CN116829156A - 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗 - Google Patents

使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN116829156A
CN116829156A CN202180094092.2A CN202180094092A CN116829156A CN 116829156 A CN116829156 A CN 116829156A CN 202180094092 A CN202180094092 A CN 202180094092A CN 116829156 A CN116829156 A CN 116829156A
Authority
CN
China
Prior art keywords
population
tils
inhibitor
amplification
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180094092.2A
Other languages
English (en)
Inventor
M·法尔迪
F·G·芬肯施泰因
Z·戈德堡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iovance Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iovance Biotherapeutics Inc filed Critical Iovance Biotherapeutics Inc
Priority claimed from PCT/US2021/063910 external-priority patent/WO2022133140A1/en
Publication of CN116829156A publication Critical patent/CN116829156A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于制备TIL的经改进和/或缩短的过程及方法，以制备具有增加的治疗功效的治疗性TIL群体，用于用如本文所述的TIL与CTLA‑4以及PD‑1抑制剂和/或PD‑L1抑制剂组合治疗癌症。

Description

使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与CTLA-4及PD-1抑制剂组合的 治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月17日提交的美国临时申请号63/127,060、2021年2月5日提交的美国临时申请号63/146,425和2021年11月9日提交的美国临时申请号63/277,371的优先权，它们各自出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
序列表并入段落
本申请含有序列表，该序列表已按ASCII格式以电子方式提交，特此以全文引用的方式并入。2021年12月15日创建的该ASCII副本命名为116983-5085-AR_ST25.txt，大小为245,483个字节。
背景技术
癌症(例如黑色素瘤)的治疗仍然具有挑战性，特别是对于对常用初始疗法系列无反应的患者，该疗法包括纳武单抗(nivolumab)单药疗法、帕博利珠单抗(pembrolizumab)单药疗法、使用纳武单抗及伊匹木单抗(ipilimumab)的组合的疗法、伊匹木单抗单药疗法、达拉非尼(dabrafenib)及曲美替尼(trametinib)组合疗法、维罗非尼(vemurafenib)单药疗法及聚乙二醇化干扰素(preinterferon)α-2b。已获批准的转移性黑色素瘤的一线治疗包括阻断PD-1的免疫治疗策略(帕博利珠单抗、纳武单抗)，或将纳武单抗与抗CTLA4阻断剂伊匹木单抗相结合，或用靶向BRAF路径中特定活化突变的药物进行化疗(例如维罗非尼、达拉非尼、曲美替尼)。随着疾病进展，患者可接受额外的抗PD-1单药疗法；纳武单抗/伊匹木单抗组合疗法；伊匹木单抗单药疗法；BRAF突变体的靶向疗法；高剂量阿地白介素(白介素-2；IL-2)；细胞毒素剂(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、紫杉醇、顺铂、卡铂、长春碱)；或伊马替尼(imatinib)来治疗KIT突变型黑色素瘤。在2015年，拉-他利莫近(Talimogene Laherparepvec)，一种活溶瘤病毒疗法，经批准用于在初始手术切除后复发的患有黑色素瘤的患者中不可切除性皮肤、皮下及结节病变的局部治疗。此产品尚未展示可改善整体存活率或对内脏癌转移具有影响。
直至最近，高剂量阿地白介素是唯一一种经FDA批准的用于转移性黑色素瘤的全身性治疗，能够诱导持久的客观癌症反应，总体客观反应率(ORR)为16％且在高达6％的治疗患者中观测到持久的肿瘤完全消退(CR)((阿地白介素)标签，FDA，2012年7月)。Alva等人，《癌症免疫学及免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)2016,65,1533-1544。近年来审批通过的PD-1免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗及纳武单抗在转移性黑色素瘤中的持久反应率相对于阿地白介素治疗约增加一倍。Larkin等人，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》2015,373,23-34；Robert等人，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》2015,372,2521-32。在预先治疗的患者中，纳武单抗的ORR为32％，更高及更持久反应与肿瘤的较高水平的PD-1配体表达相关；在先前用伊匹木单抗治疗后，帕博利珠单抗的ORR为21％(表2)。在未接受治疗的患者中，当纳武单抗及伊匹木单抗组合施用时，50％患者达成持久客观反应，尽管CR率仍然很低仅为8.9％((纳武单抗)标签，FDA，2016年10月)。
检查点抑制剂的用途与一系列免疫相关不良事件相关，包括肺炎、结肠炎、肝炎、肾炎及肾功能障碍(Opdivo(纳武单抗)标签，FDA，2016年10月)。Hofmann等人，《欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)》2016,60,190-209。在用纳武单抗及伊匹木单抗组合疗法治疗的患者中观测到增加的毒性。在接受组合疗法、单独使用纳武单抗或单独使用伊匹木单抗的患者中，导致疗法中断的治疗相关不良事件的发生率分别为36.4％、7.7％及14.8％。Larkin等人，《新英格兰医学杂志》2015,373,23-34；Johnson等人，《新英格兰医学杂志》2016,375,1749-1755。
虽然靶向疗法及免疫检查点抑制剂可在患有转移性黑色素瘤的患者中达成显著反应，但预计到2030年，此癌的死亡率将保持稳定。2011年经年龄调整的黑色素瘤总死亡率为每10万人中有2.7人，2015年仍保持这一水平。Guy等人，《发病率及死亡率周报(Morbidity Mortality Weekly Rep.)》2015,64,591-596。
使用过继性自体转移肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)治疗大型、难治性癌症表示对于不良预后患者的一种强大的治疗方案。Gattinoni等人，《自然免疫学评论(Nat.Rev.Immunol.)》2006,6,383-393。TIL是由T细胞主导，基于IL-2的TIL扩增及随后的“快速扩增过程”(REP)已因其速度及效率而成为TIL扩增的优选方法。Dudley等人，《科学(Science)》2002，298,850-54；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2005,23,2346-57；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2008,26,5233-39；Riddell等人，《科学(Science)》1992,257,238-41；Dudley等人，《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2003,26,332-42。已探究许多改善黑色素瘤对TIL疗法的反应且将TIL疗法扩展到其他肿瘤类型的方法，但成效有限，该领域仍然具有挑战性。Goff等人，《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2016,34,2389-97；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2008,26,5233-39；Rosenberg等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2011,17,4550-57。也已描述单一免疫检查点抑制剂的组合研究，但其他研究正在进行中且需要额外治疗方法(Kverneland等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》,2020,11(22),2092-2105)。
此外，当前的TIL制造及治疗过程受到长度、成本、无菌性问题及本文所述的其他因素的限制，使得治疗对其他检查点抑制剂疗法难治的患者的潜力受到严重限制。迫切需要提供TIL制造过程及基于此类过程的疗法，此类过程适合用于治疗剩余极少治疗选择方案或无可行的治疗选择方案的患者。本发明通过提供一种用于产生TIL的缩短制造过程来满足此需要。
本发明提供了用于制备TIL的经改进和/或缩短的过程及方法，以制备具有增加的治疗功效的治疗性TIL群体，用于用如本文所述的TIL与CTLA-4以及PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂组合治疗癌症。
发明内容
本文提供了产生TIL的方法，TIL可随后用于治疗癌症，该方法通过将TIL与如本文所述的CTLA-4以及PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂组合施用。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，可选地，该患者或受试者已接受至少一种先前疗法，其中，该至少一种先前疗法包括CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增(primingfirst expansion))，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
本发明提供了一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，该方法包括以下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，其中，该受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将该肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使该肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
在一些实施例中，患者或受试者患有肿瘤，该肿瘤是不可切除的、转移性的、耐药的和/或难以用CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂治疗。
在一些实施例中，在步骤(c)中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少50倍。
在一些实施例中，PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂与治疗有效剂量的第三TIL群体同时施用。
在一些实施例中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后保持施用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
在一些实施例中，PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂不与治疗有效剂量的第三TIL群体同时施用。
在一些实施例中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后至少一周向受试者施用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
在一些实施例中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后可选地向患者施用CTLA-4抑制剂。
在一些实施例中，在步骤(a)中移除和/或获得和/或接受之前，可选地向患者施用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
在一些实施例中，患者或受试者先前已用CTLA-4抑制剂或其生物类似物和/或PD-1抑制剂或其生物类似物和/或PD-L1抑制剂或其生物类似物治疗。
在一些实施例中，肿瘤先前已用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂或它们的生物类似物治疗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂选自如下：纳武单抗、帕博利珠单抗及它们的生物类似物。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂选自如下：阿维鲁单抗(avelumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)及它们的生物类似物。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂选自如下：伊匹木单抗(ipilumumab)、曲美单抗(tremelimumab)及它们的生物类似物。
在一些实施例中，第一扩增在约11天的时间段内进行。
在一些实施例中，初始扩增在约11天的时间段内进行。
在一些实施例中，IL-2在第一扩增中的细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
在一些实施例中，IL-2在初始扩增中的细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
在一些实施例中，在第二扩增步骤中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施例中，在快速扩增步骤中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施例中，第一扩增使用透气容器进行。
在一些实施例中，初始扩增使用透气容器进行。
在一些实施例中，第二扩增使用透气容器进行。
在一些实施例中，快速扩增使用透气容器进行。
在一些实施例中，第一细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
在一些实施例中，第一扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
在一些实施例中，第二细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
在一些实施例中，第二扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
在一些实施例中，该方法进一步包括在向患者施用TIL之前用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案治疗患者的步骤。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨(fludarabine)持续五天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施例中，环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。
在一些实施例中，该方法进一步包括在向患者施用第三TIL群体之后次日开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施例中，该方法进一步包括以在向患者施用第三TIL群体的同一天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施例中，IL-2方案在向患者完成施用第三TIL群体之后3至24小时施用。
在一些实施例中，IL-2方案为包含600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，其以每八小时进行15分钟的推注静脉内输注形式施用直至耐受。
在一些实施例中，施用治疗有效的TIL群体，该TIL群体包含约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
在一些实施例中，初始扩增在21天以下的时间段内进行。
在一些实施例中，初始扩增在7天以下的时间段内进行。
在一些实施例中，快速扩增在7天以下的时间段内进行。
在一些实施例中，步骤(c)中的第一扩增和步骤(d)中的第二扩增各自单独地进行11天的时间段。
在一些实施例中，步骤(a)至(f)在约10天至约22天内进行。
在一些实施例中，受试者经历预先治疗，该预先治疗包括在切除肿瘤之前施用CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗或其生物类似物以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗或其生物类似物以约200mg至约500mg的剂量施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗或其生物类似物每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗或其生物类似物以约1mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或75mg的剂量施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗或其生物类似物每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，其中，纳武单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，其中，纳武单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，其中，纳武单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂在切除肿瘤之前1、2、3、4或5周施用，可选地在切除肿瘤之前1、2或3周施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂在IL-2施用之后1、2、3、4或5天施用，Tablend可选地在IL-2施用之后1、2或3天施用。
在一些实施例中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物包含在酶培养基中孵育肿瘤样本。
在一些实施例中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括以机械方式破坏肿瘤样本以便解离肿瘤样本。
在一些实施例中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括使用密度梯度分离纯化解离的肿瘤样本。
在一些实施例中，酶培养基包含DNA酶。
在一些实施例中，酶培养基包含30单位/mL的DNA酶。
在一些实施例中，酶培养基包含胶原蛋白酶。
在一些实施例中，酶培养基包含1.0mg/mL胶原蛋白酶。
附图说明
图1：示例性Gen 2(过程2A)图表提供了步骤A至F的概述。
图2A至2C：用于TIL制造的Gen 2(过程2A)实施例的过程流程图。
图3：显示冷冻保存的TIL示例性制造过程(约22天)的实施例的图示。
图4：显示Gen 2(过程2A)的实施例的图示，其为一个用于TIL制造的22天过程。
图5：过程1C及用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的示例性实施例的步骤A至F的比较表。
图6：过程1C的实施例及用于TIL制造之Gen 2(过程2A)的实施例的详细比较。
图7：示例性Gen 3型TIL制造过程。
图8A至图8D：A)显示2A过程(约22天过程)与用于TIL制造的Gen 3过程(约14天至16天过程)的实施例之间的比较。B)示例性Gen 3图表提供了步骤A至F的概述(约14天至16天过程)。C)该图表提供三种示例性Gen 3过程，概述了三种过程变型各自的步骤A至F(约14天或16天过程)。D)示例性的经修改的类Gen 2过程，其提供了步骤A至F的概述(约22天过程)。
图9：提供Gen 2(过程2A)与Gen 3过程之间的可比较性的实验流程图。
图10：显示各种Gen 2(过程2A)与Gen 3.1过程实施例之间的比较。
图11：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图12：Gen 3过程(被称作Gen 3.1)之一实施例的培养基条件的概述。
图13：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图14：比较Gen 2及Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图15：提供所描述扩增过程的各种实施例中的培养基用途的表。
图16：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施例的示意图。
图17：使用Gen 3扩增平台扩增来自造血系统恶性肿瘤的T细胞的方法的示例性实施例的示意图。
图18：提供结构I-A及I-B。圆柱体指单独的多肽结合结构域。结构I-A及I-B包含三个线性连接的衍生自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合结构域，其折叠形成三价蛋白质，该三价蛋白质接着通过IgG1-Fc(包括CH3及CH2结构域)与第二三价蛋白质连接，该IgG1-Fc随后通过二硫键(小长椭圆形)将两个三价蛋白质连接在一起，从而稳定结构且提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域与信号传导蛋白集合在一起以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可为包含例如由接头连接的VH及VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基及提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。
图19：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施例的示意图。
图20：提供Gen 3.1过程(16天过程)的示例性实施例的过程概述。
图21：Gen 3.1测试过程(16天至17天过程)的示例性实施例的示意图。
图22：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施例的示意图。
图23：示例性Gen 2及示例性Gen 3过程的比较表。
图24：Gen 3过程(16天至17天过程)制备时间线的示例性实施例的示意图。
图25：Gen 3过程(14天至16天过程)的示例性实施例的示意图。
图26A至图26B：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施例的示意图。
图27：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施例的示意图。
图28：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的实施例的比较。
图29：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的实施例的比较。
图30：Gen 3实施例组分。
图31：Gen 3实施例流程图比较(Gen 3.0、Gen 3.1对照、Gen 3.1测试)。
图32：显示Gen 3过程(16天至17天过程)的示例性实施例的组分。
图33：验收准则表。
图34：实例16中所描述的临床试验的TIL的制造及施用的示意性说明。
图35：实例16中所描述的临床试验的治疗方案。
图36：实例16中所描述的临床试验随时间推移的治疗引发的不良事件。
图37：实例16中所描述的临床试验的最佳整体反应。
图38：实例16中所描述的临床试验的反应时间。
图39：实例16中所描述的临床试验的肿瘤大小相对于基线之变化。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1为莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为IL-2形式。
SEQ ID NO：6为奈瓦纽金α(nemvaleukin alfa)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为IL-2形式。
SEQ ID NO：8为粘蛋白结构域多肽。
SEQ ID NO：9为重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为IL-2序列。
SEQ ID NO：14为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：15为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：16为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO：17为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO：18为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO：19为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO：20为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO：21为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO：22为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO：23为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO：24为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO：25为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO：26为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO：27为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO：28为IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO：29为IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO：30为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO：31为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO：32为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO：33为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO：34为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO：35为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO：36为VL链。
SEQ ID NO：37为轻链。
SEQ ID NO：38为轻链。
SEQ ID NO：39为轻链。
SEQ ID NO：40为人4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为鼠4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO：43为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO：44为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：45为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：46为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO：47为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO：48为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO：49为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：50为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：51为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：52为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO：53为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO：54为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：55为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：56为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO：57为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO：58为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO：59为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：60为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：61为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：62为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：63为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：64为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：65为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：66为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：67为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：68为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：69为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：70为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：71为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：72为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：73为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：74为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：75为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：76为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：77为4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：78为4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：79为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：80为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：81为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：82为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：83为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：84为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：85为人OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：86为鼠OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：87为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO：88为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO：89为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：90为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：91为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO：92为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO：93为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO：94为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：95为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：96为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：97为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO：98为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO：99为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：100为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：101为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO：102为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO：103为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO：104为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO：105为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO：106为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO：107为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO：108为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO：109为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：110为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：111为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO：112为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO：113为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO：114为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO：115为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO：116为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO：117为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：118为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：119为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO：120为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO：121为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO：122为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO：123为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO：124为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO：125为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：126为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：127为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO：128为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO：129为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO：130为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO：131为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO：132为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO：133为OX40配体(OX40L)氨基酸序列。
SEQ ID NO：134为OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：135为OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO：136为OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：137为OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：138为OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：139为OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：140为OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：141为OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：142为OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：143为OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：144为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：145为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：146为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：147为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：148为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：149为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：150为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：151为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：152为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：153为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：154为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：155为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：156为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：157为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：158为PD-1抑制剂纳武单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：159为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：160为PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：161为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：162为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：163为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：164为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：165为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：166为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：167为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：168为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：169为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：170为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：171为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：172为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：173为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：174为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：175为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：176为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：177为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：178为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：179为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：180为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：181为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：182为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：183为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：184为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：185为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：186为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：187为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：188为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：189为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：190为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：191为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：192为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：193为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：194为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：195为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：196为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：197为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：198为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：199为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：200为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：201为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：202为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：203为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：204为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：205为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：206为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：207为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：208为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：209为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：210为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：211为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：212为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：213为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：214为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：215为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：216为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：217为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：218为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：219为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：220为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：221为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：222为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：223为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：224为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：225为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：226为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：227为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：228为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：229为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：230为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：231为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：232为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：233为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：234为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：235为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：236为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：237为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
具体实施方式
I.引言
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞疗法，已在患有癌症(例如黑色素瘤)的患者的宿主免疫抑制之后产生成功的过继性细胞疗法。目前的输注接受参数依赖于TIL的组成的读数(例如CD28、CD8或CD4阳性率)及REP产物的扩增倍数及存活率。
当前REP方案对将输注至患者体内的TIL的健康状况提供极少了解。T细胞在其自幼稚T细胞至效应T细胞的成熟过程中经历了极大的代谢转变(参见Chang等人，《自然免疫学(Nat.Immunol.)》2016,17,364，特此明确地以全文并入，尤其是针对厌氧及好氧代谢的论述及标记物)。例如，幼稚T细胞依赖于粒线体呼吸产生ATP，而成熟、健康效应T细胞(例如TIL)则具有高度糖酵解，依赖于好氧性糖酵解来提供它们增殖、迁移、激活及抗肿瘤功效所需的生物能量底物。
当前TIL制造及治疗过程受到长度、成本、无菌性问题及本文所述的其他因素的限制，使得治疗对BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂难治的患者的潜力受到严重限制。迫切需要提供TIL制造过程及基于此类过程的疗法，此类过程适合用于治疗剩余极少治疗选择方案或无可行的治疗选择方案的患者。本发明通过提供一种缩短的制造过程来满足此需要，该方法用于产生可随后用于治疗难以用BRAF和/或MEK抑制剂治疗的黑色素瘤癌症的患者的TIL。
定义
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属的领域的技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的所有专利及出版物均以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“共同施用”、“共同给药”、“与…组合施用”、“与……联合施用”、“同时”及“同期”涵盖向受试者施用两种以上活性药物成分(在本发明的一个优选实施例中，例如多个TIL)，使得活性药物成分和/或其代谢物两者同时存在于受试者中。共同施用包括以分开的组合物同时施用、以分开的组合物在不同时间施用或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物的形式施用。以分开的组合物同时施用及以其中存在两种试剂的组合物的形式施用为优选。
术语“体内”指发生于受试者体内的事件。
术语“体外”指发生于受试者体外的事件。体外分析涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的分析，也可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的分析。
术语“离体”指涉及对已自受试者身体移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或执行程序的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者体内。
术语“快速扩增”指抗原特异性TIL的数目在一周时间内增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选在一周时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选在一周时间内增加至少约100倍。多种快速扩增方案描述于本文中。
本文中“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1及Th17 CD4+ T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞及M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL及继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所述的获自患者组织样本的细胞(有时称为“新鲜收集”)，“继代TIL”是任何如本文所述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)主体TIL(bulkTIL)及经扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞群体可包括经遗传修饰的TIL。
本文中的“细胞群体”(包括TIL)指许多具有共同特质的细胞。一般而言，群体数目在1×106至1×1010的范围内，其中，不同的TIL群体包含不同数目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生长产生约1×108个细胞的主体TIL群体。一般进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群体用于输注。
本文中“冷冻保存的TIL”指在约-150℃至-60℃的范围内处理且储存TIL，无论是初代的、主体的或经扩增的(REP TIL)。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包括在实例中。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初代TIL来源的冷冻组织样本区分。
本文的“解冻的冷冻保存的TIL”指先前经冷冻保存且随后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群体。
TIL通常可使用生物化学(使用细胞表面标记物)或功能性(根据其浸润肿瘤及实现治疗的能力)来进行定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可通过重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。
术语“冷冻保存培养基”或“冻存培养基”指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、HypoThermosol以以及它们的组合。术语“CS10”指获自Stemcell Technologies或BiolifeSolutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基为包含DMSO的无血清、无动物组分的培养基。
术语“中枢记忆T细胞”指在人类中为CD45R0+且组成型表达CCR7(CCR7hi)及CD62L(CD62hi)的T细胞子集。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中枢记忆T细胞在TCR引发之后主要分泌IL-2及CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞主要存在于血液的CD4隔室中，在人类中按比例富集于淋巴结及扁桃体中。
术语“效应记忆T细胞”指人或哺乳动物T细胞的子集，例如中枢记忆T细胞，为CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成型表达(CCR7lo)且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62Llo)。中枢记忆T细胞的表面表型也包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激之后快速分泌高含量炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL4-和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8隔室中，在人类中按比例富集于肺、肝脏及肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔蛋白。
术语“密闭系统”指对外部环境密闭的系统。适用于细胞培养方法的任何密闭系统均可用于本发明的方法。密闭系统包括例如(但不限于)密闭G容器。一旦将肿瘤碎片添加至密闭系统中，该系统不对外部环境开放，直至TIL准备好向患者施用。
如本文所用，术语“破碎”、“碎片”及“破碎的”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分割及粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”及“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)及单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC为一种类型的抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞优选地是经辐照的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”及“PBL”指自外周血扩增的T细胞。在一些实施例中，PBL从来自供体的全血或单采(apheresis)产物中分离出。在一些实施例中，PBL通过正向或负向选择T细胞表型(例如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或单采产物分离。
术语“抗CD3抗体”指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3及CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizuma)及维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也被称作“OKT3”)指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体，包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，美国加利福尼亚州圣地亚哥美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech,Inc.))及莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖型或生物类似物。莫罗单抗的重链及轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1及SEQID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保存于美国菌种保藏中心且所分配的ATCC登录号为CRL8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保存于欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)且所分配的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人及哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-2是描述于例如Nelson的《免疫学杂志(J.Immunol.)》2004,172,3983-88及Malek,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》2008,26,453-79，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：3)。举例而言，术语IL-2涵盖人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含22百万IU)以及由美国新罕布什尔州次茅斯的CellGenix,Inc.或美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式及来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(去丙胺酰基-1，丝氨酸-125人IL-2)为分子量约15kDa的非糖基化人重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2也涵盖如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前药贝培阿地白介素(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如SEQ ID NO：4中所示的聚乙二醇化人重组IL-2，其中，平均6个赖氨酸残基是经[(2,7-双{[甲基聚(氧乙烯)]氨基甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基取代的N6)，其可购自美国加利福尼亚州南旧金山的NektarTherapeutics，或可通过本领域中已知的方法制备，例如国际专利申请公开号WO 2018/132496 A1的实例19中描述的方法或美国专利申请公开号US2019/0275133 A1的实例1中描述的方法，这些公开的公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的贝培阿地白介素(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL-2分子描述于美国专利申请公开号US2014/0328791 A1及国际专利申请公开号WO 2012/065086A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261及4,902,502中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，适合用于本发明的IL-2形式为可购自Synthorx,Inc.的THOR-707。THOR-707及适用于本发明的另外替代形式的IL-2的制备及特性描述于美国专利申请公开号US2020/0181220 A1及US2020/0330601 A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离纯化的IL-2多肽；以及在选自以下的氨基酸位置结合至分离纯化的IL-2多肽的缀合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107，其中，氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO：5。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72及Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72及Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自R38及K64。在一些实施例中，氨基酸位置选自E61、E62及E68。在一些实施例中，氨基酸位置在E62。在一些实施例中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施例中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施例中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施例中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、2-氨基-8-侧氧基辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯基丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、磷酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷丝氨酸、磷酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-侧氧基丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱氨酸。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，IL-2缀合物与IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力降低。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是与IL-2Rα的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些实施例中，缀合部分削弱或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施例中，缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施例中，另外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇及丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚恶唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含PEG。在一些实施例中，PEG为线性PEG或支化PEG。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含多糖。在一些实施例中，多糖包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含聚糖。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含多胺。在一些实施例中，缀合部分包含蛋白质。在一些实施例中，另外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含白蛋白、转铁蛋白(transferrin)或运甲状腺素蛋白(transthyretin)。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含Fc部分。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含IgG的Fc部分。在一些实施例中，缀合部分包含多肽。在一些实施例中，另外的缀合部分包含多肽。在一些实施例中，多肽各自独立地包含XTEN肽、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白质(GLK)聚合物。在一些实施例中，分离纯化的IL-2多肽通过谷氨酰胺化修饰。在一些实施例中，缀合部分直接结合至分离纯化的IL-2多肽。在一些实施例中，缀合部分通过接头间接结合至分离纯化的IL-2多肽。在一些实施例中，接头包含同型双官能接头。在一些实施例中，同型双官能接头包含罗曼特氏试剂(Lomant's reagent)二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3′3′-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、糖基双(琥珀酰亚胺基丁二酸)亚乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、二亚胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亚胺酸二甲酯(DMP)、辛二亚胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代双丙酰亚胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3′-(2′-吡啶基二硫基)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含有芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N′-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施例中，接头包含异型双官能接头。在一些实施例中，异型双官能接头包含3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(sIAB)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、碘乙酸对硝苯酯(NPIA)、羰基反应性及硫氢基反应性交联剂，例如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮水杨基酰胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮水杨基酰胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基丁二酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-叠氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sADP)、4-(对叠氮苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸对硝苯酯(ρNPDP)、对硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮苯基乙二醛(APG)。在一些实施例中，接头包含可裂解接头，可选地包含二肽接头。在一些实施例中，二肽接头包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施例中，接头包含不可裂解接头。在一些实施例中，接头包含顺丁烯二酰亚胺基，可选地包含顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施例中，接头进一步包含间隔子。在一些实施例中，间隔子包含对氨基苯甲基醇(PAB)、对氨基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施例中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施例中，另外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为本文所述的任一种IL-2形式的片段。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为如美国专利申请公开号US2020/0181220 A1及美国专利申请公开号US 2020/0330601A1中所公开地聚乙二醇化。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQID NO：5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO：5的一个残基的N末端缺失。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链接合，但保持与中间亲和力IL-2Rβ-γ信号复合物的正常结合。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。
在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式的奈瓦纽金α(也称为ALKS-4230(SEQID NO：6)，其购自阿尔凯默斯公司(Alkermes,Inc.))。奈瓦纽金α也被称为人白介素2片段(1-59)变体(Cys125>Ser51)，其通过肽基接头(60GG61)融合至人白介素2片段(62-132)，其通过肽基接头(133GSGGGS138)融合至人白介素2受体α链片段(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，经糖基化；人白介素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125(51)>Ser]-突变体(1-59)，其通过G2肽接头(60-61)融合至人白介素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且通过GSG3S肽接头(133-138)融合至人白介素2受体α链(IL2R亚基α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖型α。奈瓦纽金α的氨基酸序列以SEQ ID NO：6给出。在一些实施例中，奈瓦纽金α具有以下翻译后修饰：在以下位置处的双硫桥键：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO：6中的编号)，及使用SEQ ID NO：6中的编号在位置N187、N206、T212处的糖基化位点。奈瓦纽金α的制备及特性以及适用于本发明的IL-2的另外替代形式描述于美国专利申请公开号US2021/0038684A1及美国专利号10,183,979中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为与SEQ ID NO：6具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含SEQID NO：7的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物的融合蛋白。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含与SEQ ID NO：7的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。适合用于本发明的其他IL-2形式描述于美国专利号10,183,979中，其公开内容以引用的方式并入本文中。可选地，在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含第一融合伴侣的融合蛋白，第一融合伴侣通过粘蛋白结构域多肽接头与第二融合伴侣连接，其中，第一融合伴侣为IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％氨基酸序列同一性且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性的蛋白质，第二融合伴侣包含全部或部分包含Fc区的免疫球蛋白，其中，该粘蛋白结构域多肽接头包含SEQ ID NO：8或与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，融合蛋白的半衰期与第一融合伴侣在没有粘蛋白结构域多肽接头的情况下与第二融合伴侣的融合相比有所改良。
表2：白介素的氨基酸序列
在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子移植蛋白质，该抗体细胞因子移植蛋白质包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该抗体细胞因子移植蛋白质优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，IL-2方案包括施用美国专利申请公开号US2020/0270334 A1中所描述的抗体，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中；其中，IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞，该抗体进一步包含IgG类重链及IgG类轻链，其选自如下：包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链及包含SEQ ID NO：38的IgG类重链；包含SEQ ID NO：37的IgG类轻链及包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链及包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；以及包含SEQ ID NO：37的IgG类轻链及包含SEQ ID NO：38的IgG类重链。
在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N末端区域处或附近，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会将CDR序列框移。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N末端区域处，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列或整个CDR序列的一或两个氨基酸。
在一些实施例中，IL-2分子直接移植至无肽接头的CDR中，CDR序列与IL-2序列之间没有另外的氨基酸。在一些实施例中，IL-2分子间接移植至具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个以上另外的氨基酸。
在一些实施例中，本文所述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施例中，IL-2突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：14或SEQID NO：15。在一些实施例中，IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开号US 2020/0270334A1中表1中的氨基酸序列，该公开的公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：25的HCDR1。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16的HCDR1。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自如下的HCDR1：选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：23及SEQ ID NO：26的HCDR2。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：27的HCDR3。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含轻链，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；以及VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链区，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链区，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链区，其包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链区，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含美国专利申请公开号2020/0270334A1的IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其变体、衍生物或片段，或其保守氨基酸取代，或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白具有如表3中所述的序列。
表3：示例性帕利珠单抗抗体-IL-2移植蛋白的序列
术语“IL-4”(在本文中也称“IL4”)指被称为白介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞及嗜酸性细胞、嗜碱性细胞及肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2T细胞。Steinke及Borish，《呼吸研究(Respir.Res.)》2001,2,66-70。在由IL-4活化后，Th2T细胞随后以正反馈回路产生另外IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖及II类MHC表达，诱导来自B细胞的类别转换为IgE及IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)及美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Inc.)(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列于表2中给出(SEQID NO：9)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白介素7的糖基化的组织衍生性细胞因子，其可获自基质及上皮细胞以及树突状细胞。Fry及Mackall，《血液(Blood)》2002，99，3892-904。IL-7可刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α及共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育及在外周内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)及美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：10)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人及哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-15描述于例如Fehniger及Caligiuri的《血液》2001,97,14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共用β及γ信号受体亚基。重组人IL-15为分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(及N末端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)及美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：11)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白介素-21的多效性细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人及哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-21描述于例如Spolski及Leonard，《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug.Disc.)》2014,13,379-95，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-21主要通过自然杀伤T细胞及经活化之人CD4+ T细胞产生。重组人IL-21为分子质量为15.4kDa的含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)及美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：12)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明的组合物待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度及病状的个体差异来确定。通常说明本文所述的包含肿瘤浸润性淋巴细胞(例如继代TIL或遗传修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/kg体重(例如，105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/kg体重)的剂量施用，包括在那些范围内的所有整数值。TIL(在一些情况下包括经遗传修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以这些剂量多次施用。TIL(在一些情况下包括经基因工程改造的TIL)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术进行施用(参见例如Rosenberg等人，《新英格兰医学杂志》1988,319,1676)。特定患者的最佳剂量及治疗方案可容易地由所属医药领域中具有通常知识者通过监测患者的疾病病症且相应地调整治疗来确定。
术语“造血系统恶性肿瘤”、“造血系统恶性病”或相关意义的术语指哺乳动物造血及淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结及淋巴系统之组织)的癌症及肿瘤。造血系统恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。造血系统恶性肿瘤包括(但不限于)急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。术语“B细胞恶性血液病”指影响B细胞的造血系统恶性肿瘤。
术语“液体肿瘤”指性质上为流体的异常细胞团块。液体肿瘤癌症包括(但不限于)白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他造血系统恶性肿瘤。获自液体肿瘤的TIL在本文中也可称为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤(包括在外周血中循环的液体肿瘤)的TIL在本文中也可称为PBL。术语MIL、TIL及PBL在本文中可互换使用且仅基于衍生细胞的组织类型而有所不同。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境指以下的复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长及侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号分子、细胞外基质及机械信号”，如Swartz等人，《癌症研究(Cancer Res.)》,2012,72,2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一些实施例中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中，患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，可提供TIL群体，其中，患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27及26天)及氟达拉滨25mg/m2/天持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施例中，在根据本发明的非骨髓清除式化疗及TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗尽通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施例在引入本发明的TIL之前，在患者身上采用淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
术语“有效量”或“治疗有效量”指如本文所述的化合物或化合物组合的量，其足以实现所预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可视预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者及疾病病状(例如，受试者的体重、年龄及性别)、疾病病状的严重程度或施用方式而变化。该术语也适用于将诱发目标细胞中的特定反应(例如血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将视以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间、其所施用的组织及其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗”、“医治”、“处理”及其类似术语指获得所要的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、尤其人的疾病的任何治疗，包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断出患有该疾病的受试者中出现该疾病；(b)抑制疾病，也即遏制其发展或进展；以及(c)缓解疾病，也即促使疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”也意在涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或病状的情况下也如此。举例而言，“治疗”涵盖可在不存在疾病病状的情况下(例如在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。举例而言，通常以重组方式产生核酸，其具有两个以上来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子及来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白表示蛋白质包含两个以上在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”、“同一性百分比”及“序列同一性百分比”(或其同义词，例如“99％同一性”)指两个以上序列或子序列在进行比较及比对(视需要引入间隔)以达到最大对应性且不将任何保守氨基酸取代视为序列同一性的部分时，该两个以上序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。所属领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法及软件。用以确定序列同一性百分比的适合的程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站的BLAST套装程序。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可购自DNASTAR)是另外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件来确定用于最大比对的适当参数。在某些实施例中，使用比对软件的预设参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖(但不限于)包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个以上取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体也包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1及Th17 CD4+ T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞及M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL及继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所述的获自患者组织样本的细胞(有时称为“新鲜收集”)，“继代TIL”是任何如本文所述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)主体TIL及经扩增的TIL(“REP TIL”)以及“reREP TIL”)。reREP TIL可包括例如第二扩增TIL或第二另外扩增TIL(例如于图8的步骤D中描述的TIL，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标记物)或功能性(根据其浸润肿瘤及实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种以上分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。TIL可进一步通过效力表征-例如，若例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可视为强效的。若例如干扰素(IFNγ)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，则TIL可视为强效的。
术语“脱氧核糖核苷酸”包涵天然的及合成的、未经修饰的及经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸之间的连接。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA)以及通过添加、缺失、取代和/或改变一种以上核苷酸而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文所述的RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意在包括任何及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途为本领域所熟知。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗组合物中的用途。诸如其他药物的额外活性药物成分也可并入所描述的组合物及方法中。
术语“约”或“大约”指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在给定值或范围的一个数量级内，优选50％内，更优选20％内，再更优选10％内，甚至更优选5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差值取决于研究下的特定系统，可由所属领域中具有通常知识者容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”及“大约”指尺寸、大小、制剂、参数、形状及其他数量及特征并不精确且不需要精确，而可以视需要为近似值和/或更大或更小，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域的技术人员已知的其他因素。一般而言，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征皆为“约”或“大约”的。应注意，大小、形状及尺寸非常不同的实施例可采用所描述的设置。
当以原始及修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包含”、“基本上由…组成”及“由…组成”相对于未叙述的另外的权利要求要素或步骤(若存在)被排除在权利要求范围之外来定义权利要求范围。术语“包含”意在为包括性的或开放性的，不排除任何另外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”不包括除申请专利范围中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，在后一情况中排除与指定材料一般相关的杂质。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限于所指定要素、步骤或材料及基本上不影响所主张发明的基础及新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施例中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法及套件可由任何过渡术语“包含”、“基本上由…组成”及“由…组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式“抗体(antibodies)”指完整的免疫球蛋白及任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”进一步指包含通过二硫键连接的至少两个重(H)链及两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)及重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2及CH3)构成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)及轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。抗体的VH及VL区可进一步细分成高变区，其称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，其可穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH及VL由自氨基端至羧基端按以下顺序排列之三个CDR及四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区含有与一个以上抗原表位相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合于宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”指诱导免疫反应的物质。在一些实施例中，若通过主要组织相容复合物(MHC)分子呈递，则抗原为能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也包涵T细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别。在一些实施例中，抗原能够诱导使得B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，这可能需要抗原含有或连接至Th细胞表位。抗原也可具有一个以上表位(例如B表位及T表位)。在一些实施例中，抗原优选将通常以高度特异性且选择性方式与其对应抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识及技术制得，即向测试受试者注射适合抗原，接着分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至编码单克隆抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离及测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。DNA一经分离，则可置放于表达载体中，接着转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中达成单克隆抗体的合成。抗体的重组产生将在下文更详细地描述。
如本文所用，术语抗体(或简言之“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指保持特异性结合至抗原之能力的抗体的一个以上片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一个二价片段，包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)结构域抗体(dAb)片段(Ward等人，《自然(Nature)》,1989,341,544-546),其可能由一个VH或一个VL结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)经独立基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，该合成接头能够将其制造成VL与VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(被称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人，《科学(Science)》1988,242,423-426；以及Huston等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1988,85,5879-5883)。此类scFv抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，以与完整抗体相同的方式来筛选供使用的片段。在一些实施例中，scFv蛋白结构域包含VH部分及VL部分。若VL结构域为scFv分子的N末端部分，则scFv分子表示为VL-L-VH，或若VH结构域为scFv分子的N末端部分，则表示为VH-L-VL。用于制得scFv分子及设计适合的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；R.Raag及M.Whitlow，Single Chain Fvs.，《美国实验生物学学会联合会(FASEB)》，9:73-80(1995)；以及R.E.Bird及B.W.Walker，Single Chain AntibodyVariable Region,《生物技术趋势(TIBTECH)》,9:132-137(1991)中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
如本文中所使用，术语“人抗体”意在包括具有其中框架区及CDR区皆来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。另外，若抗体含有恒定区，则该恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人抗体”并不意在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的呈现单一结合特异性的抗体，在可变区中框架与CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一些实施例中，人单克隆抗体系由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因及轻链转基因的基因组。
如本文中所使用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部人抗体，该人抗体例如(a)自对于人免疫球蛋白基因而言转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)自经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组、组合人抗体库分离的抗体；以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有框架区及CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体可进行体外突变(或当使用人Ig序列的转基因动物时，为体内体细胞突变)，因此重组抗体的VH及VL区的氨基酸序列为虽然来源于人种系VH及VL序列且与其相关，但体内可不天然存在于人抗体种系谱系内的序列。
如本文所用，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”及“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何经修饰形式，包括抗体与另一活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”指与另一治疗部分缀合的抗体或其片段，该治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文所述的抗体缀合。
术语“人源化抗体”、“人源化的抗体”及“人源化”意在指其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。在人框架序列中可作出其他框架区修饰。非人(例如鼠)抗体之人源化形式为含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自受体的高变区的残基经来自例如具有所需特异性、亲和力及能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的15个高变区之残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基置换为相应非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体效能。一般而言，人源化抗体将包含基本全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中，全部或基本全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，全部或基本全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体可选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人,《自然》1986,321,522-525；Riechmann等人,《自然》1988,332,323-329；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》1992,2,593-596。本文所述的抗体也可经修饰以采用已知赋予效应功能和/或FcR结合改良(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如以下所公开的氨基酸取代中的任一者：国际专利申请公开号WO 1988/07089A1、WO 1996/14339 A1、WO 1998/05787 A1、WO 1998/23289 A1、WO 1999/51642 A1、WO 99/58572 A1、WO 2000/09560 A2、WO 2000/32767 A1、WO 2000/42072 A2、WO 2002/44215 A2、WO 2002/060919 A2、WO 2003/074569 A2、WO 2004/016750 A2、WO 2004/029207 A2、WO2004/035752 A2、WO 2004/063351 A2、WO 2004/074455 A2、WO 2004/099249 A2、WO 2005/040217 A2、WO 2005/070963 A1、WO 2005/077981 A2、WO 2005/092925 A2、WO 2005/123780 A2、WO 2006/019447 A1、WO 2006/047350 A2及WO 2006/085967 A2；以及美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253及7,083,784；其公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“嵌合抗体”指可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
“双功能抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。片段包含重链可变结构域(VH)，其连接至相同多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变结构域(VL)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双功能抗体更充分地描述于例如欧洲专利号EP 404,097，国际专利公开号WO 93/11161；以及Bolliger等人,《美国国家科学院院刊》1993,90,6444-6448。
术语“糖基化”指抗体的经修饰的衍生物。非糖基化抗体缺乏糖基化。糖基化可经改变以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个以上糖基化位点来完成。举例而言，可进行一个以上氨基酸取代，以消除一个以上可变区框架糖基化位点，由此消除该位点的糖基化。去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力，如美国专利号5,714,350及6,350,861中所描述。另外地或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。此类经改变的糖基化模式已证明会提高抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例而言，细胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得表达于Ms704、Ms705及Ms709细胞系中的抗体缺乏在其碳水化合物上的岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8-/-细胞系通过使用两种置换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向断裂而形成(参见美国专利公开号2004/0110704或Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》,2004,87,614-622)。作为另一实例，欧洲专利号EP 1,176,195描述一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而展现出低岩藻糖基化，也描述如下细胞系，该细胞系具有用于将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如细胞系为大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开号WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec 13细胞，其具有将岩藻糖附接至Asn(297)-连接的碳水化合物的降低能力，也导致表达于宿主细胞中的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2002,277,26733-26740。国际专利公开号WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程改造的细胞系内所表达的抗体展现出增加的平分型GlcNac结构，从而提高抗体的ADCC活性(也参见Umana等人,《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》1999,17,176-180)。可替代地，抗体的岩藻糖残基可使用岩藻糖苷酶裂解开。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中移除岩藻糖基残基，如描述于Tarentino等人,《生物化学(Biochem.)》1975,14,5516-5523中。
“聚乙二醇化”指经修饰的抗体或其片段，其通常在一个以上PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。例如，聚乙二醇化可增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意在涵盖已用于衍生其他蛋白质的PEG形式中的任一者，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体为去糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的且可应用于本发明的抗体，如在欧洲专利号EP 0154316及欧洲专利号EP 0401384及美国专利号5,824,778中描述的，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“生物类似物”指一种生物产品，包括单克隆抗体或蛋白质，与美国许可参考生物产品高度相似，尽管临床非活性组分的差异很小，就产品的安全性、纯度及效能而言，生物产品及参考产品之间无临床意义的差异。此外，类似生物或“生物类似物”是一种与已被欧洲药物管理局授权使用的另一生物药物相似的生物药物。术语“生物类似物”也与其他国家及地区监管机构同义地使用。生物产品或生物药物是由生物来源(例如细菌或酵母)制成或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人胰岛素或红细胞生成素)或复杂分子(例如单克隆抗体)组成。举例而言，若参考IL-2蛋白为阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构批准的参考阿地白介素的蛋白质为阿地白介素的“生物类似物”或为阿地白介素“其生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似物”是一种与已被欧洲药物管理局(EMA)授权使用的另一生物药物相似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条及指令2001/83/EC第10(4)条，经修订且因此在欧洲，生物类似物是可根据法规(EC)第726/2004号第6条及指令2001/83/EC第10(4)条进行授权、批准的授权或授权申请的对象。经授权的原始生物药物产品在欧洲可被称为”参考药品”。CHMP关于类似生物药物产品的指南中概述了产品被视为是生物类似物的一些要求。此外，产品特定指南，包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南，由EMA逐项产品提供，且发布在其网站上。如本文所述的生物类似物可借助于品质特性、生物活性、作用机制、安全概况和/或功效与参考药品类似。另外，生物类似物可使用或意在用于治疗与参考药品相同的病况。因此，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的品质特征。替代地或另外，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的生物活性。替代地或另外，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的安全概况。替代地或另外，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的功效。如本文所述，欧洲生物类似物与已由EMA授权之参考药品相比较。然而，在一些情况下，生物类似物可与在某些研究中在欧洲经济区以外获得授权的生物学药物产品(非EEA授权的“比较物”)相比较。此类研究包括例如某些临床及体内非临床研究。如本文所用，术语“生物类似物”也关于已经授权或可与非经EEA授权的比较物比较的生物医药产品。某些生物类似物是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)及融合蛋白。蛋白质生物类似物可具有氨基酸序列，该氨基酸序列在氨基酸结构中具有少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)，其不显著影响多肽的功能。生物类似物可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％或更高序列同一性的氨基酸序列，例如97％、98％、99％或100％。生物类似物可包含一个以上翻译后修饰，例如但不限于糖基化、氧化、去酰胺和/或截短，其不同于参考药品的翻译后修饰，其限制条件为差异不会引起药物产品的安全性和/或功效变化。生物类似物可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特定地，虽然不排他性地，但若差异解决或意在解决与参考药品相关的安全问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外，生物类似物可在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈现方式等方面偏离参考药品，前提是药物产品的安全性及功效不受影响。相比于参考药品，生物类似物可包含例如药物动力学(PK)和/或药效动力学(PD)概况的差异，但仍视为与参考药品充分类似，从而待授权或视为适合于授权。在某些情况下，生物类似物展现出与参考药品相比不同的结合特征，其中，不同结合特征通过监管机构(例如EMA)认为不是作为类似生物产品获得授权的障碍。术语“生物类似物”也与其他国家及地区监管机构同义地使用。
II.Gen 2TIL制造过程
图1及图2中描绘一个示例性TIL程序系列，称为Gen 2(也被称作过程2A)，其含有这些特征中的一些。Gen 2的实施例如图2所示。
如本文所述，本发明可包括与冷冻保存的TIL的再刺激以增加其代谢活性且因此在移植至患者中之前相对健康相关的步骤，及测试该代谢健康的方法。如本文大体上概述，TIL一般获自患者样本且在移植至患者体内之前进行操作以扩增它们的数目。在一些实施例中，TIL可以可选地如下文所述经基因操作。
在一些实施例中，TIL可经冷冻保存。解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者中之前增加其代谢。
在一些实施例中，将第一扩增(包括称为预REP的过程以及图1中所示的作为步骤A的过程)缩短至3至14天，将第二扩增(包括称为REP的过程以及图1中所示的作为步骤B的过程)缩短至7至14天，如下文以及实例及图示中所详细论述。在一些实施例中，第一扩增(例如图1中步骤B描述的扩增)缩短为11天，第二扩增(例如图1中步骤D中描述的扩增)缩短为11天。在一些实施例中，第一扩增及第二扩增的组合(例如，在图1中描述为步骤B和步骤D的扩增)缩短至22天，如下文及实施例的图示中所详细讨论。
下文“步骤”标示A、B、C等参考图1且参考本文描述的某些实施例。以下步骤及图1中的步骤次序为示例性的，本申请及本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
一般而言，TIL最初获自患者肿瘤样本且随后扩增成用于如本文所述的进一步操作、可选地如本文所述的低温保存、再刺激，可选地评估作为TIL健康之指标的表型及代谢参数的更大群体。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，一般通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。在一些实施例中，使用多病灶取样。在一些实施例中，手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式包括多病灶取样(即，从患者中的一个以上肿瘤部位和/或位置以及在相同位置或紧密相邻的一个以上肿瘤处获得样本)。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可以是肺组织。在一些实施例中，适用的TIL获自非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤可以是皮肤组织。在一些实施例中，适用的TIL获自黑色素瘤。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，其中约2mm3至3mm3尤其适用。在一些实施例中，使用酶肿瘤消化物由这些碎片培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置放于酶培养基中且机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离及孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支化亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所述的任何实施例中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、弹性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(链蛋白酶(pronase))、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，及它们的任何组合。
在一些实施例中，解离酶由冻干酶重构。在一些实施例中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中重构。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施例中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中重构。在一些实施例中，在重构后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZU/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZU/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施例中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施例中，在重构后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施例中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施例中，在重构后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施例中，酶的储备液是可变的且可能需要确定浓度。在一些实施例中，可检验冻干储备液的浓度。在一些实施例中，添加至消化混合物中的酶的最终量基于所确定的储备液浓度进行调节。
在一些实施例中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μL中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)及250μL DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施例中，TIL衍生自实体肿瘤。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎且以完整肿瘤进行酶消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，完整肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施例中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施例中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施例中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施例中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施例中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施例中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施例中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mL DNA酶及1mg/mL玻尿酸酶。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mL DNA酶及1mg/mL玻尿酸酶。
一般地，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施例中，破碎为物理破碎。在一些实施例中，破碎为分割。在一些实施例中，破碎是通过消化。在一些实施例中，TIL最初可自酶肿瘤消化物培养，肿瘤碎片由消化或破碎获自患者的肿瘤样本获得。
在一些实施例中，在肿瘤是实体肿瘤时，肿瘤在例如步骤A(如图1中所提供)中获得肿瘤样本之后经历物理破碎。在一些实施例中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施例中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施例中，破碎在获得肿瘤之后且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施例中，将肿瘤破碎，将10、20、30、40个以上碎片或块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎且将30或40个碎片或块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎且将40个碎片或块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，多个碎片包含约4个至约50个碎片，各碎片的体积为约27mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施例中，多个碎片包含约4个碎片。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施例中，肿瘤为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施例中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施例中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施例中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施例中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。
在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上出血性组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上脂肪组织的量减至最小。
在一些实施例中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施例中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术有限公司的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，接着再次机械破坏大致1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，若在第三次机械破坏后大块组织仍存在，则可向样本施加1或2次另外机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，若在最终孵育结束时细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，将第一扩增步骤之前收集的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，细胞可以可选地在样本收集之后冷冻且在进入步骤B(其在下文进一步详细描述以及图1以及图8中所示例)中所描述的扩增之前冷冻储存。
1.胸腔积液T细胞及TIL
在一些实施例中，样本为胸膜液样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施例中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开号US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施例中，样本可衍生自来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液及胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部及肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔及腹腔中皆具有间皮细胞系及流体形式，在一些实施例中，此类流体含有TIL。在所公开的方法利用胸膜液的一些实施例中，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施例中，胸膜液呈未经处理的形式直接自患者移除。在一些实施例中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施例中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施例中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施例中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施例中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施例中，稀释度为1:10胸膜液对稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:9胸膜液对稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施例中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施例中，样本在自患者收集及稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在另外其他实施例中，在进一步处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施例中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或离心块再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施例中，对胸膜液样本进行多次离心及再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施例中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在进一步处理中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施例中，膜中的孔的直径可为至少4μm。在其他实施例中，孔径可为5μm以上，在其他实施例中，可为6μm、7μm、8μm、9μm或10μm中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的进一步处理步骤中。
在一些实施例中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞离心块与裂解试剂接触，该裂解试剂差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施例中，在胸膜液含有大量RBC之情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。适合的裂解试剂包括单一裂解试剂或裂解试剂及淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂及固定试剂。适合的裂解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司(BectonDickenson))。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.))或氯化铵系统。在一些实施例中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解及TIL的保守性及胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂用于裂解之外，适用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的效应的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视裂解试剂的选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施例中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
B.步骤B：第一扩增
在一些实施例中，本发明方法提供获得年轻TIL，其能够在向受试者/患者施用时提供增加的复制循环且因此可提供优于更老TIL(也即在向受试者/患者施用之前进一步经历更多轮复制的TIL)的额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》2012，75，157-167；Dudley等人，Clin.Cancer Res.)》2010，16，6122-6131；Huang等人，《免疫学杂志》2005，28，258-267；Besser等人，《临床癌症研究》2013，19，OF1-OF9；Besser等人，《免疫学杂志》2009，32:415-423；Robbins等人，《免疫学杂志》2004，173，7125-7130；Shen等人，《免疫学杂志》2007，30，123-129；Zhou等人，《免疫学杂志》2005，28，53-62；以及Tran等人，《免疫学杂志》2008，31，742-751，它们各自以引用的方式并入本文中。
T及B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)及C(恒定区)决定免疫球蛋白及T细胞受体(TCR)的结合特异性及下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图1中实施的方法以外的方法。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图5和/或图6中示例的称为过程1C的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第一扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ及δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图1的步骤A中所描述的肿瘤碎片的解剖或消化之后，所得细胞在含有IL-2的血清中在促进TIL生长超过肿瘤及其他细胞的条件下培养。在一些实施例中，在2mL孔中在包含具有6000IU/mL IL-2的灭活人AB血清的培养基中孵育肿瘤消化物。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常3至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养7至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养10至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养约11天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施例中，TIL的扩增可使用如下文及本文所述的初始主体TIL扩增步骤(例如图1的步骤B中所描述的那些，其可包括称为预REP的过程)进行，接着进行如下文步骤D及本文所述的第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行可选的冷冻保存，接着进行如下文及本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征及代谢参数进行表征。
在TIL培养在24孔板中起始的实施例中，例如，使用Costar 24孔细胞培养簇，平底(Corning Incorporated，Corning，NY，各孔可接种有1×106个肿瘤消化物细胞或一个含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.,Emeryville,CA)的2mL完全培养基(CM)中的肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes及10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI1640组成。在具有40mL容量及10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如，G-REX10；Wilson WolfManufacturing,New Brighton,MN)中起始培养的实施例中，各培养瓶装载有用10-40×106个活肿瘤消化物细胞或在10-40mL含IL-2的CM中之5-30个肿瘤碎片。G-REX10及24孔板均在37℃于5％CO2的湿气培养箱中培养，培养起始后5天，移除一半培养基且替换为新鲜的CM和IL-2，在之后第5天，每2-3天更换一半培养基。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基之批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇及2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(也即)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(也即)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开号WO/1998/030679中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素及一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物及一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施例的一些中，无血清补充剂包含下表4中的类型及标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
表4：非微量元素部分成分的浓度
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学(Clin Transl Immunology.)》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
制备肿瘤碎片之后，所得细胞(即碎片)在含有IL-2之血清中在促进TIL生长至肿瘤及其他细胞的条件下培养。在一些实施例中，将肿瘤消化物在包含灭活人AB血清(或在一些情况下，如本文所述，在APC细胞群体的存在下)与6000IU/mL的IL-2的培养基中的2mL孔中孵育。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常10至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，生长培养基在第一扩增期间包含IL-2或其变体。在一些实施例中，IL为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，IL-2储备液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有5至7×106IU/mgIL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备溶液如实例5中所述地制备。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施例中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，细胞培养基包含抗CD3激动剂抗体，例如OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL及约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间及50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2及初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施例中，CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes及10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量及10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)中开始培养的实施例中，各培养瓶装载有用10-40×106个活肿瘤消化物细胞或在10-40mL含IL-2的CM中的5-30个肿瘤碎片。G-REX10及24孔板均在37℃于5％CO2的湿气培养箱中培养，培养开始后5天，移除一半培养基且替换为新鲜的CM和IL-2，在之后第5天，每2-3天更换一半培养基。在一些实施例中，CM为实例中所描述的CM1，参见实例1。在一些实施例中，第一扩增发生于初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施例中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施例中，第一扩增(包括例如描述于图1的步骤B中的那些过程的过程，其可包括有时被称作预REP的那些过程)缩短至3-14天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，第一扩增(包括例如图1的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP的那些过程)缩短至7至14天，如实例中所述及图4及5中所示，以及包括例如图1的步骤B中所述的扩增。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短至10-14天。在一些实施例中，第一扩增缩短至11天，如例如图1的步骤B中所描述的扩增中所述。
在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及它们的任何组合可包括在第一扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤B过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合可包括在根据图1以及如本文所述的步骤B过程期间。
在一些实施例中，如实例及图示中所述，第一扩增(包括被称为预REP的过程；例如，根据图1的步骤B)过程被缩短至3至14天。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短至7至14天。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短至10至14天。在一些实施例中，第一扩增缩短至11天。
在一些实施例中，第一扩增，例如根据图1的步骤B，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子及其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来快速扩增和/或第二扩增TIL也是可能的，如美国专利申请公开号US2017/0107490 A1中所描述，使用两种以上IL-2、IL-15和IL-21的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2或IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加OX-40激动剂，如本文别处所描述。在其他实施例中，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开号US2019/0307796 A1中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
C.步骤C：第一扩增至第二扩增的转变
在一些情况下，自第一扩增获得的主体TIL群体，包括例如自例如图1中所示的步骤B获得的TIL群体，可使用下文所述的方案立即冷冻保存。或者，获自第一扩增(称为第二TIL群体)的TIL群体可经历第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增)，接着如下文所述冷冻保存。类似地，在经遗传修饰的TIL将用于疗法的情况下，第一TIL群体(有时称为主体TIL群体)或第二TIL群体(其在一些实施例中可包括称为REP TIL群体的群体)可在扩增之前或在第一扩增之后及在第二扩增之前进行遗传修饰以用于适合治疗。
在一些实施例中，储存获自第一扩增(例如，来自如图1中所指示的步骤B)的TIL直至经表型分型以供选择。在一些实施例中，获自第一扩增(例如，来自如图1中所指示的步骤B)的TIL未经储存且直接继续进行至第二扩增。在一些实施例中，获自第一扩增的TIL在第一扩增之后且在第二扩增之前不经冷冻保存。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约3天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约4天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约4天至约10天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约7天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后约14天发生。
在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后1天至14天发生。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后3天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后4天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后5天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后6天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后7天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后8天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后9天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后10天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后11天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后12天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后13天至14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后14天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后1天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后2天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后3天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后4天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后5天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后6天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后7天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后8天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后9天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后10天至11天发生。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎发生后11天发生。
在一些实施例中，TIL在第一扩增之后且在快速第二扩增之前不经储存，TIL直接进行第二扩增(例如在一些实施例中，在如图1中所示的步骤B至步骤D的转变期间不经储存)。在一些实施例中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施例中，来自第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二扩增而无转变期。
在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变(例如根据图1的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100生物反应器。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
D.步骤D：第二扩增
在一些实施例中，TIL细胞群体在收集及初始批量处理之后的数目扩增，例如在步骤A和步骤B之后，转变称为步骤C，如图1中所指示。此进一步扩增在本文中称为第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP)的扩增过程；以及如图1的步骤D中所指示的过程。第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源及抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。
在一些实施例中，第二扩增或第二TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约14天。
在一些实施例中，第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)进行。举例而言，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/ml OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体例如为人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原进行再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施例中，再刺激作为第二扩增的部分发生。在一些实施例中，第二扩增在经照射之自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL之间的IL-2。
在一些实施例中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL及约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间及50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2及初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及它们的任何组合可包括在第二扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤D过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合可包括在根据图1及如本文所述的步骤D过程期间。
在一些实施例中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施例中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施例中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1:50与1:300之间。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1:100与1:200之间。
在一些实施例中，REP和/或第二扩增在培养瓶中进行，其中，主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基替换(通常通过抽吸用新鲜培养基进行2/3培养基替换)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶及透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)缩短至7至14天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，第二扩增缩短至11天。
在一些实施例中，REP和/或第二扩增可以使用先前描述的T-175培养瓶及透气袋(Tran等人，《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2008,31,742-51；Dudley等人，《免疫疗法杂志》2003,26,332-42)或透气性培养器皿(G-REX培养瓶)进行。在一些实施例中，第二扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175培养瓶中进行，可将悬浮于150mL培养基中约1×106个TIL添加至各T-175培养瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2及30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物中培养。T-175培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育。可在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施例中，在第7天，可以将来自两个T-175培养瓶的细胞合并在3L袋中，将300mL AIM V与5％人AB血清及3000IU/mL IL-2添加至300mL TIL悬浮液中。每日或每两天计数各袋中的细胞数目，添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图1的步骤D中提及的那些扩增)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-REX-100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿市的威尔逊狼制造公司(Wilson Wolf ManufacturingCorporation))中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC在400mL的补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2及30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除，放入离心瓶中以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL离心块可用150mL具有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回原始G-REX-100培养瓶中。当TIL在G-REX-100培养瓶中连续扩增时，在第7天各G-REX-100中的TIL可悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，细胞悬浮液可分成可用于接种3个G-REX-100培养瓶的3个100mL等分试样。随后可将150mL具有5％人AB血清及3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育且在4天之后，可将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加至各G-REX-100培养瓶中。可在培养第14天收集细胞。
在一些实施例中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在培养瓶中进行，其中，将主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。在一些实施例中，替换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施例中，2/3的培养基被新鲜培养基的呼吸替换。在一些实施例中，替代生长箱室包括G-REX培养瓶及透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，进行第二扩增(包括被称为REP的扩增)，其进一步包含其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。举例而言，美国专利申请公开号2016/0010058A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，细胞存活率分析可在第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知标准分析进行。举例而言，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活性评定。在一些实施例中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算及确定存活性。在一些实施例中，存活性根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
在一些实施例中，TIL的第二扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所描述的T-175培养瓶及透气袋(Tran等人，2008,《免疫疗法杂志》,31,742-751，及Dudley等人，2003,《免疫疗法杂志》,26,332-342)或透气G-REX培养瓶进行。在一些实施例中，使用培养瓶进行第二扩增。在一些实施例中，使用透气G-REX培养瓶进行第二扩增。在一些实施例中，第二扩增在T-175培养瓶中进行，将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中，将其添加至各T-175培养瓶中。TIL与作为“喂养”细胞的经照射(50Gy)同种异体PBMC以1:100的比率一起培养，细胞在补充有3000IU/mL IL-2及30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养。T-175培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育。在一些实施例中，在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施例中，在第7天，来自2个T-175培养瓶的细胞在3L袋中合并，将具有5％人AB血清及3000IU/mL IL-2的300mL AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可每日或每两天计数各袋中的细胞数目，可添加新鲜培养基以使细胞计数保持在约0.5与约2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施例中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在500mL培养瓶中进行，该培养瓶具有100cm2透气硅底(G-REX-100，Wilson Wolf)，约5×106或10×106个TIL与经照射的同种异体PBMC以1:100的比率在400mL 50/50培养基中培养，其中补充有3000IU/mL IL-2及30ng/mL抗CD3。G-REX-100培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育。在一些实施例中，在第5天，将250mL上清液移除且放入离心瓶中以1500rpm(491g)离心10分钟。TIL离心块可随后用具有3000IU/mL IL-2的150mL新鲜50/50培养基再悬浮且添加回原始G-REX-100培养瓶中。在TIL在G-REX-100培养瓶中连续扩增的实施例中，在第7天将各G-REX-100中的TIL悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，将细胞悬浮液分成可用于接种3个G-REX-100培养瓶的三个100mL等分试样。随后将150mL具有5％人AB血清及3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。G-REX-100培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育且在4天之后，将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加至各G-REX-100培养瓶中。在培养的第14天收集细胞。
T及B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)及C(恒定区)决定免疫球蛋白及T细胞受体(TCR)的结合特异性及下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ及δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施例中，第二扩增培养基(例如有时被称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇及2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(即)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开号WO/1998/030679中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素及一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物及一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基之优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表4中的类型及标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学(Clin Transl Immunology.)》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，第二扩增，例如根据图1的步骤D，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大(scale up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；接着(b)实现将小规模培养中的TIL转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大(scale out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的TIL部分于第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分成多个步骤之前将快速扩增或第二扩增进行约3至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增或第二扩增之分流发生在快速扩增或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的分流发生在第一扩增(即预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天。在一个示例性实施例中，快速扩增或第二扩增的分流发生在第一扩增开始后约第16天。
在一些实施例中，在分流之后，快速扩增或第二扩增进一步进行约7至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速扩增或第二扩增进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2及可选的OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2及可选的OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，快速扩增的分流发生在密闭系统中。
在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增期间规模纵向扩大TIL培养物包括向TIL培养物添加新鲜细胞培养基(也称为喂养TIL)。在一些实施例中，喂养包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施例中，喂养包括以规则时间间隔将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施例中，新鲜细胞培养基通过恒定流动供应至TIL。在一些实施例中，例如Xuri W25的自动细胞扩增系统用于快速扩增及喂养。
1.饲养细胞及抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序(例如包括例如图1的步骤D中所描述的扩增以及称为REP的那些扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天及第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增之起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天及第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增之起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体及1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体及2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体及2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体及2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:50与1:300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:100与1:200之间。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约25×106个TIL的比率。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序在第二扩增期间需要过量饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示及实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子及其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来快速扩增和/或第二扩增TIL也是可能的，如美国专利申请公开号US2017/0107490 A1中所描述，使用两种以上IL-2、IL-15和IL-21的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基添加OX-40激动剂，如本文别处所描述。此外，可在步骤D期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如美国专利申请公开号US2019/0307796 A1中所述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
E.步骤E：收集TIL
在第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施例中，在例如图1中所提供的一个、二个、三个、四个以上扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在两个扩增步骤之后收集TIL，例如如图1中所提供。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施例中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)及InotechBiosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施例中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动及细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施例中，收集(例如根据图1的步骤E)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX 10或G-REX 100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施例中，根据图1的步骤E根据本文所述的过程进行。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性及密闭性质。在一些实施例中，采用如实例中所描述的密闭系统。
在一些实施例中，根据实例中所描述的方法收集TIL。在一些实施例中，第1天及第11天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如在实例中的第11天收集TIL。在一些实施例中，第12及第24天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如在实例中的第22天收集TIL。在一些实施例中，第12及第22天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如在实例中的第22天收集TIL。
F.步骤F：最终配制及转移至输注容器
在如图1中以示例性次序提供且如上文及本文中所详细概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施例中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，将其转移至容器以用于向患者施用。
在一些实施例中，使用本公开的APC扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内及淋巴管内施用。
III.Gen 3TIL制造过程
在不受任何特定理论限制的情况下，认为如本发明方法中所描述的启动T细胞活化的起始第一扩增及随后的加强T细胞活化的快速第二扩增，允许制备保留“较年轻”表型的经扩增T细胞，因此预期本发明的经扩增T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞展现较高细胞毒性。特别是，认为如本发明方法所教导的通过暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2及可选的抗原呈递细胞(APC)来启动T细胞的活化，接着通过后续暴露于另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2及APC来加强，其限制或避免培养基中T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群体，该T细胞因培养扩增而耗竭较少且对癌细胞展现较高细胞毒性。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自第一小规模培养中的T细胞转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相同的第二容器中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分于第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养中的T细胞转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养中的T细胞转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施例中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分成多个步骤之前将快速扩增进行约1至5天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的分流发生在快速扩增开始后约第1天、第2天、第3天、第4天或第5天。
在一些实施例中，快速扩增的分流发生在第一扩增(即预REP扩增)开始后约第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天。在一个示例性实施例中，快速扩增之分流发生在起始第一扩增开始后约第10天。在另一示例性实施例中，快速扩增的分流发生在起始第一扩增开始后约第11天。
在一些实施例中，在分流之后，快速二扩增进一步进行约4至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速扩增进一步进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，分流后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2及可选的OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2及可选的OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流后用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，快速扩增的分流发生在密闭系统中。
在一些实施例中，在快速扩增期间规模纵向扩大TIL培养物包括向TIL培养物添加新鲜细胞培养基(也称为喂养TIL)。在一些实施例中，喂养包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施例中，喂养包括以规则时间间隔将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施例中，新鲜细胞培养基通过恒定流动供应至TIL。在一些实施例中，诸如Xuri W25的自动细胞扩增系统用于快速扩增及喂养。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增所实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低刚好或约(at or about)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增所实现的T细胞活化已降低刚好或约1％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低刚好或约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低在至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低至多刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施例中，通过起始第一扩增实现的T细胞活化的降低通过T细胞响应于抗原刺激而释放的干扰素γ的量的减少来确定。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约7天或约8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行刚好或约1天至刚好或约7天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行刚好或约1天至刚好或约11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行刚好或约1天至刚好或约8天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行刚好或约1天至刚好或约9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行8天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行刚好或约1天至刚好或约7天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行刚好或约1天至刚好或约9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行7天的时间段，T细胞的快速第二扩增进行9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施例中，T细胞为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。
在一些实施例中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施例中，T细胞获自患有癌症的供体。
在一些实施例中，T细胞为获自患有癌症的患者所切除的肿瘤的TIL。
在一些实施例中，T细胞为获自患有造血系统恶性肿瘤的患者的骨髓的MIL。
在一些实施例中，T细胞为获自供体的外周血单核细胞(PBMC)的PBL。在一些实施例中，供体患有癌症。在一些实施例中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌及肾细胞癌。在一些实施例中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌及肾细胞癌。在一些实施例中，供体患有肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施例中，供体患有造血系统恶性肿瘤。
在本公开的某些方面中，免疫效应细胞(例如T细胞)可使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLL分离)自收集自受试者的血液单元获得。在一个优选方面中，通过单采获得来自受试者的循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞及血小板。在一个方面中，通过单采收集的细胞可经洗涤以移除血浆部分，可选地将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一替代实施例中，洗涤溶液缺乏钙，可能缺乏镁或可能缺乏许多(若并非全部)二价阳离子。在一个方面中，通过溶解红细胞及例如通过PERCOLL梯度离心或通过逆流离心洗脱耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一些实施例中，T细胞为自供体的全血或富含淋巴细胞的单采产物分离的PBL。在一些实施例中，供体患有癌症。在一些实施例中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌及肾细胞癌。在一些实施例中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌及肾细胞癌。在一些实施例中，供体患有肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施例中，供体患有造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，PBL通过使用正向或负向选择方法从全血或富含淋巴细胞的单采产物分离，即使用T细胞表型标记物(例如CD3+CD45+)移除PBL，或移除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施例中，PBL通过梯度离心分离。在从供体组织分离PBL后，PBL的起始第一扩增可根据本文所述的任何方法的起始第一扩增步骤，通过将适合数目的经分离PBL(在一些实施例中，约1×107个PBL)接种在起始第一扩增培养物中来开始。
含有这些特征中的一些的称为过程3(在本文中也称作Gen 3)的示例性TIL过程描绘于图8(特别是例如图8B和/或图8C和/或图8D)中，本发明的此实施例在Gen2中的一些优势描述于图1、图2、图8、图30及图31(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中。Gen 3的实施例显示于图1、图8及图30(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中。过程2A或Gen 2或Gen 2A也描述于美国专利公开号2018/0280436中，其以全文引用的方式并入本文中。Gen 3过程也描述于国际专利公开号2020/096988中。
如本文中所述及大体上概述，TIL取自患者样本，使用本文所述且称为Gen 3的TIL扩增过程操作以在移植至患者中之前扩增其数目。在一些实施例中，TIL可以可选地如下文所述经基因操作。在一些实施例中，TIL可在扩增之前或之后冷冻保存。解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者中之前增加其代谢。
在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如以下及实例及图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤D的过程)缩短为1至8天，如以下及实例及图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤B的过程)缩短为1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如以下及实例及图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图1B和/或图8C)中示为步骤B的过程)为1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中示为步骤D的过程)为1至10天，如以下及实例及图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为8至9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为7至8天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为8天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为7至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为8至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为9至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，快速第二扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施例中，起始第一扩增及快速第二扩增(例如，在图8(特别是例如图1B和/或图8C)中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合为14至16天，如以下及实例及图示中所详细论述。特别是，认为本发明的某些实施例包含起始第一扩增步骤，其中，TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原而活化。在某些实施例中，在如上文所描述的起始第一扩增步骤中活化的TIL为第一TIL群体，即，其为初代细胞群体。
以下的“步骤”标识A、B、C等参考图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的非限制性实例且参考本文所述的某些非限制性实施例。以下及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中的步骤次序为示例性的，本申请及本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步驟A：获得患者肿瘤样本
一般而言，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)或获自循环淋巴细胞(例如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞)，接着扩增成较大群体以进行如本文所述的进一步操作，可选地经冷冻保存且可选地评估表型及代谢参数作为TIL健康的指标。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，一般通过手术切除、针吸活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可为任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰脏癌、前列腺癌、大肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌及皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤)。在一些实施例中，癌症选自子宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰脏癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌及非小细胞肺癌。在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，适用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高含量的TIL。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，约2mm3至3mm3尤其适用。TIL由这些碎片使用酶肿瘤消化物培养。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置放于酶培养基中且机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离及孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用FICOLL支化亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所述的任何实施例中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，及它们的任何组合。
在一些实施例中，解离酶由冻干酶重构。在一些实施例中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中重构。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10ml无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施例中，胶原蛋白酶在5ml至15ml缓冲液中重构。在一些实施例中，在重构后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZU/ml至约400PZ U/ml，例如，约100PZ U/ml至约400PZ U/ml、约100PZ U/ml至约350PZ U/ml、约100PZ U/ml至约300PZ U/ml、约150PZ U/ml至约400PZ U/ml、约100PZ U/ml、约150PZU/ml、约200PZ U/ml、约210PZ U/ml、约220PZ U/ml、约230PZ U/ml、约240PZ U/ml、约250PZU/ml、约260PZ U/ml、约270PZ U/ml、约280PZ U/ml、约289.2PZ U/ml、约300PZ U/ml、约350PZ U/ml或约400PZ U/ml。
在一些实施例中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。冻干储备酶的浓度可为175DMC/mL。在一些实施例中，在重构后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/ml至约400DMC/ml，例如，约100DMC/ml至约400DMC/ml、约100DMC/ml至约350DMC/ml、约100DMC/ml至约300DMC/ml、约150DMC/ml至约400DMC/ml、约100DMC/ml、约110DMC/ml、约120DMC/ml、约130DMC/ml、约140DMC/ml、约150DMC/ml、约160DMC/ml、约170DMC/ml、约175DMC/ml、约180DMC/ml、约190DMC/ml、约200DMC/ml、约250DMC/ml、约300DMC/ml、约350DMC/ml或约400DMC/ml。
在一些实施例中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施例中，在重构后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/ml至10KU/ml，例如约1KU/ml、约2KU/ml、约3KU/ml、约4KU/ml、约5KU/ml、约6KU/ml、约7KU/ml、约8KU/ml、约9KU/ml或约10KU/ml。
在一些实施例中，酶储备液会发生变化，因此验证冻干储备液的浓度，并相应地修改添加至消化混合物中的酶的最终量。
在一些实施例中，酶混合物包含约4.7ml无菌HBSS中的约10.2ul中性蛋白酶(0.36DMC U/ml)、21.3ul胶原蛋白酶(1.2PZ/ml)及250ul DNA酶I(200U/ml)。
如上文所指出，在一些实施例中，TIL衍生自实体肿瘤。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎且以完整肿瘤进行酶消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶及玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施例中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施例中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施例中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施例中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施例中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施例中，DNA酶法人工作储备液为10,000IU/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施例中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mL DNA酶及1mg/mL玻尿酸酶。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mL DNA酶及1mg/mL玻尿酸酶。
一般而言，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施例中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施例中，破碎为物理破碎。在一些实施例中，破碎为分割。在一些实施例中，破碎通过消化。在一些实施例中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物及肿瘤碎片培养。在一些实施例中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物及肿瘤碎片培养。
在一些实施例中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所提供)中获得肿瘤样本之后，肿瘤进行物理破碎。在一些实施例中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施例中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施例中，破碎在获得肿瘤之后且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施例中，破碎步骤是体外或离体过程。在一些实施例中，将肿瘤破碎且将10、20、30、40以上碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎且将30或40个碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎且将40个碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，多个碎片包含约4个至约50个碎片，各碎片之体积为约27mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施例中，多个碎片包含约4个碎片。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为1至4mm×1至4mm×1至4mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为1mm×1mm×1mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为2mm×2mm×2mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为3mm×3mm×3mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为4mm×4mm×4mm。
在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上出血性组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上脂肪组织的量减至最小。在某些实施例中，肿瘤破碎步骤是体外或离体方法。
在一些实施例中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施例中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术有限公司的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，其接着再次机械破坏大致1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，若在第三次机械破坏后大块组织仍存在，则可向样本施加1或2次另外机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，若在最终孵育结束时细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行Ficoll密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，将起始第一扩增步骤之前的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。
在一些实施例中，细胞可以可选地在样本分离之后(例如在获得肿瘤样本后和/或在自肿瘤样本获得细胞悬浮液后)冷冻，在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，步骤B进一步详细描述于下文且示例于图8(特别是例如图8B)中。
1.粗针/小活体组织切片衍生的TIL
在一些实施例中，TIL最初获自通过粗针活体组织切片或类似程序获得的患者肿瘤样本(“初代TIL”)且随后扩增成较大群体以进行如本文所述的进一步操作，可选地经冷冻保存且可选地评估表型及代谢参数。
在一些实施例中，患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，一般通过小活体组织切片、粗针活体组织切片、针吸活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。在一些实施例中，样本可来自多个小肿瘤样本或活体组织切片。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的单一肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的一个、两个、三个或四个肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的多个肿瘤的多个肿瘤样本。实体肿瘤可以为肺癌和/或非小细胞肺癌(NSCLC)。
一般而言，获自肿瘤核心或碎片的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施例中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，若肿瘤为转移性肿瘤且在过去已有效治疗/移除原发性病灶，则可能需要移除一个转移性病灶。在一些实施例中，若可用，微创方法是移除皮肤病灶或颈部或腋窝区域上的淋巴结。在一些实施例中，移除皮肤病灶或移除其小活体组织切片。在一些实施例中，移除淋巴结或其小活体组织切片。在一些实施例中，肿瘤为黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤的小活体组织切片包含黑痣或其一部分。
在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入可疑黑痣周围的皮肤中获得。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得，且移除一块圆形皮肤。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片且移除圆形部分的肿瘤。
在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片且移除整个黑痣或生长物。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片且连同小边缘的正常外观皮肤移除整个黑痣或生长物。
在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片且仅采集最不规则部分的黑痣或生长物。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片，该切开式活体组织切片在其他技术无法完成时使用，例如当可疑黑痣非常大时使用。
在一些实施例中，小活体组织切片为肺活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片通过支气管镜检获得。一般而言，支气管镜检在患者麻醉下使小工具通过鼻或口、下至咽喉且进入支气管通道，其中小工具用于移除一些组织。在一些实施例中，在无法通过支气管镜检达到肿瘤或生长物的情况下，可以采用经胸针吸活体组织切片。一般而言，对于经胸针吸活体组织切片，患者也处于麻醉下且将针穿过皮肤直接插入可疑位点以移除小样本的组织。在一些实施例中，经胸针吸活体组织切片可能需要介入性放射线学(例如使用X射线或CT扫描引导针头)。在一些实施例中，小活体组织切片通过针吸活体组织切片获得。在一些实施例中，小活体组织切片经内视镜超声波获得(例如，内视镜附灯且经口置于食道中)。在一些实施例中，小活体组织切片经手术获得。
在一些实施例中，小活体组织切片为头颈活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片，其中从外观异常区域切除一小块组织。在一些实施例中，若容易接近异常区，则无需住院即可采集样本。在一些实施例中，若肿瘤在口腔或咽喉内部较深处，则活体组织切片可能需要在手术室全身麻醉进行。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片，其中移除整个区域。在一些实施例中，小活体组织切片为细针抽吸(FNA)。在一些实施例中，小活体组织切片为细针抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器的非常细的针头从肿瘤或肿块抽取(抽吸)细胞。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片，其中使用穿孔镊移除一块可疑区域。
在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片通过阴道镜获得。通常，阴道镜方法采用附接至双目放大镜的附灯放大仪器(阴道镜)，接着用于对一小部分的子宫颈进行活体组织切片检查。在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片，其中可能需要门诊手术以从子宫颈移除较大块组织。在一些实施例中，锥状活体组织切片除了有助于确诊之外，锥状活体组织切片也可以用作初始治疗。
术语“实体肿瘤”指通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。术语“实体肿瘤癌症”指恶性、赘生性或癌性实体肿瘤。实体肿瘤癌症包括肺癌。在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)及有癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
在一些实施例中，来自肿瘤的样本以细针抽吸物(FNA)、粗针活体组织切片、小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)形式获得。在一些实施例中，先将样本置于G-REX-10中。在一些实施例中，当有1个或2个粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-10中。在一些实施例中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个以上粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-100中。在一些实施例中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个以上粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-500中。
FNA可获自皮肤肿瘤，包括例如黑色素瘤。在一些实施例中，FNA获自皮肤肿瘤，例如来自患有转移性黑色素瘤的患者的皮肤肿瘤。在一些情况下，患有黑色素瘤的患者先前已经受手术治疗。
FNA可获自肺肿瘤，包括例如NSCLC。在一些实施例中，FNA获自肺肿瘤，例如来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺肿瘤。在一些情况下，NSCLC患者先前已经受手术治疗。
本文所述的TIL可获自FNA样本。在一些情况下，FNA样本使用在18号针头至25号针头范围中的细口径针头自患者获得或分离。细口径针头可为18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施例中，来自患者的FNA样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
在一些情况下，本文所述的TIL获自粗针活体组织切片样本。在一些情况下，粗针活体组织切片样本使用在11号针头至16号针头范围中的外科或医用针头从患者获得或分离。针头可为11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施例中，来自患者的粗针活体组织切片样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
一般地，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，TIL并非获自肿瘤消化物。在一些实施例中，实体肿瘤核心未经破碎。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术有限公司的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，其接着再次机械破坏大致1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，若在第三次机械破坏后大块组织仍存在，则可向样本施加1或2次另外机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，若在最终孵育结束时细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，获得第一TIL群体包含多病灶取样方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，及它们的任何组合。
在一些实施例中，解离酶由冻干酶重构。在一些实施例中，冻干酶在一定量之无菌缓冲液，例如汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中重构。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施例中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中重构。在一些实施例中，在重构后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZU/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZU/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施例中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施例中，在重构后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施例中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施例中，在重构后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施例中，酶储备液会发生变化，因此验证冻干储备液的浓度，并相应地修改添加至消化混合物中的酶的最终量。
在一些实施例中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2ul中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3ul胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)及250ul DNA酶I(200U/mL)。
2.胸腔积液T细胞及TIL
在一些实施例中，样本为胸膜液样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施例中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施例中，样本可为来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)之继发转移性癌细胞。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液及胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部及肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔及腹腔中皆具有间皮细胞系及流体形式，在一些实施例中，此类流体含有TIL。在本发明示例胸膜液的一些实施例中，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施例中，胸膜液呈未经处理的形式直接从患者移除。在一些实施例中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施例中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施例中，在从患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施例中，样本在从患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，样本在4℃下从患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施例中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施例中，稀释度为1:10胸膜液对稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:9胸膜液对稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施例中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施例中，样本在从患者收集及稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施例中，胸膜液样本在从患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，胸膜液样本在从患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在另外其他实施例中，在进一步处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对此胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施例中，通过在将胸膜液样本从受试者中取出后将其离心并将离心液或离心块再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施例中，对胸膜液样本进行多次离心及再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施例中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在接触步骤中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施例中，膜中的孔的直径可为至少4μm。在其他实施例中，孔径可为5μm以上，在其他实施例中，可为6μm、7μm、8μm、9μm或10μm中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)从膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的接触步骤中。
在一些实施例中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞离心块与裂解试剂接触，该裂解试剂是差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施例中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。适合的裂解试剂包括单一裂解试剂或裂解试剂及淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂及固定试剂。适合的裂解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司)。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司)或氯化铵系统。在一些实施例中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解及TIL的保守性及胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂用于裂解之外，适用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的效应的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视裂解试剂之选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施例中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
3.扩增来自外周血之外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一些实施例中，PBL使用本文所述的方法扩增。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC数目。使用人泛T细胞分离套件与LS柱(美天旎生物技术)分离T细胞。
PBL方法2。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法2扩增，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。通过在37℃下孵育PBMC至少三小时，接着分离非贴壁细胞来富集来自PBMC的T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种在CM-2培养基中的6孔板中，在37℃下孵育3小时。3小时后，移除非贴壁细胞(其为PBL)，计算其数目。
PBL方法3。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法3扩增，该方法包括获得来自外周血的PBMC样本。B细胞使用CD19+选择分离，T细胞使用负向选择PBMC样本的非CD19+级分来选择。
在本发明的一些实施例中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻，计算其数目。使用CD19多分选人套件(美天旎生物技术)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人泛T细胞分离套件及LS柱(美天旎生物技术)纯化T细胞。
在一些实施例中，PBMC由全血样本分离。在一些实施例中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始物质。在一些实施例中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在其他实施例中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始物质。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的方法由PBMC分离T细胞。在一些实施例中，使用人泛T细胞分离套件及LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)由PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBMC样本在有效鉴别非贴壁细胞的所需温度下孵育一段时间。在本发明的一些实施例中，孵育时间为约3小时。在本发明的一些实施例中，温度为约37℃。接着使用上述过程扩增非贴壁细胞。
在一些实施例中，PBMC样本是来自可选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，肿瘤样本是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长。在其他实施例中，PBMC是来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如伊布替尼(ibrutinib))的患者。
在一些实施例中，PBMC样本是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如伊布替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施例中，PBMC样本是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长的受试者或患者。在其他实施例中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一些实施例中，在第0天，针对CD19+选择细胞且据此分选。在本发明的一些实施例中，使用抗体结合珠粒进行选择。在本发明的一些实施例中，在第0天由PBMC分离纯T细胞。
在本发明的一些实施例中，对于未经伊布替尼或其他ITK抑制剂预处理的患者，10至15mL白膜将产生约5×109个PBMC，其又将产生约5.5×107个PBL。
在本发明的一些实施例中，对于经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一些实施例中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个PBL。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本，通过单采获得，来源于白膜，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施例中，PBL使用美国专利申请公开号US2020/0347350 A1中所描述的方法制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
4.扩增来自骨髓衍生的PBMC的骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC，分选，对非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理，将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。
在本发明的一些实施例中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。将细胞用CD3、CD33、CD20及CD14抗体染色且使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)及AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本发明的一些实施例中，PBMC获自骨髓。在一些实施例中，PBMC通过单采、抽吸、针吸活体组织切片或本领域中已知的其他类似方式获自骨髓。在一些实施例中，PBMC为新鲜的。在其他实施例中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一些实施例中，MIL由10至50ml骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施例中，从患者获得10mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，从患者获得20mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，从患者获得30mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，从患者获得40mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，从患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施例中，由约10至50mL骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在其他实施例中，产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施例中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个MIL。在本发明的一些实施例中，产生约1×106个MIL。
在本发明的一些实施例中，来源于骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生约1.4×105个MIL。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采获得，来源于白膜，或由本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施例中，使用美国专利申请公开号US2020/0347350 A1中所描述的方法制备MIL，其公开内容以引用的方式并入本文中。
B.步驟B：起始第一扩增
在一些实施例中，本发明方法提供较年轻TIL，较年轻TIL相较于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前已进一步进行更多次复制的TIL)可能提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》2012，75，157-167；Dudley等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2010，16，6122-6131；Huang等人，《免疫学杂志》2005，28，258-267；Besser等人，《临床癌症研究》2013，19，OF1-OF9；Besser等人，《免疫学杂志》2009，32，415-423；Robbins等人，《免疫学杂志》2004，173，7125-7130；Shen等人，《免疫学杂志》2007，30，123-129；Zhou等人，《免疫学杂志》2005，28，53-62；以及Tran等人，《免疫学杂志》2008，31，742-751，它们各自以引用的方式并入本文中。
在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C)的步骤A中所描述的肿瘤碎片和/或肿瘤碎片的分割或消化之后，将所得细胞在有利于TIL但不利于肿瘤及其他细胞生长的条件下培养在含有IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中。在一些实施例中，IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养起始时(例如在第0天)与肿瘤消化物和/或肿瘤碎片一起添加。在一些实施例中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片以每容器至多60个碎片且与6000IU/mL IL-2孵育于容器中。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养通常1至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养通常1至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，起始第一扩增发生1至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，起始第一扩增发生1至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生5至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生5至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生约6至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生约6至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生约7至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生约7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增发生约8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施例中，TIL的扩增可使用如下文及本文所述的起始第一扩增步骤(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些，其可包括称为预REP或初始REP的过程，其从第0天和/或从培养起开始含有饲养细胞)进行，接着进行如下文步骤D及本文所述的快速第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行可选的冷冻保存，接着进行如下文及本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征及代谢参数进行表征。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes及10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI1640组成。
在一些实施例中，有少于或等于240个肿瘤碎片。在一些实施例中，有少于或等于240个肿瘤碎片被放入少于或等于4个容器中。在一些实施例中，容器为GREX100MCS培养瓶。在一些实施例中，少于或等于60个肿瘤碎片被放入1个容器中。在一些实施例中，各容器包含少于或等于500mL培养基/容器。在一些实施例中，培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施例中，培养基包含2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。在一些实施例中，培养基包含OKT-3。在一些实施例中，培养基包含30ng/mL OKT-3/容器。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。
在制备肿瘤碎片之后，将所得细胞(即，为初代细胞群体的碎片)在有利TIL但不利肿瘤及其他细胞生长的条件下培养在含有IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中，其允许自第0天培养起开始TIL启动及加速生长。在一些实施例中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片与6000IU/mL IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起孵育。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施例中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，IL-2储备液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有5至7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液如实例C中所描述制备。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或约8000IU/mL IL-2。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL及约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间及50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2及初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约6000IU/mL的IL-2及初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基称为“CM”(培养基之缩写)。在一些实施例中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施例中，CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes及10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在一些实施例中，CM为实例中所描述的CM1。在一些实施例中，起始第一扩增发生于初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施例中，起始第一扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为饲养细胞)。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基之批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇及2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(即)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开号WO/1998/030679中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素及一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物及一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表4中的类型及标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7至8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为8天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至7天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7天，如实例及图示中所述。
在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7天。
在一些实施例中，TIL的起始第一扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及它们的任何组合可包括在起始第一扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)以及本文所述的步骤B过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)以及如本文所述的步骤B过程期间。
在一些实施例中，起始第一扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-10。
1.饲养细胞及抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第6至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第6至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7或8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第8天期间的任何时间添加。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8B)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时及起始第一扩增期间需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每容器2.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每GREX-102.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每GREX-100 2.5×108个饲养细胞。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第14天活细胞总数小于在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体及1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体及2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体及2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体及2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在15ng/ml OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:50与1:300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:100与1:200之间。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞。在其他实施例中，起始第一扩增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用于快速第二扩增的饲养细胞数目。
在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，培养基包含每容器30ng OKT-3。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基及15μg OKT-3。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基及15μg OKT-3。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含500mL培养基、6000IU/mLIL-2、30ng/mL OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基、6000IU/mL IL-2、15μg OKT-3及2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基及15μg OKT-3。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序在第二扩增期间需要多于TIL的过量饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示及实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在起始第一扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子及其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子与以下的组合进行TIL的起始第一扩增也是可能的，如美国专利申请公开号US2017/0107490 A1中所描述的IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是其中所描述的T细胞。参见例如表2。
在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基添加OX-40激动剂，如本文别处所描述。此外，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如美国专利申请公开号US2019/0307796 A1中所述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
C.步骤C：起始第一扩增至快速第二扩增的转变
在一些情况下，获自起始第一扩增(其可包括有时称为预REP的扩增)的主体TIL群体，包括例如获自例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的步骤B的TIL群体，可经历快速第二扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)，接着如下文所述冷冻保存。类似地，在经遗传修饰的TIL将用于疗法的情况下，来自起始第一扩增的经扩增TIL群体或来自快速第二扩增的经扩增TIL群体可在扩增步骤之前或在起始第一扩增之后且在快速第二扩增之前进行遗传修饰以用于合适治疗。
在一些实施例中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的步骤B)的TIL经储存直至为了选择而测定表型。在一些实施例中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的步骤B)的TIL不经储存且直接进行快速第二扩增。在一些实施例中，获自起始第一扩增的TIL在起始第一扩增之后且在快速第二扩增之前不经冷冻保存。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在肿瘤破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约8天发生。
在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至7天发生在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后7天至8天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后7天发生。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后8天发生。
在一些实施例中，TIL在初级第一扩增(primary first expansion)之后且在快速第二扩增之前不经储存，TIL直接进行快速第二扩增(例如在一些实施例中，在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所显示的步骤B至步骤D的转变期间不经储存)。在一些实施例中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施例中，来自起始第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行快速第二扩增而无转变期。
在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如GREX-10或GREX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变涉及容器大小的规模纵向扩大。在一些实施例中，起始第一扩增与快速第二扩增相比在较小容器中进行。在一些实施例中，起始第一扩增在GREX-100中进行且快速第二扩增在GREX-500中进行。
D.步骤D：快速第二扩增
在一些实施例中，TIL细胞群体在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的收集及起始第一扩增(步骤A和步骤B)及称为步骤C的转变之后进一步扩增数目。此进一步扩增在本文中称为快速第二扩增或快速扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP)的扩增过程；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中所指示的过程。快速第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源及抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。在一些实施例中，在快速第二扩增开始后1天、2天、3天或4天(即，在整体Gen 3过程的第8、9、10或11天)，将TIL转移至较大体积容器。
在一些实施例中，TIL的快速第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约10天。
在一些实施例中，快速第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中所指示的过程)进行。在一些实施例中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施例中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中将饲养细胞添加至最终浓度，该最终浓度为存在于起始第一扩增中的饲养细胞浓度的2倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。举例而言，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mLOKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体例如为人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施例中，再刺激作为第二扩增的部分发生。在一些实施例中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL之间的IL-2。
在一些实施例中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL及约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间及50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含30ng/mL与60ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3。在一些实施例中，细胞培养基包含约60ng/mL OKT-3。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基及30μg OKT-3。在一些实施例中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3及7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基及6000IU/mLIL-2、30μg OKT-3及7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基及30μg OKT-3。在一些实施例中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3及5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基及6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3及5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2及初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及它们的任何组合可包括在第二扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)以及本文所述的步骤D过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)及如本文所述的步骤D过程期间。
在一些实施例中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施例中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施例中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1:10、约1:15、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:75、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400、或约1:500。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1:50与1:300之间。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1:100与1:200之间。
在一些实施例中，REP和/或快速第二扩增在培养瓶中进行，其中主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30ng/mL OKT3抗CD3抗体及6000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中，饲养细胞浓度是起始第一扩增中的饲养细胞浓度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。替换培养基(通常通过抽取2/3用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基替换，来替换2/3培养基)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶及透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，快速第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)为7至9天，如实例及图示中所述。在一些实施例中，第二扩增为7天。在一些实施例中，第二扩增为8天。在一些实施例中，第二扩增为9天。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中提及的那些)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-REX-100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿市的威尔逊狼制造公司(Wilson Wolf Manufacturing Corporation))中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC在400mL的补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2及30ng/ml抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除，放入离心瓶中，以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL离心块可用150mL具有5％人AB血清、6000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回原始GREX-100培养瓶中。当TIL在GREX-100培养瓶中连续扩增时，在第10或11天可将TIL移至较大培养瓶，例如GREX-500。可在培养第14天收集细胞。细胞可在培养的第15天收集。细胞可在培养的第16天收集。在一些实施例中，替换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施例中，通过抽取用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基替换，来替换2/3培养基。在一些实施例中，替代生长箱室包括GREX培养瓶及透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基使用，该生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基及26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇及2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇及2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)及约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(即)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施例中，国际专利申请公开号WO1998/030679及美国专利申请公开号US2002/0076747 A1中所描述的确定成分培养基(其以引用的方式并入本文中)适用于本发明中。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素及一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物及一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体及一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白及一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表4中的类型及标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基之渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，进行快速第二扩增(包括称为REP的扩增)，其进一步包含其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。举例而言，美国专利申请公开号2016/0010058A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，可在快速第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准分析来进行细胞存活率分析。举例而言，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活性评定。在一些实施例中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算及确定存活性。在一些实施例中，存活性根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
T及B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)及C(恒定区)决定免疫球蛋白及T细胞受体(TCR)的结合特异性及下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ及δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30ug/瓶OKT-3以及如下文更详细论述的7.5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30ug/瓶OKT-3以及如下文更详细论述的5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施例中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将小规模培养中的TIL转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的TIL部分于第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施例中，在快速第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分成多个步骤之前将快速第二扩增进行约3至7天的时间段。在一些实施例中，快速第二扩增的分流发生在快速扩增或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。
在一些实施例中，快速第二扩增的分流发生在第一扩增(即预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天或第18天。在一个示例性实施例中，快速扩增或第二扩增的分流发生在第一扩增开始后约第16天。
在一些实施例中，在分流之后，快速第二扩增进一步进行约7至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速第二扩增进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3及进一步可选的APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2及可选的OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2及可选的OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换分流前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。
1.饲养细胞及抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的快速第二扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中所描述的那些扩增以及称为REP的那些扩增)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第7或14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天及第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增之起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天及第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增之起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体及1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体及2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体及2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体及2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体及6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1:10、约1:25、约1:50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1:200、约1:225、约1:250、约1:275、约1:300、约1:325、约1:350、约1:375、约1:400或约1:500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:50与1:300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1:100与1:200之间。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，快速第二扩增需要快速第二扩增的2倍数目的饲养细胞。在其他实施例中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约5×108个饲养细胞。在其他实施例中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约7.5×108个饲养细胞。在其他实施例中，快速第二扩增需要起始第一扩增的2倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X数目的饲养细胞。
在一些实施例中，本文所述的快速第二扩增程序在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法、例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。在一些实施例中，PBMC以添加至起始第一扩增的PBMC浓度的2倍添加至快速第二扩增。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示及实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在快速第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子及其他添加剂
本文所述的快速第二扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来快速第二扩增TIL也是可能的，如美国专利申请公开号US2017/0107490 A1中所描述，使用两种以上IL-2、IL-15和IL-21的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)也可包括将OKT-3抗体或莫罗单抗添加至培养基中，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施例中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)也可包括将OX-40激动剂添加至培养基中，如本文别处所描述。此外，可在步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开号US2019/0307796 A1中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
E.步骤E：收集TIL
在快速第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所提供的一个、二个、三个、四个以上扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所提供的两个扩增步骤(一个起始第一扩增及一个快速第二扩增)之后收集TIL。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施例中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)及InotechBiosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施例中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动及细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施例中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施例中，根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤E系根据本文所述的过程进行。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性及密闭性质。在一些实施例中，采用如本文所述的密闭系统。
在一些实施例中，根据本文所述的方法收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法收集第14与16天之间的TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第14天收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第15天收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第16天收集TIL。
F.步骤F：最终配制及转移至输注容器
在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中以示例性次序提供且如上文及本文中所述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施例中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，将其转移至容器以用于向患者施用。
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。如本文所公开的扩增的TIL可通过如本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施例中，TIL以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内及淋巴管内施用。
IV.进一步的Gen 2、Gen 3及其他TIL制造过程实施例
A.PBMC饲养细胞比率
在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D))的培养基包括抗CD3抗体，例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞活化及细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab及F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，PBMC饲养细胞层的数目如下计算：
A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr3＝523.6μm3
B.具有40μm(4个细胞)高度的G-REX-100(M)体积：V＝(4/3)πr3＝4×1012μm3
C.填满体积B所需的细胞数目：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3*0.64＝4.86×108
D.可在4D空间中经最佳活化的细胞数目：4.86×108/24＝20.25×106
E.外推至G-REX-500的饲养细胞、TIL数目：TIL：100×106、饲养细胞：2.5×109
在此计算中，使用在具有100cm2基底的圆柱体中提供TIL活化的二十面体几何学所需的单核细胞近似数目。计算导出的T细胞临界值活化的实验结果为约5×108，其与NCI实验资料密切相关，如Jin等人,《免疫疗法杂志》2012,35,283-292中所描述。在(C)中，乘数(0.64)是等效球体的随机填充密度，由Jaeger及Nagel，《科学》,1992,255,1523-3计算得出。在(D)中，除数24是4维空间中可接触类似物体的等效球体的数目或“牛顿数”，如Musin,《俄罗斯数学评论(Russ.Math.Surv.)》2003,58,794-795中所描述。
在一些实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目约为在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目的一半。在某些实施例中，方法包括在相较于快速第二扩增的细胞培养基包含约50％较少抗原呈递细胞的细胞培养基中进行起始第一扩增。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)数目大于在起始第一扩增期间外源供应的APC数目。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率是刚好或约2:1。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率是刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约2.5×108个APC，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约5×108个APC。
在一些实施例中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)数目在起始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC数目的约一半。在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞至第一TIL群体且在第7天添加抗原呈递细胞至第二TIL群体，其中，在第0天添加的抗原呈递细胞的数目在起始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数目的约50％。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目大于在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约4×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率是刚好或约2:1。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率是刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目是刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目系刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC(包括例如PBMC)。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约1×109个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约3×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约7.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约2×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约5.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目系刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目系刚好或约5×108个APC(包括例如PBMC)。
在一些实施例中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数是在快速第二扩增第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的约一半。在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞层至第一TIL群体且在第7天添加抗原呈递细胞层至第二TIL群体，其中，在第0天添加的抗原呈递细胞层的数目是在第7天添加的抗原呈递细胞层的数目的约50％。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层至刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层至刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率是刚好或约1:2。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.0×106个APC/cm2至约4.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约2.5×106个APC/cm2至约7.5×106个APC/cm2的范围。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.5×106个APC/cm2至约3.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约3.5×106个APC/cm2至约6.0×106个APC/cm2的范围。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约2.0×106个APC/cm2至约3.0×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约4.0×106个APC/cm2至约5.5×106个APC/cm2的范围。
A.可选的细胞培养基组分
1.抗CD3抗体
在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图1及图8(特别是例如图8B))的培养基包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞活化及细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab及F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆及单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠及犬科动物抗体。在一些实施例中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil公司或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)。参见表1。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆及单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠及犬科动物抗体。在一些实施例中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil公司或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)。
2.4-1BB(CD137)激动剂
在一些实施例中，起始第一扩增和/或快速第二扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可为本领域已知任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可为能够与人或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链及轻链。如本文所使用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；人、人源化或嵌合抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、任何上述的表位结合片段，以及与4-1BB结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施例中，4-1BB激动剂为一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，用于本发明所公开的方法及组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈免疫反应。Lee等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》2013,8,e69677。在一些实施例中，4-1BB激动剂为激动性抗4-1BB人源化或完全人单克隆抗体(即，衍生自单一细胞系的抗体)。在一些实施例中，4-1BB激动剂为EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施例中，4-1BB激动剂为乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一些实施例中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可为融合蛋白。在一些实施例中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚4-1BB激动剂，例如三聚或六聚4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(4-1BBL)聚类及内部细胞信号复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域及IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)以上融合蛋白描述于例如Gieffers等人,《分子癌症治疗学》2013,12,2735-47中。
已知激动性4-1BB抗体及融合蛋白诱导强烈免疫反应。在一些实施例中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施例中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力及激动活性与人4-1BB(SEQID NO：40)结合。在一些实施例中，4-1BB激动剂为与人4-1BB(SEQ ID NO：40)结合的结合分子。在一些实施例中，4-1BB激动剂为与鼠4-1BB(SEQ ID NO：41)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列概述于表5。
表5：4-1BB抗原的氨基酸序列
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约90pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约80pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约70pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约60pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约50pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约40pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、或以约30pM以下的KD结合人或鼠4-1BB。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8×105l/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.3×10- 51/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、或以约1nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为乌图木单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌图木单抗可购自辉瑞公司(Pfizer,Inc.)。乌图木单抗为免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌图木单抗的氨基酸序列阐述于表6中。乌图木单抗包含位于Asn59及Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)及362-420(CH3)的重链链内二硫键；位于位置22'-87'(VH-VL)及136'-195'(CH1-CL)的轻链链内二硫键；位于IgG2A异构体(isoform)位置218-218、219-219、222-222及225-225、位于IgG2A/B异构体位置218-130、219-219、222-222及225-225及位于IgG2B异构体位置219-130(2)、222-222及225-225的链间重链-重链二硫键；以及位于IgG2A异构体位置130-213'(2)、IgG2A/B异构体位置218-213'及130-213'及位于IgG2B异构体位置218-213'(2)的链间重链-轻链二硫键。乌图木单抗及其变体及片段的制备及性质描述于美国专利号8,821,867、8,337,850及9,468,678及国际专利申请公开号WO 2012/032433 A1中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。乌图木单抗的临床前特征描述于Fisher等人，《癌症免疫学及免疫治疗(Cancer Immunolog.&Immunother.)》2012,61,1721-33中。目前乌图木单抗在多种血液及实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别符NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：42所示的重链及SEQ ID NO：43所示的轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43所示序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含乌图木单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：44中所示序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：45中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含含有VH及VL区的scFv抗体，VH及VL区各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少99％同一性。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47及SEQID NO：48中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌图木单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其与该参考药品或参考生物产品相比包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。
表6：与乌图木单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，4-1BB激动剂为单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自百时美施贵宝公司及Creative Biolabs,Inc.。乌瑞鲁单抗为免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌瑞鲁单抗的氨基酸序列阐述于表7中。乌瑞鲁单抗包含位于位置298(及298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)及368-426(CH3)(及位于位置22”-95”、148”-204”、262”-322”及368”-426”)的重链链内二硫键；位于位置23'-88'(VH-VL)及136'-196'(CH1-CL)(及位于位置23”'-88”'及136”'-196”')的轻链链内二硫键；位于位置227-227”及230-230”的链间重链-重链二硫键；以及位于135-216'及135”-216”'的链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗及其变体及片段的制备及性质描述于美国专利号7,288,638及8,962,804中，其公开内容以引用的方式并入本文中。乌瑞鲁单抗的临床前及临床特征描述于Segal等人,Clin.Cancer Res.)》2016,请访问http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前乌瑞鲁单抗在多种血液及实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别符NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：52所示的重链及SEQ ID NO：53所示的轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53所示序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：54中所示序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：55中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH及VL区，其各自分别与SEQID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含含有VH及VL区的scFv抗体，VH及VL区各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少99％同一性。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57及SEQID NO：58中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物学产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列且其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。
表7：与乌瑞鲁单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，4-1BB激动剂选自如下：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(赛默飞世尔MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、通过保存为ATCC第HB-11248号的细胞系产生且美国专利号6,974,863中公开的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、美国专利申请公开号US2005/0095244中公开的抗体、美国专利号7,288,638中公开的抗体(例如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美国专利号6,887,673中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利号7,214,493中公开的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、美国专利号6,905,685中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利号6,362,325中公开的抗体(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美国专利号6,974,863中公开的抗体(例如53A2)；美国专利号6,210,669中公开的抗体(例如1D8、3B8或3El)、美国专利号5,928,893中描述的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、国际专利申请公开号WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433中公开的抗体，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公开中的每一者的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为以下中描述的4-1BB激动融合蛋白：国际专利申请公开号WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051A1及WO 2010/078966 A1；美国专利申请公开号US2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US2011/0111494 A1、US2015/0110734 A1及US2015/0126710 A1；以及美国专利号9,359,420、9,340,599,8,921,519及8,450,460，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为如结构I-A(C末端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc-抗体片段融合蛋白)中所描绘的4-1BB激动融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物(参见图18)。在结构I-A及I-B中，圆柱指受试者多肽结合结构域。结构I-A及I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域，该TNFRSF结合结构域衍生自例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(TNFSF9)或结合4-1BB的抗体，该TNFRSF结合结构域折叠以形成三价蛋白质，接着该三价蛋白质通过IgG1-Fc(包括CH3及CH2结构域)与第二三价蛋白质连接，随后该IgG1-Fc用于通过二硫键(细长小椭圆)将两个三价蛋白质连接在一起，从而使结构稳定且提供能够将六个受体的细胞内信号域放在一起且信号蛋白质以形成信号复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可为包含例如由接头连接的VH及VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基及提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。可使用任何scFv结构域设计，例如以下中描述的那些scFv结构域：de Marco,《微生物细胞工厂(Microbial Cell Factories)》,2011,10,44；Ahmad等人,《临床及发育免疫学(Clin.&Dev.Immunol.)》2012,980250；Monnier等人,《抗体(Antibodies)》,2013,2,193-208；或本文中别处并入的参考文献。此形式的融合蛋白结构描述于美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
图18中给出的结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表8。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc-抗体的优选的接头可选自SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施例，包括适合于融合其他多肽的接头。
表8：具有C末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列
图18中给出的结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表9。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N末端融合，则Fc模块的序列优选地为SEQ ID NO：73中所示的序列，接头序列优选地选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的那些实施例。
表9：具有N末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的4-1BB结合结构域：乌图木单抗的可变重链及可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链及可变轻链、乌图木单抗的可变重链及可变轻链、选自表10中描述的可变重链及可变轻链的可变重链及可变轻链、前述可变重链及可变轻链的任何组合，及其片段、衍生物、缀合物、变体及生物类似物。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：77的序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含可溶性4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：78的序列的4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域为包含各自分别与SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区的scFv结构域，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域为包含各自分别与SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区的scFv结构域，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域为包含各自与表10中给出的VH及VL序列至少95％同一性的VH及VL区的scFv结构域，其中VH及VL结构域由接头连接。
表10：适合用作融合蛋白中的4-1BB结合结构域或适合用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽结构域
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性4-1BB结合结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域，(iv)第二肽接头，以及(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N末端和/或C末端的另外结构域，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性4-1BB结合结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域，(iv)第二肽接头，及(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N末端和/或C末端的另外结构域，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域，其中各可溶性4-1BB结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某一距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一肽和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域，(iv)第二肽接头，以及(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中各可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺乏茎区，第一和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，各TNF超家族细胞因子结构域为4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动scFv抗体，其包含与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体，目录号79097-2，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在一些实施例中，4-1BB激动剂为Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体，目录号MOM-18179，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs。
3.OX40(CD134)激动剂
在一些实施例中，TNFRSF激动剂为OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可以为能够与人或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链及轻链。如本文所用，术语结合分子还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化或嵌合抗体及抗体片段，例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达文库产生的片段、任一上述的表位-结合片段及与OX40结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施例中，OX40激动剂是一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂是一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，用于本公开方法及组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40阿德奈汀、抗OX40结构域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施例中，OX40激动剂为激动性抗OX40人源化或完全人单克隆抗体(即，源自单个细胞系的抗体)。
在一些实施例中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等人,《免疫疗法杂志》2009,182,1481-89。在一些实施例中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚OX40激动剂、例如三聚或六聚OX40激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(OX40L)聚类及内部细胞信号复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域及IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)以上融合蛋白描述于例如Gieffers等人，《分子癌症治疗学》2013,12,2735-47中。
已知激动性OX40抗体及融合蛋白可诱导强烈免疫反应。Curti等人，《癌症研究》2013,73,7189-98。在一些实施例中，OX40激动剂为以足够减少毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、例如NK细胞细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除Fc区功能的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施例中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力及激动性活性与人OX40(SEQID NO：85)结合。在一些实施例中，OX40激动剂为与人OX40(SEQ ID NO：85)结合的结合分子。在一些实施例中，OX40激动剂为与鼠OX40(SEQ ID NO：86)结合的结合分子。表11中概述与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表11：OX40抗原的氨基酸序列
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约90pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约80pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约70pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约60pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约50pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约40pM以下的KD结合人或鼠OX40或以约30pM以下的KD结合人或鼠OX40。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合或以约1×1061/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.3×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程及方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠OX40结合或以约1nM以下的IC50与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，OX40激动剂为塔沃西单抗，也称为MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西单抗可获自阿斯利康公司(AstraZeneca,Inc.)的医学免疫(MedImmune)子公司。塔沃西单抗为免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化及嵌合单克隆抗体。塔沃西单抗的氨基酸序列阐述于表12中。塔沃西单抗包含在位置301及301”处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化复合物二触角CHO型聚糖；在位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、265-325(CH2)及371-429(CH3)处(及在位置22”-95”、148”-204”、265”-325”及371”-429”处)的重链链内二硫键；在位置23'-88'(VH-VL)及134'-194'(CH1-CL)处(及在位置23”'-88”'及134”'-194”'处)的轻链链内二硫键；在位置230-230”及233-233”处的链间重链-重链二硫键；以及在224-214'及224”-214”'处的链间重链-轻链二硫键。塔沃西单抗在各种实体肿瘤适应症中的当前临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别符NCT02318394及NCT02705482。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：87所示的重链及SEQ ID NO：88所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88中所示序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含塔沃西单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：89中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：90中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少98％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少97％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少96％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92及SEQID NO：93中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95及SEQ ID NO：96中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考塔沃西单抗批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。
表12：与塔沃西单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂为11D4，其为可获自辉瑞公司的完全人抗体。11D4的制备及特性描述于美国专利号7,960,515、8,236,930及9,028,824中，其公开内容以引用的方式并入本文中。11D4的氨基酸序列阐述于表13中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：97所示的重链及SEQ ID NO：98所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中所示序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含11D4的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：99中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：100中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：100中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：100中所示序列具有至少98％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO：99及SEQ ID NO：100中所示序列具有至少97％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：100中所示序列具有至少96％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102及SEQ ID NO：103中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考11D4批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为11D4。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为11D4。
表13：与11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂为18D8，其为可获自辉瑞公司的完全人抗体。18D8的制备及特性描述于美国专利号7,960,515、8,236,930及9,028,824中，其公开内容以引用的方式并入本文中。18D8的氨基酸序列阐述于表14中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：107所示的重链及SEQ ID NO：108所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：108中所示序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：108中所示序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO：107及SEQ ID NO：108中所示序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：108中所示序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107及SEQID NO：108中所示序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：108中所示序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含18D8的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：109中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：110中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110中所示序列具有至少98％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110中所示序列具有至少97％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110中所示序列具有至少96％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQID NO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112及SEQ ID NO：113中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115及SEQ ID NO：116中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考18D8批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为18D8。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为18D8。
表14：与18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂为Hu119-122，其为可获自葛兰素史克公共有限公司(GlaxoSmithKline plc)的人源化抗体。Hu119-122的制备及特性描述于美国专利号9,006,399及9,163,085以及国际专利公开号WO 2012/027328中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu119-122的氨基酸序列阐述于表15中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：117中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：118中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117及SEQ ID NO：118中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117及SEQ IDNO：118中所示序列具有至少98％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117及SEQ ID NO：118中所示序列具有至少97％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117及SEQ ID NO：118中所示序列具有至少96％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117及SEQ ID NO：118中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120及SEQ ID NO：121中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123及SEQ ID NO：124中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu119-122批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为Hu119-122。
表15：与Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂为Hu106-222，其为可获自葛兰素史克公共有限公司的人源化抗体。Hu106-222的制备及特性描述于美国专利号9,006,399及9,163,085以及国际专利公开号WO 2012/027328中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu106-222的氨基酸序列阐述于表16中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：125中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：126中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ ID NO：126中所示序列具有至少99％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ IDNO：126中所示序列具有至少98％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ ID NO：126中所示序列具有至少97％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ ID NO：126中所示序列具有至少96％同一性的VH及VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ ID NO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128及SEQ ID NO：129中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131及SEQ ID NO：132中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu106-222批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，参考药品或参考生物产品为Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，参考药品或参考生物产品为Hu106-222。
表16：与Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂抗体为MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469为鼠单克隆抗体。Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585。在一些实施例中，OX40激动剂为由9B12杂交瘤产生、由Biovest Inc.(美国马萨诸塞州马尔文(Malvern,MA,USA))保存的抗体，如Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施例中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施例中，OX40激动剂为L106 BD(Pharmingen，产品号340420)。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的CDR。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施例中，OX40激动剂为ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施例中，OX40激动剂为鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可购自新罕布什尔州西黎巴嫩的BioXcell Inc的InVivoMAb。
在一些实施例中，OX40激动剂选自以下中描述的OX40激动剂：国际专利申请公开号WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO2013/038191及WO 2014/148895；欧洲专利申请号EP 0672141；美国专利申请公开号US2010/136030、US2014/377284、US2015/190506及US2015/132288(包括克隆20E5及12H3)；以及美国专利号7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085，它们各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，OX40激动剂为如结构I-A(C末端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc-抗体片段融合蛋白)中所描绘的OX40激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A及I-B的特性已在上文及美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460中描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。图18中给出的结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列见于表9。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ IDNO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc-抗体的优选的接头可选自SEQID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施例，包括适合于融合其他多肽的接头。同样，图18中给出了结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列见于表10。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N末端融合，则Fc模块的序列优选地为SEQ ID NO：73中所示的序列，接头序列优选地选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的那些实施例。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的OX40结合结构域：塔沃西单抗的可变重链及可变轻链、11D4的可变重链及可变轻链、18D8的可变重链及可变轻链、Hu119-122的可变重链及可变轻链、Hu106-222的可变重链及可变轻链、选自表17中描述的可变重链及可变轻链的可变重链及可变轻链、前述的可变重链及可变轻链的任何组合，及其片段、衍生物、缀合物、变体及生物类似物。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：133的序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含可溶性OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQID NO：134的序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：135的序列的OX40结合结构域。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：99及SEQID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：109及SEQ IDNO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：127及SEQ IDNO：128中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：125及SEQ IDNO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自与表17中给出的VH及VL序列至少95％同一性的VH及VL区，其中VH及VL结构域由接头连接。
表17：适用作融合蛋白(例如结构I-A及I-B)中的OX40结合结构域或适用作scFvOX40激动剂抗体的另外多肽结构域
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N末端和/或C末端处的另外结构域，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N末端和/或C末端处的另外结构域，其中该另外结构域为Fab或Fc片段结构域，其中各可溶性OX40结合结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某一距离，但不为OX40结合结构域的一部分)，第一及第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中各可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺乏茎区，第一及第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，TNF超家族细胞因子结构域为OX40结合结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为MEDI6383。MEDI6383为OX40激动性融合蛋白且可如美国专利号6,312,700中所描述来制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性scFv抗体，其包含与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs，Inc.。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend,Inc.。
B.可选的细胞存活率分析
可选地，在起始第一扩增(有时称为初始主体扩增(initial bulk expansion))之后，可使用本领域已知的标准分析进行细胞存活率分析。因此，在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增之后进行细胞存活率分析。举例而言，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活性评定。其他用于测试存活性的分析可包括但不限于阿尔玛蓝(Alamar blue)分析及MTT分析。
1.细胞计数、存活性、流式细胞术
在一些实施例中，测量细胞计数和/或存活性。标记物(例如但不限于CD3、CD4、CD8及CD56以及本文所公开或描述的任何其他标记物)的表达可通过流动式细胞测量术，使用FACSCantoTM流动式细胞仪(碧迪生物科学(BD Biosciences))，用抗体，例如但不限于可购自碧迪生物科学的那些(碧迪生物科学，加利福尼亚州圣荷西)测量。细胞可使用一次性c-芯片血细胞计数器(VWR，伊利诺伊州巴达维亚)手动计算，存活性可使用本领域中已知的任何方法，包括但不限于台盼蓝染色评定。也可基于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请公开号2018/0282694分析细胞存活率。细胞存活率也可基于美国专利公开号2018/0280436或国际专利公开号WO/2018/081473分析，两者全文均出于所有目的并入本文中。
在一些情况下，主体TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。替代地，主体TIL群体可进行REP，接着如下文所述冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰的TIL将用于疗法中的情况下，主体或REP TIL群体可进行遗传修饰以用于合适治疗。
2.细胞培养
在一些实施例中，用于扩增TIL的方法(包括上文所述以及图1及图8，特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G中示例的那些方法)可包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一些实施例中，培养基为不含血清培养基。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基不含血清。在一些实施例中，第二扩增中的培养基不含血清。在一些实施例中，起始第一扩增及第二扩增(也称为快速第二扩增)中的培养基均不含血清。在一些实施例中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM链霉素硫酸盐及10μM庆大霉素硫酸盐)细胞培养基(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州喀斯巴德)。就此而言，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量及培养基类型的数目。在一些实施例中，扩增TIL数目可包含频繁性不超过每三或四天一次地喂养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至8天的时间段，例如约7天作为起始第一扩增，约8天作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增数目TIL持续约7至9天(例如约7天、约8天或约9天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间段作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增TIL数目持续约7至14天或约7至9天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间段作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增TIL数目持续约7至11天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，TIL在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，使用PBMC，使用本领域中已知的方法、组合物及装置，包括美国专利申请公开号2005/0106717A1中描述的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，TIL在透气袋中扩增。在一些实施例中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))扩增。在一些实施例中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare))扩增。在一些实施例中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，该透气细胞袋的容积选自如下：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L及约10L。
在一些实施例中，TIL可在G-REX培养瓶(可购自威尔逊狼制造公司)中扩增。此类实施例允许细胞群体自约5×105个细胞/cm2扩增至介于10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一些实施例中，其为未进行喂养。在一些实施例中，其为未进行喂养，只要G-REX培养瓶中的培养基位于约10cm的高度。在一些实施例中，其为未进行喂养但添加一种以上细胞因子。在一些实施例中，细胞因子可作为推注添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置及方法为本领域已知且已用于扩增TIL，包括以下中描述的那些：美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际公开号WO 2014/210036 A1、美国专利申请公开号US2013/0115617A1、国际公开号WO 2013/188427 A1、美国专利申请公开号US2011/0136228 A1、美国专利号US 8,809,050 B2、国际公开号WO 2011/072088 A2、美国专利申请公开号US2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133 A1、国际公开号WO 2012/129201 A1、美国专利申请公开号US2013/0102075 A1、美国专利号US 8,956,860B2、国际公开号WO 2013/173835A1、美国专利申请公开号US2015/0175966 A1，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35:283-292中。
C.TIL中可选的基因减弱或基因剔除
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造过程期间(各自如本文所提供)经进一步操作，以用暂时性方式改变蛋白质表达。在一些实施例中，暂时性改变的蛋白质表达是因为暂时性基因编辑。在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL用转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施例中，TF和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子提供TIL群体中改变的肿瘤抗原表达和/或改变肿瘤抗原特异性T细胞的数目。
在某些实施例中，方法包括基因编辑TIL群体。在某些实施例中，方法包括基因编辑第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明包括通过核苷酸插入，例如通过核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)至TIL群体中进行基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达或抑制一种以上蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL经历暂时性改变蛋白质表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第一扩增之前的主体TIL群体，包括例如获自例如如图8(尤其图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的步骤A的TIL群体中。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第一扩增期间，包括例如获自例如如图8(例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的步骤B的TIL群体中。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第一扩增之后，包括例如在第一与第二扩增之间转变的TIL群体(例如如本文所述的第二TIL群体)、获自例如如图8中所指示的步骤B且包括于步骤C中的TIL群体中。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第二扩增之前的主体TIL群体中，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤C且在步骤D中其扩增之前的TIL群体中。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第二扩增期间，包括例如在例如如图8中所指示的步骤D中扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)中。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达发生在第二扩增之后，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤D中的扩增的TIL群体中。
在一些实施例中，暂时性改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域已知，描述于例如如下中：Tsong,《生物物理学杂志》1991,60,297-306及美国专利申请公开号2014/0227237A1，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，暂时性改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包覆及胞吞作用)为本领域已知且描述于如下中：Graham及van der Eb,《病毒学(Virology)》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》1979,76,1373-1376；以及Chen及Okayarea,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1987,7,2745-2752；以及美国专利号5,593,875，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，暂时性改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)及二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知且描述于如下中：Rose等人,《生物技术(Biotechniques)》1991,10,520-525及Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利号5,279,833、5,908,635、6,056,938、6,110,490、6,534,484及7,687,070，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，暂时性改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利号5,766,902、6,025,337、6,410,517、6,475,994及7,189,705，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致记忆干T细胞(TSCM)增加。TSCM为抗原经历中枢记忆T细胞的早期前驱细胞。TSCM一般呈现定义干细胞的长期存活、自我更新及多效能能力，一般为产生有效TIL产物所需的。在过继细胞转移之小鼠模型中，TSCM与其他T细胞亚群相比已展示增强的抗肿瘤活性。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致具有包含高比例的TSCM的组成的TIL群体。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIL群体中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的TIL群体。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的治疗性TIL群体。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致抗原经历T细胞复苏(rejuvenation)。在一些实施例中，复苏包括例如增加增殖、增加T细胞活化和/或增加抗原识别。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达改变一大部分T细胞的表达，以保留肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达不改变肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达维持肿瘤衍生的TCR贮库。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质导致改变特定基因的表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向包括但不限于以下的基因：PD-1(也称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(highmobility group；HMG)匣(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向选自如下的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CTLA-4、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)匣(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向PD-1。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向TGFBR2。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR4/5。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CTLA-4。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CBLB。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CISH。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-2。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-12。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-15。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-18。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-21。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向TIM3。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向LAG3。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向TIGIT。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向TET2。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向TGFβ。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR1。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR2。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR4。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR5。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCR1。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCR2。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CSCR3。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL5(RANTES)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCL1。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCL8。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL22。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL17。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向VHL。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向CD44。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向PIK3CD。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向SOCS1。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向胸腺细胞选择相关之高迁移率组(HMG)匣(TOX)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向BCL6辅抑制物(BCOR)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达。在一些实施例中，因暂时性蛋白质表达而过度表达的趋化因子受体包括具有配体的受体，该配体包括但不限于CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1、CTLA-4、CBLB、CISH、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TET2、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ路径阻断)。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM-3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG-3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TGFβR2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TGFβ的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达，以例如改善TIL运输或运动至肿瘤部位。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致嵌合共刺激受体(CCR)增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自如下的趋化因子受体增加和/或过度表达：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致白介素增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自如下的白介素增加和/或过度表达：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致NOTCH 1/2ICD增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致VHL增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CD44增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PIK3CD增加和/或过度表达。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致SOCS1增加和/或过度表达。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致cAMP蛋白激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自如下的分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自如下的两种分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及选自如下的一种分子的表达降低和/或减少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致以下的表达降低和/或减少：PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT以及它们的组合。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及以下中的一者的表达降低和/或减少：CTLA-4、LAG3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT、TET2以及它们的组合。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及CTLA-4的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1及TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CTLA-4及TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3及CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3及CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3及TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3及TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH及CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH及TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH及TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CBLB及TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CBLB及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致CBLB及TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3及TET的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的粘附分子通过γ逆转录病毒或慢病毒方法插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集TIL群体中(例如粘附分子的表达增加)。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达导致选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、CISH、CBLB、TIGIT、TET2以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。
在一些实施例中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％。在一些实施例中，表达减少至少约85％。在一些实施例中，表达减少至少约90％。在一些实施例中，表达减少至少约95％。在一些实施例中，表达减少至少约99％。
在一些实施例中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约80％。在一些实施例中，表达增加至少约85％。在一些实施例中，表达增加至少约90％。在一些实施例中，表达增加至少约95％。在一些实施例中，表达增加至少约99％。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达通过用转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导。在一些实施例中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。此类方法证明了将包括转录因子在内的蛋白质递送至包括T细胞在内的多种初代人细胞的能力，已描述于美国专利申请公开号US2019/0093073 A1、US2018/0201889 A1及US2019/0017072 A1中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。此类方法可用于本发明中，以将TIL群体暴露于转录因子(TF)和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子，其中该TF和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子提供TIL群体中的肿瘤抗原的表达增加和/或肿瘤抗原特异性T细胞的数目增加，从而导致TIL群体重新编程及重新编程TIL群体的治疗功效相较于非重新编程TIL群体增加。在一些实施例中，重新编程导致相对于开始或先前TIL群体(即，在重新编程之前)，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞亚群增加，如本文所述。
在一些实施例中，转录因子(TF)包括但不限于TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施例中，转录因子(TF)为TCF-1。在一些实施例中，转录因子(TF)为NOTCH 1/2ICD。在一些实施例中，转录因子(TF)为MYB。在一些实施例中，转录因子(TF)与诱导性多能干细胞培养物(iPSC)，例如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/赛默飞世尔)一起施用，以诱导另外TIL重新编程。在一些实施例中，转录因子(TF)与iPSC混合物一起施用，以诱导另外TIL重新编程。在一些实施例中，转录因子(TF)不与iPSC混合物一起施用。在一些实施例中，重新编程导致TSCM的百分比增加。在一些实施例中，重新编程导致TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的TSCM。
在一些实施例中，如上文所描述的暂时性改变蛋白质表达的方法可与遗传修饰TIL群体的方法组合，包括稳定并入基因以产生一种以上蛋白质的步骤。在某些实施例中，方法包括遗传修饰TIL群体的步骤。在某些实施例中，方法包括遗传修饰第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域已知且描述于例如如下中：Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志》1998,72,8463-71及美国专利号6,627,442，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域已知且描述于例如Cepko及Pear,《分子生物学中之当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括转位子介导的基因转移的步骤。转位子介导的基因转移系统为本领域已知，包括其中转位酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转位酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包含帽及多腺苷酸尾的mRNA)的转位酶。包括类鲑鱼型Tel样转位酶(SB或睡美人转位酶)，例如SB10、SB11及SB100x；以及酶活性增加的经工程改造酶的合适的转位子介导的基因转移系统描述于例如如下中：Hackett等人,《分子疗法(Mol.Therapy)》2010,18,674-83及美国专利号6,489,458，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，暂时性改变TIL中的蛋白质表达由小干扰RNA(siRNA)诱导，该小干扰RNA有时称为短干扰RNA或静默RNA，其为双链RNA分子，长度一般为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。
在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达为表达减少。在一些实施例中，暂时性改变蛋白质表达系由自我递送RNA干扰(sdRNA)诱导，该自我递送RNA干扰为具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(引导)链及使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或静默RNA，为双链RNA分子，长度一般为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。sdRNA为进入细胞不需要递送媒介的共价及疏水性修饰的RNAi化合物。sdRNA一般为具有极小双链区的不对称化学修饰核酸分子。sdRNA分子通常含有单链区及双链区，可在分子之单链及双链区内含有各种化学修饰。另外，如本文所述，sdRNA分子可与疏水性缀合物，例如常规及高级固醇型分子连接。sdRNA及制备此类sdRNA的相关方法也已广泛描述于例如如下中：美国专利申请公开号US2016/0304873 A1、US2019/0211337 A1、US2009/0131360 A1及US 2019/0048341A1，及美国专利10,633,654及10,913,948B2，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。为了最佳化sdRNA结构、化学性质、靶向位置、序列偏好等，已开发一种算法且将其用于sdRNA效能预测。基于这些分析，功能性sdRNA序列一般定义为在1μM浓度下表达减少超过70％，其中概率超过40％。
双链RNA(dsRNA)可通常用来定义包含一对互补RNA链，一般有义(随从)及反义(引导)链的任何分子，可包括单链突出端区域。与siRNA不同，术语dsRNA一般指包括siRNA分子的序列的前体分子，siRNA分子通过裂解酶系统(包括Dicer)的作用自较大dsRNA分子释放。
在一些实施例中，方法包括暂时性改变TIL群体(包括经修饰以表达CCR的TIL)中蛋白质表达，包括使用自我递送RNA干扰(sdRNA)，其为例如具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(引导)链及使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。使用siRNA及sdRNA的方法已描述于如下中：Khvorova及Watts,《自然生物技术学(Nat.Biotechnol.)》2017,35,238-248；Byrne等人,《眼药理学与治疗学杂志(J.Ocul.Pharmacol.Ther.)》2013,29,855-864；以及Ligtenberg等人,《分子疗法》2018,26,1482-93，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，siRNA的递送使用电穿孔或细胞膜破坏(例如挤压或SQZ法)来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体不需要使用电穿孔、SQZ或其他方法来完成，实际上使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA。在某些实施例中，方法包括递送siRNA或sdRNA至TIL群体，其包含将TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA持续1至3天之间的时间段。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为10μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为50μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间在培养基中的sdRNA来完成，其中暴露于sdRNA通过添加新鲜sdRNA至培养基来进行两次、三次、四次或五次。其他合适过程描述于例如如下中：美国专利申请公开号US2011/0039914 A1、US2013/0131141 A1及US2013/0131142 A1，及美国专利号9,080,171，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，在制造期间将siRNA或sdRNA插入TIL群体中。在一些实施例中，sdRNA编码干扰以下的RNA：NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBLB。在一些实施例中，表达减少基于例如如通过流式细胞术和/或qPCR评定的基因静默的百分比而确定。在一些实施例中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％。在一些实施例中，表达减少至少约85％。在一些实施例中，表达减少至少约90％。在一些实施例中，表达减少至少约95％。在一些实施例中，表达减少至少约99％。
基于化学修饰siRNA的自我可递送RNAi技术可用于本发明的方法中，以成功递送sdRNA至如本文所述的TIL。主链修饰与不对称siRNA结构及疏水配体的组合(参见例如Ligtenberg等人,《分子疗法》2018,26,1482-93及美国专利申请公开号2016/0304873A1，其公开内容以引用的方式并入本文中)允许sdRNA通过简单地添加至培养基中，利用核酸酶稳定性或sdRNA而无需额外的制剂及方法即可渗透经培养的哺乳动物细胞。此稳定性允许仅通过维持sdRNA在培养基中的有效浓度，支持恒定含量的RNAi介导的目标基因活性减少。尽管不受理论束缚，但sdRNA的主链稳定化提供延长减少基因表达效应，其在非分裂细胞中可持续数月。
在一些实施例中，超过95％的TIL转染效率及目标的表达减少通过各种特定siRNA或sdRNA发生。在一些实施例中，含有若干未经修饰的核糖残基的siRNA或sdRNA经完全修饰的序列置换，以增加RNAi效应的效能和/或寿命。在一些实施例中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更久。在一些实施例中，表达减少效应在siRNA或sdRNA处理TIL 10天或更久后降低。在一些实施例中，目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施例中，TIL中的目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施例中，PD-1/PD-L1路径中的表达减少允许TIL展现更强效的体内效应，在一些实施例中是因为避免PD-1/PD-L1路径的抑制效应。在一些实施例中，因siRNA或sdRNA的PD-1的表达减少导致增加TIL增殖。
在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列显示出70％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列显示出75％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列显示出80％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用之sdRNA序列显示出85％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列显示出90％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用之sdRNA序列显示出95％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列显示出99％的目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸剂包含一种以上修饰以增加治疗剂的稳定性和/或有效性及实现寡核苷酸至待治疗的细胞或组织的有效递送。此类修饰可包括2'-O-甲基修饰、2'-O-氟修饰、二硫代磷酸酯修饰、2'F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的和/或2'脱氧核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸经修饰以包括一个以上疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苯甲基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在一些实施例中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'脱氧、疏水性修饰及硫代磷酸酯的组合。在一些实施例中，糖可经修饰且经修饰的糖可包括但不限于D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基及2'-0-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤基(包括2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及其类似物。在一些实施例中，糖部分可为己糖且并入寡核苷酸中，如Augustyns等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》1992,18,4711，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上为双链，即在分子的任一端处无突出单链序列，即为钝端。在一些实施例中，个别核酸分子可具有不同长度。换言之，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上不为双链。举例而言，当使用两个分开的核酸分子时，分子中的一者，例如包含反义序列的第一分子可比与其杂交的第二分子更长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施例中，当使用单核酸分子时，在任一端处的一部分的分子可保持单链。
在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在至少约70％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链寡核苷酸在至少约80％的寡核苷酸长度上为双链的。在其他实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约90％-95％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约96％-98％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如通过修饰3'或5'键联而基本上保护其免受核酸酶的影响，如美国专利号5,849,902中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。举例而言，寡核苷酸可通过纳入“阻断基团”而具有抗性。如本文所用的术语“阻断基团”指可作为用于合成的保护基或偶合基团与寡核苷酸或核单体连接的取代基(例如除OH基团以外)(例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸盐(PO3 2")、磷酸氢盐或氨基亚磷酸酯)。“阻断基团”也可包括“末端阻断基团”或“核酸外切酶阻断基团”，其保护寡核苷酸的5'及3'端，其包括经修饰的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性结构。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA内的至少一部分连续多核苷酸通过取代基键联，例如硫代磷酸酯键联连接。
在一些实施例中，化学修饰可导致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500％的细胞摄取siRNA或sdRNA增强。在一些实施例中，C或U残基中的至少一者包括疏水性修饰。在一些实施例中，多个C及U含有疏水性修饰。在一些实施例中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C及U可含有疏水性修饰。在一些实施例中，所有C及U均含有疏水性修饰。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子通过并入可质子化胺展现增强的胞内体释放。在一些实施例中，将可质子化胺并入有义链中(在RISC装载后被舍弃的分子部分中)。在一些实施例中，本发明的siRNA或sdRNA化合物包含不对称化合物，该不对称化合物包含双螺旋区(有效RISC进入所需，10-15个碱基长)及4-12个核苷酸长的单链区；具有13个核苷酸的双螺旋。在一些实施例中，采用6个核苷酸的单链区。在一些实施例中，siRNA或sdRNA的单链区包含2-12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施例中，采用6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本发明的siRNA或sdRNA化合物也包括独特的化学修饰模式，其提供稳定性且与RISC进入相容。举例而言，引导链也可通过任何证实稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施例中，引导链中的化学修饰模式包括大部分为2'F修饰且5'端经磷酸化的C及U核苷酸。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA中至少30％的核苷酸为经修饰的。在一些实施例中，siRNA或sdRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸为经修饰的。在一些实施例中，siRNA或sdRNA中100％的核苷酸为经修饰的。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子具有极少双链区。在一些实施例中，分子的双链区介于8-15个核苷酸长范围内。在一些实施例中，分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在一些实施例中，双链区为13个核苷酸长。引导链与随从链之间可有100％互补性，或引导链与随从链之间可存在一个以上错配。在一些实施例中，在双链分子的一端上，分子为钝端或具有一个核苷酸的突出端。分子的单链区在一些实施例中是介于4-12个核苷酸长。在一些实施例中，单链区可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。在一些实施例中，单链区也可小于4个核苷酸或大于12个核苷酸长。在某些实施例中，单链区为6或7个核苷酸长。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子具有增加的稳定性。在一些情况下，化学修饰的siRNA或sdRNA分子在培养基中的半衰期长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时，包括任何中间值。在一些实施例中，siRNA或sd-RNA在培养基中的半衰期长于12小时。
在一些实施例中，对siRNA或sdRNA进行最佳化以增加效能和/或减少毒性。在一些实施例中，引导链和/或随从链的核苷酸长度和/或引导链和/或随从链中硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面中可影响RNA分子的效能，而用2'-O-甲基(2'OMe)修饰置换2'-氟(2'F)修饰在一些方面中可影响分子的毒性。在一些实施例中，预期减少分子的2'F含量将减少分子的毒性。在一些实施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响摄取分子至细胞中、例如被动摄取分子至细胞中的效率。在一些实施例中，siRNA或sdRNA不具有2'F修饰，但其特征在于细胞摄取与组织渗透方面的功效相等。
在一些实施例中，引导链的长度为约18-19个核苷酸且具有约2-14个磷酸酯修饰。举例而言，引导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超过14个经磷酸酯修饰之核苷酸。引导链可含有一个以上赋予增加的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸，可在3'端、5'端或遍布于整个引导链中。在一些实施例中，引导链的3'端10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。引导链也可含有2'F和/或2'OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施例中，引导链中位置一的核苷酸(引导链的最5'位置中的核苷酸)经2'OMe修饰和/或磷酸化。引导链内的C及U核苷酸可经2'F修饰。举例而言，19个核苷酸的引导链的位置2-10(或不同长度的引导链中的对应位置)中的C及U核苷酸可经2'F修饰。引导链内的C及U核苷酸也可经2'OMe修饰。举例而言，19个核苷酸的引导链的位置11-18(或不同长度的引导链中的对应位置)中的C及U核苷酸可经2'OMe修饰。在一些实施例中，在引导链的最3'端处的核苷酸未经修饰。在某些实施例中，引导链内的大部分C及U经2'F修饰，引导链的5'端经磷酸化。在其他实施例中，位置1及位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，引导链的5'端经磷酸化。在其他实施例中，位置1及位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，引导链的5'端经磷酸化，位置2-10中的C或U经2'F修饰。
自我可递送RNAi技术提供一种直接用RNAi剂(无论是siRNA、sdRNA或是其他RNAi剂)转染细胞而无需另外制剂或技术的方法。转染难以转染细胞系的能力、高体内活性及使用简单为该组合物及方法的特征，其相对于基于siRNA的传统技术存在显著的功能优势，因此在关于减少本发明的TIL中目标基因表达的方法的若干实施例中采用sdRNA方法。sdRNAi方法允许直接递送化学合成化合物至广泛范围的离体及体内初代细胞及组织。在本文中本发明的一些实施例中描述的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC。
siRNA及sdRNA可以疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂交结构形成，公开于例如Byrne等人,《眼科药理学治疗杂志(J.Ocular Pharmacol.Therapeut.)》,2013,29,855-864中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用无菌电穿孔递送至本文所述的TIL。在某些实施例中，方法包括无菌电穿孔TIL群体以递送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合递送至细胞。在一些实施例中，此跨膜递送系统包含脂质、病毒载体及其类似物。在一些实施例中，寡核苷酸剂为不需要任何递送剂的自我递送RNAi剂。在某些实施例中，方法包括使用跨膜递送系统来递送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群体。
使寡核苷酸及寡核苷酸组合物与本文所述的TIL接触(例如使其接触，在本文中也称为施用或递送至)且被摄入，包括通过TIL被动摄取。sdRNA可在以下时添加至如本文所述的TIL：在第一扩增期间(例如步骤B)、在第一扩增之后(例如在步骤C期间)、在第二扩增之前或期间(例如在步骤D之前或期间)、在步骤D之后且在步骤E中收集之前、在步骤F中收集期间或之后、在步骤F中最终配制和/或转移至输注袋之前或期间、以及在步骤F中任何可选的冷冻保存步骤之前。此外，siRNA或sdRNA可在由步骤F中任何冷冻保存步骤解冻之后添加。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)的sdRNA，以选自100nM至20mM、200nM至10mM、500nm至1mM、1μM至100μM及1μM至100μM的浓度，添加至包含TIL及其他药剂的细胞培养基。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)的sdRNA，以选自如下的量添加至包含TIL及其他药剂的细胞培养基：0.1μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μMsiRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基或10μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)的sdRNA，在预REP或REP阶段期间一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培养物。
本发明的寡核苷酸组合物，包括sdRNA，可在扩增过程期间，例如通过将高浓度sdRNA溶解于细胞培养培养基中及允许足够时间发生被动摄取而与如本文所述的TIL接触。在某些实施例中，本发明方法包括使TIL群体与如本文所述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施例中，方法包括将寡核苷酸，例如sdRNA，溶解在细胞培养基中，使细胞培养基与TIL群体接触。TIL可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
在一些实施例中，递送寡核苷酸至细胞中可通过合适的本领域公认方法增强，包括磷酸钙、DMSO、甘油或聚葡萄糖、电穿孔或通过转染，例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域中已知的方法，例如描述于以下的那些方法：美国专利号4,897,355；5,459,127；5,631,237；5,955,365；5,976,567；10,087,464和10,155,945；以及Bergan等人,《核酸评述(Nucl.Acids Res.)》1993,21,3567，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，使用超过一种siRNA或sdRNA来减少目标基因表达。在一些实施例中，靶向siRNA或sdRNA的PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上一起使用。在一些实施例中，PD-1siRNA或sdRNA与TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上一起使用，以减少超过一种基因目标的表达。在一些实施例中，LAG3 siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的CISH组合使用，以减少两种目标基因表达。在一些实施例中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上的siRNA或sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，另一种siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2以及它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自PD-1及以下中的一者的基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。
如上文所述，本发明的实施例提供已通过基因编辑进行遗传修饰以增强其治疗效果的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。本发明的实施例涵盖通过核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群体中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达及抑制一种以上蛋白质的表达以及其组合本发明的实施例也提供用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中该方法包括基因编辑TIL。存在若干种可用于遗传修饰TIL群体的基因编辑技术，该基因编辑技术适合于根据本发明使用。此类方法包括下文所描述的方法以及本文别处所描述的病毒及转座子方法。在一些实施例中，遗传修饰TIL、MIL或PBL以表达CCR的方法也可包括通过稳定基因剔除此类基因或暂时基因减弱此类基因来抑制基因表达的修饰。
在一些实施例中，方法包括遗传修饰TIL群体的方法，该方法包括稳定并入用于产生一种以上蛋白质的基因的步骤。在实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域已知且描述于例如如下中：Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志》1998,72,8463-71及美国专利号6,627,442，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域已知且描述于例如Cepko及Pear,《分子生物学中的当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括转位子介导的基因转移的步骤。转位子介导的基因转移系统为本领域已知，包括其中转位酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转位酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包含帽及多腺苷酸尾的mRNA)的转位酶。包括类鲑鱼型Tel样转位酶(SB或睡美人转位酶)，例如SB10、SB11及SB100x；以及酶活性增加的经工程改造酶的合适的转位子介导的基因转移系统描述于例如如下中：Hackett等人,《分子疗法(Mol.Therapy)》2010,18,674-83及美国专利号6,489,458，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，方法包括遗传修饰TIL群体的方法，该TIL群体为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括稳定并入用于产生或抑制(例如静默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域已知，描述于例如如下中：Tsong,《生物物理学杂志》1991,60,297-306及美国专利申请公开号2014/0227237A1，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利号5,019,034、5,128,257、5,137,817、5,173,158、5,232,856、5,273,525、5,304,120、5,318,514、6,010,613及6,078,490，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；以及(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；以及(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，及使得维持TIL的存活性。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沈淀、细胞表面包覆及胞吞作用)为本领域已知且描述于如下中：Graham及van der Eb,《病毒学(Virology)》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》1979,76,1373-1376；以及Chen及Okayarea,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1987,7,2745-2752；以及美国专利号5,593,875，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)及二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)在过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知且描述于如下中：Rose等人,《生物技术(Biotechniques)》1991,10,520-525及Felgner等人,《美国国家科学院院刊》1987,84,7413-7417以及美国专利号5,279,833、5,908,635、6,056,938、6,110,490、6,534,484及7,687,070，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，遗传修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利号5,766,902、6,025,337、6,410,517、6,475,994及7,189,705，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可为如本文所述的第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
根据一个实施例，基因编辑方法可包括使用介导在一个以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂的可编程核酸酶。此类可编程核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置且介导在目标序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机制募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如静默、抑制或增强)目标基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样核酸酶(TALEN)及CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN及TALEN通过蛋白质-DNA相互作用达成特定DNA结合，而CRISPR系统，例如Cas9，通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA引导分子及通过蛋白质-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(Nature Medicine)》,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，该方法在下文更详细地描述。根据一个实施例，将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2过程)的任何实施例或如美国专利申请公开号US2020/0299644 A1及US2020/0121719 A1以及美国专利号10,925,900(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，其中该方法进一步包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一种以上基因编辑至少一部分的TIL，以产生可提供增强治疗效果的TIL。根据一个实施例，可通过体外比较基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估基因编辑的TIL的改善的治疗效果。在某些实施例中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法来基因编辑TIL群体。
在本发明的一些实施例中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN及ZFN系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施例的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2)的任何实施例或如美国专利申请公开号US2020/0299644 A1及US2020/0121719 A1以及美国专利号10,925,900(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，该方法进一步包括通过CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因编辑至少一部分的TIL。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达静默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR代表成簇规律间隔短回文重复序列使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的并入RNA及Cas蛋白且可根据本发明使用的CRISPR系统：第I、II及III型。II型CRISPR(由Cas9示例)为最充分表征的系统之一。
CRISPR技术是改编自细菌及古菌(单细胞微生物的结构域)的天然防御机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA及各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎及破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒及其他外来体的攻击。CRISPR为具有两个独特特征的DNA特化区：存在核苷酸重复序列及间隔子。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区中，其中短外来DNA区段(间隔子)穿插在重复序列中。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合于CRISPR基因组基因座内且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，引导Cas蛋白进行序列特异性裂解及静默病原性DNA。Cas9蛋白进行的目标识别需要crRNA内的“种子”序列及crRNA结合区上游的含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻基序(PAM)序列。由此CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向以裂解几乎任何DNA序列。原生系统中的crRNA及tracrRNA可简化为约100个核苷酸的单引导RNA(sgRNA)以用于基因工程改造。CRISPR/Cas系统通过共同递送表达Cas9核酸内切酶及必需crRNA组分的质体可直接携带入人细胞。可使用不同的Cas蛋白变体来减少靶向限制(例如Cas9的异种同源物，例如Cpf1)。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而静默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过CRISPR方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施例使用的系统、方法及组合物的实例描述于如下中：美国专利号8,697,359、8,993,233、8,795,965、8,771,945、8,889,356、8,865,406、8,999,641、8,945,839、8,932,814、8,871,445、8,906,616及8,895,308，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法的资源，例如用于表达CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1的质体，可购自公司，例如金斯瑞(GenScript)。
在一些实施例中，遗传修饰如本文中所描述的TIL群体可使用如美国专利号US9790490中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2)的任何实施例或如美国专利申请公开号US2020/0299644 A1及US2020/0121719 A1以及美国专利号10,925,900中所描述进行，其公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法进一步包括通过TALE方法基因编辑至少一部分的TIL。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达静默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表转录活化因子样效应蛋白，其包括转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)。使用TALE系统来基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单孢菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复结构域构成的DNA结合结构域。TALE特异性通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合结构域中的特异性RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合结构域。将TALE的DNA结合结构域与IIS型FokI核酸内切酶的催化结构域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合及产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可并入TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦)及Life Technologies(美国纽约州格兰德岛)市售。适用于本发明的TALE及TALEN方法描述于如下中：美国专利申请公开号US2011/0201118 A1、US2013/0117869 A1、US2013/0315884 A1、US 2015/0203871A1及US2016/0120906 A1，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而静默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过TALE方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施例使用的系统、方法及组合物的实例描述于美国专利号8,586,526中，其以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法的任何实施例或如美国专利申请公开号US2020/0299644 A1及US2020/0121719 A1以及美国专利号10,925,900中所描述进行，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法进一步包括通过锌指或锌指核酸酶方法基因编辑至少一部分的TIL。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达静默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
呈保守ββα组态的个别锌指含有约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA主沟槽中的3bp。锌指具有两个蛋白结构域。第一结构域为DNA结合结构域，其包括真核转录因子且含有锌指。第二结构域为核酸酶结构域，其包括FokI限制酶且负责催化裂解DNA。
个别ZFN的DNA结合结构域通常含有介于三个与六个之间的个别锌指重复且各自可识别介于9个与18个之间的碱基对。若锌指结构域对其预期目标位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法为组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对目标位点的3指阵列。替代地，可使用基于选择的方法，例如寡聚体库工程改造(oligomerizedpool engineering；OPEN)，来自随机分组文库选择新的锌指阵列，该随机分组文库考虑介于邻近指之间的背景依赖性(context-dependent)相互作用。工程改造的锌指可从SangamoBiosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙)及Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)购得。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而静默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过锌指方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施例使用的系统、方法及组合物的实例描述于如下中：美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185及6,479,626，其以引用的方式并入本文中。
通过锌指方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的其他实施例使用之系统、方法及组合物的实例描述于Beane等人,《分子疗法》,2015,23 1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，TIL可选地经基因工程改造以包括另外官能性，该官能性包括但不限于高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例，基因工程改造方法描述于国际专利公开号WO 2019/160829A1(其公开内容以引用的方式并入本文中)中，其可用于遗传编辑TIL，包括基因剔除特定靶基因，例如编码PD-1即CTLA-4的基因。在某些实施例中，方法包括基因工程改造TIL群体以包括高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群体可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
D.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用较少培养瓶且允许成本降低。在一些实施例中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统为本领域中熟知的且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInforma tion/Guidances/Blood/ucm076779.htm处。
无菌连接装置(STCD)在两件相容性管之间产生无菌熔接部分。此程序允许无菌连接多个容器及管直径。在一些实施例中，密闭系统包括鲁尔锁及热封系统，如例如实例中所描述。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性及密闭性质。在一些实施例中，采用如实例中所描述的密闭系统。在一些实施例中，根据本文实例中所描述的方法，将TIL配制至最终产物配制容器中。
在一些实施例中，从获得肿瘤碎片的时间至准备向患者施用TIL或冷冻保存，密闭系统使用一个容器。在一些实施例中，当使用两个容器时，第一容器为密闭G容器，在不打开第一密闭G容器的情况下离心TIL群体且将其转移至输注袋。在一些实施例中，当使用两个容器时，输注袋为含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦已添加肿瘤样本和/或肿瘤碎片，则系统自外部紧密密封以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。
在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施例中，微生物污染减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在不存在微生物污染下和/或在微生物污染显著减少下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压及氧气分压各自随细胞培养而变化。因此，即使适合于细胞培养的培养基经循环，但密闭环境仍需要不断地维持为TIL增殖的最佳环境。为了此目的，合乎需要的是，借助于感测器监测密闭环境的培养液内的pH、二氧化碳分压及氧气分压的物理因素，其讯号用于控制安设在培养环境之入口处的气体交换器，及根据培养液中的变化实时调整密闭环境的气体分压以便最佳化细胞培养环境。在一些实施例中，本发明提供密闭细胞培养系统，其在至密闭环境之入口处并入配备有测量密闭环境的pH、二氧化碳分压及氧气分压的监测装置的气体交换器，通过基于来自监测装置的讯号自动调整气体浓度来最佳化细胞培养环境。
在一些实施例中，连续地或间歇地控制密闭环境内的压力。即，密闭环境中的压力可借助于例如压力维持装置来改变，从而确保空间在正压力状态下适合于TIL生长或促进在负压力状态下渗出流体且因此促进细胞增殖。此外，通过间歇性地施加负压力，有可能借助于暂时性缩小密闭环境的容积而均匀且有效地置换密闭环境中的循环液体。
在一些实施例中，可替换或添加TIL增殖的最佳培养物组分，可添加包括例如IL-2和/或OKT3以及其组合的因子。
E.可选的TIL的冷冻保存
主体TIL群体(例如第二TIL群体)或扩增TIL群体(例如第三TIL群体)可以可选地进行冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存发生于治疗性TIL群体。在一些实施例中，冷冻保存发生于在第二扩增后收集的TIL。在一些实施例中，冷冻保存发生于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的示例性步骤F中的TIL。在一些实施例中，TIL是冷冻保存于输注袋中。在一些实施例中，TIL在置于输注袋中之前冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存TIL且不将其置于输注袋中。在一些实施例中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。此一般通过将TIL群体放置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清及15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置放于低温小瓶中且储存在-80℃下24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报(Acta Oncologica)》2013,52,978-986。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。一般将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施例中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活性。
在一些实施例中，TIL群体使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用约1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基(进一步包含另外IL-2)冷冻保存。
如上文所述且如图1和/或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的步骤A至E中所示例，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的多个点。在一些实施例中，在第一扩增之后(如例如根据步骤B所提供)经扩增的TIL群体或在根据图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D的一个以上第二扩增之后的经扩增的TIL群体可进行冷冻保存。冷冻保存一般可通过将TIL群体置放于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清及15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置放于低温小瓶中且储存在-80℃下24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报(ActaOncologica)》2013,52,978-986。在一些实施例中，TIL是冷冻保存于5％DMSO中。在一些实施例中，TIL是冷冻保存于细胞培养基加5％DMSO中。在一些实施例中，TIL是根据实例6中提供的方法冷冻保存。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。一般将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施例中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活性。
在某些情况下，图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B的TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可经历来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤C和步骤D，接着在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰TIL将用于疗法中的情况下，来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B或步骤D的TIL群体可进行遗传修饰以用于合适的治疗。
F.扩增TIL的表型特征
在一些实施例中，分析TIL在扩增后的多种表型标记物的表达，该标记物包括本文及实例中所描述的那些。在一些实施例中，检查一种以上表型标记物的表达。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤B中的第一扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤C中的转变期间分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤C中的转变期间且在冷冻保存之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中的第二扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)的步骤D中的两次或更多次扩增之后分析TIL的表型特征。
在一些实施例中，标记物选自CD8及CD28。在一些实施例中，检查CD8的表达。在一些实施例中，检查CD28的表达。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的Gen3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8和/或CD28的表达更高。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8的表达更高。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD28的表达更高。在一些实施例中，高CD28表达指示较年轻更持久的TIL表型。在一些实施例中，测量一种以上调节标记物的表达。
在一些实施例中，在用于扩增本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法的任一步骤期间，未基于CD8和/或CD28表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或所收集TIL群体。
在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL的中枢记忆细胞的百分比更高。在一些实施例中，中枢记忆细胞的记忆标记物选自CCR7及CD62L。
在一些实施例中，CD4+和/或CD8+ TIL记忆子集可分为不同记忆子集。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+ TIL包含初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL包含中枢记忆(central memory，CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+ TIL包含效应记忆(EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+ TIL包含RA+效应记忆/效应(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些实施例中，TIL表达一种以上选自如下的标记物：颗粒酶B、穿孔蛋白及颗粒溶解素。在一些实施例中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施例中，TIL表达穿孔蛋白。在一些实施例中，TIL表达颗粒溶解素。
在一些实施例中，也可使用细胞因子释放分析，评估再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施例中，可评估TIL的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。在一些实施例中，IFN-γ分泌通过ELISA分析测量。在一些实施例中，IFN-γ分泌通过ELISA分析在快速第二扩增步骤之后、在如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)所提供的步骤D之后测量。在一些实施例中，TIL健康通过IFN-γ(IFN-γ)分泌测量。在一些实施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过测定经抗CD3、CD28及CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的含量测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ含量可通过测量IFN-γ释放测定。在一些实施例中，例如如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中提供的Gen 3过程中步骤D的TIL相较于例如如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程中步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D的TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施例中，IFN-γ之分泌增加三倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施例中，使用Quantikine ELISA套件测量IFN-γ。在一些实施例中，测量离体TIL中的IFN-γ。在一些实施例中，测量离体TIL中的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图8B方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于一倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于两倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于三倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于四倍之IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于五倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少100pg/mL至约1000pg/mL或更多的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，在能够分泌至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少550pg/mL、至少600pg/mL、至少650pg/mL、至少700pg/mL、至少750pg/mL、至少800pg/mL、至少850pg/mL、至少900pg/mL、至少950pg/mL或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少300pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少400pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少600pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少700pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少800pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少900pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少10,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少15,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少20,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少25,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少30,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少35,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少40,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少45,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少50,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少100pg/mL/5e5个细胞至约1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞、至少250pg/mL/5e5个细胞、至少300pg/mL/5e5个细胞、至少350pg/mL/5e5个细胞、至少400pg/mL/5e5个细胞、至少450pg/mL/5e5个细胞、至少500pg/mL/5e5个细胞、至少550pg/mL/5e5个细胞、至少600pg/mL/5e5个细胞、至少650pg/mL/5e5个细胞、至少700pg/mL/5e5个细胞、至少750pg/mL/5e5个细胞、至少800pg/mL/5e5个细胞、至少850pg/mL/5e5个细胞、至少900pg/mL/5e5个细胞、至少950pg/mL/5e5个细胞或至少1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少300pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少400pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少600pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少700pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少800pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少900pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少10,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少15,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少20,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少25,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少30,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少35,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少40,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少45,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少50,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。
T及B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)及C(恒定区)决定免疫球蛋白及T细胞受体(TCR)的结合特异性及下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中实施的方法以外的方法。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图8(特别是例如图8A)中示例的称为Gen 2的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第一扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ及δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。在一些实施例中，如本文所述的过程(例如Gen 3过程)相较于其他过程(例如称为Gen 2的过程)，基于样本内独特肽CDR的数目，显示更高的克隆多样性。
在一些实施例中，TIL的活化及耗竭可通过检查一种以上标记物确定。在一些实施例中，活化及耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施例中，标记物的活化及耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG-3。在一些实施例中，标记物之活化及耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施例中，标记物的活化及耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施例中，可确定和/或分析T细胞标记物(包括活化及耗竭标记物)以检查T细胞活化、抑制或功能。在一些实施例中，T细胞标记物可包括但不限于一种以上选自如下的标记物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59。
在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。
在一些实施例中，显示出分泌高于1000pg/mL至300000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于1000pg/mL、高于2000pg/mL、高于3000pg/mL、高于4000pg/mL、高于5000pg/mL、高于6000pg/mL、高于7000pg/mL、高于8000pg/mL、高于9000pg/mL、高于10000pg/mL、高于20000pg/mL、高于30000pg/mL、高于40000pg/mL、高于50000pg/mL、高于60000pg/mL、高于70000pg/mL、高于80000pg/mL、高于90000pg/mL、高于100000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于1000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于2000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于3000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于4000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于5000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于6000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于7000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于8000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于9000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于10000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于20000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于30000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于40000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于50000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于60000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于70000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于80000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于90000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出高于100000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于120000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于140000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于160000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于180000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于200000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于220000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于240000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于260000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于280000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。在一些实施例中，显示出分泌高于300000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)产生的TIL。
在一些实施例中，本发明的扩增方法产生显示出相较于非扩增TIL群体增加的体外颗粒酶B分泌的扩增TIL群体，包括例如如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G中提供的TIL。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少两倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少六倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少七倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少八倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少九倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多含量的TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少一倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少两倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少三倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少四倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌分泌低至少五倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL。
在一些实施例中，测量IFN-γ及颗粒酶B含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量IFN-γ及TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量颗粒酶B及TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量IFN-γ、颗粒酶B及TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施例中，表型特征在冷冻保存之后检查。
G.另外过程实施例
在一些实施例中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1天至7天或约1至8天以获得第二TIL群体，第二TIL群体在数目上大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天或约1天至10天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群体。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至8天以获得第二TIL群体，第二TIL群体在数目上大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至8天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群体。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至5天的时间段。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至7天以获得第二TIL群体，第二TIL群体在数目上大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群体。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约4天的时间段进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移且分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-g500MCS容器)的中，其中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过使第一TIL群体与进一步包含外源性抗原呈递细胞(APC)的培养基接触来进行，步骤(c)中培养基中的APC数目大于步骤(b)中培养基中的APC数目。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，培养基补充有另外外源性APC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改之如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或约2:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目为刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，快速第二扩增中添加的APC数目为刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约1×108个APC至刚好或约3.5×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约3.5×108个APC至刚好或约1×109个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，刚好或约2.5×108个APC添加至初级第一扩增，刚好或约5×108个APC添加至快速第二扩增。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个肿瘤碎片是分布至多个分开的容器中，在各分开的容器中，第一TIL群体在步骤(a)中获得，第二TIL群体在步骤(b)中获得，第三TIL群体在步骤(c)中获得，将来自步骤(c)中多个容器的治疗性TIL群体合并以产生来自步骤(d)的经收集的TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个肿瘤均匀分布至多个分开的容器中。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含至少两个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含两个至二十个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含两个至十五个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含两个至十个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含两个至五个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个分开的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在各容器中对步骤(b)中的第一TIL群体进行起始第一扩增，在同一容器中对由此类第一TIL群体产生的第二TIL群体进行步骤(c)中的快速第二扩增。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，分开的容器各自包含第一透气表面区域。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个肿瘤碎片分布于单一容器中。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，单一容器包含第一透气表面区域。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在包含第二透气表面区域的第二容器中进行。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二容器大于第一容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第二透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在第一容器中进行。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:9的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约1.5:1至刚好或约100:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约50:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约25:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约20:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约10:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少刚好或约50倍。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中的第二时间段开始后刚好或约2天或刚好或约3天，对细胞培养基补充另外的IL-2。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，进一步包括通过冷冻保存过程冷冻保存步骤(d)中的经收集的TIL群体的步骤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，包含在步骤(d)后进行将来自步骤(d)的经收集的TIL群体转移至可选地含有HypoThermosol的输注袋的另外步骤(e)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，包括通过冷冻保存过程冷冻保存包含步骤(e)中的经收集的TIL群体的输注袋的步骤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，使用1:1比率的经收集的TIL群体与冷冻保存培养基来进行冷冻保存过程。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，PBMC为经照射且同种异体的。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中添加至细胞培养物的APC总数为2.5×108个。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中添加至细胞培养物的APC总数为5×108个。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，APC为PBMC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，PBMC为经照射且同种异体的。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，使用基于膜的细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，使用LOVO细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约5至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约10至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约15至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约20至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约25至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约30至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约35至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约40至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约45至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约50至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约27mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约20mm3至刚好或约50mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约21mm3至刚好或约30mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约22mm3至刚好或约29.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约23mm3至刚好或约29mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约24mm3至刚好或约28.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约25mm3至刚好或约28mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约26.5mm3至刚好或约27.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，各碎片具有刚好或约以下的体积：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm3。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含刚好或约30至刚好或约60个碎片，总体积为刚好或约1300mm3至刚好或约1500mm3。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含刚好或约50个碎片，总体积为刚好或约1350mm3。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，多个碎片包含刚好或约50个碎片，总质量为刚好或约1克至刚好或约1.5克。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，细胞培养基提供于为G容器或Xuri细胞袋的容器中。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，细胞培养基中的IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，细胞培养基中的IL-2浓度为约6,000IU/mL。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，冷冻保存培养基包含7％至10％DMSO。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段进行刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(c)中的第二时间段进行刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别进行刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别进行刚好或约5天、6天或7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别进行刚好或约7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约17天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天以下。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天以下。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天以下。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约18天以下。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(d)中收集的治疗性TIL群体包含足以用于TIL的治疗有效剂量的TIL。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，足以用于治疗有效剂量的TIL数为刚好或约2.3×1010个至刚好或约13.7×1010个。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(c)中的第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于16天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于17天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于18天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相对于获自步骤(b)第二细胞群体的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自步骤(c)第三TIL群体的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞显示出增加的CD8及CD28表达。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为密闭容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为G容器。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-10。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-100。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-500。
在其他实施例中，本发明提供了通过如上适用的任何前述段落中描述的方法制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)或OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无添加的抗原呈递细胞(APC)及无添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于16天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于17天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供了一种由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于18天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的功效。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞群体产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的APC的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3之情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的APC的情况下进行之过程制备的TIL，该治疗性TIL群体产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了一种治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3之情况下进行之过程制备的TIL，该治疗性TIL群体产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文中描述，例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括由一个以上来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括进行起始第一扩增约8天的时间段；(iv)该方法包括进行快速第二扩增约11天的时间段。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括由一个以上来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括进行起始第一扩增约8天的时间段；(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物分成至多5个继代培养物，培养该继代培养物约6天。在一些前述实施例中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小以上的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施例中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括由1至约10个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群体；(iv)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体约11天的时间段来进行快速第二扩增步骤。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括由1至约10个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群体；(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物分成至多5个继代培养物，以及在包含IL-2的细胞培养基中培养该继代培养物中的每一者约6天。在一些前述实施例中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小以上的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施例中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，(i)该方法包括由1至约10个来自受试者的肿瘤组织粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在G-REX-100M培养瓶中在包含6000IU IL-2/ml的0.5L CM1培养基的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过以下方式进行起始第一扩增：添加含有6000IU/ml IL-2、30ng/ml OKT-3及约108个饲养细胞的0.5L CM1培养基，培养约8天的时间段；(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：(a)将第二TIL群体转移至含有具有3000IU/ml IL-2、30ng/ml OKT-3及5×109个饲养细胞的5L CM2培养基的G-REX-500MCS培养瓶中，培养约5天；(b)通过将109个TIL转移至含有具有3000IU/ml IL-2的5L AIM-V培养基的至多5个G-REX-500MCS培养瓶中之每一者中而将培养物分成至多5个继代培养物，培养该继代培养物约6天。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，其包括：(a)通过培养获自供体的第一T细胞群体来进行第一T细胞群体的起始第一扩增，以实现生长及启动第一T细胞群体的活化；(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰退后，通过培养第一T细胞群体进行第一T细胞群体的快速第二扩增以实现生长及增强第一T细胞群体的活化，获得第二T细胞群体；以及(c)收集第二T细胞群体。在其他实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移至大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增步的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移至大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在第二容器中之较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至6天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大及规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)的起始第一扩增进行至多7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多8天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多11天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天或8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天或8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多8天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含OKT-3、IL-2及抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第一T细胞群体在包含OKT-3、IL-2及抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、IL-2及第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、IL-2及第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2及第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二APC群体中的APC的数目与第一APC群体中的APC的数目的比率为约2:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一APC群体中的APC的数目为约2.5×108，第二APC群体中的APC的数目为约5×108。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以2个APC层的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自4至8个APC层的范围内的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中层叠至第一透气表面上的APC层的平均数目与在步骤(a)中层叠至第一透气表面上的APC层的平均数目的比率为2:1。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，APC为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，PBMC经照射且对于第一T细胞群体的供体为外源性的。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，T细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，T细胞为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过自供体的全血分离而获得。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过自供体的单采产物分离而获得。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过T细胞表型的正向或负向选择自供体的全血或单采产物分离。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，T细胞表型为CD3+及CD45+。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在进行第一T细胞群体的起始第一扩增之前，自NK细胞分离T细胞。在其他实施例中，通过自第一T细胞群体移除CD3-CD56+细胞来将第一T细胞群体中的T细胞与NK细胞分离。在其他实施例中，通过使用移除CD3-CD56+细胞级分且回收阴性级分的门控策略对第一T细胞群体进行细胞分选，自第一T细胞群体移除CD3-CD56+细胞。在其他实施例中，前述方法用于以高百分比的NK细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以高百分比的CD3-CD56+细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以存在大量NK细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于从患有以存在大量NK细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于从患有以存在大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于从患有卵巢癌的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，将刚好或约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞接种在容器中，以开始此类容器中的初级第一扩增培养。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，将第一T细胞群体分布至多个容器中，在各容器中接种刚好或约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞，以开始此类容器中的初级第一扩增培养。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中收集的第二T细胞群体为治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养由受试者肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得的肿瘤样本约3天而由该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约7天或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体在数目上大于第一TIL群体；(iii)通过用另外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群体的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，在快速第二扩增中添加的APC数目为在步骤(ii)中添加的APC数目的至少2倍，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在包含第二透气表面区域的容器中进行；(iv)收集获自步骤(iii)的治疗性TIL群体；以及(v)将来自步骤(iv)的经收集的TIL群体转移至输注袋。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：(i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养由受试者肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得的肿瘤样本约3天而由该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约7天或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体在数目上大于第一TIL群体；(iii)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(iv)收集获自步骤(iii)的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上继代培养物，向各继代培养物补充另外数量的第三培养基且培养约6天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上继代培养物，向各继代培养物补充包含IL-2的第四培养基且培养约6天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成至多5个继代培养物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中的所有步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，其包括：(i)通过培养来自肿瘤样本的第一T细胞群体来进行第一T细胞群体的起始第一扩增，以实现生长及启动第一T细胞群体的活化，该肿瘤样本由供体肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得；(ii)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰退后，通过培养第一T细胞群体进行第一T细胞群体的快速第二扩增以实现生长及增强第一T细胞群体的活化，获得第二T细胞群体；以及(iv)收集第二T细胞群体。在一些实施例中，肿瘤样本由多个粗针活体组织切片获得。在一些实施例中，多个粗针活体组织切片选自如下：2、3、4、5、6、7、8、9及10个粗针活体组织切片。
在一些实施例中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，T细胞或TIL由肿瘤消化物获得。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶及1.0mg/mL胶原蛋白酶)孵育肿瘤，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术有限公司的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在一些实施例中，将肿瘤置放于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含一种以上解离(消化)酶，例如(但不限于)胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、蛋白酶型XIV(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，及它们的任何组合。在其他实施例中，将肿瘤置放于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、中性蛋白酶(分散酶)及脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)。
V.药物组合物、剂量及给药方案
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增和/或遗传修饰的TIL、MIL或PBL(包括遗传修饰以表达CCR的TIL、MIL或PBL)作为药物组合物施用患者。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内及淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施例中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC或黑色素瘤的情况下。在一些实施例中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症为NSCLC。在一些实施例中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及9×1013。在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供在本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将视施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别及年龄、待治疗受试者的体重及主治医师的偏好及经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将视所治疗的人或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置及开处方医师的判断而定。
在一些实施例中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施例中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施例中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及9×1013。在一些实施例中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的试剂的任一种的接受模式，包括鼻内及经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
在其他实施例中，本发明提供了一种输注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体及药学上可接受的载体。
在其他实施例中，本发明提供了一种输注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供了一种如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体的冷冻保存制剂。
在其他实施例中，本发明提供了一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体及冷冻保存培养基。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的TIL组合物，冷冻保存培养基含有DMSO。
在其他实施例中，本发明提供了经修改之如上任何前述段落中描述的TIL组合物，冷冻保存培养基含有7％至10％DMSO。
在其他实施例中，本发明提供了一种如上在任何前述段落中描述的TIL组合物的冷冻保存制剂。
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内及淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施例中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别在癌症为NSCLC的情况下。在一些实施例中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症为NSCLC。在一些实施例中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及9×1013。在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供在本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将视施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别及年龄、待治疗受试者的体重及主治医师的偏好及经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将视所治疗之人或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置及开处方医师的判断而定。
在一些实施例中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过诸如静脉内注射的注射进行。在一些实施例中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL之施用可视需要而继续。
在一些实施例中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及9×1013。在一些实施例中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012及5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的试剂的任一种的接受模式，包括鼻内及经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
VI.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集及TIL培养。此类方法均已描述于例如以全文引用的方式并入本文中的Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35(3):283-292的领域中。下文贯穿各个部分，包括实例，描述了治疗方法的实施例。
发现根据本文所述的方法，包括例如如上文步骤A至F中所描述或根据上文步骤A至F(也如例如图1和/或图8中所示)而产生的扩增TIL在治疗癌症患者方面的特殊用途(例如，如以全文引用的方式并入本文中的Goff等人,《临床肿瘤学杂志》,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所描述)。在一些实施例中，如先前描述由经切除转移性黑色素瘤保存物生长TIL(参见以全文引用的方式并入本文中的Dudley等人,《免疫疗法杂志》,2003,26:332-342)。可在无菌条件下分割新鲜肿瘤。可收集代表样本以用于正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施例中，自每位患者获得5、10、15、20、25或30个样本。在一些实施例中，自每位患者获得20、25或30个样本。在一些实施例中，自每位患者获得20、22、24、26或28个样本。在一些实施例中，自每位患者获得24个样本。可将样本置于24孔板的个别孔中，维持于含高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤破坏和/或TIL增殖。如本文所述，可将在处理后剩余活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬浮液并冷冻保存。
在一些实施例中，可对成功生长的TIL进行取样以用于表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)，在可用时针对自体肿瘤进行测试。若过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)含量＞200pg/mL且为背景的2倍，则可认为TIL具反应性。(Goff等人,《免疫疗法杂志》,2010,33:840-847；以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，可选择已证明具自体反应性或充足生长模式的培养物用于第二扩增(例如根据图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增，包括有时称作快速扩增(REP)的第二扩增)。在一些实施例中，选择具有高自体反应性(例如在第二扩增期间高度增殖)的经扩增TIL用于另外的第二扩增。在一些实施例中，选择具高自体反应性(例如在如图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增期间高度增殖)的TIL用于根据图1和/或图8的步骤D的另外的第二扩增。
可通过针对表面标记物CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(碧迪生物科学)以及通过本文所述的任一种方法分析输注袋TIL的冷冻保存样本的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-g的升高定义为＞100pg/mL及大于43的基线水平。
在一些实施例中，通过本文所提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL获得对TIL的临床功效的惊人改善。在一些实施例中，相较于通过除本文所述方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中示例的方法外的方法)产生的TIL，通过本文所提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL显示出增加的临床功效。在一些实施例中，除本文所述的方法外的方法包括称作过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施例中，通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量增加的功效。在一些实施例中，相较于通过除本文所述方法外的方法(包括例如除图1和/或图8示例的方法外的方法)产生的TIL，通过本文所提供的方法，例如图1中示例的方法产生的TIL显示出类似反应时间及安全性概况。
在一些实施例中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，该方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施例中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施例中，使用Quantikine ELISA套件测量IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中的IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中的IFN-γ。在一些实施例中，IFN-γ指示在治疗肿瘤中的治疗功效和/或增加的临床功效。
在一些实施例中，通过本发明的方法制备的TIL，包括如例如图1中所描述的那些TIL。在一些实施例中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施例中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ。
在一些实施例中，通过本发明的方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1和/或图8中示例的方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL显示出增加的多克隆性。在一些实施例中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施例中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施例中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)，如本领域已知以及本文所述。
A.治疗癌症的方法
本文所述的组合物及方法可用于一种治疗疾病的方法中。在一些实施例中，其用于治疗成人患者或儿科患者中的过度增殖性病症，例如癌症。其也可用于治疗如本文及以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施例中，过度增殖性病症为癌症。在一些实施例中，过度增殖性病症为实体肿瘤癌症。在一些实施例中，实体肿瘤癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。
在一些实施例中，过度增殖性病症为造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，血液科恶性疾病选自如下：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤及多发性骨髓瘤。在一些实施例中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，癌症为造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，癌症是造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，癌症是造血系统恶性肿瘤。
在一些实施例中，癌症为前述癌症中的一者，包括实体肿瘤癌症及造血系统恶性肿瘤，其对于用至少一种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的。在一些实施例中，癌症对用至少两种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。在一些实施例中，癌症对用至少三种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。
在一些实施例中，癌症为微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复缺陷型癌症。MSI-H及dMMR癌症及其检测已描述于Kawakami等人，《当前肿瘤学的治疗选择(Curr.Treat.Options Oncol.)》2015,16,30中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是人。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是非人。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是伴侣动物。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂治疗。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼、达拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、匹马色替尼、瑞法替尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼、达拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物；且难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、匹马色替尼、瑞法替尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症是儿科癌症。
在一些实施例中，本发明一种包括治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症是葡萄膜黑色素瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该葡萄膜黑色素瘤是脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症是神经母细胞瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症是肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该肉瘤是骨肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该肉瘤是软组织肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该软组织肉瘤是横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤或原始神经外胚层肿瘤(PNET)。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症是中枢神经系统(CNS)相关癌症。在一些实施例中，儿科癌症难以用化学疗法治疗。在一些实施例中，儿科癌症难以用放射疗法治疗。在一些实施例中，儿科癌症难以用地努图希单抗(dinutuximab)治疗。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该CNS相关癌症为神经管胚细胞瘤、松果体母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤或神经胶母细胞瘤。
本文中所描述的组合物及方法可用于治疗癌症的方法，其中，癌症难以用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗或对预先治疗具有抗性。在一些实施例中，患者是抗PD-1或抗PD-L1抗体的原发性难治性患者。在一些实施例中，患者未显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应。在一些实施例中，患者显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应，随后患者的癌症进展。在一些实施例中，癌症难以用抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1或抗PD-L1抗体与至少一种化学治疗剂的组合治疗。在一些实施例中，先前化学治疗剂为卡铂、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)和/或顺铂。在一些先前实施例中，化学治疗剂是铂双重化学治疗剂。在一些实施例中，铂双重疗法包含选自顺铂及卡铂的第一化学治疗剂，及选自长春瑞滨、吉西他滨及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel))的第二化学治疗剂。在一些实施例中，铂双重化学治疗剂与培美曲塞组合。
在一些实施例中，NSCLC为PD-L1阴性和/或来自患有表达PD-L1且肿瘤比例评分(TPS)<1％的癌症的患者，如本文别处所描述。
在一些实施例中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体及铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，该铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂及卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自如下：长春瑞滨、吉西他滨及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型紫杉醇)。
在一些实施例中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体、培美曲塞及铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，该铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂及卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自如下：长春瑞滨、吉西他滨及紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型紫杉醇)。
在一些实施例中，NSCLC已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC已用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC患者尚未接受治疗。在一些实施例中，NSCLC尚未用抗PD-1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC尚未用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC先前已用化学治疗治疗。在一些实施例中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗，但目前不再用该化学治疗剂治疗。在一些实施例中，NSCLC患者未使用过抗PD-1/PD-L1。在一些实施例中，NSCLC患者具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者未经NSCLC治疗或为化学疗法后治疗，但未经PD-1/PD-L1治疗。在一些实施例中，NSCLC患者未经治疗或接受化学治疗剂治疗后但未经抗PD-1/PD-L1治疗且具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者在基线时患有大块疾病。在一些实施例中，受试者在基线时患有大块疾病且具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者无可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者未经治疗或接受化学治疗剂治疗后但未经抗PD-1/PD-L1治疗且无可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，患者在基线时患有大块疾病且无可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者具有未经治疗的NSCLC或接受化疗后(例如化学治疗剂后)但未经抗PD-1/PD-L1治疗，该患者具有低PD-L1表达和/或在基线时具有大块疾病。在一些实施例中，当在横向或冠状面中测量的最大肿瘤直径大于7cm时指示为大块疾病。在一些实施例中，当存在具有20mm以上的短轴直径的肿胀淋巴结时指示为大块疾病。在一些实施例中，化学治疗剂包括NSCLC的标准护理治疗剂。
在一些实施例中，通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施例中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗且在该抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-L1抗体治疗且在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施例中，通过本发明的方法(包括如例如图1或图8中所描述的那些方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1或图8中示例的那些方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL显示出增加的多克隆性。在一些实施例中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示对癌症治疗的治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施例中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施例中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
在一些实施例中，使用如本文所述的一种以上测试方法通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施例中，患有NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，NSCLC肿瘤具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗且在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗且在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗且在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗且在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施例中，NSCLC是显示出肿瘤比例评分(TPS)的NSCLC，或在抗PD-1或抗PD-L1疗法之前自患者获取的活肿瘤细胞的百分比，在任何强度下显示部分或完全膜染色的PD-L1蛋白的百分比低于1％(TPS<1％)。在一些实施例中，NSCLC为显示出选自如下TPS的NSCLC：<50％、<45％、<40％、<35％、<30％、<25％、<20％、<15％、<10％、<9％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.9％、<0.8％、<0.7％、<0.6％、<0.5％、<0.4％、<0.3％、<0.2％、<0.1％、<0.09％、<0.08％、<0.07％、<0.06％、<0.05％、<0.04％、<0.03％、<0.02％及<0.01％。在一些实施例中，NSCLC为显示出选自如下TPS的NSCLC：约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％及约0.01％。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与1％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.9％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.8％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC系显示出0％与0.7％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.6％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.5％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.4％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.3％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.2％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.1％之间的TPS的NSCLC。TPS可通过本领域中已知的方法测量，例如描述于Hirsch等人,《胸肿瘤学期刊(J.Thorac.Oncol.)》》2017,12,208-222中的那些方法或用于在使用帕博利珠单抗或其他抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗前测定TPS的那些方法。也可使用经美国食品药物管理局批准的用于测量TPS的方法。在一些实施例中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施例中，在循环肿瘤细胞上发现PD-L1。
在一些实施例中，部分膜染色包括1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。在一些实施例中，完整膜染色包括大致100％膜染色。
在一些实施例中，测试PD-L1可涉及测量患者血清中PD-L1的含量。在这些实施例中，患者血清中PD-L1的测量移除肿瘤异质性的不确定性及患者进行连续活体组织切片的不适。
在一些实施例中，相较于基线或标准水平升高的可溶性PD-L1与NSCLC的恶化的预后相关。参见例如Okuma等人，《临床肺癌(Clinical Lung Cancer)》,2018,19,410-417；Vecchiarelli等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》,2018,9,17554-17563。在一些实施例中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施例中，PD-L1在循环肿瘤细胞上表达。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的受试者或患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该受试者或患者具有以下中的至少一者：
i.PD-L1的预定肿瘤比例评分(TPS)<1％，
ii.PD-L1的TPS分数为1％-49％，或
iii.一个以上驱动突变的预定缺失，
其中，驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变及GNA11突变，其中，该方法包括：
(a)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；以及
(h)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达及PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变及GNA11突变，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％且确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达及PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变及GNA11突变，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分小于约1％且确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达及PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％且确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达及PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分小于约1％且确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将获自该受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自该受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，在分别施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体及TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，该方法进一步包括在向受试者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、子宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)及胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为子宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的治疗性TIL群体，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的TIL组合物，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物，其中，在施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其进一步包括在向患者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、子宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)及胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为子宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为神经胶母细胞瘤。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供了经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，其包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供了任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物在治疗患者的癌症的方法中的用途，该方法包括向患者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案，随后向受试者施用治疗有效剂量的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
1.与PD-1及PD-L1抑制剂的组合
在一些实施例中，提供给患有癌症的患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗或可包括组合治疗，该组合治疗包括TIL及一种以上PD-1和/或PD-L1抑制剂。
计划性死亡1(PD-1)为由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)T细胞、活化单核细胞及树突状细胞表达的288氨基酸跨膜免疫检查点受体蛋白。PD-1，也称为CD279，属于CD28家族，在人中是由2号染色体上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、跨膜区及细胞内结构域组成，该细胞内域含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)及免疫受体酪氨酸切换基序(ITSM)。已知PD-1及其配体(PD-L1及PD-L2)在免疫耐受性中起重要作用，如Keir等人,《免疫学年度评论》2008,26,677-704中所描述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)及PD-L2(也称为B7-DC或CD273)表达于肿瘤细胞及基质细胞上，其可能遇到表达PD-1的活化T细胞，导致对T细胞的免疫抑制。PD-L1为由人9号染色体上的Cd274基因编码的290氨基酸跨膜蛋白。使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1与其配体PD-L1及PD-L2之间的相互作用，可克服免疫抗性，如近期临床研究，例如Topalian等人,《新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)》2012,366,2443-54中所描述的研究所显示。PD-L1表达在许多肿瘤细胞系上，而PD-L2主要表达在树突状细胞上及表达在一些肿瘤株上。除T细胞(其在活化后诱导性表达PD-1)以外，PD-1也表达于B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、活化单核细胞及树突状细胞上。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者之HNSCC。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合，而无需进一步与一种以上CTLA抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，TIL及PD-1抑制剂作为用于治疗NSCLC的组合疗法或协同疗法施用。
在一些实施例中，NSCLC尚未经历先前疗法。在一些实施例中，将PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施例中，将PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂可为本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。关于PD-1抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”及“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-1抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-1抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，PD-1抑制剂为多克隆抗体。在一些实施例中，PD-1抑制剂为单克隆抗体。在一些实施例中，PD-1抑制剂竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。在一些实施例中，抗体竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-1、以约90pM以下的KD结合人PD-1、以约80pM以下的KD结合人PD-1、以约70pM以下的KD结合人PD-1、以约60pM以下的KD结合人PD-1、以约50pM以下的KD结合人PD-1、以约40pM以下的KD结合人PD-1、以约30pM以下的KD结合人PD-1、以约20pM以下的KD结合人PD-1、以约10pM以下的KD结合人PD-1，或以约1pM以下的KD结合人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1、以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1、以约8×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1、以约8.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1、以约9×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1，或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约2×10-51/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1，或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.9×10-51/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1，或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗(可自百时美施贵宝公司以OPDIVO商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗为阻断PD-1受体的完全人IgG4抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体为免疫球蛋白G4κ抗(人CD274)抗体。纳武单抗经分配化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4且也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106及ONO-4538。纳武单抗的制备及特性描述于美国专利号8,008,449及国际专利公开号WO 2006/121168中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗在各种形式的癌症中的临床安全性及功效已描述于Wang等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》2014,2,846-56；Page等人，《医学年评(Ann.Rev.Med.)》,2014,65,185-202；以及Weber等人,《临床肿瘤学杂志》,2013,31,4311-4318中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗的氨基酸序列阐述于表18中。纳武单抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”及360”-418”处具有重链内二硫键；在23'-88'、134'-194'、23”'-88”'及134”'-194”'处具有轻链内二硫键；在127-214'、127”-214”'处具有重链-轻链间二硫键；在219-219”及222-222”处具有重链-重链间二硫键；且在290、290”处具有N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：158所示的重链及SEQ ID NO：159所示的轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含纳武单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：160中所示的序列，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：161中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160及SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160及SEQID NO：161中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160及SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160及SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160及SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163及SEQ ID NO：164中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166及SEQ ID NO：167中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考纳武单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中，该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。
表18：参考纳武单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用纳武单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每2周以约240mg进行施用。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每4周以约480mg进行施用。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每3周于同一天施用约1mg/kg纳武单抗，然后施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg或每4周施用480mg纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗且每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每3周以约360mg施用纳武单抗，加上每6周1mg/kg伊匹木单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约240mg或每4周以480mg施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每3周以约360mg施用纳武单抗且每6周施用1mg/kg伊匹木单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg、每4周施用480mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗成人及小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人及小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人及小儿患者之高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗以治疗<40kg的小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人及小儿患者之高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人及小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，以约1mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用纳武单抗240mg，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，以约1mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包括帕博利珠单抗(可自美国新泽西州凯尼尔沃思之默克公司以KEYTRUDA商购)或抗原结合片段、缀合物或变体。帕博利珠单抗经分配CAS登记号1374853-91-4且也称为兰立珠单抗、MK-3475及SCH-900475。帕博利珠单抗具有免疫球蛋白G4抗(人蛋白PDCD1(计划性细胞死亡1))抗体，含(人小家鼠单克隆重链)二硫键与人小家鼠单克隆轻链二聚体结构。帕博利珠单抗的结构也可描述为免疫球蛋白G4抗(人计划性细胞死亡1)抗体；含人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')二硫键与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)双二硫键。帕博利珠单抗的特性、用途及制备描述于国际专利公开号WO 2008/156712 A1、美国专利号8,354,509以及美国专利申请公开号US2010/0266617 A1、US2013/0108651 A1及US2013/0109843 A2中，其公开内容以引用的方式并入本文中。帕博利珠单抗在各种形式的癌症中的临床安全性及功效描述于Fuerst,《肿瘤学时报(Oncology Times)》,2014,36,35-36；Robert等人,《柳叶刀(Lancet)》,2014,384,1109-17；以及Thomas等人,《生物治疗专家意见(Exp.Opin.Biol.Ther.)》,2014,14,1061-1064中。帕博利珠单抗的氨基酸序列阐述于表19中。帕博利珠单抗包括以下二硫键：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425及367”-425”；以及以下糖基化位点(N)：Asn-297及Asn-297”。帕博利珠单抗为在Fc区中含稳定化S228P突变的IgG4/κ同种型；IgG4铰链区中此突变的插入防止形成IgG4抗体通常观测到的半分子。帕博利珠单抗在各重链的Fc结构域内在Asn297处异质糖基化，使得完整抗体的分子量为约149kDa。帕博利珠单抗的主要糖型为岩藻糖基化去半乳糖基二触角聚糖形式(G0F)。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：168所示的重链及SEQ ID NO：169所示的轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含帕博利珠单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：170中所示的序列，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：171中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173及SEQ ID NO：174中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176及SEQ ID NO：177中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考帕博利珠单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中，该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。
表19：参考帕博利珠单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，小儿每3周以约约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷大肠直肠癌(dMMR)CRC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫颈癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫颈癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗默克氏细胞癌(MCC)。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天两次经口施用阿西替尼(axitinib)5mg以治疗RCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫内膜癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天一次经口施用用于非MSI-H或dMMR肿瘤的乐伐替尼(lenvatinib)20mg以治疗子宫内膜癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗cSCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TNBC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，若患者或受试者为成人，即治疗成人适应症，则可采用另外的每6周400mg的给药方案。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为可商购的抗PD-1单克隆抗体，例如抗m-PD-1单克隆J43(目录号BE0033-2)及RMP1-14(目录号BE0146)(美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio XCell,Inc.)。多种可商购的抗PD-1抗体为本领域一般本领域技术人员所知。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为公开于美国专利号8,354,509或美国专利申请公开号2010/0266617A1、2013/0108651A1、2013/0109843A2中的抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂为描述于美国专利号8,287,856、8,580,247及8,168,757以及美国专利申请公开号2009/0028857A1、2010/0285013A1、2013/0022600A1及2011/0008369A1中的抗PD-1抗体，其教导内容以引用的方式并入本文中。在其他实施例中，PD-1抑制剂为公开于美国专利号8,735,553B1中的抗PD-1抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂为皮立珠单抗，也称为CT-011，其描述于美国专利号8,686,119中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，PD-1抑制剂可为小分子或肽或肽衍生物，例如美国专利号8,907,053、9,096,642及9,044,442以及美国专利申请公开号US2015/0087581中所描述的小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-恶二唑化合物及衍生物，例如美国专利申请公开号2015/0073024中所描述的那些；环状肽模拟化合物及衍生物，例如美国专利申请公开号US2015/0073042中所描述的那些；环状化合物及衍生物，例如美国专利申请公开号US 2015/0125491中所描述的那些；1,3,4-恶二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物，例如国际专利申请公开号WO 2015/033301中所描述的那些；基于肽的化合物及衍生物，例如国际专利申请公开号WO 2015/036927及WO 2015/04490中所描述的那些；或基于肽的巨环化合物及衍生物，例如美国专利申请公开号US2014/0294898中所描述的那些；它们各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂是西米普利单抗，其可商购自再生元公司(Regeneron,Inc.)。
在一些实施例中，TIL及PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂以用于治疗NSCLC的组合疗法或协同疗法施用。
在一些实施例中，NSCLC尚未经历先前疗法。在一些实施例中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施例中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂可为本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。关于PD-L1及PD-L2抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”及“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-L1或PD-L2抑制剂时也可指代化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施例中，本文所述的组合物、过程及方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为小分子。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为多克隆抗体。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为单克隆抗体。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争结合PD-L1或PD-L2和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。在一些实施例中，抗体竞争结合PD-L1或PD-L2，和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。
在一些实施例中，本文提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具有选择性，因为化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度相比其与其他受体(包括PD-L2受体)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施例中，化合物结合至PD-L1受体的结合常数比结合至PD-L2受体高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
在一些实施例中，本文提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具有选择性，因为化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度相比其与其他受体(包括PD-L1受体)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施例中，化合物结合至PD-L2受体的结合常数比结合至PD-L1受体高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
不受任何理论束缚，认为肿瘤细胞表达PD-L1，T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞对PD-L1的表达不为PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效所需。在一些实施例中，肿瘤细胞表达PD-L1。在其他实施例中，肿瘤细胞不表达PD-L1。在一些实施例中，方法可包括PD-1及PD-L1抗体(例如本文所述的PD-1及PD-L1抗体)与TIL的组合。可同时或依序施用PD-1及PD-L1抗体与TIL的组合。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约90pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约80pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约70pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约60pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约50pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约40pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2，或以约30pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2，或以约1×1061/M·s或更快的kassoc结合至人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-L1或PD-L2、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-1、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人PD-L1或PD-L2，或以约3×10-51/s或更慢的kdissoc结合至人PD-L1或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断人PD-1或阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736(其可自马里兰州盖瑟斯堡阿斯特捷利康制药公司子公司Medimmune,LLC商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利号8,779,108或美国专利申请公开号2013/0034559中的抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的临床功效已描述于Page等人,《年度医学评论》,2014,65,185-202；Brahmer等人,《临床肿瘤学杂志》2014,32,5s(增刊，摘要8021)；以及McDermott等人,《癌症治疗评论(Cancer TreatmentRev.)》,2014,40,1056-64中。德瓦鲁单抗的制备及特性描述于美国专利号8,779,108中，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的氨基酸序列阐述于表20中。德瓦鲁单抗单克隆抗体包括22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429及371”-429'处的二硫键；以及Asn-301及Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：178所示的重链及SEQ ID NO：179所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178及SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含德瓦鲁单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：180中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：181中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180及SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180及SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180及SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180及SEQ IDNO：181中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180及SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183及SEQ ID NO：184中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186及SEQ ID NO：187中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考德瓦鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。
表20：参考德瓦鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可自默克集团/雪兰诺商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备及特性描述于美国专利申请公开号US2014/0341917 A1中，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿维鲁单抗的氨基酸序列阐述于表21中。阿维鲁单抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”及370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22”'-90”'及138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；223-215'及223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；229-229”及232-232”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合物二触角CHO型聚糖；以及450及450'处之H CHS K2 C末端赖氨酸裁剪。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：188所示的重链及SEQ ID NO：189所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：190中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：191中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190及SEQ IDNO：191中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：194中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196及SEQ ID NO：197中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考阿维鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。
表21：参考阿维鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为阿替利珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞尔罗氏的子公司基因泰克公司以TECENTRIQ商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利号8,217,149中的抗体，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利申请公开号2010/0203056A1、2013/0045200A1、2013/0045201A1、2013/0045202A1或2014/0065135A1中的抗体，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的制备及特性描述于美国专利号8,217,149中，其公开内容以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的氨基酸序列阐述于表22中。阿替利珠单抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”及368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23”'-88”'及134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；221-214'及221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；227-227”及230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；以及298及298'处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4>A)。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：198所示的重链及SEQ ID NO：199所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列的重链及轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含阿替利珠单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：200中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：201中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO：200及SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203及SEQ ID NO：204中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206及SEQ ID NO：207中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体为药物管理机构参考阿替利珠单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。
表22：参考阿替利珠单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包括美国专利申请公开号US2014/0341917 A1中所描述的那些抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在其他实施例中，也包括与这些抗体中的任一种竞争结合至PD-L1的抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为MDX-1105，也称为BMS-935559，其公开于美国专利号US 7,943,743中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利号US 7,943,743中的抗PD-L1抗体，该专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为可商购单克隆抗体，例如INVIVOMAB抗m-PD-L1选克隆10F.9G2(目录号BE0101，美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell,Inc.)。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为可商购单克隆抗体，例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多种可商购抗PD-L1抗体为本领域一般本领域技术人员所知。
在一些实施例中，PD-L2抑制剂为可商购单克隆抗体，例如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2aκ同种型(目录号329602，加利福尼亚圣地亚哥Biolegend,Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗体(目录号SAB3500395，密苏里州圣路易斯西格玛奥瑞奇公司)或本领域一般本领域技术人员已知的其他可商购抗PD-L2抗体。
2.与CTLA-4抑制剂的组合
在一些实施例中，提供给患有癌症的患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗或可包括组合治疗，该组合治疗包括TIL及一种以上CTLA-4抑制剂。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂组合施用，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL可与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合施用以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。
在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的癌症的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。在一些实施例中，癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤及原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌及子宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨及软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的黑色素瘤的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的HNSCC的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂组合，而无需进一步与一种以上PD-1抑制剂和/或一种以上PD-L1抑制剂组合，以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。
在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，本发明提供了如本文所述产生的TIL与一种以上CTLA-4抑制剂及一种以上PD-1抑制剂及一种以上PD-L1抑制剂组合以用于治疗患者或受试者的子宫颈癌的用途。在一些实施例中，患者或受试者先前未经一种以上免疫检查点抑制剂治疗；换言之，患者或受试者为未使用过免疫检查点抑制剂的患者或受试者。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自如下：计划性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、计划性细胞死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂以及它们的组合。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族成员且表达于辅助T细胞表面上。CTLA-4为CD28依赖性T细胞活化的负向调节因子且充当适应性免疫反应的检查点。类似于T细胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4结合抗原在细胞上呈递CD80及CD86。CTLA-4将抑制因子信号递送至T细胞，而CD28递送刺激信号。针对人CTLA-4的人抗体已描述为许多疾病病状的免疫刺激调节剂，例如治疗或预防病毒及细菌感染且治疗癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。已在临床试验中研究多种完全人抗人CTLA-4单克隆抗体(mAb)，用于治疗各种类型的实体肿瘤，该抗体包括但不限于伊匹木单抗(MDX-010)及曲美单抗(CP-675,206)。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂可为本领域已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。关于CTLA-4抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”及“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的CTLA-4抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及CTLA-4抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
适用于本发明的方法的CTLA-4抑制剂包括但不限于抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激动共刺激路径的CTLA-4抑制剂、公开于PCT公开号WO 2001/014424中的抗体、公开于PCT公开号WO 2004/035607中的抗体、公开于美国公开号2005/0201994中的抗体及公开于授与欧洲专利号EP 1212422B1中的抗体，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227及6,984,720中；PCT公开号WO 01/14424及WO 00/37504中；以及美国公开号2002/0039581及2002/086014中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可用于本发明方法中之其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利号6,682,736及6,207,156；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》,22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,《癌症研究》,58:5301-5304(1998)；以及美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003及7,132,281，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
另外的CTLA-4抑制剂包括但不限于以下：通常由于经活化而能够破坏CD28抗原结合至其同源配体的能力、抑制CTLA-4结合至其同源配体的能力、增强通过共刺激路径的T细胞反应、破坏B7结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏B7活化共刺激路径的能力、破坏CD80结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD80活化共刺激路径的能力、破坏CD86结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD86活化共刺激路径的能力及破坏共刺激路径的任何抑制剂。这必定包括：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的RNAi抑制剂(单链及双链)；以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂以如下Kd结合至CTLA-4，该Kd为约10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下，例如10-13M与10-16M之间，或在任两个前述值作为端点的任何范围内。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd不超过伊匹木单抗的Kd的10倍。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd与伊匹木单抗的Kd约相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值高不超过10倍。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值约相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些实施例中，以如下量使用CTLA-4抑制剂，该量足以相对于适合的对照将CTLA-4的表达抑制和/或使CTLA-4的生物活性降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如50％与75％之间、75％与90％之间、或90％与100％之间。在一些实施例中，以如下量使用CTLA-4路径抑制剂，该量足以通过使CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合相对于适合的对照减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于适合的对照减少50％与75％之间、75％与90％之间、或90％与100％之间来降低CTLA-4的生物活性。在评定或量化所关注的药剂的效应的上下文中的适合对照通常为尚未暴露于所关注之药剂(例如CTLA-4路径抑制剂)或用该药剂处理的相当的生物系统(例如细胞或受试者)(或已暴露于可忽略量或用可忽略量进行处理)。在一些实施例中，生物系统可充当其自身的对照，例如可在暴露于药剂或用药剂处理之前评定生物系统并与开始或结束暴露或处理之后的状态进行比较。在一些实施例中，可使用历史对照。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗(可自百时美施贵宝公司以Yervoy商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹木单抗指抗CTLA-4抗体，一种来源于具有编码重链及轻链的人基因以产生功能性人谱系的转基因小鼠的完全人IgG1κ抗体。伊匹木单抗也可通过其CAS登记号477202-00-9及在PCT公开号WO 01/14424中提及，该公开出于所有目的以全文引用的方式并入。其以抗体10DI的形式公开。特别是，伊匹木单抗含有轻链可变区及重链可变区(具有包含SEQ ID NO：211的轻链可变区且具有包含SEQ ID NO：210的重链可变区)。伊匹木单抗的药物组合物包括含有伊匹木单抗及一种以上稀释剂、媒剂或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹木单抗的药物组合物的实例描述于国际专利申请公开号WO 2007/67959中。伊匹木单抗可静脉内(IV)施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：208所示的重链及SEQ ID NO：209所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列的重链及轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含伊匹木单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：210中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：211中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210及SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210及SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210及SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210及SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210及SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213及SEQ ID NO：214中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216及SEQ ID NO：217中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考伊匹木单抗批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。伊匹木单抗的氨基酸序列阐述于表23中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。
表23：伊匹木单抗的氨基酸序列
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，其中，伊匹木单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用伊匹木单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约mg/kg施用伊匹木单抗，持续最多4次剂量以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约10mg/kg施用伊匹木单抗，持续4次剂量，然后每12周施用10mg/kg，持续至多3年，以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每3周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，紧接着在同一天施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，在完成组合的4次剂量之后，可根据标准给药方案针对晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每3周经30分钟以约1mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在完成组合物的4次剂量之后，如根据标准给药方案所推荐针对高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每3周经30分钟以约3mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用1mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，在完成组合的4次剂量之后，根据标准给药方案针对肝细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每2周施用3mg/kg纳武单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，加上每3周360mg纳武单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每3周施用360mg纳武单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
曲美单抗(也称为CP-675,206)为完全人IgG2单克隆抗体且CAS编号为745013-59-6。曲美单抗以抗体11.2.1形式公开于美国专利号6,682,736(以引用的方式并入本文中)中。曲美单抗的重链及轻链的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中。已在临床试验中针对治疗包括黑色素瘤及乳腺癌的各种肿瘤研究了曲美单抗；每4或12周以0.01与15mg/kg之间的剂量范围呈单次剂量或多次剂量静脉内施用曲美单抗。在本发明提供的方案中，局部施用，尤其是皮内或皮下施用曲美单抗。皮内或皮下施用的曲美单抗的有效量通常在每人5-200毫克/剂的范围内。在一些实施例中，曲美单抗的有效量在每人每剂10-150毫克/剂的范围内。在一些特定实施例中，曲美单抗的有效量为每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：218所示的重链及SEQ ID NO：219所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列的重链及轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含曲美单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：220中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：221中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223及SEQ ID NO：224中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226及SEQ ID NO：227中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考曲美单抗批准的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。曲美单抗的氨基酸序列阐述于表24中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。
表24：曲美单抗的氨基酸序列
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，其中，曲美单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用曲美单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为来自Agenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗为完全人单克隆抗体。泽弗利单抗经分配化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9且也称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备及特性描述于美国专利号10,144,779及美国专利申请公开号US2020/0024350A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：228所示的重链及SEQ ID NO：229所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列的重链及轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少99％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少98％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少97％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少96％同一性的重链及轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少95％同一性的重链及轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含泽弗利单抗的重链及轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：230中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：231中所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少99％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少98％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少97％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少96％同一性的VH区及VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230及SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少95％同一性的VH区及VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含：分别具有SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233及SEQ ID NO：234中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2及CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236及SEQ ID NO：237中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2及CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考泽弗利单抗批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用及截短。泽弗利单抗的氨基酸序列阐述于表25中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构、例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。
表25：弗利单抗的氨基酸序列
另外的抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659及ADG116，其为本领域技术人员已知。
在一些实施例中，抗CTLA-4抗体为公开于以下专利公开中的任一者中的抗CTLA-4抗体：US2019/0048096 A1；US2020/0223907；US2019/0201334；US2019/0201334；US2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO 2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；以及WO1997020574，它们各自以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于如下中：美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227及6,984,720；PCT公开号WO 01/14424及WO 00/37504；以及美国公开号2002/0039581及2002/086014；和/或美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003及7,132,281，它们各自以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗CTLA-4抗体为例如公开于以下中的那些抗体：WO 98/42752；美国专利号6,682,736及6,207,156；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,1998,95,10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》2004,22,145(摘要第2505号(2004)(抗体CP-675206)；或Mokyr等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,1998,58,5301-5304(1998)，它们各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为如WO 1996/040915(以引用的方式并入本文中)中所公开的CTLA-4配体。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为CTLA-4表达的核酸抑制剂。举例而言，抗CTLA-4RNAi分子可呈描述于以下的分子的形式：PCT公开号WO 1999/032619及WO 2001/029058；美国公开号2003/0051263、2003/0055020、2003/0056235、2004/265839、2005/0100913、2006/0024798、2008/0050342、2008/0081373、2008/0248576及2008/055443；和/或美国专利号6,506,559、7,282,564、7,538,095及7,560,438(以引用的方式并入本文中)。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在欧洲专利号EP 1309726(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在美国专利号7,056,704及7,078,196(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为PCT公开号WO 2004/081021(以引用的方式并入本文中)中所描述的适体。
在其他实施例中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子为在美国专利号5,898,031、6,107,094、7,432,249及7,432,250以及欧洲申请号EP 0928290(以引用的方式并入本文中)中描述的RNA分子。
3.患者的淋巴细胞耗尽预调节
在一些实施例中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中，患者在输注根据本公开的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，本发明包括用于治疗已用非骨髓清除式化疗预治疗的患者的癌症的TIL群体。在一些实施例中，TIL群体通过输注施用。在一些实施例中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27及26天)及氟达拉滨25mg/m2/天持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施例中，在根据本公开的非骨髓清除式化疗及TIL输注(第0天)之后，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN商购)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施例中，TIL群体用于与IL-2组合治疗癌症，其中，IL-2在TIL群体之后施用。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗尽通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施例在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
一般而言，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称作马磷酰胺)以及它们的组合的施用实现淋巴细胞耗尽。此类方法描述于Gassner等人,《癌症免疫学及免疫治疗》2011,60,75-85、Muranski等人,《自然临床实践肿瘤学》,2006,3,668-681、Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2008,26,5233-5239及Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2005,23,2346-2357中，所有文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施例中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施例中，施用氟达拉滨治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施例中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。
在一些实施例中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施例中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施例中，施用环磷酰胺治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施例中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施例中，环磷酰胺是静脉内(即i.v.)施用。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4至5天。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4天。
在一些实施例中，通过将氟达拉滨及环磷酰胺一起施用给患者进行淋巴细胞耗尽。在一些实施例中，经4天以25mg/m2/天静脉内施用氟达拉滨且以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天及以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺及氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天及以约25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺及氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天及以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺及氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天及以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺及氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天及以约15mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺及氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施例中，环磷酰胺与美司钠一起施用。在一些实施例中，美司钠以15mg/kg施用。在一些实施例中，输注美司钠，若连续输注，则历经24小时，伴随各自环磷酰胺剂量开始，美司钠可经约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，随后在剩余22小时以3mg/kg/小时的速率输注。
在一些实施例中，淋巴细胞耗尽包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群体之后次日开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施例中，淋巴细胞耗尽包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群体的同一天开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施例中，淋巴细胞耗尽包含5天的预调节治疗。在一些实施例中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施例中，该方案包含第-5天及第-4天(即第0天及第1天)的环磷酰胺。在一些实施例中，该方案包含第-5天及第-4天(即第0天及第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施例中，该方案包含第-5天及第-4天(即第0天及第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施例中，环磷酰胺与美司钠一起施用。在一些实施例中，该方案进一步包含氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含第-5天及第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含第-5天及第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续一天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表26施用。
表26：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表27施用。
表27：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表28施用。
表28：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表29施用。
表29：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表30施用。
表30：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表31施用。
表31：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表32施用。
表32：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表33施用。
表33：示例性淋巴细胞耗尽及治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，与骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案的前述实施例一起使用的TIL输注可为本文所述的任何TIL组合物，以及添加IL-2方案及施用如本文所述的协同疗法(例如PD-1及PD-L1抑制剂)。
4.IL-2方案
在一些实施例中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中，高剂量IL-2方案包括阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性TIL群体的治疗有效部分之后次日开始静脉内施用，阿地白介素或其生物类似物或变体是每八小时使用15分钟推注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最多为14个剂量。在休止9天后，可重复此时程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施例中，IL-2以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施例中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。
在一些实施例中，IL-2方案包括递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人,《临床肿瘤学杂志》1999,17,2752-61及Eton等人,《癌症》2000,88,1703-9，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，递减IL-2方案包括经6小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经12小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经24小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2阿地白介素或其生物类似物或变体。此治疗周期可每28天重复，达最多四个周期。在一些实施例中，递减IL-2方案包括第1天18,000,000IU/m2，第2天9,000,000IU/m2以及第3天及第4天4,500,000IU/m2。
在一些实施例中，IL-2方案包括低剂量IL-2方案。可使用本领域中已知的任何低剂量IL-2方案，包括Dominguez-Villar及Hafler，《自然免疫学(Nat.Immunology)》2000,19,665-673；Hartemann等人,《柳叶刀糖尿病与内分泌学(Lancet DiabetesEndocrinol.)》2013,1,295-305；以及Rosenzwaig等人,《风湿病年鉴(Ann.Rheum.Dis.)》2019,78,209-217中所描述的低剂量IL-2方案，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，低剂量IL-2方案包括每24小时18×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体，以连续输注形式施用5天；之后2至6天不施用IL-2疗法；可选地之后再静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体5天，以每24小时连续输注18×106IU/m2的形式；可选地在之后3周不施用IL-2疗法，其后可进行另外周期的施用。
在一些实施例中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。在一些实施例中，高剂量IL-2方案适用于小儿用途。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为600,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为400,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为300,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为200,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为100,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。
在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用贝培阿地白介素或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用THOR-707或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施例中，IL-2方案包括在施用TIL之后施用奈瓦纽金α或其片段、变体或生物类似物。在某些实施例中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量向患者施用奈瓦纽金。
在一些实施例中，IL-2方案包括施用移植至抗体主链上的IL-2片段。在一些实施例中，IL-2方案包括施用结合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子移植蛋白。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用抗体或其片段、变体或生物类似物，该抗体包含选自SEQ ID NO：29及SEQ IDNO：38的重链及选自SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：39的轻链。
在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。
5.另外的治疗方法
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的上文段落中任一项中所描述的治疗性TIL群体。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的上文段落中任一项中所描述的TIL组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，在分别施用治疗有效剂量的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体及TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其进一步包含在向受试者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为实体肿瘤。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在另一个实施例中，本发明提供如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在另一个实施例中，本发明提供如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，在向受试者施用治疗有效剂量的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上任何前述段落中描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其进一步包括以下步骤：在向患者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为实体肿瘤。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为高突变癌症。
在另一个实施例中，本发明提供了经修改的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在另一个实施例中，本发明提供如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在另一个实施例中，本发明提供如上任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在另一个实施例中，本发明提供如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案且随后向受试者施用治疗有效剂量的如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上任何前述段落中描述的TIL组合物。
实例
现参考以下实例描述本文中涵盖的实施例。这些实例仅出于说明的目的提供且本公开决不应理解为限于这些实例，而应理解为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何及所有变化形式。
实例1：制备用于预REP及REP过程的培养基
此实例描述用于制备适用于涉及来源于各种实体肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的培养的方案的组织培养基的程序。此培养基可用于制备本申请及实例中所描述的任一TIL。
制备CM1
自冷藏库取出以下试剂并使其在37℃水浴中升温：(RPMI1640、人AB血清、200mML-谷氨酰胺)。根据下表34，通过将每一成分添加至适于待过滤体积的0.2μm过滤器单元的顶部来制备CM1培养基。储存于4℃下。
表34：制备CM1
成分 最终浓度 最终体积500mL 最终体积IL
RPMI1640 NA 450mL 900mL
人AB血清，加热灭活10％ 50mL 100mL
200mM L-谷氨酰胺 2 mM 5mL 10mL
55mM BME 55μM 0.5mL 1mL
50mg/mL硫酸庆大霉素 50μg/mL 0.5mL 1mL
使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中预热并添加6000IU/mL IL-2。
根据表35，可视需要进行另外补充。
表35：对CM1的另外补充(视需要)
制备CM2
自冰箱取出已制备的CM1或制备新鲜CM1。自冰箱取出通过在无菌培养基瓶中混合已制备的CM1与等体积来制备所需量的CM2。在使用当天向CM2培养基中添加3000IU/mL IL-2。在使用当天用3000IU/mL IL-2制成足够量的CM2。将CM2培养基瓶标记上名称、制备者名字缩写、过滤/制备日期、两周的过期日期，在需要用于组织培养之前储存于4℃下。
制备CM3
在需要使用的当天，制备CM3。CM3与培养基相同，但在使用当天补充3000IU/mL IL-2。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备液，制备满足实验需求的量的CM3。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IU/mL IL-2”。若存在过量CM3，则将其储存于处于4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、制备者名字缩写、制备培养基的日期及其过期日期(制备后7天)。储存于4℃下7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
制备CM4
CM4与CM3相同，但另外补充2mM G1utaMAXTM(最终浓度)。每1L CM3添加10mL的200mM GlutaMAXTM。通过向AIM-V瓶或袋直接添加IL-2储备液及GlutaMAXTM储备液，制备满足实验需求的量的CM4。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IL/mL IL-2及GlutaMAX”。若存在过量CM4，则将其储存于在4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、“G1utaMAX”及其过期日期(制备后7天)。储存于4℃下超过7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
实例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合物的用途
此实例描述其充当其他T细胞生长因子的IL-2、IL-15和IL-21细胞因子与本文实例中的任一者的TIL过程的用途。
使用本文所述的过程，TIL可在实验的一个组中在IL-2存在的情况下自肿瘤中生长，在培养开始时，可在另一个组中使用IL-2、IL-15和IL-21的组合来代替IL-2。在预REP完成时，评估培养物的扩增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCRVβ谱系。IL-15和IL-21在本文别处及于Santegoets等人,《转化医学杂志(J.Transl.Med.)》,2013,11,37中描述。
结果可以表明，相对于仅IL-2条件，可观测到在IL-2、IL-15和IL-21处理条件下，CD4+及CD8+细胞中的TIL扩增增强(>20％)。相对于仅IL-2培养物，从IL-2、IL-15和IL-21处理的培养物获得的TIL中，出现了以CD8+群体为主的倾斜，TCRVβ谱系也有所倾斜。与仅IL-2处理的TIL相比，经IL-2、IL-15和IL-21处理的TIL中的IFN-γ及CD107a升高。
实例3：对单个批次的γ照射的外周单核细胞进行鉴定
本实例描述了用于鉴定在本文所述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞的单个批次的经γ照射的外周单核细胞(PBMC，也称为单核细胞或MNC)的简化程序。
各经照射的MNC饲养细胞批次均由受试者供体制备。在存在经纯化的抗CD3(克隆OKT3)抗体及白介素-2(IL-2)的情况下，针对各批次或供体在REP中扩增TIL的能力进行单独筛选。此外，各批次饲养细胞都在不添加TIL的情况下进行测试，以验证所接收的γ照射剂量足以使其复制机能不全。
TIL的REP需要经γ照射的生长停滞的MNC饲养细胞。饲养细胞MNC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合并与REP培养瓶中的TIL交联，刺激TIL扩增。饲养细胞批次由采集自受试者供体的全血的白细胞清除术制备。将白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上进行离心、洗涤、照射且在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，接受TIL疗法的患者不输注活饲养细胞，因为此可能导致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，饲养细胞的生长受到γ照射抑制，导致双链DNA断裂及在重新培养时MNC细胞细胞存活率的损失。
饲养细胞批次根据两个准则进行评估：(1)其在共培养中扩增TIL的能力>100倍及(2)其复制机能不全。
利用在立式T25组织培养瓶中生长的两个主要预REP TIL株系，以微REP(mini-REP)形式测试饲养细胞批次。饲养细胞批次针对两个不同的TIL株系进行了测试，因为各TIL株系在其响应于REP中活化而增殖的能力方面是独特的。作为对照，与测试批次一起运行了许多历来已证明满足上述准则的经照射的MNC饲养细胞。
为确保在单一实验中测试的所有批次都接受等效测试，可使用相同预REP TIL株系的足够储备液来测试所有条件及所有饲养细胞批次。
对于测试的各批次饲养细胞，总共存在六个T25培养瓶：预REP TIL株系#1(2个培养瓶)；预REP TIL株系#2(2个培养瓶)；以及饲养细胞对照组(2个培养瓶)。含有TIL株系#1及#2的培养瓶评估了饲养细胞批次扩增TIL的能力。饲养细胞对照组培养瓶评估了饲养细胞批次的复制机能不全。
A.实验方案
第-2/3天，TIL株系解冻。在37℃水浴中制备CM2培养基及保温CM2。制备40mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2。保持温热直至使用。将20mL不含IL-2的预热CM2置放于两个50mL锥形管中之每一者中，用所用TIL株系的名称标记。自LN2储存取出两个指定的预REP TIL株系且将小瓶转移至组织培养室。通过将其放入的经密封拉链储存袋中于37℃水浴中解冻直至保留少量冰。
使用无菌移液管，将各小瓶的内容物立即转移至所制备的50mL锥形管中的20mLCM2中。补足至40mL，使用不含IL-2的CM2来洗涤细胞，在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液，再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的5mL温热CM2中。
使用自动化细胞计数器一式两份地移出小等分试样(20μL)用于细胞计数。记录计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管置放于潮湿的37℃5％CO2培养箱中，盖松开以允许气体交换。测定细胞浓度，TIL在补充有3000IU/mL IL-2的CM2中稀释至1×106个细胞/mL。
将24孔组织培养板的2mL/孔在潮湿的37℃培养箱中按需要多孔培养，直至微REP的第0天。不同TIL株系在单独的24孔组织培养板中培养以避免混淆及潜在的交叉污染。
第0天，开始微REP。针对待测试的饲养细胞批次的数目制备足够CM2培养基(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备800mL CM2培养基)。将上述制备的CM2的一部分等分，其补充3000IU/mL IL-2用于细胞培养(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备具有3000IU/mL IL-2的500mL CM2培养基)。
用各TIL株系独立地工作以防止交叉污染，自保温箱取出具有TIL培养物的24孔板，转移至BSC。
使用无菌移液管或100-1000μL移液器及吸头，自待使用的TIL的各孔取出约1mL培养基，将其置于24孔组织培养板的未使用孔中。
使用新鲜的无菌移液管或100-1000μL移液器及吸头，将剩余培养基与孔中的TIL混合以再悬浮细胞，随后将细胞悬浮液转移至标有TIL批次的50mL锥形管中，记录体积。
用保留的培养基清洗孔，将该体积转移至相同的50mL锥形管中。以400×CF旋转细胞以收集细胞离心块。抽吸培养基上清液，将细胞离心块再悬浮在2-5mL含有3000IU/mLIL-2的CM2培养基中，使用体积取决于收集的孔数目及离心块的大小-体积应足以确保浓度>1.3×106个细胞/mL。
使用血清移液管将细胞悬浮液彻底混合，记录体积。使用自动化细胞计数器取出200μL以进行细胞计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管置放于潮湿的5％CO2 37℃培养箱中，其中，盖松开以允许气体交换。记录计数。
移出含有来自培养箱中的TIL细胞的50mL锥形管，使其细胞以1.3×106个细胞/mL的浓度再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将50mL锥形管放回至具有松散盖子的培养箱中。
对于第二TIL株系重复以上步骤。
仅在将TIL接种至用于实验的T25培养瓶中之前，如下所示将TIL按1:10稀释成最终浓度为1.3×105个细胞/mL。
制备MACSGMPCD3纯(OKT3)工作溶液。自4℃冰箱中取出OKT3的储备溶液(1mg/mL)，置放于BSC中。最终浓度为30ng/mL OKT3用于微REP的培养基中。
对于各实验的T25培养瓶中，20mL需要600ng OKT3；此相当于各20mL需要60μL的10μg/mL溶液，或者各饲养细胞批次的所有6个测试培养瓶需要360μL。
对于各测试的饲养细胞批次，制备400μL 1:100稀释度的1mg/mL OKT3，工作浓度为10μg/mL(例如，一次测试4个饲养细胞批次，制备1600μL 1:100稀释度的1mg/mL OKT3：16μL 1mg/mL OKT3+1.584mL具有3000IU/mL IL-2的CM2培养基)。
制备T25培养瓶。在制备饲养细胞之前用CM2培养基标记各培养瓶及经填充的培养瓶。将培养瓶置放于37℃潮湿的5％CO2培养箱中以保持培养基温暖，同时等待添加其余组分。在制备饲养细胞后，将组分添加至各培养瓶中的CM2中。
其他信息提供于表36中。
表36：溶液信息
制备饲养细胞。对于此方案每次测试的批次需要最少78×106个饲养细胞。由SDBB冷冻的各1mL小瓶在冷冻时具有100×106个活细胞。假设从液态N2储存解冻后回收率为50％，建议每批次至少解冻两个1mL小瓶的饲养细胞，各REP估计有100×106个活细胞。或者，若供应于1.8mL小瓶中，则仅一个小瓶提供足够的饲养细胞。
在解冻饲养细胞之前，对于待测试的各饲养细胞批次预温热约50mL不含IL-2的CM2。自LN2储存器取出指定饲养细胞批次小瓶，置放于拉链储存袋中，置放于冰上。通过浸没于37℃水浴中，使小瓶在封闭的拉链储存袋中解冻。自拉链袋取出小瓶，用70％EtOH喷涂或擦拭，并转移至BSC。
使用移液管，将饲养细胞小瓶的内容物立即转移至50mL锥形管中的30mL温热CM2中。用小体积的CM2洗涤小瓶以移除小瓶中的任何残余细胞，在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液，再悬浮于外加3000IU/mL IL-2之4mL温热CM2中。使用自动化细胞计数器取出200μL进行细胞计数。记录计数。
将细胞以1.3×107个细胞/mL再悬浮于外加3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。
建立共培养物。将1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。将4.5mL CM2培养基添加至15mL锥形管。自培养箱中取出TIL细胞，使用10mL血清移液管充分再悬浮。自1.3×106个细胞/mL TIL悬浮液取出0.5mL细胞，添加至15mL锥形管中的4.5mL培养基中。将TIL储备液瓶返回至培养箱。充分混合。重复第二TIL株系。
将具有预温热培养基的培养瓶自培养箱转移至BSC中用于单次饲养细胞批次。通过用1mL移液器吸头上下移液数次来混合饲养细胞，然后将1mL(1.3×107个细胞)转移至该饲养细胞批次的各培养瓶中。向各培养瓶中添加60μL OKT3工作储备液(10μg/mL)。将两个对照瓶返回至培养箱。
将各TIL批次的1mL(1.3×105)转移至相应标记的T25培养瓶中。将培养瓶返回至培养箱中，直立孵育。直到第5天才干预。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
第5天，培养基更换。用3000IU/mL IL-2制备CM2。各培养瓶需要10mL。通过10mL移液管，将具有3000IU/mL IL-2的10mL温热CM2转移至各培养瓶。将培养瓶返回至培养箱中，直立孵育至第7天。对所有测试的饲养细胞批次重复。
第7天，收集。自培养箱中移出培养瓶，转移至BSC，注意以免干扰培养瓶底部的细胞层。在不干扰培养瓶底部生长的细胞的情况下，自各测试培养瓶取出10mL培养基，自对照瓶中的每一者取出15mL培养基。
使用10mL血清移液管，将细胞再悬浮于中剩余的培养基中，充分混合以打散任何细胞凝集块。通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL以用于细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数。在第7天，记录计数。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
评估饲养细胞对照瓶的复制机能不全，第0天开始评估含有TIL的培养瓶的扩增倍数。
第7天，继续饲养细胞对照瓶至第14天。在第7天完成饲养细胞对照瓶计数后，将15mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜CM2培养基添加至对照瓶中的每一者。将对照瓶返回至培养箱中，以直立位置孵育直至第14天。
第14天，延长非增殖的饲养细胞对照瓶。自培养箱中移出培养瓶，转移至BSC，注意以免干扰培养瓶底部的细胞层。在不干扰培养瓶底部生长的细胞的情况下，自各对照瓶取出约17mL培养基。使用5mL血清移液管，将细胞再悬浮于中剩余的培养基中，充分混合以打散任何细胞凝集块。记录各培养瓶的体积。
通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL用于细胞计数。使用适当标准操作程序结合自动细胞计数器设备对TIL进行计数，记录计数。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
B.结果及验收准则方案
结果。γ辐射的剂量足以使饲养细胞复制机能不全。预期所有批次符合评估准则，且也显示出相比于第0天，REP培养第7天剩余的饲养细胞的总活细胞数目减少。预计到REP培养的第7天，所有饲养细胞批次都将满足TIL增长100倍扩增的评估准则。预计第14天的饲养对照瓶计数将持续第7天所看到的非增殖趋势。
验收准则。对于各批次饲养细胞测试的各复本TIL株系满足以下验收准则。验收准则为2倍，如下表37中所展示。
表37：验收准则的实施例
测试 验收准则
MNC的照射及复制机能不全 在7天及14天未观测到生长
TIL扩增 各TIL至少扩增100倍(最小1.3×107个活细胞)
当在30ng/mL OKT3抗体及3000IU/mL IL-2存在下培养时，评估照射剂量是否足以使MNC饲养细胞复制机能不全。如通过在REP的第7天及第14天通过自动细胞计数测定的总活细胞计数(TVC)来评估复制机能不全。
验收准则为“无生长”指从REP第0天投入培养的初始活细胞数目，在第7天及第14天总活细胞数目没有增加。
评估饲养细胞支持TIL扩增的能力。自REP的第0天开始培养至REP至第7天，根据活细胞的倍数扩增来测量TIL生长。在第7天，如通过自动细胞计数所评估，TIL培养物达成最小100倍扩增(即超过REP第0天投入培养物中的总活TIL细胞数目的100倍)。
不符合验收准则的MNC饲养细胞批次的应急测试。在MNC饲养细胞批次不满足以上概述的验收准则中之任一者的情况下，将采取以下步骤重新测试批次，以排除简单的实验者错误作为其原因。
若存在该批次的两个以上剩余卫星测试小瓶，则再测试该批次。若批次中存在一个或不存在剩余卫星测试小瓶，则根据上文所列的验收准则该批次不合格。
为了合格，所讨论批次及对照批次必须达成以上验收准则。在符合这些准则之后，放行批次以供使用。
实例4：制备IL-2储备溶液
此实例描述将经纯化的冻干重组人白介素-2溶解于适合用于其他组织培养方案(包括本申请及实例中所描述的所有那些方案)的储备样本中的过程，包括涉及使用rhIL-2的那些过程。
程序。制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移至50mL锥形管中。向50mL锥形管中添加1mL 1N乙酸。通过倒转管2至3次进行充分混合。通过使用Steriflip过滤器对HAc溶液进行灭菌。
在PBS中制备1％HSA。在150mL无菌过滤器单元中，向96mL PBS中添加4mL 25％HSA储备溶液。过滤溶液。储存于4℃下。针对制备的每小瓶rhIL-2，填写表格。
制备rhIL-2储备液(6×106IU/mL最终浓度)。每一批次的rhIL-2不同，所需信息见于制造商的分析证书(COA)，例如：1)每小瓶rhIL-2之质量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)推荐0.2％HAc复原体积(mL)。
使用以下公式计算rhIL-2批次所需的1％HAS的体积：
举例而言，根据rhIL-2批次10200121(Cellgenix)的COA，1mg小瓶的比活性为25×106IU/mg。推荐在2mL 0.2％HAc中复原rhIL-2。
用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶的橡胶塞。使用连接于3mL注射器的16G针头，将推荐体积的0.2％HAc注入小瓶中。请小心不要在拔出针头时取开塞子。将小瓶倒转3次且旋动直至所有粉末溶解。小心地取下塞子并搁置于酒精擦拭物上。向小瓶中添加所计算体积的1％HSA。
储存rhIL-2溶液。对于短期储存(<72小时)，将小瓶储存于4℃下。对于长期储存(>72小时)，将小瓶等分成较小体积，在准备使用之前储存于-20℃下的冷冻小瓶中。避免冷冻/解冻循环。在制备日期之后6个月结束。Rh-IL-2标签包括供应商及目录号、批号、过期日期、操作员首字母缩写、浓度及等分体积。
实例5：冷冻保存过程
此实例描述使用CryoMed受控速率冷冻机型号7454(Thermo Scientific)对利用本文所述的程序制备的TIL进行冷冻保存过程的方法。
所用设备如下：铝制卡盒支架(与CS750冷冻袋相容)、用于750mL袋的冷冻盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶感测器(带式袋)及CryoStore CS750冷冻袋(OriGenScientific)。
冷冻过程在自成核至-20℃之间提供0.5℃速率，在至-80℃终点温度之间提供1℃/分钟的冷却速率。程序参数如下：步骤1：在4℃下等待；步骤2：1.0℃/min(样本温度)达至-4℃；步骤3：20.0℃/min(箱室温度)达至-45℃；步骤4：10.0℃/min(箱室温度)达至-10.0℃；步骤5：0.5℃/min(箱室温度)达至-20℃；步骤6：1.0℃/min(样本温度)达至-80℃。
实例6：利用确定成分培养基的肿瘤扩增过程
用相应确定成分培养基(例如CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，赛默飞世尔，包括例如DM1及DM2)替代CM1及CM2培养基来进行公开于以上的过程。
实例7：冷冻保存TIL细胞疗法的示例性GEN 2生产
此实例描述一种根据当前组织优良操作规范(current Good Tissue Practices)及当前优良制造规范(current Good Manufacturing Practices)在G-REX培养瓶中进行艾欧凡斯生物治疗公司的TIL细胞疗法过程的cGMP制造。此实例描述一种根据当前组织优良操作规范及当前优良制造规范在G-Rex培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表38：过程扩增示例性计划
表39：培养瓶体积
第0天CM1培养基制备。在BSC中，向RPMI 1640培养基瓶添加试剂。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMaxTM(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
自BSC取出不必要的材料。自BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素及HBSS保留在BSC以用于配制洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。记录IL-2：批号及有效期。
将IL-2储备液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备液转移至准备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-REX100MCS传递至BSC中。将G-REX100MCS(W3013130)无菌转移至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-REX100MCS培养瓶中。组织碎片锥形管或GRex100MCS。
第0天肿瘤洗涤培养基制备。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理。获得肿瘤试样，立即转移至2-8℃下的套件中进行处理。等分肿瘤洗涤培养基。使用8”镊子(W3009771)进行肿瘤洗涤1。自试样瓶移出肿瘤，转移至所制备的“洗涤1”培养皿中。此随后为肿瘤洗涤2及肿瘤洗涤3。测量且评估肿瘤。评定是否观测到整个肿瘤面积的>30％坏死和/或为脂肪组织。在适用时清洁解剖。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除分割”。解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤试样切割成偶数个适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小大致为3×3×3mm的块。储存中间碎片以防脱水。重复中间碎片分割。测定收集的块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间碎片”6孔板选择另外的有利肿瘤块来填充最多50个块的液滴。
准备锥形管。将肿瘤块转移至50mL锥形管中。制备用于G-REX100MCS的BSC。自培养箱取出G-REX100MCS。将G-REX100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-REX100MCS培养瓶中。使块均匀分布。
按以下参数使G-REX100MCS保温：使G-REX培养瓶保温：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。计算：保温时间；下限＝保温时间+252小时；上限＝保温时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基，解冻IL-2的等分试样。
第11天：培养基制备监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
在培养箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶及3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。自培养箱取出RPMI 1640培养基瓶。准备RPMI 1640培养基瓶。过滤培养基。解冻3×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)。自培养箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋及中继泵转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基，置于50mL锥形管中。制备细胞计数稀释液管。在BSC中，向四个的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”及批号的AIM-V培养基。将试剂自BSC转移至2至8℃下。准备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天：TIL收集预处理表格。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-REX100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-REX100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶，开始TIL收集。收集TIL。使用GatheREX，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的贴壁细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-REX100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL及“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本且接种在厌氧瓶。
孵育TIL。在需要之前将TIL转移包置于培养箱中。进行细胞计数及计算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限及下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积：计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样本的体积(4.0mL)(B)经调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，取出过量TIL并按需要将TIL置于培养箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的目标细胞浓度添加至过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/mL。按需要使过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。如果体积≤0.5mL，将CS10添加至小瓶中，直至体积为0.5mL。
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于培养箱中。
样本的冷冻保存。观测锥形管，缓慢添加CS-10，记录添加0.5mL CS10的体积。
第11天：饲养细胞。获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或cryotherm。在37.0±2.0℃于水浴或cytotherm处解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失。自培养箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并饲养细胞进行混合，标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。取出细胞计数样本。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包抽吸4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，确定乘数，选定方案，输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限，确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4饲养细胞袋置于拉链袋中，在37.0±2.0℃水浴或Cytotherm中解冻约3至5分钟，合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积，记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备细胞计数。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数及计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器及16G针头，吸取0.15mL OKT3，添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-REX填充及接种设置G-REX500MCS。从培养箱取出“完全CM2第11天培养基”，将培养基泵吸至G-REX500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封，使培养瓶保温。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-REX500MCS。将饲养细胞添加至G-REX500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-REX500MCS。热封。将G-REX500MCS在37.0±2.0℃下保温，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
计算保温范围。进行计算以确定在第16天自培养箱取出G-REX500MCS的适当时间。下限：保温时间+108小时。上限：保温时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存。适用：冷冻过量TIL小瓶。确证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存件中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备预热AIM-V培养基。针对培养基袋1、2及3计算使培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12至24小时的持续时间。设定用于上清液的10LLabtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10L Labtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。等分100.0mL GlutaMaxTM。向GlutaMaxTM中添加IL-2。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMaxTM+IL-2泵吸至袋中。监测参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分瓶。监测培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-REX500MCS。准备1L转移包，标记为TIL悬浮液，称重1L。
G-REX500MCS的体积减少。将约4.5L培养上清液自G-REX500MCS转移至10LLabtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶，旋动培养基以使细胞剥离，确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheRex，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞及培养基。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量，计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌性及BacT测试取样。自制备的15mL锥形标记的BacT取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对各样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包取出1.0mL，置于准备的标记有“支原体稀释液”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于培养箱中。自BSC取出细胞悬浮液，在需要之前置于培养箱中。进行细胞计数及计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mLAIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，得到稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限。注意：稀释可以根据预期的细胞浓度进行调整。自进行的所有四次计数中确定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出以用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-REX500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-REX-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一GREX-500M培养瓶，同时准备另外的培养基并使其升温。准备确定的所计算数目的其他培养基袋并使其升温。填充G-REX500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中。热封。重复填充。使培养瓶保温。计算待添加至新G-REX500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自培养箱取出G-REX500MCS。准备用于泵吸的G-REX500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自培养箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。泵吸所计算体积的TIL悬浮液至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使培养瓶保温。
测定在第22天自培养箱取出G-REX500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备。准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10L Labtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为待进行收集的每两个G-REX500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，通过翻转泵及操控袋子的位置从3000mL Origen袋去除空气。将25％的人白蛋白添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的人白蛋白25％。
制备IL-2稀释液。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上的无针注入口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记为“IL-2稀释液”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2至8℃下，以对其进行预处理，以便用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”及批号的AIM-V培养基。准备细胞计数。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1至4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集。监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自培养箱中取出G-REX500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭额外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-REX500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞已剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheREX，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子，确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本
进行细胞计数。利用NC-200及过程注释5.14进行细胞计数及计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度及总成核细胞浓度。测定计数的上限及下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度及总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释液。通过鲁尔样本口自一个上清液袋取出10.0mL，置于15mL锥形管中。
进行“TIL G-REX收集”方案并测定最终产物目标体积。装载一次性套件。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。确证已附接PlasmaLyte，观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，确证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制及填充。目标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10及LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)：300IU/mL。IL-2工作储备：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接至制备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，自“IL-2 6×104”等分试样取出所测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。一旦已填充最后一个最终产物袋，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中，更换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中，将管标记为“保留物”及批号。针对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2至8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物，置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数及计算。注意：仅将一个样本稀释至适当稀释度以验证稀释度是足够的。将另外的样本稀释至适当稀释因数并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数之上限及下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表40：样本计划
样本 容器数目 各添加的样本体积 容器类型
*支原体 1 1.0mL 15mL锥形管
内毒素 2 1.0mL 2mL冷冻小瓶
革兰氏染色 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
IFN-γ 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
流式细胞术 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
**Bac-T无菌性 2 1.0mL Bac-T瓶
QC保留物 4 1.0mL 2mL冷冻小瓶
卫星小瓶 10 0.5mL 2mL冷冻小瓶
无菌性及BacT测试。测试取样。在BSC中，自使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存准备速率受控冷冻机(CRF)。确证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物及样本置于CRF中。测定要达至4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子及小瓶。将盒子及小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
最终药品的处理及分析包括以下测试：(第22天)通过流式细胞术测定第22天REP天的CD3+细胞；(第22天)革兰氏染色方法(GMP)；(第22天)通过凝胶凝块LAL分析(GMP)进行细菌内毒素测试；(第16天)BacT无菌性分析(GMP)；(第16天)TD-PCR(GMP)检测支原体DNA；可接受外观特质；(第22天)BacT无菌分析(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ分析。如本文所述的其他效力分析也用于分析TIL产物。
实例8：GEN 3扩增平台的示例性实施例
第0天
制备肿瘤洗涤培养基。培养基在开始前加热。将5mL庆大霉素(50mg/mL)添加至500mL HBSS瓶中。将5mL肿瘤洗涤培养基添加至15mL锥形瓶中，用于OKT3稀释。准备饲养细胞袋。将饲养细胞无菌转移到饲养细胞袋中且储存在37℃下直至使用或冷冻。若在37℃下，计数饲养细胞。若冷冻，则解冻然后计数饲养细胞。
饲养细胞浓度的最佳范围在5×104及5×106个细胞/mL之间。制备具有4.5mL AIM-V的四个锥形管。添加0.5mL细胞级分用于各细胞计数。若总活饲养细胞数≥1×109个细胞，则进行调节饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋中取出的饲养细胞体积，以便将1×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL的肿瘤洗涤培养基转移至OKT3等分试样(100μL)中。使用注射器及无菌技术，抽取0.6mL的OKT3且添加至第二饲养细胞袋中。调整培养基体积至2L的总体积。将第二饲养细胞袋转移至培养箱。
OKT3制剂详情：OKT3可等分且冷冻于100μL等分试样中的小瓶(1mg/mL)的原始储备浓度中。每1mL小瓶约10×等分试样。储存于-80℃下第0天：15μg/瓶，即30ng/mL在500mL中-60μL最大～1等分试样。
将5mL肿瘤洗涤培养基添加至标记为多余肿瘤块的6孔板的所有孔中。保存肿瘤洗涤培养基，以进一步用于在分割过程中保持肿瘤水分。将50mL肿瘤洗涤培养基添加至各100mm皮氏培养皿中。
在解剖培养皿盖下用直尺作为参考，将肿瘤分割成约27mm3的碎片(3×3×3mm)。解剖中间碎片，直到达到60个碎片。根据所产生的最终碎片的数目(每个培养瓶通常60个碎片)对最终碎片的总数目进行计数，制备G-REX-100MCS培养瓶。
在标记为碎片管1至碎片管4的锥形管中保留有利的组织碎片。根据发起的碎片管的数目，计数要接种饲养细胞悬浮液的G-REX-100MCS培养瓶的数目。
自培养箱中取出饲养细胞袋且接种G-REX-100MCS。标记为D0(第0天)。
在G-REX-100MCS中向培养物中添加肿瘤碎片。在无菌条件下，拧开标有肿瘤碎片培养物(D0)1的G-REX-100MCS及标有碎片管的50mL锥形管的盖子。旋转打开的碎片管1，同时轻轻抬起G-REX100MCS的盖子。在旋转的同时将带有碎片的培养基添加至G-REX100MCS。记录转移至G-REX100MCS的碎片数目。
一旦碎片位于GREX培养瓶底部，吸取7mL培养基且创建七个1mL等分试样：5mL用于扩增表征，以及2mL用于无菌样本。将5个等分试样(最终碎片培养上清液)储存在-20℃下进行扩增表征，直至需要。
分别在一个厌氧BacT/Alert瓶及一个好氧BacT/Alert瓶中各灌输1mL最终碎片培养上清液。对取样的各培养瓶进行重复。
在第7-8天
准备饲养细胞袋。当冷冻时在37℃水浴中解冻饲养袋3至5分钟。若冷冻，则计数饲养细胞。饲养细胞浓度的最佳范围在5×104及5×106个细胞/mL之间。制备具有4.5mL AIM-V的四个锥形管。将各细胞计数的0.5mL细胞级分添加至新的冷冻小瓶管中。将样本充分混合并进行细胞计数。
若总活饲养细胞数≥2×109个细胞，则进行下一步骤以调节饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋中取出的饲养细胞体积，以便将2×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL的HBSS转移至100μL OKT3等分试样中。通过上下移液3次进行混合。制备两个等分试样。
OKT3制剂详情：OKT3可等分且冷冻于100μL等分试样中的小瓶(1mg/mL)的原始储备浓度中。每1mL小瓶约10×等分试样。储存于-80℃下第7/8天：30μg/瓶，即60ng/mL在500mL中-120μl最大，～2等分试样。
使用注射器及无菌技术，抽取0.6mL的OKT3且添加至饲养细胞袋中，确保全部添加。将培养基体积调整为2L的总体积。用第二OKT3等分试样重复且添加至饲养细胞袋中。将第二饲养细胞袋转移至培养箱。
用饲养细胞悬浮液制备G-REX100MCS培养瓶。根据第0天生成的G-REX培养瓶的数目记录要处理的G-REX-100MCS培养瓶的数目。自培养箱中取出G-REX培养瓶，从培养箱中取出第二饲养细胞袋。
在添加饲养细胞悬浮液之前取出上清液。将一个10mL注射器连接至G-REX100培养瓶且抽取5mL培养基。创建五个1mL等分试样-5mL用于扩增表征，将5个等分试样(最终碎片培养上清液)储存在-20℃用于扩增表征，直至发起人提出要求。对各G-REX100培养瓶进行标记及重复。
5-20×1mL样本用于表征，取决于培养瓶的数目：
·5mL＝1个培养瓶
·10mL＝2个培养瓶
·15mL＝3个培养瓶
·20mL＝4个培养瓶
继续将饲养细胞接种至G-REX100 MCS中，针对各G-REX100 MCS培养瓶重复。使用无菌转移方法，将500mL的第二饲养细胞袋按重量(假设1g＝1mL)重力转移至各G-REX-100MCS培养瓶中，记录量。标记为第7天培养且对各G-REX100培养瓶进行重复。将G-REX-100MCS培养瓶转移至培养箱。
第10-11天
取出第一个G-REX-100MCS培养瓶，在无菌条件下使用10mL注射器取出7mL预处理培养上清液。产生七个1mL等分试样：5mL用于扩增表征，2mL用于无菌样本。
小心地混合培养瓶且使用新的10mL注射器取出10mL上清液，转移至标记为D10/11支原体上清液的15mL管中。
小心地混合培养瓶，使用新注射器根据待处理的培养瓶数量取出以下体积：
·1个培养瓶＝40mL
·2个培养瓶＝20mL/瓶
·3个培养瓶＝13.3mL/瓶
·4个培养瓶＝10mL/瓶
应自所有培养瓶中取出总共40mL，汇集在标有“第10/11天QC样本”的50mL锥形管中，储存在培养箱中直至需要。进行细胞计数且分配细胞。
将5等分试样(预处理培养上清液)储存在≤-20℃下进行扩增表征，直至需要。分别在一个厌氧BacT/Alert瓶及一个好氧BacT/Alert瓶中各灌输1mL预处理培养上清液。
继续将细胞悬浮液转移至G-REX-500MCS且针对各G-REX-100MCS进行重复。使用无菌条件，将各G-REX-100MCS之内容物转移至G-REX-500MCS中，每次监测约100mL液体转移。当G-REX-100MCS的体积减小至500mL时停止转移。
在转移步骤期间，使用10mL注射器且自G-REX-100MCS抽吸10mL细胞悬浮液至注射器中。根据培养瓶的数目按照说明书进行操作。若仅1个培养瓶：总共使用两个注射器取出20mL。若2个培养瓶：每培养瓶取出10mL。若3个培养瓶：每培养瓶取出7mL。若4个培养瓶：每培养瓶取出5mL。将细胞悬浮液转移至一个常见的50mL锥形管。保持在培养箱中直至细胞计数步骤及QC样本。QC所需的细胞总数目为约20e6个细胞：4×0.5mL细胞计数(细胞计数首先未稀释)。
分析所需的细胞量如下：
1.最少10×106个细胞用于效力分析，例如本文所述的那些分析，或用于IFN-γ或颗粒酶B分析；
2.1×106个细胞用于支原体；
3.5×106个细胞用于CD3+/CD45+的流式细胞术。
将G-REX-500MCS培养瓶转移至培养箱。
制备QC样本。在此实施例中，分析需要至少15×108个细胞。分析包括：细胞计数及存活率；支原体(1×106个细胞/平均存活浓度)；流式细胞术(5×106个细胞/平均存活浓度)；IFN-g分析(5×106个细胞-1×106个细胞；8-10×106个细胞为IFN-γ分析所需。
计算10×106个细胞/mL的冷冻保存的细胞级分的体积，计算用以制备的小瓶的数目。
第16-17天
洗涤缓冲液制备(1％HSA Plasmalyte A)。将HSA及Plasmalyte转移至5L袋中以制作LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件将总体积为125mL的25％HSA转移至5L袋中。取出，将10mL或40mL洗涤缓冲液转移至“IL-2 6×104IU/mL管”中(若预先制备IL-2，则为10mL，或若新鲜制备IL-2，则为40mL)。
计算添加至Plasmalyte+1％HSA中的经复原IL-2的体积：经复原IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准分析)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出复原IL-2所需的IL-2的计算初始体积，转移至“IL-2 6×104IU/mL”管中。将来自预先制备的等分试样的100μL IL-2 6x106 IU/mL添加至含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为“IL-2 6×104IU/mL”的管中。
自G-REX-500MCS培养瓶取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液且将细胞转移至细胞收集池袋中。对所有G-REX-500MCS培养瓶重复。
取出60mL上清液且添加至上清液试管中用于品质对照分析，包括支原体检测。储存于+2-8℃。
细胞收集。计数细胞。用4.5mL的AIM-V制备四个15mL锥形管。这些可预先准备。最佳范围＝介于5×104及5×106个细胞/mL之间(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向先前制备的4500μL AIM V，添加500μL CF。记录稀释因数。
计算预LOVO(存活+死亡)的TC(总细胞)＝
平均总细胞
浓度(预LOVO TC浓度)
(存活+死亡)
X
源袋的体积
计算预LOVO(存活)的TVC(总活细胞)＝
平均总活细胞
浓度(预LOVO TVC)
(存活)
X
LOVO源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝待取出的体积。
当总细胞(TC)数目≤5×109，取出4×106个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。4×106÷总TC浓度＝待取出的体积。
当测定总细胞数目时，移除细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认预LOVO的TVC 5×108或4×106或不适用。计算取出的细胞体积。
计算袋中剩余的剩余总细胞。计算预LOVO的TC(总细胞)。[平均总细胞浓度X剩余体积＝TC预LOVO剩余]
根据剩余的细胞的总数目，选择表41中的对应过程。
表41：细胞总数目
总细胞： 保留物(mL)
0<总细胞≤31×109 115
31×109<总细胞≤71×109 165
71×109<总细胞≤110×109 215
110×109<总细胞≤115×109 265
选择与所用过程相对应的IL-2添加的体积。体积计算为：保留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO袋后添加的IL-2体积。记录所有添加的体积。在冷冻小瓶中获得样本用于进一步分析。
充分混合细胞产物。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样本进行内毒素、IFN-γ、无菌及其他分析。
实例9：GEN 2及GEN 3示例性过程
此实例展示了Gen 2及Gen 3过程。过程Gen 2及Gen 3TIL通常由来自个体患者(通过手术切除肿瘤)的自体TIL构成，然后离体扩增。Gen 3过程的起始第一扩增步骤为在白介素-2(IL-2)及单克隆抗体OKT3存在下进行细胞培养，该单克隆抗体OKT3靶向经照射外周血单核细胞(PBMC)的支架上的T细胞共受体CD3。
Gen 2TIL产品的制造由两个阶段组成：1)预快速扩增(预REP)及2)快速扩增方案(REP)。在预REP期间，将切除的肿瘤切成≤50个各维度为2-3mm的碎片，这些碎片用含血清的培养基(含有10％HuSAB的RPMI 1640培养基)及6,000IU/mL之白介素-2(IL-2)培养11天的时间段。在第11天，收集TIL且将其引入大规模二级REP扩增中。REP由以下组成：自在5×109个经照射的同种异体PBMC饲养细胞的共培养物中活化≤200×106个来自预REP的活细胞，该饲养细胞在5L体积的补充有3000IU/mL rhIL-2的CM2中负载有150μg单克隆抗CD3抗体(OKT3)持续5天。在第16天，培养物体积减少90％且将细胞部分以≥1×109活淋巴细胞/瓶分流至多个G-REX-500培养瓶中，用CM4补足至5L。TIL再孵育6天。REP在第22天收集，洗涤，配制且冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
Gen 3TIL产品的制造由三个阶段组成：1)起始第一扩增方案；2)快速第二扩增方案(也称作快速扩增阶段或REP)；以及3)继代培养物分流。为了实现起始第一扩增TIL增殖，将切除的肿瘤切成≤120个各维度为2-3mm的碎片。在起始第一扩增的第0天，在3个100MCS容器中之每一者中，在约100cm2的表面区域上建立了约2.5×108个同种异体照射的PBMC饲养细胞的饲养层，该饲养细胞负载有OKT-3。肿瘤碎片分布在3个100MCS容器中，各容器用含有500mL含血清的CM1培养基及6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)及15ug OKT-3培养7天的时间段。在第7天，REP通过以下来启动：将约5×108个负载有OKT-3的同种异体照射的PBMC饲养细胞的额外饲养细胞层并入至三个100MCS容器中的每一者的肿瘤破碎培养阶段中，用500mL CM2培养基及6,000IU/mL IL-2及30μg OKT-3培养。通过使用密闭系统流体将负载OKT3的饲养细胞转移至100MCS容器中，活化同一容器中的整个起始第一扩增培养物来增强REP启动。对于Gen 3，TIL纵向扩大或分流涉及处理步骤，其中，整个细胞培养物通过密闭系统流体转移而按比例调整至较大容器，转移(自100M培养瓶转移至500M培养瓶)，添加额外4L CM4培养基。REP在第16天收集，洗涤，配制且冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
总体而言，3过程是一个更短、更可调式且易于修改的扩增平台，将适应稳健制造及过程可比性。
表50：示例性Gen 2及示例性Gen 3制造过程的比较
在第0天，对于两种过程，肿瘤洗涤3次，将碎片随机分组且分成两个池；每个过程一个池。对于Gen 2过程，将碎片转移至一个具有含有6,000IU/mL rhIL-2的1L CM1培养基的GREX 100MCS培养瓶中。对于Gen 3过程，将碎片转移至一个具有含有6,000IU/mL rhIL-2、15ug OKT-3及2.5×108个饲养细胞的500mL CM1培养基的G-REX-100MCS培养瓶中。Rep启动天的TIL的接种根据各过程在不同天发生。对于Gen2过程，G-REX-100MCS培养瓶的体积减少90％，将收集的细胞悬浮液转移至新的G-REX-500MCS中，以在第11天在含有IL-2(3000IU/mL)、外加5×109个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP启动。每个方案中细胞在第16天扩增且分流至多个G-REX-500MCS培养瓶中，各培养瓶中具有含有IL-2(3000IU/mL)的CM4培养基。然后在每个方案中的第22天收集培养物且冷冻保存。对于Gen 3过程，REP启动发生在第7天，同一G-REX-100MCS用于REP启动。简言之，向各培养瓶中添加500mL含有IL-2(6000IU/mL)及5×108个饲养细胞及30ug OKT-3的CM2培养基。在第9-11天，纵向扩大培养物。将整个体积的G-REX100M(1L)转移至G-REX-500MCS中，添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将培养瓶孵育5天。收集培养物且在第16天冷冻保存。
比较中包括三种不同的肿瘤，两种肺肿瘤(L4054及L4055)及一种黑色素瘤(M1085T)。
CM1(培养基1)、CM2(培养基2)及CM4(培养基4)培养基是预先制备的，保持在4℃下用于L4054及L4055。CM1及CM2培养基未经过滤制备，以比较具有及不具有培养基过滤的细胞生长。
对于L4055肿瘤，在REP启动及规模扩大时，将培养基在37℃下温热至多24小时。
结果。Gen 3的结果为在Gen 2实现的总活细胞数的30％以内。Gen 3最终产物显示出再刺激之后较高的IFN-γ的产量。如通过存在的总独特CDR3序列所测量，Gen 3最终产物显示出增加的克隆多样性。Gen 3最终产物显示出较长平均端粒长度。
Gen 2及Gen 3过程的预REP及REP扩增遵循上文所描述的程序。对于各肿瘤，两个池含有相等数目的碎片。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。在Gen 2过程的第11天及Gen 3过程的第7天收集且计数总预REP细胞(TVC)。为比较两个预REP组，将细胞计数除以培养物中所提供的碎片的数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。如下表51中所指示，与Gen 3过程相比，Gen 2过程每碎片始终生长更多细胞。第11天Gen 3过程预期的TVC数目的外推计算，计算方法是将预REP TVC除以7，随后再乘以11。
表51：预REP细胞计数
*L4055，未过滤的培养基。
对于Gen 2及Gen 3过程，根据过程条件对TVC进行计数，在过程的每天产生活细胞百分比。收集时，收集第22天(Gen 2)及第16天(Gen 3)细胞且建立TVC计数。然后将TVC除以第0天提供的碎片数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。通过将收集TVC除以超过REP启动TVC来计算倍数扩增。如表52所示，比较Gen 2及Gen 3，L4054的倍数扩增相似；在L4055的情况下，Gen 2过程的倍数扩增更高。具体而言，在此情况下，在REP启动日之前使培养基升温24。在Gen 3中也观测到M1085T的较高倍数扩增。第22天Gen 3过程预期的TVC数目的外推计算，计算方法是将REP TVC除以16，随后再乘以22。
表52：TIL最终产物的总活细胞计数及倍数扩增
*L4055，未过滤的培养基。
表53：TIL最终产物的存活率％：在收集时，将最终TIL REP产物与存活率％的放行准则进行比较。Gen 2及Gen 3过程的所有条件都超过70％的存活率准则，在过程及肿瘤方面具有可比性。
在收集后，将最终TIL REP产物与存活率％的放行准则进行比较。Gen 2及Gen3过程的所有条件都超过70％的存活率准则，在过程及肿瘤方面具有可比性。
表53：REP的存活率％(TIL最终产物)
由于每个培养瓶的碎片数目低于最大所需数目，故针对各肿瘤计算收集时所估计的细胞计数。评估是基于以下预期：临床肿瘤在第0天足够大以接种2个或3个培养瓶。
表54：将估计细胞计数外推至Gen 3过程的全尺寸2及3培养瓶上
免疫表型-TIL最终产物的表型标记比较。三种肿瘤L4054、L4055及M1085T在Gen 2及Gen 3过程中均经历TIL扩增。收集后，对REP TIL最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化及记忆标记物。对于所有条件，TCR a/b+细胞的百分比超过90％。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示出更高的CD8及CD28表达。Gen 2过程显示较高百分比的CD4+。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示出更高的中枢记忆室表达。
在来自两个肿瘤L4054及L4055的TIL中分析活化及耗尽标记物，以比较来自Gen 2及Gen 3TIL扩增过程的最终TIL产物。Gen 2及Gen 3过程之间的活化及耗尽标记物具有可比性。
再刺激时的干扰素γ分泌。在收集日，即Gen 2的第22天及Gen 3的第16天，TIL使用L4054及L4055的经涂布的抗CD3板进行过夜再刺激。使用抗CD3、CD28及CD137珠粒对M1085T进行再刺激。在所有条件下再刺激24小时后收集上清液且冷冻上清液。同时使用相同ELISA板对来自两种过程之上清液评估通过ELISA进行的IFNγ分析。在所分析的三个肿瘤中观测到来自Gen 3过程的较高的IFNγ产生。
培养基中IL-2含量的测量。为了比较Gen 2及Gen 3过程之间的IL-2消耗，在REP启动、规模纵向扩大及收集日，在肿瘤L4054及L4055上收集细胞上清液。细胞培养物上清液中IL-2的量通过R&D的Quantitate ELISA套件测量。一般趋势指示当相比于Gen 2过程时，IL-2浓度在Gen 3过程中保持较高。这可能是由于Gen 3的REP启动时较高浓度的IL-2(6000IU/mL)以及整个过程中培养基的残留。
代谢基质及代谢物分析。代谢底物例如D-葡萄糖及L-谷氨酰胺的含量经测量为整体培养基消耗的代替物。测量其互逆代谢物，例如乳酸及氨。葡萄糖是培养基中的一种单糖，粒线体利用其以ATP的形式产生能量。当葡萄糖经氧化时，会产生乳酸(乳酸系乳酸盐)。在细胞指数生长期期间强烈产生乳酸盐。高含量的乳酸盐会对细胞培养过程产生负面影响。
L4054及L4055的用过的培养基在Gen 2及Gen 3过程的REP启动、规模纵向扩大及收集日进行收集。对于Gen 2在第11天、第16天及第22天收集用过的培养基；对于Gen 3在第7天、第11天及第16天收集用过的培养基。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、GlutaMaxTM及氨的浓度。
L-谷氨酰胺是细胞培养基制剂中所需的一种不稳定的必需氨基酸。谷氨酰胺含有一种胺，及此酰胺结构基团可向细胞输送及递送氮。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞会产生有毒的氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，Gen 2及Gen 3过程的培养基添加了GlutaMaxTM，其在水溶液中更稳定且不会自发降解。在两个肿瘤株系中，Gen 3组在此过程中显示出L-谷氨酰胺及GlutaMaxTM的减少，以及整个REP中氨的增加。在Gen 2组中，L-谷氨酰胺及GlutaMaxTM的浓度恒定，观测到氨产生略有增加。Gen 2及Gen 3过程在收集日时的氨具有可比性，L-谷氨酰胺降解略有不同。
通过Flow-FISH重复端粒。Flow-FISH技术用于测量Gen 2及Gen 3过程下L4054及L4055上端粒重复的平均长度。使用端粒PNA套件/FITC计算相对端粒长度(RTL)的测定，以用于来自DAKO的流式细胞术分析。Gen 3显示出与Gen 2相当的端粒长度。
CD3分析。为了确定各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，对L4054及L4055收集的TIL最终产物进行取样，通过T细胞受体的CDR3部分的测序进行克隆多样性的分析。
表55显示了Gen 2及Gen 3之间在TIL收集的细胞产物上的L4054上共享独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3及Gen 2最终产物共享199个序列，相当于Gen 2前80％的独特CDR3序列中的97.07％与Gen 3最终产物共享。
表55：L4054上Gen 2与Gen 3过程之间的共享uCDR3序列的比较
表56显示了Gen 2及Gen 3之间在TIL收集的细胞产物上的L4055上共享独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3及Gen 2最终产物共享1833个序列，相当于Gen 2前80％的独特CDR3序列中的99.45％与Gen 3最终产物共享。
表56：L4055上Gen 2与Gen 3过程之间的共享uCDR3序列的比较
CM1及CM2培养基未经过滤预先制备且保持在4℃，直至用于肿瘤L4055以用于Gen2及Gen 3过程。
对于L4055肿瘤，在REP启动日时，将培养基在37℃下温热24小时以用于Gen 2及Gen 3过程。
在过程中收集的上清液中未测量LDH。
M1085T TIL细胞计数使用K2 cellometer细胞计数器进行。
在肿瘤M1085T上，样本不可用，例如用于代谢分析的上清液、用于活化及耗尽标记物物分析的TIL产物、端粒长度及CD3-TCR vb分析。
结论。此实例比较了3个独立供体肿瘤组织的功能品质属性，外加Gen 2及Gen 3过程之间的扩增表型表征及培养基消耗。
Gen 2及Gen 3预REP及REP扩增比较根据所产生的总活细胞及总有核细胞群体的存活率来评估。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，约在收集时收集的总活细胞的40％左右。
假设预REP收集发生在第11天而不是第7天，REP收集发生在第22天而不是第16天，则计算Gen 3过程的外推细胞数目。在这两种情况下，与Gen 2过程相比，Gen 3在TVC上显示出更接近的数目，表明早期活化增强型TIL增长。
在Gen 3过程中额外培养瓶(2或3)的外推值的情况下，假设处理的肿瘤尺寸更大，达到如所描述的每个过程所需的最大碎片数目。观测到，与在第22天的Gen 2过程相比，Gen3过程在第16天收集的TVC上可达类似剂量。此观测结果是重要的，指示培养物的早期活化降低TIL处理时间。
Gen 2及Gen 3预REP及REP扩增比较根据所产生的总活细胞及总有核细胞群体的存活率来评估。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，约在收集时收集的总活细胞的40％左右。
就表型表征而言，与Gen 2过程相比，在Gen 3过程中的三个肿瘤上观测到较高的CD8+及CD28+表达。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程显示出较高的中枢记忆隔室。
尽管Gen 3过程的持续时间较短，但Gen 2及Gen 3过程显示出相当的活化及耗尽标记物。
相较于所分析的三个肿瘤中的Gen 2，Gen 3最终产物上的IFN伽马(IFNγ)产量高出3倍。此资料表明，与Gen 2过程相比，Gen 3过程产生了功能强大且更有效的TIL产物，此可能是由于Gen 3上CD8表达及CD28表达更高。表型表征表明，与Gen 2过程相比，Gen 3在三个肿瘤上的CD8+、CD28+表达呈阳性趋势。
Gen 2与Gen 3之间的TIL最终产物的端粒长度相当。
Gen 2及Gen 3最终产物之间的葡萄糖及乳酸盐含量相当，这表明Gen 3过程的培养基上的营养含量未受到影响，因为与Gen 2相比，在过程的每一天都没有执行减量移除，而且过程中的培养基体积较小。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程的总体处理时间减少了近2倍，此将显著降低由Gen3过程扩增的TIL产物的商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2过程中IL-2消耗的一般趋势，而在Gen 3过程中，由于未移除旧培养基，因此IL-2较高。
通过CDR3 TCRab序列分析，Gen 3过程显示出较高的克隆多样性。
在预REP的第0天添加饲养细胞和OKT-3允许TIL的早期活化并允许使用Gen3过程进行TIL生长。
表57描述与当前的Gen 2过程相比的Gen 3过程之各种实施例及结果。
表57：示例性Gen 3过程特征
实例10：示例性GEN 3过程(也称为GEN 3.1)
此实例描述关于“Gen 2与Gen 3程序之间针对TIL扩增的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在该过程早期包括活化步骤，其目标为增加最终总活细胞(TVC)输出，同时维持表型及功能概况。如下文所描述，Gen 3实施例经修改为另一个实施例且在本文中在此实例中被称作Gen 3.1。
在一些实施例中，Gen 3.1TIL制造过程具有四个操作员介入：
1.肿瘤碎片分离及活化：在该过程的第0天，解剖肿瘤且产生各自为约3×3mm的最终碎片(总计至多240个碎片)，在1至4个G-REX100MCS培养瓶中培养。各培养瓶含有至多60个碎片、500mL CM1或DM1培养基，补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3及2.5×108个经照射的同种异体单核细胞。将培养物在37℃下孵育6至8天。
2.TIL培养再活化：在第7至8天，在两种情况下培养物通过缓慢添加补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3及5×108个经照射的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基补充。注意不要干扰培养瓶底部处的现有细胞。将培养物在37℃下孵育3至4天。
3.培养规模纵向扩大：发生在第10至11天。在培养规模纵向扩大期间，将G-REX100MCS的全部内容物转移至含有在两种情况下补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的4L G-REX500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下孵育5至6天直至收集。
4.收集/洗涤/配制：在第16至17天，培养瓶体积减小且汇集。将细胞浓缩且用含有1％HAS的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。经洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比例配制，补充rhIL-2至最终浓度为300IU/mL。
DP以受控速率冷冻进行冷冻保存且储存在气相液氮中。*完整标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可替代CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，其称为确定成分培养基(DM1或DM2)，如上文所提及。
过程描述。在第0天，将肿瘤洗涤3次，然后破碎成3×3×3的最终碎片。整个肿瘤经破碎后，随后将最后碎片同等地随机化且分成三个池。将一个随机化碎片池引入各组，每个三个实验矩阵添加相同数目的碎片。
在整个TIL扩增过程中，使用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，用确定成分培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完整培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM GlutaMaxTM、10％人AB血清、庆大霉素(50ug/mL)、2-巯基乙醇(55uM)。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM2完整培养基2：50％CM1培养基+50％AIM-V培养基。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM4完整培养基4：补充有GlutaMaxTM(2mM)的AIM-V。补充有3000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CTS OpTmizer CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)及CTSTM免疫细胞SR(3％)与GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有6,000IU/mL IL-2的最终制剂。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)及CTSTM免疫细胞SR(3％)与GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有3,000IU/mL IL-2的最终制剂。
预先制备所有类型的所用培养基，即完整(CM)及确定(DM)培养基，在4℃下保持直至使用前一天，在培养箱中在37℃下在处理日之前提前升温至多24小时。
针对两种肿瘤在第7天发生TIL培养再活化。规模扩大针对L4063在第10天及针对L4064在第11天出现。收集两种培养物且在第16天冷冻保存。
达成的结果。确定了Gen 3.0及Gen 3.1过程的细胞计数及存活率％。在所有条件中扩增遵循描述于此实例中的细节。
对于各肿瘤，碎片分成三个相等数目的池。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。对于三个不同的过程，评估各条件的总活细胞及细胞存活率。细胞计数确定为第7天用于再活化的TVC，第10天(L4064)或第11天(L4063)用于规模扩大的TVC，以及第16/17天收集的TVC。
第7天及第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将收集日第16/17TVC除以第7天再活化TVC来计算倍数扩增。为了比较三组，收集日的TVC除以在第0天添加至培养物中的碎片的数目，以便计算每个碎片的活细胞的平均值。
对L4063及L4064进行细胞计数及存活率分析。在两个肿瘤上，Gen 3.1测试过程每个碎片产生的细胞比Gen 3.0过程多。
总活细胞计数及倍数扩增；该过程期间的存活率％。在再活化时、规模纵向扩大及收集的存活率百分比在所有条件下进行。在第16/17天收集时，将最终TIL与存活率％的放行准则进行比较。所有条件都超过70％的存活率准则，在过程及肿瘤方面具有可比性。
免疫表型-TIL最终产物的表型表征。对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化及记忆标记物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+及CD8+细胞的百分比群体都是一致的。
进行了REP TIL的扩增表型分析。在两个肿瘤中TIL产物显示，与Gen 3.0相比，Gen3.1条件下CD4+细胞的百分比较高，在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，Gen 3.0中来自CD8+群体的CD28+细胞百分比较高。
自Gen 3.0及Gen 3.1过程中收集的TIL显示出与CD4+及CD8+细胞上的CD27及CD56表达相当的表型标记物，以及CD4+闸控细胞群上相当的CD28表达。对TIL最终产物的记忆标记物比较：
将第16天收集的冷冻TIL样本进行染色以用于分析。TIL记忆状态在Gen 3.0与Gen3.1过程之间相当。对TIL最终产物的活化及耗尽标记物比较：
活化及耗尽标记物在CD4+及CD8+细胞上门控的Gen 3.0及Gen 3.1过程之间具有可比性。
再刺激时的干扰素γ分泌。收集的TIL使用L4063及L4064的经涂布的抗CD3板进行过夜再刺激。在所分析的两个肿瘤中，与Gen 3.0过程相比，观测到来自Gen 3.1过程的较高的IFNγ产生。
培养基中IL-2含量的测量。为比较所有条件与过程之间的IL-2消耗含量，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大及第16天/第17天收集日收集细胞上清液，冷冻。随后将上清液解冻且接着分析。细胞培养物上清液中IL-2的量通过制造商方案测量。
在同一培养基条件下评估的整个过程中，Gen 3及Gen 3.1的总体过程就IL-2消耗而言具有可比性。对收集的L4063及L4064用过的培养基的IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析。对于每种条件，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大及在L4063及L4064的第16天/第17天收集日收集来自L4063及L4064的用过的培养基上清液。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、GlutaMaxTM及氨的浓度。
与完整培养基(2g/L)相比，确定成分培养基的葡萄糖浓度更高，为4.5g/L。总体而言，各培养基类型中Gen 3.0及Gen 3.1过程的葡萄糖浓度及消耗量相当。
观测到乳酸盐增加，乳酸盐增加在Gen 3.0与Gen 3.1条件之间及在用于再活化扩增的两个培养基(完整培养基及确定成分培养基)之间相当。
在一些情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM GlutaMaxTM以补偿在培养条件下L-谷氨酰胺自然降解为L-谷氨酸及氨的情况。
在一些情况下，所使用的确定(无血清)培养基在基础培养基上不含L-谷氨酰胺，仅补充有GlutaMaxTM至最终浓度为2mM。GlutaMaxTM是L-丙氨酸及L-谷氨酰胺的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，不会自发降解为谷氨酸及氨。相反，二肽逐渐分解成单个氨基酸，从而保持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以维持稳健的细胞生长。
在一些情况下，谷氨酰胺及GlutaMaxTM的浓度在规模扩大日略有下降，但在收集日显示出与再活化日相比增加至类似或更接近的含量。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺及GlutaMaxTM浓度在不同条件下以相似的速率出现轻微降解。
氨浓度在含有2mM谷氨酰胺+2mM GlutaMaxTM的标准培养基中生长的样本比在含有2mM GlutaMaxTM的确定成分培养基中生长的样本更高。此外，如所预期，在培养过程内，氨逐渐增加或累积。在三种不同测试条件，在氨浓度方面不存在差异。
通过Flow-FISH测量重复端粒。Flow-FISH技术用于测量Gen 3及Gen 3.1过程下L4063及L4064上端粒重复的平均长度。使用端粒PNA套件/FITC计算相对端粒长度(RTL)的测定，以用于来自DAKO的流式细胞术分析。进行端粒测定。将样本中的端粒长度与对照细胞系(1301白血病)进行比较。对照细胞系是具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞系。在两种肿瘤中评估的Gen 3及Gen 3.1过程显示出相当的端粒长度。
TCRVβ谱系分析
为了确定各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，通过对T细胞受体的CDR3部分进行测序来分析TIL最终产物的克隆多样性分析。
在三个条件之间比较三个参数：
·独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
·共享uCDR3％
·对于uCDR3的前80％：
о比较共享uCDR3复本％
о比较独特克隆型的频率
对照及Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上共享独特CDR3序列的百分比：975个序列在Gen 3及Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1共享的来自Gen 3独特CDR3序列的前80％的88％。
对照及Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上共享独特CDR3序列的百分比：2163个序列在Gen 3及Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1共享的来自Gen3独特CDR3序列的前80％的87％。
来自收集第16天收集的1×106个细胞中鉴别的独特CD3序列的数目，用于不同的过程。基于样本中独特肽CDR的数量，Gen 3.1测试条件显示出与Gen 3.0相比略高的克隆多样性。
夏侬熵(Shannon entropy)多样性指数是一个可靠且常用的比较度量，因为两种肿瘤的Gen 3.1条件显示出略高于Gen 3过程的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系比Gen 3.0过程更具多克隆性。
此外，Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系与Gen 3.0过程的相应谱系在肿瘤L4063及L4064上显示超过87％的重叠。
Gen 3.1测试L4064在再活化日用过的培养基上的IL-2浓度值低于预期值(类似于Gen 3.1对照及Gen 3.0条件)。
低值可能由于移液错误造成，但由于采集的样本很少，因此不可能重复分析。
结论。与Gen 3.0及Gen 3.1对照相比，第0天的Gen 3.1测试条件(包括饲养细胞和OKT-3)在收集第16天显示出细胞剂量的较高TVC。Gen 3.1测试条件下最终产物的TVC比Gen3.0高约2.5倍。
对于所测试的两个肿瘤样本，在第0天添加OKT-3及饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，若在第0天起始最多4个培养瓶，则最终细胞剂量可在80至100×109个TIL之间。
在Gen 3.1测试及Gen 3.0过程之间保持所有品质属性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗尽、活化及记忆标记物。
在所分析的两个肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1上的最终TIL产物的IFN-γ产生比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生有效的TIL产物。
在测试条件下葡萄糖或乳酸盐含量未观测到差异。在不同培养基条件下，Gen3.0及Gen 3.1过程之间的谷氨酰胺及氨未观测到差异。培养基上的较低含量的谷氨酰胺不限制细胞生长，表明仅在培养基中添加GlutaMaxTM就足以给予细胞增殖所需的营养。
在第11天及第10天分别规模纵向扩大，在过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示出重大差异，在整个过程期间两种情况下，代谢物消耗都具有可比性。此观测结果表明Gen 3.0最佳化过程可在处理天数上具有灵活性，由此促进过程安排的灵活性。
与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示出较高的克隆多样性，通过CDR3 TCRab序列分析测量。
图32描述Gen 3过程(Gen 3最佳化过程)的实施例。标准培养基及CTS Optimizer无血清培养基可用于Gen 3最佳化过程TIL扩增。在使用CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基上的GlutaMaxTM增加至最终浓度4mM。
实例11：GEN 3扩增平台第16-17天的示例性实施例
洗涤缓冲液制备(1％HAS PLASMALYTE A)。
将HAS及PLasmalyte转移至5L袋中以制作LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件将总体积为125mL的25％HSA转移至5L袋中。在室温下储存。
取出且将10mL或40mL洗涤缓冲液转移至“IL-2 6×104IU/mL管”中(若预先制备IL-2，则为10mL，或若新鲜制备IL-2，则为40mL)。
计算添加至Plasmalyte+1％HSA中的经复原IL-2的体积：经复原IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准分析)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出复原IL-2所需的IL-2的计算初始体积，转移至“IL-2 6×104IU/mL”管中。将来自预先制备的等分试样的100μL IL-2 6×106IU/mL添加至含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为“IL-2 6×104IU/mL”的管中。
自G-Rex 500MCS培养瓶取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液且将细胞转移至细胞收集池袋中。对所有G-Rex 500MCS培养瓶重复。
取出60mL上清液且添加至上清液试管中用于品质对照分析，包括支原体检测。储存于+2-8℃。
细胞收集
计数细胞。用4.5mL的AIM-V制备四个15mL锥形管。这些可预先准备。最佳范围＝介于5×104及5×106个细胞/mL之间(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向先前制备的4500μL AIM V，添加500μL CF。记录稀释因数。
计算预LOVO(存活+死亡)的TC(总细胞)＝
平均总细胞
浓度(预LOVO TC浓度)
(存活+死亡)
X
源袋的体积
计算预LOVO(存活)的TVC(总活细胞)＝
平均总活细胞
浓度(预LOVO TVC)
(存活)
X
LOVO源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝待取出的体积。
当总细胞(TC)数目≤5×109，取出4×106个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。4×106÷总TC浓度＝待取出的体积。
使用适当大小的注射器自LOVO源袋中取出所需体积。在冷冻保存步骤之前保存于培养箱中。
当测定总细胞数目时，取出细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认预LOVO的TVC 5×108或4×106或不适用。计算取出的细胞体积。
计算袋中剩余的剩余总细胞。计算预LOVO的TC(总细胞)。[平均总细胞浓度X剩余体积＝TC预LOVO剩余]
根据剩余的细胞的总数目，在下表中选择相应过程。
表38：细胞总数目
总细胞 保留物(mL)
0<总细胞≤31×109 115
31×109<总细胞≤71×109 165
71×109<总细胞≤110×109 215
110×109<总细胞≤115×109 265
选择与所用过程相对应的IL-2添加的体积。体积计算为：保留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO袋后添加的IL-2体积。记录所有添加的体积。在冷冻小瓶中获得样本用于进一步分析。
充分混合细胞产物。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样本进行内毒素、IFN-γ、无菌及其他分析。
实例12：示例性GEN 3过程(也称为GEN 3.1)
目的
此实例描述关于“Gen 2与Gen 3程序之间针对TIL扩增的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在该过程早期包括活化步骤，其目标为增加最终总活细胞(TVC)输出，使其与Gen 2相当(或更好)，同时维持表型及功能概况。
范围
通过在第0天对经培养的肿瘤碎片引入活化步骤来评估TVC输出。
在两个独立患者肿瘤上，证实Gen 3标准组以及对照组在功能性及扩增表型表征上具有可比较性。
分析培养基消耗及代谢物产生以确定处理参数维持在生理条件下。
此实例的所有操作均在全尺寸平台进行，使用市售供体肿瘤组织作为起始材料。
信息
过程Gen 3实施例经修改为另一个实施例且在本文中在此实例中称作Gen 3.1。
Gen 3.1TIL制造概念具有四个操作员介入：
1.肿瘤碎片分离及活化：在该过程的第0天，解剖肿瘤且产生各自为约3×3mm的最终碎片(总计至多240个碎片)，在1至4个G-Rex100MCS培养瓶中培养。各培养瓶含有至多60个碎片、500mL CM1或DM1培养基，补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3及2.5×108个经照射的同种异体单核细胞。将培养物在37℃下孵育6至8天。
2.TIL培养再活化：在第7至8天，在两种情况下培养物通过缓慢添加补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3及5×108个经照射的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基补充。注意不要干扰培养瓶底部处的现有细胞。将培养物在37℃下孵育3至4天。
3.培养规模纵向扩大：发生在第10至11天。在培养规模纵向扩大期间，将G-Rex100MCS的全部内容物转移至含有在两种情况下补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的4L G-Rex500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下孵育5至6天直至收集。
4.收集/洗涤/配制：在第16至17天，培养瓶体积减小且汇集。将细胞浓缩且用含有1％HAS的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。经洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比例配制，补充rhIL-2至最终浓度为300IU/mL。
DP以受控速率冷冻进行冷冻保存且储存在气相液氮中。*完整标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可替代CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，其称为确定成分培养基(DM1或DM2)，如上文所提及。
过程描述
在第0天，将肿瘤洗涤3次，然后破碎成3×3×3的最终碎片。整个肿瘤经破碎后，随后将最后碎片同等地随机化且分成三个池。将一个随机化碎片池引入各组，每个三个实验矩阵添加相同数目的碎片。
在整个TIL扩增过程中，使用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，用确定成分培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完整培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM Glutamax、10％人AB血清、庆大霉素(50ug/mL)、2-巯基乙醇(55uM)。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM2完整培养基2：50％CM1培养基+50％AIM-V培养基。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM4完整培养基4：补充有GlutaMax(2mM)之AIM-V。补充有3000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CTS OpTmizer CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)及CTSTM免疫细胞SR(3％)与GlutaMax(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有6,000IU/mL IL-2的最终制剂。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)及CTSTM免疫细胞SR(3％)与GlutaMax(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有3,000IU/mL IL-2的最终制剂。
预先制备所有类型的所用培养基，即完整(CM)及确定(DM)培养基，在4℃下保持直至使用前一天，在培养箱中在37℃下在处理日之前提前升温至多24小时。
针对两种肿瘤在第7天发生TIL培养再活化。规模扩大针对L4063在第10天及针对L4064在第11天出现。收集两种培养物且在第16天冷冻保存。
预期结果
与Gen 3.0相比，Gen 3.1在第16-17天收集时可能达到更高的总活细胞数。
与Gen 3.0相比，Gen 3.1可能会在再刺激后产生相似含量的IFNγ。
Gen 3.1及Gen 3.0可能具有相似的克隆多样性，其通过最终TIL产物中存在的总独特CDR3序列来测量。
Gen 3.1过程中的表型表征可能与Gen 3.0相似。
达成的结果
确定了Gen 3.0及Gen 3.1过程的细胞计数及存活率％。在所有条件中扩增遵循描述于此实例中的细节。
总活细胞计数及倍数扩增
对于各肿瘤，碎片分成三个相等数目的池。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。对于三个不同的过程，评估各条件的总活细胞及细胞存活率。细胞计数确定为第7天用于再活化的TVC，第10天(L4064)或第11天(L4063)用于规模扩大的TVC，以及第16/17天收集的TVC。
第7天及第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将收集日第16/17TVC除以第7天再活化TVC来计算倍数扩增。为了比较三组，收集日的TVC除以在第0天添加至培养物中的碎片的数目，以便计算每个碎片的活细胞的平均值。
对L4063及L4064进行细胞计数及存活率分析。在两个肿瘤上，Gen 3.1测试过程每个碎片产生的细胞比Gen 3.0过程多。
在过程期间总活细胞计数及倍数扩增存活率％
在再活化时、规模纵向扩大及收集的存活率百分比在所有条件下进行。在第16/17天收集时，将最终TIL与存活率％的放行准则进行比较。所有条件都超过70％的存活率准则，在过程及肿瘤方面具有可比性。
免疫表型分型
TIL最终产物的表型表征。
对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化及记忆标记物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+及CD8+细胞的百分比群体都是一致的。
进行了REP TIL的扩增表型分析。在两个肿瘤中TIL产物显示，与Gen 3.0相比，Gen3.1条件下CD4+细胞的百分比较高，在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，Gen 3.0中来自CD8+群体的CD28+细胞百分比较高。
自Gen 3.0及Gen 3.1过程中收集的TIL显示出与CD4+及CD8+细胞上的CD27及CD56表达相当的表型标记物，以及CD4+门控细胞群上相当的CD28表达。对TIL最终产物的记忆标记物比较：
将第16天收集的冷冻TIL样本进行染色以用于分析。TIL记忆状态在Gen 3.0与Gen3.1过程之间相当。对TIL最终产物的活化及耗尽标记物比较：
活化及耗尽标记物在CD4+及CD8+细胞上门控的Gen 3.0及Gen 3.1过程之间具有可比性。
再刺激时的干扰素γ分泌：
收集的TIL使用L4063及L4064的经涂布的抗CD3板进行过夜再刺激。在所分析之两个肿瘤中，与Gen 3.0过程相比，观测到来自Gen 3.1过程的较高的IFNγ产生。
培养基中IL-2含量的测量
为比较所有条件与过程之间的IL-2消耗含量，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大及第16天/第17天收集日收集细胞上清液，冷冻。随后将上清液解冻且接着分析。细胞培养物上清液中IL-2的量通过制造商方案测量。
在同一培养基条件下评估的整个过程中，Gen 3及Gen 3.1的总体过程就IL-2消耗而言具有可比性。对收集的L4063及L4064用过的培养基的IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析
对于每种条件，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大及在L4063及L4064的第16天/第17天收集日收集来自L4063及L4064的用过的培养基上清液。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、glutamax及氨的浓度。
与完整培养基(2g/L)相比，确定成分培养基的葡萄糖浓度更高，为4.5g/L。总体而言，各培养基类型中Gen 3.0及Gen 3.1过程的葡萄糖浓度及消耗量相当。
在所有测试条件下，L4063及L4064两种肿瘤均观测到乳酸盐增加。乳酸盐增加在Gen 3.0与Gen 3.1条件之间及在用于再活化扩增的两个培养基(L4063的完整培养基及L4064的确定成分培养基)之间相当。
在L4063的情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM glutamax以补偿在培养条件下L-谷氨酰胺自然降解为L-谷氨酸及氨的情况。
对于L4064肿瘤，所使用之确定(无血清)培养基在基础培养基上不含L-谷氨酰胺，仅补充有glutamax至最终浓度为2mM。Glutamax为L-丙氨酸及L-谷氨酰胺的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，不会自发降解为谷氨酸及氨。相反，二肽逐渐分解成单个氨基酸，从而保持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以维持稳健的细胞生长。
对于L4063，谷氨酰胺及glutamax的浓度在规模扩大日略有下降，但在收集日显示出与再活化日相比增加至类似或更接近的含量。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺及glutamax浓度在不同条件下以相似的速率出现轻微降解。
如所预期，L4063(在含有2mM谷氨酰胺+2mM glutamax的标准培养基中生长)的氨浓度高于L4064(在含有2mM glutamax的确定成分培养基中生长)。此外，如所预期，在培养过程内，氨逐渐增加或累积。在三种不同测试条件，在氨浓度方面不存在差异。
通过Flow-FISH测量重复端粒：
Flow-FISH技术用于测量Gen 3及Gen 3.1过程下L4063及L4064上端粒重复的平均长度。使用端粒PNA套件/FITC计算相对端粒长度(RTL)的测定，以用于来自DAKO的流式细胞术分析。进行端粒测定。
将L4063及L4064样本中的端粒长度与对照细胞系(1301白血病)进行比较。对照细胞系是具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞系。在两种肿瘤中评估的Gen 3及Gen 3.1过程显示出相当的端粒长度。
TCRVβ谱系分析
为了确定各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，通过对T细胞受体的CDR3部分进行测序来分析TIL最终产物的克隆多样性分析。
在三个条件之间比较三个参数：
·独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
·共享uCDR3％
·对于uCDR3的前80％：
о比较共享uCDR3复本％
о比较独特克隆型的频率
对照及Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上L4063上的共享独特CDR3序列的百分比：975个序列在Gen 3及Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1测试最终产物共享的来自Gen 3独特CDR3序列的前80％的88％。
对照及Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上L4064上的共享独特CDR3序列的百分比：2163个序列在Gen 3及Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1测试最终产物共享的来自Gen 3独特CDR3序列的前80％的87％。
来自收集第16天收集的1×106个细胞中鉴别的独特CD3序列的数目，用于不同的过程。基于样本中独特肽CDR的数量，Gen 3.1测试条件显示出与Gen 3.0相比略高的克隆多样性。
夏侬熵多样性指数是一个更可靠且常用的比较度量，因为两种肿瘤的Gen 3.1条件显示出略高于Gen 3过程的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系比Gen 3.0过程更具多克隆性。
此外，Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系与Gen 3.0过程的相应谱系在肿瘤L4063及L4064上显示超过87％的重叠。
额外信息
Gen 3.1测试L4064在再活化日用过的培养基上的IL-2浓度值低于预期值(类似于Gen 3.1对照及Gen 3.0条件)。
低值可能由于移液错误造成，但由于采集的样本很少，因此不可能重复分析。
样本L4064的规模纵向放大第10/11天的用过的培养基未进行收集，不包括在对上清液的IL-2浓度分析及代谢物分析中。
结论
与Gen 3.0及Gen 3.1对照相比，第0天的Gen 3.1测试条件(包括饲养细胞和OKT-3)在收集第16天显示出细胞剂量的较高TVC。Gen 3.1测试条件下最终产物的TVC比Gen 3.0高约2.5倍。
对于肿瘤L4063及L4064，在第0天添加OKT-3及饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，若在第0天起始最多4个培养瓶，则最终细胞剂量可在80至100E+09个TIL之间。
在Gen 3.1测试及Gen 3.0过程之间保持所有品质属性且具有可比性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗尽、活化及记忆标记物。TIL最终产物的端粒长度及用过的培养基上的IL-2消耗量在Gen 3.0及Gen 3.1过程之间相当。
在所分析的两个肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1上的最终TIL产物的IFN-γ产生比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生有效的TIL产物。
在测试条件下葡萄糖或乳酸盐含量未观测到差异。在不同培养基条件下，Gen3.0及Gen 3.1过程之间的谷氨酰胺及氨未观测到差异。培养基上的较低含量的谷氨酰胺不限制细胞生长，表明仅在培养基中添加glutamax就足以给予细胞增殖所需的营养。
L4063及L4064的规模纵向扩大日分别为第11天及第10天，在过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示出重大差异，在整个过程期间两种情况下，代谢物消耗都具有可比性。此观测结果表明Gen 3.0最佳化过程可在处理天数上具有灵活性，由此促进过程安排的灵活性。
与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示出较高的克隆多样性，通过CDR3 TCRab序列分析测量。
图32描述Gen 3过程(Gen 3最佳化过程)的实施例。标准培养基及CTS Optimizer无血清培养基可用于Gen 3最佳化过TIL扩增。在使用CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基上的glutamax增加至最终浓度为4mM。
可行性及可比较性：
可行性：
为所有实验中的所有研究条件建立可行性。在所有实验及条件以及供体肿瘤组织之间，所有实验均使用相同批次的关键原材料进行，例如IL-2、人血清AB、同种异体饲养细胞、OKT-3。
可比较性：
根据LFP-002自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)冷冻保存第22天，通过研究的任何组满足我们的临床产品发行准则的能力来确定可比较性。
实例13：利用确定成分培养基的肿瘤扩增过程。
用根据本发明的确定成分培养基(例如CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，赛默飞世尔，包括例如DM1及DM2)替代CM1及CM2培养基来进行公开于实例7至实例12中所公开的过程。
实例14：冷冻保存TIL细胞疗法的示例性生产
此实例描述一种根据当前组织优良操作规范及当前优良制造规范在G-Rex培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表44：过程扩增示例性计划
表45：培养瓶体积
初始过程信息
第0天CM1培养基制备。
在BSC中，向RPMI 1640培养基瓶添加试剂。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMax(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
自BSC取出不必要的材料。自BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素及HBSS保留在BSC以用于配制洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。记录IL-2：批号及有效期。
将IL-2储备液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备液转移至准备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-Rex100MCS传递至BSC中。将G-Rex100MCS(W3013130)无菌传递至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-Rex100MCS培养瓶中。组织碎片锥形管或GRex100MCS。
第0天肿瘤洗涤培养基制备
在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/ml(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理
获得肿瘤。自QAR获得肿瘤试样且立即转移至2-8℃下的套件中进行处理。
等分肿瘤洗涤培养基。
肿瘤洗涤1，使用8”镊子(W3009771)，自试样瓶移出肿瘤，转移至所制备的“洗涤1”培养皿中。随后为肿瘤洗涤2及肿瘤洗涤3。
测量肿瘤。评估肿瘤。评定是否观测到整个肿瘤面积的>30％坏死和/或为脂肪组织。若适用时：清洁解剖。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除分割”。
解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤试样切割成偶数个适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小大致为3×3×3mm的块。储存中间碎片以防脱水。
重复中间碎片分割。测定收集的块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间块”6孔板选择另外的有利肿瘤碎片来填充最多50个块的液滴。
准备锥形管。将肿瘤块转移至50mL锥形管中。制备用于G-REX100MCS的BSC。自培养箱取出G-REX100MCS。将G-Rex100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-Rex100MCS培养瓶中。使块均匀分布。
按以下参数使G-Rex100MCS保温：使G-Rex培养瓶保温：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。计算：保温时间；下限＝保温时间+252小时；上限＝保温时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基并解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备
监测培养箱。监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
在培养箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶及3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。自培养箱取出RPMI 1640培养基瓶。准备RPMI 1640培养基瓶。过滤培养基。解冻3×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)。自培养箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋及中继泵转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基，置于50mL锥形管中。制备细胞计数稀释液管。在BSC中，向四个的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”及批号的AIM-V培养基。将试剂自BSC转移至2至8℃下。制备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集
预处理表格。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-Rex100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-Rex100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶，开始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的贴壁细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL及“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，并分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本且接种在厌氧瓶。
孵育TIL。在需要之前将TIL转移包置于培养箱中。进行细胞计数及计算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限及下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样本的体积(4.0ml)(B)经调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，取出过量TIL并按需要将TIL置于培养箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的目标细胞浓度添加至过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/ml。按需要使过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。根据SOP-00242将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。若体积≤0.5mL，将CS10添加至小瓶中，直至体积为0.5mL。
样本的TIL冷冻保存
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于培养箱中。
样本的冷冻保存
观测锥形管，缓慢添加CS-10，记录添加0.5mL CS10的体积。
第11天-饲养细胞
获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或Cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或Cytotherm处解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失。自培养箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并饲养细胞进行混合，标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。
取出细胞计数样本。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包抽吸4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，确定乘数，选定方案，输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限，并确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4饲养细胞袋置于拉链袋中，在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻约3至5分钟并合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积并记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备细胞计数。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数及计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器及16G针头，吸取0.15mL OKT3且添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-REX填充及接种
设定G-Rex500MCS。自培养箱取出“完全CM2第11天培养基”并将培养基泵吸至G-Rex500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封并使培养瓶保温。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-Rex500MCS。将饲养细胞添加至G-Rex500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-Rex500MCS。热封。将G-Rex500MCS在37.0±2.0℃下保温，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
计算保温范围。进行计算以确定在第16天自培养箱取出G-Rex500MCS的适当时间。下限：保温时间+108小时。上限：保温时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存
适用：冷冻过量TIL小瓶。确证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存件中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存件中。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备
预热AIM-V培养基。针对培养基袋1、2及3计算使培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12至24小时的持续时间。设定用于上清液的10L Labtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10LLabtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。等分100.0mL GlutaMax。将IL-2添加至GlutaMax。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMax+IL-2泵吸至袋中。监测参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分瓶
监测培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-Rex500MCS。准备1L转移包，标记为TIL悬浮液，称重1L。
G-Rex500MCS的体积减少。根据SOP-01777将约4.5L培养上清液自G-Rex500MCS转移至10L Labtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离，以确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheRex，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞及培养基。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量并计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌性及BacT测试取样：自准备的标记有BacT的15mL锥形管取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对每个样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包移除1.0mL，置于准备的标记有“支原体稀释液”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于培养箱中。自BSC取出细胞悬浮液，在需要之前置于培养箱中。进行细胞计数及计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mLAIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，得到稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出以用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-Rex500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-Rex-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一GREX-500M培养瓶，同时准备另外的培养基并使其升温。准备确定的所计算数目的其他培养基袋并使其升温。填充G-Rex500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中。热封。重复填充。使培养瓶保温。计算待添加至新G-Rex500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自培养箱取出G-Rex500MCS。准备用于泵吸的G-Rex500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自培养箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。泵吸所计算体积的TIL悬浮液至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使培养瓶保温。
测定在第22天自培养箱取出G-Rex500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备
准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10LLabtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为待进行收集的每两个G-Rex500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，通过翻转泵及操控袋子的位置来自3000mL Origen袋移除空气。将25％的人白蛋白添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的人白蛋白25％。
制备IL-2稀释液。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上的无针注入口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻IL-2。解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化。IL-2制备。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记为“IL-2稀释液”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2至8℃下，以对其进行预处理，以便用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”及批号的AIM-V培养基。准备细胞计数。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1至4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自培养箱中取出G-Rex500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭额外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-Rex500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子，并确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本。
进行细胞计数。利用NC-200及过程注释5.14进行细胞计数及计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度及总成核细胞浓度。测定计数的上限及下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度及总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释液。通过鲁尔样本口自一个上清液袋取出10.0mL，置于15mL锥形管中。
LOVO
进行“TIL G-Rex收集”方案并测定最终产物目标体积。装载一次性套件。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。确证已附接PlasmaLyte，观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，确证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制及填充
目标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10及LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作储备液：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接(依据过程注释5.11)至准备的集束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，自“IL-2 6×104”等分试样取出所测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。一旦已填充最后一个最终产物袋，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中并替换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中并将管标记为“保留物”及批号。针对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2至8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物，置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数及计算。注意：仅将一个样本稀释至适当稀释度以验证稀释度是足够的。将另外的样本稀释至适当稀释因数并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值及存活率平均值。测定计数的上限及下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表46：样本计划
样本 容器数目 各个添加的样本体积 容器类型
*支原体 1 1.0mL 15mL锥形管
内毒素 2 1.0mL 2mL冷冻小瓶
革兰氏染色 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
IFN-g 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
流式细胞术 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
**Bac-T无菌性 2 1.0mL Bac-T瓶
QC保留物 4 1.0mL 2mL冷冻小瓶
卫星小瓶 10 0.5mL 2mL冷冻小瓶
无菌性及BacT。测试取样。在BSC中，自使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存
准备速率受控冷冻机。确证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物及样本置于CRF中。测定要达至4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子及小瓶。将盒子及小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
后处理概述
后处理：最终药品
(第22天)在第22天REP中通过流式细胞术测定CD3+细胞
(第22天)革兰氏染色法(GMP)
(第22天)通过凝胶凝块LAL分析(Gel Clot LAL Assay)进行细菌内毒素测试(GMP)
(第16天)BacT无菌性分析(GMP)
(第16天)通过TD-PCR进行支原体DNA检测(GMP)
可接受的外观属性
(第22天)BacT无菌性分析(GMP)(第22天)
(第22天)IFN-γ分析
实例15：使用TIL加伊匹木单抗及纳武单抗的癌症疗法
此实例提供一种治疗癌症的方法的示例性概况，该方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，患者或受试者已接受至少一种先前疗法，该至少一种先前疗法包括CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
在切除前1至3周之间，向患者施用伊匹木单抗，至多两次剂量。伊匹木单抗可以标准剂量中的任一者施用，包括以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量或约200mg至约500mg的剂量进行施用。在一些情况下，伊匹木单抗可以1mg/kg进行施用。在一些情况下，伊匹木单抗可以1mg/kg IV Q6W进行施用。
在切除前1至3周之间，可选地向患者施用纳武单抗。在一些情况下，患者在肿瘤收集前施用1次剂量及肿瘤收集后施用1次剂量。在一些情况下，患者在IL-2施用后也施用纳武单抗。在一些情况下，IL-2以60,000IU/kg进行施用。
如以下示意图中所指示，环磷酰胺在TIL施用第-5天及第-4天(即，在TIL施用之前5天以及在TIL施用之前4天施用)施用。环磷酰胺可与美司钠一起施用。环磷酰胺以60mg/kg进行施用。
如以下示意图中所指示，氟达拉滨在TIL施用第-5天、第-4天、第-3天、第-2天及第-1天(即，在TIL施用之前5天、4天、3天、2天及1天施用)施用。氟达拉滨以25mg/m2/天进行施用。
如以下示意图中所指示，IL-2(例如阿地白介素)可选地与TIL一起施用。IL-2也在TIL疗法后第1、2、3及4天进行施用。
如以下示意图中所指示，伊匹木单抗在IL-2施用后进行施用。伊匹木单抗可以标准剂量中的任一者施用，包括以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量或约200mg至约500mg的剂量进行施用。在一些情况下，伊匹木单抗可以1mg/kg进行施用。在一些情况下，伊匹木单抗可以1mg/kg IV Q6W进行施用。
如以下示意图中所示，纳武单抗在IL-2施用后进行施用。在一些情况下，纳武单抗在施用IL-2后1至3天进行施用。纳武单抗可以标准剂量中的任一者施用，包括以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量或约200mg至约500mg的剂量进行施用。在一些情况下，纳武单抗可以1mg/kg进行施用。在一些情况下，纳武单抗可以3mg/kg Q2W进行施用。在一些情况下，纳武单抗可以480mg Q4W进行施用。
提供上述实例以为一般本领域技术人员提供如何制得并使用本发明的组合物、系统及方法的实施例的完整公开及描述，并不意在限制本发明人定义其发明的范围。对本领域技术人员显而易见的用于进行本发明的上文所描述模式的修改意在落入以下权利要求范围内。本说明书中提及的所有专利及公开指示本领域技术人员的技能水平。
所有标题及章节名称仅用于清晰及参考目的，不应视为以任何方式具限制性。举例而言，本领域技术人员应了解根据本文所述的本发明的精神及范围按需要组合来自不同标题及章节的各种方面的有用性。
本文中引用的所有参考文献以全文引用的方式且出于所有目的并入本文中，其引用程度如同各个别公开或专利或专利申请经特定且个别地指示出于所有目的以全文引用的方式并入本文中一般。
对本领域技术人员将显而易见的是，可在不脱离本申请的精神及范围的情况下对其进行多种修改及改变。本文所述的特定实施例及实例仅作为示例提供，本申请仅受随附权利要求的条款以及权利要求所享有的等效物的全部范围的限制。
实例16：自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)细胞疗法以及帕博利珠单抗在未使用免疫检查点抑制剂的晚期癌症患者中的2期疗效及安全性
背景
免疫检查点抑制剂(ICI)为治疗多种晚期癌症的标准疗法，包括黑色素瘤、HNSCC及子宫颈癌(Carlino MS等人,《柳叶刀(Lancet.)》2021；398(10304):1002-14；Ferris RL等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》2016；375(19):1856-67；Hsieh RW等人,《肿瘤学前沿(Frontiers in Oncology.)》2021；11:705614；Liu Y等人,《药理学前沿(Frontiersin Pharmacology.)》2019；10:65；Minion LE等人,《妇科肿瘤学(GynecologicOncology.)》2018；148(3):609-21；Sarnaik AA等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)》2021；39(24):2656-66；Jazaeri AA等人,《临床肿瘤学杂志》2019；37(增刊；摘要182))。Lifileucel(LN-144)及LN-145为使用TIL的一次性自体过继细胞疗法，在ICI治疗失败的晚期癌症患者中，作为单药疗法显示出令人鼓舞的疗效与可接受的安全性。需要新的早期组合疗法来提高反应率及反应深度，并具有可控的长期安全性。探索了TIL细胞疗法及帕博利珠单抗组合治疗未使用ICI的黑色素瘤、HNSCC及子宫颈癌的患者。
研究设计及合格性
对于临床研究IOV-COM-202(NCT03645928)：实体肿瘤患者的自体TIL的2期多中心研究，存在两个组：组1A：不可切除或转移性黑色素瘤未使用抗PD-1/PD-L1Lifileucel+帕博利珠单抗，N＝12；组2A：晚期、复发性或转移性HNSCC未使用抗PD-1/PD-L1LN-145+帕博利珠单抗，N＝19。
对于临床研究C-145-04(NCT03108495)：复发性、转移性或持续性子宫颈癌患者的自体TIL的2期多中心研究，存在一个组：组3：阶段4b，持续性、复发性或转移性子宫颈癌无先前疗法(局部化学放射或手术除外)LN-145+帕博利珠单抗，N＝24。
主要合格性准则
≥1个用于TIL制造的可切除病变(切除后直径≥1.5cm)
≥1个用于反应评估的可测量病变(根据RECIST v1.1由研究人员测量)
ECOG效能状态0-1
方法
患者自2019年3月至2021年8月入选北美及EU的站点
不允许同时进行抗癌疗法
根据RECIST v1.1评估反应
指标
指标 IOV-COM-202 C-145-04
主要 ORR≥3级TEAE的发生率 ≥3级TEAE的发生率
次要 CR率、DOR、DCR、PFS、OS ORR、DOR、DCR、PFS、OS
患者行程及中央Gen 2 GMP制造
图34说明了制备TIL及其施用的示意性程序。Lifileucel及LN-145为冷冻保存的TIL输注产品，其在中央GMP设施中使用22天Gen 2过程生产，类似于上述实例7和/或实例9中描述的Gen 2过程。
治疗方案
治疗方案于图35中说明。
治疗包括：
用于TIL制造的肿瘤切除；在肿瘤切除后但在NMA-LD之前进行1剂量的帕博利珠单抗(200mg*或400mg)；NMA-LD(环磷酰胺60mg/kg每日2剂及氟达拉滨25mg/m2每日5剂)；TIL输注(1×109至150×109个细胞)≤6次IL-2剂量(600,000 IU/kg)每8-12小时(TIL输注完成后3-24小时)；每3周(200mg)或6周(400mg)持续使用帕博利珠单抗，持续≤24个月，C-145-04中所需的剂量为*200mg；IOV-COM-202中允许200mg或400mg的剂量。
基线人口统计及临床特征
基线患者特征与未使用ICI(黑色素瘤及HNSCC)或未进行治疗(子宫颈癌)疾病的纳入准则一致。
患者在基线时具有高肿瘤负荷。
在进入研究时已知疾病转移状态的子宫颈癌组中所有患者均具有远端癌转移。
*仅适用于黑色素瘤及HNSCC。患者接受普赖松以及化疗(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱)。仅适用于子宫颈癌。
BRAFi/MEKi、BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；ICI，免疫检查点抑制剂；NA，不适用
*TEAE包括从第一剂帕博利珠单抗或TIL输注中的较早者到最后一剂帕博利珠单抗或TIL输注或开始新的抗癌治疗后30天发生的AE。
在总群体中。
级事件包括2次呼吸衰竭事件(COM-202组2A)、1次肿瘤出血(COM-202组2A)、1次败血症(COM-202组1A)及1次败血性休克(COM-202组2A)；所有被评估为与TIL或帕博利珠单抗不相关或不太可能相关，2个与NMA-LD相关，以及1个与NMA-LD和IL-2相关。
AE，不良事件；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；IL-2，白介素-2；NMA-LD，骨髓清除式淋巴细胞耗尽；TEAE，治疗引发的不良事件；TIL，肿瘤浸润性淋巴细胞。
随时间推移的治疗引发的不良事件*
随时间推移的治疗引发的不良事件(TEAE)于图36中说明。TEAE包括从第一剂帕博利珠单抗或TIL输注中的较早者到最后一剂帕博利珠单抗或TIL输注或开始新的抗癌治疗后30天发生的AE。
AE，不良事件；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；IL-2，白介素-2；NMA-LD，骨髓清除式淋巴细胞耗尽；TEAE，治疗引发的不良事件；TIL，肿瘤浸润性淋巴细胞。
TEAE概况与潜在疾病及帕博利珠单抗、NMA-LD和IL-2的已知概况一致。大部分TEAE发生在TIL输注后的前2周内。IL-2剂量的中位数：黑色素瘤，5.5；HNSCC，5.0；子宫颈癌，5.5。
客观反应率
ORR(FAS)：
黑色素瘤，60.0％
包括3(30.0％)CR
HNSCC，38.9％
子宫颈癌，57.1％
输注的TIL细胞的中位数：
黑色素瘤，21.3×109
HNSCC，15.7×109
子宫颈癌，17.9×109
*全分析集，所有接受TIL及帕博利珠单抗的患者；疗效评估集，所有疗效评估≥1的FAS患者。在资料截取时，患者在初始CR后尚未进行确认评估，但已确认为PR。在资料截取时，患者进行第一次PR评估，但尚未达到确认评估。§DCR定义为CR+PR+SD。€由于在第一次评估前死亡而自疗效评估集中排除。
CR，完全反应；DCR，疾病控制率；FAS，全分析集；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；NE，不可评估；ORR，客观反应率；PR，部分反应；SD，病情稳定；uCR，未确认的完全反应；uPR，未确认的部分反应。
最佳整体反应
图37显示出整体反应。患者2A-16及C3-13进行了第一次PR评估，但在资料截取时尚未达到确认评估。患者2A-11进行了第一次CR评估，但在资料截取时尚未达到确认评估。对于患者C3-04，与基线相比的-100％变化包括淋巴结病变消退至<10mm。
几乎所有可评估疗效的患者都经历肿瘤负荷的减少：黑色素瘤，100％；HNSCC，87.5％；子宫颈癌，85.7％。
反应时间(PR或优选)
图38显示出反应时间。阳性，定义为TPS≥5％(黑色素瘤)、CPS≥20％(HNSCC)、CPS≥1％(子宫颈癌)。基于使用反向卡本-麦尔(Kaplan-Meier)方法的整体存活资料。
自TIL输注日期至新抗癌疗法的日期、评估结束、死亡或资料截止日期(无论哪个较早发生)呈现为每位患者的各条形图。
CPS，组合阳性评分；CR，完全反应；PD-L1，计划性死亡配体-1；pembro，帕博利珠单抗；PR，部分反应；TIL，肿瘤浸润性淋巴细胞；TPS，肿瘤比例评分；Unk，未知。
资料截止时的持续反应：黑色素瘤，66.7％(4/6)；HNSCC，50.0％(3/6)；子宫颈癌，71.4％(5/7)。
中位数研究随访：黑色素瘤，11.5个月；HNSCC，7.8个月；子宫颈癌，7.6个月。
目标病变直径的总和相对于基线的百分比变化
图39显示出肿瘤大小相对于基线的变化。阴性FDG-PET扫描的时间。所呈现的反应表示最佳整体反应。对于患者C3-04，与基线相比的-100％变化包括淋巴结病变消退至<10mm。研究人员在第84天将患者2A-08报告为PR，尽管由于共病情况而无法评估目标病变。
CR，完全反应；FDG-PET，氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；PD，进行性疾病；PR，部分反应；SD，病情稳定；SOD，直径总和；uCR，未确认的完全反应；uPR，未确认的部分反应。
结论
在未使用ICI的情况下，TIL+帕博利珠单抗在晚期黑色素瘤、HNSCC及子宫颈癌患者中产生令人鼓舞的疗效及预期的安全性。几乎所有可评估疗效的患者(86％-100％)都经历肿瘤负荷的减少。在60％的黑色素瘤患者、39％的HNSCC患者及57％的子宫颈癌患者中观测到客观反应(根据FAS中的RECIST v1.1)，该比率与先前关于该组合的报告相似。在黑色素瘤组中达到30％的CR率。
使用lifileucel及LN-145的TIL细胞疗法已在多种实体肿瘤类型及疗法系列中证明了疗效及安全性，无论作为单一疗法以及与ICI组合，加强了此种潜在的同类最佳IO组合对晚期癌症患者的价值。
在正在进行的研究IOV-COM-202(NCT03645928)及C-145-04(NCT03108495)中，TIL+ICI的组合需要在晚期癌症患者中继续研究。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司（Iovance Biotherapeutics, Inc.）
<120> 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与CTLA-4及PD-1抑制剂组合的治疗
<130> PUSCNN235362T
<140> PCT/US21/63910
<141> 2021-12-17
<150> US 63/127,060
<151> 2020-12-17
<150> US 63/146,425
<151> 2021-02-05
<150> US 63/277,371
<151> 2021-11-09
<160> 237
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗的重链的氨基酸序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗的轻链的氨基酸序列
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-2蛋白的氨基酸序列
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿地白介素的氨基酸序列
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2形式
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 6
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 奈瓦纽金α的氨基酸序列
<400> 6
Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn
1 5 10 15
Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
20 25 30
Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile
35 40 45
Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
85 90 95
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
100 105 110
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
115 120 125
Asn Leu Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp
130 135 140
Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu
145 150 155 160
Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys
165 170 175
Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser
180 185 190
Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr
195 200 205
Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr
210 215 220
Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly
225 230 235 240
His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile
245 250 255
Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly
260 265 270
Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr
275 280 285
His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly
290 295 300
<210> 7
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2形式
<400> 7
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Ala Arg Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys
20 25 30
Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu
35 40 45
Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn
50 55 60
Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly
85 90 95
Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser
100 105 110
Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser
115 120 125
Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu
130 135 140
Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro
145 150 155 160
Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro
180 185 190
His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser
195 200 205
Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 粘蛋白结构域多肽
<400> 8
Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro
1 5 10 15
<210> 9
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-4蛋白的氨基酸序列
<400> 9
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 10
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-7蛋白的氨基酸序列
<400> 10
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-15蛋白的氨基酸序列
<400> 11
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 12
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-21蛋白的氨基酸序列
<400> 12
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130
<210> 13
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2序列
<400> 13
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2突变蛋白序列
<400> 14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-2突变蛋白序列
<400> 15
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 16
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2
<400> 16
Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
1 5 10 15
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
20 25 30
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe
35 40 45
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
50 55 60
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
65 70 75 80
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
85 90 95
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
100 105 110
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
115 120 125
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val
130 135 140
Gly
145
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR2
<400> 17
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR3
<400> 18
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 kabat
<400> 19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly
130 135 140
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat
<400> 20
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat
<400> 21
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 22
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 clothia
<400> 22
Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
1 5 10 15
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
20 25 30
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe
35 40 45
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
50 55 60
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
65 70 75 80
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
85 90 95
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
100 105 110
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
115 120 125
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met
130 135 140
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia
<400> 23
Trp Trp Asp Asp Lys
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia
<400> 24
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 25
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2 IMGT
<400> 25
Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
1 5 10 15
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
20 25 30
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe
35 40 45
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
50 55 60
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
65 70 75 80
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
85 90 95
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
100 105 110
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
115 120 125
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser
130 135 140
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT
<400> 26
Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys
1 5
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT
<400> 27
Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 28
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的VH链
<400> 28
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr
20 25 30
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
35 40 45
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
50 55 60
Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
65 70 75 80
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
85 90 95
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
100 105 110
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
115 120 125
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
130 135 140
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr
145 150 155 160
Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys
180 185 190
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr
195 200 205
Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp
210 215 220
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 29
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的重链
<400> 29
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
1 5 10 15
Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
20 25 30
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
50 55 60
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
85 90 95
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
115 120 125
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala
165 170 175
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
180 185 190
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
195 200 205
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
210 215 220
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
245 250 255
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
260 265 270
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
275 280 285
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
290 295 300
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
305 310 315 320
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
325 330 335
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val
340 345 350
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
355 360 365
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
370 375 380
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
385 390 395 400
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala
405 410 415
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
420 425 430
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
435 440 445
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
450 455 460
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
465 470 475 480
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
485 490 495
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
500 505 510
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
515 520 525
Leu Ser Pro Gly Lys
530
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat
<400> 30
Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat
<400> 31
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat
<400> 32
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia
<400> 33
Gln Leu Ser Val Gly Tyr
1 5
<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia
<400> 34
Asp Thr Ser
1
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia
<400> 35
Gly Ser Gly Tyr Pro Phe
1 5
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL链
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 38
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链
<400> 38
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr
20 25 30
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
35 40 45
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
50 55 60
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
65 70 75 80
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
85 90 95
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
100 105 110
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
115 120 125
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
130 135 140
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr
145 150 155 160
Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys
180 185 190
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr
195 200 205
Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp
210 215 220
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
290 295 300
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
325 330 335
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 39
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人4-1BB的氨基酸序列
<400> 40
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 41
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠4-1BB的氨基酸序列
<400> 41
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 42
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的重链
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的轻链
<400> 43
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的重链可变区（VH）。
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的轻链可变区（VL）。
<400> 45
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的重链CDR1
<400> 46
Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的重链CDR2
<400> 47
Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的重链CDR3
<400> 48
Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的轻链CDR1
<400> 49
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的轻链CDR2
<400> 50
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗（PF-05082566）的轻链CDR3
<400> 51
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
<210> 52
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的重链
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 53
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的轻链
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 54
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的重链可变区（VH）
<400> 54
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro
115 120
<210> 55
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的轻链可变区（VL）
<400> 55
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的重链CDR1
<400> 56
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的重链CDR2
<400> 57
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的重链CDR3
<400> 58
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的轻链CDR1
<400> 59
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的轻链CDR2
<400> 60
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗（BMS-663513）的轻链CDR3
<400> 61
Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域
<400> 62
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 63
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 63
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 64
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 64
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 65
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 65
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 66
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 66
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 67
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 67
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 68
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 68
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 69
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 70
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 70
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 71
Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 72
Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 73
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域
<400> 73
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
245
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 74
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 75
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF激动剂融合蛋白的接头
<400> 76
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 77
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB配体（4-1BBL）氨基酸序列
<400> 77
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 78
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BBL多肽的可溶部分
<400> 78
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
20 25 30
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
35 40 45
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
50 55 60
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
85 90 95
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
100 105 110
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
115 120 125
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区（VH）
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区（VL）
<400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区（VH）
<400> 81
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区（VL）
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 83
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区（VH）
<400> 83
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr
115 120
<210> 84
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区（VL）
<400> 84
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105
<210> 85
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人OX40的氨基酸序列
<400> 85
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 86
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠OX40的氨基酸序列
<400> 86
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 87
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的重链
<400> 87
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的轻链
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 89
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的重链可变区（VH）
<400> 89
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的轻链可变区（VL）
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的重链CDR1
<400> 91
Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 92
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的重链CDR2
<400> 92
Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的重链CDR3
<400> 93
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的轻链CDR1
<400> 94
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的轻链CDR2
<400> 95
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗（MEDI-0562）的轻链CDR3
<400> 96
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
1 5
<210> 97
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 98
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr
180
<210> 99
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区（VH）
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区（VL）
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1
<400> 101
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2
<400> 102
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3
<400> 103
Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1
<400> 104
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2
<400> 105
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3
<400> 106
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 107
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 108
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链
<400> 108
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 109
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区（VH）
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区（VL）
<400> 110
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1
<400> 111
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2
<400> 112
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3
<400> 113
Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1
<400> 114
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2
<400> 115
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3
<400> 116
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
1 5
<210> 117
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区（VH）
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区（VL）
<400> 118
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1
<400> 119
Ser His Asp Met Ser
1 5
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2
<400> 120
Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3
<400> 121
His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1
<400> 122
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2
<400> 123
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3
<400> 124
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区（VH）
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区（VL）
<400> 126
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1
<400> 127
Asp Tyr Ser Met His
1 5
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2
<400> 128
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 129
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3
<400> 129
Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1
<400> 130
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2
<400> 131
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3
<400> 132
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 133
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40配体（OX40L）氨基酸序列
<400> 133
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 134
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L多肽的可溶部分
<400> 134
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
20 25 30
Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
35 40 45
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser
50 55 60
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
85 90 95
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
100 105 110
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
115 120 125
Cys Val Leu
130
<210> 135
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L多肽的替代性可溶部分
<400> 135
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
20 25 30
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
35 40 45
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
50 55 60
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
65 70 75 80
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
85 90 95
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
100 105 110
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
115 120 125
<210> 136
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区（VH）
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 137
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区（VL）
<400> 137
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 138
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区（VH）
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 139
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区（VL）
<400> 139
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 140
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区（VH）
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 141
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区（VL）
<400> 141
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 142
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区（VH）
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 143
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区（VL）
<400> 143
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 144
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 144
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 145
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 146
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 146
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 147
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 147
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 148
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 148
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 149
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 150
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 150
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 151
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 152
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 153
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 154
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 155
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 155
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区（VH）
<400> 156
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 157
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区（VL）
<400> 157
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 158
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的重链氨基酸序列
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 159
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列
<400> 159
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 160
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 160
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 161
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 162
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 162
Asn Ser Gly Met His
1 5
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 163
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 164
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 164
Asn Asp Asp Tyr
1
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 165
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 166
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 167
Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 168
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链氨基酸序列
<400> 168
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 169
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列
<400> 169
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 170
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 171
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 172
Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 173
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 173
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 174
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 175
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 176
Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 177
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 178
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链氨基酸序列
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 179
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser
65 70 75 80
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
85 90 95
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
100 105 110
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
115 120 125
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
130 135 140
Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
145 150 155 160
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
165 170 175
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
180 185 190
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
210 215 220
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
225 230 235 240
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
245 250 255
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260 265
<210> 180
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 181
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 181
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 182
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 183
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 184
Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 185
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 185
Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 186
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 187
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 188
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链氨基酸序列
<400> 188
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 189
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列
<400> 189
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 190
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 190
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 191
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 191
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 192
Ser Tyr Ile Met Met
1 5
<210> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 193
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 194
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 194
Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 195
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 195
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 196
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 196
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 197
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210> 198
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链氨基酸序列
<400> 198
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 199
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列
<400> 199
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 200
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 200
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 201
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 201
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 202
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 202
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 203
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 203
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 204
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 205
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 205
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 206
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 207
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 208
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链氨基酸序列
<400> 208
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His
225
<210> 209
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链氨基酸序列
<400> 209
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 210
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 210
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 211
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 211
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 212
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 213
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 213
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
1 5 10
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 214
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 215
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 215
Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 216
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 216
Gly Ala Phe
1
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 217
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 218
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链氨基酸序列
<400> 218
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
210 215 220
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 219
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链氨基酸序列
<400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 220
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 220
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn
35 40 45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50 55 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165
<210> 221
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 221
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85 90 95
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
100 105 110
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
115 120 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 222
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 223
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
<210> 224
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 224
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 225
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 226
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 226
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 227
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 228
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链氨基酸序列
<400> 228
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 229
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列
<400> 229
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 230
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区（VH）氨基酸序列
<400> 230
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 231
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区（VL）氨基酸序列
<400> 231
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 232
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列
<400> 232
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 233
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列
<400> 233
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列
<400> 234
Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 235
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列
<400> 235
Gln Ser Val Ser Arg Tyr
1 5
<210> 236
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列
<400> 236
Gly Ala Ser
1
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列
<400> 237
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5

Claims (95)

1.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，可选地，所述患者或受试者已接受至少一种先前疗法，所述至少一种先前疗法包括CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
2.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
3.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
4.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
5.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
6.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
7.一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使所述肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
8.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
9.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
10.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
11.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
12.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
13.一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使所述肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
14.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
15.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
16.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
17.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
18.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
19.一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体、CTLA-4抑制剂以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使所述肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
20.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体是治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
21.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
22.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
23.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
24.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
25.一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体以及PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，而不进一步施用CTLA-4抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使所述肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
26.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得和/或接受来自受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
27.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物或(iii)冷冻保存的肿瘤消化物，获得来自受试者所切除的肿瘤的第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
28.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
29.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存包含来自步骤(f)的所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
30.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，其中，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
31.一种治疗有需要的患者或受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体和CTLA-4抑制剂，而不进一步施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，其中，所述患者或受试者未使用过免疫检查点抑制剂，所述方法包括如下步骤：
(a)可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，切除受试者或患者的肿瘤，其中，所述肿瘤包含第一TIL群体，所述受试者或患者先前已用CTLA-4抑制剂治疗；
(b)将所述肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使所述肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)对第一细胞培养基中的第一TIL群体进行初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少5倍，第一细胞培养基包含IL-2，可选地，起始第一扩增发生1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速扩增，获得第三TIL群体；其中，自快速扩增开始7至8天之后，第三TIL群体在数目上比第二TIL群体大至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，在开始快速第二扩增后，第二TIL扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有黑色素瘤的受试者或患者施用第三TIL群体的治疗有效部分；以及
(i)向受试者施用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，所述患者或受试者患有肿瘤，所述肿瘤是不可切除的、转移性的、耐药的和/或难以用CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂治疗。
33.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少50倍。
34.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂与治疗有效剂量的第三TIL群体同时施用。
35.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后保持施用所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
36.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后施用。
37.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂不与治疗有效剂量的第三TIL群体同时施用。
38.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后至少一周向所述受试者施用所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
39.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，在施用治疗有效剂量的第三TIL群体之后可选地向所述患者施用所述CTLA-4抑制剂。
40.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中切除和/或获得和/或接受之前，可选地向所述患者施用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
41.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述患者或受试者先前已用CTLA-4抑制剂或其生物类似物和/或PD-1抑制剂或其生物类似物和/或PD-L1抑制剂或其生物类似物治疗。
42.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤先前已用PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂或它们的生物类似物治疗。
43.根据权利要求1至25所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂选自如下：纳武单抗、帕博利珠单抗及它们的生物类似物。
44.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-L1抑制剂选自如下：阿维鲁单抗、阿替利珠单抗、德瓦鲁单抗及它们的生物类似物。
45.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂选自如下：伊匹木单抗、曲美单抗及它们的生物类似物。
46.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，所述第一扩增在约11天的时间段内进行。
47.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，初始扩增在约11天的时间段内进行。
48.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，所述IL-2在第一扩增中的细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
49.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，所述IL-2在初始扩增中的细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
50.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，在第二扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
51.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，在快速扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
52.根据权利要求2至31所述的方法，其中，第一扩增使用透气容器进行。
53.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，初始扩增使用透气容器进行。
54.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，第二扩增使用透气容器进行。
55.根据权利要求2至31所述的方法，其中，快速扩增使用透气容器进行。
56.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，第一细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
57.根据权利要求2至31所述的方法，其中，第一扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
58.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，第二细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
59.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中，第二扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在向所述患者施用TIL之前用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案治疗所述患者的步骤。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
62.根据权利要求60所述的方法，其中，所述非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
63.根据权利要求60至61中任一项所述的方法，其中，环磷酰胺与美司钠一起施用。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在向所述患者施用第三TIL群体之后次日开始用IL-2方案治疗所述患者的步骤。
65.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在向所述患者施用第三TIL群体的同一天开始用IL-2方案治疗所述患者的步骤。
66.根据权利要求64所述的方法，其中，所述IL-2方案在向所述患者完成施用第三TIL群体之后3至24小时施用。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述IL-2方案为包含600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，其以每八小时进行15分钟的推注静脉内输注形式施用直至耐受。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的方法，其中，施用治疗有效的TIL群体，所述治疗有效的TIL群体包含约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
69.根据权利要求2至68中任一项所述的方法，其中，初始扩增在21天以下的时间段内进行。
70.根据权利要求2至68中任一项所述的方法，其中，初始扩增在7天以下的时间段内进行。
71.根据权利要求2至68中任一项所述的方法，其中，快速扩增在7天以下的时间段内进行。
72.根据权利要求2至68中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的第一扩增和步骤(d)中的第二扩增各自单独地在11天的时间段内进行。
73.根据权利要求2至68中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(f)在约10天至约22天内进行。
74.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述受试者经历预先治疗，所述预先治疗包括在切除所述肿瘤之前施用CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂。
75.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，所述伊匹木单抗或其生物类似物以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
76.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，所述伊匹木单抗或其生物类似物以约200mg至约500mg的剂量施用。
77.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，所述伊匹木单抗或其生物类似物每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
78.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，所述曲美单抗或其生物类似物以约1mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或75mg的剂量施用。
79.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，所述曲美单抗或其生物类似物每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
80.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，所述纳武单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
81.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，所述纳武单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。
82.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，所述纳武单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
83.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，所述帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。
84.根据权利要求1至权利要求25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，所述帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。
85.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，所述帕博利珠单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。
86.根据权利要求1至7或14至19或26至31中任一项所述的方法，其中，所述CTLA-4抑制剂在切除肿瘤之前1、2、3、4或5周施用，可选地在切除肿瘤之前1、2或3周施用。
87.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂在IL-2施用之后1、2、3、4或5天施用，Tablend可选地在IL-2施用之后1、2或3天施用。
88.根据权利要求2至87中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物包括在酶培养基中孵育肿瘤样本。
89.根据权利要求2至87中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括以机械方式破坏肿瘤样本以便解离肿瘤样本。
90.根据权利要求2至87中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自受试者的肿瘤样本处理成包含酶培养基的肿瘤消化物进一步包括使用密度梯度分离纯化解离的肿瘤样本。
91.根据权利要求90所述的方法，其中，所述酶培养基包含DNA酶。
92.根据权利要求90所述的方法，其中，所述酶培养基包含30单位/mL的DNA酶。
93.根据权利要求90所述的方法，其中，所述酶培养基包含胶原蛋白酶。
94.根据权利要求90所述的方法，其中，所述酶培养基包含1.0mg/mL胶原蛋白酶。
95.根据前述权利要求中任一项所述的TIL组合物。
CN202180094092.2A 2020-12-17 2021-12-16 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗 Pending CN116829156A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/127,060 2020-12-17
US63/146,425 2021-02-05
US202163277371P 2021-11-09 2021-11-09
US63/277,371 2021-11-09
PCT/US2021/063910 WO2022133140A1 (en) 2020-12-17 2021-12-16 Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116829156A true CN116829156A (zh) 2023-09-29

Family

ID=88114960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180094092.2A Pending CN116829156A (zh) 2020-12-17 2021-12-16 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116829156A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023523855A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用
WO2022165260A9 (en) Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CN112969469A (zh) 抗pd-1抗体难治性nsclc患者的治疗
JP2024510505A (ja) Ｃｄ３９／ｃｄ６９選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張及びｔｉｌにおける遺伝子ノックアウトのための方法
TW202239415A (zh) 腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｃｔｌａ－４及ｐｄ－１抑制劑組合之治療
JP2024519029A (ja) Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
JP2024501845A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス
JP2024500403A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
JP2023524108A (ja) 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
JP2024501452A (ja) Ｂｒａｆ阻害剤及び／またはｍｅｋ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球治療によるがん患者の治療
JP2024527961A (ja) Ｋｒａｓ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法によるがん患者の治療
CN117279506A (zh) 肿瘤储存及细胞培养组合物
KR20240032711A (ko) T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물
CN116829156A (zh) 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗
CN118541159A (zh) 使用pd-1 talen基因敲低生成til产物的方法
CN117940557A (zh) 制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用
CN117480246A (zh) 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物
WO2023049862A1 (en) Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
JP2024526898A (ja) 固形腫瘍断片の凍結保存のための方法
JP2024534581A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球のための拡張プロセス及び薬剤
JP2024535002A (ja) Ｐｄ－１ ｔａｌｅｎノックダウンを使用したｔｉｌ製品を生成するためのプロセス
WO2024098027A1 (en) Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
EP4430167A1 (en) Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
TW202328439A (zh) 使用ｐｄ－１ ｔａｌｅｎ基因減弱生成ｔｉｌ產物之方法
TW202346573A (zh) 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40100826

Country of ref document: HK