201919662A (zh) 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
TW202039830A (zh) 用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途
TW201938177A (zh) 產生富含腫瘤抗原特異性ｔ細胞的腫瘤浸潤淋巴球（ｔｉｌ）產物之方法
JP2022506508A (ja) Ａｋｔ経路阻害剤を利用したｔｉｌの拡大培養
TW202039829A (zh) 改善之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
JP2022514023A (ja) 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用
JP2021503885A (ja) 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
KR20200138329A (ko) 종양 침윤 림프구의 제조 방법 및 면역요법에서의 그의 용도
TW202208617A (zh) 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
TW202241508A (zh) 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
TW202039831A (zh) 對抗ｐｄ－１抗體呈現難治性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患之治療
TW202106704A (zh) 抗利妥昔單抗嵌合抗原受體及其用途