CN112368003A - 肿瘤浸润淋巴细胞的基因编辑及其在免疫治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了扩增TIL和产生治疗性TIL群的改进和/或缩短的方法，包括在封闭系统中扩增TIL群的新型方法，该方法在更短时间内得到了TIL的改善的功效、改善的表型和增强的代谢健康，同时减少了微生物污染并降低了成本。该方法可以包括对至少一部分TIL进行基因编辑以增强其治疗功效。此类TIL可用于治疗方案。

Description

肿瘤浸润淋巴细胞的基因编辑及其在免疫治疗中的用途
技术领域
本文描述了扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并产生治疗性TIL群的方法。此外，本文公开了基因编辑TIL的方法以及经基因编辑的TIL在治疗疾病(例如癌症)中的用途。
背景技术
使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltrating lymphocyte)治疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。Gattinoni等，Nat.Rev.I mmunol.，2006，6，383-393。成功的免疫治疗需要大量的TIL，商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这是一项需要实现的挑战。由于其速度和效率，基于IL-2的TIL扩增、随后进行“快速扩增过程”(REP，rapid expansion process)已成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。REP可以在14天内使TIL扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞((PBMC，peripheral blood mononuclear cell)，也称为单核细胞(MNC))作为饲养细胞(feeder cell)，以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等J.I mmunother.2003，26，332-42。经历REP程序的TIL在黑色素瘤患者的宿主免疫抑制后产生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数(infusion acceptance parameter)依赖于TIL组成的读数(例如CD28、CD8或CD4阳性)以及REP产物的倍数扩增和活力。
目前的TIL生产方法受到时长、成本、无菌问题以及本文所述的其他因素的限制，使得此类方法商业化的潜力受到严重限制，并且由于这些和其他原因，目前尚无商业方法可用。迫切需要提供TIL生产方法和基于此种方法的治疗，其适用于商业规模生产，并获得在多个临床中心用于人类患者的监管批准。此外，迫切需要能改善患者的反应率和反应强度的更有效的TIL治疗。
发明内容
本发明提供了扩增TIL并产生治疗性TIL群的方法。根据示例性实施方式，对治疗性TIL群的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗效果。
在一个实施方式中，本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(g)在该方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋。
在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的TIL群与冷冻保存培养基进行。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方式中，PBMC是经辐照且同种异体的。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。
在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用基于膜的细胞处理系统进行。
在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用LOVO细胞处理系统进行。
在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。
在一些实施方式中，在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。
在一些实施方式中，步骤(d)中的细胞培养基还包含IL-15和/或IL-21。
在一些实施方式中，IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在一些实施方式中，IL-15浓度为约500IU/mL至约100IU/mL。
在一些实施方式中，IL-21浓度为约20IU/mL至约0.5IU/mL。
在一些实施方式中，步骤(f)中的输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含7％至10％的二甲基亚砜(DMSO)。
在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。
在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约22天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约15天至约20天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约20天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约15天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行20天以下。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行15天以下。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行10天以下。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。
在一些实施方式中，在步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL的治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的TIL产量增加。
在一些实施方式中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到TIL中。
在一些实施方式中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三TIL群提供增加的疗效、增加的干扰素-γ产量、增加的多克隆性(polyclonality)、增加的平均IP-10和/或增加的平均MCP-1。
在一些实施方式中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三TIL群提供至少5倍以上的干扰素-γ产量。
在一些实施方式中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，该治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，该治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自第三TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。
在一些实施方式中，将来自步骤(g)的TIL输注到患者体内。
在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑在第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行。
在一些实施方式中，基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，从第一次扩增起始日开始，细胞培养基包含OKT-3；在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
在一些实施方式中，基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
在一些实施方式中，基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
在一些实施方式中，基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指(zinc finger)法及它们的组合的一种以上方法。
在一些实施方式中，基因编辑包括CRISPR法。
在一些实施方式中，CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
在一些实施方式中，基因编辑包括TALE法。
在一些实施方式中，基因编辑包括锌指法。
在另一个实施方式中，本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括以下步骤：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由受试者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；
(h)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群，该第三TIL群来自步骤(g)的输液袋；以及
(i)在该方法的步骤(a)至步骤(f)期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
在一些实施方式中，在步骤(e)收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方式中，足以达到在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞(APC)是PBMC。
在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。
在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已给患者施用了非清髓性(non-myeloablative)淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)方案。
在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天的步骤。
在一些实施方式中，该方法还包括在步骤(h)中给患者施用TIL细胞后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施方式中，高剂量IL-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注(bolusintravenous infusion)方式施用600,000IU/kg或720,000IU/kg，直至耐受。
在一些实施方式中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，该治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，该治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌和NSCLC。
在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。
在一些实施方式中，癌症是HNSCC。
在一些实施方式中，癌症是宫颈癌。
在一些实施方式中，癌症是NSCLC。
在一些实施方式中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑在第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行。
在一些实施方式中，基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，从第一次扩增起始日开始，细胞培养基包含OKT-3；在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
在一些实施方式中，基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
在一些实施方式中，基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
在一些实施方式中，基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
在一些实施方式中，基因编辑包括CRISPR法。
在一些实施方式中，CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
在一些实施方式中，基因编辑包括TALE法。
在一些实施方式中，基因编辑包括锌指法。
在另一个实施方式中，本发明还提供一种将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将来自患者切除肿瘤的经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中，获得第一TIL群；
(b)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；
(c)通过向第二TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)收获从步骤(c)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)将步骤(d)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)在该方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
在一些实施方式中，在步骤(d)中收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL的治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的TIL群的输液袋。
在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的TIL群与冷冻保存培养基进行。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，PBMC是经辐照且同种异体的。
根据权利要求68的方法，其中，在步骤(c)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。
在一些实施方式中，使用LOVO细胞处理系统进行步骤(d)中的收获。
在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。
在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。
在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供第二细胞培养基。
在一些实施方式中，步骤(e)中的输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。
在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。
在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在11天内进行。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约22天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约20天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约15天。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。
在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。
在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的TIL产量增加。
在一些实施方式中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到TIL中。
在一些实施方式中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，该治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自治疗性TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自治疗性TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。
在一些实施方式中，将来自步骤(e)的TIL输注到患者体内。
在一些实施方式中，封闭容器包括单个生物反应器。
在一些实施方式中，封闭容器包括G-REX-10。
在一些实施方式中，封闭容器包括G-REX-100。
在一些实施方式中，在步骤(d)中，以APC：TIL为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(APC)添加到第二TIL群的细胞培养基中。
在一些实施方式中，细胞培养基具有2.5×109个APC：100×106个TIL的比率。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，以APC：TIL为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(APC)添加至第二TIL群的细胞培养基中。
在一些实施方式中，细胞培养基具有2.5×109个APC：100×106个TIL的比率。
在一些实施方式中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑在第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行。
在一些实施方式中，基因编辑在步骤(b)之前、步骤(c)之前或步骤(d)之前进行。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，从第一次扩增起始日开始，细胞培养基包含OKT-3；在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
在一些实施方式中，基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
在一些实施方式中，基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
在一些实施方式中，基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
在一些实施方式中，基因编辑包括CRISPR法。
在一些实施方式中，CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
在一些实施方式中，基因编辑包括TALE法。
在一些实施方式中，基因编辑包括锌指法。
在另一个实施方式中，本发明提供了已根据本文所述的任何扩增方法进行扩增的治疗性TIL群(例如，用于治疗受试者的癌症)；其中，所述治疗性TIL群已被永久性基因编辑。
在另一个实施方式中，本发明还提供一种用于治疗患有癌症的受试者的扩增的TIL群，其中，该扩增的TIL群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三TIL群：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由受试者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；其中，所述第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；以及
(h)在该方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
在一些实施方式中，上述方法还包括本文所述的任一方法和组合物中列举的一种以上特征。
在一些实施方式中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
在一些实施方式中，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑在第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行。
在一些实施方式中，基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之前进行基因编辑。
在一些实施方式中，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，从第一次扩增起始日开始，细胞培养基包含OKT-3；在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
在一些实施方式中，基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
在一些实施方式中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
在一些实施方式中，基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
在一些实施方式中，基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
在一些实施方式中，基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
在一些实施方式中，基因编辑包括CRISPR法。
在一些实施方式中，CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
在一些实施方式中，基因编辑包括TALE法。
在一些实施方式中，基因编辑包括锌指法。
在另一个实施方式中，本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，该方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器(gene editor)的转移；
(f)使第二TIL群静息(resting)约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR，ClusteredRegularly Interspersed Short Palindromic Repeat)系统、转录激活因子样效应物(TALE，Transcription Activator-Like Effector)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括以下步骤：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；以及
(k)从输液袋向患者施用治疗有效剂量的收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于治疗患有癌症的受试者的扩增的TIL群，其中，所述扩增的TIL群是可由包括以下步骤的方法获得的收获的TIL群：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
在一些实施方式中，该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增；其中，从第0天或第1天开始，OKT-3和4-1BB激动剂抗体可选地存在于细胞培养基中。
在另一个实施方式中，本发明提供了冷冻保存组合物，该冷冻保存组合物包含用于治疗患有癌症的受试者的TIL群、包含DMSO的冷冻保护剂和电解质溶液。
在一些实施方式中，冷冻保存组合物还可包含一种以上稳定剂(例如HSA)和一种以上淋巴细胞生长因子(例如IL-2)。
在一些实施方式中，包含DMSO的冷冻保护剂和电解质溶液以约1.1：1至约1：1.1的比率存在。
在一些实施方式中，冷冻保存组合物包含：约30mL至约70mL的包含DMSO的冷冻保护剂；约30mL至约70mL的电解质溶液；约0.1g至约1.0g的HAS以及约0.001mg至约0.005mg的IL-2。
附图说明
图1：显示了过程2A(22天的TIL生产过程)的一个实施方式的图。
图2：显示了TIL生产的1C过程和2A过程的实施方式之间的比较。
图3：显示了1C过程的时间线。
图4：显示了使用更高细胞计数的过程2A进行TIL生产的TIL治疗的一个实施方式的过程，包括施用步骤和联合治疗步骤。
图5：显示了使用更低细胞计数的过程2A进行TIL生产的TIL治疗的一个实施方式的过程，包括施用步骤和联合治疗步骤。
图6：显示了2A过程的一个实施方式的详细示意图。
图7a、7b和7c：描述了包括冷冻保存步骤的过程2A的实施方式的主要步骤。
图8：描述了临床试验设计，包括用过程1C和过程2A的实施方式治疗的队列。
图9：概述了步骤A至步骤F的过程2A的示例性图。
图10：关于过程2A数据收集计划的过程流程图。
图11：快速扩增方案(REP)的示例性实施方式的方案。到达后，破碎肿瘤，将肿瘤碎片放入加有IL-2的G-REX烧瓶中进行TIL扩增(pre-REP扩增)，持续11天。对于三重混合物(triple cocktail)研究，在pre-REP开始时添加IL-2/IL-15/IL-21。对于快速扩增方案(REP)，将TIL与饲养细胞和OKT3一起培养，REP扩增另外的11天。
图12：显示了过程2A(22天的TIL生产过程)的实施方式的图。
图13：过程1C和过程2A的示例性实施方式的步骤A至步骤F的比较表。
图14：过程1C的一个实施方式和过程2A的一个实施方式的详细比较。
图15：TIL治疗过程的一个实施方式的详细方案。
图16：冷冻保存的TIL的生产过程(22天)的一个实施方式的描述。
图17：从Gen 1到Gen 2的过程改进的表。
图18：本发明的TIL生产过程的一个实施方式。
图19：过程2A的过程流程图。
图20：TIL生产过程的一个实施方式的描述，包括与基因编辑过程(包括本文所述的TALEN法、锌指核酸酶法和CRISPR法)一起使用的电穿孔步骤。
图21：TIL生产过程的实施方式的描述，包括与基因编辑过程(包括本文所述的TALEN法、锌指核酸酶法和CRISPR法)一起使用的电穿孔步骤。
图22：显示了结构I-A和I-B，圆柱表示单个多肽结合结构域。结构I-A和结构I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域(其来自例如4-1BBL或与4-1BB结合的抗体)，这些结构域折叠形成三价蛋白，然后通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)与第二个三价蛋白连接，然后通过二硫键(小的细长椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构，提供能将六个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起形成信号传导复合体的激动剂。TNFRSF结合结构域(表示为圆柱)可以是scFv结构域，其包括例如通过接头连接的VH和VL链，该接头可以包含亲水性残基和Gly和Ser序列(用于柔韧性)以及Glu和Lys(用于溶解性)。
图23：描述了靶向Pdcd1基因的外显子2的TALEN构建体。
具体实施方式
一、介绍
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞治疗已经在宿主免疫抑制后的黑色素瘤患者中产生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数依赖于TIL组成的读数(例如CD28、CD8或者CD4阳性)以及REP产物的扩增数值倍数和活力。
目前的REP方案很少考虑将被输注到患者体内的TIL的健康状况。T细胞在从幼稚T细胞到效应T细胞的成熟过程中经历了深刻的代谢转变(参见Chang等，Nat.Immunol.2016，17，364，在此明确地整体并入，特别是对于厌氧和有氧代谢的讨论和标志物)。例如幼稚T细胞依靠线粒体呼吸产生ATP，而成熟、健康的效应T细胞如TIL是高度糖酵解的，依靠有氧糖酵解提供它们增殖、迁移、活化和抗肿瘤疗效所需的生物能量学底物。
先前论文报道，在转移前限制TIL中的糖酵解和促进TIL中的线粒体代谢是期望的，因为严重依赖糖酵解的细胞在过继性转移时会遭受营养缺乏，这会导致大部分转移的细胞死亡。因此，本领域教导，促进线粒体代谢可能会促进体内寿命，并且事实上建议在诱导免疫应答之前使用糖酵解抑制剂。参见Chang等(Chang等，Nat.I mmunol.2016，17(364)，574-582)。
在一些实施方式中，本发明还涉及评价和量化代谢健康的此种增加的方法。因此，本发明提供了使用代谢的一种以上常规评价来检测TIL群的相对健康的方法，该方法包括但不限于糖酵解、氧化磷酸化、备用呼吸能力(SRC)和糖酵解储备的速率和量。
此外，在一些实施方式中，本发明还涉及评价和量化代谢健康的此种增加的方法。因此，本发明提供了使用代谢的一种以上常规评价来检测TIL群的相对健康的方法，该方法包括但不限于糖酵解、氧化磷酸化、备用呼吸能力(SRC)和糖酵解储备的速率和量。
此外，可选的另外评价包括但不限于ATP产生、线粒体质量和葡萄糖摄取。
在一些实施方式中，本发明还涉及使用基因编辑技术来增强TIL的治疗效果。虽然肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性转移提供了一种有前景望且有效的治疗，但仍强烈需要能提高患者的反应率和反应强度的更有效的TIL治疗。如本文所述，本发明的实施方式提供了将TIL扩增成治疗性TIL群的方法，该治疗性TIL群经基因编辑以提供增强的治疗效果。
二、定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文提及的所有专利和出版物均通过引用整体并入本文。
术语“体内”指发生在受试者体内的事件。
术语“体外”指在受试者体外发生的事件。体外检测包括使用活细胞或死细胞的基于细胞的检测，并且还可以包括不使用完整细胞的无细胞检测。
术语“离体”指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。适当地，该细胞、组织和/或器官可通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
术语“快速扩增”指在一周的时间内抗原特异性TIL的数量增加至少约3倍(或者4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或者9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或者20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或者90倍)，或者最优选在一周的时间内增加至少约100倍。下文概述了许多快速扩增方案。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“TIL”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次代TIL。“原代TIL”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或者增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于大量TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或者“post-REP TIL”)。TIL细胞群可以包括经基因修饰(genetically modified)的TIL。
本文的“细胞群”(包括TIL)指许多具有共同特征的细胞。通常，群的数量通常为1×106至1×1010，不同的TIL群包含不同的数量。例如，在IL-2存在下，原代TIL的初始增长产生约1×108个细胞的大量TIL群。通常，进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞的群用于输注。
本文的“冷冻保存的TIL”指在约-150℃至-60℃范围内进行处理和储存的原代、大量或扩增的TIL(REP TIL)。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方描述，包括在实施例中。为清楚起见，“冷冻保存的TIL”能够与可用作原代TIL来源的冷冻组织样品区分开。
本文的“解冻的冷冻保存的TIL”指先前被冷冻保存然后被处理以恢复至室温以上温度(包括但不限于细胞培养温度或可将TIL施用于患者的温度)的TIL群。
TIL通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或者通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外，或者，TIL可通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力在功能上定义。
术语“冷冻保存培养基(cryopreservation media)”或者“冷冻保存培养基(cryopreservation medium)”指可用于细胞的冷冻保存的任何培养基。此类培养基可以包括包含7％至10％DMSO的培养基。示例性的培养基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及它们的组合。术语“CS10”指购自Stemcell Technologies或者Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以用商品名“
Figure BDA0002855613220000221
CS10”来指代。CS10培养基是包含DMSO的无血清无动物成分的培养基。
术语“中枢记忆T细胞”指人细胞中CD45R0+并且组成性地表达CCR7(CCR7高)和CD62L(CD62高)的T细胞亚群。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。在TCR触发后，中枢记忆T细胞主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞在血液中的CD4区室(compartment)中占优势，在人体中按比率富集在淋巴结和扁桃体。
术语“效应记忆T细胞”指人或哺乳动物T细胞的亚群，其与中枢记忆T细胞一样，为CD45R0+，但丧失CCR7的组成型表达(CCR7低)，并且异质性或CD62L的表达低(CD62L低)。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后迅速分泌高水平的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞在血液的CD8区室中占优势，在人体中在肺、肝和肠中按比率富集。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
术语“封闭系统”指的是对外部环境封闭的系统。适用于细胞培养方法的任何封闭系统均可用于本发明的方法。封闭系统包括例如但不限于封闭的G容器。一旦将肿瘤碎片加入封闭系统中，系统就不会向外部环境开放，直至TIL准备好施用于患者。
本文用于描述破坏肿瘤的方法的术语“碎片化”(fragmenting)、“碎片化”(fragment)和“经碎片化”(fragmented)包括机械破碎方法，例如破碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。优选地，外周血单核细胞是辐照的同种异体外周血单核细胞。PBMC是一种抗原呈递细胞。
术语“抗CD3抗体”指抗体或者它的变体(例如单克隆抗体)，包括：针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗(Muromonab)。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)和威司利珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)指单克隆抗体或者其生物类似物或者变体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体，还包括市售形式，如OKT-3(30ng/mL，纯MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech，Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥)和莫罗单抗，或者其变体、保守性氨基酸取代、糖型(glycoform)或者生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，American Type CultureCollection)，并且其分配的ATCC登录号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC，European Collection of Authenticated CellCultures)中，并且其分配的目录号为86022706。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆(购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend)，也称为T3和CD3ε。
表1：莫罗单抗的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000231
Figure BDA0002855613220000241
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-2描述于例如Nelson，J.I mmunol.2004，172，3983-88和Malek，Annu.Rev.Immunol.2008，26，453-79，其公开内容其内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2包括人类重组形式的IL-2，例如，阿地白细胞介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每个单独使用的小管2200万IU)，以及可购自美国新罕布什尔州朴茨茅斯的CellGenix，Inc.(CELLGRO GMP)或美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)的重组形式的IL-2和其他供应商的其他商业等价物。阿地白细胞介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量约为15kDa。适用于本发明的阿地白细胞介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可购自美国加利福尼亚州南旧金山的NektarTherapeutics公司。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容其内容通过引用并入本文。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容其内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容其内容通过引用并入本文。
表2：白细胞介素的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000242
Figure BDA0002855613220000251
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)指称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节幼稚辅助性T细胞(Th0细胞)向Th2 T细胞的分化。Steinke和Borish，Respir.Res.2001，2，66-70。在被IL-4活化后，Th2 T细胞随后在正反馈环中产生另外的IL-4。IL-4还刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并诱导B细胞转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国Waltham，MA的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号GibcoCTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突状细胞中获得。Fry和Mackall，Blood 2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的生长。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IL-7受体α和常见γ链受体(co mmon ga mma chain receptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对胸腺内的T细胞发育和外周存活具有重要作用。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国Waltham，MA的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri，Blood 2001，97，14-32中，其公开内容其内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人IL-15是非糖基化多肽单链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国Waltham，MA的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，Nat.Rev.Drug.Disc.2014，13，379-95，其公开内容其内容通过引用并入本文。IL-21主要由自然杀伤T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是非糖基化多肽单链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国Waltham，MA的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：8)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医生确定，考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异。通常可以说，包含本文所述的经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的药物组合物可以104至1011个细胞/kg体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/kg体重)的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组合物也可以这些剂量多次施用。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞可通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg et al.，“新的”Eng.J.of Med.319：1676，1988)。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
术语“血液恶性肿瘤(hematological malignancy)”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓样白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。术语实体瘤癌症指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
术语“液体肿瘤”指本质上是流体的异常细胞团。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤获得的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
如本文所用，术语“微环境”可以指整个实体或血液肿瘤微环境，或指微环境内的单个细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境指“细胞、可溶性因子、信号分子、细胞外基质，以及促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、促进治疗抵抗力并为显性转移灶的繁殖提供利基的机制线索”的复杂混合物，如Swartz等，Cancer Res.，2012，72，2473中所述。尽管肿瘤表达应该被T细胞识别到的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统很少清除肿瘤。
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，在输注本发明的TIL之前用非清髓性化疗预处理患者。在一些实施方式中，可以提供TIL群；其中，在输注本发明的TIL之前，用非清髓性化疗对患者进行预处理。在一个实施方式中，非清髓性化疗是环磷酰胺60mg/kg/天、持续2天(TIL输注前第27和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天、持续5天(TIL输注前第27至第23天)。在一个实施方式中，在根据本发明的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2的静脉输注，直至生理耐受。
实验发现表明，过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在增强治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的rTIL之前对患者使用淋巴耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administering)”、“与...组合施用(administered in combination with)”、“与...组合施用(administering in combination with)”、“同时”和“共同”包括向受试者施用两种以上活性药物成分(在本发明的一个优选实施方式中，例如至少一种钾通道激动剂与多个TIL组合)，使得活性药物成分和/或它们的代谢物同时存在于受试者体内。共同施用包括：同时施用不同的组合物、在不同时间施用不同的组合物，或者施用其中存在两种以上活性药物成分的组合物。优选同时施用不同的组合物和施用其中存在两种药剂的组合物。
术语“有效量”或者“治疗有效量”指如本文所述的化合物或者化合物组合的量足够实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或者体内)或者所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或者施用方式而变化。该术语还适用于会在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将取决于所选择的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织以及携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括哺乳动物，特别是人类中疾病的任何治疗，包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。
当针对核酸或者蛋白质部分使用时，术语“异源”表示核酸或者蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列。例如核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个以上序列，它被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区，或者来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个以上核酸或多肽的情况下，术语“序列同一性”，“百分比同一性”和“序列百分比同一性”(或其同义词，例如“99％同一性”)指，当比较和比对(视需要的话，引入空位)以获得最大对应性时，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可使用序列比较软件或算法或通过目视检查，来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。测定序列同一性百分比的合适程序包括，例如可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站获得的BLAST程序套件。可使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(加利福尼亚州南旧金山的Genentech)或可从DNASTAR获得的MegAlign是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些实施例中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的抗体或融合蛋白：其通过在参考抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体在其氨基酸序列中可包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如取代相似带电荷或不带电荷的氨基酸。该变体保留了特异性结合参考抗体的抗原的能力。术语“变体”还包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“TIL”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次代TIL。“原代TIL”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或者增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于大量TIL、扩增的TIL(“REP TIL”)以及“reREP TIL”。例如，reREP TIL可以包括第二次扩增TIL或者第二次另外的扩增TIL(例如，图9的步骤D中所描述的那些，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或者通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外，或者，TIL可通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力在功能上定义。TIL还可通过效价强度来表征——例如，如果例如干扰素(IFN)的释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可被认为是有效的。
术语“药学上可接受的载体”或者“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。此种药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所述组合物和方法中。
术语“约”和“大约”表示在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或者范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或者“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”表示大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性不是、也不必是精确的，但可以视需要是近似的和/或更大的或者更小的，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。通常，大小、尺寸、配方、参数、形状或者其他性质或者特性是“约”或者“近似”的，无论是否明确说明如此。应注意，具有非常不同的尺寸、形状和大小的实施方式可采用所述安排。
当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，转变术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”定义了关于被排除在权利要求的范围之外的未列举的另外的权利要求要素或者步骤(如果有的话)的权利要求范围。术语“包含”旨在是包含性的或者开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或者材料。术语“由......组成”不包括除权利要求中所述那些之外的任何元素、步骤或者材料，在材料的情况下，术语“由...组成”不包括与指定材料相关的普通杂质。术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为指定的元素、步骤或者材料以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。在替代实施方式中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可以更具体地由任意转变术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”定义。
三、基因编辑过程
A.概述：TIL扩增+基因编辑
本发明的实施方式涉及扩增TIL群的方法，该方法包括基因编辑至少一部分TIL以增强其治疗效果的一个以上步骤。如本文所用，“基因编辑(gene-editing)”、“基因编辑(gene-edit)”和“基因组编辑(genome editing)”指细胞基因组中的DNA被永久性修饰的一种基因修饰，例如，细胞基因组内的DNA被插入、缺失、修饰或替代。在一些实施方式中，基因编辑导致DNA序列的表达被沉默(有时称为基因敲除(gene knockout))或被抑制/降低(有时称为基因敲落(gene knockdown))。在其他实施方式中，基因编辑引起DNA序列的表达增强(例如通过引起过表达)。根据本发明的实施方式，基因编辑技术用于增强治疗性TIL群的有效性。
将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可以根据本文所述方法的任何实施方式进行(例如下文描述了称为过程2A的示例性TIL扩增方法)，其中所述方法还包括对至少一部分TIL进行基因编辑。根据其他实施方式，将TIL扩增成治疗性TIL群的方法根据PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633(其全部内容通过引用并入本文)中所述方法的任何实施方式进行，其中该方法还包括对至少一部分TIL进行基因编辑。因此，本发明的一个实施方式提供了根据本文所述的任何实施方式进行扩增的治疗性TIL群，其中至少一部分治疗性TIL群已经被基因编辑，例如，转移至输液袋的至少一部分治疗性TIL群已被永久性基因编辑。
B.TIL扩增期间基因编辑的时机
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增(例如，OKT-3可从扩增过程的起始日期开始存在于培养基中)，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；其中，第三TIL群是治疗性TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(g)在该方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
如上述实施方式的步骤(g)中所述，基因编辑过程可以在TIL扩增方法期间的任何时间进行，这意味着可以在扩增方法的任一步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在上述方法概述的步骤(a)至步骤(f)中任一步骤期间，或在上述方法概述的步骤(a)至步骤(f)中任一步骤之前或之后。根据某些实施方式，在扩增方法期间收集TIL(例如，对于至少部分TIL，扩增方法被“暂停”)，对收集的TIL进行基因编辑过程，在某些情况下，随后将其重新引入扩增方法中(例如重新引入培养基中)以继续扩增过程，从而使最终转移至输液袋的至少一部分治疗性TIL群被永久性基因编辑。在一个实施方式中，可通过以下步骤在扩增之前进行基因编辑过程：活化TIL，对活化的TIL进行基因编辑步骤，以及根据本文所述过程扩增经基因编辑的TIL。
应注意，扩增过程的替代实施方式可不同于上述方法；例如，替代实施方式可不采用相同的步骤(a)至步骤(g)，或具有不同的步骤数量。无论具体的实施方式如何，基因编辑过程可以在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方式可包括超过两次扩增，可在第三次扩增或第四次扩增等期间对TIL进行基因编辑。
根据一个实施方式，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑过程。例如，可以对第一TIL群或从第一TIL群收集的部分TIL进行基因编辑，在基因编辑过程之后，随后可将这些TIL放回扩增过程中(例如放回培养基中)。或者，可对第二TIL群或第三TIL群或分别从第二TIL群或第三TIL群收集的部分TIL进行基因编辑，在基因编辑过程之后，随后可将这些TIL放回扩增过程中(例如放回培养基中)。根据另一个实施方式，在TIL仍在培养基中且在进行扩增的同时进行基因编辑，即，不必为了进行基因编辑而将TIL从扩增中“取出”。
根据另一个实施方式，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑过程。例如，在第一次扩增或第二次扩增期间，可对从培养基收集的TIL进行基因编辑，在基因编辑过程之后，随后可将这些TIL放回扩增方法中(例如将这些TIL重新引入培养基中)。
根据另一个实施方式，在第一次扩增之后和第二次扩增之前，对至少一部分TIL进行基因编辑过程。例如，在第一次扩增之后，可对从培养基中收集的TIL进行基因编辑，在基因编辑过程之后，随后可将这些TIL放回扩增方法中(例如将这些TIL重新引入培养基中)用于第二次扩增。
根据替代实施方式，基因编辑过程在步骤(c)之前(例如在步骤(a)至步骤(b)中任一步骤之前、期间或之后)、在步骤(d)之前(例如在步骤(a)至步骤(c)中任一步骤之前、期间或之后)、在步骤(e)之前(例如在步骤(a)至步骤(d)中任一步骤之前、期间或之后)或在步骤(f)之前(例如在步骤(a)至步骤(e)中任一步骤之前、期间或之后)进行。
应注意，根据某些实施方式，关于OKT-3，细胞培养基可从第一次扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含OKT-3，使得在第0天和/或第1天TIL被暴露于细胞培养基中的OKT-3之后，对TIL进行基因编辑。根据另一个实施方式，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含OKT-3；在将OKT-3引入细胞培养基之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增和/或第二次扩增期间包含OKT-3，在将OKT-3引入细胞培养基之后进行基因编辑。
还应注意，根据某些实施方式，关于4-1BB激动剂，细胞培养基可从第一次扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含4-1BB激动剂，使得在第0天和/或第1天TIL被暴露于细胞培养基中的4-1BB激动剂之后，对TIL进行基因编辑。根据另一个实施方式，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含4-1BB激动剂；在将4-1BB激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增和/或第二次扩增期间包含4-1BB激动剂，在将4-1BB激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
还应注意，根据某些实施方式，关于IL-2，细胞培养基可从第一次扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含IL-2，使得在第0天和/或第1天TIL被暴露于细胞培养基中的IL-2之后，对TIL进行基因编辑。根据另一个实施方式，在第一次扩增和/或第二次扩增期间，细胞培养基包含IL-2；在将IL-2引入细胞培养基之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增和/或第二次扩增期间包含IL-2，在将IL-2引入细胞培养基之后进行基因编辑。
如上所述，细胞培养基可从第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一种以上。根据一个实施方式，细胞培养基从第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3；和/或细胞培养基从第一次扩增的第0天或第1天开始包含4-1BB激动剂；和/或细胞培养基从第一次扩增的第0天或第1天开始包含IL-2。根据一个实施方式，细胞培养基从第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3和4-1BB激动剂。根据另一个实施方式，细胞培养基从第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2。当然，如本文所述的各种实施方式中所述，可在扩增过程中的一个以上其他时间点，将OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一种以上添加到细胞培养基中。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群。
根据一个实施方式，前述方法可用于提供自体收获的TIL群，用于治疗患有癌症的人类受试者。
C.免疫检查点
根据本发明的具体实施方式，通过基因修饰TIL群的一种以上免疫检查点基因来对TIL群进行基因编辑。换言之，TIL中编码一种以上TIL免疫检查点的DNA序列在TIL的基因组中被永久性修饰(例如插入、缺失或替换)。免疫检查点是淋巴细胞表达的分子，可通过抑制或刺激通路调节免疫应答。在癌症的情况下，免疫检查点通路通常被活化以抑制抗肿瘤反应，即，恶性细胞表达某些免疫检查点会抑制抗肿瘤免疫力并有利于癌细胞的生长。参见例如Marin-Acevedo等，Journal of Hematology&Oncology(2018)11:39。因此，某些抑制性检查点分子用作本发明的免疫疗法的靶标。根据具体实施方式，对TIL进行基因编辑以阻断或刺激某些免疫检查点途径，从而增强人体对肿瘤的免疫活性。
如本文所用，免疫检查点基因包含编码免疫检查点分子的DNA序列。根据本发明的具体实施方式，TIL扩增方法期间的基因编辑TIL导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。例如，基因编辑可能导致抑制性受体(例如PD-1或CTLA-4)的表达被沉默或降低以增强免疫反应。
最广泛研究的检查点包括程序性细胞死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关分子4(CTLA-4)，当与抑制性配体相互作用时，它们是免疫细胞上抑制关键效应子功能(例如活化、增殖、细胞因子释放、细胞毒性等)的抑制性受体。如下文更详细地讨论，除PD-1和CTLA-4之外，许多检查点分子已成为免疫治疗的潜在靶标。
可以通过永久性基因编辑本发明的TIL来沉默或抑制的免疫检查点基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、BAFF(BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF1010、CASP8、CASP CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、L10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1B2和GUCY1B3。例如，在本发明的TIL中，可被沉默或抑制的免疫检查点基因可选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CISH、TGFβ和PKA。Bloom等，J.Immunother.，2018(出版中)描述了BAFF(BR3)。根据另一个示例，在本发明的TIL中，可被沉默或抑制的免疫检查点基因可选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH，TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
1.PD-1
研究最多的诱导检查点阻断的靶标之一是程序性死亡受体(PD1或PD-1，也称为PDCD1)，它是T细胞调节剂CD28超家族的成员。它的配体PD-L1和PD-L2在包括黑色素瘤在内的多种肿瘤细胞上表达。PD-1与PD-L1的相互作用抑制了T细胞效应子功能，在慢性刺激的情况下导致T细胞衰竭，在肿瘤微环境中诱导T细胞凋亡。PD1也可能在免疫监控中的肿瘤特异性逃逸中发挥作用。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中PD1的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制PD1的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下面更详细描述的，基因编辑过程可涉及使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如PD1)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或减少TIL中PD1的表达。
2.CTLA-4
T细胞活化后，活化的T细胞上的CTLA-4表达被诱导，并竞争结合活化抗原CD80和CD86的抗原呈递细胞。CTLA-4与CD80或CD86的相互作用引起T细胞抑制，起到维持免疫反应平衡的作用。但是，抑制CTLA-4与CD80或CD86的相互作用可能会延长T细胞活化，从而增加对癌症抗原的免疫应答水平。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中CTLA-4的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制CTLA-4的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如CTLA-4)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中CTLA-4的表达。
3.LAG-3
在主要的组织相容性复合体(MHC)II类连接后，T细胞和自然杀伤(NK)细胞表达淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，CD223)。尽管机制尚不清楚，但其调节作用会导致对T细胞功能的负调节作用，从而防止组织损伤和自身免疫。TIL的LAG-3和PD-1经常被共表达和上调，导致免疫力衰竭和肿瘤生长。因此，LAG-3阻断改善了抗肿瘤反应。参见例如Marin-Acevedo等，Journal of Hematology&Oncology(2018)11:39。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中LAG-3的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制LAG-3的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该核酸酶介导在免疫检查点基因(例如LAG-3)处产生双链或单链断裂。根据具体实施方式，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中LAG-3的表达。
4.TIM-3
T细胞免疫球蛋白-3(TIM-3)是T细胞的直接负调节剂，在NK细胞和巨噬细胞上表达。TIM-3通过诱导髓样来源的抑制细胞(MDSC)的扩增间接地促进免疫抑制。已发现TIM-3水平在功能异常和耗竭的T细胞中特别升高，表明其在恶性肿瘤中起重要作用。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中TIM-3的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制TIM-3的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如TIM-3)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中TIM-3的表达。
5.CISH
CISH(细胞因子信号传导抑制物(SOCS)家族的成员)由CD8+T细胞中的TCR刺激诱导并抑制CD8+T细胞对肿瘤的功能亲和力(avidity)。CD8+T细胞中CISH的基因缺失可能会增强该细胞的扩增、功能亲和力和细胞因子多功能性，导致已建立肿瘤的明显且持久的消退。参见例如Palmer等，Journal of Experiment Medicine，212(12)：2095(2015)。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中CISH的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制CISH的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如CISH)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中CISH的表达。
6.TGFβ
TGFβ信号通路在调节细胞生长、分化、凋亡、运动性和侵袭、细胞外基质产生、血管生成和免疫应答中具有多种功能。TGFβ信号转导失调在肿瘤中很常见，其在肿瘤初发、发展和转移中起关键作用。在微环境水平上，TGFβ通路有助于在整个癌变过程中为肿瘤的生长和转移产生有利的微环境。参见，例如Neuzillet等，Pharmacology&Therapeutics，147：22-31(2015)。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中TGFβ的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或减少TGFβ的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下面更详细描述的，基因编辑过程可以包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如TGFβ)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中TGFβ的表达。
在一些实施方式中，使用本领域已知的方法，可通过使用CRISPR/Cas9系统使TGFβR2沉默或通过使用TGFβR2显性负向细胞外陷阱(negative extracellular trap)使TGFβR2沉默来抑制TGFβR2(TGFβ受体2)。
7.PKA
蛋白激酶A(PKA)是公知的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶超家族成员。PKA(也称为cAMP依赖性蛋白激酶)是一种多单位蛋白激酶，PKA在cAMP结合后通过其活化介导G蛋白偶联受体的信号转导。PKA涉及从新陈代谢到离子通道活化、细胞生长和分化、基因表达和细胞凋亡的各种细胞过程的控制。重要的是，PKA与许多肿瘤的发生和发展有关。参见，例如Sapio等，EXCLI Journal；2014；13：843-855。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中PKA的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制PKA的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如PKA)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中PKA的表达。
8.CBLB
CBLB(或CBL-B)是E3泛素蛋白连接酶，是T细胞活化的负调节剂。Bachmaier等，Nature 2000，403，211-216；Wallner等，Clin.Dev.Immunol.2012，692639。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中CBLB的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制CBLB的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下文更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如CBLB)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中PKA的表达。在一些实施方式中，使用TALEN敲除使CBLB沉默。在一些实施方式中，使用TALE-KRAB转录抑制剂敲入使CBLB沉默。关于这些方法的更多细节，参见Boettcher和McManus，Mol.Cell Review 2015，58，575-585。
9.TIGIT
具有Ig及ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)结构域的T细胞免疫受体或TIGIT是胞浆域(cytoplasmic domain)内具有Ig样V型结构域和ITIM的跨膜糖蛋白受体。Khalil等，Advances in Cancer Research 2015，128：1-68；Yu等，Nature Immunology 2009，10(1)：48-57。TIGIT由某些T细胞和自然杀伤细胞表达。此外，已显示TIGIT在特别是患有黑色素瘤的个体的抗原特异性CD8+T细胞和CD8+TIL上过表达。研究表明，TIGIT通路有助于肿瘤免疫逃避，据显示TIGIT抑制可增加响应于多克隆和抗原特异性刺激的T细胞活化和增殖。Khalil等，Advances in Cancer Research 2015，128：1-68。此外，在小鼠模型中，已显示TIGIT与PD-1或TIM3的共阻断针对实体瘤具有协同作用。另见Kurtulus等，The Journal ofClinical Investigation 2015，125(11)：4053-4062。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法沉默或降低TIL中TIGIT的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过沉默或抑制TIGIT的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下面更详细描述的，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在免疫检查点基因(例如TIGIT)处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来沉默或抑制TIL中TIGIT的表达。
D.共刺激受体或粘附分子的过表达
根据其他实施方式，在TIL扩增方法期间对TIL进行基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强。例如，基因编辑可引起刺激性受体的表达增强，这意味着该刺激性受体与未经过基因修饰的刺激性受体的表达相比过表达。通过永久性基因编辑本发明TIL可表现出表达增强的免疫检查点基因的非限制性实例包括某些趋化因子受体和白细胞介素，例如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
1.CCR
为了使过继性T细胞免疫疗法有效，需要通过趋化因子将T细胞适当运输至肿瘤中。肿瘤细胞分泌的趋化因子、周围存在的趋化因子和T细胞表达的趋化因子受体之间的匹配对于将T细胞成功运输到肿瘤床至关重要。
根据具体实施方式，本发明的基因编辑方法可用于增加某些趋化因子受体在TIL中的表达，例如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上。在过继性转移后，CCR的过表达可能有助于促进效应子功能和TIL的增殖。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法增强TIL中CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过增强CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下面更详细描述的，基因编辑过程可以包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在趋化因子受体基因处产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来增强TIL中某些趋化因子受体的表达。
在一个实施方式中，使用本文所述的γ-逆转录病毒或慢病毒方法，将CCR4和/或CCR5粘附分子插入TIL群。在一个实施方式中，如Forget等，Frontiers Immunology 2017，8，908或Peng等，Clin.Cancer Res.2010，16，5458(其公开内容通过引用并入本文)所述，使用γ-逆转录病毒或慢病毒方法将CXCR2粘附分子插入TIL群。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1和可选的LAG-3的表达；此外，其中，通过γ-逆转录病毒或慢病毒方法将CXCR2粘附分子插入第一TIL群、第二TIL群或收获的TIL群。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1以及可选的LAG-3的表达；此外，其中，通过γ-逆转录病毒或慢病毒方法将CCR4和/或CCR5粘附分子插入第一TIL群、第二TIL群或收获的TIL群。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1以及可选的LAG-3的表达；此外，其中，通过γ-逆转录病毒或慢病毒方法将粘附分子插入第一TIL群、第二TIL群或收获的TIL群，所述粘附分子选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3，CX3CR1及它们的组合。
2.白细胞介素
根据其他实施方式，本发明的基因编辑方法可用于增加某些白细胞介素的表达，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-21中的一种以上。已经证明某些白细胞介素可以增强T细胞的效应子功能并介导肿瘤控制。
根据具体实施方式，本发明的组合物和方法增强IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-21中的一种以上在TIL中的表达。例如，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述的方法的任何实施方式(例如，过程2A或图20和21所示方法)进行，其中，该方法包括通过增强IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-21中的一种以上的表达来基因编辑至少一部分TIL。如下面更详细描述的，基因编辑过程可以包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导在白细胞介素基因从产生双链或单链断裂。例如，可使用CRISPR法、TALE法或锌指法来增强TIL中某些白细胞介素的表达。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1以及可选的LAG-3的表达；此外，其中，通过γ-逆转录病毒或慢病毒方法将白细胞介素插入第一TIL群、第二TIL群或收获的TIL群，所述白细胞介素选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21及它们的组合。
E.基因编辑方法
如上所述，本发明的实施方式提供了已通过基因编辑进行基因修饰以增强其治疗效果的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。本发明的实施方式包括通过核苷酸插入(RNA或DNA)到TIL群中进行基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达和抑制一种以上蛋白质的表达以及它们的组合。本发明的实施方式还提供了将TIL扩增成治疗性群的方法，其中，所述方法包括对TIL进行基因编辑。有几种可用于基因修饰TIL群的基因编辑技术，其适用于根据本发明使用。
在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括稳定掺入用于产生一种以上蛋白质的基因的步骤。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统是本领域已知的，描述于例如Levine等，Proc.Nat’l Acad.Sci.2006，103，17372-77；Zufferey，etal.，Nat.Biotechnol.1997，15，871-75；Dull等，J.Virology 1998，72，8463-71和美国专利号6,627,442，其各自公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统是本领域已知的，描述于例如Cepko和Pear，Cur.Prot.Mol.Biol.1996，9.9.1-9.9.16，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统是本领域已知的，包括这样的系统：转座酶以DNA表达载体或可表达RNA或蛋白质的形式提供，使得转座酶不会在转基因细胞中长期表达，例如，转座酶作为mRNA(例如，包含帽和poly-A尾的mRNA)提供。合适的转座子介导的基因转移系统，包括鲑鱼(salmonid)型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x，以及具有增强的酶活性的工程化酶，描述于例如Hackett等，Mol.Therapy 2010，18：674-83和美国专利号6,489,458，其各自公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括稳定掺入用于产生或抑制(例如沉默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法是本领域已知的，描述于例如Tsong，Biophys J.1991，60，297-306和美国专利申请公开号2014/0227237 A1，其各自公开内容通过引用并入本文。可使用本领域已知的其他电穿孔方法，例如美国专利号5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613和6,078,490中所述的那些，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，电穿孔方法是无菌电穿孔方法。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中确定且受控的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加至少三个场强为100V/cm以上、操作器控制独立编程的单个DC电脉冲的序列的步骤；其中，至少三个DC电脉冲的序列具有一种、两种或三种以下特征：(1)至少三个脉冲中至少两个的脉冲幅度彼此不同；(2)至少三个脉冲中至少两个的脉冲宽度彼此不同；以及(3)至少三个脉冲中两个的第一组的第一脉冲间隔不同于至少三个脉冲中两个的第二组的第二脉冲间隔。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中确定且受控的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加至少三个场强为100V/cm以上、操作器控制独立编程的单个DC电脉冲的序列的步骤；其中，至少三个脉冲中至少两个的脉冲幅度彼此不同。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中确定且受控的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加至少三个场强为100V/cm以上、操作器控制独立编程的单个DC电脉冲的序列的步骤；其中，至少三个脉冲中至少两个的脉冲宽度彼此不同。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中确定和受控的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加至少三个场强为100V/cm以上、操作器控制独立编程的单个DC电脉冲的序列的步骤；其中，至少三个脉冲中两个的第一组的第一脉冲间隔不同于至少三个脉冲中两个的第二组的第二脉冲间隔。在一个实施方式中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL的孔形成的步骤，包括向TIL施加至少三个场强为100V/cm以上的DC电脉冲的序列的步骤；其中，至少三个DC电脉冲的序列具有一种、两种或三种以下特征：(1)至少三个脉冲中至少两个的脉冲幅度彼此不同；(2)至少三个脉冲中至少两个的脉冲宽度彼此不同；以及(3)至少三个脉冲中两个的第一组的第一脉冲间隔不同于至少三个脉冲中两个的第二组的第二脉冲间隔，使得诱导的孔维持相对长的时间段，并且使得TIL的活力被保持。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和内吞)是本领域中已知的，描述于Graham和van der Eb，Virology 1973，52：456-467；Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.1979，76：1373-1376；和Chen和Okayarea，Mol.Cell.Biol.1987，7：2745-2752以及美国专利号5,593,875，其各自公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法是本领域已知的，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)在过滤水中的1：1(w/w)脂质体制剂的方法，其描述于Rose等，Biotechniques 1991，10：520-525和Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，84：7413-7417；以及美国专利号5279833、5,908,635、6,056,938、6,110,490、6,534,484和7,687,070，其各自公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括使用美国专利号5,766,902、6,025,337、6,410,517、6,475,994和7,189,705(其各自公开内容通过引用并入本文)中描述的方法进行转染的步骤。
根据一个实施方式，基因编辑过程可包括使用介导在一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂的可编程核酸酶。此种可编程核酸酶通过在特定基因组位点处引入断裂来实现精确的基因组编辑，即，它们依靠对基因组内特定DNA序列的识别，来将核酸酶结构域靶向此位置，并介导在靶序列处产生双链断裂。DNA的双链断裂，随后内源性修复机器被募集到该断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入破坏(例如沉默、抑制或增强)靶基因产物的插入/缺失突变。
已开发用于实现位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要种类包括：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。根据其DNA识别模式，这些核酸酶系统可大致分为两类：ZFN和TALEN通过蛋白质-DNA相互作用实现特定的DNA结合，而CRISPR系统(例如Cas9)通过直接与目标DNA碱基配对的短RNA指导分子以及蛋白质-DNA相互作用，靶向特定的DNA序列。参见，例如Cox等，Nature Medicine 2015，21(2)。
可用于本发明的TIL扩增方法的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR法、TALE法和ZFN方法(它们的实施方式在下文详述)。根据一个实施方式，将TIL扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述方法的任何实施方式(例如过程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述进行，其中，该方法还包括通过CRISPR法、TALE法或ZFN法中的一种以上对至少一部分TIL进行基因编辑，以产生可提供增强的治疗效果的TIL。根据一个实施方式，可通过将基因编辑的TIL与未修饰的TIL进行体外比较，来评估基因编辑的TIL的增强的治疗效果；例如，通过与未修饰的TIL相比，评估体外效应子功能、细胞因子特征等。
在本发明的一些实施方式中，电穿孔用于递送基因编辑系统，例如CRISPR系统、TALEN系统和ZFN系统。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统是流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方式的合适的流式电穿孔系统的实例为市售的MaxCyte STX系统。有几种适用于本发明的备选市售电穿孔仪器，例如购自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统与其余TIL扩增方法一起形成封闭的无菌系统。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统是本文所述的脉冲电穿孔系统，并与其余TIL扩增方法一起形成封闭的无菌系统。
1.CRISPR法
将TIL扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述方法的任何实施方式(例如过程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述进行，其中，该方法还包括通过CRISPR法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)对至少一部分TIL进行基因编辑。根据具体实施方式，TIL扩增期间使用CRISPR法导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。或者，在TIL扩增期间使用CRISPR法导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR表示“成簇规律间隔短回文重复序列”。在本文中，使用CRISPR系统进行基因编辑的方法也称为CRISPR法。CRISPR系统可分为两个主要类别，即1类和2类，它们又分为不同的类型和子类型。CRISPR系统的分类是基于能够切割特定核酸的效应Cas蛋白。在1类CRISPR系统中，效应子模块由多蛋白复合物组成，而2类系统仅使用一种效应子蛋白。1类CRISPR包括I型、III型和IV型，2类CRISPR包括II型、V型和VI型。尽管本发明可使用这些CRISPR系统中的任一种类型，但本发明优选使用以下三种类型的CRISPR系统，其包含RNA和Cas蛋白：I型(以Cas3为例)、II型(以Cas9为例)和III型(以Cas10为例)。II型CRISPR是表征最充分的系统之一。
CRISPR技术由细菌和古细菌(单细胞微生物的域)的天然防御机制而改编。这些生物利用CRISPR来源的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎并破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒和其他异物的攻击。CRISPR是具有两种不同特性的DNA特异性区域：存在核苷酸重复序列和间隔区(spacer)。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区，外来DNA的短片段(间隔区)散布在重复序列之间。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔区被整合到CRISPR基因组基因座中并被转录加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火为反式激活crRNA(tracrRNA)，并通过Cas蛋白引导致病DNA的序列特异性切割和沉默。Cas9蛋白的靶识别需要crRNA内的“种子”序列和crRNA结合区上游的保守的含二核苷酸的前间隔区相邻基序(PAM，protospacer adjacent motif)序列。通过重新设计crRNA，可将CRISPR/Cas系统重新靶向为切割几乎任何DNA序列。因此，根据某些实施方式，Cas9用作RNA引导的DNA内切核酸酶，其在crRNA-tracrRNA识别后切割DNA。可将天然系统中的crRNA和tracrRNA简化为约100个核苷酸的单链指导RNA(sgRNA，single guide RNA)以用于基因工程。sgRNA是合成RNA，其包含Cas结合所需的支架(scaffold)序列和用户定义的约17至20个核苷酸的间隔区，该间隔区定义了要修饰的基因组靶标。因此，用户可通过改变sgRNA中存在的靶序列来改变Cas蛋白的基因组靶标。通过共递送表达Cas9内切核酸酶和RNA成分(例如sgRNA)的质粒，可将CRISPR/Cas系统直接移植到人细胞。Cas蛋白的不同变体可用于减少靶向限制(例如Cas9的直向同源物，如Cpf1)。
根据一个实施方式，工程化可编程非天然存在的II型CRISPR-Cas系统包含Cas9蛋白和至少一个指导RNA，该指导RNA靶向TIL中DNA分子的靶序列并与其杂交；其中，DNA分子编码且TIL表达至少一种免疫检查点分子，Cas9蛋白切割DNA分子，从而改变至少一种免疫检查点分子的表达；并且，Cas9蛋白和指导RNA不能天然地同时存在。根据一个实施方式，两种以上免疫检查点分子的表达被改变。根据一个实施方式，指导RNA包含与tracr序列融合的指导序列。例如，指导RNA可以包含crRNA-tracrRNA或sgRNA。根据本发明的方面，术语“指导RNA”、“单链指导RNA”和“合成指导RNA”可互换使用，指包含指导序列的多核苷酸序列，其为在指导RNA内对靶位点具有特异性的约17bp至20bp序列。
根据本发明的实施方式，也可使用与Cas9相比具有改善的在靶(on-target)特异性的Cas9的变体。此类变体可称为高保真(high-fidelity)Cas-9。根据一个实施方式，可使用双切口酶(nickase)法，其中靶向相反DNA链的两种切口酶在靶DNA内产生DSB(通常称为双切口或双切口酶CRISPR系统)。例如，此方法可涉及两种Cas9核酸酶结构域之一的突变，Cas9从核酸酶转变为切口酶。高保真Cas9的非限制性实例包括eSpCas9、SpCas9-HF1和HypaCas9。此类变体可减少或消除在非靶DNA位点的不需要的改变。参见，例如SlaymakerIM等，Science 2015年12月1日；Kleinstiver BP等，Nature 2016年1月6日；以及Ran等，NatProtoc.2013年11月，8(11)：2281-2308，其公开内容通过引用并入本文。
此外，根据具体实施方式，可使用改善Cas9向细胞的基因递送以及改善在靶特异性的Cas9支架，例如美国专利申请公开号2016/0102324中公开的那些，其内容通过引用并入本文。例如，Cas9支架可包含由(D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A)定义的RuvC基序和/或由(Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S)定义的HNH基序，其中X表示20种天然氨基酸中的任一种，[I/L]表示异亮氨酸或亮氨酸。HNH结构域负责使靶dsDNA的一条链产生切口，而RuvC结构域参与dsDNA的另一条链的切割。因此，这些结构域中的每一个都在紧邻PAM的前间隔区中使靶DNA的一条链产生切口，导致DNA的平齐(blunt)切割。这些基序可以彼此组合以产生更紧凑和/或特异性更强的Cas9支架。此外，这些基序可用于产生拆分为两个单独的RuvC结构域和HNH结构域的拆分Cas9蛋白(即包含RuvC结构域或HNH结构域的Cas9蛋白或Cas9变体的还原形式或截短形式)，其可以一起或分别处理靶DNA。
根据具体实施方式，CRISPR法包括通过引入Cas9核酸酶和指导RNA(例如crRNA-tracrRNA或sgRNA)来沉默或降低TIL中一种以上免疫检查点基因的表达，该指导RNA含有对免疫检查点基因的靶DNA序列具有特异性的约17至20个核苷酸的序列。指导RNA可以作为RNA或通过在启动子下用指导RNA编码序列转化质粒来递送。CRISPR/Cas酶基于sgRNA定义的靶序列在特定位置引入双链断裂(DSB)。可通过非同源末端连接(NHEJ)修复细胞的DSB，该机制通常会导致DNA中的插入或缺失(插入缺失(indel))。插入缺失经常导致移码，造成功能等位基因的丧失；例如，通过在靶基因的开放阅读框(ORF)内引起提前的终止密码子。根据某些实施方式，结果得到靶标免疫检查点基因内的功能丧失突变。
或者，可通过同源性定向修复(HDR)而不是NHEJ来修复由CRISPR/Cas酶引起的DSB。尽管NHEJ介导的DSB修复通常会破坏基因的开放阅读框，但同源直接修复(HDR)可用于产生特定核苷酸变化(从单个核苷酸变化到大的插入)。根据一个实施方式，通过将包含所需序列的DNA修复模板与sgRNA和Cas9或Cas9切口酶一起递送至TIL中，利用HDR来基因编辑免疫检查点基因。优选地，修复模板包含所需编辑以及紧挨着靶基因上游和下游的其他同源序列(通常称为左同源臂和右同源臂)。
根据具体实施方式，Cas9的酶促失活形式(deadCas9或dCas9)可以靶向转录起始位点以通过阻断起始来抑制转录。因此，可在不使用DSB的情况下抑制所靶向的免疫检查点基因。dCas9分子保留了基于sgRNA靶向序列与靶DNA结合的能力。根据本发明的一个实施方式，CRISPR法包括通过抑制或阻止靶基因的转录来沉默或降低一种以上免疫检查点基因的表达。例如，CRISPR法可包括使诸如Kruppel相关盒(KRAB，Kruppel-associated box)结构域的转录阻遏结构域与Cas9的酶促失活形式融合，从而形成例如靶向免疫检查点基因转录起始位点的dCas9-KRAB，导致抑制或阻止基因转录。优选地，阻遏结构域靶向转录起始位点下游的窗口，例如下游约500bp。通过靶RNA的转录减少，此种方法(可称为CRISPR干扰(CRISPRi))可产生稳健的基因敲落。
根据具体实施方式，Cas9的酶促失活形式(deadCas9或dCas9)可以靶向转录起始位点以活化转录。此种方法可以称为CRISPR活化(CRISPRa)。根据一个实施方式，CRISPR法包括通过活化靶基因的转录来增加一种以上免疫检查点基因的表达。根据此类实施方式，可在不使用DSB的情况下活化所靶向的免疫检查点基因。CRISPR法可包括使转录活化结构域靶向转录起始位点；例如，通过将转录活化因子(例如VP64)与dCas9融合，从而形成例如靶向免疫检查点基因转录起始位点的dCas9-VP64，从而活化该基因的转录。优选地，活化结构域靶向转录起始位点上游的窗口，例如上游约50bp至400bp。
本发明的其他实施方式可利用已被开发用于在哺乳动物细胞中有效活化靶基因的活化策略。非限制性实例包括：表位标记的dCas9和抗体活化因子效应蛋白(例如SunTag系统)的共表达、与串联的多个不同活化结构域融合的dCas9(例如，dCas9-VPR)，或dCas9-VP64与修饰的支架gRNA和其他RNA结合辅助活化因子(例如SAM活化因子)的共表达。
根据其他实施方式，如美国专利号9,982,278(其内容通过引用并入本文)所公开，CRISPR介导的基因组编辑(称为CRISPR辅助的理性蛋白质工程化，CARPE)方法可根据本发明的实施方式来使用。CARPE涉及“供体”和“目的”文库的生成，这些文库将来自单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)编辑盒的定向突变直接掺入基因组中。供体文库的构建涉及将理性设计的编辑寡核苷酸与指导RNA(gRNA)(其与靶DNA序列杂交)共转化到细胞中。将编辑寡核苷酸设计为使PAM的缺失或突变与相邻基因中一个以上所需密码子的突变结合。这使整个供体文库可在单个转化中生成。使用来自编辑寡核苷酸的合成特征(即同时整合到基因3'末端的第二种PAM缺失或突变)，通过重组染色体的扩增(例如通过PCR反应)来检索供体文库。这将密码子靶标突变共价偶联到PAM缺失。然后将供体文库与目的gRNA载体共转化到细胞中，以创建表达理性设计的蛋白文库的细胞群。
根据其他实施方式，如美国专利号9,982,278(其内容通过引用并入本文)所公开，使用CRISPR介导的系统进行可追踪的精确基因组编辑(称为可追踪CRISPR富集重组技术的基因组工程，GEn-TraCER)的方法可用于本发明的实施方式。GEn-TraCER法和载体在单个载体上结合了编辑盒和编码gRNA的基因。该盒包含所需突变和PAM突变。将还可编码Cas9的载体引入细胞或细胞群中。这会活化CRISPR系统在细胞或细胞群中的表达，导致gRNA将Cas9募集到目标区域(在该区域发生dsDNA断裂)，从而整合PAM突变。
可通过CRISPR法被永久性基因编辑的TIL沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
可通过CRISPR法通过永久性基因编辑的TIL来增强的基因的非限制性实例包括：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
美国专利号8,697,359、8,993,233、8,795,965、8,771,945、8,889,356、8,865,406、8,999,641、8,945,839、8,932,814、8,871,445、8,906,616和8,895,308(其内容通过引用并入本文)中描述了通过CRISPR法改变靶基因序列的表达的系统、方法和组合物的实例，其可根据本发明的实施方式使用。进行CRISPR法的资源(例如表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒)可购自GenScript等公司。
在一个实施方式中，如本文所述，可使用如美国专利号US 9,790,490(其公开内容通过引用并入本文)中所述的CRISPR/Cpf1系统对TIL群进行基因修饰。CRISPR/Cpf1系统在功能上不同于CRISPR-Cas9系统，因为Cpf1相关CRISPR阵列无需另外的tracrRNA即可被加工成成熟crRNA。CRISPR/Cpf1系统中使用的crRNA具有间隔区或指导序列以及直接重复序列。使用此种方法形成的Cpf1p-crRNA复合物本身足以切割靶DNA。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9或CRISPR/Cpf1系统，用于调节至少一种蛋白质的表达。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9或CRISPR/Cpf1系统，用于抑制PD-1和LAG-3的表达。
2.TALE法
将TIL扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述方法的任何实施方式(例如过程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述进行，其中，该方法还包括通过TALE法对至少一部分TIL进行基因编辑。根据具体实施方式，TIL扩增期间使用TALE法导致至少一部分治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。或者，TIL扩增期间使用TALE法导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强。
TALE表示“转录激活因子样效应物”蛋白，其包括TALEN(“转录激活因子样效应物核酸酶”)。在本文中，使用TALE系统进行基因编辑的方法也可称为TALE法。TALE是植物病原细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)中天然存在的蛋白质，并包含DNA结合结构域(由一系列33至35个氨基酸重复结构域组成)，每个结构域识别单个碱基对。TALE特异性由两个称为重复可变双残基(RVD)的高变氨基酸确定。模块TALE重复序列连接在一起以识别连续的DNA序列。DNA结合域中的特定RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供组装可预测的DNA结合域的结构特征。将TALE的DNA结合结构域与IIS FokI型核酸内切酶的催化结构域融合，形成可靶向的TALE核酸酶。为诱导位点特异性突变，两个单独的TALEN臂(由14至20个碱基对的间隔区隔开)使FokI单体紧密接近以进行二聚化并产生目标双链断裂。
利用各种组装方法的多项大型系统研究表明，可组合TALE重复序列以识别用户定义的几乎任何序列。能快速组装定制TALE阵列的策略包括Golden Gate分子克隆、高通量固相组装和不依赖连接的克隆技术。定制设计的TALE阵列也可购自Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦)和LifeTechnologies(美国纽约州格兰德岛)。此外，还可使用基于Web的工具(例如TAL Effector-Nucleotide Target 2.0)，其可针对所需靶标设计定制TAL效应子重复序列，还可以提供预测的TAL效应子结合位点。参见Doyle等，Nucleic Acids Research 2012，40：W117-W122。适用于本发明的TALE和TALEN方法的实例描述于美国专利申请公开号US 2011/0201118 A1、US 2013/0117869 A1、US 2013/0315884 A1、US 2015/0203871 A1和US 2016/0120906 A1，其公开内容通过引用并入本文。
根据本发明的一个实施方式，TALE法包括通过抑制或阻止靶基因的转录来沉默或减少一种以上免疫检查点基因的表达。例如，TALE法可以包括利用KRAB-TALE，其中该方法包括将转录的Kruppel相关盒(KRAB)结构域融合到靶向基因转录起始位点的DNA结合结构域，从而抑制或防止基因转录。
根据另一个实施方式，TALE法包括通过在靶基因引入突变来沉默或减少一种以上免疫检查点基因的表达。例如，TALE法可以包括将核酸酶效应子结构域(例如Fok1)融合到TALE DNA结合结构域，产生TALEN。Fokl是活跃的二聚体；因此，该方法包括构建成对的TALEN，以将FOKL核酸酶结构域定位到相邻的基因组靶位点(在该位点引入DNA双链断裂)。Fokl的正确定位和二聚化后，可完成双链断裂。引入双链断裂后，可通过两种不同的机制完成DNA的修复：高保真的同源重组对(HRR)(也称为同源性定向修复或HDR)或易出错(error-prone)的非同源末端连接(NHEJ)。通过NHEJ修复双链断裂优选导致DNA靶位点缺失、插入或取代，即NHEJ通常导致在断裂位点引入小的插入和缺失，通常引起敲除基因功能的移码。根据具体实施方式，TALEN对靶向基因的最5'外显子，促进早期移码突变或过早的终止密码子。优选地，由TALEN引入的基因突变是永久性的。因此，根据一个实施方式，该方法包括通过利用二聚化的TALEN诱导位点特异性双链断裂来沉默或降低免疫检查点基因的表达，所述双链断裂通过易出错的NHEJ修复，从而导致靶标免疫检查点基因中的一个以上突变。
根据其他实施方式，TALEN被用于通过HRR引入基因改变，例如DNA片段的非随机点突变、靶向缺失或添加。DNA双链断裂的引入使得能够在合适的供体DNA的存在下通过同源重组进行基因编辑。根据一个实施方式，该方法包括共递送二聚化的TALEN和携带基因座特异性同源臂的供体质粒，以诱导位点特异性双链断裂并将一个以上转基因整合到DNA中。
根据另一个实施方式，如美国专利公开号2011/0201118所公开的，可根据本发明的实施方式使用TALEN，TALEN是源自FokI和AvrXa7的杂合蛋白。该TALEN保留了对AvrXa7的靶核苷酸的识别特异性和对FokI的双链DNA切割活性。可使用相同方法来制备具有不同识别特异性的其他TALEN。例如，可通过工程化具有不同RVD组的核心TALE支架来产生致密TALEN，以改变DNA结合特异性并靶向特定的单个dsDNA靶序列。参见美国专利公开号2013/0117869。可将选择的催化结构域连接到支架上以进行DNA加工，可对其进行改造以确保当融合到核心TALE支架上时，催化结构域能够处理单个dsDNA靶序列附近的DNA。肽接头也可被工程化以将催化结构域融合到支架上，以产生由单一多肽链制成的紧凑TALEN，其不需要二聚化即可靶向特定的单一dsDNA序列。还可通过将可能是TAL单体的催化结构域融合到其N-末端来修饰核心TALE支架，从而使该催化结构域可与融合到另一个TAL单体的另一个催化结构域相互作用，从而产生一个可能在目标序列附近加工DNA的催化实体。参见美国专利公开号2015/0203871。此种结构仅允许靶向一条DNA链，而经典TALEN结构则不能作此选择。
根据本发明的一个实施方式，可使用常规RVD产生能够显著降低基因表达的TALEN。在一个实施方式中，四个RVD(即NI，HD，NN和NG)分别用于靶向腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。这些常规RVD可用于例如创建靶向PD-1基因的TALEN。使用常规RVD的TALEN的实例包括在Gautron等，Molecular Therapy：Nucleic Acids 2017年12月，9：312-321(其内容通过引用并入本文)公开的T3v1和T1 TALEN。T3v1和T1 TALEN靶向PD-L1结合位点所在的PDCD1基因座的第二个外显子，能够显著降低PD-1产生。在一个实施方式中，T1 TALEN通过使用靶标SEQ ID NO：127来进行，而T3v1 TALEN通过使用靶标SEQ ID NO：128来进行。
根据另一个实施方式，例如如Gautron所公开的，使用非常规RVD修饰TALEN以改善其对靶基因的活性和特异性。对于高变氨基酸位置，天然存在的RVD仅覆盖潜在多样性库中的一小部分。非常规RVD提供了天然RVD的替代方法，具有新型内在靶向特异性功能，可用于排除TALEN对异位(off-site)靶点(相对于靶点序列含有少量错配的基因组内序列)的靶向。如Juillerat等，Scientific Reports 5，文章编号8150(2015)(其内容通过引用并入本文)所公开，可通过生成和筛选TALEN集合来鉴定非常规RVD，所述TALEN在阵列定义位置的两个高变氨基酸位置包含氨基酸的替代组合。接下来，可选择非常规RVD以区分错配位置上存在的核苷酸，这可防止异位序列处的TALEN活性，同时仍允许对靶标位置进行适当处理。然后，可使用所选的非常规RVD替换TALEN中的常规RVD。已用非常规RVD代替常规RVD的TALEN的示例包括Gautron生产的T3v2和T3v3 PD-1 TALEN。与使用常规RVD的TALEN相比，这些TALEN具有更高的特异性。
根据其他实施方式，TALEN可用于引入基因改变以沉默或减少两种基因的表达。例如，可产生两种不同的TALEN以靶向两种不同基因，然后一起使用。由两种TALEN在其各自的基因座和潜在的脱靶(off-target)位点产生的分子事件可通过高通量DNA测序来表征。这样使得能够分析脱靶位点，并识别使用两种TALEN可能得到的位点。基于此信息，可选择适当的常规和非常规RVD来工程化TALEN，即使它们一起使用时也具有增加的特异性和活性。例如，Gautron公开了组合使用T3v4 PD-1和TRAC TALEN以产生双重敲除的CAR T细胞，该CAR T细胞保持了有效的体外抗肿瘤功能。
在一个实施方式中，可使用Gautron的方法或本文所述其他方法对TIL进行基因编辑，然后可通过本文所述的任何程序对经基因编辑的TIL进行扩增。在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用转录激活因子样效应物核酸酶的电穿孔，对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3至14天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约7至14天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用转录激活因子样效应物核酸酶的电穿孔，在Cytoporation培养基中对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约6至9天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约9至11天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用转录激活因子样效应物核酸酶的电穿孔，在Cytoporation培养基中对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；其中，孵育在约30℃至40℃、约5％的CO2下进行；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约6至9天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约9至11天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
根据另一个实施方式，可以特别设计TALEN，其允许靶细胞内更高比率的DSB事件(其能靶向特定选择的基因)。参见美国专利公开号2013/0315884。此种稀有切割核酸内切酶的使用增加了转染细胞中靶基因双失活的机会，从而可以生产工程化细胞(例如T细胞)。此外，可将另外的催化结构域与TALEN一起引入以增加诱变作用并增强靶基因的失活。美国专利公开号2013/0315884中描述的TALEN已成功用于工程化T细胞，使其适合免疫疗法。TALEN也可用于使T细胞中的各种免疫检查点基因失活，包括使单个T细胞中至少两种基因失活。参见美国专利公开号2016/0120906。此外，如美国专利公开号2018/0021379(其内容通过引用并入本文)中所公开，TALEN可用于使编码免疫抑制剂和T细胞受体的靶标的基因失活。此外，如美国专利公开号2019/0010514(其内容通过引用并入本文)中所公开，TALEN可用于抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)的表达。
可通过TALE法通过永久性基因编辑TIL来沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
下表提供了靶向PD-1基因的TALE核酸酶的非限制性实例。在这些实例中，靶向的基因组序列包含两个由15bp间隔区(以小写字母显示)分隔的17个碱基对(bp)的长序列(称为半靶标(half target)，以大写字母显示)。通过表中所列的半TALE核酸酶的重复序列识别每个半靶标。因此，根据具体实施方式，本发明的TALE核酸酶识别并切割选自SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128的靶序列。如上所述，TALEN序列和基因编辑方法也描述于Gautron。
Figure BDA0002855613220000601
在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用靶向PDCD1的转录激活因子样效应物核酸酶的电穿孔，在Cytoporation培养基中对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；其中，孵育在约30℃至40℃、约5％的CO2下进行；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约6至9天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约9至11天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获得自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用靶向SEQ ID NO：128的转录激活因子样效应物核酸酶的电穿孔，在Cytoporation培养基中对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；其中，孵育在约30℃至40℃、约5％的CO2下进行；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约6至9天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约9至11天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
在一个实施方式中，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化磁珠或抗体，对获自患者切除肿瘤的第一TIL群进行活化1至5天；
(b)使用根据SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136的转录激活因子样效应物核酸酶mRNA的电穿孔，在Cytoporation培养基中对至少一部分第一TIL群进行基因编辑，获得第二TIL群；
(c)可选地孵育第二TIL群；其中，孵育在约30℃至40℃、约5％的CO2下进行；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群进行第一次扩增，产生第三TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约6至9天，获得第三TIL群；
(e)通过向第三TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第四TIL群；其中，第二次扩增进行约9至11天，获得第四TIL群；其中，第四TIL群是治疗性TIL群；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；
(g)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(h)其中，步骤(a)至(g)中的一个以上步骤在封闭的无菌系统中进行。
可通过TALE法通过永久性基因编辑TIL来增强的基因的其他非限制性实例包括：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
美国专利号8,586,526(其内容通过引用并入本文)中描述了通过TALE法来改变靶基因序列的表达的系统、方法和组合物的实例，其可根据本发明的实施方式使用。这些公开的实例包括使用具有两个以上TALE重复单元的非天然存在的DNA结合多肽，该重复单元包含重复RVD、由TALE蛋白残基制成的N-帽多肽和由TALE蛋白的全长C-末端区域的片段制成的C帽多肽。
Valton等，Methods 2014，69：151-170(其内容通过引用并入本文)中描述了可用于有效地进行TALEN介导的基因整合和失活的TALEN设计和设计策略、活性评估、筛选策略和方法的实例，其可根据本发明的实施方式使用。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送TALE核酸酶系统，用于调节至少一种蛋白质的表达。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送TALE核酸酶系统，用于抑制PD-1和LAG-3的表达。
3.锌指法
将TIL扩增成治疗性TIL群的方法可根据本文所述方法的任何实施方式(例如过程2A)或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所述进行，其中，该方法还包括通过锌指法或锌指核酸酶法对至少一部分TIL进行基因编辑。根据具体实施方式，TIL扩增期间使用锌指法导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。或者，TIL扩增期间使用锌指法导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强。
单个锌指以保守的ββα构型包含约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常接触DNA大沟(major groove)内的3bp，选择性水平各不相同。锌指具有两个蛋白质结构域。第一结构域是DNA结合结构域，其包含真核转录因子并包含锌指。第二个结构域是核酸酶结构域，其包含FokI限制性内切酶并负责DNA的催化裂解。
单个ZFN的DNA结合结构域通常包含3至6个单个锌指重复序列，单个ZFN可识别9至18个碱基对。如果锌指结构域对它们的预期靶位点具有特异性，那么理论上，甚至一对3指ZFN(识别总共18个碱基对)可以靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。产生新的锌指阵列的一种方法是结合特异性已知的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程包括组合三个单独的锌指(每个锌指可识别3个碱基对的DNA序列)以生成3指阵列(可识别9个碱基对的目标位点)。或者，可使用基于选择的方法(例如寡聚体库工程(OPEN，oligomerized poolengineering))从随机文库中选择新的锌指阵列，其考虑了相邻的指之间的背景相关交互作用。工程化的锌指可商购；Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州里士满)与Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)合作开发了用于锌指构建的合适平台
Figure BDA0002855613220000651
可通过锌指法通过永久性基因编辑TIL来沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
可通过锌指法通过永久性基因编辑TIL来增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
可根据本发明的实施方式使用的通过锌指法改变靶基因序列的表达的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626，其内容通过引用并入本文。
可根据本发明的实施方式使用的通过锌指法改变靶基因序列的表达的系统、方法和组合物的其他实例描述于Beane等，Mol.Therapy 2015，23：1380-1390，其公开内容通过引用并入本文。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送锌指核酸酶系统，用于调节至少一种蛋白质的表达。
根据一个实施方式，将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送锌指核酸酶系统，用于抑制PD-1和LAG-3的表达。
四、TIL生产过程
图1描述了一个包含这些特征中的一些特征的示例性的TIL过程(称为过程2A)，图2描述了本发明的此实施方式相对于过程1C的一些优点，图14也是。图3显示了用于比较的过程1C。图4(较高的细胞计数)和图5(较低的细胞计数)显示了基于过程2A的TIL治疗的两个替代时间线。图6和图9示出了过程2A的一个实施方式。图13和14进一步提供了与示例性1C过程相比的示例性2A过程。
如本文所讨论的，本发明可以包括与冷冻保存的TIL的再刺激有关的步骤，以在移植入患者之前增加其代谢活性并因此增加相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如本文一般概述的，TIL通常取自患者样品并在移植入患者之前进行操作以扩增其数量。在一些实施方式中，TIL可以可选地进行如下所述的基因操作。
在一些实施方式中，可以冷冻保存TIL。一旦解冻，在输注给患者之前，也可对它们进行再刺激以增加它们的新陈代谢。
在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括称为preREP的过程以及图9中步骤A所示的过程)被缩短为3天至14天，第二次扩增(包括称为REP的过程以及图9中步骤B所示的过程)被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所述以及如图4、图5和图27中所示，第一次扩增(例如图9中步骤B中所述的扩增)被缩短为11天，第二次扩增(例如图9中步骤D中所述的扩增)被缩短为11天。在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图中所讨论的，第一次扩增和第二次扩增(例如图9中步骤B和步骤D所述的扩增)的组合被缩短为22天。
下文的“步骤”标记A、B、C等参考图9和本文所述的某些实施方式。下述的和图9中的步骤排序是示例性的，本申请和本文公开的方法预期步骤的任何组合或顺序，以及附加步骤、步骤的重复和/或步骤的省略。
A、步骤A：获得患者肿瘤样品
通常，TIL最初从患者肿瘤样品获得(“原代TIL”)，然后如本文所述地扩增为更大的群用于进一步操作，可选地，如本文所概述的冷冻保存、再刺激，并可选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指示。
可使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品，通常通过手术切除、穿刺活检或者用于获得含有肿瘤和TIL细胞混合物的样品的其他手段。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或者转移性肿瘤。肿瘤样品也可以是液体肿瘤，例如，从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方式中，有用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为据报道这些恶性黑色素瘤肿瘤具有特别高水平的TIL。
术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或者液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或者恶性的。术语“实体瘤癌”指恶性、肿瘤性或者癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。在一些实施方式中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
术语“血液恶性肿瘤”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓样白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
一旦获得肿瘤样品，通常使用锐器解剖法(sharp dissection)将肿瘤样品切成1mm3至约8mm3的小块；其中，约2mm3至3mm3是特别有用的。使用酶促肿瘤消化液从这些碎片培养TIL。此种肿瘤消化液可通过在酶培养基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mm谷氨酸盐、10mcg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育然后机械解离(例如使用组织解离剂)来产生。肿瘤消化液可通过将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟来产生，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行机械解离和孵育的重复循环，直至仅存在小的组织碎片。在该过程结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或死细胞，则可使用FICOLL分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法都可用于本文所述扩增TIL的方法或治疗癌症的方法的任何实施方式中。
通常，收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。
在一些实施方式中，碎片化包括物理碎片化，包括例如切碎和消化。在一些实施方式中，碎片化是物理碎片化。在一些实施方式中，碎片化是切碎。在一些实施方式中，碎片化是通过消化。在一些实施方式中，可通过酶促肿瘤消化液和从患者获得的肿瘤碎片来对TIL进行初始培养。
在一些实施方式中，当肿瘤是实体瘤时，例如在步骤A中获得肿瘤样品后，肿瘤经历物理破碎(如图9所提供)。在一些实施方式中，碎片化发生在冷冻保存之前。在一些实施方式中，碎片化发生在在冷冻保存之后。在一些实施方式中，碎片化发生在获得肿瘤之后并且没有任何冷冻保存的情况下。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将10、20、30、40或者更多个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将30或40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施方式中，通过锐器解剖法获得肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，肿瘤消化物通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mm GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育，然后机械解离(GentleMACS，MiltenyiBiotec，Aubum，加利福尼亚州)来产生。将肿瘤置于酶培养基中后，可以机械解离肿瘤约1分钟。然后将溶液在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中再次孵育30分钟后，可以第三次机械破碎肿瘤约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破碎后，如果存在大块组织，则对样品施加1或者2次另外的机械解离，在或者不在37℃、5％CO2中进行另外的30分钟孵育。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或者死细胞，则可使用Ficoll进行密度梯度分离以除去这些细胞。
在一些实施方式中，在第一次扩增步骤之前获得的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。
在一些实施方式中，可选地，可以在收获样品后将细胞冷冻，并在进入步骤B所述扩增之前冷冻保存，这将在下文进一步详细描述并在图9中进行举例说明。
B、步骤B：第一次扩增
1、年轻TIL
在一些实施方式中，本发明方法提供获得年轻TIL，年轻TIL能够在施用给受试者/患者后增加复制周期，因此相对于较老TIL(即，在施用给受试者/患者之前进一步经历了更多轮复制的TIL)可以提供其他治疗益处。文献中已经描述了年轻TIL的特征，例如Donia等，Scandinavian Journalof Immunology，75：157-167(2012)；Dudley等，Clin Cancer Res，16：6122-6131(2010)；Huang等，J Immunother，28(3)：258-267(2005)；Besser等，ClinCancer Res，19(17)：OF1-OF9(2013)；Besser等，J Immunother，32：415-423(2009)；Bunds等，J Immunother，32：415-423(2009)；Robbins等，J Immunol，2004；173：7125-7130；Shen等，J Immunother，30：123-129(2007)；Zhou等，J Immunother，28：53-62(2005)和Tran等，JImmunother，31：742-751(2008)，其全部内容通过引用整体并入本文。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因片段的体细胞重组来产生。这些基因片段：V(可变区)、D(多变区)、J(结合区)和C(恒定区)确定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR，T-cell receptor)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生TIL的方法，其显示并增加T细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的TIL和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(例如包括除了图9中所示那些之外的方法)制备的TIL相比，通过本发明方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的TIL和/或使用如图13所示的称为过程1C的方法制备的TIL相比，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，第一次扩增中获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是T细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的T细胞受体的多样性。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
例如，如图9的步骤A中所述，切开或者消化肿瘤碎片后，在有利于TIL生长(相对于肿瘤和其他细胞)的条件下，在含有IL-2的血清中培养所得细胞。在一些实施方式中，在2mL孔中的包含灭活的人AB血清和6000IU/mL的IL-2的培养基中孵育肿瘤消化物。培养此原代细胞群一段时间，通常为3天至14天，产生大量TIL群，通常为约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群7天至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群10至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群约11天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。
在一个优选实施方式中，TIL的扩增可以如下进行：使用如下文和此处所述的初始大量TIL扩增步骤(例如，如图9的步骤B中所述的那些，其可以包括称为pre-REP的过程)，然后进行如下文步骤D和此处所述的第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后可选地进行冷冻保存，然后进行如下文和此处所述的第二次步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。可选地，可对从该过程获得的TIL进行如本文所述的表型特征和代谢参数的表征。
在用24孔板开始TIL培养的实施方式中，例如，使用Costar 24孔细胞培养板、平底(康宁公司，康宁，纽约)，可以在每个孔接种2mL含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，埃默里维尔，加利福尼亚州)的完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化细胞或者一个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基被称为“CM”，其中CM是培养基的缩写。在一些实施方式中，步骤B的CM由含有GlutaMAX的RPMI 1640组成，补充有10％人AB血清、25mmHEPES和10mg/mL庆大霉素。在用容量为40mL、透气性硅底为10cm2的透气性烧瓶(例如，G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，明尼苏达州新布莱顿)开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶装有在10至40mL含有IL-2的CM中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或者5至30个肿瘤碎片。在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中孵育G-Rex 10和24孔板，培养开始5天后，移除一半培养基，换上新鲜的CM和IL-2，在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。
在制备肿瘤碎片后，在有利于TIL生长(相对于肿瘤和其他细胞)的条件下，在含有IL-2的血清中培养所得细胞(即碎片)。在一些实施方式中，肿瘤消化液在含有灭活的人AB血清(或在一些情况下，如本文所述，在aAPC细胞群存在下)和6000IU/mL IL-2的培养基的2mL孔中孵育。将该原代细胞群培养一段时间，通常为10至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体。在一些实施方式中，IL是重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg至30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为4×106IU/mg至8×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为5×106IU/mg至7×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为6×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，如实施例4中所述制备IL-2储备溶液。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL的IL-2，约9,000IU/mL的IL-2，约8,000I U/mL的IL-2，约7,000IU/mL IL-2，约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL的IL-2至约5,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或者约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或者约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或者约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或者约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。OKT-3抗体可以从REP的第0天(即REP的开始日)和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)开始存在于细胞培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL以及50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。
在一些实施方式中，第一次扩增的培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，将其称为CM1(培养基1)。在一些实施方式中，CM由具有GlutaMAX的RPMI 1640组成，补充有10％人AB血清、25mm Hepes和10mg/mL庆大霉素。在具有40mL容量和10cm2透气性硅底的透气性烧瓶(例如G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)中开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶在含有IL-2的10-40mL CM中装载10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。将G-Rex 10和24孔板在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中培养，培养开始5天后，取出一半培养基，换上新鲜的CM和IL-2，在第5天后，每2-3天更换一半的培养基。在一些实施方式中，CM是实施例中描述的CM1，参见实施例5。在一些实施方式中，第一次扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括例如图9的步骤B中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-REP的那些过程)过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5中所示，以及包括例如图9的步骤B中所述的扩增，第一次扩增(包括例如图9的步骤B中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-REP的那些过程)被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5中所示，步骤B的第一次扩增被缩短至10天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5中所示，以及包括例如图9的步骤B中所述的扩增，第一次扩增被缩短为11天。
在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行1天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行3天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行4天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行5天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行6天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行7天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行8天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行9天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行10天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行11天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行12天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行13天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行1天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行2天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行3天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行4天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行5天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行6天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以持续7天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行8天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行9天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行10天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行11天。
在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，包括例如在根据图9的步骤B期间以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图9的步骤B期间以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括被称为pre-REP的过程；例如，根据图9的步骤B)的过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5所示的，步骤B的第一次扩增被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4、图5和图9所示的，步骤B的第一次扩增缩短至10至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4、图5和图9所示的，第一次扩增被缩短为11天。
在一些实施方式中，第一次扩增，例如根据图9的步骤B，在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如此处所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
在一些实施方式中，使用下文所述的任何4-1BB激动剂抗体，使用在扩增开始时添加至细胞培养基的另外的4-1BB激动剂抗体进行第一次扩增。
C、步骤C：第一次扩增向第二次扩增的转变
在一些情况下，可使用下文讨论的方案，立即冷冻保存从第一次扩增获得的大量TIL群，包括例如从例如图9所示的步骤B收获的TIL群。可选地，可对第一次扩增收获的TIL群(称为第二TIL群)进行第二次扩增(其可以包括有时被称为REP的扩增)，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在基因修饰的TIL将被用于治疗的情况下，第一TIL群(有时被称为大量TIL群)或者第二TIL群(在一些实施方式中可以包括被称为REP TIL群的群)可以在扩增之前或者第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适的治疗。
在一些实施方式中，储存从第一次扩增(例如，如图9所示的步骤B)获得的TIL直至进行表型选择。在一些实施方式中，从第一次扩增(例如，如图9所示的步骤B)获得的TIL不储存而是直接进行第二次扩增。在一些实施方式中，在第一次扩增之后且在第二次扩增之前，不冷冻保存从第一次扩增获得的TIL。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约4天至10天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约7天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约14天。
在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的5天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的6天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的7天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的8天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的9天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的10天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的11天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的12天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的13天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的2天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的3天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的4天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的5天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的6天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的7天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的8天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的9天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的10天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的11天。
在一些实施方式中，在第一次扩增之后和第二次扩增之前不储存TIL，并且TIL直接进行第二次扩增(例如，在一些实施方式中，从步骤B向步骤D转变的期间不进行储存)(如图9所示)。在一些实施方式中，如本文所述，转变在封闭系统中发生。在一些实施方式中，来自第一次扩增的TIL(即第二TIL群)不经历转变期而直接进入第二次扩增。
在一些实施方式中，在封闭系统生物反应器中进行第一次扩增向第二次扩增的转变(例如根据图9的步骤C)。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
D、步骤D：第二次扩增
在一些实施方式中，例如在步骤A和步骤B之后，在收获和初始大量处理之后，TIL细胞群的数量增加，该转变称为步骤C，如图9所示。此种进一步的扩增在本文中称为第二次扩增，其可以包括本领域中通常称为快速扩增过程(REP；以及图9的步骤D所示的过程)的扩增过程。通常在透气性容器中使用包含多种组分的培养基来完成第二次扩增，所述组分包括饲养细胞、细胞因子源(cytokine source)和抗CD3抗体。
在一些实施方式中，TIL的第二次扩增或第二次TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及图9的步骤D中所示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL烧瓶或容器进行。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约7天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约8天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约9天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约10天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约11天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约12天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可以进行约14天。
在一个实施方式中，第二次扩增可使用本公开的方法在透气性容器中进行(包括例如称为REP的扩增；以及如图9的步骤D中所示的过程)。例如，可以在白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如，抗CD3抗体，例如约30ng/mL的OKT-3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech)或者UHCT-1(购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend)。可选地在T细胞生长因子(如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下，可通过在第二次扩增期间，在体外用包括一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)诱导TIL的进一步刺激来快速扩增TIL，该抗原可可选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-L26-35(27L)或gp100：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2区和VEGFR2，或其抗原性部分。也可通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增TIL。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。在一些实施方式中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方式中，在经辐照的自体淋巴细胞或者经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下，发生第二次扩增。
在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL，或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000IU/mL至2000IU/mL、2000IU/mL至3000IU/mL、3000IU/mL至4000IU/mL、4000IU/mL至5000IU/mL、5000IU/mL至6000IU/mL、6000IU/mL至7000IU/mL、7000IU/mL至8000IU/mL，或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。OKT-3抗体可以从REP的第0天(即REP的开始日)和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)开始存在于细胞培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL，20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。
在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，第二次扩增期间(包括例如根据图9的步骤D过程，以及如此处所述)可以包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图9的步骤D过程中，以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合。
在一些实施方式中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞的补充细胞培养基中进行。在一些实施方式中，第二次扩增发生在补充细胞培养基中。在一些实施方式中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方式中，第二次扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或者约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或者约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或约1：500。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率在1：50至1：300之间。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率在1：100至1：200之间。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行；其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL的OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL的IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基更换(通常通过吸入新鲜培养基替换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室。如下文更充分讨论的，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气性容器。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第二次扩增(其可以包括称为REP过程)缩短至7天至14天。在一些实施方式中，第二次扩增缩短至11天。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增可使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.I mmunother.，2008，31，742-51；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42)或透气性培养皿(G-REX烧瓶)进行。在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175烧瓶中进行，并且可将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至每个T-175烧瓶中。TIL可以在CM和AFM-V培养基的1：1混合物中培养，补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可使用含有3000IU/mLIL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，可将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V添加至300mLTIL悬液中。每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持为0.5×106至2.0×106个细胞/mL。
在一个实施方式中，第二次扩增(其可以包括称为REP的扩增，以及图9的步骤D中提到的那些)可以在容量为500mL、透气性硅底为100cm2的透气性烧瓶(G-Rex 100，购自美国明尼苏达州新布莱顿的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中进行，5×106或10×106TIL可与PBMC一起培养在400mL的50/50培养基中，补充有5％人AB血清、3000IU/mLIL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)。G-REX 100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491×g)离心10分钟。可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL的IL-2的新鲜培养基重新悬浮TIL沉淀，并加回到原来的G-REX 100烧瓶中。当TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，可将每个G-REX 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可将细胞悬液分成可用于接种3个G-REX 100烧瓶的3个100mL等分试样。然后可以向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-Rex 100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育，4天后，可以向每个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可以在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方式中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在烧瓶中进行；其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。在一些实施方式中，进行培养基更换，直至细胞转移至替代生长室。在一些实施方式中，通过吸入新鲜培养基来更换2/3的培养基。在一些实施方式中，如下文更充分讨论的，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气性容器。
在一个实施方式中，进行第二次扩增(包括称为REP的扩增)，并且还包括选择肿瘤反应性优异的TIL的步骤。可使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058A1所述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择肿瘤反应性优异的TIL。
可选地，可使用本领域已知的标准检测法，在第二次扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后进行细胞活力检测。例如，可对大量TIL样品进行台盼蓝拒染试验实验(trypanblue exclusion assay)，其选择性地标记死细胞并允许活力评估。在一些实施方式中，可使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience，劳伦斯，马萨诸塞州)对TIL样品进行计数和检测活力。在一些实施方式中，根据例如实施例15中描述的Cellometer K2Image Cytometer自动细胞计数方案测定活力。
在一些实施方式中，TIL的第二次扩增(包括称为REP的扩增)可使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran KQ、Zhou J、Durflinger KH等，2008，J.Immunother.，31：742-751和Dudley ME、Wunderlich JR、Shelton TE等，2003，J.Immunother.，26：332-342)或透气性G-Rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用透气性G-Rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增在T-175烧瓶中进行，将约1×106TIL悬浮于约150mL培养基中，将它加至每个T-175烧瓶中。将TIL与经辐照的(50Gy)同种异体PBMC(作为“饲养”细胞)以1：100比率一起培养，将细胞在CM和AIM-V培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养，补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将T-175烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，将来自2个T-175烧瓶的细胞合并于3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬液中。可以每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持为约0.5×106至约2.0×106个细胞/mL。
在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在具有100cm2透气性硅底(G-REX 100，Wilson Wolf)的500mL容量的烧瓶中进行(图1)，约5×106或10×106TIL与经辐照同种异体PBMC以1：100的比率在400mL的50/50培养基中培养，该50/50培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将G-Rex 100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。然后可以用150mL含有3000IU/mL的IL-2的新鲜50/50培养基重新悬浮浮TIL沉淀，并加回到原来的G-Rex 100烧瓶中。在TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增的实施方式中，在第7天，将每个G-Rex 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，将细胞悬液分成用于接种3个G-Rex 100烧瓶的3个100mL等分试样。然后向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-REX 100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育，4天后，向每个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。在培养的第14天收获细胞。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体是通过有限但大量的基因片段的体细胞重组产生的。这些基因片段：V(可变区)、D(多变区)、J(结合区)和C(恒定区)确定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生TIL的方法，其显示并增加T细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，在第二次扩增中获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是T细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的T细胞受体的多样性。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方式中，第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细讨论的。
在一些实施方式中，第二次扩增(例如根据图9的步骤D)在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
1、饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方式中，在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间，本文所述的第二次扩增步骤(例如，包括例如图9的步骤D中所述的那些以及称为REP的那些扩增)需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。使用标准方法(如Ficoll-Paque梯度分离)获得PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理被灭活并用于REP步骤，如实施例(特别是实施例14)所述，它提供了评估经辐照的同种异体PBMC的复制机能不全(replicationincompetence)的示例性方案。
在一些实施方式中，如果第14天的活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。例如参见实施例14。
在一些实施方式中，如果在OKT3和IL-2存在下，与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000RU/mL IL-2的存在下培养。例如参见实施例13。
在一些实施方式中，如果在OKT3和IL-2存在下，与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在10-50ng/mL的OKT3抗体和2000-5000IU/mL的IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2的存在下培养。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是PBMC。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或者约1：500。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为1：100至1：200。
在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在另一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在又一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约25×106个TIL。
在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤在第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离获得PBMC。在一个实施方式中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或者热处理被灭活，并用于本文所述的TIL扩增步骤，包括图4、图5和图9中所述的示例性步骤。
在一个实施方式中，在第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞替代PBMC或者与PBMC组合。
2、细胞因子
如本领域已知，本文所述的扩增方法通常使用含有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基。
或者，另外可使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增；其中，IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合如国际公开号WO2015/189356和国际公开号WO2015/189357中概述的那样，其全部内容通过引用明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15；IL-2和IL-21；IL-15和IL-21；以及IL-2、IL-15和IL-21，发现后者在许多实施方式中特别有用。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞(特别是其中所述的T细胞)的产生。
3、抗CD3抗体
在一些实施方式中，本文所述的扩增方法(包括称为REP的那些，参见例如图9)中使用的培养基还包含抗CD3抗体。与IL-2组合的抗CD3抗体诱导TIL群的T细胞活化和细胞分裂。用全长抗体以及Fab和F(ab′)2片段可以看到此种效果，前者通常是优选的；例如参见Tsoukas等，J.I mmunol.，1985，135，1719，其全部内容通过引用并入本文。
如本领域技术人员将理解的，有许多可用于本发明的合适的抗人CD3抗体，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人类、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在具体实施方式中，使用OKT3抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech)。
在一些实施方式中，可以在电穿孔步骤之前2天、3天、4天或5天将抗CD3抗体(例如OKT3)添加到TIL培养物中。在一些实施方式中，可以在电穿孔步骤之前立即添加抗CD3抗体(例如OKT3)。在一些实施方式中，可以在电穿孔步骤之后立即添加抗CD3抗体(例如OKT3)。在一些实施方式中，可以在电穿孔步骤之后2天、3天、4天或5天添加抗CD3抗体(例如OKT3)。
4.4-1BB和OX40激动剂
根据一个实施方式，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，细胞培养基还包含4-1BB(CD137)激动剂和/或OX40激动剂。可以在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。或者，可以在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
4-1BB激动剂可以是本领域已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可以是能够结合人或哺乳动物4-1BB的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可能同时具有重链和轻链。如本文所用，术语“结合分子”还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体以及抗体片段(例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段、上述任一项的表位结合片段以及工程化形式的与4-1BB结合的抗体(例如scFv分子))。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是完全人抗体。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方式中，用于本文公开方法和组合物的4-1BB激动剂包括：抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB Adnectin、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗-4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈的免疫应答。Lee等，PLOS One2013，8，e69677。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是激动性抗4-1BB人源化单克隆抗体或激动性抗4-1BB完全人单克隆抗体(即源自单个细胞系的抗体)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌托鲁单抗(utomilumab)或乌瑞鲁单抗(urelumab)或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可以是融合蛋白。在一个优选实施方式中，与激动性单克隆抗体(通常具有两个配体结合域)相比，多聚体4-1BB激动剂，例如三聚体或六聚体4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)，可以诱导更好的受体(4-1BBL)聚集和内部细胞信号复合物的形成。例如，Gieffers等，Mol.CancerTherapeutics 2013，12，2735-47描述了三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体融合蛋白，其包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc并可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫应答。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式特异性结合4-1BB抗原的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞的细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动剂活性结合人4-1BB(SEQ ID NO：9)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是与人4-1BB(SEQ ID NO：9)结合的结合分子。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是与鼠4-1BB(SEQ ID NO：10)结合的结合分子。表3-1总结了与4-1BB激动剂或结合分子结合的4-1BB抗原的氨基酸序列。
表3：4-1BB抗原的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000881
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约100pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约90pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约80pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约70pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约60pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约50pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约40pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB或以约30pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、8×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、8.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、9×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、9.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、或1×106 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1BB、。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.1×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.3×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.4×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.5×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.6×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.7×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.8×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB、以约2.9×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB或以约3×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1BB。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约10nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约9nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约8nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约7nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约6nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约5nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约4nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约3nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约2nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB或以约1nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB。
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌托鲁单抗可购自Pfizer,Inc.。乌托鲁单抗是一种免疫球蛋白G2-λ，抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]，智人(完全人)单克隆抗体。乌托鲁单抗的氨基酸序列在表4中列出。乌托鲁单抗在Asn59和Asn292处包含糖基化位点；在第22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)位包含重链链内二硫键；在第22'-87'(VH-VL)和136'-195'(CH1-CL)位包含轻链链内二硫键；在IgG2A/B同工型第218-130、219-219、222-222和225-225位、在IgG2A同工型第218-218、219-219、222-222和225-225位以及在IgG2B同工型第219-130(2)、222-222和225-225位包含链间重链-重链二硫键；以及在IgG2A同工型第130-213'(2)位、在IgG2A/B同工型第218-213'和130-213'位以及在IgG2B同工型第218-213'(2)位包含链间重链-轻链二硫键。乌托鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号8,821,867；8,337,850和9,468,678以及国际专利申请公开号WO 2012/032433 A1，其各自公开内容通过引用并入本文。乌托鲁单抗的临床前特征描述于Fisher等，CancerImmunolog.&Immunother.2012，61，1721-33。目前，乌托鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的临床试验包括美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：11给出的重链和SEQ ID NO：12给出的轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含乌托鲁单抗的重链和轻链的CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：13所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：14所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1结构域、重链CDR2结构域和重链CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1结构域、轻链CDR2结构域和轻链CDR3结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是药品监管机构参考乌托鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该抗体4-1BB抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1BB激动剂抗体，其中，4-1BB激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)授权。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。
表4：与乌托鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000911
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自Bristol-Myers Squibb，Inc.和Creative Biolabs，Inc.。乌瑞鲁单抗是一种免疫球蛋白G4-κ，抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]，智人(全人)单克隆抗体。表5列出了乌瑞鲁单抗的氨基酸序列。乌瑞鲁单抗在第298位(和第298’位)包含N-糖基化位点；在第22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)位(以及在第22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”位)包含重链链内二硫键；在第23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)位(以及在第23”'-88”'和136”'-196”'位)包含轻链链内二硫桥；在第227-227'和230-230”位包含链间重链-重链二硫键；以及在第135-216'和135'-216”位包含链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号7,288,638和8,962,804，其公开内容通过引用并入本文。Segal等，Clin.CancerRes.2016(可访问http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272)描述了乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征。乌瑞鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的当前临床试验包括美国国立卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含由SEQ ID NO：21给出的重链和由SEQ IDNO：22给出的轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包括重链和轻链，所述重链和轻链分别具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQID NO：22所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链的CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：23所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：24所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQID NO：24所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQID NO：24所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1结构域、重链CDR2结构域和重链CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1结构域、轻链CDR2结构域和轻链CDR3结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是由药品监管机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该抗体4-1BB抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1BB激动剂抗体，其中，4-1BB激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)授权。在一些实施方式中，在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。
表5：与乌瑞鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000931
Figure BDA0002855613220000941
在一个实施方式中，4-1BB激动剂选自：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、由保藏于ATCC号HB-11248和公开于美国专利号6、974、863的细胞系产生的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、公开于美国专利申请公开号US2005/0095244的抗体、美国专利号7,288,638(例如20H4.9-IgG1(BMS-663031))中公开的抗体、美国专利6,887,673(例如4E9或BMS-554271)中公开的抗体、美国专利号7,214,493中公开的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、美国专利号6,905,685中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利号6,362,325(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3E1)中公开的抗体、美国专利号6,974,863中公开的抗体(例如53A2)、美国专利号6,210,669中公开的抗体(例如1D8、3B8或3E1)、美国专利号5,928,893中描述的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、国际专利中公开的抗体专利申请公开号WO 2012/177788、WO2015/119923和WO 2010/042433中公开的抗体，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中，每个前述专利或专利申请出版物的公开内容均通过引用并入本文。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是国际专利申请公开号WO 2008/025516 A1，WO2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1和WO 2010/078966 A1；美国专利申请公开号US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1和US 2015/0126710 A1；以及美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460中描述的4-1BB激动融合蛋白，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是如图22的结构I-A(C端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc抗体片段融合蛋白)中所述的4-1BB激动融合蛋白或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在图22的结构I-A和I-B中，圆柱指单个多肽结合结构域(参见图140)。例如，结构I-A和结构I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域，该结合结构域源自4-1BBL或与4-1BB结合的抗体，它们折叠形成三价蛋白，然后通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)与第二个三价蛋白连接，然后通过二硫键(小的细长椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构，提供能够六个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起形成信号传导复合体的激动剂。例如，表示为圆柱的TNFRSF结合结构域可以是scFv结构域，scFv结构域包含例如通过接头连接的VH链和VL链，该接头可包含亲水性残基和Gly和Ser序列以具有柔韧性，以及包含Glu和Lys序列以具有溶解性。可使用任何scFv结构域设计，例如描述于deMarco，Microbial Cell Factories，2011，10，44；Ahmad等，Clin.&Dev.Immunol.2012，980250；Monnier等，Antibodies，2013，2，193-208；或并入本文其他地方的参考文献中的那些。此种形式的融合蛋白结构描述于美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460，其公开内容通过引用并入本文。
结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列在表6中给出。Fc结构域优选包含完整的恒定结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸17-230)和完整的铰链结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：31的氨基酸4-16)。连接C端Fc抗体的优选的接头可选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：41给出的实施方式，包括适用于融合其他多肽的接头。
表6：具有C端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF融合蛋白(包括4-1BB融合蛋白)的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000951
Figure BDA0002855613220000961
结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列在表7中给出。如果Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B)，则Fc模块的序列优选为SED ID NO：42所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO：43至SEQ ID NO：45所示的那些实施方式。
表7：具有N末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF融合蛋白(包括4-1BB融合蛋白)的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000962
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域选自：乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、选自表8中所述可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链，前述可变重链和可变轻链的任意组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上包含4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO：46的序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含可溶性4-1BBL序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO：47的序列。
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一种以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与表8所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。
表8：用作融合蛋白中4-1BB结合结构域或用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽结构域
Figure BDA0002855613220000971
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性4-1BB结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含位于N端和/或C端的其他结构域，其中，该其他结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性4-1BB结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含位于N端和/或C端的其他结构域，其中，该其他结构域是Fab或Fc片段结构域，其中，每个可溶性4-1BB结构域均缺少茎(stalk)区(有助于三聚化并提供与细胞膜的一定距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中，每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域都缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中每个TNF超家族细胞因子结构域均是4-1BB结合结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性scFv抗体，其包含与任何前述VL结构域连接的任何前述VH结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体(目录号79097-2)，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体(目录号MOM-18179)，可购自美国纽约州Shirley的Creative Biolabs。
OX40激动剂可以是本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可以是能够结合人或哺乳动物OX40的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。OX40激动剂或OX40结合分子可能同时具有重链和轻链。如本文所用，术语“结合分子”还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体以及抗体片段(例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段、上述任一项的表位结合片段以及工程化形式的与OX40结合的抗体(例如scFv分子))。在一个实施方式中，OX40激动剂是抗原结合蛋白，其是完全人抗体。在一个实施方式中，OX40激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方式中，用于本文公开方法和组合物的OX40激动剂包括：抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40 Adnectin、抗OX40结构域抗体、单链抗OX40片段、重链抗-OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，OX40激动剂是激动性抗OX40人源化单克隆抗体或激动性抗OX40完全人单克隆抗体(即源自单个细胞系的抗体)。
在一个优选实施方式中，OX40激动剂或OX40结合分子也可以是融合蛋白。例如，Sadun等，J.Immunother.，2009，182，1481-89中描述了包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白。在一个优选实施方式中，与激动性单克隆抗体(通常具有两个配体结合结构域)相比，多聚体4-1BB激动剂(例如，三聚体或六聚体4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域))可以更好地诱导受体(4-1BBL)聚集和细胞内信号传导复合物形成。例如，如Gieffers等，Mol.Cancer Therapeutics，2013，12，2735-47所述，三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体的融合蛋白包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc并且可选地还连接两个以上的这些融合蛋白。
已知，激动性OX40抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫应答。Curti等，Cancer Res.，2013，73，7189-98。在一个优选实施方式中，OX40激动剂是单克隆抗体或融合蛋白，它以足以降低毒性的方式与OX40抗原特异性结合。在一些实施方式中，OX40激动剂是激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白，它消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞细胞毒性)。在一些实施方式中，OX40激动剂是激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白，它消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方式中，OX40激动剂是激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白，它消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方式中，OX40激动剂是激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白，它消除Fc区功能性。
在一些实施方式中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和高激动活性与人OX40(SEQ ID NO：54)结合。在一个实施方式中，OX40激动剂是与人OX40(SEQ ID NO：54)结合的结合分子。在一个实施方式中，OX40激动剂是与鼠OX40(SEQ ID NO：55)结合的结合分子。表9总结了与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表9：OX40抗原的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220000991
在一些实施方式中，该组合物、过程和方法包括OX40激动剂，该OX40激动剂：与人或鼠OX40结合的KD为约100pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约90pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约80pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约70pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约60pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约50pM以下；与人或鼠OX40结合的KD为约40pM以下；或与人或鼠OX40结合的KD为约30pM以下。
在一些实施方式中，该组合物、过程和方法包括OX40激动剂，该OX40激动剂：与人或鼠OX40结合的kassoc为约7.5×105 1/M·s以上；与人或鼠OX40结合的kassoc为约7.5×1051/M·s以上；与人或鼠OX40结合的kassoc为约8×105 1/M·s以上；与人或鼠OX40结合的kassoc为约8.5×105 1/M·s以上；与人或鼠OX40结合的kassoc为约9×105 1/M·s以上；与人或鼠OX40结合的kassoc为约9.5×105 1/M·s以上；或与人或鼠OX40结合的kassoc为约1×106 1/M·s以上。
在一些实施方式中，该组合物、过程和方法包括OX40激动剂，该OX40激动剂：与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.1×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.2×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.3×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.4×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.5×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.6×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.7×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.8×10-5 1/s以下；与人或鼠OX40结合的kdissoc为约2.9×10-5 1/s以下；或与人或鼠OX40结合的kdissoc为约3×10-5 1/s以下。
在一些实施方式中，该组合物、过程和方法包括OX40激动剂，该OX40激动剂：与人或鼠OX40结合的IC50为约10nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约9nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约8nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约7nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约6nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约5nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约4nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约3nM以下；与人或鼠OX40结合的IC50为约2nM以下；或与人或鼠OX40结合的IC50为约1nM以下。
在一些实施方式中，OX40激动剂是他利昔珠单抗(tavolixizumab)，也称为MEDI0562或MEDI-0562。他利昔珠单抗可从AstraZeneca，Inc.的Medlmmune子公司商购。他利昔珠单抗是免疫球蛋白G1-κ、抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4、OX40、CD134)]、人源化和嵌合单克隆抗体。他利昔珠单抗的氨基酸序列列于表10中。他利昔珠单抗包含：在第301位和第301”位处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化的复杂型双触角CHO聚糖(fucosylated complex bi-antennary CHO-type glycan)；在第22位至第95位(VH-VL)、第148位至第204位(CH1-CL)、第265位至第325位(CH2)和第371位至第429位(CH3)(和第22”位至第95”位、第148”位至第204”位、第265”位至第325”位和第371”位至第429”位)处的重链链内二硫键；在第23'位至第88'位(VH-VL)和第134'位至第194'位(CH1-CL)(和第23”'位至第88”'位和第134”'位至第194”'位)处的轻链链内二硫键；在第230位至第230”位和第233位至第233”位处的重链-重链链间二硫键；在第224位至在214'位和第224”位至第214”'位的重链-轻链链间二硫键。目前，他利昔珠单抗的各种血液学和实体瘤指征的临床试验包括：美国国立卫生研究院临床试验管理识别号NCT02318394和NCT02705482。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：56给出的重链和SEQ ID NO：57给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列至少99％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列至少98％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列至少97％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列至少96％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列至少95％相同的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含他利昔珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：58所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：59所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少95％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含VH和VL区，该VH和VL区分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少99％相同。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62所示的序列；和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示的序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构批准的参考他利昔珠单抗的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或提交待授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物产品制剂的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。OX40激动剂抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。在一些实施方式中，生物仿制剂作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。
表10：他利昔珠单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220001021
Figure BDA0002855613220001031
在一些实施方式中，OX40激动剂是11D4，它是可从Pfizer，Inc.商购的全人抗体。11D4的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930以及9,028,824，其公开内容通过引用并入本文。11D4的氨基酸序列列于表11中。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：66给出的重链和SEQ ID NO：67给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示序列至少99％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQID NO：67所示序列至少98％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示序列至少97％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示序列至少96％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示序列至少95％相同的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：68所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：69所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：68和SEQ IDNO：69所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的序列；和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75所示的序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构批准的参考11D4的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是11D4。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是经授权或提交待授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是11D4。OX40激动剂抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是11D4。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是11D4。
表11：11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220001051
在一些实施方式中，OX40激动剂是18D8，它是可从Pfizer，Inc.商购的全人抗体。18D8的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930以及9,028,824，其公开内容通过引用并入本文。18D8的氨基酸序列列于表12中。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：76给出的重链和SEQ ID NO：77给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示序列至少99％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQID NO：77所示序列至少98％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示序列至少97％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示序列至少96％相同的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示序列至少95％相同的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：78所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：79所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：78和SEQ IDNO：79所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82所示的序列；和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85所示的序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构批准的参考18D8的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是18D8。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是经授权或提交待授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是18D8。OX40激动剂抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是18D8。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是18D8。
表12：18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220001071
在一些实施方式中，OX40激动剂是Hu119-122，其是可从GlaxoSmithKline plc获得的人源化抗体。Hu119-122的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085以及国际专利公开号WO2012/027328中，其公开内容通过引用并入本文。Hu119-122的氨基酸序列列于表13中。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：86所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：87所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：86和SEQID NO：87所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90所示的序列；和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93所示的序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构批准的参考Hu119-122的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是经授权或提交待授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。OX40激动剂抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。在一些实施方式中，生物仿制剂作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。
表13：Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220001081
Figure BDA0002855613220001091
在一些实施方式中，OX40激动剂是Hu106-222，其是可从GlaxoSmithKline plc获得的人源化抗体。Hu106-222的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085以及国际专利公开号WO2012/027328中，其公开内容通过引用并入本文。Hu106-222的氨基酸序列列于表14中。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：94所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：95所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：94和SEQID NO：95所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，OX40激动剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98所示的序列；和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域及它们的保守性氨基酸取代，所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101所示的序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构批准的参考Hu106-222的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是经授权或提交待授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。OX40激动剂抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方式中，生物仿制剂作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。
表14：Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002855613220001101
在一些实施方式中，OX40激动剂抗体是MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469是一种鼠单克隆抗体。Weinberg等，J.Immunother.，2006，29，575-585。在一些实施方式中，如Weinberg等，J.Immunother.，2006，29，575-585(其公开内容通过引用整体并入本文)所述，OX40激动剂是由9B12杂交瘤(保藏于美国马萨诸塞州马尔文的Biovest Inc.)产生的抗体。在一些实施方式中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施方式中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是L106 BD(Pharmingen产品号340420)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen产品号340420)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方式中，OX40激动剂是ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa CruzBiotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方式中，OX40激动剂是鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可从InVivoMAb，BioXcellInc，西黎巴嫩，新罕布什尔州商购。
在一个实施方式中，OX40激动剂选自以下专利文献中所述的OX40激动剂：国际专利申请公开号WO95/12673、WO95/21925、WO2006/121810、WO2012/027328、WO2013/028231、WO2013/038191和WO2014/148895；欧洲专利申请EP0672141；美国专利申请公开号US2010/136030、US2014/377284、US2015/190506和US2015/132288(包括克隆20E5和12H3)；以及美国专利号7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399和9,163,085，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，OX40激动剂是如结构I-A(C-末端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N-末端Fc-抗体片段融合蛋白)所示的OX40激动性融合蛋白，或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的性质如上文和美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460中所述，其公开内容通过引用并入本文。表6中给出了结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列。Fc结构域优选包含完整的恒定结构域(SEQ ID NO：31的第17位至第230位氨基酸)、完整的铰链结构域(SEQ ID NO：31的第1位至第16位氨基酸)或部分铰链结构域(例如，SEQ ID NO：31的第4位至第16位氨基酸)。连接C-末端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：41给出的实施方式，包括适于融合其他多肽的接头。同样，结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列在表7中给出。如果Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B所示)，则Fc模块的序列优选如SEQ ID NO：42所示，并且接头序列优选选自SEQ ID NO：43至SEQ ID NO：45所示的那些实施方式。
在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域选自：他利昔珠单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表15中所述可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、上述可变重链和可变轻链的任何组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域包含OX40L序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域包含根据SEQ IDNO：102的序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含可溶性OX40L序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域包含根据SEQ ID NO：103的序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域包含根据SEQ ID NO：104的序列。
在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH和VL区的scFv结构域，该VH区和VL区各自分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH区和VL区的scFv结构域，VH区和VL区各自分别与SEQID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH区和VL区的scFv结构域，VH区和VL区各自分别与SEQ IDNO：78和SEQ ID NO：79所示序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH区和VL区的scFv结构域，VH区和VL区各自分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH区和VL区的scFv结构域，VH区和VL区各自分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH区和VL区的scFv结构域，VH区和VL区各自与表15中给出的VH序列和VL序列至少95％相同，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。
表15：用作融合蛋白中的OX40结合结构域(例如结构I-A和I-B)或用作scFv OX40激动剂抗体的其他多肽结构域
Figure BDA0002855613220001131
Figure BDA0002855613220001141
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合域、(iv)第二肽接头以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其在N-末端和/或C-末端还包含另外的结构域；其中，所述另外的结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合域、(iv)第二肽接头以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其在N-末端和/或C-末端还包含另外的结构域；其中，实施另外的结构域是Fab或Fc片段结构域；其中，每个可溶性OX40结合结构域缺少茎区域(有助于三聚化并提供距离细胞膜的一定距离，但不是OX40结合结构域的一部分)，并且第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动剂单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头以及(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域；其中，每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域均缺乏茎区域，第一肽接头和第二肽接头独立地具有长度3至8个氨基酸，并且TNF超家族细胞因子结构域是OX40结合结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂是MEDI6383。MEDI6383是OX40激动融合蛋白，可以如美国专利号6,312,700(其公开内容通过引用并入本文)中所述制备。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动scFv抗体，其包含与任何前述VL结构域连接的任何前述VH结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州Shirley的Creative Biolabs，Inc.。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend，Inc.。
E、步骤E：收获TIL
在第二次扩增步骤后，可以收获细胞。在一些实施方式中，例如，在如图9中所提供的一个、两个、三个、四个或者更多个扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方式中，例如，在如图9中所提供的两个扩增步骤之后收获TIL。
可以以任何适当和无菌的方式收获TIL，包括例如通过离心。收获TIL的方法是本领域熟知的，并且任何这样的已知方法可与本发明方法一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收获TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自多种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International，Inc.。任何基于细胞的收集器均可用于本方法。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方式中，细胞收集是通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)。术语“LOVO细胞处理系统”还指任何供应商制造的可在无菌和/或封闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或者过滤器(例如旋转膜或者旋转过滤器)的任何仪器或者设备，其允许连续流动和细胞处理，以除去上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统可以在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方式中，收获(例如根据图9的步骤E)是在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
F、步骤F：最终制剂和转移至输液袋
在如图9中以示例性顺序提供的步骤A至E之后以及如上文和此处详述的概述完成后，将细胞转移至容器以用于对患者施用。在一些实施方式中，一旦使用上述扩增方法获得治疗足够数量的TIL，将它们转移至容器以用于对患者施用。
在一个实施方式中，将使用本公开的APC扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一个实施方式中，T细胞以单次动脉内或静脉内输注，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。
1、药物组合物、剂量和施用方案
在一个实施方式中，将使用本公开方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，T细胞以单次动脉内或静脉内输注施用，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL数量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或0.0001％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或者0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g，或者0.0001g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g，或者10g。
本发明的药物组合物中提供的TIL在宽剂量范围内有效。精确的剂量取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可使用临床确定的TIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量，将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置和处方医生的自由裁量权。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。只要有必要，TIL的施用可以继续。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg，或者约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg，或者约198至约207mg。
有效量的TIL可通过具有类似用途的药剂的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，包括鼻内和透皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部，通过移植或者通过吸入。
H、可选的TIL的冷冻保存
如上所述和在图9中提供的步骤A至E中所举例说明的，冷冻保存可发生在整个TIL扩增过程中的许多节点。在一些实施方式中，可以冷冻保存第二次扩增后的扩增的TIL群(例如，如根据图9的步骤D提供的)。通常可通过将TIL群置于冷冻溶液(例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO))中来实现冷冻保存。将溶液中的细胞置于冻存管中并在-80℃下储存24小时，可选地转移至气态氮冷冻机中进行冷冻保存。参见Sadeghi等，ActaOncologica 2013，52，978-986。在一些实施方式中，TIL在5％DMSO中冷冻保存。在一些实施方式中，TIL在细胞培养基加5％DMSO中冷冻保存。在一些实施方式中，根据实施例8和9中提供的方法冷冻保存TIL。
适当时，将细胞从冰箱中取出并在37℃水浴中解冻至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，可以如本领域已知地对解冻的TIL进行计数并评估活力。
I、TIL生产的封闭系统
本发明提供了TIL培养期间封闭系统的使用。此种封闭系统允许预防和/或减少微生物污染，允许使用更少的烧瓶，并允许降低成本。在一些实施方式中，封闭系统使用两个容器。
此种封闭系统在本领域中是公知的，并且可以在例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guid ances/Blood/ucm076779.htm上找到。
如FDA网站上所提供的，采用无菌方法的封闭系统是已知的，并且已得到充分描述。参见，https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatory Information/Guidances/Blood/ucm076779.htm，如上文所述，在下文相关部分中提供。
无菌连接设备(STCD，sterile connecting device)在两根兼容管之间产生无菌连接处。该步骤允许无菌连接各种容器和管径。本指南描述了使用这些设备的推荐操作和步骤。本指南未发布无菌连接设备制造商为了获得上市批准或许可必须提交给FDA的数据或信息。同样重要的是要注意，根据美国联邦食品、药品和化妆品法(Federal Food，Drug和Cosmetic Act.)，将经批准或许可的无菌连接设备用于标签中未授权的目的，可能会导致该设备被视为混淆品和贴假商标。
在一些实施方式中，从获得肿瘤碎片的时间开始直至TIL准备好施用于患者或者冷冻保存，封闭系统使用一个容器。在一些实施方式中，当使用两个容器时，第一容器是封闭G容器，并且将TIL群离心并转移至输液袋而不打开第一封闭G容器。在一些实施方式中，当使用两个容器时，输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。封闭系统或者封闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦添加了肿瘤样品和/或肿瘤碎片，系统就紧密密封与外界隔离，形成了一个不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵的封闭环境。
在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约100％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约95％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约10％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约15％至约85％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或者约100％。
封闭的系统允许在无微生物污染和/或微生物污染显著减少的情况下的TIL生长。
此外，各个TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压随着细胞的培养而变化。因此，即使循环了适用于细胞培养的培养基，封闭的环境仍然需要持续保持TIL增殖的最佳环境。为此，期望通过传感器来监测封闭环境的培养液中的物理因素(pH、二氧化碳分压和氧气分压)，其信号用于控制安装在培养环境入口处的气体交换器，根据培养液的变化实时调节封闭环境的气体分压，从而优化细胞培养环境。在一些实施方式中，本发明提供了封闭细胞培养系统，该系统包括在封闭环境入口处的配备有监测装置的气体交换器，该监测装置测量封闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压，并根据来自监控设备的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施方式中，连续或者间歇地控制封闭环境内的压力。即，例如可通过压力维持装置来改变封闭环境中的压力，从而确保该空间处于适用于TIL生长的正压状态，或者处于促进流体渗出的负压状态，从而促进细胞增殖。此外，通过间歇地施加负压，可通过封闭环境的体积的暂时收缩来均匀且有效地替换封闭环境中的循环液体。
在一些实施方式中，可以更换或者添加用于TIL增殖的最佳培养组分，并且可以添加例如IL-2和/或OKT3的因子及它们的组合。
C、细胞培养
在一个实施方式中，扩增TIL的方法，包括上文讨论以及在图9中举例说明的那些，可以包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或者约5,800mL至约8700mL的细胞培养基。在一些实施方式中，培养基是无血清培养基。在一些实施方式中，第一次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第二次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第一次扩增和第二次扩增中的培养基均是无血清的。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增TIL的数量。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增TIL数量所需的培养基的量和培养基的种类数量。在一个实施方式中，扩增TIL的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率喂养细胞。在透气性容器中扩增细胞的数量通过降低扩增细胞所需的喂养频率，简化了扩增细胞数量所需的程序。
在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需的步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基不含β-巯基乙醇(BME)。
在一个实施方式中，该方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在其中装有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得TIL；在装有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL的数量持续约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，pre-REP为约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，REP为约7天至14天，例如约11天。
在一个实施方式中，在透气性容器中扩增TIL。使用本领域已知的方法、组成和装置，包括在美国专利申请公开号US2005/0106717A1中描述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用PBMC来扩增TIL。在一个实施方式中，TIL在透气袋中扩增。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如Xuri细胞扩增系统W25(Xuri Cell Expansion System W25)(GE Healthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一个实施方式中，可以在G-Rex烧瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增TIL。此类实施方式可以将细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增为10×106～30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，无需喂养细胞。在一个实施方式中，只要培养基在G-Rex烧瓶中位于约10cm的高度，就不进行喂养。在一个实施方式中，不进行喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法是本领域中已知的并且已经用于扩增TIL，包括在美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际公开号WO2014/210036A1、美国专利申请公开号US2013/0115617Al、国际公开号WO2013/188427A1、美国专利申请公开号US2011/0136228A1、美国专利号US8,809,050B2、国际公开号WO2011/072088A2、美国专利申请公开号US2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133A1、国际公开号WO2012/129201A1、美国专利申请公开号US2013/0102075A1，美国专利号US8,956,860B2、国际公开号WO2013/173835A1和美国专利申请公开号US2015/0175966A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于Jin等，J.I mmunotherapy 2012，35，283-292。
D、可选的TIL冷冻保存
可选地，可以冷冻保存大量TIL群或扩增的TIL群。在一些实施方式中，冷冻保存发生在治疗性TIL群上。在一些实施方式中，对第二次扩增后获得的TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，在图9的示例性步骤F中，对TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，对TIL进行冷冻保存在输液袋中。在一些实施方式中，在放入输液袋中之前对TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，对TIL进行冷冻保存并且不放置在输液袋中。在一些实施方式中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(DMSO)。这通常是通过将TIL群置于冷冻溶液中来完成，例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO)。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013，52，978-986。
适当时，将细胞从冰箱中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可对解冻的TIL进行计数并评估活力。
在一个优选实施方式中，使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用包含二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用1：1(体积：体积)比率的CS10和细胞培养基对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用约1：1(体积：体积)比率的CS10和细胞培养基(还包含另外的IL-2)对TIL群进行冷冻保存。
根据具体实施方式，冷冻保存组合物(本文也称为“基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基”)包含：根据本发明制备的TIL群(例如，其量为1×106至9×1013)、适用于在低温环境(例如-70℃至-196℃)保存细胞的包含DMSO的冷冻保护剂(例如
Figure BDA0002855613220001231
CS10)和电解质溶液(例如等渗溶液，例如
Figure BDA0002855613220001232
A)。在一个优选实施方式中，冷冻保护剂和电解质溶液以约1.2：1至约1：1.2或约1.1：1至约1：1.1或优选约1：1的比率存在。根据一个实施方式，电解质溶液包含钠、钾、镁、乙酸盐、氯化物和葡萄糖酸盐中的一种以上或它们的组合；例如，电解质溶液可包含氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾和氯化镁。根据一个实施方式，电解质溶液的pH为约7至约8，优选为约7.2至约7.6，或约7.4。优选地，冷冻保存组合物还包含一种以上稳定剂(例如人血清白蛋白)和/或一种以上淋巴细胞生长因子(例如IL-2)。例如，冷冻保护剂和电解质溶液各自可以以约20mL至约100mL或约30mL至约70mL或约40mL至约60mL或约50mL的量存在于冷冻保存组合物中；人血清白蛋白可以约0.01g至约2.0g或约0.1g至约1.0g或约0.5g的量存在；IL-2可以约0.001mg至约0.005mg或约0.0015mg至约0.0025mg或约0.0018mg的量存在。冷冻保存培养基可以可选地包含一种以上其他添加剂或赋形剂，例如pH调节剂、防腐剂等。
根据一个实施方式，包含TIL群的冷冻保存组合物由以下组成：
药品的公称成分(％v/v)(以100mL为基准)
Figure BDA0002855613220001241
a CryoStor CS10含有10％二甲基亚砜(DMSO)
如以上在步骤A至E中所讨论的，冷冻保存可能发生在整个TIL扩增过程中的许多节点。在一些实施方式中，可以冷冻保存根据步骤B的第一次扩增后的大量TIL群或者根据步骤D的一个以上第二次扩增后的扩增的TIL群。冷冻保存通常可通过将TIL群放入冷冻溶液中完成，例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO)。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013，52，978-986。
适当时，将细胞从冰箱中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可对解冻的TIL进行计数并评估活力。
在一些情况下，可使用下文讨论的方案立即对步骤B的TIL群进行冷冻保存。或者，可对大量TIL群进行步骤C和D，然后在步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在将基因修饰的TIL用于治疗的情况下，可对步骤B或者步骤D的TIL群进行基因修饰以用于适当的治疗。
V、治疗癌症和其他疾病的方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方式中，它们用于治疗过度增殖性疾病。它们还可用于治疗如此处及以下段落中描述的其他病症。
在一些实施方式中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗预处理患者。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(TIL输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2的静脉输注，直至生理耐受。
本文所述的TIL在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症中的疗效可使用本领域已知的各种模型进行测试，为人类疾病的治疗提供指导。例如，用于确定卵巢癌治疗疗效的模型描述于例如Mullany等，Endocrinology 2012，153，1585-92；以及Fong等，J.OvarianRes.2009，2，12。用于确定胰腺癌治疗疗效的模型描述于Herreros-Villanueva等，WorldJ.Gastroenterol.2012，18，1286-1294。用于确定乳腺癌治疗疗效的模型描述于例如Fantozzi，Breast Cancer Res.2006，8，212。用于确定黑色素瘤治疗疗效的模型描述于例如Damsky等，Pigment Cell&Melanoma Res.2010，23，853–859。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如Meuwissen等，Genes&Development，2005，19，643-664。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如Kim，Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009，2，55-60；以及Sano，HeadNeck Oncol.2009，1，32。
在一些实施方式中，IFN-伽马(IFN-γ)指示过度增殖性疾病治疗的治疗疗效。在一些实施方式中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方式中，采用了IFN-γ产生的效价测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用本发明方法(包括例如图20或图21中所述那些)制备的TIL治疗受试者的血液中细胞因子IFN-γ的水平，来检测IFN-γ的产生。在一些实施方式中，与用称为过程1C的方法(如图13中所示)制备的TIL治疗的受试者相比，本发明方法获得的TIL在用本发明方法的TIL治疗的受试者的血液中提供增加的IFN-γ。在一些实施方式中，IFN-γ的增加指示用本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了3倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了4倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒检测IFN-γ。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒检测IFN-γ。在一些实施方式中，在用本发明的方法产生的TIL治疗的患者离体的TIL中，测量IFN-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的TIL治疗的患者的血液中的IFN-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的TIL治疗的患者的血清中的IFN-γ。
在一些实施方式中，与通过其他方法制备的TIL(包括图20或图21中未示例的那些)相比，通过本发明的方法制备的TIL(包括例如图20或图21描述的那些，例如称为过程1C方法的方法)表现出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示癌症治疗的治疗功效和/或临床功效增加。在一些实施方式中，多克隆性指T细胞库多样性。在一些实施方式中，多克隆性增加可指示关于施用本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方式中，与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图20或图21所示那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了10倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了100倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了500倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图9所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了1000倍。
1、共同施用的方法
在一些实施方式中，如本文所述产生的TIL，包括例如来自图20或图21中所述方法的TIL，可与一种以上免疫检查点调节剂组合施用，例如下文描述的抗体。例如，靶向PD-1并且可与本发明的TIL共同施用的抗体包括例如但不限于：尼沃鲁单抗(BMS-936558，百时美施贵宝；
Figure BDA0002855613220001271
)，兰洛利珠单抗(lambrolizumab，MK03475或MK-3475，默克；
Figure BDA0002855613220001272
)，人源化抗PD-1抗体JS001(ShangHai JunShi)，单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro，Inc.)，匹地利珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)，抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(ShangHai HengRui)，人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)，人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)，和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)。在一些实施方式中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。适用于根据本文所述步骤A至步骤F产生的TIL的共同施用方法的其它合适的抗体是美国专利号8,008,449中公开的抗PD-1抗体，其内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L1并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。任何本领域已知的与PD-L1结合并破坏PD-1和PD-L1之间相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤A至步骤F产生的TIL的共同施用方法。例如，靶向PD-L1并且处于临床试验中的抗体包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和MPDL3280A(Genentech)。靶向PD-L1的其他合适的抗体公开于美国专利号7,943,743中，其内容通过引用并入本文。本领域普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合、破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤A至步骤F产生的TIL的共同施用方法。在一些实施方式中，当患者具有难以用单独施用抗PD-1抗体治愈的癌症类型时，施用根据步骤A至步骤F产生的TIL组合的受试者被共同施用抗PD-1抗体。在一些实施方式中，当患者患有重构黑色素瘤(refractory melanoma)时，给患者施用与抗PD-1组合的TIL。在一些实施方式中，当患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)时，给患者施用与抗PD-1组合的TIL。
2、可选的患者的淋巴细胞耗竭预处理
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗对患者进行预处理。在一个实施方式中，本发明包括用于治疗患者的癌症的TIL群，该患者已用非清髓性化疗进行预处理。在一个实施方式中，TIL群用于通过输注施用。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(TIL输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2(阿地白细胞介素，作为PROLEUKTN市售)的静脉输注，直至生理耐受。在某些实施方式中，TIL群与IL-2组合用于治疗癌症；其中，IL-2在TIL群之后施用。
实验结果表明，过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在提高治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的TIL之前对患者使用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
通常，采用施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)，及它们的组合来完成淋巴细胞耗竭。此种方法描述于Gassner等，Cancer I mmunol I mmunother.2011，60，75–85；Muranski等，Nat.Clin.Pract.Oncol.，2006，3，668–681、Dudley等；J.Clin.Oncol.2008，26，5233-5239和Dudley等，J.Clin.Oncol.2005，23，2346–2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。
在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/mL至10μg/mL浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得1μg/mL浓度的马磷酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方式中，静脉注射(即i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4至5天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4天。
在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺共同施用于患者来进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方式中，氟达拉滨以25mg/m2/天静脉注射施用且环磷酰胺以250mg/m2/天静脉注射施用，持续4天。
在一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天，来进行淋巴细胞耗竭。
3、IL-2方案
在一个实施方式中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案；其中，高剂量IL-2方案包括：在施用治疗有效份的第三TIL群之后的第二天开始静脉内施用阿地白细胞介素或其生物类似物或变体；其中，阿地白细胞介素或其生物类似物或变体以0.037mg/kg或0.044mg/kgIU/kg(患者体重)的剂量每8小时一次静脉推注施用15分钟，直至耐受，最多14剂。休息9天后，可以重复该时间表进行另外14个剂量，总共最多28个剂量。
在一个实施方式中，IL-2方案包括递减型(decrescendo)IL-2方案。递减型IL-2方案已描述于O'Day等，J.Clin.Oncol.1999，17，2752-61和Eton等，Cancer 2000，88，1703-9，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在6小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在12小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在24小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在72小时内静脉内施用4.5×106IU/m2。该治疗循环可每28天重复一次，最多4个循环。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在第1天18,000,000IU/m2，在第2天9,000,000IU/m2，在第3和4天4,500,000IU/m2。
在一个实施方式中，IL-2方案包括每天、每2天、每4天、每6天、每7天、每14天或每21天，以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化的IL-2。
4、过继性细胞转移(Adoptive Cell Transfer)
过继性细胞转移(ACT)是一种非常有效的免疫治疗形式，涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者体内。ACT是一种治疗方法，涉及体外识别具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞大量体外扩增，以及将其输注到患癌宿主中。用于过继性转移的淋巴细胞可以来自切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)。可以如本文所述制备用于ACT的TIL。在一些实施方式中，例如根据图9中描述的方法来制备TIL。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，富含混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)，或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽克隆，则它们也可来源或来自血液。淋巴细胞来源于待输注的患癌宿主的ACT称为自体ACT。美国公开号2011/0052530涉及用于实施过继性细胞治疗以促进癌症消退的方法，主要用于治疗患有转移性黑色素瘤的患者，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，TIL可以如本文所述施用。在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或超过六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或隔天一次。只要需要，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的施用可以继续。
实施例
现在参考以下实施例描述本文包括的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例
实施例1：冷冻保存的TIL细胞治疗的生产
本实施例描述了根据现行良好组织操作(Good Tissue Practices)和现行良好生产规范(Good Manufacturing Practices)在G-Rex烧瓶中的TIL治疗的cGMP生产。
过程参考扩增计划
Figure BDA0002855613220001311
烧瓶体积：
烧瓶类型 工作体积/烧瓶(mL)
G-Rex100MCS 1000
G-Rex500MCS 5000
设备
设备列表：第0天，CM1培养基制备/肿瘤洗涤液制备/肿瘤解剖：
·差压计(Magnehelic Gauge)
·生物安全柜(BSC)
·培养箱
·CO2分析仪
·微量移液器(100-1000μL)
·吸管辅助器(Pipet-Aid)
·Baxa中继泵
·Sebra封管机
·2℃-8℃冰箱
·-80℃冰柜
·-20℃冰柜
·计时器
设备列表：CM2制备/第11天REP接种
·差压计
·生物安全柜(BSC)
·培养箱
·培养箱
·CO2分析仪
·干浴
·水浴
·CytoTherm
·焊机
·Gatherex
·NC200 NucleoCounter
·Baxa中继泵
·Sebra封管机秤
设备列表：CM2制备/第11天REP接种
·离心机
·微量移液器(100-1000μL)
·吸管辅助器
·计时器
·2℃-8℃冰箱
·-80℃冰柜
·控速冷冻机
·LN2储存冷冻柜(Quarantine)
·-20℃冰柜
设备列表：CM4制备/第16天
·差压计
·生物安全柜(BSC)
·培养箱
·培养箱
·CO2分析仪
·焊机
·焊机
·Gatherex
·NC200 NucleoCounter
·Baxa中继泵
·Sebra封管机秤
·微量移液器(100-1000μL)
·吸管辅助器
·2℃-8℃冰箱
·-80℃冰柜
设备列表：第22天，配制、填充、冷冻保存
·差压计
·生物安全柜(BSC)
·培养箱
·培养箱
·CO2分析仪
·焊机
·Gatherex
·NC200 NucleoCounter
·Baxa中继泵
·Sebra封管机秤
·微量移液器(20-200μL)吸管辅助器
设备列表：第22天，配制、填充、冷冻保存
·吸管辅助器
·2℃-8℃冰箱
·-80℃冰柜
·控速冷冻机
·LN2储存冷冻柜
·LN2储存冷冻柜(Quarantine)
·LOVO细胞处理系统
7.0材料
材料：第0天，CM1培养基制备/肿瘤洗涤液制备/肿瘤
解剖
·一次性解剖刀，无菌
·50mL血清移液管，无菌
·1mL塑料血清移液管，无菌
·10mL血清移液管，无菌
·离心管，50mL，28×114mm，锥形底座，螺帽，PP，无菌
·25mL血清移液管，无菌
·5mL血清移液管，无菌
·MF75系列，一次性组织培养过滤器，1000mL，aPES过滤器，0.2μm，无菌
·移液管，血清100mL
·2-巯基乙醇1000X，液体，55mM，在D-PBS中
·Hank平衡钠盐溶液(1X)，液体，w/o氯化钙、氯化镁、硫酸镁
·GlutaMAX 1-200mM(100X)，液体
·ART Barrier移液器吸头，1000μL，独立包装，无菌
·150mm培养皿，加深，无菌
·6孔超低吸附板，9.5cm2孔生长面积，PS，无菌
·Thermo Scientific Samco通用移液器，7.7mL，无菌
·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端
·8英寸长镊子，无菌
·硫酸庆大霉素，50mg/mL储备溶液
·一次性科学镊子，4.5英寸，不锈钢，无菌
·100mm培养皿，无菌，加深
·泵送液体分配系统
·硫酸庆大霉素，50mg/mL储备溶液
·双功能注射器盖，红色
·RPMI-1640，1L瓶
·G-Rex 100M烧瓶，封闭系统
·无菌性标尺
·重组IL-2
·人体肿瘤样品，头颈，N/A
·人体肿瘤样品，宫颈，N/A
·GemCell人血清AB，热灭活，N/A
·人类肿瘤样品，黑色素瘤
·GemCell人血清AB，热灭活
材料：CM2制备/第11天REP接种
·鲁尔锁(Luer-Lok)注射器，60mL无菌针头16G×1.5”，无菌
·50mL血清移液管，无菌
·1mL血清移液管，塑料，无菌
·Nunc内螺纹冻存管，无菌
·10mL血清移液管，无菌
·离心管，15mL
·离心管，50mL
·移液管，血清100mL
·1cc鲁尔锁注射器，无菌
·3mL注射器，鲁尔锁吸头，无菌
·5mL血清移液管，无菌
·Nalgene*MF75*系列过滤器单元接收容器，250mL，无菌
·Nalgene MF75系列过滤器单元接收容器，500mL，无菌
·1000mL Nalgene快速流动无菌一次性过滤器单元，0.22μm PES
·CryoStor CS-10
·2-巯基乙醇1000X，液体，55mM，在D-PBS中
·GlutaMAX 1-200mM(100X)，液体
·1000μL ART Barrier无菌移液器吸头，独立包装
·VIA1盒
·转运包容器，1000mL，带连接器，无菌
·转运包300mL，带连接器
·无菌酒精棉片
·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端
·CTS AIM V 1L瓶
·纯MACS GMP CD3(OKT-3)
·硫酸庆大霉素，50mg/mL储备溶液
·4英寸管，带穿刺针和注射器适配器
·鲁尔锁注射器，10mL
·管，四尖嘴公鲁尔歧管
·重力式给血装置(·Gravity Blood Administration Set)，Y型，无注射位点，170μm血液过滤器
·泵送液体分配系统
·10L Labtainer 3端口袋
·硫酸庆大霉素，50mg/mL储备溶液
·100mL注射器
·3000mL培养袋
·OrigenCell Connect CC2
·双功能注射器盖，红色
·RPMI-1640，1L瓶
·G-Rex 500M烧瓶，封闭系统
·重组IL-2
·同种异体的经辐照饲养细胞
·同种异体的经辐照饲养细胞
·人血清，AB(HI)型(Gemini)
·人血清，AB(HI)型(Gemini)
材料：CM4制备/第16天
·鲁尔锁注射器，60mL，无菌
·1mL塑料血清移液管，无菌
·Nunc无菌内螺纹圆柱管样品瓶
·10mL血清移液管，无菌
·离心管，15mL
·离心管，50mL
·血清移液管，100mL
·带鲁尔锁的无菌注射器，3mL
·5mL血清移液管，无菌
·鲁尔锁注射器，10mL
·Nalgene*MF75*系列
·过滤器单元接收容器，250mL，无菌
·GlutaMAX 1-200mM(100X)，液体
·1000μL ART Barrier移液器吸头，独立包装，无菌
·VIA1盒
材料：CM4制备/第16天
·转运包容器，1000mL，带连接器，无菌
·无菌酒精棉片
·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端
·CTS AIM-V 1000mL，N/A
·血浆转运装置4英寸管，带母鲁尔接头
·30mL鲁尔锁无菌注射器
·CTS AIM V 10L袋
·泵送液体分配系统
·10L Labtainer 3端口袋
·双功能注射器盖，红色
·G-Rex500M烧瓶，封闭系统
·重组IL-2
材料：第22天，配制、填充、冷冻保存
·鲁尔锁注射器，60mL，无菌
·16G针x 1.5英寸，无菌
·50mL血清移液管，无菌
·Nunc内螺纹冻存管，无菌
·10mL血清移液管，无菌
·离心管，15mL
·离心管，50mL
·1cc鲁尔锁注射器，无菌
·3mL注射器，鲁尔锁吸头，无菌
·25mL血清移液管，无菌
·5mL血清移液管，无菌
·鲁尔锁注射器，10mL
·血清移液管，100mL
·ART Barrier无菌移液器吸头，200μL，独立包装
·VIA1盒
·Plasma-Lyte A注射液1L
·LOVO一次性细胞洗涤套装
·LOVO辅助袋套件
·无菌酒精棉片
·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端
·CTS AIM V 1L瓶
·人白蛋白25％
·血浆转运装置4英寸管，带母鲁尔接头
·管，四公鲁尔歧管
·重力式给血装置
·Y型装置，无注射位点，170μm血液过滤器
·泵送液体分配系统
·10L Labtainer 3端口袋
·100mL注射器
·CS750冻存袋
·3L培养袋
·OrigenCell Connect CC2
·双功能注射器盖，红色
·Cryostor CS10，100mL袋
·分配尖嘴，通风
·重组IL-2
过程
8.1第0天，CM1培养基制备
8.1.1检查房间消毒、管线清除和材料。确认房间消毒。
8.1.2确保完成预处理表格。
8.1.3环境监测。在处理前，确保已开始进行预处理环境监控。
8.1.4制备RPMI 1640培养基。在BSC中，使用适当尺寸的移液器，从1000mL RPMI 1640培养基中取出100.0mL，放入适当尺寸的带有“废弃物”标签的容器中。
8.1.5在BSC中，将试剂添加至RPMI 1640培养基瓶中。如下表所示，向RPMI 1640培养基瓶中添加以下试剂。记录添加的体积。每瓶添加的量：热灭活的人AB血清(100.0mL)；GlutaMax(10.0mL)；硫酸庆大霉素50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
8.1.6混合培养基。给步骤8.1.5的RPMI 1640培养基瓶加盖，旋转旋瓶子以确保试剂充分混合。
8.1.7过滤RPMI培养基。通过1L 0.22微米过滤器单元过滤步骤8.1.6的RPMI 1640培养基。
8.1.8给经过滤的培养基贴上标签。无菌地盖住经过滤的培养基，标签上具有以下信息。
8.1.9从BSC中取出不必要材料。从BSC中取出培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS留在BSC中以用于8.2节中洗涤培养基的配制。
8.1.10储存未使用的消耗品。将所有剩余的打开/解冻的培养基试剂转移到适当储存条件下或丢弃为废物。注：按照过程注释5.9，给培养基试剂分配适当有效期，贴上批次记录批号。
8.1.11解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL的IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有的冰均熔化。记录IL-2：批号和有效期(注：确保已粘贴IL-2标签)。
8.1.12将IL-2储备溶液转移至培养基。在BSC中，将1.0mL IL-2储备溶液转移至步骤8.1.8中制备的CM1第0天培养基瓶中。加入CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
8.1.13混合，重新贴标签。盖上盖子，旋转瓶子以混合含有IL-2的培养基。重新标记为“完全CM1第0天培养基”，分配新的批号。
8.1.14按照样品计划，取出样品培养基。使用适当尺寸的移液管取出20.0mL培养基，加到50mL锥形管中。
8.1.15贴好标签，储存。给样品贴上样品计划库存标签，在2℃至8℃下储存“培养基保留”样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。
8.1.16签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.1.17准备“组织块”锥形管。在BSC中，将25.0mL的“完全CM1第0天培养基”(步骤8.1.13中制备)转移至50mL锥形管中。将试管贴上标签“组织小块”，记录批号。
8.1.18将G-Rex100MCS转移到BSC。无菌地将G-Rex100MCS(W3013130)转移到BSC。
8.1.19准备G-Rex100MCS。在BSC中，关上G-Rex100MCS上的所有夹子，使排气过滤器夹子保持打开状态。
8.1.20准备G-Rex100MCS。通过鲁尔连接件将G-Rex100MCS烧瓶的红色管线连接到中继泵流体转运装置(W3009497)的较大直径端。
8.1.21准备Baxa泵。将Baxa泵置于BSC旁边。从BSC卸下中继泵流体转运装置的泵管部分并将其安装在中继泵中。
8.1.22准备泵送培养基。在BSC内，从泵送液体分配系统(PLDS)(W3012720)卸下注射器并丢弃。注：确保不损害PLDS移液器的无菌性。
8.1.23准备泵送培养基。通过鲁尔连接件将PLDS移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器尖端放置在“完全CM1第0天培养基”(步骤8.1.13中制备)中以进行抽吸。打开培养基和G-Rex100MCS之间的所有夹子。
8.1.24将完全CM1培养基泵入G-Rex100MCS烧瓶中。将泵速设置为“高”和“9”，然后将所有完全CM1第0天培养基泵入G-Rex100MCS烧瓶。一旦转移完所有培养基，清除管线，停止泵送。
8.1.25从烧瓶上断开泵。确保除通气过滤器外，所有烧瓶上的夹子都已关闭。从红色培养基管线上拆下中继泵流体转运装置，在红色培养基管线上放一个红色盖子(W3012845)。
8.1.26热封。从BSC上取下G-Rex100MCS烧瓶，(按照过程注释5.12)热封终端鲁尔接口附近红色管线上的红色盖子。
8.1.27标记G-Rex100MCS。给G-Rex100MCS烧瓶贴上QA提供的过程中“第0天”标签。给样品贴上以下标签“第0天”。
8.1.28监控培养箱。保温箱参数：温度LED显示屏：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
8.1.29加热培养基。将步骤8.1.17制备的标有“组织碎片”的50mL锥形管和步骤8.1.27制备的G-Rex100MCS放入培养箱中，加热≥30分钟。下面记录加热时间。记录预热时间≥30分钟(是/否)。
[组织碎片锥形管或GRex100MCS]
8.1.30检查8.1节。
8.2第0天，制备肿瘤洗涤培养基
8.2.1将庆大霉素添加至HBSS中。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。记录体积。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素50mg/mL(5.0mL)。
8.2.2盖上HBSS瓶，旋紧。盖上步骤8.2.1制备的含有庆大霉素的HBSS，旋紧瓶子，确保彻底混合试剂。
8.2.3过滤溶液。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)，过滤在步骤8.2.1中制备的含有庆大霉素的HBSS。
8.2.4无菌盖上过滤后的培养基，贴上标签。无菌盖上过滤后的培养基，标记以下信息。进入8.3节。
8.2.5检查8.2节。
8.3第0天，肿瘤处理
8.3.1获得肿瘤。从QAR获得肿瘤样本，立即转移到2℃至8℃套件中进行处理。确保将所有必要信息记录在肿瘤运输批次记录。
8.3.2记录肿瘤信息。
8.3.3贴上肿瘤标签。贴上肿瘤附件。QAR发布标签如下。贴上的肿瘤运输批次记录为#5。
8.3.4将用于肿瘤解剖的必要材料放入BSC。
8.3.5打开材料。打开BSC内部的所有材料，确保不影响材料的无菌性。
8.3.6标记材料。标记3个50mL锥形管：第一个标记为“镊子”，第二个标记为“解剖刀”，第三个标记为“新鲜肿瘤洗涤培养基”。将5×100mm培养皿标记为“洗涤1”、“洗涤2”，“洗涤3”、“保持”和“不良”。将1个6孔板标记为“良好中间碎片”。
8.3.7等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将5.0mL的“肿瘤洗涤培养基”转移至一个6孔板的每个孔中，得到良好的中间肿瘤碎片(总计30.0mL)。注：在进行肿瘤洗涤和解剖过程中，视需要将镊子和解剖刀分别存放在各自的肿瘤洗涤培养基锥形瓶中。
8.3.8等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将50.0mL步骤8.2.4中制备的“肿瘤洗涤培养基”转移至“洗涤1”、“洗涤2”，“洗涤3”和“保持”的每个100mm培养皿中(总共200.0mL)。
8.3.9等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将20.0mL步骤8.2.4中制备的“肿瘤洗涤培养基”转移至每个50mL锥形瓶中(总共60.0mL)。
8.3.10准备盖子用于肿瘤块。从2个6孔板上无菌地取下盖子。将盖子用于所选肿瘤块。注：在整个肿瘤处理过程中，不要跨过开放的组织培养板和盖子。8.3.11将肿瘤转移到BSC中。将肿瘤无菌转移到BSC中。记录处理开始时间。
8.3.12肿瘤洗涤1：使用8”镊子(W3009771)从样本瓶中取出肿瘤，转移至步骤8.3.8准备的“洗涤1”皿中。注：将溶液保留在样本瓶中。
8.3.13肿瘤洗涤1。用镊子轻轻洗涤肿瘤，通过下方计时器使样本放置≥3分钟。记录洗涤时间(某分：某秒)。
8.3.14按照样品计划，准备生物负载样品。根据样品计划，将20.0mL(或可用体积)溶液从肿瘤样本瓶转移至50mL锥形瓶中。
8.3.15贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，将在步骤8.3.14收集的生物负载样品储存在2℃至8℃下，直至提交进行检测。
8.3.16签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.3.17肿瘤洗涤2。使用一套新的镊子，将肿瘤从“洗涤1”皿中取出，转移至8.3.8中准备的“洗涤2”皿中。
8.3.18肿瘤洗涤2。用镊子轻轻搅动≥3分钟以洗涤肿瘤样本，然后静置。记录时间。
8.3.19为所需肿瘤块准备肿瘤洗涤培养基液滴。使用移液管，将步骤8.3.9准备的锥形瓶的4滴单独的肿瘤洗涤培养基滴入上翻盖的6孔板(2个盖)的6个圆圈中的每个圆圈中。将一个额外的液滴放置在两个圆圈上，总计50滴。
8.3.20肿瘤洗涤3。使用镊子，将肿瘤从“洗涤2”皿中取出，转移至步骤8.3.8准备的“洗涤3”皿中。
8.3.21肿瘤洗涤3。用镊子轻轻搅动洗涤肿瘤样本，静置≥3分钟。记录时间。
8.3.22准备肿瘤解剖皿。将尺子放在150mm培养皿盖下方。
8.3.23将肿瘤转移到解剖皿中。使用镊子，将肿瘤样本无菌转移至150mm解剖皿盖上。
8.3.24测量肿瘤。首尾相连排列所有肿瘤样品，记录大概的总长度和碎片数。给每个肿瘤样本拍摄清晰图片。
8.3.25评估肿瘤。评估肿瘤坏死/脂肪组织。评估肿瘤坏死组织/脂肪组织。评估是否观察到>30％的整个肿瘤区域是坏死组织和/或脂肪组织；如果是，联系区域管理确保肿瘤大小合适，然后进行步骤8.3.26。评估是否观察到<30％的整个肿瘤区域是坏死组织或脂肪组织；如果是，继续步骤8.3.27，不进行清理解剖。
8.3.26如果适用：清理解剖。如果肿瘤较大并且观察到>30％的组织外部为坏死/脂肪，则使用解剖刀和/或镊子的组合，通过切除坏死/脂肪组织进行“清理解剖”，同时保留肿瘤的内部结构。注：为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。不用解剖刀进行切锯动作。注：将脂肪组织、坏死组织和外来组织放在“不良”培养皿中。
8.3.27解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样品切成均匀的适当尺寸的碎片(最多6个中间碎片)。注：为了维持肿瘤的内部结构，只能使用垂直切割压力。不用解剖刀进行切锯动作。注：确保将未解剖的中间碎片完全浸没在(步骤8.2.4中制备的)“肿瘤洗涤培养基”中。
8.3.28转移中间肿瘤碎片。将步骤8.3.8的每个中间碎片转移到“保持”皿中。
8.3.29解剖肿瘤碎片。一次处理一个中间碎片，将解剖皿中的肿瘤中间碎片切成约3mm×3mm×3mm的小块，以使每块上的出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的量最小。注：为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。不用解剖刀进行切锯动作。
8.3.30选择肿瘤块。选择至多八(8)个无出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的肿瘤块。使用标尺作为参考。继续解剖，直至获得8个良好碎片，或整个中间碎片已被解剖。将每个选定的碎片转移至步骤8.3.19制备的“肿瘤洗涤培养基”的滴液之一中。
8.3.31储存中间碎片以防止干燥。从中间碎片中选择至多八(8)个小块后，将中间碎片的残余物放入步骤8.3.7中制备的“良好中间碎片”6孔板的新的单个孔中。注：将脂肪组织或坏死组织置于(步骤8.3.6制备的)“不良”皿中。
8.3.32重复中间碎片解剖。进行下一个中间碎片，重复步骤8.3.29至步骤8.3.31，直至所有中间碎片都被处理，视需要获得新鲜解剖刀和镊子。
8.3.33确定收集的块的数量。如果所需组织有剩余，则从“良好中间碎片”6孔板中选择另外的良好肿瘤块以填充液滴(最多50块)。记录产生的解剖小块总数。注：在整个解剖过程中，必要时确保用清洗培养基保持肿瘤中间碎片的水分。记录收集的解剖块总数。
8.3.34从培养箱中取出锥形管。从培养箱中取出“组织小块”50mL锥形管。在步骤8.1.29中记录时间。确保锥形管加热≥30分钟。
8.3.35准备锥形管。将50mL锥形管“组织小块”放到BSC中，确保不损害开放处理表面的无菌性。
8.3.36将肿瘤碎片转移到50mL锥形管中。使用移液器、解剖刀、镊子或组合，将选定的50个最佳肿瘤碎片从合适的培养皿盖转移至“组织小块”50mL锥形管。注：如果肿瘤块在转移过程中掉落且所需组织保留，则应添加来自良好肿瘤中间碎片孔的其他小块。记录小块数量。
8.3.37准备BSC用于G-REX100MCS。从BSC取出用于容器接种的所有非必需物品，保留“良好组织”板(如果它们包含多余碎片)。
8.3.38从培养箱中取出含有培养基的G-Rex100MCS。从培养箱中取出含有培养基的G-Rex100MCS。完成步骤8.1.29。
8.3.39将烧瓶放入BSC。无菌通过G-Rex100MCS烧瓶进入BSC。注：转移烧瓶时，不要从容器的盖子或底部握住(容器)。通过握住容器的侧面来转移容器。注：处理G-Rex烧瓶时仅使用IPA WIPES。
8.3.40将肿瘤碎片加到G-Rex100MCS烧瓶中。在BSC中，举起G-Rex100MCS烧瓶盖子，确保内部管线保持无菌状态。旋转装有肿瘤块的锥形管以使肿瘤块悬浮，将内容物快速倒入G-Rex100MCS烧瓶。
8.3.41使肿瘤块均匀分布。确保肿瘤块均匀地分布在烧瓶的膜上。视需要，轻轻地前后摇动烧瓶以均匀分布肿瘤块。
8.3.42记录容器中肿瘤碎片的总数。记录容器的底部膜上的肿瘤碎片的数量和观察漂浮在容器中的肿瘤碎片的数量。注：如果接种的碎片数量不等于步骤8.3.36H收集的数量，联系区域管理，并且在第10.0节中记录。
8.3.43孵育G-Rex烧瓶。在以下参数下孵育G-Rex100MCS：孵育G-Rex烧瓶：温度LED显示屏：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0％±1.5％CO2。
8.3.44计算孵育窗口。进行计算以确定在第11天取出G-Rex100MCS培养箱的适当时间。计算：孵育时间；下限＝孵育时间+252小时；上限＝孵育时间+276小时。
8.3.45环境监测。处理后，验证BSC和人员监控。
8.3.46丢弃材料。将剩余的未加热的培养基储存在2℃至8℃，贴好标签。处理完成后，弃去任何剩余的加热过的培养基和解冻的IL-2的等分试样。
8.3.47提交样品。确保将所有第0天的样品提交计入系统并以LIMS转移。
8.3.48检查8.3节。
8.4第11天-培养基制备
8.4.1检查房间、清洁、管线清除和材料。确认房间消毒、管线清除以及材料在有效期内。
8.4.2预处理表格。设备列表：BSC；天平；Sebra封管机；GatherexTM培养基取出和细胞恢复设备；确保将提供的QA标示放在适当的BSC上；确保提供的QA标示批号和患者ID与批次记录中的批号和患者ID匹配。
8.4.3监控培养箱。监控培养箱。培养箱参数：
温度LED显示屏：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。注：8.4节可与8.5节同时运行。
8.4.4加热培养基。将3x1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3x1000mLAIM-V(W3009501)瓶在培养箱中加热≥30分钟。记录时间。培养基：RPMI 1640和AIM-V。注：将一个另外的1x1000ml的AIM-V培养基(W3009501)瓶放置在室温下，以用于步骤8.5.34。将瓶子标上“仅用于细胞计数稀释”和批次记录批号。
8.4.5环境监测。进行处理前，确保按照SOP-00344进行预处理环境监控。
8.4.6从培养箱中取出RPMI 1640培养基。当到达时间时，取出RPMI 1640培养基。在步骤8.4.4中记录结束孵育时间。确保将培养基加热≥30分钟。
8.4.7制备RPMI 1640培养基。在BSC中，从三个预热的1000mL RPMI 1640培养基瓶中各取100.0mL，放入尺寸合适的标有“废弃物”的容器中。
8.4.8在BSC中，将试剂添加至RPMI 1640培养基瓶。在BSC中，将以下试剂添加至三个RPMI 1640培养基瓶中的每一个中，记录添加至每个瓶中的体积。GemCell人血清，热灭活的AB型(100.0mL)，GlutaMax(10.0mL)，硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)，2-巯基乙醇(1.0mL)。
8.4.9过滤培养基。盖上步骤8.4.8的瓶子，旋转以确保试剂充分混合。通过单独的1L0.22微米过滤器过滤每瓶培养基。
8.4.10给经过滤的培养基贴上标签。无菌地盖上过滤后的培养基，给每个瓶子贴上标签“CM1第11天培养基”。
8.4.11解冻IL-2等分试样。解冻3×1.1mL IL-2的等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰解冻为止。记录IL2批号和有效期。注：确保已贴上IL-2标签。
8.4.12从培养箱中取出AIM-V培养基。从培养箱中取出三瓶AIM-V培养基。记录步骤8.4.4中的结束孵育时间。确保培养基已加热≥30分钟。
8.4.13将IL-2添加到AIM-V中。在BSC中，使用微量移液器，将3.0mL解冻的IL-2加入一个1L瓶的预热AIM-V培养基中。加入IL-2后，用培养基冲洗微量移液器吸头。每个等分试样均使用新的无菌微量移液器吸头。记录添加的总体积。给瓶子贴上标签“含IL-2的AIM-V”。
8.4.14转移材料。无菌转移10L Labtainer袋和中继泵转运装置到BSC中。
8.4.15准备10L Labtainer培养基袋。关闭10L Labtainer袋上的所有管线。通过鲁尔锁连接将中继泵转运装置的较大直径的管端连接到10L Labtainer袋的中间母端口。
8.4.16准备Baxa泵。将Baxa泵安装在BSC旁边。使转运装置管线通过位于BSC外部的Baxa泵。将Baxa泵设置为“高”和“9”。
8.4.17准备10L Labtainer培养基袋。在BSC中，从泵送液体分配系统(PLDS)中取出注射器并丢弃。注：确保不损害PLDS移液器的无菌性。
8.4.18准备10L Labtainer培养基袋。通过鲁尔连接件将PLDS移液管连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液管尖端放入含有IL-2的AIM-V培养基瓶(在步骤8.4.13中制备)中进行抽吸。打开培养基瓶和10L Labtainer之间的所有夹子。
8.4.19将培养基泵入10L Labtainer。在BSC中，使用PLDS，将步骤8.4.13制备好的包含IL-2的预热AIM-V培养基以及另外两个AIM-V瓶转移至10L Labtainer袋中。添加3瓶步骤8.4.10的经过滤的CM1第11天培养基。添加最后一瓶后，清除袋子连接的管线。注：在添加每瓶培养基之间停止泵。
8.4.20取下Labtainer袋的PLDS。从转运装置上取下PLDS，在BSC中管线的鲁尔接口上盖上一个红色的盖子。
8.4.21混合培养基。轻轻揉按袋子以使其混合。
8.4.22给培养基贴上标签。在BSC中，在培养基袋上贴上以下信息。到期日期为制备日期起的24小时。
8.4.23按照样品计划取样培养基。在BSC中，将60mL注射器连接到步骤8.4.22制备的“完全CM2第11天培养基”袋的可用母端口。取出20.0mL培养基，放入50mL锥形管中。在“完全CM2第11天培养基”袋的母端口上放一个红色盖子。
8.4.24贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至提交登录进行检测。
8.4.25签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.4.26密封转运装置管线。在BSC外，靠近红色盖子，热封(按照过程说明5.12)转运装置管线上的红色盖子。将转运装置保留在袋子上。
8.4.27准备细胞计数稀释管。在BSC中，向4个15mL锥形管中添加4.5mL标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。用批号和管编号(1至4)标记管。将4个冻存管标上“饲养细胞”和管编号(1至4)。将管保存在BSC，用于步骤8.5.30。
8.4.28将试剂从BSC转移到2℃至8℃。将所有剩余的2-巯基乙醇、GlutaMax和人血清从BSC转移至2℃至8℃。确保所有试剂均贴有记录批号和按照过程注释5.9的适当有效期。
8.4.29准备1L转运包。在BSC外，将1L转运包连接(按照过程注释5.11)到连接至步骤8.4.22制备的“完全CM2第11天培养基”袋的转运装置上。给转运包标上“饲养细胞CM2培养基”和批号。
8.4.30准备1L转运包。在距离袋子几英寸的1L转运包管线的管线上做一个标记。将空的转运包放在天平上，使管线在天平上达到标记的点。
8.4.31去皮称重。将秤去皮，将空的转运包留在秤上。
8.4.32准备饲养细胞转运包。将Baxa泵设置为“中”和“4”。将步骤8.4.22中制备的500.0±5.0mL的“完全CM2第11天”培养基泵入“细胞CM2培养基”转运包中。称重，记录添加至转运包中的完全CM2培养基的体积。
8.4.33热封管线。一旦填充，按照过程注释5.12热封管线。将带有转运装置的CM2第11天培养基袋与饲养细胞培养基转运包分开，保持连接朝向1L转运包。
8.4.34如果适用：孵育饲养细胞培养基转运包。如果适用，将“完全CM2第11天培养基”放置在培养箱中，直至用于步骤8.6.6。
8.4.35孵育完全CM2第11天培养基。将步骤8.4.22制备的“完全CM2第11天培养基”放入培养箱，直至用于步骤8.7.2。
8.4.36检查8.4节。
8.5第11天-TIL收获
8.5.1预处理表格。监控培养箱。培养箱参数：温度LED显示：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。注：第8.5节可与第8.4节和第8.6节同时运行。
8.5.2从培养箱中取出G-Rex100MCS。从培养箱中取出G-Rex100MCS之前，进行以下检查以确保符合培养参数。下限来自步骤8.3.44B。上限来自步骤8.3.44C。记录从培养箱取出的时间。确定：是否8.3.44B≤从培养箱中取出的时间<步骤8.3.44C？*如果否，联系区域管理。小心地从培养箱中取出G-Rex100MCS，确保除大型过滤器管线外，所有夹子均已关闭。记录处理开始时间。
8.5.3准备300mL转运包。将300mL转运包标记为“TIL悬液”。
8.5.4准备300mL转运包。无菌连接(按照过程注释5.11)重力血液过滤器的TIL悬液转移(单线)。参见例如。
8.5.5准备300mL转运包。将300mL转运包放在天平上，记录干重。
8.5.6准备1L转运包。标记1L转运包为“上清液”和批号。
8.5.7将转运包连接到G-Rex100MCS。(按照过程注释5.11)将来自G-Rex100MCS的红色培养基取出管线无菌连接到“上清液”转运包。将G-Rex100MCS的透明细胞取出管线无菌连接到与“TIL悬液”转运包相连的血液过滤器顶部的两个加标管线(spike line)之一。例如参见。
8.5.8 GatheRex设置。将G-Rex100MCS放置在GatheRex的左侧，将“上清液”和“TIL悬液”转运包放置在GatheRex的右侧。
8.5.9 GatheRex设置。将G Rex100MCS的红色培养基取出管线安装到GatheRex上的顶部夹子(标有红色线)和导管。将G-Rex100MCS的透明收获管线安装到GatheRex上的底部夹子(标有蓝色线)和导管。
8.5.10 GatheRex设置。将来自GatheRex的气体管线连接到G-Rex100MCS烧瓶的无菌过滤器上。注：从G-Rex100MCS烧瓶中取出上清液之前，确保关闭细胞取出管线上的所有夹子。
8.5.11减少G-Rex100MCS体积。将约900mL培养上清液从G-Rex100MCS转移至1L转运包中。目视检查G-Rex100MCS烧瓶，以确保烧瓶处于水平状态且培养基已减少至抽吸汲取管的末端。注：如果Gatherex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。
8.5.12准备烧瓶，收获TIL。在取出上清液之后，关闭至红色管线的所有夹子。
8.5.13开始收获TIL。记录TIL收获的开始时间。
8.5.14开始收获TIL。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。注：如果细胞未分离，联系区域管理。
8.5.15开始收获TIL。将烧瓶向远离收集管倾斜，使肿瘤块沿边缘沉降。向收集管缓慢倾斜烧瓶，使碎片留在烧瓶的另一侧。注：如果细胞收集管不在壁和底部膜的交界处，将烧瓶倾斜45°角度同时敲击烧瓶通常足以使管正确放置。
8.5.16收获TIL。释放通往TIL悬液转运包的所有夹子。
8.5.17收获TIL。使用GatheRex，将细胞悬液通过血液过滤器转移至300mL转运包中。注：保持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基。
8.5.18收获TIL。检查膜上是否有贴壁细胞。
8.5.19冲洗烧瓶膜。冲洗G-Rex100MCS的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。注：如果肿瘤块阻塞收获管线，按下细胞收集管线上的“X”以暂停收集。按下Gatherex上的“释放夹子”按钮，拿起转运包，用逐渐增加的压力轻轻挤压，直至碎片被移除。请勿过分挤压袋子，否则可能会导致管线或袋子破裂。清除障碍物后，继续收集。
8.5.20关闭G-Rex100MCS的夹子。确保所有夹子均已关闭。
8.5.21热封。(按照过程注释5.12)在尽可能靠近连接处将TIL悬液转运包热封，以使总管长度保持大致相同。
8.5.22热封。按照过程注释5.12热封“上清液”转运包。保持足够的线进行连接。
8.5.23计算TIL悬液体积。记录TIL悬液转运包的重量，计算细胞悬液的体积。
8.5.24准备用于取样的上清液转运包。将4英寸血浆转运装置连接(按照过程注释5.11)到“上清液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至BSC中。
8.5.25准备用于取样的TIL悬液转运包。将4英寸血浆转运装置连接(按照过程注释5.11)到300mL“TIL悬液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至BSC中。
8.5.26抽取Bac-T样品。在BSC中，使用适当尺寸的注射器，从1L“上清液”转运包中吸取约20.0mL上清液，然后加到标有“Bac-T”的50mL无菌锥形管中。保存在BSC，用于步骤8.5.27。
8.5.27按照样品计划接种BacT。使用适当尺寸的注射器，从标记有BacT(步骤8.5.26制备)的50mL锥形中取出1.0mL样品，接种厌氧瓶。在瓶子标签上留下的空白处记录瓶子的接种时间。好氧瓶重复以上操作。注：此步骤可不按顺序进行。
8.5.28贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，在室温下保存Bac-T样品，避光，直至根据样品计划提交登录进行检测。注：不要让标签挡住瓶子上的条形码。
8.5.29签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.5.30对样品进行TIL细胞计数。用瓶号(1至4)标记4个冻存管。使用单独的3mL注射器，使用鲁尔连接件从TIL悬液转运包中提取4x1.0mL细胞计数样品，放置在各自的冻存管中。
8.5.31关闭鲁尔接头。在管线上放一个红色盖子(W3012845)。
8.5.32孵育TIL。TIL转运包放置在培养箱中，直至需要。
8.5.33进行细胞计数。使用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。对未稀释的初始细胞进行计数。
8.5.34记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，则“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.5.35确定乘法因数(Multiplication Factor)。总细胞计数样品体积：8.5.34A+8.5.34B。乘法因数C÷8.5.34A。
8.5.36选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.5.37记录文件名、活力和Nucleoview的细胞计数。
8.5.38确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。活力：(8.5.37A+8.5.37B)÷2。活细胞浓度：(8.5.37C+8.5.37D)÷2。
8.5.39确定计数的上限和下限。下限：8.5.38F×0.9。上限：8.5.38F×1.1。
8.5.40两个计数均在可接受范围内吗？下限：8.5.37C+8.5.37D≥8.5.39G。上限：8.5.37C+8.5.37D≤8.5.39H。*如果任一结果为“否”，则在步骤8.5.41至步骤8.5.48进行第二组计数*。
8.5.41如果适用：进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：根据预期细胞浓度调整稀释度。
8.5.42如果适用：记录细胞计数的样品体积。
8.5.43如果适用：确定乘法因数。总细胞计数样品体积：8.5.42A+8.5.42B。乘法因数C÷8.5.42A D
8.5.44如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.5.45如果适用：从Nucleoview记录细胞计数
8.5.46如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。确定平均活细胞浓度。
8.5.47如果适用：确定计数的上限和下限。下限：8.5.46F×0.9。上限：8.5.46F×1.1。
8.5.48如果适用：计数是否在可接受范围内？下限：8.5.45C+8.5.45D≥8.5.47G。上限：8.5.45C+8.5.45D≤8.5.47H。注：如果结果为“否”，进行步骤8.5.49，确定平均值。
8.5.49如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。平均活细胞浓度：(A+B+C+D)÷4＝平均值
8.5.50调整TIL悬液体积。计算取出细胞计数样品后TIL悬液的调整体积。步骤8.5.23C(A)的TIL细胞总体积。取出的细胞计数样品的体积(4.0ml)(B)。调整后的TIL细胞总体积C＝A-B。
8.5.51计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：8.5.38F*或8.5.46F*或*8.5.49E*；总体积：8.5.50；活细胞总数：C＝A×B。*圈出步骤参考用于确定活细胞浓度。注：如果“活TIL细胞总数”少于5×106个细胞，联系“区域管理”，进行步骤8.7.1。如果“活TIL细胞总数”>5×106，进行步骤8.5.52。
8.5.52流式细胞术计算。如果步骤8.5.51C的活TIL细胞总数≥4.0×107，计算获得流式细胞术样品有1.0×107个细胞的体积。*如果细胞数<4.0×107，则N/A表中的其余字段。进行步骤8.7.1。流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：8.5.51的活细胞浓度/1.0×107细胞A。
8.5.53如果适用：从培养箱中取出TIL。从培养箱中取出TIL悬液并记录步骤8.5.32中的最终培养时间。
8.5.54如果适用：根据“样品计划”取出流式细胞术样品。使用适当尺寸的注射器，从TIL悬液转运包中取出用于对样品进行表型分析的计算体积(8.5.52C)，放入50mL锥形管中。
8.5.55如果适用：标记并储存流式细胞术样品。贴上样品计划库存标签，在2℃至8℃下储存流式细胞术样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。
8.5.56签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.5.57如果适用：重新计算活细胞总数和体积流量。计算取出下面的细胞计数样品后的剩余活细胞总数和剩余体积。
Figure BDA0002855613220001511
8.5.58如果适用：计算TIL体积。计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬液体积。
Figure BDA0002855613220001512
8.5.59如果适用：计算要取出的TIL体积，计算要取出的过量TIL体积。
Figure BDA0002855613220001513
8.5.60如果适用：取出过量TIL。在BSC中，使用适当尺寸的注射器，从TIL悬液转运包取出计算体积(步骤8.5.59C)。注：请勿多次使用注射器。如果适用，使用多个注射器。放在适当尺寸的无菌容器中，贴上日期和批号标签。在“TIL悬液”转运包管线上放一个红色盖子。
8.5.61如果适用：将TIL放在培养箱中。将TIL悬液转运包放在培养箱中，直至需要。记录时间。
8.5.62如果适用：计算。计算取出的过量TIL的总数。步骤8.5.51A从步骤8.5.59C取出的TIL体积。计算取出的过量TIL的总数。
Figure BDA0002855613220001514
8.5.63如果适用：计算。计算要添加到步骤8.5.62C的过量TIL细胞中的CS-10培养基的量。冷冻的目标细胞浓度为1.0×108个细胞/mL。
Figure BDA0002855613220001521
8.5.64如果适用：离心过量TIL。离心过量TIL细胞悬液。速度：350×g。时间：10:00分钟。温度：环境。制动：全速(9)。加速：全速(9)。
8.5.65如果适用：观察锥形管。记录观察结果：是否观察到沉淀？上清液是否清澈？*注：如果答案为否，联系区域管理。
8.5.66如果适用：添加CS-10。在BSC中，无菌地吸出上清液。轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余液体中。
8.5.67如果适用：添加CS10。缓慢添加步骤8.5.63C中计算的CS10体积。
8.5.68如果适用：标记小管。用QA提供的标签标记管。贴上样品标签。
8.5.69如果适用：填充小管。将1.0mL细胞悬液等分到适当尺寸的冻存管中。注：过量TIL填充不超过10个小管。
8.5.70如果适用：填充小管。根据SOP-00242，将剩余体积等分到适当尺寸的冻存管中。如果体积≤0.5mL，则将CS10加到小管中，直至体积为0.5mL。
8.5.71如果适用：填充小管。用1.0mL CS10填充一个小管，标记为“空白”。
8.5.72如果适用：记录已填充的小管的数量。记录以下已填充的小管的数量，不包括空白。
8.5.73如果适用：监测环境。处理后，对BSC和人员监控进行验证。
样品的TIL冷冻保存
8.5.74如果适用：计算冷冻保存的体积。计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。
Figure BDA0002855613220001522
8.5.75如果适用：取出样品进行冷冻保存。在BSC中，使用适当尺寸的注射器，从“TIL悬液”转运包中取出计算的体积(步骤8.5.74C)。放入适当尺寸的锥形管中，贴上“冷冻保存样品1×107个细胞”、日期和批号。在TIL悬液转运包上放一个红色盖子(W3012845)。
8.5.76如果适用：将TIL放在培养箱中。将TIL悬液转运包放在培养箱中，直至需要。
8.5.77如果适用：冷冻保存样品。根据以下参数将“冷冻保存样品1×107细胞”离心：速度：350×g，时间：10：00分钟，温度：环境，制动：全速(9)；加速：全速(9)。注：确保离心机的速度和时间设置的单位适当。
8.5.78如果适用：观察锥形管。记录观察结果：是否观察到沉淀？上清液是否清澈？*注：如果答案为否，联系区域管理。
8.5.79如果适用：添加CS-10。在BSC中，无菌地吸出上清液。轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余液体中。
8.5.80如果适用：添加CS-10。缓慢加入0.5mL CS10。记录添加的体积。
8.5.81如果适用：标记小管。用QA签发标签标记小管。
8.5.82如果适用：填充小管。将重悬体积等分到标记的冻存管中。
8.5.83如果适用：填充空白。用0.5mL CS10填充另一个小管，标记为“空白”。
8.5.84如果适用：记录填充的小管的数量，不包括“空白”。冷冻保存样品小管装入约0.5mL。
8.5.85如果适用：环境监测。处理后，确认已进行BSC和人员监控。
8.5.86检查8.5节
8.6第11天-饲养细胞
8.6.1获得饲养细胞。从LN2冷冻机中获得3袋具有至少两个不同批号的饲养细胞。将细胞保存在干冰上，直至准备解冻。注：8.6节可与8.5节同时进行。
8.6.2获得饲养细胞。记录饲养细胞信息。确认获得了至少两个不同批次的饲养细胞。
8.6.3准备水浴或低温浴。准备用于饲养细胞解冻的水浴或低温浴。
8.6.4根据批号将饲养细胞袋放入单个拉链封口袋中，37.0℃±2.0℃水浴或低温浴约3至5分钟来解冻，或直至冰刚刚消失。用计时器记录解冻时间。
8.6.5饲养细胞线束准备。将4S-4M60(按照过程注释5.11)连接到CC2 Cell Connect(W3012820)，在G处，用4S-4M60歧管的4个尖嘴端代替Cell Connect装置(B)的单个尖嘴。将H连接到G。
8.6.6如果适用：从培养箱中取出培养基。从培养箱中取出在步骤8.4.34准备的饲养细胞CM2培养基转运包。
8.6.7附加培养基转运包。将“饲养细胞CM2培养基”转运包(按照过程注释5.11)连接到CC2鲁尔接口上。注：通过无针注射口将袋子连接到线束的侧面。
8.6.8转移线束。将包含完全CM2第11天培养基的组件转移至BSC中。
8.6.9合并解冻的饲养细胞。在BSC内，将10mL的空气吸入100mL注射器中。用它来替换CC2上的60mL注射器。
8.6.10合并解冻的饲养细胞在取下盖子之前，先用酒精棉片擦拭饲养细胞袋上的每个端口。使用CC2的三个尖嘴刺入三个饲养细胞袋。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。
8.6.11合并解冻的饲养细胞。打开旋塞阀，以便打开从饲养细胞袋中取出的管线，关闭通往无针注射口的管线。
8.6.12合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞袋的内容物吸进注射器。立刻排干全部三个袋子。排干饲养细胞袋后，在保持注射器压力的同时，夹住饲养细胞袋上的管线。
8.6.13记录饲养细胞体积。不要将下面的注射器从线束拆掉。记录注射器中饲养细胞的总体积。
8.6.14将饲养细胞添加至转运包。转动旋塞阀，以关闭通往饲养细胞袋的管线，打开通往培养基转运包的管线。确保未松开到培养基转运包的管线。
8.6.15将注射器中的饲养细胞加到“饲养细胞CM2培养基”转运包中。夹住包含饲养细胞的转运包的管线，将注射器留在线束上。
8.6.16混合合并的饲养细胞。揉按袋子以混合转运包中合并的饲养细胞。
8.6.17标记转运包。将袋子标为“饲养细胞悬液”。
8.6.18计算转运包中的总体积，计算饲养细胞悬液的总体积。
8.6.19取出细胞计数样品。对每个样品使用单独的3mL注射器，使用无针注射口从饲养细胞悬液转运包中提取4×1.0mL细胞计数样品。将每个样品等分到步骤8.4.27标记的冻存管中。注：在每次细胞计数取样之间，用无菌酒精棉片(W3009488)擦拭不需要的注射端口，混合饲养细胞悬液。
8.6.20进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。通过将0.5mL细胞悬液添加至标有批号和“用于细胞计数稀释”的4.5mL AIM-V培养基中，稀释细胞计数样品。这将产生1:10的稀释度。必要时进行调整。
8.6.21记录细胞计数的样品体积。
8.6.22确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001551
8.6.23选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。
8.6.24记录文件名、活力和Nucleoview的细胞计数。
8.6.25确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.6.24A+8.6.24B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.6.24C+8.6.24D)÷2 F.个细胞/mL
8.6.26确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.6.25F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.6.25F×1.1 H.个细胞/mL
8.6.27两个计数均在可接受范围内吗？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.6.24C+8.6.24D≥8.6.26G
上限 8.6.24C+8.6.24D≤8.6.26H
注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.6.28至步骤8.6.35进行第二组计数
8.6.28如果适用：进行细胞计数。按照SOP-00314和过程注释5.14，利用NC-200进行细胞计数和计算。注：稀释可根据预期细胞浓度进行调整。
8.6.29如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.6.30如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001552
Figure BDA0002855613220001561
8.6.31选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.6.32如果适用：从Nucleoview记录细胞计数
8.6.33如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.6.32A+8.6.32B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.6.32C+8.6.32D)÷2 F.个细胞/mL
8.6.34如果适用：确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.6.33F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.6.33F×1.1 H.个细胞/mL
8.6.35如果适用：计数是否在可接受范围内？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.6.32C+8.6.32D≥8.6.34G
上限 8.6.32C+8.6.32D≤8.6.34H
注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.6.36，找到总的平均活细胞浓度，进行计算。
8.6.36如果适用：由进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度。
8.6.37调整饲养细胞悬液的体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的饲养细胞悬液体积。由步骤8.6.18C的总饲养细胞体积减去4.0mL。
8.6.38计算活饲养细胞的总数。
Figure BDA0002855613220001562
如果活细胞总数小于5×109，继续步骤8.6.39。如果活细胞总数≥5×109，则进行步骤8.5.70。
8.6.39如果适用：获得另外的饲养细胞。从LN2冰箱获得另外一袋饲养细胞。将细胞放在干冰上，直至准备解冻。
8.6.40如果适用：获得另外的饲养细胞。记录饲养细胞信息。
8.6.41如果适用：解冻另外的饲养细胞。将第4个饲养细胞袋放入拉链封口袋中，在37.0±2.0℃水浴或Cytotherm中解冻约3-5分钟，或直至冰刚刚消失。记录解冻时间。
8.6.42如果适用：合并另外的饲养细胞。在BSC中，将10mL空气吸入一个新的100mL注射器中。用它来更换线束上的注射器。
8.6.43如果适用：合并另外的饲养细胞，然后用酒精棉片擦拭饲养细胞袋的端口，然后再取下盖子。使用在步骤8.6.7中准备的线束的剩余尖嘴之一刺入饲养细胞袋。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。
8.6.44如果适用：合并另外的饲养细胞。打开旋塞阀，从而打开饲养细胞袋的管线，关闭不需要注射口的管线。
8.6.45如果适用：合并另外的饲养细胞。将饲养细胞袋的内容物吸进注射器。记录体积。
8.6.46如果适用：测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积，记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。
Figure BDA0002855613220001571
8.6.47如果适用：将饲养细胞添加到转运包中。转动旋塞阀，关闭通往饲养细胞袋的管线，打开通往“饲养细胞悬液”转运包的管线。确保未打开转运包的管线。将注射器中的饲养细胞分配到“饲养细胞悬液”转运包中。将管线夹在转运包上，将注射器留在线束上。
8.6.48如果适用：将饲养细胞添加到转运包中。揉按袋子，混合饲养细胞悬液转运包中的合并的饲养细胞。
8.6.49如果适用：制备稀释液。在BSC中，将4.5mL标有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基添加到4个15mL锥形管中。用批号和小管编号(1至4)标记管。给4个冻存管标上“另外的饲养细胞”和小管编号(1至4)。
8.6.50如果适用：准备细胞计数。对每个样品使用单独的3mL注射器，使用不需要的进样口从饲养细胞悬液转运包中取出4×1.0mL细胞计数样品。将每个样品等分到步骤8.6.49中标记的冻存管中。注：用无菌酒精棉片擦拭不需要的注射端口，在每次取样之间混合饲养细胞悬液以进行细胞计数。
8.6.51如果适用：进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。通过将0.5mL细胞悬液添加到4.5mL标有批号和“用于细胞计数稀释”的AIM-V培养基中，稀释细胞计数样品。这将产生1:10的稀释度。必要时进行调整。
8.6.52如果适用：记录细胞计数的样品体积。
8.6.53如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001581
8.6.54如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。
8.6.55如果适用：记录文件名、活力和Nucleoview的细胞计数。
8.6.56如果适用：确定活细胞浓度的平均值和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.6.55A+8.6.55B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.6.55C+8.6.55D)÷2 F.个细胞/mL
8.6.57如果适用：确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.6.56F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.6.56F×1.1 H.个细胞/mL
两者均在可接受范围内吗？注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.5.59至步骤8.5.65进行第二组计数。
8.6.59如果适用：进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：稀释可根据预期细胞浓度进行调整。
8.6.60如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.6.61如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001591
8.6.62如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.6.63如果适用：从Nucleoview记录细胞计数。
8.6.64如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
Figure BDA0002855613220001592
8.6.65如果适用：确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.6.64F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.6.64F×1.1 H.个细胞/mL
8.6.66如果适用：计数是否在可接受范围内？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.6.63C和D≥8.6.65G
上限 8.6.63C和D≤8.6.65H
注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.6.67，找到总的平均活细胞浓度，进行计算。
8.6.67如果适用：由进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度。
8.6.68如果适用：调整饲养细胞悬液的体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的饲养细胞悬液体积。用步骤8.6.46C的总饲养细胞体积减去4.0mL。
8.6.69如果适用：计算活饲养细胞的总数。
Figure BDA0002855613220001601
*圈出用于确定活细胞浓度的参考步骤。
8.6.70计算饲养细胞的体积。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬液的体积。
Figure BDA0002855613220001602
*圈出适用步骤
8.6.71计算过量饲养细胞的体积。计算要取出的过量饲养细胞的体积。向下舍入到最接近的整数。
*圈出适用步骤
Figure BDA0002855613220001603
8.6.72取出过量的饲养细胞。在新的100mL注射器中，吸出10mL空气，将注射器连接到线束上。
8.6.73取出过量的饲养细胞。打开“饲养细胞悬液”转运包的管线。使用注射器吸取步骤8.6.71C计算出的饲养细胞体积，再从转运包中将另外的10.0mL放入100mL注射器中。取出饲养细胞体积后，关闭通往饲养细胞悬液转运包的管线。不要卸下最终注射器。注：注射器装满后，换上新的注射器。可使用多个注射器取出总体积。每个新注射器都吸入10mL空气。
8.6.74记录体积。记录取出的饲养细胞的总体积(包括另外的10mL)。
8.6.75添加OKT3。在BSC中，使用1.0mL注射器和16G针头吸取0.15mL OKT3。
8.6.76添加OKT3。从注射器上无菌地取下针头，将注射器连接到无针注射口上。注入OKT3。
8.6.77添加OKT3。打开旋塞阀进入“饲养细胞悬液”转运包，添加10mL步骤8.6.73取出的饲养细胞以冲洗OKT3。
8.6.78添加OKT3。将注射器上下颠倒并推动空气通过，以清除通往饲养细胞悬液转运包的管线。
8.6.79添加OKT3。将剩余的饲养细胞悬液留在注射器中。关闭所有夹子，然后从BSC上拆下线束。
8.6.80热封。热封(按照过程注释5.12)饲养细胞悬液转运包，留下足够的管线进行连接。丢弃线束。
8.6.81检查8.6节
8.7第11天G-Rex填充和接种
8.7.1设置G-Rex500MCS。在BSC外，从包装中取出G-Rex500MCS，检查烧瓶中是否有任何裂纹或扭结。确保所有鲁尔连接件和密封件都拧紧。关闭除排气过滤器管线之外的所有G-Rex500MCS管线上的夹子。使用记号笔在4.5L刻度处画一条线。
8.7.2从培养箱中取出培养基。从培养箱中取出步骤8.4.35制备“完全CM2第11天培养基”。
8.7.3准备泵送培养基。将G-Rex500MCS的红色管线(按照过程注释5.11)连接到与完全CM2第11天培养基相连的中继泵转运装置上。
8.7.4准备泵送培养基。将“完全CM2第11天培养基”袋挂在输液架上。通过Baxa泵进料泵管。
8.7.5将培养基泵入G-Rex500MCS。将Baxa泵设置为“高”和“9”。将4.5L培养基泵入G-Rex500MCS，填充至步骤8.7.1中标记的烧瓶刻度处。
8.7.6热封。将步骤8.7.3产生的连接附近的G-Rex500MCS红色管线热封(按照过程注释5.12)。
8.7.7给烧瓶贴上标签。在烧瓶上贴上“第11天”标签。给样品贴上过程中的“第11天QC”标签。
8.7.8如果适用：孵育烧瓶。直至用TIL接种时放在培养箱中。
8.7.9连接饲养细胞：将悬液转运包接到烧瓶。将G-Rex500MCS的红色管线无菌连接(按照过程注释5.11)到“饲养细胞悬液”转运包。
8.7.10向G-Rex500MCS添加饲养细胞。打开饲养细胞悬液和G-Rex500MCS之间的所有夹子，通过重力进料将饲养细胞悬液添加至烧瓶中。确保线路已完全清除。
8.7.11热封。热封(按照过程注释5.12)步骤8.7.9创建的连接附近的红色管线。
8.7.12将TIL悬液转运包连接到烧瓶上。将G-Rex500MCS的红色管线无菌连接(按照过程注释5.11)到“TIL悬液”转运包。
8.7.13向G-Rex500MCS添加TIL。打开TIL悬液和G-Rex500MCS之间的所有夹子，通过重力进料将TIL悬液添加至烧瓶中。确保线路已完全清除。
8.7.14热封。热封(按照过程注释5.12)步骤8.7.12创建的连接附近的红色管线，取出TIL悬液袋。
8.7.15孵育G-Rex500MCS。检查是否已关闭G-Rex500MCS上除大型过滤器管线之外的所有夹子，放置在培养箱中。培养箱参数：温度LED显示：37.0℃±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
8.7.16计算孵育窗口。进行计算以确定在第16天从培养箱中取出G-Rex500MCS的正确时间。孵育时间(步骤8.7.15)。下限：培养时间+108小时。上限：孵育时间+132小时。
8.7.17环境监测。处理后，对BSC和人员监控进行验证。
8.7.18提交样品。提交样品登录。
8.7.19检查8.7节。
·8.8第11天，冷冻保存过量的TIL
8.8.1如果适用：冻结过量的TIL瓶。冻结之前，已设置验证CRF。进行冷冻保存。
8.8.2如果适用：启动CRF。记录放入CRF中的瓶的总数(不包括空白)。验证转移到CRF中的样品瓶的数量是否与步骤8.5.72或步骤8.5.84或步骤8.5.72C或步骤8.5.84中准备的样品瓶总数匹配。
8.8.3如果适用：开始冷冻方案的自动部分。记录开始时间，启动冷冻方案的自动部分。
8.8.4如果适用：将小管从控速冷冻机转移到适当的储存容器中。冷冻完成后，将小管从CRF转移至适当的储存容器中。
8.8.5如果适用：将小管转移到适当的储存容器中。记录在LN2中的储存位置。
8.8.6检查8.8节
8.9第16天，制备培养基
8.9.1预热AIM-V培养基。至少在使用前12小时从2℃至8℃取出3个CTS AIMV 10L培养基袋，在室温下避光放置。确认每个袋子均在有效期内。在每个袋子上贴上袋子编号(1至3)、批号、日期和“加热开始时间：某时某分”。记录预热开始时间和日期。
8.9.2计算时间。加热步骤8.9.1的培养基。由步骤8.9.1计算培养基袋1、2和3的加热时间。确保将所有袋子加热12到24小时。
8.9.3检查房间消毒、管线清除和材料。确认房间消毒、管线清除和材料。
8.9.4确保完成预处理表格。
8.9.5环境监测。进行处理前，确保已开始进行预处理环境监控。
8.9.6设置10L Labtainer用于上清液。在BSC中，用鲁尔连接件将流体泵转运装置的较大直径的一端连接到10L Labtainer袋的母端口之一。
8.9.7设置10L Labtainer用于上清液。标为“上清液”和批号。
8.9.8设置10L Labtainer用于上清液。在从BSC上卸下之前，确保所有夹子都已关闭。注：TIL收获(8.10节)期间使用上清液袋，其可与培养基制备同时进行。
8.9.9解冻IL-2。每个CTS AIM V培养基袋解冻5x1.1mL的IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰熔化。记录IL-2批号和有效期。贴上IL-2标签。
8.9.10等分GlutaMax。在BSC中，将100.0mL的Glutamax分装到适当大小的接收容器中。记录添加至每个接收容器的体积。注：按照步骤8.9.10至步骤8.9.28，最初制备一袋AIM-V培养基。步骤8.10.59确定了所需的其他袋子。
8.9.11标记接收容器。将每个接收容器标记为“GlutaMax”。
8.9.12将IL-2添加至GlutaMax。用微量移液器向每个GlutaMax接收器中加入5.0mLIL-2。确保按照操作说明5.18冲洗吸头，针对添加的每毫升使用新的移液器吸头。记录添加至每个Glutamax接收容器的体积。
8.9.13标记接收容器。将每个接收器标记为“GlutaMax+IL-2”和接收容器编号。
8.9.14准备用于制剂的CTS AIM V培养基袋。确保在使用前在室温下加热CTS AIM V10L培养基袋(W3012717)并避光放置12至24小时。在步骤8.9.2记录结束孵育时间。
8.9.15准备用于制剂的CTS AIM V培养基袋。在BSC中，关闭4英寸血浆转运装置上的夹子，然后使用尖嘴端口(spike port)将夹子连接到袋子。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。
8.9.16准备用于制剂的CTS AIM V培养基袋。通过鲁尔接口将中继泵流体转运装置的较大直径端连接到4英寸血浆转运装置。
8.9.17安装Baxa泵。将Baxa泵安装在BSC旁。从BSC取出中继泵流体转运装置的泵管部分，将其安装在中继泵中。
8.9.18准备配制培养基。在BSC中，将注射器从泵送液体分配系统(PLDS)中移除并丢弃。注：确保不损害PLDS移液器的无菌性。
8.9.19准备配制培养基。通过鲁尔连接件将PLDS移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器吸头置于步骤8.9.13中制备的“GlutaMax+IL-2”中，用于抽吸。打开接收器和10L袋之间的所有夹子。
8.9.20将GlutaMax+IL-2泵入袋中。将泵速设为“中”和“3”，将所有“GlutaMax+IL-2”泵入10L CTS AIM V培养基袋中。一旦无溶液残留，清理管线并停止泵。记录添加至下面每个Aim V袋中的含IL-2的GlutaMax的体积。
8.9.21移除PLDS。确保关闭所有夹子，从中继泵流体转运装置上卸下PLDS移液器。卸下中继泵流体转运装置，盖上4英寸血浆转运装置的红色盖子。
8.9.22标记袋子。标记每个制备好的“完全CM4第16天培养基”袋。
8.9.23按照样品计划，取出培养基保留。使用30mL注射器，通过将注射器连接到4英寸血浆转运装置上，取出20.0mL的“完全CM4第16天培养基”，然后将样品加到50mL锥形管中。注：仅从准备好的第一袋培养基中取出培养基保留样品。注：取出注射器后，确保将4英寸血浆转运装置夹紧或盖上红色盖子。
8.9.24连接新的中继泵流体转运装置。将新的流体泵转运装置的较大直径的一端连接到“完全CM4第16天培养基”袋的4英寸血浆转运装置上。
8.9.25贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至根据样品计划提交登录进行检测。
8.9.26签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.9.27监控培养箱。如果适用，监控步骤8.9.10准备的其他袋子。培养箱参数：温度LED显示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
8.9.28加热完全CM4第16天培养基。在培养箱中将第一袋完全CM4第16天培养基加热≥30分钟，直至可使用。如果适用，按照步骤8.10.59加热其他袋子。
8.9.29制备稀释液。在BSC中，向每个4x15mL锥形管中加入4.5mL标记有“用于细胞计数稀释”的AIM-V培养基。用批号和管编号(1至4)标记锥形管。用管编号(1至4)标记4个冻存管。在BSC下保存管，用于步骤8.10.31。
8.9.30检查8.9节
8.10第16天，REP分装
8.10.1预处理表格。
8.10.2监控培养箱。培养箱参数：温度LED显示屏：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
8.10.3从培养箱中取出G-Rex500MCS。在从培养箱中取出G-Rex500MCS之前，进行以下检查以确保符合培养参数。
Figure BDA0002855613220001651
从培养箱中取出G-Rex500MCS。
8.10.4设置1L转运包。按照过程注释5.12，热封1L转运包(W3006645)，留下约12英寸管线。
8.10.5准备1L转运包。将1L转运包标为“TIL悬液”。
8.10.6称重1L转运包，将包括整个管线在内的1L转运包放在秤上，记录干重。
8.10.7 GatheRex设置。将G-Rex500MCS的红色培养基取出管线无菌连接到步骤8.9.8准备的10L Labtainer袋“上清液”上的中继泵转运装置上。将G-Rex500MCS的透明细胞取出管线无菌连接到步骤8.10.5准备的TIL悬液转运包上。
8.10.8 GatheRex设置。将G-Rex500MCS烧瓶放在GatheRex的左侧。将上清液实验室容器袋和TIL悬液转运包放在右侧。
8.10.9 GatheRex设置。从G-Rex500MCS到顶部夹子(标有红色线)安装了红色培养基取出管线，GatheRex上安装了导管。从G-Rex500MCS到底部夹子(标有蓝色线)安装了透明收获管线，在GatheRex上安装了导管。
8.10.10 GatheRex设置。将GatheRex的气体管线连接到G-Rex500 MCS的无菌过滤器上。注：从G-Rex500MCS取出上清液之前，确保已关闭细胞取出管线上的所有夹子。
8.10.11减少G-Rex500MCS体积。按照SOP-01777，将约4.5L培养上清液从G-Rex500MCS转移至10L Labtainer。目视检查G-Rex500MCS，确保将烧瓶的液位和培养基减小至吸管的末端。注：如果GatheRex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。
8.10.12准备烧瓶用于TIL收获。取出上清液后，关闭至红色管线的所有夹子。
8.10.13开始TIL收获。记录TIL收获的开始时间。
8.10.14开始TIL收获。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。注：如果细胞未分离，联系区域管理。
8.10.15开始TIL收获。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。注：如果细胞收集吸管不在壁和底部膜的交界处，则以450度倾斜的角度敲击烧瓶通常足以正确放置吸管。
8.10.16收获TIL。松开通往TIL悬液转运包的所有夹子。
8.10.17收获TIL。使用GatheRex将细胞悬液转移至TIL悬液转运包中。注：确保保持倾斜的边缘，直至收集完所有细胞和培养基。
8.10.18收获TIL。检查膜的贴壁细胞。
8.10.19冲洗烧瓶膜。冲洗G-Rex500MCS的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。
8.10.20关闭G-Rex500MCS上的夹子。确保关闭G-Rex500MCS上的所有夹子。
8.10.21热封。(按照过程注释5.12)将包含TIL的转运包热封到尽可能靠近连接处的位置，以使总管长度保持大致相同。
8.10.22热封。(按照过程注释5.12)热封含有上清液的10L Labtainer，放入BSC用于进行步骤8.10.25的样品收集。
8.10.23计算TIL悬液体积。记录具有细胞悬液的转运包的重量，计算体积悬液。
8.10.24准备好的转运包用于样品取出。按照过程注释5.11，将4英寸血浆转运装置连接到步骤8.10.21的TIL悬液转运包，使母鲁尔接口端尽可能靠近袋子。
8.10.25从细胞上清液中取出检测样品。在BSC中，使用母鲁尔端口和适当尺寸的注射器从10L实验室容器中取出10.0mL上清液。放入15mL锥形管中，标记为“BacT”，在步骤8.10.28保留该管用于BacT样品。
8.10.26从细胞上清液中取出检测样品。使用另一个注射器，取出10.0mL上清液，放入15mL锥形管中。保留用于支原体样品的试管，用于步骤8.10.32。试管标记为“支原体稀释液”。
8.10.27封闭上清液袋。在鲁尔端口上放一个红色盖子，以关闭袋子，从BSC中送出。
8.10.28无菌性和BacT检测取样。在BSC中，使用适当尺寸的注射器从步骤8.10.25制备的标记了BacT的15mL锥形瓶中取出1.0mL样品，接种厌氧瓶。对有氧瓶重复上述步骤。注：此步骤可不按顺序进行。
8.10.29标记并储存样品。用样品计划库存标签标记样品，在室温下保存BacT样品，避光，直至根据样品计划提交登录进行检测。注：不要让标签挡住瓶子上的条形码。
8.10.30签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.10.31取出细胞计数样品。在BSC中，对每个样品使用单独的3mL注射器，使用鲁尔连接件从“TIL悬液”转运包中取出4x1.0mL细胞计数样品。将样品置于步骤8.9.29制备的冻存管中。
8.10.32取出支原体样品。使用3mL注射器，从TIL悬液转运包中取出1.0mL，放入上面制备的15mL锥形标签“支原体稀释液”中。
8.10.33标记并储存样品。在2℃至8℃下标记并储存支原体样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。
8.10.34签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.10.35准备用于接种的转运包。在BSC中，将中继泵流体转运装置的大直径管线末端连接到包含TIL的转运包上的鲁尔接口适配器。使用止血钳将管线夹在转运包附近。在转运装置的末端放一个红色盖子。
8.10.36将TIL放在培养箱中。从BSC中取出细胞悬液，放入培养箱中直至需要。记录时间。
8.10.37进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。最初通过将0.5mL细胞悬液加入步骤8.9.29制备的4.5mL AIM-V培养基中来稀释细胞计数样品。得到1:10的稀释度。
8.10.38记录细胞计数的样品体积。
8.10.39确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001681
8.10.40选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。
8.10.41记录文件名、活力和Nucleoview的细胞计数。
8.10.42确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.10.41A+8.10.41B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.10.41C+8.10.41D)÷2 F.个细胞/mL
8.10.43确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.10.42F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.10.42F×1.1 H.个细胞/mL
8.10.44两个计数均在可接受范围内吗？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.10.41C和D≥8.10.43G
上限 8.10.41C和D≤8.10.43H
8.10.45如果适用：进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。
8.10.46如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.10.47如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001682
Figure BDA0002855613220001691
8.10.48如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.10.49如果适用：从Nucleoview记录细胞计数。
8.10.50如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.10.49A+8.10.49B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.10.49C+8.10.49D)÷2 F.个细胞/mL
8.10.51如果适用：确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.10.50F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.10.50F×1.1 H.个细胞/mL
8.10.52如果适用：计数是否在可接受范围内？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.10.49C和D≥8.10.51G
上限 8.10.49C和D≤8.10.51H
注：如果任一结果为“否”，进行步骤8.10.53，确定所收集的所有细胞计数的平均值。
8.10.53如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。
8.10.54调整TIL悬液体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的TIL悬液的体积。用步骤8.10.23C的TIL细胞总体积减去用于检测的5.0mL取出体积。
8.10.55计算活TIL细胞总数。
Figure BDA0002855613220001692
8.10.56计算用于传代培养的烧瓶。计算要接种的烧瓶总数。注：将要接种的G-Rex500MCS烧瓶的数量向上舍入，得到接近的整数。
Figure BDA0002855613220001701
注：要接种的G-Rex500MCS烧瓶的最大数量为5个。如果计算得出的要接种的烧瓶数量超过5个，则使用所有可用的细胞悬液仅接种5个。
8.10.57计算用于传代的烧瓶数量
Figure BDA0002855613220001702
8.10.58 QA检查步骤8.10.38至步骤8.10.57中的细胞计数计算。
8.10.59确定所需的其他培养基袋的数量。除步骤8.9.28准备的袋子之外，计算还需要的培养基袋子数量。
Figure BDA0002855613220001703
*将所需培养基袋数量向上舍入为最接近的整数。
8.10.60如果适用：准备其他培养基。对于步骤8.10.59D计算出的需要的每两个G-Rex-500M烧瓶，准备一个10L袋子的“CM4第16天培养基”。进行步骤8.10.62，在准备和加热另外的培养基的同时，对第一个G-REX-500M烧瓶进行接种。
8.10.61如果适用：准备另外的培养基袋。准备并加热步骤8.10.59D确定的另外的培养基袋的计算数量，重复步骤8.9.10至步骤8.9.28。
8.10.62填充G-Rex500MCS。在台式机上打开G-Rex500MCS，检查了容器中是否有裂纹或管子是否扭结。确保所有鲁尔连接件和密封件都拧紧。用记号笔在烧瓶外部的4500mL线上标记。关闭G-Rex500MCS上所有大型过滤器线夹之外的所有线夹。
8.10.63填充G-Rex500MCS。将G-Rex500MCS的红色培养基管线无菌连接(按照过程注释5.11)到步骤8.9.28准备的培养基袋上的流体转运装置上。
8.10.64准备泵送培养基。将“CM4第16天培养基”挂在输液杆上。通过Baxa泵喂入泵管。
8.10.65将培养基泵送到G-Rex500MCS中。将Baxa泵设置为“高”和“9”，然后将4500mL的培养基泵入烧瓶。将4.5L的“CM4第16天培养基”泵入G-Rex500MCS，填充至上述烧瓶的线标记处。一旦转移了4.5L的培养基，停止泵。
8.10.66热封。将G-Rex500MCS的红色培养基管线热封(按照过程注释5.12)在步骤8.10.63产生的连接附近，取下培养基袋。
8.10.67重复填充。加热培养基并准备使用时，对步骤8.10.56C计算的每个烧瓶重复步骤8.10.62至步骤8.10.66。注：使用重力填充以上泵可以同时填充多个烧瓶。注：每袋培养基只能装满两个烧瓶。
8.10.68记录并标记装满的烧瓶。每个烧瓶装满后，用字母和QA提供的过程中“第16天”标签对每个烧瓶进行标记。
8.10.69标记样品。下面给样品贴上“第16天”标签。
8.10.70如果适用：孵育烧瓶。在等待用TIL接种的同时将烧瓶放在培养箱中。
8.10.71验证填充的烧瓶数量。记录已装瓶的总数。
8.10.72计算要添加的细胞悬液的体积。计算添加至新的G-Rex500MCS烧瓶中的TIL悬液的目标体积。
Figure BDA0002855613220001711
8.10.56 C如果烧瓶的数量超过5个，则使用细胞悬液的整个体积仅接种5个。
8.10.73准备用于接种的烧瓶。从培养箱的步骤8.10.70中取出G-Rex500MCS。
8.10.74准备泵送。关闭G-Rex500MCS上除了大型过滤器管线之外的所有夹子。通过Baxa泵喂入泵管。
8.10.75从培养箱中取出TIL。从培养箱中取出“TIL悬液”转运包，在步骤8.10.36记录培养结束时间。
8.10.76准备用于接种的细胞悬液。将步骤8.10.75的“TIL悬液”转运包无菌(按照过程注释5.11)连接到泵入口管线。
8.10.77去皮称重。将TIL悬液袋放在秤上。使用设置为“低”和“2”的Baxa泵，填装从TIL悬液袋至连接处的管线。放磅秤。
8.10.78用TIL悬液接种烧瓶。将Baxa泵设为“中”和“5”。将步骤8.10.72C计算出的TIL悬液的体积泵入烧瓶中。记录添加至每个烧瓶中的TIL悬液的体积。
8.10.79热封。(按照过程注释5.12)热封“TIL悬液”转运包，留下足够的管子以连接在下一个烧瓶上。使用管线汽提器，将G-Rex烧瓶管线中残留的TIL悬液清除到容器中。
8.10.80填充剩余的烧瓶。在接种的每个烧瓶之间，确保混合“TIL悬液”转运包，重复步骤8.10.76至步骤8.10.79，以接种所有剩余烧瓶。以字母顺序填充烧瓶。
8.10.81监控培养箱。注：如果必须在两个培养箱之间分装培养瓶，确保同时监控两个培养箱。培养箱参数：温度LED显示：37.0℃±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
8.10.82孵育烧瓶。记录每个烧瓶放在培养箱中的时间。
8.10.83计算孵育窗口。进行以下计算，以确定在第22天从培养箱中取出G-Rex500MCS的时间范围。
Figure BDA0002855613220001721
8.10.84环境监测。处理后，对BSC和人员监控进行验证。
8.10.85提交样品。确保第16天所有样品均已提交登录。
8.10.86检查8.10节。
8.11第22天，制备洗涤缓冲液
8.11.1检查房间消毒、管线清除和材料。
8.11.2确保完成预处理表格。
8.11.3环境监测。进行处理前，确保已进行预处理环境监控。
8.11.4准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔连接件将4英寸血浆转运装置连接到10L Labtainer袋中。
8.11.5准备10L Labtainer袋，标上“上清液”、批号和初始/日期。
8.11.6准备10L Labtainer袋。移出BSC之前，关闭所有夹子。注：对于每两个要收获的G-Rex500MCS烧瓶，准备一个10L Labtainer袋。注：8.12节中使用上清液袋，其可与8.11节同时运行。
8.11.7连接流体转运装置。在BSC外，关闭4S-4M60上的所有夹子。将中继流体转运装置连接(按照过程注释5.11)至4S-4M60的公鲁尔接口端之一。
8.11.8将材料放到BSC中。将Plasmalyte-A和人白蛋白25％放入BSC。将4S-4M60和中继流体转运装置装配件放进BSC。
Figure BDA0002855613220001731
8.11.9将Plasmalyte泵入3000mL袋中。将三袋Plasmalyte-A刺入4S-4M60连接器套件。注：在卸下之前，用酒精棉签(W3009488)擦拭端口盖。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。
8.11.10将Plasmalyte泵入3000mL袋中。通过鲁尔连接件将Origen 3000mL收集袋连接到中继站泵转运装置的较大直径端。
8.11.11将Plasmalyte泵入3000mL袋中。封闭3000mL Origen袋未使用的管线上的夹子。
8.11.12将Plasmalyte泵入3000mL袋中。将Baxa泵安装在BSC旁边。通过位于BSC外部的Baxa泵喂入转运装置管。将泵设置为“高”和“9”。
8.11.13将Plasmalyte泵入3000mL袋中。打开从Plasmalyte-A到3000mL Origen袋的所有夹子。
8.11.14将Plasmalyte泵入3000mL袋中。将所有Plasmalyte-A泵入3000mL源袋中。转移完所有Plasmalyte-A后，停止泵。
8.11.15将Plasmalyte泵入3000mL袋中。视需要，通过倒转泵并操纵袋子的位置，从3000mL Origen袋子中除去空气。
8.11.16将Plasmalyte泵入3000mL袋中。关闭所有夹子。通过鲁尔连接件从中继泵流体转运装置中取出3000mL袋子，在通往袋子的管线上放一个红色盖子(W3012845)。
8.11.17向3000mL袋中添加25％人白蛋白。打开排气迷你尖嘴。在不影响尖嘴无菌性的情况下，确保牢固地固定蓝色盖子。
8.11.18向3000mL袋中添加25％人白蛋白。用排气的迷你尖嘴刺入25％人白蛋白瓶的隔垫。注：确保不损害尖嘴的无菌性。
8.11.19向3000mL袋中添加25％人白蛋白。重复步骤8.11.17至步骤8.11.18两次，共三(3)个加标25％的人白蛋白瓶。
8.11.20向3000mL袋中添加25％人白蛋白。从一个排气的迷你尖嘴上取下蓝色盖子，将60mL注射器连接到25％人血清白蛋白瓶上。
8.11.21向3000mL袋中添加25％人白蛋白。吸取60mL 25％的人血清白蛋白。注：可能需要使用一瓶以上25％的人血清白蛋白。视需要，将注射器从排气迷你尖嘴断开，将其连接到25％人血清白蛋白瓶中的下一个排气迷你尖嘴上。请勿从25％人血清白蛋白瓶中取出排气迷你尖嘴。
8.11.22向3000mL袋中添加25％人白蛋白。一旦获得60mL，从排气的迷你尖嘴中取出注射器。
8.11.23向3000mL袋中添加25％人白蛋白。在步骤8.11.16中，将注射器连接到装有Plasmalyte-A的3000mL Origen袋的无针进样口上。加入所有人白蛋白25％。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。
8.11.24向3000mL袋中添加25％人白蛋白。重复步骤8.11.20至步骤8.11.23，获得最终体积为120.0mL的人白蛋白25％。
8.11.25混合袋子。加入所有25％的人白蛋白后，轻轻混合袋子。
8.11.26标记袋子。标记为“LOVO洗涤缓冲液”和批号，标明24小时到期。
8.11.27制备IL-2稀释液。使用10mL注射器，通过LOVO洗涤缓冲液袋上的无针进样取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液加到50mL锥形管中，标记为“IL-2稀释液”和批号。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。
8.11.28等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，从无针进样口中吸出70.0mL LOVO洗涤缓冲液。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。
8.11.29等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。在注射器上盖上红色盖子，贴上“空白冻存袋”和批号的标签。注：保持注射器在室温下，直至在步骤8.14.3中需要。
8.11.30完成洗涤缓冲液的制备。关闭LOVO洗涤缓冲液袋上的所有夹子。
8.11.31解冻IL-2。解冻1个1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰解冻为止。记录IL-2批号和有效期。注：确保贴有IL-2标签。
8.11.32制备IL-2。向标有“IL-2稀释液”的50mL锥形管中加入50μL IL-2储备溶液(6×106IU/mL)。
8.11.33制备IL-2。将锥形管重新标记为“IL-2 6x104”、日期、批号和有效期24小时。盖上盖子，保存在2℃至8℃下。
8.11.34冷冻保存制剂。将5个冻存盒放在2℃至8℃进行预处理，以进行最终产品的冷冻保存。
8.11.35制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个单独的15mL锥形管中添加4.5mL的AIM-V培养基(已标记批号和“用于细胞计数稀释”)，用记录批号和管编号(1至4)标记管。放在一边，在步骤8.12.34中使用。
8.11.36准备细胞计数。用瓶编号(1至4)标记4个冻存管。在BSC下保存管，在步骤8.12.33中使用。
8.11.37检查8.11节
8.12第22天，TIL收获
8.12.1监控培养箱。培养箱参数温度LED显示屏：37℃±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。注：8.12节可与8.11节同时运行。
8.12.2从培养箱中取出G-Rex500MCS烧瓶。从培养箱中取出G-Rex500MCS之前，进行以下检查以确保符合培养参数。
Figure BDA0002855613220001751
注：必须从培养箱中取出每个烧瓶后进行此步骤。
8.12.3准备TIL收集袋。将3000mL收集袋标记为“TIL悬液”、批号和初始/日期。
8.12.4密封额外的连接。按照过程注释5.12，在收集袋的每个连接末端附近将两个鲁尔连接件热封。
8.12.5 GatheRex设置。将红色培养基取出管线从G-Rex500MCS无菌连接(按照过程注释5.11)至步骤8.11.5准备的10L Labtainer袋。注：有关使用多个GatheRex设备，参考过程注释5.16。
8.12.6 GatheRex设置。将G-Rex500MCS的透明细胞取出管线无菌连接至步骤8.12.3准备的TIL悬液收集袋(按照过程注释5.11)。注：有关使用多个GatheRex设备，参考过程注释5.16。
8.12.7 GatheRex设置。将G-Rex500MCS烧瓶放在GatheRex的左侧。将上清液Labtainer袋和合并的TIL悬液收集袋放在右侧。
8.12.8 GatheRex设置。将G-Rex500MCS的红色培养基取出管线安装到GatheRex的顶部夹子(标有红色线)和导管。将G-Rex500MCS的透明收获线安装到GatheRex的底部夹子(标有蓝色线)和导管。
8.12.9 GatheRex设置。将GatheRex的气体管线连接到G-Rex500MCS的无菌过滤器。从G-Rex500MCS去除上清液之前，确保关闭细胞取出管线上的所有夹子。
8.12.10减小体积。将约4.5L的上清液从G-Rex500MCS转移至上清液袋中。目视检查G-Rex500MCS以确保烧瓶处于水平状态，培养基已减少至抽吸汲取管的末端。视需要，重复步骤。注：如果GatheRex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。
8.12.11准备用于TIL收获的烧瓶。取出上清液后，关闭至红色管线的所有夹子。
8.12.12开始收集TIL。记录TIL收获的开始时间。
8.12.13开始收集TIL。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。将“TIL悬液”3000mL收集袋放在平坦表面的干抹布上。注：如果细胞未分离，联系区域管理。
8.12.14开始收集TIL。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。注：如果细胞收集软管不在壁膜和底部膜的连接处，则将烧瓶以45°角倾斜时敲击烧瓶通常足以正确放置软管。
8.12.15收获TIL松开通往TIL悬液收集袋的所有夹子。
8.12.16收获TIL。使用GatheRex，将TIL悬液转移至3000mL收集袋中。注：保持边缘倾斜直至收集所有细胞和培养基。
8.12.17收获TIL。检查膜上是否有贴壁细胞。
8.12.18冲洗烧瓶膜。冲洗G-Rex500MCS的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。
8.12.19关闭G-Rex500MCS上的夹子。确保所有夹子都已关闭。
8.12.20热封。将装有TIL的收集袋热封(按照过程注释5.12)尽可能靠近连接的位置，以使总管长度保持大致相同。
8.12.21热封。热封(按照过程注释5.12)上清液袋。
8.12.22完成剩余G-Rex 500MCS烧瓶的收获。重复步骤8.12.2和步骤8.12.5至步骤8.12.21，将所有TIL合并到同一收集袋中。注：每第二个烧瓶后必须更换10L上清液袋。注：有关使用多个GatheRex设备，参考过程注释5.16。
8.12.23准备LOVO源袋。获得一个新的3000mL收集袋。标记为“LOVO源袋”、批号和初始/日期。
8.12.24准备LOVO源袋。热封(按照过程注释5.12)“LOVO袋”的管线，取下母鲁尔接头，留下足够的线进行连接。
8.12.25称重LOVO源袋。在秤和皮重上放置适当大小的塑料箱。将LOVO源袋(包括端口和管线)放入垃圾箱，记录干重。
8.12.26将细胞悬液转移到LOVO源袋中。关闭170μm重力血液过滤器的所有夹子。
8.12.27将细胞悬液转移到LOVO源袋中。将重力血液过滤器的长末端无菌连接(按照过程注释5.11)到LOVO源袋上。
8.12.28将细胞悬液转移到LOVO源袋中。将过滤器的两根来源管线之一无菌连接(按照过程注释5.11)到“合并的TIL悬液”收集袋中。
8.12.29将细胞悬液转移到LOVO源袋中。连接完成后，将过滤器上未使用的管线加热封(按照过程注释5.12)以将其移除。
8.12.30将转移细胞悬液装入LOVO源袋中。打开所有必要的夹子，将收集袋悬挂在IV杆上，以提升TIL悬液，以启动TIL的重力流转移，使其通过血液过滤器进入LOVO源袋。排水时轻轻旋转或揉捏TIL悬吊袋，以保持TIL均匀悬吊。注：不要将LOVO源袋悬挂在过滤设备上。将LOVO源袋放在平坦的干抹布上。
8.12.31关闭所有夹子。将所有TIL转移到LOVO源袋后，关闭所有夹子。
8.12.32热封。尽可能靠近连接加热封(根据过程注释5.12)以去除重力血液过滤器
8.12.33取出细胞计数样品。在BSC中，对每个样品使用单独的3mL注射器，使用无针注射口从LOVO源袋中取出4x1.0mL细胞计数样品。将样品放在步骤8.11.36中准备的冻存管中。注：用酒精棉片擦拭不需要的进样口，混合每个样品之间的LOVO源袋。
8.12.34进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。最初通过将0.5mL细胞悬液加入步骤8.11.35制备的4.5mL AIM-V培养基中来稀释细胞计数样品。得到1:10的稀释度。
8.12.35记录细胞计数的样品体积。
8.12.36确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001781
8.12.37选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.12.38从Nucleoview记录细胞计数。
8.12.39确定进行细胞计数的平均活力，活细胞浓度和有核细胞总浓度。
参数 公式 结果
活力 (8.12.38A+8.12.38B)÷2 G.
活细胞浓度 (8.12.38C+8.12.38D)÷2 H.个细胞
有核细胞总浓度 (8.12.38E+8.12.38F)÷2 I.个细胞
8.12.40确定计数的上限和下限
参数 公式 结果
下限 8.12.39H×0.9 J.个细胞/mL
上限 8.12.39I×1.1 K.个细胞/mL
8.12.41两个计数均在可接受范围内吗？
Figure BDA0002855613220001782
Figure BDA0002855613220001791
注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.12.42至步骤8.12.49进行第二组计数。
8.12.42如果适用：进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。
8.12.43如果适用：记录细胞计数的样品体积
8.12.44如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001792
8.12.45如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.12.46如果适用：从Nucleoview记录细胞计数。
8.12.47如果适用：确定进行细胞计数的平均活力、活细胞浓度和有核细胞总浓度。
参数 公式 结果
活力 (8.12.46A+8.12.46B)÷2 G.
活细胞浓度 (8.12.46C+8.12.46D)÷2 H.个细胞/mL
有核细胞总浓度 (8.12.46E+8.12.46F)÷2 I.个细胞/mL
8.12.48如果适用：确定计数的上限和下限
参数 公式 结果
下限 8.12.47H×0.9 J.个细胞/mL
上限 8.12.47H×1.1 K.个细胞/mL
8.12.49如果适用：计数是否在可接受范围内？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.12.46C+8.12.46D≥8.12.48J
上限 8.12.46C+8.12.46D≤8.12.48K
注：如果任一结果为“否”，进行步骤8.12.50以确定平均值。
8.12.50如果适用：用进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度和平均有核细胞总浓度。
8.12.51 QA检查细胞计数。QA人员检查步骤8.12.38至步骤8.12.50中进行的计算。
8.12.52称重LOVO源袋。在去皮天平上放置适当尺寸的塑料箱。将完整LOVO源袋放入箱中，记录重量。计算细胞悬液的体积。
8.12.53计算活TIL细胞总数。
Figure BDA0002855613220001801
*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。
**如果“是”，则继续。如果“否”，联系区域管理。
8.12.54计算有核细胞总数。
Figure BDA0002855613220001802
*圈出用于确定有核细胞总浓度的步骤参考。
8.12.55制备支原体稀释液。在BSC中，通过鲁尔样品端口从一个上清液袋中取出10.0mL，放入15mL锥形瓶中。标记15mL锥形“支原体稀释液”，保存在BSC中以用于步骤8.14.69。
8.12.56检查8.12节
8.13 LOVO
8.13.1使用仪器左后方的开关打开LOVO。注：步骤8.13.1至8.13.13可与8.11节至8.12节同时进行。
8.13.2检查秤和压力传感器。
8.13.3确保任一秤上均未悬挂物品，检查每个秤的读数。记录步骤8.13.5中的值。注：如果任一秤的读数超出0+/-2g的范围，校准秤。
8.13.4如果所有秤在未悬挂重量时有公差，则在每个秤(#1至#4)上悬挂1kg重量，检查读数。记录步骤8.13.5中的值。
8.13.5检查秤。记录每个秤的显示值。如果值在范围内，继续处理。如果值不在范围内，进行校准。
8.13.6检查仪器操作方案屏幕的压力传感器读数，记录。压力的可接受范围读数为0+/-10mmHg。如果显示值超出此范围，则按照机器说明储存新大气压设置。
8.13.7重复步骤。如果进行新的电子秤校准或储存新的大气压设置，重复步骤8.13.3至步骤8.13.6。
8.13.8从下拉菜单开始“TIL G-Rex收获”方案。
8.13.9显示溶液1屏幕：读取缓冲液类型为PlasmaLyte。
8.13.10至8.13.16遵循LOVO触摸屏提示。
8.13.17确定最终产品目标体积。注：使用步骤8.12.54C的有核细胞总数(TNC)值和下表，确定最终产物目标体积。记录最终产物体积(mL)。
Figure BDA0002855613220001811
注：如果步骤8.12.53C的TVC>1.5×1011，联系区域管理。
8.13.18至8.13.22遵循LOVO触摸屏提示。
8.13.23装入一次性试剂盒。在装入一次性试剂盒之前，先用酒精抹布擦拭再用不起毛的抹布擦拭压力传感器端口。装入一次性试剂盒。按照屏幕上的指示安装一次性试剂盒。
8.13.24取出滤液袋。装入标准LOVO一次性试剂盒后，触摸“下一步”按钮。显示“集装箱信息和位置”屏幕。从秤上取下滤液袋。
8.13.25确保滤液容器是新的且超出刻度(Off-Scale)。
8.13.26输入滤液容量。将LOVO辅助袋无菌连接到现有过滤袋的公鲁尔接口管线上。确保所有夹子均已打开且流体通道畅通。触摸过滤容器容量输入字段。
显示数字小键盘。输入总的新滤液容量(5,000mL)。触摸按钮以接受输入。注：估计滤液量不应超过5000mL。
8.13.27将滤液容器放在工作台上。注：如果在连接过程中从F夹上拆下了管子，则将其放回夹子中。将新的过滤容器放在工作台上。不要将过滤袋挂在#3秤上。在此过程中，秤#3将为空。
8.13.28跟随过滤容器更换后的LOVO触摸屏提示。
8.13.29确保正确装入试剂盒。将显示“一次性试剂盒干燥检查”覆盖图。检查试剂盒是否正确装入，所有夹子均已打开。检查所有管线是否有扭结或其他障碍物，尽可能进行纠正。确保已正确安装试剂盒，检查所有Robert的夹子。按下“是”按钮。所有LOVO机械夹子自动关闭，并显示“检查一次性试剂盒安装”屏幕。LOVO经历了一系列加压步骤以检查试剂盒。
8.13.30试剂盒检查结果。如果工具包检查通过，则继续下一步。*如果否，则在检查完成后可进行第二次试剂盒检查。*如果否，请检查所有管线是否有扭结或其他障碍物，并进行纠正。*如果否，请确保正确安装了确定的是，检查所有罗伯特夹子。如果第二个是检查失败：请联系区域施用人员，并准备在第10.0节中安装新是。重复步骤8.13.23-所需的步骤8.13.30。
8.13.31连接PlasmaLyte。显示“连接溶液”屏幕。洗涤值将始终为3000mL。在屏幕上输入此值。按照过程注释5.11，将3000mL的PlasmaLyte袋无菌连接到穿过夹子1的管线上。将PlasmaLyte袋挂在IV杆上，将两个角袋环都放在钩子上。
8.13.32验证PlasmaLyte已连接。打开所有塑料夹。验证溶液体积条目为3000mL。触摸“下一步”按钮。显示“灌注一次性试剂盒”覆盖。确认已连接PlasmaLyte且通向PlasmaLyte袋的管线上的所有连接和塑料夹都已打开，然后触摸“是”按钮。
8.13.33观察到PlasmaLyte正在移动。一次性试剂盒灌注开始，显示“灌注一次性试剂盒”屏幕。肉眼观察到PlasmaLyte通过连接到PlasmaLyte袋的管子移动。如果没有流体在移动，按下屏幕上的“暂停”按钮，确定是否仍关闭了夹子或连接。解决问题后，请按屏幕上的“继续”按钮以继续使用一次性试剂盒。一次性试剂盒灌注成功完成后，将显示“连接源”屏幕。
8.13.34至8.13.35遵循LOVO触摸屏提示。
8.13.36将来源容器附接到管线上。按照过程注释5.11将步骤8.12.31中准备的LOVO源袋无菌连接到穿过S夹的管线上。可能有必要从夹子上拆下管线。注：如果已拆下，确保将来源管线更换到S夹中。
8.13.37悬挂源容器。将源容器挂在IV杆上，将两个角袋环都放在钩子上。不要将源悬挂在#1秤上。打开所有到源袋的夹子。
8.13.38连接已验证的源容器。触摸下一步按钮。显示灌注源覆盖。确认源已连接到一次性试剂盒且通往源的管线上的所有连接和塑料夹都已打开。触摸“是”按钮。
8.13.39确认PlasmaLyte正在移动。开始源灌注，显示源灌注屏幕。肉眼观察到PlasmaLyte正在通过与源袋相连的管线移动。如果没有流体在移动，按屏幕上的“暂停”按钮，然后确定夹子或连接是否仍关闭。解决问题后，按屏幕上的“继续”按钮以恢复源灌注。
8.13.40启动程序屏幕。当源灌注成功完成后，将显示“启动过程”屏幕。按下开始键，按下开始键后，将立即出现“预洗涤循环1”暂停屏幕。
8.13.41倒置处理袋。从#2磅秤上卸下过程中包装袋(也可以从过程中顶部端口管线导板中移除管线)，将其手动翻转，以允许在一次性试剂盒灌注步骤中添加的洗涤缓冲液覆盖包装袋的所有内表面。重新将处理中的袋子挂在#2的秤上(袋子上的标签朝左)。如果顶管已卸下，则将其更换。
8.13.42倒置源袋。在按下“开始”按钮之前，混合源袋，但不从IV电极上移开，方法是揉按袋角并轻轻搅动细胞，以形成均匀的细胞悬液。按下恢复按钮。LOVO开始处理源袋中的液体，显示洗涤循环1屏幕。
8.13.43源冲洗暂停。一旦排放源容器排空并且LOVO已向洗涤源袋中添加了洗涤缓冲液，就会显示“冲洗源暂停”屏幕。在不从静脉输液架上取下源袋的情况下，揉按角落并充分混合。按下恢复。
8.13.44混合过程中袋子暂停。为使细胞再次准备通过旋转器，用洗涤缓冲液稀释处理袋。在将洗涤缓冲液添加至处理袋中后，LOVO会自动暂停并显示“混合处理袋”暂停屏幕。在不从秤上移开袋子的情况下，通过轻轻挤压袋子将产品充分混合。按下继续。
8.13.45揉按过程中角落暂停。当处理袋为空时，将洗涤缓冲液添加至处理袋的底部以冲洗袋子。添加冲洗液后，LOVO自动暂停并显示“揉按IP角落”暂停屏幕。当显示“揉按IP角落”暂停屏幕时，请勿从秤#2取出袋子。待处理袋仍悬在秤#2上时，揉按袋子角落，使残留的细胞悬浮。确保袋子没有在秤上摆动，按下“继续”按钮。
8.13.46等待“取出产品”屏幕。LOVO过程结束时，将显示“取出产品”屏幕。当显示此屏幕时，可以操纵LOVO套件上的所有行李袋。注：直至显示“取出产品”时，才可以触摸任何袋子。
8.13.47取出滞留物袋。在滞留物袋的端口附近非常靠近管线的位置放置止血钳，以防止细胞悬液沉淀到管线中。在止血钳下方加热封(按照过程注释5.12)，确保保持足够的线数以在步骤8.13.48中进行连接。取出滞留物袋。
8.13.48制备用于制剂的滞留物袋。将4英寸血浆转运装置的母鲁尔锁定端连接(按照过程注释5.11)到滞留物袋上。转移滞留物袋以用于步骤8.14.11。
8.13.49取出产品。按照“取出产品”屏幕上的说明进行操作。关闭LOVO套件上的所有夹子，以防止流体移动。
8.13.50取出产品。触摸下一步按钮。打开所有LOVO机械夹子，显示“拆卸套件”屏幕。
8.13.51记录数据。按照“拆卸工具包”屏幕上的说明进行操作。触摸“下一步”按钮。关闭所有LOVO机械夹子，显示结果概述屏幕。从结果概述屏幕记录数据。关闭所有泵和过滤器支撑。当LOVO提示时，卸下套件。*注：适用时，直接从LOVO结果摘要屏幕以HH：分分：秒秒格式和(HH：分分：秒秒)格式记录所有记录时间。
8.13.52至8.13.54通过LOVO关机选择方案。按照LOVO屏幕提示进行操作。
8.13.55检查8.13节
8.14最终制剂和填充
8.14.1目标体积/袋子计算。从下表DDD中，选择要填充的CS750袋数量、每袋目标填充体积、每袋取出用于保留的体积以及对应于步骤8.13.22中LOVO滞留物体积的每袋最终目标体积。
Figure BDA0002855613220001841
Figure BDA0002855613220001851
8.14.2准备CRF空白。计算CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积以配制空白袋。
Figure BDA0002855613220001852
8.14.3准备CRF空白。在BSC外部，使用步骤8.11.29准备的LOVO洗涤缓冲液注射器，通过鲁尔连接件将步骤8.14.2B计算出的体积添加至空CS750袋中。注：空白的CS750袋子配方无需无菌操作。
8.14.4准备CRF空白。使用适当尺寸的注射器，将在步骤8.14.2中计算出的CS-10体积添加到与步骤8.14.3制备的相同的CS750袋中。在CS750包上放一个红色盖子。
8.14.5准备CRF空白。尽可能从CS-750袋中赶出空气。将CS750袋尽可能热封(按照过程注释5.12)，使其尽可能靠近袋，拆下管线。
8.14.6准备CRF空白。在CS750袋上贴上“CRF空白”、批号和首字母/日期标签。将CRF空白放置在冷袋上，直至将其放入CRF中为止。
8.14.7计算所需IL-2体积。计算添加至最终产品中的IL-2的体积
Figure BDA0002855613220001853
8.14.8组装连接设备。(按照过程注释5.11)将4S-4M60无菌地连接至CC2 CellConnect，在(G)处用4S-4M60歧管的4尖嘴端替换Cell Connect设备(B)的单个尖嘴。
8.14.9组装连接设备。将CS750冻存袋无菌连接(按照过程注释5.11)至步骤8.14.8中准备的线束上，用每个袋替换4个鲁尔接口公端(E)之一。参考步骤8.14.1确定所需的袋子数量。
8.14.10组装连接设备。将CS-10袋(按过程注释5.11)连接到4S-4M60的尖嘴上。将袋子放在2℃至8℃的两个冰袋之间来保存CS-10。
8.14.11将材料放入BSC。
项目 项目#或步骤参考 质量
4”血浆转运装置 1
IL-2(6.0×10<sup>4</sup>)等分试样 8.11.33 1
用适当尺寸注射器添加IL-2 8.14.7F 1
LOVO滞留物袋 8.13.48 1
红色盖子 5
8.14.12用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，从“IL-2 6x104”等分试样中取出步骤8.14.7确定的IL-2量。
8.14.13用IL-2制备TIL。通过鲁尔连接件将注射器连接到步骤8.13.48准备的滞留物袋上，注入IL-2。
8.14.14用IL-2制备TIL。通过将注射器中的空气推入管线来清理管线。
8.14.15标为配制的TIL袋。关闭转运装置上的夹子，将袋子标为“配制的TIL”，然后将其从BSC取出。
8.14.16如果适用：按照样品计划取样。如果步骤8.11.33制备的“IL-2 6×104”等分试样有剩余，则使用适当尺寸的注射器根据样品计划取出约5mL样品滞留物，加到50mL锥形管中。
8.14.17如果适用：按照样品计划取样。贴上样品计划库存标签，储存在2℃至8℃下，直至根据样品计划提交登录进行检测。
8.14.18如果适用：按照样品计划取样。对于取出的样品，确保填写LIMS样品计划表。
8.14.19将配制的TIL袋添加至设备中。添加IL-2后，将步骤8.14.10中“配制的TIL”袋连接(按照过程注释5.11)到设备上剩余的尖嘴上。
8.14.20添加CS10。将已安装配制的TIL、CS-750袋和CS-10的组装好的设备放入BSC。注：CS-10袋和所有CS-750袋都放在两个预先设置为2℃-8℃的冷袋之间。未将配制的TIL袋放在冷袋上。
8.14.21添加CS10。确保关闭所有夹子。转动旋塞阀，以关闭注射器。
8.14.22切换注射器。将约10mL的空气吸入100mL的注射器中，更换设备上的60mL的注射器。
8.14.23添加CS10。旋开旋塞阀，以使通往CS750袋的管线关闭。打开CS-10袋子的夹子，将在步骤8.14.1B中计算的体积拉入注射器。注：将使用多个注射器添加适当体积的CS-10。注：在步骤8.14.26中记录每个注射器的体积。
8.14.24添加CS10。关闭CS-10的夹子，打开配制的TIL袋的夹子，添加CS-10。以约10.0mL/分钟的速度添加第一个10.0mL的CS10。以约1.0mL/秒的速度添加剩余的CS-10。注：使用多个注射器添加适量的CS-10。添加完后，勿重复使用注射器。
8.14.25添加CS10。记录时间。注：从第一次添加CS-10到开始冻结的目标时间是30分钟。
8.14.26添加CS10。记录每次CS10添加的体积和添加的总体积。根据步骤8.14.1B计算的总匹配体积。
8.14.27添加CS10。关闭所有CS10袋子的夹子。
8.14.28准备CS-750袋子。转动旋塞阀，以便打开注射器。打开配方TIL袋的夹子，在悬液到达旋塞阀之前，将悬液停下来。
8.14.29准备CS-750袋。关闭配制的TIL袋的夹子。旋动旋塞阀，使其对CS750最终产品袋开放。
8.14.30准备CS-750袋子。使用新的注射器，通过抽出空气，从CS750最终产品袋中除去尽可能多的空气。在保持注射器柱塞压力的同时，将袋子夹紧。
8.14.31准备CS-750袋子。将约20mL的空气吸入新的100mL注射器中，连接至设备。注：每个CS-750最终产品袋应位于两个冷袋之间，以使配制好的TIL悬液保持低温。
8.14.32分配细胞。转动旋塞阀，以关闭通往最终产品袋的管线。从配制的TIL袋中将上述计算出的体积拉入注射器。注：可使用多个注射器获得正确的体积。
8.14.33分配细胞。转动旋塞阀，以使通往配制的TIL袋的管线关闭。一次使用一个最终产品袋，将细胞加到最终产品袋中。在步骤8.14.35记录到上述每个CS750袋中的细胞体积。
8.14.34分配细胞。用注射器中的空气清除管线，使细胞与尖嘴端口的顶部均匀。关闭装满袋子的夹子。对每个最终产品袋子重复步骤8.14.29至步骤8.14.34，在每个袋子之间轻轻混合配制的TIL袋子。
8.14.35分配细胞。记录在下面每个最终产品包装袋中的TIL的体积。
8.14.36从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。装满最后一个最终产品袋后，关闭所有夹子。
8.14.37从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。将10mL的空气吸入新的100mL注射器中，更换设备上的注射器。
8.14.38从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。一次操作一个袋子，从每个产品袋中抽出所有空气，再加上步骤8.14.1D确定的要保留的产品体积。注：取下样品体积后，将注射器倒转，用空气清理通向产品袋顶部端口的管线。除去保留体积和空气后，将管线夹在袋子上。
8.14.39记录取出的体积。记录从每个袋子中取出的保留体积。
8.14.40添加滞留物。将滞留物加入50mL锥形管中，标记为“保留”和批号。对每个袋子重复步骤8.14.37至步骤8.14.39。
8.14.41制备用于冷冻保存的最终产品。使用止血钳，靠近袋子夹住管线。拆下注射器和注射器所在设备上的红色盖子鲁尔接口。将设备移出BSC。
8.14.42制备用于冷冻保存的最终产品。取出空的滞留物袋和CS-10袋。注：保留设备上的用于注射器的鲁尔连接件。丢弃空的滞留物和CS-10袋。
8.14.43进行目视检查。注：步骤8.14.43至步骤8.14.46可与步骤8.14.47至步骤8.14.68同时进行。
8.14.44给最终产品袋贴上标签。下面附有样品最终产品标签。
8.14.45制备用于冷冻保存的最终产品。将冻存袋放在冰袋上或2℃至8℃下直至冷冻保存。
8.14.46准备外部标签。确保将QA合格的外部标签贴在盒标签上，与相应的最终产品标签匹配。将QA合格的外部标签贴在盒上。以下给样品贴上外部标签：
8.14.47取出细胞计数样品。使用适当尺寸的移液器，取出步骤8.14.38取出的2.0mL滞留物，放入15mL锥形管中以进行细胞计数。
8.14.48进行细胞计数。根据SOP-00314和过程注释5.14，利用NC-200进行细胞计数和计算。注：仅将一个样品稀释至适当的稀释因子以验证稀释是否足够。将其他样品稀释至适当的稀释倍数，然后进行计数。
8.14.49记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，则“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.14.50确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001891
8.14.51选择方案，输入乘法因数。确保已根据“SOP–00314”选择了“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0
8.14.52记录文件名、活力和Nucleoview的细胞计数。
8.14.53确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.14.52A+8.14.52B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.14.52C+8.14.52D)÷2 F.个细胞/mL
8.14.54确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.14.53F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.14.53F×1.1 H.个细胞/mL
8.14.55两个计数均在可接受范围内吗？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.14.52C和D≥8.14.54G
上限 8.14.52C和D≤8.14.54H
注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.14.56至步骤8.14.63中进行第二组计数。
8.14.56如果适用：进行细胞计数。根据SOP-00314和过程注释5.14，使用NC-200时进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。
8.14.57如果适用：记录细胞计数的样品体积。
8.14.58如果适用：确定乘法因数。
Figure BDA0002855613220001901
8.14.59如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
8.14.60如果适用：从Nucleoview记录细胞计数。
8.14.61如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。
参数 公式 结果
活力 (8.14.60A+8.14.60B)÷2 E.％
活细胞浓度 (8.14.60C+8.14.60D)÷2 F.个细胞/mL
8.14.62如果适用：确定计数的上限和下限。
参数 公式 结果
下限 8.14.61F×0.9 G.个细胞/mL
上限 8.14.61F×1.1 H.个细胞/mL
8.14.63如果适用：计数是否在可接受范围内？
参数 公式 结果(是/否)
下限 8.14.60C和D≥8.14.62G
上限 8.14.60C和D≤8.14.62H
注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.14.64，确定平均值。
8.14.64如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。
8.14.65计算流式细胞术样品。进行计算，确保用于流式细胞术取样的细胞浓度足够。
Figure BDA0002855613220001902
*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。**注：如果“否”，则联系区域管理。
8.14.66计算IFN-γ。对样品进行计算，确保用于IFN-γ取样的细胞浓度足够。
Figure BDA0002855613220001911
*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。**注：如果“否”，则联系区域管理。
8.14.67报告结果。完成提交样品表格的填写。
8.14.68热封。一旦确定样品体积，尽可能靠近袋子热封(按照过程注释5.12)最终产物袋，从设备中取出。
8.14.69按照样品计划，贴上标签，收集样品。
Figure BDA0002855613220001912
*注：对于支原体样品，将上方配制的细胞悬液体积添加至步骤8.12.55标记为“支原体稀释液”的15mL锥形管中。
**注：进行步骤8.14.70的Bac-T接种。
8.14.70无菌和BacT。测试采样。在BSC中，使用适当大小的注射器从上面收集的保留的细胞悬液中取出1.0mL样品，接种厌氧瓶。对有氧瓶重复上述步骤。注：储存的Bac-T瓶应在室温下避光保存。
8.14.71贴好标签，储存样品。给所有样品贴上样品计划库存标签，妥善保存直至转移登录。进行下一步以冷冻保存最终产品和样品。注：有关最终产品和样品的冷冻保存，参见8.15节。
8.14.72签名，取样。确保完成LIMS样品计划表，取出样品。
8.14.73样品提交。第22天将所有测试样品提交登录。
8.14.74环境监测。处理后，对BSC和人员监控进行验证。
8.14.75检查8.14节
8.15最终产品冷冻保存
8.15.1准备控速冷冻机。确认已在冻结之前设置CRF。记录CRF设备。进行冷冻保存。
8.15.2设置CRF探针。刺破CRF空白袋上的隔膜。插入6mL样品瓶温度探针。
8.15.3将最终产品和样品置于CRF中。将空白袋放入预处理的盒中，转移至CRF机架的约中间位置。将最终产品盒转移至CRF样品架中，将样品瓶转移至CRF样品瓶架中。
8.15.4将最终产品和样品置于CRF中。将产品架和样品瓶架转移至CRF中。在步骤8.15.5记录产品转移至CRF中的时间和反应室温度。注：将盒和样品瓶架均匀分布在CRF中，在每个架子之间留出尽可能大的空间。
8.15.5确定达到4℃±1.5℃所需的时间并进行CRF运行。箱内温度达到4℃±1.5℃后，开始运行。记录时间。
参数 公式 值
最终产品转移到CRF的时间 (某时某分)
最终产品转移到CRF的温度 从监视器读出 ℃
B.CRF开始时间 (某时某分)
从配制到CRF开始所经过的时间 C＝B–步骤8.14.25A min
8.15.6完成CRF，储存。运行完成后停止CRF。从CRF取出盒子和小管。将盒和小管转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
后处理(Post Processing)概述
·后处理：最终药物产品
ο(第22天)在REP第22天通过流式细胞术测定CD3+细胞
ο(第22天)革兰染色法(GMP)
ο(第22天)通过凝胶凝块LAL测定(Gel Clot LAL Assay)进行细菌内毒素测试(GMP)
ο(第16天)BacT无菌性测定(GMP)
ο(第16天)通过TD-PCR检测支原体DNA(GMP)
ο合格外观属性(步骤8.14.43)
ο(第22天)BacT无菌性测定(GMP)
ο(第22天)IFN-γ测定
实施例2：使用TALE核酸酶对冷冻保存的TIL治疗进行基因编辑
该实施例描述了结合TIL生产过程使用的基因编辑步骤(例如图20所示的过程)。
人TIL电穿孔的优化如下进行。源自黑色素瘤的4至6个pre-REP TIL系将被鉴定为表达>25％PD1。选定的TIL细胞系将被解冻、静息和活化，每次操作1个细胞系。五百万个活化的TIL将与以下对照或测试RNA中的每个一起进行电穿孔：无电穿孔对照(NE)；无RNA对照；绿色荧光蛋白(GFP)mRNA转染对照、CD52 TALEN KO对照、PD1 TALEN、LAG-3TALEN和TIM-3TALEN。将对活细胞进行计数，预留等分试样用于转染效率测量(GFP表达)。经电穿孔的细胞将通过REP扩增。将评估Post-REP TIL的细胞活力和倍数扩增(细胞计数器)和靶基因敲落(流式和qPCR)。目标结果是活力>80％或NE的10％以内；转染率>70％；TIL倍数扩增为NE的30％以内；以及敲除>50％。
TIL生产过程的TALEN介导的PD-1敲除如下进行。使用来自多种组织学的多达6种新鲜肿瘤，可包括黑色素瘤、肉瘤以及乳腺癌和肺癌。研究规模的准备将根据图20和21所示的过程进行。将在每个过程的预定时间点来施加先前实验的电穿孔条件。Post-REP TIL将进行以下评估：细胞活力和倍数扩增(细胞计数器)；细胞表型(流式细胞术)；TCRVβ库(流式)；T细胞效应子功能(再刺激后产生IFN-γ)；以及靶基因敲落(流式和qPCR)。目标结果是：活力>80％或在NE的10％以内；转染率>70％；扩增倍数为NE的30％以内；与过程2A产生的TIL相比，T细胞谱系/亚群维持；TIL效力足够；以及PD-1敲除>50％。在此项研究之后，将进行PD-1敲落的TIL的全规模制备和充分表征。
除PD-1之外，还将进行检测以验证两个另外的靶基因的沉默。
实施例3：TIL中TALEN介导的PD-1的失活
该实施例描述了结合本文所述TIL生产过程的TALEN介导的PD-1的失活(例如图20或图21所示过程)。TIL生产过程可包括预先将OKT-3和/或4-1BB激动剂加入到细胞培养基中，例如如图21的实施方式2所示。可选地，可以在第一次扩增或第二次扩增的第0天或第1天开始添加OKT-3和/或4-1BB激动剂。
可根据Menger等，Cancer Res.，2016年4月15日，76(8)：2087-93；Gautron等，Molecular Therapy：Nucleic Acids 2017，9：312-321或美国专利号9,458,439描述的方法(其各自公开内容通过引用并入本文)进行TALEN的构建和电穿孔。例如，可使用由Daboussi等，Nat Commun 2014，5：3831(其内容通过引用并入本文)所述的固相组装方法来产生靶向PD-1基因的TALEN，或者如Gautron，Molecular Therapy：Nucleic Acids 2017，9：312-321所述，其可购自Trilink Biotechnologies或其他供应商。可采用Gautron等，MolecularTherapy：Nucleic Acids 2017，9：312-321和本文其他地方所述的方法来活化TIL，其中，使用Dynabeads人T-蛋白活化因子CD3/CD28磁珠(购自Invitrogen)，以1：1比率的CD3+磁珠：细胞或人T细胞活化因子CD3/CD28抗体复合物(例如Immunocult CD3/CD28活化因子，购自StemCell Technologies)来活化TIL。电穿孔之前，可使用Agile Pulse BTX系统(HarvardApparatu)，将总共5×106TIL/180μL BTXCytoporation培养基T与约10至20μg的体外转录的TALEN mRNA(mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒；Ambion)混合。可通过本文其他地方所述的pre-REP和REP方法扩增电穿孔的细胞。将评估Post-REP TIL的细胞活力和倍数扩增(细胞计数器)和PD-1敲落(流式和qPCR)。目标结果是活力>80％或在“未电穿孔”(NE)对照的10％以内；转染率>70％；TIL倍数扩增为NE的30％以内；以及PD-1敲除>50％。可使用本领域已知的电穿孔方法，例如美国专利号6,010,613和6,078,490中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
可使用本文所述的方法或如下进行脉冲电穿孔优化。为了确定可转染细胞的电压范围，对TIL进行了第一系列的实验。测试了五个不同的程序：
Figure BDA0002855613220001941
可使用不同电穿孔程序，在含有约20μg的编码GFP的质粒和对照质粒pUC的0.4cm间隙的比色皿(约106个细胞/mL的量级)中，对TIL进行电穿孔。电穿孔后约24小时，通过流式细胞术分析电穿孔细胞中的GFP表达，以确定转染效率。国际专利申请公开号WO 2014/184744和美国专利申请公开号US 2013/0315884 A1(其公开内容通过引用并入本文)先前已报道了TIL中质粒电穿孔所需的最小电压，程序3和程序4各自允许TIL的有效TALEN导入过程。
图23所示的TALEN构建体靶向Pdcd1基因的外显子2(如图所示)，并可用于PD1的失活。
提供以上提出的实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方式的完整公开和描述，并不意图限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。
所有标题和小节名称仅用于清楚和参照目的，并不以任何方式视为限制。例如，本领域技术人员将理解，根据本文所述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和小节的各个方面的有效性。
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地和单独地指出通过引用整体并入用于所有目的。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。这里描述的具体实施方式和实施例仅作为示例提供，并且本申请仅受所附权利要求以及权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司（Iovance Biotherapeutics, Inc.）
<120> 肿瘤浸润淋巴细胞的基因编辑及其在免疫治疗中的用途
<130> 116983-5037
<150> US 62/663,885
<151> 2018-04-27
<150> US 62/680,821
<151> 2018-06-05
<160> 136
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗轻链
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-2 (rhIL-2)
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿地白介素
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-4 (rhIL-4)
<400> 5
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-7 (rhIL-7)
<400> 6
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-15 (rhIL-15)
<400> 7
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-21 (rhIL-21)
<400> 8
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130
<210> 9
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
(智人)
<400> 9
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 10
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
(小家鼠)
<400> 10
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 11
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链
<400> 12
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链可变区
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链可变区
<400> 14
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR1
<400> 15
Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR2
<400> 16
Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR3
<400> 17
Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR1
<400> 18
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR2
<400> 19
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR3
<400> 20
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
<210> 21
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的可变重链
<400> 23
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro
115 120
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的可变轻链
<400> 24
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR1
<400> 25
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR2
<400> 26
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR3
<400> 27
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR1
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR2
<400> 29
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR3
<400> 30
Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Fc结构域
<400> 31
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 32
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 33
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 34
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 35
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 37
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 37
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 38
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 39
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 40
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 40
Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 41
Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 42
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Fc结构域
<400> 42
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
245
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 43
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 44
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 45
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 46
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 47
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BBL可溶性结构域
<400> 47
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
20 25 30
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
35 40 45
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
50 55 60
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
85 90 95
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
100 105 110
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
115 120 125
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本1的可变重链
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本1的可变轻链
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本2的可变重链
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本2的可变轻链
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H39E3-2的可变重链
<400> 52
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr
115 120
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H39E3-2的可变轻链
<400> 53
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105
<210> 54
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人OX40 (智人)
<400> 54
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 55
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠OX40 (小家鼠)
<400> 55
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 56
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链可变区
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链可变区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR1
<400> 60
Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR2
<400> 61
Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His
1 5 10
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR3
<400> 62
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR1
<400> 63
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR2
<400> 64
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR3
<400> 65
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
1 5
<210> 66
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链可变区
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链可变区
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR1
<400> 70
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR2
<400> 71
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR3
<400> 72
Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR1
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR2
<400> 74
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR3
<400> 75
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 76
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 77
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链
<400> 77
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链可变区
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链可变区
<400> 79
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR1
<400> 80
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR2
<400> 81
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR3
<400> 82
Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR1
<400> 83
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR2
<400> 84
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR3
<400> 85
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
1 5
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链可变区
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链可变区
<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR1
<400> 88
Ser His Asp Met Ser
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR2
<400> 89
Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR3
<400> 90
His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR1
<400> 91
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR2
<400> 92
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR3
<400> 93
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链可变区
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链可变区
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR1
<400> 96
Asp Tyr Ser Met His
1 5
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR2
<400> 97
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR3
<400> 98
Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR1
<400> 99
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR2
<400> 100
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR3
<400> 101
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 102
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L
<400> 102
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 103
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L可溶性结构域
<400> 103
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
20 25 30
Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
35 40 45
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser
50 55 60
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
85 90 95
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
100 105 110
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
115 120 125
Cys Val Leu
130
<210> 104
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L可溶性结构域 (备选)
<400> 104
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
20 25 30
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
35 40 45
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
50 55 60
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
65 70 75 80
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
85 90 95
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
100 105 110
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
115 120 125
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 008的可变重链
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 008的可变轻链
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 011的可变重链
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 011的可变轻链
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 021的可变重链
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 110
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 021的可变轻链
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 023的可变重链
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 023的可变轻链
<400> 112
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 113
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 113
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 115
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 115
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 117
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 120
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 123
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 125
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 125
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 126
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 126
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 127
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体PD-1靶序列1
<400> 127
ttctccccag ccctgctcgt ggtgaccgaa ggggacaacg ccaccttca 49
<210> 128
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体PD-1靶序列1
<400> 128
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagaga 49
<210> 129
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体重复序列 PD-1-左
<400> 129
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
65 70 75 80
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
340 345 350
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
500 505 510
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala
515 520 525
Leu Glu
530
<210> 130
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体重复序列 PD-1-右
<400> 130
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
65 70 75 80
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln
275 280 285
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
290 295 300
Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
305 310 315 320
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
325 330 335
Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
340 345 350
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
355 360 365
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
370 375 380
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
385 390 395 400
Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile
405 410 415
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
420 425 430
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val
435 440 445
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
450 455 460
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln
465 470 475 480
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
485 490 495
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
500 505 510
Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu
515 520 525
Glu
<210> 131
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体重复序列 PD-1-左
<400> 131
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
65 70 75 80
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
500 505 510
Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala
515 520 525
Leu Glu
530
<210> 132
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体重复序列 PD-1-右
<400> 132
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
65 70 75 80
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
420 425 430
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val
435 440 445
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
450 455 460
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln
465 470 475 480
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
485 490 495
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
500 505 510
Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu
515 520 525
Glu
<210> 133
<211> 2814
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体 PD-1-左 TALEN
<400> 133
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60
gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120
aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180
acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240
aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300
ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360
agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420
gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480
ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600
gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720
ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780
cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020
agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080
caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1140
caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200
ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260
caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320
atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380
ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440
ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500
ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620
gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740
ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800
cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1860
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040
agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100
ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160
cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220
aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280
gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340
aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400
aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460
gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520
aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580
gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640
aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700
tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760
gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814
<210> 134
<211> 2829
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体 PD-1-右 TALEN
<400> 134
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60
gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120
cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180
ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240
ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300
gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360
acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420
attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480
acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caagtcgtcg caatcgccag caataacgga 540
gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc 600
cttacccctg agcaggtggt ggccatcgca agtaacattg gaggaaagca agccttggag 660
acagtgcagg ccctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc 720
gtggccattg cctccaacat cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca ggccctgctg 780
cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat 840
aacggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct 900
catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acaacggggg caagcaggcc 960
cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa 1020
caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc 1080
ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc 1140
agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc 1200
caggcacacg ggctgacccc ccagcaggtg gtggctatcg ccagcaataa tgggggcaag 1260
caggccctgg aaacagtcca gcgcctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact 1320
cccgaacagg tcgtggcaat cgcctccaac ggagggaagc aggctctgga gaccgtgcag 1380
agactgctgc ccgtcttgtg ccaggcccac ggactcacac ctcagcaggt cgtcgccatt 1440
gcctctaaca acgggggcaa acaagccctg gagacagtgc agcggctgtt gcctgtgttg 1500
tgccaagccc acggcttgac tcctcaacaa gtggtcgcca tcgcctcaaa tggcggcgga 1560
aaacaagctc tggagacagt gcagaggttg ctgcccgtcc tctgccaagc ccacggcctg 1620
actccccaac aggtcgtcgc cattgccagc aacggcggag gaaagcaggc tctcgaaact 1680
gtgcagcggc tgcttcctgt gctgtgtcag gctcatgggc tgacccccca gcaagtggtg 1740
gctattgcct ctaacaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca 1800
gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacggc 1860
gggggcaaac aggcattgga aaccgtccag cgcctgcttc cagtgctctg ccaggcacac 1920
ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg 1980
gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa 2040
gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag 2100
ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc 2160
tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc 2220
cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg 2280
aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac 2340
cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag 2400
cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac 2460
tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag 2520
gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc 2580
aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc 2640
ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 2700
aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc 2760
accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc 2820
gactgataa 2829
<210> 135
<211> 2814
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体 PD-1-左 TALEN
<400> 135
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60
gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120
aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180
acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240
aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300
ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360
agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420
gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480
ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 540
acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600
gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720
gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780
cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900
caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020
agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080
caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1140
caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200
ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260
cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320
atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380
ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440
ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500
ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1560
acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620
gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680
ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740
gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800
cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860
ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920
caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980
ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040
agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100
ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160
cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220
aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280
gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340
aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400
aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460
gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520
aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580
gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640
aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700
tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760
gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814
<210> 136
<211> 2829
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的构建体 PD-1-右 TALEN
<400> 136
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60
gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120
cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180
ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240
ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300
gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360
acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420
attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480
acgggtgccc cgctcaactt gacccccgag caagtcgtcg caatcgccag ccatgatgga 540
gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc 600
cttacccctc agcaggtggt ggccatcgca agtaacggag gaggaaagca agccttggag 660
acagtgcagc gcctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc 720
gtggccattg cctcccatga cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca gaggctgctg 780
cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat 840
ggcggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct 900
catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acgggggggg caagcaggcc 960
cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa 1020
caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc 1080
ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc 1140
agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc 1200
caggcacacg ggctgacccc cgagcaggtg gtggctatcg ccagcaatat tgggggcaag 1260
caggccctgg aaacagtcca ggccctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact 1320
ccccagcagg tcgtggcaat cgcctccaac ggcggaggga agcaggctct ggagaccgtg 1380
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ttgtgccaag cccacggctt gactcctcaa caagtggtcg ccatcgcctc aaatggcggc 1560
ggaaaacaag ctctggagac agtgcagagg ttgctgcccg tcctctgcca agcccacggc 1620
ctgactcccc aacaggtcgt cgccattgcc agcaacaacg gaggaaagca ggctctcgaa 1680
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gtggctattg cctctaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca 1800
gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacaac 1860
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ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg 1980
gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa 2040
gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag 2100
ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc 2160
tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc 2220
cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg 2280
aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac 2340
cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag 2400
cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac 2460
tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag 2520
gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc 2580
aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc 2640
ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 2700
aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc 2760
accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc 2820
gactgataa 2829

Claims (214)

1.一种将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，其中，所述方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；其中，所述肿瘤碎片来自患者切除的肿瘤；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(g)在所述方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻保存方法使用1：1比率的收获的TIL群与冷冻保存培养基进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞PBMC。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述PBMC是经辐照且同种异体的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(d)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用基于膜的细胞处理系统进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用LOVO细胞处理系统进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，多个碎片包括约4个至约50个碎片，每个碎片的体积为约27mm3。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，总体积为约1300mm3至约1500mm3。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，总体积为约1350mm3。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，总质量为约1克至约1.5克。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供所述细胞培养基。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中的细胞培养基还包含IL-15和/或IL-21。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述IL-2的浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述IL-15的浓度为约500IU/mL至约100IU/mL。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述IL-21的浓度为约20IU/mL至约0.5IU/mL。
19.根据前述权利要求1所述的方法，其中，步骤(f)中的输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。
20.根据权利要求3所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(DMSO)。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含7％至10％的DMSO。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约22天。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约15天至约20天。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约20天。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约15天。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行20天以下。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行15天以下。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行10天以下。
33.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，在步骤(e)中收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL的治疗有效剂量的TIL。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，足以达到治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的TIL产量增加。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到TIL中。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三TIL群提供增加的疗效、增加的干扰素-γ产量、增加的多克隆性、增加的平均IP-10和/或增加的平均MCP-1。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三TIL群提供至少5倍以上的干扰素-γ产量。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，所述治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自第三TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中，将来自步骤(g)的TIL输注到患者体内。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中，多个碎片包括约4个碎片。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，所述细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
47.根据权利要求45所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
49.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，对第一次扩增的TIL或第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
50.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，基因编辑在第一次扩增之后和第二次扩增之前进行。
51.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
52.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在将OKT-3引入所述细胞培养基之前进行基因编辑。
53.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在将OKT-3引入所述细胞培养基之后进行基因编辑。
54.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，从所述第一次扩增起始日开始，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
58.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
60.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
61.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括CRISPR法。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
63.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括TALE法。
64.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括锌指法。
65.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由受试者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；
(h)给患者施用治疗有效剂量的第三TIL群，所述第三TIL群来自步骤(g)的输液袋；以及
(i)在所述方法的步骤(a)至步骤(f)期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，在步骤(e)收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的TIL。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，足以达到在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞APC是PBMC。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，在步骤(d)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。
70.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已给患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天的步骤。
72.根据权利要求65至71中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤(h)中给患者施用TIL细胞后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述高剂量IL-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000IU/kg或720,000IU/kg，直至耐受。
74.根据权利要求65至73中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，所述治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
75.根据权利要求65至74中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，所述治疗性TIL群中的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
76.根据权利要求65至75中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌HNSCC)、肾癌和肾细胞癌。
77.根据权利要求65至76中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌和NSCLC。
78.根据权利要求65至77中任一项所述的方法，其中，所述癌症是黑色素瘤。
79.根据权利要求65至78中任一项所述的方法，其中，所述癌症是HNSCC。
80.根据权利要求65至79中任一项所述的方法，其中，所述癌症是宫颈癌。
81.根据权利要求65至80中任一项所述的方法，其中，所述癌症是NSCLC。
82.根据权利要求65至81中任一项所述的方法，其中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，所述细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
83.根据权利要求82所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
84.根据权利要求82所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
85.根据权利要求65至84中任一项所述的方法，其中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
86.根据权利要求65至84中任一项所述的方法，其中，对所述第一次扩增的TIL或所述第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
87.根据权利要求65至84中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑在所述第一次扩增之后和所述第二次扩增之前进行。
88.根据权利要求65至84中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
89.根据权利要求65至88中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在将OKT-3引入所述细胞培养基之前进行基因编辑。
90.根据权利要求65至88中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在将OKT-3引入所述细胞培养基之后进行基因编辑。
91.根据权利要求65至88中任一项所述的方法，其中，从所述第一次扩增起始日开始，所述细胞培养基包含OKT-3；并且在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
92.根据权利要求65至91中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
95.根据权利要求65至91中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
96.根据权利要求65至95中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
97.根据权利要求65至95中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
98.根据权利要求65至95中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括CRISPR法。
99.根据权利要求98所述的方法，其中，所述CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
100.根据权利要求65至95中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括TALE法。
101.根据权利要求65至95中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括锌指法。
102.将肿瘤浸润淋巴细胞TIL扩增成治疗性TIL群的方法，其中，所述方法包括：
(a)将来自患者切除肿瘤的经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中，获得第一TIL群；
(b)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；
(c)通过向第二TIL群的细胞培养基补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)收获从步骤(c)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)将步骤(d)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)在所述方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
103.根据权利要求102所述的方法，其中，在步骤(d)中收获的治疗性TIL群包含足以达到TIL的治疗有效剂量的TIL。
104.根据权利要求103所述的方法，其中，足以达到治疗有效剂量的TIL的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。
105.根据权利要求104所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的TIL群的输液袋。
106.根据权利要求105所述的方法，其中，所述冷冻保存方法使用1：1比率的收获的TIL群与冷冻保存培养基进行。
107.根据权利要求102所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞PBMC。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述PBMC是经辐照且同种异体的。
109.根据权利要求108所述的方法，其中，在步骤(c)的第9天至第14天中的任何一天将PBMC添加到细胞培养基中。
110.根据权利要求102所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。
111.根据权利要求102所述的方法，其中，使用LOVO细胞处理系统进行步骤(d)中的收获。
112.根据权利要求62所述的方法，其中，多个碎片包括约4个至约50个碎片，每个碎片的体积为约27mm3。
113.根据权利要求102所述的方法，其中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，总体积为约1300mm3至约1500mm3。
114.根据权利要求103所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，总体积为约1350mm3。
115.根据权利要求102所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，总质量为约1克至约1.5克。
116.根据权利要求102所述的方法，其中，多个碎片包括约4个碎片。
117.根据权利要求102所述的方法，其中，在选自G容器和Xuri细胞袋的容器中提供所述第二细胞培养基。
118.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(e)中的输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。
119.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。
120.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在11天内进行。
121.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约22天。
122.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约20天。
123.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约15天。
124.根据权利要求102所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。
125.根据权利要求105所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。
126.根据权利要求102至125中任一项所述的方法，其中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的TIL产量增加。
127.根据权利要求102至126中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到TIL中。
128.根据权利要求102至127中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自治疗性TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出选自下组的一种以上特征：CD27+表达、CD28+表达、端粒更长、CD57表达增加和CD56表达降低。
129.根据权利要求102至128中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自治疗性TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现出：CD57表达增加和CD56表达降低。
130.根据权利要求102至129中任一项所述的方法，其中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。
131.根据权利要求102至130中任一项所述的方法，其中，将来自步骤(e)的TIL输注到患者体内。
132.根据权利要求102至131中任一项所述的方法，其中，所述封闭容器包括单个生物反应器。
133.根据权利要求132所述的方法，其中，所述封闭容器包括G-REX-10。
134.根据权利要求132所述的方法，其中，所述封闭容器包括G-REX-100。
135.根据权利要求102至134中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，以APC：TIL为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(APC)添加到第二TIL群的细胞培养基中。
136.根据权利要求135所述的方法，其中，所述细胞培养基具有2.5×109个APC：100×106个TIL的比率。
137.根据权利要求102至134中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，以APC：TIL为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞APC添加至第二TIL群的细胞培养基中。
138.根据权利要求137所述的方法，其中，所述细胞培养基具有2.5×109个APC：100×106个TIL的比率。
139.根据权利要求102至138中任一项所述的方法，其中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，所述细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
140.根据权利要求139所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之后进行基因编辑。
141.根据权利要求139所述的方法，其中，在将4-1BB激动剂和/或OX40激动剂引入细胞培养基之前进行基因编辑。
142.根据权利要求102至141中任一项所述的方法，其中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
143.根据权利要求102至141中任一项所述的方法，其中，对所述第一次扩增的TIL或所述第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
144.根据权利要求102至141中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑在所述第一次扩增之后和所述第二次扩增之前进行。
145.根据权利要求102至141中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑在步骤(b)之前、步骤(c)之前或步骤(d)之前进行。
146.根据权利要求102至145中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；以及在将OKT-3引入所述细胞培养基之前进行基因编辑。
147.根据权利要求102至145中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增和/或所述第二次扩增期间，所述细胞培养基包含OKT-3；以及在将OKT-3引入所述细胞培养基之后进行基因编辑。
148.根据权利要求102至145中任一项所述的方法，其中，从所述第一次扩增起始日开始，所述细胞培养基包含OKT-3；以及在TIL暴露于OKT-3之后进行基因编辑。
149.根据权利要求102至148中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑导致至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
150.根据权利要求149所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
151.根据权利要求149所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
152.根据权利要求102至148中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
153.根据权利要求102至152中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
154.根据权利要求102至152中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
155.根据权利要求102至152中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括CRISPR法。
156.根据权利要求155所述的方法，其中，所述CRISPR法是CRISPR/Cas9法。
157.根据权利要求102至152中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括TALE法。
158.根据权利要求102至152中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括锌指法。
159.用于治疗患有癌症的受试者的扩增的TIL群，其中，所述扩增的TIL群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三TIL群：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由受试者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；所述第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)将从步骤(e)收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的TIL群的输液袋；以及
(h)在所述方法期间的任何时间，对至少一部分TIL进行基因编辑。
160.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述方法还包括权利要求1至158中任一项所述的一种以上特征。
161.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，在第一次扩增、第二次扩增或两者期间，所述细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
162.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，对第一TIL群、第二TIL群和第三TIL群中的一种以上进行基因编辑。
163.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，对所述第一次扩增的TIL或所述第二次扩增的TIL或两者进行基因编辑。
164.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑在所述第一次扩增之后和所述第二次扩增之前进行。
165.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑在步骤(c)之前、步骤(d)之前或步骤(e)之前进行。
166.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑使至少一部分扩增的TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达被沉默或减少。
167.根据权利要求166所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
168.根据权利要求166所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、CISH、TGFβ和PKA。
169.根据权利要求166所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑使至少一部分治疗性TIL群的一种以上免疫检查点基因的表达增强，所述免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
170.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑包括使用可编程核酸酶，所述可编程核酸酶介导在所述一种以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂。
171.根据权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群，其中，所述基因编辑包括选自CRISPR法、TALE法、锌指法及它们的组合的一种以上方法。
172.冷冻保存组合物，其中，所述冷冻保存组合物包含：权利要求159所述的用于治疗患有癌症的受试者的TIL群、包含DMSO的冷冻保护剂和电解质溶液。
173.根据权利要求172所述的冷冻保存组合物，其中，所述冷冻保存组合物还包含一种以上稳定剂和一种以上淋巴细胞生长因子。
174.根据权利要求173所述的冷冻保存组合物，其中，所述一种以上稳定剂包括人血清白蛋白HSA，所述一种以上淋巴细胞生长因子包括IL-2。
175.根据权利要求174所述的冷冻保存组合物，其中，包含DMSO的冷冻保护剂和电解质溶液以约1.1：1至约1：1.1的比率存在。
176.根据权利要求174所述的冷冻保存组合物，其中，所述冷冻保存组合物包含：约1×106至约9×1014的TIL群、约30mL至约70mL的包含DMSO的冷冻保护剂、约30mL至约70mL的电解质溶液、约0.1g至约1.0g的HSA和约0.001mg至约0.005mg的IL-2。
177.将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
178.根据权利要求177所述的方法，其中，所述方法包括：通过在包含IL-2、OKT-3和4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增；其中，从第0天或第1天开始，OKT-3和4-1BB激动剂抗体可选地存在于细胞培养基中。
179.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB及它们的组合的分子的表达。
180.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1的表达。
181.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制LAG-3的表达。
182.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制TIM-3的表达。
183.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CISH的表达。
184.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CBLB的表达。
185.根据权利要求177至184中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。
186.根据权利要求177至184中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送转录激活因子样效应物(TALE)系统。
187.根据权利要求177至184中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送锌指系统。
188.根据权利要求177至187中任一项所述的方法，其中，所述基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基包含DMSO、电解质溶液、可选的HSA和可选的IL-2。
189.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；以及
(k)从输液袋向患者施用治疗有效剂量的收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
190.根据权利要求189所述的方法，其中，所述方法包括：通过在包含IL-2、OKT-3和4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增；其中，从第0天或第1天开始，OKT-3和4-1BB激动剂抗体可选地存在于细胞培养基中。
191.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB及它们的组合的分子的表达。
192.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1的表达。
193.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制LAG-3的表达。
194.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制TIM-3的表达。
195.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CISH的表达。
196.根据权利要求189或190所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CBLB的表达。
197.根据权利要求189至196中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。
198.根据权利要求189至196中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送转录激活因子样效应物(TALE)系统。
199.根据权利要求189至196中任一项所述的方法，其中，所述电穿孔步骤包括递送锌指系统。
200.根据权利要求189至196中任一项所述的方法，其中，所述基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基包含DMSO、电解质溶液、可选的HSA和可选的IL-2。
201.用于治疗患有癌症的受试者的扩增的TIL群，其中，所述扩增的TIL群是可由包括以下步骤的方法获得的收获的TIL群：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，由患者切除的肿瘤获得第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(c)通过在包含IL-2且可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群约2天至5天，来进行第一次扩增；
(d)可选地添加OKT-3，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约1天至3天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少50倍；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)对第二TIL群进行无菌电穿孔步骤；其中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使第二TIL群静息约1天；
(g)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至11天，获得第三TIL群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群，提供收获的TIL群；其中，从步骤(g)到步骤(h)的转变在不打开系统的情况下发生；其中，收获的TIL群是治疗性TIL群；
(i)将收获的TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(h)到步骤(i)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(j)使用基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基冷冻保存收获的TIL群；
其中，电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)及它们的组合的分子的表达。
202.根据权利要求201所述的扩增的TIL群，包括：通过在包含IL-2、OKT-3和4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增；其中，从第0天或第1天开始，OKT-3和4-1BB激动剂抗体可选地存在于细胞培养基中。
203.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制选自PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB及它们的组合的分子的表达。
204.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制PD-1的表达。
205.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制LAG-3的表达。
206.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制TIM-3的表达。
207.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CISH的表达。
208.根据权利要求201或202所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，用于抑制CBLB的表达。
209.根据权利要求201至208所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。
210.根据权利要求201至208所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括传递转录激活因子样效应物(TALE)系统。
211.根据权利要求201至208所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括递送锌指系统。
212.根据权利要求201至211所述的扩增的TIL群，其中，所述基于二甲基亚砜的冷冻保存培养基包含DMSO、电解质溶液、可选的HSA和可选的IL-2。
213.根据权利要求201至211所述的扩增的TIL群，其中，所述电穿孔步骤包括脉冲电穿孔步骤。
214.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述基因编辑包括CRISPR法，所述CRISPR法包括使用高保真Cas9。
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