KR20240032711A - T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20240032711A
KR20240032711A KR1020237036004A KR20237036004A KR20240032711A KR 20240032711 A KR20240032711 A KR 20240032711A KR 1020237036004 A KR1020237036004 A KR 1020237036004A KR 20237036004 A KR20237036004 A KR 20237036004A KR 20240032711 A KR20240032711 A KR 20240032711A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
til
cells
cell
approx
hours
Prior art date
Application number
KR1020237036004A
Other languages
English (en)
Inventor
미쉘 알. 심프슨-아벨슨
매튜 제이. 프리걸트
웨인 피. 로트바움
마이클 와이저
Original Assignee
이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. filed Critical 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20240032711A publication Critical patent/KR20240032711A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 암 치료법을 포함하는 치료법에 사용하기 위한 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물의 효력 및/또는 기능성을 분석하거나 검정하고, 골수 침윤 림프구(MIL) 및 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물과 같은 다른 다클론 생성물의 효력 및/또는 기능성을 분석하거나 검정하기 위한 신규 공정, 조성물, 및 방법을 제공한다. 또한, TIL, MIL, 및 PBL 생성물을 사용하여 암을 준비 및 치료하기 위한 조성물, 방법 및 키트도 제공된다.

Description

T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물
종양 침윤 림프구(TIL)의 입양 자가 전달을 이용하는, 부피가 큰 불응성 암의 치료는 예후가 좋지 않은 환자를 위한 치료법에 대한 강력한 접근법을 나타낸다. Gattinoni, 등, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. TIL에는 T 세포가 우세하며, IL-2 기반 TIL 확장에 이어 "급속 확장 공정"(REP)은 속도와 효율성으로 인해 TIL 확장에 바람직한 방법이 되었다. Dudley 등, Science 2002, 298, 850-54; Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, 등, Science 1992, 257, 238-41; Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42. 흑색종에서 TIL 치료법에 대한 반응을 개선하고 TIL 치료법을 다른 종양 유형으로 확장하기 위한 다수의 접근법이 연구되었지만 제한적인 성공을 거두어, 이 분야는 여전히 어려운 과제로 남아 있다. Goff, 등, J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97; Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Rosenberg, 등, Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57. 단일 면역 관문 저해제를 사용한 조합 연구도 기술되어 있지만, 추가 연구가 진행 중이며 추가적인 치료 방법을 필요로 한다(Kverneland, 등, Oncotarget, 2020, 11(22), 2092-2105).
더욱이, 현재의 TIL 제조 및 치료 공정은 길이, 비용, 멸균 문제 및 본원에 기술된 기타 요인에 의해 제한되어, 다른 관문 저해제 요법에 불응성인 환자를 치료할 수 있는 잠재성이 심각하게 제한되었다. 이에 TIL 제조 공정에 대한 품질 제어 공정 및 실행 가능한 치료 옵션이 거의 없거나 전혀 남아 있지 않은 환자의 치료에 사용하기에 적절한 이러한 공정에 기초한 치료법을 제공하는 것이 시급히 필요하다. 본 발명은 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위한 메커니즘을 제공하는 추가 단계를 통해 TIL을 발생시키는 데 사용하기 위한 단축된 제조 공정을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은, 예를 들어, 암 치료에 대한 치료 효능이 증가된 TIL의 치료 집단을 제조하기 위해 TIL을 포함하는 T 세포를 제조하고 이의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위한 개선된 공정, 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 효력 검정은 관련 기술분야에 공지된 검정과 비교하여 다른 개선 사항 중에서도 우수한 성능, T 세포 생성물 효력에 대한 더 나은 제어 및 증가된 생물학적 적절성을 제공할 수 있다. 효력 검정을 사용한 제조 공정, 투여 방법 및 약제학적 조성물도 기술된다. 이들 공정 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이 CTLA-4 및 PD-1 저해제와 조합으로, 및/또는 PD-L1 저해제와 조합으로 TIL의 투여와 함께 추가적으로 사용될 수 있다.
본원에는 확장된 TIL 및 다른 다클론 T 세포 생성물, 예를 들어 골수 침윤 림프구(MIL) 및 말초 혈액 림프구(PBL)의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위한 방법이 제공되며, 이는 이후 이 방법에 의해 평가된 TIL, MIL, PBL, 또는 다른 다클론 T 세포 생성물을 투여함으로써 암 치료에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. T 세포 생성 세포와 표적 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법은 다음의 추가 단계를 포함한다:
d. (i) 음성 대조군 세포 또는 (ii) 인간 림프구 항원(HLA) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군 및 표적 세포를 T 세포 생성 세포와 함께 제2 기간 동안 제2 공배양을 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각각의 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물은 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물, 골수 침윤 림프구(MIL) 생성물 또는 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 여기서 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조된다.
일부 실시양태에서, 방법은 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다.
일부 실시양태에서, 음성 대조군 세포에는 MHC 또는 HLA 클래스 I 및 MHC 또는 HLA 클래스 II 발현이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다.
일부 실시양태에서, HLA 차단 항체는 HLA-I 차단 항체, HLA-II 차단 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 5:1 내지 1:5이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 5:1 내지 1:5이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 3:1 내지 1:3이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 3:1 내지 1:3이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 1:2 내지 1:4이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 1:2 내지 1:4이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 1:25 내지 1:35이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 1:25 내지 1:35이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 약 1:2이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 약 1:2이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 약 1:3이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 약 1:3이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 약 1:4이다.
일부 실시양태에서, TIL 생성 세포의 수 대 음성 대조군 세포의 수 사이의 비는 약 1:4이다.
일부 실시양태에서, 공배양은 동결보존된 TIL 생성물, MIL 생성물 또는 PBL 생성물을 해동시키고, 해동된 TIL 생성물, MIL 생성물 또는 PBL 생성물을 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 및 72시간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 기간 동안 인큐베이션 하에 회복되도록 한 후 수행된다.
일부 실시양태에서, 제1 기간은 약 6시간 내지 약 48시간이다.
일부 실시양태에서, 제2 기간은 약 6시간 내지 약 48시간이다.
일부 실시양태에서, 제1 기간은 약 12시간, 약 18시간, 및 약 24시간으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 기간은 약 12시간, 약 18시간 및 약 24시간으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 기간 및 제2 기간은 동일한 기간이다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물 상의 하나 이상의 마커는 CD25, CD69, CD134, CD137, CD150, KLRG1, 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물로부터 분비된 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, TIL 생성물로부터 분비된 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 관찰 값의 양은 하나 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값의 양에 대해 정규화되고, 하나 이상의 분석물 각각에서 대조 값에 대한 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 및 적어도 5배로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, TIL 생성물은 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 인간 환자로부터의 TIL 세포 및 종양의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 기타 수단에 의해 수득되는 종양으로부터 제조된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구(TIL) 집단을 사용하여 치료가 필요한 환자의 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 수득한 종양 샘플을 (i) 다수의 종양 단편 또는 (ii) 종양 분해물로 처리함으로써, 환자로부터 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 수단에 의해 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하고/하거나 수용하는 단계;
(b) 상기 TIL의 제1 집단을 밀폐 시스템에 첨가하는 단계;
(c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 1차 확장을 수행함으로써, TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 1차 확장은 약 3 내지 14일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하고, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충하여 2차 확장을 수행함으로써 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 수득하기 위해 약 7-14일 동안 수행되며, TIL의 제3 집단은 TIL의 치료 집단이고, 2차 확장은 제2 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 단계 (c)에서 단계 (d)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득한 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(f) 다음을 통해 TIL의 치료 집단의 효력을 결정하는 단계:
i. TIL의 치료 집단의 일부와 표적 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
ii. 상기 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계;
iii. 수확물을 (1) TIL의 치료 집단의 일부에서 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) TIL의 치료 집단의 일부로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL의 치료 집단에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계;
iv. 음성 대조군 세포 또는 (i) 음성 대조군 세포 또는 (ii) 인간 백혈구 항원 차단 항체와 TIL의 치료 집단의 제2 부분과의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
v. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
vi. 제2 수확물을 (1) TIL의 치료 집단의 제2 부분 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) TIL의 치료 집단의 제2 부분으로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
vii. 하나 이상의 관찰 값을 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 각각의 관찰 값이 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL의 치료 집단의 효력을 결정하는 단계;
(g) 단계 (e)로부터 TIL의 치료 집단을 주입 백으로 전달하는 단계로서, 여기서 단계 (e)에서 (g)로의 전달은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인 단계;
(h) 선택적으로 단계 (g)로부터 TIL의 치료 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(i) TIL의 치료 집단이 효력이 있는 것으로 결정되면, 단계 (g) 또는 (h)의 주입 백으로부터 TIL의 치료 집단의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 수확된 TIL의 효력 및/또는 기능성을 검사하는 단계는 동결보존 후, 또는 선택적으로 동결보존 단계 전후에 일어난다.
일부 실시양태에서, 환자는 CTLA-4 저해제, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제에 대해 절제 불가능하거나, 전이성이거나, 저항성(resistant) 또는 불응성인 종양을 갖고 있고, 선택적으로 환자는 이전에 CTLA-4 저해제, PD-1 저해제, 또는 PD-L1 저해제로 치료받은 적이 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 수가 적어도 50배 더 많다.
일부 실시양태에서, 1차 확장은 약 10 내지 약 12일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시양태에서, 2차 확장은 약 10 내지 약 12일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시양태에서, 1차 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시양태에서, 2차 확장은 약 11일의 기간에 걸쳐 수행된다.
일부 실시양태에서, IL-2는 1차 확장에서 세포 배양 배지 중 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL 사이의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 단계에서, IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL 사이의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 TIL을 투여하기 전에 비-골수파괴성 림프구고갈 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴성 림프구고갈 요법은 사이클로포스파미드를 60 mg/m2/일의 용량으로 2일 동안 투여한 후, 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 5일 동안 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴성 림프구고갈 요법은 사이클로포스파미드을 60 mg/m2/일의 용량으로, 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 2일 동안 투여한 후, 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 3일 동안 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 TIL의 치료 집단을 투여한 후 다음 날부터 시작하는 IL-2 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 TIL의 치료 집단을 투여한 날과 동일한 날에 시작하는 IL-2 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2 요법은 환자에게 TIL의 치료 집단을 투여 완료한 후 약 3 내지 약 24시간 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, IL-2 요법은 내성(tolerance)이 생길 때까지 매 8시간마다 15분 볼러스 정맥 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨 또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 요법이다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 것은 종양 샘플을 효소 배지에서 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 단계는 종양 샘플을 기계적으로 파괴하여 종양 샘플을 해리시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 것은 밀도 구배 분리를 사용하여 해리된 종양 샘플을 정제하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 배지는 DNase를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 배지는 약 30 단위/mL의 DNase를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 배지는 콜라게나제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 배지는 약 1.0 mg/mL의 콜라게나제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 난소암, 췌장암, 자궁내막암, 갑상선암, 자궁경부암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 방광암, 유방암, 두경부암, 교모세포종, 위장암, 신장암, 육종, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 CTLA-4 저해제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 하기 단계를 포함하며:
a. 상이한 표적 세포 농도에서 T 세포 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3회의 공배양을 수행하는 단계;
b. 상이한 표적 세포 농도에서 T 세포 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3회의 공배양을 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 T 세포 생성 세포 및 T 세포 기준 표준 세포로부터 분비된 사이토카인에 대해 평가하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계;
여기서, 표적 세포는 단핵구 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물은 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물, 골수 침윤 림프구(MIL) 생성물, 또는 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물이다.
일부 실시양태에서, 단핵구 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 여기서 사이토카인은 인터페론-γ이다.
일부 실시양태에서, 공배양은 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 및 약 48시간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 시간 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성물은 TIL 생성물이고, 웰당 약 4×105, 약 2×105, 약 1×105 및 약 0.5×105 표적 세포의 4가지 표적 세포 용량 농도 및 웰당 약 1.5×106 TIL의 단일 TIL 세포 농도가 사용된다.
일부 실시양태에서, T 세포 생성 세포와 함께 표적 세포의 적어도 4가지 공배양 및 T 세포 기준 표준 세포와 함께 표적 세포의 적어도 4가지 공배양이 사용되고, 평행선 분석이 수행되고, 하나의 이상치 표적 세포 용량 농도는 폐기된다.
일부 실시양태에서, 방법은 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
일부 실시양태에서, 효력 검정 매트릭스는 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 검정 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, 및 KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검정을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 종양 분해물 또는 종양 단편을 밀폐 시스템에 첨가하는 단계로서, 종양 분해물 또는 종양 단편이 TIL의 제1 집단을 포함하고 대상체로부터 절제된 종양으로부터 수득되는 것인 단계;
(b) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 1차 확장을 수행함으로써 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 1차 확장은 제1 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 수득하기 위해 약 3-11일 동안 수행되며, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(c) IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 추가적인 세포 배양 배지를 보충하여 2차 확장을 수행함으로써 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 수득하기 위해 약 7-11일 동안 수행되고, 2차 확장은 제2 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (c)에서 단계 (d)로의 전환은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수확된 TIL의 제3 집단을 주입 백으로 전달하는 단계로서, 단계 (d)에서 (e)로의 전달은 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
(f) 단계 (e)로부터의 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(g) 단계 (f)에서의 주입 백으로부터의 TIL의 제3 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서, APC는 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 흑색종(전이성 흑색종 및 포도막 흑색종 포함), 난소암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암, 방광암, 유방암, 인유두종 바이러스로 인한 암, 두경부암(두경부 편평세포암종(HNSCC) 포함), 식도암, 식도위접합부암, 위암, 위장관암, 신장암 및 신장세포암종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)에서의 1차 확장 및 단계 (b)에서의 2차 확장은 11일의 기간 내에 각각 개별적으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (d)가 약 10일 내지 약 22일 내에 수행된다.
일부 실시양태에서, TIL의 효력은 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정되었다.
일부 실시양태에서, TIL의 효력은 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정되었다.
도 1: 단계 A 내지 F의 개요를 제공하는 예시적인 Gen 2(공정 2A) 차트.
도 2a-2c: TIL 제조를 위한 Gen 2(공정 2A) 실시양태의 공정 흐름도.
도 3: 동결보존된 TIL 예시적인 제조 공정(~22일)의 실시양태의 다이어그램을 보여준다.
도 4: TIL 제조를 위한 22일 공정인 Gen 2(공정 2A)의 실시양태의 다이어그램을 보여준다.
도 5: TIL 제조를 위한 공정 1C 및 Gen 2(공정 2A)의 예시적인 실시양태로부터의 단계 A 내지 F의 비교 표.
도 6: TIL 제조를 위한 공정 1C의 실시양태 및 Gen 2(공정 2A)의 실시양태의 상세한 비교.
도 7: 예시적인 Gen 3 유형 TIL 제조 공정.
도 8a-8d: a) 2A 공정(대략 22일 공정)과 TIL 제조를 위한 Gen 3 공정(대략 14일 내지 16일 공정)의 실시양태 간의 비교를 보여준다. b) 단계 A 내지 F(대략 14일 내지 16일 공정)의 개요를 제공하는 예시적 공정 Gen 3 차트. c) 3 가지 공정 변동 각각에 대한 단계 A 내지 F(대략 14일 내지 16일 공정)의 개요를 갖는 3가지 예시적인 Gen 3 공정을 제공하는 차트. d) 단계 A부터 F까지의 개요를 제공하는 예시적인 수정된 Gen 2 유사 공정(대략 22일 공정).
도 9: Gen 2(공정 2A) 대 Gen 3 공정 간의 비교가능성에 대한 실험적 흐름도를 제공한다.
도 10: 다양한 Gen 2(공정 2A)와 Gen 3.1 공정 실시양태 간의 비교를 보여준다.
도 11: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3.0 공정의 실시양태의 다양한 특징을 기술하는 표.
도 12: Gen 3.1로 지칭되는 Gen 3 공정의 실시양태에 대한 배지 조건의 개요.
도 13: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3.0 공정의 실시양태에 대한 다양한 특징을 기술하는 표.
도 14: Gen 2 및 Gen 3.0 공정의 실시양태에 대한 다양한 특징을 비교하는 표.
도 15: 기술된 확장 공정의 다양한 실시양태에서 배지 사용을 제공하는 표.
도 16: Gen 3 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 17: Gen 3 확장 플랫폼을 사용하여 조혈 악성종양으로부터의 T 세포를 확장하는 방법의 예시적 실시양태의 개략도.
도 18: 구조 I-A 및 I-B를 제공한다. 원통은 개별 폴리펩타이드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어 4-1BBL 또는 4-1BB에 결합하는 항체로부터 유래된 3개의 선형 연결된 TNFRSF 결합 도메인을 포함하며, 이는 접혀서 3가 단백질을 형성하고, 이는 그 다음 IgG1-Fc(CH3 및 CH2 도메인을 포함함)를 통해 제2의 3가 단백질에 연결되고, 그 다음 이황화 결합(작은 길쭉한 난형)을 통해 2개의 3가 단백질을 함께 연결하는 데 사용되어, 구조를 안정화시키고 6개 수용체의 세포내 신호전달 도메인과 신호전달 단백질을 함께 가져와서 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 작용제(agonist)를 제공한다. 원통으로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어 가용성을 위한 Glu 및 Lys 뿐만 아니라 유연성을 위한 Gly 및 Ser 서열 및 친수성 잔기를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다.
도 19: Gen 3 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 20: Gen 3.1 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태에 대한 공정 개요를 제공한다.
도 21: Gen 3.1 테스트 공정(16-17일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 22: Gen 3 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 23: 예시적인 Gen 2 공정 및 예시적인 Gen 3 공정에 대한 비교 표.
도 24: Gen 3 공정(16-17일 공정) 준비 타임라인의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 25: Gen 3 공정(14-16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 26a-26b: Gen 3 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 27: Gen 3 공정(16일 공정)의 예시적인 실시양태의 개략도.
도 28: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3 공정(16일 공정)의 실시양태의 비교.
도 29: Gen 2, Gen 2.1 및 Gen 3 공정(16일 공정)의 실시양태의 비교.
도 30: Gen 3 실시양태 구성요소.
도 31: Gen 3 실시양태 흐름도 비교(Gen 3.0, Gen 3.1 대조군, Gen 3.1 테스트).
도 32: Gen 3 공정(16-17일 공정)의 예시적 실시양태의 구성요소가 도시된다.
도 33: 허용 기준 표.
도 34: TIL-K562 음성 대조군, 및 MLR(환자-일치 PBMC) 및 비드 기반 양성 대조군을 사용한 TIL-Raji 공배양 검정의 실시양태의 다이어그램.
도 35: TIL-Raji 공배양 검정을 사용하여 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에 대해 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에서 유세포분석에 의해 관찰된 CD25 수준(CD3의 %).
도 36: TIL-Raji 공배양 검정을 사용하여 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에 대해 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에서 유세포분석에 의해 관찰된 CD69 수준(CD3의 %).
도 37: TIL-Raji 공배양 검정을 사용하여 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에 대해 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에서 유세포분석에 의해 관찰된 CD137(4-1BB) 수준(CD3의 %).
도 38: TIL-Raji 공배양 검정을 사용하여 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에 대해 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에서 유세포분석에 의해 관찰된 CD134(OX40) 수준(CD3의 %).
도 39: TIL-Raji 공배양 검정을 사용한 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에서의 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에 대한 IFN-γ 분비.
도 40: TIL-Raji 공배양 검정을 사용한 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에서의 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에 대한 CCL4 분비.
도 41: TIL-Raji 공배양 검정을 사용한 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1152)에서의 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에 대한 상이한 공배양 기간 및 TIL:표적 비에 대한 그랜자임 B 분비.
도 42: TIL-K562 음성 대조군을 사용한 TIL-Raji 공배양 검정의 실시양태의 다이어그램.
도 43: TIL-Raji 세포 기반 효력 검정의 예시적 실시양태를 위한 공배양 실험 구성.
도 44: TIL-Raji 공배양 검정에서 활성화 마커의 표현형 발현.
도 45: TIL-Raji 공배양에서 CD69(Gen 2 TIL: 301-001)의 표현형 발현.
도 46: IFN-γ 분비 수준, pg/mL.
도 47: 그랜자임 B 분비 수준, pg/mL.
도 48: IFN-γ 및 그랜자임 B 분비 수준.
도 49: IFN-γ 방출의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL 단독.
도 50: 그랜자임의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL 단독.
도 51: 사이토카인 방출의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL 단독.
도 52: IFN-γ 방출의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL + K562.
도 53: 그랜자임 B 방출의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL + K562.
도 54: 사이토카인 방출의 배수 변화: TIL + 세포주/TIL + K562.
도 55: IFN-γ 및 그랜자임 B 분비 요약 표.
도 56: MHC 우성 인식에 의한 TIL 활성화를 보여주는 TIL-Raji 세포 기반 효력 검정의 실시양태의 개략도.
도 57: TIL-Raji 세포 기반 효력 검정의 예시적 실시양태를 위한 공배양 실험 플레이트 구성.
도 58: 선택적인 TIL-K562 음성 대조군을 사용한 TIL-Raji 공배양 검정의 실시양태의 다이어그램.
도 59: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 IFN-γ 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 60: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트의 IFN-γ 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 61: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트의 IFN-γ 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 62: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL 단독으로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 63: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL 단독으로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 64: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL 단독으로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 65: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL + K562 세포로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 66: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL + K562 세포로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 67: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에서 흑색종 TIL 로트에 대한 TIL + K562 세포로부터의 IFN-γ 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 68: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL 단독 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화, 여기서 *는 ≤0.05의 p-값을 나타내고; **는 ≤0.01의 p-값을 나타내며; ***는 ≤0.001 이하의 p-값을 나타낸다.
도 69: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL 단독 또는 K562 세포 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화, 여기서 *는 ≤0.05의 p-값을 나타내고; **는 ≤0.01의 p-값을 나타내며; ***는 이 ≤0.001 이하의 p-값을 나타낸다.
도 70: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는, 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL + K562 세포 대비 또는 TIL 대비 TIL + Raji 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화, 여기서 *는 ≤0.05의 p-값을 나타내고; NS는 전체 규모에서 유의미하지 않음을 나타낸다.
도 71: 낮은 배수 변화 수준을 상세히 보여주기 위해 확장된, 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는, 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL + K562 세포 대비 또는 TIL 대비 TIL + Raji 세포에 대한 IFN-γ 방출의 배수 변화.
도 72: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 그랜자임 B 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 73: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 그랜자임 B 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 74: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 그랜자임 B 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 75: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 76: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 77: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 78: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 79: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 80: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 81: 12시간 및 18시간의 인큐베이션 시간에서 pg/mL/TIL 단위의 TIL에 대한 그랜자임 B 방출.
도 82: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL 단독 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출, 여기서 ***는 ≤0.001의 p-값을 나타내고 ****는 ≤0.0001의 p-값을 나타낸다.
도 83: 1:3 TIL:Raji 세포 또는 TIL:K562 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 K562 세포 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 그랜자임 B 방출, 여기서 ****는 ≤0.0001의 p-값을 나타낸다.
도 84: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서의 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 12시간 및 18시간째 TIL + K562 세포 대비 또는 TIL 대비 TIL + Raji 세포에 대한 그랜자임 B 방출의 배수 변화, 여기서 **는 ≤0.01의 p-값을 나타내고 NS는 유의미하지 않음을 나타낸다.
도 85: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 TNF-α 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 86: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 TNF-α 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 87: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트의 TNF-α 분비(pg/mL). pg/mL 단위의 분비 수준은 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 88: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 89: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 90: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL 단독으로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 91: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 92: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 93: 3:1, 1:1 및 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 비에 대한 흑색종 TIL 로트에서 TIL + K562 세포로부터의 그랜자임 B 방출 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화. 배수 변화는 y축에 표시되고 TIL:표적 비는 x축에 표시된다.
도 94: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 18시간째 TIL 단독 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화, 여기서 ****는 ≤0.0001의 p-값을 나타낸다.
도 95: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 18시간째 K562 세포 대비 TIL + Raji 또는 K562 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화, 여기서 ****는 ≤0.0001의 p-값을 나타낸다.
도 96: 1:3 TIL:Raji 또는 TIL:K562 세포 비에서 누적 데이터 세트를 보여주는 인큐베이션 시간 18시간째 TIL 단독 대비 또는 TIL + K562 세포 대비 TIL + Raji 세포에 대한 TNF-α 방출의 배수 변화, 여기서 ****는 ≤0.0001의 p-값을 나타낸다.
도 97: Raji 세포 공배양 검정의 실시양태를 사용하여 테스트된 22개 샘플에 대한 그랜자임 B 및 IFN-γ 결과에 대한 요약 표.
도 98: 선택적인 TIL-K562 음성 대조군을 사용한 TIL-Raji 공배양 검정의 실시양태에 대한 다이어그램.
도 99: TIL 로트 M1173에 대한 검정 결과.
도 100: TIL 로트 M1152에 대한 검정 결과.
도 101: TIL 로트 M1187에 대한 검정 결과.
도 102: TIL 로트 M1179에 대한 검정 결과.
도 103: TIL 로트 M1183에 대한 검정 결과.
도 104: 상이한 해동 후 회복 시간에서 TIL 단독 대비 TIL + K562 또는 Raji 세포에 대한 배수 변화를 보여주는 IFN-γ에 대한 사이토카인 분비 결과.
도 105: 상이한 해동 후 회복 시간에서 TIL + K562 대비 TIL + K562 또는 Raji 세포에 대한 배수 변화를 보여주는 IFN-γ에 대한 사이토카인 분비 결과.
도 106: 상이한 해동 후 회복 시간에서 TIL 단독 대비 TIL + K562 또는 Raji 세포에 대한 배수 변화를 보여주는 그랜자임 B에 대한 사이토카인 분비 결과.
도 107: 상이한 해동 후 회복 시간에서 TIL + K562 대비 TIL + K562 또는 Raji 세포에 대한 배수 변화를 보여주는 그랜자임 B에 대한 사이토카인 분비 결과.
도 108: 동종이계 인식 검정의 실시양태.
도 109: 동종이계 인식 검정 검출 방법의 실시양태.
도 110: 해동 후 조건 1에 대한 결과(해동 후 18 내지 24시간 동안 밤새 휴식). 테스트된 이펙터:표적(E:T) 비는 35:1 내지 2.5:1 범위였으며, 테스트된 공배양 기간은 4시간, 8시간, 16시간 및 36시간이었다.
도 111: 해동 후 조건 2(해동 후 휴식 없음)에 대한 결과. 테스트된 이펙터:표적(E:T) 비는 10:1 내지 1:10 범위였으며 공배양 기간은 밤새(16 내지 24시간)였다. 난소암 종양(OV8178) 및 흑색종 종양(M1203)으로부터 생성된 TIL이 테스트되었다.
도 112: TIL-Raji 세포 기반 효력 검정의 예시적 실시양태.
도 113: 휴식 시간 대비 총 생존 세포(TVC, 상단 플롯) 및 생존력 %(하단 플롯).
도 114: pg/mL 단위의 IFN-γ 분비를 보여주는, 300 IU/mL IL-2의 유무 하에 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
도 115: 배수 변화 단위의 IFN-γ 분비를 보여주는, 300 IU/mL IL-2의 유무 하에 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
도 116: pg/mL 단위의 IFN-γ 분비를 보여주는, 서로 다른 공배양 조건 하에서 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
도 117: 배수 변화 단위의 IFN-γ 분비를 보여주는, 상이한 공배양 조건 하에서 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
도 118: TIL 해동 후 회복 기간이 연장됨에 따라 사이토카인 분비 효과를 평가하기 위한 상이한 공배양 조건 하에서 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과로서, pg/mL 단위의 IFN-γ 분비를 보여준다.
도 119: TIL 해동 후 회복 기간이 연장됨에 따라 사이토카인 분비 효과를 평가하기 위한, 본 발명의 실시양태인, 상이한 공배양 조건 하에서 2가지 TIL 세포주를 사용한 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과로서, 배수 변화 단위의 IFN-γ 분비를 보여준다.
도 120: 72시간 휴식 기간에서 공배양 조건의 2가지 실시양태 중 TIL 세포주 M1179에 대한 부모 생존 집단의 잔류 세포 집단에 대한 유세포 분석.
도 121: Raji 세포주의 증식 프로파일.
도 122: K562 세포주의 증식 프로파일.
도 123: 본 발명의 실시양태이기도 한, TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 124: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비(pg/mL, 절대값).
도 125: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비([TIL + 표적]/[TIL 단독]의 배수 변화).
도 126: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비([TIL + 표적]/[TIL + K562]의 배수 변화).
도 127: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 TNF-α 분비(pg/mL, 절대값).
도 128: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 TNF-α 분비([TIL + 표적]/[TIL 단독]의 배수 변화).
도 129: 본 발명의 실시양태인, 3가지 TIL 대 표적 세포의 비(3:1, 1:1, 및 1:3)에서 테스트된 표적(Raji, Ramos, Thp1 및 U937) 세포주 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 TNF-α 분비([TIL + 표적]/[TIL + K562]의 배수 변화).
도 130: 본 발명의 실시양태이기도 한, TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 131: 본 발명의 실시양태인, 테스트된 표적 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비(pg/mL).
도 132: 본 발명의 실시양태인, 테스트된 표적 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비([TIL + 표적]/[TIL 단독]의 배수 변화).
도 133: 본 발명의 실시양태인, 테스트된 표적 및 음성 대조군(K562) 세포주에 대한 IFN-γ 분비([TIL + 표적]/[TIL + K562]의 배수 변화).
도 134: TIL 단독 대비 TIL + 표적 세포주(또는 조합)의 배수 변화(왼쪽 패널) 및 TIL + K562 대비 TIL + 표적 세포주(또는 조합)의 배수 변화(오른쪽 패널)의 평균 및 범위.
도 135: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주, 예를 들어 조합 표적 세포주에 대한 TNF-α 분비(pg/mL).
도 136: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 TNF-α 분비([TIL + 종양 세포주 또는 조합]/[TIL 단독]의 배수 변화).
도 137: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 TNF-α 분비([TIL + 종양 세포주 또는 조합]/[TIL + K562]의 배수 변화).
도 138: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 그랜자임 B 분비(pg/mL).
도 139: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 그랜자임 B 분비([TIL + 종양 세포주 또는 조합]/[TIL 단독]의 배수 변화).
도 140: 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 그랜자임 B 분비([TIL + 종양 세포주 또는 조합]/[TIL + K562]의 배수 변화).
도 141: 본 발명의 실시양태이기도 한, TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 142: 연구용 NSCLC TIL 세포주 L4253, L4254, L4262 및 L4270에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비(pg/mL). 검은색 점선: 3:1 TIL 단독. 회색 점선: 1:1 TIL 단독.
도 143: 연구용 NSCLC TIL 세포주 L4253, L4254, L4262 및 L4270에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 NSCLC 세포주의 IFN-γ 분비 배수(TIL + 종양 세포주/TIL 단독).
도 144: 연구용 NSCLC TIL 세포주 L4253, L4254, L4262 및 L4270에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 NSCLC 세포주의 IFN-γ 분비 배수(TIL + 종양 세포주/[TIL + K562]).
도 145: 임상용 NSCLC TIL 세포주 1013-304, 1036-307, 1057-304, 1004-303, 1057-302, 및 1088-303에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비(pg/mL). 검은색 점선: TIL 단독. 데이터는 1:1 TIL:표적 비에서 수득되었다.
도 146: 임상 NSCLC TIL 세포주 1013-304, 1036-307, 1057-304, 1004-303, 1057-302, 및 1088-303에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비 배수(TIL + 종양 세포주/TIL 단독). 검은색 점선: TIL 단독. 데이터는 1:1 TIL:표적 비에서 수득되었다.
도 147: 임상 NSCLC TIL 세포주 1013-304, 1036-307, 1057-304, 1004-303, 1057-302, 및 1088-303에 대한, 조합 표적 세포주를 포함하는 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비 배수(TIL + 종양 세포주/[TIL + K562]). 검은색 점선: TIL 단독. 데이터는 1:1 TIL:표적 비에서 수득되었다.
도 148: 임상 NSCLC TIL 세포주 1013-304, 1036-307, 1057-304, 1004-303, 1057-302, 및 1088-303에 대한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비의 배수 변화 요약(TIL + 종양 세포주/TIL 단독). 채워진 빨간색 기호는 임상적 부분 반응을 나타내는 반면, 나머지 기호는 임상적 안정 질병 반응을 나타낸다.
도 149: 임상 NSCLC TIL 세포주 1013-304, 1036-307, 1057-304, 1004-303, 1057-302, 및 1088-303에 대한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비의 배수 변화 요약(TIL + 종양 세포주/[TIL + K562]). 채워진 빨간색 기호는 임상적 부분 반응을 나타내고 나머지 기호는 임상적 안정 질병 반응을 나타낸다.
도 150: 19개 연구용 및 임상용 흑색종 및 NSCLC TIL 세포주에 대한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비의 배수 변화 요약(TIL + 종양 세포주/TIL 단독). 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 151: 19개 연구 및 임상 흑색종 및 NSCLC TIL 세포주에 대한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주의 IFN-γ 분비의 배수 변화 요약(TIL + 종양 세포주/[TIL + K562]). 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 152: 24시간의 공배양 동안 Raji 및 K562 세포의 증식(총 생존 세포, TVC)에 미치는 방사선조사의 영향.
도 153: 2개의 자궁경부암 TIL 로트에 대해 방사선 조사되지 않은 Raji 세포 및 방사선 조사된 Raji 세포와 공배양 시의 분비된 IFN-γ의 농도.
도 154: 방사선 조사("Irr.") 및 방사선 조사 없이("비-irr."), 3개의 마커에 대해 유세포 분석에 의해 결정된 K562 및 Raji 세포의 표면 마커 발현.
도 155: 3개의 흑색종, 2개의 자궁경부 및 1개의 NSCLC TIL 세포주에 대해 TIL 단독 대비 IFN-γ 배수 변화(3반복 샘플) 대 검정 공배양 기간(시간).
도 156: 본 발명의 실시양태이기도 한 TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 157: 12개 흑색종 TIL 세포주에 대한 1.0 x 106 TVC/웰에서 TIL 단독 대비 종양 세포주 + TIL의 IFN-γ에 대한 평균 배수 변화. 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 158: 12개 흑색종 TIL 세포주에 대한 2.0 x 106 TVC/웰에서 TIL 단독 대비 종양 세포주 + TIL의 IFN-γ에 대한 평균 배수 변화. 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 159: 12개 흑색종 TIL 세포주에 대한 1.0 x 106 TVC/웰에서 K562 음성 대조군 세포 대비 종양 세포주 + TIL의 IFN-γ에 대한 평균 배수 변화. 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 160: 12개 흑색종 TIL 세포주에 대한 2.0 x 106 TVC/웰에서 K562 음성 대조군 세포 대비 종양 세포주 + TIL의 IFN-γ에 대한 평균 배수 변화. 박스는 선으로 표시되는 평균의 어느 한쪽에 있는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 161: 본 발명의 실시양태이기도 한, 야생형(WT) 및 유전자 변형된 것인, 2종의 Thp1(THP-1) 단핵구 세포주에 대한 TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 162: WT 및 유전자 변형된 Thp1 표적 세포에 대해 수득된 IFN-γ 값(pg/mL)의 비교.
도 163: WT 및 유전자 변형된 Thp1 표적 세포에 대해 수득되는, TIL 단독 값 대비 IFN-γ 배수 변화의 비교.
도 164: 특정 실시양태에서 본 발명의 검정에 대한 음성 대조군인 HLA 차단을 예시하는 다이어그램.
도 165: 각 단핵구 세포주에 대한 생존력(%)으로 측정된, 상이한 항체 농도에서 Thp1(THP-1) 및 U937 단핵구 세포주에 대한 HLA-I 차단 효과.
도 166: 각 단핵구 세포주에 대한 생존력(%)으로 측정된, 상이한 항체 농도에서 Thp1(THP-1) 및 U937 단핵구 세포주에 대한 HLA-II 차단 효과.
도 167: Raji 세포 및 유전자 변형된 Raji 세포(B2M KO)에 대한 생존력(%)으로 측정된, 상이한 항체 농도에서 Raji 세포에 대한 HLA-II 차단 효과.
도 168: TIL 세포주 M1213에 대한 HLA-I(aMHC I) 및 HLA-II(aMHC II) 항체 차단 효과.
도 169: TIL 세포주 M1214에 대한 HLA-I(aMHC I) 및 HLA-II(aMHC II) 항체 차단 효과.
도 170: TIL 세포주 PD-LIM-20-08에 대한 HLA-I(aMHC I) 및 HLA-II(aMHC II) 항체 차단 효과.
도 171: HLA(MHC) 클래스 I 및 II 항체 용량 적정의 결과. HLA 차단 음성 대조 방법의 실시양태 I은 20 μg/mL의 HLA-I 차단 항체와 10 μg/mL의 HLA-II 차단 항체를 사용하여 수행했다. HLA 차단 음성 대조 방법의 실시양태 II는 10 μg/mL의 HLA-I 차단 항체 및 5 μg/mL의 HLA-II 차단 항체를 사용하여 수행했다.
도 172: 각각 3반복으로 수행된, 항-HLA-I 항체(αMHC I로 표시됨) 및 항-HLA-II 항체(αMHC II로 표시됨)의 첨가 시에 10가지 TIL 세포주로부터의 배경 IFN-γ 분비의 결과. 실시양태 I 및 실시양태 II는 각각 도 173 및 도 184에 제시되고, 본원의 다른 곳에서, 실시양태 I에 대해 20 μg/mL HLA-I 차단 항체 및 10 μg/mL HLA-II 차단 항체, 및 실시양태 II에 대해 10 μg/mL HLA-I 차단 항체 및 5 μg/mL HLA-II 차단 항체의 사용을 포함하는 것으로 기술된 실험적 실시양태를 지칭한다.
도 173: 적용가능한 경우 본원에서 "실시양태 I"이라고 총칭되고 본 발명의 실시양태이기도 한, 음성 대조군 세포주 대신에 음성 대조군으로서 HLA 차단 항체를 사용하는 TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램.
도 174: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1152에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다.
도 175: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1187에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다.
도 176: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1164에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다.
도 177: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1213에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다.
도 178: 표적 세포 및 대조군로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1214에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다.
도 179: 표적 세포 및 대조군로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1152에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다.
도 180: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1187에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다.
도 181: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1164에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다.
도 182: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1213에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다.
도 183: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1214에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다.
도 184: 음성 대조군 세포주 대신에 음성 대조군으로서 HLA 차단 항체를 사용하는 TIL:종양 세포주 공배양 검정에 대한 실험 계획의 다이어그램으로서, 이는 적용 가능한 경우 본원에서 "실시양태 II"로서 총칭되고, 본 발명의 실시양태이기도 하다.
도 185: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1161에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다. M1161에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 1.4% 및 97.6%인 것으로서 결정되었다.
도 186: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1163에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다. M1163에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 60.6% 및 34.9%인 것으로서 결정되었다.
도 187: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1172에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다. M1172에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 71.8% 및 22.2%인 것으로서 결정되었다.
도 188: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1173에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다. M1173에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 13.4% 및 81.6%인 것으로서 결정되었다.
도 189: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1174에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, IFN-γ의 pg/mL로서 보고된다. M1174에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 92.3% 및 6.2%인 것으로서 결정되었다.
도 190: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1161에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다. M1161에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 1.4% 및 97.6%인 것으로서 결정되었다.
도 191: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1163에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다. M1163에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 60.6% 및 34.9%인 것으로서 결정되었다.
도 192: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1172에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다. M1172에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 71.8% 및 22.2%인 것으로서 결정되었다.
도 193: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1173에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다. M1173에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 13.4% 및 81.6%인 것으로서 결정되었다.
도 194: 표적 세포 및 대조군으로서 K562 세포와 공배양된 흑색종 TIL 세포주 M1174에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과로서, TIL 단독 대비 IFN-γ 방출의 배수 향상으로서 보고된다. M1174에 대한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 유세포 분석에 의해 각각 92.3% 및 6.2%인 것으로서 결정되었다.
도 195: 음성 대조군 세포주 대신에 또는 TIL 단독 대조군 실험에 추가하여 음성 대조군으로서 HLA 차단 항체를 사용하는 TIL:종양 세포주 공배양 검정을 위한 실험 계획의 다이어그램으로서, 이들 모두 본 발명의 실시양태이기도 하다. 15가지 흑색종 세포주가 사용된다.
도 196: U937 표적 세포와 공배양된 15가지 흑색종 TIL 세포주에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과.
도 197: Thp1(THP-1) 표적 세포와 공배양된 15가지 흑색종 TIL 세포주에 대한 HLA 차단 음성 대조군 실험의 결과.
도 198: Thp1 세포에 대한 유효 TIL 농도의 결정. 별표는 2×106 TVC에서 3:1 TIL:Thp1 비를 나타낸다.
도 199: U937 세포에 대한 유효 TIL 농도의 결정. 별표는 2×106 TVC에서 3:1 TIL:U937 비를 나타낸다.
도 200: Thp1 및 U937 표적 세포를 사용한 3가지 TIL 로트(M1164, M1163 및 M1169)에 대한 용량-반응 곡선.
도 201: Thp1 및 U937 표적 세포를 사용한 3가지 추가 TIL 로트(M1218, M1174 및 M1150A)에 대한 용량-반응 곡선.
도 202: U937 표적 세포를 사용한 6가지 TIL 로트에 대한 평행선 분석. 6개 TIL 모두 명확한 용량 반응을 입증한다.
도 203: Thp1 표적 세포를 사용한 6가지 TIL 로트에 대한 평행선 분석. TIL M1173 및 TIL M1213은 명확한 용량 반응을 입증한다.
도 204: U937 표적 세포를 사용하여 HLA 차단 항체의 유무 하에 1.5x106 TIL 농도에서 3가지 TIL 로트(M1145, M1161 및 M1173)에 대한 용량-반응 곡선. 3가지 TIL 로트 모두 명확한 용량 반응을 입증하며 항체 처리에 의한 신호의 완전한 저해(특이적 저해)를 보여주기도 한다.
도 205: U937 표적 세포를 사용하여 HLA 차단 항체의 유무 하에 1.5x106 TIL 농도에서 3가지 TIL 로트(M1197, M1213 및 M1214)에 대한 용량-반응 곡선. 3가지 TIL 로트 모두 명확한 용량 반응을 입증하며 항체 처리에 의한 신호의 완전한 저해(특이적 저해)를 보여주기도 한다.
도 206: 흑색종 TIL 임상 샘플에 대한 유세포 분석에 의한 LAG3 발현의 히스토그램.
도 207: 흑색종 TIL 임상 샘플에 대한 유세포 분석에 의한 KLRG1 발현의 히스토그램.
도 208: U937 동종반응성 공배양 검정을 사용한 28가지 과거 임상 로트의 상대 효력의 히스토그램의 로그 분포 평가. 각 TIL 로트에 대해 계산된 상대 효력 측정값은 로그 변환되었으며 결과적인 분포는 정규 분포를 나타내며, 이는 기본 분포가 로그 정규 분포임을 나타낸다.
도 209: REP 동안 U937 세포 또는 동종이계 PBMC와 함께 인큐베이션된 TIL의 확장.
도 210: U937 세포 또는 동종이계 PBMC를 이용한 REP 후 항-CD3 및 항-CD28 비드에 의해 자극된 TIL에서의 IFN-γ 분비.
도 211: 본 발명의 동종반응성 공배양 검정("동종-pMHC-TCR 상호작용 유도된 T 세포"로 표시)의 실시양태와 T 세포 효력 테스트를 위한 전통적인 항체 비드 기반 검정의 비교.
서열목록에 대한 간략한 설명
서열번호 1은 무로모나브(muromonab) 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 무로모나브 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 재조합 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 알데스류킨(aldesleukin)의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 IL-2 형태이다.
서열번호 6은 IL-2 형태이다.
서열번호 7은 IL-2 형태이다.
서열번호 8은 뮤신 도메인 폴리펩타이드이다.
서열번호 9는 재조합 인간 IL-4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 재조합 인간 IL-7 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 재조합 인간 IL-15 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 재조합 인간 IL-21 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 IL-2 서열이다.
서열번호 14는 IL-2 뮤테인 서열이다.
서열번호 15는 IL-2 뮤테인 서열이다.
서열번호 16은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR1_IL-2이다.
서열번호 17은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR2이다.
서열번호 18은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR3이다.
서열번호 19는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR1_IL-2 카바트(kabat)이다.
서열번호 20은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR2 카바트이다.
서열번호 21은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR3 카바트이다.
서열번호 22는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR1_IL-2 클로티아(clothia)이다.
서열번호 23은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR2 클로티아이다.
서열번호 24는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR3 클로티아이다.
서열번호 25는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR1_IL-2 IMGT이다.
서열번호 26은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR2 IMGT이다.
서열번호 27은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 HCDR3 IMGT이다.
서열번호 28은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 VH 사슬이다.
서열번호 29는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 중쇄이다.
서열번호 30은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR1 카바트이다.
서열번호 31은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR2 카바트이다.
서열번호 32는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR3 카바트이다.
서열번호 33은 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR1 초티아(chothia)이다.
서열번호 34는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR2 초티아이다.
서열번호 35는 IgG.IL2R67A.H1에 대한 LCDR3 초티아이다.
서열번호 36은 VL 사슬이다.
서열번호 37은 경쇄이다.
서열번호 38은 경쇄이다.
서열번호 39는 경쇄이다.
서열번호 40은 인간 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호 41은 뮤린 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열번호 42는 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(utomilumab)(PF-05082566)에 대한 중쇄이다.
서열번호 43은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 경쇄이다.
서열번호 44는 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 45는 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 46은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 47은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 48은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 49는 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 50은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 51은 4-1BB 작용제 단클론 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 52는 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(urelumab)(BMS-663513)에 대한 중쇄이다.
서열번호 53은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 경쇄이다.
서열번호 54는 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 55는 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 56은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 57은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 58은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 59는 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 60은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 61은 4-1BB 작용제 단클론 항체 우렐루맙(BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 62는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호 63은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 64는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 65는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 66은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 67은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 68은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 69는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 70은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 71은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 72는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 73은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열번호 74는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 75는 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 76은 TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열번호 77은 4-1BB 리간드(4-1BBL) 아미노산 서열이다.
서열번호 78은 4-1BBL 폴리펩타이드의 가용성 부분이다.
서열번호 79는 4-1BB 작용제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 80은 4-1BB 작용제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 81은 4-1BB 작용제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 82는 4-1BB 작용제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 83은 4-1BB 작용제 항체 H39E3-2에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 84는 4-1BB 작용제 항체 H39E3-2에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 85는 인간 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호 86은 뮤린 OX40의 아미노산 서열이다.
서열번호 87은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(tavolixizumab)(MEDI-0562)에 대한 중쇄이다.
서열번호 88은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 경쇄이다.
서열번호 89는 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 90은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 91은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 92는 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 93은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 94는 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 95는 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 96은 OX40 작용제 단클론 항체 타볼릭시주맙(MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 97은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 중쇄이다.
서열번호 98은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 경쇄이다.
서열번호 99는 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 100은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 101은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 102는 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 103은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 104는 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 105는 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 106은 OX40 작용제 단클론 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 107은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 중쇄이다.
서열번호 108은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 경쇄이다.
서열번호 109는 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 110은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 111은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 112는 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 113은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 114는 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 115는 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 116은 OX40 작용제 단클론 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 117은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 118은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 119는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 120은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 121은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 122는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 123은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 124는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 125는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 126은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 127은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열번호 128은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열번호 129는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열번호 130은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열번호 131은 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열번호 132는 OX40 작용제 단클론 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열번호 133은 OX40 리간드(OX40L) 아미노산 서열이다.
서열번호 134는 OX40L 폴리펩타이드의 가용성 부분이다.
서열번호 135는 OX40L 폴리펩타이드의 대안적인 가용성 부분이다.
서열번호 136은 OX40 작용제 단클론 항체 008에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 137은 OX40 작용제 단클론 항체 008에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 138은 OX40 작용제 단클론 항체 011에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 139는 OX40 작용제 단클론 항체 011에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 140은 OX40 작용제 단클론 항체 021에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 141은 OX40 작용제 단클론 항체 021에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 142는 OX40 작용제 단클론 항체 023에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 143은 OX40 작용제 단클론 항체 023에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 144는 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 145는 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 146은 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 147은 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 148은 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 149는 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 150은 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 151은 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 152는 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 153은 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 154는 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 155는 인간화 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 156은 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역(VH)이다.
서열번호 157은 OX40 작용제 단클론 항체에 대한 경쇄 가변 영역(VL)이다.
서열번호 158은 PD-1 저해제 니볼루맙(nivolumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 159는 PD-1 저해제 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 160은 PD-1 저해제 니볼루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 161은 PD-1 저해제 니볼루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 162는 PD-1 저해제 니볼루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 163은 PD-1 저해제 니볼루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 164는 PD-1 저해제 니볼루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 165는 PD-1 저해제 니볼루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 166은 PD-1 저해제 니볼루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 167은 PD-1 저해제 니볼루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 168은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙(pembrolizumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 169는 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 170은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 171은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 172는 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 173은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 174는 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 175는 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 176은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 177은 PD-1 저해제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 178은 PD-L1 저해제 두르발루맙(durvalumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 179는 PD-L1 저해제 두르발루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 180은 PD-L1 저해제 두르발루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 181은 PD-L1 저해제 두르발루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 182는 PD-L1 저해제 두르발루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 183은 PD-L1 저해제 두르발루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 184는 PD-L1 저해제 두르발루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 185는 PD-L1 저해제 두르발루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 186은 PD-L1 저해제 두르발루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 187은 PD-L1 저해제 두르발루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 188은 PD-L1 저해제 아벨루맙(avelumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 189는 PD-L1 저해제 아벨루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 190은 PD-L1 저해제 아벨루맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 191은 PD-L1 저해제 아벨루맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 192는 PD-L1 저해제 아벨루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 193은 PD-L1 저해제 아벨루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 194는 PD-L1 저해제 아벨루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 195는 PD-L1 저해제 아벨루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 196은 PD-L1 저해제 아벨루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 197은 PD-L1 저해제 아벨루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 198은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙(atezolizumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 199는 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 200은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 201은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 202는 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 203은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 204는 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 205는 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 206은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 207은 PD-L1 저해제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 208은 CTLA-4 저해제 이필리무맙(ipilimumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 209는 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 210은 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 211은 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 212는 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 213은 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 214는 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 215는 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 216은 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 217은 CTLA-4 저해제 이필리무맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 218은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙(tremelimumab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 219는 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 220은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 221은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 222는 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 223은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 224는 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 225는 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 226은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 227은 CTLA-4 저해제 트레멜리무맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 228은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙(zalifrelimab)의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 229는 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 230은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열이다.
서열번호 231은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열이다.
서열번호 232는 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 233은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 234는 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열번호 235는 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열번호 236은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열번호 237은 CTLA-4 저해제 잘리프렐리맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
I. 도입
급속 확장 프로토콜(REP)에 의해 생체외에서 배양된 TIL을 활용하는 입양 세포 요법은 흑색종과 같은 암 환자에서 숙주 면역억제 후 성공적인 입양 세포 요법을 생성했다. 현재 주입 허용 매개변수는 TIL 조성(예: CD28, CD8 또는 CD4 양성)의 판독값, 비드 기반 효력 검정에서 자극 시 다양한 사이토카인 및 기타 마커의 발현(예: IFN-γ), 및 REP 생성물의 확장 및 생존력의 수치 배수에 의존적이다. 관련 기술분야에 공지된 검정과 비교하여 다른 개선 사항 중 우수한 성능, T 세포 생성물 효력 대비 더 나은 제어, 및 증가된 생물학적 적합성을 제공할 수 있는 효력 검정이 본원에 기술된다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전체가 참고로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "공동 투여", "공동 투여하는", "조합으로 투여되는", "조합으로 투여하는", "동시" 및 "병행(concurrent)"은 2종 이상의 활성 약제학적 성분(복수의 TIL과 같은 본 발명의 바람직한 실시양태에서)을 대상체 또는 환자에게 투여하여, 활성 약제학적 성분 및/또는 이의 대사산물 모두가 동시에 대상체 또는 환자에 존재하도록 하는 것을 포괄한다. 공동 투여는 별도의 조성물로 동시 투여, 별도의 조성물로 상이한 시점에 투여, 또는 2종 이상의 활성 약제학적 성분이 존재하는 조성물로의 투여를 포함한다. 별도의 조성물로의 동시 투여 및 두 제제 모두가 존재하는 조성물로의 투여가 바람직하다.
"생체내"라는 용어는 대상체의 신체 또는 환자의 신체에서 발생하는 사건을 지칭한다.
"시험관내"라는 용어는 대상체의 신체 또는 환자의 신체 외부에서 발생하는 사건을 의미한다. 시험관내 검정은 살아 있거나 죽은 세포를 사용하는 세포 기반 검정을 포괄하며, 온전한 세포가 사용되지 않는 무세포 검정도 포괄할 수 있다.
"생체외"라는 용어는 대상체의 신체 또는 환자의 신체에서 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 절차를 수행하거나 처리하는 것을 수반하는 사건을 지칭한다. 적절하게는, 수술이나 치료 방법에서 세포, 조직 및/또는 기관은 대상체의 신체 또는 환자의 신체로 복귀할 수 있다.
용어 "급속 확장"은 항원 특이적 TIL의 수가 1주일의 기간에 걸쳐 적어도 약 3배(또는 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 9배), 보다 바람직하게는 1주일의 기간에 걸쳐 적어도 10배(또는 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배 또는 90배), 또는 가장 바람직하게는 1주일의 기간에 걸쳐 적어도 약 100배 증가한 것을 의미한다. 다수의 급속 확장 프로토콜은 본원에 기술되어 있다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포 집단을 의미한다. TIL에는 CD8+ 세포독성 T 세포(림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 제2 TIL 둘 모두를 포함한다. "제1 TIL"은 본원에 개략된 바와 같이 환자 조직 샘플에서 수득되는 것(때로 "새로 수확한"이라고도 함)이며, "제2 TIL"은 본원에 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단으로서, 벌크 TIL 및 확장 TIL("REP TIL" 또는 "REP후 TIL")을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. TIL 세포 집단은 유전자 변형된 TIL을 포함할 수 있다.
본원에서, "세포 집단"(TIL 포함)이란 공통 형질을 공유하는 다수의 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 일반적으로 수가 1 x 106 내지 1 x 1010 범위이며, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2의 존재 하에 제1 TIL의 초기 성장은 대략 1 x 108 세포의 벌크 TIL의 집단을 초래한다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위한 1.5 x 109 내지 1.5 x 1010 세포의 집단을 제공하기 위해 수행된다.
본원에서 "동결보존된 TIL"이란 1차, 벌크 또는 확장된(REP TIL) TIL이 약 -150℃ 내지 -60℃ 범위에서 처리되고 저장된다는 것을 의미한다. 동결보존을 위한 일반적인 방법은 실시예를 포함하는 본원의 다른 곳에도 기술되어 있다. 명확하게 하기 위해 "동결보존된 TIL"은 제1 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과 구별할 수 있다.
본원에서 "해동된 동결보존된 TIL"은 이전에 동결보존된 후 실온 이상, 예를 들어 비제한적으로 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도로 복귀하도록 처리된 TIL 집단을 의미한다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 종양에 침윤하여 치료를 달성하게 하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현함으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 및 CD25. 추가적으로 및 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입 시 고형 종양에 침윤하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
용어 "동결보존 배지들" 또는 "동결보존 배지"는 세포의 동결보존에 사용될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 7% 내지 10% DMSO를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 배지에는 CryoStor CS10, Hypothermasol, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. "CS10"이라는 용어는 Stemcell Technologies 또는 Biolife Solutions에서 수득되는 동결보존 배지를 지칭한다. CS10 배지는 상표명 "CryoStor® CS10"으로 지칭될 수 있다. CS10 배지는 DMSO를 포함하는 무혈청, 동물성분-무함유 배지이다.
용어 "중심 기억 T 세포", "중심 기억 T 세포" 또는 "TCM"은 인간에서 CD45R0+이고 CCR7(CCR7hi 또는 CCR7+) 및 CD62L(CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 TCR, CD3, CD127(IL-7R) 및 IL-15R도 포함한다. 중심 기억 T 세포의 전사 인자로는 BCL-6, BCL-6B, MBD2 및 BMI1을 포함한다. 중심 기억 T 세포는 TCR 유발 후 이펙터 분자로서 IL-2 및 CD40L을 주로 분비한다. 중심 기억 T 세포는 혈액에서 CD4 구획에 우세하며, 인간에서는 림프절 및 편도에 비례적으로 농축된다. 자가 재생 줄기 기억 T 세포, 즉 "TSCM"은 TCM 또는 TEM 세포로 분화할 수 있는 하위세트이며, Gattinoni, 등, Nature Med. 2011, 17, 1290-97에 기술되어 있다.
용어 "이펙터 기억 T 세포", "이펙터 기억 T-세포" 또는 "TEM"은 중심 기억 T 세포와 같이, CD45R0+이지만 CCR7의 구성적 발현을 상실(CCR7lo 또는 CCR-)했고 CD62L 발현이 불균질하거나 낮은(CD62Llo), 인간 또는 포유동물 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127(IL-7R) 및 IL-15R도 포함한다. 중심 기억 T 세포의 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 이펙터 기억 T 세포는 항원 자극 후, 인터페론-γ, IL-4 및 IL-5를 포함하는 염증성 사이토카인의 높은 수준을 급속하게 분비한다. 이펙터 기억 T 세포는 혈액에서 CD8 구획에 우세하며, 인간에서는 폐, 간 및 장에 비례적으로 농축된다. CD8+ 이펙터 기억 T 세포는 다량의 퍼포린을 운반한다. CD45RA 마커를 재발현하는 최종 분화된 TEM 세포는 "TEMRA" 또는 "TEMRA" 세포라고 지칭된다.
"밀폐 시스템"이라는 용어는 외부 환경에 대해 밀폐된 시스템을 지칭한다. 세포 배양 방법에 적절한 임의의 밀폐 시스템은 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 밀폐 시스템으로는 밀폐 G-용기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일단 종양 분절이 밀폐 시스템에 첨가되면, 시스템은 TIL이 환자에게 투여될 준비가 될 때까지 외부 환경에 개방되지 않는다.
종양을 파괴하는 공정을 기술하기 위해 본원에 사용된 용어 "단편화", "단편" 및 "단편화된"은 종양 조직을 분쇄, 슬라이싱, 분할 및 세절화하는 것과 같은 기계적 단편화 방법뿐만 아니라 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하는 임의의 다른 방법을 포함한다.
용어 "말초 혈액 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구를 포함하는 둥근 핵을 갖는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 항원 제시 세포로 사용하는 경우(PBMC는 항원 제시 세포의 일종임), 말초 혈액 단핵 세포는 방사선 조사된 동종이계 말초 혈액 단핵 세포인 것이 바람직하다.
"말초 혈액 림프구" 및 "PBL"이라는 용어는 말초 혈액에서 확장된 T 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, PBL은 공여자의 전체 혈액 또는 성분채집 생성물로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, PBL은 CD3+ CD45+의 T 세포 표현형과 같은 T 세포 표현형의 양성 또는 음성 선택에 의해 공여자의 전체 혈액 또는 성분채집 생성물로부터 분리된다.
"주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"라는 용어는 적응 면역 시스템의 기능에 필수적인, MHC 분자로 알려진 세포 표면 단백질을 암호하는 밀접하게 연결된 다형성 유전자 세트를 함유하는 척추동물 DNA 상의 큰 유전자좌를 지칭한다. MHC 유전자는 매우 다형성이 높으며 2가지 주요 생성물인 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 산출한다. MHC 클래스 I 단백질은 세포질에서 기원하는 내인성 항원을 제시한다. MHC 클래스 II 단백질은 박테리아와 같은 이물질로부터 세포외적으로 기원하는 외인성 항원을 제시한다.
"MHC 우성 인식"이라는 용어는 T 세포의 TCR 복합체와 표적 세포의 HLA-펩타이드 복합체의 동종이계 상호작용을 지칭한다. MHC 우성 인식은 문헌[Felix and Allen, Nat. Rev. Immunol., 2007, 7(12), 942-53; Matzinger and Bevan, Cell Immunol., 1977, 29(1), 1-5, 및 Janeway, The Major Histocompatibility Complex and Its Functions in Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition, Garland Science, 2001]에 기술되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. MHC 우성 인식에서, 동종이계 MHC 분자는 T 세포 수용체에 우수한 맞춤(fit)을 제공하여 MHC 분자에 결합되는 펩타이드에 덜 의존적인 긴밀한 결합을 제공할 수 있다.
"인간 백혈구 항원", "HLA" 또는 "HLA 복합체"라는 용어는 인간 세포의 표면에서 발현되는 MHC 분자를 지칭한다. 인간 백혈구 항원은 인간에서 MHC 유전자 복합체에 의해 암호화된다.
용어 "표적 세포" 및 "표적 세포주"는 TIL, MIL 또는 PBL과 같은 T 세포의 검정 표적인 세포를 지칭한다. 실시양태에서, 표적 세포는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II를 발현한다. 실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손, 뿐만 아니라 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II를 발현하는 다른 세포를 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포는 Thp1 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포는 Ramos 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포는 U937 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포는 Daudi 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포는 방사선조사된다. 실시양태에서, 표적 세포는 방사선조사되지 않는다. 실시양태에서, 표적 세포주는 Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주 및 Daudi 세포주 중 임의의 2개의 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, 및 Daudi 세포주 중 임의의 3개의 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주 및 Daudi 세포주 중 임의의 4개의 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주 및 Daudi 세포주의 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 혼합된 종양 표적 세포주이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 동종반응성 표적 세포주이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 혼합된 종양 동종반응성 표적 세포주이다. 실시양태에서, 표적 세포주는 다음 세포주 중 적어도 2개의 조합을 포함하는 혼합 종양 동종반응성 표적 세포주이다: Raji 세포주, Ramos 세포주, Thp1 세포주, U937 세포주, 및 Daudi 세포주.
용어 "Raji 세포" 또는 "Raji 세포주"는 미국 모식균 배양수집소(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, B 세포 특징을 갖는 버킷 림프종 세포주 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. Raji 세포는 문헌[Theofilopoulos, 등, J. Clin. Invest. 1976, 57, 169-182; Sobel and Bokisch, Fed. Proc. 1975, 34, 965; 및 Theofilopoulos, 등, J. Exp. Med. 1974, 140, 1230-1244]에 기술되어 있고, 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. Raji 세포에는 막-결합 면역글로불린이 결여되어 있지만, IgG Fc, C3b, C3d 및 C1q에 대한 수용체가 있다. 실시양태에서, Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손은 표적 세포이다. 실시양태에서, Raji 세포는 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지를 발현하도록 유전자 변형되어, 이의 세포막이 파괴될 때 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지가 잠재적인 검출 용도의 배지로 방출된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 Raji 세포의 변형에 사용될 수 있다.
용어 "Thp1 세포" 또는 "Thp1 세포주"는 "THP-1 세포" 또는 "THP-1 세포주"라고도 지칭되고 미국 모식균 배양수집소(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, 인간 급성 단핵구 백혈병 세포주 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. Thp1 세포주는 문헌[Tsuchiya, 등, Int. J. Cancer 1980, 26, 171-176 및 Bosshart and Heinzelmann, Ann. Transl. Med. 2016, 4(21), 438]에 기술되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손은 표적 세포이다. 실시양태에서, Thp1 세포는 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지를 발현하도록 유전자 변형되어, 이의 세포막이 파괴될 때 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지가 잠재적인 검출 용도의 배지로 방출된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 Thp1 세포의 변형에 사용될 수 있다.
"Ramos 세포" 또는 "Ramos 세포주"라는 용어는 미국 모식균 배양수집소(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, 인간 버킷 림프종 세포주 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. Ramos 세포주는 문헌[Benjamin, 등, J. Immunol. 1982, 129, 1336-1342]에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손은 표적 세포이다. 실시양태에서, Ramos 세포는 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지를 발현하도록 유전자 변형되어, 이의 세포막이 파괴될 때 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지가 잠재적인 검출 용도의 배지로 방출된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 Ramos 세포의 변형에 사용될 수 있다.
용어 "U937 세포" 또는 "U937 세포주"는 미국 모식균 배양수집소(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, 인간 조직구성 림프종 세포주 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. U937 세포주는 문헌[Kraus, 등, J. Clin. Microbiol. 2007, 45, 3777-3780]에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손은 표적 세포이다. 실시양태에서, U937 세포는 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지를 발현하도록 유전자 변형되어, 이의 세포막이 파괴될 때 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지가 잠재적인 검출 용도의 배지로 방출된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 U937 세포의 변형에 사용될 수 있다.
용어 "Daudi 세포" 또는 "Daudi 세포주"는 미국 모식균 배양수집소(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, 인간 버킷 림프종 세포주 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. Daudi 세포주는 문헌[Gao, 등, J.Virol. 1997, 71, 84-94]에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손은 표적 세포이다. 실시양태에서, Daudi 세포는 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지를 발현하도록 유전자 변형되어, 이의 세포막이 파괴될 때 형광, 인광, 화학발광 또는 생물발광 표지가 잠재적인 검출 용도의 배지로 방출된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 Daudi 세포의 변형에 사용될 수 있다.
용어 "음성 대조군", "음성 대조군 세포" 및 "음성 대조군 세포주"는 TIL, MIL 또는 PBL 검정을 비롯한 T 세포 검정에서 음성 대조군으로서 사용되는 세포를 지칭한다. 실시양태에서, 표적 세포에는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 발현이 결여되어 있다. 실시양태에서, 표적 세포에는 MHC 클래스 I 발현이 결여되어 있다. 실시양태에서, 표적 세포에는 MHC 또는 HLA 클래스 I 발현이 결여되어 있다. 실시양태에서, 표적 세포는 MHC 또는 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II를 최소 수준으로 발현한다.
용어 "K562 세포" 또는 "K562 세포주"는 미국 모식균 배양수집소(미국 버지니아주 마나사스)를 포함하는 여러 공급업체로부터 입수 가능한, 림프모구성 형태를 갖는 인간 백인 만성 골수성 백혈병 세포주, 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손을 의미한다. K562 세포는 문헌[Lozzio and Lozzio, Blood, 1975, 45, 321-34]에 기술되어 있다. 실시양태에서, 음성 대조군 세포는 K562 세포 및 이의 파생물, 변이체, 변형 및 자손, 뿐만 아니라 MHC 또는 HLA 클래스 I 또는 클래스 II를 발현하지 않는 다른 세포를 포함한다.
용어 "항-CD3 항체"는 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 유도되는 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함하는, 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어 단클론 항체를 지칭한다. 항-CD3 항체는 무로모나브(muromonab)로도 알려진 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3ε으로도 알려진 UHCT1 클론도 포함한다. 다른 항-CD3 항체는 예를 들어 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙을 포함한다.
용어 "OKT-3"(본원에서는 "OKT3"으로도 지칭됨)은 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용채에서 CD3 수용체에 대해 유도된 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함하는 단클론 항체, 이의 바이오시밀러 또는 변이체를 지칭하며, 상업적으로 입수 가능한 형태, 예컨대 OKT-3(30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수, Miltenyi Biotech, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 무로모나브 또는 이의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 글리코폼, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 무로모나브의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있다(서열번호 1 및 서열번호 2). OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 미국 모식균 배양 수집소에 기탁되어 있고, ATCC 수탁 번호 CRL 8001이 할당되어 있다. OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마는 또한 ECACC(European Collection of Authenticated Cell Cultures)에 기탁되어 있으며, 카탈로그 번호 86022706이 할당되어 있다.
용어 "IL-2"(본원에서는 "IL2"라고도 함)는 인터루킨-2로 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 인간 및 포유동물 형태, 이의 보존적 아미노산 치환체, 글리코폼, 바이오시밀러 및 변이체를 포함하는 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-2는 예를 들어 문헌[Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79]에 기술되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 3)에 제시되어 있다. 예를 들어, IL-2라는 용어는 알데스류킨(PROLEUKIN, 1회용 바이알당 2,200만 IU로 여러 공급자로부터 상업적으로 입수 가능함)과 같은 IL-2의 인간 재조합 형태, 뿐만 아니라 CellGenix, Inc.(미국 뉴햄프셔주 포츠머스 소재)(CELLGRO GMP) 또는 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(미국 뉴저지주 이스트 브런스윅 소재)(Cat. No. CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 공급자로부터의 다른 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨(데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 분자량이 대략 15 kDa인, IL-2의 비글리코실화된 인간 재조합 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 4)에 제시되어 있다. IL-2라는 용어는 또한 본원에 기술된 바와 같은 IL-2의 페길화된 형태, 예를 들어, 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재하는 Nektar Therapeutics로부터 입수 가능한 페길화된 IL2 전구약물 NKTR-214를 포괄한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0328791 A1호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/065086 A1에 기술되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 접합된 IL-2의 대안적인 형태는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4902,502호에 기술되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 THOR-707이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 추가적인 대안적 형태는 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0181220 A1호 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0330601 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 ALKS-4230이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 추가적인 대안적 형태는 또한 미국 특허 출원 공개 제US 2021/0038684 A1호 및 미국 특허 제10,183,979호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 단리 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드; 및 K35, T37, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, E68, K64, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택되는 아미노산 위치에서 단리 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 접합 모이어티를 포함하는 인터루킨 2(IL-2) 접합체이며, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 미국 특허 출원 공개번호 US 2020/018120에서의 서열번호 1에 상응한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 T37, R38, T41, F42, F44, Y45, E61, E62, E68, K64, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 T37, R38, T41, F42, F44, Y45, E61, E62, E68, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 T37, T41, F42, F44, Y45, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 R38 및 K64로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 E61, E62 및 E68로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 위치는 E62에 있다. 일부 실시양태에서, K35, T37, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, E68, K64, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택되는 아미노산 잔기는 라이신, 시스테인, 또는 히스티딘으로 추가로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기는 시스테인으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기는 리신으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, K35, T37, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, E68, K64, P65, V69, L72 및 Y107로부터 선택되는 아미노산 잔기는 비천연 아미노산으로 추가로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 N6-아지도에톡시-L-리신(AzK), N6-프로파르길에톡시-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노르보르넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카르보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파르길옥시페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산, 또는 셀레노시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-2 접합체는 야생형 IL-2 폴리펩타이드에 비해 IL-2 수용체 α(IL-2Rα) 서브유닛에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 감소된 친화도는 야생형 IL-2 폴리펩타이드에 비해 IL-2Rα에 대한 결합 친화도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99% 초과 감소이다. 일부 실시양태에서, 감소된 친화도는 야생형 IL-2 폴리펩타이드에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 30배, 50배, 100배, 200배, 300배, 500배, 1000배 또는 그 이상이다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 IL-2와 IL-2Rα의 결합을 손상시키거나 차단한다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 접합 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀계 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 독립적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 독립적으로 PEG를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG 또는 분지형 PEG이다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 독립적으로 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 헤파란 설페이트(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-전분(HES)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 독립적으로 글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 독립적으로 폴리아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 접합 모이어티는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 단백질은 독립적으로 알부민, 트랜스페린 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 단백질은 Fc 부분을 독립적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 단백질은 IgG의 Fc 부분을 독립적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 접합 모이어티는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩타이드는 독립적으로 XTEN 펩타이드, 글리신-풍부한 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ELP), CTP 펩타이드 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드는 글루타밀화에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 단리 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드에 직접 결합된다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 단리 및 정제된 IL-2 폴리펩타이드에 링커를 통해 간접적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 동종이작용기성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이작용기성 링커는 로망(Lomant) 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포숙신이미딜 프로프리오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베리미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-(3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴할라이드 함유 화합물(DFDNB), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카르보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 술폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 이종이작용기성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종이작용기성 링커는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MB), N-숙신이미딜(4-요오도액테일)아미노벤조에이트(sIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도액테일)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포숙신이미드 에스테르(설포-GMB), 숙신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(slAXX), 숙신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-(((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카르보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카르보닐-반응성 및 설프하이드릴-반응성 가교제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미드)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포숙신이미딜-2-(p-아지도살리실아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOs), 설포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마인-3-아세테이트(설포-sAMCA), p-니트로페닐 디아조피루베이트(pNPDP), p-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, p-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 4-(ρ-아지도살리실아미드)부틸아민(AsBA) 또는 p-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 디펩타이드 링커를 선택적으로 포함하는 절단가능한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 링커는 Val-Cit, Phe-Lys, Val-Ala 또는 Val-Lys을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단 불가능한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 말레이미도카프로일(mc), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 또는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-sMCC)를 선택적으로 포함하는 말레이미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 p-아미노벤질 알코올(PAB), p-아미노벤지옥시카르보닐(PABC), 이들의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 모이어티는 IL-2 접합체의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 접합 모이어티는 IL-2 접합체의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 본원에 기술된 임의의 IL-2 형태의 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0181220 A1 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0330601 A1에 개시된 바와 같이 페길화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 접합 모이어티에 공유 부착된 N6-아지도에톡시-L-리신(AzK)을 포함하는 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2 접합체이며, 여기서 IL-2 폴리펩타이드는 미국 특허 출원 공개 번호 2020/0330601에서의 서열번호 1(본원에서는 표 2에 서열번호 5로 나열됨)과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 미국 특허 공개 출원 번호 US 2020/0330601에서의 서열번호 1(본원에서는 표 2에 서열번호 5로서 나열됨) 내의 아미노산 위치와 관련하여 위치 K35, F42, F44, K43, E62, P65, R38, T41, E68, Y45, V69 또는 L72의 아미노산에 대해 AzK 치환체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-2 폴리펩타이드는 미국 특허 공개 출원 번호 US 2020/0330601에서의 서열번호 1(본원에서는 표 2에 서열번호 5로 나열됨)에 비해 1개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 IL-2R 알파 사슬 체결이 결여되어 있지만 중간 친화도 IL-2R 베타-감마 신호전달 복합체에 대한 정상적인 결합을 보유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 ALKS-4230이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 형태는 미국 특허 출원 공개 제US 2021/0038684 A1에 서열번호 1(본원에서는 표 2에 서열번호 6으로 나열됨)로서 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 2(미국 특허 제10,183,979호에서의 서열번호 2는 본원에서 표 2에 서열번호 7로서 기재됨)의 아미노산 24-452를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 2의 아미노산 24-452 또는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 2의 아미노산 24-452의 전체 길이에 걸쳐 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 2의 아미노산 24-452에 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 2의 아미노산 24-452의 수용체 길항제 활성을 갖는 융합 단백질이다. 선택적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 뮤신 도메인 폴리펩타이드 링커에 의해 제2 융합 파트너에 연결된 제1 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질이고, 여기서 제1 융합 파트너는 IL-1Rα 또는 IL-1Rα에 대해 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖고 IL-Rα의 수용체 길항제 활성을 갖는 단백질이고, 여기서 제2 융합 파트너는 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기서 뮤신 도메인 폴리펩타이드 링커는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 14(본원에서 표 2에 서열번호 8로서 나열됨) 또는 미국 특허 제10,183,979호의 서열번호 14(본원에서는 표 2에 서열번호 8로서 나열됨)와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 융합 단백질의 반감기는 뮤신 도메인 폴리펩타이드 링커의 부재 하에 제2 융합 파트너에 대한 제1 융합 파트너의 융합체에 비해 개선된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2 형태는 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및 VH 또는 VL의 CDR에 접목된 IL-2 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 항체 사이토카인 접목된 단백질은 조절 T 세포에 비해 T 이펙터 세포를 우선적으로 확장시킨다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및 VH 또는 VL의 CDR에 접목된 IL-2 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서, IL-2 분자는 뮤테인이고, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 조절 T 세포에 비해 T 이펙터 세포를 우선적으로 확장시킨다. 실시양태에서, IL-2 요법은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에 기술된 항체의 투여를 포함하며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및 VH 또는 VL의 CDR에 접목된 IL-2 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이고, 여기서 항체 사이토카인 접목된 단백질은 조절 T 세포에 비해 T 이펙터 세포를 우선적으로 확장시키고, 항체는 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 69를 포함하는 IgG 클래스 경쇄 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 53을 포함하는 IgG 클래스 중쇄; 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 37을 포함하는 IgG 클래스 경쇄 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 21을 포함하는 IgG 클래스 중쇄; 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 69를 포함하는 IgG 클래스 경쇄 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 21을 포함하는 IgG 클래스 중쇄; 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 37을 포함하는 IgG 클래스 경쇄 및 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호에서 서열번호 53을 포함하는 IgG 클래스 중쇄로 구성되는 군으로부터 선택되는 IgG 클래스 중쇄 및 IgG 클래스 경쇄를 추가로 포함한다.
실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VH의 HCDR1에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다. 실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VH의 HCDR2에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다. 실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VH의 HCDR3에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다. 실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VL의 LCDR1에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다. 실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VL의 LCDR2에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다. 실시양태에서, IL-2 분자 또는 이의 단편은 VL의 LCDR3에 접목되며, 여기서 IL-2 분자는 뮤테인이다.
IL-2 분자의 삽입은 CDR의 N-말단 영역 또는 그 근처, CDR의 중간 영역 또는 CDR의 C-말단 영역 또는 그 근처일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 CDR에 혼입된 IL-2 분자를 포함하며, 여기서 IL2 서열은 CDR 서열을 프레임이동시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 CDR에 혼입된 IL-2 분자를 포함하며, 여기서 IL-2 서열은 CDR 서열의 전부 또는 일부를 교체한다. IL-2 분자에 의한 교체는 CDR의 N-말단 영역, CDR의 중간 영역 또는 CDR의 C-말단 영역 또는 그 근처일 수 있다. IL-2 분자에 의한 교체는 CDR 서열의 최소 1개 또는 2개의 아미노산이거나, 또는 전체 CDR 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2 분자는 펩타이드 링커 없이 CDR 내에 직접 접목되고, CDR 서열과 IL-2 서열 사이에 추가 아미노산이 없다. 일부 실시양태에서, IL-2 분자는 CDR 서열과 IL-2 서열 사이에 1개 이상의 추가 아미노산을 갖는 펩타이드 링커를 사용하여 CDR에 간접적으로 접목된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-2 분자는 IL-2 뮤테인이다. 일부 경우에, IL-2 뮤테인은 R67A 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-2 뮤테인은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 아미노산 서열번호 4 또는 서열번호 6을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-2 뮤테인은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 표 1에 있는 아미노산 서열을 포함하며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR1을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR1, 및 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 및 서열번호 17로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR2를 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR1, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14 및 서열번호 17로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR2, 및 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 및 서열번호 18로 구성되는 군으로부터 선택되는 HCDR3을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0270334 A1호의 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 영역 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역을 포함한다. 실시양태에서, 항체 사이토카인 접목된 단백질은 미국 특허 출원 공개 제2020/0270334 A1호의 IgG.IL2R67A.H1을 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 사이토카인 접목된 단백질의 항체 구성요소는 팔리비주맙의 면역글로불린 서열, 프레임워크 서열, 또는 CDR 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 사이토카인 접목된 단백질은 야생형 IL-2 분자, 예컨대 비제한적으로 알데스큐킨(Proleukin®) 또는 비슷한 분자보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.
실시양태에서, 본원에 기술된 항체 사이토카인 접목된 단백질은 표 3에 제시된 서열을 갖는다.
용어 "IL-4"(본원에서는 "IL4"라고도 함)는 인터루킨 4로 알려진 사이토카인을 지칭하며, 이는 Th2 T 세포와 호산구, 호염기구 및 비만 세포에 의해 생성된다. IL-4는 나이브 헬퍼(naive helper) T 세포(Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. IL-4에 의해 활성화되면 Th2 T 세포는 이후 양성 피드백 루프에서 추가 IL-4를 생성한다. IL-4는 또한 B 세포 증식 및 클래스 II MHC 발현을 자극하고, B 세포에서 IgE 및 IgG1 발현으로의 클래스 전환을 유도한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4는 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(미국 뉴저지주 이스트 브룬스윅)(카탈로그 번호 CYT-211) 및 ThermoFisher Scientific, Inc.(미국 매사추세츠주 월텀)(인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 Gibco CTP0043)를 비롯한 여러 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 9)에 제시되어 있다.
용어 "IL-7"(본원에서 "IL7"이라고도 함)은 인터루킨 7로 알려진 글리코실화된 조직 유래 사이토카인을 지칭하며, 이는 간질 및 상피 세포는 물론 수지상 세포로부터 수득될 수 있다. Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7은 T 세포의 발달을 자극할 수 있다. IL-7은 IL-7 수용체 알파와 공통 감마 사슬 수용체로 이루어지는 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합하고, 이는 흉선 내에서 T 세포 발달 및 말초 내에서 생존에 중요한 일련의 신호 내에 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(미국 뉴저지주 이스트 브룬스윅, (카탈로그 번호 CYT-254) 및 ThermoFisher Scientific, Inc.(미국 매사추세츠주 월텀)(인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 Gibco PHC0071)를 비롯한 여러 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 10)에 제시되어 있다.
용어 "IL-15"(본원에서는 "IL15"라고도 지칭됨)는 인터루킨-15로 알려진 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 이의 글리코폼, 바이오시밀러 및 변이체를 포함하는 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-15는 예를 들어 문헌[Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32]에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. IL-15는 IL-2와 β 및 γ 신호전달 수용체 하위단위를 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 114개의 아미노산(및 N-말단 메티오닌)을 함유하고 분자량이 12.8kDa인 단일 비글리코실화된 폴리펩타이드 사슬이다. 재조합 인간 IL-15는 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(미국 뉴저지주 이스트 브룬스윅, 카탈로그 번호 CYT-230-b) 및 ThermoFisher Scientific, Inc.(미국 매사추세츠주 월텀)(인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 34-8159-82)를 비롯한 여러 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 11)에 제시되어 있다.
용어 "IL-21"(본원에서는 "IL21"로도 지칭됨)은 인터루킨-21로 알려진 다면발현성 사이토카인 단백질을 지칭하며, 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 이의 글리코폼, 바이오시밀러 및 변이체를 비롯한 모든 형태의 IL-21을 포함한다. IL-21은 예를 들어 문헌[Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95]에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. IL-21은 주로 자연 살해 T 세포와 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 생산된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자량을 갖고 132개의 아미노산을 포함하는 단일의 비글리코실화된 폴리펩타이드 사슬이다. 재조합 인간 IL-21은 ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(미국 뉴저지주 이스트 브룬스윅, 카탈로그 번호 CYT-408-b) 및 ThermoFisher Scientific, Inc.(미국 매사추세츠주 월텀)(인간 IL-21 재조합 단백질, 카탈로그 번호 14-8219-80)를 포함한 여러 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2(서열번호 12)에 제시되어 있다.
"항종양 유효량", "종양 저해 유효량" 또는 "치료량"이 표시된 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 환자(대상체)의 상태의 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 종양 침윤 림프구(예를 들어, 제2 TIL 또는 유전자 변형된 세포독성 림프구)를 포함하는 약제학적 조성물은 104 내지 1011 세포/kg 체중(예를 들어, 105 내지 106, 105 내지 1010, 105 내지 1011, 106 내지 1010, 106 내지 1011, 107 내지 1011, 107 내지 1010, 108 내지 1011, 108 내지 1010, 109 내지 1011, 또는 109 내지 1010 세포/kg 체중)의 투여량, 예를 들어 이들 범위 내의 모든 정수 값으로 투여될 수 있다고 명시될 수 있다. 종양 침윤 림프구(예를 들어, 일부 경우에 유전자 변형된 세포독성 림프구) 조성물도 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 종양 침윤 림프구(예를 들어, 일부 경우에 유전자적으로)는 면역요법에서 흔히 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 환자를 질병 징후에 대해 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련된 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
용어 "혈액학적 악성종양", "혈액학적 악성종양" 또는 상관관계가 있는 의미의 용어는 혈액, 골수, 림프절 및 림프계의 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조혈 및 림프 조직의 포유동물 암 및 종양을 지칭한다. 혈액학적 악성종양은 또한 "액체 종양"이라고도 한다. 혈액학적 악성종양에는 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 림프종(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 단핵구성 백혈병(AMoL), 호지킨 림프종, 및 비호지킨 림프종이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. "B 세포 혈액학적 악성종양"이라는 용어는 B 세포에 영향을 미치는 혈액학적 악성종양을 지칭한다.
"액체 종양"이라는 용어는 본질적으로 유체인 비정상적인 세포 덩어리를 지칭한다. 액체 종양 암에는 백혈병, 골수종, 림프종뿐만 아니라 기타 혈액학적 악성 종양이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 액체 종양에서 수득되는 TIL은 본원에서 골수 침윤 림프구(MIL)라고도 지칭될 수 있다. 말초 혈액에서 순환하는 액체 종양을 포함한 액체 종양으로부터 수득되는 TIL은 또한 본원에서 PBL이라고도 지칭될 수 있다. MIL, TIL 및 PBL이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이들 세포가 유래되는 조직 유형만이 다르다.
본원에 사용된 용어 "미세환경"은 고형 또는 혈액학적 종양 미세환경을 전체적으로 지칭하거나 미세환경 내 세포의 개별 하위세트를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 종양 미세환경은 문헌[Swartz, 등, Cancer Res., 2012, 72, 2473]에 기술된 바와 같이, "신생물성 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침입을 지원하고, 숙주 면역으로부터 종양을 보호하고, 치료 저항성을 조장하고, 우성 전이가 번성할 수 있는 틈새를 제공하는, 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 기질 및 기계적 단서의 복잡한 혼합물"을 지칭한다. 종양은 T 세포에 의해 인식되어야 하는 항원을 발현하지만 면역 시스템에 의한 종양 제거는 미세환경에 의한 면역억제 때문에 드물다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수파괴성 화학요법으로 사전 치료된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비골수파괴성 화학요법으로 환자가 사전 치료된 TIL의 집단이 제공될 수 있다. 실시양태에서, 비-골수파괴성 화학요법은 2일(TIL 주입 전 27일 및 26일차) 동안 사이클로포스파미드 60 mg/kg/d이고 5일(TIL 주입 전 27일 내지 23일) 동안 플루다라빈 25 mg/m2/d이다. 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-골수파괴성 화학요법 및 TIL 주입(0일째) 후, 환자는 생리적 내성이 생길 때까지 매 8시간마다 720,000 IU/kg씩 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 투여받는다.
실험적 발견은 종양 특이적 T 림프구의 입양 전달 전 림프구 고갈이 조절 T 세포 및 면역 시스템의 경쟁 요소("사이토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 핵심 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 TIL을 도입하기 전에 환자에 대한 림프구 고갈 단계(때로 "면역억제 조건화"라고도 함)를 활용한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 질병 치료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 의도된 적용을 수행하기에 충분한, 본원에 기술된 화합물 또는 화합물 조합의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 의도된 적용(시험관내 또는 생체내), 치료 받는 대상체 및 질병 상태(예: 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질병 상태의 중증도 또는 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 이 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응(예: 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도하는 용량에도 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 화합물, 따라야 할 투약 요법, 화합물이 다른 화합물과 조합으로 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여되는 조직 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 질병으로 인한 부작용에 대해 부분적 또는 완전한 치유 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질병에 대한 모든 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉬우나, 질병이 있는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질병이 일어나는 것을 방지하는 것; (b) 질병을 저해하는 것, 즉 질병의 발병이나 진행을 저지하는 것; 및 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 야기하고/하거나 하나 이상의 질병 증상을 완화시키는 것을 포함한다. "치료"는 또한 질병 또는 상태가 없더라도 약리학적 효과를 제공하기 위한 제제의 전달을 포괄하는 것을 의미한다. 예를 들어, "치료"는 예를 들어 백신의 경우, 질병 상태 없이 면역 반응을 유발하거나 면역성을 부여할 수 있는 조성물의 전달을 포괄한다.
핵산 또는 단백질의 부분과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합 방식으로 생산되어, 관련 없는 유전자로부터의 2개 이상의 서열, 예를 들어 한 공급원의 프로모터와 또 다른 공급원의 암호 영역, 또는 서로 다른 공급원의 암호 영역들이 새로운 기능성 핵산을 만들도록 배열된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다(예: 융합 단백질).
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "서열 동일성", "동일성 퍼센트" 및 "서열 동일성 퍼센트"(또는 이의 동의어, 예를 들어 "99% 동일한")는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려함이 없이, 최대 상응도로 비교 및 정렬(필요한 경우, 갭을 도입함)할 때, 동일하거나 또는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 수득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하는 데 적합한 프로그램으로는, 예를 들어, 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트에서 이용 가능한 BLAST 프로그램 제품군을 포함한다. BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행할 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. ALIGN, ALIGN-2(Genentech, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 또는 DNASTAR에서 입수 가능한 MegAlign은 서열을 정렬하는 데 사용할 수 있는 공개적으로 입수 가능한 추가 소프트웨어 프로그램이다. 관련 기술분야의 기술자는 특정 정렬 소프트웨어에 의해 최대 정렬에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 매개변수가 사용된다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 기준 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 인접한 특정 위치에서 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 기준 항체의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 포괄하지만, 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 기준 항체의 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의 보존적 치환을 아미노산 서열에 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어, 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환을 수반할 수 있다. 변이체는 기준 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 변이체라는 용어는 페길화된 항체 또는 단백질도 포함한다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포 집단을 의미한다. TIL에는 CD8+ 세포독성 T 세포(림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 제2 TIL 둘 모두를 포함한다. "제1 TIL"은 본원에 개략된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 수득되는 것(때로 "새로 수확된"이라고도 함)이며, "제2 TIL"은 본원에서 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단, 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같은 벌크 TIL, 확장 TIL("REP TIL"), 뿐만 아니라 "reREP TIL"을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. reREP TIL은 예를 들어 2차 확장 TIL 또는 2차 추가 확장 TIL(예를 들어 reREP TIL이라고 지칭되는 TIL을 포함한, 도 8의 단계 D에 기술된 것)을 포함할 수 있다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로 정의되거나, 종양에 침윤하여 치료를 수행하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현함으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 및 CD25. 추가적으로, 그리고 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입 시 고형 종양에 침윤하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 효력에 의해 추가로 특성화될 수 있고, 예를 들어 인터페론(IFN) 방출이 약 50 pg/mL 초과, 약 100 pg/mL 초과, 약 150 pg/mL 초과, 또는 약 200 pg/mL 초과인 경우, TIL은 효력이 있는 것으로 간주될 수 있다.
용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 천연 및 합성, 미변형 및 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포괄한다. 변형은 당 모이어티, 염기 모이어티 및/또는 올리고뉴클레오타이드 내 데옥시리보뉴클레오타이드 간의 연결에 대한 변화를 포함한다.
용어 "RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 정의한다. "리보뉴클레오타이드"라는 용어는 b-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오타이드를 정의한다. 용어 RNA는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라 자연 발생 RNA로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 차이가 있는 변경된 RNA를 포함한다. 본원에 기술된 RNA 분자의 뉴클레오타이드는 또한 비-자연 발생 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드와 같은 비-표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 지칭될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 부형제"라는 용어는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하도록 의도된다. 활성 약제학적 성분을 위한 이러한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 부형제의 사용은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 부형제가 활성 약제학적 성분과 양립 불가능한 경우를 제외하고, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 기타 약물과 같은 추가적인 활성 약제학적 성분도 기술된 조성물 및 방법에 혼입될 수 있다.
"약" 및 "대략"이라는 용어는 통계적으로 의미 있는 범위 내의 값을 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 50% 이내, 더욱 바람직하게는 20% 이내, 더욱 바람직하게는 10% 이내, 훨씬 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다. "약" 또는 "대략"이라는 용어에 의해 포괄되는 허용 가능한 변동은 연구 중인 특정 시스템에 따라 달라지며, 관련 기술분야의 기술자라면 쉽게 이해할 수 있다. 더욱이, 본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제형, 매개변수, 모양 및 기타 수량 및 특징이 정확하지 않고 정확할 필요도 없지만 대략적일 수 있고 및/또는 바람직한 경우 더 크거나 더 작을 수 있어, 공차, 변환 인자, 반올림, 측정 오류 등, 및 관련 기술분야의 기술자에게 알려진 기타 인자를 반영한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제형, 매개변수, 모양 또는 기타 양이나 특징은 명시적으로 기술되었는지 여부에 관계없이 "약" 또는 "대략"이다. 매우 다른 크기, 형상 및 치수의 실시양태는 기술된 배열을 이용할 수 있다는 점에 유의한다.
첨부된 청구범위에서 원래의 형태 및 수정된 형태로 사용될 때 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"이라는 전환 용어는 언급되지 않은 추가 청구항 요소 또는 단계가 존재하더라도 청구항(들)의 범위에서 배제되는 것과 관련하여 청구 범위를 정의한다. "포함하는"이라는 용어는 포괄적이거나 개방적이도록 의도된 것으로서, 언급되지 않은 임의의 추가적인 요소, 방법, 단계 또는 물질을 배제하지 않는다. "구성되는"이라는 용어는 청구항에 명시된 것 이외의 다른 임의의 요소, 단계 또는 물질을 배제하며, 후자의 경우에 명시된 물질(들)과 일상적으로 연관된 불순물을 배제한다. "본질적으로 구성되는"이라는 용어는 청구항의 범위를 특정 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 중대한 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기술된 모든 조성물, 방법 및 키트는 대안적 실시양태에서 임의의 전환 용어 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"에 의해 보다 구체적으로 정의될 수 있다.
용어 "항체" 및 이의 복수형 "항체들"은 전체 면역글로불린 및 이의 임의의 항원 결합 단편("항원 결합 부분") 또는 단일 사슬을 지칭한다. "항체"는 추가로 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL이라는 하나의 도메인으로 구성된다. 항체의 VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역(HVR)으로 지칭되고, 프레임워크 영역(FR)이라는 보다 보존적인 영역이 산재될 수 있는 초가변성 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원 에피토프 또는 에피토프들과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성요소(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
"항원"이라는 용어는 면역 반응을 유도하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 TCR에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 면역 시스템에 의해 추가적으로 인식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 야기하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 이것은 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나, 이에 연결될 것을 필요로 할 수 있다. 항원은 또한 하나 이상의 에피토프(예: B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바람직하게는 이의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하고, 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않는, 전형적으로 매우 특이적이고 선택적인 방식으로 반응할 것이다.
용어 "단클론 항체", "mAb", "단클론 항체 조성물" 또는 이들의 복수형은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조물을 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 전시한다. 특정 수용체에 특이적인 단클론 항체는 테스트 대상체에게 적합한 항원을 주입한 다음 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리하는 기술 분야의 지식과 기술을 사용하여 만들 수 있다. 단클론 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 그런 다음 E.콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합 생산은 이하에 더 자세히 설명될 것이다.
본원에 사용된, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"(또는 간단히 "항체 부분" 또는 "단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 또는 VL 도메인으로 구성될 수 있는, 도메인 항체(dAb) 단편(Ward, 등, Nature, 1989, 341, 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호되지만, 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려진 1가 분자를 형성하도록 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Bird, 등, Science 1988, 242, 423-426; 및 Huston, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883] 참조. 이러한 scFv 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포괄되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
"인간 단클론 항체"라는 용어는 프레임워크와 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 전시하는 항체를 지칭한다. 실시양태에서, 인간 단클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 전이염색체성인 동물(예컨대, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(이하에 추가로 설명됨)로부터 단리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(trasfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합성, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 문구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
"인간 항체 유도체"라는 용어는 항체와 또 다른 활성 약제학적 성분 또는 항체의 접합체를 포함하는 인간 항체의 임의의 변형된 형태를 지칭한다. 용어 "접합체", "항체-약물 접합체", "ADC" 또는 "면역접합체"는 또 다른 치료 모이어티에 접합된 항체 또는 이의 단편을 지칭하며, 이는 관련 기술분야에서 이용가능한 방법을 사용하여 본원에 기술된 항체에 접합될 수 있다.
용어 "인간화 항체", "인간화 항체들" 및 "인간화"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가적인 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다. 비인간(예: 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 15 초가변 영역 유래의 잔기로 교체되어 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에는 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역이다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 Fc 일부를 포함할 것이다. 더 자세한 내용은 문헌[Jones, 등, Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann, 등, Nature 1988, 332, 323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596]을 참고한다. 본원에 기술된 항체는 또한 이펙터 기능 및/또는 FcR 결합의 개선(예를 들어 감소)을 부여하는 것으로 알려진 임의의 Fc 변이체를 사용하도록 변형될 수 있다. Fc 변이체는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 1988/07089 A1, WO 1996/14339 A1, WO 1998/05787 A1, WO 1998/23289 A1, WO 1999/51642 A1, WO 99/58572 A1, WO 2000/09560 A2, WO 2000/32767 A1, WO 2000/42072 A2, WO 2002/44215 A2, WO 2002/060919 A2, WO 2003/074569 A2, WO 2004/016750 A2, WO 2004/029207 A2, WO 2004/035752 A2, WO 2004/063351 A2, WO 2004/074455 A2, WO 2004/099249 A2, WO 2005/040217 A2, WO 2005/070963 A1, WO 2005/077981 A2, WO 2005/092925 A2, WO 2005/123780 A2, WO 2006/019447 A1, WO 2006/047350 A2, 및 WO 2006/085967 A2; 및 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 및 제7,083,784호에 개시된 아미노산 치환 중 어느 하나를 포함할 수 있고; 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예컨대, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기에 너무 짧은 링커를 사용하면, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이룰 수 밖에 없어, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들어 유럽 특허 제EP 404,097호, 국제 특허 공개 번호 WO 93/11161; 및 Bolliger, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448에 더 상세하게 기술되어 있다.
용어 "글리코실화"는 항체의 변형된 유도체를 지칭한다. 비글리코실화된 항체에는 글리코실화가 결여되어 있다. 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 비글리코실화는 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 기술된 바와 같이 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체와 같이 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 글리코실화 기구가 변경된 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(알파(1,6) 푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체에는 이의 탄수화물에 푸코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 교체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 표적화 파괴함으로써 생성되었다(예를 들어 미국 특허 공개 제2004/0110704호 또는 Yamane-Ohnuki, 등, Biotechnol.Bioeng., 2004, 87, 614-622 참조). 또 다른 예로서, 유럽 특허 제EP 1,176,195호는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주로서, 이러한 세포주에서 발현된 항체가 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거하여 저푸코실화를 나타내도록 하는 세포주, 및 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위해 낮은 효소 활성을 갖거나, 또는 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예컨대 랫트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술한다. 국제 특허 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되어 해당 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포를 기술한다(또한, Shields 등, J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740 참조). 국제 특허 공개 번호 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예: 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작되어, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내도록 하는 세포주를 기술한다(또한 Umana, 등, Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180 참조). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 문헌(Tarentino, 등, Biochem. 1975, 14, 5516-5523)에 기술된 바와 같이 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다.
"페길화"는 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에서, 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 페길화는, 예를 들어, 항체의 생물학적(예: 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같이, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 페길화될 항체는 비글리코실화된 항체일 수 있다. 페길화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 유럽 특허 제EP 0154316호 및 제EP 0401384호 및 미국 특허 제5,824,778호에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체에 적용될 수 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
"바이오시밀러"라는 용어는 임상적으로 비활성 구성요소의 사소한 차이에도 불구하고 허가를 받은 미국 기준 생물학적 제품과 매우 유사하며, 이로 인해 제품의 안전성, 순도, 및 효력 측면에서 생물학적 생성물과 기준 제품 간에 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 단클론 항체 또는 단백질을 포함하는 생물학적 생성물을 의미한다. 더욱이, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약품은 이미 유럽의약품청(European Medicines Agency)에서 사용이 승인된 다른 생물학적 의약품과 유사한 생물학적 의약품이다. "바이오시밀러"라는 용어는 다른 국가 및 지역 규제 기관에서도 동의어로 사용된다. 생물학적 제품 또는 생물학적 의약품은 박테리아나 효모와 같은 생물학적 공급원에 의해 제조되거나 그로부터 파생된 의약품이다. 이는 인간 인슐린이나 에리스로포이에틴과 같은 상대적으로 작은 분자 또는 단클론 항체와 같은 복잡한 분자로 구성될 수 있다. 예를 들어, 기준 IL-2 단백질이 알데스류킨(PROLEUKIN)인 경우, 알데스류킨과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 단백질은 알데스류킨에 대한 "바이오시밀러"이거나 알데스류킨의 "이의 바이오시밀러"이다. 유럽에서 유사한 생물학적 의약품 또는 "바이오시밀러" 의약품은 이미 유럽의약품청(EMA)에서 사용이 승인된 다른 생물학적 의약품과 유사한 생물학적 의약품이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용에 대한 관련 법적 근거는 규정(EC) No 726/2004의 6조 및 Directive 2001/83/EC의 10(4)조(개정안)이므로, 유럽에서 바이오시밀러는 규정(EC) No 726/2004의 6조 및 Directive 2001/83/EC의 10(4)조에 따라 허가되거나 허가 승인되거나 또는 허가 신청의 대상일 수 있다. 유럽에서는 이미 허가된 오리지널 생물학적 의약품은 유럽에서 "기준 의약품”이라고 지칭될 수 있다. 바이오시밀러로 간주될 제품에 필요한 일부 요건은 유사 생물학적 의약품에 대한 CHMP 가이드라인에 요약되어 있다. 또한, 단클론 항체 바이오시밀러에 관한 지침을 포함한 제품별 지침은 EMA에서 제품별로 제공되어 있고 웹사이트에 게시되어 있다. 본원에 기술된 바이오시밀러는 품질 특징, 생물학적 활성, 작용 기전, 안전성 프로파일 및/또는 효능 측면에서 기준 의약품과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 기준 의약품과 동일한 상태를 치료하기 위해 사용되거나 사용하도록 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 매우 유사한 품질 특징을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기술된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기술된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기술된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 유럽의 바이오시밀러는 EMA에서 허가된 기준 의약품과 비교된다. 그러나, 일부 경우에 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 지역 외에서 허가된 생물학적 의약품(비-EEA 허가 "비교약")과 비교될 수 있다. 이러한 연구에는 예를 들어 특정 임상 및 생체내 비임상 연구가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 허가 비교약과 비교되었거나 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 항체, 항체 단편(예: 항원 결합 부분) 및 융합 단백질과 같은 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩타이드의 기능에 유의미한 영향을 미치지 않는 아미노산 구조의 사소한 변형(예를 들어 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환 포함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 기준 의약품의 아미노산 서열과 97% 이상, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 하나 이상의 해독 후 변형, 예를 들어 기준 의약품의 해독 후 변형과 상이하지만, 단 이 상이성이 의약품의 안전성 및/또는 효능에 변화를 초래하지 않는, 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및/또는 절두를 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 기준 의약품과 동일하거나 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 반드시 그런 것은 아니지만, 바이오시밀러는 기준 의약품과 연관된 안전성 문제를 상이성이 해결하거나 해결하고자 하는 것이라면 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 의약품의 안전성과 유효성이 손상되지 않는다면, 강도, 약제학적 형태, 제형, 부형제 및/또는 실연(presentation) 등에서 기준 의약품으로부터 벗어날 수 있다. 바이오시밀러는 예를 들어 기준 의약품과 비교하여 약동학(PK) 및/또는 약력학(PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있지만, 여전히 허가될 만큼 또는 허가에 적합한 것으로 간주될 만큼 충분히 기준 의약품과 유사한 것으로 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 기준 의약품과 비교하여 상이한 결합 특징을 나타내며, 여기서 상이한 결합 특징은 EMA와 같은 규제 당국이 유사한 생물학적 생성물로서 허가를 받는 데 장애가 되지 않는 것으로 간주된다는 것이다. "바이오시밀러"라는 용어는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관에서도 동의어로 사용된다.
III. 효력 검정 방법 및 조성물
임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 상업적으로 실행 가능한 TIL 및 T 세포 효력 검정은 신생항원 발현 표적 세포의 이용 불가능성, 환자와 이들의 종양에 의해 발현된 신생항원 사이의 공통점의 결여, 및 검정을 구축하기 위해 제때에 모든 관련 신생항원을 식별할 수 없는 점에 의해 제한된다. 결과적으로, 일부 사례에서 표적 기반 검정을 사용하여 규제 기관의 허가를 받은 형질도입된 키메라 항원 수용체를 사용하는 상업용 및 임상 T 세포 치료법과 달리, 표적 기반 검정은 TIL, MIL 또는 PBL 치료법 또는 생성물과 같은 다클론성 T 세포 생성물에 효과적인 암 치료법에 필요한 기간에 실현 불가능하다. 동시에, 비드 기반의 검정은 TIL 또는 T 세포의 자연적 활성화 및 사멸 능력을 재현할 수 없음에 의해 제한된다. 예를 들어, 항-CD3 코팅을 활용하는 비드 기반 또는 플레이트 기반의 검정은 TCR과 비공유적으로 연관되는 TIL 또는 T 세포 상의 CD3 엡실론 사슬에 결합하는데, 이때 TCR은 TCR 자체에 결합하는 것이 보다 바람직할 것이다. 따라서, CD3를 사용하는 비드 기반 검정의 단점은 TCR의 알파 및 베타 구성요소를 이들의 상호작용에 사용하지 않는다는 것이다. 비드 상에 CD28 또는 CD137(4-1BB)과 같은 다른 공동자극 분자의 존재는 적어도 이러한 공동자극 분자의 활성화가 TIL과 같은 종양-상주 세포에 대해 덜 선택적인 검정을 초래하기 때문에, 또한 비자연적이고 덜 바람직한 상호작용을 야기한다. 본 발명은 이러한 문제에 대한 해결책을 제공한다. 특정 이론에 제한되지 않고, TIL, MIL 또는 PBL을 포함하는 T 세포의 TCR과 표적 세포의 MHC 또는 HLA 간의 상호작용은 TIL, MIL 또는 PBL을 포함한 T 세포에 의해 생성된 분석물과 비교되고, MHC-음성 대조군과 공동배양되어 TIL, MIL, 또는 PBL을 포함하는 T 세포의 하나 이상의 특성, 예컨대 암에 대한 치료법의 제조 또는 제공에 도움을 주는 효력, 정체, 또는 기타 유용한 특징을 평가할 수 있는 분석물을 생산하는 것으로 생각된다. 또한, 다시 임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, TIL 및 MIL과 같은 T 세포는 종양 부위에서 발견되거나, 또는 PBL이 종양 노출에 의해 이전에 활성화되었기 때문에, TIL, MIL, 및 PBL을 포함하는, 이러한 T 세포는 이미 활성화된 CD28 및 4-1BB에 의해 이미 교차 프라이밍 또는 프라이밍 T 세포인 것으로 생각된다.
실시양태에서, 본 발명은 배지에서 공배양된 Raji 세포 및 T 세포, 예컨대 TIL을 포함하는 효력 검정 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지에서 공배양된 Thp1 세포 및 T 세포, 예컨대 TIL을 포함하는 효력 검정 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지에서 공배양된 Ramos 세포 및 TIL과 같은 T 세포를 포함하는 효력 검정 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지에서 공배양된 U937 세포 및 T 세포, 예를 들어 TIL을 포함하는 효력 검정 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지에서 공배양된 Daudi 세포 및 T 세포, 예를 들어 TIL을 포함하는 효력 검정 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 효력 검정 조성물은 배지에서 공배양된 K562 세포 및 T 세포, 예를 들어 TIL을 포함하며, 음성 대조군으로 사용된다. 실시양태에서, 효력 검정 조성물은 배지에서 공배양된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 T 세포, 예를 들어 TIL을 포함하며, 혼합 림프구 반응(MLR) 양성 대조군으로서 사용된다. 실시양태에서, 전술한 실시양태의 TIL 및 PBMC는 동일한 환자로부터 유래된다. 실시양태에서, TIL은 Gen 2 또는 Gen 3 공정 또는 본원에 기술된 기타 제조 공정을 사용하여 제조된다. 실시양태에서, TIL은 적어도 하나의 REP 단계를 사용하여 제조된다. 실시양태에서, 효력 검정은 본원에 기술된 확장 또는 제조 공정을 사용하여 생산된 TIL, MIL 또는 PBL을 사용하여 수행된다. 실시양태에서, TIL은 미국 특허 출원 제US 2018/0282694 A1호 또는 미국 특허 제10,130,659호, 제10,166,257호, 제10,272,113호, 제10,363,273호, 제10,398,734호, 제10,420,799호, 제10,463,697호, 제10,537,595호, 제10,646,517호, 제10,653,723호, 제10,693,330호, 제10,695,372호, 제10,894,063호 및 제10,905,718호에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 각 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 미국 특허 제10,918,666호에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0277573 A1호에 기술된 공정으로 제조한 후, 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 국제 특허 출원 공개 제WO 2019/210131 A1호에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/136456 A1에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2021/123832 A1에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, MIL 및 PBL은 미국 특허 출원 공개 제US 2020/0224161 A1호에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/145711 A1에 기술된 공정으로 제조한 후 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2020/152451 A1에 기술된 공정으로 제조된 후, 본원에 기술된 효력 검정으로 테스트되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
A. 검정 방법
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 MHC 우성 인식이라고도 지칭되는 표적 세포의 HLA-펩타이드 복합체와 T 세포 또는 TIL, MIL 또는 PBL TCR 복합체의 동종이계 상호작용에 기초한 검정을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 MHC-음성 대조군과 T 세포 또는 TIL 공배양에 의해 생성되는 분석물과 비교되는, 분석물을 생성하기 위해 표적 세포와 T 세포 또는 TIL, MIL, 또는 PBL TCR 복합체의 MHC 우성 인식을 활용하는 검정을 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포에 대한 T 세포 또는 TIL, MIL, 또는 PBL TCR 복합체 결합은 그의 알파(α) 및 베타(β) 사슬을 통해 일어난다. 실시양태에서, 표적 세포는 HLA를 발현한다. 실시양태에서, 표적 세포는 B 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 B 세포 림프모구성 세포 또는 B-림프모구성 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 단핵구이다. 실시양태에서, 표적 세포는 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 표적 세포는 Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 표적 세포는 Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 표적 세포는 U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 표적 세포는 Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 표적 세포는 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 표적 세포는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 흑색종 세포이다.
실시양태에서, 본 발명은 종양 세포와 T 세포, 예를 들어 본원에 기술된 확장 또는 제조 공정을 사용하여 생성된 TIL, MIL 또는 PBL 사이에서 일어나는 동종반응성 TCR 또는 HLA 인식에 기초한 검정을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Thp1, Ramos, U937 또는 Daudi 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손과 본원에 기술된 확장 또는 제조 공정을 사용하여 생성된 T 세포, 예컨대 TIL, MIL 또는 PBL 사이에서 일어나는 동종반응성 TCR 또는 HLA 인식에 기초한 검정을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 음성 대조군과 조합된 전술한 실시양태의 사용을 포함한다. 실시양태에서, 음성 대조군은 MHC 우성 인식에 기초한 T 세포 검정과의 비교를 위해 TIL, MIL 또는 PBL과 같은 T 세포에 대한 기본 또는 기준선 활성 수준의 역할을 한다. 실시양태에서, 음성 대조군은 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 발현이 결여된 세포주이다. 실시양태에서, 음성 대조군은 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 발현이 결여된 세포주이다. 실시양태에서, 음성 대조군은 검정 변동성을 제어하기 위해 HLA 또는 MHC가 결여된 세포주이다. 실시양태에서, 음성 대조군은 MHC 우성 인식이 효력 검정의 주요 변수임을 입증하는 HLA 또는 MHC가 결여된 세포주이다.
실시양태에서, 본 발명은 K562 세포와 TIL, MIL, 또는 PBL 생성물과 같은 T 세포 생성물의 공배양에 의해 본원에 기술된 음성 대조군으로서 사용되는, K562 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손의 용도를 포함한다. 음성 대조군으로서 K562 세포의 사용은 IFN-γ에 대한 항-CD3 플레이트 검정과 같은 비드 및 플레이트-결합된 항체-자극된 생물검정, 뿐만 아니라 본원에 기술된 검정과 함께 사용될 수 있다.
실시양태에서, 본 발명은 음성 대조군으로서 표적 세포 또는 표적 세포의 조합과 함께, T 세포 생성물, 예컨대 TIL, MIL, 또는 PBL 생성물을 공배양함으로써 사용되는, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 HLA-차단 항체, 또는 이의 단편, 유도체, 변이체, 또는 변형의 용도를 포함한다. 음성 대조군으로서 HLA-차단 항체 또는 다수의 HLA-차단 항체의 사용은 본원에 기술된 검정과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술되거나 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생성된 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성이 검사된다. 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성을 검사하는 것은 임상 TIL 생성물 로트의 특성화를 가능하게 한다. 실시양태에서, TIL 효력은 선택적으로 K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시에 마커-양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 표현되는 선택 표면 마커의 발현 증가로서 정의된다. 대안적으로, Raji 세포, K562 및 TIL은 단독으로 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL 또는 MIL이 수득되는 동일한 환자로부터의 PBMC는 대조군으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 비드 기반의 CD3/CD28 자극은 또한 대조군으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드 기반의 CD3/CD28/CD137 자극은 또한 대조군으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD28에 대한 마우스 단클론 항체의 첨가는 T 세포 반응을 증폭시키기 위한 추가적인 공동자극을 보장하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 MLR 반응에 대한 양성 대조군으로서 각 TIL 로트와 공배양될 수 있다.
실시양태에서, 효력 검정은 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 및 50시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 일어난다. 실시양태에서, 효능 검정은 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간 및 32시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 일어난다.
실시양태에서, 효력 검정은 표적 세포 및 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 및 50시간으로 구성된 군 중에서 선택되는 기간 동안 일어난다. 실시양태에서, 효력 검정은 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간 및 32시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 일어난다.
실시양태에서, 효력 검정은 음성 대조군 세포 및 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 및 50시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 일어난다. 실시양태에서, 효력 검정은 공배양 단계를 포함하며, 여기서 공배양은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간 및 32시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 일어난다.
실시양태에서, 본 발명은 임상적 이점에 관한 TIL, MIL, PBL 또는 기타 T 세포 생성물의 효력을 결정하기 위한 효력 검정 방법을 포함한다. 임상적 이점은 시험관내 세포 기능의 입증, 질병 통제율, 전체 반응률, 반응 기간 또는 임상적 이점이나 잠재적인 임상적 이점에 대한 기타 과학적 척도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 방법으로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 확장되거나 조제된 TIL, MIL 및 PBL의 효력은 본원에 기술된 공배양 검정에 의해 검사된다. 확장되거나 조제된 TIL, MIL 및 PBL의 효력 검사는 TIL, MIL 또는 PBL 생성물 로트의 특성화를 허용한다. 활성화라고도 지칭되는 TIL, MIL 또는 PBL의 효력은 K562 세포와 TIL, MIL, 또는 PBL의 공배양과 비교하여, Raji 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손과 TIL, MIL, 또는 PBL의 공배양 시 마커-양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 표현되는 선택 표면 마커의 증가된 발현으로서 정의된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 Raji 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 사용하는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 Ramos 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 Daudi 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 효력을 결정하는 방법은 동종인식 검정이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 단백질의 분비 또는 발현은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 검출 방법을 사용하여 검출된다. 추가 실시양태에서, ELISA 방법은 ELLA 시스템(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 BioTechne, Inc.의 ProteinSimple 사업부에서 이용 가능), ISOPLEXIS 시스템(Isoplexis, Inc.에서 이용 가능, 미국 코네티컷주 브랜포드), 또는 LUNARIS 시스템(AYOXXA Biosystems GmbH에서 이용 가능, 독일 쾰른)과 같은 자동화 또는 로봇 시스템을 사용하여 자동화된다. 실시양태에서, 효력 검정 검출은 LUMINEX 시스템(미국 미네소타주 미네소타 소재의 BioTechne, Inc.의 R&D Systems 사업부로부터 이용 가능)과 같은 다중 검정 검출을 사용하여 수행된다. 실시양태에서, 본 발명은 유세포분석 검출 방법을 사용하는 효력 검정 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 분비된 단백질에 대한 효력 검정 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 세포 표면 또는 결합 단백질에 대한 효력 검정 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 결합 검정 검출 방법을 사용하는 효력 검정 방법을 포함한다. 실시양태에서, ELLA 시스템은 본원에 기술된 공배양 검정의 활성화 후 IFN-γ 농도를 측정하며, 여기서 공배양으로부터 수집된 상청액은 각각 다중 웰(예: 72-웰)의 상업적으로 검증된 카트리지에서 IFN-γ 생산에 대해 스크리닝된다. 실시양태에서, ELLA 자동화 시스템은 동적 범위에서 4 log의 감도를 포함하는 서브피코그램 수준의 감도로 수행된다. 실시양태에서, 전통적인 ELISA 방법에 비해, ELLA 시스템을 사용하여 절차상의 오류를 최소화함으로써 검정의 반복성 및 정밀도가 증가된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 분석물의 분비 또는 발현은 검출 방법을 사용하여 검출된다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 단백질이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 사이토카인이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 인터페론이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 IFN-α 또는 IFNα로도 지칭되는 인터페론-알파이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 IFN-β 또는 IFNβ로도 지칭되는 인터페론-알파이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 IFN-γ 또는 IFNγ로도 지칭되는 인터페론-감마이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 GzmB로도 지칭되는 그랜자임 B이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 퍼포린이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 TNF-α 또는 TNFα로도 지칭되는 종양 괴사 인자 알파이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 인터루킨이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25 또는 IL-26이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 CD25이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 CD69이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 CD137(4-1BB)이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 CD134(OX40)이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 CCL4이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 SLAM, SLAM F1 또는 신호전달 림프구 활성화 분자 1로도 알려진 CD150이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 KLRG1이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 KLRG1이다. 실시양태에서, 검출된 분석물은 분비된 MIP-1β이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 분석물의 분비 또는 발현은 검출 방법을 사용하여 검출되며, 여기서 T 세포 생성물은 TIL 생성물이고, 분석물은 CD25, CD69, CD134, CD137 및 CD150으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 동종이계 결합할 수 있는 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 MHC I 및 MHC II 발현이 결여된 세포를 포함하는 음성 대조군은 표적 세포와 T 세포 생성물(예: TIL, MIL 또는 PBL 생성물)의 공배양과 비교하기 위해 사용된다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 동종이계 결합할 수 있는 Raji 세포를 사용하여 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 MHC I 및 MHC II 발현이 결여된 K562 세포를 포함하는 음성 대조군은 Raji 세포와 TIL 생성물의 공배양과 비교하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 선택 표면 마커의 발현 증가는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 선택 표면 마커의 발현 증가는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공배양 방법으로부터의 상청액은 공배양으로부터 제거된 직후에 테스트된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 공배양 방법으로부터의 상청액은 공배양으로부터 제거된 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 또는 48시간째에 테스트된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 공배양 방법으로부터의 상청액은 공배양으로부터 제거된 후 동결되고 나중에 테스트를 위해 해동된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공배양 방법으로부터의 상청액은 IFN-γ, 그랜자임 B, TNF-α, CCL4 및/또는 MIP-1β 분비에 대해 평가된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) Raji 세포 및 K562 세포를 방사선조사하는 단계; (b) 방사선조사된 Raji 세포 및 방사선조사된 K562 세포를 TIL과 다음과 같은 하나 이상의 표적 비(50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:6.25, 1:12.5, 1:25)로, 선택적으로 작동성(agonistic) 또는 초작동성 항-CD28 항체와 함께 공배양하는 단계; (c) 단계 (b)에서 공배양된 세포로부터 상청액을 6 내지 24시간 후에 수집하는 단계; (d) 단계 (b)로부터 세포를 수확하고 T 세포 활성화의 표면 마커 발현을 측정하는 단계; 및 (e) T 세포 활성화의 마커에 대해 단계 (c)에서 수집된 공배양된 세포로부터의 상청액을 검정하는 단계를 포함하는, TIL 활성을 검정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성은 TIL의 동결보존 전에 검사된다. 일부 실시양태에서, 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성은 동결보존 후에 검사된다. 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물의 효능은 의약품에 대한 방출 테스트의 일부로 검사된다. 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물의 효력은 예를 들어 동결보존된 생성물을 해동한 후 또는 이전에 해동했거나 결코 동결되지 않은 생성물을 상이한 환경 조건 하에서 소정의 기간 동안 저장한 후 의약품에 대한 안정성 테스트의 일부로서 검사된다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 선택 표면 마커의 발현 증가는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 선택 표면 마커의 발현 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD25의 발현 증가는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현된 CD25의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD69의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현된 CD69의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD134의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현된 CD134의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD137의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD137의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD150의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 마커 양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 CD150의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 그랜자임 B의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 그랜자임 B의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 IFN-γ의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 IFN-γ의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 TNF-α의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 TNF-α의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 퍼포린의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 퍼포린의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 CCL4의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 CCL4의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 MIP-1β의 증가된 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 증가이다.
일부 실시양태에서, K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공배양 시 ELISA-검출된 분석물의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로서 발현되거나 분비된 MIP-1β의 증가된 발현은 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배의 증가이다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 그랜자임 B의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg /mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/ mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이며, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL, 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 IFN-γ의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 TNF-α의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 퍼포린의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/mL , 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 CCL4의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, Raji 세포와의 공배양 시 분비된 MIP-1β의 양은 적어도 20 pg/mL, 적어도 30 pg/mL, 적어도 40 pg/mL, 적어도 50 pg/mL, 적어도 60 pg/mL, 적어도 70 pg/mL, 적어도 80 pg/mL, 적어도 90 pg/mL, 적어도 100 pg/mL, 적어도 150 pg/mL, 적어도 200 pg/mL, 적어도 250 pg/mL, 적어도 300 pg/mL, 적어도 350 pg/mL, 적어도 400 pg/mL, 적어도 450 pg/mL, 적어도 500 pg/mL, 적어도 600 pg/mL, 적어도 700 pg/mL, 적어도 800 pg/mL, 적어도 900 pg/mL, 적어도 1000 pg/mL, 적어도 1100 pg/mL 또는 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
실시양태에서, 표적 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 비는 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 약 1:3, 약 1:3.1, 약 1:3.2, 약 1:3.3, 약 1:3.4, 약 1:3.5, 약 1:3.6, 약 1:3.7, 약 1:3.8, 약 1:3.9, 약 1:4, 약 1:4.1, 약 1:4.2, 약 1:4.3, 약 1:4.4, 약 1:4.5, 약 1:4.6, 약 1:4.7, 약 1:4.8, 약 1:4.9, 약 1:5, 약 1:5.1, 약 1:5.2, 약 1:5.3, 약 1:5.4, 약 1:5.5, 약 1:5.6, 약 1:5.7, 약 1:5.8, 약 1:5.9, 약 1:6, 약 1:6.1, 약 1:6.2, 약 1:6.25, 약 1:6.3, 약 1:6.4, 약 1:6.5, 약 1:6.6, 약 1:6.7, 약 1:6.8, 약 1:6.9, 약 1:7, 약 1:7.1, 약 1:7.2, 약 1:7.3, 약 1:7.4, 약 1:7.5, 약 1:7.6, 약 1:7.7, 약 1:7.8, 약 1:7.9, 약 1:8, 약 1:8.1, 약 1:8.2, 약 1:8.3, 약 1:8.4, 약 1:8.5, 약 1:8.6, 약 1:8.7, 약 1:8.8, 약 1:8.9, 약 1:9, 약 1:9.1, 약 1:9.2, 약 1:9.3, 약 1:9.4, 약 1:9.5, 약 1:9.6, 약 1:9.7, 약 1:9.8, 약 1:9.9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:12.5, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:45, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 또는 약 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 표적 세포 비는 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 약 1:3, 약 1:3.1, 약 1:3.2, 약 1:3.3, 약 1:3.4, 약 1:3.5, 약 1:3.6, 약 1:3.7, 약 1:3.8, 약 1:3.9, 약 1:4, 약 1:4.1, 약 1:4.2, 약 1:4.3, 약 1:4.4, 약 1:4.5, 약 1:4.6, 약 1:4.7, 약 1:4.8, 약 1:4.9, 약 1:5, 약 1:5.1, 약 1:5.2, 약 1:5.3, 약 1:5.4, 약 1:5.5, 약 1:5.6, 약 1:5.7, 약 1:5.8, 약 1:5.9, 약 1:6, 약 1:6.1, 약 1:6.2, 약 1:6.25, 약 1:6.3, 약 1:6.4, 약 1:6.5, 약 1:6.6, 약 1:6.7, 약 1:6.8, 약 1:6.9, 약 1:7, 약 1:7.1, 약 1:7.2, 약 1:7.3, 약 1:7.4, 약 1:7.5, 약 1:7.6, 약 1:7.7, 약 1:7.8, 약 1:7.9, 약 1:8, 약 1:8.1, 약 1:8.2, 약 1:8.3, 약 1:8.4, 약 1:8.5, 약 1:8.6, 약 1:8.7, 약 1:8.8, 약 1:8.9, 약 1:9, 약 1:9.1, 약 1:9.2, 약 1:9.3, 약 1:9.4, 약 1:9.5, 약 1:9.6, 약 1:9.7, 약 1:9.8, 약 1:9.9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:12.5, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:45, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90, 또는 약 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, Raji 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 비는 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 약 1:3, 약 1:3.1, 약 1:3.2, 약 1:3.3, 약 1:3.4, 약 1:3.5, 약 1:3.6, 약 1:3.7, 약 1:3.8, 약 1:3.9, 약 1:4, 약 1:4.1, 약 1:4.2, 약 1:4.3, 약 1:4.4, 약 1:4.5, 약 1:4.6, 약 1:4.7, 약 1:4.8, 약 1:4.9, 약 1:5, 약 1:5.1, 약 1:5.2, 약 1:5.3, 약 1:5.4, 약 1:5.5, 약 1:5.6, 약 1:5.7, 약 1:5.8, 약 1:5.9, 약 1:6, 약 1:6.1, 약 1:6.2, 약 1:6.25, 약 1:6.3, 약 1:6.4, 약 1:6.5, 약 1:6.6, 약 1:6.7, 약 1:6.8, 약 1:6.9, 약 1:7, 약 1:7.1, 약 1:7.2, 약 1:7.3, 약 1:7.4, 약 1:7.5, 약 1:7.6, 약 1:7.7, 약 1:7.8, 약 1:7.9, 약 1:8, 약 1:8.1, 약 1:8.2, 약 1:8.3, 약 1:8.4, 약 1:8.5, 약 1:8.6, 약 1:8.7, 약 1:8.8, 약 1:8.9, 약 1:9, 약 1:9.1, 약 1:9.2, 약 1:9.3, 약 1:9.4, 약 1:9.5, 약 1:9.6, 약 1:9.7, 약 1:9.8, 약 1:9.9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:12.5, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:45, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 또는 약 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 Raji 세포 비는 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 약 1:3, 약 1:3.1, 약 1:3.2, 약 1:3.3, 약 1:3.4, 약 1:3.5, 약 1:3.6, 약 1:3.7, 약 1:3.8, 약 1:3.9, 약 1:4, 약 1:4.1, 약 1:4.2, 약 1:4.3, 약 1:4.4, 약 1:4.5, 약 1:4.6, 약 1:4.7, 약 1:4.8, 약 1:4.9, 약 1:5, 약 1:5.1, 약 1:5.2, 약 1:5.3, 약 1:5.4, 약 1:5.5, 약 1:5.6, 약 1:5.7, 약 1:5.8, 약 1:5.9, 약 1:6, 약 1:6.1, 약 1:6.2, 약 1:6.25, 약 1:6.3, 약 1:6.4, 약 1:6.5, 약 1:6.6, 약 1:6.7, 약 1:6.8, 약 1:6.9, 약 1:7, 약 1:7.1, 약 1:7.2, 약 1:7.3, 약 1:7.4, 약 1:7.5, 약 1:7.6, 약 1:7.7, 약 1:7.8, 약 1:7.9, 약 1:8, 약 1:8.1, 약 1:8.2, 약 1:8.3, 약 1:8.4, 약 1:8.5, 약 1:8.6, 약 1:8.7, 약 1:8.8, 약 1:8.9, 약 1:9, 약 1:9.1, 약 1:9.2, 약 1:9.3, 약 1:9.4, 약 1:9.5, 약 1:9.6, 약 1:9.7, 약 1:9.8, 약 1:9.9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:12.5, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:45, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 또는 약 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 음성 대조군 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 비는 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 약 1:3, 약 1:3.1, 약 1:3.2, 약 1:3.3, 약 1:3.4, 약 1:3.5, 약 1:3.6, 약 1:3.7, 약 1:3.8, 약 1:3.9, 약 1:4, 약 1:4.1, 약 1:4.2, 약 1:4.3, 약 1:4.4, 약 1:4.5, 약 1:4.6, 약 1:4.7, 약 1:4.8, 약 1:4.9, 약 1:5, 약 1:5.1, 약 1:5.2, 약 1:5.3, 약 1:5.4, 약 1:5.5, 약 1:5.6, 약 1:5.7, 약 1:5.8, 약 1:5.9, 약 1:6, 약 1:6.1, 약 1:6.2, 약 1:6.25, 약 1:6.3, 약 1:6.4, 약 1:6.5, 약 1:6.6, 약 1:6.7, 약 1:6.8, 약 1:6.9, 약 1:7, 약 1:7.1, 약 1:7.2, 약 1:7.3, 약 1:7.4, 약 1:7.5, 약 1:7.6, 약 1:7.7, 약 1:7.8, 약 1:7.9, 약 1:8, 약 1:8.1, 약 1:8.2, 약 1:8.3, 약 1:8.4, 약 1:8.5, 약 1:8.6, 약 1:8.7, 약 1:8.8, 약 1:8.9, 약 1:9, 약 1:9.1, 약 1:9.2, 약 1:9.3, 약 1:9.4, 약 1:9.5, 약 1:9.6, 약 1:9.7, 약 1:9.8, 약 1:9.9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:12.5, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:45, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 또는 약 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 음성 대조군 세포의 비는 약 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.25, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, K562 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함)의 비는 약 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.25, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 K562 세포의 비는 약 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.25, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:12.5, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 1:100으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 표적 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함)의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 표적 세포의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, Raji 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 Raji 세포의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, 음성 대조군 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함)의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 음성 대조군 세포의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, K562 세포 대 T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함)의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, T 세포(TIL, MIL 또는 PBL 포함) 대 K562 세포의 비는 1:1과 1:2 사이, 1:2와 1:3 사이, 1:3과 1:4 사이, 1:4와 1:5 사이, 1:5와 1:6 사이, 1:6과 1:7 사이, 1:7과 1:8 사이, 1:8과 1:9 사이, 1:9와 1:10 사이, 1:10과 1:11 사이, 1:11과 1:12 사이, 1:12와 1:13 사이, 1:13과 1:14 사이, 1:14와 1:15 사이, 1:15와 1:16 사이, 1:16과 1:17 사이, 1:17과 1:18 사이, 1:18과 1:19 사이, 1:19와 1:20 사이, 1:20과 1:25 사이, 1:25와 1:30 사이, 1:30과 1:35 사이, 1:35와 1:40 사이, 1:40과 1:45 사이, 1:45와 1:50 사이, 1:50과 1:55 사이, 1:55와 1:60, 1:60과 1:70 사이, 1:70과 1:80 사이, 1:80과 1:90 사이, 또는 1:90과 1:100 사이, 또는 대안으로 1:0.5와 1:100 사이, 1:0.5와 1:50 사이, 1:0.5와 1:40 사이, 1:0.5와 1:30 사이, 1:0.5와 1:25 사이, 1:0.5와 1:20 사이, 1:0.5와 1:15 사이, 1:0.5와 1:10 사이, 1:0.5와 1:5 사이, 1:0.75와 1:50 사이, 1:0.75와 1:40 사이, 1:0.75와 1:30 사이, 1:0.75와 1:25 사이, 1:0.75와 1:20 사이, 1:0.75와 1:15 사이, 1:0.75와 1:10 사이, 1:0.75와 1:5 사이, 1:0.5와 1:2.5 사이, 1:1과 1:20 사이, 1:1과 1:10 사이, 1:1과 1:5 사이, 1:1과 1:2.5 사이; 1:2와 1:5 사이, 1:2.5와 1:5 사이, 또는 1:3과 1:5 사이이다.
실시양태에서, 표적 세포 공배양 중 TIL 대 Raji 세포의 비는 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4.5:1, 약 4:1, 약 3.5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1.5:1, 약 1:1, 약 1:1.5, 약 1:2, 약 1:2.5, 약 1:3, 약 1:3.5, 약 1:4, 약 1:4.5, 약 1:5, 약 1:6, 약 1.7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 표적 세포 공배양 중 TIL 대 K562 세포의 비는 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4.5:1, 약 4:1, 약 3.5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1.5:1, 약 1:1, 약 1:1.5, 약 1:2, 약 1:2.5, 약 1:3, 약 1:3.5, 약 1:4, 약 1:4.5, 약 1:5, 약 1:6, 약 1.7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 약 1×105 내지 10×105 TIL은 약 1×105 내지 10×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 3×105 내지 7×105 TIL은 약 1×105 내지 3×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 5×105 내지 6×105 TIL은 약 3×105 내지 7×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 4×105 TIL은 약 5×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 5×105 TIL은 약 5×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 5×105 TIL은 약 4×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 3×105 내지 7×105 TIL은 약 7×105 내지 20×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 4×105 내지 4×105 TIL은 약 10×105 내지 15×105 Raji 세포와 공배양된다. 실시양태에서, 약 5×105 TIL은 약 15×105 Raji 세포와 공배양된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) Raji 세포 및 K562 세포에 방사선조사하는 단계; (b) 방사선조사된 Raji 세포 및 방사선조사된 K562 세포를 TIL과 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 1:1, 1:6.25, 1:12.5, 및 1:25로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 비로 공배양하는 단계로서, 이러한 공배양은 선택적으로 항-CD28 항체를 사용하여 수행되는 것인 단계; (c) 6 내지 24시간 후에 단계 (b)에서 공배양된 세포로부터 상청액을 수집하는 단계; (d) 단계 (b)로부터 세포를 수확하고 T 세포 활성화의 표면 마커 발현을 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (c)에서 수집된 공배양된 세포로부터의 상청액을 T 세포 활성화 마커에 대해 검정하는 단계를 포함하는 TIL 활성을 검정하는 방법을 제공한다.
실시양태에서, 효력 검정은 TIL, MIL 또는 PBL 동결보존된 생성물을 해동하고, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 37시간, 38시간, 39시간, 40시간, 41시간, 42시간, 43시간, 44시간, 45시간, 46시간, 47시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 71시간, 72시간, 73시간, 74시간, 75시간, 76시간, 77시간, 78시간, 79시간, 80시간, 85시간, 90시간, 95시간, 100시간, 110시간, 120시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 상온 또는 냉장 온도에서 회복시키는 회복 단계를 포함한다. 실시양태에서, 효력 검정은 TIL, MIL 또는 PBL 동결보존된 생성물을 해동하고, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 및 약 96시간으로 구성된 군으로부터 선택되는 기간 동안 상온 또는 냉장 온도에서 회복시키는 회복 단계를 포함한다. 전술한 기간은 해동 과정이 완료된 후부터 또는 해동 과정의 시작부터 측정될 수 있다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함하고:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
여기서, 상기 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다. 실시양태에서, 전술한 검정은 유세포분석 검정이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, T 세포 생성물은 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물, 골수 침윤 림프구(MIL) 생성물 또는 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 여기서 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 여기서 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 여기서 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 여기서 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 여기서 음성 대조군 세포는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 발현이 결여되어 있다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 5:1 내지 1:5 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 5:1 내지 1:5 사이이고, TIL 생성 세포의 수 대 표적 세포의 수 사이의 비는 5:1 내지 1:5 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 제1 기간은 약 6시간 내지 약 48시간이고, 제2 기간은 약 6시간 내지 약 48시간이다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 제1 기간은 약 12시간, 약 18시간, 및 약 24 시간으로 구성된 군으로부터 선택되고, 제2 시간은 약 12시간, 약 18시간, 및 약 24 시간으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, T 세포 생성물 상의 하나 이상의 마커는 CD25, CD69, CD134, CD137, CD150, KLRG1, 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, T 세포 생성물로부터 분비되는 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계;
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
h. 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 T 세포 생성물을 방출시키는 단계.
여기서, T 세포 생성물은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되고, 표적 세포는 방사선조사된 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 음성 대조군 세포는 방사선조사된 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, T 세포 생성물로부터 분비되는 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, TIL 생성물로부터 분비되는 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 관찰 값의 양은 하나 이상의 분석물 각각의 대조 값의 양으로 정규화되고, 여기서 하나 이상의 분석물 각각에서 대조 값에 비해 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배로 구성된 군으로부터 선택된다.
임의의 전술한 실시양태에서, 종양 분해는 본원에 기술되거나 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 임의의 전술한 실시양태에서, 종양 분해는 국제 특허 공개 번호 WO 2021/123832 A1에 기술된 방법에 따라 또는 조성물 또는 장치를 사용하여 수행되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 확장된 TIL 및 다른 다클론 T 세포 생성물, 예를 들어 MIL 및 PBL의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위해 TIL 다기능성 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 이는 그 다음 평가된 TIL, MIL, PBL 또는 기타 다클론성 T 세포 생성물을 투여하여 암을 치료하는 데 사용될 수 있고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 2개 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음의 추가 단계를 포함한다:
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 2개 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, TIL 생성물로부터 분비되는 2개 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 관찰 값의 양은 2개 이상의 분석물 각각의 대조 값의 양으로 정규화되고, 여기서 2개 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값에 비해 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 및 적어도 10배로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 확장된 TIL 및 다른 다클론 T 세포 생성물, 예를 들어 MIL 및 PBL의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위해 TIL 다기능성 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 이는 그 다음 평가된 TIL, MIL, PBL 또는 기타 다클론성 T 세포 생성물을 투여하여 암을 치료하는 데 사용될 수 있고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 3개 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음의 추가 단계를 포함한다:
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 3개 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, TIL 생성물로부터 분비된 3개 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 관찰 값의 양은 3개 이상의 분석물 각각의 대조 값의 양으로 정규화되고, 여기서 3개 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값에 비해 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 및 적어도 10배로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 확장된 TIL 및 다른 다클론 T 세포 생성물, 예를 들어 MIL 및 PBL의 효력 및/또는 기능성을 평가하기 위해 TIL 다기능성 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 이는 그 다음 평가된 TIL, MIL, PBL 또는 기타 다클론성 T 세포 생성물을 투여하여 암을 치료하는 데 사용될 수 있고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 복수의 표적 세포와 복수의 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음의 추가 단계를 포함한다:
d. 복수의 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, TIL 생성물로부터 분비되는 하나 이상의 분석물은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 관찰 값의 양은 하나 이상의 분석물 각각의 대조 값의 양으로 정규화되고, 여기서 하나 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값에 비해 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 및 적어도 10배로 구성되는 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 전술한 방법을 포함하고, 여기서 표적 세포는 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포, Daudi 세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 2종 이상의 세포주의 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포는 2종 이상의 세포주의 1:1 조합이다. 실시양태에서, 표적 세포는 2종 이상의 세포주의 1:1 조합이고, 여기서 2종 이상의 세포주는 상이하고 각각 독립적으로 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포 및 Daudi 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 3종 이상의 세포주의 1:1:1 조합이고, 여기서 3종 이상의 세포주는 상이하고 각각 독립적으로 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포 및 Daudi 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 4종 이상의 세포주의 1:1:1:1 조합이고, 여기서 4종 이상의 세포주는 상이하고 각각 독립적으로 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포 및 Daudi 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 2종 이상의 세포주의 1:1:1:1:1 조합이고, 여기서 2종 이상의 세포주는 상이하고 각각 독립적으로 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포 및 Daudi 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포와 Thp1 세포의 조합이고, 여기서 Raji 세포 대 Thp1 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포와 Ramos 세포의 조합이고, 여기서 Raji 세포 대 Ramos 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포와 U937 세포의 조합이고, 여기서 Raji 세포 대 U937 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 표적 세포는 Raji 세포와 Daudi 세포의 조합이고, 여기서 Raji 세포 대 Daudi 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 공배양이 세포 배양 배지를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 공배양이 CM1 배지를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 공배양이 Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)에서 상업적으로 입수 가능한, AIM V 배지라고도 지칭되는 AIM-V 배지(L-글루타민, 50μM 스트렙토마이신 설페이트 및 10μM 젠타마이신 설페이트)를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 공배양 및 제2 공배양이 세포 배양 배지를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 공배양 및 제2 공배양이 각각 CM1 배지를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 공배양 및 제2 공배양이 각각 AIM-V 배지를 포함하는 전술한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 공배양은 IL-2를 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 50 IU/mL 내지 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 공배양은 IL-2를 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 공배양은 IL-2를 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 200 IU/mL 내지 400 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 공배양은 IL-2를 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군 중에서 선택되는 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
여기서, IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양에서 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군으로부터 선택되는 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계;
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군으로부터 선택되는 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
여기서, IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양에서 약 50 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계;
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 약 50 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 여기서 사멸 검정이 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 여기서 사멸 검정이 사용되고, 여기서 세포 용해 엔드포인트가 검출된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 여기서 사멸 검정이 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 활성을 검정하는 방법을 제공하며, 여기서 사멸 검정이 사용되고, 세포 용해 엔드포인트는 용해 시 형광, 화학발광 또는 생물발광을 발현하는 표적 세포주의 유전자 변형을 통해 검출된다. 적합한 유전자 변형 및 검정으로는 미국 특허 제9,631,225호에 기술된 것과 같은 루시퍼라제 검정이 포함되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에서 생물발광 검출에 대해 기술된 유전자 변형 접근법은 표적 세포, 예를 들어 Raji 세포, K562 세포, Daudi 세포, Ramos 세포, U937 세포 또는 Thp1 세포의 변형에 이용될 수 있다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 방법은 증식을 저지하기 위해 표적 세포를 사전-방사선조사하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 증식을 저지하기 위해 방사선조사되지 않은 표적 세포의 사용을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 증식을 저지하기 위해 표적 세포를 화학적으로 또는 생물학적으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 증식을 저지하기 위해 음성 대조군 세포를 사전-방사선처리하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 증식을 저지하기 위해 방사선조사되지 않은 음성 대조군 세포의 사용을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 증식을 저지하기 위해 음성 대조군 세포를 화학적으로 또는 생물학적으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에서, 표적 세포는 X선 또는 감마선을 사용하여 약 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy, 60 Gy. 65 Gy, 70 Gy, 75 Gy, 80 Gy, 85 Gy, 90 Gy, 95 Gy, 100 Gy, 105 Gy, 110 Gy, 115 Gy, 120 Gy, 125 Gy, 130 Gy, 135 Gy, 140 Gy, 145 Gy, 150 Gy, 155 Gy, 160 Gy, 165 Gy, 170 Gy, 175 Gy, 180 Gy, 185 Gy, 190 Gy 또는 200 Gy의 방사선 총 흡수 선량으로 방사선조사된다.
실시양태에서, 표적 세포는 X-선 또는 감마선을 사용하여 약 100 rad, 200 rad, 300 rad, 400 rad, 500 rad, 600 rad, 700 rad, 800 rad, 900 rad, 1000 rad, 1100 rad, 1200 rad, 1300 rad, 1400 rad, 1500 rad, 1600 rad, 1700 rad, 1800 rad, 1900 rad, 2000 rad, 2100 rad, 2200 rad, 2300 rad, 2400 rad, 2500 rad, 2600 rad, 2700 rad, 2800 rad, 2900 rad, 3000 rad, 3100 rad, 3200 rad, 3300 rad, 3400 rad, 3500 rad, 3600 rad, 3700 rad, 3800 rad, 3900 rad, 4000 rad, 4100 rad, 4200 rad, 4300 rad, 4400 rad, 4500 rad, 4600 rad, 4700 rad, 4800 rad, 4900 rad, 5000 rad, 5100 rad, 5200 rad, 5300 rad, 5400 rad, 5500 rad, 5600 rad, 5700 rad, 5800rad, 5900 rad, 6000 rad, 6100 rad, 6200 rad, 6300 rad, 6400 rad, 6500 rad, 6600 rad, 6700 rad, 6800 rad, 6900 rad, 7000 rad, 7500 rad, 8000 rad, 8500 rad, 9000 rad, 9500 rad 또는 10000 rad의 방사선 총 흡수 선량으로 방사선조사된다.
실시양태에서, 표적 세포는 X선 또는 감마선을 사용하여 약 20 rad/min, 40 rad/min, 60 rad/min, 80 rad/min, 100 rad/min, 120 rad/min, 140 rad/min, 160 rad/min, 180 rad/min, 200 rad/min, 220 rad/min, 240 rad/min, 260 rad/min, 280 rad/min, 300 rad/min, 320 rad/min, 340 rad/min, 360 rad/min, 380 rad/min, 400 rad/min, 420 rad/min, 440 rad/min, 460 rad/min, 480 rad/min, 500 rad/min, 520 rad/min, 540 rad/min, 560 rad/min, 580 rad/min, 600 rad/min, 620 rad/min, 640 rad/min, 660 rad/min, 680 rad/min, 또는 700 rad/min의 방사선 총 흡수 선량의 속도로 방사선조사된다. 실시양태에서, 표적 세포는 약 50 rad/min, 100 rad/min, 150 rad/min, 200 rad/min, 250 rad/min, 300 rad/min, 350 rad/min, 400 rad/min, 450 rad/min, 500 rad/min, 550 rad/min, 600 rad/min, 650 rad/min, 700 rad/min, 750 rad/min, 800 rad/min, 850 rad/min, 900 rad/min, 950 rad/min, 1000 rad/min, 1050 rad/min, 1100 rad/min, 1150 rad/min, 1200 rad/min, 1250 rad/min, 1300 rad/min, 1350 rad/min, 1400 rad/min, 1450 rad/min, 1500 rad/min, 1550 rad/min, 1600 rad/min, 1650 rad/min, 1700 rad/min, 1750 rad/min, 1800 rad/min, 1850 rad/min, 1900 rad/min, 1950 rad/min 또는 2000 rad/min의 방사선 총 흡수 선량의 속도로 방사선조사된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 T 세포 생성물의 효력을 결정하기 위해 혼합 종양 동종반응성 검정 방법 개시내용를 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. T 세포 생성 세포와 혼합 종양 동종반응성 세포주의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
여기서, IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양에서 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군으로부터 선택되는 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. T 세포 생성 세포와 혼합 종양 동종반응성 세포주의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계로서, 여기서 혼합 종양 동종반응성 세포주는 혼합 종양 세포주인, 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계;
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군으로부터 선택되는 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 혼합 종양 동종반응성 세포주와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
여기서, IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양에서 약 50 IU/mL 내지 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 혼합 종양 동종반응성 세포주와 T 세포 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 관찰값을 수득하여 T 세포 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계;
d. 음성 대조군 세포와 T 세포 생성 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하는 단계;
f. 제2 수확물을 (1) T 세포 생성 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) T 세포 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, T 세포 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계.
여기서, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 약 50 IU/mL 내지 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다.
실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 HLA 다양성을 위해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 이형접합성에 대해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 면역원성에 대해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 HLA-A2 면역원성에 대해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA 특성에 기초하여 선택되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2) 또는 이들의 조합을 발현하는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 동종이계 HLA-TCR 상호작용에 대해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 최대 비항원 특이적 HLA-TCR 상호작용에 대해 최적화되는 효력 검정을 수행하는 방법을 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 효력 검정을 수행하는 방법을 포함하며, 여기서 바이알 또는 웰당 TIL 및 표적 세포의 총 수는 대략 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 1.5×106, 2×106, 2.5×106, 3×106, 3.5×106, 4×106, 4.5×106, 또는 5×106이다. 실시양태에서, 바이알 또는 웰은 약 0.5 mL, 1 mL, 1.5 mL, 2 mL, 2.5 mL, 3 mL, 3.5 mL, 4 mL, 4.5 mL 또는 5 mL의 부피를 갖는다.
일부 실시양태에서, HLA-I 차단 항체는 약 0.1 μg/mL, 약 0.2 μg/mL, 약 0.3 μg/mL, 약 0.4 μg/mL, 약 0.5 μg/mL, 약 0.6 μg/mL, 약 0.7 μg/mL, 약 0.8 μg/mL, 약 0.9 μg/mL, 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 3 μg/mL, 약 4 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 6 μg/mL, 약 7 μg/mL, 약 8 μg/mL, 약 9 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 11 μg/mL, 약 12 μg/mL, 약 13 μg/mL, 약 14 μg/mL, 약 15 μg/mL, 약 16 μg/mL, 약 17 μg/mL, 약 18 μg/mL, 약 19 μg/mL, 약 20 μg/mL, 약 21 μg/mL, 약 22 μg/mL, 약 23 μg/mL, 약 24 μg/mL, 약 25 μg/mL, 약 26 μg/mL, 약 27 μg/mL, 약 28 μg/mL, 약 29 μg/mL, 약 30 μg/mL, 약 35 μg/mL, 약 40 μg/mL, 약 45 μg/mL, 또는 약 50 μg/mL의 농도로 음성 대조군으로서 사용된다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-I 차단 항체는 Biolegend, Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수 가능한 클론 W6/32(항-HLA-ABC)이다.
일부 실시양태에서, HLA-II 차단 항체는 약 0.1 μg/mL, 약 0.2 μg/mL, 약 0.3 μg/mL, 약 0.4 μg/mL, 약 0.5 μg/mL, 약 0.6 μg/mL, 약 0.7 μg/mL, 약 0.8 μg/mL, 약 0.9 μg/mL, 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 3 μg/mL, 약 4 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 6 μg/mL, 약 7 μg/mL, 약 8 μg/mL, 약 9 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 11 μg/mL, 약 12 μg/mL, 약 13 μg/mL, 약 14 μg/mL, 약 15 μg/mL, 약 16 μg/mL, 약 17 μg/mL, 약 18 μg/mL, 약 19 μg/mL, 약 20 μg/mL, 약 21 μg/mL, 약 22 μg/mL, 약 23 μg/mL, 약 24 μg/mL, 약 25 μg/mL, 약 26 μg/mL, 약 27 μg/mL, 약 28 μg/mL, 약 29 μg/mL, 약 30 μg/mL, 약 35 μg/mL, 약 40 μg/mL, 약 45 μg/mL, 또는 약 50μg/mL의 농도로 음성 대조군으로 사용된다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-II 차단 항체는 BD Biosciences, Inc.(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로부터 입수 가능한 클론 TU39(HLA-DR, DP, DQ)이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 3:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 3:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL이고, 전술한 방법은 사이토카인에 대한 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다. 실시양태에서, 전술한 검정은 유세포분석 검정이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 3:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 2×106/mL이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 3:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 2×106/mL이고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다. 실시양태에서, 전술한 검정은 유세포분석 검정이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 1:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL이고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다. 실시양태에서, 전술한 검정은 유세포분석 검정이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 약 1:1이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 2×106/mL이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원(HLA) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 단핵구 세포이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA 차단 항체는 HLA-I 차단 항체, HLA-II 차단 항체, 및 이의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원(HLA) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA 차단 항체는 HLA-I 차단 항체, HLA-II 차단 항체, 및 이의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원(HLA) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA 차단 항체는 HLA-I 차단 항체, HLA-II 차단 항체, 및 이의 조합으로 구성된 군 중에서 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이고, TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물은 인터페론-γ를 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하거나 상청액을 추출하는 단계; 및
c. (1) 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. (1) 제2 수확물을 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 또는 (2) 제2 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각 관찰 값은 이의 상응하는 대조 값과 비교되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이며, TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물은 인터페론-γ이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 생성물로부터의 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 상청액을 평가하여 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 생성물로부터의 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 제2 상청액을 평가하여 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 관찰값을 단계 f로부터의 대조값과 비교하는 단계로서, 여기서 배수 향상이 계산되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 생성물로부터의 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 상청액을 평가하여 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 생성물로부터의 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 제2 상청액을 평가하여 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 관찰값을 단계 f로부터의 대조값과 비교하는 단계로서, 여기서 배수 향상이 계산되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양에서 총 세포는 약 0.5×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 생성물로부터의 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 상청액을 평가하여 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 생성물로부터의 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 제2 상청액을 평가하여 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 관찰값을 단계 f로부터의 대조값과 비교하는 단계로서, 여기서 배수 향상이 계산되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지되고, 공배양 및 제2 공배양은 AIM-V 배지를 사용하여 수행된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 생성물로부터의 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 상청액을 평가하여 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 생성물로부터의 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 제2 상청액을 평가하여 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 관찰값을 단계 f로부터의 대조값과 비교하는 단계로서, 여기서 배수 향상이 계산되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지되고, 공배양 및 제2 공배양은 AIM-V 배지를 사용하여 수행된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 표적 세포와 TIL 생성물로부터의 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 상청액을 평가하여 관찰값을 수득하는 단계,
d. 인간 백혈구 항원 클래스 I(HLA-I) 차단 항체 및 인간 백혈구 항원 클래스 II(HLA-II) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군과 TIL 생성물로부터의 TIL 세포 및 표적 세포의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 이러한 제2 기간은 선택적으로 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
e. 제2 공배양으로부터 제2 상청액을 추출하는 단계;
f. TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 제2 상청액을 평가하여 대조 값을 수득하는 단계; 및
g. 단계 c로부터의 관찰값을 단계 f로부터의 대조값과 비교하는 단계로서, 여기서 배수 향상이 계산되어, TIL 생성물의 효력을 결정하는 것인, 단계
를 포함하고,
여기서, TIL 대 표적 세포의 비는 3:1 내지 1:1 사이이고, 표적 세포는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 단계 (a)의 공배양 및 단계 (d)의 제2 공배양에서 총 세포는 약 1×106/mL 내지 3×106/mL 사이이고, HLA-I 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이이고, HLA-II 차단 항체의 농도는 5 μg/mL 내지 10 μg/mL 사이이고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 및 제2 공배양 각각에서 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지되고, 공배양 및 제2 공배양은 AIM-V 배지를 사용하여 수행되고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다. 실시양태에서, 전술한 검정은 유세포분석 검정이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포주는 마스터 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 표적 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포주 또는 이들의 조합은 마스터 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포주 또는 이의 조합의 제공자 또는 제공자들에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 음성 대조군 세포주는 마스터 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 음성 대조군 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, K562 세포주는 마스터 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 K562 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 세포주는 제조용(working) 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 표적 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포주 또는 이들의 조합은 제조용 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포주 또는 이의 조합의 제공자 또는 제공자들에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 음성 대조군 세포주는 제조용 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 음성 대조군 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, K562 세포주는 제조용 세포 뱅크로부터 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 또는 10회 이하로 계대되어 제조된다. 전술한 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 총 계대 횟수는 K562 세포주의 제공자에 의해 보고된 계대 횟수와 비교하여 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 음성 대조군 세포주는 표적 세포주가 TIL 세포주와 함께 포함되지 않는다는 것을 제외하고는, 표적 세포주(예컨대, 단핵세포 세포주, 또는 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포주)와의 공배양에 사용된 조건 하에서 배양 후 단백질(예컨대, IFN-γ 또는 그랜자임 B)의 분비 또는 발현에 대해 테스트된 TIL 세포주이다. 이러한 음성 대조 실험은 일부 경우에 "TIL 단독" 대조 실험으로 본원에서 지칭된다. 배수 향상 및 평행 선 분석(parallel line assay) 계산은 TIL 단독 음성 대조 실험과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, TIL 라인의 공배양은 단핵구 표적 세포주와 함께 본원에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 동일한 조건에서 동시에 실행되는 별도의 실험에서 TIL 라인이 단독으로 배양될 수 있다. 그런 다음 두 실험 모두 IFN-γ 발현에 대해 분석하고 배수 향상을 계산하기 위해 비교되거나 평행 선 분석 기울기 또는 기타 분석 기준의 계산에 사용될 수 있다.
전술한 실시양태 중 일부에서, 양성 대조군 TIL 세포주도 포함되며, 이는 본원에 기술된 방법(예를 들어, 관련된 전술한 실시양태의 단계 (a) 내지 (c))을 사용하여 측정되어, 실험간, 일간, 분석가간 또는 실험실간 기반으로 재현성을 보장한다.
일부 실시양태에서, 전술한 방법은 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 데이터 분석 단계는 본원의 다른 곳에서 상세히 설명된 바와 같이 배수 향상 계산이다. 일부 실시양태에서, 데이터 분석 단계는 본원의 다른 곳에서 상세히 기술된 평행 선 분석 계산이다. 통계 분석 및 통과/실패 방출 또는 안정성 결정에 대한 평행 선 분석 접근법은, 예를 들어 용량 반응을 결정하기 위한 단일 TIL 로트 농도에 대한 2개, 3개, 4개, 또는 5개 표적 세포 농도의 측정 및 1개 또는 2개의 이상치(outlier)의 선택적 제거와 함께(예를 들어, 1개의 이상치가 제거되는 4개의 표적 세포 농도), 임의의 전술한 검정 실시양태와 함께 사용될 수 있다. 평행 선 분석은 또한 문헌[USP Chapter <1032> Design and Development of Biological Assays. USP Pharmacopeial Convention: 매릴랜드주 록빌, 2013; USP Chapter <111> Design and Analysis of Biological Assays. US Pharmacopeial Convention: 매릴랜드주 록빌, 2014; USP Chapter <1033> Biological Assay Validation. USP Pharmacopeial Convention: 매릴랜드주 록빌, 2013; USP Chapter <1034> Analysis of Biological Assays. US Pharmacopeial Convention: 매릴랜드주 록빌, 2013; Hauck, 등, PDA J. Pharma. Sci. Technol. 2005, 59(2), 127-137; Callahan and Sajjadi, BioProcessing J. 2003, 2(2), 71-77; Findlay, 등, J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 21, 1249- 1273; and Gottschalk and Dunn, J. Biopharm. Stat. 2005, 15(3), 437-463; 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 전술한 방법은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 USP <1032> Design and Development of Biological Assays에 따라 수행되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 각각의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 USP <1032> Design and Development of Biological Assays 및 USP <1033> Biological Assay Validation에 따라 데이터가 로그 변환되는 데이터 분석 단계와 함께 사용되어, 효력 범위 전반에 걸친 측정에서 대칭성, 정규 분포 및 변동성의 균질성에 대한 요구 사항을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 USP <1034> Analysis of Biological Assays에 기술된 바와 같이 이상치가 평가되고 분석에서 생략되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 곡선의 포화로 인해 최고 또는 최저 농도가 은폐된(필요한 경우), 4점 용량 곡선을 따라 선형 회귀를 수행하는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 적어도 3개 및 바람직하게는 4개의 인접[용량-] 농도가 사용되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 선형 절편의 기울기가 충분히 가파른 것이 요구되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 표준 샘플 및 테스트 샘플에 대한 선 맞춤(fit)이 직선이고 선이 평행인 것을 요구하는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 USP <1032> Design and Development of Biological Assays에 따라 TIL 테스트 물품과 기준 표준물질 사이에 평행선 분석이 수행되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 평행성에 의해 측정된 기준 표준물질과 TIL 테스트 물품 사이의 통계적 유사성이 기준 표준물질에 대한 TIL 테스트 물품의 생물학적 유사성을 입증하는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 평행성 기울기 비, 직선성 비, 회귀(R2) 및 RMSE(평균 제곱근 오차)가 계산되고 보고되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 USP <1033> Biological Assay Validation에 따라 평행성 및 직선성의 검정 적합성 및 타당성을 순위화하고, 한계 내에서 타당성 기준을 "통과" 또는 "실패"로 결정하는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 전술한 방법은 공차의 퍼센트 범위로서 95% 신뢰 구간 내에서 상대 효력이 "보고가능" 또는 "비결정적"으로 결정되는 데이터 분석 단계와 함께 사용된다. 이론에 얽매이지 않지만, USP <1032> Design and Development of Biological Assays에 따르면 상대 효력은 절대값에서 파생되는 효력보다 바람직한데, 이는 생물학적 샘플에 내재된 변동성 및 시간 경과에 따른 세포 거동의 영향을 없앤 교정자(calibrator)이기 때문이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력을 결정하기 위한 전술한 방법 중 하나를 포함하고, 효력 검정(또는 효력 및 정체 검정) 매트릭스를 형성하기 위해 다른 효력 검정 및/또는 동일성 검정과 함께 전술한 방법 중 하나의 사용을 추가로 포함한다. 이러한 매트릭스는 TIL, MIL 또는 PBL 생성물의 효력(또는 효력 및 정체)을 결정하기 위한 다수의 단계를 포함한다. 효력 검정 매트릭스는 미국 식품의약국(FDA)의 Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products, 2011, 76 Fed. Reg. 9028에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 하나의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 2개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 3개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 4개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 5개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 6개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 7개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 8개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 9개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 10개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용하는 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 11개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 표적 세포를 사용한 동종이계 공배양 검정과 같은 동종이계 공배양 검정, 뿐만 아니라 적어도 12개의 추가 검정을 포함하는 매트릭스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에는 IFN-γ, 그랜자임 B 또는 TNF-α의 수준이 항-CD3, 항-CD28 및/또는 항-CD137 항체에 의한 자극을 포함하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 자극 방법에 의해 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 상이한 메커니즘을 통해 TIL, MIL 또는 PBL 활성화를 검출하고 TIL, MIL 또는 PBL 치료 생성물의 기능성 또는 활성에 대해 추가로 보고한다는 점에서 본원에 기술된 동종이계 공배양 검정과 직교성이다. 이러한 방법은 단독으로 또는 본원에 기술된 동종이계 공배양 검정과 조합으로, 본원에 기술된 효력 검정 매트릭스에 포함될 수 있다. 적합한 비드 및 플레이트 기반 방법은 각각의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제 10,130,659호; 제11,083,752호; 제10,918,666호; 제11,168,303호; 및 제11,026,974호 및 미국 특허 출원 공개 제US 2019/0276802 A1호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TCM 세포의 수 또는 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TEM 세포의 수 또는 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TSCM 세포의 수 또는 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TEMRA 세포의 수 또는 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD45RA-CCR7- 발현 세포의 백분율을 통해 TEM 세포의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD45RA-CCR7-의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD45RA-CCR7+ 발현 세포의 백분율을 통해 TCM 세포의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD45RA-CCR7+의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 총 TEM 및 TCM 세포 집단이 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과 또는 10×109 세포 초과인 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD8의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행된 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행된 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에 기술된 동종반응성 공배양 검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD8의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD8의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD8의 발현은 2% 초과, 3% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD4의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD8의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD4의 발현은 2% 초과, 3% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD4 및 CD8 둘 모두의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4 및 CD8 둘 모두의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4 및 CD8 둘 모두의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4 및 CD8 둘 모두의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4 및 CD8 둘 모두의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD4 및 CD8 둘 모두의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD4 및 CD8의 발현은 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 단일 양성 CD4, 단일 양성 CD8 및 이중 양성 하위세트를 포함하는 총 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단은 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 LAG3의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, LAG3의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 LAG3의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 LAG3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 LAG3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 LAG3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 LAG3의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 LAG3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 LAG3의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 LAG3+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 LAG3+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 KLRG1의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, KLRG1의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 KLRG1의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 KLRG1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 KLRG1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 KLRG1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 KLRG1의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 KLRG1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 KLRG1의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 KLRG1+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 KLRG1+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD101의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD101의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD101의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD101의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD101의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD101의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD101의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD101의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD101의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD101+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD101+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD69의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD69의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD69의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD69의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD69의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD69의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD69의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD69의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD69의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD69+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD69+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 PD-1의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 PD-1의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 PD-1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 PD-1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 PD-1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 PD-1의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 PD-1의 측정에 의해 결정되며, 여기서 PD-1의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 PD-1+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 PD-1+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIM3의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIM3의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIM3의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIM3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIM3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIM3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIM3의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIM3의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIM3의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 TIM3+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIM3+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD25의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD25의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD25의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD25의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD25의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD25의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD25의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD25의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD25의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD25+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD25+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD27의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD27의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD27의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD27의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD27의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD27의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD27의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD27의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD27의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD27+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD27+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD28의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD28의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD28의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD28의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD28의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD28의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD28의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD28의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD28+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD28+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD56의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD56의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD56의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD56의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD56의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD56의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD56의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD56의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD56의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD56+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD56+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD57의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD57의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD57의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD57의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD57의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD57의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD57의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CD57의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD57의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CD57+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CD57+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CTLA-4의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CTLA-4의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CTLA-4의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CTLA-4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CTLA-4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CTLA-4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CTLA-4의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 CTLA-4의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CTLA-4의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 CTLA-4+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 CTLA-4+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIGIT의 발현 백분율이 측정되는 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT의 측정은 유세포분석에 의한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIGIT의 측정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIGIT의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIGIT의 측정에 의해 결정되며, 여기서 측정은 검정 매트릭스에 따라 수행되는 일련의 측정의 일부이고, 추가로 검정 매트릭스는 본원의 다른 곳에서 기술된 동종반응성 공배양 검정도 포함한다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIGIT의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIGIT의 발현은 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 35% 미만, 40% 미만, 45% 미만, 50% 미만, 55% 미만, 60% 미만, 65% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 유세포분석에 의한 TIGIT의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIGIT의 발현은 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 CD3+ 세포 또는 TCRαβ-양성 세포에서 검출된다. 일부 실시양태에서, TIL, MIL, 또는 PBL 생성물 효력은 TIGIT+ 세포의 총 수의 측정에 의해 결정되며, 여기서 TIGIT+ 세포의 총 수는 50×106 초과, 100×106 초과, 150×106 초과, 200×106 초과, 250×106 초과, 300×106 초과, 350×106 초과, 400×106 초과, 450×106 초과, 500×106 초과, 550×106 초과, 600×106 초과, 650×106 초과, 700×106 초과, 750×106 초과, 800×106 초과, 850×106 초과, 900×106 초과, 950×106 초과, 1×109 초과, 1.5×109 초과, 2.0×109 초과, 2.5×109 초과, 3.0×109 초과, 3.5×109 초과, 4.0×109 초과, 5.0×109 초과, 6.0×109 초과, 7.0×109 초과, 8.0×109 초과, 9.0×109 초과, 또는 10×109 세포 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은, FoxP3+ 세포에 대한 세포내 염색 유세포분석 검정에 의한 것을 포함하는, Treg 세포의 함량이 측정되는 검정을 포함하는 효력 또는 정체 검정 매트릭스를 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적 세포를 사용하여 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 적어도 하나의 다른 효력 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스에 사용된다. 실시양태에서, 본 발명은 MHC 우성 인식이라고도 지칭되는, 표적 세포의 HLA-펩타이드 복합체와 T 세포 또는 TIL, MIL, 또는 PBL TCR 복합체의 동종이계 상호작용을 기초로 하는 검정을 포함하여, 여기서 검정은 적어도 하나의 다른 효력 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스에 사용된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 단핵구 계통 세포이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 적어도 3개의 상이한 표적 세포 농도를 사용하여 약 24시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Thp1 세포 또는 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 4개의 공배양을 4개의 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
d. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 4개의 공배양을 4개의 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
e. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
f. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정되고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용된다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 4개의 공배양을 4개의 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정되고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 전술한 방법이 사이토카인에 대한 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 4개의 공배양을 4개의 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정되고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 전술한 방법이 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 4개의 공배양을 4개의 상이한 표적 세포 농도에서 약 24시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 Raji, Ramos, Daudi, U937, 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정되고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법이 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성물로부터의 TIL 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
c. 상청액을 TIL 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고, 단핵구 계통 세포이고, 상대 효력은 단계 a 내지 c를 반복하는 별도의 일련의 실험에서 TIL 기준 표준물질을 사용한 평행선 분석에 의해 결정되고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법이 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 또는 TIL 생성 세포 농도에서 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 또는 TIL 기준 표준 세포 농도에서 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 사이토카인에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 단핵구 계통 세포이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 사이토카인에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 단핵구 계통 세포이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 사이토카인에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 단핵구 계통 세포이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 단핵구 계통 세포이고, 전술한 방법은 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 다수의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 전술한 방법은 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 12 내지 48 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 전술한 방법은 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 전술한 방법은 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법이 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 이들 각각이 적어도 2개의 복제물에 의해 수행되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 이들 각각이 적어도 2개의 복제물에 의해 수행되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 3개의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하고, 이 방법은
a. TIL 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
b. TIL 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3개의 공배양을 상이한 표적 세포 농도에서 약 24 시간의 기간 동안 수행하는 단계;
c. 각각의 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
d. 상청액을 TIL 생성 세포 및 TIL 기준 표준 세포로부터 분비된 인터페론-γ에 대해 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 용량-농도를 수득하는 단계
를 포함하고,
여기서 표적 세포는 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 4개의 표적 세포 용량 농도인 웰당 4×105, 2×105, 1×105 및 0.5×105 세포 및 단일 TIL 세포 농도인 웰당 1.5×106 TIL이 사용되고, 이들 각각이 적어도 2개의 복제물에 의해 수행되고, 1개의 이상치 용량-농도가 폐기될 수 있고, 전술한 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군 중에서 선택되는 적어도 5개의 다른 검정을 포함하는 효력 검정 매트릭스의 구성요소이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다채널 및 다색 유세포 분석기를 포함하는 유세포 분석기를 사용하여 유세포분석을 수행하는 단계를 포함한다. 적합한 유세포 분석기 및 방법은 미국 특허 제9,645,010호; 제10,816,550호; 제10,137,479호; 제9,453,791호; 제10,935,482호; 제10,648,900호; 제9,341,562호; 제9,677,989호; 제4,710,635호; 제4,662,742호; 제4,660,971호; 제4,818,103호; 제5,057,413호; 제5,641,457호; 제5,620,842호; 제5,985,216호; 제6,079,836호; 제6,495,333호; 제6,256,096호; 제6,482,652호; 제6,700,130호; 제7,855,078호; 제7,990,525호; 및 제10,436,698호; 및 미국 특허 출원 공개 제US 2001/0006416 A1호 및 제US 2002/0186375 A1호를 포함하는 관련 기술분야에 기술되어 있고, 이들의 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 전술한 유세포분석 방법은 본원에 기술된 바와 같은 동종이계 공배양 검정과 조합된다. 일부 실시양태에서, 전술한 유세포분석 방법은 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 ELISA 기반 방법에 의해 인터페론-γ, 그랜자임 B 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 또는 플레이트 기반 검정과 조합된다.
일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 40℃의 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 35℃의 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 37℃의 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 5% CO2 가스가 있는 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 10% CO2 가스가 있는 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 15% CO2 가스가 있는 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 약 20% CO2 가스가 있는 인큐베이터에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 전술한 공배양은 가습되는 인큐베이터에서 수행된다.
B. 검정 조성물
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 표적 세포를 배지에 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 표적 세포는 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 음성 대조군 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 배지에 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 음성 대조군 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL 및 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 음성 대조군 세포는 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 공배양 검정으로부터 수득되는 상청액을 포함하고, 선택적으로 분비된 단백질을 함유하는 조성물을 함유한다.
실시양태에서, 본 발명은 배지(예컨대, AIM-V 배지), Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는. 공배양 동안 50 IU/mL 내지 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 200 IU/mL 내지 400 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, Raji 세포주, Thp1 세포주, Ramos 세포주, U937 세포주, Daudi 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군 중에서 선택되는 농도의 IL-2를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 표적 세포는 Raji 세포와 Thp1 세포의 조합이고, Raji 세포 대 Thp1 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 표적 세포는 Raji 세포와 Ramos 세포의 조합이고, Raji 세포 대 Ramos 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 표적 세포는 Raji 세포와 U937 세포의 조합이고, Raji 세포 대 U937 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 표적 세포는 Raji 세포와 Daudi 세포의 조합이고, Raji 세포 대 Daudi 세포의 비는 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 및 1:5로 구성된 군 중에서 선택된다.
실시양태에서, 본 발명은 배지(예컨대, AIM-V 배지), B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 50 IU/mL 내지 1000 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 IL-2를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 IL-2는 공배양 동안 연속적으로 첨가되고, IL-2는 공배양 동안 200 IU/mL 내지 400 IU/mL 사이의 농도로 유지된다. 실시양태에서, 본 발명은 AIM-V 배지, B 세포주, B 세포 림프모구성 세포주, 버킷 림프종 세포주, 골수 계통 세포주, 단핵구 세포주, 급성 단핵구 백혈병 세포, M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포, 멜라닌형성 세포주, 흑색종 세포주 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 세포주로부터의 적어도 하나의 세포, 및 약 50 IU/mL, 약 100 IU/mL, 약 150 IU/mL, 약 200 IU/mL, 약 250 IU/mL, 약 300 IU/mL, 약 350 IU/mL, 약 400 IU/mL, 약 450 IU/mL 및 약 500 IU/mL로 구성된 군 중에서 선택되는 농도의 IL-2를 포함하는 조성물을 포함한다.
실시양태에서, 표적 세포의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사된 표적 세포를 포함한다. 실시양태에서, 표적 세포의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사되지 않은 표적 세포를 포함한다. 실시양태에서, 음성 대조군 세포의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사된 음성 대조군 세포를 포함한다. 실시양태에서, 음성 대조군 세포의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사되지 않은 음성 대조군 세포를 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2) 또는 이들의 조합을 발현하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2), 또는 이들의 조합을 발현하고, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 TIL, MIL, 또는 PBL의 집단을 추가로 포함하는 효력 검정을 수행하기 위한 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2), 또는 이들의 조합을 발현하고, 본원에 기술된 Gen 2 공정에 의해 제조된 TIL, MIL, 또는 PBL의 집단을 추가로 포함하는 효력 검정을 수행하기 위한 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2), 또는 이들의 조합을 발현하고, 본원에 기술된 Gen 3 공정에 의해 제조된 TIL, MIL, 또는 PBL의 집단을 추가로 포함하는 효력 검정을 수행하기 위한 방법을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합이 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ(A1), HLA-DQ(A2), HLA-DR(B1), HLA-DP(B1), HLA-DP(B2), 또는 이들의 조합을 발현하고, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,894,063호; 제10,398,734호; 제10,537,595호; 제10,695,372호; 및 제10,653,723호에 개시되거나 청구된 조성물에 따른 TIL, MIL 또는 PBL의 집단을 추가로 포함하는 효력 검정을 수행하기 위한 방법을 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 B 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 B 세포 림프모구성 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 버킷 림프종 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 골수 계통 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 단핵구를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 급성 단핵구 백혈병 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손, 예컨대 Raji B2M 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손, 예컨대 사멸 검정에 적합한 유전자 변형된 Thp1 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Ramos 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손, 예컨대 사멸 검정에 적합한 유전자 변형된 Ramos 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 U937 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손, 예컨대 사멸 검정에 적합한 유전자 변형된 U937 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Daudi 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손, 예컨대 사멸 검정에 적합한 유전자 변형된 Daudi 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 멜라닌형성 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 흑색종 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A-02 양성 흑색종 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는 흑색종 세포를 포함하는 표적 세포주 또는 표적 세포주의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 배지, 표적 세포 및 HLA-I 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지, 표적 세포 및 HLA-II 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지, 표적 세포, HLA-I 차단 항체, 및 HLA-II 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지, IL-2, 표적 세포, 및 HLA-1 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지, IL-2, 표적 세포 및 HLA-II 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명은 배지, IL-2, 표적 세포, HLA-I 차단 항체, 및 HLA-II 차단 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 임의의 전술한 실시양태에서, 조성물은 분비된 사이토카인을 추가로 포함하며, 그 수준은 HLA-I 및/또는 HLA-II 차단 항체의 존재 없이 수득된 수준과 비교될 수 있다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-I 차단 항체는 1 μg/mL 내지 50 μg/mL 사이의 농도로 존재한다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-I 차단 항체는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이의 농도로 존재한다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-II 차단 항체는 1 μg/mL 내지 50 μg/mL 사이의 농도로 존재한다. 임의의 전술한 실시양태에서, HLA-II 차단 항체는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL 사이의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 효력 검정은 각각의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 출원 공개 제US 2018/0282694 A1호; 제US2020/0224161 A1호; 및 제US 2020/0277573 A1호; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/210131 A1; WO 2019/136456 A1; WO 2019/145711 A1; WO 2019/210131 A1; WO 2020/152451 A1; 및 WO 2021/123832 A1; 및 미국 특허 제10,130,659호, 제10,166,257호, 제10,272,113호, 제10,363,273호, 제10,398,734호, 제10,420,799호, 제10,463,697호, 제10,537,595호, 제10,646,517호, 제10,653,723호, 제10,693,330호, 제10,695,372호, 제10,894,063호, 제10,905,718호 및 제10,918,666호에 기술된, TIL, MIL, 및 PBL 조성물을 포함하는 T 세포 조성물의 효력을 결정하는 데 사용될 수 있다.
전술한 실시양태 중 일부에서, 효력 검정을 위한 표적 세포는 제조용 세포 은행으로서 제조된다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 효력 검정을 위한 표적 세포는 마스터 세포 뱅크로서 제조된다.
C. 검정 키트
실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL의 효력을 테스트하기 위한 키트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 표적 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트는 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포, Daudi 세포, 이들의 조합, 또는 이들의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 음성 대조군 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트는 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 배지, 면역검정 시약, ELISA 또는 자동화된 ELISA 시스템, 분비된 단백질을 포함하는 상청액, PBMC, 본원에 기술된 양성 대조군, 또는 기타 테스트 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TIL, MIL 또는 PBL 생성물과 같은 TIL의 효력을 테스트하기 위한 키트를 포함하며, 여기서 키트는 1 내지 3개의 표적 세포, 배지 및 공배양 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 3개의 표적 세포는 Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포, Daudi 세포, 및 이들의 조합, 파생물, 변이체, 변형 및 자손으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 배지는 AIM-V 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 단핵구 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 골수 계통 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 B 세포 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 B 세포 림프모구성 세포 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 버킷 림프종 세포 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 급성 단핵구 백혈병 세포 표적 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포주를 포함한다.
실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사된 표적 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사되지 않은 표적 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사된 음성 대조군 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사되지 않은 음성 대조군 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사되지 않은 K562 음성 대조군 세포를 포함한다. 실시양태에서, 키트의 임의의 이전 실시양태는 방사선조사된 K562 음성 대조군 세포를 포함한다.
TIL, MIL 및 PBL을 포함하는 T 세포의 효력 또는 기능성을 검정하기 위한 제안된 방법의 예시적인 실시양태는 본원에 포함된 실시예 및 도면에서도 찾아볼 수 있다.
임의의 전술한 실시양태에서, 키트는 또한 HLA-I 차단 항체를 포함한다. 임의의 전술한 실시양태에서, 키트는 또한 HLA-II 차단 항체를 포함한다.
임의의 전술한 실시양태에서, 키트는 또한 양성 대조군 TIL 세포주를 포함한다. 적합한 양성 대조군 TIL 세포주는 특성이 잘 규명되어 있고, 큰 세포수로 확장되고, 본 발명의 효력 검정에서 재현 가능하게 반응하는 것으로 나타나고, 나중에 사용하기 위해 동결 조건 하에서 조심스럽게 저장된 세포주를 포함한다.
IV. Gen 2 TIL 제조 공정
Gen 2로 알려진(공정 2A로도 알려진) TIL 공정의 예시적 패밀리는 이들 특징의 일부를 함유하는 것으로서 도 1 및 2에 도시된다. Gen 2의 실시양태는 도 2에 도시된다. 공정 1C에 비해 본 발명의 이 실시양태의 장점 중 일부는 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO2018/081473 A1에 기술되어 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 환자에게 이식하기 전에 대사 활성 및 이에 따른 상대적 건강을 증가시키기 위한 동결보존된 TIL의 재자극에 관한 단계, 및 상기 대사 건강을 테스트하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에 일반적으로 개략된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고, 환자에게 이식하기 전에 TIL의 수를 확장시키기 위해 조작된다. 일부 실시양태에서, TIL은 선택적으로 이하에 논의된 바와 같이 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL은 동결보존될 수 있다. 일단 해동되면 환자에게 주입하기 전에 이의 대사를 증가시키기 위해 재자극될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 1차 확장(preREP로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 1에서 단계 A로서 도시된 공정 포함)은 3 내지 14일로 단축되고, 2차 확장(REP로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 단계 B로서 도 1에 도시된 공정 포함)은 이하에 상세히 논의될 뿐만 아니라 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장(예를 들어, 도 1에서 단계 B로서 기술된 확장)은 11일로 단축되고, 2차 확장(예를 들어, 도 1에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 11일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 및 2차 확장의 조합(예를 들어, 도 1에서 단계 B 및 단계 D로 기술된 확장)은 이하 및 실시예 및 도면에 상세히 논의된 바와 같이 22일로 단축된다.
이하에서 "단계" 명칭 A, B, C 등은 도 1을 참고로 하고, 본원에 기술된 특정 실시양태를 참고로 한다. 이하 및 도 1에서 단계들의 순서는 예시적이며, 단계들의 임의의 조합 또는 순서, 뿐만 아니라 추가 단계들, 단계들의 반복, 및/또는 단계들의 생략은 본 출원 및 본원에 개시된 방법에 의해 고려된다.
A. 단계 A: 환자 종양 샘플 수득하기
일반적으로, TIL은 환자 종양 샘플("제1 TIL")로부터 초기에 수득되고, 그 다음 본원에 기술된 바와 같은 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되며, 선택적으로 본원에 개략된 바와 같이 동결보존되고, 재자극되고, 선택적으로 TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.
환자 종양 샘플은 일반적으로 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 기타 수단을 통해 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중병변 샘플링이 사용된다. 일부 실시양태에서, 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단으로는 다병변 샘플링(즉, 환자내 하나 이상의 종양 부위 및/또는 위치로부터의 샘플, 뿐만 아니라 동일 위치 또는 매우 근접한 위치의 하나 이상의 종양을 수득함)을 포함한다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함하는 임의의 고형 종양으로부터 유래될 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성 종양으로부터 수득되는 종양과 같은 액체 종양일 수도 있다. 고형 종양은 피부 조직일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 TIL은 흑색종으로부터 수득된다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 예리한 절개를 사용하여 1 내지 약 8 mm3의 작은 조각으로 단편화되며, 특히 약 2-3 mm3이 유용하다. TIL은 이들 단편으로부터 효소 종양 분해물을 사용하여 배양된다. 이러한 종양 분해물은 효소 배지(예를 들어, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완충액, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 젠타마이신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)에서 인큐베이션한 다음, 기계적 해리(예를 들어, 조직 해리장치 사용)에 의해 생성될 수 있다. 종양 분해물은 종양을 효소 배지에 두고, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리한 후, 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 전술한 조건 하에 기계적 해리 및 인큐베이션을 반복 순환함으로써 생성될 수 있다. 이 과정의 마지막에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 세포 또는 사세포를 함유하는 경우, 이들 세포를 제거하기 위해 FICOLL 분지형 친수성 폴리사카라이드를 이용한 밀도 구배 분리를 수행할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2012/0244133 A1호에 기술된 것이 사용될 수 있다. 임의의 전술한 방법은 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대한 본원에 기술된 임의의 실시양태에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO 2021/123832 A1에 기술된 조성물의 형태에서 또는 방법에 따라 분해된다.
상기에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서, TIL은 고형 종양으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 단편화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 단편화되지 않고 전체 종양으로서 효소 분해를 거친다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 1-2시간 동안 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2시간 동안 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2시간 동안 회전에 의해 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 일정한 회전에 의해 밤새 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 일정한 회전에 의해 37℃, 5% CO2에서 밤새 분해된다. 일부 실시양태에서, 전체 종양은 효소와 조합되어 종양 분해 반응 혼합물을 형성한다.
일부 실시양태에서, 종양은 멸균 완충액에서 동결건조된 효소에 의해 재구성된다. 일부 실시양태에서, 완충액은 멸균 HBSS이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 콜라게나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제는 콜라게나제 IV이다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제에 대한 제조용 스톡(stock)은 100 mg/mL 10x 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 DNAse를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNAse에 대한 제조용 스톡은 10,000 IU/mL 10x 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 히알루로니다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히알루로니다제에 대한 제조용 스톡은 10 mg/mL 10X 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 10 mg/mL 콜라게나제, 1000 IU/mL DNAse, 및 1 mg/mL 히알루로니다제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 10 mg/mL 콜라게나제, 500 IU/mL DNAse, 및 1 mg/mL 히알루로니다제를 포함한다.
일반적으로, 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수확된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, 단편화에는 예를 들어 분해뿐만 아니라 절개를 포함하는, 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 분해에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득한 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득한 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양은 종양 샘플이 예를 들어 단계 A에서 수득된 후 물리적 단편화를 겪는다(도 1에 제공됨). 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 종양을 수득한 후, 임의의 동결보존 없이 일어난다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고 10, 20, 30, 40개 이상의 단편 또는 조각이 1차 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고 30 또는 40개의 단편 또는 조각이 1차 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고 40개의 단편 또는 조각이 1차 확장을 위해 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50개의 단편을 포함하고, 여기서 각 단편은 약 27mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1350 mm3의 총 부피를 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1g 내지 약 1.5g의 총 질량을 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4개의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 예리한 절개에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양은 1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 1 mm × 1 mm × 1 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 2mm × 2mm × 2mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 3 mm × 3 mm × 3 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 4 mm × 4 mm × 4 mm이다.
일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 출혈성, 괴사성 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하도록 절제된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 출혈성 조직의 양을 최소화하도록 절제된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 괴사성 조직의 양을 최소화하도록 절제된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 지방 조직의 양을 최소화하도록 절제된다.
일부 실시양태에서, 종양 단편화는 종양 내부 구조를 유지하도록 수행한다. 일부 실시양태에서, 종양 단편화는 메스를 이용한 톱질 동작을 수행함이 없이 수행된다. 일부 실시양태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로, RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10 mg/mL 젠타마이신, 30 U/mL DNase 및 1.0 mg/mL 콜라게나제에서의 인큐베이션에 이어 기계적 해리(GentleMACS, Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 어번)에 의해 발생되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후 종양은 대략 1분 동안 기계적으로 해리될 수 있다. 그런 다음 용액은 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있고, 그 다음 다시 대략 1분 동안 기계적으로 파괴된다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양은 대략 1분 동안 3번째로 기계적으로 파괴될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우 3차 기계적 파괴 후, 5% CO2, 37℃에서 추가 30분의 인큐베이션 여부에 관계없이 샘플에 1회 또는 2회의 추가적인 기계적 해리를 적용했다. 일부 실시양태에서, 최종 인큐베이션의 마지막에 세포 현탁액에 다수의 적혈구 또는 사세포가 함유된 경우, 이들 세포를 제거하기 위해 Ficoll을 사용한 밀도 구배 분리가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 단계 이전에 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수확된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, 세포는 샘플 수확 후 선택적으로 동결될 수 있고 단계 B에 기술된 확장에 들어가기 전에 동결된 상태로 저장될 수 있으며, 이는 이하에 더욱 상세하게 기술되며, 뿐만 아니라 도 1 및 도 8에 예시되어 있다.
1. 흉막 삼출액 TIL
일부 실시양태에서, 샘플은 흉막액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공정에 따라 확장하기 위한 TIL의 공급원은 흉막액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 흉막 삼출액 유래 샘플이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공정에 따라 확장하기 위한 TIL의 공급원은 흉막 삼출액 유래 샘플이다. 예를 들어, 본원에 전체가 모든 목적에 대해 참고로 포함되는 미국 특허 공개 제US 2014/0295426호에 기술된 방법을 참조한다.
일부 실시양태에서, TIL을 함유할 것으로 의심되고/되거나 TIL을 함유하는 임의의 흉막액 또는 흉막 삼출액이 사용될 수 있다. 이러한 샘플은 NSCLC 또는 SCLC와 같은 원발성 또는 전이성 폐암으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 또 다른 기관, 예를 들어 유방, 난소, 결장 또는 전립선에서 기원하는 2차 전이암 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법에 사용하기 위한 샘플은 흉막 삼출물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법에 사용하기 위한 샘플은 흉막 누출물이다. 다른 생물학적 샘플은 TIL을 함유하는 기타 장액, 예를 들어, 복부 유래 복수액 또는 췌장 낭종액을 포함할 수 있다. 복수액 및 흉막액은 매우 유사한 화학 시스템을 수반한다; 복부와 폐는 둘 모두가 중피선을 갖고 흉막 및 복부 공간에 악성 종양의 동일한 물질의 유체를 형성하고, 이러한 유체는 일부 실시양태에서 TIL을 함유한다. 본 개시내용이 흉막액을 예시하는 일부 실시양태에서, 동일한 방법이 TIL을 함유하는 복수 또는 기타 낭종액을 사용하여 유사한 결과로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 흉막액은 환자로부터 제거된 즉시의 미처리 형태이다. 일부 실시양태에서, 미처리 흉막액은 접촉 단계 전에 EDTA 또는 헤파린 튜브와 같은 표준 혈액 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 미처리 흉막액은 접촉 단계 전에 표준 CellSave® 튜브(Veridex)에 배치된다. 일부 실시양태에서, 생존 TIL 수가 감소하는 것을 방지하기 위해 환자로부터 수집한 직후 샘플은 CellSave 튜브에 배치한다. 생존 TIL의 수는 미처리 흉막액에, 심지어 4℃에서 방치된다면, 24시간 이내에 유의미한 정도로 감소할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 제거된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간 또는 최대 24시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 4℃에서 환자로부터 제거된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간 또는 최대 24시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다.
일부 실시양태에서, 선택된 대상체로부터의 흉막액 샘플은 희석될 수 있다. 실시양태에서, 희석은 1:10 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:9 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:8 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:5 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:2 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:1 흉막액 대 희석제이다. 일부 실시양태에서, 희석제는 식염수, 인산염 완충 식염수, 또 다른 완충액 또는 생리학적으로 허용되는 희석제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 수집, 및 미처리 흉막액에, 심지어 4℃에서 방치된 경우 24-48시간 이내에 유의미한 정도로 일어날 수 있는 생존 TIL의 감소를 피하기 위한 희석 후, 즉시 CellSave 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 환자로부터 제거되고 희석된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간, 36시간, 최대 48시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 환자로부터 제거 및 4℃에서 희석 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간, 36시간, 최대 48시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다.
또 다른 실시양태에서, 흉막액 샘플은 추가 처리 단계 전에 통상의 수단에 의해 농축된다. 일부 실시양태에서, 흉막액의 이러한 전처리는 방법을 수행하는 실험실로의 배송을 위해 또는 추후 분석을 위해(예를 들어, 수집 후 24-48시간 이후) 흉막액을 동결보존해야 하는 상황에서 바람직하다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 대상체로부터 채취한 후 흉막액 샘플을 원심분리하고 원심분리액 또는 펠릿을 완충액에 재현탁시켜 제조한다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 수송 또는 추후 분석 및/또는 처리를 위해 동결보존되기 전에 다수의 원심분리 및 재현탁을 거친다.
일부 실시양태에서 흉막액 샘플은 추가 처리 단계 전에 여과 방법을 사용하여 농축된다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계에 사용되는 흉막액 샘플은 흉막액이 멤브레인을 통과하도록 허용하지만 종양 세포는 보유하는 공지되고 본질적으로 균일한 기공 크기를 함유하는 필터를 통해 유체를 여과함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 멤브레인의 기공 직경은 적어도 4μM일 수 있다. 다른 실시양태에서 기공 직경은 5 μM 이상일 수 있고, 다른 실시양태에서는 6, 7, 8, 9 또는 10 μM 중 어느 하나일 수 있다. 여과 후, 멤브레인에 의해 보유된 TIL을 포함한 세포는 적합한 생리학적으로 허용되는 완충액 내로 멤브레인으로부터 헹궈낼 수 있다. 이러한 방식으로 농축된 TIL을 포함하는 세포는 이후 방법의 접촉 단계에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 흉막액 샘플(예를 들어, 미처리된 흉막액 포함), 희석된 흉막액 또는 재현탁된 세포 펠릿은 샘플에 존재하는 비핵화 적혈구를 차별적으로 용해하는 용해 시약과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 이 단계는 흉막액이 상당한 수의 RBC를 함유하는 상황에서 추가 처리 단계 전에 수행된다. 적합한 용해 시약은 단일 용해 시약 또는 용해 시약 및 켄치 시약, 또는 용해제, 켄치 시약 및 고정 시약을 포함한다. 적합한 용해 시스템은 상업적으로 시판되며 BD Pharm Lyse™ 시스템(Becton Dickenson)을 포함한다. 다른 용해 시스템으로는 Versalyse™ 시스템, FACSlyse™ 시스템(Becton Dickenson), Immunoprep™ 시스템 또는 Erythrolyse II 시스템(Beckman Coulter, Inc.), 또는 염화암모늄 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 시약은 적혈구의 효율적인 용해, 및 흉막액 내 TIL 및 TIL의 표현형 특성의 보존이라는 주요 요구 사항에 따라 달라질 수 있다. 용해를 위한 단일 시약을 사용하는 것 외에도, 본원에 기술된 방법에 유용한 용해 시스템은 제2 시약, 예를 들어 방법의 나머지 단계 동안 용해 시약의 효과를 켄치하거나 지체시키는 것, 예를 들어 Stabilyse™ 시약(Beckman Coulter, Inc.)을 포함할 수 있다. 또한, 방법의 바람직한 구현예 또는 용해 시약의 선택에 따라 통상의 고정 시약이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 미처리, 희석 또는 다수 회 원심분리 또는 처리된 흉막액 샘플은 본원에 제공된 바와 같이 추가 처리 및/또는 확장되기 전에 약 -140℃의 온도에서 동결보존된다.
B. 단계 B: 1차 확장
일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체/환자에게 투여 시 복제 사이클을 증가시킬 수 있는 젊은 TIL을 수득하기 위한 것이고, 이와 같이 더 늙은 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여되기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 거친 TIL)에 비해 추가적인 치료 이점을 제공할 수 있다. 젊은 TIL의 특징은 문헌, 예를 들어 Donia, 등, Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley 등, Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang 등, J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser 등, Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser 등, J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, 등, J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen 등, J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou 등, J Immunother, 28:53-62 (2005); 및 Tran, 등, J Immunother, 31:742-751 (2008)에 기술되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한적이지만 다수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이러한 유전자 분절: V(가변성), D(다양성), J(결합성) 및 C(불변성)는 면역글로불린 및 T 세포 수용체(TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 발생시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득되는 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득되는 TIL은 새로 수확된 TIL 및/또는 본원에 제공된 방법 외에 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL, 예를 들어 도 1에서 구현된 방법 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 새로 수확된 TIL 및/또는 도 5 및/또는 도 6에 예시된 바와 같은 공정 1C로 지칭되는 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 수득된 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T 세포 수용체에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 구성된 군 중에서 선택되는 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파 및/또는 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, TCRab(즉, TCRα/β)의 발현이 증가된다.
예를 들어, 도 1의 단계 A에 기술된 바와 같이, 종양 단편의 절개 또는 분해 후, 결과적으로 생성된 세포는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 비활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 2 mL 웰에서 인큐베이션된다. 이 1차 세포 집단은 일반적으로 3 내지 14일 동안인 일정 기간 배양되어 일반적으로 약 1 x 108 벌크 TIL 세포인 벌크 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 1차 세포 집단은 7일 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 일반적으로 약 1 x 108 벌크 TIL 세포인 벌크 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 1차 세포 집단은 10일 내지 14일의 기간 동안 배양되어, 일반적으로 약 1 x 108 벌크 TIL 세포인 벌크 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 1차 세포 집단은 약 11일의 기간 동안 배양되어, 일반적으로 약 1 x 108 벌크 TIL 세포인 벌크 TIL 집단을 초래한다.
바람직한 실시양태에서, TIL의 확장은 이하 및 본원에 기술된 바와 같은 초기 벌크 TIL 확장 단계(예를 들어, 사전 REP라고 불리는 공정을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기술된 것과 같은 단계), 그 다음 단계 D 하에서 이하에 및 본원에 기술된 바와 같은 2차 확장(급속 확장 프로토콜(REP) 단계로 지칭되는 공정을 포함하는 단계 D), 그 다음 선택적 동결보존 및 그 다음 이하 및 본원에 기술된 바와 같은 제2 단계 D(재자극 REP 단계라고 지칭되는 공정 포함)를 사용하여 수행될 수 있다. 이 공정에서 수득되는 TIL은 선택적으로 본원에 기술된 표현형 특성 및 대사 매개변수에 대해 특성화될 수 있다.
TIL 배양이 예를 들어 Costar 24-웰 세포 배양 클러스터, 편평 바닥(Corning Incorporated, 뉴욕 코닝)을 사용하는 24-웰 플레이트에서 개시되는 실시양태에서, 각 웰에는 2mL의 완전 배지(CM) 중 1 x 106의 종양 분해 세포 또는 1개의 종양 단편이 IL-2(6000 IU/mL; Chiron Corp., 캘리포니아주 에머리빌)와 함께 파종될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3 사이이다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 단계 B에 대한 CM은 10% 인간 AB 혈청, 25mM Hepes 및 10 mg/mL 젠타마이신이 보충된 GlutaMAX를 포함하는 RPMI 1640으로 구성된다. 40 mL 용량 및 10 cm2 가스 투과성 실리콘 바닥을 갖는 가스 투과성 플라스크(예를 들어, G-Rex 10; Wilson Wolf Manufacturing, 미네소타주 뉴브라이튼)에서 배양이 개시되는 실시양태에서, 각 플라스크에는 10-40 mL의 CM 중 10-40 x 106 생존 종양 분해 세포 또는 5-30개의 종양 단편이 IL-2와 함께 부하된다. G-Rex 10 및 24웰 플레이트는 둘 모두가 5% CO2, 37℃에서 가습 인큐베이션에서 인큐베이션되었고, 배양 개시 5일 후, 배지의 절반을 제거하고 신선한 CM 및 IL-2로 교체하고, 5일 후 배지의 절반을 2 내지 3일마다 교환했다.
종양 단편의 제조 후, 결과적으로 생성된 세포(즉, 단편)는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하는 조건 하에 IL-2를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 2mL 웰에서 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 비활성화된 인간 AB 혈청(또는 일부 경우에는 본원에 개략된 바와 같이, aAPC 세포 집단의 존재 하에)을 포함하는 배지에서 인큐베이션된다. 이 1차 세포 집단은 일반적으로 10 내지 14일의 일정 기간 동안 배양되어 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포인 벌크 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 동안 성장 배지는 IL-2 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL은 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)이다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 20-30x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서 IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 20x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서 IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 25x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서 IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 30x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 4-8 x 106 IU/mg IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 5-7 x 106 IU/mg IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 6×106 IU/mg IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모나브이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 하나 이상의 TNFRSF 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제이고, 4-1BB 작용제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질 및 이의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합물로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지에서 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지에서 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFRSF 작용제에 더하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서는 CM1(배양 배지 1)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25mM Hepes 및 10mg/mL 젠타마이신이 보충된, GlutaMAX를 포함한 RPMI 1640으로 구성된다. 40mL 용량 및 10cm2 가스 투과성 실리콘 바닥을 갖는 가스 투과성 플라스크(예를 들어, G-Rex 10; Wilson Wolf Manufacturing, 미네소타주 뉴브라이튼)에서 배양이 개시되는 실시양태에서, 각 플라스크에는 10-40 mL의 CM 중 10-40 x 106 생존 종양 분해 세포 또는 5-30개의 종양 단편이 IL-2와 함께 부하된다. G-Rex 10 및 24웰 플레이트는 둘 모두가 5% CO2, 37℃에서 가습 인큐베이션에서 인큐베이션되었고, 배양 개시 5일 후, 배지의 절반을 제거하고 신선한 CM 및 IL-2로 교체하고, 5일 후 배지의 절반을 2 내지 3일마다 교환했다. 일부 실시양태에서, CM은 실시예에 기술된 CM1이다, 실시예 1 참조. 일부 실시양태에서, 1차 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 1차 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지 또는 1차 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1차 확장(때로 사전 REP라고 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기술된 것과 같은 공정 포함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3-14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장(때로 사전-REP로 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 도 1의 단계 B에 기술된 것과 같은 공정 포함)은 실시예에서 논의되고 도 4 및 5에 도시된 바와 같이, 뿐만 아니라 예를 들어, 도 1의 단계 B에 기술된 확장과 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 단계 B의 1차 확장은 10-14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장은 예를 들어 도 1의 단계 B에 기술된 확장에 논의된 바와 같이 11일로 단축된다.
일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 1일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 3일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 4일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 5일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 6일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 7일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 8일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 9일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 10일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 11일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 12일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 13일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 1일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 2일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 3일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 4일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 5일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 6일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 7일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 8일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 9일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 10일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 11일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 1차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 예를 들어 도 1에 따른 단계 B 공정 동안, 뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 1차 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 1차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따라, 그리고 본원에 기술된 바와 같은 단계 B 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1차 확장(사전 REP로 지칭되는 공정 포함; 예를 들어 도 1에 따른 단계 B) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이, 3일 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서 단계 B의 1차 확장은 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서 단계 B의 1차 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장은 11일로 단축된다.
일부 실시양태에서, 1차 확장, 예를 들어 도 1에 따른 단계 B는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 G-Rex 10 또는 G-Rex 100이다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
C. STEP C: 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환
일부 경우에, 예를 들어 도 1에 표시된 단계 B 등에서 수득한 TIL 집단을 포함하는, 1차 확장으로부터 수득한 벌크 TIL 집단은 이하 본원에서 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 제2 TIL 집단이라고 지칭되는, 1차 확장으로부터 수득된 TIL 집단은 2차 확장(때로는 REP라고도 하는 확장을 포함할 수 있음)을 거친 후 이하에 논의되는 바와 같이 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 치료법에 사용될 경우, 제1 TIL 집단(때로 벌크 TIL 집단이라고도 함) 또는 제2 TIL 집단(일부 실시양태에서는 REP TIL 집단이라고 하는 집단을 포함할 수 있음)은 확장 전 또는 1차 확장 후 및 2차 확장 전에 적절한 처리를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 1차 확장(예를 들어, 도 1에 표시된 단계 B로부터)으로부터 수득한 TIL은 선택을 위해 표현형별될 때까지 저장된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장(예를 들어, 도 1에 표시된 단계 B로부터)으로부터 수득된 TIL은 저장되지 않고 2차 확장으로 바로 진행된다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 수득된 TIL은 1차 확장 후 및 2차 확장 이전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 4일 내지 10일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 약 14일에 일어난다.
일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 1일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 4일 내지 10일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 5일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 6일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 8일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 9일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 10일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 11일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 12일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 13일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 1일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 2일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 3일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 4일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 5일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 6일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 7일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 8일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 9일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 10일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때로부터 11일에 일어난다.
일부 실시양태에서, TIL은 1차 확장 이후 및 2차 확장 이전에 저장되지 않고, TIL은 2차 확장으로 바로 진행된다(예를 들어, 일부 실시양태에서는 도 1에 도시된 바와 같이 단계 B에서 단계 D로의 전환 동안 저장되지 않는다). 일부 실시양태에서, 전환은 본원에 기술된 바와 같이 밀폐 시스템에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 1차 확장으로부터의 TIL, 즉 제2 TIL 집단은 전환 기간 없이 2차 확장으로 바로 진행된다.
일부 실시양태에서, 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환, 예를 들어 도 1에 따른 단계 C는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 단일 생물반응기는 예를 들어 G-Rex 10 또는 G-Rex 100이다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 사이토카인
본원에 기술된 확장 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 알려진 바와 같이, 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2가 있는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 2차 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 또한 가능하며, IL-2, IL-15 및 IL-21 중 2개 이상의 조합이 본원에 각각의 전체가 참고로 분명하게 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US 2017/0107490 A1호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/189357에 기술된 바와 같이 사용 가능하다. 따라서, 가능한 조합으로는 IL-2 및 IL-15, IL-2 및 IL-21, IL-15 및 IL-21 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하며, 후자는 특히 많은 실시양태에서 사용된다. 사이토카인의 조합의 사용은 림프구, 특히 본원에 기술된 바와 같은 T 세포의 발생을 특히 유리하게 한다.
D. 단계 D: 2차 확장
일부 실시양태에서, TIL 세포 집단은 수확 및 초기 벌크 처리, 예를 들어 단계 A 및 단계 B, 및 도 1에 표시된 바와 같이 단계 C로 지칭되는 전환 후에, 수가 확장된다. 이 추가 확장은 본원에서 2차 확장이라고 지칭되고, 이는 관련 기술분야에서 일반적으로 급속 확장 공정(REP; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 표시된 바와 같은 공정)이라고 지칭되는 확장 공정을 포함할 수 있다. 2차 확장은 가스-투과성 용기에서 배양보조 세포, 사이토카인 공급원, 및 항-CD3 항체를 포함하는 다수의 구성요소를 포함하는 배양 배지를 사용하여 일반적으로 달성된다.
일부 실시양태에서, TIL의 2차 확장 또는 제2 TIL 확장(때로 REP라고 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 표시된 바와 같은 공정을 포함할 수 있음)은 관련 기술분야의 기술자에 의해 공지된 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 7일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 8일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 9일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 10일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 11일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 12일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
실시양태에서, 2차 확장은 본 개시내용의 방법(예를 들어 REP라고 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 표시된 공정 포함)을 사용하여 가스 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-15(IL-15)의 존재 하에 비특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 급속 확장될 수 있다. 비특이적 T 세포 수용체 자극은 예를 들어 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/mL의 OKT3, 마우스 단클론 항-CD3 항체(다음에서 상업적으로 입수 가능: Ortho-McNeil, 뉴저지주 라리탄 또는 Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 어번) 또는 UHCT-1(BioLegend에서 상업적으로 입수 가능, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 포함할 수 있다. TIL은 시험관내에서 TIL의 추가 자극을 유도하기 위해 2차 확장 동안 하나 이상의 항원, 예를 들어 벡터로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들), 예컨대 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩타이드, 예를 들어 0.3μM MART-1:26-35(27L) 또는 gp100:209-217(210M)을 포함시켜, 선택적으로 T 세포 성장 인자, 예를 들어 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원으로는, 예를 들어 NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2 및 VEGFR2 또는 이의 항원성 부분을 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2 발현 항원 제시 세포에 펄스를 가한 암의 동일한 항원(들)으로 재자극함으로써 급속 확장될 수도 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어 방사선조사된 자가 림프구 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2를 이용하여 추가로 재자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재자극은 2차 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 방사선조사된 자가 림프구의 존재 하에 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2를 이용하여 일어난다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모나브이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 하나 이상의 TNFRSF 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제이고, 4-1BB 작용제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 이의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지 중에서 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지 중에서 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFRSF 작용제에 더하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 2차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 2차 확장 동안, 예를 들어 도 1에 따른 단계 D 공정 동안 및 본원에 기술된 바와 같이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 2차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 1에 따른 단계 D 공정 동안 및 본원에 기술된 바와 같이 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2차 확장은 IL-2, OKT-3, 항원 제시 배양보조 세포, 및 선택적으로 TNFRSF 작용제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC; 항원 제시 배양보조 세포라고도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 배양보조 세포(즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시양태에서 항원 제시 배양보조 세포(APC)는 PBMC이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제시 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 약 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50과 1 대 300 사이이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100과 1 대 200 사이이다.
실시양태에서, REP 및/또는 2차 확장은 벌크 TIL이 100배 또는 200배 과량의 비활성화된 배양보조 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 150 mL 배지에 혼합되어 있는 플라스크에서 수행된다. 세포가 대체 성장 챔버로 전달될 때까지 배지 교체가 수행된다(일반적으로 신선한 배지를 이용한 호흡을 통한 2/3 배지 교체). 대체 성장 챔버는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같은 G-Rex 플라스크 및 가스 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2차 확장(REP 공정이라고 하는 공정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의되는 바와 같이 7-14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 11일로 단축된다.
실시양태에서, REP 및/또는 2차 확장은 이전에 기술된 바와 같은 T-175 플라스크 및 가스 투과성 백(Tran, 등, J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, 등, J. Immunother. 2003, 26, 332-42) 또는 가스 투과성 배양 용기(G-Rex 플라스크)를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 확장(급속 확장으로 지칭되는 확장 포함)은 T-175 플라스크에서 수행되고, 150 mL의 배지에 현탁된 약 1 x 106 TIL이 각 T-175 플라스크에 첨가될 수 있다. TIL은 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항CD3이 보충된 CM과 AIM-V 배지의 1:1 혼합물에서 배양될 수 있다. T-175 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 배지 절반은 3000 IU/ML의 IL-2가 있는 50/50 배지를 사용하여 5일째에 교환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 7일째에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3L 백에서 조합될 수 있고, 300mL의 TIL 현탁액에 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 AIM-V 300mL를 첨가했다. 각 백 중 세포의 수는 매일 또는 2일마다 계수했고, 세포수를 0.5 내지 2.0 x 106 세포/mL 사이로 유지하기 위해 신선한 배지를 첨가했다.
실시양태에서, 2차 확장(REP로 지칭되는 확장, 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에서 지칭되는 확장을 포함할 수 있음)은 100cm 가스 투과성 실리콘 바닥을 갖는 500mL 용량의 가스 투과성 플라스크(G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing Corporation에서 상업적으로 입수 가능, 미국 미네소타주 뉴브라이튼 소재)에서 수행될 수 있고, 5 x 106 또는 10 x 106 TIL은 5% 인간 AB 혈청, IL-2 3000 IU/mL 및 항-CD3(OKT3) 30 ng/mL가 보충된 50/50 배지 400mL에서 PBMC와 함께 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 5일째에 상청액 250mL를 제거하고 원심분리병에 넣고 1500 rpm(491×g)에서 10분 동안 원심분리할 수 있다. TIL 펠릿은 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 신선한 배지 150mL에 의해 재현탁될 수 있고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가될 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 경우, 각 G-Rex 100 중의 TIL은 7일째에 각 플라스크에 존재하는 배지 300mL에 현탁될 수 있고, 세포 현탁액은 3개의 G-Rex 100 플라스크를 파종하는 데 사용될 수 있는 3개의 100mL 분취량으로 나눌 수 있다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한 AIM-V 150mL가 각 플라스크에 첨가될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션될 수 있고, 4일 후에 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 AIM-V 150mL가 각 G-Rex 100 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포는 배양 14일째에 수확될 수 있다.
실시양태에서, 2차 확장(REP라고 지칭되는 확장 포함)은 벌크 TIL이 100배 또는 200배 과량의 비활성화된 배양보조 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL의 IL-2와 150mL 배지에서 혼합되어 있는 플라스크에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 배지 교체는 세포가 대체 성장 챔버로 전달될 때까지 수행한다. 일부 실시양태에서, 배지의 2/3는 호흡에 의해 신선한 배지로 교체된다. 일부 실시양태에서, 대체 성장 챔버는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같은 G-Rex 플라스크 및 가스 투과성 용기를 포함한다.
실시양태에서, 2차 확장(REP라고도 지칭되는 확장 포함)이 수행되고, TIL이 우수한 종양 반응성에 대해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2016/0010058 A1호에 기술된 방법은 우수한 종양 반응성에 대한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존력 검정은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 2차 확장(REP 확장이라고 지칭되는 확장 포함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트리판 블루 배제 검정은 벌크 TIL 샘플에 수행되어 사세포를 선택적으로 표지하고 생존력 평가를 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL 샘플은 Cellometer K2 자동화 세포 계수기(Nexcelom Bioscience, 매사추세츠주 로렌스)를 사용하여 계수되고 생존력이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생존력은 표준 Cellometer K2 Image Cytometer 자동 세포 계수기 프로토콜에 따라 결정된다.
일부 실시양태에서, TIL의 2차 확장(REP라고도 지칭되는 확장 포함)은 이전에 기술된 바와 같은 T-175 플라스크 및 가스 투과성 백(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, 등, 2008, J Immunother., 31:742-751, 및 Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, 등 2003, J Immunother., 26:332-342) 또는 가스 투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 가스-투과성 G-Rex 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 T-175 플라스크에서 수행되고, 약 1 x 106 TIL이 약 150 mL의 배지에 현탁되고, 이것이 각 T-175 플라스크에 첨가된다. TIL은 "배양보조(feeder)" 세포로서 방사선조사된(50 Gy) 동종이계 PBMC와 함께 1 대 100의 비로 배양되고, 세포는 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3이 보충된 CM과 AIM-V 배지의 1:1 혼합물(50/50 배지)에서 배양했다. T-175 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 배지 절반은 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 50/50 배지를 사용하여 5일째에 교환한다. 일부 실시양태에서, 7일째에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포는 3L 백에서 조합되며, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 AIM-V 300mL가 300mL의 TIL 현탁액에 첨가된다. 각 백 중 세포의 수는 매일 또는 2일마다 계수될 수 있고, 세포수를 약 0.5 내지 약 2.0 x 106 세포/mL 사이로 유지하기 위해 신선한 배지가 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2차 확장(REP로 지칭되는 확장 포함)은 100 cm2 가스 투과성 실리콘 바닥을 갖는 500 mL 용량의 플라스크(G-Rex 100, Wilson Wolf)에서 수행되며, 약 5×106 또는 10×106 TIL이 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3이 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 방사선조사된 동종이계 PBMC와 1:100의 비율로 배양된다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 5일째에, 250 mL의 상청액을 제거하여 원심분리병에 넣고 1500 rpm(491g)에서 10분 동안 원심분리한다. 그 다음, TIL 펠릿은 3000 IU/mL의 IL-2가 포함된 신선한 50/50 배지 150mL로 재현탁되고, 원래의 G-Rex 100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 G-Rex 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 실시양태에서, 7일째에 각 G-Rex 100 중의 TIL은 각 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁되고 세포 현탁액은 3개의 G-Rex 100 플라스크를 파종하는 데 사용되는 3개의 100 mL 분취량으로 나누었다. 그 다음, 5% 인간 AB 혈청과 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한 AIM-V 150mL를 각 플라스크에 첨가한다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션하고, 4일 후 3000 IU/mL의 IL-2와 함께 150 mL의 AIM-V가 각 G-Rex 100 플라스크에 첨가된다. 세포는 배양 14일째에 수확한다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한되지만 다수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이러한 유전자 분절: V(가변성), D(다양성), J(결합성) 및 C(불변성)는 면역글로불린 및 T 세포 수용체(TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 발생시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득되는 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 2차 확장에서 수득된 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T 세포 수용체에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파 및/또는 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, TCRab(즉, TCRα/β)의 발현이 증가된다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지(예를 들어, 때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지라고 지칭됨)는 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포(APC)를 포함하고, 이는 이하에서 더 자세히 논의된다.
일부 실시양태에서, 2차 확장, 예를 들어 도 1에 따른 단계 D는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 G-Rex 10 또는 G-Rex 100이다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
1. 배양보조 세포 및 항원 제시 세포
실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차(예를 들어, 도 1의 단계 D에 기술된 확장, 뿐만 아니라 REP라고 지칭되는 확장과 같은 확장 포함)는 REP TIL 확장 동안 및/또는 2차 확장 동안 과량의 배양보조 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전체 혈액 단위로부터 수득되는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득된다.
일반적으로, 동종이계 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 비활성화되고, 방사선조사된 동종이계 PBMC의 복제 불능을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공하는 실시예에 기술된 바와 같은 REP 절차에 사용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 14일째의 생존 세포의 총 수가 REP의 0일째 및/또는 2차 확장 0일째(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수보다 적다면, 복제 불능으로 간주되고 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하는 것이 허용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존 세포의 총 수가 7일 및 14일째에 REP의 0일째 및/또는 2차 확장 0일째(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수에서 증가하지 않았다면, 복제 불능으로 간주되고 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하는 것이 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 ng/mL OKT3 항체 및 3000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존 세포의 총 수가 7일 및 14일째에 REP의 0일째 및/또는 2차 확장 0일째(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 투입된 초기 생존 세포 수에서 증가하지 않았다면, 복제 불능으로 간주되고 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하는 것이 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 5-60 ng/mL OKT3 항체 및 1000-6000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 10-50 ng/mL OKT3 항체 및 2000-5000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 20-40 ng/mL OKT3 항체 및 2000-4000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 25-35 ng/mL OKT3 항체 및 2500-3500 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, 항원 제시 배양보조 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 배양보조 세포는 인공 항원 제시 배양보조 세포이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 2.5×109 배양보조 세포 대 약 100×106 TIL의 비를 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 2.5×109 배양보조 세포 대 약 50×106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 2.5×109 배양보조 세포 대 약 25×106 TIL을 필요로 한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 2차 확장 동안 과량의 배양보조 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전체 혈액 단위로부터 수득한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득한다. 실시양태에서, 인공 항원 제시 세포(aAPC)가 PBMC 대신에 사용된다.
일반적으로, 동종이계 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 비활성화되고, 도면 및 실시예에 기술된 예시적인 절차를 포함한 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용된다.
실시양태에서, aAPC는 PBMC에 대한 교체로서, 또는 PBMC와의 조합으로 2차 확장에 사용된다.
실시양태에서, Gen 2 공정의 2차 확장에 사용되는 항원 제시 세포는 단핵구 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포 림프모구성 세포 또는 B-림프모구성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합, 또는 이들의 파생물, 변종, 변형 또는 자손으로 구성된 군 중에서 선택된다. 임의의 전술한 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사선조사되거나 방사선 조사되지 않을 수 있다.
실시양태에서, aAPC는 Gen 2 공정의 2차 확장에 사용된다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 B 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 B 세포 림프모구성 세포 또는 B-림프모구성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 단핵구이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합, 또는 이들의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군 중에서 선택되는 유전자 변형 항원 제시 세포이다. 실시양태에서, 유전자 변형된 세포는 CD86, OX40L, 4-1BBL, OX-40 작용성 항체, 4-1BB 작용성 항체, OKT-3의 Fc 사슬에 결합할 수 있는 항체, 및/또는 ICOS-L을 발현하도록 변형되고, 이는 미국 특허 제10,415,015호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 임의의 전술한 실시양태에서, 유전자 변형된 aAPC는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 방사선조사될 수 있거나 방사선조사되지 않을 수 있다.
2. 사이토카인
본 명세서에 기술된 확장 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 포함하는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 2차 확장을 위한 사이토카인 조합의 사용이 추가로 가능하며, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 미국 특허 출원 공개 제US 2017/0107490 A1호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/189357에 기술되어 있고, 이들 각각은 각각의 전체내용이 본원에 참고로 분명하게 포함됨). 따라서, 가능한 조합은 IL-2와 IL-15, IL-2와 IL-21, IL-15와 IL-21, 및 IL-2, IL-15와 IL-21을 포함하며, 후자는 많은 실시양태에서 특별히 사용된다. 사이토카인 조합의 사용은 특히 본원에 기술된 림프구, 및 특히 T 세포의 발생에 유리하다.
E. 단계 E: TIL 수확
2차 확장 단계 후, 세포는 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 도 1에 제공된 바와 같이 1, 2, 3, 4개 이상의 확장 단계 후에 수확된다. 일부 실시양태에서 TIL은 예를 들어 도 1에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계 후에 수확된다.
TIL은 예를 들어 원심분리를 포함하여 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수확될 수 있다. TIL 수확 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 임의의 이러한 알려진 방법은 본 공정과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 자동화 시스템을 사용하여 수확된다.
세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 예를 들어 Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer 및 Inotech Biosystems International, Inc.를 비롯한 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다. 임의의 세포 기반 수확기가 본 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 멤브레인 기반 세포 수확기이다. 일부 실시양태에서, 세포 수확은 LOVO 시스템(Fresenius Kabi 제조)과 같은 세포 처리 시스템을 통해 이루어진다. "LOVO 세포 처리 시스템"이라는 용어는 또한 멸균 및/또는 밀폐 시스템 환경에서 스피닝 멤브레인 또는 스피닝 필터와 같은 멤브레인 또는 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌핑하여, 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 제거하기 위해 연속적인 유동 및 세포 처리를 가능하게 하는, 임의의 판매자가 제조한 임의의 기기 또는 장치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 밀폐된 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체 교환, 농축 및/또는 기타 세포 처리 단계를 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수확, 예를 들어 도 1에 따른 단계 E는 밀폐 시스템 생물반응기로부터 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 G-Rex 10 또는 G-Rex 100이다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
일부 실시양태에서, 도 1에 따른 단계 E는 실시양태 14에 기술된 공정에 따라 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 시스템의 멸균성 및 밀폐 본성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시양태에서, 실시예 14에 기술된 바와 같은 밀폐 시스템이 사용된다.
일부 실시양태에서, TIL은 실시예 14에 기술된 방법에 따라 수확된다. 일부 실시양태에서, 기술된 방법을 사용하여 1일과 11일 사이의 TIL이 수확된다(실시예 14에서는 11일 TIL 수확물이라고 지칭됨). 일부 실시양태에서, 기술된 방법을 사용하여 12일 내지 22일 사이의 TIL이 수확된다(실시예 14에서는 22일 TIL 수확이라고 지칭됨).
F. 단계 F: 확장된 TIL 검정
일부 실시양태에서, 위에 제공된 단계로부터 확장된 TIL의 효력 및/또는 기능성은 본원에 기술된 검정 방법 중 하나를 사용하여 검사된다.
실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 Gen 2 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 표적 세포와 Gen 2 TIL 생성 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. 수확물을 (1) Gen 2 TIL 생성물에 대한 하나 이상의 마커 발현 또는 (2) Gen 2 TIL 생성 세포에서 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 Gen 2 TIL 생성물에 대한 효력을 결정하는 단계.
대안적으로, 일부 실시양태에서, 확장된 TIL은 IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린 및 TNF-α로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 분석물의 ELISA 또는 자동화된 ELISA(예, ELLA) 검출과 함께 CD3 또는 CD3/CD28 비드-기반의 자극을 포함하는 조합 검정을 사용하여 분석된다. 실시양태에서, 이러한 조합 검정의 세부 사항은 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 500 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 600 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 700 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 800 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 900 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1000 pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1100 pg/mL, 또는 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1200 pg/mL이고, 여기서 테스트 물품의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
G. 단계 G: 최종 제형 및 주입 용기로의 전달
도 1에 예시적인 순서로 제공된 바와 같은 단계 A 내지 E, 및 상기 및 본원에 상세히 개략된 바와 같은 단계 F가 완료된 후, 세포는 환자에 대한 투여용 용기로 전달된다. 일부 실시양태에서, 일단 치료적으로 충분한 수의 TIL이 상기 기술된 확장 방법을 사용하여 수득되면, 이는 본원에 기술된 약제학적 조성물을 비롯한 약제학적 조성물로서 환자에게 투여하기 위해 사용되는 주입 백 또는 멸균 바이알을 포함할 수 있는 용기로 전달된다. TIL은 이러한 용기로 전달된 후 효력에 대해 평가될 수 있으며, 이는 전달 직후 또는 안정성 테스트 등을 위해 용기를 일정 기간 저장한 후에 일어날 수 있다.
실시양태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로 투여되며, 이는 바람직하게는 대략 30분 내지 60분 동안 지속된다. 다른 적합한 투여 경로로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.
V. Gen 3 TIL 제조 공정
임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 방법에 기술된 바와 같이 T 세포의 활성화를 프라이밍하는 프라이밍 1차 확장에 이어 T 세포의 활성화를 촉진하는 급속 2차 확장은 "더 젊은" 표현형을 보유하는 확장된 T 세포의 제조를 가능하게 하고, 이와 같이 본 발명의 확장된 T 세포는 다른 방법에 의해 확장된 T 세포보다 암 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다. 특히, 항-CD3 항체(예: OKT-3), IL-2 및 선택적으로 항원 제시 세포(APC)에 대한 노출에 의해 프라이밍되고, 이후 본 발명의 방법에 의해 교시된 바와 같이 추가 항-CD-3 항체(예, OKT-3), IL-2 및 APC에 대한 후속적인 노출에 의해 촉진되는 T 세포의 활성화는 배양 중 T 세포의 성숙을 제한하거나 회피하여, 덜 성숙한 표현형을 갖는 T 세포 집단을 산출하고, 여기서 T 세포는 배양 중 확장에 의해 덜 소모되고 암세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낸다. 예시적인 공정은 도 8에 도시된다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 단계는 복수의 단계로 분할되어, (a) 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양으로 T 세포를 약 3일 내지 4일의 기간 동안 배양하여 급속 2차 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양으로부터의 T 세포를 제1 용기보다 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로의 전달을 수행하고, 소규모 배양으로부터의 T 세포를 제2 용기의 대규모 배양으로 약 4 내지 7일의 기간 동안 배양하는 단계에 의해, 배양의 스케일링 업(scaling up)을 달성한다. 일부 실시양태에서, 급속 확장 단계는 복수의 단계로 분할되어, (a) 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 1차 소규모 배양으로 T 세포를 약 3일 내지 4일의 기간 동안 배양하여 급속 2차 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 1차 소규모 배양으로부터의 T 세포를 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 제2 용기로의 전달을 수행하고 배분하여, 각각의 제2 용기 중에서 이러한 제2 용기로 전달된 1차 소규모 배양으로부터의 T 세포의 일부를 2차 소규모 배양에서 약 4일 내지 7일의 기간 동안 배양하는 단계에 의해 배양의 스케일링 아웃(scaling out)을 달성한다. 일부 실시양태에서, 급속 확장 단계는 복수의 단계로 분할되어, (a) 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양으로 T 세포를 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양하여 급속 2차 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양으로부터의 T 세포를 제1 용기보다 크기가 큰 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로의 전달을 수행하고 배분하여, 각각의 제2 용기 중에서 이러한 제2 용기로 전달된 소규모 배양으로부터의 T 세포의 일부를 더 큰 규모의 배양으로 약 4일 내지 7일의 기간 동안 배양하는 단계에 의해 배양의 스케일링 업 및 스케일링 아웃을 달성한다. 일부 실시양태에서, 급속 확장 단계는 복수의 단계로 분할되어, (a) 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양으로 T 세포를 약 4일의 기간 동안 배양하여 급속 2차 확장을 수행하는 단계, 및 그 다음 (b) 소규모 배양으로부터의 T 세포를 제1 용기보다 크기가 큰 2개, 3개, 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로의 전달을 수행하고 배분하여, 각각의 제2 용기 중에서 이러한 제2 용기로 전달된 소규모 배양으로부터의 T 세포의 일부를 더 큰 규모의 배양으로 약 5일의 기간 동안 배양하는 단계에 의해 배양의 스케일링 아웃 및 스케일링 업을 달성한다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 감소, 약화, 쇠퇴하거나 또는 떨어지기 시작한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 감소한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 1% 내지 100% 또는 약 1% 내지 100% 범위의 백분율만큼 감소한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 1% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 100% 또는 약 1% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 100% 범위의 백분율만큼 감소한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%만큼 감소한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포의 활성화가 최대 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%만큼 감소한 후에 수행된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에 의해 수행된 T 세포 활성화의 감소는 항원 자극에 대한 반응으로 T 세포에 의해 방출되는 인터페론 감마 양의 감소에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 최대 또는 최대 약 7일 또는 약 8일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 최대 또는 최대 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 급속 2차 확장은 최대 또는 최대 약 11일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 급속 2차 확장은 최대 또는 최대 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 또는 11일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 급속 2차 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 1일 내지 7일 또는 약 1일 내지 약 7일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 1일 내지 11일 또는 약 1일 또는 약 11일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 최대 또는 최대 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 최대 또는 최대 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 1일 내지 8일 또는 약 1일 내지 약 8일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 1일 내지 9일 또는 약 1일 또는 약 9일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 8일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 9일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 1일 내지 7일 또는 약 1일 내지 약 7일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 1일 또는 9일 또는 약 1일 내지 약 9일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포의 프라이밍 1차 확장은 7일의 기간 동안 수행되고, T 세포의 급속 2차 확장은 9일의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 골수 침윤 림프구(MIL)이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 말초 혈액 림프구(PBL)이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 암을 앓고 있는 공여자로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 암을 앓고 있는 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득된 TIL이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 흑색종을 앓고 있는 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득된 TIL이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 혈액학적 악성종양을 앓고 있는 환자의 골수로부터 수득된 MIL이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 수득된 PBL이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 암을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암(두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 포함), 교모세포종(GBM 포함), 위장암, 신장암 및 신장 세포 암종으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암(두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 포함), 교모세포종(GBM 포함), 위장암, 신장암 및 신장 세포 암종으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 공여자는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 액체 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 혈액학적 악성종양을 앓고 있다.
본 개시내용의 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 FICOLL 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 바람직한 한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집 생성물은 전형적으로 림프구, 예를 들어 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 한 측면에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣을 수 있다. 실시양태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적인 실시양태에서, 세척 용액에는 칼슘이 결여되고 마그네슘이 결여될 수 있거나 모든 2가 양이온은 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다. 한 측면에서, T 세포는 예를 들어 PERCOLL 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용출에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 전체 혈액로부터 분리된 PBL이거나 공여자로부터 림프구가 농축된 성분채집 생성물이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 암을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인유두종 바이러스로 인해 유발된 암, 두경부암(두경부 편평세포암종(HNSCC) 포함), 교모세포종(GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장세포암종으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인유두종 바이러스로 인해 유발된 암, 두경부암(두경부 편평세포암종(HNSCC) 포함), 교모세포종(GBM 포함), 위장암, 신장암, 및 신장세포암종으로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 공여자는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 액체 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 혈액학적 악성종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, PBL은 양성 또는 음성 선택 방법을 사용하여 전체 혈액 또는 림프구가 농축된 성분채집 생성물로부터 단리되고, 즉 T 세포 표현형에 대해 마커(들), 예를 들어 CD3+, CD45+를 사용하여 PBL을 제거하거나, 또는 비-T 세포 표현형 세포를 제거함으로써 PBL을 남긴다. 다른 실시양태에서, PBL은 구배 원심분리에 의해 단리된다. 공여자 조직으로부터 PBL이 단리되면, PBL의 프라이밍 1차 확장은 본원에 기술된 임의의 방법의 프라이밍 1차 확장 단계에 따른 프라이밍 1차 확장 배양물에 적합한 수의 단리된 PBL(일부 실시양태에서, 대략 1x107 PBL)을 파종함으로써 개시될 수 있다.
이러한 특징 중 일부를 함유하는 공정 3(본원에서는 Gen 3이라고도 지칭됨)으로 알려진 예시적인 TIL 공정은 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시되어 있으며, 공정 2A에 비해 이러한 본 발명의 실시양태의 장점 중 일부는 도 1, 2, 8, 30, 및 31(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b, 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 기술되어 있다. 공정 3의 실시양태(Gen 3)는 도 8 및 30(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 도시되어 있다. 공정 2A 또는 Gen 2는 또한 미국 특허 공개 제2018/0280436호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다. Gen 3 공정은 국제 특허 공개 WO 2020/096988에도 기술되어 있다.
본원에 논의되고 일반적으로 개략된 바와 같이, TIL은 환자 샘플로부터 채취되고, 환자에게 이식하기 전에 본원에 기술되고 Gen 3으로 지칭되는 TIL 확장 공정을 사용하여 TIL의 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, TIL은 이하에 논의된 바와 같이 선택적으로 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 확장 전 또는 후에 동결보존될 수 있다. 일단 해동되면 TIL은 환자에게 주입하기 전에 대사를 증가시키기 위해 재자극될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(본원에서 사전 급속 확장(사전 REP)으로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 도시된 공정 포함)은 1 내지 8일로 단축되고, 급속 2차 확장(본원에서 급속 확장 프로토콜(REP)로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 1(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D로서 도시된 공정 포함)은 실시예 및 도면뿐만 아니라 이하에 자세히 논의되는 바와 같이 1 내지 9일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(본원에서 사전 급속 확장(사전 REP)으로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 도시된 공정 포함)은 1 내지 8일로 단축되고, 급속 2차 확장(본원에서 급속 확장 프로토콜(REP)로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D로서 도시된 공정 포함)은 실시예 및 도면뿐만 아니라 이하에 자세히 논의되는 바와 같이 1 내지 8일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(본원에서 사전 급속 확장(사전 REP)으로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 도시된 공정 포함)은 1 내지 7일로 단축되고, 급속 2차 확장(본원에서 급속 확장 프로토콜(REP)로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D로서 도시된 공정 포함)은 실시예 및 도면뿐만 아니라 이하에 자세히 논의되는 바와 같이 1 내지 9일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(본원에서 사전 급속 확장(사전 REP)으로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 도시된 공정 포함)은 1 내지 7일이고, 급속 2차 확장(본원에서 급속 확장 프로토콜(REP)로 지칭되는 공정, 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D로서 도시된 공정 포함)은 실시예 및 도면뿐만 아니라 이하에 자세히 논의되는 바와 같이 1 내지 10일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 8일로 단축되고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 7일 내지 9일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장은 8일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 8일 내지 9일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 7일로 단축되고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 1(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 7일 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 8일로 단축되고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 8일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 9일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 8일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 10일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 7일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 7일 내지 10일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 7일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 8일 내지 10일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 7일이고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 9일 내지 10일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B로서 기술된 확장)은 7일로 단축되고 급속 2차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 D에 기술된 바와 같은 확장)은 7일 내지 9일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장과 급속 2차 확장의 조합(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계 B 및 단계 D로서 기술된 확장)은 이하 및 실시예 및 도면에서 자세히 논의되는 바와 같이 14일 내지 16일이다. 특히, 본 발명의 특정 실시양태는 IL-2의 존재 하에 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT-3에 대한 노출 또는 적어도 IL-2 및 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT-3의 존재 하에 항원에 대한 노출에 의해 TIL이 활성화되는 프라이밍 1차 확장 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전술한 바와 같은 프라이밍 1차 확장 단계에서 활성화되는 TIL은 TIL의 1차 집단, 즉 1차 세포 집단이다.
이하에서 "단계" 명칭 A, B, C 등은 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 비제한적 예를 참고로 하고, 본원에 기술된 특정 비제한적 실시양태를 참고로 한다. 이하 및 도 8(특히, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서 단계의 순서는 예시적이며, 단계의 임의의 조합 또는 순서, 뿐만 아니라 추가 단계, 단계의 반복, 및/또는 단계의 생략은 본 출원 및 본원에 개시된 방법에 의해 고려된다.
A. 단계 A: 환자 종양 샘플 수득하기
일반적으로, TIL은 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 또는 순환 림프구, 예컨대 말초 혈액 림프구, 예를 들어 TIL-유사 특징을 갖는 말초 혈액 림프구로부터 초기에 수득되고, 그 다음 본원에 기술된 바와 같은 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존되고, 선택적으로 TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.
환자 종양 샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 일반적으로 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단을 통해 수득될 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함하는 임의의 고형 종양으로부터 유래될 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성 종양으로부터 수득되는 종양과 같은 액체 종양일 수도 있다. 고형 종양은 피부를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 암 유형(예를 들어, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 및 흑색종을 포함하나, 이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 유용한 TIL은 특히 높은 TIL 수준을 갖고 있는 것으로 보고된 것으로서, 악성 흑색종 종양으로부터 수득된다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 예리한 절개를 사용하여 1 내지 약 8 mm3의 작은 조각으로 단편화되며, 특히 약 2-3 mm3이 유용하다. TIL은 이들 단편으로부터 효소 종양 분해물을 사용하여 배양된다. 이러한 종양 분해물은 효소 배지(예를 들어, Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 완충액, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 젠타마이신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)에서 인큐베이션한 다음, 기계적 해리(예를 들어, 조직 해리장치 사용)에 의해 생성될 수 있다. 종양 분해물은 종양을 효소 배지에 두고, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리한 후, 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 전술한 조건 하에 기계적 해리 및 인큐베이션을 반복 순환함으로써 생성될 수 있다. 이 과정의 마지막에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 세포 또는 사세포를 함유하는 경우, 이들 세포를 제거하기 위해 FICOLL 분지형 친수성 폴리사카라이드를 이용한 밀도 구배 분리를 수행할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2012/0244133 A1호에 기술된 것이 사용될 수 있다. 임의의 전술한 방법은 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법을 위해 본원에 기술된 임의의 실시양태에 사용될 수 있다.
종양 해리 효소 혼합물은 콜라게나제(콜라게나제의 임의의 블렌드 또는 유형 포함), Accutase™, Accumax™, 히알루로니다제, 중성 프로테아제(디스파제), 키모트립신, 키모파파인, 트립신, 카제이나제, 엘라스타제, 파파인, 프로테아제 유형 XIV(프로나제), 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase), 트립신 저해제, 임의의 다른 해리 또는 단백질분해 효소, 및 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 해리(분해) 효소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 해리 효소는 동결건조된 효소로부터 재구성된다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 효소는 HBSS와 같은 상당한 양의 멸균 완충액에서 재구성된다.
일부 경우에, 콜라게나제(예컨대, 동물 성분 무함유(free)-1형 콜라게나제)는 10mL의 멸균 HBSS 또는 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소는 2892 PZ U/바이알의 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제는 5 mL 내지 15 mL 완충액에서 재구성된다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 콜라게나제 스톡은 약 100 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 예를 들어 약 100 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL - 약 350 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL - 약 300 PZ U/mL, 약 150 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL, 약 150 PZ U/mL, 약 200 PZ U/mL, 약 210 PZ U/mL, 약 220 PZ U/mL, 약 230 PZ U/mL, 약 240 PZ U/mL, 약 250 PZ U/mL, 약 260 PZ U/mL, 약 270 PZ U/mL, 약 280 PZ U/mL, 약 289.2 PZ U/mL, 약 300 PZ U/mL, 약 350 PZ U/mL, 또는 약 400 PZ U/mL의 범위이다.
일부 실시양태에서, 중성 프로테아제는 1 mL의 멸균 HBSS 또는 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소는 175 DMC U/바이알의 농도일 수 있다. 동결건조된 스톡 효소는 175 DMC/mL의 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 중성 프로테아제 스톡은 약 100 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 예를 들어 약 100 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 약 100 DMC/mL 내지 약 350 DMC/mL, 약 100 DMC/mL 내지 약 300 DMC/mL, 약 150 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 약 100 DMC/mL, 약 110 DMC/mL, 약 120 DMC/mL, 약 130 DMC/mL, 약 140 DMC/mL, 약 150 DMC/mL, 약 160 DMC/mL, 약 170 DMC/mL, 약 175 DMC/mL, 약 180 DMC/mL, 약 190 DMC/mL, 약 200 DMC/mL, 약 250 DMC/ mL, 약 300 DMC/mL, 약 350 DMC/mL, 또는 약 400 DMC/mL의 범위이다.
일부 실시양태에서, DNAse I은 1 mL의 멸균 HBSS 또는 또 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소의 농도는 4 KU/바이알이었다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 DNase I 스톡은 약 1 KU/mL 내지 10 KU/mL, 예를 들어 약 1 KU/mL, 약 2 KU/mL, 약 3 KU/mL, 약 4 KU/mL, 약 5 KU/mL, 약 6 KU/mL, 약 7 KU/mL, 약 8 KU/mL, 약 9 KU/mL, 또는 약 10 KU/mL의 농도였다.
일부 실시양태에서, 효소 스톡은 변화시켜 동결건조된 스톡의 농도를 검증하고 이에 따라 분해 칵테일에 첨가되는 효소의 최종 양을 수정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 약 10.2ul의 중성 프로테아제(0.36 DMC U/mL), 21.3ul의 콜라게나제(1.2 PZ/mL) 및 250ul의 DNAse I(200U/mL)을 약 4.7mL의 멸균 HBSS에 포함한다.
위에서 지적한 바와 같이, 일부 실시양태에서, TIL은 고형 종양으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 단편화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 단편화되지 않고 전체 종양으로서 효소 분해를 거친다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 1-2시간 동안 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 37℃, 5% CO2에서 1-2시간 동안 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 콜라게나제, DNase 및 히알루로니다제를 포함하는 효소 혼합물에서 37℃, 5% CO2에서 1-2시간 동안 회전 하에 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 일정한 회전 하에 밤새 분해된다. 일부 실시양태에서, 종양은 일정한 회전 하에 37℃, 5% CO2에서 밤새 분해된다. 일부 실시양태에서, 전체 종양은 효소와 조합되어 종양 분해 반응 혼합물을 형성한다.
일부 실시양태에서, 종양은 멸균 완충액 중 동결건조된 효소에 의해 재구성된다. 일부 실시양태에서, 완충액은 멸균 HBSS이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 콜라게나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제는 콜라게나제 IV이다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제에 대한 제조용 스톡은 100 mg/mL 10x 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 DNAse를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNAse에 대한 제조용 스톡은 10,000 IU/mL 10x 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 히알루로니다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히알루로니다제에 대한 제조용 스톡은 10 mg/mL 10x 제조용 스톡이다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 10 mg/mL 콜라게나제, 1000 IU/mL DNAse, 및 1 mg/mL 히알루로니다제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 10 mg/mL 콜라게나제, 500 IU/mL DNAse, 및 1 mg/mL 히알루로니다제를 포함한다.
일반적으로, 종양으로부터 수득한 세포 현탁액은 "1차 세포 집단", "새로 수득한" 또는 "새로 단리된" 세포 집단으로 불린다. 특정 실시양태에서, 새로 수득한 TIL의 세포 집단은 항원 제시 세포, IL-12 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에 노출된다.
일부 실시양태에서, 단편화는 예를 들어 절개, 뿐만 아니라 분해를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 절개이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 분해에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득한 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득한 효소적 종양 분해물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양은 예를 들어 단계 A(도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같음)에서 종양 샘플이 수득된 후 물리적 단편화를 겪는다. 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 종양을 수득한 후 동결보존 없이 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화 단계는 시험관내 또는 생체외 과정이다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고, 프라이밍 1차 확장을 위해 10, 20, 30, 40개 이상의 단편 또는 조각이 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고 프라이밍 1차 확장을 위해 30 또는 40개의 단편 또는 조각이 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고 프라이밍 1차 확장을 위해 40개의 단편 또는 조각이 각 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50개의 단편을 포함하며, 여기서 각 단편은 약 27mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1350mm3의 총 부피를 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1g 내지 약 1.5g의 총 질량을 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4개의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 예리한 절개에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3 사이이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3 사이이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 1-4mm x 1-4mm x 1-4mm이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 1mm x 1mm x 1mm이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 2mm x 2mm x 2mm이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 3mm x 3mm x 3mm이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 4mm x 4mm x 4mm이다.
일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 출혈성, 괴사성 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하도록 단편화된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각에서 출혈성 조직의 양을 최소화하도록 단편화된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각의 괴사성 조직의 양을 최소화하도록 단편화된다. 일부 실시양태에서, 종양은 각 조각의 지방 조직의 양을 최소화하도록 단편화된다. 특정 실시양태에서, 종양의 단편화 단계는 시험관내 또는 생체외 방법이다.
일부 실시양태에서, 종양 단편화는 종양 내부 구조를 유지하도록 수행된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편화는 메스로 톱질 동작을 수행함이 없이 수행된다. 일부 실시양태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로, RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10 mg/mL 젠타마이신, 30 U/mL DNase 및 1.0 mg/mL 콜라게나제에서의 인큐베이션에 이어 기계적 해리(GentleMACS, Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 어번)에 의해 발생되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후 종양은 대략 1분 동안 기계적으로 해리될 수 있다. 그런 다음 용액은 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있고, 그 다음 다시 대략 1분 동안 기계적으로 파괴된다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양은 대략 1분 동안 3번째로 기계적으로 파괴될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우 3차 기계적 파괴 후, 5% CO2, 37℃에서 추가 30분의 인큐베이션 여부에 관계없이 샘플에 1회 또는 2회의 추가적인 기계적 해리를 적용했다. 일부 실시양태에서, 최종 인큐베이션의 마지막에 세포 현탁액에 다수의 적혈구 또는 사세포가 함유된 경우, 이들 세포를 제거하기 위해 Ficoll을 사용한 밀도 구배 분리가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 단계 이전의 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수확된" 또는 "새로 단리된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, 세포는 샘플 단리(예를 들어, 종양 샘플을 수득한 후 및/또는 종양 샘플로부터 세포 현탁액을 수득한 후) 후 선택적으로 동결될 수 있고, 이하에 더 자세히 기술될 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어 도 8b)에 예시되는 단계 B에 기술된 확장으로 들어가기 전에 동결 저장된다.
1. 중심부/소형 생검 유래 TIL
일부 실시양태에서, TIL은 코어 생검 또는 유사한 절차에 의해 수득한 환자 종양 샘플("원발성 TIL")로부터 초기에 수득된 다음, 본원에 기술된 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존되고, 선택적으로 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.
일부 실시양태에서, 환자 종양 샘플은 일반적으로 소형 생검, 코어 생검, 바늘 생검 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 기타 수단을 통해 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함하는 임의의 고형 종양으로부터 유래될 수 있다. 종양 샘플은 또한 혈액학적 악성 종양으로부터 수득한 종양과 같은 액체 종양일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다수의 작은 종양 샘플 또는 생검으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동일한 환자의 단일 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동일한 환자로부터의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동일한 환자의 다수의 종양으로부터의 다수의 종양 샘플을 포함할 수 있다. 고형 종양은 흑색종이다.
일반적으로, 종양 코어 또는 단편으로부터 수득한 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수득한" 또는 "새로 단리된" 세포 집단으로 불린다. 특정 실시양태에서, 새로 수득한 TIL의 세포 집단은 항원 제시 세포, IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에 노출된다.
일부 실시양태에서, 종양이 전이성이고 원발성 병변이 과거에 효율적으로 치료/제거된 경우, 전이성 병변 중 하나의 제거가 필요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최소 침습 접근법은 피부 병변 또는 가능한 경우 목 또는 겨드랑이 부위의 림프절을 제거하는 것이다. 일부 실시양태에서, 피부 병변이 제거되거나 이의 소형 생검이 제거된다. 일부 실시양태에서, 림프절 또는 이의 소형 생검이 제거된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 흑색종에 대한 소형 생검은 점 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소형 생검은 펀치 생검이다. 일부 실시양태에서, 펀치 생검은 피부에 원형 칼날을 압착시켜 수득한다. 일부 실시양태에서, 펀치 생검은 의심스러운 점 주위의 피부에 원형 칼날을 압착시켜 수득한다. 일부 실시양태에서, 펀치 생검은 원형 칼날을 피부에 압착시켜 수득하고, 둥근 피부 조각을 제거한다. 일부 실시양태에서, 소형 생검은 펀치 생검이고 종양의 둥근 부분이 제거된다.
일부 실시양태에서, 소형 생검은 절제 생검이다. 일부 실시양태에서, 소형 생검은 절제 생검이며 전체 점 또는 혹이 제거된다. 일부 실시양태에서, 소형 생검은 절제 생검이며, 정상으로 보이는 피부의 작은 경계를 따라 전체 점 또는 혹이 제거된다.
일부 실시양태에서, 소형 생검은 절개 생검이다. 일부 실시양태에서, 소형 생검은 절개 생검이며, 점 또는 혹의 가장 불규칙한 부분만이 채취된다. 일부 실시양태에서, 소형 생검은 절개 생검이고, 절개 생검은 의심스러운 점이 매우 큰 경우와 같이 다른 기술이 끝낼 수 없는 경우에 사용된다.
"고형 종양"이라는 용어는 일반적으로 낭종이나 액체 부위를 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성일 수도 있고 악성일 수도 있다. "고형 종양 암"이라는 용어는 악성, 신생물성 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 고형 종양의 조직 구조는 실질(암 세포) 및 암 세포가 분산되어 있고 지지 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 간질 세포를 포함하는 상호의존적인 조직 구획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양으로부터의 샘플은 미세 바늘 흡인물(FNA), 코어 생검, 소형 생검(예를 들어 펀치 생검 포함)으로서 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 먼저 G-Rex 10에 배치된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2개의 코어 생검 및/또는 소형 생검 샘플이 있는 경우, 샘플은 먼저 G-Rex 10에 배치된다. 일부 실시양태에서, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 코어 생검 및/또는 소형 생검 샘플이 있는 경우, 샘플은 먼저 G-Rex 100에 배치된다. 일부 실시양태에서, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 코어 생검 및/또는 소형 생검 샘플이 있는 경우, 샘플은 먼저 G-Rex 500에 배치된다.
FNA는 예를 들어 흑색종을 비롯한 피부 종양으로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에는 흑색종 환자는 이전에 외과적 치료를 받은 적이 있다.
본원에 기술된 TIL은 FNA 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 경우에, FNA 샘플은 18게이지 바늘 내지 25게이지 바늘 범위의 미세 게이지 바늘을 사용하여 환자로부터 수득되거나 단리된다. 미세 게이지 바늘은 18게이지, 19게이지, 20게이지, 21게이지, 22게이지, 23게이지, 24게이지 또는 25게이지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자로부터의 FNA 샘플은 적어도 400,000 TIL, 예를 들어 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL 이상을 함유할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 TIL은 코어 생검 샘플로부터 수득된다. 일부 경우에는, 코어 생검 샘플은 11게이지 바늘 내지 16게이지 바늘 범위의 외과용 또는 의료용 바늘을 사용하여 환자로부터 수득되거나 단리된다. 바늘은 11게이지, 12게이지, 13게이지, 14게이지, 15게이지 또는 16게이지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자로부터의 코어 생검 샘플은 적어도 400,000 TIL, 예를 들어 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL 이상을 함유할 수 있다.
일반적으로, 수확된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수확된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 중심부는 단편화되지 않는다.
일부 실시양태에서, TIL은 종양 분해물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로, RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10 mg/mL 젠타마이신, 30 U/mL DNase 및 1.0 mg/mL 콜라게나제에서의 인큐베이션에 이어 기계적 해리(GentleMACS, Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 어번)에 의해 발생되었다. 종양을 효소 배지에 넣은 후 종양은 대략 1분 동안 기계적으로 해리될 수 있다. 그런 다음 용액은 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있고, 그 다음 다시 대략 1분 동안 기계적으로 파괴된다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양은 대략 1분 동안 3번째로 기계적으로 파괴될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우 3차 기계적 파괴 후, 5% CO2, 37℃에서 추가 30분의 인큐베이션 여부에 관계없이 샘플에 1회 또는 2회의 추가적인 기계적 해리를 적용했다. 일부 실시양태에서, 최종 인큐베이션의 마지막에 세포 현탁액에 다수의 적혈구 또는 사세포가 함유된 경우, 이들 세포를 제거하기 위해 Ficoll을 사용한 밀도 구배 분리가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 제1 집단을 수득하는 것은 다병변 샘플링 방법을 포함한다.
종양 해리 효소 혼합물은 콜라게나제(콜라게나제의 임의의 블렌드 또는 유형 포함), Accutase™, Accumax™, 히알루로니다제, 중성 프로테아제(디스파제), 키모트립신, 키모파파인, 트립신, 카제이나제, 엘라스타제, 파파인, 프로테아제 유형 XIV(프로나제), 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase), 트립신 저해제, 기타 해리 또는 단백질분해 효소, 및 이들의 조합과 같은 하나 이상의 해리(분해) 효소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 해리 효소는 동결건조된 효소로부터 재구성된다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 효소는 HBSS와 같은 상당량의 멸균 완충액에서 재구성된다.
일부 경우에, 콜라게나제(예컨대, 동물 성분 무함유(free)-1형 콜라게나제)는 10mL의 멸균 HBSS 또는 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소는 2892 PZ U/바이알의 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라게나제는 5 mL 내지 15 mL 완충액에서 재구성된다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 콜라게나제 스톡은 약 100 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 예를 들어 약 100 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL - 약 350 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL - 약 300 PZ U/mL, 약 150 PZ U/mL - 약 400 PZ U/mL, 약 100 PZ U/mL, 약 150 PZ U/mL, 약 200 PZ U/mL, 약 210 PZ U/mL, 약 220 PZ U/mL, 약 230 PZ U/mL, 약 240 PZ U/mL, 약 250 PZ U/mL, 약 260 PZ U/mL, 약 270 PZ U/mL, 약 280 PZ U/mL, 약 289.2 PZ U/mL, 약 300 PZ U/mL, 약 350 PZ U/mL, 또는 약 400 PZ U/mL의 범위이다.
일부 실시양태에서, 중성 프로테아제는 1 mL의 멸균 HBSS 또는 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소는 175 DMC U/바이알의 농도일 수 있다. 동결건조된 스톡 효소는 175 DMC/mL의 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 중성 프로테아제 스톡은 약 100 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 예를 들어 약 100 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 약 100 DMC/mL 내지 약 350 DMC/mL, 약 100 DMC/mL 내지 약 300 DMC/mL, 약 150 DMC/mL 내지 약 400 DMC/mL, 약 100 DMC/mL, 약 110 DMC/mL, 약 120 DMC/mL, 약 130 DMC/mL, 약 140 DMC/mL, 약 150 DMC/mL, 약 160 DMC/mL, 약 170 DMC/mL, 약 175 DMC/mL, 약 180 DMC/mL, 약 190 DMC/mL, 약 200 DMC/mL, 약 250 DMC/ mL, 약 300 DMC/mL, 약 350 DMC/mL, 또는 약 400 DMC/mL의 범위이다.
일부 실시양태에서, DNAse I은 1 mL의 멸균 HBSS 또는 또 다른 완충액에서 재구성된다. 동결건조된 스톡 효소의 농도는 4 KU/바이알이었다. 일부 실시양태에서, 재구성 후 DNase I 스톡은 약 1 KU/mL 내지 10 KU/mL, 예를 들어 약 1 KU/mL, 약 2 KU/mL, 약 3 KU/mL, 약 4 KU/mL, 약 5 KU/mL, 약 6 KU/mL, 약 7 KU/mL, 약 8 KU/mL, 약 9 KU/mL, 또는 약 10 KU/mL의 농도였다.
일부 실시양태에서, 효소 스톡은 변화시켜 동결건조된 스톡의 농도를 검증하고 이에 따라 분해 칵테일에 첨가되는 효소의 최종 양을 수정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 효소 혼합물은 약 10.2ul의 중성 프로테아제(0.36 DMC U/mL), 21.3ul의 콜라게나제(1.2 PZ/mL) 및 250ul의 DNAse I(200U/mL)을 약 4.7mL의 멸균 HBSS에 포함한다.
2. 흉막 삼출액 TIL
일부 실시양태에서, 샘플은 흉막액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공정에 따른 확장을 위한 TIL의 공급원은 흉막액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 흉막 삼출액 유래 샘플이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 공정에 따른 확장을 위한 TIL의 공급원은 흉막 삼출액 유래 샘플이다. 예를 들어, 모든 목적에 대해 전체 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 공개 제US 2014/0295426호에 기술된 방법을 참고한다.
일부 실시양태에서, TIL을 함유하는 것으로 의심되고/되거나 TIL을 함유하는 임의의 흉막액 또는 흉막삼출액이 사용될 수 있다. 이러한 샘플은 NSCLC 또는 SCLC와 같은 원발성 또는 전이성 폐암으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 또 다른 기관, 예를 들어 유방, 난소, 결장 또는 전립선에서 유래된 2차 전이암 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법에 사용하기 위한 샘플은 흉막 삼출물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법에 사용하기 위한 샘플은 흉막 누출물이다. 다른 생물학적 샘플은 TIL을 함유하는 기타 장액, 예를 들어, 복부 유래 복수액 또는 췌장 낭종액을 포함할 수 있다. 복수액 및 흉막액은 매우 유사한 화학 시스템을 수반한다; 복부와 폐는 둘 모두가 중피선을 갖고 흉막 공간 및 복부 공간에서 악성 종양의 동일한 물질의 유체를 형성하고, 이러한 유체는 일부 실시양태에서 TIL을 함유한다. 본 개시내용이 흉막액을 예시하는 일부 실시양태에서, 동일한 방법이 TIL을 함유하는 복수 또는 기타 낭종액을 사용하여 유사한 결과로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 흉막액은 환자로부터 제거된 즉시 미처리 형태이다. 일부 실시양태에서, 미처리 흉막액은 접촉 단계 전에 EDTA 또는 헤파린 튜브와 같은 표준 혈액 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 미처리 흉막액은 접촉 단계 전에 표준 CellSave® 튜브(Veridex)에 배치된다. 일부 실시양태에서, 생존 TIL 수가 감소하는 것을 방지하기 위해 환자로부터 수집한 직후 샘플은 CellSave 튜브에 배치된다. 생존 TIL의 수는 미처리 흉막액 내에, 심지어 4℃에서 방치된다면, 24시간 이내에 유의미한 정도로 감소할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 제거된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간 또는 최대 24시간 내에 적절한 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 4℃에서 환자로부터 제거된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간 또는 최대 24시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다.
일부 실시양태에서, 선택된 대상체로부터의 흉막액 샘플은 희석될 수 있다. 실시양태에서, 희석은 1:10 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:9 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:8 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:5 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:2 흉막액 대 희석제이다. 다른 실시양태에서, 희석은 1:1 흉막액 대 희석제이다. 일부 실시양태에서, 희석제는 식염수, 인산염 완충 식염수, 또 다른 완충액 또는 생리학적으로 허용되는 희석제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 수집, 및 희석 직후 CellSave 튜브에 배치되어 미처리 흉막액에, 심지어 4℃에서 방치된 경우에도 24-48시간 이내에 유의미한 정도로 일어날 수 있는 생존 TIL의 감소를 피한다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 환자로부터 제거되고 희석된 후 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간, 36시간, 최대 48시간 이내에 적절한 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 환자로부터 제거 및 4℃에서 희석된 후, 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간, 36시간, 최대 48시간 내에 적절한 수집 튜브에 배치된다.
또 다른 실시양태에서, 흉막액 샘플은 추가 처리 단계 전에 통상의 수단에 의해 농축된다. 일부 실시양태에서, 흉막액의 이러한 전처리는 방법을 수행하는 실험실로의 배송을 위해 또는 추후 분석을 위해(예를 들어, 수집 후 24-48시간 이후) 흉막액을 동결보존해야 하는 상황에서 바람직하다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 대상체로부터 채취한 후 흉막액 샘플을 원심분리하고 원심분리액 또는 펠릿을 완충액에 재현탁시켜 제조한다. 일부 실시양태에서, 흉막액 샘플은 수송 또는 추후 분석 및/또는 처리를 위해 동결보존되기 전에 다수의 원심분리 및 재현탁을 거친다.
일부 실시양태에서 흉막액 샘플은 추가 처리 단계 전에 여과 방법을 사용하여 농축된다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계에 사용되는 흉막액 샘플은 흉막액이 멤브레인을 통과하도록 허용하지만 종양 세포는 보유하는 공지되고 본질적으로 균일한 기공 크기를 함유하는 필터를 통해 유체를 여과함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 멤브레인의 기공 직경은 적어도 4μM일 수 있다. 다른 실시양태에서 기공 직경은 5 μM 이상일 수 있고, 다른 실시양태에서는 6, 7, 8, 9 또는 10 μM 중 어느 하나일 수 있다. 여과 후, 멤브레인에 의해 보유된 TIL을 포함한 세포는 적합한 생리학적으로 허용되는 완충액 내로 멤브레인으로부터 헹궈낼 수 있다. 이러한 방식으로 농축된 TIL을 포함한 세포는 이후 방법의 접촉 단계에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 흉막액 샘플(예를 들어, 미처리된 흉막액 포함), 희석된 흉막액 또는 재현탁된 세포 펠릿은 샘플에 존재하는 비핵화 적혈구를 차별적으로 용해하는 용해 시약과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 이 단계는 흉막액이 상당한 수의 RBC를 함유하는 상황에서 추가 처리 단계 전에 수행된다. 적합한 용해 시약은 단일 용해 시약 또는 용해 시약 및 켄치 시약, 또는 용해제, 켄치 시약 및 고정 시약을 포함한다. 적합한 용해 시스템은 상업적으로 시판되며 BD Pharm Lyse™ 시스템(Becton Dickenson)을 포함한다. 다른 용해 시스템으로는 Versalyse™ 시스템, FACSlyse™ 시스템(Becton Dickenson), Immunoprep™ 시스템 또는 Erythrolyse II 시스템(Beckman Coulter, Inc.), 또는 염화암모늄 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 시약은 적혈구의 효율적인 용해, 및 흉막액 내 TIL 및 TIL의 표현형 특성의 보존이라는 주요 요구 사항에 따라 달라질 수 있다. 용해를 위해 단일 시약을 사용하는 것 외에도, 본원에 기술된 방법에 유용한 용해 시스템은 제2 시약, 예를 들어 방법의 나머지 단계 동안 용해 시약의 효과를 켄치하거나 지체시키는 것, 예를 들어 Stabilyse™ 시약(Beckman Coulter, Inc.)을 포함할 수 있다. 또한, 방법의 바람직한 구현예 또는 용해 시약의 선택에 따라 통상의 고정 시약이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 미처리, 희석 또는 다중 원심분리 또는 처리된 흉막액 샘플은 본원에 제공된 바와 같이 추가 처리 및/또는 확장되기 전에 약 -140℃의 온도에서 동결보존된다.
3. 말초 혈액으로부터 말초 혈액 림프구(PBL)를 확장시키는 방법
PBL 방법 1. 본 발명의 실시양태에서, PBL은 본원에 기술된 공정을 사용하여 확장된다. 본 발명의 실시양태에서, 방법은 전체 혈액로부터 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 방법은 비-CD19+ 분획의 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 순수한 T 세포를 단리함으로써 T 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 방법은 비-CD19+ 분획의 자기 비드 기반의 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 순수한 T 세포를 단리함으로써 T 세포를 농축하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시양태에서, PBL 방법 1은 다음과 같이 수행된다: 0일째에, 동결보존된 PBMC 샘플을 해동하고 PBMC를 계수한다. T 세포는 Human Pan T-Cell Isolation Kit 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 단리한다.
PBL 방법 2. 본 발명의 실시양태에서, PBL은 전체 혈액로부터 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함하는 PBL 방법 2를 사용하여 확장된다. PBMC로부터의 T 세포는 PBMC를 37℃에서 적어도 3시간 동안 인큐베이션한 다음 비-부착성 세포를 단리함으로써 농축된다.
본 발명의 실시양태에서, PBL 방법 2는 다음과 같이 수행된다: 0일째에, 동결보존된 PMBC 샘플을 해동하고, PBMC 세포를 CM-2 배지에서 6웰 플레이트에 웰당 600만 개의 세포로 파종하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 3시간 후, PBL인 비-부착성 세포를 제거하고 계수한다.
PBL 방법 3. 본 발명의 실시양태에서, PBL은 말초 혈액으로부터 PBMC 샘플을 수득하는 것을 포함하는 PBL 방법 3을 사용하여 확장한다. B 세포는 CD19+ 선택을 사용하여 단리하고, T 세포는 PBMC 샘플의 비-CD19+ 분획의 음성 선택을 사용하여 선택한다.
본 발명의 실시양태에서, PBL 방법 3은 다음과 같이 수행한다: 0일차에, 말초 혈액으로부터 유래된 동결보존된 PBMC를 해동하고 계수한다. CD19+ B 세포는 CD19 Multisort Kit, Human(Miltenyi Biotec)을 사용하여 분류한다. 비-CD19+ 세포 분획 중 T 세포는 Human Pan T 세포 단리 키트 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 정제한다.
실시양태에서, PBMC는 전체 혈액 샘플로부터 단리된다. 실시양태에서, PBMC 샘플은 PBL을 확장하기 위해 출발 물질로서 사용된다. 실시양태에서, 샘플은 확장 공정 전에 동결보존된다. 다른 실시양태에서, PBL을 확장하기 위해 출발 물질로서 신선한 샘플을 사용한다. 본 발명의 실시양태에서, T 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 PBMC로부터 단리된다. 실시양태에서, T 세포는 Human Pan T 세포 단리 키트 및 LS 컬럼을 사용하여 단리된다. 본 발명의 실시양태에서, T 세포는 관련 기술분야에 공지된 항체 선택 방법, 예를 들어 CD19 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리된다.
본 발명의 실시양태에서, PBMC 샘플은 비-부착성 세포를 식별하는데 효과적인 원하는 온도에서 일정 기간 동안 인큐베이션된다. 본 발명의 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 3시간이다. 본 발명의 실시양태에서, 온도는 약 37℃이다. 그런 다음, 비-부착성 세포는 전술한 공정을 사용하여 확장된다.
일부 실시양태에서, PBMC 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 선택적으로 사전 치료된 대상체 또는 환자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 사전 치료된 대상체 또는 환자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, PBMC 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 사전 치료되고, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 또는 1년 이상 동안 치료를 받은 대상체 또는 환자로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, PBMC는 현재 이브루티닙과 같은 ITK 저해제 요법을 받고 있는 환자로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, PBMC 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 사전 치료를 받았고 키나제 저해제 또는 ITK 저해제, 예컨대 이브루티닙을 사용한 치료에 불응성인 대상체 또는 환자로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, PBMC 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 사전 치료를 받았으나 더 이상 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 사용한 치료를 받고 있지 않은 대상체 또는 환자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, PBMC 샘플은 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 포함하는 요법으로 사전 치료를 받았지만 더 이상 키나제 저해제 또는 ITK 저해제를 사용한 치료를 받고 있지 않으며, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년 이상 동안 치료를 받지 않은 대상체 또는 환자로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, PBMC는 이전에 ITK 저해제에 노출되었으나 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월 또는 적어도 1년 동안 치료되지 않은 환자로부터 유래된다.
본 발명의 실시양태에서, 0일째 세포는 CD19+에 대해 선택되고 이에 따라 분류된다. 본 발명의 실시양태에서, 선택은 항체 결합 비드를 사용하여 이루어진다. 본 발명의 실시양태에서, 순수 T 세포는 0일째 PBMC로부터 단리된다.
본 발명의 실시양태에서, 이브루티닙 또는 다른 ITK 저해제로 사전 치료되지 않은 환자인 경우, 10-15 mL의 연층는 약 5×109 PBMC를 산출할 것이며, 이는 결국 약 5.5×107 PBL을 산출할 것이다.
본 발명의 실시양태에서, 이브루티닙 또는 다른 ITK 저해제로 사전 치료된 환자의 경우, 확장 공정은 약 20x109 PBL을 산출할 것이다. 본 발명의 실시양태에서, 40.3×106 PBMC는 약 4.7×105 PBL을 산출할 것이다.
임의의 전술한 실시양태에서, PBMC는 전체 혈액 샘플로부터, 성분채집술에 의해, 연층로부터, 또는 PBMC를 수득하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법으로부터 유래될 수 있다.
4. 골수 유래 PBMC로부터 골수 침윤 림프구(MIL)를 확장시키는 방법
MIL 방법 3. 본 발명의 실시양태에서, 방법은 골수로부터 PBMC를 수득하는 것을 포함한다. 0일째, PBMC는 CD3+/CD33+/CD20+/CD14+에 대해 선택되고, 분류되며, 비-CD3+/CD33+/CD20+/CD14+ 세포 분획은 초음파처리되고, 초음파처리된 세포 분획의 일부는 선택된 세포 분획에 다시 첨가된다.
본 발명의 실시양태에서, MIL 방법 3은 다음과 같이 수행된다: 0일째, 동결보존된 PBMC 샘플은 해동되고 PBMC는 계수된다. 세포는 CD3, CD33, CD20 및 CD14 항체로 염색하고 분류된 S3e 세포(Bio-Rad)를 사용하여 분류한다. 세포는 면역 세포 분획(또는 MIL 분획)(CD3+CD33+CD20+CD14+)과 AML 모세포 분획(비-CD3+CD33+CD20+CD14+)인 2개의 분획으로 분류된다.
본 발명의 실시양태에서, PBMC는 골수로부터 수득된다. 실시양태에서, PBMC는 성분채집술, 흡인, 바늘 생검, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 유사한 수단을 통해 골수로부터 수득된다. 실시양태에서, PBMC는 신선하다. 다른 실시양태에서, PBMC는 동결보존된다.
본 발명의 실시양태에서, MIL은 10-50 mL의 골수 흡인물로부터 확장된다. 본 발명의 실시양태에서, 10 mL의 골수 흡인물이 환자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 20mL의 골수 흡인물이 환자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 30mL의 골수 흡인물이 환자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 40mL의 골수 흡인물이 환자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 50mL의 골수 흡인물이 환자로부터 수득된다.
본 발명의 실시양태에서, 약 10-50 mL의 골수 흡인물로부터 산출된 PBMC의 수는 약 5×107 내지 약 10×107 PBMC이다. 다른 실시양태에서, 산출된 PBMC의 수는 약 7×107 PBMC이다.
본 발명의 실시양태에서, 약 5×107 내지 약 10×107 PBMC는 약 0.5×106 내지 약 1.5×106 MIL을 산출한다. 본 발명의 실시양태에서, 약 1×106 MIL이 산출된다.
본 발명의 실시양태에서, 골수 흡인물로부터 유래된 12×106 PBMC는 대략 1.4×105 MIL을 초래한다.
임의의 전술한 실시양태에서, PBMC는 전체 혈액 샘플, 골수, 성분채집술, 연층, 또는 PBMC를 수득하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법으로부터 유래될 수 있다.
B. 단계 B: 프라이밍 1차 확장
일부 실시양태에서, 본 방법은 더 젊은 TIL을 제공하며, 이는 더 늙은 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여하기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 겪은 TIL)에 비해 추가적인 치료 이점을 제공할 수 있다. 젊은 TIL의 특징은 문헌, 예를 들어 Donia, 등, Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley 등, Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang 등, J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser 등, Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser 등, J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, 등, J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen 등, J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou 등, J Immunother, 28:53-62 (2005); 및 Tran, 등, J Immunother, 31:742-751 (2008)에 기술되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, 도 1(특히, 예를 들어, 도 1b 및/또는 도 8c)의 단계 A에 기술된 바와 같이, 종양 단편 및/또는 종양 단편의 절개 또는 분해 후, 결과적으로 생성된 세포는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하는 조건 하에 IL-2, OKT-3, 및 배양보조 세포(예를 들어, 항원 제시 배양보조 세포)를 함유하는 혈청에서 배양된다. 일부 실시양태에서, IL-2, OKT-3, 및 배양보조 세포는 종양 분해물 및/또는 종양 단편과 함께 배양 개시 시(예를 들어, 0일째)에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물 및/또는 종양 단편은 용기당 최대 60개의 단편을 포함한 용기에서 6000 IU/mL의 IL-2와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 이 1차 세포 집단은 일정 기간 동안, 일반적으로 1일 내지 8일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 1차 세포 집단은 일정 기간 동안, 일반적으로 1일 내지 7일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장은 1일 내지 8일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장은 1일 내지 7일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 5일 내지 8일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 5일 내지 7일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 약 6일 내지 8일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 약 6일 내지 7일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 약 7일 내지 8일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 약 7일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이 프라이밍 1차 확장은 약 8일의 기간 동안 일어나, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다.
바람직한 실시양태에서, TIL의 확장은 이하 및 본원에 기술된 바와 같은 프라이밍 1차 확장 단계(예를 들어, 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고 지칭되는 공정을 포함할 수 있고 0일째 및/또는 배양 개시부터 배양보조 세포를 함유하는 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 B에 기술된 것), 그 다음 단계 D 하에 아래에 기술되고 본원에 기술된 바와 같은 급속 2차 확장(단계 D, 예를 들어 급속 확장 프로토콜(REP) 단계라고 지칭되는 공정), 그 다음 선택적인 동결보존, 및 그 다음 이하에 그리고 본원에 기술된 바와 같은 2차 단계 D(예를 들어, 재자극 REP 단계라고 지칭되는 공정)를 사용하여 수행될 수 있다. 이 공정으로부터 수득되는 TIL은 본원에 기술된 바와 같은 표현형 특징 및 대사 매개변수에 대해 선택적으로 특성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1mm3 내지 10 mm3 사이이다.
일부 실시양태에서, 1차 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"이라고 지칭된다. 일부 실시양태에서, 단계 B에 대한 CM은 10% 인간 AB 혈청, 25mM Hepes 및 10 mg/mL 젠타마이신이 보충된 GlutaMAX를 포함하는 RPMI 1640으로 구성된다.
일부 실시양태에서, 종양 단편은 240개 이하이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 4개 이하의 용기에 배치된 240개 이하이다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 60개 이하가 1개의 용기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 각 용기는 용기당 500 mL 이하의 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 항원-제시 배양보조 세포(또한, 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 30 ng/mL의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 30ng의 OKT-3, 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 6000 IU/mL의 IL-2, 30ng/mL의 OKT-3, 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다.
종양 단편의 제조 후, 결과적으로 생성된 세포(즉, 1차 세포 집단인 단편)는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하고 0일차에 배양 개시부터 TIL 프라이밍 및 가속된 성장을 허용하는 조건 하에 IL-2, 항원 제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 함유하는 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물 및/또는 종양 단편은 6000 IU/mL의 IL-2, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포 및 OKT-3과 함께 인큐베이션된다. 이러한 1차 세포 집단은 일정 기간, 일반적으로 1일 내지 8일 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 성장 배지는 IL-2 또는 이의 변이체, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 1차 세포 집단은 일정 기간, 일반적으로 1일 내지 7일 동안 배양되어, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1x108 벌크 TIL 세포를 초래한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 성장 배지는 IL-2 또는 이의 변이체, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-2는 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)이다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 20-30 x 106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 20 x 106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 25 x 106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 1mg 바이알에 대해 30 x 106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 4-8 x 106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 5-7 x 106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 6 x 106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 스톡 용액은 실시예 C에 기술된 바와 같이 제조된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 15 ng/mL 내지 30 ng/mL 사이의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모나브이다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 하나 이상의 TNFRSF 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제이고, 4-1BB 작용제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질 및 이의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합물로 구성된 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지에서 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지에서 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFRSF 작용제에 더하여, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFRSF 작용제에 더하여, 프라이밍 1차 확장 세포 배양 배지는 약 6000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제이다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지는 배양 배지의 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서는 CM1(배양 배지 1)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25mM Hepes 및 10mg/mL 젠타마이신이 보충된 GlutaMAX를 함유한 RPMI 1640으로 구성된다. 일부 실시양태에서, CM은 실시예에 기술된 CM1이다, 실시예 1 참조. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 1차 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 배양 배지 또는 초기 세포 배양 배지 또는 1차 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 배양보조 세포(본원에서 배양보조 세포라고도 지칭됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 확장 공정에 사용되는 배양 배지는 무혈청 배지 또는 한정(defined) 배지이다. 일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기본 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 부분적으로 혈청 함유 배지의 로트간 변동으로 인한 실험적 변동을 방지 및/또는 감소시키기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기본 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기본 세포 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CTS™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno-Free 배지, Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 혈청 보충물 또는 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer T-세포 확장 혈청 보충물, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 항생제, 및 하나 이상의 미량 원소 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원 글루타티온, L-아스코르브산-2-인산염, 철 포화 트랜스페린, 인슐린 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-머캅토에탄올을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 면역 세포 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CST™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno-Free 배지, Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 통상의 성장 배지와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지 내 총 혈청 대체물 농도(vol%)는 총 무혈청 또는 한정 배지의 부피를 기준으로 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 3%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 5%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 10%이다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 1L CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지와 26mL CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 55mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충되며 배지 내 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시양태에서, 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 1L CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지와 26mL CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 55mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 약 3000IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)으로 보충되며, 배지 내 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 0.5mM 내지 약 9mM, 1mM 내지 약 8mM, 2 mM 내지 약 7 mM, 3 mM 내지 약 6 mM, 또는 4 mM 내지 약 5 mM 농도의 글루타민(즉, GlutaMAX®)이 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 2mM 농도의 글루타민(즉, GlutaMAX®)이 보충된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 5mM 내지 약 150mM, 10mM 내지 약 140mM, 15mM 내지 약 130mM, 20mM 내지 약 120mM, 25mM 내지 약 110mM, 30mM 내지 약 100mM, 35mM 내지 약 95mM, 40mM 내지 약 90mM, 45mM 내지 약 85mM, 50mM 내지 약 80mM, 55mM 내지 약 75mM, 60mM 내지 약 70mM, 또는 약 65mM 농도의 2-머캅토에탄올이 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 55mM 농도의 2-머캅토에탄올이 보충된다. 일부 실시양태에서, 배지 중 2-머캅토에탄올의 최종 농도는 55μM이다.
일부 실시양태에서, 본원에 참고로 포함된 국제 PCT 공개 번호 WO/1998/030679에 기술된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 해당 간행물에는 무혈청 진핵 세포 배양 배지가 기술되어 있다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지는 무혈청 배양물에서 세포의 성장을 지원할 수 있는 무혈청 보충제가 보충된 기본 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지 보충제는 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 미량 원소 및 하나 이상의 항생제로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하거나 또는 조합함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 베타-머캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 또는 알부민 대체물 및 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체 및 하나 이상의 미량 원소로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-인산염, 철 포화 트랜스페린, 인슐린 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기본 세포 배지는 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지로 구성된 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 내 글리신의 농도는 약 5-200 mg/L 범위이고, L-히스티딘의 농도는 약 5-250 mg/L이고, L-이소류신의 농도는 약 5-300 mg/L이며, L-메티오닌 농도는 약 5-200 mg/L, L-페닐알라닌 농도는 약 5-400 mg/L, L-프롤린 농도는 약 1-1000 mg/L, L-하이드록시프롤린 농도는 약 1-45 mg/L, L-세린 농도는 약 1-250 mg/L, L-트레오닌 농도는 약 10-500 mg/L, L-트립토판 농도는 약 2-110 mg/L, L-티로신 농도는 약 3-175 mg/L, L-발린 농도는 약 5-500 mg/L, 티아민 농도는 약 1-20 mg/L, 환원된 글루타티온 농도는 약 1-20 mg/L, L-아스코르브산-2-인산염 농도는 약 1-200 mg/L, 철 포화 트랜스페린 농도는 약 1-50 mg/L, 인슐린 농도는 약 1-100mg/L, 아셀렌산 나트륨 농도는 약 0.000001-0.0001 mg/L, 및 알부민(예: AlbuMAX® I) 농도는 약 5000-50,000 mg/L이다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 내 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래 표 4의 "1X 배지 내 농도 범위"라는 제목 아래의 열에 나열된 농도 범위로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지 내 비-미량 원소 모이어티 성분은 아래 표 3의 "1X 배지의 바람직한 실시양태"라는 제목 아래의 열에 나열된 최종 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지는 무혈청 보충제를 포함하는 기본 세포 배지이다. 이들 실시양태 중 일부에서, 무혈청 보충제는 아래 표 4의 "보충제의 바람직한 실시양태"라는 제목 아래의 열에 나열된 유형 및 농도의 비-미량 모이어티 성분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 한정 배지의 삼투압농도는 약 260 내지 350 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 삼투압농도는 약 280 내지 310 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 최대 약 3.7 g/L, 또는 약 2.2 g/L 중탄산나트륨으로 보충된다. 한정 배지는 L-글루타민(최종 농도 약 2 mM), 하나 이상의 항생제, 비-필수 아미노산(NEAA; 최종 농도 약 100 μM), 2-머캅토에탄올(최종 농도 약 100 μM)로 추가로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 문헌[Smith, 등, "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clin. Transl. Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)]에 기술된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 간략히 설명하면, RPMI 또는 CTS™ OpTmizer™은 기본 세포 배지로 사용하고 0, 2%, 5% 또는 10% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물을 보충했다.
실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기 내의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기 내의 세포 배지에는 베타-머캅토에탄올(BME 또는 βME; 2-머캅토에탄올이라고도 알려짐, CAS 60-24-2)이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의되는 바와 같이 1 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 2 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 3 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의되는 바와 같이, 4 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 실시예 및 도면에서 논의되는 바와 같이 1 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 2 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 2 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 3 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 3 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 4 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 4 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 5 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 5 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 6 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 6 내지 7일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 7 내지 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 8일이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(때로는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 공정을 포함할 수 있는 공정, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 공정을 포함함) 공정은 7일이다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 1일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 1일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 2일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 2일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 3일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 3일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 4일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 4일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 5일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 5일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 6일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 6일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 7일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 TIL 확장은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 7일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 프라이밍 1차 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 1일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 1일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 2일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 2일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 3일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 3일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 4일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 4일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 5일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 5일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 6일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 6일 내지 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 7일 내지 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 TIL 확장은 7일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 프라이밍 1차 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 프라이밍 1차 확장, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따르고, 뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 단계 B 공정 동안 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 프라이밍 1차 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15, 및 IL-21, 뿐만 아니라 이의 임의의 조합은 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따르고, 본원에 기술된 바와 같은 단계 B 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 B는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기는 용기로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 생물반응기는 예를 들어 G-Rex-10 또는 G-Rex-100이다. 일부 실시양태에서, 사용된 생물반응기는 G-Rex-100이다. 일부 실시양태에서, 사용된 생물반응기는 G-Rex-10이다.
1. 배양보조 세포 및 항원 제시 세포
실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 1(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 4-8일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 4-7일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 5-8일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 5-7일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 6-8일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 6-7일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 7일 또는 8일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 7일 동안 언제든지 첨가된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시에서는 배양보조 세포(또한 본원에서 "항원 제시 세포"라고도 지칭됨)를 필요로 하지 않지만, 프라이밍 1차 확장 동안에는 8일 동안 언제든지 첨가된다.
실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b)의 단계 B에 기술된 것, 뿐만 아니라 사전 REP 또는 사전 REP 또는 프라이밍 REP라고도 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 TIL 확장의 개시 시 및 프라이밍 1차 확장 동안 배양보조 세포(본원에서는 "항원 제시 세포"라고도 함)를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 건강한 동종이계 혈액 공여자로부터의 표준 전체 혈액 단위로부터 수득한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 2.5 x 108개의 배양보조 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 용기당 2.5 x 108개의 배양보조 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, GREX-10당 2.5 x 108개의 배양보조 세포가 프라이밍 1차 확장 동안 사용된다. 일부 실시양태에서, GREX-100당 2.5 x 108개의 배양보조 세포가 프라이밍 1차 확장 동안 사용된다.
일반적으로, 동종이계 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 비활성화되고, 방사선조사된 동종이계 PBMC의 복제 불능을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공하는 실시예에 기술된 바와 같은 REP 절차에 사용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 14일째의 총 생존 세포 수가 프라이밍 1차 확장 0일째 배양물에 투입된 초기 생존 세포 수보다 적은 경우, 복제 불능으로 간주되며 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용되는 것이 허용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 7일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존 세포의 총 수가 프라이밍 1차 확장 0일째 배양물에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않았다면, 복제 불능으로 간주되며 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용되는 것이 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 ng/mL OKT3 항체 및 3000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 ng/mL OKT3 항체 및 6000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 7일째에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 생존 세포의 총 수가 프라이밍 1차 확장 0일째 배양물에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않았다면, 복제 불능으로 간주되며 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용되는 것이 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 5-60 ng/mL OKT3 항체 및 1000-6000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 10-50 ng/mL OKT3 항체 및 2000-5000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 20-40 ng/mL OKT3 항체 및 2000-4000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 25-35 ng/mL OKT3 항체 및 2500-3500 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 ng/mL OKT3 항체 및 6000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 15 ng/mL OKT3 항체 및 3000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 15 ng/mL OKT3 항체 및 6000 IU/mL IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, 항원 제시 배양보조 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 배양보조 세포는 인공 항원 제시 배양보조 세포이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300 사이이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원 제시 배양보조 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200 사이이다.
실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차는 약 2.5 x 108 배양보조 세포 대 약 100 x 106 TIL의 비를 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차는 약 2.5 x 108 배양보조 세포 대 약 50 x 106 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차는 약 2.5 x 108 배양보조 세포 대 약 25 x 106 TIL을 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차는 약 2.5 x 108 배양보조 세포를 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 절차는 급속 2차 확장에 사용된 배양보조 세포 수의 1/4, 1/3, 5/12, 또는 1/2을 필요로 한다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 배지는 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 배지는 용기당 2.5 x 108개의 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 30ng의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포당 15 μg의 OKT-3 및 500 mL의 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 500 mL의 배양 배지 및 15 μg의 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 배지는 500 mL의 배양 배지, 6000 IU/mL의 IL-2, 30 ng/mL의 OKT-3 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 500 mL의 배양 배지, 6000 IU/mL의 IL-2, 15 μg의 OKT-3 및 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 2.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포당 15 μg의 OKT-3 및 500 mL의 배양 배지를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장 절차는 2차 확장 동안 TIL에 비해 과량의 배양보조 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 건강한 동종이계 혈액 공여자로부터의 표준 전체 혈액 단위로부터 수득한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득한다. 실시양태에서, 인공 항원 제시(aAPC) 세포는 PBMC 대신에 사용된다.
일반적으로, 동종이계 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 비활성화되고, 도면 및 실시예에 기술된 예시적인 절차를 포함하는, 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용된다.
실시양태에서, 인공 항원 제시 세포는 프라이밍 1차 확장에서 PBMC의 대체로서, 또는 PBMC와 조합으로 사용된다.
실시양태에서, Gen 3 공정의 프라이밍 1차 확장에 사용되는 항원 제시 세포는 단핵구 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포 림프모구성 세포 또는 B-림프모구성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합, 또는 이들의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군 중에서 선택된다. 임의의 전술한 실시양태에서, 항원 제시 세포는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사선조사되거나 방사선조사되지 않을 수 있다.
실시양태에서, aAPC는 Gen 3 공정의 프라이밍 1차 확장에 사용된다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 B 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 B 세포 림프모구성 세포 또는 B-림프모구성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 단핵구이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Raji 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Thp1 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Ramos 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 U937 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 Daudi 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 멜라닌형성 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전자 변형된 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이들의 조합, 또는 이들의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군 중에서 선택된다. 실시양태에서, 유전자 변형된 세포는 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,415,015호에 기술된 바와 같이, CD86, OX40L, 4-1BBL, OX-40 작용성 항체, 4-1BB 작용성 항체, OKT-3의 Fc 사슬에 결합할 수 있는 항체, 및/또는 ICOS-L을 발현하도록 변형된다. 임의의 전술한 실시양태에서, 유전자 변형된 aAPC는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사선조사될 수 있거나 방사선조사되지 않을 수 있다.
2. 사이토카인
본원에 기술된 확장 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 함유하는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 프라이밍 1차 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 추가로 가능하며, 미국 특허 출원 공개 제US 2017/0107490 A1호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/189357에 기술된 바와 같은 IL-2, IL-15 및 IL-21 중 2종 이상의 조합이 있고, 각각의 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 분명하게 포함된다. 따라서, 가능한 조합으로는 IL-2와 IL-15, IL-2와 IL-21, IL-15와 IL-21, 및 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함하며, 후자는 많은 실시양태에서 특별히 사용되고 있다. 사이토카인의 조합의 사용은 특히 림프구, 특히 본원에 기술된 T 세포의 생성에 유리하다.
C. 단계 C: 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환
일부 경우에, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터 수득되는 TIL 집단 등을 포함하는 프라이밍 1차 확장(때로 사전 REP라고 지칭되는 확장을 포함할 수 있음)으로부터 수득되는 벌크 TIL 집단은 급속 2차 확장(때로 급속 확장 프로토콜(REP)이라고 지칭되는 확장을 포함할 수 있음)을 거칠 수 있으며, 그런 다음 이하에 논의되는 바와 같이 동결보존된다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 치료법에 사용될 경우, 프라이밍 1차 확장에서 확장된 TIL 집단 또는 급속 2차 확장에서 확장된 TIL 집단은 확장 단계 전 또는 프라이밍 1차 확장 후와 급속 2차 확장 전에 적합한 치료를 위해 유전자 변형을 거칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 표시된 단계 B)으로부터 수득한 TIL은 선택을 위해 표현형별될 때까지 저장된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 표시된 단계 B)으로부터 수득한 TIL은 저장되지 않고 바로 급속 2차 확장으로 진행된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장으로부터 수득한 TIL은 프라이밍 1차 확장 후 및 급속 2차 확장 전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 종양 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 3일 내지 7일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 3일 내지 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 4일 내지 7일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 4일 내지 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 5일 내지 7일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 5일 내지 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 6일 내지 7일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 6일 내지 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 7일 내지 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 7일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 약 8일째에 일어난다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일째에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 1일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 1일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 2일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 2일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 3일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 3일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 4일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 4일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 5일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 5일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 6일 내지 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 6일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 7일 내지 8일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 7일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 단편화가 일어난 때 및/또는 1차 프라이밍 확장 단계가 개시된 때로부터 8일에 일어난다.
일부 실시양태에서, TIL은 원발성 1차 확장 후 및 급속 2차 확장 전에 저장되지 않고, TIL은 급속 2차 확장으로 바로 진행된다(예를 들어, 일부 실시양태에서, 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 도시된 바와 같은 단계 B에서 단계 D로의 전환 동안에 저장은 없음). 일부 실시양태에서, 전환은 본원에 기술된 바와 같이 밀폐 시스템에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장으로부터의 TIL, 즉 TIL의 2차 집단은 전환 기간 없이 급속 2차 확장으로 직접 진행된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장으로부터 급속 2차 확장, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 C로의 전환은 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 단일 생물반응기는 예를 들어 GREX-10 또는 GREX-100이다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 급속 2차 확장으로의 전환은 용기 크기의 스케일업을 수반한다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장은 급속 2차 확장보다 더 작은 용기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장은 GREX-100에서 수행되고 급속 2차 확장은 GREX-500에서 수행된다.
D. 단계 D: 급속 2차 확장
일부 실시양태에서, TIL 세포 집단은 수확 및 프라이밍 1차 확장 후, 즉 도 8(특히, 예를 들어 단계 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 표시된 바와 같이 단계 A 및 단계 B, 및 단계 C로서 지칭되는 전환 후에, 수가 추가로 확장된다. 이러한 추가 확장은 본원에서 급속 2차 확장이라고 지칭되며, 이는 관련 기술분야에서 급속 확장 공정(급속 확장 프로토콜 또는 REP; 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 단계 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 D에 표시된 바와 같은 공정)으로 일반적으로 지칭되는 확장 공정을 포함할 수 있다. 급속 2차 확장은 일반적으로 배양보조 세포, 사이토카인 공급원 및 항-CD3 항체를 포함하는 다수의 구성요소를 포함하는 배양 배지를 가스 투과성 용기에서 사용하여 달성된다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 개시 후 1일, 2일, 3일 또는 4일째(즉, 전체 Gen 3 공정의 8일, 9일, 10일 또는 11일째)에 TIL은 더 큰 부피의 용기로 전달된다.
일부 실시양태에서, TIL의 급속 2차 확장(때로 REP라고 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 D에 표시된 바와 같은 공정을 포함할 수 있음)은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 1일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 1일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 2일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 2일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 3일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 3일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 4일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 4일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 5일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 5일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 6일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 6일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 7일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 7일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 8일 내지 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 8일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 9일 내지 약 10일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 1일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 2일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 3일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 4일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 5일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 6일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 7일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 8일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 9일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 급속 2차 확장의 개시 후 약 10일 동안 진행될 수 있다.
실시양태에서, 급속 2차 확장은 본 개시내용의 방법(예를 들어, REP라고 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)의 단계 D에 표시된 바와 같은 공정을 포함함)을 사용하여 가스 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 IL-2, OKT-3, 및 배양보조 세포(본원에서는 "항원 제시 세포"로도 지칭됨)의 존재 하에 급속 2차 확장에서 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL은 IL-2, OKT-3 및 배양보조 세포의 존재 하에 급속 2차 확장으로 확장되며, 여기서 배양보조 세포는 프라이밍 1차 확장에 존재하는 배양보조 세포 농도의 2배, 2.4배, 2.5배, 3배, 3.5배 또는 4배인 최종 농도로 첨가된다. 예를 들어, TIL은 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-15(IL-15)의 존재 하에서 비특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 급속 확장될 수 있다. 비특이적 T 세포 수용체 자극은, 예를 들어 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/mL의 OKT3, 마우스 단클론 항-CD3 항체(다음에서 상업적으로 입수 가능: Ortho-McNeil, 뉴저지주 라리탄 또는 Miltenyi Biotech, 미국 캘리포니아주 어번) 또는 UHCT-1(BioLegend에서 상업적으로 입수 가능, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 포함할 수 있다. TIL은 시험관내에서 TIL의 추가 자극을 유도하기 위해 2차 확장 동안 하나 이상의 항원, 예를 들어 벡터로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들), 예컨대 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩타이드, 예를 들어 0.3μM MART-1:26-35(27L) 또는 gp100:209-217(210M)을, 선택적으로 T 세포 성장 인자, 예를 들어 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에 포함시킴으로써 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원으로는, 예를 들어 NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2 및 VEGFR2 또는 이의 항원성 부분을 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2 발현 항원 제시 세포에 펄스를 가한 암의 동일한 항원(들)으로 재자극함으로써 급속 확장될 수도 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어 방사선조사된 자가 림프구 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2를 이용하여 추가로 재자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재자극은 2차 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 방사선조사된 자가 림프구의 존재 하에 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2를 이용하여 일어난다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 15 ng/mL 내지 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 30 ng/mL 내지 60 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 60 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모나브이다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 용기당 7.5 x 108개의 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 급속 2차 확장 배지는 용기당 30 μg의 OKT-3 및 500 mL의 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 60 ng/mL의 OKT-3 및 7.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 6000 IU/mL의 IL-2, 30 μg의 OKT-3 및 7.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포 및 500mL의 배양 배지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 IL-2를 포함한다. 배지는 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 용기당 5 x 108 내지 7.5 x 108 사이의 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 OKT-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배지는 용기당 30 μg의 OKT-3 및 500 mL의 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 G-Rex 100 MCS 플라스크이다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배지는 6000 IU/mL의 IL-2, 60 ng/mL의 OKT-3 및 5 x 108 내지 7.5 x 108 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 배지는 용기당 6000 IU/mL의 IL-2, 30 μg의 OKT-3 및 5 x 108 내지 7.5 x 108 사이의 항원 제시 배양보조 세포 및 500mL의 배양 배지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 하나 이상의 TNFRSF 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제이고, 4-1BB 작용제는 우렐루맙, 유토밀루맙, EU-101, 융합 단백질, 및 이의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지 중 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL 사이의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 세포 배양 배지 중 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFRSF 작용제에 더하여, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하고, 여기서 하나 이상의 TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 2차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 2차 확장 동안, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 D 공정 동안, 뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 2차 확장 동안 조합으로 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합은 도 8(특히, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 D 공정 동안 및 본원에 기술된 바와 같이 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2차 확장은 IL-2, OKT-3, 항원 제시 배양보조 세포, 및 선택적으로 TNFRSF 작용제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 배양보조 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC; 항원 제시 배양보조 세포라고도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 배양보조 세포(즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시양태에서 항원 제시 배양보조 세포(APC)는 PBMC이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원 제시 세포의 비는 약 1 대 10, 약 1 대 15, 약 1 대 20, 약 1 대 25, 약 1 대 30, 약 1 대 35, 약 1 대 40, 약 1 대 45, 약 1 대 50, 약 1 대 75, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 약 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50과 1 대 300 사이이다. 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 2차 확장에서 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100과 1 대 200 사이이다.
실시양태에서, REP 및/또는 급속 2차 확장은 벌크 TIL이 100배 또는 200배 과량의 비활성화된 배양보조 세포, 30 ng/mL OKT3 항-CD3 항체 및 6000 IU/mL IL-2와 150 mL 배지에서 혼합되는 플라스크에서 수행되고, 여기서 배양보조 세포 농도는 프라이밍 1차 확장에서의 배양보조 세포 농도의 적어도 1.1배(1.1×), 1.2×, 1.3×, 1.4×, 1.5×, 1.6×, 1.7×, 1.8×, 1.8×, 2×, 2.1×, 2.2×, 2.3×, 2.4×, 2.5×, 2.6×, 2.7×, 2.8×, 2.9×, 3.0×, 3.1×, 3.2×, 3.3×, 3.4×, 3.5×, 3.6×, 3.7×, 3.8×, 3.9× 또는 4.0×이다. 배지 교체는 세포가 대체 성장 챔버로 전달될 때까지 수행된다(일반적으로 소비된 배지의 2/3 흡인을 통한 2/3 배지 교체 및 동일한 부피의 신선한 배지로 교체). 대체 성장 챔버는 이하에 더 자세히 설명되는 G-Rex 플라스크 및 가스 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장(REP 공정으로 지칭되는 공정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 7일 내지 9일이다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 7일이다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 8일이다. 일부 실시양태에서, 2차 확장은 9일이다.
실시양태에서, 2차 확장(REP로 지칭되는 확장뿐만 아니라 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에서 지칭되는 확장을 포함할 수 있음)은 100 cm 가스 투과성 실리콘 바닥을 갖는 500 mL 용량의 가스 투과성 플라스크(G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing Corporation에서 상업적으로 입수 가능, 미국 미네소타주 뉴브라이튼)에서 수행될 수 있고, 약 5×106 또는 10×106 TIL이 5% 인간 AB 혈청, 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3(OKT3)이 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 PBMC와 배양될 수 있다. G-Rex 100 플라스크는 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 5일째, 250 mL의 상청액을 제거하여 원심분리병에 넣고 1500 rpm(491×g)에서 10분 동안 원심분리할 수 있다. 그 다음, TIL 펠릿은 5% 인간 AB 혈청, 6000 IU/mL의 IL-2가 포함된 신선한 배지 150mL로 재현탁하고, 원래의 GREX-100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 GREX-100 플라스크에서 연속적으로 확장되면, 10일 또는 11일째에 TIL은 GREX-500과 같은 더 큰 플라스크로 이동될 수 있다. 세포는 배양 14일째 수확될 수 있다. 세포는 배양 15일째 수확될 수 있다. 세포는 배양 16일째 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지 교체는 세포가 대체 성장 챔버로 전달될 때까지 수행된다. 일부 실시양태에서, 배지의 2/3은 소비된 배지의 흡인 및 동량의 신선한 배지로의 교체에 의해 교체된다. 일부 실시양태에서, 대체 성장 챔버는 이하에 더 자세히 논의되는 GREX 플라스크 및 가스 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 확장 공정에 사용된 배양 배지는 무혈청 배지 또는 한정 배지이다. 일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기본 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 부분적으로 혈청 함유 배지의 로트간 변동으로 인한 실험 변동을 방지하고/하거나 감소시키는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기본 세포 배지 및 혈청 보충물 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기본 세포 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지, CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CTS™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno-Free 배지, Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 혈청 보충물 또는 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer T-세포 확장 혈청 보충물, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 항생제, 및 하나 이상의 미량 원소 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원 글루타티온, L-아스코르브산-2-인산염, 철 포화 트랜스페린, 인슐린 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-머캅토에탄올을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 면역 세포 혈청 대체물은 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CST™ AIM-V SFM, LymphoONE™ T-세포 확장 Xeno-Free 배지, Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 통상의 성장 배지와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지 내 총 혈청 대체물 농도(vol%)는 총 무혈청 또는 한정 배지의 부피를 기준으로 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 3%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 5%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 배지 또는 한정 배지의 총 부피의 약 10%이다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 1L CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지와 26mL CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 55mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충된다.
일부 실시양태에서, 한정 배지는 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM(ThermoFisher Scientific)이다. CTS™ OpTmizer™의 임의의 제형은 본 발명에 유용하다. CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 1L CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 기본 배지와 26mL CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 55mM의 2-머캅토에탄올과 함께 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific)로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific), 55mM의 2-머캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되며, 추가로 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 약 3000IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 55mM의 2-머캅토에탄올로 보충되며, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 3000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™OpTmizer™ T 세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(SR)(ThermoFisher Scientific) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되며, 약 6000 IU/mL의 IL-2를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 0.5mM 내지 약 9mM, 1mM 내지 약 8mM, 2 mM 내지 약 7 mM, 3 mM 내지 약 6 mM, 또는 4 mM 내지 약 5 mM 농도의 글루타민(즉, GlutaMAX®)이 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 2mM 농도의 글루타민(즉, GlutaMAX®)이 보충된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 5mM 내지 약 150mM, 10mM 내지 약 140mM, 15mM 내지 약 130mM, 20mM 내지 약 120mM, 25mM 내지 약 110mM, 30mM 내지 약 100mM, 35mM 내지 약 95mM, 40mM 내지 약 90mM, 45mM 내지 약 85mM, 50mM 내지 약 80mM, 55mM 내지 약 75mM, 60mM 내지 약 70mM, 또는 약 65mM 농도의 2-머캅토에탄올이 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 55mM 농도의 2-머캅토에탄올이 보충된다.
일부 실시양태에서, 본원에 참고로 포함되는 국제 PCT 공개 번호 WO 1998/030679에 기술된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 해당 간행물에는 무혈청 진핵 세포 배양 배지가 기술되어 있다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지는 무혈청 배양물에서 세포의 성장을 지원할 수 있는 무혈청 보충제가 보충된 기본 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지 보충제는 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체, 하나 이상의 미량 원소 및 하나 이상의 항생제로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하거나 또는 조합함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 베타-머캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 또는 알부민 대체물 및 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 하나 이상의 콜라겐 전구체 및 하나 이상의 미량 원소로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원된 글루타티온, L-아스코르브산-2-인산염, 철 포화 트랜스페린, 인슐린 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-머캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 기본 세포 배지는 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 Eagle(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지(αMEM), Glasgow의 최소 필수 배지(G-MEM), RPMI 성장 배지 및 Iscove의 변형 Dulbecco 배지로 구성된 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 내 글리신의 농도는 약 5-200 mg/L 범위이고, L-히스티딘의 농도는 약 5-250 mg/L이고, L-이소류신의 농도는 약 5-300 mg/L이며, L-메티오닌 농도는 약 5-200 mg/L, L-페닐알라닌 농도는 약 5-400 mg/L, L-프롤린 농도는 약 1-1000 mg/L, L-하이드록시프롤린 농도는 약 1-45 mg/L, L-세린 농도는 약 1-250 mg/L, L-트레오닌 농도는 약 10-500 mg/L, L-트립토판 농도는 약 2-110 mg/L, L-티로신 농도는 약 3-175 mg/L, L-발린 농도는 약 5-500 mg/L, 티아민 농도는 약 1-20 mg/L, 환원된 글루타티온 농도는 약 1-20 mg/L, L-아스코르브산-2-인산염 농도는 약 1-200 mg/L, 철 포화 트랜스페린 농도는 약 1-50 mg/L, 인슐린 농도는 약 1-100mg/L, 아셀렌산 나트륨 농도는 약 0.000001-0.0001 mg/L, 및 알부민(예: AlbuMAX® I) 농도는 약 5000-50,000 mg/L이다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 내 비-미량 원소 모이어티 성분은 상기 표 4의 "1X 배지 내 농도 범위"라는 제목 아래의 열에 나열된 농도 범위로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지 내 비-미량 원소 모이어티 성분은 상기 표 4의 "1X 배지의 바람직한 실시양태"라는 제목 아래의 열에 나열된 최종 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지는 무혈청 보충제를 포함하는 기본 세포 배지이다. 이들 실시양태 중 일부에서, 무혈청 보충제는 상기 표 4의 "보충제의 바람직한 실시양태"라는 제목 아래의 열에 나열된 유형 및 농도의 비-미량 모이어티 성분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 한정 배지의 삼투압농도는 약 260 내지 350 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 삼투압농도는 약 280 내지 310 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 최대 약 3.7 g/L, 또는 약 2.2 g/L 중탄산나트륨으로 보충된다. 한정 배지는 L-글루타민(최종 농도 약 2 mM), 하나 이상의 항생제, 비-필수 아미노산(NEAA; 최종 농도 약 100 μM), 2-머캅토에탄올(최종 농도 약 100 μM)로 추가로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 문헌[Smith, 등, "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clin. Transl. Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)에 기술된 한정 배지는 본 발명에 유용하다. 간략히 설명하면, RPMI 또는 CTS™ OpTmizer™은 기본 세포 배지로 사용하고 0, 2%, 5% 또는 10% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물을 보충했다.
실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기 내의 세포 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기 내의 세포 배지에는 베타-머캅토에탄올(BME 또는 βME; 2-머캅토에탄올이라고도 알려짐, CAS 60-24-2)이 결여되어 있다.
실시양태에서, 급속 2차 확장(REP라고도 지칭되는 확장 포함)이 수행되고, TIL이 우수한 종양 반응성에 대해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2016/0010058 A1호에 기술된 방법은 우수한 종양 반응성에 대한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.
선택적으로, 세포 생존력 검정은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 급속 2차 확장(REP 확장이라고 지칭되는 확장 포함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 트리판 블루 배제 검정은 사세포를 선택적으로 표지하고 생존력 평가를 허용하는 벌크 TIL 샘플에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL 샘플은 Cellometer K2 자동화 세포 계수기(Nexcelom Bioscience, 매사추세츠주 로렌스)를 사용하여 계수되고 생존력이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생존력은 표준 Cellometer K2 Image Cytometer 자동 세포 계수기 프로토콜에 따라 결정된다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한되지만 다수의 유전자 분절의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이러한 유전자 분절: V(가변성), D(다양성), J(결합성) 및 C(불변성)는 면역글로불린 및 T 세포 수용체(TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 발생시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득되는 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 2차 확장에서 수득된 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린에 있는 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T 세포 수용체에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파 및/또는 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 베타의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, TCRab(즉, TCRα/β)의 발현이 증가된다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배양 배지(예를 들어, 때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지라고 지칭됨)는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포(APC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배양 배지(예를 들어, 때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지라고 지칭됨)는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같이 6000 IU/mL IL-2, 30 ug/플라스크 OKT-3, 뿐만 아니라 7.5 × 108 항원 제시 배양보조 세포(APC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배양 배지(예를 들어, 때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지라고 지칭됨)는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원 제시 배양보조 세포(APC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장 배양 배지(예를 들어, 때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지라고 지칭됨)는 이하에 더 자세히 논의되는 바와 같이 6000 IU/mL IL-2, 30 ug/플라스크 OKT-3, 뿐만 아니라 5 × 108 항원 제시 배양보조 세포(APC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 D는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장에 사용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기는 용기로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용되는 생물반응기는 예를 들어 G-Rex 100 또는 G-Rex 500이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 생물반응기는 G-Rex-100이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 생물반응기는 G-Rex-500이다.
1. 배양보조 세포 및 항원제시 세포
실시양태에서, 본원에 기술된 급속 2차 확장 절차(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d로부터의 단계 D에 기술된 것과 같은 확장 포함), 뿐만 아니라 REP로서 지칭되는 것들)는 REP TIL 확장 및/또는 급속 2차 확장 동안 과잉의 배양보조 세포가 필요하다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 기울기 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득된다.
일반적으로, 동종이계 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 조사된 동종이계 PBMC의 복제 불능을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공하는 실시예에 기술된 바와 같이 REP 절차에 사용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 복제 불능으로 간주되고, 7일 또는 14일에 생존가능한 세포의 총 수가 REP의 0일차 및/또는 2차 확장의 0일차(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 배양에 투입된 초기 생존가능한 세포 수보다 적다면 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하기에 허용가능하다.
일부 실시양태에서, PBMC는 복제 불능으로 간주되고, 7일차 및 14일차에 OKT3 및 IL-2의 존재에서 배양된 생존가능한 세포의 총 수가 REP의 0일차 및/또는 2차 확장의 0일차(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 투입된 초기 생존가능한 세포 수로부터 증가하지 않았다면 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하기에 허용가능하다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30ng/mL OKT3 항체 및 3000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 60ng/mL OKT3 항체 및 6000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 60ng/mL OKT3 항체 및 3000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30ng/mL OKT3 항체 및 6000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 복제 불능으로 간주되고, 7일차 및 14일차에 OKT3 및 IL-2의 존재에서 배양된 생존가능한 세포의 총 수가 REP의 0일차 및/또는 2차 확장의 0일차(즉, 2차 확장의 시작일)에 배양에 투입된 초기 생존가능한 세포 수로부터 증가하지 않았다면 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용하기에 허용가능하다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30-60ng/mL OKT3 항체 및 1000-6000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30-60ng/mL OKT3 항체 및 2000-5000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 내지 60ng/mL OKT3 항체 및 2000-4000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30-60ng/mL OKT3 항체 및 2500-3500IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 내지 60ng/mL OKT3 항체 및 6000IU/mL IL-2의 존재에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 항원-제시 배양보조 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 배양보조 세포는 인공 항원-제시 배양보조 세포이다. 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원-제시 배양보조 세포의 비율은 약 1 대 10, 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 내지 175, 약 1 내지 200, 약 1 내지 225, 약 1 내지 250, 약 1 내지 275, 약 1 내지 300, 약 1 내지 325, 약 1 내지 350, 약 1 내지 375, 약 1 내지 400, 또는 약 1 대 500이다. 일 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원-제시 배양보조 세포의 비율은 1 대 50 내지 1 대 300이다. 일 실시양태에서, 2차 확장에서 TIL 대 항원-제시 배양보조 세포의 비율은 1 대 100 내지 1 대 200이다.
실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 5×108 배양보조 세포 대 약 100×106 TIL의 비율을 필요로 한다. 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 7.5×108 배양보조 세포 대 약 100×106 TIL의 비율을 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 5×108 배양보조 세포 대 약 50×106 TIL의 비율을 필요로 한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 7.5×108 배양보조 세포 대 약 50×106 TIL의 비율을 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 5×108 배양보조 세포 대 약 25×106 TIL을 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 2차 확장 절차는 약 7.5×108 배양보조 세포 대 약 25×106 TIL을 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 급속 2차 확장은 급속 2차 확장보다 2배의 배양보조 세포의 수를 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장에 약 2.5×108 배양보조 세포가 필요한 경우, 급속 2차 확장에는 약 5×108 배양보조 세포가 필요하다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 프라이밍 1차 확장에 약 2.5×108 배양보조 세포가 필요한 경우, 급속 2차 확장에는 약 7.5×108 배양보조 세포가 필요하다. 또 다른 실시양태에서, 급속 2차 확장은 프라이밍 1차 확장보다 2배(2.0×), 2.5× 3.0× 3.5× 또는 4.0× 배양보조 세포의 수를 필요로 한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 급속 2차 확장 절차는 급속 2차 확장 동안 과잉의 배양보조 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 배양보조 세포는 동종이계 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전혈 단위로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 Ficoll-Paque 기울기 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 수득된다. 실시양태에서, 인공 항원-제시(aAPC) 세포가 PBMC 대신 사용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 프라이밍 1차 확장에 첨가된 PBMC 농도의 2배로 급속 2차 확장에 첨가된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 도면 및 실시예에 기술된 예시적인 절차를 포함하여 본원에 기술된 TIL 확장 절차에 사용된다.
실시양태에서, 인공 항원 제시 세포는 PBMC를 대체하거나 PBMC와 조합하여 급속 2차 확장에 사용된다.
실시양태에서, Gen 3 과정의 급속 2차 확장에 사용되는 항원 제시 세포는 단핵구 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 B 세포 림프구 세포 또는 B-림프구 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 단핵구이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Raji 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 라모스 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 U937 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원-제시 세포는 다우디 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, 항원-제시 세포는 멜라노사이트 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 멜라노사이트 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, 항원 제시 세포는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이의 조합, 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택된다. 전술한 실시양태 중 임의의 것에서, 항원 제시 세포는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사선 조사되거나 방사선 조사되지 않을 수 있다.
실시양태에서, aAPC는 Gen 3 과정의 급속 2차 확장에 사용된다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 B 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 B 세포 림프모세포양 세포 또는 B-림프모세포양 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 버킷 림프종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 골수 계통 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 단핵구이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 HLA-A-02 양성 단핵구 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 M5-아형 급성 단핵구 백혈병 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 Raji 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 라모스 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 U937 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 Daudi 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 멜라노사이트 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 HLA-A-02 양성 멜라노사이트 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 HLA-A-02 양성 흑색종 세포이다. 실시양태에서, aAPC는 Sk-MEL-5, Malme-3M, SK-MEL-28, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, SK-MEL-1, A375, G-361 및 이의 조합, 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택된 유전적으로 변형된 항원 제시 세포이다. 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 10,415,015에 기술된 바와 같이, CD86, OX40L, 4-1BBL, OX-40 효능작용 항체, 4-1BB 효능작용 항체, OKT-3 및/또는 ICOS-L의 Fc 사슬에 결합할 수 있는 항체를 발현하도록 변형된다. 임의의 전술한 실시양태에서, 유전적으로 변형된 aAPC는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사선 조사될 수 있거나 방사선 조사되지 않을 수 있다.
2. 사이토카인
본원에 기술된 급속 2차 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, 그 전체가 본원에 명백히 참고로 포함된 WO 2015/189356 및 WO 2015/189357에 일반적으로 개괄된 바와 같이, IL-2, IL-15 및 IL-21 중 2개 이상의 조합으로, TIL의 급속 2차 확장을 위해 사이토카인의 조합을 사용하는 것이 부가적으로 가능하다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2와 IL-15, IL-2와 IL-21, IL-15와 IL-21, 및 IL-2, IL-15와 IL-21을 포함하며, 후자가 많은 실시양태에서의 사용에 특히 발견된다. 사이토카인 조합의 사용은 특히 그기에 기술된 바와 같이 림프구, 특히 T 세포의 생성에 유리하다.
E. 단계 E: TIL 수확
급속 2차 확장 단계 후, 세포가 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 제공된 바와 같이 1, 2, 3, 4개 이상의 확장 단계 후에 수확된다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계 후에 수확된다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 제공된 바와 같이 2개의 확장 단계인, 하나의 프라이밍 1차 확장 및 하나의 급속 2차 확장 후에 수확된다.
TIL은 예를 들어 원심분리에 의한 것을 포함하여 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수확될 수 있다. TIL을 수확하기 위한 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있고, 임의의 이러한 공지된 방법이 본 과정에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 자동화된 시스템을 사용하여 수확된다.
세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 예를 들어 Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer 및 Inotech Biosystems International, Inc.를 비롯한 다양한 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다. 임의의 세포 기반 수확기가 본 방법으로 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 막-기반 세포 수확기이다. 일부 실시양태에서, 세포 수확은 LOVO 시스템(Fresenius Kabi에 의해 제작됨)과 같은 세포 처리 시스템을 통해 된다. 용어 "LOVO 세포 처리 시스템"은 또한 무균 및/또는 밀폐 시스템 환경에서 방사막 또는 방사 필터와 같은 막 또는 필터를 통해 세포를 포함하는 용액을 펌핑하여, 펠렛화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 제거하기 위한 연속 흐름 및 세포 처리를 허용할 수 있는 임의의 판매자에 의해 제작된 임의의 기기 또는 장치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 폐쇄된 멸균 시스템에서 세포 분리, 세정, 유체-교환, 농축 및/또는 기타 세포 처리 단계를 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 급속 2차 확장, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 따른 단계 D는 밀폐 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 TIL 확장을 위해 밀폐 시스템이 이용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기가 이용된다. 일부 실시양태에서, 생물반응기가 용기로 이용된다. 일부 실시양태에서, 이용되는 생물반응기는 예를 들어 G-Rex-100 또는 G-Rex-500이다. 일부 실시양태에서, 이용된 생물반응기는 G-Rex-100이다. 일부 실시양태에서, 이용된 생물반응기는 G-Rex-500이다.
일부 실시양태에서, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 따른 단계 E는 본원에 기술된 과정에 따라 수행된다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 시스템의 멸균성과 폐쇄된 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기술된 밀폐 시스템이 이용된다.
일부 실시양태에서, TIL은 본원에 기술된 방법에 따라 수확된다. 일부 실시양태에서, 14일차와 16일차 사이의 TIL은 본원에 기술된 방법을 사용하여 수확된다. 일부 실시양태에서, TIL은 본원에 기술된 방법을 사용하여 14일에 수확된다. 일부 실시양태에서, TIL은 본원에 기술된 방법을 사용하여 15일에 수확된다. 일부 실시양태에서, TIL은 본원에 기술된 방법을 사용하여 16일에 수확된다.
F. 단계 F: 확장된 TIL 검정
일부 실시양태에서, 상기에 제공된 단계로부터 확장된 TIL의 효능 및/또는 기능성은 본원에 기술된 검정 방법 중 하나를 사용하여 검사된다.
실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 바와 같이 Gen 3 TIL 생성물의 효능을 결정하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 제1 기간 동안 표적 세포와 Gen 3 TIL 생성 세포의 공배양을 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. (1) Gen 3 TIL 생성물에 대한 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) Gen 3 TIL 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대한 수확물을 평가하여 Gen 3 TIL 생성물에 대한 효능을 결정하기 위한 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계.
대안적으로, 일부 실시양태에서, 확장된 TIL은 IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린 및 TNF-α로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 분석물의 ELISA 또는 자동화된 ELISA(예를 들어, ELLA) 검출로 CD3 또는 CD3/CD28 비드-기반 자극을 포함하는 조합된 검정을 사용하여 분석된다. 실시양태에서, 이러한 조합된 검정에 대한 생성물 방출 사양은 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 500pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 600pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 700pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 800pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 900pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1000pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1100pg/mL, 또는 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1200pg/mL이며, 여기서 시험 항목의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
G. 단계 G: 최종 제형 및 주입 용기로의 이동
도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에서의 예시적인 순서로 제공되고 상기 및 본원에 상세히 기술된 바와 같은 단계 A 내지 E가 완료된 후에, 환자에 대한 투여에 사용하기 위해 세포는 주입 백이나 멸균 바이알과 같은 용기로 이동된다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 확장 방법을 사용하여 치료학적으로 충분한 수의 TIL이 얻어지면, 이는 본원에 기술된 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조성물로서 환자에 대한 투여에 사용하기 위해 주입 백 또는 멸균 바이알을 포함할 수 있는 용기로 이동된다. TIL은 이러한 용기로 이동된 후 효능에 대해 평가될 수 있으며, 이는 이동 직후 또는 예컨대 안정성 테스트를 위해 용기를 일정 기간 보관한 후에 발생할 수있다.
실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 실시양태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액에서 TIL의 현탁액이다. 본원에 개시된 바와 같이 확장된 TIL은 당업계에 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 단일 동맥-내 또는 정맥내 주입으로 투여되며, 이는 바람직하게는 대략적으로 30분 내지 60분 동안 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.
VI. 추가 Gen 2, Gen 3 및 기타 TIL 제조 과정 실시양태
A. PBMC 배양보조 세포 비율
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법(예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) 참조)에 사용되는 배양 배지는 항-CD3 항체, 예를 들어, OKT-3을 포함한다. IL-2와 조합한 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과는 전체 길이 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편으로 관찰될 수 있으며, 전자가 일반적으로 바람직하다; 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719를 참조한다.
실시양태에서, PBMC 배양보조 층의 수는 다음과 같이 계산된다:
A. T 세포의 부피(10μm 직경): V = (4/3)πr3 = 523.6μm3
B. 40μm(4 셀) 높이를 갖는 G-Rex 100(M)의 컬럼: V = (4/3)πr3 = 4×1012μm3
C. 컬럼 B를 충진하는데 필요한 세포 수: 4×1012μm3/523.6μm3 = 7.6×108μm3 * 0.64 = 4.86×108
D. 4D 공간에서 최적으로 활성화될 수 있는 세포 수: 4.86×108/24 = 20.25×106
E. G-Rex 500으로 외삽된 배양보조 및 TIL의 수: TIL: 100×106 및 배양보조: 2.5×109
이 계산에서는 100cm2 기부를 갖는 실린더에서 TIL의 활성화를 위한 정이십면체 기하구조를 제공하는데 필요한 단핵 세포의 수의 근사치가 사용된다. 계산은 Jin, et.al., J. Immunother. 2012, 35, 283-292에 기술된 바와 같이 NCI 실험 데이터를 밀접하게 반영하는 T 세포의 임계값 활성화에 대한 ~5×108의 실험 결과를 도출한다. (C)에서, 승수(0.64)는 Jaeger and Nagel, Science, 1992, 255, 1523-3에 의해 계산된 바와 같이 등가 구에 대한 무작위 패킹 밀도이다. (D)에서, 제수 24는 4-차원 공간에서 유사한 물체와 접촉할 수 있는 등가 구의 수 또는 Musin, Russ. Math. Surv. 2003, 58, 794-795에 기술된 바와 같은 "뉴턴 수"이다.
실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 항원-제시 배양보조 세포의 수는 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 항원-제시 배양보조 세포의 수의 대략적으로 절반이다. 특정 실시양태에서, 방법은 급속 2차 확장의 세포 배양 배지와 비교하여 대략적으로 50% 더 적은 항원 제시 세포를 포함하는 세포 배양 배지에서 프라이밍 1차 확장을 수행하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 항원-제시 배양보조 세포(APC)의 수는 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수보다 크다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 20:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 8:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율)은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택된다.
른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1이다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수 대 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1이다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 APC이고, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1×109 APC이다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 1.5×108 APC 내지 바로 또는 약 3×108 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 4×108 APC 내지 바로 또는 약 7.5×108 APC의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 2×108 APC 내지 바로 또는 약 2.5×108 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 4.5×108 APC 내지 바로 또는 약 5.5×108 APC의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 2.5×108 APC이고, 급속 2차 확장 동안 외인적으로 공급되는 APC의 수는 바로 또는 약 5×108 APC이다.
실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 추가된 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 프라이밍 1차 확장의 7일차(예를 들어, 방법의 7일차)에 추가된 PBMC 수의 대략적으로 절반이다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 제1 집단에 프라이밍 1차 확장의 0일차에 항원 제시 세포를 첨가하고 TIL의 제2 집단에 7일차에 항원 제시 세포를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 0일차에 첨가된 항원 제시 세포의 수는 프라이밍 1차 확장의 7일차(예를 들어, 방법의 7일차)에 첨가된 항원 제시 세포의 수의 대략적으로 50%이다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 PBMC의 수보다 많다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 4.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.0×106, 1.1×106, 1.2×106, 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106, 1.6×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2×106, 2.1×106, 2.2×106, 2.3×106, 2.4×106, 2.5×106, 2.6×106, 2.7×106, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106 또는 4.5×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서,급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 7.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서,급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠ 내지 약 6.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서,급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠ 내지 약 5.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서,급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서,급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠, 2.6×106 APC/㎠, 2.7×106 APC/㎠, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106, 4.5×106, 4.6×106, 4.7×106, 4.8×106, 4.9×106, 5×106, 5.1×106, 5.2×106, 5.3×106, 5.4×106, 5.5×106, 5.6×106, 5.7×106, 5.8×106, 5.9×106, 6×106, 6.1×106, 6.2×106, 6.3×106, 6.4×106, 6.5×106, 6.6×106, 6.7×106, 6.8×106, 6.9×106, 7×106, 7.1×106, 7.2×106, 7.3×106, 7.4×106 또는 7.5×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.0×106, 1.1×106, 1.2×106, 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106, 1.6×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2×106, 2.1×106, 2.2×106, 2.3×106, 2.4×106, 2.5×106, 2.6×106, 2.7×106, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106 또는 4.5×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종되고 급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠, 2.6×106 APC/㎠, 2.7×106 APC/㎠, 2.8×106, 2.9×106, 3×106, 3.1×106, 3.2×106, 3.3×106, 3.4×106, 3.5×106, 3.6×106, 3.7×106, 3.8×106, 3.9×106, 4×106, 4.1×106, 4.2×106, 4.3×106, 4.4×106, 4.5×106, 4.6×106, 4.7×106, 4.8×106, 4.9×106, 5×106, 5.1×106, 5.2×106, 5.3×106, 5.4×106, 5.5×106, 5.6×106, 5.7×106, 5.8×106, 5.9×106, 6×106, 6.1×106, 6.2×106, 6.3×106, 6.4×106, 6.5×106, 6.6×106, 6.7×106, 6.8×106, 6.9×106, 7×106, 7.1×106, 7.2×106, 7.3×106, 7.4×106 또는 7.5×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 4.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종되고, 급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 7.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 1.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종되고, 급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 6×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종되고, 급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 4×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 5.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 2×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종되고, 급속 2차 확장에서 외인적으로 공급되는 APC는 바로 또는 약 4×106 APC/㎠의 밀도로 배양 플라스크에 접종된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 PBMC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 20:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 PBMC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 PBMC의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 8:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 2:1이다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 대 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수의 비율은 바로 또는 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1이다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수 바로 또는 약 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)이고, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1×109 APC(예를 들어, PBMC 포함)이다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어 PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 1×108 APC(예를 들어, PBMC 포함) 내지 바로 또는 약 3.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 3.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함) 내지 바로 또는 약 1×109 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어 PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 1.5×108 APC 내지 바로 또는 약 3×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 4×108 APC(예를 들어, PBMC 포함) 내지 바로 또는 약 7.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어 PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 2×108 APC(예를 들어, PBMC 포함) 내지 바로 또는 약 2.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 4.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함) 내지 바로 또는 약 5.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어 PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 2.5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)이고, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 수는 바로 또는 약 5×108 APC(예를 들어, PBMC 포함)이다.
실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차에 첨가되는 APC(예를 들어 PBMC 포함)의 층의 수는 급속 2차 확장의 7일차에 첨가되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 층의 수의 대략적으로 절반이다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 제1 집단에 프라이밍 1차 확장의 0일차에 항원 제시 세포 층을 첨가하고 TIL의 제2 집단에 7일차에 항원 제시 세포 층을 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 0일차에 첨가된 항원 제시 세포 층의 수는 7일차에 첨가된 항원 제시 세포 층의 수의 대략적으로 50%이다.
다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 7일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 층 수는 프라이밍 1차 확장의 0일차에 외인적으로 공급되는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 층 수보다 많다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 2개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 4개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 하나의 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 3개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 1.5개 세포 층 내지 바로 또는 약 2.5개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 3개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 하나의 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 2개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 1개 세포 층 내지 바로 또는 약 2개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 3개 세포 층 내지 바로 또는 약 10개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 2개 세포 층 내지 바로 또는 약 3개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 4개 세포 층 내지 바로 또는 약 8개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 2개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 4개 세포 층 내지 바로 또는 약 8개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 바로 또는 약 1, 2 또는 3개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 바로 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 세포 층의 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재 하에서 발생한다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:10의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:8의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:7의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:6의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:5의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:4의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:3의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:2의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.2 내지 바로 또는 약 1:8의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.3 내지 바로 또는 약 1:7의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.4 내지 바로 또는 약 1:6의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.5 내지 바로 또는 약 1:5의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.6 내지 바로 또는 약 1:4의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.7 내지 바로 또는 약 1:3.5의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.8 내지 바로 또는 약 1:3의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.9 내지 바로 또는 약 1:2.5의 범위에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 약 1:2이다.
다른 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장의 0일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수와 동일한 제1 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하고, 급속 2차 확장의 7일차는 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수와 동일한 제2 평균 두께를 갖는 층상 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 존재에서 발생하며, 여기서 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제1 층의 수 대 APC(예를 들어, PBMC 포함)의 제2 층의 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 또는 1:10으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 APC의 수는 약 1.0×106 APC/㎠ 내지 약 4.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 APC의 수는 약 2.5×106 APC/㎠ 내지 약 7.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 APC의 수는 약 1.5×106 APC/㎠ 내지 약 3.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 APC의 수는 약 3.5×106 APC/㎠ 내지 약 6.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서 APC의 수는 약 2.0×106 APC/㎠ 내지 약 3.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 APC의 수는 약 4.0×106 APC/㎠ 내지 약 5.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된다.
B. 선택적 세포 배지 성분
1. 항-CD3 항체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 확장 방법(REP로 지칭되는 것을 포함, 예를 들어 도 1 및 8(특히, 예를 들어, 도 8b) 참조)에 사용되는 배양 배지는 항-CD3 항체를 포함한다. IL-2와 조합한 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이 효과는 전체 길이 항체뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편으로 관찰될 수 있으며 전자가 일반적으로 바람직하다; 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Tsoukas 등, J. Immunol. 1985, 135, 1719를 참조한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 이에 제한되지 않지만 뮤어라인, 인간, 영장류, 랫트 및 개 항체를 포함하여, 다양한 포유동물로부터의 항-인간 CD3 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한, 발명에 사용되는 다수의 적합한 항-인간 CD3 항체가 있다. 특정 실시양태에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다(뉴저지주 라리탄 소재의 Ortho-McNeil, 또는 캘리포니아주 오번 소재의 Miltenyi Biotech로부터 상업적으로 이용가능).
2. 4-1BB(CD137) 작용제
실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 및/또는 급속 2차 확장의 세포 배양 배지는 TNFRSF 작용제를 포함한다. 실시양태에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB(CD137) 작용제이다. 4-1BB 작용제는 당업계에 공지된 임의의 4-1BB 결합 분자일 수 있다. 4-1BB 결합 분자는 인간 또는 포유동물 4-1BB에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. 4-1BB 작용제 또는 4-1BB 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 이소형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 또는 하위 클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. 4-1BB 작용제 또는 4-1BB 결합 분자는 중쇄와 경쇄 둘 모두를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 4-1BB에 결합하는 항체(전체 길이 항체 포함), 단클론성 항체(전체 길이 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 및 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어 scFv 분자를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제4-1BB 작동제는 완전 인간 항체인 항원 결합 단백질이다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 인간화된 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 4-1BB 작용제는 항-4-1BB 항체, 인간 항-4-1BB 항체, 마우스 항-4-1BB 항체, 포유동물 항-4-1BB 항체, 단클론성 항-4-1BB 항체, 다클론성 항-4-1BB 항체, 키메라 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 애드넥틴, 항-4-1BB 도메인 항체, 단일 사슬 항-4-1BB 단편, 중쇄 항-4-1BB 단편, 경쇄 항-4-1BB 단편, 항-4-1BB 융합 단백질 및 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러를 포함한다. 효능작용 항-4-1BB 항체는 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. Lee, 등, PLOS One 2013, 8, e69677. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 효능작용, 항-4-1BB 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체(즉, 단일 세포주로부터 유래된 항체)이다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 EU-101(Eutilex Co. Ltd.), 유토밀루맙 또는 우레루맙, 또는 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 유토밀루맙 또는 우레루맙, 또는 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다.
바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제 또는 4-1BB 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 삼량체 또는 육량체 4-1BB 작용제(3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 가짐)와 같은 다량체 4-1BB 작용제는 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 효능작용 단클론성 항체에 비해 우수한 수용체(4-1BBL) 클러스터링 및 내부 세포 시그널링 복합체 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2개 이상을 추가로 연결하는 삼량체(3가) 또는 육량체(또는 6가) 또는 더 큰 융합 단백질은 예를 들어 Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47에 기술되어 있다.
효능작용 4-1BB 항체 및 융합 단백질은 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 4-1BB 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 무효화하는 효능작용 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP)을 무효화하는 효능작용 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 무효화하는 효능작용 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 Fc 영역 기능성을 무효화하는 효능작용 4-1BB 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 높은 친화력 및 효능작용 활성으로 인간 4-1BB(서열번호: 40)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 실시양태에서, 4-1BB 작동제는 인간 4-1BB(서열번호: 40)에 결합하는 결합 분자이다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 뮤어라인 4-1BB(서열번호: 41)에 결합하는 결합 분자이다. 4-1BB 작용제 또는 결합 분자가 결합하는 4-1BB 항원의 아미노산 서열은 표 5에 요약되어 있다.
표 5. 4-1BB 항원의 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 약 100pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 90pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 80pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 70pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 60pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 50pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 40pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 또는 약 30pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 8×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 8.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 9×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 9.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 또는 1×106 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 2×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.1×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.2×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.3×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.4×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.5×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.6×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.7×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.8×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 2.9×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 또는 3×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는 4-1BB 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 약 10nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 9nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 8nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 7nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 6nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 5nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 4nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 3nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 약 2nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는, 또는 약 1nM 또는 더 낮은 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 4-1BB에 결합하는 4-1BB 작용제를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 PF-05082566 또는 MOR-7480으로도 알려진 유토밀루맙, 또는 이의 단편, 유도체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 유토밀루맙은 Pfizer, Inc.로부터 이용가능하다. 유토밀루맙은 면역글로불린 G2-람다, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF9(종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리 구성원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모 사피엔스(완전 인간) 단클론성 항체이다. 유토밀루맙의 아미노산 서열은 표 6에 제시되어 있다. 유토밀루맙은 Asn59 및 Asn292에서의 글리코실화 부위; 위치 22-96(VH-VL), 143-199(CH1-CL), 256-316(CH2) 및 362-420(CH3)에서 중쇄 사슬내 이황화 가교; 위치 22'-87'(VH-VL) 및 136'-195'(CH1-CL)에서 경쇄 사슬내 이황화 가교; IgG2A 이소형 위치 218-218, 219-219, 222-222 및 225-225, IgG2A/B 이소형 위치 218-130, 219-219, 222-222 및 225-225, 및 IgG2B 이소형 위치 219-130(2), 222-222 및 225-225에서 사슬간 중쇄-중쇄 이황화 가교; 및 IgG2A 이소형 위치 130-213'(2), IgG2A/B 이소형 위치 218-213' 및 130-213' 및 IgG2B 이소형 위치 218-213'(2)에서 사슬간 중쇄-경쇄 이황화 가교를 포함한다. 유토밀루맙과 이의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/032433 A1에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 유토밀루맙의 전임상 특징은 Fisher, 등, Cancer Immunolog. & Immunother. 2012 , 61, 1721-33에 기술되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서의 유토밀루맙의 현행 임상 시험에는 미국 국립 보건원 Clinicaltrials.gov 식별자 NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 및 NCT02554812가 포함된다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 서열번호: 42로 제시된 중쇄 및 서열번호: 43으로 제시된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 제시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 제시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 제시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 제시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 42 및 서열번호: 43에 제시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 유토밀루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 44에 도시된 서열을 포함하고, 4-1BB 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 45에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 서열번호: 44 및 서열번호: 45에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 46, 서열번호: 47, 및 서열번호: 48에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 49, 서열번호: 50 및 서열번호: 51에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 유토밀루맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 4-1BB 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 유토밀루맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 허가를 받았거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 작용제 항체이고, 여기서 4-1BB 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 유토밀루맙이다. 4-1BB 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 유토밀루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 유토밀루맙이다.
표 6. 유토밀루맙과 관련된 4-1BB 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
바람직한 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 BMS-663513 및 20H4.9.h4a로도 알려진 단클론성 항체 우레루맙, 또는 이의 단편, 유도체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 우레루맙은 Bristol-Myers Squibb, Inc. 및 Creative Biolabs, Inc.로부터 이용가능하다. 우레루맙은 면역글로불린 G4-카파, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF9(종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모 사피엔스(완전 인간) 단클론성 항체이다. 우레루맙의 아미노산 서열은 표 7에 제시되어 있다. 우레루맙은 위치 298(및 298'')에 N-글리코실화 부위; 위치 22-95(VH-VL), 148-204(CH1-CL), 262-322(CH2) 및 368-426(CH3)(및 위치 22''-95'', 148''-204'', 262''-322'' 및 368''-426'')에 중쇄 사슬내 이황화 가교; 위치 23'-88'(VH-VL) 및 136'-196'(CH1-CL)(및 위치 23'''-88''' 및 136'''-196'')에 경쇄 사슬내 이황화 가교; 위치 227-227'' 및 230-230''에 사슬간 중쇄-중쇄 이황화 가교; 및 135-216' 및 135''-216'''에 사슬간 중쇄-경쇄 이황화 가교를 포함한다. 우레루맙과 이의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,288,638 및 8,962,804에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 우레루맙의 전임상 및 임상 특징은 Segal, 등, Clin. Cancer Res. 2016, available at http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272에 기술되어 있다. 다양한 혈액학적 및 고형 종양 징후에서 우레루맙의 현행 임상 시험에는 미국 국립 보건원 Clinicaltrials.gov 식별자 NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 및 NCT01471210이 포함된다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 서열번호: 52로 제시된 중쇄 및 서열번호: 53으로 제시된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 이의 또는 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 52 및 서열번호: 53에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 우레루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 54에 도시된 서열을 포함하고, 4-1BB 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 55에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 각각 서열번호: 56, 서열번호: 57, 및 서열번호: 58에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 59, 서열번호: 60, 및 서열번호: 61에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 우레루맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 4-1BB 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하며, 여기서, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 우레루맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 허가를 받았거나 허가를 위해 제출된 4-1BB 작용제 항체이고, 여기서 4-1BB 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품은 생성물 또는 참조 생물학적 생성물은 우레루맙이다. 4-1BB 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 우레루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 우레루맙이다.
표 7. 우레루맙과 관련된 4-1BB 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 1D8, 3Elor, 4B4(BioLegend 309809), H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532), BBK2(Thermo Fisher MS621PABX), 145501(Leinco Technologies B591), ATCC 번호 HB-11248로 기탁되고 미국 특허 번호 6,974,863에 개시된 세포주에 의해 생산된 항체, 5F4(BioLegend 31 1503), C65-485(BD Pharmingen 559446), 미국 특허 출원 공개 번호 US 2005/0095244에 개시된 항체, 미국 특허 번호 7,288,638에 개시된 항체(예컨대, 20H4.9-IgG1(BMS-663031)), 미국 특허 6,887,673에 개시된 항체(예컨대, 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 번호 7,214,493에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,569,997에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,905,685에 개시된 항체(예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 번호 6,362,325에 개시된 항체(예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3E1), 미국 특허 번호 6,974,863에 개시된 항체(예컨대 53A2); 미국 특허 번호 6,210,669에 개시된 항체(예컨대 1D8, 3B8 또는 3E1), 미국 특허 번호 5,928,893에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,569,997에 개시된 항체, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/177788, WO 2015/119923 및 WO 2010/042433에 개시된 항체, 및 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, 전술한 특허 또는 특허 출원 공개의 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, 및 WO 2010/078966 A1; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, 및 US 2015/0126710 A1; 및 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 및 8,450,460에 기술된 4-1BB 효능작용 융합 단백질이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 구조 I-A(C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B(N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 묘사된 바와 같은 4-1BB 효능작용 융합 단백질, 또는 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러(도 18 참조)이다. 구조 I-A 및 I-B에서, 원통은 개별 폴리펩타이드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는 예를 들어 4-1BBL(4-1BB 리간드, CD137 리간드(CD137L) 또는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFSF9)) 또는 4-1BB에 결합하는 항체로부터 유래된 3개의 선형으로-연결된 TNFRSF 결합 도메인을 포함하며. 이는 접혀서 3가 단백질을 형성하고, 이는 그 다음 IgG1-Fc(CH3 및 CH2 도메인 포함)를 통해 제2 3가 단백질에 연결되고 그 다음 이황화 결합(작은 신장된 타원형)을 통해 3가 단백질 중 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고 6개 수용체의 세포내 시그널링 도메인과 시그널링 단백질을 함께 모아 시그널링 복합체를 형성할 수 있는 작용제를 제공한다. 원통으로 표시된 TNFRSF 결합 도메인은 예를 들어 친수성 잔기 및 유연성을 위한 Gly 및 Ser 서열뿐만 아니라 가용성을 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 scFv 도메인일 수 있다. de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, 등, Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; Monnier, 등, Antibodies, 2013, 2, 193-208; 또는 본원의 다른 곳에 포함된 참고자료에 기술된 것과 같은 임의의 scFv 도메인 디자인이 사용될 수 있다. 이 형태의 융합 단백질 구조는 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 및 8,450,460에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
도 18에 주어진 구조 I-A의 다른 폴리펩타이드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 8에서 발견된다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전한 불변 도메인(서열번호: 62의 아미노산 17-230) 완전한 힌지 도메인(서열번호: 62의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부(예를 들어, 서열번호: 62의 아미노산 4-16)를 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가 폴리펩타이드의 융합에 적합한 링커를 포함하여, 서열번호: 63 내지 서열번호: 72에 주어진 실시양태로부터 선택될 수 있다.
표 8. C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질 디자인(구조 I-A)을 갖는, 4-1BB 작용제 융합 단백질을 포함하는, TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 아미노산 서열.
도 18에 제공된 구조 I-B의 다른 폴리펩타이드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 9에서 발견된다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호: 73에 도시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호: 74 내지 서열번호: 76에 제시된 이들 실시양태로부터 선택된다.
표 9. N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질 디자인(구조 I-B)을 갖는, 4-1BB 작용제 융합 단백질을 포함하는, TNFRSF 작용제 융합 단백질에 대한 아미노산 서열.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우레루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 유토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 10에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택되는 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전기한 것의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 임의의 조합, 및 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 및 바이오시밀러로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 서열번호: 77에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 가용성 4-1BBL 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 서열번호: 78에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 43 및 서열번호: 44에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 54 및 서열번호: 55에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 작용제 융합 단백질은 표 10에 제공된 VH 및 VL 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
표 10. 융합 단백질에서 4-1BB 결합 도메인으로 또는 scFv 4-1BB 작용제 항체로 유용한 추가 폴리펩타이드 도메인.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단 종단에서 추가 도메인을 포함하고, 여기서 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인인 4-1BB 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단 종단에서 추가 도메인을 포함하고, 여기서 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이며, 여기서 각각의 가용성 4-1BB 도메인은 줄기 영역(삼량체화에 기여하고 세포막에 특정 거리를 제공하지만 4-1BB 결합 도메인의 일부는 아님)을 결하고 제1 및 제2 펩타이드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 가지는 4-1BB 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 4-1BB 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이며, 여기서 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역을 결하고 제1 및 제2 펩타이드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 가지고, 여기서 각각의 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 4-1BB 결합 도메인이다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 임의의 전기한 VL 도메인에 연결된 임의의 전기한 VH 도메인을 포함하는 4-1BB 효능작용 scFv 항체이다.
실시양태에서, 4-1BB 작용제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BPS Bioscience로부터 상업적으로 이용가능한, BPS Bioscience 4-1BB 작용제 항체 카탈로그 번호 79097-2이다. 실시양태에서, 4-1BB 작용제는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs로부터 상업적으로 이용가능한, Creative Biolabs 4-1BB 작용제 항체 카탈로그 번호 MOM-18179이다.
3. OX40(CD134) 작용제
실시양태에서, TNFRSF 작용제는 OX40(CD134) 작용제이다. OX40 작용제는 당업계에 공지된 임의의 OX40 결합 분자일 수 있다. OX40 결합 분자는 인간 또는 포유동물 OX40에 결합할 수 있는 단클론성 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. OX40 작용제 또는 OX40 결합 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 클래스의 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. OX40 작용제 또는 OX40 결합 분자는 중쇄와 경쇄 둘 모두를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 결합 분자는 또한 OX40에 결합하는, 항체(전체 길이 항체 포함), 단클론성 항체(전체 길이 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 및 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 조작된 형태의 항체, 예를 들어 scFv 분자를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 완전 인간 항체인 항원 결합 단백질이다. 실시양태에서, OX40 작용제는 인간화된 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 현재 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 OX40 작용제는 항-OX40 항체, 인간 항-OX40 항체, 마우스 항-OX40 항체, 포유동물 항-OX40 항체, 단클론성 항-OX40 항체, 다클론성 항-OX40 항체, 키메라 항-OX40 항체, 항-OX40 애드넥틴, 항-OX40 도메인 항체, 단일 사슬 항-OX40 단편, 중쇄 항-OX40 단편, 경쇄 항-OX40 단편, 항-OX40 융합 단백질 및 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, OX40 작용제는 효능작용, 항-OX40 인간화된 또는 완전 인간 단클론성 항체(즉, 단일 세포주로부터 유래된 항체)이다.
바람직한 실시양태에서, OX40 작용제 또는 OX40 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. OX40L에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 OX40 융합 단백질은, 예를 들어 Sadun, 등, J. Immunother. 2009, 182, 1481-89에 기술되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 삼량체 또는 육량체 OX40 작용제(3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 가짐)와 같은 다량체 OX40 작용제는 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 효능작용 단클론성 항체에 비해 우수한 수용체(OX40L) 클러스터링 및 내부 세포 시그널링 복합체 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 선택적으로 이들 융합 단백질 중 2개 이상을 추가로 연결하는 삼량체(3가) 또는 육량체(또는 6가) 또는 더 큰 융합 단백질은 예를 들어 Gieffers, 등, Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47에 기술되어 있다.
효능작용 OX40 항체 및 융합 단백질은 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. Curti, 등, Cancer Res. 2013, 73, 7189-98. 바람직한 실시양태에서, OX40 작용제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 OX40 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 무효화하는 효능작용 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP)을 무효화하는 효능작용 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 무효화하는 효능작용 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 Fc 영역 기능성을 무효화하는 효능작용 OX40 단클론성 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 높은 친화도 및 효능작용 활성으로 인간 OX40(서열번호: 85)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 인간 OX40(서열번호: 85)에 결합하는 결합 분자이다. 실시양태에서, OX40 작용제는 뮤어라인 OX40(서열번호: 86)에 결합하는 결합 분자이다. OX40 작용제 또는 결합 분자가 결합하는 OX40 항원의 아미노산 서열은 표 11에 요약되어 있다.
표 11. OX40 항원의 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 약 100pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 90pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 80pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 70pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 60pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 50pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 40pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 또는 약 30pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는 OX40 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 8×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 8.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 9×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 9.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 또는 1×106 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는 OX40 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 2×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.1×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.2×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.3×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.4×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.5×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.6×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.7×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.8×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 2.9×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 또는 3×10-5 1/s 또는 더 느린 kassoc로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는 OX40 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 조성물, 과정 및 방법은 약 10nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 9nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 8nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 7nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 6nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 5nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 4nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 3nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 약 2nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는, 또는 약 1nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤어라인 OX40에 결합하는 OX40 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 MEDI0562 또는 MEDI-0562로도 알려진 타볼릭시주맙이다. 타볼릭시주맙은 AstraZeneca, Inc.의 MedImmune 자회사로부터 이용가능하다. 타볼릭시주맙은 면역글로불린 G1-카파, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF4(종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리 구성원 4, OX40, CD134)], 인간화된 및 키메라 단클론성 항체이다. 타볼릭시주맙의 아미노산 서열은 표 12에 제시되어 있다. 타볼릭시주맙은 푸코실화된 복합 이중-촉각의 CHO-유형 글리칸을 갖는, 위치 301 및 301''에 N-글리코실화 부위; 위치 22-95(VH-VL), 148-204(CH1-CL), 265-325(CH2) 및 371-429(CH3)(및 위치 22''-95'', 148''-204'', 265''-325'' 및 371''-429'')에 중쇄 사슬내 이황화 가교; 위치 23'-88'(VH-VL) 및 134'-194'(CH1-CL)(및 위치 23'''-88''' 및 134'''-194''')에 경쇄 사슬내 이황화 가교; 위치 230-230'' 및 233-233''에 사슬간 중쇄-중쇄 이황화 가교; 및 224-214' 및 224''-214'''에 사슬간 중쇄-경쇄 이황화 가교를 포함한다. 다양한 고형 종양 징후에서의 타볼릭시주맙의 현행 임상 시험에는 미국 국립 보건원 Clinicaltrials.gov 식별자 NCT02318394 및 NCT02705482가 포함된다.
실시양태에서, OX40 작용제는 서열번호: 87로 주어진 중쇄 및 서열번호: 88로 주어진 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 87 및 서열번호: 88에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:87 및 서열번호:88에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:87 및 서열번호:88에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:87 및 서열번호:88에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:87 및 서열번호:88에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:87 및 서열번호:88에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 타볼릭시주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 89에 도시된 서열을 포함하고, OX40 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 90에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다, 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 서열번호:89 및 서열번호:90에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 91, 서열번호: 92, 및 서열번호: 93에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 94, 서열번호: 95 및 서열번호: 96에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 타볼릭시주맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 OX40 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되었거나 승인을 위해 제출된 OX40 작용제 항체이고, 여기서 OX40 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 타볼릭시주맙이다. OX40 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 타볼릭시주맙이다.
표 12. 타볼릭시주맙과 관련된 OX40 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 11D4이며, 이는 Pfizer, Inc.로부터 이용가능한 완전 인간 항체이다. 11D4의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,960,515; 8,236,930; 및 9,028,824에 개시되어 있으며; 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 11D4의 아미노산 서열은 표 13에 제시되어 있다.
실시양태에서, OX40 작용제는 서열번호: 97로 주어진 중쇄 및 서열번호: 98로 주어진 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 97 및 서열번호: 98에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:97 및 서열번호:98에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:97 및 서열번호:98에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:97 및 서열번호:98에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:97 및 서열번호:98에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:97 및 서열번호:98에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 11D4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 99에 도시된 서열을 포함하고, OX40 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 100에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:99 및 서열번호:100에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:99 및 서열번호:100에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:99 및 서열번호:100에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:99 및 서열번호:100에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:99 및 서열번호:100에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호:101, 서열번호:102, 및 서열번호:103에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 104, 서열번호: 105 및 서열번호: 106에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 11D4와 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 OX40 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 11D4이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되었거나 승인을 위해 제출된 OX40 작용제 항체이며, 여기서 OX40 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 11D4이다. OX40 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 11D4이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 11D4이다.
표 13. 11D4와 관련된 OX40 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 18D8이며, 이는 Pfizer, Inc.로부터 이용가능한 완전 인간 항체이다. 18D8의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,960,515; 8,236,930; 및 9,028,824에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 18D8의 아미노산 서열은 표 14에 제시되어 있다.
실시양태에서, OX40 작용제는 서열번호: 107로 제공된 중쇄 및 서열번호: 108로 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체, 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 108에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 18D8의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 109에 도시된 서열을 포함하고, OX40 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 110에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 111, 서열번호: 112, 및 서열번호: 113에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 114, 서열번호: 115 및 서열번호: 116에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 18D8과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 OX40 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 18D8이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되었거나 승인을 위해 제출된 OX40 작용제 항체이고, 여기서 OX40 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 18D8이다. OX40 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 18D8이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 18D8이다.
표 14. 18D8과 관련된 OX40 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 GlaxoSmithKline plc로부터 이용가능한 인간화된 항체인 Hu119-122이다. Hu119-122의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 9,006,399 및 9,163,085, 그리고 국제 특허 공개 번호 WO 2012/027328에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. Hu119-122의 아미노산 서열은 표 15에 제시되어 있다.
실시양태에서, OX40 작용제는 Hu119-122의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 117에 도시된 서열을 포함하고, OX40 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 118에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, OX40 효능제 작용는 각각 서열번호: 117 및 서열번호: 118에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 117 및 서열번호: 118에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 117 및 서열번호: 118에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 117 및 서열번호: 118에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 117 및 서열번호: 118에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 119, 서열번호: 120, 및 서열번호: 121에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 122, 서열번호: 123, 및 서열번호: 124에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 Hu119-122와 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 OX40 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu119-122이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되었거나 승인을 위해 제출된 OX40 작용제 항체이고, 여기서 OX40 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu119-122 이다. OX40 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu119-122이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu119-122이다.
표 15. Hu119-122와 관련된 OX40 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 GlaxoSmithKline plc로부터 이용가능한 인간화된 항체인 Hu106-222이다. Hu106-222의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 9,006,399 및 9,163,085, 그리고 국제 특허 공개 번호 WO 2012/027328에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. Hu106-222의 아미노산 서열은 표 16에 제시되어 있다.
실시양태에서, OX40 작용제는 Hu106-222의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 125에 도시된 서열을 포함하고, OX40 작용제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 126에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 각각 서열번호: 127, 서열번호: 128, 및 서열번호: 129에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 130, 서열번호: 131 및 서열번호: 132에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 Hu106-222와 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 OX40 작용제 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러 단클론성 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고, 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu106-222이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되었거나 승인을 위해 제출된 OX40 작용제 항체이고, 여기서 OX40 작용제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu106-222이다. OX40 작용제 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu106-222이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 Hu106-222이다.
표 16. Hu106-222와 관련된 OX40 작용제 항체에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, OX40 작용제 항체는 MEDI6469(9B12로도 지칭됨)이다. MEDI6469는 뮤어라인 단클론성 항체이다. Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585. 일부 실시양태에서 OX40 작용제는, 그 개시내용이 그 전체가 참고로 본원에 포함된, Weinberg, 등, J. Immunother. 2006, 29, 575-585에 기재된 바와 같이, Biovest Inc.(미국 매사추세츠주 맬번 소재)에 기탁된 9B12 하이브리도마에 의해 생산된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 MEDI6469의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
실시양태에서, OX40 작용제는 L106 BD(Pharmingen 생성물 #340420)이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체 L106(BD Pharmingen 생성물 #340420)의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체 L106(BD Pharmingen 생성물 #340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 ACT35(Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)이다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체 ACT35(Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, OX40 작용제는 항체 ACT35(Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 #20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 실시양태에서, OX40 작용제는 뉴햄프셔주 웨스트레바논 소재의 InVivoMAb, BioXcell Inc로부터 상업적으로 이용가능한, 뮤어라인 단클론성 항체 항-mCD134/mOX40(클론 OX86)이다.
실시양태에서, OX40 작용제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, 및 WO 2014/148895; 유럽 특허 출원 EP 0672141; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506, 및 US 2015/132288(클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 번호 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399 및 9,163,085에 기술된 OX40 작용제로부터 선택되며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, OX40 작용제는 구조 I-A(C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B(N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 묘사된 바와 같은 OX40 효능작용 융합 단백질, 또는 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 구조 I-A 및 I-B의 특성은 상기 및 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 및 8,450,460에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 도 18에 주어진 구조 I-A의 폴리펩타이드 도메인에 대한 아미노산 서열이 표 9에서 발견된다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전한 불변 도메인(서열번호: 62의 아미노산 17-230) 완전한 힌지 도메인(서열번호: 62의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 일부(예를 들어, 서열번호: 62의 아미노산 4-16)을 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결하기 위한 바람직한 링커는 추가 폴리펩타이드의 융합에 적합한 링커를 포함하여 서열번호: 63 내지 서열번호: 72에 주어진 실시양태로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 도 18에 주어진 구조 I-B의 폴리펩타이드 도메인에 대한 아미노산 서열이 표 10에서 발견된다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열번호: 73에 도시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열번호: 74 내지 서열번호: 76에 제시된 이들 실시양태로부터 선택된다.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 타볼릭시주맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 11D4의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 18D8의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu119-122의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu106-222의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 17에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택되는 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 전기한 것의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 임의의 조합, 및 이의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 및 바이오시밀러로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 서열번호: 133에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 가용성 OX40L 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 서열번호: 134에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 서열번호: 135에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 89 및 서열번호: 90에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 99 및 서열번호: 100에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 110에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 127 및 서열번호: 128에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 각각 서열번호: 125 및 서열번호: 126에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다. 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 작용제 융합 단백질은 표 17에 주어진 VH 및 VL 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인인 하나 이상의 OX40 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결된다.
표 17. 융합 단백질(예를 들어, 구조 I-A 및 I-B)에서 OX40 결합 도메인으로 또는 scFv OX40 작용제 항체로 유용한 추가 폴리펩타이드 도메인.
실시양태에서, OX40 작용제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하며, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단 종단에 추가 도메인을 추가로 포함하는 OX40 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이고, 여기서 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이다. 실시양태에서, OX40 작용제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하며, 추가로 N-말단 및/또는 C-말단 종단에 추가 도메인을 포함하는 OX40 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이며, 여기서 추가 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고 여기서 각각의 가용성 OX40 결합 도메인은 줄기 영역(삼량체화에 기여하고 세포막에 일정한 거리를 제공하지만 OX40 결합 도메인의 일부는 아님)을 결하고 제1 및 제2 펩타이드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 갖는다.
실시양태에서, OX40 작용제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인, (iv) 제2 펩타이드 링커, 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인을 포함하는 OX40 효능작용 단일-사슬 융합 폴리펩타이드이며, 여기서 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 줄기 영역을 결하고 제1 및 제2 펩타이드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 가지고, 여기서 TNF 슈퍼패밀리 사이토카인 도메인은 OX40 결합 도메인이다.
일부 실시양태에서, OX40 작용제는 MEDI6383이다. MEDI6383은 OX40 효능작용 융합 단백질이고 미국 특허 번호 6,312,700에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, OX40 작용제는 임의의 전기한 VL 도메인에 연결된 임의의 전기한 VH 도메인을 포함하는 OX40 효능작용 scFv 항체이다.
실시양태에서, OX40 작용제는 미국 뉴욕주 셜리 소재의 Creative Biolabs로부터 상업적으로 이용가능한, Creative Biolabs OX40 작용제 단클론성 항체 MOM-18455이다.
실시양태에서, OX40 작용제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BioLegend, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 OX40 효능작용 항체 클론 Ber-ACT35이다.
C. 선택적 세포 생존율 분석
선택적으로, 세포 생존율 검정은 프라이밍 1차 확장(때때로 초기 벌크 확장으로 지칭됨) 후에 당업계에 공지된 표준 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 방법은 프라이밍 1차 확장에 이어서 세포 생존율 검정을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어, 트리판 블루 배제 검정은 죽은 세포를 선택적으로 표지하고 생존율 평가를 허용하는 벌크 TIL의 샘플에서 수행될 수 있다. 생존율을 시험하는데 사용하기 위한 다른 검정은 알라마 블루 검정; 및 MTT 검정을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
1. 세포 계수, 생존율, 유세포 분석
일부 실시양태에서, 세포 계수 및/또는 생존율이 측정된다. CD3, CD4, CD8 및 CD56뿐만 아니라 본원에 개시되거나 기술된 임의의 다른 마커와 같은 마커의 발현은 예를 들어, FACSCanto 유세포 분석기(BD Biosciences, Inc., 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)를 사용하여 BD Biosciences Inc.(캘리포니아주 산호세 소재)로부터 상업적으로 이용가능한 것이지만 이에 제한되지 않는 항체로 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계산기(VWR, 미국 일리노이주 바타비아 소재)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있고 생존율은 트리판 블루 염색을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포 생존율은 또한 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 2018/0282694에 기반하여 검정될 수 있다. 세포 생존율은 또한 미국 특허 출원 공개 번호 2018/0280436 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2018/081473에 기반하여 검정될 수 있으며, 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 포함된다.
일부 경우에, 벌크 TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 REP 대상으로 된 다음 아래에 논의된 바와 같이 동결보존될 수 있다. 마찬가지로, 유전적으로 변형된 TIL이 치료법에 사용될 경우, 벌크 또는 REP TIL 집단은 적절한 치료를 위해 유전적 변형을 받을 수 있다.
2. 세포 배양
실시양태에서, 상기에 논의된 것뿐만 아니라 도 1 및 8, 특히 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c에 예시된 것들을 포함하는, TIL을 확장하는 방법은 약 5,000mL 내지 약 25,000mL의 세포 배지, 약 5,000mL 내지 약 10,000mL의 세포 배지, 또는 약 5,800mL 내지 약 8,700mL의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장에서의 배지는 혈청이 없다. 일부 실시양태에서, 2차 확장에서의 배지는 혈청이 없다. 일부 실시양태에서, 프라이밍 1차 확장 및 2차 확장(급속 2차 확장으로도 지칭됨)에서의 배지는 둘 모두 혈청이 없다. 실시양태에서, TIL의 수를 확장하는 것은 한 가지 유형 이하의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어 AIM V 배지(캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen로부터 상업적으로 이용가능)로도 지칭되는 AIM-V 세포 배지(L-글루타민, 50μM 스트렙토마이신 설페이트 및 10μM 겐타마이신 설페이트) 세포 배양 배지가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 발명의 방법은 유리하게 TIL의 수를 확장하는데 필요한 배지의 양과 배지 유형의 수를 감소시킨다. 실시양태에서, TIL의 수를 확장하는 것은 매 3일 또는 4일보다 더 자주 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 가스 투과성 용기에서 세포의 수를 확장하는 것은 세포를 확장하는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴에 의해 세포의 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화한다.
실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기에서의 세포 배양 배지는 여과되지 않는다. 여과되지 않은 세포 배지의 사용은 세포 수를 확장하는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 가스 투과성 용기에서의 세포 배지는 베타-메르캅토에탄올(BME)을 결한다.
실시양태에서, 방법의 지속기간은 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 것; 종양 조직 샘플을 IL-2, 1X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제1 가스 투과성 용기에서 프라이밍 1차 확장으로서 약 1 내지 8일, 예를 들어 약 7일, 또는 프라이밍 1차 확장으로 약 8일의 지속기간 동안 배양하는 것; TIL을 제2 가스 투과성 용기로 옮기고 IL-2, 2X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3를 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 가스 투과성 용기에서 약 7 내지 9일, 예를 들어, 약 7일, 약 8일, 또는 약 9일의 지속기간 동안 TIL의 수를 확장하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 방법의 지속기간은 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 것; 종양 조직 샘플을 IL-2, 1X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제1 가스 투과성 용기에서 프라이밍 1차 확장으로서 약 1 내지 7일, 예를 들어 약 7일의 지속기간 동안 배양하는 것; TIL을 제2 가스 투과성 용기로 옮기고 IL-2, 2X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3를 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 가스 투과성 용기에서 약 7 내지 14일, 또는 약 7 내지 9일, 예를 들어 약 7일, 약 8일, 또는 약 9일, 약 10일, 또는 약 11일의 지속기간 동안 TIL의 수를 확장하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 방법의 지속기간은 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 것; 종양 조직 샘플을 IL-2, 1X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3을 포함하는 세포 배지를 함유하는 제1 가스 투과성 용기에서 프라이밍 1차 확장으로서 약 1 내지 7일, 예를 들어 약 7일의 지속기간 동안 배양하는 것; TIL을 제2 가스 투과성 용기로 옮기고 IL-2, 2X 항원-제시 배양보조 세포 및 OKT-3를 포함하는 세포 배지를 함유하는 제2 가스 투과성 용기에서 약 7 내지 11일, 예를 들어 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 또는 약 11일의 지속기간 동안 TIL의 수를 확장하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, TIL은 가스-투과성 용기에서 확장된다. 가스-투과성 용기는 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0106717 A1에 기술된 것을 포함하여 당업계에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장하는데 사용되었으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL은 가스-투과성 백에서 확장된다. 실시양태에서, TIL은 Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)와 같은 가스 투과성 백에서 TIL을 확장하는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 실시양태에서, TIL은 Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)로도 알려진 WAVE Bioreactor System과 같은 가스 투과성 백에서 TIL을 확장하는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 100mL, 약 200mL, 약 300mL, 약 400mL, 약 500mL, 약 600mL, 약 700mL, 약 800mL, 약 900mL, 약 1L, 약 2L, 약 3L, 약 4L, 약 5L, 약 6L, 약 7L, 약 8L, 약 9L 및 약 10L로 구성된 군으로부터 선택된 부피를 갖는 가스 투과성 세포 백을 포함한다.
실시양태에서, TIL은 G-Rex 플라스크(Wilson Wolf Manufacturing으로부터 상업적으로 이용가능)에서 확장될 수 있다. 이러한 실시양태는 세포 집단이 약 5×105개 세포/㎠에서 10×106 내지 30×106개 세포/㎠까지 확장되는 것을 허용한다. 실시양태에서 이것은 공급 없이 이루어진다. 실시양태에서, 이것은 배지가 G-Rex 플라스크에서 약 10cm의 높이에 존재하는 한 공급 없이 이루어진다. 실시양태에서 이것은 공급 없이 이루어지지만 하나 이상의 사이토카인의 첨가는 갖는다. 실시양태에서, 사이토카인은 사이토카인을 배지와 혼합할 필요 없이 볼루스로서 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치 및 방법은 당업계에 알려져 있고 TIL을 확장하는데 사용되었으며, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0377739A1, 국제 공개 번호 WO 2014/210036 A1, 미국 특허 출원 공개 US 2013/0115617 A1, 국제 공개 번호 WO 2013/188427 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0136228 A1, 미국 특허 번호 US 8,809,050 B2, 국제 공개 번호 WO 2011/072088 A2, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2016/0208216 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0244133 A1, 국제 공개 번호 WO 2012/129201 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0102075 A1, 미국 특허 번호 US 8,956,860 B2, 국제 공개 번호 WO 2013/173835 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0175966 A1에 기술된 것들을 포함하며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 과정은 또한 Jin 등, J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292에 기술되어 있다.
D. TIL의 선택적 유전자 조작
일부 실시양태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 일시적인 방식으로 단백질 발현을 변경하기 위해, 각각 본원에 제공된 바와 같은, 폐쇄형 멸균 제조 과정 동안을 포함하여 확장 단계 전, 동안 또는 후에 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, 일시적으로 변경된 단백질 발현은 일시적인 유전자 편집에 기인한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 TIL에서 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 전사 인자(TF) 및/또는 다른 분자로 처리된다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 TF 및/또는 다른 분자는 TIL의 집단에서 종양 항원의 변경된 발현 및/또는 종양 항원-특이적 T 세포의 수에서의 변경을 제공한다.
특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 집단을 유전적으로 편집하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단 및/또는 TIL의 제3 집단을 유전적으로 편집하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 단백질의 발현의 촉진 또는 하나 이상의 단백질의 발현의 억제, 뿐만 아니라 한 세트의 단백질의 촉진과 다른 세트의 단백질의 억제 둘 모두의 동시적인 조합을 위한 TIL의 집단 내로 메신저 RNA(mRNA) 또는 작은(또는 짧은) 간섭 RNA(siRNA)의 삽입을 포함하여 리보핵산(RNA) 삽입을 통한 것과 같은 뉴클레오티드 삽입을 통한 유전자 편집을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 확장된 TIL은 단백질 발현의 일시적인 변경을 겪는다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 도 8(특히 도 8b 및/또는 도 8c)에 표시된 바와 같이, 예를 들어 단계 A로부터 수득된 TIL 집단을 포함하여, 1차 확장 이전 벌크 TIL 집단에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 도 8(예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 표시된 바와 같이, 예를 들어 단계 B에서 확장된 TIL 집단을 포함하여 1차 확장 동안 발생한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 1차 확장과 2차 확장 사이의 전이에서의 TIL 집단(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 TIL의 제2 집단), 예를 들어 도 8에 표시된 바와 같이 단계 B로부터 수득되고 단계 C에 포함된 TIL 집단을 포함하여, 1차 확장 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 도 8에 표시된 바와 같이 예를 들어 단계 C로부터 수득된 TIL 집단을 포함하여 2차 확장 이전 및 단계 D에서의 그 확장 이전에 벌크 TIL 집단에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 도 8에 표시된 바와 같이 예를 들어 단계 D에서 확장된 TIL 집단(예를 들어, TIL의 제3 집단)을 포함하여 2차 확장 동안 발생한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 도 8에 표시된 바와 같이 예를 들어 단계 D에서의 확장으로부터 수득된 TIL 집단을 포함하여 2차 확장 후에 발생한다.
실시양태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 전기천공의 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0227237 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 인산칼슘 형질감염의 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법(인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅 및 세포내이입)은 당업계에 공지되어 있고, Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; 및 Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; 및 미국 특허 번호 5,593,875에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 리포솜 형질감염의 단계를 포함한다. 여과된 물에서 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 디올레오일 포스포티딜에탄올아민(DOPE)의 1:1(w/w) 리포솜 제형을 이용하는 방법과 같은 리포솜 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있고, Rose, 등, Biotechniques 1991, 10, 520-525 및 Felgner, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417 및 미국 특허 번호 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; 및 7,687,070에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단에서 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 미국 특허 번호 5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; 및 7,189,705에 기술된 방법을 사용한 형질감염의 단계를 포함하며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 줄기 기억 T 세포(TSCM)에서의 증가를 초래한다. TSCM은 항원-경험된 중앙 기억 T 세포의 초기 전구세포이다. TSCM은 일반적으로 줄기 세포를 정의하는 장기 생존, 자가-재생 및 다능성 능력을 나타내고, 일반적으로 효과적인 TIL 생성물의 생성에 바람직하다. TSCM은 입양 세포 전달의 마우스 모델에서 다른 T 세포 하위세트와 비교하여 증강된 항-종양 활성을 보여주었다(Gattinoni 등 Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri 등 Blood 2013). 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 높은 비율의 TSCM을 포함하는 조성물을 갖는 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TSCM 백분율에서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIL 집단에서 TSCM에서의 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% TSCM을 갖는 TIL 집단을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% TSCM을 갖는 치료적 TIL 집단을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 항원-경험된 T 세포의 회생을 초래한다. 일부 실시양태에서, 회생은 예를 들어 증가된 증식, 증가된 T 세포 활성화 및/또는 증가된 항원 인식을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 보존하기 위해 T 세포의 큰 분획에서 발현을 변경한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 변경하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 종양-유래된 TCR 레퍼토리를 유지한다.
일부 실시양태에서, 단백질의 일시적인 변경은 특정 유전자의 변경된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1(PDCD1 또는 CC279로도 지칭됨), TGFBR2, CCR4/5, CBLB(CBL-B), CISH, CCR(키메라 공동-자극 수용체), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2(MCP-1), CCL3(MIP-1α), CCL4(MIP1-β), CCL5(RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1 및/또는 cAMP 단백질 키나제 A (PKA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, TGFBR2, CCR4/5, CBLB(CBL-B), CISH, CCR(키메라 공동-자극 수용체), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2(MCP-1), CCL3(MIP-1α), CCL4(MIP1-β), CCL5(RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1 및/또는 cAMP 단백질 키나제 A(PKA)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TGFBR2를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR4/5를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CBLB를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CISH를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR(키메라 공동-자극 수용체)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 IL-2를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 IL-12를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 IL-15를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 IL-21을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 NOTCH 1/2 ICD를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIM3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 LAG3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIGIT를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TGFβ를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR2를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR4를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR5를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CXCR1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CXCR2를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CSCR3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL2(MCP-1)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL3(MIP-1α)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL4(MIP1-β)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL5(RANTES)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CXCL1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CXCL8을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL22를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCL17을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 VHL을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CD44를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PIK3CD를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 SOCS1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 cAMP 단백질 키나제 A(PKA)를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 케모카인 수용체의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 일시적인 단백질 발현에 의해 과발현되는 케모카인 수용체는 CCL2(MCP-1), CCL3(MIP-1α), CCL4(MIP1-β), CCL5( RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22 및/또는 CCL17을 포함하지만 이에 제한되지 않는 리간드를 갖는 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, CTLA-4, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβR2 및/또는 TGFβ의 감축 및/또는 감소된 발현을 초래한다(예를 들어, TGFβ 경로 차단을 초래하는 것을 포함). 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CBLB(CBL-B)의 감축 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CISH의 감축 및/또는 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 예를 들어 TIL 트래피킹 또는 종양 부위로의 이동을 개선하기 위해 케모카인 수용체의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR(키메라 공동-자극 수용체)의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2 및/또는 CSCR3으로 구성된 군으로부터 선택된 케모카인 수용체의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 인터루킨의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 IL-2, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21로 구성된 군으로부터 선택된 인터루킨의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 NOTCH 1/2 ICD의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 VHL의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CD44의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PIK3CD의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 SOCS1의 증가된 및/또는 과발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 cAMP 단백질 키나제 A(PKA)의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 분자의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 2개 분자의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1 및 LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 분자의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, LAG3, CISH, CBLB, TIM3 및 이의 조합의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1 및 LAG3, CISH, CBLB, TIM3 및 이의 조합 중 하나의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1 및 LAG3의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1 및 CISH의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1 및 CBLB의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 LAG3 및 CISH의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 LAG3 및 CBLB의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 CISH 및 CBLB의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIM3 및 PD-1의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIM3 및 LAG3의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIM3 및 CISH의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIM3 및 CBLB의 감축된 및/또는 감소된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 접합 분자는 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스 방법에 의해 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단, 또는 수확된 TIL의 집단 안으로 삽입된다(예를 들어, 접합 분자의 발현이 증가됨).
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 분자의 감축된 및/또는 감소된 발현, 및 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 및 이의 조합의 증가된 및/또는 증강된 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 PD-1, LAG3, TIM3, CISH, CBLB 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 분자의 감축된 및/또는 감소된 발현, 및 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 및 이의 조합의 증가된 및/또는 증강된 발현을 초래한다.
일부 실시양태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서는 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 90%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 99%의 발현에서의 감소가 있다.
일부 실시양태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 90%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 95%의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 99%의 발현에서의 증가가 있다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 TIL에서 전사 인자(TF) 및/또는 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자로 TIL의 처리에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, SQZ 벡터가 없는 미세유체 플랫폼은 전사 인자(TF) 및/또는 단백질 발현을 일시적으로 변경할 수 있는 다른 분자의 세포내 전달을 위해 이용된다. 전사 인자를 포함한 단백질을 T 세포를 포함한 다양한 일차 인간 세포에 전달하는 능력을 입증하는 이러한 방법(Sharei 등 PNAS 2013, 뿐만 아니라 Sharei 등 PLOS ONE 2015 및 Greisbeck 등 J. Immunology vol. 195, 2015)이 기술되어 있다; 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1 및 WO 2017/123663A1을 참조하며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 국제 특허 공개 WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1 및 WO 2017/123663A1에 기술된 이러한 방법은 TIL의 집단을 전사 인자(TF) 및/또는 일시적인 단백질 발현을 유도할 수 있는 다른 분자에 노출시키기 위해 본 발명과 함께 이용될 수 있으며, 여기서 상기 TF 및/또는 일시적인 단백질 발현을 유도할 수 있는 다른 분자는 TIL의 집단에서 종양 항원의 증가된 발현 및/또는 종양 항원-특이적 T 세포의 수에서의 증가를 제공하며, 따라서 재프로그래밍되지 않은 TIL 집단과 비교하여 TIL 집단의 재프로그래밍 및 재프로그래밍된 TIL 집단의 치료적 효능에서 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍은 본원에 기술된 바와 같이 TIL의 집단 시작 또는 이전 집단(즉, 재프로그래밍 이전)에 비해 효과기 T 세포 및/또는 중추 기억 T 세포의 증가된 하위 집단을 초래한다.
일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 TCF-1, NOTCH 1/2 ICD 및/또는 MYB를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 TCF-1이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 NOTCH 1/2 ICD이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 MYB이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 추가의 TIL 재프로그래밍을 유도하기 위해 상업적으로 이용가능한 KNOCKOUT 혈청 대체(Gibco/ThermoFisher)와 같은 유도 만능 줄기 세포 배양(iPSC)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 추가의 TIL 재프로그래밍을 유도하기 위해 iPSC 칵테일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자(TF)는 iPSC 칵테일 없이 투여된다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍은 TSCM의 백분율에서 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍은 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% TSCM까지 TSCM의 백분율에서 증가를 초래한다.
일부 실시양태에서, 상기에서 기술된 바와 같이 단백질 발현을 일시적으로 변경하는 방법은 하나 이상의 단백질의 생산을 위한 유전자의 안정적인 통합 단계를 포함하는 TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법과 조합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단 및/또는 TIL의 제3 집단을 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 렌티바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Levine, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, 등, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, 등, J. Virology 1998, 72, 8463-71, 및 미국 특허 번호 6,627,442에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달의 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 트랜스포사제가 DNA 발현 벡터 또는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되어 트랜스포사제의 장기간 발현이, 예를 들어, mRNA(예를 들어, 캡 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 mRNA)로 제공된 트랜스포사제인, 이식유전자의 세포에서 발생하지 않는 시스템을 포함한다. SB10, SB11 및 SB100x와 같은 연어-유형 Tel-유사 트랜스포사제(SB 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제) 및 증가된 효소 활성을 갖는 조작된 효소를 포함하는 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은, 예를 들어 Hackett, 등, Mol. Therapy 2010, 18, 674-83 및 미국 특허 번호 6,489,458에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 단백질 발현의 일시적인 변경은 테트라에틸렌글리콜(TEG) 링커를 사용하여 그 3' 말단에서 콜레스테롤에 접합된 20-뉴클레오티드 안티센스(가이드) 가닥 및 13 내지 15개 염기 센스(패신저) 가닥을 포함하는 2'-OH 치환(전형적으로 불소 또는 -OCH3)의 높은 백분율을 갖는 화학적으로-합성된 비대칭 siRNA 이중체인 자가-전달 RNA 간섭(sdRNA)에 의해 유도된 발현에서의 감소이다. 일부 실시양태에서, 방법은 테트라에틸렌글리콜(TEG) 링커를 사용하여 그 3' 말단에서 콜레스테롤에 접합된 20-뉴클레오티드 안티센스(가이드) 가닥 및 13 내지 15개 염기 센스(패신저) 가닥을 포함하는 2'-OH 치환(전형적으로 불소 또는 -OCH3)의 높은 백분율을 갖는 화학적으로-합성된 비대칭 siRNA 이중체인 자가-전달 RNA 간섭(sdRNA)의 사용을 포함하는, TIL의 집단에서 단백질 발현의 일시적인 변경을 포함한다. sdRNA를 사용하는 방법은 출판물 Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248; Byrne, 등, J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864; 및 Ligtenberg, 등, Mol. Therapy, 2018에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL 집단에 대한 sdRNA의 전달은 전기천공, SQZ 또는 다른 방법의 사용 없이, 대신 TIL 집단이 배지에서 1μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일 기간을 사용하여 달성된다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL 집단을 1 내지 3일의 기간 동안 배지에서 1μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출시키는 것을 포함하는 TIL 집단에 sdRNA를 전달하는 것을 포함한다. 실시양태에서, TIL 집단에 sdRNA의 전달은 TIL 집단이 배지에서 10μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일 기간을 사용하여 달성된다. 실시양태에서, TIL 집단에 sdRNA의 전달은 TIL 집단이 배지에서 50μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일 기간을 사용하여 달성된다. 실시양태에서, TIL 집단에 sdRNA의 전달은 TIL 집단이 배지에서 0.1μM/10,000 TIL 내지 50μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일 기간을 사용하여 달성된다. 실시양태에서, TIL 집단에 sdRNA의 전달은 TIL 집단이 배지에서 0.1μM/10,000 TIL 내지 50μM/10,000 TIL의 농도에서 sdRNA에 노출되는 1 내지 3일 기간을 사용하여 달성되며, 여기서 sdRNA에 대한 노출은 배지에 신선한 sdRNA의 첨가에 의하여 2회, 3회, 4회 또는 5회 수행된다. 다른 적합한 과정은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0039914 A1, US 2013/0131141 A1, 및 US 2013/0131142 A1, 및 미국 특허 번호 9,080,171에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, sdRNA는 제조하는 동안에 TIL의 집단에 삽입된다. 일부 실시양태에서, sdRNA는 NOTCH 1/2 ICD, PD-1, CTLA-4, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFβ, TGFBR2, cAMP 단백질 키나제 A(PKA), BAFF BR3, CISH 및/또는 CBLB를 방해하는 RNA를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 발현에서 감소는, 예를 들어, 유세포 분석 및/또는 qPCR에 의해 평가된 바와 같이 유전자 침묵의 백분율에 기반하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 80%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 85%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 90%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 95%의 발현에서의 감소가 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 99%의 발현에서의 감소가 있다.
siRNA의 화학적 변형에 기반한 자가-전달가능한 RNAi 기술이 본 발명의 방법과 함께 이용되어 본원에 기술된 바와 같이 TIL에 sdRNA를 성공적으로 전달할 수 있다. 비대칭 siRNA 구조 및 소수성 리간드를 갖는 백본 변형의 조합(예를 들어, Ligtenberg, 등, Mol. Therapy, 2018 및 US20160304873 참조)은 추가의 제형 및 sdRNA의 뉴클레아제 안정성을 활용한 배양 배지에 단순한 추가에 의한 방법 없이 sdRNA가 배양된 포유동물 세포에 침투할 수 있도록 한다. 이 안정성은 단순히 배지에서 sdRNA의 활성 농도를 유지함에 의해 표적 유전자 활성의 RNAi-매개된 감소의 일정한 수준의 유지를 허용한다. 이론에 구애되지는 않지만, sdRNA의 백본 안정화는 비-분할 세포에서 수개월 동안 지속될 수 있는 유전자 발현 효과의 확장된 감소를 제공한다.
일부 실시양태에서, TIL의 95%가 넘는 형질감염 효율과 다양한 특정 sdRNA에 의한 표적의 발현에서의 감소가 발생한다. 일부 실시양태에서, 여러 변형되지 않은 리보스 잔기를 함유하는 sdRNA는 RNAi 효과의 효능 및/또는 수명을 증가시키기 위해 완전히 변형된 서열로 대체되었다. 일부 실시양태에서, 발현 효과에서의 감소는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 5일, 6일, 7일 또는 8일 이상 동안 유지된다. 일부 실시양태에서, 발현 효과에서의 감소는 TIL의 sdRNA 처리 후 10일 이상에서 감소한다. 일부 실시양태에서, 표적 발현의 발현에서의 70% 초과 감소가 유지된다. 일부 실시양태에서, 표적 발현의 발현에서의 70% 초과 감소가 TIL 동안 유지된다. 일부 실시양태에서, PD-1/PD-L1 경로에서 발현에서의 감소는 TIL이 보다 강력한 생체내 효과를 나타내는 것을 허용하며, 이는 일부 실시양태에서 PD-1/PD-L1 경로의 억제성 효과의 회피에 기인한다. 일부 실시양태에서, sdRNA에 의한 PD-1의 발현에서의 감소는 TIL 증식의 증가를 초래한다.
때때로 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로 알려진, 작은 간섭 RNA(siRNA)는 일반적으로 길이가 19-25 염기쌍인 이중 가닥 RNA 분자이다. siRNA는 RNA 간섭(RNAi)에 사용되며, 여기서 그것은 상보성인 뉴클레오티드 서열로 특정 유전자의 발현을 방해한다.
이중 가닥 DNA(dsRNA)는 일반적으로 RNA의 상보성 가닥의 쌍, 일반적으로 센스(패신저) 가닥과 안티센스(가이드) 가닥을 포함하는 임의의 분자를 정의하는데 사용될 수 있고, 단일-가닥 오버행 영역을 포함할 수 있다. siRNA와 대조적으로, 용어 dsRNA는 일반적으로 Dicer를 포함한 절단 효소 시스템의 작용에 의해 더 큰 dsRNA 분자로부터 방출되는 siRNA 분자의 서열을 포함하는 전구체 분자를 지칭한다.
sdRNA(자가-전달가능한 RNA)는 세포에 들어가기 위해 전달 비히클을 요하지 않고 전통적인 siRNA에 비해 향상된 약리학을 갖는 새로운 클래스의 공유적으로 변형된 RNAi 화합물이다. "자가-전달가능한 RNA" 또는 "sdRNA"는 소수성으로 변형된 RNA 간섭-안티센스 하이브리드이며, 이는 일차 세포에서는 시험관내에서 그리고 국소 투여 시 생체내에서 고도로 효과적인 것으로 입증되었다. 독성 없이 강력한 흡수 및/또는 침묵이 입증되었다. sdRNA는 일반적으로 최소의 이중 가닥 영역을 갖는 비대칭 화학적으로 변형된 핵산 분자이다. sdRNA 분자는 전형적으로 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역을 함유하고, 분자의 단일 가닥 및 이중 가닥 영역 둘 모두 내에 다양한 화학적 변형을 함유할 수 있다. 추가로, sdRNA 분자는 본원에 기술된 바와 같이 통상적이고 진보된 스테롤-유형 분자와 같은 소수성 접합체에 부착될 수 있다. sdRNA 및 이러한 sdRNA를 제조하기 위한 연관된 방법은 또한, 예를 들어, US20160304873, WO2010033246, WO2017070151, WO2009102427, WO2011119887, WO2010033247A2, WO2009045457, WO2011119852에 광범위하게 기술되어 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. sdRNA 구조, 화학, 표적화 위치, 서열 선호도 등을 최적화하기 위해, 독점 알고리즘이 개발되었고 sdRNA 효능 예측을 위해 활용되었다(예를 들어, US 20160304873 참조). 이들 분석에 기반하여, 기능성 sdRNA 서열은 일반적으로 1μM 농도에서 발현에서의 70%를 넘는 감소를 갖는 것으로 정의되었으며, 확률은 40%를 넘는다.
일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 70% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 75% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 80% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 85% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 90% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 95% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 표적 유전자의 발현에서 99% 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 0.25μM 내지 약 4μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 0.25μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 0.5μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 0.75μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 1.0μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 1.25μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 1.5μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 1.75μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 2.0μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 2.25μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 2.5μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 2.75μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 3.0μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 3.25μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 3.5μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 3.75μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 발명에 사용된 sdRNA 서열은 약 4.0μM의 농도에서 전달될 때 표적 유전자의 발현에서 감소를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 제제는 치료제의 안정성 및/또는 유효성을 증가시키고 치료되어 지는 세포 또는 조직에 올리고뉴클레오티드의 효율적인 전달을 유효하게 하기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 이러한 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-O-플루로 변형, 디포스포로티오에이트 변형, 2' F 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 및/또는 2'데옥시 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 스테롤, 콜레스테롤, 비타민 D, 나프틸, 이소부틸, 벤질, 인돌, 트립토판 및/또는 페닐을 포함하는 하나 이상의 소수성 변형을 포함하도록 변형된다. 추가의 특정 실시양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 2'-O-메틸, 2'데옥시, 소수성 변형 및 포스포로티오에이트의 조합이다. 일부 실시양태에서, 당은 변형될 수 있고 변형된 당은 D-리보스, 2'-O-알킬(2'-O-메틸 및 2'-O-에틸 포함), 즉 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로(2'-플루오로 포함), T-메톡시에톡시, 2'-알릴옥시(-OCH2CH=CH2), 2'-프로파르길, 2'-프로필, 에티닐, 에테닐, 프로페닐, 시아노 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 당 모이어티는 6탄당일 수 있고, Augustyns, 등, Nucl. Acids. Res. 1992, 18, 4711에 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 안으로 통합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥으로, 즉, 분자의 양쪽 말단에 돌출하는 단일-가닥 서열이 없으며, 즉 무딘-말단이다. 일부 실시양태에서, 개별 핵산 분자는 상이한 길이의 것일 수 있다. 환언하면, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥이 아니다. 예로서, 2개의 별도의 핵산 분자가 사용되는 경우, 분자 중 하나, 예를 들어 안티센스 서열을 포함하는 제1 분자는 이에 혼성화하는 제2 분자보다 길 수 있다(분자의 일부는 단일-가닥으로 남음). 일부 실시양태에서, 단일 핵산 분자가 사용되는 경우, 어느 하나의 말단에서 분자의 일부는 단일-가닥으로 유지될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 미스매치 및/또는 루프 또는 돌출부를 함유하지만, 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 70%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 80%에 걸쳐 이중-가닥이다. 또 다른 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 90%-95%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 96%-98%에 걸쳐 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 미스매치를 함유한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 3' 또는 5' 연결을 변형함에 의해 뉴클레아제로부터 실질적으로 보호될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,849,902 및 WO 98/13526). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 "차단기"의 함입에 의해 저항성으로 만들어 질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "차단기"는 합성을 위한 보호기 또는 커플링기(예를 들어, FITC, 프로필(CH2-CH2-CH3), 글리콜(-O-CH2-CH2-O-) 포스페이트(PO3 2"), 수소 포스포네이트 또는 포스포르아미다이트)로서 올리고뉴클레오티드 또는 핵단량체에 부착될 수 있는 치환기(예를 들어, OH 기 이외)를 지칭한다. "차단기"는 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 엑소뉴클레아제 저항성 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 보호하는 "말단 차단기" 또는 "엑소뉴클레아제 차단기"를 또한 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, sdRNA 내의 연속 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 대체 연결, 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다.
일부 실시양태에서, 화학적 변형은 세포 흡수에서 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 , 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 , 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 증강으로 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, C 또는 U 잔기 중 적어도 하나는 소수성 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 C 및 U가 소수성 변형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 적어도 95%의 C 및 U가 소수성 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, C 및 U 모두가 소수성 변형을 함유한다.
일부 실시양태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA는 양성자화가능한 아민의 통합을 통해 sd-rxRNA 분자의 증강된 엔도솜 방출을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 양성자화가능한 아민은 센스 가닥(RISC 로딩 후 폐기되는 분자의 일부)에 통합된다. 일부 실시양태에서, 발명의 sdRNA 화합물은 이중체 영역(10-15개 염기 길이의 효율적인 RISC 유입에 필요함) 및 4-12개 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 영역을 포함하는 비대칭 화합물을 포함하며; 13개의 뉴클레오티드 이중체를 갖는다. 일부 실시양태에서, 6개 뉴클레오티드 단일 가닥 영역이 이용된다. 일부 실시양태에서, sdRNA의 단일 가닥 영역은 2-12개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결(포스포로티오에이트 변형으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 6-8개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결이 이용된다. 일부 실시양태에서, 발명의 sdRNA 화합물은 또한 안정성을 제공하고 RISC 유입과 양립할 수 있는 독특한 화학적 변형 패턴을 포함한다.
예를 들어, 가이드 가닥은 또한 RISC 유입을 방해하지 않고 안정성을 확인하는 임의의 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥에서 화학적 변형 패턴은 2' F 변형된 대부분의 C 및 U 뉴클레오티드 및 인산화되는 5' 말단을 포함한다.
일부 실시양태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA에서 뉴클레오티드의 적어도 30%가 변형된다. 일부 실시양태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA에서 뉴클레오티드의 적어도 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% , 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 변형된다. 일부 실시양태에서, sdRNA 또는 sd-rxRNA에서 뉴클레오티드의 100%가 변형된다.
일부 실시양태에서, sdRNA 분자는 최소 이중 가닥 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서 이중 가닥인 분자의 영역은 8-15개 뉴클레오티드 길이의 범위이다. 일부 실시양태에서 이중 가닥인 분자의 영역은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서 이중 가닥 영역은 13개 뉴클레오티드 길이이다. 가이드 가닥과 패신저 가닥 사이에는 100% 상보성이 있을 수 있거나, 가이드 가닥과 패신저 가닥 사이에는 하나 이상의 미스매치가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 분자의 일 말단 상에서 분자는 무딘-말단이거나 일-뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 분자의 단일 가닥 영역은 일부 실시양태에서 4-12개 뉴클레오티드 사이의 길이이다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 또한 4개 미만 또는 12개 초과 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 6 또는 7개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, sdRNA 분자는 증가된 안정성을 갖는다. 어떤 경우에, 화학적으로 변형된 sdRNA 또는 sd-rxRNA 분자는, 임의의 중간 값을 포함하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 24 초과 시간보다 긴 배지에서의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 12시간보다 긴 배지에서의 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, sdRNA는 증가된 효능 및/또는 감소된 독성을 위해 최적화된다. 일부 실시양태에서, 가이드 및/또는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 길이 및/또는 가이드 및/또는 패신저 가닥에서 포스포로티오에이트 변형의 수는 일부 양태에서 RNA 분자의 효력에 영향을 미칠 수 있으면서, 2'-O-메틸(2'OMe) 변형으로 2'-플루오로(2'F) 변형을 대체하는 것은 일부 양태에서 분자의 독성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 2'F 함량의 감소는 분자의 독성을 감소시키는 것으로 예측된다. 일부 실시양태에서, RNA 분자에서 포스포로티오에이트 변형의 수는 분자의 세포 내로의 흡수, 예를 들어 분자의 세포 내로의 수동적 흡수의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, sdRNA는 2'F 변형을 갖지 않지만 세포 흡수 및 조직 침투에 있어서 동일한 효능을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 가이드 가닥은 길이가 대략적으로 18-19개 뉴클레오티드이고 대략적으로 2-14개 포스페이트 변형을 갖는다. 예를 들어, 가이드 가닥은 포스페이트-변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 14개 초과의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 가이드 가닥은 RISC 유입을 방해함이 없이 증가된 안정성을 부여하는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드와 같은 포스페이트 변형된 뉴클레오티드는 3' 말단, 5' 말단에 있거나 가이드 가닥 전체에 걸쳐 퍼질 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 3' 말단 10개 뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 가이드 가닥은 또한 분자 전체에 걸쳐 위치할 수 있는 2'F 및/또는 2'OMe 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 위치 일에서의 뉴클레오티드(가이드 가닥의 가장 5' 위치에서의 뉴클레오티드)는 2'OMe 변형되고/되거나 인산화된다. 가이드 가닥 내의 C 및 U 뉴클레오티드는 2'F 변형될 수 있다. 예를 들어, 19nt 가이드 가닥의 위치 2-10(또는 다른 길이의 가이드 가닥에서의 상응하는 위치)에서의 C 및 U 뉴클레오티드는 2'F 변형될 수 있다. 가이드 가닥 내의 C 및 U 뉴클레오티드도 2'OMe 변형될 수 있다. 예를 들어, 19nt 가이드 가닥의 위치 11-18(또는 다른 길이의 가이드 가닥에서의 상응하는 위치)에서의 C 및 U 뉴클레오티드는 2'OMe 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 가장 3' 말단에서 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 특정 실시양태에서, 가이드 가닥 내의 대부분의 C 및 U는 2'F 변형되고 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시양태에서, 위치 1 및 위치 11-18에서의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시양태에서, 위치 1 및 위치 11-18에서의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화되고, 위치 2-10에서의 C 또는 U는 2'F 변형된다.
자가-전달가능한 RNAi 기술은 추가 제형 또는 기술이 필요 없이 RNAi 제제로 세포를 직접적으로 형질감염시키는 방법을 제공한다. 형질감염이 어려운 세포주를 형질감염시키는 능력, 높은 생체내 활성 및 사용의 단순성은 전통적인 siRNA-기반 기술에 비해 상당한 기능적 이점을 제시하는 조성물 및 방법의 특징이고, 이와 같은 sdRNA 방법은 본 발명의 TIL에서 표적 유전자의 발현에서 감소의 방법과 관련된 여러 실시양태에서 이용된다. sdRNAi 방법은 생체-외 및 생체내 둘 모두에서 화학적으로 합성된 화합물의 광범위한 일차 세포 및 조직으로의 직접적인 전달을 허용한다. 본원에서의 발명의 일부 실시양태에 기술된 sdRNA는 미국 매사추세츠주 우스터 소재의 Advirna LLC로부터 상업적으로 이용가능하다.
sdRNA는 소수성으로-변형된 siRNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 하이브리드 구조로 형성되고, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된, Byrne 등, December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, sdRNA 올리고뉴클레오티드는 멸균 전기천공을 사용하여 본원에 기술된 TIL로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 sdRNA 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위해 TIL 집단의 멸균 전기천공을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 막관통 전달 시스템과 조합하여 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 막관통 전달 시스템은 지질, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 제제는 임의의 전달 제제를 필요로 하지 않는 자가-전달 RNAi 제제이다. 특정 실시양태에서, 방법은 TIL의 집단에 sdRNA 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 막관통 전달 시스템의 사용을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물은 TIL에 의한 수동 흡수를 통한 것을 포함하여, 본원에 기술된 TIL과 접촉되고(예를 들어, 본원에서 투여 또는 전달되는 것으로도 지칭되는, 접촉하게 되어 지고) 이에 의해 흡수된다. sdRNA는 1차 확장, 예를 들어 단계 B 동안, 1차 확장 후, 예를 들어 단계 C 동안, 2차 확장 전 또는 동안, 예를 들어 단계 D 전 또는 동안, 단계 D 후, 단계 E에서 수확 전, 단계 F에서 수확 동안 또는 후, 최종 제형화 및/또는 단계 F에서 주입 백으로의 이전 전 또는 동안, 뿐만 아니라 단계 F에서 임의의 선택적 동결보존 단계 전에 본원에 기술된 바와 같이 TIL에 첨가될 수 있다. 더욱이, sdRNA는 단계 F에서 임의의 동결보존 단계로부터 해동한 후 첨가될 수 있다. 실시양태에서, PD-1, LAG3, TIM3, CISH 및 CBLB를 포함하여 본원에 기술된 바와 같이 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 TIL 및 기타 제제를 포함하는 세포 배양 배지에 100nM 내지 20mM, 200nM 내지 10mM, 500nm 내지 1mM, 1μM 내지 100μM 및 1μM 내지 100μM으로 구성된 군으로부터 선택된 농도에서 첨가될 수 있다. 실시양태에서, PD-1, LAG3, TIM3, CISH 및 CBLB를 포함하여 본원에 기술된 바와 같이 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 TIL 및 기타 제제를 포함하는 세포 배양 배지에 0.1μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 0.5μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 0.75μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 1μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 1.25μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 1.5μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 2μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 5μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지, 또는 10μM sdRNA/10,000 TIL/100μL 배지로 구성된 군으로부터 선택된 양에서 첨가될 수 있다. 실시양태에서, PD-1, LAG3, TIM3, CISH 및 CBLB를 포함하여 본원에 기술된 바와 같이 유전자를 표적화하는 하나 이상의 sdRNA는 사전-REP 또는 REP 단계 동안 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다 또는 7일마다 TIL 배양에 첨가될 수 있다.
sdRNA를 포함하는 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물은, 예를 들어 sdRNA를 세포 배양 배지에 고농도로 용해시키고 수동적 흡수가 일어나기 위한 충분한 시간을 허용함에 의해 확장 과정 동안 본원에 기술된 바와 같이 TIL과 접촉될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TIL의 집단을 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 세포 배양 배지에서 올리고뉴클레오티드 예를 들어 sdRNA를 용해시키고 세포 배양 배지를 TIL의 집단과 접촉시키는 것을 포함한다. TIL은 본원에 기술된 바와 같은 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단일 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 세포 안으로의 전달은 인산칼슘, DMSO, 글리세롤 또는 덱스트란, 전기천공을 포함하는 적합한 당업계에서 인정된 방법에 의해, 또는 예를 들어 당업계에 공지된 방법(예를 들어, WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; 미국 특허 번호 4,897,355; Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567 참조)을 사용하여 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질 조성물 또는 리포솜을 사용하는 형질감염에 의해 증강될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 sdRNA가 표적화된 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, PD-1, TIM3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 표적화 sdRNA 중 하나 이상이 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, PD-1 sdRNA는 하나 이상의 유전자 표적의 발현을 감소시키기 위해 TIM3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 중 하나 이상과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, LAG3 sdRNA는 두 표적 모두의 유전자 발현을 감소시키기 위해 CISH 표적화 sdRNA와 조합하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에서의 PD-1, TIM3, CBLB, LAG3 및/또는 CISH 중 하나 이상을 표적화하는 sdRNA는 미국 매사추세츠주 우스터 소재의 Advirna LLC로부터 상업적으로 이용가능하다.
일부 실시양태에서, sdRNA는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, sdRNA는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적으로 하고, 또 다른 sdRNA는 LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFβR2, PKA, CBLB, BAFF(BR3) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, sdRNA는 PD-1, LAG3, CISH, CBLB, TIM3 및 이의 조합으로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, sdRNA는 PD-1 및 LAG3, CISH, CBLB, TIM3 및 이의 조합 중 하나로부터 선택된 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적화하고 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적화하고 하나의 sdRNA는 CISH를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적화하고 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적화하고, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적화하고 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적화하고, 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적화하고, 하나의 sdRNA는 PD-1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적화하고 하나의 sdRNA는 LAG3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적화하고, 하나의 sdRNA는 CISH를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 하나의 sdRNA는 TIM3을 표적화하고 하나의 sdRNA는 CBLB를 표적화한다.
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 실시양태는 그 치료적 효과를 증강시키기 위해 유전자-편집을 통해 유전적으로 변형된 것을 제공한다. 본 발명의 실시양태는 하나 이상의 단백질의 발현 촉진 및 하나 이상의 단백질의 발현 억제 둘 모두, 뿐만 아니라 이의 조합을 위해 TIL의 집단 안으로 뉴클레오티드 삽입(RNA 또는 DNA)을 통한 유전자 편집을 포용한다. 본 발명의 실시양태는 또한 TIL을 치료적 집단 안으로 확장하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 TIL을 유전자-편집하는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 TIL의 집단을 유전적으로 변형하는데 사용될 수 있는 여러 가지 유전자-편집 기술이 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 단백질의 생산을 위한 유전자의 안정한 합체의 단계를 포함하는 TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 렌티바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Levine, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, 등, Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, 등, J. Virology 1998, 72, 8463-71 및 미국 특허 번호 6,627,442에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달의 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있고 트랜스포사제가 DNA 발현 벡터 또는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되어 트랜스포사제의 장기간 발현이 이식유전자 세포, 예를 들어, mRNA(예를 들어, 캡 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 mRNA)로 제공된 트랜스포사제에서 발생하지 않는 시스템을 포함한다. SB10, SB11 및 SB100x와 같은 연어-유형 Tel-유사 트랜스포사제(SB 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제) 및 증가된 효소 활성을 갖는 조작된 효소를 포함하는 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템이, 예를 들어 Hackett, 등, Mol. Therapy 2010, 18, 674-83 및 미국 특허 번호 6,489,458에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, 방법은 TIL의 집단, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단을 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 하나 이상의 단백질의 생산 또는 억제(예를 들어, 사일런싱)를 위한 유전자의 안정한 합체의 단계를 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 전기천공의 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0227237 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 그 개시내용이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 5,019,034; 5,128,257; 5,137,817; 5,173,158; 5,232,856; 5,273,525; 5,304,120; 5,318,514; 6,010,613 및 6,078,490에 기술된 것과 같이 당업계에 공지된 다른 전기천공 방법이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 전기천공 방법은 멸균 전기천공 방법이다. 실시양태에서, 전기천공 방법은 펄스된 전기천공 방법이다. 실시양태에서, 전기천공 방법은, 100V/cm 이상의 전계 강도를 갖는 일련의 적어도 3개의 단일, 조작자-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스된 전기장으로 처리하여 TIL에서의 정의되고 제어된, 영구적 또는 일시적인 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스된 전기천공 방법이며, 여기서 일련의 적어도 3개의 DC 전기 펄스는 다음 특징 중 1개, 2개 또는 3개를 갖는다: (1) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다르고; (2) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다르고; (3) 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 다르다. 실시양태에서, 전기천공 방법은 방법은, 100V/cm 이상의 전계 강도를 갖는 일련의 적어도 3개의 단일, 조작자-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스된 전기장으로 처리하여 TIL에서의 정의되고 제어된, 영구적 또는 일시적인 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스된 전기천공 방법이며, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다르다. 실시양태에서, 전기천공 방법은, 100V/cm 이상의 전계 강도를 갖는 일련의 적어도 3개의 단일, 조작자-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스된 전기장으로 처리하여 TIL에서의 정의되고 제어된, 영구적 또는 일시적인 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스된 전기천공 방법이며, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다르다. 실시양태에서, 전기천공 방법은, 100V/cm 이상의 전계 강도를 갖는 일련의 적어도 3개의 단일, 조작자-제어된, 독립적으로 프로그래밍된 DC 전기 펄스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스된 전기장으로 처리하여 TIL에서의 정의되고 제어된, 영구적 또는 일시적인 변화를 변경, 조작 또는 유발하는 단계를 포함하는 펄스된 전기천공 방법이며, 여기서 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 다르다. 실시양태에서, 전기천공 방법은, 100V/cm 이상의 전계 강도를 갖는 일련의 적어도 3개의 DC 전기 펄스를 TIL에 적용하는 단계를 포함하는, TIL을 펄스된 전기장으로 처리하여 TIL에서의 포어 형성을 유도하는 단계를 포함하는 펄스된 전기천공 방법이며, 여기서 일련의 적어도 3개의 DC 전기 펄스는 다음 특징 중 1개, 2개 또는 3개를 갖는다: (1) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 진폭이 서로 다르고; (2) 적어도 3개의 펄스 중 적어도 2개는 펄스 폭이 서로 다르고; (3) 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제1 세트에 대한 제1 펄스 간격은 적어도 3개의 펄스 중 2개의 제2 세트에 대한 제2 펄스 간격과 달라, 유도된 포어가 상대적으로 장기간 동안 지속되고 TIL의 생존력이 유지된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 인산칼슘 형질감염의 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법(인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅 및 세포내이입)은 당업계에 공지되어 있고, Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; and Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; 및 미국 특허 번호 5,593,875에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 리포솜 형질감염의 단계를 포함한다. 리포솜 형질감염 방법, 예컨대 여과수에서 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)와 디올레오일 포포티딜에탄올아민(DOPE)의 1:1(w/w) 리포솜 제형을 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 Rose, 등, Biotechniques 1991, 10, 520-525 및 Felgner, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417 및 미국 특허 번호 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; 및 7,687,070에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 실시양태에서, TIL의 집단을 유전적으로 변형시키는 방법은 미국 특허 번호 5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; 및 7,189,705에 기술된 방법을 사용한 형질감염의 단계를 포함하며; 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. TIL은 본원에 기술된 바와 같은 TIL의 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단일 수 있다.
실시양태에 따르면, 유전자-편집 과정은 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 파괴의 생성을 매개하는 프로그램가능한 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 프로그래밍가능한 뉴클레아제는 특정 게놈 좌위에 파괴를 도입함에 의해 정확한 게놈 편집을 가능하게 하며, 즉 게놈 내의 특정 DNA 서열의 인식에 의존하여 뉴클레아제 도메인을 이 위치로 표적화하고 표적 서열에서 이중-가닥 파괴의 생성을 매개한다. DNA에서의 이중-가닥 파괴는 후속적으로 비-상동성 말단-결합(NHEJ) 또는 상동-지향된 복구(HDR)에 의한 게놈 편집을 매개하기 위해 파괴 부위에 내인성 복구 기계를 모집한다. 따라서, 파괴의 복구는 표적 유전자 산물을 방해(예를 들어, 침묵, 억제 또는 증강)하는 삽입/결실 돌연변이의 도입을 초래할 수 있다.
부위-특이적 게놈 편집을 가능하게 하기 위해 개발된 주요 부류의 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 뉴클레아제(TALEN) 및 CRISPR-연관된 뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas9)를 포함한다. 이들 뉴클레아제 시스템은 그 DNA 인식의 방식에 기반하여 크게 2가지 범주로 분류될 수 있다: ZFN과 TALEN은 단백질-DNA 상호작용을 통해 특정 DNA 결합을 달성하는 반면, Cas9와 같은 CRISPR 시스템은 표적 DNA와 직접적으로 염기-쌍을 이루는 짧은 RNA 가이드 분자에 의해 그리고 단백질-DNA 상호작용에 의해 특정 DNA 서열에 표적화된다. 예를 들어, Cox 등, Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2 참조.
본 발명의 TIL 확장 방법에 따라 사용될 수 있는 유전자-편집 방법의 비-제한적 예는 CRISPR 방법, TALE 방법 및 ZFN 방법을 포함하며, 이는 아래에 보다 자세히 기술되어 있다. 실시양태에 따르면, TIL을 치료적 집단 안으로 확장하는 방법은 본원에 기술된 방법의 임의의 실시양태(예를 들어, GEN 3 과정)에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605 또는 PCT/US2018/012633에 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 방법은 증강된 치료적 효과를 제공할 수 있는 TIL을 생성하기 위해 CRISPR 방법, TALE 방법 또는 ZFN 방법 중 하나 이상에 의해 TIL의 적어도 일부를 유전자-편집하는 것을 추가로 포함한다. 실시양태에 따르면, 유전자-편집된 TIL은 이를 시험관내에서 비-변형된 TIL과 비교함에 의해, 예를 들어 비변형된 TIL과 비교된, 시험관내 이펙터 기능, 사이토카인 프로필 등을 평가함에 의해 개선된 치료적 효과에 대해 평가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 CRISPR, TALE 및/또는 ZFN 방법을 사용하여 TIL의 집단을 유전자 편집하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 전기천공은 CRISPR, TALEN 및 ZFN 시스템과 같은 유전자 편집 시스템의 전달을 위해 사용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전기천공 시스템은 유동 전기천공 시스템이다. 본 발명의 일부 실시양태로 사용하기에 적합한 적합한 유동 전기천공 시스템의 예는 상업적으로-이용가능한 MaxCyte STX 시스템이다. BTX-Harvard Apparatus로부터 이용가능한 AgilePulse 시스템 또는 ECM 830, Cellaxess Elektra(Cellectricon), Nucleofector(Lonza/Amaxa), GenePulser MXcell(BIORAD), iPorator-96(Primax) 또는 siPORTer96(Ambion)과 같은, 본 발명과 함께 사용하기에 적합할 수 있는 몇 가지 대안적인 상업적으로-이용가능한 전기천공 장비가 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전기천공 시스템은 TIL 확장 방법의 나머지 부분과 함께 폐쇄된 멸균 시스템을 형성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전기천공 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 펄스된 전기천공 시스템이고, TIL 확장 방법의 나머지 부분과 함께 폐쇄된 멸균 시스템을 형성한다.
TIL을 치료적 집단 안으로 확장하는 방법은 본원에 기술된 방법의 임의의 실시양태(예를 들어, 프로세스 GEN 3)에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 방법은 CRISPR 방법(예를 들어, CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cpf1)에 의해 TIL의 적어도 일부를 유전자-편집하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, TIL 확장 과정 동안 CRISPR 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 침묵되거나 감소되도록 한다. 대안적으로, TIL 확장 과정 동안 CRISPR 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 증강되도록 한다.
CRISPR은 "클러스터형 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복"을 의미한다. 유전자 편집을 위해 CRISPR 시스템을 사용하는 방법은 본원에서 CRISPR 방법으로도 지칭된다. RNA 및 Cas 단백질을 합체하고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 CRISPR 시스템의 3가지 유형: 유형 I, II 및 III이 있다. 유형 II CRISPR(Cas9에 의해 예시됨)는 가장 잘-특성화된 시스템 중 하나이다.
CRISPR 기술은 박테리아와 고세균(단일-세포로된 미생물의 도메인)의 자연 방어 메커니즘으로부터 채택되었다. 이들 유기체는 CRISPR-유래된 RNA와 Cas9를 포함한 다양한 Cas 단백질을 사용하여, 외부 침입자의 DNA를 자르고 파손함에 의해 바이러스 및 기타 이물질의 공격을 저지한다. CRISPR은 2가지 독특한 특징인: 뉴클레오티드 반복과 스페이서의 존재를 가진 DNA의 특별화된 영역이다. 뉴클레오티드의 반복된 서열은 반복된 서열 사이에 점재된 외래 DNA의 짧은 세그먼트(스페이서)와 함께 CRISPR 영역 전반에 걸쳐 분포된다. 유형 II CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 CRISPR 게놈 좌위 내에 합체되어 전사되고 짧은 CRISPR RNA(crRNA)로 처리된다. 이들 crRNA는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)에 어닐링하고 Cas 단백질에 의한 병원성 DNA의 서열-특이적 절단 및 사일런싱을 지시한다. Cas9 단백질에 의한 표적 인식에는 crRNA 내의 "시드" 서열과 crRNA-결합 영역 상류의 보존된 디뉴클레오티드-함유 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열이 필요하다. CRISPR/Cas 시스템은 이에 의해 crRNA를 재설계함에 의해 사실상 임의의 DNA 서열을 절단하도록 재표적화될 수 있다. 천연 시스템에서의 crRNA 및 tracrRNA는 유전적 조작에 사용하기 위해 대략적으로 100개 뉴클레오티드의 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 단순화될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 엔도-뉴클레아제와 필요한 crRNA 구성요소를 발현하는 플라스미드의 공동-전달에 의해 인간 세포에 직접적으로 이동가능하다. Cas 단백질의 다양한 변이체를 사용하여 표적화 한계를 감소시킬 수 있다(예를 들어, Cpf1과 같은 Cas9의 오솔로그).
CRISPR 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함에 의해 침묵되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG3, HAVCR2 (TIM3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3을 포함한다.
CRISPR 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함에 의해 증강될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 및 IL-21을 포함한다.
CRISPR 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하고, 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물의 예는 미국 특허 번호 8,697,359; 8,993,233; 8,795,965; 8,771,945; 8,889,356; 8,865,406; 8,999,641; 8,945,839; 8,932,814; 8,871,445; 8,906,616; 및 8,895,308에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. CRISPR/Cas9 및 CRISPR/Cpf1을 발현하기 위한 플라스미드와 같은 CRISPR 방법을 수행하기 위한 공급원은 GenScript와 같은 회사에서 상업적으로 이용가능하다.
실시양태에서, 본원에 기술된 TIL의 집단의 유전적 변형은 미국 특허 번호 US 9790490에 기술된 바와 같은 CRISPR/Cpf1 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
TIL을 치료적 집단 안으로 확장하는 방법은 본원에 기술된 방법의 임의의 실시양태(예를 들어, Gen 2)에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 방법은 TALE 방법에 의해 TIL의 적어도 일부를 유전자-편집하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, TIL 확장 과정 동안 TALE 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 침묵되거나 감소되도록 야기한다. 대안적으로, TIL 확장 과정 동안 TALE 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 증강되도록 야기한다.
TALE는 TALEN("전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제")을 포함하는 "전사 활성제-유사 이펙터" 단백질을 의미한다. 유전자 편집을 위해 TALE 시스템을 사용하는 방법은 본원에서 TALE 방법으로도 지칭될 수 있다. TALE는 식물 병원성 박테리아 속 잔토모나스로부터 자연적으로 발생하는 단백질이고 각각 단일 염기쌍을 인식하는 일련의 33―35-아미노산 반복 도메인으로 구성된 DNA-결합 도메인을 함유한다. TALE 특이성은 반복-가변성 이중-잔기(RVD)로 알려진 2개의 초가변성 아미노산에 의해 결정된다. 모듈형 TALE 반복은 함께 연결되어 인접한 DNA 서열을 인식한다. DNA-결합 도메인에서의 특정 RVD는 표적 좌위에서 염기를 인식하여, 예측가능한 DNA-결합 도메인을 조립하는 구조적 특징을 제공한다. TALE의 DNA 결합 도메인은 유형 IIS FokI 엔도뉴클레아제의 촉매적 도메인에 융합되어 표적화가능한 TALE 뉴클레아제를 만든다. 부위-특이적 돌연변이를 유도하기 위해, 14-20개 염기쌍 스페이서 영역에 의해 분리된 2개의 개별 TALEN 아암이 FokI 단량체를 가까이 가져와 이량체화하고 표적화된 이중-가닥 파괴를 생성한다.
다양한 조립 방법을 활용하는 몇몇 대규모의 체계적인 연구는 TALE 반복이 조합되어 사실상 임의의 사용자-정의된 서열을 인식할 수 있음을 나타냈다. 맞춤형-설계된 TALE 어레이는 또한 Cellectis Bioresearch(프랑스 파리 소재), Transposagen Biopharmaceuticals(미국 켄터키주 렉싱턴 소재) 및 Life Technologies(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 통해 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 TALE 및 TALEN 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0201118 A1; 미국 2013/0117869 A1; 미국 2013/0315884 A1; US 2015/0203871 A1 및 US 2016/0120906 A1에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
TALE 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함 의해 침묵되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG3, HAVCR2(TIM3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3을 포함한다.
TALE 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함에 의해 증강될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 및 IL-21을 포함한다.
TALE 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하고, 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물의 예는, 미국 특허 번호 8,586,526에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
TIL을 치료적 집단 안으로 확장하는 방법은 본원에 기술된 방법의 임의의 실시양태(예를 들어, 프로세스 GEN 3)에 따라 또는 PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, 또는 PCT/US2018/012633에 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 여기서 방법은 징크 핑거 또는 징크 핑거 뉴클레아제 방법에 의해 TIL의 적어도 일부를 유전자-편집하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, TIL 확장 과정 동안 징크 핑거 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 침묵되거나 감소되도록 야기한다. 대안적으로, TIL 확장 과정 동안 징크 핑거 방법의 사용은 TIL의 치료적 집단의 적어도 일부에서 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현이 증강되도록 야기한다.
개별 징크 핑거는 보존된 ββα 구성에서 대략적으로 30개의 아미노산을 함유한다. α-나선의 표면 상의 여러 아미노산은 전형적으로 다양한 수준의 선택성을 가지고 DNA의 주요 홈에서 3bp와 접촉한다. 징크 핑거는 2개의 단백질 도메인을 갖는다. 제1 도메인은 진핵생물 전사 인자를 포함하고 징크 핑거를 함유하는 DNA 결합 도메인이다. 제2 도메인은 FokI 제한 효소를 포함하고 DNA의 촉매적 절단을 담당하는 뉴클레아제 도메인이다.
개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 3 내지 6개의 개별 징크 핑거 반복을 함유하고 각각 9 내지 18개의 염기쌍을 인식할 수 있다. 징크 핑거 도메인이 그 의도된 표적 부위에 특이적이라면, 총 18개 염기쌍을 인식하는 한 쌍의 3-핑거 ZFN이 이론적으로는 포유동물 게놈에서의 단일 좌위를 표적화할 수 있다. 새로운 징크-핑거 어레이를 생성하는 한 가지 방법은 공지된 특이성의 더 작은 징크-핑거 "모듈"을 조합하는 것이다. 가장 일반적인 모듈식 조립 과정은 각각 3개의 염기쌍 DNA 서열을 인식할 수 있는 3개의 별도 징크 핑거를 조합하여 9개의 염기쌍 표적 부위를 인식할 수 있는 3-핑거 어레이를 생성하는 것을 포함한다. 대안적으로, 올리고머화된 풀 엔지니어링(OPEN)과 같은 선택-기반 접근방식을 사용하여 이웃하는 핑거 간의 상황-의존적 상호작용을 고려하는 무작위화된 라이브러리에서 새로운 징크-핑거 어레이를 선택할 수 있다. 조작된 징크 핑거가 상업적으로 이용가능하다; Sangamo Biosciences(미국 캘리포니아주 리치몬드 소재)는 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재)와 협력하여 징크-핑거 구축을 위한 독점 플랫폼(CompoZr®)을 개발했다.
징크 핑거 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함에 의해 침묵되거나 억제될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 PD-1, CTLA-4, LAG3, HAVCR2(TIM3), Cish, TGFβ, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3을 포함한다.
징크 핑거 방법을 통해 TIL을 영구적으로 유전자-편집함에 의해 증강될 수 있는 유전자의 비-제한적인 예는 CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 및 IL-21을 포함한다.
징크 핑거 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하고, 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물의 예는 미국 특허 번호 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,719, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185, 및 6,479,626에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
징크 핑거 방법에 의해 표적 유전자 서열의 발현을 변경하고, 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물의 다른 예는 Beane, 등, Mol. Therapy, 2015, 23 1380-1390에 기재되어 있으며, 이 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, TIL은 선택적으로 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어 MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1과 같은 종양-연관된 항원에 표적화된 TCR, 또는 종양-연관된 세포 표면 분자(예를 들어, 메조텔린) 또는 계통-제한된 세포 표면 분자(예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가 기능을 포함하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시양태에서, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 국제 특허 공개 번호 WO 2019/160829 A1에 기술된 유전적 조작 방법이 특정 표적 유전자 예컨대 PD-1 및 CTLA-4에 대해 코딩하는 유전자의 녹아웃을 포함하여 TIL을 유전적으로 편집하는데 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어 MAGE-1, HER2, 또는 NY-ESO-1과 같은 종양-연관된 항원에 표적화된 TCR, 또는 종양-연관된 세포 표면 분자(예를 들어, 메조텔린) 또는 계통-제한된 세포 표면 분자(예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하도록 TIL의 집단을 유전적으로 조작하는 것을 포함한다. 적절하게, TIL의 집단은 본원에 기술된 바와 같은 제1 집단, 제2 집단 및/또는 제3 집단일 수 있다.
E. TIL 제조를 위한 밀폐 시스템
본 발명은 TIL 배양 과정 동안 밀폐 시스템의 사용을 제공한다. 이러한 밀폐 시스템은 미생물 오염을 방지 및/또는 감소하게 하고, 더 적은 플라스크의 사용을 허용하고 비용 절감을 허용한다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 2개의 용기를 사용한다.
이러한 밀폐 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 및 https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm에서 발견될 수 있다.
멸균 연결 장치(STCD)는 2개의 호환가능한 튜브 조각 사이에 멸균 용접을 생성한다. 이 절차는 다양한 용기와 튜브 직경의 멸균 연결을 허용한다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 예를 들어 실시예 14에 기술된 바와 같은 루어 락 및 열 밀봉된 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 시스템의 멸균성 및 폐쇄된 특성을 유지하기 위해 멸균 조건 하에서 주사기를 통해 접근된다. 일부 실시양태에서, 실시예 14에 기술된 바와 같은 밀폐 시스템이 이용된다. 일부 실시양태에서, TIL은 실시예 14의 "최종 제형화 및 충진" 섹션에 기술된 방법에 따라 최종 생성물 제형 용기로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 밀폐 시스템은 종양 단편이 수득된 시점부터 TIL이 환자에게 투여되거나 동결보존될 준비가 될 때까지 하나의 용기를 사용한다. 일부 실시양태에서 2개의 용기가 사용되는 경우, 제1 용기는 폐쇄된 G-용기이고, TIL의 집단은 원심분리되고 제1 폐쇄된 G-용기를 개봉함에 없이 주입 백으로 옮겨진다. 일부 실시양태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우 주입 백은 HypoThermosol-함유 주입 백이다. 밀폐 시스템 또는 폐쇄된 TIL 세포 배양 시스템은 일단 종양 샘플 및/또는 종양 단편이 추가되면 시스템이 외부로부터 단단히 밀봉되어 박테리아, 진균의 침입 및/또는 임의의 기타 미생물 오염 없는 폐쇄된 환경을 형성하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 5% 내지 약 95%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 5% 내지 약 90%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 10% 내지 약 90%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 15% 내지 약 85%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염에서 감소는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%이다.
밀폐 시스템은 미생물 오염에서의 부재 및/또는 상당한 감소에서 TIL 성장을 허용한다.
더욱이, TIL 세포 배양 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압은 세포가 배양됨에 따라 각각 달라진다. 결과적으로, 세포 배양에 적합한 배지가 순환되더라도 여전히 폐쇄된 환경은 TIL 증식을 위한 최적의 환경으로 지속적으로 유지되어야 할 필요가 있다. 이 목적을 위해, 폐쇄된 환경의 배양액 내 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압의 물리적 인자가 센서의 수단에 의해 모니터링되고, 그 신호는 배양 환경의 입구에 설치된 가스 교환기를 제어하기 위해 이용되고, 폐쇄된 환경의 가스 분압은 배양액에서의 변화에 따라 실시간으로 조정되어 세포 배양 환경을 최적화하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 폐쇄된 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압을 측정하는 모니터링 장치가 장착된 가스 교환기를 폐쇄된 환경에 대한 입구에서 합체하고 모니터링 장치로부터 신호를 기반으로 가스 농도를 자동으로 조정함에 의해 세포 배양 환경을 최적화하는 폐쇄된 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 폐쇄된 환경 내의 압력은 연속적으로 또는 간헐적으로 제어된다. 즉, 폐쇄된 환경에서의 압력은 예를 들어 압력 유지 장치의 수단에 의해 가변될 수 있고 따라서 공간이 양압 상태에서 TIL의 성장에 적합한 것을 보장하거나 음압 상태에서 유체의 삼출을 촉진하고 따라서 세포 증식을 촉진한다. 더욱이, 간헐적으로 음압을 가함에 의해, 폐쇄된 환경의 부피에서 일시적인 수축의 수단에 의해 폐쇄된 환경에서의 순환액을 균일하고 효율적으로 교체하는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, TIL의 증식을 위한 최적의 배양 성분이 대체되거나 추가될 수 있고, IL-2 및/또는 OKT3과 같은 인자뿐만 아니라 조합을 포함하여 추가될 수 있다.
F. TIL의 선택적 동결보존
벌크 TIL 집단(예를 들어 TIL의 제2 집단) 또는 TIL의 확장된 집단(예를 들어 TIL의 제3 집단)은 선택적으로 동결보존될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 치료적 TIL 집단에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 2차 확장 후에 수확된 TIL에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 도 1 및/또는 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 예시적인 단계 F에서의 TIL에서 발생한다. 일부 실시양태에서, TIL은 주입 백에 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 주입 백에 배치 이전에 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 동결보존되고 주입 백에 배치되지 않는다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 동결보존 배지를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유한다. 이는 일반적으로 TIL 집단을 냉동 용액, 예를 들어 85% 보체 비활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 안에 둠에 의해 성취된다. 용액에서의 세포는 극저온 바이알 안으로 배치되고, 동결보존을 위해 기체성 질소 냉동고로 선택적 이동으로 -80℃에서 24시간 동안 보관된다. Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986 참조.
적절한 경우, 세포를 냉동고에서 제거하여 용액의 대략적으로 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동한다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 계수하고 당업계에 공지된 바와 같이 생존성에 대해 평가할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, TIL의 집단은 CS10 동결보존 배지(CryoStor 10, BioLife Solutions)를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL의 집단은 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 동결보존 배지를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL의 집단은 CS10 및 세포 배양 배지의 1:1(부피:부피) 비를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL의 집단은 추가 IL-2를 추가로 포함하는, CS10 및 세포 배양 배지의 약 1:1(부피:부피) 비율을 사용하여 동결보존된다.
상기에 논의되고 도 1 및/또는 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 단계 A부터 E까지 예시된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 과정 전반에 걸쳐 다수의 지점에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 단계 B에 따라 제공된 바와 같은 1차 확장 후의 TIL의 확장된 집단, 또는 도 1 또는 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)의 단계 D에 따른 하나 이상의 2차 확장 후의 TIL의 확장된 집단는 동결보존될 수 있다. 동결보존은 일반적으로 TIL 집단을 동결 용액, 예를 들어, 85% 보체 비활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 안으로 배치함에 의해 성취될 수 있다. 용액에서의 세포는 극저온 바이알 안으로 배치되고, 동결보존을 위해 기체성 질소 냉동고로 선택적 이동으로 -80℃에서 24시간 동안 보관된다. Sadeghi, 등, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986 참조. 일부 실시양태에서, TIL은 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 세포 배양 배지 플러스 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 실시예 6에 제공된 방법에 따라 동결보존된다.
적절한 경우, 세포를 냉동고에서 제거하여 용액의 대략적으로 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동한다. 세포는 일반적으로 완전 배지에 재현탁되고 선택적으로 1회 이상 세정된다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 계수하고 당업계에 공지된 바와 같이 생존성에 대해 평가할 수 있다.
일부 경우에, 단계 B TIL 집단은 아래에 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 단계 C 및 단계 D를 거친 후 단계 D 후에 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 TIL이 요법에서 사용되는 경우, 단계 B 또는 단계 D TIL 집단은 적절한 처리를 위한 유전적 변형을 받을 수 있다.
G. 확장된 TIL의 검정 및 표현형 특성
일부 실시양태에서, 상기에 기술된 과정으로부터 TIL의 효력 및/또는 기능성은 본원에 기술된 검정 방법 중 하나를 사용하여 검사된다.
실시양태에서, 발명은 유전적으로 조작된 TIL 생성물 및 CD134(OX40) 및/또는 CD137(4-1BB) 작동제를 사용하여 생산된 TIL 생성물을 포함하는, 상기에 기술된 TIL 생성물의 효력을 결정하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a. 제1 기간 동안 표적 세포와 TIL 생성 세포의 공배양을 수행하는 단계;
b. 공배양으로부터 수확물을 수득하는 단계; 및
c. (1) TIL 생성물에 대한 하나 이상의 마커의 발현 또는 (2) TIL 생성 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대한 수확물을 평가하여 TIL 생성물의 효력을 결정하기 위한 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계.
대안적으로, 일부 실시양태에서, 상기에 기술된 과정으로부터의 TIL은 IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 분석물의 ELISA 또는 자동화된 ELISA(예를 들어, ELLA) 검출로 CD3 또는 CD3/CD28 비드-기반 자극을 포함하는 조합된 검정을 사용하여 분석된다. 실시양태에서, 이러한 조합된 검정에 대한 생성물 방출 사양은 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 500pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 600pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 700pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 800pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 900pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1000pg/mL, 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1100pg/mL, 또는 적어도 2개의 선택된 분석물에 대해 적어도 1200pg/mL이며, 여기서 시험 항목의 각 mL는 1×105 TIL, 2×105 TIL, 3×105 TIL, 4×105 TIL, 5×105 TIL, 6×105 TIL, 7×105 TIL, 8×105 TIL, 9×105 TIL 또는 10×105 TIL을 함유한다.
일부 실시양태에서, TIL은 본원 및 실시예에 기술된 것들을 포함하여 확장 후 다수의 표현형 마커의 발현에 대해 분석된다. 실시양태에서, 하나 이상의 표현형 마커의 발현이 검사된다. 일부 실시양태에서, TIL의 표현형 특징은 단계 B에서 1차 확장 후에 분석된다. 일부 실시양태에서, TIL의 표현형 특징은 단계 C에서 전환 동안 분석된다. 일부 실시양태에서, TIL의 표현형 특징은 단계 C에 따른 전환 동안 및 동결보존 후에 분석된다. 일부 실시양태에서, TIL의 표현형 특징은 단계 D에 따른 2차 확장 후에 분석된다. 일부 실시양태에서, TIL의 표현형 특징은 단계 D에 따른 2회 이상의 확장 후에 분석된다.
일부 실시양태에서, 마커는 CD8 및 CD28로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD8의 발현이 검사된다. 일부 실시양태에서, CD28의 발현이 검사된다. 일부 실시양태에서, CD8 및/또는 CD28의 발현은 다른 과정(예를 들어, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 Gen 3 과정과 비교하여, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 2A 과정과 비교하여 본 발명 과정에 따라 생성된 TIL에서 더 높다. 일부 실시양태에서, CD8의 발현은 다른 과정(예를 들어, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b)에 제공된 바와 같은 Gen 3 과정과 비교하여, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 2A 과정과 비교하여 본 발명 과정에 따라 생성된 TIL에서 더 높다. 일부 실시양태에서, CD28의 발현은 다른 과정(예를 들어, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 Gen 3 과정과 비교하여, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8a))에 제공된 바와 같은 2A 과정과 비교하여 본 발명 과정에 따라 생성된 TIL에서 더 높다. 일부 실시양태에서, 높은 CD28 발현은 더 젊고 더 지속적인 TIL 표현형을 나타낸다. 실시양태에서, 하나 이상의 조절 마커의 발현이 측정된다.
실시양태에서, CD8 및/또는 CD28 발현에 기반한 TIL의 제1 집단, TIL의 제2 집단, TIL의 제3 집단, 또는 수확된 TIL 집단의 선택은 본원에 기술된 종양 침윤 림프구(TIL)를 확장하는 방법에 대한 임의의 단계 동안 수행되지 않는다.
일부 실시양태에서, 중앙 기억 세포의 백분율은 다른 과정(예를 들어, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같은 Gen 3 과정과 비교하여, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8a))에 제공된 바와 같은 2A 과정과 비교하여 본 발명 과정에 따라 생성된 TIL에서 더 높다. 일부 실시양태에서 중앙 기억 세포에 대한 기억 마커는 CCR7 및 CD62L로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL 기억 하위집합은 서로 다른 기억 하위집합으로 분할될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 나이브(CD45RA+CD62L+) TIL을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 중앙 기억(CM; CD45RA-CD62L+) TIL을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 효과기 기억(EM; CD45RA-CD62L-) TIL을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ TIL은 RA+ 효과기 기억/효과기(TEMRA/TEFF; CD45RA+CD62L+) TIL을 포함한다.
일부 실시양태에서, TIL은 그랜자임 B, 퍼포린 및 그래눌리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하다. 일부 실시양태에서, TIL은 그랜자임 B를 발현한다. 일부 실시양태에서, TIL은 퍼포린을 발현한다. 일부 실시양태에서, TIL은 그래눌리신을 발현한다.
실시양태에서, 재자극된 TIL은 또한 사이토카인 방출 검정을 사용하여 사이토카인 방출에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 인터페론-γ(IFN-γ) 분비에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 ELISA 검정에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어 도 8b 및/또는 도 8c)에 제공된 바와 같이 단계 D 후, 급속 2차 확장 단계 후에 ELISA 검정에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, TIL 건강은 IFN-감마(IFN-γ) 분비에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효력 검정이 이용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 가능성의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은 CD3, CD28 및 CD137/4-1BB에 대한 항체로 자극된 TIL의 배지에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있다. 이들 자극된 TIL로부터 배지에서의 IFN-γ 수준은 IFN-γ 방출을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a)에 제공된 바와 같은 2A 과정에서의 단계 D에 비교하여 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c) TIL에 제공된 바와 같은 Gen 3 과정에서 단계 D에서의 IFN-γ 생산에서 증가는 단계 D TIL의 세포독성 잠재력에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 1-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 3-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 4-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 5-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 예를 들어 도 8b 방법을 포함하여, 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL을 포함하여 생체외 TIL에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 3-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 4-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 5-배 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, 적어도 100pg/mL 내지 약 1000pg/mL 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL, 적어도 250pg/mL, 적어도 300pg/mL, 적어도 350pg/mL, 적어도 400pg/mL, 적어도 450pg/mL, 적어도 500pg/mL, 적어도 550pg/mL, 적어도 600pg/mL, 적어도 650pg/mL, 적어도 700pg/mL, 적어도 750pg/mL, 적어도 800pg/mL, 적어도 850pg/mL, 적어도 900pg/mL, 적어도 950pg/mL, 또는 적어도 1000pg/mL 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도200pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 300pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 400pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 500pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 600pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 700pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 800pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 900pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 3000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 4000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 5000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 6000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 7000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 8000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 9000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 10,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 15,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 20,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 25,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 30,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 35,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 40,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 45,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 50,000pg/mL의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, 적어도 100pg/mL/5×105 세포 내지 약 1000pg/mL/5×105 세포 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d에 묘사된 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL/5×105 세포, 적어도 250pg/mL/5×105 세포, 적어도 300pg/mL/5×105 세포, 적어도 350pg/mL/ 5×105 세포, 적어도 400pg/mL/5×105 세포, 적어도 450pg/mL/5×105 세포, 적어도 500pg/mL/5×105 세포, 적어도 550pg/mL/5×105 세포, 적어도 600pg/mL/5×105 세포, 적어도 650pg/mL/5×105 세포, 적어도 700pg/mL/5×105 세포, 적어도 750pg/mL/5×105 세포, 적어도 800pg/mL/5×105 세포, 적어도 850pg/mL/5×105 세포, 적어도 900pg/mL/5×105 세포, 적어도 950pg/mL/5×105 세포, 또는 적어도 1000pg/mL/5×105 세포 이상의 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 300pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 400pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 500pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 600pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 700pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 800pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 900pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 3000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d에 묘사된 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 4000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 5000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 6000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 7000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 8000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 9000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 10,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 15,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 20,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 25,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 30,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 35,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 40,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 45,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 50,000pg/mL/5×105 세포 IFN-γ 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한되지만 많은 수의 유전자 세그먼트의 체세포 재조합에 의해 생성된다. 이들 유전자 세그먼트: V(가변), D(다양성), J(결합) 및 C(불변)는 면역글로불린 및 T 세포 수용체(TCR)의 결합 특이성과 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T 세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 새롭게 수확된 TIL 및/또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 새롭게 수확된 TIL 및/또는 도 8(특히, 예를 들어 도 8a)에 예시된 바와 같이 Gen 2로 지칭되는 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T 세포 레퍼토리 다양성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1차 확장에서 수득된 TIL은 T 세포 레퍼토리 다양성에서의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성에서의 증가는 면역글로불린 다양성 및/또는 T 세포 수용체 다양성에서의 증가이다. 일부 실시양태에서, 다양성은 면역글로불린 중쇄에 있는 면역글로불린에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 면역글로불린 경쇄에 있는 면역글로불린에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T 세포 수용체에 있다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 중 하나에 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파 및/또는 베타의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 알파의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체(TCR) 베타의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, TCRαβ(즉, TCRα/β)의 발현에서의 증가가 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 과정(예를 들어, Gen 3 과정)은 다른 과정, 예를 들어 샘플 내의 고유한 펩타이드 CDR의 수에 기반하여 Gen 2로 지칭되는 과정과 비교하여 더 높은 클론 다양성을 나타낸다(참조, 예를 들어 도 12-14).
일부 실시양태에서, TIL의 활성화 및 고갈은 하나 이상의 마커를 검사함에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 및 고갈은 다색 유세포 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 CD3, PD-1, 2B4/CD244, CD8, CD25, BTLA, KLRG, TIM3, CD194/CCR4, CD4, TIGIT, CD183, CD69, CD95, CD127, CD103 및/또는 LAG3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG3, PD-1, TIGIT 및/또는 TIM3으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 마커의 활성화 및 고갈은 BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG3, CD103+/CD69+, CD103+/CD69-, PD-1, TIGIT 및/또는 TIM3으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 마커(활성화 및 고갈 마커 포함)를 결정하고/하거나 분석하여 T 세포 활성화, 억제 또는 기능을 조사할 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 마커는 TIGIT, CD3, FoxP3, TIM3, PD-1, CD103, CTLA-4, LAG3, BTLA-4, ICOS, Ki67, CD8, CD25, CD45, CD4 및/또는 CD59로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 초과 내지 300000pg/106 TIL 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 초과 5000pg/106 TIL 초과, 7000pg/106 TIL 초과, 9000pg/106 TIL 초과, 11000pg/106 TIL 초과, 13000pg/106 TIL 초과, 15000pg/106 TIL 초과, 17000pg/106 TIL 초과, 19000pg/106 TIL 초과, 20000pg/106 TIL 초과, 40000pg/106 TIL 초과, 60000pg/106 TIL 초과, 80000pg/106 TIL 초과, 100000pg/106 TIL 초과, 120000pg/106 TIL 초과, 140000pg/106 TIL 초과, 160000pg/106 TIL 초과, 180000pg/106 TIL 초과, 200000pg/106 TIL 초과, 220000pg/106 TIL 초과, 240000pg/106 TIL 초과, 260000pg/106 TIL 초과, 280000pg/106 TIL 초과, 300000pg/106 TIL 초과 또는 그 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 5000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 7000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 9000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 11000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 13000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 15000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 17000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 19000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 20000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 40000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 60000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 80000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 100000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 120000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 140000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 160000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 180000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 200000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 220000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 240000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 260000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 280000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 300000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 내지 300000pg/106 TIL 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 초과 5000pg/106 TIL 초과, 7000pg/106 TIL 초과, 9000pg/106 TIL 초과, 11000pg/106 TIL 초과, 13000pg/106 TIL 초과, 15000pg/106 TIL 초과, 17000pg/106 TIL 초과, 19000pg/106 TIL 초과, 20000pg/106 TIL 초과, 40000pg/106 TIL 초과, 60000pg/106 TIL 초과, 80000pg/106 TIL 초과, 100000pg/106 TIL 초과, 120000pg/106 TIL 초과, 140000pg/106 TIL 초과, 160000pg/106 TIL 초과, 180000pg/106 TIL 초과, 200000pg/106 TIL 초과, 220000pg/106 TIL 초과, 240000pg/106 TIL 초과, 260000pg/106 TIL 초과, 280000pg/106 TIL 초과, 300000pg/106 TIL 초과 또는 그 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 5000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 7000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 9000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 11000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 13000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 15000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 17000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 19000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 20000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 40000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 60000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 80000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 100000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 120000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 140000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 160000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 180000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 200000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 220000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 240000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 260000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 280000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 300000pg/106 TIL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, 1000pg/mL 초과 내지 300000pg/mL 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 1000pg/mL 초과, 2000pg/mL 초과, 3000pg/mL 초과, 4000pg/mL 초과, 5000pg/mL 초과, 6000pg/mL 초과, 7000pg/mL 초과, 8000pg/mL 초과, 9000pg/mL 초과, 10000pg/mL 초과, 20000pg/mL 초과, 30000pg/mL 초과, 40000pg/mL 초과, 50000pg/mL 초과, 60000pg/mL 초과, 70000pg/mL 초과, 80000pg/mL 초과, 90000pg/mL 초과, 100000pg/mL 초과 또는 그 이상의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 1000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 2000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 3000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 4000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 5000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 6000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 7000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 8000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 9000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 10000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 20000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 30000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 40000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 50000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 60000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 70000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 80000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 90000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 100000pg/mL 초과의 그랜자임 B를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 120000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 140000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 160000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 180000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 200000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 220000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 240000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 260000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 280000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 300000pg/mL 초과의 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d를 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 확장 방법은 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d에 제공된 TIL을 포함하여 시험관내에서 증가된 그랜자임 B 분비를 나타내는 TIL의 확장된 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 1-배 내지 50-배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 40-배, 적어도 50-배 또는 그 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 3-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 4-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 5-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 6-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 7-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 8-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 9-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 10-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 20-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 30-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 40-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TIL의 확장된 집단의 그랜자임 B 분비는 TIL의 비-확장된 집단과 비교하여 적어도 50-배 증가된다.
일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 이상 더 낮은 수준의 TNF-α(즉, TNF-알파) 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 1-배 더 낮은 수준의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 2-배 더 낮은 수준의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 3-배 더 낮은 수준의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 4-배 더 낮은 수준의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비와 비교하여 적어도 5-배 더 낮은 수준의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, 적어도 200pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α(즉, TNF-알파) 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 500pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 3000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 4000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 5000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 6000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 7000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 8000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다. 일부 실시양태에서, 적어도 9000pg/mL/5×105 세포 내지 약 10,000pg/mL/5×105 세포 이상의 TNF-α 분비가 가능한 TIL은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL이다.
일부 실시양태에서, IFN-γ 및 그랜자임 B 수준은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL의 표현형 특성을 결정하기 위해 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 수준은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL의 표현형 특성을 결정하기 위해 측정된다. 일부 실시양태에서, 그랜자임 B 및 TNF-α 수준은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL의 표현형 특성을 결정하기 위해 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ, 그랜자임 B 및 TNF-α 수준은, 예를 들어 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d 방법을 포함하는 본 발명의 확장 방법에 의해 생성된 TIL의 표현형 특성을 결정하기 위해 측정된다.
일부 실시양태에서, 표현형 특성화는 동결보존 후에 수행된다.
H. 추가적인 과정 실시양태
일부 실시양태에서, 발명은 (a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 프라이밍 1차 확장은 약 1 내지 7일 또는 약 1 내지 8일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 수에서 더 큰 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴에 의해 급속 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 급속 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 1 내지 11일 또는 약 1 내지 10일 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단인 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구(TIL)를 TIL의 치료적 집단 안으로 확장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일 또는 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 소규모 배양으로부터 제1 용기보다 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로 TIL의 제2 집단의 이전을 수행함에 의해 배양물의 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 제2 용기에서는 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단이 약 4 내지 7일 또는 약 4 내지 8일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장을 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 7일, 또는 약 4 내지 8일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일 또는 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 7일, 또는 약 4 내지 8일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3, 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 5 내지 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 발명은 (a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 프라이밍 1차 확장은 약 1 내지 8일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 수에서 더 큰 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴에 의해 급속 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 급속 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 1 내지 8일 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단인 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구(TIL)를 TIL의 치료적 집단 안으로 확장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 단계는 (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 소규모 배양으로부터 제1 용기보다 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로 TIL의 제2 집단의 이전을 수행함에 의해 배양물의 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 제2 용기에서는 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단이 약 4 내지 8일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장을 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 6일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 2 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 6일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3, 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 5일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 발명은 (a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) IL-2 및 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 프라이밍 1차 확장은 약 1 내지 7일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 수에서 더 큰 단계; (c) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 외인성 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴에 의해 급속 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 급속 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 1 내지 11일 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단인 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구(TIL)를 TIL의 치료적 집단 안으로 확장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 급속 2차 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 소규모 배양으로부터 제1 용기보다 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로 TIL의 제2 집단의 이전을 수행함에 의해 배양물의 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 제2 용기에서는 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단이 약 4 내지 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 제1 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장을 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 3 내지 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 4 내지 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (1) 약 4일의 기간 동안 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 소규모 배양에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하고, 그 다음 (2) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3, 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 TIL의 제2 집단을 이전하고 할당하는 것을 수행함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 소규모 배양으로부터 이전된 TIL의 제2 집단의 일부는 약 5일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단을 추가로 외인성 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 배양 배지와 접촉시킴에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 배양 배지에서의 APC의 수는 단계 (b)에서 배양 배지에서의 APC의 수보다 크다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 배양 배지에는 추가적인 외인성 APC가 보충되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 20:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 9:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 8:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 7:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 6:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1 내지 바로 또는 약 2:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 10:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 5:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 4:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 3:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.9:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.8:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.7:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.6:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.5:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.4:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.3:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.2:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1 내지 바로 또는 약 2.1:1의 범위로부터 선택되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 2:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수 대 단계(b)에서 추가된 APC의 수의 비율이 바로 또는 약 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1, 또는 5:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 주된 1차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108, 2×108, 2.1×108, 2.2×108, 2.3×108, 2.4×108, 2.5×108, 2.6×108, 2.7×108, 2.8×108, 2.9×108, 3×108, 3.1×108, 3.2×108, 3.3×108, 3.4×108 또는 3.5×108 APC가 되고, 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 3.5×108, 3.6×108, 3.7×108, 3.8×108, 3.9×108, 4×108, 4.1×108, 4.2×108, 4.3×108, 4.4×108, 4.5×108, 4.6×108, 4.7×108, 4.8×108, 4.9×108, 5×108, 5.1×108, 5.2×108, 5.3×108, 5.4×108, 5.5×108, 5.6×108, 5.7×108, 5.8×108, 5.9×108, 6×108, 6.1×108, 6.2×108, 6.3×108, 6.4×108, 6.5×108, 6.6×108, 6.7×108, 6.8×108, 6.9×108, 7×108, 7.1×108, 7.2×108, 7.3×108, 7.4×108, 7.5×108, 7.6×108, 7.7×108, 7.8×108, 7.9×108, 8×108, 8.1×108, 8.2×108, 8.3×108, 8.4×108, 8.5×108, 8.6×108, 8.7×108, 8.8×108, 8.9×108, 9×108, 9.1×108, 9.2×108, 9.3×108, 9.4×108, 9.5×108, 9.6×108, 9.7×108, 9.8×108, 9.9×108 또는 1×109 APC가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 주된 1차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 1×108 APC 내지 바로 또는 약 3.5×108 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 3.5×108 APC 내지 바로 또는 약 1×109 APC의 범위로부터 선택도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 주된 1차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 1.5×108 APC 내지 바로 또는 약 3×108 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 4×108 APC 내지 바로 또는 약 7.5×108 APC의 범위로부터 선택도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 주된 1차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 2×108 APC 내지 바로 또는 약 2.5×108 APC의 범위로부터 선택되고, 급속 2차 확장에서 추가된 APC의 수가 바로 또는 약 4.5×108 APC 내지 바로 또는 약 5.5×108 APC의 범위로부터 선택도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 바로 또는 약 2.5×108 APC가 주된 1차 확장에 추가되고 바로 또는 약 5×108 APC가 급속 2차 확장에 추가되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 항원-제시 세포가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 종양 단편이 복수의 별도 용기 안으로 분포되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 각각의 그 별도 용기에서 TIL의 제1 집단은 단계 (a)에서 수득되고, TIL의 제2 집단은 단계 (b)에서 수득되고, TIL의 제3 집단은 단계 (c)에서 수득되고, 단계 (c)에서 복수의 용기로부터 TIL의 치료적 집단이 조합되어 단계 (d)로부터 수확된 TIL 집단을 생성한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 종양이 복수의 별도 용기에 고르게 분포되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 적어도 2개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 2개 내지 20개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 2개 내지 15개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 2개 내지 10개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 2개 내지 5개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 복수의 별도 용기가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 별도 용기를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 프라이밍 1차 확장이 단계 (b)에서 TIL의 제1 집단에 대해 수행되는 각 용기에 대해 단계 (c)에서 급속 2차 확장이 이러한 TIL의 제1 집단으로부터 생성된 TIL의 제2 집단에 대한 동일한 용기에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각각의 별도 용기가 제1 가스-투과성 표면 영역을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 종양 단편이 단일 용기에 분포되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단일 용기가 제1 가스-투과성 표면 영역을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 추가된 APC의 수는 단계 (b)에서 추가된 APC의 수보다 더 크고, 여기서 단계 (b)에서 APC는 바로 또는 약 1개 세포층 내지 바로 또는 약 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1.5개 세포층 내지 바로 또는 약 2.5개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 2개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3개 세포층 내지 바로 또는 약 10개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 4개 세포층 내지 바로 또는 약 8개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 프라이밍 1차 확장이 제1 가스-투과성 표면 영역을 포함하는 제1 용기에서 수행되고, 단계 (c)에서 급속 2차 확장이 제2 가스-투과성 표면 영역을 포함하는 제2 용기에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제2 용기가 제1 용기보다 크도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 추가된 APC의 수는 단계 (b)에서 추가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 APC는 바로 또는 약 1개 세포층 내지 바로 또는 약 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1.5개 세포층 내지 바로 또는 약 2.5개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 2개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3개 세포층 내지 바로 또는 약 10개 세포층의 평균 두께에서 제2 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 4개 세포층 내지 바로 또는 약 8개 세포층의 평균 두께에서 제2 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 세포층의 평균 두께에서 제2 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8개 세포층의 평균 두께에서 제2 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 프라이밍 1차 확장이 제1 가스-투과성 표면 영역을 포함하는 제1 용기에서 수행되고 단계 (c)에서 급속 2차 확장은 제1 용기에서 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 추가된 APC의 수는 단계 (b)에서 추가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 APC는 바로 또는 약 1개 세포층 내지 바로 또는 약 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1.5개 세포층 내지 바로 또는 약 2.5개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 2개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC가 바로 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3개 세포층 내지 바로 또는 약 10개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 4개 세포층 내지 바로 또는 약 8개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 APC가 바로 또는 약 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8개 세포층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 영역 상에 층상화되도록 변형된 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:10의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:9의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:8의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:7의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:6의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:5의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:4의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:3의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1 내지 바로 또는 약 1:2의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.2 내지 바로 또는 약 1:8의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.3 내지 바로 또는 약 1:7의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.4 내지 바로 또는 약 1:6의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.5 내지 바로 또는 약 1:5의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.6 내지 바로 또는 약 1:4의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.7 내지 바로 또는 약 1:3.5의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.8 내지 바로 또는 약 1:3의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.9 내지 바로 또는 약 1:2.5의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:2의 범위로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 주된 1차 확장이 TIL의 제1 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 항원-제시 세포(APC)를 보충함에 의해 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 단계 (c)에서 첨가된 APC의 수는 단계 (b)에서 첨가된 APC의 수보다 크고, 여기서 단계 (b)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수 대 단계 (c)에서 층상화된 APC의 층의 평균 수의 비율은 바로 또는 약 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 또는 1:10으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단에서 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단에서 TIL의 수의 비율이 바로 또는 약 1.5:1 내지 바로 또는 약 100:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단에서 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단에서 TIL의 수의 비율이 바로 또는 약 50:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단에서 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단에서 TIL의 수의 비율이 바로 또는 약 25:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단에서 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단에서 TIL의 수의 비율이 바로 또는 약 20:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단에서 TIL의 수 대 TIL의 제1 집단에서 TIL의 수의 비율이 바로 또는 약 10:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에서 적어도 바로 또는 약 50-배 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에서 적어도 바로 또는 약 1-, 2-, 3-, 4-, 5- , 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21-, 22 -, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31-, 32-, 33-, 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 42-, 43-, 44-, 45-, 46-, 47-, 48-, 49- 또는 50-배 더 크도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 제2 기간의 개시 후 바로 또는 약 2일 또는 바로 또는 약 3일 후에, 세포 배양 배지에는 추가적인 IL-2가 보충되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 과정을 사용하여 단계 (d)에서 수확된 TIL 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (d) 후에 선택적으로 HypoThermosol을 함유하는 주입 백으로 단계 (d)로부터 수확된 TIL 집단을 이전하는 (e)의 추가적인 단계를 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 과정을 사용하여 단계 (e)에서 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 과정이 수확된 TIL 집단 대 동결보존 배지의 1:1 비율을 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 항원-제시 세포가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 PBMC가 조사되고 동종이계가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 세포 배양에 첨가된 APC의 총 수가 2.5×108이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 세포 배양에 첨가된 APC의 총 수가 5×108이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 APC가 PBMC가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 PBMC가 조사되고 동종이계가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 항원-제시 세포가 인공 항원-제시 세포가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (d)에서의 수확이 막-기반 세포 처리 시스템을 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (d)에서의 수확이 LOVO 세포 처리 시스템을 사용하여 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 5 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 10 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 15 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 20 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 25 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 30 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 35 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 40 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 45 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 50 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 단계 (b)에서 용기당 바로 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 27㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 20㎣ 내지 바로 또는 약 50㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 21㎣ 내지 바로 또는 약 30㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 22㎣ 내지 바로 또는 약 29.5㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 23㎣ 내지 바로 또는 약 29㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 24㎣ 내지 바로 또는 약 28.5㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 25㎣ 내지 바로 또는 약 28㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 26.5㎣ 내지 바로 또는 약 27.5㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각 단편이 바로 또는 약 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50㎣의 부피를 갖도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 바로 또는 약 1300㎣ 내지 바로 또는 약 1500㎣의 총 부피를 갖는 바로 또는 약 30 내지 바로 또는 약 60개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 바로 또는 약 1350㎣의 총 부피를 갖는 바로 또는 약 50개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 다중 단편이 바로 또는 약 1 그람 내지 바로 또는 약 1.5 그람의 총 질량을 갖는 바로 또는 약 50개 단편을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 세포 배양 배지가 G-용기 또는 Xuri 셀백인 용기에 제공되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 세포 배양 배지에서 IL-2 농도가 약 10,000IU/mL 내지 약 5,000IU/mL이도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기재된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 세포 배양 배지에서 IL-2 농도가 약 6,000IU/mL이도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기재된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 배지가 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 배지가 7% 내지 10% DMSO를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 제1 기간이 바로 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 제2 기간이 바로 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 제1 기간과 단계 (c)에서 제2 기간이 각각 개별적으로 바로 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 제1 기간과 단계 (c)에서 제2 기간이 각각 개별적으로 바로 또는 약 5일, 6일, 또는 7일의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 제1 기간과 단계 (c)에서 제2 기간이 각각 개별적으로 바로 또는 약 7일의 기간 내에 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 14일 내지 바로 또는 약 18일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 15일 내지 바로 또는 약 18일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 16일 내지 바로 또는 약 18일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 17일 내지 바로 또는 약 18일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 14일 내지 바로 또는 약 17일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 15일 내지 바로 또는 약 17일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 16일 내지 바로 또는 약 17일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 14일 내지 바로 또는 약 16일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 15일 내지 바로 또는 약 16일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 14일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 15일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 16일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 17일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 18일 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 14일 이하 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 15일 이하 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 16일 이하 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a) 내지 (d)가 전체로 바로 또는 약 18일 이하 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (d)에서 수확된 TIL의 치료적 집단이 TIL의 치료적으로 효과적인 복용량을 위해 충분한 TIL을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 치료적으로 효과적인 복용량을 위해 충분한 TIL의 수가 바로 또는 약 2.3×1010 내지 바로 또는 약 13.7×1010이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 TIL의 제3 집단이 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 TIL의 제3 집단이 16일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 이상의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 TIL의 제3 집단이 17일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 이상의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 TIL의 제3 집단이 18일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 내지 5-배 또는 그 이상의 인터페론-감마 생산을 제공하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c) TIL의 제3 집단으로부터 수득된 효과기 T 세포 및/또는 중추 기억 T 세포가 단계 (b) 세포의 제2 집단으로부터 수득된 효과기 T 세포 및/또는 중추 기억 T 세포에 비해 증가된 CD8 및 CD28 발현을 나타내도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서 언급된 각각의 용기가 폐쇄된 용기가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서 언급된 각각의 용기가 G-용기가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서 언급된 각각의 용기가 GREX-10이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서 언급된 각각의 용기가 GREX-100이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서 언급된 각각의 용기가 GREX-500이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법에 의해 만들어진 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 항원-제시 세포(APC) 또는 OKT3 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 항원-제시 세포(APC) 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 임의의 추가된 OKT3 없이 TIL의 1차 확장이 수행되는 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 항원-제시 세포(APC)를 첨가하지 않고 OKT3를 첨가하지 않고 TIL의 1차 확장이 수행되는 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 16일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 17일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자의 종양 조직으로부터 제조된 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공하며, 여기서 TIL의 치료적 집단은 18일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 증가된 효능, 증가된 인터페론-감마 생산 및/또는 증가된 다클론성을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 증가된 인터페론-감마 생산을 제공하는 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 증가된 다클론성을 제공하는 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 증가된 효능을 제공하는 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 16일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 17일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 18일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 16일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 17일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 18일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 16일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 17일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 치료적 집단이 18일보다 긴 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 항원-제시 세포(APC) 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 OKT3 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 APC 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 OKT3 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 2-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 APC 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 1-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 1차 확장이 임의의 추가된 OKT3 없이 수행된 과정에 의해 제조된 TIL과 비교하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있는 TIL의 치료적 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, TIL은 예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같이 또는 상기 단계 A 내지 F에 따라(또는 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8b 및/또는 도 8c)에 도시된 바와 같음) 본원에 기술된 확장 과정에 기인하여 적어도 3-배 이상의 인터페론-감마 생산을 할 수 있도록 한다.
다른 실시양태에서, 발명은 종양 단편이 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 종양 단편이 코어 생검이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 종양 단편이 미세 바늘 흡인이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 종양 단편이 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 종양 단편이 코어 바늘 생검이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 방법이 대상체로부터 종양 조직의 하나 이상의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 것을 포함하고, (ii) 방법이 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 프라이밍 1차 확장의 단계를 수행하기 이전 약 3일의 기간 동안 배양하는 단계를 수행하는 단계를 포함하고, (iii) 방법이 약 8일의 기간 동안 프라이밍 1차 확장을 수행하는 것을 포함하고, (iv) 방법이 약 11일의 기간 동안 급속 2차 확장을 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 방법의 단계는 약 22일 내에 완료된다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 방법이 대상체로부터 종양 조직의 하나 이상의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 것을 포함하고, (ii) 방법이 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 프라이밍 1차 확장의 단계를 수행하기 이전 약 3일의 기간 동안 배양하는 단계를 수행하는 단계를 포함하고, (iii) 방법이 약 8일의 기간 동안 프라이밍 1차 확장을 수행하는 것을 포함하고, (iv) 방법이 TIL의 제2 집단의 배양물을 약 5일 동안 배양하고, 배양물을 최대 5개의 하위배양물로 분할하고 약 6일 동안 하위배양물을 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 최대 5개의 하위배양물은 TIL의 제2 집단의 배양이 급속 2차 확장에서 개시되는 용기와 동일한 크기 또는 더 큰 용기에서 각각 배양된다. 전술한 실시양태 중 일부에서, TIL의 제2 집단의 배양물은 최대 5개의 하위배양물 사이에 동일하게 분배된다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 방법의 단계는 약 22일 내에 완료된다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 20개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 20개 코어 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 코어 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 코어 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 코어 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제1 TIL 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 20개 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 20개 코어 바늘 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 코어 바늘 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 코어 바늘 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 코어 바늘 생검으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 20개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 TIL의 제1 집단이 대상체로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 방법이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 코어 생검으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 것을 포함하고, (ii) 방법이 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 프라이밍 1차 확장의 단계를 수행하기 이전 약 3일의 기간 동안 배양하는 단계를 수행하는 단계를 포함하고, (iii) 방법이 약 8일의 기간 동안 TIL의 제1 집단을 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 배양 배지에서 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장 단계를 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 것을 포함하고, (iv) 방법이 약 11일의 기간 동안 IL-2, OKT-3 및 APC를 포함하는 배양 배지에서 TIL의 제2 집단을 배양함에 의해 급속 2차 확장 단계를 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 방법의 단계는 약 22일 내에 완료된다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 방법이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 코어 생검으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 것을 포함하고, (ii) 방법이 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 프라이밍 1차 확장의 단계를 수행하기 이전 약 3일의 기간 동안 배양하는 단계를 수행하는 단계를 포함하고, (iii) 방법이 약 8일의 기간 동안 TIL의 제1 집단을 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 배양 배지에서 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장 단계를 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하는 것을 포함하고, (iv) 방법이 약 5일의 기간 동안 IL-2, OKT-3 및 APC를 포함하는 배양 배지에서 TIL의 제2 집단을 배양하고, 배양물을 최대 5개의 하위배양물로 분할하고 약 6일 동안 각각의 하위배양물을 IL-2를 포함하는 배지에서 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 최대 5개의 하위배양물은 TIL의 제2 집단의 배양이 급속 2차 확장에서 개시되는 용기와 동일한 크기 또는 더 큰 용기에서 각각 배양된다. 전술한 실시양태 중 일부에서, TIL의 제2 집단의 배양물은 최대 5개의 하위배양물 사이에 동일하게 분배된다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 방법의 단계는 약 22일 내에 완료된다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 방법이 대상체로부터 종양 조직의 1 내지 약 10개 코어 생검으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 것을 포함하고, (ii) 방법이 G-Rex 100M 플라스크에서 0.5L의 CM1 배양 배지에 6000IU IL-2/mL를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 프라이밍 1차 확장의 단계를 수행하기 이전 약 3일의 기간 동안 배양하는 단계를 수행하는 것을 포함하고, (iii) 방법이 6000IU/mL IL-2, 30ng/mL OKT-3 및 약 108 배양보조 세포를 함유하는 0.5L의 CM1 배양 배지를 추가하고 약 8일의 기간 동안 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하는 것을 포함하고, (iv) 방법이 (a) TIL의 제2 집단을 3000IU/mL IL-2, 30ng/mL OKT-3 및 5×109 배양보조 세포를 갖는 5L의 CM2 배양 배지를 함유하는 G-Rex 500MCS 플라스크로 이전하고 약 5일 동안 배양하고 (b) 109 TIL을 3000IU/mL IL-2를 갖는 5L의 AIM-V 배지를 함유하는 최대 5개 G-Rex 500MCS 플라스크 각각으로 이전함에 의해 배양물을 최대 5개 하위배양물로 분할하고, 하위배양물을 약 6일 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행하는 것을 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다. 전술한 실시양태 중 일부에서, 방법의 단계는 약 22일 내에 완료된다.
다른 실시양태에서, 발명은 (a) T 세포의 제1 집단을 배양하여 성장을 가져오게 하고, T 세포의 제1 집단의 활성화를 프라이밍함에 의해 공여자로부터 수득된 T 세포의 제1 집단의 프라이밍 1차 확장을 수행하는 것; (b) 단계 (a)에서 프라이밍된 T 세포의 제1 집단의 활성화가 붕괴되기 시작한 후, T 세포의 제1 집단을 배양하여 성장을 가져오게 하고 T 세포의 제1 집단의 활성화를 증폭시킴에 의해 T 세포의 제1 집단의 급속 2차 확장을 수행하여 T 세포의 제2 집단을 얻는 것; 및 (c) T 세포의 제2 집단을 수확하는 것을 포함하는 T 세포를 확장하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 급속 2차 확장의 단계는 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 제1 용기보다 더 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로 이전을 하고, 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 용기에서 더 큰 규모 배양으로 배양함에 의해 배양물의 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할된다. 다른 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (a) 제1 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장을 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 제1 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 4 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 4 내지 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 급속 확장의 단계는 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에 약 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 5일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 2차 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 2 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 제1 용기보다 더 큰 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기로 이전을 하고, 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 약 5 내지 7일의 기간 동안 제2 용기에서 더 큰 규모 배양으로 배양함에 의해 배양물의 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 제1 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 2 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기와 크기가 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기 안으로 그리고 그 중에 제1 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장을 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 제1 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 5 내지 7일의 기간 동안 제2 소규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에 약 2 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 5 내지 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 5 내지 6일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 5일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 6일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 급속 확장의 단계가 (a) 소규모 배양에서 T 세포의 제1 집단을 제1 용기, 예를 들어 G-Rex 100MCS 용기에서 약 3 내지 4일의 기간 동안 배양함에 의해 급속 2차 확장을 수행한 다음, (b) 제1 용기보다 크기가 더 큰 2, 3 또는 4개의 제2 용기, 예를 들어 G-Rex 500MCS 용기 안으로 그리고 그 중에 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단을 이전하고 할당하는 것을 초래함에 의해 배양물의 규모 확장 및 규모 확대를 달성하기 위해 복수의 단계로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 각각의 제2 용기에서 이러한 제2 용기로 이전된 소규모 배양으로부터 T 세포의 제1 집단의 일부는 약 7일의 기간 동안 더 큰 규모 배양에서 배양된다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)의 프라이밍 1차 확장이 최대 7일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 8일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 11일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 7일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 7일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 7일 또는 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 7일 또는 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 10일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 9일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서의 프라이밍 1차 확장이 8일의 기간 동안 수행되고 단계 (b)의 급속 2차 확장이 최대 8일의 기간 동안 수행되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제1 배양 배지가 4-1BB 작동제, OKT-3 및 IL-2를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제1 배양 배지가 OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제1 배양 배지가 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 T 세포의 제1 집단이 OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 제2 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제2 배양 배지가 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 제1 가스-투과성 표면을 포함하는 용기에서의 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 제1 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)의 제1 집단을 포함하고, 여기서 APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고, APC의 제1 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 단계 (b)에서 T 세포의 제1 집단은 용기에서의 제2 배양 배지에서 배양되고, 여기서 제2 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 제1 가스-투과성 표면을 포함하는 용기에서의 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 제1 배양 배지는 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)의 제1 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 단계 (b)에서 T 세포의 제1 집단은 용기에서의 제2 배양 배지에서 배양되며, 여기서 제2 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 제1 가스-투과성 표면을 포함하는 용기에서의 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 제1 배양 배지는 OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)의 제1 집단을 포함하고, 여기서 APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 단계 (b)에서 T 세포의 제1 집단은 용기에서의 제2 배양 배지에서 배양되고, 여기서 제2 배양 배지는 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 T 세포의 제1 집단이 제1 가스-투과성 표면을 포함하는 용기에서의 제1 배양 배지에서 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공하며, 여기서 제1 배양 배지는 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 항원-제시 세포(APC)의 제1 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제1 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제1 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 단계 (b)에서 T 세포의 제1 집단은 용기에서의 제2 배양 배지에서 배양되고, 여기서 제2 배양 배지는 4-1BB 작동제, OKT-3, IL-2 및 APC의 제2 집단을 포함하며, 여기서 APC의 제2 집단은 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이고 APC의 제2 집단은 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되고, 여기서 APC의 제2 집단은 APC의 제1 집단보다 더 크다.
다른 실시양태에서, 발명은 APC의 제2 집단에서 APC의 수 대 APC의 제1 집단에서 APC의 수의 비율이 2:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다
다른 실시양태에서, 발명은 APC의 제1 집단에서 APC의 수가 약 2.5×108이고 APC의 제2 집단에서 APC의 수가 약 5×108이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 APC의 2개 층의 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 APC의 4 내지 8개 층의 범위로부터 선택된 평균 두께에서 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화된 APC의 평균 층의 수 대 단계 (a)에서 제1 가스-투과성 표면 상에 층상화된 APC의 평균 층의 수의 비율이 2:1이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 1.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 4.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 1.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 2.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 2.0×106 APC/㎠의 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 7.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 6.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 5.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠의 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 1.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 4.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되고 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 2.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 7.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 1.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되고 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 3.5×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 6.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 2.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 3.0×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되고 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠ 내지 바로 또는 약 5.5×106 APC/㎠의 범위로부터 선택된 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (a)에서 APC의 제1 집단이 바로 또는 약 2.0×106 APC/㎠의 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되고 단계 (b)에서 APC의 제2 집단이 바로 또는 약 4.0×106 APC/㎠의 밀도에서 제1 가스 투과성 표면에 접종되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 APC가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 PBMC가 방사선 조사되고 T 세포의 제1 집단의 공여자에 대해 외인성이도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포가 골수 침윤 림프구(MIL)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포가 말초 혈액 림프구(PBL)가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자의 전혈로부터 분리에 의해 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자의 혈장교환 생성물로부터 분리에 의해 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 T 세포 표현형의 양성 또는 음성 선택에 의해 공여자의 전혈 또는 혈장교환 생성물로부터 분리되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포 표현형이 CD3+ 및 CD45+가 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기재된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단의 프라이밍 1차 확장을 수행하기 전에 T 세포가 NK 세포로부터 분리되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기재된 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, T 세포는 T 세포의 제1 집단으로부터 CD3- CD56+ 세포의 제거에 의해 T 세포의 제1 집단에서의 NK 세포로부터 분리된다. 다른 실시양태에서, CD3- CD56+ 세포는 CD3- CD56+ 세포 분획을 제거하고 음성 분획을 회수하는 게이팅 전략을 사용하여 T 세포의 제1 집단을 세포 분류에 적용함에 의해 T 세포의 제1 집단으로부터 제거된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 백분율의 NK 세포를 특징으로 하는 T 세포의 제1 집단에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 백분율의 CD3- CD56+ 세포를 특징으로 하는 T 세포의 제1 집단에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 수의 NK 세포의 제시를 특징으로 하는 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 수의 CD3- CD56+ 세포를 특징으로 하는 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 수의 NK 세포의 존재를 특징으로 하는 종양을 앓고 있는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 높은 수의 CD3- CD56+ 세포의 존재를 특징으로 하는 종양을 앓고 있는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다. 다른 실시양태에서, 전술한 방법은 난소암을 앓고 있는 환자로부터 수득된 종양 조직에서 T 세포의 확장을 위해 활용된다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단으로부터 바로 또는 약 1×107 T 세포가 용기에 접종되어 그러한 용기에서 주된 1차 확장 배양을 시작하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 복수의 용기 안으로 분포되고, 각 용기에 T 세포의 제1 집단으로부터 바로 또는 약 1×107 T 세포가 접종되어 그러한 용기에서 주된 1차 확장 배양을 시작하도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 단계 (c)에서 수확된 T 세포의 제2 집단이 TIL의 치료적 집단이 되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 하나 이상의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 20개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 10개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함), 코어 생검, 코어 바늘 생검 또는 미세 바늘 흡인으로부터 수득되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 하나 이상의 코어 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 20개의 코어 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 10개의 코어 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 코어 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 코어 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 하나 이상의 미세 바늘 흡인으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 20개의 미세 바늘 흡인으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 10개의 미세 바늘 흡인으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 미세 바늘 흡인으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미세 바늘 흡인으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 하나 이상의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 20개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 10개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 소형 생검(예를 들어, 펀치 생검 포함)으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 하나 이상의 코어 바늘 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 20개의 코어 바늘 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1 내지 10개의 코어 바늘 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 코어 바늘 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 T 세포의 제1 집단이 공여자로부터 종양 조직의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 코어 바늘 생검으로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 i) 약 3일 동안 IL-2를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 종양 샘플을 배양함에 의해 대상체에서 종양의 하나 이상의 소형 생검, 코어 생검, 또는 바늘 생검으로부터 수득된 종양 샘플로부터 TIL의 제1 집단을 수득 및/또는 수용하는 단계; (ii) IL-2, OKT-3 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 TIL의 제2 집단을 생성함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 프라이밍 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 포함하는 용기에서 수행되며, 여기서 프라이밍 1차 확장은 약 7 또는 8일의 제1 기간 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 그 수에서 더 큰, 단계; (iii) TIL의 제2 집단의 제2 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 APC를 보충함에 의해 급속 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생산하는 단계로서, 여기서 급속 2차 확장에 추가된 APC의 수는 단계 (ii)에서 추가된 APC 수의 적어도 2배이며, 여기서 급속 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 11일의 제2 기간 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단이며, 여기서 급속 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 포함하는 용기에서 수행되는, 단계; (iv) 단계 (iii)에서 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계; 및 (v) 단계 (iv)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 TIL의 치료적 집단 안으로 확장시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) 약 3일 동안 IL-2를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 종양 샘플을 배양함에 의해 대상체에서 종양의 하나 이상의 소형 생검, 코어 생검 또는 바늘 생검으로부터 수득된 종양 샘플로부터 TIL의 제1 집단을 획득 및/또는 수용하는 단계; (ii) IL-2, OKT-3 및 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 프라이밍 1차 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 프라이밍 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 7 또는 8일의 제1 기간 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 그 수에서 더 큰, 단계; (iii) TIL의 제2 집단을 IL-2, OKT-3 및 APC를 포함하는 제3 세포 배양 배지와 접촉시킴에 의해 급속 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생산하는 단계로서, 여기서 급속 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위한 약 11일의 제2 기간 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단인, 단계; 및 (iv) 단계 (iii)으로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구(TIL)를 TIL의 치료적 집단 안으로 확장시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제2 기간의 5일 후에 배양이 2개 이상의 하위배양으로 분할되고, 각각의 하위배양에는 추가적인 양의 3차 배양 배지가 보충되고 약 6일 동안 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제2 기간의 5일 후에 배양이 2개 이상의 하위배양으로 분할되고, 각각의 하위배양에는 IL-2를 포함하는 제4 배양 배지가 보충되고 약 6일 동안 배양되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 제2 기간의 5일 후에 배양이 최대 5개의 하위배양으로 분할되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 방법에서의 모든 단계가 약 22일 내에 완료되도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 (i) T 세포의 제1 집단의 성장을 초래하고 활성화를 프라이밍하기 위해 T 세포의 제1 집단을 배양함에 의해 공여자에서 종양의 하나 이상의 소형 생검, 코어 생검 또는 바늘 생검으로부터 수득된 종양 샘플로부터 T 세포의 제1 집단의 프라이밍 1차 확장을 수행하는 단계; (ii) 단계 (a)에서 프라이밍된 T 세포의 제1 집단의 활성화가 붕괴되기 시작한 후, T 세포의 제2 집단을 얻기 위해 T 세포의 제1 집단을 배양하여 T 세포의 제1 집단의 성장을 초래하고 활성화를 증폭시킴에 의해 T 세포의 제1 집단의 급속 2차 확장을 수행하는 단계; 및 (iv) T 세포의 제2 집단을 수확하는 단계를 포함하는 T 세포를 확장하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 복수의 코어 생검으로부터 획득된다. 일부 실시양태에서, 복수의 코어 생검은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 코어 생검으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 발명은 T 세포 또는 TIL이 종양 분해물로부터 얻어지도록 변형된 상기 적용가능한 바와 같은 임의의 이전 단락에 기술된 방법이다. 일부 실시양태에서, 종양 분해물은 종양을 효소 배지, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10mg/mL 겐타마이신, 30U/mL DNase, 및 1.0mg/mL 콜라게나제에서 인큐베이션하고 이어서 기계적 해리(GentleMACS, Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 오번 소재)에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 종양은 이에 제한되지는 않지만, 콜라게나제(콜라게나제의 임의의 블렌드 또는 유형 포함), Accutase™, Accumax™, 히알루로니다제, 중성 프로테아제(디스파제), 키모트립신, 키모파파인, 트립신, 카제이나제, 엘라스타제, 파파인, 프로테아제 유형 XIV(프로나제), 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase), 트립신 저해제, 임의의 기타 해리 또는 단백질분해 효소, 및 이의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 해리(분해) 효소를 포함하는 종양 해리 효소 혼합물에 배치된다. 다른 실시양태에서, 종양은 콜라게나제(콜라게나제의 임의의 블렌드 또는 유형 포함), 중성 프로테아제(디스파제) 및 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase)을 포함하는 종양 해리 효소 혼합물에 배치된다.
약제학적 조성물, 복용량 및 투여 요법
실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 실시양태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액에서의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 단일 동맥-내 또는 정맥내 주입으로 투여되며, 이는 바람직하게는 대략적으로 30 내지 60분 동안 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 암이 흑색종인 경우, 약 7.8×1010 TIL의 평균으로, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010 TIL이 투여된다. 실시양태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 7.8×1010 TIL이고, 특히 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 예를 들어, 약제학적 조성물 중 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 양은 10g, 9.5g, 9.0g, 8.5g, 8.0g, 7.5g, 7.0g, 6.5g, 6.0g, 5.5g, 5.0g, 4.5g, 4.0g, 3.5g, 3.0g, 2.5g, 2.0g, 1.5g, 1.0g, 0.95g, 0.9g, 0.85g, 0.8g, 0.75g, 0.7g , 0.65g, 0.6g, 0.55g, 0.5g, 0.45g, 0.4g, 0.35g, 0.3g, 0.25g, 0.2g, 0.15g, 0.1g, 0.09g, 0.08g, 0.07g, 0.06g, 0.05g, 0.04g, 0.03g, 0.02g, 0.01g, 0.009g, 0.008g, 0.007g, 0.006g, 0.005g, 0.004g, 0.003g, 0.002g, 0.001g, 0.0009g, 0.0008g, 0 .0007g, 0.0006g, 0.0005g, 0.0004g, 0.0003g, 0.0002g 또는 0.0001g 이하이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 양은 0.0001g, 0.0002g, 0.0003g, 0.0004g, 0.0005g, 0.0006g, 0.0007g, 0.0008g, 0.0009g, 0.001g, 0.0015g, 0.002g, 0.0025g, 0.003g, 0.0035g, 0.004g, 0.0045g, 0.005g, 0.0055g, 0.006g, 0.0065g, 0.007g, 0.0075g, 0.008g, 0.0085g, 0.009g, 0.0095g, 0.01g, 0.015g, 0.02g, 0.025g, 0.03g, 0.035g, 0.04g, 0.045g, 0.05g, 0.055g, 0.06g, 0.065g, 0.07g, 0.075g, 0.08g, 0.085g, 0.09g, 0.095g, 0.1g, 0.15g, 0.2g, 0.25g, 0.3g, 0.35g, 0.4g, 0.45g, 0.5g, 0.55g, 0.6g, 0.65g, 0.7g, 0.75g, 0.8g, 0.85g, 0.9g, 0.95g, 1g, 1.5g, 2g, 2.5, 3g, 3.5, 4g, 4.5g, 5g, 5.5g, 6g, 6.5g, 7g, 7.5g, 8g, 8.5g, 9g, 9.5g 또는 10g 초과이다.
발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL은 넓은 복용량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 복용량은 투여의 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료되어 지는 대상체의 성별 및 연령, 치료되어 지는 대상체의 체중, 주치의의 선호도 및 경험에 따라 달라질 것이다. 적절한 경우 임상적으로-확립된 TIL의 복용량이 사용될 수도 있다. TIL의 복용량과 같은 본원의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 약제학적 성분의 성질 및 처방 의사의 재량에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 연간 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 한 달에 한 번, 2주에 한 번, 일주일에 한 번, 또는 이틀에 한 번일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 한 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 0.01mg/kg 내지 약 4.3mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 3.6mg/kg, 약 0.3mg/kg 내지 약 3.2mg/kg, 약 0.35mg/kg 내지 약 2.85mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 2.85mg/kg, 약 0.3mg 내지 약 2.15mg/kg, 약 0.45mg/kg 내지 약 1.7mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 1.3mg/kg, 약 0.3mg/kg 내지 약 1.15mg/kg, 약 0.45mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.55mg/kg 내지 약 0.85mg/kg, 약 0.65mg/kg 내지 약 0.8mg/kg, 약 0.7mg/kg 내지 약 0.75mg/kg, 약 0.7mg/kg 내지 약 2.15mg/kg, 약 0.85mg/kg 내지 약 2mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 1.85mg/kg, 약 1.15mg/kg 내지 약 1.7mg/kg, 약 1.3mg/kg mg 내지 약 1.6mg/kg, 약 1.35mg/kg 내지 약 1.5mg/kg, 약 2.15mg/kg 내지 약 3.6mg/kg, 약 2.3mg/kg 내지 약 3.4mg/kg, 약 2.4mg/kg 내지 약 3.3mg/kg, 약 2.6mg/kg 내지 약 3.15mg/kg, 약 2.7mg/kg 내지 약 3mg/kg, 약 2.8mg/kg 내지 약 3mg/kg, 또는 약 2.85mg/kg 내지 약 2.95mg/kg의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 1mg 내지 약 500mg, 약 10mg 내지 약 300mg, 약 20mg 내지 약 250mg, 약 25mg 내지 약 200mg, 약 1mg 내지 약 50mg, 약 5mg 내지 약 45mg, 약 10mg 내지 약 40mg, 약 15mg 내지 약 35mg, 약 20mg 내지 약 30mg, 약 23mg 내지 약 28mg, 약 50mg 내지 약 150mg, 약 60mg 내지 약 140mg, 약 70mg 내지 약 130mg, 약 80mg 내지 약 120mg, 약 90mg 내지 약 110mg, 또는 약 95mg 내지 약 105mg, 약 98mg 내지 약 102mg, 약 150mg 내지 약 250mg, 약 160mg 내지 약 240mg, 약 170mg 내지 약 230mg, 약 180mg 내지 약 220mg, 약 190mg 내지 약 210mg, 약 195mg 내지 약 205mg, 또는 약 198 내지 약 207mg의 범위 내이다.
TIL의 유효한 양은, 동맥-내 주사, 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 국소, 이식 또는 흡입에 의해, 비강내 및 경피 경로를 포함한, 유사한 유용성을 갖는 제제의 임의의 허용되는 투여의 방식에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단을 포함하는 주입 백을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 종양 침윤 림프구(TIL) 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물을 포함하는 주입 백을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단의 동결보존된 제형을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL의 치료적 집단 및 동결보존 배지를 포함하는 종양 침윤 림프구(TIL) 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 배지가 DMSO를 함유하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 동결보존 배지가 7-10% DMSO를 함유하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물의 동결보존된 제형을 제공한다.
실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 실시양태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액에서의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 단일 동맥-내 또는 정맥내 주입으로 투여되며, 이는 바람직하게는 대략적으로 30 내지 60분 동안 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.
임의의 적합한 용량의 TIL이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 암이 흑색종인 경우, 약 7.8×1010 TIL의 평균으로, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010 TIL이 투여된다. 실시양태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 7.8×1010 TIL이고, 특히 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 3×1010 내지 약 12×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 4×1010 내지 약 10×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 5×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 6×1010 내지 약 8×1010 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료적으로 유효한 복용량은 약 7×1010 내지 약 8×1010 TIL이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는, 예를 들어, 약제학적 조성물 중 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 약제학적 조성물 중 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 양은 10g, 9.5g, 9.0g, 8.5g, 8.0g, 7.5g, 7.0g, 6.5g, 6.0g, 5.5g, 5.0g, 4.5g, 4.0g, 3.5g, 3.0g, 2.5g, 2.0g, 1.5g, 1.0g, 0.95g, 0.9g, 0.85g, 0.8g, 0.75g, 0.7g, 0.65g, 0.6g, 0.55g, 0.5g, 0.45g, 0.4g, 0.35g, 0.3g, 0.25g, 0.2g, 0.15g, 0.1g, 0.09g, 0.08g, 0.07g, 0.06g, 0.05g, 0.04g, 0.03g, 0.02g, 0.01g, 0.009g, 0.008g, 0.007g, 0.006g, 0.005g, 0.004g, 0.003g, 0.002g, 0.001g, 0.0009g, 0.0008g, 0.0007g, 0.0006g, 0.0005g, 0.0004g, 0.0003g, 0.0002g, 또는 0.0001g 이하이다.
일부 실시양태에서, 발명의 약제학적 조성물에 제공되는 TIL의 양은 0.0001g, 0.0002g, 0.0003g, 0.0004g, 0.0005g, 0.0006g, 0.0007g, 0.0008g, 0.0009g, 0.001g, 0.0015g, 0.002g, 0.0025g, 0.003g, 0.0035g, 0.004g, 0.0045g, 0.005g, 0.0055g, 0.006g, 0.0065g, 0.007g, 0.0075g, 0.008g, 0.0085g, 0.009g, 0.0095g, 0.01g, 0.015g, 0.02g, 0.025g, 0.03g, 0.035g, 0.04g, 0.045g, 0.05g, 0.055g, 0.06g, 0.065g, 0.07g, 0.075g, 0.08g, 0.085g, 0.09g, 0.095g, 0.1g, 0.15g, 0.2g, 0.25g, 0.3g, 0.35g, 0.4g, 0.45g, 0.5g, 0.55g, 0.6g, 0.65g, 0.7g, 0.75g, 0.8g, 0.85g, 0.9g, 0.95g, 1g, 1.5g, 2g, 2.5, 3g, 3.5, 4g, 4.5g, 5g, 5.5g, 6g, 6.5g, 7g, 7.5g, 8g, 8.5g, 9g, 9.5g, 또는 10g 초과이다.
발명의 약학적 조성물에 제공되는 TIL은 넓은 복용량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 복용량은 투여의 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료되어 지는 대상체의 성별 및 연령, 치료되어 지는 대상체의 체중, 주치의의 선호도 및 경험에 따라 달라질 것이다. 적절한 경우 임상적으로-확립된 TIL의 복용량이 사용될 수도 있다. TIL의 복용량과 같은 본원의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 약제학적 성분의 성질 및 처방 의사의 재량에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 연간 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 한 달에 한 번, 2주에 한 번, 일주일에 한 번, 또는 이틀에 한 번일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 한 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013이다. 일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 0.01mg/kg 내지 약 4.3mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 3.6mg/kg, 약 0.3mg/kg 내지 약 3.2mg/kg, 약 0.35mg/kg 내지 약 2.85mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 2.85mg/kg, 약 0.3mg 내지 약 2.15mg/kg, 약 0.45mg/kg 내지 약 1.7mg/kg, 약 0.15mg/kg 내지 약 1.3mg/kg, 약 0.3mg/kg 내지 약 1.15mg/kg, 약 0.45mg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 0.55mg/kg 내지 약 0.85mg/kg, 약 0.65mg/kg 내지 약 0.8mg/kg, 약 0.7mg/kg 내지 약 0.75mg/kg, 약 0.7mg/kg 내지 약 2.15mg/kg, 약 0.85mg/kg 내지 약 2mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 1.85mg/kg, 약 1.15mg/kg 내지 약 1.7mg/kg, 약 1.3mg/kg mg 내지 약 1.6mg/kg, 약 1.35mg/kg 내지 약 1.5mg/kg, 약 2.15mg/kg 내지 약 3.6mg/kg, 약 2.3mg/kg 내지 약 3.4mg/kg, 약 2.4mg/kg 내지 약 3.3mg/kg, 약 2.6mg/kg 내지 약 3.15mg/kg, 약 2.7mg/kg 내지 약 3mg/kg, 약 2.8mg/kg 내지 약 3mg/kg, 또는 약 2.85mg/kg 내지 약 2.95mg/kg의 범위 내이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효한 복용량은 약 1mg 내지 약 500mg, 약 10mg 내지 약 300mg, 약 20mg 내지 약 250mg, 약 25mg 내지 약 200mg, 약 1mg 내지 약 50mg, 약 5mg 내지 약 45mg, 약 10mg 내지 약 40mg, 약 15mg 내지 약 35mg, 약 20mg 내지 약 30mg, 약 23mg 내지 약 28mg, 약 50mg 내지 약 150mg, 약 60mg 내지 약 140mg, 약 70mg 내지 약 130mg, 약 80mg 내지 약 120mg, 약 90mg 내지 약 110mg, 또는 약 95mg 내지 약 105mg, 약 98mg 내지 약 102mg, 약 150mg 내지 약 250mg, 약 160mg 내지 약 240mg, 약 170mg 내지 약 230mg, 약 180mg 내지 약 220mg, 약 190mg 내지 약 210mg, 약 195mg 내지 약 205mg, 또는 약 198 내지 약 207mg의 범위 내이다.
TIL의 유효한 양은, 동맥-내 주사, 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 국소, 이식 또는 흡입에 의해, 비강내 및 경피 경로를 포함한, 유사한 유용성을 갖는 제제의 임의의 허용되는 투여의 방식에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
I. 개선된 인공 항원 제시 세포 과정 실시양태
일부 실시양태에서, 발명은 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형, 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택된 APC를 사용하여 TIL, MIL 또는 PBL을 확장하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발명은 APC를 사용하여 TIL, MIL 또는 PBL을 확장시키는 방법을 포함하며, 여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손이다. 일부 실시양태에서, APC는 인공 APC이다. 일부 실시양태에서, APC는, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형되어 4-1BBL 또는 OX40L을 발현한다. 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 CD86, OX40L, 4-1BBL, OX-40 효능작용 항체, 4-1BB 효능작용 항체, OKT-3의 Fc 사슬에 결합할 수 있는 항체, 및/또는 ICOS-L을 발현하도록 변형되며, 이는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 10,415,015에 기술되어 있는 바와 같다. 임의의 전술한 실시양태에서, 유전적으로 변형된 aAPC는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 조사될 수 있거나 비-조사될 수 있다. 세포 표면 마커의 선별에 기반한 과정을 포함하는 전술한 Gen 2, Gen 3 및 기타 TIL 제조 과정이 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되고, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 그 수에서 적어도 10-배 더 크고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터 TIL의 제3 집단의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택됨.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 그 수에서 적어도 10-배 더 크고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터 TIL의 제3 집단의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손임.
일부 실시양태에서, 발명은 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)의 집단을 포함하며, 여기서 확장된 TIL의 집단은 다음을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 TIL의 제3 집단이다:
(a) 환자로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단이고, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
여기서 APC는 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택됨.
일부 실시양태에서, 발명은 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)의 집단을 포함하며, 여기서 확장된 TIL의 집단은 다음을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 TIL의 제3 집단이다:
(a) 환자로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료적 집단이고, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손임.
일부 실시양태에서, 발명은 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 포함하는 동결보존된 종양 침윤 림프구(TIL) 조성물을 포함하며, 여기서 동결보존된 TIL 조성물은 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되고, 여기서 TIL의 제2 집단은 TIL의 제1 집단보다 그 수에서 적어도 10-배 더 크고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계; (e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계; 및
(f) 동결보존된 TIL 조성물을 수득하기 위해 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계;
여기서 APC는 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택됨.
일부 실시양태에서, 발명은 종양 침윤 림프구(TIL)의 치료적 집단을 포함하는 동결보존된 종양 침윤 림프구(TIL) 조성물을 포함하며, 여기서 동결보존된 TIL 조성물은 다음을 포함하는 방법에 의해 생성된다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 TIL의 제2 집단은 제1 TIL 집단보다 그 수에서 적어도 10-배 더 크고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 치료적 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (e)로부터 수확된 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계; 및
(f) 동결보존된 TIL 조성물을 수득하기 위해 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계;
여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손임.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 종양 분해물 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 분해물을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수확된 제3 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터 TIL의 제3 집단의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택됨.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 대상체로부터 수득된 종양 샘플을 종양 분해물 안으로 처리함에 의해 대상체로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 분해물을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-11일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 7-11일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) 단계 (d)로부터 수득된 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수확된 제3 TIL 집단을 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (e)로부터 (f)로의 이전은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (f)로부터 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서의 주입 백으로부터 TIL의 제3 집단의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손임.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 환자로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 환자로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2, 및 선택적으로 OKT-3, 및 선택적으로 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-14일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 APC를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 4-6일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) TIL의 제3 집단을 제1 복수의 2-5개의 TIL의 하위집단으로 분할하는 단계로서, 여기서 적어도 1.0×109 TIL이 각 하위집단에 존재하고, 단계 (d)로부터 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 선택적으로 TIL의 각 하위집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 APC를 보충함에 의해 TIL의 제2 복수의 하위집단의 3차 확장을 수행하여 TIL의 제2 복수의 하위집단을 생성하는 단계로서, 여기서 3차 확장은 약 5-7일 동안 수행되고, 여기서 각 하위집단에 대한 3차 확장은 제3 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (e)로부터 단계 (f)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수득된 TIL의 제2 복수의 하위집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (f)로부터 단계 (g)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수확된 TIL의 하위집단을 하나 이상의 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (g)로부터 (h)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(i) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (h)로부터 수확된 TIL의 하위집단을 포함하는 하나 이상의 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(j) 단계 (i)에서의 하나 이상의 주입 백으로부터 수확된 TIL의 하위집단의 치료적으로 유효한 복용량을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 Raji 세포, Ramos 세포, Daudi 세포, U937 세포, Thp1 세포 및 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성된 군으로부터 선택됨.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함하는 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함한다:
(a) 환자로부터 수득된 종양 샘플을 다중 종양 단편 안으로 처리함에 의해 환자로부터 절제된 종양으로부터 TIL의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 종양 단편을 밀폐 시스템 안에 첨가하는 단계;
(c) TIL의 제2 집단을 생성하기 위해 IL-2, 및 선택적으로 OKT-3, 및 선택적으로 항원-제시 세포(APC)를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함에 의해 1차 확장을 수행하는 단계로서, 여기서 1차 확장은 제1 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 여기서 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 얻기 위해 약 3-14일 동안 수행되고, 여기서 단계 (b)로부터 단계 (c)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(d) TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 APC를 보충함에 의해 2차 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 얻기 위해 약 4-6일 동안 수행되며, 여기서 2차 확장은 제2 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (c)로부터 단계 (d)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(e) TIL의 제3 집단을 제1 복수의 2-5개의 TIL의 하위집단으로 분할하는 단계로서, 여기서 적어도 1.0×109 TIL이 각 하위집단에 존재하고, 단계 (d)로부터 (e)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(f) 선택적으로 TIL의 각 하위집단의 세포 배양 배지에 추가적인 IL-2, OKT-3 및 APC를 보충함에 의해 TIL의 제2 복수의 하위집단의 3차 확장을 수행하여 TIL의 제2 복수의 하위집단을 생성하는 단계로서, 여기서 3차 확장은 약 5-7일 동안 수행되고, 여기서 각 하위집단에 대한 3차 확장은 제3 가스-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄된 용기에서 수행되고, 단계 (e)로부터 단계 (f)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수득된 TIL의 제2 복수의 하위집단을 수확하는 단계로서, 여기서 단계 (f)로부터 단계 (g)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수확된 TIL의 하위집단을 하나 이상의 주입 백으로 이전하는 단계로서, 여기서 단계 (g)로부터 (h)로의 전환은 시스템을 개방함이 없이 발생하는, 단계;
(i) 동결보존 과정을 사용하여 단계 (h)로부터 수확된 TIL의 하위집단을 포함하는 하나 이상의 주입 백을 동결보존하는 단계; 및
(j) 단계 (i)에서의 하나 이상의 주입 백으로부터 수확된 TIL의 하위집단의 치료적으로 유효한 복용량을 대상체에게 투여하는 단계;
여기서 APC는 조사되거나 비-조사된 단핵구 계통 세포, 예컨대 U937 또는 Thp1 세포 또는 이의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손임.
VII. 환자를 치료하는 방법
치료의 방법은 초기 TIL 수집 및 TIL의 배양으로 시작된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된, Jin, 등, J. Immunother., 2012, 35(3), 283-292에 의해 당업계에 둘 모두 기술되어 있다. 치료 방법의 실시양태는 실시예를 포함하여 아래 섹션 전반에 걸쳐 기술된다.
예를 들어 상기의 단계 A 내지 F에 기술된 바와 같은 또는 상기의 단계 A 내지 F에 따른 것(또한, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 도시된 바와 같음)을 포함하여, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 확장된 TIL은 암을 앓고 있는 환자의 치료에 특별한 용도를 발견한다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Goff, 등, J. Clin. Oncol., 2016, 34(20), 2389-239뿐만 아니라 보충 내용에 기술된 바와 같음. 일부 실시양태에서, TIL은 이전에 기술된 바와 같이 전이성 흑색종의 절제된 침착물로부터 성장되었다(그 전체가 본원에 참고로 포함된, Dudley, 등, J. Immunother., 2003, 26, 332-342 참조). 신선한 종양은 멸균 조건 하에서 해부될 수 있다. 대표적인 샘플이 정식 병리학적 분석을 위해 수집될 수 있다. 2 mm3 내지 3 mm3의 단일 단편이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자당 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 20, 25 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 20, 22, 24, 26 또는 28개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 24개의 샘플이 수득된다. 샘플은 24-웰 플레이트의 개별 웰에 배치되고 고-용량 IL-2(6,000IU/mL)를 갖는 성장 배지에서 유지되고 종양의 파괴 및/또는 TIL의 증식에 대해 모니터링될 수 있다. 처리 후 잔존하는 생존가능한 세포를 갖는 임의의 종양은 본원에 기술된 바와 같이 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 단리되고 동결보존될 수 있다.
일부 실시양태에서, 성공적으로 성장한 TIL은 표현형 분석(CD3, CD4, CD8 및 CD56)을 위해 샘플링될 수 있고 가능한 경우 자가조직의 종양에 대해 테스트될 수 있다. TIL은 밤새 공동배양하여 인터페론-감마(IFN-γ) 수준 > 200pg/mL 및 2배의 배경을 생성하는 경우 반응성으로 간주될 수 있다. (Goff, 등, J. Immunother., 2010, 33, 840-847; 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 자가조직의 반응성 또는 충분한 성장 패턴의 증거를 갖는 배양물이 때로는 급속 확장(REP)으로 지칭되는 2차 확장을 포함한, 2차 확장(예를 들어, 도 1 및/또는 도 8의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은 2차 확장)을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 자가조직의 반응성(예를 들어, 2차 확장 동안 높은 증식)을 갖는 확장된 TIL은 추가적인 2차 확장을 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 높은 자가조직의 반응성(예를 들어, 도 1 및/또는 도 8의 단계 D에 제공된 바와 같은 2차 확장 동안 높은 증식)을 갖는 TIL은 도 1 및/또는 도 8의 단계 D에 따른 추가적인 2차 확장을 위해 선택된다.
주입 백 TIL의 동결보존된 샘플의 세포 표현형은 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CCR7 및 CD45RA(BD BioSciences)에 대한 유세포 분석(예를 들어, FlowJo)뿐만 아니라 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 분석될 수 있다. 혈청 사이토카인은 표준 효소-결합 면역흡착 검정 기술을 사용함에 의해 측정되었다. 혈청 IFN-g에서의 상승은 >100pg/mL 및 4 3 기준선 수준 초과로 정의되었다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 예시된 방법에 의해 생산된 TIL은 TIL의 임상적 효능에 놀라운 개선을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 예시된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 기술된 것 이외의 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 임상적 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것 이외의 방법은 과정 1C 및/또는 1 세대(Gen 1)로 지칭되는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 효능은 DCR, ORR 및/또는 기타 임상적 반응에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1에 예시된 방법에 의해 생성된 TIL은, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 예시된 것 이외의 방법, 예를 들어, Gen 1 과정을 포함하여, 본원에 기술된 것 이외의 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 반응에 대한 유사한 시간 및 안전성 프로필을 나타낸다.
일부 실시양태에서, IFN-감마(IFN-γ)는 치료 효능 및/또는 증가된 임상적 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 IFN-γ는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효력 검정이 이용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 가능성의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액, 혈청 또는 생체외 TIL에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, IFN-γ에서의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서의 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 3-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 4-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 5-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈청으로부터의 TIL에서 측정된다.
일부 실시양태에서, IFN-감마(IFN-γ)는 치료 효능 및/또는 증가된 임상적 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 IFN-γ는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효력 검정이 이용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 가능성의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액, 혈청 또는 기타 조직에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, IFN-γ에서의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서의 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 이상 IFN-γ 증가된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 도 1 및/또는 도 8에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어 과정 1C 방법으로 지칭되는 방법을 포함하여, 도 1 및/또는 도 8에 예시되지 않은 것을 포함하여 다른 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상당하게 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 치료 효능 및/또는 증가된 임상적 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 T 세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 다클론성에서 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나 예를 들어, 도 1 및/또는 도 8에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여, 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
효능의 측정은 당업계에 공지되어 있을뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 질환 제어율(DCR)뿐만 아니라 전반적인 반응율(ORR)을 포함할 수 있다.
1. 암 및 기타 질환을 치료하는 방법
본원에 기술된 조성물 및 방법은 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 이것은 과다증식성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 이것은 또한 본원서 및 다음 단락에 기술된 바와 같은 다른 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 육종, 췌장암, 간암, 교모세포종, 신경교종, 위장관암, 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 인유두종 바이러스로 인한 암, 두경부암(두경부 편평세포암종(HNSCC) 포함), 신장암, 전립선암, 및 신장세포암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 외투세포 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 항문암, 방광암, 유방암(삼중-음성 유방암 포함), 골암, 인간 유두종 바이러스(HPV)로 인한 암, 중추신경계 연관된 암(뇌실막세포종, 수모세포종, 신경모세포종, 송과체아세포종, 및 원시 신경외배엽 종양 포함), 자궁경부암(편평세포 자궁경부암, 선편평형 자궁경부암, 및 자궁경부 선암종 포함), 대장암, 직장암, 자궁내막암, 식도암, 식도위접합부암, 위암, 위장암, 위장 간질 종양, 교모세포종, 신경교종, 두경부암(두경부 편평 세포 암종(HNSCC), 하인두암, 후두암, 비인두암, 구인두암, 및 인두암 포함), 신장암, 간암, 폐암(비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암 포함), 흑색종(포도막 흑색종, 맥락막 흑색종, 모양체 흑색종 또는 홍채 흑색종 포함), 중피종(악성 흉막 중피종 포함), 난소암, 췌장암(췌장관 선암종 포함), 음경암, 직장암, 신장암, 신세포암종, 육종(유잉 육종, 골육종, 횡문근육종 및 기타 뼈 및 연조직 육종 포함), 갑상선암(역형성 갑상선암 포함), 자궁암, 및 질암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종 병기 IIB 내지 IV이다.
일부 실시양태에서, 발명은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며 여기서 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인유두종 바이러스로 인한 암, 두경부암(두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 포함), 교모세포종(GBM 포함), 위장암, 신장암 또는 신장 세포 암종이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 흑색종, HNSCC, 자궁경부암, NSCLC, 교모세포종(GBM 포함) 및 위장암이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 흑색종이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 HNSCC이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 자궁경부암이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 NSCLC이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 교모세포종(GBM 포함)이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 위장암이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 과돌연변이된 암이다.
다른 실시양태에서, 발명은 본원에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 암은 소아 과돌연변이암이다.
일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액학적 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종, 외투세포 림프종 및 다발성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 혈액학적 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 CCR을 발현하도록 변형된 TIL, MIL 또는 PBL을 사용하여 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 혈액학적 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 CCR을 발현하도록 변형된 MIL 또는 PBL을 사용하여 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 혈액학적 악성종양이다.
일부 실시양태에서, 암은 과돌연변이된 암 또는 과돌연변이된 암 표현형이다. 과돌연변이된 암은, 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된, Campbell, 등, Cell 2017, 171, 1042-1056에 광범위하게 기술되어 있다). 일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 9 내지 10개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소아 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 9.91개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성인 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 9개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 10 내지 100개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 소아 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 10 내지 100개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 성인 과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 10 내지 100개 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 초-과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 100개 초과 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소아 초-과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 100개 초과 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성인 초-과돌연변이된 종양은 메가베이스(Mb)당 100개 초과 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 복제 복구 경로에 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 복제 복구 연관된 DNA 중합효소에 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 현미부수체 불안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 초-과돌연변이된 종양은 복제 복구 연관된 DNA 중합효소에 돌연변이를 갖고 현미부수체 불안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양에서의 과돌연변이는 면역 체크포인트 저해제에 대한 반응과 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 면역 체크포인트 저해제로의 치료에 대해 내성이다. 일부 실시양태에서, 과돌연변이된 종양은 본 발명의 TIL을 사용하여 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양에서의 과돌연변이는 환경 요인(외인성 노출)에 의해 야기된다. 예를 들어, UV 광은 악성 흑색종에서 많은 수의 돌연변이의 주요 원인이 될 수 있다(예를 들어, Pfeifer, 등 Mutat. Res. 2005, 571, 19-31; Sage, Photochem. Photobiol. 1993, 57, 163-174 참조). 일부 실시양태에서, 종양에서의 과돌연변이는 직접적인 돌연변이유발원 노출에 기인하여 폐 및 후두의 종양뿐만 아니라 다른 종양에 대한 담배 연기 내 60개 초과의 발암물질에 의해 야기될 수 있다(예를 들어, Pleasance, 등, Nature 2010, 463, 184-190 참조). 일부 실시양태에서, 종양에서 과돌연변이는 아포지단백질 B mRNA 편집 효소인, 촉매적 폴리펩타이드-유사(APOBEC) 계열 구성원의 조절장애에 의해 야기되며, 이는 광범위한 암에서 C에서 T로 전환의 증가된 수준을 초래하는 것으로 나타났다(예를 들어, Roberts, 등, Nat. Genet. 2013, 45, 970-976 참조). 일부 실시양태에서, 종양에서의 과돌연변이는 주요 복제 효소 Pol3 및 Pold1에 의해 수행되는 교정을 손상시키는 돌연변이에 의한 결함있는 DNA 복제 복구에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 종양에서 과돌연변이는 결장직장암, 자궁내막암 및 기타 암에서의 과돌연변이와 연관된 DNA 미스매치 복구에서 결함에 의해 야기된다(예를 들어, Kandoth, 등, Nature 2013, 497, 67-73.; Muzny, 등, Nature 2012, 487, 330-337 참조). 일부 실시양태에서, DNA 복제 복구 돌연변이는 구성적 또는 이중대립유전자 미스매치 복구 결핍(CMMRD), 린치 증후군 및 중합효소 교정-연관된 용종증(PPAP)과 같은 암 소인 증후군에서도 발견된다.
실시양태에서, 발명은 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 과돌연변이된 암이다. 실시양태에서, 발명은 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 증강된 과돌연변이된 암이다. 실시양태에서, 발명은 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 암은 초-과돌연변이된 암이다.
실시양태에서, 발명은 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 이전에 비-골수파괴 화학요법으로 사전-치료된다. 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d 및 5일(TIL 주입 이전 27일차 내지 23일차) 동안 플루다라빈 25mg/m2/d이다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d 및 3일(TIL 주입 이전 27일차 내지 25일차) 동안 플루다라빈 25mg/m2/d이다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d, 이어서 3일 동안(TIL 주입 이전 25일차 내지 23일차) 플루다라빈 25mg/m2/d이다. 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 비-골수파괴 화학요법 및 TIL 주입(0일차에) 후, 환자는 생리적 내성에 대해 매 8시간마다 720,000IU/kg에서 IL-2의 주입을 정맥내로 받는다.
표시된 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는데 있어서 본원에 기술된 화합물 및 화합물의 조합의 효능은 인간 질환의 치료에 대한 지침을 제공하는 당업계에 공지된 다양한 모델을 사용하여 테스트될 수 있다. 예를 들어, 난소암 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 예를 들어 Mullany, 등, Endocrinology 2012, 153, 1585-92; 및 Fong, 등, J. Ovarian Res. 2009, 2, 12에 기술되어 있다. 췌장암 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 Herreros-Villanueva, 등, World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294에 기술되어 있다. 유방암에 대한 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 예를 들어 Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212에 기술되어 있다. 흑색종에 대한 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 예를 들어 Damsky, 등, Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859에 기술되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 예를 들어 Meuwissen, 등, Genes & Development, 2005, 19, 643-664에 기술되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 결정하기 위한 모델은 예를 들어 Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; 및 Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, IFN-감마(IFN-γ)는 과증식성 장애 치료에 대한 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 IFN-γ는 활성 TIL을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효능 검정이 이용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 가능성의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 기술된 것을 포함하여, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 예시된 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)과 같이 그리고 본 출원 전반에 걸쳐, Gen 3 과정으로 지칭되는 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 대상체와 비교하여 본 방법의 TIL로 치료된 대상체의 혈액에서 증가된 IFN-γ를 제공한다. 일부 실시양태에서, IFN-γ에서 증가는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료된 환자에서의 치료 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배, 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 3-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 4-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 5-배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 Quantikine ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자로부터 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서의 혈액에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL로 치료된 환자에서의 혈청에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 기술된 것을 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은, 예를 들어 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 예시되지 않은 것을 포함한 다른 방법, 예컨대 예를 들어 과정 1C 방법으로 지칭되는 방법에 의해 생성된 TIL과 비교하여 증가된 다클론성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상당하게 개선된 다클론성 및/또는 증가된 다클론성은 암 치료에 대한 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 T 세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 다클론성에서의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생성된 TIL의 투여에 관한 치료 효능을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 다클론성은, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1-배, 2-배, 10-배, 100-배, 500-배, 또는 1000-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 2-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 10-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 100-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 500-배 증가된다. 일부 실시양태에서, 다클론성은 치료되지 않은 환자와 비교하고/하거나, 예를 들어, 도 8(특히, 예를 들어, 도 8a 및/또는 도 8b 및/또는 도 8c 및/또는 도 8d)에 구현된 것 이외의 방법을 포함하여 본원에 제공된 것 이외의 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료된 환자와 비교하여 1000-배 증가된다.
2. PD-1 및 PD-L1 저해제와의 조합
일부 실시양태에서, 암을 않고 있는 환자에게 제공된 TIL 요법은 TIL 단독의 치료적 집단으로의 치료를 포함할 수 있거나, TIL과 하나 이상의 PD-1 및/또는 PD-L1 저해제를 포함하는 조합 치료를 포함할 수 있다. 예를 들어, PD-1을 표적화하고 본 발명의 TIL과 공동-투여될 수 있는 항체는 예를 들어 니볼루맙(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), 펨브롤리주맙(람브롤리주맙, MK03475 또는 MK-3475, Merck; Keytruda®), 인간화된 항PD-1 항체 JS001(ShangHai JunShi), 단클론성 항-PD-1 항체 TSR-042(Tesaro, Inc.), 피딜리주맙(항PD-1 mAb CT-011, Medivation), 항-PD-1 단클론성 항체 BGB-A317(BeiGene) 및/또는 항-PD-1 항체 SHR-1210(ShangHai HengRui), 인간 단클론성 항체 REGN2810(Regeneron), 인간 단클론성 항체 MDX-1106(Bristol-Myers Squibb) 및/또는 인간화된 항-PD-1 IgG4 항체 PDR001(Novartis)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 클론: RMP1-14(랫트 IgG) - BioXcell 카탈로그# BP0146으로부터 유래된다. 본원에 기재된 바와 같이 단계 A 내지 F에 따라 생성된 TIL과의 공동-투여 방법에 사용하기에 적합한 다른 적합한 항체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 8,008,449에 개시된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1과 그의 상호작용을 억제함에 의해 면역 활성을 증가시킨다. PD-L1에 결합하고 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 파괴하고 항-종양 면역 반응을 자극하는 당업계에 공지된 임의의 항체는 본원에 기술된 바와 같이 단계 A 내지 F에 따라 생성된 TIL과의 공동-투여 방법에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, PD-L1을 표적화하고 임상 시험 중인 항체는 BMS-936559(Bristol-Myers Squibb) 및 MPDL3280A(Genentech)를 포함한다. PD-L1을 표적화하는 다른 적합한 항체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 7,943,743에 개시되어 있다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고, PD-1/PD-L1 상호작용을 파괴하고, 항-종양 면역 반응을 자극하는 임의의 항체가 본원에 기술된 단계 A 내지 F에 따라 생성된 TIL과 공동-투여 방법에 사용하기에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 단계 A 내지 F에 따라 생산된 TIL의 조합이 투여된 대상체는 환자가 항-PD-1 항체 단독의 투여에 대해 난치성인 암 유형을 가질 때 항-PD-1 항체와 공동 투여된다. 일부 실시양태에서, 환자가 난치성 흑색종을 가질 때, 환자는 항-PD-1과 조합하여 TIL이 투여된다.
프로그램된 사멸 1(PD-1)은 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) T 세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포에 의해 발현되는 288-아미노산 막관통 면역체크포인트 수용체 단백질이다. CD279라고도 알려진 PD-1은 CD28 계열에 속하고, 인간에서는 염색체 2 상의 Pdcd1 유전자에 의해 인코딩된다. PD-1은 하나의 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 도메인, 막관통 영역, 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)와 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프(ITSM)를 함유하는 세포내 도메인으로 구성된다. PD-1 및 이의 리간드(PD-L1 및 PD-L2)는 Keir, 등, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 677-704에 기술된 바와 같이 면역 내성에서 핵심 역활을 수행하는 것으로 알려져 있다. PD-1은 T 세포 면역 반응을 부정적으로 조절하는 억제성 신호를 제공한다. PD-L1(B7-H1 또는 CD274로도 알려짐) 및 PD-L2(B7-DC 또는 CD273으로도 알려짐)는 종양 세포 및 간질 세포 상에서 발현되며, 이는 PD-1을 발현하는 활성화된 T 세포에 의해 조우될 수 있어 T 세포의 면역억제를 유도한다. PD-L1은 인간 염색체 9 상의 Cd274 유전자에 의해 인코딩된 290개 아미노산 막관통 단백질이다. PD-1 저해제, PD-L1 저해제 및/또는 PD-L2 저해제의 사용에 의해 PD-1과 그 리간드인 PD-L1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 차단하는 것은 Topalian, 등, N. Eng. J. Med. 2012, 366, 2443-54에 기술된 것과 같이 최근 임상 연구에서 입증된 바와 같이 면역 내성을 극복할 수 있다. PD-L1은 많은 종양 세포주에서 발현되는 반면, PD-L2는 대부분 수지상 세포와 소수의 종양주에서 발현된다. T 세포(활성화 후 PD-1을 유도적으로 발현함)에 부가하여, PD-1은 B 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포에서도 발현된다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 당업계에 공지된 임의의 PD-1 저해제 또는 PD-1 차단제일 수 있다. 특히 그것은 다음 단락에서 더 자세히 기술되는 PD-1 저해제 또는 차단제 중 하나이다. 용어 "저해제", "항작동제" 및 "차단제"는 PD-1 저해제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인 PD-1 저해제에 대한 본원에서의 언급은 화합물 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, PD-1 저해제에 대한 본원에서의 언급은 또한 소분자 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, PD-1 저해제는 항체(즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함한 이의 단편, 또는 이의 단일-사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서 PD-1 저해제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 저해제는 단클론성 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 약 100pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 90pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 80pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 70pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 60pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 50pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 40pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 30pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 20pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 약 10pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고, 또는 약 1pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 약 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 8.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 9.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하고, 또는 약 1×106 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 약 2×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.1×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.7×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.8×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.9×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 또는 약 3×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 약 10nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 9nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 8nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 7nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 6nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 5nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 4nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 3nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 약 2nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고, 또는 약 1nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하는 것이다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb Co.로부터 OPDIVO로 상업적으로 이용가능함), 또는 이의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 니볼루맙은 PD-1 수용체를 차단하는 완전하게 인간 IgG4 항체이다. 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 면역글로불린 G4 카파, 항-(인간 CD274) 항체이다. 니볼루맙은 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호 946414-94-4로 지정되어 있고 5C4, BMS-936558, MDX-1106 및 ONO-4538로도 알려져 있다. 니볼루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,008,449호 및 국제 특허 공개 번호 WO 2006/121168에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 다양한 형태의 암에서 니볼루맙의 임상적 안전성 및 효능은 Wang, 등, Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 846-56; Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; 및 Weber, 등, J. Clin. Oncology, 2013, 31, 4311-4318에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 니볼루맙의 아미노산 서열은 표 18에 제시되어 있다. 니볼루맙은 22-96,140-196, 254-314, 360-418, 22''-96'', 140''-196'', 254''-314'', 및 360''-418''에서 중쇄-내 이황화 연결; 23'-88', 134'-194', 23'''-88''', 및 134'''-194'''에서 경쇄-내 이황화 연결; 127-214', 127''-214'''에서 중쇄-경쇄-간 이황화 연결, 219-219'' 및 222-222''에서 중쇄-중쇄-간 이황화 연결; 및 290, 290''에서 N-글리코실화 부위(H CH2 84.4)를 갖는다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 158에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호: 159에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-1 저해제는 각각 서열번호: 158 및 서열번호: 159에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사실 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 158 및 서열번호: 159에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 158 및 서열번호: 159에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 158 및 서열번호: 159에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 158 및 서열번호: 159에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 463 및 서열번호: 159에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 160에 도시된 서열을 포함하고, PD-1 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 161에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 160 및 서열번호: 161에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 160 및 서열번호: 161에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 160 및 서열번호: 161에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 160 및 서열번호: 161에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 160 및 서열번호: 161에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 각각 서열번호: 162, 서열번호: 163, 및 서열번호: 164에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 165, 서열번호: 166, 및 서열번호: 167에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 PD-1 상의 동일한 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 니볼루맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-1 항체이며, 여기서 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 니볼루맙이다. 항-PD-1 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국에 의해 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 니볼루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 니볼루맙이다.
표 18. 니볼루맙과 관련된 PD-1 저해제에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 1.5mg/kg, 약 2mg/kg, 약 2.5mg/kg, 약 3mg/kg, 약 3.5mg/kg, 약 4mg/kg, 약 4.5mg/kg, 약 5mg/kg, 약 5.5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 6.5mg/kg, 약 7mg/kg, 약 7.5mg/kg, 약 8mg/kg, 약 8.5mg/kg, 약 9mg/kg, 약 9.5mg/kg, 또는 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 약 200mg 내지 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 약 200mg, 약 220mg, 약 240mg, 약 260mg, 약 280mg, 약 300mg, 약 320mg, 약 340mg, 약 360mg, 약 380mg, 약 400mg, 약 420mg, 약 440mg, 약 460mg, 약 480mg, 또는 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 또는 6주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 투여되고, 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 투여되고, 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 투여되고 4회 용량으로 3주마다 동일한 날에 약 1mg/kg으로 투여되고 이어서 이필리무맙 3mg/kg이 투여된 다음, 2주마다 240mg 또는 4주마다 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 흑색종의 보조 치료를 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 흑색종의 보조 치료를 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 흑색종의 보조 치료를 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 6주마다 약 1mg/kg에서의 이필리무맙과 함께 2주마다 약 3mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 매 6주마다 이필리무맙 1mg/kg 및 백금-이중 화학요법의 2주기로 3주마다 약 360mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg 또는 4주마다 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 소세포폐암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 소세포폐암을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 악성 흉막 중피종을 치료하기 위해 6주마다 이필리무맙 1mg/kg과 3주마다 약 360mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 매 3주마다 같은 날에 약 3mg/kg으로 투여되고 이어서 약 1mg/kg으로 이필리무맙이 투여된 다음, 2주마다 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 매 3주마다 같은 날에 약 3mg/kg으로 투여되고 이어서 약 1mg/kg으로 이필리무맙이 투여된 다음, 2주마다 240mg 4회마다 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 고전적 호지킨 림프종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 고전적 호지킨 림프종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 고전적 호지킨 림프종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 두경부의 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 두경부의 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 두경부의 재발성 또는 전이성 편평 세포 암종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 국소 진행성 또는 전이성 요로상피 암종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 국소 진행성 또는 전이성 요로상피 암종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 성인 및 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 ≥40kg인 성인 및 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 ≥40kg인 성인 및 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 <40kg인 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 2주마다 약 3mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 ≥40kg인 성인 및 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다 같은 날에 약 3mg/kg으로 투여되고 이어서 이필리무맙 1mg/kg이 투여된 다음, 2주마다 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 ≥40kg인 성인 및 소아 환자에서 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다 같은 날에 약 3mg/kg으로 투여되고 이어서 이필리무맙 1mg/kg이 투여된 다음, 4주마다 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다 같은 날에 약 1mg/kg으로 투여되고 이어서 이필리무맙 3mg/kg이 투여된 다음, 2주마다 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다 같은 날에 약 1mg/kg으로 투여되고 이어서 이필리무맙 3mg/kg이 투여된 다음, 4주마다 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 니볼루맙은 식도 편평 세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 식도 편평 세포 암종을 치료하기 위해 2주마다 약 240mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 식도 편평 세포 암종을 치료하기 위해 4주마다 약 480mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 니볼루맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙(미국 뉴저지주 케닐워스 소재의 Merck & Co., Inc.로부터 KEYTRUDA로 상업적으로 이용가능함), 또는 이의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체를 포함한다. 펨브롤리주맙은 CAS 등록 번호 1374853-91-4로 지정되어 있고 람브롤리주맙, MK-3475 및 SCH-900475로도 알려져 있다. 펨브롤리주맙은 면역글로불린 G4, 항-(인간 단백질 PDCD1(프로그램된 세포 사멸 1))(인간-뮤스 뮤스큘러스 단클론성 중쇄), 인간-뮤스 뮤스큘러스 단클론성 경쇄를 갖는 이황화물, 이량체 구조를 가지고 있다. 펨브롤리주맙의 구조는 또한 면역글로불린 G4, 항-(인간 프로그램된 세포 사멸 1); 인간화된 마우스 단클론성 [228-L-프롤린(H10-S>P)]γ4 중쇄(134-218')-인간화 마우스 단클론성 κ 경쇄 이량체(226-226'':229-229'')를 갖는 이황화물-비스디설파이드로 기술될 수 있다. 펨브롤리주맙의 특성, 용도 및 제조는 국제 특허 공개 번호 WO 2008/156712 A1, 미국 특허 번호 8,354,509 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/0266617 A1, US 2013/0108651 A1 및 US 2013/0109843 A2에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 다양한 형태의 암에서 펨브롤리주맙의 임상적 안전성과 효능은 Fuerst, Oncology Times, 2014, 36, 35-36; Robert, 등, Lancet, 2014, 384, 1109-17; 및 Thomas, 등, Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14, 1061-1064에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙의 아미노산 서열은 표 19에 제시되어 있다. 펨브롤리주맙은 다음 이황화 가교: 22-96, 22''-96'', 23'-92', 23'''-92''', 134-218', 134''-218''', 138'-198', 138'''-198''', 147-203, 147''-203'', 226-226'', 229-229'', 261-321, 261''-321'', 367-425, 및 367''-425'', 및 다음 글리코실화 부위(N): Asn-297 및 Asn-297''을 포함한다. 펨브롤리주맙은 Fc 영역에 안정화 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4/카파 이소타입이다; IgG4 힌지 영역에 이 돌연변이의 삽입은 IgG4 항체에 대해 전형적으로 관찰되는 절반 분자의 형성을 방지한다. 펨브롤리주맙은 각 중쇄의 Fc 도메인 내의 Asn297에서 이질적으로 글리코실화되어, 온전한 항체의 경우 대략적으로 149kDa의 분자량을 생성한다. 펨브롤리주맙의 현저한 글리코형은 푸코실화된 아갈락토 디안테나리 글리칸 형태(G0F)이다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168에 의해 주어진 중쇄 및 서열번호: 169에 의해 주어진 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 각각 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 168 및 서열번호: 169에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 170에 도시된 서열을 포함하고, PD-1 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 171에 도시된 서열 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 170 및 서열번호: 171에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 170 및 서열번호: 171에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 170 및 서열번호: 171에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 170 및 서열번호: 171에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 서열번호: 170 및 서열번호: 171에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 각각 서열번호: 172, 서열번호: 173, 및 서열번호: 174에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 175, 서열번호: 176, 및 서열번호: 177에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 PD-1 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-PD-1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-1 항체이며, 여기서 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 펨브롤리주맙이다. 항-PD-1 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합의 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 펨브롤리주맙이다.
표 19. 펨브롤리주맙과 관련된 PD-1 저해제에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 펨브롤리주맙은 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 펨브롤리주맙은 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 1.5mg/kg, 약 2mg/kg, 약 2.5mg/kg, 약 3mg/kg, 약 3.5mg/kg, 약 4mg/kg, 약 4.5mg/kg, 약 5mg/kg, 약 5.5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 6.5mg/kg, 약 7mg/kg, 약 7.5mg/kg, 약 8mg/kg, 약 8.5mg/kg, 약 9mg/kg, 약 9.5mg/kg, 또는 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 여기서 펨브롤리주맙은 약 200mg 내지 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 니볼루맙은 약 200mg, 약 220mg, 약 240mg, 약 260mg, 약 280mg, 약 300mg, 약 320mg, 약 340mg, 약 360mg, 약 380mg, 약 400mg, 약 420mg, 약 440mg, 약 460mg, 약 480mg, 또는 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 여기서 펨브롤리주맙은 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 또는 6주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 흑색종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 흑색종을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 흑색종을 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 NSCLC를 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 NSCLC를 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 NSCLC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 소세포폐암(SCLC)을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 SCLC를 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 SCLC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 두경부 편평 세포암(HNSCC)을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 HNSCC를 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 HNSCC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 고전적 호지킨 림프종(cHL) 또는 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(PMBCL)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 고전적 호지킨 림프종(cHL) 또는 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(PMBCL)을 치료하기 위해 성인의 경우 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 고전적 호지킨 림프종(cHL) 또는 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(PMBCL)을 치료하기 위해 소아의 경우 3주마다 약 2mg/kg(최대 200mg)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 요로상피 암종을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 요로상피 암종을 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 암을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 MSI-H 또는 dMMR 암을 치료하기 위해 성인의 경우 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 MSI-H 또는 dMMR 암을 치료하기 위해 소아의 경우 3주마다 약 2mg/kg(최대 200mg)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍 결장암(dMMR CRC)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 MSI-H 또는 dMMR CRC를 치료하기 위해 매 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 위암을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 위암을 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 식도암을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 식도암을 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 자궁경부암을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 자궁경부암을 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 간세포 암종(HCC)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 HCC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 메르켈 세포 암종(MCC)을 치료하기 위해 성인의 경우 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 MCC를 치료하기 위해 성인의 경우 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 MCC를 치료하기 위해 소아의 경우 3주마다 약 2mg/kg(최대 200mg)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 신세포 암종(RCC)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 RCC를 치료하기 위해 매일 2회 경구로 악시티닙 5mg과 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 자궁내막 암종을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 자궁내막 암종을 치료하기 위해 MSI-H 또는 dMMR이 아닌 종양에 대해 매일 1회 경구로 렌바티닙 20mg과 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 종양 돌연변이의 부담-높은(TMB-H) 암을 치료하기 위해 성인의 경우 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 TMB-H 암을 치료하기 위해 성인의 경우 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 TMB-H 암을 치료하기 위해 소아의 경우 3주마다 약 2mg/kg(최대 200mg)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 피부 편평 세포 암종(cSCC)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 cSCC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 삼중-음성 유방암(TNBC)을 치료하기 위해 3주마다 약 200mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 TNBC를 치료하기 위해 6주마다 약 400mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
실시양태에서, 환자 또는 대상체가 성인인 경우, 즉 성인 징후의 치료 및 6주마다 400mg의 추가 복용량 요법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 3, 4 또는 5일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙 투여는 IL-2 투여 후 1, 2, 또는 3일에 시작된다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 또한 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 전) 1, 2, 또는 3주에 투여될 수 있다.
실시양태에서, PD-1 저해제 또는 항-PD-1 항체는 Regeneron, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 세미플리맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러이다. 실시양태에서, PD-1 저해제 또는 항-PD-1 항체는 Novartis AG 및 Beigene Co., Ltd.로부터 이용가능한 티슬레리주맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러이다. 실시양태에서, PD-1 저해제 또는 항-PD-1 항체는 Eli Lilly and Co.로부터 이용가능한 신틸리맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러이다. 실시양태에서, PD-1 저해제 또는 항-PD-1 항체는 Junshi Biosciences Co., Ltd. 및 Coherus BioSciences, Inc.로부터 이용가능한 토리팔리맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러이다. 실시양태에서, PD-1 저해제 또는 항-PD-1 항체는 GlaxoSmithKline plc로부터 이용가능한 도스타리맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 이의 바이오시밀러이다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 상업적으로-이용가능한 항-PD-1 단클론성 항체, 예컨대 항-m-PD-1 클론 J43(Cat # BE0033-2) 및 RMP1-14(Cat # BE0146) (Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔주 웨스트레바논 소재)이다. 다수의 상업적으로-이용가능한 항-PD-1 항체가 당업자에게 공지되어 있다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 미국 특허 번호 8,354,509 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0266617 A1, 2013/0108651 A1, 2013/0109843 A2에 개시된 항체이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 미국 특허 번호 8,287,856, 8,580,247, 및 8,168,757 및 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0028857 A1, 2010/0285013 A1, 2013/0022600 A1, 및 2011/0008369 A1에 개시된 항-PD-1 항체이며, 이의 교시는 참고로 본원에 포함된다. 다른 실시양태에서, PD-1 저해제는 미국 특허 번호 8,735,553 B1에 개시된 항-PD-1 항체이며, 이의 개시내용은 참고로 본원에 포함된다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 CT-011로도 공지되어 있는 피딜리주맙이며, 이는 미국 특허 번호 8,686,119에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, PD-1 저해제는 소분자 또는 펩타이드, 또는 펩타이드 유도체, 예컨대 미국 특허 번호 8,907,053; 9,096,642; 및 9,044,442 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0087581에 기술된 것; 1,2,4-옥사디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0073024에 기술된 것; 고리형 펩타이드모방체 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0073042에 기술된 것; 고리형 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0125491에 기술된 것; 1,3,4-옥사디아졸 및 1,3,4-티아디아졸 화합물 및 유도체 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/033301에 기술된 것; 펩타이드-기반 화합물 및 유도체 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/036927 및 WO 2015/04490에 기술된 것, 또는 거대고리형 펩타이드-기반 화합물 및 유도체 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0294898에 기술된 것일 수 있으며; 각각의 그 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 Regeneron, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 세미플리맙이다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 Novartis AG 및 Beigene Co., Ltd.로부터 이용가능한 티슬레리주맙이다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 Eli Lilly and Co.로부터 이용가능한 신틸리맙이다. 실시양태에서, PD-1 저해제는 Junshi Biosciences Co., Ltd. 및 Coherus BioSciences, Inc.에서 이용가능한 토리팔리맙이다.
실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 당업계에 공지된 임의의 PD-L1 또는 PD-L2 저해제, 항작동제 또는 차단제일 수 있다. 특히 이는 다음 단락에서 더 자세히 기술되는 PD-L1 또는 PD-L2 저해제, 항작동제 또는 차단제 중 하나이다. 용어 "저해제", "항작동제" 및 "차단제"는 PD-L1 및 PD-L2 저해제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인 PD-L1 또는 PD-L2 저해제에 대한 본원에서의 언급은 화합물 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, PD-L1 또는 PD-L2 저해제에 대한 본원에서의 언급은 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 과정 및 방법은 PD-L1 또는 PD-L2 저해제를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 소분자이다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 항체(즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함한 이의 단편, 또는 이의 단일-사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서 PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 다클론성 항체이다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 단클론성 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 저해제는 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합을 위해 경쟁하고/하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다. 실시양태에서, 항체는 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합을 위해 경쟁하고/하거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 PD-L1 저해제는 화합물이 PD-L2 수용체를 포함한 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L1에 결합하거나 상호작용한다는 점에서 PD-L1에 대해 선택적이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 PD-L2 수용체보다 적어도 약 2-배 더 높은 농도, 약 3-배 더 높은 농도, 약 5-배 더 높은 농도, 약 10-배 더 높은 농도, 약 20-배 더 높은 농도, 약 30-배 더 높은 농도, 약 50-배 더 높은 농도, 약 100-배 더 높은 농도, 약 200-배 더 높은 농도, 약 300-배 더 높은 농도 또는 약 500-배 더 높은 농도인 결합 상수에서 PD-L1 수용체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 PD-L2 저해제는 화합물이 PD-L1 수용체를 포함한 다른 수용체에 결합하거나 상호작용하는 것보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 PD-L2에 결합하거나 상호작용한다는 점에서 PD-L2에 대해 선택적이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 PD-L1 수용체보다 적어도 약 2-배 더 높은 농도, 약 3-배 더 높은 농도, 약 5-배 더 높은 농도, 약 10-배 더 높은 농도, 약 20-배 더 높은 농도, 약 30-배 더 높은 농도, 약 50-배 더 높은 농도, 약 100-배 더 높은 농도, 약 200-배 더 높은 농도, 약 300-배 더 높은 농도 또는 약 500-배 더 높은 농도인 결합 상수에서 PD-L2 수용체에 결합한다.
임의의 이론에 구속됨이 없이, 종양 세포는 PD-L1을 발현하고, T 세포는 PD-1을 발현하는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양 세포에 의한 PD-L1 발현이 PD-1 또는 PD-L1 저해제 또는 차단제의 효능에 요구되지는 않는다. 실시양태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현한다. 다른 실시양태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 TIL과 조합된 PD-1 및 PD-L1 항체의 조합, 예컨대 본원에 기술된 것을 포함할 수 있다. PD-1 및 PD-L1 항체와 TIL의 조합의 투여는 동시에 또는 순차적으로 될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 저해제는 약 100pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 90pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 80pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 70pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 60pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 50pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 40pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 또는 약 30pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 저해제는 약 7.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 8.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 약 9.5×105 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하고, 또는 약 1×106 1/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 저해제는 약 2×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하고, 약 2.1×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.2×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.3×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.4×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.5×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.6×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하고, 약 2.7×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하고, 또는 약 3×10-5 1/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 것이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 및/또는 PD-L2 저해제는 약 10nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 9nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 8nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 7nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 6nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 5nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 4nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 3nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 약 2nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하거나 억제하고; 또는 약 1nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한, 인간 PD-L1을 차단하거나, 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단하는 것이다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 MEDI4736(AstraZeneca plc.의 자회사인, 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 Medimmune, LLC로부터 상업적으로 이용가능함)으로도 알려진 두르발루맙, 또는 이의 항원-결합 단편, 접합체, 또는 변이체이다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 미국 특허 번호 8,779,108 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0034559에 개시된 항체이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 두르발루맙의 임상적 효능은 Page, 등, Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; Brahmer, 등, J. Clin. Oncol. 2014, 32, 5s (보충, 요약 8021); 및 McDermott, 등, Cancer Treatment Rev., 2014, 40, 1056-64에 기술되어 있다. 두르발루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,779,108호에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 두르발루맙의 아미노산 서열은 표 20에 제시되어 있다. 두르발루맙 단클론성 항체는 22-96, 22''-96'', 23'-89', 23'''-89''', 135'-195', 135'''-195''', 148-204, 148''-204'', 215'-224, 215'''-224'', 230-230'', 233-233'', 265-325, 265''-325'', 371-429, 및 371''-429'에서 이황화 연결; 및 Asn-301 및 Asn-301''에서 N-글리코실화 부위를 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 179에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 178 및 서열번호: 179에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 두르발루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 180에 도시된 서열을 포함하고, PD-L1 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 181에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 180 및 서열번호: 181에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 180 및 서열번호: 181에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 180 및 서열번호: 181에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 180 및 서열번호: 181에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 180 및 서열번호: 181에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 182, 서열번호: 183, 및 서열번호: 184에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 185, 서열번호: 186, 및 서열번호: 187에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 PD-L1 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 두르발루맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 두르발루맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 두르발루맙이다. 항-PD-L1 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 두르발루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 두르발루맙이다.
표 20. 두르발루맙과 관련된 PD-L1 저해제의 아미노산 서열.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 MSB0010718C로도 알려진 아벨루맙(Merck KGaA/EMD Serono로부터 상업적으로 이용가능함), 또는 이의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 아벨루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0341917 A1에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 아벨루맙의 아미노산 서열은 표 21에 제시되어 있다. 아벨루맙은 22-96, 147-203, 264-324, 370-428, 22''-96'', 147''-203'', 264''-324'', 및 370''-428''에서 중쇄-내 이황화 연결(C23-C104); 22''-90', 138'-197', 22'''-90''' 및 138'''-197'''에서 경쇄-내 이황화 연결(C23-C104); 223-215' 및 223''-215'''에서 중쇄-경쇄-내 이황화 연결(h 5-CL 126); 229-229'' 및 232-232''에서 중쇄-중쇄-내 이황화 연결(h 11, h 14); 300, 300''에서 N-글리코실화 부위(H CH2 N84.4); 푸코실화된 복합 이중-촉각의 CHO-유형 글리칸; 및 450 및 450'에서 H CHS K2 C-말단 라이신 클리핑을 갖는다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 189에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 188 및 서열번호: 189에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 아벨루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 190에 도시된 서열을 포함하고, PD-L1 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 191에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 190 및 서열번호: 191에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 190 및 서열번호: 191에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 190 및 서열번호: 191에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 190 및 서열번호: 191에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 190 및 서열번호: 191에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 192, 서열번호: 193, 및 서열번호: 194에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 195, 서열번호: 196, 및 서열번호: 197에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 PD-L1 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 아벨루맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아벨루맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아벨루맙이다. 항-PD-L1 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아벨루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아벨루맙이다.
표 21. 아벨루맙과 관련된 PD-L1 저해제에 대한 아미노산 서열.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 MPDL3280A 또는 RG7446(스위스 바젤 소재의 Roche Holding AG의 자회사인 Genentech, Inc.로부터 TECENTRIQ로 상업적으로 이용가능함)으로도 알려진 아테졸리주맙, 또는 이의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 미국 특허 번호 8,217,149에 개시된 항체이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0203056 A1, 2013/0045200 A1, 2013/0045201 A1, 2013/0045202 A1 또는 2014/0065135 A1에 개시된 항체이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 아테졸리주맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,217,149에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 아테졸리주맙의 아미노산 서열은 표 22에 제시되어 있다. 아테졸리주맙은 22-96, 145-201, 262-322, 368-426, 22''-96'', 145''-201'', 262''-322'' 및 368''-426''에서 중쇄-내 이황화 연결C23-C104); 23'-88', 134'-194', 23'''-88''' 및 134'''-194'''에서 경쇄-내 이황화 연결(C23-C104); 221-214' 및 221''-214'''의 중쇄-경쇄-내 이황화 연결(h 5-CL 126); 227-227'' 및 230-230''에서 중쇄-중쇄-내 이황화 연결(h 11, h 14); 및 298 및 298'에서 N-글리코실화 부위(H CH2 N84.4>A)를 갖는다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 199에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 198 및 서열번호: 199에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 아테졸리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 200에 도시된 서열을 포함하고, PD-L1 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 201에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 200 및 서열번호: 201에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 200 및 서열번호: 201에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 200 및 서열번호: 201에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 200 및 서열번호: 201에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, PD-L1 저해제는 서열번호: 200 및 서열번호: 201에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 각각 서열번호: 202, 서열번호: 203, 및 서열번호: 204에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 205, 서열번호: 206, 및 서열번호: 207에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 PD-L1 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 일 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-PD-L1 항체이고, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아테졸리주맙이다. 항-PD-L1 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 아테졸리주맙이다.
표 22. 아테졸리주맙과 관련된 PD-L1 저해제에 대한 아미노산 서열.
실시양태에서, PD-L1 저해제 또는 항-PD-L1 항체는 Incyte, Inc.로부터 이용가능한 레티판리맙, 또는 이의 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러이다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0341917 A1에 기술된 이들 항체를 포함하며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 다른 실시양태에서, PD-L1에 대한 결합에 대해 임의의 이들 항체와 경쟁하는 항체도 포함된다. 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-935559로도 알려진 MDX-1105이며, 이는 미국 특허 번호 US 7,943,743에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 US 7,943,743에 개시된 항-PD-L1 항체로부터 선택된다.
실시양태에서, PD-L1 저해제는 상업적으로-이용가능한 단클론성 항체, 예컨대 INVIVOMAB 항-m-PD-L1 클론 10F.9G2(카탈로그 # BE0101, Bio X Cell, Inc., 미국 뉴햄프셔주 웨스트레바논 소재)이다. 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 상업적으로-이용가능한 단클론성 항체, 예컨대 AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)이다. 다수의 상업적으로-이용가능한 항-PD-L1 항체가 당업자에게 공지되어 있다.
실시양태에서, PD-L2 저해제는 상업적으로-이용가능한 단클론성 항체, 예컨대 BIOLEGEND 24F.10C12 마우스 IgG2a, κ 이소타입(카탈로그 # 329602 Biolegend, Inc., 캘리포니아주 샌디에이고 소재), SIGMA 항-PD-L2 항체(카탈로그 번호 SAB3500395, Sigma-Aldrich Co., 미주리주 세인트루이스 소재), 또는 당업자에게 공지된 기타 상업적으로-이용가능한 항-PD-L2 항체이다.
3. CTLA-4 저해제와 조합
일부 실시양태에서, 암을 앓고 있는 환자에게 제공되는 TIL 요법은 TIL의 치료적 집단 단독으로 치료를 포함할 수 있거나 TIL 및 하나 이상의 CTLA-4 저해제를 포함하는 조합 치료를 포함할 수 있다.
세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA-4)는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이고 헬퍼 T 세포의 표면 상에 발현된다. CTLA-4는 CD28-의존성 T 세포 활성화의 음성 조절자이고 적응성 면역 반응에 대한 체크포인트로서 역할을 한다. T 세포 공동자극 단백질 CD28과 유사하게, CTLA-4 결합 항원은 세포 상에 CD80과 CD86을 나타낸다. CTLA-4는 T 세포에 억제 신호를 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다. 인간 CTLA-4에 대한 인간 항체는 바이러스 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하고 암을 치료하는 것과 같은 많은 질환 상태에서 면역자극 조절제로 기술되었다(WO 01/14424 및 WO 00/37504). 이필리무맙(MDX-010) 및 트레멜리무맙(CP-675,206)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다수의 완전 인간 항-인간 CTLA-4 단일클론성 항체(mAb)가 다양한 유형의 고형 종양의 치료를 위한 임상 시험에서 연구되었다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 당업계에 공지된 임의의 CTLA-4 저해제 또는 CTLA-4 차단제일 수 있다. 특히, 이는 다음 단락에서 더 자세히 기술되는 CTLA-4 저해제 또는 차단제 중 하나이다. 용어 "저해제", "항작용제" 및 "차단제"는 CTLA-4 저해제와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 의심을 피하기 위해, 항체인 CTLA-4 저해제에 대한 본원에서의 언급은 화합물 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, CTLA-4 저해제에 대한 본원에서의 언급은 또한 소분자 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
발명의 방법에 사용하기에 적합한 CTLA-4 저해제는, 제한 없이, 항-CTLA-4 항체, 인간 항-CTLA-4 항체, 마우스 항-CTLA-4 항체, 포유동물 항-CTLA-4 항체, 인간화된 항-CTLA-4 항체, 단클론성 항-CTLA-4 항체, 다클론성 항-CTLA-4 항체, 키메라 항-CTLA-4 항체, MDX-010(이필리무맙), 트레멜리무맙, 항-CD28 항체, 항-CTLA-4 애드넥틴, 항-CTLA-4 도메인 항체, 단일 사슬 항-CTLA-4 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 경쇄 항-CTLA-4 단편, 공동-자극 경로를 작동시키는 CTLA-4의 저해제, PCT 공개 번호 WO 2001/014424에 개시된 항체, PCT 공개 번호 WO 2004/035607에 개시된 항체, 미국 공개 번호 2005/0201994에 개시된 항체, 및 승인된 유럽 특허 번호 EP 1212422 B1에 개시된 항체를 포함하며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 추가적인 CTLA-4 항체는 미국 특허 번호 5,811,097, 5,855,887, 6,051,227 및 6,984,720; PCT 공개 번호 WO 01/14424 및 WO 00/37504; 및 미국 공개 번호 2002/0039581 및 2002/086014에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다른 항-CTLA-4 항체는 예를 들어 WO 98/42752; 미국 특허 번호 6,682,736 및 6,207,156; Hurwitz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998); Camacho 등, J. Clin. Oncology, 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (antibody CP-675206); Mokyr 등, Cancer Res., 58:5301-5304 (1998), 및 미국 특허 번호 5,977,318, 6,682,736, 7,109,003 및 7,132,281에 개시된 것을 포함하며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
추가적인 CTLA-4 저해제는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD28 항원이 그 동족 리간드에 결합하는 능력을 방해하고, CTLA-4가 동족 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, 공동-자극 경로를 통해 T 세포 반응을 증강시키고, CD28 및/또는 CTLA-4에 결합하는 B7의 능력을 방해하고, 공동-자극 경로를 활성화하는 B7의 능력을 방해하고, CD28 및/또는 CTLA-4에 결합하는 CD80의 능력을 방해하고, 공동-자극 경로를 활성화하는 CD80의 능력을 방해하고, CD28 및/또는 CTLA-4에 결합하는 CD86의 능력을 방해하고, 공동-자극 경로를 활성화하는 CD86의 능력을 방해하고, 그리고 일반적으로 활성화되어 있는 공동-자극 경로를 방해할 수 있는 임의의 저해제. 이것은 공동-자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA-4의 소분자 저해제; 공동-자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA-4에 지향된 항체; 공동-자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA-4에 대해 지향된 안티센스 분자; 공동-자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA-4에 대해 지향된 애드넥틴, 공동-자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA-4의 RNAi 저해제(단일 및 이중 가닥 둘 모두)를 다른 CTLA-4 저해제 중에서 반드시 포함한다.
일부 실시양태에서 CTLA-4 저해제는 약 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 예를 들어 10-13 M 내지 10-16 M, 또는 상기-언급된 값 중 임의의 2개를 평가변수로 갖는 임의의 범위 내의 Kd로 CTLA-4에 결합한다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 동일한 검정을 사용하여 비교할 때 이필리무맙의 것보다 10-배 이하의 Kd로 CTLA-4에 결합한다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 동일한 검정을 사용하여 비교할 때 이필리무맙의 것과 거의 동일하거나 그보다 낮은(예를 들어, 최대 10-배 더 낮거나, 최대 100-배 더 낮은) Kd로 CTLA-4에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD80 또는 CD86에 대한 CTLA-4 결합의 CTLA-4 저해제에 의한 억제에 대한 IC50 값은 동일한 검정을 사용하여 비교할 때, 각각 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA-4 결합의 이필리무맙-매개된 억제의 것보다 10-배 이하 더 크다. 일부 실시양태에서, CD80 또는 CD86에 대한 CTLA-4 결합의 CTLA-4 저해제에 의한 억제에 대한 IC50 값은 동일한 검정을 사용하여 비교할 때, 각각 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA-4 결합의 이필리무맙-매개된 억제의 것과 거의 동일하거나 그보다 낮다(예를 들어, 최대 10-배 더 낮거나, 최대 100-배 더 낮음).
일부 실시양태에서 CTLA-4 저해제는, 적합한 대조군에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%, 예를 들어 50%와 75%, 75%와 90%, 또는 90%와 100% 사이로 CTLA-4의 발현을 억제하고/하거나 CTLA-4의 생물학적 활성을 감소시키기에 충분한 양으로 사용된다. 일부 실시양태에서 CTLA-4 경로 저해제는, 적합한 대조군에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%, 예를 들어 적합한 대조군에 비해 50%와 75%, 75%와 90%, 또는 90%와 100% 사이로 CD80, CD86 또는 둘 모두에 대한 CTLA-4의 결합을 감소시킴에 의해 CTLA-4의 생물학적 활성을 감소시키기에 충분한 양으로 사용된다. 관심있는 제제의 효과를 평가하거나 정량화하는 맥락에서 적합한 대조군은 전형적으로 관심있는 제제, 예를 들어, CTLA-4 경로 저해제에 노출되거나 처리되지 않은 (또는 무시할 수 있는 양에 노출되었거나 처리된) 비교할만한 생물학적 시스템(예를 들어, 세포 또는 대상체)이다. 일부 실시양태에서 생물학적 시스템은 그 자체의 대조군으로 역할을 할 수 있다(예를 들어, 생물학적 시스템은 제제에 노출되거나 처리되기 전에 평가될 수 있고 노출 또는 처리가 시작되거나 완료된 후의 상태와 비교될 수 있다. 일부 실시양태에서 전통적인 대조군이 사용될 수 있다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙(Bristol-Myers Squibb Co.에서 Yervoy로 상업적으로 이용가능함), 또는 이의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이필리무맙은 기능성 인간 레퍼토리를 생성하기 위해 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 인간 유전자를 갖는 형질전환 마우스로부터 유래된 완전 인간 IgG 1κ 항체인 항-CTLA-4 항체를 지칭한다. 거기 있음. 이필리무맙은 또한 그 CAS 등록 번호 477202-00-9에 의해 지칭될 수 있고 PCT 공개 번호 WO 01/14424에서 지칭될 수 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 그것은 항체 10DI로 개시되어 있다. 구체적으로, 이필리무맙은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호: 211을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지고 서열번호: 210을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가짐)을 함유한다. 이필리무맙의 약제학적 조성물은 이필리무맙 및 하나 이상의 희석제, 비히클 또는 부형제를 함유하는 모든 약제학적으로 허용가능한 조성물을 포함한다. 이필리무맙을 함유하는 약제학적 조성물의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2007/67959에 기재되어 있다. 이필리무맙은 정맥내로(IV)로 투여될 수 있다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 208에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 209에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 208 및 서열번호: 209에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:208 및 서열번호:209에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:208 및 서열번호:209에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:208 및 서열번호:209에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호:208 및 서열번호:209에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:208 및 서열번호:209에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 210에 도시된 서열을 포함하고, CTLA-4 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 211에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 210 및 서열번호: 211에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 210 및 서열번호: 211에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 210 및 서열번호: 211에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 210 및 서열번호: 211에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 210 및 서열번호: 211에 각각 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 212, 서열번호: 213, 및 서열번호: 214에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 및, 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 215, 서열번호: 216, 및 서열번호: 217에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 CTLA-4 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-CTLA-4 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 이필리무맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 이필리무맙의 아미노산 서열은 표 23에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-CTLA-4 항체이며, 여기서 항-CTLA-4 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 이필리무맙이다. 항-CTLA-4 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 이필리무맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 이필리무맙이다.
표 23. 이필리무맙에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 이필리무맙은 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 이필리무맙은 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 1.5mg/kg, 약 2mg/kg, 약 2.5mg/kg, 약 3mg/kg, 약 3.5mg/kg, 약 4mg/kg, 약 4.5mg/kg, 약 5mg/kg, 약 5.5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 6.5mg/kg, 약 7mg/kg, 약 7.5mg/kg, 약 8mg/kg, 약 8.5mg/kg, 약 9mg/kg, 약 9.5mg/kg, 또는 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4, 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 이필리무맙은 약 200mg 내지 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 이필리무맙은 약 200mg, 약 220mg, 약 240mg, 약 260mg, 약 280mg, 약 300mg, 약 320mg, 약 340mg, 약 360mg, 약 380mg, 약 400mg, 약 420mg, 약 440mg, 약 460mg, 약 480mg, 또는 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 이필리무맙은 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다 또는 6주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 치료하기 위해 최대 4회 용량에 대해 3주마다 약 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 흑색종의 보조 치료를 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 흑색종의 보조 치료를 위해 4회 용량에 대해 3주마다 약 10mg/kg, 이어서 최대 3년 동안 12주마다 10mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 진행성 신세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다, 같은 날에 니볼루맙 3mg/kg에 바로 이어서 약 1mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합물의 4회 용량을 완료한 후, 니볼루맙은 진행성 신세포 암종 및/또는 신세포 암종에 대한 표준 복용량 요법에 따라 단일 제제로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다, 같은 날에 30분에 걸쳐 정맥내로 니볼루맙 3mg/kg에 바로 이어서 30분에 걸쳐 정맥내로 약 1mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합물의 4회 용량을 완료한 후, 현미부수체 높은-불안정성(MSI-H) 또는 미스매치 복구 결핍(dMMR) 전이성 결장암에 대한 표준 복용량 요법에 따라 권장되는 대로 단일 제제로서 니볼루맙을 투여한다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 간세포 암종을 치료하기 위해 4회 용량에 대해 3주마다, 같은 날에 30분에 걸쳐 정맥내로 니볼루맙 1mg/kg에 바로 이어서 30분에 걸쳐 정맥내로 약 3mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합물의 4회 용량을 완료한 후, 간세포 암종에 대한 표준 복용량 요법에 따라 단일 제제로서 니볼루맙을 투여한다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 이필리무맙은 2주마다 니볼루맙 3mg/kg과 6주마다 약 1mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 전이성 비-소세포폐암을 치료하기 위해 3주마다 니볼루맙 360mg 및 백금-이중 화학요법의 2주기로 6주마다 약 1mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, 이필리무맙은 악성 흉막 중피종을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙은 악성 흉막 중피종을 치료하기 위해 3주마다 니볼루맙 360mg과 6주마다 약 1mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 이필리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
트레멜리무맙(또한 CP-675,206으로 공지됨)은 완전 인간 IgG2 단클론성 항체이고 CAS 번호 745013-59-6을 갖는다. 트레멜리무맙은 미국 특허 번호 6,682,736(본원에 참고로 포함됨)에 항체 11.2.1로 개시되어 있다. 트레멜리무맙의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 218 및 219에 제시되어 있다. 트레멜리무맙은 흑색종 및 유방암을 포함한 다양한 종양의 치료를 위한 임상적 시험에서 조사되었으며; 여기서 트레멜리무맙은 0.01 내지 15mg/kg의 용량 범위에서 4주 또는 12주마다 단일 용량 또는 다중 용량으로 정맥내로 투여되었다. 본 발명에 의해 제공된 요법에서, 트레멜리무맙은 국소적으로, 특히 피내로 또는 피하로 투여된다. 피내로 또는 피하로 투여되는 트레멜리무맙의 유효량은 전형적으로 1인당 5-200mg/용량의 범위이다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 용량당 1인당 10-150mg/용량의 범위이다. 일부 특정 실시양태에서, 트레멜리무맙의 유효량은 1인당 약 10, 25, 37.5, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200mg/용량이다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 218에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 219에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 218 및 서열번호: 219에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 220에 도시된 서열을 포함하고, CTLA-4 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 221에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 220 및 서열번호: 221에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 220 및 서열번호: 221에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 220 및 서열번호: 221에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 220 및 서열번호: 221에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 220 및 서열번호: 221에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 222, 서열번호: 223, 및 서열번호: 224에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 225, 서열번호: 226, 및 서열번호: 227에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 항-CTLA-4 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-CTLA-4 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 트레멜리무맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 트레멜리무맙의 아미노산 서열은 표 24에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-CTLA-4 항체이며, 여기서 항-CTLA-4 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 트레멜리무맙이다. 항-CTLA-4 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 트레멜리무맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 트레멜리무맙이다.
표 24. 트레멜리무맙에 대한 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 트레멜리무맙은 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 트레멜리무맙은 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 1.5mg/kg, 약 2mg/kg, 약 2.5mg/kg, 약 3mg/kg, 약 3.5mg/kg, 약 4mg/kg, 약 4.5mg/kg, 약 5mg/kg, 약 5.5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 6.5mg/kg, 약 7mg/kg, 약 7.5mg/kg, 약 8mg/kg, 약 8.5mg/kg, 약 9mg/kg, 약 9.5mg/kg, 또는 약 10mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 트레멜리무맙은 약 200mg 내지 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 트레멜리무맙은 약 200mg, 약 220mg, 약 240mg, 약 260mg, 약 280mg, 약 300mg, 약 320mg, 약 340mg, 약 360mg, 약 380mg, 약 400mg, 약 420mg, 약 440mg, 약 460mg, 약 480mg, 또는 약 500mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 트레멜리무맙 또는 이의 바이오시밀러이고, 트레멜리무맙은 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다 또는 6주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 3, 4 또는 5주에 시작된다. 일부 실시양태에서, 트레멜리무맙 투여는 절제-전(즉, 대상체 또는 환자로부터 종양 샘플을 수득하기 이전) 1, 2, 또는 3주에 시작된다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 Agenus로부터 잘리프레리맙, 또는 이의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 잘리프레리맙은 완전 인간 단클론성 항체이다. 잘리프레리맙은 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호 2148321-69-9로 지정되어 있고 AGEN1884로도 알려져 있다. 잘리프렐리맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 10,144,779호 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2020/0024350 A1에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 서열번호: 228에 의해 제공된 중쇄 및 서열번호: 229에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 228 및 서열번호: 229에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 잘리프레리맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 230에 도시된 서열을 포함하고, CTLA-4 저해제 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 231에 도시된 서열, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:230 및 서열번호:231에 도시된 서열과 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:230 및 서열번호:231에 도시된 서열과 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:230 및 서열번호:231에 도시된 서열과 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:230 및 서열번호:231에 도시된 서열과 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호:230 및 서열번호:231에 도시된 서열과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 각각 서열번호: 231, 서열번호: 233, 및 서열번호: 234에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환, 및 각각 서열번호: 235, 서열번호: 236, 및 서열번호: 237에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 실시양태에서, 항체는 임의의 전술한 항체와 같은 CTLA-4 상의 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다.
실시양태에서, CTLA-4 저해제는 잘리프레리맙과 관련하여 약물 규제 당국에 의해 승인된 CTLA-4 바이오시밀러 단클론성 항체이다. 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물과 비교하여 하나 이상의 번역-후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-CTLA-4 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 잘리프레리맙이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역-후 변형은 글리코실화, 산화, 탈아미노화 및 절삭 중 하나 이상으로부터 선택된다. 잘리프레리맙의 아미노산 서열은 표 25에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 승인되거나 승인을 위해 제출된 항-CTLA-4 항체이며, 여기서 항-CTLA-4 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물의 제형과 다른 제형으로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 잘리프레리맙이다. 항-CTLA-4 항체는 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA와 같은 약물 규제 당국의 승인을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 잘리프레리맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 하나 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 생성물은 잘리프레리맙이다.
표 25. 잘리프레리맙에 대한 아미노산 서열.
추가적인 항-CTLA-4 항체의 예는 당업자에게 공지된 AGEN1181, BMS-986218, BCD-145, ONC-392, CS1002, REGN4659, 및 ADG116을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 임의의 다음 특허 공보(본원에 참고로 포함됨)에 개시된 항-CTLA-4 항체이다: US 2019/0048096 A1; US 2020/0223907; US 2019/0201334; US 2019/0201334; US 2005/0201994; EP 1212422 B1; WO 2018/204760; WO 2018/204760; WO 2001/014424; WO 2004/035607; WO 2003/086459; WO 2012/120125; WO 2000/037504; WO 2009/100140; WO 2006/09649; WO2005092380; WO 2007/123737; WO 2006/029219; WO 2010/0979597; WO 2006/12168; 및 WO1997020574. 추가적인 CTLA-4 항체는 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 5,811,097, 5,855,887, 6,051,227 및 6,984,720; PCT 공개 번호 WO 01/14424 및 WO 00/37504; 및 미국 공개 번호 2002/0039581 및 2002/086014; 및/또는 미국 특허 번호 5,977,318, 6,682,736, 7,109,003 및 7,132,281에 기술되어 있다). 일부 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어, WO 98/42752; 미국 특허 번호 6,682,736 및 6,207,156; Hurwitz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17): 10067-10071 (1998); Camacho 등, J. Clin. Oncol., 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (항체 CP-675206); Mokyr 등, Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)(본원에 참고로 포함됨)에 개시된 것들이다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 WO1996040915(본원에 참고로 포함됨)에 개시된 CTLA-4 리간드이다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 CTLA-4 발현의 핵산 저해제이다. 예를 들어, 항-CTLA-4 RNAi 분자는 PCT 공개 번호 WO 1999/032619 및 WO 2001/029058; 미국 공개 번호 2003/0051263, 2003/0055020, 2003/0056235, 2004/265839, 2005/0100913, 2006/0024798, 2008/0050342, 2008/0081373, 2008/0248576, 및 2008/055443; 및/또는 미국 특허 번호 6,506,559, 7,282,564, 7,538,095 및 7,560,438(본원에 참고로 포함됨)에서 Mello and Fire에 의해 기술된 분자의 형태를 취할 수 있다. 일부 경우에, 항-CTLA-4 RNAi 분자는 유럽 특허 번호 EP 1309726(본원에 참고로 포함됨)에서 Tuschl에 의해 기술된 이중 가닥 RNAi 분자의 형태를 취한다. 일부 경우에, 항-CTLA-4 RNAi 분자는 미국 특허 번호 7,056,704 및 7,078,196(본원에 참고로 포함됨)에서 Tuschl에 의해 기술된 이중 가닥 RNAi 분자의 형태를 취한다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 저해제는 PCT 공개 번호 WO2004081021(본원에 참고로 포함됨)에 기술된 압타머이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 RNAi 분자는 미국 특허 번호 5,898,031, 6,107,094, 7,432,249 및 7,432,250, 및 유럽 출원 번호 EP 0928290(본원에 참고로 포함됨)에서 Crooke에 의해 기술된 RNA 분자이다.
4. 환자의 선택적 림프구고갈 전처리
실시양태에서, 발명은 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 이전에 비-골수파괴 화학요법으로 사전-치료된다. 실시양태에서, 발명은 비-골수파괴 화학요법으로 사전-치료된 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 포함한다. 실시양태에서, TIL의 집단은 주입에 의한 투여를 위한 것이다. 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d이고 5일(TIL 주입 이전 27일차 내지 23일차) 동안 플루다라빈 25mg/㎡/d이다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d이고 3일(TIL 주입 이전 27일차 내지 25일차) 동안 플루다라빈 25mg/m2/d이다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 화학요법은 2일(TIL 주입 이전 27일차 및 26일차) 동안 시클로포스파미드 60mg/kg/d, 이어서 3일 동안(TIL 주입 이전 25일차 내지 23일차) 플루다라빈 25mg/m2d이다. 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 비-골수파괴 화학요법 및 TIL 주입(0일차) 후, 환자는 생리적 내성을 위해 8시간마다 720,000IU/kg으로 정맥내로 IL-2(알데스류킨, PROLEUKIN으로 상업적으로 이용가능함)의 정맥내 주입을 받는다. 특정 실시양태에서, TIL의 집단은 IL-2와 조합하여 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이며, 여기서 IL-2는 TIL의 집단 후에 투여된다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 이전 림프구고갈이 조절 T 세포를 제거하고 면역계의 요소를 경쟁시킴에 의해 치료 효능을 증강시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다('사이토카인 싱크'). 따라서, 발명의 일부 실시양태는 발명의 TIL의 도입 이전에 환자에게 림프구 고갈 단계(때때로 "면역억제 처리"로도 지칭됨)를 활용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈 또는 시클로포스파미드(활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 이의 조합의 투여를 사용하여 달성된다. 이러한 방법은 Gassner, 등, Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, 등, Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, 및 Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357에 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 플루다라빈은 0.5μg/mL - 10μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 1μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 10mg/kg/일, 15mg/kg/일, 20mg/kg/일, 25mg/kg/일, 30mg/kg/일, 35mg/kg/일, 40mg/kg/일, 또는 45mg/kg/일의 복용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 25mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 0.5μg/mL -10μg/mL의 농도에서 시클로포스파미드의 투여에 의해 획득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 1μg/mL의 농도에서 시클로포스파미드의 투여에 의해 획득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 100mg/㎡/일, 150mg/㎡/일, 175mg/㎡/일, 200mg/㎡/일, 225mg/㎡/일, 250mg/㎡/일, 275mg/㎡/일 또는 300mg/㎡/일의 복용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 정맥내로(즉, i.v.) 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 35mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250mg/㎡/일 i.v.로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250mg/㎡/일 i.v.로 4일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈은 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 환자에게 함께 투여함에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 25mg/㎡/일 i.v.로 투여되고, 시클로포스파미드는 4일에 걸쳐 250mg/㎡/일 i.v.로 투여된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행되며, 여기서 시클로포스파미드 및 플루다라빈는 처음 2일에서 둘 모두 투여되고, 림프구 고갈은 총 5일 동안 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 약 50mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 약 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행되며, 여기서 시클로포스파미드 및 플루다라빈는 처음 2일에서 둘 모두 투여되고, 림프구 고갈은 총 5일 동안 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 약 50mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 약 20mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행되며, 여기서 시클로포스파미드 및 플루다라빈는 처음 2일에서 둘 모두 투여되고, 림프구 고갈은 총 5일 동안 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 약 40mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 약 20mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행되며, 여기서 시클로포스파미드 및 플루다라빈는 처음 2일에서 둘 모두 투여되고, 림프구 고갈은 총 5일 동안 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 약 40mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 약 15mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행되며, 여기서 시클로포스파미드 및 플루다라빈는 처음 2일에서 둘 모두 투여되고, 림프구 고갈은 총 5일 동안 수행된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 약 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 3일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
실시양태에서, 시클로포스파미드는 메스나와 함께 투여된다. 실시양태에서, 메스나는 15mg/kg으로 투여된다. 메스나가 주입되는 실시양태에서, 연속적으로 주입되는 경우, 메스나는 시클로포스파미드와 함께 대략적으로 2시간에 걸쳐(-5일차 및/또는 -4일차에) 주입될 수 있으며, 그 다음 각 시클로포스파미드 용량과 동시적으로 시작하여 24시간에 걸쳐 나머지 22시간 동안 3mg/kg/시간의 속도로 주입될 수 있다.
실시양태에서, 림프구고갈은 환자에게 TIL의 제3 집단의 투여 후 다음날에 시작하여 IL-2 요법으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 림프구고갈은 환자에게 TIL의 제3 집단의 투여와 같은 날에 시작하여 IL-2 요법으로 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈화는 5일의 전처리 치료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일은 -5일차부터 -1일차까지, 또는 0일차부터 4일차까지로 표시된다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 정맥내 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 60mg/kg 정맥내 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 메스나와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 요법은 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 25mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -1일차(즉, 0일차 내지 4일차)에 25mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -1일차(즉, 0일차 내지 4일차)에 25mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 5일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 3일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 1일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 2일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 3일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 5일의 전처리 치료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일은 -5일차부터 -1일차까지, 또는 0일차부터 4일차까지로 표시된다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 정맥내 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -4일차(즉, 0일차 및 1일차)에 300mg/kg 정맥내 시클로포스파미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 메스나와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 요법은 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 30mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -1일차(즉, 0일차 내지 4일차)에 30mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 -5일차 및 -1일차(즉, 0일차 내지 4일차)에 30mg/㎡ 정맥내 플루다라빈을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 300mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 5일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 3일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 1일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 300mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 2일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 2일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여와 함께 2일 동안 300mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드 및 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여에 이어서 3일 동안 30mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 26에 따라 투여된다.
표 26. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 27에 따라 투여된다.
표 27. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 28에 따라 투여된다.
표 28. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 29에 따라 투여된다.
표 29. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 30에 따라 투여된다.
표 30. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 31에 따라 투여된다.
표 31. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 32에 따라 투여된다.
표 32. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 표 33에 따라 투여된다.
표 33. 예시적인 림프구고갈 및 치료 요법.
일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 TIL 주입의 일 이전 1, 2, 또는 3일의 경과에 걸쳐 100mg/㎡의 총 용량으로 투여되는 멜팔란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 TIL 주입의 일 이전 1, 2, 또는 3일의 경과에 걸쳐 200mg/㎡의 총 용량으로 투여되는 멜팔란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 TIL 주입의 일 이전 1, 2, 또는 3일의 경과에 걸쳐 100mg/㎡의 총 용량으로 투여되는 멜팔란 및 30mg/㎡/일의 용량으로 투여되는 플루다라빈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-골수파괴 림프구고갈 요법은 TIL 주입의 일 이전 1, 2, 또는 3일의 경과에 걸쳐 200mg/㎡의 총 용량으로 투여되는 멜팔란 및 30mg/㎡/일의 용량으로 투여되는 플루다라빈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전술한 골수파괴 림프구고갈 요법의 실시양태와 함께 사용되는 TIL 주입은 본원에 기술된 임의의 TIL 조성물일 수 있고, 또한 TIL 주입 대신에 MIL 및 PBL의 주입뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 IL-2 요법의 추가 및 공동-요법(예컨대 PD-1 및 PD-L1 저해제)의 투여를 포함할 수 있다.
5. IL-2 요법
실시양태에서, IL-2 요법은 TIL의 치료적 집단의 치료적으로 유효한 부분을 투여한 후 다음날부터 시작하여 정맥내로 투여된, 고-용량 IL-2 요법을 포함하며, 여기서 고-용량 IL-2 요법은 알데스류킨, 또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하며, 여기서 알데스류킨 또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회 용량에 대한 내성까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥 주입을 사용하여 0.037mg/kg 또는 0.044mg/kg IU/kg(환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 9일간 휴식을 취한 후, 이 일정은 최대 총 28회 용량을 위해, 다른 14회 용량에 대해 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, IL-2는 최대 6회 용량의 최대 복용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 고-용량 IL-2 요법은 소아용으로 적합하다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 600,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 500,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 400,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 500,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 300,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 200,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다. 일부 실시양태에서, 최대 6회 용량까지 8-12시간마다 100,000 국제 단위(IU)/kg의 알데스류킨의 용량이 사용된다.
실시양태에서, IL-2 요법은 디크레센도 IL-2 요법을 포함한다. 디크레센도 IL-2 요법은 O'Day, 등, J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 and Eton, 등, Cancer 2000, 88, 1703-9에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 실시양태에서, 디크레센도 IL-2 요법은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18×106 IU/㎡, 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18×106 IU/㎡, 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 18×106 IU/㎡, 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여된 4.5×106 IU/㎡를 포함한다. 이 치료 주기는 최대 4주기에 대해 28일마다 반복될 수 있다. 실시양태에서, 디크레센도 IL-2 요법은 1일차에 18,000,000 IU/㎡, 2일차에 9,000,000 IU/㎡, 그리고 3 및 4일차에 4,500,000 IU/㎡를 포함한다.
실시양태에서, IL-2 요법은 1일, 2일, 4일, 6일, 7일, 14일 또는 21일마다 0.10mg/일 내지 50mg/일의 용량으로 페길화된 IL-2의 투여를 포함한다.
실시양태에서, IL-2 요법은 항체 백본 상에 접목된 IL-2 단편의 투여를 포함한다. 실시양태에서, IL-2 요법은 IL-2 저친화성 수용체에 결합하는 항체-사이토카인 접목된 단백질의 투여를 포함한다. 실시양태에서, IL-2 요법은 IL-2Rα 수용체에 대한 결합에 영향을 주지 않고, 알데스류킨과 비교하여, IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ 수용체에 대한 증강된 결합을 나타내는 항체-사이토카인 접목된 단백질의 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체 사이토카인 접목된 단백질은 야생형 IL-2 분자 예컨대, 비제한적으로, 알데스큐킨(Proleukin®) 또는 필적하는 분자보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.
6. 추가적인 치료 방법
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물의 치료적으로 유효한 복용양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 각각 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 및 TIL 조성물의 치료적으로 유효한 복용양을 투여하기 이전에 비-골수파괴 림프구고갈 요법이 대상자에게 투여되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 비-골수파괴 림프구고갈 요법이 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 대상체에게 TIL 세포의 투여 후 다음 날에 시작하여 고-용량 IL-2 요법으로 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 고-용량 IL-2 요법이 내성이 생길 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg을 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 고형 종양이 되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 흑색종이도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 소아 과돌연변이된 암이 되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 치료적으로 유효한 복용량의 치료적 TIL 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 치료적으로 유효한 복용량의 TIL 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물의 치료적으로 유효한 복용량을 대상체에게 투여하기 이전에 비-골수파괴 림프구고갈 요법이 대상체에게 투여되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 비-골수파괴 림프구고갈 요법이 2일 동안 60mg/㎡/일의 용량으로 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25mg/㎡/일의 용량으로 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 환자에게 TIL 세포의 투여 후 다음날부터 시작하여 고-용량 IL-2 요법으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 고-용량 IL-2 요법이 내성이 생길 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg을 포함하도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 고형 종양이 되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 흑색종이도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 과돌연변이된 암이 되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 암이 소아 과돌연변이된 암이 되도록 변형된 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 TIL 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 치료적으로 유효한 복용량의 치료적 TIL 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단의 용도를 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 치료적으로 유효한 복용량의 TIL 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물의 용도를 제공한다.
다른 실시양태에서, 발명은 비-골수파괴 림프구고갈 요법을 대상체에게 투여한 다음 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적으로 유효한 복용량의 치료적 TIL 집단 또는 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적으로 유효한 복용량의 TIL 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 상기 임의의 이전 단락에 기술된 치료적 TIL 집단 또는 상기 임의의 이전 단락에 기술된 TIL 조성물의 용도를 제공한다.
실시예
본원에 포함된 실시양태는 이제 다음 실시예를 참조하여 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고 본원에 포함된 개시내용은 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: PRE-REP 및 REP 프로세스를 위한 배지의 제조
본 실시예는 흑색종을 포함한 다양한 종양 유형으로부터 유래된 TIL의 배양을 포함하는 프로토콜에 사용하기 위한 조직 배양 배지의 제조에 대한 절차를 기술한다. 이 배지는 본 출원 및 실시예에 기술된 임의의 TIL의 제조를 위해 사용될 수 있다.
CM1의 제조. 다음 시약을 냉장 보관에서 꺼내어 37℃ 수조에서 가온했다: (RPMI1640, 인간 AB 혈청, 200mM L-글루타민). 여과하고자 하는 부피에 적합한 0.2um 필터 유닛의 상단 섹션 안으로 각각의 성분을 첨가함에 의해 아래 표 34에 따라 CM1 배지를 제조하였다. 4℃에서 보관한다.
표 34. CM1의 제조
사용 당일에, 37℃ 수조에서 필요한 양의 CM1을 사전가온하고 6000 IU/mL IL-2를 첨가했다.
추가적인 영양보충이 표 35에 따라 필요에 따라 수행될 수 있다.
표 35. 필요에 따른, CM1의 추가적인 영양보충.
CM2의 제조. 제조된 CM1을 냉장고에서 꺼내거나 신선한 CM1을 제조한다. AIM-V®를 냉장고에서 꺼내어 제조된 CM1과 동량의 AIM-V®를 멸균 배지 병에 혼합함에 의해 필요한 양의 CM2를 제조한다. 사용의 당일에 CM2 배지에 3000 IU/mL IL-2를 첨가했다. 사용의 당일에 3000 IU/mL IL-2로 충분한 양의 CM2를 만들었다. CM2 배지 병에 그 명칭, 제조자의 이니셜, 여과/제조된 날짜, 2-주 유효 일자를 라벨링하고 조직 배양에 필요할 때까지 4℃에서 보관한다.
CM3의 제조. CM3는 사용이 필요한 당일에 제조된다. CM3은 AIM-V® 배지와 동일하며 사용의 당일 3000 IU/mL IL-2가 보충되었다. IL-2 저장 용액을 AIM-V의 병이나 봉지에 직접적으로 추가함에 의해 실험 요구에 충분한 양의 CM3를 제조했다. 부드럽게 흔들어 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 후 즉시 병에 "3000 IU/mL IL-2"으로 라벨링하였다. CM3가 과잉인 경우 그것을 배지 명칭, 제조자의 이니셜, 배지가 제조된 날짜, 그 유효 일자(제조 후 7일)를 라벨링한 4℃에서의 병에 보관한다. 4℃에서 7일 보관 후 IL-2가 보충된 배지를 폐기한다.
CM4의 제조. CM4는 2mM G1utaMAX™(최종 농도)의 추가적인 보충을 갖는, CM3과 동일하였다. 1L의 CM3마다 10m1의 200mM G1utaMAX™을 추가한다. IL-2 저장 용액과 G1utaMAX™ 저장 용액을 AIM-V의 병이나 봉지에 직접적으로 추가함에 의해 실험의 요구에 충분한 양의 CM4를 제조했다. 부드럽게 흔들어 잘 혼합하였다. AIM-V에 첨가한 후 즉시 병에 "3000 IL/nil IL-2 및 G1utaMAX"로 라벨링하였다. CM4가 과잉인 경우 그것을 배지 명칭 "G1utaMAX", 및 유통 일자(제조 후 7일)를 라벨링한 4℃에서의 병에 보관한다. 4℃에서 7-일 보관 후 IL-2가 보충된 배지를 폐기한다.
실시예 2: 감마선-조사된 말초 단핵 세포의 개별 로트 적격성평가
본 실시예는 본원에 기술된 예시적인 방법에서 동종이계 배양보조 세포로 사용하기 위해 감마선-조사된 말초 단핵 세포(PBMC, 또한 단핵 세포 또는 MNC로 알려져 있음)의 개별 로트를 적격성평가하기 위한 약식 절차를 기술한다.
각각의 조사된 MNC 배양보조 로트는 개별 공여자로부터 제조되었다. 각 로트 또는 공여자는 정제된 항-CD3(클론 OKT3) 항체 및 인터루킨-2(IL-2)의 존재에서 REP에서 TIL을 확장하는 그 능력에 대해 개별적으로 스크리닝되었다. 부가하여, 배양보조 세포의 각 로트는 TIL의 첨가 없이 테스트되어 감마 방사선의 수신된 선량이 복제 불능을 만들기에 충분하였다는 것을 검증했다.
감마선-조사되고, 성장-정지된 MNC 배양보조 세포가 TIL의 REP를 위해 필요하다. 배양보조 MNC 상의 막 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체에 결합하고 REP 플라스크에서의 TIL에 가교결합하여 TIL이 확장되도록 자극하였다. 배양보조 로트는 개별 공여자로부터 채취한 전혈의 백혈구성분채집술로부터 제조되었다. 백혈구성분채집술 생성물을 Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리되고, 세정되고, 조사되고, GMP 조건 하에 냉동보관되도록 되었다.
TIL 요법을 받은 환자에게 생존가능한 배양보조 세포를 주입하지 않는 것이 중요한데 이는 이식편대숙주병(GVHD)을 초래할 수 있기 때문이다. 따라서 배양보조 세포는 세포에 감마선-조사를 가함에 의해 성장-정지되고, 그 결과 이중 가닥 DNA가 파손되고 재-배양 시 MNC 세포의 세포 생존력이 손실된다.
배양보조 로트는 2가지 기준에 대해 평가되었다: (1) 공배양에서 TIL을 >100-배 확장하는 그 능력 및 (2) 그 복제 무능력.
배양보조 로트는 직립형 T25 조직 배양 플라스크에서 성장한 2개의 주된 사전-REP TIL 계통을 활용하여 미니-REP 형식에서 테스트되었다. 배양보조 로트는, 각 TIL 계통이 REP에서의 활성화에 반응하여 증식하는 그 능력이 독특하기 때문에 2개의 별개의 TIL 계통에 대해 테스트되었다. 대조군으로서, 상기 기준을 충족하는 것으로 역사적으로 나타난 많은 조사된 MNC 배양보조 세포가 테스트 로트와 함께 실행되었다.
단일 실험에서 테스트된 모든 로트가 동등한 테스트를 받도록 보장하기 위해, 동일한 사전-REP TIL 계통의 충분한 스톡을 모든 조건과 모든 배양보조 로트를 테스트하는데 이용할 수 있었다.
테스트된 각 배양보조 세포의 로트에는 총 6개의 T25 플라스크가 있었다: 사전-REP TIL 계통 #1(2개 플라스크); 사전-REP TIL 계통 #2(2개 플라스크); 및 배양보조 대조군(2개 플라스크). TIL 계통 #1 및 #2를 함유하는 플라스크는 TIL을 확장하는 배양보조 로트의 능력을 평가했다. 배양보조 대조군 플라스크는 배양보조 로트의 복제 무능력을 평가했다.
A. 실험 프로토콜
-2/3일차, TIL 계통의 해동. CM2 배지를 제조하고 37℃ 수조에서 CM2를 가온한다. 3000 IU/mL IL-2로 보충된 CM2 40mL를 제조한다. 사용할 때까지 따뜻하게 유지한다. IL-2 없는 사전-가온된 CM2 20mL를 사용된 TIL 계통의 명칭이 표지된 각각의 2개 50mL 원뿔형 튜브 안에 넣는다. LN2 저장소로부터 2개의 지정된 사전-REP TIL 계통을 제거하고 바이알을 조직 배양실로 옮겼다. 소량의 얼음이 남을 때까지 37℃ 수조에서의 밀봉된 지퍼 보관 백 안에 바이알을 넣음에 의해 이를 해동한다.
멸균 이동 피펫을 사용하여, 각 바이알의 내용물을 제조되고 표지된 50mL 원뿔형 튜브에서의 20mL의 CM2 안으로 즉시 이동했다. IL-2 없이 CM2를 사용한 40mL로 QS하여 세포를 세정하고 400×CF에서 5분간 원심분리했다. 상청액을 흡인하고 3000 IU/mL IL-2가 보충된 따뜻한 CM2 5mL에 재현탁했다.
작은 분취액(20μL)이 자동화된 세포 계수기를 사용한 세포 계수를 위해 이중으로 제거되었다. 계수가 기록되었다. 계수하는 동안, TIL 세포를 갖는 50mL 원뿔형 튜브는 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터 안으로 배치되고, 캡이 느슨하게 되어 가스 교환이 허용되었다. 세포 농도가 측정되고, TIL은 3000 IU/mL에서의 IL-2가 보충된 CM2에서 1×106 세포/mL로 희석되었다.
미니-REP의 0일차까지 가습된 37℃ 인큐베이터에서 필요한 만큼 많은 웰에서의 24-웰 조직 배양 플레이트의 2mL/웰에서 배양되었다. 혼동과 교차-오염 가능성을 피하기 위해 다른 TIL 계통이 별도의 24-웰 조직 배양 플레이트에서 배양되었다.
0일차, 미니-REP를 시작하다. 테스트되어 지는 배양보조 로트 수만큼 충분한 CM2 배지를 제조했다. (예를 들어, 한 번에 4개 배양보조 로트를 테스트하기 위해 CM2 배지 800mL를 제조했다). 상기 제조된 CM2의 일부를 분취하고 그것에 세포의 배양을 위해 3000 IU/mL IL-2를 보충했다. (예를 들어, 한 번에 4개 배양보조 로트를 테스트하기 위해 3000 IU/mL IL-2를 갖는 CM2 배지 500mL를 제조한다).
교차-오염을 방지하기 위해 별도로 각 TIL 계통으로 작업하여, TIL 배양물을 갖는 24-웰 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 BSC로 옮겼다.
멸균 이동 피펫 또는 100-1000μL 피펫터 및 팁을 사용하여, 약 1mL의 배지를 사용되는 TIL의 각 웰에서 제거하고 24-웰 조직 배양 플레이트의 사용하지 않은 웰에 배치했다.
신선한 멸균 이동 피펫 또는 100-1000μL 피펫터 및 팁을 사용하여, 남은 배지를 웰에서의 TIL과 혼합하여 세포를 재현탁시킨 다음 세포 현탁액을 TIL 로트 명칭이 표지된 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 부피를 기록했다.
예비의 배지로 웰을 세정하고 그 부피를 동일한 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 세포를 400 × CF로 회전시켜 세포 펠렛을 수집하였다. 배지 상청액을 흡인하고, 수확된 웰의 수와 펠렛의 크기에 기반하여 사용되는 부피인, 3000 IU/mL IL-2를 함유한 CM2 배지 2-5mL에 세포 펠렛을 재현탁하였다 - 부피는 >1.3 × 106 세포/mL의 농도를 보장하도록 충분해야 한다.
혈청학적 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 완전하게 혼합하고 부피를 기록했다. 세포 계수를 위해 자동화된 세포 계수기를 사용하여 200μL를 제거했다. 계수하면서, TIL 세포가 있는 50mL 원뿔형 튜브를 가습된 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에 넣고, 캡을 느슨하게 하여 가스 교환을 허용했다. 계수를 기록했다.
인큐베이터에서 TIL 세포를 함유하는 50mL 원뿔형 튜브를 제거하고 3000IU/mL IL-2가 보충된 따뜻한 CM2에 1.3 × 106 세포/mL의 농도로 이들 세포를 재현탁시켰다. 캡을 느슨하게 하여 50mL 원뿔형 튜브를 인큐베이터에 다시 넣었다.
상기 단계는 제2 TIL 계통에 대해 반복되었다.
실험을 위해 T25 플라스크 안에 TIL을 도말하기 직전에, TIL을 아래와 같이 1.3 × 105 세포/mL의 최종 농도가 되도록 1:10으로 희석했다.
MACS GMP CD3 순수(OKT3) 작업 용액을 제조한다. 4℃ 냉장고에서 OKT3(1mg/mL)의 스톡 용액을 꺼내 BSC에 넣었다. 최종 농도 30ng/mL OKT3이 미니-REP의 배지에 사용되었다.
실험의 각 T25 플라스크에서의 20mL에 대해 600ng의 OKT3가 필요했다; 이는 각 20mL에 대해 60μL의 10μg/mL 용액 또는 각 배양보조 로트에 대해 테스트된 6개 플라스크 모두에 대해 360μL에 해당한다.
테스트된 각 배양보조 로트에 대해, 10μg/mL의 작업 농도를 위해 1mg/mL OKT3의 1:100 희석액 400μL를 만들었다(예를 들어, 한 번에 4개의 배양보조 로트를 테스트하기 위해, 1:100 희석의 1mg/mL OKT3 1600μL: 1mg/mL OKT3 16μL + 3000IU/mL IL-2를 갖는 CM2 배지 1.584mL를 만든다.)
T25 플라스크를 제조한다. 배양보조 세포을 준비하기 이전에 각 플라스크를 라벨링하고 플라스크에 CM2 배지를 충진하였다. 나머지 구성요소를 추가하기를 기다리는 동안 배지를 가온하기 위해 플라스크를 37℃ 가습된 5% CO2 인큐베이터에 배치했다. 배양보조 세포이 제조되면, 구성요소가 각 플라스크에서의 CM2에 추가된다.
표 36. 용액
배양보조 세포를 제조한다. 최소 78×106개의 배양보조 세포가 이 프로토콜에서 테스트된 로트당 필요했다. SDBB에 의해 냉동된 각 1mL 바이알은 냉동 시 100Х106개의 생존가능한 세포를 가지고 있었다. 액체 N2 저장에서 해동 시 50% 회수를 가정할 때, 각 REP에 대해 추산되는 100×106 생존가능한 세포를 제공하는 로트당 배양보조 세포의 적어도 2개의 1mL 바이알을 해동하는 것이 권장되었다. 대안적으로, 1.8mL 바이알에 공급되는 경우, 바이알 하나만으로 충분한 배양보조 세포을 제공하였다.
배양보조 세포를 해동하기 전에, IL-2가 없는 대략적으로 50mL의 CM2를 테스트되어 지는 각 배양보조 로트에 대해 사전-가온했다. 지정된 배양보조 로트 바이알을 LN2 저장소에서 꺼내어 지퍼 보관 백에 넣고 얼음 위에 두었다. 바이알을 닫힌 지퍼 보관 백 내에서 37℃ 수조에 침지함에 의해 해동했다. 바이알을 지퍼 백에서 꺼내어 70% EtOH를 뿌리거나 닦은 다음 BSC로 이동시켰다.
이동 피펫을 사용하여, 배양보조 바이알의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에서의 30mL의 따뜻한 CM2 안으로 즉시 이동시켰다. 바이알을 소량의 CM2로 세정하여 바이알에서의 임의의 잔류 세포를 제거하고 400×CF에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 흡인하고 따뜻한 CM2 4mL 플러스 3000IU/mL IL-2에 재현탁했다. 세포 계수를 위해 자동화된 세포 계수기를 사용하여 200μL를 제거했다. 계수를 기록했다.
따뜻한 CM2 플러스 3000 IU/mL IL-2에 1.3×107 세포/mL로 세포를 재현탁했다. TIL 세포를 1.3×106 세포/mL에서 1.3×105 세포/mL로 희석했다.
공배양을 설정한다. TIL 세포를 1.3×106 세포/mL에서 1.3×105 세포/mL로 희석했다. 15mL 원뿔형 튜브에 4.5mL의 CM2 배지를 추가했다. 인큐베이터에서 TIL 세포를 제거하고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 잘 재현탁했다. 1.3×106 세포/mL TIL 현탁액에서 0.5mL의 세포를 제거하고 15mL 원뿔형 튜브에서의 4.5mL의 배지에 첨가했다. TIL 스톡 바이알을 인큐베이터에 다시 넣었다. 잘 혼합했다. 제2 TIL 계통에 대해 반복했다.
인큐베이터로부터 BSC로 단일 배양보조 로트에 대해 사전-가온된 배지를 갖는 플라스크를 이동시켰다. 1mL 피펫 팁으로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 배양보조 세포를 혼합하고 그 배양보조 로트에 대한 각 플라스크에 1mL(1.3×107 세포)를 이동시켰다. 각 플라스크에 60μL의 OKT3 작업 스톡(10μg/mL)을 추가했다. 2개의 대조군 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣었다.
1mL(1.3×105)의 각 TIL 로트를 상응하게 표지된 T25 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣고 똑바로 세워서 인큐베이션했다. 5일차까지 방해하지 않았다. 테스트된 모든 배양보조 로트에 대해 이 절차를 반복했다.
5일차, 배지 변경. 3000 IU/mL IL-2를 갖는 CM2를 제조했다. 10mL가 각 플라스크에 필요하다. 10mL 피펫을 사용하여 3000IU/mL IL-2를 갖는 따뜻한 CM2 10mL를 각 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣고 7일차까지 똑바로 세워서 인큐베이션했다. 테스트된 모든 배양보조 로트에 대해 반복했다.
7일차, 수확. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 BSC로 이동시키고, 플라스크 바닥 상의 세포 층을 방해하지 않도록 주의한다. 플라스크 바닥에서 성장하는 세포를 방해함에 없이, 각각의 테스트 플라스크에서 배지 10mL를 제거하고 대조군 플라스크 각각에서 배지 15mL를 제거했다.
10mL 혈청 피펫을 사용하여, 세포를 남은 배지에 재현탁시키고 잘 혼합하여 세포의 임의의 덩어리를 부수었다. 피펫팅에 의해 세포 현탁액을 완전히 혼합한 후, 세포 계수를 위해 200μL를 제거했다. 자동 세포 계수기 장비와 연계하여 적절한 표준 조작 절차를 사용하여 TIL을 계수했다. 7일차에 계수를 기록했다. 테스트된 모든 배양보조 로트에 대해 이 절차를 반복했다.
배양보조 대조군 플라스크는 복제 무능력에 대해 평가되었고 TIL을 함유한 플라스크는 0일차부터 배수 확장에 대해 평가되었다.
7일차, 14일차까지 배양보조 대조군 플라스크의 지속. 배양보조 대조군 플라스크의 7일차 계수를 완료한 후, 3000IU/mL IL-2를 함유하는 15mL의 신선한 CM2 배지를 각각의 대조군 플라스크에 첨가하였다. 대조군 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣고 14일차까지 수직 위치에서 인큐베이션했다.
14일차, 배양보조 대조군 플라스크의 확장된 비-증식. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 BSC로 이동시키고, 플라스크 바닥 상의 세포 층을 방해하지 않도록 주의했다. 플라스크 바닥에서 성장하는 세포를 방해함이 없이, 각 대조군 플라스크에서 대략적으로 17mL의 배지를 제거했다. 5mL 혈청 피펫을 사용하여 세포를 남은 배지에 재현탁하고 잘 혼합하여 세포의 덩어리를 부수었다. 각 플라스크에 대해 부피를 기록했다.
피펫팅에 의해 세포 현탁액을 완전하게 혼합한 후, 세포 계수를 위해 200μL를 제거했다. 자동 세포 계수기 장비와 연계하여 적절한 표준 조작 절차를 사용하여 TIL을 계수하고 계수를 기록했다. 테스트된 모든 배양보조 로트에 대해 이 절차를 반복했다.
B. 결과 및 허용 기준 프로토콜
결과. 감마선 조사의 선량은 배양보조 세포 복제를 무능력하게 만드는데 충분했다. 모든 로트는 평가 기준을 충족할 것으로 예상되었고 또한 REP 배양 0일차에 비해 7일차에 남아 있는 총 생존가능한 배양보조 세포의 수가 감소한 것으로 입증되었다. 모든 배양보조 로트는 REP 배양의 7일차까지 TIL 성장의 100-배 확장의 평가 기준을 충족할 것으로 예상되었다. 배양보조 대조군 플라스크의 14일차 계수는 7일차에 나타난 비-증식 추세를 유지할 것으로 예상되었다.
허용 기준. 각 배양보조 세포의 로트에 대해 테스트된 각 복제 TIL 계통에 대해 다음 허용 기준이 충족되었다. 허용 기준은 아래 표 37에 나타난 바와 같이 2-배이었으며, 이는 본원에 제시된 방법을 사용하여 효력 검정 허용 기준과 조합될 수 있다.
표 37. 허용 기준
30ng/mL OKT3 항체 및 3000 IU/mL IL-2의 존재에서 배양될 때 MNC 배양보조 세포 복제를 무능력하게 만드는 그 충분성에 대해 방사의 선량을 평가했다. 복제 무능력은 REP의 7일차와 14일차에 자동화된 세포 계수에 의해 결정된 총 생존가능한 세포 계수(TVC)에 의해 평가되었다.
허용 기준은 총 생존가능한 세포 수가 REP의 0일차 배양에 투입된 초기 생존가능한 세포 수로부터 7일차 및 14일차에 증가하지 않았음을 의미하는 "성장 없음"이었다.
TIL 확장을 지원하는 배양보조 세포의 능력을 평가했다. TIL 성장은 REP의 0일차 배양의 개시부터 REP의 7일차까지 생존가능한 세포의 배수 확장의 관점에서 측정되었다. 7일차에 TIL 배양은 자동화된 세포 계수에 의해 평가된 바와 같이 최소 100-배 확장(즉, REP 0일차에 배양에 투입된 총 생존가능한 TIL 세포 수의 100배 초과)을 달성했다.
허용 기준을 충족하지 않는 MNC 배양보조 로트의 비상 테스트. MNC 배양보조 로트가 상기 약술된 허용 기준 중 하나를 충족하지 못하는 경우, 다음 단계가 단순한 실험자 오류를 그 원인으로 배제하기 위해 로트를 다시 테스트하기 위해 수행될 것이다.
로트의 위성 테스트 바이알이 2개 이상 남아 있으면 로트를 다시 테스트했다. 로트의 위성 테스트 바이알이 하나 남아 있거나 전혀 없으면 상기 나열된 허용 기준에 따라 로트는 실패한 것이다.
적격성으로 되기 위해, 문제의 로트와 대조군 로트는 상기 허용 기준을 달성해야 했다. 이들 기준을 충족하면 로트가 사용을 위해 출시된다.
실시예 3: 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포의 개별 로트의 적격성 평가
본 실시예는 본원에 기술된 예시적 방법에서 동종이계 배양보조 세포로 사용하기 위해 감마선-조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 개별 로트를 적격성 평가하기 위한 신규한 약식 절차를 기술한다. 본 실시예는 TIL의 임상적 로트의 생산에 사용하기 위해 조사된 PBMC 세포 로트의 평가를 위한 프로토콜을 제공한다. 각각의 조사된 PBMC 로트는 개별 공여자로부터 제조되었다. 100개 초과의 적격성 프로토콜의 경과에 걸쳐서, 모든 경우에 SDBB(San Diego Blood Bank)에서 조사된 PBMC 로트가 REP의 7일차에 TIL > 100-배를 확장하는 것으로 나타났다. 이 변형된 적격성 프로토콜은 SDBB에서 조사된 공여자 PBMC 로트에 적용하기 위해 의도되었으며 이는 그 다음 수신된 감마 방사의 선량이 이를 복제 무능력으로 만들기에 충분하였다는 것을 확인하기 위해 추가로 테스트되었다. 14일의 경과에 걸쳐 복제 무능력을 유지한 것으로 입증되면, 공여자 PBMC 로트는 TIL의 임상 로트를 생산하는데 사용할 수 있는 "적격성이 있는 것"으로 간주되었다.
감마선-조사되고 성장-정지된 PBMC는 TIL의 현행 표준 REP에 필요했다. PBMC 상의 막 수용체는 항-CD3(클론 OKT3) 항체에 결합하고 배양물에서 TIL과 가교결합하여 TIL이 확장되도록 자극한다. PBMC 로트는 개별 공여자로부터 취한 전혈의 백혈구성분채집으로부터 제조되었다. 백혈구성분채집 생성물을 Ficoll-Hypaque 상에서 원심분리하고, 세정하고, 조사하고, GMP 조건 하에 냉동보관하였다.
TIL 요법을 받은 환자에게는 생존가능한 PBMC를 주입하지 않는 것이 중요한데 이는 이식편대숙주병(GVHD)을 초래할 수 있기 때문이다. 따라서 공여자 PBMC는 세포에 감마선-조사를 가함에 의해 성장-정지되어, 이중 가닥 DNA 파괴를 초래하고 재배양 시 PBMC의 세포 생존력의 손실을 초래한다.
조사된 PBMC 로트에 대한 평가 기준은 그의 복제 무능력이었다.
배양보조 로트는 직립형 T25 조직 배양 플라스크를 사용하여 TIL과 공배양되어 지는 것처럼 미니-REP 형식에서 테스트되었다. 대조군 로트는 평가 기준을 충족하는 것으로 역사적으로 나타난 조사된 PBMC의 하나의 로트였으며, 대조군으로 실험 로트와 함께 수행되었다. 테스트된 조사된 공여자 PBMC의 각 로트에 대해, 이중 플라스크가 수행되었다.
실험 프로토콜 - 0일차. 테스트되어 지는 공여자 PBMC의 각 로트에 대해 ~90mL의 CM2 배지를 제조했다. CM2를 37℃ 수조에서 따뜻하게 유지했다. 6 × 106 IU/mL IL-2의 분취액을 해동했다. CM2 배지를 BSC에 다시 넣고 후드에 넣기 전에 70% EtOH로 닦았다. 테스트된 각 PBMC 로트에 대해, 약 60mL의 CM2를 별도의 멸균 병으로 옮겼다. 해동된 6 × 106 IU/mL 스톡 용액으로부터 IL-2를 3000 IU/mL의 최종 농도가 되도록 이 배지에 첨가하였다. 보충되지 않은 CM2와 구별하기 위해 이 병을 "CM2/IL2"(또는 이와 유사)로 라벨링하였다.
OKT3을 제조한다. 4℃ 냉장고에서 항-CD3(OKT3)의 스톡 용액을 꺼내어 BSC에 넣었다. 최종 농도 30ng/mL OKT3이 미니-REP의 배지에 사용되었다. 1mg/mL 스톡 용액으로부터 항-CD3(OKT3)의 10μg/mL 작업 용액을 제조했다. 필요할 때까지 냉장고에 두었다.
테스트된 각 PBMC 로트에 대해, 항-CD3(OKT3) 스톡의 1:100 희석 150μL를 제조한다. 예를 들어, 한 번에 4개 PBMC 로트를 테스트하기 위해, 3000 IU/mL IL-2가 보충된 594μl의 CM2에 6μL의 1mg/mL 스톡 용액을 추가함에 의해 600μl의 10μg/mL 항-CD3(OKT3)을 제조한다.
플라스크를 제조한다. 라벨링된 T25 플라스크에 CM2/IL-2의 플라스크당 19mL를 추가하고 세포를 제조하는 동안 플라스크를 37℃, 가습된, 5% CO2 인큐베이터에 두었다.
조사된 PBMC를 제조한다. LN2 저장소로부터 테스트되어 지는 PBMC 로트의 바이알을 회수했다. 이들을 해동하기 이전에 -80℃에 두거나 드라이아이스 상에 유지했다. 해동되어 지는 각 로트에 대해 30mL의 CM2(IL-2 보충 없음)를 50mL 원뿔형 튜브 안에 넣었다. 해동되어 지는 PBMC의 서로 다른 로트 번호를 각 튜브에 라벨링했다. 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 사용하기 이전에 37℃ 수조에 둔다. 필요에 따라 50mL 원뿔형 튜브를 BSC에 다시 넣고 후드에 넣기 이전에 70% EtOH로 닦았다.
냉장 저장고로부터 바이알 PBMC를 꺼내고 37℃ 수조에서의 부동 튜브 랙에 넣어 해동했다. 바이알에 소량의 얼음이 남을 때까지 해동이 진행되도록 허용한다. 멸균 이송 피펫을 사용하여, 바이알의 내용물을 즉시 50mL 원뿔형 튜브에서의 30mL CM2 안으로 이동시켰다. 튜브로부터 약 1mL의 배지를 꺼내어 바이알을 헹구었다; 50mL 원뿔형 튜브에 헹굼물을 다시 넣었다. 뚜껑을 단단하게 닫고 부드럽게 휘저어 세포를 세정한다.
실온에서 5분 동안 400 × g로 원심분리했다. 상청액을 흡인하고 1000μL 피펫 팁을 사용하여 따뜻한 CM2/IL-2 1mL에 세포 펠렛을 재현탁하였다. 대안적으로, 배지를 추가하기 이전에 빈 튜브 랙을 따라 뚜껑이 덮인 튜브를 드래그하여 세포 펠렛을 재현탁하였다. 세포 펠렛을 재현탁한 후, CM2/IL-2 배지를 사용하여 부피를 4mL로 하였다. 부피를 기록하였다.
세포 계수를 위해 자동화된 세포 계수기를 사용하여 작은 분취액(예를 들어, 100μL)을 꺼냈다. 특정 자동화된 세포 계수기 SOP에 따라 중복하여 계수를 수행했다. 세포 수를 계산하기 이전에 PBMC의 희석을 수행하는 것이 필요할 가능성이 높다. 권장되는 시작 희석 비율은 1:10이었지만 이는 사용된 세포 계수기의 유형에 따라 달라졌다. 계수를 기록했다.
CM2/IL-2 배지를 사용하여 PBMC의 농도를 1.3×107 세포/mL로 조정했다. 부드럽게 휘젓거나 혈청 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 흡인함에 의해 잘 혼합하였다.
배양 플라스크를 설정한다. 2개의 라벨링된 T25 플라스크를 조직 배양 인큐베이터로부터 BSC에 다시 넣었다. 10μg/mL 항-CD3/OKT3 바이알을 BSC에 다시 넣었다. 각 플라스크에 1.3×107 PBMC 세포 현탁액 1mL를 첨가했다. 각 플라스크에 10μg/mL 항-CD3/OKT3 60μL를 첨가했다. 방해 없이 14일의 성장을 위해 뚜껑이 닫힌 플라스크를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣었다. 다음 로트에 필요할 때까지 항-CD3/OKT3 바이알을 냉장고 안에 두었다. 평가되어 지는 PBMC의 각 로트에 대해 반복했다.
14일차, PBMC의 비-증식의 측정. 이중 T25 플라스크를 BSC에 다시 넣었다. 각 플라스크에 대해, 신선한 10mL 혈청 피펫을 사용하여 각각의 플라스크로부터 ~17mL를 꺼낸 다음 나머지 배지를 조심스럽게 끌어 올려 플라스크에 남아 있는 부피를 측정했다. 부피를 기록했다.
동일한 혈청 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅함에 의해 샘플을 잘 혼합했다.
계수를 위해 각 플라스크에서 200μL 샘플을 꺼냈다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수했다. 평가 중인 각 PBMC의 로트에 대해 각 단계를 반복한다.
결과. 감마선 조사의 선량은 배양보조 세포 복제를 무능력하게 만드는데 충분할 것으로 예상되었다. 모든 로트는 평가 기준을 충족할 것으로 예상되었으며, 이는 0일차에 비해 REP 배양의 14일차에 남아 있는 총 생존가능한 배양보조 세포의 수에서의 감소를 입증하였다.
허용 기준. 테스트된 각 조사된 공여자 PBMC 로트에 대해 다음 허용 기준이 충족되었다: "성장 없음" - 14일차에서 총 생존가능한 세포의 수가 REP의 0일차에서 배양에 투입된 초기 생존가능한 세포 수보다 적음을 의미한다.
허용 기준을 충족하지 않는 MNC 배양보조 로트의 비상 테스트. 조사된 공여자 PBMC 로트가 상기 허용 기준을 충족하지 못하는 경우, 다음 단계가 단순한 실험자 오류를 그 실패의 원인으로 배제하기 위해 로트를 다시 테스트하기 위해 수행되었다. 로트의 위성 바이알이 2개 이상 남아 있으면 로트를 다시 테스트했다. 로트의 위성 바이알이 하나 남아 있거나 전혀 없으면 상기 허용 기준에 따라 로트는 실패한 것이다.
적격성으로 되기 위해, 비상 테스트를 거치는 PBMC 로트는 대조군 로트와 문제의 로트의 두 복제물 모두가 허용 기준을 달성하도록 했다. 이 기준을 충족하면 로트는 사용을 위해 출시되었다.
실시예 4: IL-2 스톡 용액의 제조
본 실시예는 정제되고 동결건조된 재조합 인간 인터루킨-2를 rhIL-2를 사용하는 것을 포함하는 것들을 포함하여, 본 출원 및 실시예에 기술된 모든 것을 포함하여 추가 조직 배양 프로토콜에 사용하기에 적합한 스톡 샘플 안으로 용해시키는 과정을 기술한다.
절차. 0.2% 아세트산 용액(HAc)을 제조했다. 29mL 멸균수를 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 50mL 원뿔형 튜브에 1mL 1N 아세트산을 첨가했다. 튜브를 2-3회 뒤집어 잘 혼합하였다. Steriflip 필터를 사용한 여과에 의해 HAc 용액을 멸균했다.
PBS에 1% HSA를 제조한다. 150mL 멸균 필터 장치에서의 96mL PBS에 25% HSA 스톡 용액 4mL를 추가했다. 용액을 여과했다. 4℃에서 보관했다. 제조된 각 rhIL-2의 바이알에 대해 양식을 작성한다.
rhIL-2 저장 용액(6×106 IU/mL 최종 농도)을 제조했다. rhIL-2의 각 로트는 서로 달랐고, 1) 바이알당 rhIL-2의 질량(mg), 2) rhIL-2의 비활성(IU/mg) 및 3) 권장된 0.2% HAc 재구성 부피(mL)와 같은, 제조업체의 분석 인증서(COA)에서 발견된 정보가 필요했다.
아래 방정식을 사용하여 rhIL-2 로트에 필요한 1% HSA의 부피를 계산했다:
예를 들어, rhIL-2 로트 10200121(Cellgenix)의 COA에 따르면, 1mg 바이알에 대한 비활성은 25×106 IU/mg이다. 2mL 0.2% HAc에서 rhIL-2를 재구성하는 것이 권장된다.
IL-2 바이알의 고무 마개를 알코올 천으로 닦았다. 3mL 주사기에 부착된 16G 바늘을 사용하여 권장된 부피 0.2% HAc를 바이알 안에 주입했다. 바늘을 빼낼 때 마개가 빠지지 않도록 주의한다. 바이알을 3회 뒤집고 모든 분말이 용해될 때까지 휘젓는다. 마개를 조심스럽게 제거하고 알코올 천 위에 따로 둔다. 계산된 부피의 1% HSA를 바이알에 추가했다.
rhIL-2 용액의 보관: 단기 보관(<72시간)의 경우, 바이알을 4℃에서 보관한다. 장기 보관(>72시간)의 경우, 바이알을 더 작은 용량으로 분취하고 사용 준비가 될 때까지 -20℃의 극저온 바이알에 보관한다. 동결/해동 주기를 피했다. 제조의 일자 후 6개월에 유효기간이 만료했다. RhIL-2 라벨에는 공급업체 및 카탈로그 번호, 로트 번호, 만료 일자, 작업자 이니셜, 농도 및 분취액의 부피가 포함되었다.
실시예 5: 동결보존 과정
본 실시예는 CryoMed Controlled Rate Freezer, 모델 7454(Thermo Scientific)를 사용하여 본원에 기술된 절차로 제조된 TIL에 대한 동결보존 과정 방법을 기술한다.
사용된 장비는 다음과 같다: 알루미늄 카세트 홀더 랙(CS750 냉동고 백과 호환가능), 750mL 백용 동결 보관 카세트, 저압(22psi) 액체 질소 탱크, 냉장고, 열전대 센서(백용 리본 유형), 및 CryoStore CS750 동결 백(OriGen Scientific).
동결 과정은 핵 생성부터 -20℃까지 0.5℃ 속도와 -80℃ 최종 온도까지 분당 1℃의 냉각 속도를 제공한다. 프로그램 매개변수는 다음과 같다: 단계 1 - 4℃에서 대기; 단계 2: -4℃까지 1.0℃/분(샘플 온도); 단계 3: -45℃까지 20.0℃/분(챔버 온도); 단계 4: -10.0℃까지 10.0℃/분(챔버 온도); 단계 5: -20℃까지 0.5℃/분(챔버 온도); 단계 6: -80℃까지 1.0℃/분(샘플 온도).
실시예 6: GEN 2 및 GEN 3 예시적인 과정
본 실시예는 Gen 2 및 Gen 3 과정을 입증한다. 과정 Gen 2 및 Gen 3 TIL은 일반적으로 종양의 외과적 절제를 통해 개별 환자로부터 유래된 다음 생체외 확장된 자가조직의 TIL로 구성된다. Gen 3 과정의 프라이밍 1차 확장 단계는 방사선 조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 스캐폴드 상에 T 세포 공동-수용체 CD3을 표적화하는 단클론성 항체 OKT3과 인터루킨-2(IL-2)의 존재에서의 세포 배양이었다. 예시적인 Gen 2 과정은 미국 특허 번호 11,083,752 및 11,168,304에 기술되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함되어 있고, 여기서 그 개시내용은 PBMC를 본원의 다른 곳에 기술된 aAPC 또는 항원 제시 세포, 예컨대 선택적으로 유전적으로 변형되고 선택적으로 방사선 조사된 Thp1 또는 U937 세포로 대체하도록 변형될 수 있다.
Gen 2 TIL 생성물의 제조는 1) 사전-급속 확장(Pre-REP) 및 2) 급속 확장 프로토콜(REP)인 두 단계로 구성된다. Pre-REP 동안 절제된 종양은 11일의 기간 동안 혈청-함유 배양 배지(보충된 10% HuSAB를 함유하는 RPMI 1640 배지) 및 6,000 IU/mL의 인터루킨-2(IL-2)로 배양된 각 치수가 2-3mm인 ≤50 단편으로 절단되었다. 11일차에 TIL을 수확하고 대규모 2차 REP 확장에 도입했다. REP는 5일 동안 3000 IU/mL의 rhIL-2가 보충된 5L 부피의 CM2에 150μg의 단클론성 항-CD3 항체(OKT3)가 장입된 5×109 조사된 동종이계 PBMC 배양보조 세포(또는 본원의 다른 곳에 기술된 aAPC 또는 항원-제시 세포, 예컨대 선택적으로 유전적으로 변형되고 선택적으로 조사된 Thp1 또는 U937 세포)의 공배양에서 사전-REP로부터 ≤200×106의 생존가능한 세포의 활성화로 구성된다. 16일차에 배양물은 부피가 90% 감소하고 세포 분획을 ≥1×109 생존가능한 림프구/플라스크로 다중 G-Rex-500 플라스크로 분할하고 CM4를 사용한 5L로 QS한다. TIL은 추가적인 6일 동안 인큐베이션된다. REP는 22일차에 수확되고, 세정되고, 제형화되고, 주입을 위해 -150℃에서 임상 현장으로 배송되기 전에 동결-보존된다.
Gen 3 TIL 생성물의 제조는 3가지 단계로 구성된다: 1) 프라이밍 1차 확장 프로토콜, 2) 급속 2차 확장 프로토콜(급속 확장 단계 또는 REP로도 지칭됨), 및 3) 계대배양 분할. 프라이밍 1차 확장 TIL 전파를 수행하기 위해, 절제된 종양을 각 치수가 2-3mm인 ≤120 단편으로 절단했다. 프라이밍 1차 확장의 0일차에, OKT-3이 장입된 대략적으로 2.5×108 동종이계 조사된 PBMC 배양보조 세포의 배양보조 층이 3 100 MCS 용기의 각각에서 대략적으로 100㎠의 표면적 상에 확립되었다. 종양 단편을 각각 500mL 혈청-함유 CM1 배양 배지 및 6,000 IU/mL의 인터루킨-2(IL-2) 및 15ug OKT-3을 갖는 3 100 MCS 용기에 분배하고 7일의 기간 동안 배양했다. 7일차에, REP는 OKT-3가 장입된 대략적으로 5×108 동종이계 조사된 PBMC 배양보조 세포의 추가 배양보조 세포 층을 3개의 100 MCS 용기의 각각에 종양 단편화된 배양 단계에 통합하고 500mL CM2 배양 배지 및 6,000 IU/mL IL-2와 30μg OKT-3과 함께 배양함에 의해 개시되었다. REP 개시는 OKT3 장입된 배양보조 세포의 100MCS 용기 안으로의 폐쇄 시스템 유체 전달을 사용하여 동일한 용기에서 전체 프라이밍 1차 확장 배양을 활성화함에 의해 증강되었다. Gen 3의 경우, TIL 확장 또는 분할에는 전체 세포 배양물이 폐쇄 시스템 유체 전달을 통해 더 큰 용기로 확장되고 이동(100M 플라스크에서 500M 플라스크로)되고 추가적인 4L의 CM4 배지가 추가되는 과정 단계가 포함되었다. REP 세포는 16일차에 수확되고, 세정되고, 제형화되고, 주입을 위해 -150℃에서 임상 현장으로 운송하기 이전에 동결-보존되었다. PBMC 대신에, 본원의 다른 곳에 기술된 aAPC 또는 항원 제시 세포, 예컨대 선택적으로 유전적으로 변형되고 선택적으로 조사된 Thp1 또는 U937 세포가 이용될 수 있다.
전반적으로, Gen 3 과정은 견고한 제조 및 과정 비교가능성에 적합하도록 수용할 수 있는 더 짧고, 더 확장가능하고, 쉽게 변형가능한 확장 플랫폼이다.
표 38. 예시적인 Gen 2 및 예시적인 Gen 3 제조 과정의 비교.
0일차에, 두 과정 모두에 대해, 종양을 3회 세정하고 단편을 무작위화하고 2개의 풀로 분할하였다; 과정당 하나의 풀. Gen 2 과정의 경우, 단편을 6,000 IU/mL rhIL-2를 함유한 CM1 배지 1L를 갖는 하나의 -GREX 100MCS 플라스크로 이동시켰다. Gen 3 과정의 경우, 단편을 6,000 IU/mL rhIL-2, 15ug OKT-3 및 2.5×108 배양보조 세포를 함유한 CM1 500mL를 갖는 하나의 G-Rex 100MCS 플라스크로 이동시켰다. Rep 개시일에 대한 TIL의 접종은 각 과정에 따라 다른 날에 발생했다. G-Rex 100MCS 플라스크의 부피가 90% 감소된 Gen 2 과정의 경우, 수집된 세포 현탁액을 새로운 G-Rex 500MCS로 이동시켜 IL-2(3000 IU/mL), 플러스 5×109 배양보조 세포 및 OKT-3(30ng/mL)을 함유하는 CM2 배지에서 11일차에 REP 개시를 시작하였다. 세포를 확장하고 프로토콜당 IL-2(3000 IU/mL)를 갖는 CM4 배지를 갖는 다중 G-Rex 500 MCS 플라스크 안으로 16일차에 분할했다. 그런 다음 배양물을 프로토콜에 따라 22일차에 수확하고 동결보존했다. Gen 3 과정의 경우, REP 개시는 7일차에 발생했으며, 여기서 동일한 G-Rex 100MCS가 REP 개시에 사용되었다. 간략하게 설명하면, IL-2(6000 IU/mL) 및 30ug OKT-3을 갖는 5×108 배양보조 세포를 함유한 500mL의 CM2 배지를 각 플라스크에 첨가했다. 9-11일차에 배양 규모를 확대했다. 전체 부피의 G-Rex 100M(1L)을 G-Rex 500MCS로 옮기고 IL-2(3000 IU/mL)를 함유한 CM4 4L를 첨가했다. 플라스크를 5일 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 16일차에 수확하고 동결보존했다.
3개의 다른 종양, 즉 2개의 폐 종양(L4054 및 L4055)과 1개의 흑색종 종양(M1085T)이 비교에 포함되었다.
CM1(배양 배지 1), CM2(배양 배지 2) 및 CM4(배양 배지 4) 배지를 미리 제조하고 L4054 및 L4055에 대해 4℃에서 유지했다. CM1 및 CM2 배지는 여과 없이 제조되어 배지의 여과 유무에 따른 세포 성장을 비교했다.
REP 개시 및 규모 확대 시 L4055 종양에 대해 배지를 미리 최대 24시간 37℃에서 가온했다.
결과. Gen 3 결과는 달성된 총 생존가능한 세포에 대해 Gen 2의 30% 이내로 떨어졌다. Gen 3 최종 생성물은 재자극 후 더 높은 IFN-γ의 생산을 나타냈다. Gen 3 최종 생성물은 존재하는 총 고유 CDR3 서열에 의해 측정된 바와 같이 증가된 클론 다양성을 나타냈다. Gen 3 최종 생성물은 더 긴 평균 텔로미어 길이를 나타냈다.
Gen 2 및 Gen 3 과정에 대한 사전-REP 및 REP 확장은 상기에 기술된 절차를 따랐다. 각 종양에 대해 2개의 풀은 동일한 수의 단편을 함유했다. 종양의 작은 크기이 기인하여, 플라스크당 단편의 최대 수에 도달하지 못했다. 총 사전-REP 세포(TVC)를 수확하여 Gen 2 과정에 대해 11일차에, Gen 3 과정에 대해 7일차에 계수했다. 2개의 사전-REP 아암을 비교하기 위해, 세포 계수를 배양에 제공된 단편의 수에 걸쳐서 나누어 단편당 생존가능한 세포의 평균을 계산했다. 아래 표 39에 표시된 바와 같이, Gen 2 과정은 Gen 3 과정에 비해 단편당 더 많은 세포를 지속적으로 성장시켰다. TVC의 수의 외삽된 계산이 11일차에 Gen 3 과정에 대해 예상되었으며, 이는 사전-REP TVC를 7로 나눈 다음 11을 곱하여 계산되었다.
표 39. 사전-REP 세포 계수
* L4055, 여과되지 않은 배지.
Gen 2 및 Gen 3 과정의 경우, TVC는 과정 조건별로 계수되고 과정의 각 일자에 대해 생존가능한 세포 퍼센트가 생성되었다. 수확 시, 22일차(Gen 2) 및 16일차(Gen 3) 세포를 수집하고 TVC 계수를 설정했다. 그런 다음 TVC를 0일차에 제공된 단편의 수로 나누어 단편당 생존가능한 세포의 평균을 계산했다. 배수 확장은 REP 개시 TVC에 걸쳐서 이로 수확 TVC를 나누어 계산했다. 표 40에 나타난 바와 같이, Gen 2와 Gen 3을 비교하면, 배수 확장은 L4054에 대해 유사했지만; L4055의 경우에, Gen 2 과정에서 배수 확장이 더 높았다. 특히 이 경우에, 배지는 REP 개시일 24일 전에 가온되었다. M1085T의 경우 Gen 3에서도 더 높은 배수 확장이 관찰되었다. TVC의 수의 외삽된 계산이 22일차에 Gen 3 과정에 대해 예상되었으며, 이는 REP TVC를 16으로 나눈 다음 22를 곱하여 계산되었다.
표 40. TIL 최종 생성물에 대한 총 생존가능한 세포 계수 및 배수 확장
* L4055, 여과되지 않은 배지.
수확 시, 최종 TIL REP 생성물을 생존율 %에 대한 방출 기준에 대해 비교했다. Gen 2 및 Gen 3 과정에 대한 조건의 모두가 70% 생존율 기준을 초과했고 과정 및 종양에 걸쳐서 비교가능했다.
표 41. REP의 생존율 %(TIL 최종 생성물).
플라스크당 단편 수가 최대 요구 수보다 낮음에 기인하여, 수확 일에서 추정된 세포 계수를 각 종양에 대해 계산했다. 평가는 임상적 종양이 0일차에 2 또는 3개 플라스크를 접종하기에 충분히 크다는 예상에 근거한 것이다.
표 42. Gen 3 과정에 대한 전체 규모(2 및 3개 플라스크)에 대해 외삽된 추정된 세포 계수 계산.
면역표현형검사 - TIL 최종 생성물에 대한 표현형 마커 비교. 3개의 종양 L4054, L4055 및 M1085T는 Gen 2 및 Gen 3 과정 둘 모두에서 TIL 확장을 겪었다. 수확 시, REP TIL 최종 생성물이 유세포 분석을 받아 순도, 분화 및 기억 마커를 테스트했다. 모든 조건에 대해 TCR a/b+ 세포의 백분율은 90% 이상이었다.
Gen 3 과정로부터 수확된 TIL은 Gen 2 과정에서 수확된 TIL에 비해 CD8 및 CD28의 더 높은 발현을 나타냈다. Gen 2 과정은 CD4+의 더 높은 백분율을 나타냈다.
Gen 3 과정로부터 수확된 TIL은 Gen 2 과정로부터의 TIL과 비교하여 중앙 메모리 구획에서 더 높은 발현을 나타냈다.
활성화 및 고갈 마커를 Gen 2 및 Gen 3 TIL 확장 과정으로부터의 최종 TIL 생성물을 비교하기 위해 2개의 종양 L4054 및 L4055로부터 TIL에서 분석했다. 활성화 및 고갈 마커는 Gen 2 과정와 Gen 3 과정 간에 필적할만했다.
재자극 시 인터페론 감마 분비. 수확일인, Gen 2의 경우 22일차 및 Gen 3의 경우 16일차에, TIL은 L4054 및 L4055에 대해 코팅된 항-CD3 플레이트로 밤새 재자극을 거쳤다. M1085T에 대한 재자극은 항-CD3, CD28 및 CD137 비드를 사용하여 수행되었다. 상청액을 모든 조건에서 재자극 24시간 후에 수집하고 상청액을 동결시켰다. ELISA에 의한 IFN-γ 분석은 동일한 ELISA 플레이트를 사용하여 동시에 두 과정 모두로부터의 상청액에 대해 평가되었다. Gen 3 과정으로부터 IFN-γ의 더 높은 생산이 분석된 3개의 종양에서 관찰되었다.
배양 배지에서 IL-2 수준의 측정. Gen 2와 Gen 3 과정 간의 IL-2 소비를 비교하기 위해, 세포 상청액을 종양 L4054 및 L4055에서 REP 개시, 규모 확대 및 수확일에 수집했다. 세포 배양 상청액에서 IL-2의 양은 R&D로부터 Quantitate ELISA Kit에 의해 측정되었다. 일반적인 경향은 Gen 2 과정과 비교할 때 Gen 3 과정에서 IL-2 농도가 더 높게 유지된다는 것을 나타낸다. 이는 과정 전반에 걸쳐 배지의 이월과 커플링된 Gen 3에 대한 REP 개시 시 더 높은 농도의 IL-2(6000 IU/mL)에 기인하기 때문인 것 같다.
대사 기질 및 대사산물 분석. D-글루코스 및 L-글루타민과 같은 대사 기질의 수준은 전반적인 배지 소비의 대용으로 측정되었다. 유산과 암모니아와 같은 상호적인 대사산물이 측정되었다. 글루코스는 ATP 형태의 에너지를 생산하기 위해 미토콘드리아에서 활용되는 배지에서의 단순한 당이다. 글루코스가 산화되면 유산이 생성된다(락테이트는 유산의 에스테르이다). 락테이트는 세포의 대수증식 성장 단계 동안 강력하게 생성된다. 높은 수준의 락테이트는 세포 배양 과정에 부정적인 영향을 미친다.
L4054 및 L4055에 대한 소비된 배지는 과정 Gen 2 및 Gen 3 둘 모두에 대해 REP 개시, 규모 확대 및 수확일에 수집되었다. 소비된 배지 수집은 Gen 2에 대해 11일차, 16일차 및 22일차에 이루어졌으며; Gen 3에 대해 7일차, 11일차 및 16일차에 이루어졌다. 상청액은 CEDEX 바이오-분석기에서 글루코스, 유산, 글루타민, GlutaMax 및 암모니아의 농도에 대해 분석되었다.
L-글루타민은 세포 배양 배지 제형에 필요한 불안정한 필수 아미노산이다. 글루타민은 아민을 함유하고, 이 아미드 구조 기는 질소를 세포로 운반하고 전달할 수 있다. L-글루타민이 산화될 때, 독성 암모니아 부산물이 세포에 의해 생성된다. L-글루타민의 분해를 막기 위해 Gen 2 및 Gen 3 과정용 배지에 Glutamax가 보충되었는데, 이는 수성 용액에서 더 안정하고 자발적으로 분해되지 않는다. 두 종양 계통에서 Gen 3 아암은 과정 동안 L-글루타민과 Glutamax가 감소하고 REP 전반에 걸쳐서 암모니아가 증가한 것으로 나타났다. Gen 2 아암에서는 L-글루타민과 Glutamax의 농도가 일정했고 암모니아 생산량이 약간 증가한 것으로 관찰되었다. Gen 2 및 Gen 3 과정은 수확일에 암모니아에 대해 유사했고 L-글루타민 분해에서 약간의 차이를 보였다.
텔로미어는 Flow-FISH에 의해 반복된다. Flow-FISH 기술은 Gen 2 및 Gen 3 과정 하에서 L4054 및 L4055에 대한 텔로미어 반복의 평균 길이를 측정하는데 사용되었다. 상대 텔로미어 길이(RTL)의 결정은 DAKO로부터 유세포 분석용 텔로미어 PNA 키트/FITC를 사용하여 계산되었다. Gen 3은 Gen 2와 필적하는 텔로미어 길이를 나타냈다.
CD3 분석. 각 과정에서 생성된 세포 생성물의 클론 다양성을 결정하기 위해, L4054 및 L4055에 대해 수확된 TIL 최종 산물이 샘플링되고 T 세포 수용체의 CDR3 부분의 서열분석을 통해 클론 다양성 분석을 위해 검정되었다.
표 43은 TIL 수확된 세포 생성물에서 L4054에 대해 공유된 고유 CDR3 서열 백분율의 Gen 2와 Gen 3 간의 비교를 보여준다. 199개 서열이 Gen 3과 Gen 2 최종 생성물 간에 공유되며, 이는 Gen 3 최종 생성물과 공유되는 Gen 2로부터의 고유한 CDR3 서열 중 상위 80% 중 97.07%에 해당한다.
표 43. L4054에 대한 Gen 2와 Gen 3 과정 간의 공유된 uCDR3 서열의 비교.
표 44는 TIL 수확된 세포 생성물에서 L4055에 대해 공유된 고유 CDR3 서열 백분율의 Gen 2와 Gen 3 간의 비교를 보여준다. 1833개 서열은 Gen 3과 Gen 2 최종 생성물 간에 공유되며, 이는 Gen 3 최종 생성물과 공유되는 Gen 2로부터의 고유한 CDR3 서열 중 상위 80% 중 99.45%에 해당한다.
표 44. L4055에 대한 Gen 2와 Gen 3 과정 간의 공유된 uCDR3 서열의 비교.
CM1 및 CM2 배지를 여과 없이 미리 제조하고 Gen 2 및 Gen 3 과정에 사용하기 위해 종양 L4055에 사용할 때까지 4도씨에서 유지했다.
배지를 Gen 2 및 Gen 3 과정에 대한 REP 개시일에 종양 L4055에 대해 24시간 전에 37도씨에서 가온했다.
LDH는 과정에서 수집된 상청액에서 측정되지 않았다.
M1085T TIL 세포 계수는 K2 셀로미터 세포 계수기로 실행되었다.
종양 M1085T에 대해, 대사 분석을 위한 상청액, 활성화 및 고갈 마커 분석을 위한 TIL 생성물, 텔로미어 길이 및 CD3 - TCR vb 분석과 같은 샘플이 이용가능하지 않았다.
결론. 이 실시예는 기능적 품질 속성, 플러스 Gen 2 및 Gen 3 과정 중에 확장된 표현형 특성화 및 배지 소비의 관점에서 3개의 독립적인 공여자 종양 조직을 비교한다.
Gen 2 및 Gen 3 사전-REP 및 REP 확장 비교가 생성된 전체 생존가능한 세포 및 전체 유핵화된 세포 집단의 생존율의 관점에서 평가되었다. 수확일에서 TVC 세포 용량은 Gen 2(22일)와 Gen 3(16일) 간에 필적할만하지 않았다. Gen 3 세포 용량은 수확 시 수집된 전체 생존가능한 세포의 대략 40%로 Gen 2보다 낮았다.
사전-REP 수확이 7일차 대신 11일차에 발생하고 REP 수확이 16일차 대신 22일차에 발생했다고 가정하여 Gen 3 과정에 대해 외삽된 세포 수를 계산했다. 두 경우 모두에서, Gen 3은 TVC에서 Gen 2 과정과 비교하여 더 가까운 숫자를 나타내어, 조기 활성화를 통해 TIL 성장에 대한 전반적인 성능이 향상될 수 있음을 나타낸다.
Gen 3 과정에서 여분의 플라스크(2 또는 3)에 대한 외삽된 값의 경우에 처리된 종양의 크기가 더 크고 기술된 바와 같이 과정당 필요한 최대 단편의 수에 도달한다고 가정한다. 22일차에 Gen 2 과정과 비교하여 Gen 3 과정의 경우 16일차 수확에서 TVC에서 유사한 용량에 도달가능할 수 있는 것이 관찰되었다. 이 관찰은 중요하고 배양의 조기 활성화가 더 적은 처리 시간에서 더 나은 TIL의 성능을 허용할 수 있음을 나타낸다.
Gen 2 및 Gen 3 사전-REP 및 REP 확장 비교가 생성된 전체 생존가능한 세포 및 전체 유핵화된 세포 집단의 생존율의 측면에서 평가되었다. 수확일에서 TVC 세포 용량은 Gen 2(22일)와 Gen 3(16일) 간에 필적할만하지 않았다. Gen 3 세포 용량은 수확 시 수집된 전체 생존가능한 세포의 대략 40%로 Gen 2보다 낮았다.
표현형 특성화의 관점에서, Gen 2 과정과 비교하여 Gen 3 과정에서 3개의 종양에서 더 높은 CD8+ 및 CD28+ 발현이 관찰되었다. 이 데이터는 Gen 3 과정이 Gen 2에 비해 최종 TIL 생성물의 개선된 속성을 가짐을 나타낸다.
Gen 3 과정은 Gen 2 과정에 비해 약간 더 높은 중앙 메모리 구획을 나타냈다.
Gen 2 과정와 Gen 3 과정은 Gen 3 과정의 더 짧은 기간에도 불구하고 필적할만한 활성화 및 고갈 마커를 보여주었다.
IFN 감마(IFN-γ) 생산은 분석된 3개 종양에서 Gen 2에 비해 Gen 3 최종 생성물에서 3배 더 높았다. 이 데이터는 Gen 3 과정이 가능하기로는 Gen 3에서 CD8 및 CD28 발현의 더 높은 발현에 기인하여, Gen 2 과정과 비교하여 고도로 기능적이고 더 강력한 TIL 생성물을 생성했음을 나타낸다. 표현형 특성화는 Gen 2 과정과 비교한 3개 종양에서의 CD8+, CD28+ 발현에 대한 Gen 3에서의 긍정적인 경향을 제안했다.
Gen 2와 Gen 3 사이의 TIL 최종 생성물에 대한 텔로미어 길이는 필적할만했다.
글루코스 및 락테이트 수준은 Gen 2와 Gen 3 최종 생성물 간에 필적할만했으며, 이는 Gen 3 과정의 배지에서 영양분의 수준이 Gen 2에 비해 과정의 각 일자에서 부피 감소 제거의 비-실행 및 과정에서 전반에 걸쳐 보다 낮은 부피 배지에 기인하여 영향을 받지 않았음을 시사하다.
전반적인 Gen 3 과정은 Gen 2 과정에 비해 처리 시간이 거의 2배 감소한 것으로 나타났으며, 이는 Gen 3 과정에 의해 확장된 TIL 생성물에 대한 상품의 비용(COG)에 대한 실질적인 감소를 가져올 것이다.
IL-2 소비는 Gen 2 과정에서 IL-2 소비의 일반적인 경향을 나타내고, Gen 3 과정에서는 IL-2가 기존 배지의 비-제거로 인해 더 높았다.
Gen 3 과정은 CDR3 TCRab 서열 분석에 의해 측정된 더 높은 클론 다양성을 나타냈다.
사전-REP의 0일차에 배양보조 및 OKT-3의 첨가는 TIL의 조기 활성화 및 Gen 3 과정을 사용한 전반적인 양호한 성장 TIL 수행성을 허용했다.
표 45는 현행 Gen 2 과정과 비교하여 Gen 3 과정에 대한 다양한 실시양태 및 결과를 기술한다.
표 45. 예시적인 Gen 3 과정 특징
실시예 7: 0일차에서 Gen 3 확장 과정의 예시적인 실시양태
종양 세정 배지를 제조했다. 시작하기 이전에 배지를 가온했다. HBSS의 500mL 병에 겐타마이신(50mg/mL) 5mL를 추가했다. OKT3 희석에 사용되어 지는 15mL 원뿔형에 5mL의 종양 세정 배지를 추가했다. 실온(RT)에 보관한다.
준비된 배양보조 세포(PBMC) 백. 배양보조 세포를 배양보조 세포 백으로 멸균하여 옮기고 사용할 때까지 37℃에서 보관하거나 동결한다. 37℃인 경우 배양보조 세포를 계수한다. 해동한 다음 동결된 경우 배양보조 세포를 계수한다. PBMC 대신에, aAPC 또는 본원의 다른 곳에 기술된 항원 제시 세포, 예컨대 선택적으로 유전적으로 변형되고 선택적으로 조사된 Thp1 또는 U937 세포가 이용될 수 있다.
배양보조 세포 농도에 대한 최적 범위는 5×104 내지 5×106 세포/mL이다. 4.5mL의 AIM-V를 갖는 4개의 원뿔형 튜브를 준비했다. 각 세포 계수에 대해 0.5mL의 세포 분획을 추가했다.
총 생존가능한 배양보조 세포 수가 ≥1×109 세포인 경우, 배양보조 세포 농도를 조정하기 위해 다음 단계로 진행되었다. 제2 배양보조 세포 백에 1×109 세포를 추가하기 위해 제1 배양보조 세포 백에서 제거할 배양보조 세포의 부피를 계산했다.
p1000 마이크로피펫을 사용하여, 900μL의 종양 세정 배지를 OKT3 분취액(100μL)으로 이동시켰다. 주사기와 멸균 기술을 사용하여, OKT3 0.6mL를 채취하여 제2 배양보조 세포 백에 추가했다. 배지 부피를 총 2L로 조정했다. 제2 배양보조 세포 백을 인큐베이터로 이동시켰다.
OKT3 제형 세부사항: OKT3은 100μL 분취액으로 바이알로부터 원래 스톡 농도(1mg/mL)로 분취되고 동결될 수 있다. 1mL 바이알당 ~10× 분취액. -80℃에서 보관된다. 0일차: 15μg/플라스크, 즉 500mL 내 30ng/mL - 최대 60μL ~ 1개 분취액.
종양 샘플을 제조했다. 6-웰 플레이트와 100mm 페트리 디쉬(총 4개)를 획득했다. 6개 웰 플레이트에 '과잉 종양 조각'이라고 라벨링했다. 4개의 100mm 페트리 디쉬의 각각에 'Wash_01', 'Wash_02', 'Wash_03', 'Wash_04' 및 '홀딩'으로 라벨링했다.
과잉 종양 조각으로 표지된 6-웰 플레이트의 모든 웰 안에 5mL의 종양 세정 배지를 첨가했다. 종양 세정 배지를 단리 동안 수화된 종양을 유지하는데 추가로 사용하는데 이용가능하도록 유지한다.
Wash_01, Wash_02, Wash_03 및 홀딩 표지된 각 100mm 페트리 디쉬에 50mL의 종양 세정 배지를 첨가했다. 마커를 사용하여, 각 페트리 디쉬에 단리 1부터 단리 4까지 라벨링한다. 종양을 Wash_01에서의 주변 온도에서 ≥3분 동안 인큐베이션했다. 종양을 Wash_02에서의 주변 온도에서 ≥3분 동안 인큐베이션했다. 종양을 Wash_03에서의 주변 온도에서 ≥3분 동안 인큐베이션했다. 세정이 완료된 후 수화된 조직에 유지하도록 종양을 '홀딩' 디쉬로 이동시켰다.
종양 인큐베이션이 진행되는 동안, 10mL의 종양 운송 배지를 종양 운송 배지로 표지된 튜브로 이동시켰다. 종양 운송 배지 10mL를 주사기에 뽑고 혐기성 및 호기성 멸균 병에 각각 5mL의 종양 운송 배지를 접종했다.
전체 단리 과정 동안 페트리 디쉬 뚜껑 아래에 자를 배치했다. 종양의 길이와 단편의 수를 측정하고 기록했다. 종양을 4개의 중간 조각으로 단리하거나 동등한 부피의 4개 그룹으로 그룹화하고 각 중간 조각의 종양 구조를 보존한다. 수화된 종양 조각을 유지한다.
수화된 조직을 유지하기 위해 적극적으로 단리되지 않은 임의의 중간 종양 조각을 홀딩 디쉬로 이동시켰다.
단리 디쉬 뚜껑 아래의 자를 기준으로 사용하여 종양을 27㎣ 단편(3×3×3mm)으로 단리했다. 60개의 단편에 도달할 때까지 중간 단편을 단리했다. 생성된 최종 단편의 수에 따라 최종 단편의 총 수와 제조된 G-Rex 100MCS 플라스크를 계산했다(일반적으로 플라스크당 60개 단편).
단편 튜브 1 내지 단편 튜브 4로 표지된 원뿔형 튜브에 유리한 조직 단편이 남아있었다. 유래된 단편 튜브의 수에 따라 배양보조 세포 현탁액을 접종할 G-Rex 100MCS 플라스크의 수를 계산했다.
인큐베이터에서 배양보조 세포 백을 꺼내고 G-Rex 100MCS를 접종했다. D0(0일차)으로 라벨링했다.
G-Rex 100 MCS에서 배양에 종양 단편 첨가. 멸균 조건 하에서, 종양 단편 배양(D0) 1로 표지된 G-Rex 100MCS의 캡과 단편 튜브로 표지된 50mL 원뿔형 튜브의 캡을 풀었다. 열린 단편 튜브 1을 휘젓는 동시에 G-Rex 100MCS의 캡을 살짝 들어 올렸다. 단편이 있는 배지를 G-Rex 100MCS에 소용돌이치면서 추가했다. G-Rex 100MCS로 이동된 단편의 수를 기록했다.
일단 단편이 GREX 플라스크 바닥에 위치되면, 7mL의 배지를 뽑아 7개의 1mL 분취액을 생성했다 - 확장된 특성화를 위한 5mL 및 무균 샘플을 위한 2mL. 확장된 특성화 분석을 위해 필요할 때까지 -20℃에서 5개의 분취액(최종 단편 배양 상청액)을 보관했다.
1개의 혐기성 BacT/Alert 병과 1개의 호기성 BacT/Alert 병에 각각 1mL의 최종 단편 배양 상청액을 접종했다. 샘플링된 각 플라스크에 대해 반복한다.
실시예 8: 7-8일차에서 GEN 3 확장 과정의 예시적인 실시양태
배양보조 세포 백을 준비했다. 동결 시 37℃ 수조에서 3~5분 동안 배양보조 백을 해동했다. 동결된 경우 배양보조 세포를 계산했다.
배양보조 세포 농도에 대한 최적 범위는 5×104 내지 5×106 세포/mL이다. 4.5mL의 AIM-V를 갖는 4개의 원뿔형 튜브를 준비했다. 새로운 극저온 튜브 안에 각 세포 계수에 대해 0.5mL의 세포 분획을 추가했다. 샘플을 잘 혼합한 후 세포 계수를 진행했다.
총 생존가능한 배양보조 세포 수가 ≥2×109 세포인 경우, 배양보조 세포 농도를 조정하기 위해 다음 단계로 진행하였다. 제2 배양보조 세포 백에 2×109 세포를 추가하기 위해 제1 배양보조 세포 백에서 꺼내기 위한 배양보조 세포의 부피를 계산했다.
p1000 마이크로피펫을 사용하여, 900μL의 HBSS를 100μL OKT3 분취액으로 이동시켰다. 위아래로 3회 피펫팅하여 혼합했다. 2개의 분취액을 제조했다.
OKT3 제형 세부사항: OKT3은 100μL 분취액으로 바이알로부터 원래의 스톡 농도(1mg/mL)로 분취되고 동결될 수 있다. 1mL 바이알당 ~10× 분취액. -80C에 보관했다. 7/8일차: 30μg/플라스크, 즉 500mL 중 60ng/mL - 최대 120μl ~ 2개 분취액.
주사기와 멸균 기술을 사용하여 OKT3 0.6mL를 뽑아내고 배양보조 세포 백 안에 첨가하여 모두 첨가되었는지 확인했다. 배지 부피를 총 용량 2L로 조정했다. 제2 OKT3 분취액으로 반복하고 배양보조 세포 백에 추가했다. 제2 배양보조 세포 백을 인큐베이터로 이동시켰다.
배양보조 세포 현탁액을 갖는 G-Rex 100MCS 플라스크의 제조. 0일차에 생성된 G-Rex 플라스크의 수에 따라 처리할 G-Rex 100MCS 플라스크 수를 기록했다. 인큐베이터로부터 G-Rex 플라스크를 꺼내고 인큐베이터로부터 제2 배양보조 세포 백을 꺼냈다.
배양보조 세포 현탁액 첨가 이전에 상청액의 제거. 하나의 10mL 주사기를 G-Rex 100 플라스크에 연결하고 5mL의 배지를 뽑았다. 확장된 특성화를 위해 5개의 1mL 분취액 - 5mL를 생성하고 분석 요청이 있을 때까지 -20℃에서 확장된 특성화를 위해 5개의 분취액(최종 단편 배양 상청액)을 저장했다. 각 G-Rex 100 플라스크에 대해 라벨링하고 반복했다.
플라스크 수에 의존하여, 특성화를 위해 5-20×1mL 샘플을 제조한다;:
ㆍ5mL = 1 플라스크
ㆍ10mL = 2 플라스크
ㆍ15mL = 3 플라스크
ㆍ20mL = 4 플라스크
계속해서 G-Rex 100 MCS에 배양보조 세포를 접종하고 각 G-Rex 100 MCS 플라스크에 대해 반복했다. 멸균 이동 방법을 사용하여 중량에 의해 제2 배양보조 세포 백 500mL(1g = 1mL로 가정)를 각 G-Rex 100 MCS 플라스크 안으로 중력 이동시키고 양을 기록했다. 배양 7일차로 라벨링하고 각 G-Rex 100 플라스크에 대해 반복했다. G-Rex 100MCS 플라스크를 인큐베이터로 이동시켰다.
실시예 9: 10-11일차에서 GEN 3 확장 과정의 예시적인 실시양태
제1 G-Rex 100MCS 플라스크를 꺼내고 멸균 조건을 사용하여 10mL 주사기를 사용하여 사전-처리 배양 상청액 7mL를 꺼냈다. 7개의 1mL 분취액을 생성했다 - 확장된 특성화를 위한 5mL 및 무균 샘플을 위한 2mL.
플라스크를 조심스럽게 혼합하고 새로운 10mL 주사기를 사용하여 10mL 상청액을 꺼내고 D10/11 마이코플라스마 상청액으로 라벨링된 15mL 튜브로 이동시킨다.
플라스크를 조심스럽게 혼합하고 새로운 주사기를 사용하여 처리되어 지는 플라스크 수에 따라 아래의 부피를 꺼냈다:
ㆍ1 플라스크 = 40mL
ㆍ2 플라스크 = 20mL/플라스크
ㆍ3 플라스크 = 13.3mL/플라스크
ㆍ4 플라스크 = 10mL/플라스크
모든 플라스크에서 총 40mL를 뽑아 '10/11일차 QC 샘플'이라고 표지된 50mL 원뿔형 튜브에 모아 필요할 때까지 인큐베이터에 보관해야 한다. 세포 계수를 수행하고 세포를 할당했다.
확장된 특성 분석을 위해 5개 분취액(사전-처리 배양 상청액)을 필요할 때까지 ≤-20℃에서 보관했다. 하나의 혐기성 BacT/Alert 병과 하나의 호기성 BacT/Alert 병에 각각 1mL의 사전-처리 배양 상청액을 접종했다.
세포 현탁액을 G-Rex 500MCS로 이동시키고 각 G-Rex 100MCS에 대해 반복했다. 멸균 조건을 사용하여 각 G-Rex 100MCS의 내용물을 G-Rex 500MCS로 이동시키고 한 번에 약 100mL의 유체 전달을 모니터링했다. G-Rex 100MCS의 부피가 500mL로 줄어들었을 때 이동을 중지했다.
전달 단계 동안, 10mL 주사기를 사용하고 G-Rex 100MCS로부터 주사기 안으로 10mL의 세포 현탁액을 뽑았다. 배양에서의 플라스크의 수에 따라 지침을 따랐다. 단지 1 플라스크 경우: 2개 주사기를 사용하여 총 20mL를 꺼냈다. 2 플라스크인 경우: 플라스크당 10mL를 꺼냈다. 3 플라스크인 경우: 플라스크당 7mL를 꺼냈다. 4 플라스크인 경우: 플라스크당 5mL를 꺼냈다. 세포 현탁액을 하나의 일반적인 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 세포 계수 단계 및 QC 샘플까지 인큐베이터에 유지한다. QC에 필요한 총 세포의 수는 ~ 20×106 세포: 4×0.5mL 세포 계수이다(세포 계수는 먼저 희석되지 않았다).
검정에 필요한 세포의 양은 다음과 같다:
ㆍ본원에 기술된 것과 같은 효력 검정, 또는 IFN-γ 또는 그랜자임 B 검정의 경우 최소 10×106 세포
ㆍ마이코플라스마의 경우 1×106 세포
ㆍCD3+/CD45+에 대한 유세포 분석의 경우 5×106 세포
G-Rex 500MCS 플라스크를 인큐베이터로 이동시켰다.
QC 샘플을 제조했다. 적어도 15×108 세포가 이 실시헝태에서의 검정에 필요했다. 검정에는 다음이 포함된다: 세포 계수 및 생존율; 마이코플라스마(1×106 세포/평균 생존가능한 농도;) 흐름(5×106 세포/평균 생존가능한 농도;) 및 IFN-γ 검정(5×106 세포 - 1×106 세포; 8-10×106 세포가 IFN-γ 검정에 요구된다.
10×106 세포/mL에서 동결보존을 위한 세포 분획의 부피를 계산하고 준비할 바이알의 수를 계산했다.
실시예 10: 16-17일차에서 GEN 3 확장 과정의 예시적인 실시양태
세정 완충액 제조(1% HSA Plasmalyte A). HSA와 Plasmalyte를 5L 백에 옮겨 LOVO 세정 완충액을 만든다. 멸균 조건을 사용하여, 총 부피 125mL의 25% HSA를 5L 백에 옮기고 이를 실온에서 보관했다.
'IL-2 6×104 IU/mL' 튜브에서의 10mL 또는 40mL의 세정 완충액을 꺼내어 이동시켰다(IL-2가 미리 제조된 경우 10mL 또는 IL-2가 새로 제조된 경우 40mL).
Plasmalyte + 1% HSA에 첨가하기 위한 재구성된 IL-2의 부피를 계산했다: 재구성된 IL-2의 부피 = (IL-2의 최종 농도 x 최종 부피)/IL-2의 비활성(표준 검정에 기초함). IL-2의 최종 농도는 6×104 IU/mL였다. 최종 부피는 40mL였다.
재구성된 IL-2에 필요한 IL-2의 계산된 초기 부피를 꺼내고 'IL-2 6×104 IU/mL' 튜브로 이동시켰다. 10mL의 LOVO 세정 완충액을 함유하는 'IL-2 6×104 IU/mL' 표지된 튜브에 미리 준비된 분취액으로부터 IL-2 6×106 IU/mL 100μL를 첨가했다.
G-Rex 500MCS 플라스크로부터 약 4500mL의 상청액을 꺼냈다. 남은 상청액을 휘젓고 세포를 세포 수집 풀 백으로 이동시켰다. 모든 G-Rex 500MCS 플라스크에 대해 반복했다.
60mL의 상청액을 꺼내고 마이코플라스마 검출을 포함한 품질 관리 검정을 위해 상청액 튜브에 추가했다. +2-8℃에서 보관했다.
세포 수집. 세포를 계수했다. AIM-V 4.5mL를 갖는 15mL 원뿔형 4개를 준비한다. 이들은 사전에 준비될 수 있다. 최적 범위는 = 5×104 내지 5×106 세포/mL 사이이다. (1:10 희석이 권장된다). 1:10 희석의 경우, 미리 준비된 4500μL의 AIM-V에 500μL의 CF를 추가한다. 희석 인자를 기록했다.
TC(총 세포) 사전-LOVO(살아 있음 + 죽음)를 계산했다 =
평균 총 세포
농도(TC conc pre LOVO)
(살아있음+죽음)
X
소스 백의 부피
TVC(총 생존가능한 세포) 사전-LOVO(살아 있음)를 계산했다 =
평균 총 생존가능한 세포
농도(TVC pre LOVO)
(살아 있음)
X
LOVO 소스 백의 부피
총 세포(TC) 수가 > 5×109인 경우, MDA 보유 샘플로 동결보존할 5×108 세포를 꺼낸다. 5×108 ÷ 평균 TC 농도(14.44단계) = 꺼낼 부피.
총 세포(TC) 수가 ≤5×109인 경우, MDA 보유 샘플로 동결보존할 4×106 세포를 꺼낸다. 4×106 ÷ 평균 TC 농도 = 꺼낼 부피.
LOVO 소스 백에서 필요한 부피를 꺼내기 위해 적절한 크기의 주사기를 사용했다. 동결보존 단계까지 인큐베이터에 보관했다.
총 세포 수가 결정되었을 때, 꺼낼 세포의 수는 150×109 생존가능한 세포를 보유할 수 있어야 한다. TVC 사전-LOVO 5×108 또는 4×106이 적용가능한지 않는지 확인한다. 꺼낼 세포의 부피를 계산한다.
백에 남아 있는 잔존하는 총 세포 수를 계산한다. TC(총 세포) 사전-LOVO를 [평균 총 세포 농도×잔존하는 부피 = 잔존하는 TC 사전-LOVO]로 계산한다.
잔존하는 세포의 총 수에 따라, 표 46에서의 상응하는 과정이 선택된다.
표 46. 세포의 총 수.
사용된 과정에 상응하여 추가할 IL-2의 부피를 선택한다. 다음과 같이 계산된 부피: 잔류물 부피×2×300 IU/mL = 필요한 IL-2의 IU. 필요한 IL-2의 IU/6×104 IU/mL = 사후-LOVO 백을 추가하기 위한 IL-2의 용량. 추가된 모든 부피를 기록했다. 추가 분석을 위해 동결바이알에서 샘플을 수득했다.
세포 생성물을 잘 혼합했다. 추가 처리를 위해 모든 백을 밀봉하고 적용가능한 경우 냉동보존을 포함했다.
수득된 동결바이알 샘플에 대해 필요에 따라 내독소, IFN-γ, 멸균성 및 기타 검정을 수행했다.
실시예 11: 예시적인 GEN 3 과정(GEN 3.1로도 지칭됨)
본 실시예는 "TIL 확장을 위한 Gen 2 과정과 Gen 3 과정 간의 비교가능성"에 관한 추가 연구를 기술한다. Gen 3 과정은 표현형 및 기능적 프로필을 이전에 나타난 바와 같이 유지하면서 최종 총 생존가능한 세포(TVC) 산출량을 Gen 2에서의 것에 비교할 수 있을 정도로(또는 더 좋게) 증가시키는 것을 목표로 과정에서의 초기에 활성화 단계를 포함하도록 변형되었다.
본 실시예의 범주는 0일차에 배양된 종양 단편에 활성화 단계의 도입을 통해 TVC 출력의 평가를 포함한다; 2개의 독립적인 환자 종양에 걸쳐, Gen 3 표준뿐만 아니라 대조군 아암과 기능적 및 확장된 표현형 특성화의 관점에서 비교가능성을 입증하고; 처리 매개변수를 확인하기 위한 배지 소비 및 대사산물 생산의 분석이 생리학적 조건에서 유지되었다.
본 실시예에 대한 모든 실행은 상업적 공여자 종양 조직을 출발 물질로 사용하여 전체-규모 플랫폼에서 수행되었다.
Gen 3 실시양태는 추가 실시양태로 변형되었고 본 실시예에서는 Gen 3.1로 지칭된다.
실시양태에서, Gen 3.1 TIL 제조 과정에는 4개의 조작자 개입이 있다:
1. 종양 단편 분리 및 활성화: 과정의 0일차에 종양을 절개하고 생성된 최종 단편은 각각 ~3×3mm(최대 총 240개 단편)였으며 1-4 G-Rex 100 MCS 플라스크에서 배양했다. 각 플라스크는 최대 60개 단편, 500mL의 CM1 또는 DM1 배지를 함유하였고, 6,000IU rhIL-2, 15μg OKT3 및 2.5×108 조사된 동종 단핵 세포(PBMC)가 보충되었다. 배양액을 37℃에서 6-8일 동안 인큐베이션하였다. PBMC 대신에, 본원의 다른 곳에 기술된 aAPC 또는 항원 제시 세포, 예컨대 선택적으로 유전적으로 변형되고 선택적으로 조사된 Thp1 또는 U937 세포가 이용될 수 있다.
2. TIL 배양액 재활성화: 7-8일차에 배양액은 두 경우 모두에 6,000 IU rhIL-2, 30μg OKT3, 및 5×108 조사된 동종이계 단핵 세포가 보충된 CM2 또는 DM1 배지의 느린 첨가를 통해 보충되었다. 플라스크의 바닥에 있는 기존 세포를 방해하지 않도록 주의했다. 배양액을 37℃에서 3-4일 동안 인큐베이션했다.
3. 배양 규모 확대: 10-11일차에 발생한다. 배양 규모-확대 동안, G-Rex 100 MCS의 전체 내용물을 두 경우 모두에 3,000 IU/mL의 IL-2가 보충된 4L의 CM4 또는 DM2를 함유하는 G-Rex 500 MCS 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 수확시까지 37℃에서 5-6일 동안 인큐베이션했다.
4. 수확/세정/조형화: 16-17일차에 플라스크는 부피 감소되고 풀링되었다. 세포는 농축되고 1% HSA를 함유한 PlasmaLyte A pH 7.4로 세정되었다. 세정된 세포 현탁액을 CryoStor10과 1:1 비율로 제형화하고 rhIL-2를 보충하여 최종 농도가 300 IU/mL가 되도록 했다.
DP를 제어된 속도 동결로 동결보존하고 증기상 액체 질소에 저장했다. 완전 표준 TIL 배지 1, 2 또는 4(CM1, CM2, CM4)는 상기에 언급된 바와 같이 정의된 배지(DM1 또는 DM2)로 지칭되는 CTS™OpTmizer™ T-세포 무혈청 확장 배지를 대체할 수 있다.
과정 설명. 0일차에 종양을 3회 세정한 다음 3x3x3 최종 단편으로 단편화했다. 전체 종양이 단편화되면 최종 단편을 균등하게 무작위화하고 3개의 풀로 나누었다. 하나의 무작위화된 단편 풀이 각 아암에 도입되어, 3개의 실험 매트릭스당 동일한 수의 단편을 추가한다.
종양 L4063 확장은 표준 배지로 수행되었고, 종양 L4064 확장은 전체 TIL 확장 과정에 대해 정의된 배지(CTS OpTmizer)로 수행되었다. 배지의 구성요소는 본원에 기술되어 있다.
CM1 완전 배지 1: 2mM Glutamax, 10% 인간 AB 혈청, 겐타마이신(50ug/mL), 2-머캅토에탄올(55uM)이 보충된 RPMI+ 글루타민. 6000IU/mL IL-2가 보충된 최종 배지 제형.
CM2 완전 배지 2: 50% CM1 배지 + 50% AIM-V 배지. 6000IU/mL IL-2가 보충된 최종 배지 제형.
CM4 완전 배지 4: Glutamax(2mM)가 보충된 AIM-V. 3000IU/mL IL-2가 보충된 최종 배지 제형.
CTS™ OpTmizer T-세포 확장 보충제(26mL/L)가 보충된 CTS OpTmizer CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 기본 배지.
DM1: CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충제(26mL/L) 및 CTS™ 면역 세포 SR(3%)이 보충된, Glutamax(2mM)를 갖는 CTS™OpTmizer™ T-세포 확장 기본 배지. 6,000 IU/mL의 IL-2가 보충된 최종 제형.
DM2: CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 보충제(26 mL/L) 및 CTS™ 면역 세포 SR(3%)이 보충된, Glutamax(2mM)를 갖는 CTS™ OpTmizer™ T-세포 확장 기본 배지. 3,000 IU/mL의 IL-2가 보충된 최종 제형.
사용된 모든 유형의 배지, 즉 완전(CM) 및 정의된(DM) 배지를 미리 제조하고 사용 전날까지 4℃로 유지하고 인큐베이터에서 처리일 이전에 미리 최대 24시간 동안 37℃에서 가온했다.
TIL 배양액 재활성화는 두 종양 모두에 대해 7일차에 발생했다. L4063의 경우 10일차, L4064의 경우 11일차에 규모-확장이 발생했다. 두 배양액 모두 16일차에 수확되어 동결보존되었다.
결과를 달성했다. Gen 3.0 및 Gen 3.1 과정에 대한 세포 계수와 % 생존율을 결정했다. 모든 조건에서의 확장은 본 실시예에 기술된 세부사항을 따랐다.
각각의 종양에 대해, 단편을 동등한 수의 3개 풀로 나누었다. 종양의 크기가 작기 때문에, 플라스크당 최대 단편의 수를 달성하지 못했다. 3가지 다른 과정에 대해, 각 조건에 대해 총 생존가능한 세포와 세포 생존율 평가했다. 세포 계수는 재활성화의 경우 7일차에 TVC, 규모-확대의 경우 10일차(L4064) 또는 11일차(L4063)에 TVC, 16/17일차에 수확 시 TVC로 결정되었다.
7일차 및 10/11일차에 대한 세포 수를 FIO로 취했다. 배수 확장은 수확 16/17일차 TVC를 7일차 재활성화일 TVC로 나누어 계산되었다. 3개 아암을 비교하기 위해, 수확일에서 TVC는 단편당 생존가능한 세포의 평균을 계산하기 위해 0일차에 배양액에 첨가된 단편의 수로 나누어졌다.
세포 계수 및 생존율 검정이 L4063 및 L4064에 대해 수행되었다. Gen 3.1-테스트 과정은 두 종양 모두에서 Gen 3.0 과정보다 단편당 더 많은 세포를 생성했다.
총 생존가능한 세포 수 및 배수 확장; 과정 동안 % 생존율. 재활성화, 규모 확대 및 수확 시 퍼센트 생존율이 모든 조건에 대해 수행되었다. 수확 16/17일차에 최종 TVC가 % 생존율%에 대한 방출 기준에 대해 비교되었다. 평가된 모든 조건은 70% 생존율 기준을 초과했으며 과정과 종양 전반에 걸쳐 비교가능했다.
면역표현형분석 - TIL 최종 생성물에 대한 표현형 특성화. 최종 생성물에 대해 유세포분석 분석을 실시하여 순도, 분화도, 메모리 마커를 테스트하였다. 집단 퍼센트는 모든 조건에서 TCRα/β, CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 일관되었다.
REP TIL의 확장된 표현형 분석이 수행되었다. TIL 생성물은 두 종양 모두에서 Gen 3.0에 비해 Gen 3.1 조건에 대해 CD4+ 세포의 더 높은 백분율, 및 두 조건 모두에서 Gen 3.1 조건에 비해 Gen 3.0에 대해 CD8+ 집단으로부터 CD28+ 세포의 더 높은 백분율을 나타냈다.
Gen 3.0 및 Gen 3.1 과정으로부터 수확된 TIL은 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 CD27 및 CD56 발현과 필적할만한 표현형 마커, 및 CD4+ 게이트된 세포 집단에서 필적할만한 CD28 발현을 나타냈다. TIL 최종 생성물에 대한 메모리 마커 비교:
16일차에 수확된 TIL의 동결된 샘플을 분석을 위해 염색했다. TIL 메모리 상태는 Gen 3.0과 Gen 3.1 과정 간에 필적할만했다. TIL 최종 생성물에 대한 활성화 및 고갈 마커 비교:
활성화 및 고갈 마커는 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 게이팅된 Gen 3.0 및 Gen 3.1 과정 간에 필적할만했다.
재자극 시 인터페론 감마 분비. 수확된 TIL은 L4063 및 L4064에 대해 코팅된 항-CD3 플레이트로 밤새 재자극을 거쳤다. Gen 3.0 과정과 비교하여 분석된 두 종양에서 Gen 3.1 과정으로부터 IFN-γ의 더 높은 생산이 관찰되었다.
배양 배지에서 IL-2 수준의 측정. 모든 조건과 과정 사이의 IL-2 소비 수준을 비교하기 위해, 7일차에 재활성화의 개시, 규모 확대 10일차(L4064)/11일차(L4063) 및 수확 16/17일차, 및 동결 시에 세포 상청액을 수집했다. 이어서 상청액을 해동한 후 분석하였다. 세포 배양 상청액에서 IL-2의 양은 제조업체 프로토콜에 의해 측정되었다.
전반적인 Gen 3 및 Gen 3.1 과정은 동일한 배지 조건에 걸쳐 평가된 완전한 과정 동안 IL-2 소비의 관점에서 필적할만했다. 소비된 배지에 대한 IL-2 농도(pg/mL) 분석을 L4063 및 L4064에 대해 수집했다.
대사산물 분석. 소비된 배지 상청액을 모든 조건에 대해 7일차 재활성화 개시 시, 10일차(L4064) 또는 11일차(L4063)에서 규모-확대, 및 L4063 및 L4064의 경우 16/17일차에 수확 시에 L4063 및 L4064로부터 수집했다. 상청액은 글루코스, 락테이트, 글루타민, GlutaMax 및 암모니아의 농도에 대해 CEDEX 바이오-분석기에서 분석되었다.
정의된 배지는 완전 배지(2g/L)에 비해 4.5g/L의 더 높은 글루코스 농도를 갖는다. 전반적으로, 글루코스의 농도와 소비는 각 배지 유형 내에서 Gen 3.0 및 Gen 3.1 과정에 대해 필적할만했다.
모든 테스트 조건에 대해 두 종양, L4063 및 L4064에 대해 락테이트에서의 증가가 관찰되었다. 락테이트에서의 증가는 Gen 3.0과 Gen 3.1 조건 사이, 그리고 재활성화 확장에 사용된 두 배지(L4063에 대한 완전 배지와 L4064에 대한 정의된 배지) 사이에서 필적할만했다.
L4063의 경우, 표준 기본 배지는 2mM L-글루타민을 함유하고 배양 조건에서 L-글루타민의 L-글루타메이트 및 암모니아로의 자연적인 분해에 대해 보상하기 위해 2mM GlutaMax가 보충되었다.
L4064 종양의 경우, 사용된 정의된(무혈청) 배지는 기본 배지에 L-글루타민을 함유하지 않았고 최종 농도가 2mM이 되도록 GlutaMax만 보충했다. GlutaMax는 L-알라닌과 L-글루타민의 디펩타이드이고, 수성 용액에서 L-글루타민보다 더 안정적이고 자발적으로 글루타메이트와 암모니아로 분해되지 않는다. 대신, 디펩타이드는 점차적으로 개별 아미노산으로 해리되고 이에 의해 강력한 세포 성장을 유지하기에 더 낮지만 충분한 L-글루타민 농도를 유지한다.
L4063의 경우, 글루타민 및 GlutaMax의 농도는 규모-확장 일에 약간 감소했지만, 수확일에는 재활성화일과 비교하여 유사하거나 더 가까운 수준으로 증가하는 것으로 나타났다. L4064의 경우, 글루타민과 GlutaMax 농도는 전체 과정 동안 다양한 조건 간에 유사한 속도로 약간의 분해를 보였다.
예상한 대로, L4063(2mM 글루타민 + 2mM GlutaMax를 함유하는 표준 배지에서 성장)의 경우 L4064(2mM GlutaMax를 함유하는 정의된 배지에서 성장)보다 암모니아 농도가 더 높았다. 더욱이, 예상한 대로, 배양의 과정에서 암모니아가 점진적으로 증가하거나 축적되었다. 3가지 다른 테스트 조건에 걸쳐서 암모니아 농도에는 차이가 없었다.
텔로미어는 Flow - FISH에 의해 반복된다. Flow-FISH 기술은 Gen 3 및 Gen 3.1 과정 하에서 L4063 및 L4064의 텔로미어 반복의 평균 길이를 측정하는데 사용되었다. 상대적인 텔로미어 길이(RTL)의 결정은 DAKO로부터 유세포분석 분석용 텔로미어 PNA 키트/FITC를 사용하여 계산되었다. 텔로미어 검정이 수행되었다. L4063 및 L4064의 샘플에서 텔로미어 길이를 대조군 세포주(1301 백혈병)와 비교했다. 대조군 세포주는 상대적인 텔로미어 길이를 계산할 수 있는 길고 안정적인 텔로미어를 갖는 4배체 세포주이다. 두 종양 모두에서 평가된 Gen 3 및 Gen 3.1 과정은 필적할만한 텔로미어 길이를 보여주었다. TCR Vβ 레퍼토리 분석
각 과정에서 생성된 세포 생성물의 클론 다양성을 결정하기 위해, T 세포 수용체의 CDR3 부분의 서열분석을 통해 클론 다양성 분석을 위해 TIL 최종 생성물을 분석했다.
3가지 조건 사이에서 3가지 매개변수를 비교했다:
ㆍ고유한 CDR3(uCDR3)의 다양성 지수
ㆍ% 공유된 uCDR3
ㆍuCDR3의 상위 80% 경우:
o % 공유된 uCDR3 카피를 비교한다
o 고유한 클론형의 빈도를 비교한다
다음에 대한 대조군 및 Gen 3.1 테스트, TIL 수확된 세포 생성물에 대한 L4063에서 공유된 고유한 CDR3 서열 백분율: 975개 서열은, Gen 3.1 테스트 최종 생성물과 공유된 Gen 3으로부터 고유의 CDR3 서열의 상위 80% 중 88%에 동등한, Gen 3과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 간에 공유된다.
다음에 대한 대조군 및 Gen 3.1 테스트, TIL 수확된 세포 생성물에 대한 L4064에서 공유된 고유한 CDR3 서열 백분율: 2163개 서열은, Gen 3.1 테스트 최종 생성물과 공유된 Gen 3으로부터 고유의 CDR3 서열의 상위 80% 중 87%에 동등한, Gen 3과 Gen 3.1 테스트 최종 생성물 간에 공유된다.
다양한 과정에 대해 수확 16일차에 수집된 1×106 세포로부터 식별된 고유한 CD3 서열의 수. Gen 3.1 테스트 조건은 샘플 내 고유한 펩타이드 CDR의 수를 기준으로 Gen 3.0에 비해 클론 다양성이 약간 더 높은 것으로 나타났다.
두 종양 모두에 대한 Gen 3.1 조건이 Gen 3 과정보다 약간 더 높은 다양성을 나타냈기 때문에, 섀넌 엔트로피 다양성 지수는 비교를 위한 보다 신뢰할 수 있고 일반적인 척도이며, 이는 Gen 3.1 테스트 조건에 대한 TCR Vβ 레퍼토리가 Gen 3.0 과정보다 더 다클론임을 시사한다.
추가적으로, Gen 3.1 테스트 조건에 대한 TCR Vβ 레퍼토리는 종양 L4063 및 L4064 둘 모두에서 Gen 3.0 과정에 대한 상응하는 레퍼토리와 87% 초과 중복을 나타냈다.
재활성화 일에 Gen 3.1 테스트 L4064에 대해 소비된 배지에 대한 IL-2 농도의 값은 예상된 값보다 낮았다(Gen 3.1 대조군 및 Gen 3.0 조건과 유사).
낮은 값은 피펫팅 오류로 기인한 것일 수 있지만, 채취된 최소 샘플로 인해 검정을 반복하는 것이 불가능했다.
샘플 L4064에 대한 규모 확대 10/11일차로부터 소비된 배지는 수집되지 않았으며, IL-2 농도의 분석 및 상청액에 대한 대사산물 분석에 포함되지 않았다.
결론. 0일차에 배양보조 및 OKT-3을 포함하는 Gen 3.1 테스트 조건은 Gen 3.0 및 Gen 3.1 대조군에 비해 수확 16일차에 더 높은 세포 용량의 TVC를 나타냈다. Gen 3.1 테스트 조건에 대한 최종 생성물에 대한 TVC는 Gen 3.0보다 대략 2.5배 높았다.
종양 L4063 및 L4064 둘 모두에 대해 0일차에서 OKT-3 및 배양보조의 첨가를 갖는 Gen 3.1 테스트 조건은 수확 시 플라스크의 최대 용량에 도달했다. 이들 조건 하에서 0일차에 최대 4개의 플라스크가 개시되면, 최종 세포 용량은 80 - 100×109 TIL 사이가 될 수 있다.
최종 TIL 생성물에 대한 순도, 고갈, 활성화 및 메모리 마커를 포함한 표현형 특성화와 같은 모든 품질 속성은 유지되었고 Gen 3.1 테스트와 Gen 3.0 과정 간에 필적할만했다. TIL 최종 생성물에 대한 텔로미어 길이와 소비된 배지에 대한 IL-2 소비는 Gen 3.0과 Gen 3.1 과정 간에 필적할만했다.
최종 TIL 생성물에 대한 IFN-γ 생산은 분석된 두 종양에서 Gen 3.0과 비교하여 0일차에 배양보조 및 OKT-3 첨가를 갖는 Gen 3.1에서 3배 더 높았으며, 이는 Gen 3.1 과정이 강력한 TIL 생성물을 생성했음을 시사한다.
테스트 조건 전반에 걸쳐 글루코스 또는 락테이트 수준에서 차이가 관찰되지 않았다. 배지 조건 전반에 걸쳐 Gen 3.0과 Gen 3.1 과정 사이의 글루타민과 암모니아에서는 차이가 관찰되지 않았다. 배지에 대한 낮은 수준의 글루타민은 세포 성장을 제한하지 않았고 배지에만 GlutaMax의 첨가는 세포를 증식하게 만드는데 필요한 영양분을 제공하기에 충분하다는 것을 시사한다.
L4063 및 L4064에 대한 규모 확대 일은 각각 11일차 및 10일차이었고 과정의 수확일에 도달된 세포 수의 관점에서 큰 차이를 나타내지 않았으며 대사산물 소비는 전체 과정 동안 두 경우 모두에서 필적할만했다. 이 관찰은 Gen 3.0 최적화된 과정이 처리일에 유연성을 가질 수 있고 이에 의해 제조 일정에서 유연성을 촉진할 수 있음을 시사한다.
0일차에 배양보조 및 OKT-3 첨가를 갖는 Gen 3.1 과정은 Gen 3.0과 비교하여 CDR3 TCRab 서열 분석에 의해 측정된 더 높은 클론 다양성을 나타냈다.
도 32는 Gen 3 과정(Gen 3 최적화 프로세스)의 실시양태를 기술한다. 표준 배지 및 CTS Optimizer 무혈청 배지는 Gen 3 최적화된 과정 TIL 확장에 사용될 수 있다. CTS Optimizer 무혈청 배지의 경우 배지에서의 GlutaMax를 최종 농도 4mM로 증가시키는 것이 권장된다.
모든 실험에서 모든 연구 조건에 대한 타당성이 확립되었다. 모든 실험과 조건에 걸쳐서 그리고 공여자 종양 조직 사이에서, 모든 실험은 IL-2, 인간 혈청-AB, 동종이계 배양보조 세포, OKT-3와 같은 중요한 원료의 동일한 로트를 이용하여 수행되었다.
비교가능성은 동결보관된 22일차 TIL 생성물에 대한 이전 사양에 따라 임상적 생성물의 출시 기준을 충족하는 임의의 연구 부문의 능력에 의해 결정되었다.
실시예 12: 정의된 배지로 종양 확장 과정.
상기에 개시된 과정은 (예를 들어, 예를 들어 DM1 및 DM2를 포함하는, CTS™ OpTmizer™ T-Cell Expansion SFM, ThermoFisher)에 따른 정의된 배지로 CM1 및 CM2 배지를 대체하여 수행될 수 있다.
실시예 13: 동결보존 TIL 세포 요법의 예시적 생산
본 실시예는 현행 우수 조직 관리기준 및 현행 우수 제조 관리기준에 따라 G-Rex 플라스크에서 TIL 세포 요법 과정의 예시적인 cGMP 제조를 기술한다.
표 47. 과정 확장 예시적 계획.
표 48. 플라스크 부피.
0일차 CM1 배지 제조. BSC에서 RPMI 1640 배지 병에 시약을 추가했다. 병당 추가된 다음 시약 t를 추가했다: 열 불활성화된 인간 AB 혈청(100.0mL); Glutamax(10.0mL); 겐타마이신 설페이트, 50mg/mL(1.0mL); 2-메르캅토에탄올(1.0mL)
BSC로부터 불필요한 물질을 제거했다. BSC로부터 배지 시약을 배포하고, 제형화된 세정 배지 제조를 위해 BSC에 겐타마이신 설페이트 및 HBSS를 남겨두었다.
IL-2 분취액을 해동했다. 모든 얼음이 녹을 때까지 1.1mL IL-2 분취액(6×106 IU/mL)(BR71424) 1개를 해동했다. IL-2를 기록했다: 로트 # 및 만료
IL-2 스톡 용액을 배지로 이동시켰다. BSC에서, IL-2 스톡 용액 1.0mL를 제조된 CM1 0일차 배지 병에 이동시켰다. CM1 0일차 배지 1 병 및 IL-2(6×106 IU/mL) 1.0mL를 추가했다.
G-Rex 100MCS를 BSC 안으로 전달했다. G-Rex1 00MCS(W3013130)를 무균적으로 BSC 안으로 전달했다.
모든 완전한 CM1 0일차 배지를 G-Rex 100 MCS 플라스크 안으로 펌핑했다. 조직 단편 원뿔형 또는 G-Rex 100 MCS.
0일차 종양 세정 배지 제조. BSC에서, 5.0mL 겐타마이신(W3009832 또는 W3012735)을 1 x 500mL HBSS 배지(W3013128) 병에 추가했다. 병당 추가했다: HBSS(500.0mL); 겐타마이신 설페이트, 50mg/mL(5.0mL). 1L 0.22-마이크론 필터 장치(W1218810)를 통해 제조된 겐타마이신을 함유하는 HBSS를 여과했다.
0일차 종양 처리. 종양 표본을 수득하고 처리를 위해 즉시 2-8℃에서 스위트룸으로 이동시켰다.
분취된 종양 세정 배지. 종양 세정 1은 8" 겸자(W3009771)를 사용하여 수행된다. 종양을 표본 병에서 꺼내어 준비된 "Wash 1" 디쉬로 이동시킨다. 이것은 종양 세정 2와 종양 세정 3으로 이어진다.
종양을 측정하고 평가했다. 전체 종양 면적의 > 30%가 괴사성 및/또는 지방 조직으로 관찰되는지 여부를 평가했다. 적용가능한 경우 단리를 정리한다. 종양이 크고 조직 외부의 >30%가 괴사성/지방인 것으로 관찰된 경우, 외과용 메스 및/또는 겸자의 조합을 사용하여 종양 내부 구조를 보존하면서 괴사성/지방 조직을 제거하여 "단리 정리"를 수행했다.
종양을 단리한다. 외과용 메스 및/또는 겸자의 조합을 사용하여, 종양 표본을 보다 적절한 크기의 단편(최대 6개 중간 단편)으로 자른다. 중간 종양 단편을 이동시켰다. 종양 단편을 대략적으로 3x3x3mm 크기의 조각으로 단리했다. 건조를 방지하기 위해 중간 단편을 저장했다.
반복된 중간 단편 단리. 수집된 조각의 수를 결정했다. 바람직한 조직이 남아 있는 경우, "유리한 중간 단편" 6-웰 플레이트로부터 추가적인 유리한 종양 단편을 선택하여 최대 50개 조각에 대해 점적 충진한다.
원뿔형 튜브를 준비한다. 종양 단편을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. G-Rex 100 MCS용 BSC를 준비했다. 인큐베이터로부터 G-Rex 100 MCS를 꺼냈다. G-Rex 100 MCS 플라스크를 BSC 안으로 무균적으로 통과시켰다. G-Rex 100 MCS 플라스크에 종양 단편을 추가했다. 조각이 고르게 분포되었다.
다음 매개변수에서 G-Rex 100 MCS를 인큐베이션했다: 인큐베이션된 G-Rex 플라스크: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃; CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2. 계산: 인큐베이션의 시간; 하한 = 인큐베이션의 시간 + 252시간; 상한 = 인큐베이션의 시간 + 276시간.
과정이 완료된 후, 임의의 잔존하는 가온된 배지를 폐기하고 IL-2의 분취액을 해동했다.
11일차 - 배지 제조. 인큐베이터를 모니터링했다. 인큐베이터 매개변수: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃; CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2.
3×1000mL RPMI 1640 배지(W3013112) 병 및 3×1000mL AIM-V(W3009501) 병을 인큐베이터에서 ≥30분 동안 가온했다. 인큐베이터에서 RPMI 1640 배지를 꺼냈다. RPMI 1640 배지를 제조했다. 배지를 여과한다. IL-2(6×106 IU/mL)(BR71424)의 3 x 1.1mL 분취액을 해동했다. 인큐베이터에서 AIM-V 배지를 꺼냈다. AIM-V에 IL-2를 추가한다. 10L Labtainer Bag과 리피터 펌프 전송 세트를 무균적으로 BSC로 이동시켰다.
10L Labtainer 배지 백을 준비했다. Baxa 펌프를 준비했다. 10L Labtainer 배지 백을 준비했다. 배지를 10L Labtainer 안으로 펌핑했다. Labtainer 백에서 펌프매틱을 꺼냈다.
배지를 혼합했다. 백을 부드럽게 마사지하여 혼합했다. 샘플 계획당 샘플 배지. 20.0mL의 배지를 꺼내고 50mL 원뿔형 튜브에 넣는다. 세포 계수 희석 튜브를 준비했다. BSC에서, "세포 계수 희석용" 및 로트 번호가 표지된 AIM-V 배지 4.5mL를 4개의 15mL 원뿔형 튜브에 추가했다. 시약을 BSC로부터 2-8℃로 이동시켰다. 1L 이동 팩을 준비했다. BSC의 외부를 준비된 "완전한 CM2 11일차 배지" 백에 부착된 이동 세트에 대한 1L 이동 팩을 (프로세스 노트 5.11에 따라) 용접했다. 배양보조 세포 이동 팩을 준비했다. 완전한 CM2 11일차 배지를 인큐베이션했다.
11일차 - TIL 수확. 전처리 테이블. 인큐베이터 매개변수: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃; CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2. 인큐베이터로부터 G-Rex 100 MCS를 꺼냈다. 300mL 이동 팩을 준비했다. G-Rex 100 MCS에 이동 팩을 용접했다.
TIL 수확 및 TIL 수확의 개시를 위한 플라스크를 준비한다. TIL을 수확했다. GatheRex 펌프를 사용하여, 혈액 필터를 통해 세포 현탁액을 300mL 이동 팩 안으로 이동시켰다. 부착 세포에 대한 막을 검사한다.
플라스크 막을 린스했다. G-Rex 100 MCS에 대해 클램프 폐쇄했다. 모든 클램프가 폐쇄되었는지 확인했다. TIL과 "상청액" 이동 팩을 열 밀봉했다. TIL 현탁액의 부피를 계산했다. 샘플링을 위해 상청액 이동 팩을 준비했다.
Bac-T 샘플을 뽑아냈다. BSC에서, 1L "상청액" 이동 팩에서 대략적으로 20.0mL의 상청액을 뽑아 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 분배한다.
샘플 계획에 따라 BacT를 접종했다. 적절한 크기의 주사기를 사용하여 준비된 50mL 원뿔형 표지된 BacT에서 1.0mL 샘플을 꺼내고 혐기성 병에 접종했다.
TIL을 인큐베이션했다. 필요할 때까지 TIL 이동 팩을 인큐베이터에 두었다. 세포 계수 및 계산을 수행했다. 수행된 세포 계수의 생존가능한 세포 농도 및 생존율의 평균을 결정했다. 생존율 ÷ 2. 생존가능한 세포 농도 ÷ 2. 계수에 대한 상한 및 하한이 결정되었다. 하한: 생존가능한 세포 농도의 평균 × 0.9. 상한: 생존가능한 세포 농도의 평균 × 1.1. 허용가능한 한도 내에서 두 계수 모두를 확인했다. 수행된 4가지 계수 모두에서 평균 생존가능한 세포 농도를 결정했다.
TIL 현탁액의 조정된 부피: 세포 계수 샘플의 제거 후 TIL 현탁액의 조정된 부피를 계산한다. 총 TIL 세포 볼륨(A). 제거된 세포 계수 샘플의 부피(4.0mL) (B) 조정된 총 TIL 세포 부피 C=A-B.
계산된 총 생존가능한 TIL 세포. 평균 생존가능한 세포 농도: 총 부피; 총 생존가능한 세포: C = A × B.
유세포 분석을 위한 계산: 총 생존가능한 TIL 세포 계수가 ≥4.0×107인 경우 유세포 분석 샘플에 대해 1.0×107 세포를 얻기 위한 부피를 계산했다.
유세포 분석에 필요한 총 생존가능한 세포: 1.0×107 세포. 유세포 분석에 필요한 세포의 부피: 1.0×107 세포 A로 나눈 생존가능한 세포 농도.
2.0×108 생존가능한 세포와 동일한 TIL 현탁액의 부피를 계산했다. 필요에 따라, TIL 세포의 과잉 부피를 계산하여 과잉 TIL을 제거하고 제거하고 필요에 따라 TIL을 인큐베이터에 배치했다. 필요에 따라 제거된 총 과잉 TIL을 계산했다.
동결을 위한 표적 세포 농도를 갖는 과잉 TIL 세포에 첨가하기 위한 CS-10 배지의 계산된 양은 1.0×108 세포/mL이다. 필요에 따라 과잉 TIL을 원심분리한다. 원뿔형 튜브를 관찰하고 CS-10을 추가했다.
바이알을 충진했다. 1.0mL 세포 현탁액을 적절한 크기의 동결바이알에 분취했다. 적절한 크기의 동결바이알 안에 잔여 부피를 분취했다. 부피가 ≤0.5mL이면 부피가 0.5mL가 될 때까지 CS10을 바이알에 추가한다.
동결보존을 위해 1×107 세포를 얻는데 필요한 세포의 부피를 계산했다. 동결보존을 위해 샘플을 꺼냈다. 인큐베이터에 TIL을 배치했다.
샘플의 동결보존. 원뿔형 튜브를 관찰하고 CS-10을 천천히 첨가하고 0.5mL의 첨가된 CS10의 부피를 기록한다.
11일차 - 배양보조 세포. 배양보조 세포를 수득했다. LN2 냉동고에서 적어도 2개의 서로 다른 로트 번호가 있는 배양보조 세포의 백 3개를 얻었다. 해동 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 세포를 유지했다. 수조 또는 극저온을 준비한다. 배양보조 세포를 37.0±2.0℃의 수조 또는 세포열에서 ~3-5분 동안 또는 얼음이 막 사라질 때까지 해동했다. 인큐베이터에서 배지를 꺼냈다. 해동된 배양보조 세포를 모았다. 이동 팩에 배양보조 세포을 추가했다. 주사기로부터 배양보조 세포를 이동 팩 안으로 분배했다. 모아진 배양보조 세포를 혼합하고 이동 팩을 라벨링했다.
이동 팩에서의 배양보조 세포 현탁액의 총 부피를 계산했다. 세포 계수 샘플을 꺼냈다. 각 샘플에 대해 별도의 3mL 주사기를 사용하여, 니들리스 주입 포트를 사용하여 배양보조 세포 현탁액 이동 팩에서 4x1.0mL 세포 계수 샘플을 끌어냈다. 각 샘플을 표지된 동결바이알에 분취했다. 세포 계수를 실행하고 증식 인자를 결정하고 프로토콜을 선택하고 증식 인자를 입력했다. 수행된 세포 계수의 생존가능한 세포 농도 및 생존율의 평균을 결정했다. 계수의 상한과 하한을 결정하고 한계 내에서 확인한다.
배양보조 세포 현탁액의 부피를 조정했다. 세포 계수 샘플의 제거 후 배양보조 세포 현탁액의 조정된 부피를 계산했다. 총 생존가능한 배양보조 세포를 계산했다. 필요에 따라 추가 배양보조 세포을 수득했다. 필요에 따라 추가 배양보조 세포를 해동했다. 제4 배양보조 세포 백을 지퍼 탑 백 안에 넣고 37.0±2.0℃ 수조 또는 세포열에서 ~3-5분 동안 해동하고 추가 배양보조 세포를 모았다. 부피를 측정했다. 주사기에서의 배양보조 세포의 부피를 측정하고 아래에 기록했다(B). 배양보조 세포의 새로운 총 부피를 계산했다. 이동 팩에 배양보조 세포을 추가했다.
필요에 따라 희석액을 제조하고 4.5mL의 AIM-V 배지를 4개의 15mL 원뿔형 튜브에 첨가했다. 세포 계수를 준비했다. 각 샘플에 대해 별도의 3mL 주사기를 사용하여, 니들리스 주입 포트를 사용하여 배양보조 세포 현탁액 이동 팩에서 4x1.0mL 세포 계수 샘플을 끌어냈다. 세포 개수 및 계산을 수행했다. 수행된 4가지 계수 모두에서 평균 생존가능한 세포 농도를 결정했다. 배양보조 세포 현탁액의 부피를 조정하고 세포 계수 샘플의 제거 후 배양보조 세포 현탁액의 조정된 부피를 계산했다. 총 배양보조 세포 부피 작은 양 4.0mL가 제거되었다. 5×109 생존가능한 배양보조 세포를 얻기 위해 필요한 배양보조 세포 현탁액의 부피를 계산했다. 초과 배양보조 세포 부피를 계산했다. 제거할 과잉 배양보조 세포의 부피를 계산했다. 과잉 배양보조 세포을 제거했다.
1.0mL 주사기와 16G 바늘을 사용하여, 0.15mL의 OKT3를 뽑아내고 OKT3을 첨가했다. 배양보조 세포 현탁액 이동 팩을 열 밀봉했다.
11일차 G-Rex 충진 및 시드 설정 G-Rex500MCS. 인큐베이터로부터 "완전한 CM2 11일차 배지"를 꺼내고 배지를 G-Rex500MCS 안으로 펌핑했다. 4.5L의 배지를 G-Rex500MCS 안으로 펌핑하여 플라스크 상에 표시된 선까지 충진하였다. 필요에 따라 플라스크를 가열 밀봉하고 인큐베이션했다. 배양보조 세포 현탁액 이동 팩을 G-Rex500MCS에 용접했다. G-Rex500MCS에 배양보조 세포을 추가했다. 열 밀봉했다. TIL 현탁액 이동 팩을 플라스크에 용접했다. G-Rex500MCS에 TIL을 추가했다. 열 밀봉했다. G-Rex500MCS를 37.0±2.0℃, CO2 백분율: 5.0±1.5%CO2에서 인큐베이션했다.
인큐베이션 윈도우를 계산했다. 16일차에 인큐베이터로부터 G-Rex500MCS를 꺼내는 적절한 시간을 결정하기 위한 계산을 수행했다. 하한: 인큐베이션의 시간 + 108시간. 상한: 인큐베이션의 시간 + 132시간.
11일차 초과 TIL 동결보존. 적용가능: 과잉 TIL 바이알을 동결한다. 동결하기 이전에 CRF가 설정되었는지 확인했다. 동결보존을 수행한다. 제어된 속도 냉동고로부터 적절한 저장소로 바이알을 이동시켰다. 동결이 완료되면 바이알을 CRF로부터 적절한 저장 용기로 이동시킨다. 바이알을 적절한 저장소로 이동시켰다. LN2에 저장 위치를 기록했다.
16일차 배지 제조. AIM-V 배지를 사전-가온했다. 계산된 시간, 배지 백 1, 2, 3에 대해 배지가 가온되었다. 모든 백이 12 내지 24시간 동안 가온되었는지 확인했다. 상청액용 10L Labtainer를 설정한다. 루어 커넥터를 사용하여 유체 펌프 이동 세트의 더 큰 직경 말단을 10L Labtainer 백의 암 포트 중 하나에 부착했다. 상청액 및 라벨용 10L Labtainer를 설정한다. 상청액용 10L Labtainer를 설정한다. BSC에서 꺼내기 이전에 모든 클램프가 닫혀 있는지 확인한다. 참고: 상청액 백은 TIL 수확 동안 사용되었으며, 이는 배지 제조와 동시적으로 수행될 수 있다.
IL-2를 해동했다. 모든 얼음이 용융될 때까지 CTS AIM-V 배지의 백당 IL-2(6×106 IU/mL)(BR71424)의 5×1.1mL 분취액을 해동했다. 100.0mL GlutaMax를 분취했다. GlutaMax에 IL-2를 추가했다. 제형화를 위해 CTS AIM-V 배지 백을 준비했다. 제형화를 위해 CTS AIM-V 배지 백을 준비했다. 스테이지 Baxa 펌프. 배지를 제형화하기 위해 준비했다. GlutaMax +IL-2를 백 안으로 펌핑했다. 매개변수를 모니터링했다: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃, CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2. 완전한 CM4 16일차 배지를 가온했다. 희석액을 제조했다.
16일차 REP 스플릿. 인큐베이터 매개변수를 모니터링했다: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃; CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2. 인큐베이터로부터 G-Rex500MCS를 꺼냈다. 1L 이동 팩을 TIL 현탁액으로 준비하고 라벨링한 후 1L를 계량했다.
G-Rex500MCS의 부피 감소. G-Rex500MCS로부터 배양 상청액 ~4.5L를 10L Labtainer로 이동시켰다.
TIL 수확을 위해 플라스크를 준비했다. 상청액의 제거 후, 모든 클램프를 빨간색 선까지 닫았다.
TIL 수확의 개시. 플라스크를 세게 두드리고 배지를 휘저어 세포를 방출하고 모든 세포가 분리되었는지 확인한다.
TIL 수확. TIL 현탁액 이동 팩으로 이어지는 모든 클램프를 해제했다. GatheRex를 사용하여 세포 현탁액을 TIL 현탁액 이동 팩으로 이동시켰다. 참고: 모든 세포와 배지가 수집될 때까지 기울어진 가장자리를 유지하도록 한다. 부착 세포에 대해 막을 검사했다. 플라스크 막을 세정했다. G-Rex500MCS에 대한 클램프를 폐쇄했다. TIL을 함유하는 이동 팩을 열 밀봉했다. 상청액을 함유하는 10L Labtainer를 열 밀봉했다. 세포 현탁액을 갖는 이동 팩의 무게를 기록하고 현탁액 부피를 계산한다. 샘플 제거를 위해 이동 팩을 준비했다. 세포 상청액으로부터 테스트 샘플을 꺼냈다.
무균성 & BacT 테스트 샘플링. 준비된 15mL 원뿔형의 표지된 BacT로부터 1.0mL 샘플을 꺼냈다. 세포 계수 샘플을 꺼냈다. BSC에서, 각 샘플에 대해 별도의 3mL 주사기를 사용하여 "TIL 현탁액" 이동 팩으로부터 4x1.0mL 세포 계수 샘플을 꺼냈다.
마이코플라스마 샘플을 꺼냈다. 3mL 주사기를 사용하여, TIL 현탁액 이동 팩에서 1.0mL를 꺼내고 준비된 15mL 원뿔형의 표지된 "마이코플라스마 희석제"에 넣는다.
시딩을 위한 전달 팩을 준비했다. 인큐베이터에 TIL을 배치했다. BSC에서 세포 현탁액을 꺼내고 필요할 때까지 인큐베이터에 넣는다. 세포 계수 및 계산을 수행했다. 처음에 0.5mL의 세포 현탁액을 1:10 희석을 제공하는 준비된 AIM-V 배지 4.5mL 안에 추가함에 의해 세포 계수 샘플을 희석했다. 수행된 세포 계수의 생존가능한 세포 농도 및 생존율의 평균을 결정했다. 계수에 대한 상한 및 하한을 결정했다. 참고: 희석은 예상되는 세포의 농도를 벗어난 기준에 따라 조정될 수 있다. 수행된 4가지 계수 모두에서 평균 생존가능한 세포 농도를 결정했다. TIL 현탁액의 부피를 조정했다. 세포 계수 샘플의 제거 후 TIL 현탁액의 조정된 부피를 계산했다. 총 TIL 세포 부피 마이너스 테스트를 위해 제거된 5.0mL.
총 생존가능한 TIL 세포를 계산했다. 시딩할 플라스크의 총 개수를 계산했다. 참고: 시딩할 G-Rex500MCS 플라스크의 최대 수는 5개였다. 계산된 시딩할 플라스크 수가 5개를 초과하는 경우, 이용가능한 세포 현탁액의 전체 부피를 사용하여 5개만 시딩했다.
하위배양물을 위한 플라스크의 수를 계산한다. 준비된 백에 부가하여 필요한 배지 백의 수를 계산했다. 계산된 대로 필요한 G-Rex-500M 플라스크 2개마다 "CM4 16일차 배지"의 10L 백 1개를 준비했다. 추가 배지를 제조하고 가온되는 동안 제1 GREX-500M 플라스크에 시딩을 진행했다. 결정된 계산된 수의 추가 배지 백을 준비하고 가온했다. G-Rex500MCS를 충진했다. 배지를 펌핑할 준비를 하고 4.5L의 배지를 G-Rex500MCS 안으로 펌핑했다. 열 밀봉했다. 충진을 반복했다. 플라스크를 인큐베이션했다. 새로운 G-Rex500MCS 플라스크에 추가할 TIL 현탁액의 목표 부피를 계산했다. 계산된 플라스크 수가 5개를 초과하는 경우 세포 현탁액의 전체 부피를 사용하여 5개만 시딩될 것이다. 시딩을 위해 플라스크를 준비했다. 인큐베이터에서 G-Rex500MCS를 꺼냈다. 펌핑용 G-Rex500MCS를 준비했다. 대형 필터 라인을 제외하고 모든 클램프를 닫았다. 인큐베이터에서 TIL을 꺼냈다. 시딩을 위해 세포 현탁액을 제조했다. "TIL 현탁액" 이동 팩을 펌프 흡입구 라인에 (프로세스 노트 5.11에 따라) 멸균 용접하였다. TIL 현탁액 백을 저울 위에 놓았다.
플라스크에 TIL 현탁액을 시딩했다. 계산된 TIL 현탁액의 부피를 플라스크 안으로 펌핑한다. 열 밀봉하였다. 남은 플라스크를 충진했다.
인큐베이터를 모니터링했다. 인큐베이터 매개변수: 온도 LED 디스플레이: 37.0±2.0℃, CO2 백분율: 5.0±1.5% CO2. 플라스크를 인큐베이션했다.
22일차에 인큐베이터로부터 G-Rex500MCS를 꺼내는 시간 범위를 결정했다.
22일차 세정 완충제 제조. 10L Labtainer 백을 준비했다. BSC에서, 루어 연결을 통해 4" 플라즈마 이동 세트를 10L Labtainer 백에 부착한다. 10L Labtainer 백을 준비했다. BSC의 외부로 이송하기 전에 모든 클램프를 닫았다. 참고: 수확할 G-Rex500MCS 플라스크 2개마다 10L Labtainer 백 1개를 준비했다. Plasmalyte를 3000mL 백에 펌핑하고 펌프를 역전시키고 백의 위치를 조작함에 의해 3000mL Origen 백에서 공기를 제거했다. 3000mL 백에 인간 알부민 25%를 추가했다. 인간 알부민 25%의 최종 부피 120.0mL를 수득한다.
IL-2 희석제를 제조했다. 10mL 주사기를 사용하여, LOVO 세정 완충액 백에 대해 바늘 없는 주입 포트를 사용하여 5.0mL의 LOVO 세정 완충액을 꺼냈다. LOVO 세정 완충액을 50mL 원뿔형 튜브에 분배했다.
CRF 블랭크 백 LOVO 세정 완충액을 분취했다. 100mL 주사기를 사용하여, 바늘 없는 주입 포트로부터 70.0mL의 LOVO 세정 완충액을 뽑아냈다.
모든 얼음이 용융될 때까지 IL-2(6×106 IU/mL) 1.1mL를 해동했다. "IL-2 희석액" 표지된 50mL 원뿔형 튜브에 50μL IL-2 스톡(6×106 IU/mL)을 추가했다.
동결보존 준비. 최종 생성물 동결보존을 위한 사전조정을 위해 5개의 동결-카세트를 2-8℃에 배치했다.
세포 계수 희석액을 제조했다. BSC에서, 로트 번호와 "세포 계수 희석용"으로 라벨링된 AIM-V 배지 4.5mL를 별도의 15mL 원뿔형 튜브 4개에 추가했다. 세포 계수를 준비했다. 4개의 동결바이알에 바이알 번호(1-4)를 라벨링했다. 바이알을 사용되어 지는 BSC 하에 유지했다.
22일차 TIL 수확. 인큐베이터를 모니터링했다. 인큐베이터 매개변수 온도 LED 디스플레이: 37±2.0℃, CO2 백분율: 5%±1.5%. 인큐베이터로부터 G-Rex500MCS 플라스크를 꺼냈다. TIL 수집 백을 준비하고 라벨링했다. 추가 연결을 봉인했다. 부피 감소: G-Rex500MCS로부터 상청액 백으로 상청액 ~4.5L를 이동시켰다.
TIL 수확을 위해 플라스크를 준비했다. TIL의 수집을 개시했다. 플라스크를 세게 두드리고 배지를 휘저어 세포를 방출한다. 모든 세포가 분리되었는지 확인한다. TIL의 수집을 개시했다. TIL 현탁액 수집 백으로 이어지는 모든 클램프를 해제했다. TIL 수확. GatheRex를 사용하여, TIL 현탁액을 3000mL 수집 백 안으로 이동시켰다. 부착 세포에 대해 막을 검사한다. 플라스크 막을 세정했다. G-Rex500MCS 상의 클램프를 닫고 모든 클램프가 닫혔는지 확인한다. 세포 현탁액을 LOVO 소스 백으로 이동시켰다. 모든 클램프를 닫았다. 열 밀봉했다. 4x1.0mL 세포 계수 샘플을 꺼냈다
세포 계수를 수행했다. NC-200 및 프로세스 노트 5.14를 활용하여 세포 수 및 계산을 수행했다. 처음에 준비된 AIM-V 배지 4.5mL 안에 세포 현탁액 0.5mL를 추가함에 의해 세포 계수 샘플을 희석했다. 이것은 1:10 희석을 제공했다. 수행된 세포 계수의 평균 생존율, 생존가능한 세포 농도 및 총 유핵 세포 농도를 결정했다. 계수에 대한 상한 및 하한을 결정했다. 수행된 세포 계수의 평균 생존율, 생존가능한 세포 농도 및 총 유핵 세포 농도를 결정했다. LOVO 소스 백을 계량했다. 총 생존가능한 TIL 세포를 계산했다. 총 유핵 세포를 계산했다.
마이코플라스마 희석제를 제조했다. 루어 샘플 포트를 통해 하나의 상청액 백에서 10.0mL를 꺼내고 15mL 원뿔형에 배치했다.
"TIL G-Rex 수확" 프로토콜을 수행하고 최종 생성물 목표 부피를 결정했다. 일회용 키트를 장입했다. 여과 백을 제거했다. 여과액 용량을 입력했다. 벤치탑에 여과액 용기를 놓았다. PlasmaLyte를 첨부했다. PlasmaLyte가 부착되었는지 확인하고 PlasmaLyte가 움직이는 것을 관찰했다. 소스 용기를 튜브에 부착하고 소스 용기가 부착되었는지 확인했다. PlasmaLyte가 움직였는지를 확인했다.
최종 제형화 및 충진. 목표 부피/백 계산. 블랭크 백을 제형화하기 위한 CS-10 및 LOVO 세정 완충액의 부피를 계산했다. CRF 블랭크를 준비했다.
최종 생성물에 추가하기 위한 IL-2의 부피를 계산했다. 원하는 최종 IL-2 농도(IU/mL) - 300IU/mL. IL-2 작업 스톡: 6×104 IU/mL. 연결 장치를 조립했다. 4S-4M60을 CC2 세포 연결에 멸균 용접했다. 준비된 하네스에 CS750 동결백을 멸균 용접했다. CS-10 백을 4S-4M60의 스파이크에 용접했다. IL-2를 갖는 TIL을 제조했다. 적절한 크기의 주사기를 사용하여 "IL-2 6×104" 분취액으로부터 결정된 IL-2의 양을 꺼냈다. 제형화된 TIL 백을 라벨링했다. 장치에 제형화된 TIL 백을 추가했다. CS10을 추가했다. 주사기를 전환했다. ~10mL의 공기를 100mL 주사기에 넣고 장치 상에 60mL 주사기를 재배치했다. CS10을 추가했다. CS-750 가방을 준비했다. 세포를 분배했다.
최종 생성물 백에서 공기를 제거하고 보유한다. 마지막 최종 생성물 백이 충진되면 모든 클램프를 닫는다. 새로운 100mL 주사기 안으로 10mL의 공기를 넣고 장치 상에 주사기를 재배치한다. 50mL 원뿔형 튜브 안에 보유액을 분배하고 튜브에 "보유액" 및 로트 번호를 라벨링한다. 각 백에 대해 공기 제거 단계를 반복한다.
육안 검사를 포함하여 동결보존을 위한 최종 생성물을 제조했다. 동결보존할 때까지 동결백을 차가운 팩이나 2-8℃에 유지한다.
세포 계수 샘플을 꺼냈다. 적절한 크기의 피펫을 사용하여 2.0mL의 보유액을 꺼내고 세포 계수를 위해 사용되어 지는 15mL 원뿔형 튜브에 넣는다. 세포 계수 및 계산을 수행했다. 참고: 희석이 충분한지 확인하기 위해 단지 하나의 샘플을 적절한 희석에 희석했다. 추가 샘플을 적절한 희석 인자에 희석하고 계수를 진행한다. 수행된 세포 계수의 생존가능한 세포 농도 및 생존율의 평균을 결정했다. 계수에 대한 상한 및 하한을 결정했다. 참고: 희석은 예상되는 세포 농도를 벗어난 기준에 따라 조정될 수 있다. 생존가능한 세포 농도 및 생존율의 평균을 결정했다. 게수에 대한 상한 및 하한을 결정했다. IFN-γ를 계산했다. 최종 생성물 백을 열 밀봉했다.
아래 예시적인 샘플 계획에 따라 샘플을 라벨링하고 수집했다.
표 49. 샘플 계획.
무균성 및 BacT 테스트. 샘플링 테스트. BSC에서는 적절한 크기의 주사기를 사용하여 수집된 보유된 세포 현탁액에서 1.0mL 샘플을 꺼내고 혐기성 병에 접종한다. 호기성 병에 대해 상기 과정을 반복한다.
최종 생성물 동결보존. 제어된 속도 냉동고(CRF)를 준비했다. CRF가 설정되었는지 확인했다. CRF 프로브를 설정했다. CRF에 최종 생성물과 샘플을 배치했다. 4℃±1.5℃에 도달하고 CRF 실행을 진행하는데 필요한 시간을 결정했다. CRF가 완료되고 저장되었다. 실행의 완료 후 CRF를 중지했다. CRF로부터 카세트와 바이알을 꺼냈다. 보관을 위해 카세트와 바이알을 증기상 LN2로 이동시켰다. 저장 위치를 기록했다.
최종 의약품의 사후-처리 및 분석은 다음 테스트를 포함했다: (22일차) 유세포 분석에 의한 22일차 REP에 대한 CD3+ 세포의 결정; (22일차) 그람염색법(GMP); (22일차) Gel Clot LAL 검정(GMP)에 의한 세균 내독소 테스트; (16일차) BacT 무균성 검정(GMP); (16일차) TD-PCR(GMP)에 의한 마이코플라스마 DNA 검출; 허용가능한 외양 속성; (22일차) BacT 무균성 검정(GMP)(22일차); (22일차) IFN-감마 검정. 본원에 기술된 다른 효력 검정도 TIL 생성물을 분석하는데 이용된다.
실시예 14: TIL 효력 검정 파일럿 연구
본 실시예에서는 임상적 TIL 생성물 로트의 특성화를 위한 효력 검정을 기술한다. 본 실시예에 기술된 프로토콜은 Gen 2 제조 과정에 의해 생성된 2개의 TIL 샘플에 적용되었으며, 이는 폐 종양(L4224) 및 흑색종 종양(M1154)으로부터 제조되었다. TIL은 조사된 Raji 세포와 공배양되었다. K562 세포와 PBMC 비드는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. 일반적인 실험 계략도는 도 34에 예시되어 있다. TIL의 기능성은 항-CD3/항-CD28/항-4-1BB-코팅된 비드로 검증되었다. 공동-자극을 제공하기 위한 항-CD28 항체의 첨가는 이것이 어떤 이점을 제공하는지 또는 효과가 없는지를 결정하기 위해 또한 테스트되었다. 다양한 공배양 기간이 관찰되었다.
K562 및 Raji 세포를 해동하고, 계수하고, 6-웰 플레이트 또는 T25 플라스크에서 10-14일 동안 확장시켰다. 세포 수가 >160×106에 도달하면, 세포를 35 Gy에서 조사하고 분취하고 나중에 사용하기 위해 다시 동결했다. Gen 2 확장된 TIL을 해동하여 계수하고, 공배양 이전 48-72시간 동안 회수를 위해 배양에 투입했다.
조사된 Raji 세포 및 조사된 K562 대조군을 해동하고 다음 TIL:표적 비율: 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1, 1:1, 1:6.25, 1:12.5 및 1:25, +/- 항-CD28 항체를 사용하여 TIL과 공배양했다. TIL은 또한 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 자기 비드로 자극되어 양성 활성화 대조군을 제공했다. TIL 및 종양 세포주 단독 대조군도 포함되었다.
상청액을 공동배양의 개시-후 6-24시간에 수집하고 -80℃에서 동결시켰다. 세포를 동일한 지점에서 수확하고 T 세포 활성화의 표면 마커의 발현을 위해 염색했다. Ella 플랫폼을 사용하여, 사이토카인에 대해 해동된 상청액을 평가했다. 염색된 샘플은 Ze5 기기를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석되었다.
3개의 서로 다른 세포주를 사용하여 TIL과 공동배양했다. 야생형 Raji(Cat # CCL-86) 및 K562(Cat # CCL-243) 세포는 ATCC로부터 상업적으로 획득했다. Raji 세포는 버킷 림프종을 앓는 환자로부터 유래된 인간 B 림프구 세포주이고, K562는 골수성 백혈병 세포주이다. 조사된 인간 PBMC는 샌디에이고 혈액 은행으로부터 받았다.
2개의 Gen 2 TIL 로트를 조사된 Raji 세포, K562 세포 및 PBMC 세포와의 공동배양 시 활성화에 대해 테스트했다. TIL 활성화는 K562 세포와 비교하여, Raji 세포와의 공동배양 시 마커-양성 세포의 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI)로 표현되는 선택 표면 마커의 증가된 발현으로 정의되었다. 대안적으로, Raji 세포, K562 및 TIL은 단독으로 배양될 수 있다. PBMC를 대조군으로 사용한 경우, CD3/CD28도 사용될 수 있다. TIL 활성화는 표적 세포와 효과기 세포 사이의 서로 다른 MHC의 발현으로 인해 발생할 것으로 예상된다. TIL TCR 복합체와 표적 세포 HLA-펩타이드 복합체의 동종이계 상호작용을 MHC 우성 인식으로 지칭된다. Felix and Allen, Nat. Rev. Immunol., 2007, 7(12), 942-53; Matzinger and Bevan, Cell Immunol. 1977, 29, 1-5; 및 Janeway, The major histocompatibility complex and its functions in Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition G. Science, Editor. 2001, Garland Science.
MHC I 및 II 발현의 부족에 기인해, K562 세포는 TIL과 Raji 세포의 공동배양이 비교될 기준선 활성화 수준을 제공한다. CD28에 대한 마우스 단클론성 항체의 첨가를 추가하여 T 세포 반응을 증폭시키기 위한 공동-자극을 제공했다. PBMC는 MLR 반응에 대한 양성 대조군으로 각 TIL 로트와 함께 공배양되었다.
파일럿 실험에 충분한 세포가 이용가능할 수 있도록 보장하기 위해, 조사 이전에 Raji 세포를 160×106 백만 이상으로 확장했다.
종양 세포 샘플의 해동 및 배양. K562 및 Raji 종양 세포를 해동하고 10-14일 동안 배양하여 세포가 해동에서 회복되고, 배지에 적응하고, 실험 이전에 적절한 수로 확장되도록 허용했다. 200mL 배지를 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온했다. 각각의 종양 세포 샘플에 대해, 50mL 원뿔형 튜브를 10mL의 가온된 배지로 준비하고 종양 계열 명칭을 라벨링했다.
작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37℃수조에서, 2×106 내지 10×106 세포/1mL 바이알을 함유하는 단일 세포 바이알을 해동했다. 부분적으로 해동된 바이알을 BSC 안으로 이동시켰다. 해동된 종양 세포의 내용물을 지정된 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 0.5mL의 가온된 배지를 동결바이알 안에 천천히 점적 추가하고, 혼합할 배지를 추가하면서 바이알을 휘젓는다. 동결바이알의 내용물을 위아래로 부드럽게 5-6회 피펫팅함에 의해 혼합했다. 바이알의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다.
원뿔형 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 매일 세포를 확인하고 세포가 약 70-80% 합류하면 1:4로 분할했다.
종양 세포 수확. 플라스크 또는 플레이트로부터 현탁액에서의 종양 세포를 꺼내고 종양 배지를 갖는 50-mL 원뿔형 튜브에 추가한다. 플라스크를 1×PBS 또는 종양 배지로 헹구고 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에 추가한다.
원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 1mL 배지에 TIL을 재현탁하고 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하였다. 혈청 피펫으로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합했다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다.
K562 및 Raji 세포의 조사. 종양 세포가 160×106 초과의 세포로 확장되면, 표준 작업 절차를 사용하여 35 Gy에서 세포를 조사했다.
조사 후, K2 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 생존율에 대해 평가했다. 세포를 그 다음 CryoStor CS10 동결 배지(BioLife Solutions, Washington, Cat#210373)에서 10×106 세포/mL의 듀어에서 동결시켰다.
TIL의 해동 및 회수. BSC에 넣기 전에 37℃ 수조에서 200mL의 TIL 배지(CM1)를 15±5분 동안 가온하였다. IL-2 스톡 용액(6×106 IU/mL)을 제조했다. 가온된 배지와 IL-2 스톡 용액을 BSC로 이동시켰다. 10μL의 IL-2 스톡 용액(6×106 IU/mL)을 배지 안에 추가함에 의해 300 IU/mL IL-2로 배지를 보충한다.
각 TIL 로트에 대해, 10mL의 가온된 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비했다. TIL 번호로 튜브를 라벨링했다. TIL 생성물의 이용가능성과 바이알당 세포의 수에 기반하여, TIL 로트당 60×106 총 세포를 얻기에 충분한 바이알을 해동한다.
작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37℃ 수조에서 냉동된 TIL 바이알을 해동했다. 해동된 바이알을 BSC로 이동시킨다. 해동된 TIL 바이알과 PBMC의 내용물을 지정된 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 0.5mL의 가온된 배지를 TIL 바이알 안으로 천천히 점적 추가하고 혼합할 배지를 추가하면서 바이알을 휘젓는다. TIL 바이알의 내용물을 위아래로 부드럽게 5-6회 피펫팅함에 의해 혼합했다. TIL 바이알 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다.
원뿔형 튜브를 400 × g에서 5분 동안 실온에서 함께 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피했다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 1mL TIL 배지에 TIL을 재현탁하고 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하였다.
세포 현탁액을 혈청 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 완전하게 혼합했다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다. TIL을 CM1 배지에 1.5×106/3×106 세포/mL 및 IL-2의 3000 IU/mL의 농도로 재현탁했다. G-Rex 10 플라스크 또는 G-Rex 6-웰 플레이트를 사용하여 세포가 37℃/5% CO2에서 48-72시간 동안 회복되도록 허용했다.
공동배양을 위한 TIL 준비. 200mL의 배지를 BSC에 넣기 전에 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온했다. 10mL의 가온된 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비했다. G-Rex 10 플라스크 또는 G-Rex 6-웰 플레이트로부터 TIL을 수확하고 세포를 지정된 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리했다.
각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피했다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 1mL 배지에 TIL을 재현탁하고 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 배지로 2mL가 되도록 하였다. 혈청 피펫으로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합한다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다.
TIL 배지에 TIL을 5×105 세포/mL로 재현탁했다. 공동배양을 위해 조사된 K562 세포, Raji 세포 및 PBMC를 해동했다. 37℃ 수조에서 15±5분 동안 200mL의 배지를 가온했다. 가온된 배지를 BSC로 이동시켰다. 각각 및 세포주에 대해 가온된 배지 10mL를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비했다.
작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37℃수조에서 동결된 종양 세포주를 해동했다. 해동된 위성 바이알을 BSC 안으로 이동시켰다. 해동된 종양 세포주의 내용물을 지정된 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 0.5mL의 가온된 배지를 동결바이알에 천천히 점적 부가하고 혼합되는 배지를 추가하면서 바이알을 휘젖는다. 바이알의 내용물을 위아래로 부드럽게 5-6회 피펫팅함에 의해 혼합했다. 세포 내용물을 50-mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다.
원뿔형 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피했다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 1mL 배지에 TIL을 재현탁하고 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하였다. 혈청 피펫으로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합한다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200-μL 분취액 2개를 꺼냈다. 종양 배지에 세포를 5×105 세포/mL의 농도로 재현탁하고 TIL이 준비되면 공동배양을 위해 인큐베이터에 넣는다.
TIL 및 종양 세포 공동배양 설정. 각 TIL 로트는 조사된 K562 세포, Raji 세포 및 PBMC(3-4 공여자) 또는 TIL: 표적 비율 및 +/- 항-CD28(5μg/mL) 항체 아래 표시된 세포 수를 사용한 비드 자극과 별도로 공동배양되었다. 1×106 총 세포가 48-웰 플레이트의 1 웰에 1mL로 도말될 것이다. 실험 설정은 파일럿 연구와 메인 연구에서 동일하다. 도 47에서 볼 수 있듯이, TIL 로트당 하나의 플레이트가 필요했으며, 더하여 추가의 대조군 웰이 추가 플레이트에서 실행될 것이다.
ㆍ50:1 (9.8×105 TIL:2×104 표적 세표)
ㆍ25:1 (9.6×105 TIL:4×104 표적 세표)
ㆍ12.5:1 (9.2×105 TIL:8×104 표적 세표)
ㆍ6.25:1 (8.4×105 TIL:1.5×105 표적 세표)
ㆍ1:1 (5×105 TIL:5×105 표적 세표)
ㆍ1:6.25 (1.5×105 TIL:8.4×105 표적 세표)
ㆍ1:12.5 (8×104 TIL:9.2×105 표적 세표)
ㆍ1:25 (4×104 TIL:9.6×105 표적 세표)
표시된 웰에 5mg/mL의 항-CD28을 첨가했다. TIL 배지로 웰의 부피를 1000μL로 늘렸다. αCD3/αCD28/α4-1BB 비드를 함유하는 웰의 경우, 제조업체의 지시에 따라 비드를 세정하고, 제조하고 추가했다. TIL 로트당 대략적으로 27.0×106 TIL 및 9×106 표적 세포가 필요하다.
플레이트는 선택된 배양 기간 동안 인큐베이터(5% CO2, 37℃)에서 인큐베이션되었다. 2개의 Gen 2 연구 샘플을 사용한 파일럿 연구의 경우, 플레이트는 다양한 시점(예를 들어, 6, 12, 18 및 24시간)에 인큐베이션될 것이다. 최적의 공동배양 기간은 가장 높은 Raji/K562 활성화 값을 산출하는 기간으로 정의되고 6개의 Gen 2 TIL 임상적 샘플에 적용되었다.
활성화 마커의 발현을 평가하기 위한 세포의 수집. 세포 현탁액을 48-웰 플레이트에서 꺼내고 미리 표지된 FACS 튜브에 넣었다. 대략적으로 3mL의 1× PBS를 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 실온에서 5분 동안 높은 가속 및 브레이크로 400 × g에서 회전시켰다. 상청액을 따라냈다. 세포를 표 50에 나타난 예시적인 항체 패널로 염색하였다.
표 50. 활성화(DIG1) 유세포 분석 항체 및 염색.
염색이 완료되면, 샘플을 유세포 분석기에서 수집할 준비가 될 때까지 암실에서 40℃로 보관했고 데이터는 24시간 이내에 Ze5에서 획득했다. 유세포 분석 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 결과는 살아있는 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 세포의 퍼센트 마커-양성 세포로 표현되었다.
상청액의 수집 및 사이토카인에 대한 평가. 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냈다. 디쉬 바닥에 있는 세포를 방해하지 않는다. 각 웰의 상단에서 80μL의 상청액을 제거하고 80μL의 샘플을 96-웰 U 플레이트로 이동시킨다. 96-웰 플레이트 2개를 더 사용하여 이 단계를 반복하여 백업 플레이트 2개를 만들었다. 각 96-웰 플레이트를 접착 씰로 밀봉하고 플레이트를 -80℃ 냉동고에 보관한다. 결과는 도 35 내지 도 38에 나타나 있다.
그런 다음 ELLA 플랫폼을 사용하여 IFN-γ, CCL4, 그랜자임 B, TNF-α 및 MIP-1β 분비에 대해 상청액을 평가했다. IFN-γ에 대한 결과는 도 39에 나타나 있다. CCL4에 대한 결과는 도 40에 나타나 있다. 그랜자임 B에 대한 결과는 도 41에 나타나 있다. 플레이트 레이아웃은 도 42에 나타나 있다.
실시예 15: 6개 TIL 샘플에 대한 TIL 효력 평가
실시예 14에 기술된 바와 같이, Raji-세포 기반 공배양 시스템을 사용하여 총 6개의 Gen 2 흑색종 TIL 로트를 평가했다. K562 세포는 HLA-음성 대조군으로 사용되었다. TIL 샘플을 활성화 및 분비된 사이토카인의 표현형 마커에 대해 분석했다. 다중 추가 사이토카인 또는 기타 분비된 단백질은 ELISA 또는 자동화된 ELISA 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 일반적인 실험 계략도는 도 42에 나타나 있다.
도 43 내지 도 54는 이 TIL 샘플의 세트에 대한 공배양 효력 검정으로의 실험 결과를 나타낸다. 임상적 반응이 있는 환자는 동반 연구에 사용된 기준에 의해 구분되어 반응하지 않은 환자와 구분된다; 그러나, 환자의 반응 상태가 검정의 사용이나 데이터의 분석을 제한하지 않는다. 실험은 Raji 세포와 공배양 시 IFN-γ 및 그랜자임 B 분비를 검출하는 검정의 능력을 입증했다. 6개의 Gen 2 TIL 샘플에 걸쳐서, TIL-Raji 세포 공동배양 검정에 의해 결정된 IFN-γ의 범위는 42.1pg/mL(301-001) 내지 3708pg/mL(환자 008-002)였다. TIL-Raji 세포 공동배양 검정에 의해 결정된 그랜자임 B의 범위는 568.3pg/mL(301-001) 내지 8721.33pg/mL(008-002)였다.
실시예 16: 22개 TIL 샘플에 대한 다기능 TIL 효력 평가
본 실시예에서, 다기능 TIL 효력 검정의 다양한 실시양태는 효력에 대한 TIL 로트를 평가하기 위해 K562-세포 기반 음성 대조군 공배양 시스템과 연계하여 사용되는 Raji-세포 기반 공배양 시스템을 사용하여 입증된다. K562 및 Raji 세포를 해동하고, 계수하고 6-웰 플레이트 또는 T25 플라스크에서 10-14일 동안 확장했다. 세포 수가 >160×106에 도달하면, 세포를 35 Gy에서 조사하고 분취하고, 나중에 사용하기 위해 다시 동결했다. Gen 2 TIL 로트를 해동하고 계수하고, 공배양 이전 48-72시간 동안 회수를 위해 배양에 투입했다. 조사된 K562 및 Raji 세포를 해동하고, 일정한 TIL의 수(500,000개 세포)를 갖는, 3가지 TIL:표적 비율(3:1, 1:1, 1:3)을 사용하여 TIL과 공동 배양했다. 또한 TIL 로트는 항-CD3/CD28/41BB로 코팅된 자성 비드로 자극되어 선택적 양성 활성화 대조군을 제공할 것이다. TIL 및 종양 세포주 단독 대조군이 또한 포함될 것이다. 공동배양의 개시-후 12시간 및 18시간에 상청액이 수확될 것이다. 상청액은 ELLA 자동화 ELISA-기반 플랫폼을 사용하여 사이토카인에 대해 평가될 것이다. 2개의 세포주가 TIL과 공배양될 것이다. 야생형 Raji(Cat. # CCL-86) 및 K562(Cat. # CCL-243) 세포는 ATCC로부터 상업적으로 수득되었다. Raji 세포는 버킷 림프종을 앓고 있는 환자로부터 유래된 인간 B 림프구 세포주이다. K562는 골수성 백혈병 세포주이다. Raji 세포에 대한 HLA 유형은 사용 이전에 확인되었다.
본 실시예에 대해, 당업자에게 알려진 일반적으로-이용가능한 실험실 재료 외에 다음 재료가 사용되었다: RPMI 1640 배지(ATCC, 미국 버지니아주 소재, Cat. #ATCC 30-2001); 글루타메이트(Gibco, 미국 매사추세츠주 소재 Cat. #30050-061); 베타-머캅토에탄올(Gibco, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #21985-023); TIL에 대한 인간 AB 혈청(Gemini, 미국 캘리포니아주 소재, Cat. #100-512); 종양 세포주에 대한 소 태아 혈청(ATCC, 미국 버지니아주 소재, Cat. #ATCC 30-2020); 젠타마이신(Gibco, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #15750-060); GMP 재조합 IL-2(CellGenix, 독일 소재, Cat. #1020-1000); 행크의 균형잡힌 염 용액, 또는 HBSS(Gibco, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #14175-095); CELLSTAR T25 플라스크(Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #07-000-225); G-Rex 6, 24웰 플레이트 및 10 플라스크(Wilson Wolf, 미국 미네소타주 소재, Cat. #P/N 80240M, P/N 80192M; #80040S); IFN-γ(제3 세대), 그랜자임 B, TNF-α(제2 세대) 및 MIP-1α용 ELLA 인간 다중분석물 카트리지(BioAgilytix, 미국 노스캐롤라이나주 소재, 키트 ID 127725); 인간 사이토카인 동결건조된 대조군(BioAgilytix, 미국 노스캐롤라이나주 소재, Cat. #89077); 및 CryoStor CS10 동결 배지(BioLife Solutions, 미국 워싱톤주 소재, Cat. #210373).
본 실시예에 대해, 당업자에게 알려진 일반적으로-이용가능한 실험실 장비 외에 다음 장비가 사용되었다: 단백질 단순 ELLA(BioAgilytix, 미국 노스캐롤라이나주 소재, Cat. #500-140); K2 세포 계수기(Nexcelom, 미국 매사추세츠주 소재); K2 계수 챔버(Nexcelom, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #SD100); JUN-AIR, 모델 84R-RP 진공 펌프(Sony, 미국 뉴욕주 소재); 및 Steri-Cycle i160 CO2 인큐베이터(ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠주 소재, Cat. #51030301).
22개의 무작위로 선택된 흑색종 Gen 2 TIL 로트를 조사된 Raji 및 K562 세포와의 공배양 시 활성화에 대해 테스트했다.
이론에 구속됨이 없이, 본 발명의 실시양태에서, 도 56에 도시되고 또한 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, MHC 우성 인식으로서 표적 세포 HLA-펩타이드 복합체와 TIL TCR 복합체의 동종이계 상호작용. MHC I 및 II 발현의 결여에 기인하여, K562 세포는 TIL과 Raji 세포의 공배양을 비교할 수 있는 기준선 활성화 수준을 제공할 것으로 예상된다. TIL 단독의 배양이 또한 기준선으로 사용될 수 있다.
종양 세포 샘플의 해동 및 배양. K562 및 Raji 종양 세포를 해동하고 10-14일 동안 배양하여 세포가 해동에서 회복되고, 배지에 적응하고, 연구 이전에 적절한 수로 확장되도록 허용했다. 배지(200mL)를 BSC에 넣기 전에 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온했다. 각각의 종양 세포 샘플에 대해, 10mL의 가온된 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비했다. 튜브에는 종양 계열 명칭이 라벨링된다. 2×106 내지 10×106 세포/1mL 바이알을 함유하는 세포의 단일 바이알을 37℃ 수조에서 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 해동했다. 부분적으로 해동된 바이알을 생물학적 안전 캐비닛 안으로 이동시켰다. 해동된 종양 세포의 내용물을 지정된 원뿔형 튜브로 이동시키고, 가온된 배지 0.5mL를 동결바이알에 천천히 점적 부가하고, 혼합되는 배지를 부가하면서 바이알을 휘젖는다. 그런 다음 동결바이알의 내용물을 위아래로 부드럽게 5-6회 피펫팅함에 의해 혼합했다. 바이알의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시켰다. 원뿔형 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 400 × g에서 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 매일 세포를 확인하고 세포가 약 70-80% 합류하면 1:4로 분할했다.
종양 세포의 수확. 현탁액에서의 종양 세포를 플라스크 또는 플레이트로부터 꺼내하고 종양 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브에 첨가하였다. 플라스크를 1×PBS 또는 종양 배지로 헹구고 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에 추가한다. 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리했다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 1mL 배지에 TIL을 재현탁하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하였다. 혈청 피펫으로 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합했다. 그런 다음 K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다.
K562 및 Raji 세포의 조사. Raji 및 K562 세포가 > 160×106 세포로 확장되면, 세포를 35 Gy에서 조사했다. 조사 후, K2 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 생존율을 평가했다. 세포를 CryoStor CS10에서 10×106 세포/mL로 동결시켰다.
TIL의 해동 및 회수. TIL 배지(CM1) 200mL를 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에 넣기 전에 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온하였다. IL-2 스톡 용액(6×106 IU/mL)을 제조하고 가온된 배지와 함께 BSC 안으로 이동시켰다. 10μL의 IL-2 스톡 용액(6×106 IU/mL)을 배지 안에 첨가함에 의해 300 IU/mL IL-2를 배지에 보충한다. 각 TIL 로트에 대해, 10mL의 가온된 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비하고 TIL 로트 번호를 라벨링한다. TIL 생성물의 이용가능성과 바이알당 세포 수에 기반하여 TIL 로트당 60×106 총 세포를 얻기에 충분한 바이알을 해동한다. 냉동 TIL 바이알은 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 해동된 바이알은 BSC 안으로 이동시킨다. 해동된 TIL 바이알과 PBMC(후자는 MLR 양성 대조군으로 사용됨)의 내용물을 그 다음 지정된 원뿔형 튜브로 이동시킨다. 가온된 배지(0.5mL)를 TIL 바이알에 천천히 점적 부가하면서 바이알을 휘젓고 혼합하는 배지를 추가한다. 각 TIL 바이알의 내용물을 5-6회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합한다. TIL 바이알 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시킨다. 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리한다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 TIL 로트를 1mL 배지에 재현탁하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하고, 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합한다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다. TIL 로트를 CM1 배지에서 1.5×106/3×106 세포/mL 및 IL-2의 3000 IU/mL의 농도로 재현탁한다. 세포는 G-Rex 10 플라스크 또는 G-Rex 6웰 플레이트를 사용하여 48-72시간 동안 37℃/5% CO2에서 회수하도록 허용된다.
공배양을 위한 TIL 제조. 200mL의 배지를 BSC에 넣기 전에 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온한다. 10mL의 가온된 배지를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비한다. TIL 샘플은 G-Rex 10 플라스크 또는 G-Rex 6-웰 플레이트로부터 수확하고 지정된 원뿔형 튜브로 이동시킨다. 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리한다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 되어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여 TIL 로트를 1mL TIL 배지에 재현탁하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 배지로 2mL가 되도록 하고, 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합한다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다. TIL 로트는 TIL 배지에 5×105 세포/mL로 재현탁된다.
공배양을 위해 조사된 K562 세포, Raji 세포 및 PBMC를 해동. 200mL의 배지를 BSC에 넣기 전에 37℃ 수조에서 15±5분 동안 가온한다. 가온된 배지는 BSC로 이동시킨다. 각 세포주에 대해, 가온된 배지 10mL를 갖는 50mL 원뿔형 튜브를 준비하고 적절하게 라벨링한다. 동결된 K562 및 Raji 세포는 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37℃ 수조에서 해동된다. 해동된 위성 바이알을 BSC 안으로 이동시킨다. 해동된 K562 및 Raji 세포주의 내용물을 지정된 원뿔형 튜브로 이동시키고, 가온된 배지 0.5mL를 동결바이알 안으로 천천히 점적 부가하고, 혼합하는 배지를 첨가하면서 바이알을 휘젖는다. 바이알의 내용물을 부드럽게 5-6회 위아래로 피펫팅하여 혼합한다. 세포 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 이동시킨다. 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 400 × g에서 함께 원심분리한다. 각 튜브로부터 상청액을 조심스럽게 꺼내어, 세포 펠렛을 회피한다. 튜브 랙에 대해 튜브를 부드럽게 긁어 세포 펠렛을 느슨하게 한다. 1mL 피펫터를 사용하여, TIL을 1mL 배지에 재현탁하고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 더 파괴한다. 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 배지로 5mL가 되도록 하고, 혈청 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 철저하게 혼합한다. K2 세포 계수기에서 계수하기 위해 세포 현탁액의 200μL 분취액 2개를 꺼냈다. 세포를 종양 배지에 5×105 세포/mL의 농도로 재현탁하고 TIL 샘플이 제조되면 공배양을 위해 인큐베이터에 넣는다.
TIL 및 종양 세포 공배양 설정. 각 TIL 로트는 다음 TIL:표적 비율을 사용하여 조사된 K562 세포 및 Raji 세포와 별도로 공배양된다: 3:1(5.0×105:1.67×105); 1:1(5.0×105:5.0×105); 및 1:3(5.0×105:1.5×106). 공배양을 위한 TIL 샘플은 아래에서 볼 수 있듯이 총 24개 조건에 대해 48-웰 플레이트의 1 웰에 1mL로 모든 조건에 대해 500,000개 세포로 3중으로 도말된다. 플레이트당 2개의 Gen 2 TIL 계통이 실행될 수 있다. 한 번에 최대 3개의 플레이트가 설정된다. 웰당 총 2mL에 대해 1mL의 배지가 추가된다. αCD3/αCD28/α41BB 비드(본원의 다른 부분에 기술된 바와 같이 선택적 대조군으로 사용됨)를 함유하는 웰의 경우, 제조업체의 지시에 따라 비드를 세정하고 제조하고 추가한다. 선택된 배양 기간 동안 플레이트를 인큐베이션한다(5% CO2, 37℃). 플레이트 레이아웃은 도 57에 나타나 있으며 일반적인 실험 계략도는 도 58에 나타나 있다.
상청액의 수집 및 사이토카인에 대한 평가. 플레이트의 바닥에 있는 세포를 방해함이 없이 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸다. 12-시간 및 18-시간의 공배양에서 50μL의 상청액을 꺼내고 에펜도르프 튜브 또는 96-웰 U 플레이트로 이동시킨다. 이 단계를 2개 이상 96-웰 플레이트로 반복하여 2개의 백업 플레이트를 만든다. 샘플을 식별하기 위해 플레이트를 라벨링한다. 백업 플레이트는 -80℃에서 보관한다. 각 96-웰 플레이트는 접착 씰로 밀봉하고 사용할 때까지 4℃에서 보관한다. ELLA 플랫폼을 사용하여 IFN-γ 및 그랜자임 B에 대해 상청액을 평가한다. CD25, CD69, CD134, CD137 또는 CD150과 같은 본원에 기술된 관심있는 마커를 평가하기 위해 추가 유세포 분석 실험을 수행할 수 있다.
결과. 22개 TIL 샘플의 결과는 도 59 내지 도 97에 도시되어 있다. 샘플 007-016(2중으로 수행된, Raji 및 K562 세포로 1:3 비율 조건을 제외하고, 1회 수행됨), 샘플 019-006(모든 조건에 대해 2중으로 수행됨) 및 022-001(모든 조건에 대해 1회 수행됨)을 제외하고 모든 실험은 3중으로 수행되었다. IFN-γ 및 그랜자임 B 결과에 대해 12시간 및 18시간의 공배양 기간 둘 모두가 도시되고, TNF-α 결과에 대해 18시간 공배양 기간이 도시된다. 결과는 K562 음성 대조군 세포주와 함께 사용될 때 IFN-γ 및 그랜자임의 생산에서 배수-증가를 보여주고 공배양 시스템이 동종이계 MHC-TCR 계합을 통해 TIL을 활성화하고 Gen 2 제조, 동결보존 및 해동 후 TIL 생성물의 효력의 측정을 제공하는데 사용되었다는 것을 입증하는 것을 포함하여, 다양한 TIL 샘플에 대한 검정의 놀랍게 우수한 수행성을 예시한다. 검정은 본질적으로 다기능이어서, 하나의 분석물 또는 분석물의 조합을 효율적인 방식으로 선택할 수 있게 한다. 일반적으로, IFN-γ와 그랜자임 B 둘 모두를 고려할 때 18-시간 공동배양 시점이 더 강력한 시점이었다. TNF-α가 또한 12-시간 시점에서 평가하여 적합한 경우 활용될 수 있다. 1:3(TIL:표적) 비율이 이 실시예에서 가장 큰 사이토카인 분비를 초래했다. TIL:표적 비율 범위에 걸친 용량 반응은 놀랍게도 TNF-α에 대해 주목할만했다. TIL:표적 비율은, 예를 들어 1:5, 1:10 또는 1:20으로 증가될 수 있다.
실시예 17: 회복 시간 평가
본 실시예에서, 동결 TIL 생성물의 해동 후 회복 시간을 조사했다. 본 발명의 실시양태이기도 한 실험 계략도는 도 98에 묘사되어 있다. Gen 2 과정을 사용하여 제조된 5개의 연구 TIL 로트를 해동하고 해동 후 72, 48 또는 24시간 동안 회복되도록 허용하고, 실시예 16에 기술된 방법을 사용하여 1:3 TIL:표적 비율에서 Raji 및 K562 세포와 공배양 시 IFN-γ 및 그랜자임 B에 대해 평가했다. 결과는 로트 M1173의 경우 도 99, 로트 M1152의 경우 도 100, 로트 M1187의 경우 도 101, 로트 M1179의 경우 도 102, 및 로트 M1183의 경우 도 103에 도시되어 있다. IFN-γ에 대한 결과는 도 104와 105에 요약되어 있고, 그랜자임 B에 대한 결과는 도 106과 107에 요약되어 있다. IFN-γ에 대한 3가지 판독값 모두(절대값, TIL에 비한 배수, TIL 플러스 K562 세포에 비한 배수)는 회복 조건 전반에 걸쳐 유사했다. 72-시간 TIL 회복은 그랜자임 B 분비에 대해 TIL 플러스 K562에 비해 TIL 플러스 Raji의 더 큰 배수 유도를 초래했다. 감소된 세포 수율과 생존율이 24-시간 회복 샘플에서 관찰되었다.
실시예 18: 마스터 세포 은행 제조
본 실시예에서, 마스터 세포 은행을 Raji 및 K562 세포주에 대해 제조한다. 이러한 마스터 세포 은행은 인간 사용을 위한 TIL, MIL 또는 PBL 생성물의 방출 및/또는 안정성 테스트를 위한 검정에 사용하기에 적합하며, 이러한 생성물은 미국 식품의약국과 같은 보건 당국에 의해 규제된다. 25개 바이알을 사용하여 파일럿 연구를 먼저 수행하며, 이는 그 다음 본 발명의 하나 이상의 효력 검정에서 성능에 대해 평가된다. 그런 다음 Raji 및 K562 세포주에 대한 마스터 세포 은행은 바이알당 1mL 부피에, mL당 5×106 내지 5×106 세포를 함유하는 500개 바이알을 사용하여 제조된다. 세포 배양 확장은 필요에 따라 수행된다. 그런 다음 직접 접종에 의한 방법 적합성 테스트, 직접 접종에 의한 무균성, DNA 증폭에 의한 신속한 마이코플라스마 검출을 위한 간섭 테스트, DNA 증폭에 의한 신속한 마이코플라스마 검출, 시험관내 외래성 바이러스 검정 검출(세포주 MRC-5, Vero, 및 HeLa, 바이러스 PIV-5) 및 시토크롬 C 산화효소 서브유닛에 의한 식별 1을 포함한 특성화 및 방출이 수행된다. 분석의 인증서 및 배치 기록이 제조된다. Raji 및 K562 세포주는 그 다음 방법 검증 및 테스트 절차에 사용하기에 적합하게 적격화된다. Ramos, U937, Thp1 및 Daudi 세포에 대한 마스터 세포 은행도 유사하게 제조될 수 있다.
실시예 19: THP1 세포로 동종반응성 공배양 검정
본 실시예에서, 인간 단핵구 백혈병 세포주인, Thp1(THP-1로도 알려짐) 표적 세포주와 TIL의 공배양을 사용하는 동종반응성 공배양 검정의 실시양태가 입증된다. 이론에 구속되지 않고, TIL 활성화는 도 108에 도시된 바와 같이 Thp1 세포의 표면에서 일치하지 않는 펩타이드-MHC 복합체(MHCp)의 TCR에 의한 동종인식 시 유도되는 것으로 여겨진다. 이 검정에 대한 판독값은 표적 세포의 사멸이며, 이는 리포터 화학발광 단백질의 방출에 의해 검출될 수 있다. 검정은 예를 들어 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 마스터 세포 은행 및 작업 세포 은행을 생성하기 위해 GMP 조건 하에서 생산될 표적 세포주의 사용을 요구한다. 표적 세포는 β-gal 효소 단편인, ProLabel®(ePL)로 태그된 하우스키핑 단백질을 안정적으로 발현하도록 조작되었다. TIL, MIL 또는 PBL을 포함한 T 세포와 공배양하고 이어서 세포독성 매개된 막 파괴 시, ePL β-gal 단편이 배지로 방출된다. 공배양에 이어서, β-gal 효소의 효소 수용체 단편이 첨가되어 추가된 기질을 가수분해하는 활성 β-gal 효소를 형성하고 죽은 표적 세포의 수에 비례하는 화학발광 신호를 생성한다. 판독값은 표적 세포 사멸, 예를 들어, Thp1 또는 Raji 세포에 대한 세포 사멸에 대해 특이적이고 이를 직접적으로 측정한다. 앞선 과정은 도 109에 예시되어 있다. 이 검정의 작용 메커니즘은 동종이계 반응(예를 들어, 혼합된 림프구 반응 또는 MLR), 예컨대 T 세포가 펩타이드-동종이계 MHC 복합체를 인식하는 능력이다.
유전적으로 변형된 Thp1 세포주는 2가지 TIL 해동-후 조건(동결 TIL 로트에서 시작)을 사용하여 테스트되었다: (1) 해동 후 18 내지 24시간 동안 밤새 휴지됨 및 (2) 해동-후 휴지되지 않음. 테스트된 효과기:표적(E:T) 비율은 제1 조건의 경우 35:1 내지 2.5:1 및 제2 조건의 경우 10:1 내지 1:10이었다. 두 조건 모두 웰당 10,000개 표적 세포를 사용했다. 테스트된 공동배양 기간은 제1 조건의 경우 4시간, 8시간, 16시간, 36시간이었고 제2 조건의 경우 하룻밤(16 내지 24시간)이었다. 세포독성은 제1 조건에 대한 용량- 및 시간-의존적 반응과 제2 조건에 대한 용량-의존적 반응에 의해 관찰되었다. 도 110은 제1 조건의 결과를 나타낸다. 도시된 데이터는 3회 실험으로부터 평균이다. 도 111은 제2 조건의 결과를 나타낸다. 두 조건 모두에서 0% 세포독성 신호는 효과기 세포가 없음에 해당하고 100% 세포독성 신호는 완전히 용리된 표적 세포에 해당한다.
실시예 20: 공배양 동안 IL-2를 사용한 TIL 효력 방법
본 실시예에서, 본 발명의 효력 방법은 상기에 기술되고 실시양태 A로서 도 112에 예시된 바와 같이, 3000 IU/mL에서 IL-2를 초기 첨가한 CM1 배지와 비교하여 (도 112에서 실시양태 B, C, D, 및 E로 예시된 바와 같은) 공배양 동안 연속적으로 첨가된 300 IU/mL IL-2를 갖는 AIM-V 배지를 사용하여 추가로 평가된다. 실시양태 B, C, D 및 E는 공배양 동안 추가된 AIM-V에서 300 IU/mL IL-2를 포함하며, 이는 최종 Gen 2 및 Gen 3 생성물 제형의 실시양태와 일치하고 더 나은 시스템 적합성을 제공한다. AIM-V 배양 배지는 최종 세포 확장에 일치하도록 무혈청이고 또한 더 나은 시스템 적합성을 제공한다. 공배양 동안 IL-2를 첨가하면 사이토카인 농도가 증가한다. 해동-후 즉시 공배양의 개시(즉, TIL 회복을 위한 휴지 기간 없음)는 투여 시 TIL 의약품을 더 밀접하게 나타내기 때문에 또한 이점을 제공할 수 있다. 휴지 기간이 길어지면 TIL의 회복이 촉진되고 안정성을 나타내지 않을 수 있고 또한 제조 과정 실패를 가릴 수 있다.
도 113은 TIL 세포주의 해동 후 휴지 기간의 함수로서, 서로 다른 공배양 배지 조건 하에서 2개의 서로 다른 TIL 세포주인, M1179 및 M1183에 대한 총 생존가능한 세포 계수(TVC) 및 퍼센트 생존율의 평가의 결과를 나타낸다. 퍼센트 생존율의 감소는 처음 24-시간 기간에서 관찰되었고, TVC 및 증식의 증가는 >24시간(~1배가/일) 동안 휴지한 TIL에서 관찰되었다. 이들 결과는 24시간의 휴지 후 회복된 TIL이 의약품의 동일한 세포 집단을 나타내지 않을 수 있음을 시사한다. 두 TIL 세포주 모두에 대해, 해동 후 약간의 감소가 관찰되며, 그 후 회복이 시작된다.
300 IU/mL의 IL-2 유무에 관계없이 Raji 및 K562 세포와 공배양의 비교 결과는 표 51, 도 114 및 도 115에 제공된다. 실험은 TIL 계통 M1179 및 M1183의 해동 직후(즉, 휴지 기간 없음) AIM-V 배지에서 수행되었다. 결과는 IL-2의 첨가가 IFN-γ 분비를 증강시킨다는 것을 입증한다. IL-2를 첨가하면 IFN-γ의 절대 농도 값과 배수 변화가 증가한다. IL-2는 TIL 단독을 사용하여 수행된 대조군의 기준선을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 반복성은 이들 실험 동안 공배양 복제에 걸쳐 평가되었다. 11%의 단일 바이알 변동의 계수(CV) %가 얻어졌다.
표 51. 300 IU/mL IL-2가 있거나 없는 2개의 TIL 세포주와 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
다양한 배양 조건 및 휴지 기간이 또한 표 52, 도 116 및 도 117에 제공된 결과로 조사되었다. 결과는 AIM-V 및 IL-2가 공배양 배지에 사용되는 경우 양호한 IFN-γ 분비를 위해 72시간의 회복이 필요하지 않음을 나타낸다.
표 52. TIL 해동 후 휴지 없음("0시간 휴지"), 300 IU/mL의 IL-2를 갖는 AIM-V 배지에서 72시간의 휴지 후("AIM-V+IL2에서 72시간 휴지"), 300 IU/mL의 IL-2를 갖는 CM1 배지에서 72시간의 휴지 후("CM1+IL2에서 72시간 휴지"), 및 300 IU/mL의 IL-2가 없는 CM1 배지에서 72시간의 휴지 후("CM1-IL2에서 72시간 휴지")를 포함하여, 2개의 TIL 세포주(M1179 및 M1183)에 대해 서로 다른 배지 배양 조건으로 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
해동-후 회복 기간이 연장됨에 따른 사이토카인 분비 효과를 결정하기 위한 실험이 또한 수행되었으며, 결과는 표 53, 도 118 및 도 119에 요약되어 있다. 이들 실험에서, 휴지 배지는 3000 IU/mL IL-2를 갖는 CM1이었고 공배양 배지는 300 IU/mL IL-2를 갖는 AIM-V였다. 절대적인 IFN-γ 분비는 Raji 세포와의 공배양에 대한 모든 조건에 걸쳐서 검출되었다. TIL 단독에 비한 IFN-γ에서의 배수 변화는 모든 휴지 조건에 걸쳐서 일관되었다. TIL 단독과 K562 음성 대조군의 사용과의 사이에 배수 변화에서의 차이는 24시간 초과 시점에서 관찰되었고 세포 집단 변화를 나타낼 수 있다.
표 53. 2개 TIL 세포주(M1179 및 M1183)의 서로 다른 TIL 해동-후 회복 기간으로 수행된 Raji 및 K562 공배양 실험의 결과.
72-시간 기간에 걸쳐 세포 집단 특성을 결정하기 위해 유세포 분석을 수행했다. 시간 연구는 표 54 및 표 55에 제공된 바와 같이 두 실험으로 수행되었다.
표 54. 실험 1 설계.
표 55. 실험 2 설계.
이들 설계에 따라, 세포를 24-웰 플레이트에 1×106/mL의 농도로 시딩하고 5% CO2와 함께 37℃에서 휴지시켰다. 세포를 각각의 특정 시점 +/- 1시간에 수확했다. 생존율과 TVC는 각 시점에서 수행되었다. 세포를 FMO 대조군으로 적격화된 잔류 흐름 검정을 사용하여 염색되고 동일한 날 획득으로 BD FACSCanto 유세포 분석기에서 획득되었다(BD Biosciences, Inc., 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재). 결과는 표 56 및 표 57에 요약되어 있으며, 여기서 AIM-V + IL2 결과는 실험 1과 실험 2로부터 평균화되었다.
표 56. 휴지 조건(0 내지 72시간, IL-2 및 혈청)에 걸친 T 림프구 집단 변화.
결과는 전체 집단의 % CD45+ 및 % CD3+ 세포 집단이 모든 배지에서 IL-2로 72시간에 걸쳐 일관되었음을 나타낸다. 그러나, 살아있는 집단의 % CD45+ 및 CD3+ 집단은 모든 조건에 대한 24시간의 휴지 후 약 50% 감소한다. 결과는 24시간 초과의 휴지로 배지 조건(IL-2, 혈청)에 걸쳐 다양하다.
표 57. 휴지 조건(0 내지 72시간, IL-2 및 혈청)에 걸친 잔류 세포(B 세포, NK 세포 및 단핵구) 변화.
잔류 세포 집단은 해동-후 휴지가 길어질수록 증가하는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, B 세포 집단은 IL-2가 없는 72시간의 휴지에서 ~20% 증가하는 반면, NK 세포는 24시간의 휴지 후 4-5% 증가한다. 의약품에 대한 평균 잔류 세포 집단은 전형적으로 <1%이다.
도 120은 TIL 계통 M1179에 대한 부모 살아있는 집단의 잔류 세포 집단의 유세포 분석을 도시한다. 도 121 및 122는 각각 Raji 및 K562 세포주의 증식 프로필을 도시한다.
결론적으로, 공배양에서 300 IU/mL에서 IL-2의 첨가는 사이토카인 신호를 증가시키고 IL-2가 없는 배지에 비해 IFN-γ에 대한 변화 배수를 증가시킨다. 공배양에서의 세포 집단은 24시간의 휴식 후 CM1 배지에서 변화(성장, 분화 및 이질성 포함)하는 것으로 관찰되어, 해동 후 및 공배양 검정을 시작하기 전에 TIL에 대한 72시간의 휴지가 이 검정의 버전을 제조 과정 실패에 덜 민감하게 하는데 이는 생성물에 회복 기간 동안 회복 및 확장할 가능성이 제공되기 때문이다. AIM-V 및 IL-2는 Gen 2 및 Gen 3 TIL 생성물로 매트릭스 적합성에 대해 더 적합하다. 간섭에 기인하여 리간드 조합된 검정에서는 혈청이 권장되지 않는다.
실시예 21: 흑색종 TIL 계통 및 RAJI, THP1, RAMOS 및 U937 표적 세포로 동종반응성 공배양 검정
본 실시예는 K562 세포주 음성 대조군으로의 것을 포함하는, 본 발명의 효력 검정에서 Raji, Thp1, Ramos 및 U937 표적 세포주를 포함하는 다중 표적 세포주의 사용을 탐구한다. 실험 프로토콜은 도 123에 요약되어 있다.
공배양 시스템은 동종이계 MHC-TCR 계합을 통해 TIL을 활성화하는데 사용되었다. 4개의 연구 흑색종 Gen 2 TIL 생성물은 Raji, Ramos, Thp1 및 U937 세포와 K562 세포를 3:1, 1:1 및 1:3(종양 세포에 대한 TIL)의 비율로 공배양에 의해 IFN-γ 및 TNF-α에 대해 평가되었다. 결과는 도 124 내지 도 129에 도시되어 있다. TNF-α 및 IFN-γ 둘 모두에 대한 사이토카인 분비 및 배수 유도는 평가된 종양 세포 전반에 걸쳐 가변적이었다. 일반적으로, 여기에서 선택된 4개의 TIL 세포주에 걸친 종양주에 대한 반응성은 가장 큰 것부터 가장 작은 것 순으로 다음과 같다: Thp1, U937, Raji 및 Ramos. TIL 단독 또는 K562 세포와 비교하여 Raji 세포에 반응하여 IFN-γ의 유사한 수준을 분비한 4개의 평가된 Gen 2 TIL 계통 중 2개는 U937 또는 Thp1 존재에서 공배양했을 때 더 많은 사이토카인을 분비했다. TIL 없이 공배양한 경우 TNF-α는 Raji, Ramos, Thp1 및 U937 세포에 의해서 분비되었지만 K562 세포에 의해서는 분비되지 않는 것으로 관찰되었다. 종양 세포주에 의해 분비된 TNF-α의 양은 다양한 세포주에 걸쳐 다양했고 종양 세포의 수가 증가함에 따라 증가했으며, 본 실시예에서는 1:3에서 가장 유의한 효과가 관찰되었다.
본 발명의 효력 검정으로 사용하기 위한 예시적인 표적 세포주의 HLA 특성은 표 58에 제공되어 있다. 다양한 정도의 HLA 다양성 및/또는 면역원성은 이들 세포주 및 당업계에 알려진 다른 적합한 표적 세포주의 사용으로부터 이용가능하다.
표 58. 예시적인 효력 검정 표적 세포주의 HLA-A, -B 및 -C 특성.
도 134는 4개의 테스트된 흑색종 TIL 계통에 대한 서로 다른 표적 세포주 및 세포주 조합의 IFN-감마 수행성을 요약한다.
도 135는 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대해, 조합 표적 세포주를 포함한, 테스트된 표적 및 음성 대조군 세포주에 대한 TNF-α 분비(pg/mL)를 도시한다. 도 136은 (TIL + 종양 세포주 또는 조합)/TIL 단독의 배수 변화로서 TNF-α 분비를 도시하는 반면, 도 137은 동일한 4개의 흑색종 TIL 계통에 대해, (TIL + 종양 세포주 또는 조합)/(TIL + K562)의 배수 변화로서 TNF-α 분비를 도시한다.
도 138은 흑색종 TIL 세포주 M1152, M1187, M1198 및 M1200에 대해, 조합 표적 세포주를 포함한, 테스트된 표적 및 음성 대조 세포주에 대한 그랜자임 B 분비(pg/mL)를 도시한다. 도 139는 (TIL + 종양 세포주 또는 조합)/TIL 단독의 배수 변화로서 그랜자임 B 분비를 도시하는 반면, 도 140은 동일한 4개의 흑색종 TIL 계통에 대해, (TIL + 종양 세포주 또는 조합)/(TIL + K562)의 배수 변화로서 그랜자임 B 분비를 도시한다.
결과는 TIL 효력의 평가에서 서로 다른 표적 세포주 및 이의 조합의 효과를 입증한다.
실시예 22: 비소세포폐암 TIL 계통 및 RAJI, THP1, RAMOS 및 U937 표적 세포로 동종반응성 공배양 검정
10개의 비소세포폐암(NSCLC) TIL 계통을 도 141의 실험 프로토콜을 사용하여 서로 다른 표적 세포주 및 표적 세포주의 조합을 사용하여 평가했다.
10개의 NSCLC TIL 계통 중 4개는 상업적으로 공급되는 공여자 종양으로부터 성장한 연구 세포주였다. 이들 4개 TIL 계통으로부터의 결과는 도 142 내지 144에 도시되어 있다.
10개의 NSCLC TIL 세포주 중 다른 6개는 Iovance Biotherapeutics, Inc.가 후원하는 항-PD-1 항체로 치료 후 NSCLC 환자에서의 TIL 요법의 비-등록 연구에서 임상적 시험 참가자로부터 수득된 임상적 세포주였다. 이들 6개의 TIL 계통으로부터의 결과는 도 145 내지 147에 도시되었다.
TIL 단독에 비한 배수로서 IFN-γ 분비에 대한 임상적 NSCLC 결과의 요약은 도 148에 도시되어 있고, K562 음성 대조군 세포와 공동배양된 TIL에 비한 배수로서 IFN-γ 분비에 대한 임상적 NSCLC 결과의 요약은 도 149과 같이 도시되어 있다.
본 실시예의 10개 NSCLC 로트와 9개 흑색종 로트를 포함하는 19개 로트의 요약은, TIL 단독에 비한 배수로서, 도 150에 도시되어 있고, K562 음성 대조군 세포와 공배양된 TIL에 비한 배수로서 IFN-γ 분비에 대해서는 도 151에 도시되어 있다.
실시예 23: 조사된 및 비-조사된 표적 세포의 비교
조사된 Raji 및 K562 세포의 사용을 300 IU/mL IL-2 및 AIM-V 배지로 실시예 20에 기술된 공배양 방법을 사용한 증식(총 생존가능한 세포), IFN-γ 분비, 산란 및 세포 표면 마커에 의한 형태학을 포함한 유세포 분석 특성 및 세포사멸에 대한 아넥신 V 염색을 관찰함에 의해 비-조사된 Raji 및 K562 세포와 비교했다. 조사는 X-Rad 160 조사기(Precision X-ray, 미국 코네티컷주 노스브랜포드 소재)를 사용하여 30cm 및 420rad/분에서 5000rad의 조건에서 수행되었다.
도 152는 Raji 및 K562 세포의 조사가 일반적으로 24시간의 공배양 시간 동안 증식에 최소한의 영향을 미쳤다는 것을 도시한다. 조사된 Raji 세포는 24-시간 배양에서 농도에 걸쳐서 증식이 18 내지 27% 증가했다. 비-조사된 Raji 세포는 24-시간 배양에서 농도에 걸쳐서 증식이 2 내지 14% 증가했다. 조사된 K562 세포는 24-시간 배양에서 농도에 걸쳐서 15% 감소에서 8% 증가까지 다양했다. 비-조사된 K562 세포는 24-시간 배양에서 농도에 걸쳐서 증식이 14 내지 34% 증가했다.
도 153은 테스트된 2개의 자궁경부암 TIL 로트를 사용하여 비-조사된 Raji 세포 대 조사된 Raji 세포로 자극했을 때 TIL 세포주가 더 높은 농도의 IFN-γ를 분비하는 것으로 밝혀졌다는 것을 도시한다.
표 59 및 도 154에서의 유세포 분석 결과는 조사가 2개의 모니터링된 세포 표면 마커뿐만 아니라 HLA 클래스 I 발현을 감소시키는 것으로 관찰되었음을 입증한다.
표 59. 세포 표면 마커 및 HLA 클래스 I 발현에 대한 조사의 효과.
결과는 비-조사된 Raji 및 K562 세포의 증식이 효력 검정의 수행에 적합한 공배양의 기간인 24시간 동안 무시할 수 있음을 보여주었다. 24시간에 걸쳐 비-조사된 Raji 세포의 증식(<14%)은 조사된 Raji 세포의 증식(<27%)보다 적었으므로 방사선조사는 여기에 사용된 TIL 계통으로 Raji 세포에 대한 24-시간 배양 기간 동안 증식된 증가에 거의 영향을 미치지 않았다. IFN-γ 분비는 비-조사 조건에 대비해 조사 조건에서 감소되었으며, 이는 일반적으로 조사된 Raji 세포에 대해 HLA-ABC의 하향-조절과 상관관계가 있었다(MFI에 의해 -26%). 또한 조사는 유세포 분석에 의한 전방 대 측면 산란 관찰을 사용하여 K562와 Raji 둘 모두에서 형태학적 변화를 유도하는 것으로 관찰되었다. 마지막으로, 말기-단계의 세포사멸은 Raji 세포에 대한 조사 조건을 사용하여 증가되었고, 아넥신 V 염색에 의해 관찰된 바와 같이 비-조사 조건과 비교하여 K562에 대한 세포사멸의 모든 단계에 걸쳐 증가했다.
요약하면, 결과는 비-조사된 Raji 및 K562 세포가 본 발명의 효력 검정으로 사용될 수 있거나, 대안적으로 단지 Raji(또는 다른 표적 세포)만 조사될 수 있거나 또는 단지 K562 세포만 조사될 수 있음을 입증했다.
실시예 24: 공배양 조건의 평가
비-조사된 Raji 표적 세포를 갖는, 300 IU/mL IL-2 및 AIM-V 배지로 실시예 20에 기술된 공배양 방법을 사용하여, TIL은 웰당 1×106 내지 2×106 TIL의 범위 내의 밀도로 시딩했고 Raji 세포는 1:1 및 3:1 비율의 중간-점에 특정한 농도 범위(500,000개 세포)로 시딩했다. IFN-γ 방출은 18, 24 및 30시간의 3가지 공배양 기간 동안 3중으로 평가되었다. 결과는 표 60 및 도 155에 제공되어 있다.
표 60. 세포 표면 마커 및 HLA 클래스 I 발현에 대한 조사의 효과. "M", "L" 및 "C"로 시작하는 TIL 로트는 각각 흑색종, NSCLC 및 자궁경부 TIL 계통을 나타낸다.
결과는 30시간에서 신호 포화의 증거가 없음을 나타내고, TIL 값에 비한 배수 변화는 시점에 대해 상대적으로 둔감했다는 것을 나타냈다. TIL 단독으로부터 IFN-γ 신호는 30시간에서 최소 증가를 나타냈다.
실시예 25: 종양 표적 세포주의 비교
300 IU/mL IL-2 및 AIM-V 배지로 실시예 20에 일반적으로 기술된 공배양 방법을 사용하여, 본 실시예에서는 종양 표적 세포주의 추가 비교를 수행했다. 비-조사된 Thp1, U937 및 Raji 세포주를 사용했다. 유사한 비교가 본원에 제공된 교시에 기반한 다른 방법, 종양 표적 세포주 및 음성 대조군을 사용하여 수행될 수 있다. 도 156은 12개의 흑색종 TIL 계통의 연구를 위한 실험 설계를 도시한다. 표 61은 각 실험에 대한 TIL 및 표적 세포의 수를 요약한다.
표 61. 실험 설계에 대한 웰당 TIL 및 표적 세포의 수, 및 웰당 총 생존가능한 세포(TVC).
결과는 (대조군으로서 TIL 단독에 비해) 1.0×106 TVC/웰에 대해 도 157, (대조군으로서 TIL 단독에 비해) 2.0×106 TVC/웰에 대해 도 158, (대조군으로 K562 세포에 비해) 1.0×106 TVC/웰에 대해 도 159, 및 (대조군으로 K562 세포에 비해) 2.0×106 TVC/웰에 대해 도 160에 요약되어 있다. 일반적으로, 웰당 총 TIL을 늘리면 IFN-γ 신호가 증강된다. 테스트된 대부분의 TIL 로트에 대해, 3:1 비율은 테스트된 3가지 종양 세포주 모두에 대해 IFN-γ에 대한 가장 큰 신호를 입증했다. 본 연구에서 최적의 시딩 밀도는 대략적으로 2×106(TVC/웰 또는 웰당 총 세포)인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 Thp1은 강력한 IFN-γ 신호를 유도하기 위해 놀랍게도 더 적은 TIL 세포와 더 낮은 TVC를 필요로 한다.
야생형 및 유전적으로 변형된 Thp1(THP-1로도 지칭됨) 세포의 비교도 수행되었다. 유전적으로 변형된 Thp1 세포는 실시예 19에 기술된 바와 같이 사멸 검정에 대해 사용될 수 있다. 도 161에 도시된 실험 절차를 수행하였다. 결과는 7개 TIL 계통에 대해 도 162에 pg/mL 단위로 IFN-γ의 절대값에 대해 도시되어 있고 도 163에 TIL 단독에 비한 배수 변화에 대해 도시되어 있다. 결과는 야생형과 유전적으로 변형 Thp1이 공배양 방법을 사용하여 유사하게 수행되고 (본원의 다른 곳에 기술되거나 당업계에 공지된 바와 같은 유전적 변형을 사용하여) IFN-γ 또는 다른 사이토카인이 측정되어 지는지 여부 또는 발광에 의한 세포 사멸이 측정되어 지는지에 따라 TIL 샘플의 분석에 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 26: HLA 차단 항체를 사용한 음성 대조군
본 발명의 공배양 검정은 또한 K562 세포, 표적 세포의 유전적 녹아웃 또는 기타 세포-기반 음성 대조군의 사용 대신에 또는 이에 더하여 HLA 차단 항체를 사용하는 음성 대조군에 의해 보충되거나 뒷받침될 수 있다. 본 실시예는 HLA 차단 항체의 사용을 입증한다. 이론에 구속됨이 없이, 본 발명의 검정에서 제안된 HLA의 차단은 도 164에 묘사되어 있다.
본 실시예에 사용된 HLA-I 차단 항체는 Biolegend, Inc.(미국 캘리포니아 주 샌디에고 소재)에서 수득된 클론 W6/32(항-HLA-ABC)였으며 초엽 정제된 형식이다. 본 실시예에 사용된 HLA-II 차단 항체는 BD Biosciences, Inc.(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에서 수득된 클론 TU39(HLA-DR, DP, DQ)였으며 아지드가 없고 낮은 내독소(≤0.01 EU/μg(≤0.001ng/μg))를 갖는, 방부제를 함유하지 않은 수성 완충 용액으로 공급되고 0.2μm 멸균 여과된, 기능성 등급 형식이다.
일반적인 실험 절차는 다음과 같았다. 표적 세포는 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 항체를 플러스하여 도말되고 TIL을 추가하기 이전에 적어도 1-2시간 동안 인큐베이션되었다. TIL:표적 비율은 3:1(1.5×106 TIL 대 5×105 표적 세포)이지만 초기 실험은 1:1 TIL:표적 비율로 수행되었다. 각 조건은 일반적으로 3중으로 수행되었다. 표적 세포를 해동하고 AIM-V에 재현탁하고 NC200 또는 K2 세포 계수기로 계수했다. 세포를 300 IU/mL IL-2를 갖는 1mL의 AIM-V 배지에 1×106으로 48 웰 배양 플레이트에 시딩했다. HLA 차단 항체를 다음 단락에 명시된 농도(1-20μg/mL의 범위, 스톡 농도는 1mg/mL였음)로 즉시 첨가했다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 수집하고 결합되지 않은 항체를 포스페이트-완충 식염수로 세정했다. 세포를 아래 표시된 HLA 항체 결합 또는 세포사멸에 대해 염색하고 BD FACSCanto II 유세포 분석기(BD Biosciences, Inc., 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에서 분석했다.
검정 표적 세포의 생존율에 대한 HLA-I 및 HLA-II 차단 항체의 효과를 먼저 평가했다. 상기에 기술된 바와 같이 Thp1 및 U937 세포의 배양물에 첨가된 HLA-I 차단 항체의 결과는, 고정가능한 살아있는/죽은 생존율 염료로 세포를 염색하는 추가 단계와 함께, 도 165에 도시되어 있다. 결과는 생존율의 손실이 없음을 나타낸다. 유사하게, 상기에 기술된 바와 같이 Thp1 및 U937 세포의 배양물에 첨가된 HLA-II 차단 항체의 결과는, 다시 고정가능한 살아있는/죽은 생존율 염료로 세포를 염색하는 추가 단계와 함께, 도 166에 도시되어 있고, 또한 생존율의 손실이 없음을 나타낸다. 도 167에서, Raji 야생형 세포는 항-HLA-II 항체의 첨가 및 살아있는/죽은 생존율 염색 시 생존율의 상실을 나타내는 것으로 관찰되었다. 그러나, HLA-I을 발현하지 않는 Raji B2M(베타-2 마이크로글로불린) 녹아웃 세포주(Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스 소재)는 항-HLA-II 항체의 첨가 및 살아있는/죽은 생존율 염료로 염색 시 동일한 효과를 나타내지 않았다.
전술한 일반적인 절차를 사용하여, TIL의 생존율에 대한 HLA-I 및 HLA-II 차단 항체의 효과를 그 다음 평가했다. 세포 세포사멸은 7AAD 및 아넥신 V에 대한 염색 후 유세포 분석에 의해 검출되었다: 괴사 세포는 7AAD+ 아넥신 V-를 통해 검출되었다; 후기 세포사멸 세포는 7AAD+ 아넥신 V+를 통해 검출되었다; 초기 세포사멸 세포는 7AAD-아넥신 V+를 통해 검출되었다; 그리고 살아있는 세포는 7AAD-아넥신 V-에 의해 검출되었다. 결과는 도 168, 169 및 170에 도시되어 있다. 3가지 다른 TIL 계통에 대해 HLA 클래스 I 및 II 차단 항체와 공동배양된 TIL에서는 독성이 관찰되지 않았다.
HLA-I 및 HLA-II 항체의 농도를 평가하기 위한 적정 실험은 1mL당 1×106 TIL의 표적 세포 농도에 대해 0 내지 20μg/mL의 농도에서 Thp1 및 U937 세포주에 대해 수행되었다. HLA 항체의 결합은 표 62에서의 제제를 사용하여 차단 항체와 동일한 클론의 형광단 접합된 항체로 세포를 염색함에 의해 분석되었다.
표 62. HLA 결합 연구에 대해 사용된 패널.
결과는 도 171에 도시된다. 유동 항체의 결합 손실(평균 형광 강도 또는 MFI로 보고됨)은 차단 항체가 차지하는 결합 부위의 양을 나타낸다. 도 171에서 빨간색 점선은 형광 마이너스 일 수준을 나타낸다.
HLA-I 및 HLA-II 차단 항체와 TIL 배양의 IFN-γ ELLA 결과는 도 172에 도시되어 있다. 도 172에서 상단 플롯은 18시간의 인큐베이션 후 1×106 TIL로 배양으로부터의 결과를 묘사하는 반면 하단 플롯은 24시간의 인큐베이션 후 1.5×106 TIL로부터의 결과를 묘사한다. 결과는 또한 TIL 계통에 대한 HLA-II 차단 항체 효과가 5μg/mL에서 덜 두드러지는 것으로 나타났다.
음성 대조군으로 HLA-I, HLA-II 또는 두 차단 항체 모두를 사용하는 본 발명의 효력 검정의 특정 실시양태는 도 173에 예시되어 있고, 이 접근법의 결과는 IFN-γ의 절대값에 대해 도 174 내지 도 178, 및 TIL 단독에 비한 배수 증강에 대해 도 179 내지 도 183에 도시되어 있다. 음성 대조군으로 HLA-I, HLA-II 또는 두 차단 항체 모두를 사용하는 본 발명의 효력 검정의 추가 실시양태는 도 184에 제공되어 있으며, 이 접근법의 결과는 IFN-γ의 절대값에 대해 도 185 내지 도 189, 및 TIL 단독에 비한 배수 증강에 대해 도 190 내지 도 194에 도시되어 있다. 결과는 음성 대조군으로서 HLA-I 및 HLA-II 차단 항체의 효과를 예시한다. 항-HLA-I(A, B, C)로의 차단은 TIL 단독 플러스 항-HLA A, B, C 항체 대조군과 유사하게, THP-1 또는 U937 표적 세포와 TIL의 공동배양 시 폐기된 IFN-γ 분비를 초래하여, 효력 검정에 대한 실행가능한 음성 대조군을 입증한다. 항-HLA-II(DP, DQ, DR)로 처리는 또한 U937 및 THP-1 표적 세포로부터 감소된 IFN-γ 분비를 초래했다. 항-HLA-I 처리 단독(10μg/mL)은 U937 및 THP-1 표적 세포에 의한 TIL의 유도된 활성화를 하향조절하는데 충분하다; 그러나, 항-HLA-II의 첨가는 음성 대조군으로도 잘 수행한다. CD4+/CD8+ 비율은 평가된 TIL 계통에서 가변적이었다(도 185 내지 도 194에 대한 도면 설명 참조). TIL에 대한 HLA-I 및 HLA-II 차단의 효과는 CD4+ 및 CD8+ TIL의 비율에 독립적이었다. HLA 차단 항체의 첨가는 TIL 샘플에 대한 독성이 미미할 뿐 아니라 배양물에서 TIL 단독의 유해한 활성화도 유발하지 않았다. Raji B2M 세포 단독으로 또는 HLA-II 항체 차단과 조합하여 유용한 음성 대조군 역할도 한다.
음성 대조군으로서 HLA 차단(클래스 I 및 II)의 유효성 및 TCR 복합체를 통한 TIL의 MHC-펩타이드 활성화에 대한 본원에 기술된 효력 검정의 놀라운 특이성을 15개의 흑색종 TIL 세포주에서 추가로 평가했다. 도 195는 음성 대조군으로서 항-HLA-I, 항-HLA-II 또는 두 차단 항체 모두를 사용하는 본 발명의 효력 검정의 추가 실시양태를 도시한다. 종양 세포주를 +/- 10μg/mL HLA 클래스 I(항-HLA A, B, C) 및/또는 +/-5μg/mL HLA 클래스 II(항-HLA DP, DQ, DR) 차단 항체로 1-2시간 동안 사전처리했다. 모두 Gen 2 과정을 사용하여 생산된 15개의 흑색종 TIL 계통을 비-조사된 Raji, Raji β2M KO, THP-1 및 U937 종양 세포와 3:1 TIL:표적 비율로 2×106 TVC에서 24시간 동안 공동배양했다.
결과는 U937의 경우 도 196에, Thp1의 경우 도 197에 요약되어 있다. 항-HLA A, B, C 항체로 차단은 THP-1 또는 U937과 TIL의 공동배양 시 폐기된 IFN-γ 분비를 초래했다(TIL 단독 플러스 항-HLA A, B, C 대조군과 유사함). 항-HLA A, B, C 처리 단독(10μg/mL)은 TIL의 U937 및 THP-1 유도된 활성화를 폐기하는데 충분한 것으로 나타났다. 항-HLA DP, DQ, DR 항체로 처리(5μg/mL)는 THP-1 세포에서 감소된 IFN-γ 분비를 초래했지만, 항-HLA A, B, C로 차단의 정도까지는 아니었고; U937 세포에서 IFN-γ 분비의 완전한 차단은 항-HLA A, B, C로 차단과 유사하다. CD4+/CD8+ 비율은 평가된 TIL 계통에서 가변적이었다. HLA 클래스 I 및 II 차단의 효과는 CD4+/CD8+ 세포의 비율과 독립적이며, 이는 동종이계 종양 세포주와 공동배양 시 TIL의 활성화가 HLA 제한되지 않음을 나타낸다. HLA 차단으로 IFNγ 분비의 폐지는 비-자가조직의 종양 세포주 유도된 TIL의 활성화가 TCR-HLA 계합을 통해 직접적으로 매개된다는 것을 입증했다.
실시예 27: 단핵구 세포주 검정 데이터의 평행선 분석
본 실시예에서, 본 발명의 실시양태인 여러 검정 및 검정 조건에 대해 평행선 분석의 사용이 입증된다. 6개의 흑색종 TIL 로트가 본 연구에서 사용되었다: M1150A, M1164, M1174, M1163, M1169 및 M1218. 각 TIL 로트의 7개 농도(2×106 또는 2e6, 1.5×106 또는 1.5e6, 1×106 또는 1e6, 5×105 또는 5e5, 2.5×105 또는 2.5e5, 1.25×105 또는 1.25e5 및 6.25×104 또는 6.25e4)는 2개의 표적(U937 및 Thp1 세포) 각각에 대해 7개의 표적 농도(1e6, 5e5, 2.5e5, 1.25e5, 6.25e4, 3.13×104 또는 3.13e4, 1.56×104 또는 1.56e4)에 걸쳐 테스트되었다. 통계 분석이 검정 방법에 대한 최상의 TIL 농도를 결정하기 위해 수행되었다. 4개 매개변수 로지스틱(4PL) 분석이 언덕 경사, 범위 및 EC50을 결정하기 위해 사용되었다. 평행선 분석(PLA)이 회귀(선형성)에 대해 사용되었다.
PLA 방법의 세부사항은 USP <1032>장 생물학적 검정의 설계 및 개발. USP 약전 협약: Rockville, MD, 2013; USP <111>장 생물학적 검정의 설계 및 분석. 미국 약전 협약: Rockville, MD, 2014; USP <1033>장 생물학적 검정 검증. USP 약전 협약: Rockville, MD, 2013; USP <1034>장 생물학적 검정의 분석. 미국 약전 협약: Rockville, MD, 2013; Hauck, 등, PDA J. Pharma. Sci. Technol. 2005, 59(2), 127-137; Callahan and Sajjadi, BioProcessing J. 2003, 2(2), 71-77; Findlay, 등, J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 21, 1249- 1273; 및 Gottschalk and Dunn, J. Biopharm. Stat. 2005, 15(3), 437-463을 포함한 문헌에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
2개의 표적 세포주(U937 및 Thp1)에 대한 TIL 생성물의 자극에 대한 조건을 결정하기 위해, 2개의 비-제한적인 인자가 고려되었다: (i) 용량 곡선의 선형 부분에서 가장 큰 수의 농도를 갖는 반복성과 선형성 및 (ii) IFN-γ의 가장 큰 신호, 이는 잠재적으로 또한 최고의 신호 대 잡음을 초래할 수 있다. IFN-γ는 Thp1(도 198) 및 U937(도 199)에 대한 유효 TIL 농도의 함수로 측정되었다. 6개 TIL 로트 모두에 대해 표적 농도와 관련된 신호에서의 눈에 띄는 감소가 관찰되었다. 1.5×106 및 2.0×106 TIL 농도만이 선형 범위에서 표적 세포 농도의 4개 초과의 농도와 용량 반응을 입증했다. U937은 Thp1보다 더 높은 IFN-γ 신호와 더 큰 신호 대 잡음을 나타냈다.
도 200 및 도 201은 검정을 사용하여 6개의 흑색종 TIL 계통에 대한 용량 반응 곡선을 도시한다. 1.5×106 또는 2.0×106의 TIL 농도는 검정 방법에서 사용하기에 허용가능한 결과를 제공한다. 이는 증가된 신호, 더 나은 신호 대 잡음 및 선형 선량 곡선에서 더 큰 수의 표적 농도를 제공한다. 도 202는 1.5×106 세포의 TIL 농도에서 U937 표적 세포를 사용한 6개 TIL 로트에 대한 평행선 분석을 도시한다. 6개 TIL 모두 이 표적 세포주와의 명확한 용량 반응을 나타내는 것으로 나타났다. 도 203에서는, 동일한 조건 하에서 동일한 6개 TIL 로트에 대한 평행선 분석을 Thp1 표적 세포를 사용하여 도시하며, 여기서 TIL M1173 및 TIL M1213만이 명확한 용량 반응을 입증한다. 도 204 및 205는 차단 항체가 항-HLA-I(10μg/mL) 및 항-HLA-II(5μg/mL)를 갖는 6개 TIL 로트에 걸쳐 U937 세포로의 검정 특이성을 입증한다는 것을 예시한다. 놀랍게도 U937 세포주는 Thp1 세포주보다 더 잘 수행했다. 주어진 표적 농도에 대해, U937 세포는 검정 방법의 이 실시양태에서 Thp1 세포보다 더 큰 IFN-γ 신호를 제공한다. U937 세포는 또한 용량-반응 곡선의 선형 부분에서 더 많은 농도를 제공했다. 4-점 용량 곡선은 곡선당 하나의 이상값을 제거하고 곡선 포화를 위해 마스크하는 옵션을 갖는 선형 맞춤으로 사용될 수 있다(이는 최종 분석에 필요한 곡선 상에 적어도 3개의 점을 제공할 것이다). 곡선 포화에 대한 스크리닝 및 이에 대한 이상값 제거 및 마스킹은 USP <1032>장 Design and Development of Biological Assays, US Pharmacopeial Convention: Rockville, MD, 2013에 기술된 바와 같이 수행된 바와 같이 수행될 수 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 부가하여, Thp1 세포로 테스트한 TIL 로트는 대부분의 TIL 로트에서 선형이 되도록 더 낮은 농도에서 마스킹을 필요로 하는 반면, U937 세포에는 이 요구사항이 없었다. 상위 점근선은 Thp1 세포로 항상 해결되는 것은 아니며; 따라서, Thp1 세포로 테스트한 TIL 로트에 걸쳐서 상위 범위가 정의되지 않을 수 있다.
실시예 28: 효력 및 동일성 검정 매트릭스
본 실시예에서, 효력 및 동일성 검정 매트릭스의 사용이 입증된다. 효력 및 동일성 검정 매트릭스는 TIL, MIL 및 PBL 생성물의 방출 및 안정성 테스트에 사용될 수 있고 매트릭스의 구성요소로 본원에 기술된 효력 검정을 포함할 수 있다. 예시적이고 비-제한적인 검정 매트릭스가 표 63에 제시되어 있으며, 이는 또한 본 발명의 실시양태고 매트릭스의 구성원을 제거하거나 추가하도록 변형될 수 있다. 검정은 적절하고/하거나 필요한 경우 정밀도, 정확성, 특이성 및 선형성에 대해 적격화된다.
표 63. 예시적이고 비-제한적인 효력 및 동일성 검정 매트릭스.
본원에, 예를 들어 실시예 14 내지 27에 기술된 동종이계 공배양 검정은 TCR-HLA 상호작용을 평가하는데 사용된다. 표 63에 나타난 매트릭스는 실시예 27 및 본원의 다른 곳에 기술된 평행선 분석 방법 및 양성 대조군에 대한 상대적 효력과 연계하여 U937 또는 Thp1 세포를 사용하는 한 가지 예를 제시한다. HLA 차단 항체를 사용하는 음성 대조군은 적격성 평가 동안 TCR-HLA 상호작용에 대한 특이성을 입증하는데 사용되었고, 본원에 기술된 양성 대조군 참조 표준 대비 상대적 효력 측정에 대한 대안으로 일상적인 테스트 동안에 또한 사용될 수 있다. 양성 대조군은 이 목적을 위해 예탁되고 특성화되어 있는 공지된 TIL, MIL 또는 PBL 세포주를 사용하여 제조된다.
예를 들어, U937 공배양 검정을 사용하여 다음 절차가 사용되었다. U937 세포는 ATCC로부터 공급되었고 2-계층 GMP 세포 은행(MCB, 250개 바이알 및 WCB, 500개 바이알)을 만드는데 사용되었다. WCB는 생물검정을 위한 즉시 사용 가능한(RTU) GMP 비-생산 은행으로 제조되었으며, 여기서 바이알로부터 바로 해동된 세포를 검정에 사용하며 이에 의해 세포 확장의 필요성과 오염 또는 변동성과 연관된 위험이 제거된다. MCB는 생존가능한 세포 계수, % 생존율, 동일성, 무균성, 마이코플라스마 및 시험관내 외래성 제제에 대해 테스트되었다. WCB는 생존가능한 세포 계수, % 생존율, 무균성, 마이코플라스마 및 시험관내 외래성 제제에 대해 테스트되었다. MCB와 WCB는 견고성에 대한 적격성 평가 매개변수 내에서 공배양 효력 검정에 대한 계대 의존적 영향에 대해 평가되었고 유의미한 차이가 없는 것으로 나타났다. 양성 대조 TIL 로트는 임상적 TIL 생성물에 사용되는 동일한 Gen 2 제조 과정을 사용하여 GMP 하에서 제조되고 또한 참조 표준으로 사용될 것이다. 제형화 후, 참조 표준에 대한 전체 의약품을 바이알에 충진한 다음, 임상적 TIL 의약품 제조에 사용된 것과 동일한 장비 및 프로그램을 사용하여 제어된 속도에서 동결한다. 바이알은 증기상 액체 질소에 동결보존되어 저장된다. 대표적인 바이알은 무균성, 마이코플라스마, 세포 계수, 생존율, 동일성, 효력을 포함한 여러 속성에 대해 테스트되고 참조 표준으로 사용하기 위한 TIL 로트를 적격화하기 위해 테스트된다. 적격화되면, 참조 표준의 일회용 바이알(들)을 해동하고 각 검정의 테스트 항목과 함께 테스트한다. 이 검정은 24시간의 기간 동안 U937 세포의 4가지 용량-농도(웰당 4×105, 2×105, 1×105 , 및 0.5×105 세포; 각 용량-농도에서 3중으로 수행됨)로 공배양에 대해 확실하게 그리고 용량-의존적 방식으로 반응하는 웰당 1.5×106 TIL의 정의된 설정점에서 참조 표준 TIL 로트에 대한 상대적 효력에 대해 TIL 생성물 로트를 평가한다. 각 U937 용량-농도에서 각 복제물로부터 상청액으로 방출된 IFN-γ의 농도를 측정한다. TIL 생성물과 U937의 공배양 검정의 활성화 후 IFN-γ 농도를 측정하기 위해 (본원에서 다른 곳에서 기술된 바와 같은) ELLA 시스템을 사용했다. 심플 플렉스 72-웰 IFN-γ 제3 Gen 버전 5 카트리지(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 BioTechne, Inc.의 ProteinSimple 사업부에서 이용가능, 카탈로그 번호 #SPCKB-CS-002697)를 사용한다. 분비된 IFN-γ의 후속 측정을 위한 배지의 배양 및 보관은 공배양을 진행하기 직전에 수행된다. 상청액을 3개의 복제물 96-웰 플레이트로 옮기고 <60℃로 보관한다. 그런 다음 플레이트를 해동하고 IFN-γ를 측정한다. 공배양으로부터 수집된 상청액을 각 72-웰 상업적으로 검증된 카트리지에서 IFN-γ 생산에 대해 스크리닝한다. 데이터 분석은 USP <1032>, USP 약전 협약: Rockville, MD, 2013에 따라 수행한다. 데이터는 효력 범위 전반에 걸쳐 측정 시 대칭성, 정규 분포 및 변동성의 균질성에 대한 요구사항을 충족하도록 USP <1032> 및 USP <1033> 생물학적 검정 검증, USP 약전 협약: Rockville, MD, 2013에 따라 로그 변환된다. 이상값은 USP <1034> 생물학적 검정의 분석, USP 약전 협약: Rockville, MD, 2013에 기술된 바와 같이 평가되고 분석에서 생략된다. 선형 회귀는 곡선의 포화에 기인한 가장 높은 또는 가장 낮은 농도를 마스킹(필요한 경우)하여 4-점 용량 곡선에 걸쳐서 수행된다. USP<1032>에 따르면, "적어도 3개, 바람직하게는 4개의 인접한 [용량-] 농도를 사용하고; 선형 세그먼트의 경사가 충분히 가파르게 되는 것을 요하고; 표준 및 테스트 샘플에 맞는 선이 직선이고 선이 평행해야 하는 것을 요하는 것"이 권고된다. USP<1032>에 따라 TIL 테스트 항목과 RS 간에 평행선 분석이 수행된다. 평행성에 의해 측정된 참조 표준과 TIL 테스트 항목 간의 통계적 유사성은 참조 표준에 대한 TIL 테스트 항목의 생물학적 유사성을 입증한다. 평행체 기울기 비율, 선형성 비율, 회귀(R2) 및 평균 제곱근 오차(RMSE)가 계산되고 보고된다. 평행체 및 선형성의 검정 적합성과 타당성은 USP<1033>에 따른 한도 내에서 타당성 기준을 "통과" 또는 "실패"로 평가하고 결정한다. 내성의 백분율 범위로서 95% 신뢰 구간 내의 상대적 효력은 "보고가능" 또는 "결정적이지 않음"으로 결정된다. USP<1032>에 따르면, 상대적 효력은 절대값에서 유래되는 효력보다 선호될 수 있는데, 이는 생물학적 샘플에 내재된 가변성 및 시간 경과에 따른 세포 거동의 영향을 무효화하는 교정기이기 때문이다. 마지막으로, 예측된 IFN-γ 농도는 각 U937 세포 밀도에서 보고된다. TIL 단독(자극되지 않음) 대비 U937 세포와의 공배양에서 TIL에 의해 생성된 절대 IFN-γ 농도에서의 배수-증가는 각 TIL 로트에 대한 대체 또는 추가 보고가능한 값으로 사용하기 위해 평가된다. 분석은 적절한 검증으로 JMP Statistical Discovery LLC(미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재)로부터 JMP 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 본 발명의 추가 검정 세부사항 및 실시양태는 또한 표 64에 제공되어 있다.
표 64. 본 발명의 공배양 방법 조건 및 실시양태의 예시적이고 비-제한적인 요약.
표 63에 나타난 매트릭스는 또한 항-CD3/CD28/CD137 항체로 코팅된 비드에 의한 활성화에 반응하여 TIL에 의해 분비된 IFN-γ의 측정을 사용하는 직교 활성화 검정을 포함한다. TIL 생성물이 이들 비드에 노출될 때, 항체는 CD3 신호전달 복합체 내에 함유된 CD3ε와 T 세포 공동-자극 수용체인 CD28 및 CD137에 결합한다. 항-CD3 미토겐 항체 OKT3으로 TIL의 자극은 Borovsky, 등 J. Biol. Chem. 2002, 277, 21529-36에 기재된 바와 같이, TIL 생성물의 기능성을 평가하기 위해 사용되며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 항-CD28 활성은 시험관내 T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 증강시키는 것으로 알려져 있다. CD137(4-1BB)은 종양 괴사 인자 계열의 구성원이다. 효능작용 항-CD137 항체는 효과기 및 기억 T 세포에 특히 중요한 활성화 공동자극 분자로 작용하고 T 림프구의 생존 및 증식을 촉진한다. 따라서 비드-기반 IFN-γ 검정의 설계는 생리학적 재-자극 및 항원-특이적 T 세포의 확장과 관련된 3가지 활성화 신호를 활용함에 의해 전문 항원-제시 세포에 의한 생체내 T 세포 활성화에 반응하여 TIL 세포의 생물학적 활성을 모방하도록 의도되었다.
총 생존가능한 세포 및 생존가능한 세포 백분율이 또한 표 63에 포함되어 있다. 총 생존가능한 세포 계수는 문헌에서 TIL 생성물 주입에 대한 객관적인 종양 반응과 상관관계가 있는 매개변수이다. Seitter, 등 Clin. Cancer Res. 2021, 27, 5289-98. 세포 생존율은 총 생존가능한 세포 계수에 내재하는 매개변수이다. 생존율을 유지하거나 회복하는 세포의 능력은 TIL 기능을 위한 필수 전제조건이고, 따라서 세포 생존율의 입증은 활성의 추가 척도로 역할을 한다. TIL 생성물의 수행성에 대한 이들 매개변수의 중요성은 전임상 연구뿐만 아니라 지금까지 수백 명의 전이성 흑색종을 앓는 환자를 등록한 연구에서 TIL 요법으로의 실질적인 임상 경험에 의해 뒷받침된다. 연구자들은 객관적인 종양 반응률과 투여된 총 생존가능한 세포 사이에 통계적으로 유의미한 양성 상관관계를 보고했지만, 이들 연구에서는 반응자와 비-반응자 사이의 총 세포 수 분포에 상당한 중복이 남아 있었다 Seitter, 등, Clin. Cancer Res. 2021, 27, 5289-98; Goff, 등, J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97. 총 생존가능한 세포 계수 및 생존율 백분율에 대한 예시적인 결과는 표 65에 제시되어 있다.
표 65. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 총 생존가능한 세포 및 생존율 백분율에 대한 요약 통계.
표 63의 매트릭스에서 계통 마커는 총 생존가능한 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단, CD4+ 세포의 백분율, CD8+ 세포의 백분율을 포함하며, 이는 유세포 분석 및 세포 계수기에 의해 측정된다. TIL은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한 림프구의 혼합물로 구성된다. CD8+ 및 CD4+ T 세포는 TIL 생성물에 가변성 비율로 존재하고 두 세포 계통 모두는 항-종양 면역 반응에 기여하는 것으로 보인다. Topalian, 등, J. Immunological Methods 1987, 102, 127-41; Andersen, 등 Clin. Cancer Res. 2016, 22, 3734-45; Goff, 등 J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97. CD8+ T 세포는 종양 퇴행과 연관되어 있는 반면, CD4+ T 세포는 면역계의 기능에 중요하고 CD8+ T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 증강함에 의해 CD8+ T 세포 기능을 증가시킨다. Shedlock and Shen, Science 2003, 300, 337-9; Sun and Bevan, Science 2003, 300, 339-42. Seitter 등은 현재까지 수백 명의 전이성 흑색종을 앓는 환자가 등록된 TIL 요법에서의 연구로부터 통합된 데이터를 분석했고 객관적인 종양 반응률과 투여된 총 생존가능한 CD8+ 세포 사이에 통계적으로 유의미한 양의 상관관계, 뿐만 아니라 응답자와 비-응답자 사이의 총 세포 수 분포에 상당한 중복을 보여주었다. 이 있다. Seitter, 등 Clin. Cancer Res. 2021, 27, 5289-98. 이론에 얽매이지 않고, CD8+ 및 CD4+ T 세포의 집단을 갖는 TIL 생성물은 입양 세포 요법에 가장 유리한 생성물일 수 있고, 임상적 효능을 가질 가능성이 가장 높은 생성물일 수 있다. 임상 흑색종 TIL 로트에 대한 CD4+ 및 CD8+ 발현에 대한 예시적인 결과가 표 66에 제시되어 있다.
표 66. 임상 흑색종 TIL 로트에 대한 CD4+ 및 CD8+ 발현에 대한 요약 통계
1 %CD8+ 및 %CD4+ 세포는 CD3+ 세포의 백분율로 표현됨
표 63은 또한 여러 기억 마커, 총 생존가능한 중심 기억(TCM) 및 효과기 기억(TEM) 세포 집단, TCM 세포의 백분율, 및 TEM 세포의 백분율을 포함하며, 이는 유세포 분석 및 세포 계수기에 의해 측정된다. 기억 T 세포는 이의 트래피킹 패턴, 기능적 능력, 및 계통 관계에 의해 달라지는 다중 하위집합으로 존재한다. Farber, 등 Nature Rev. Immunol. 2014, 14, 24-35; Sallusto, 등 Ann. Rev. Immunol. 2004, 22, 745-63. 주요 하위집합은 림프 조직으로 이동하는 능력을 유지하는 TCM 세포; 및 말초 조직 부위로 이동하는 TEM 세포를 포함한다. 두 하위집합 모두 효과기 용량을 갖는다. TEM 세포는 CD45RA-CCR7-로 정의되고; TCM 세포는 유세포 분석에 의해 CD45RA-CCR7+로 정의된다. TIL 생성물에서 대부분의 세포는 높은 수준의 기능성과 일치하는 효과기 기억 T 세포 표현형을 가지고 있다. Goff, 등 J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97. 유사하게, TEM 세포는 22-일 과정 동안 그 효율적인 확장 때문에 22일차 샘플에서 Gen 2 과정에 의해 생성된 TIL 샘플에서 종종 지배적인 집단이다. 임상적 흑색종 TIL 로트에서 TEM 및 TCM 함량에 대한 예시적인 결과가 표 67에 제시되어 있다.
표 67. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 TEM 및 TCM 세포에 대한 요약 통계
1 %TEM 및 %TCM 세포는 CD3+ 세포의 백분율로 표현됨
LAG3 발현을 갖는 세포의 백분율은 또한 최종 TIL 생성물에서 고갈 및 그에 따른 효력에 대한 마커로서 표 63의 매트릭스에 포함된다. LAG3 발현은 유세포 분석에 의해 측정된다. LAG3 수준은 일반적으로, 예를 들어 Gen 2 과정에 의해 상향조절된다. 이 상향조절은 T 세포 활성화 및 이펙터 기능과 연관되어 있고 LAG3이 모니터링을 위한 민감하고 대표적인 고갈 마커일 가능성이 있음을 나타낸다. Annunziato, 등, FASEB J. 1996, 10, 769-76. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 예시적인 통계는 표 68에 제시되어 있다.
표 68. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 LAG3 발현에 대한 요약 통계
1 %LAG3+ 세포는 CD3+ 세포의 백분율로 표현됨
이들 임상적 데이터 세트에 걸친 LAG3 발현의 히스토그램이 도 206에 도시되어 있다.
KLRG1 발현을 갖는 세포의 백분율은 또한 최종 리필류셀 생성물에서 분화 및 그에 따른 효력에 대한 마커로서 표 63의 매트릭스에 포함된다. KLRG1 발현은 유세포 분석에 의해 측정된다. KLRG1은 T 세포의 최종 분화 및 노화의 마커이며, 이는 기억 T 세포의 분화 시 하향-조절되는 것으로 나타났다. Henson 등, Blood 2009, 113, 6619-28; Herndler-Brandstetter, 등, Immunity 2018, 48, 716-729. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 예시적인 통계는 표 69에 제공되어 있다.
표 69. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 KLRG1 발현에 대한 요약 통계
1 %KLRG1+ 세포는 CD3+ 세포의 백분율로 표현됨
임상적 데이터 세트에 걸친 KLRG1 발현의 히스토그램이 도 207에 도시되어 있다.
CD14+/CD19+/CD16+/CD56+ 유세포 분석 검정은 NK, NKT, B 세포 및 단핵구를 검출하기 위해 표 63에 나타난 CD16+/CD56+ 검정에 대해 대체될 수 있다.
본원에 기술되고, 표 63의 매트릭스에 포함된 U937 공배양은 상기 기술된 바와 같이 임상적 흑색종 TIL 로트의 상대적 효력을 평가하는데 사용될 수 있다. 결과는 표 70에 나타나 있으며, 여기서 여러 로트는 용량-의존적 반응을 나타내지 않는 것으로 관찰되어 잠재적인 효력의 상실을 나타낸다.
표 70. 임상적 흑색종 TIL 로트에 대한 상대적 효력 결과.
1로트는 용량-의존적 반응을 나타내지 않았다
표 70의 결과는 로그-정규 분포가 관찰되는 히스토그램으로 도 208에 플롯팅되어 있다.
CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정 및/또는 CD57+ 세포 함량에 대한 검정을 포함한, 추가의 마커 및 상응하는 유세포 분석 검정이 활용될 수 있다. Gen 2 제조 과정 동안 TIL 생성물의 재활력화에 있어 특정 마커의 통계적 유의성은 Simpson-Abelson, 등, Ann. Oncol., 2020, 31, S720, 및 Simpson-Abelson, 등, Iovance Generation-2 Tumor-infiltrating Lymphocyte (TIL) Product Is Reinvigorated During the Manufacturing Process ESMO Congress, Sept. 19-21, 2020, poster 1053P에 기술되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시예 29: U937 세포를 사용한 TIL 생성물의 확장
조사된 U937 세포는 Gen 2 과정 또는 유사한 과정의 REP 단계(또는 Gen 3 또는 유사한 과정의 활성화 단계, 또는 유전적으로 편집된 TIL 과정 및 선택된 TIL 과정에서 유사한 단계)를 위한 인공 항원 처리 세포(aAPC)로 사용될 수 있다. 3개의 흑색종 사전-REP TIL 로트를 해동하고 본원의 다른 곳(예를 들어, 실시예 6)에 기술된 절차를 사용하여 항-CD3(OKT-3)을 갖는 조사된 U937 세포 또는 동종 PBMC 배양보조 세포(3개 공여자)와 11일 동안 인큐베이션하고 확장에 대해 평가했다. 결과는 도 209에 도시되어 있다. U937 세포는 TIL 세포의 확장을 유도할 수 있다. CD3 및 CD28에 대해 비드를 자극 후, TIL은 도 210에 도시된 바와 같이 반응하여 IFN-γ를 분비했으며, 이는 TIL이 활성화될 수 있음을 나타낸다. aAPC로 U937 세포의 사용은 TCR 레퍼토리 분석(예를 들어, 고유한 CDR3 도메인 경우)에 의해 평가된 바와 같이 더 낮은 빈도의 TCR 클론의 성장 또는 보존을 지지할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Gen 2, Gen 3, 또는 본원에 기술된 다른 과정을 사용한 U937 aAPC(유전적으로 변형된 U937 aAPC 포함)의 사용에 의해 확장된 TIL, MIL, 또는 PBL은 더 낮은 빈도의 TCR 클론의 증가된 성장 또는 보존을 나타낼 수 있다.
* * *
상기에 제시된 실시예는 당업자에게 발명의 조성물, 과정, 분석, 시스템 및 방법의 실시양태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제공되고, 발명가가 그의 발명으로 간주하는 범주를 제한하려는 의도는 없다. 당업자에게 명백한 발명을 수행하기 위한 상기-기술된 모드의 변형은 다음 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다.
모든 제목과 섹션 지정은 명확성과 참조 목적으로만 사용되고 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 당업자는 본원에 기술된 발명의 사상 및 범주에 따라 적절하게 다른 제목 및 섹션으로부터 다양한 양태를 결합하는 유용성을 인식할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그리고 그 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 출원의 많은 변형 및 변경이 그 사상 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 특정 실시양태 및 실시예는 단지 예로서 제공되고, 출원은 청구범위에 부여된 등가물의 전체 범주와 함께 첨부된 청구범위의 관점에 의해서만 제한되어 진다.
SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR T-CELL COCULTURE POTENCY ASSAYS AND USE WITH CELL THERAPY PRODUCTS <130> 116983-5089-WO <140> PCT/US22/22030 <141> 2022-03-25 <150> US 63/309,919 <151> 2022-02-14 <150> US 63/286,145 <151> 2021-12-06 <150> US 63/246,890 <151> 2021-09-22 <150> US 63/233,035 <151> 2021-08-13 <150> US 63/212,933 <151> 2021-06-21 <150> US 63/189,829 <151> 2021-05-18 <150> US 63/166,210 <151> 2021-03-25 <160> 237 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Muromonab light chain <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic recombinant human IL-2 (rhIL-2) <400> 3 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 85 90 95 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 115 120 125 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Aldesleukin <400> 4 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 120 125 Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 form <400> 5 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 6 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 form <400> 6 Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn 1 5 10 15 Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu 20 25 30 Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 35 40 45 Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Ser Ser Ser 50 55 60 Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 65 70 75 80 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg 85 90 95 Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 100 105 110 His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 115 120 125 Asn Leu Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu 145 150 155 160 Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser 180 185 190 Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr 195 200 205 Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr 210 215 220 Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile 245 250 255 Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly 260 265 270 Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr 275 280 285 His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly 290 295 300 <210> 7 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 form <400> 7 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Ala Arg Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys 20 25 30 Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu 35 40 45 Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn 50 55 60 Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly 85 90 95 Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser 100 105 110 Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser 115 120 125 Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu 130 135 140 Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro 145 150 155 160 Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro 180 185 190 His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic mucin domain polypeptide <400> 8 Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 1 5 10 15 <210> 9 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic recombinant human IL-4 (rhIL-4) <400> 9 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 10 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic recombinant human IL-7 (rhIL-7) <400> 10 Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 35 40 45 Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 50 55 60 Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 65 70 75 80 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 85 90 95 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 130 135 140 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic recombinant human IL-15 (rhIL-15) <400> 11 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser 115 <210> 12 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic recombinant human IL-21 (rhIL-21) <400> 12 Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 1 5 10 15 Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 20 25 30 Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 50 55 60 Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 85 90 95 Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 100 105 110 Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 115 120 125 Ser Glu Asp Ser 130 <210> 13 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 <400> 13 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 14 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 mutein <400> 14 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 15 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-2 mutein <400> 15 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 16 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR1_IL-2 <400> 16 Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 1 5 10 15 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 20 25 30 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 35 40 45 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 65 70 75 80 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 85 90 95 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 100 105 110 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 115 120 125 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val 130 135 140 Gly 145 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR2 <400> 17 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR3 <400> 18 Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 19 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR1_IL-2 kabat <400> 19 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 130 135 140 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR2 kabat <400> 20 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR3 kabat <400> 21 Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR1_IL-2 clothia <400> 22 Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 1 5 10 15 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 20 25 30 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 35 40 45 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 65 70 75 80 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 85 90 95 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 100 105 110 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 115 120 125 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met 130 135 140 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR2 clothia <400> 23 Trp Trp Asp Asp Lys 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR3 clothia <400> 24 Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 25 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR1_IL-2 IMGT <400> 25 Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 1 5 10 15 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 20 25 30 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 35 40 45 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 50 55 60 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 65 70 75 80 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 85 90 95 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 100 105 110 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 115 120 125 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser 130 135 140 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR2 IMGT <400> 26 Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 1 5 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HCDR3 IMGT <400> 27 Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 28 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic VH <400> 28 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 20 25 30 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 35 40 45 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 50 55 60 Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 65 70 75 80 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 85 90 95 Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 100 105 110 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 130 135 140 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 145 150 155 160 Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 180 185 190 Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 29 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy chain <400> 29 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 1 5 10 15 Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 20 25 30 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 35 40 45 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 65 70 75 80 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 85 90 95 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 100 105 110 Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 115 120 125 Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr 130 135 140 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala 165 170 175 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 180 185 190 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 195 200 205 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 210 215 220 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 245 250 255 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 260 265 270 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 275 280 285 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 290 295 300 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 305 310 315 320 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 325 330 335 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val 340 345 350 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 355 360 365 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 370 375 380 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 385 390 395 400 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala 405 410 415 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 420 425 430 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 435 440 445 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 450 455 460 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 465 470 475 480 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 485 490 495 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 500 505 510 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 515 520 525 Leu Ser Pro Gly Lys 530 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR1 kabat <400> 30 Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR2 kabat <400> 31 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR3 kabat <400> 32 Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR1 chothia <400> 33 Gln Leu Ser Val Gly Tyr 1 5 <210> 34 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR2 chothia <400> 34 Asp Thr Ser 1 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic LCDR3 chothia <400> 35 Gly Ser Gly Tyr Pro Phe 1 5 <210> 36 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic VL <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light chain <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 38 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light chain <400> 38 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 20 25 30 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 35 40 45 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 50 55 60 Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 65 70 75 80 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 85 90 95 Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 100 105 110 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 130 135 140 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 145 150 155 160 Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 180 185 190 Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 245 250 255 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 260 265 270 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 290 295 300 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 305 310 315 320 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 325 330 335 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 340 345 350 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 355 360 365 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 370 375 380 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 385 390 395 400 Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 405 410 415 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 420 425 430 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 435 440 445 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 450 455 460 Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 465 470 475 480 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 485 490 495 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 500 505 510 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 515 520 525 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 530 535 540 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 545 550 555 560 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 565 570 575 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 580 <210> 39 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light chain <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human 4-1BB, Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 (Homo sapiens) <400> 40 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 41 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic murine 4-1BB, Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 (Mus musculus) <400> 41 Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln 20 25 30 Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys 50 55 60 Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr 65 70 75 80 His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro 85 90 95 Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr 100 105 110 Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn 115 120 125 Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 130 135 140 Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu 165 170 175 Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe 195 200 205 Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln 210 215 220 Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser 225 230 235 240 Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 245 250 255 <210> 42 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain for utomilumab <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain for utomilumab <400> 43 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 44 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for utomilumab <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for utomilumab <400> 45 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for utomilumab <400> 46 Ser Thr Tyr Trp Ile Ser 1 5 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for utomilumab <400> 47 Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for utomilumab <400> 48 Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for utomilumab <400> 49 Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for utomilumab <400> 50 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for utomilumab <400> 51 Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val 1 5 10 <210> 52 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain for urelumab <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 53 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain for urelumab <400> 53 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 54 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for urelumab <400> 54 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro 115 120 <210> 55 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for urelumab <400> 55 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for urelumab <400> 56 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for urelumab <400> 57 Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for urelumab <400> 58 Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for urelumab <400> 59 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for urelumab <400> 60 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for urelumab <400> 61 Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc domain <400> 62 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 63 Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 15 Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 <210> 64 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 64 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 15 Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 <210> 65 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 65 Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 66 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 <210> 67 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 67 Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 <210> 68 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 68 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 <210> 69 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 69 Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 15 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 <210> 70 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 70 Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 10 15 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 <210> 71 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 71 Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys Pro Ala Pro Glu 20 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 72 Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His 1 5 10 15 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 <210> 73 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc domain <400> 73 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25 30 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 85 90 95 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 100 105 110 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 130 135 140 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 145 150 155 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 165 170 175 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 210 215 220 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 245 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 74 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 75 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 76 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 <210> 77 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 4-1BBL <400> 77 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 78 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 4-1BBL soluble domain <400> 78 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 20 25 30 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 35 40 45 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 50 55 60 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 65 70 75 80 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 85 90 95 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 100 105 110 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 115 120 125 His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 130 135 140 Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 145 150 155 160 Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 <210> 79 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 4B4-1-1 version 1 <400> 79 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 4B4-1-1 version 1 <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 81 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 4B4-1-1 version 2 <400> 81 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 82 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 4B4-1-1 version 2 <400> 82 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 83 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for H39E3-2 <400> 83 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr 115 120 <210> 84 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for H39E3-2 <400> 84 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 100 105 <210> 85 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human OX40 (Homo sapiens) <400> 85 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 86 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic murine OX40 (Mus musculus) <400> 86 Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr 20 25 30 Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met 35 40 45 Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu 50 55 60 Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys 65 70 75 80 Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr 85 90 95 Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg 100 105 110 Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro 115 120 125 Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 130 135 140 Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu 145 150 155 160 Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu 165 170 175 Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val 180 185 190 Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro 195 200 205 Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu 210 215 220 Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp 225 230 235 240 Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr 245 250 255 Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile 260 265 270 <210> 87 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain for tavolixizumab <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 88 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain for tavolixizumab <400> 88 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 89 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for tavolixizumab <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 <210> 90 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for tavolixizumab <400> 90 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for tavolixizumab <400> 91 Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn 1 5 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for tavolixizumab <400> 92 Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for tavolixizumab <400> 93 Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for tavolixizumab <400> 94 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for tavolixizumab <400> 95 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser 1 5 10 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for tavolixizumab <400> 96 Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 1 5 <210> 97 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain for 11D4 <400> 97 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 98 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain for 11D4 <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 99 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for 11D4 <400> 99 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for 11D4 <400> 100 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 101 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for 11D4 <400> 101 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for 11D4 <400> 102 Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for 11D4 <400> 103 Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for 11D4 <400> 104 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for 11D4 <400> 105 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for 11D4 <400> 106 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 107 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain for 18D8 <400> 107 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 210 215 220 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 108 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain for 18D8 <400> 108 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 109 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for 18D8 <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 110 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for 18D8 <400> 110 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for 18D8 <400> 111 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for 18D8 <400> 112 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for 18D8 <400> 113 Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for 18D8 <400> 114 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for 18D8 <400> 115 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for 18D8 <400> 116 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 1 5 <210> 117 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for Hu119-122 <400> 117 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 118 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for Hu119-122 <400> 118 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDRl for Hu119-122 <400> 119 Ser His Asp Met Ser 1 5 <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for Hu119-122 <400> 120 Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu 1 5 10 15 Arg <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for Hu119-122 <400> 121 His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for Hu119-122 <400> 122 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for Hu119-122 <400> 123 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for Hu119-122 <400> 124 Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 125 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region for Hu106-222 <400> 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region for Hu106-222 <400> 126 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR1 for Hu106-222 <400> 127 Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 128 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR2 for Hu106-222 <400> 128 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 129 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain CDR3 for Hu106-222 <400> 129 Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR1 for Hu106-222 <400> 130 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR2 for Hu106-222 <400> 131 Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain CDR3 for Hu106-222 <400> 132 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 133 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic OX40L <400> 133 Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 85 90 95 Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 100 105 110 Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 115 120 125 Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 134 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic OX40L soluble domain <400> 134 Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu 1 5 10 15 Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu 20 25 30 Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe 35 40 45 Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser 50 55 60 Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val 65 70 75 80 Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys 85 90 95 Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His 100 105 110 Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe 115 120 125 Cys Val Leu 130 <210> 135 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic OX40L soluble domain (alternative) <400> 135 Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys 20 25 30 Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile 35 40 45 Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr 50 55 60 Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val 65 70 75 80 Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu 85 90 95 Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly 100 105 110 Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 115 120 125 <210> 136 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 008 <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 137 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 008 <400> 137 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100 105 <210> 138 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 011 <400> 138 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 139 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 011 <400> 139 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100 105 <210> 140 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 021 <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 141 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 021 <400> 141 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100 105 <210> 142 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable heavy chain for 023 <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variable light chain for 023 <400> 143 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 144 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region <400> 144 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 145 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region <400> 145 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 146 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region <400> 146 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro 115 120 <210> 147 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region <400> 147 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 148 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region of humanized antibody <400> 148 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 149 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region of humanized antibody <400> 149 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 150 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region of humanized antibody <400> 150 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 151 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region of humanized antibody <400> 151 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 152 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region of humanized antibody <400> 152 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 153 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region of humanized antibody <400> 153 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 154 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region of humanized antibody <400> 154 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 155 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region of humanized antibody <400> 155 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 156 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain variable region <400> 156 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 157 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain variable region <400> 157 Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 158 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab heavy chain <400> 158 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 115 120 125 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 159 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab light chain <400> 159 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 160 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab variable heavy chain <400> 160 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 161 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab variable light chain <400> 161 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 162 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab heavy chain CDR1 <400> 162 Asn Ser Gly Met His 1 5 <210> 163 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab heavy chain CDR2 <400> 163 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab heavy chain CDR3 <400> 164 Asn Asp Asp Tyr 1 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab light chain CDR1 <400> 165 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 166 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab light chain CDR2 <400> 166 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nivolumab light chain CDR3 <400> 167 Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 168 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab heavy chain <400> 168 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 169 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab light chain <400> 169 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 170 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab variable heavy chain <400> 170 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 171 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab variable light chain <400> 171 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab heavy chain CDR1 <400> 172 Asn Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 173 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab heavy chain CDR2 <400> 173 Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab heavy chain CDR3 <400> 174 Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 175 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab light chain CDR1 <400> 175 Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab light chain CDR2 <400> 176 Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic pembrolizumab light chain CDR3 <400> 177 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 178 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab heavy chain <400> 178 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 179 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab light chain <400> 179 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 50 55 60 Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 85 90 95 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 115 120 125 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser 130 135 140 Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 145 150 155 160 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 165 170 175 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 180 185 190 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 195 200 205 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 210 215 220 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 225 230 235 240 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 245 250 255 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 265 <210> 180 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab variable heavy chain <400> 180 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 181 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab variable light chain <400> 181 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 182 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab heavy chain CDR1 <400> 182 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 183 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab heavy chain CDR2 <400> 183 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab heavy chain CDR3 <400> 184 Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab light chain CDR1 <400> 185 Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 186 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab light chain CDR2 <400> 186 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic durvalumab light chain CDR3 <400> 187 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 188 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab heavy chain <400> 188 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 189 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab light chain <400> 189 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 190 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab variable heavy chain <400> 190 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 191 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab variable light chain <400> 191 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 192 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab heavy chain CDR1 <400> 192 Ser Tyr Ile Met Met 1 5 <210> 193 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab heavy chain CDR2 <400> 193 Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 194 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab heavy chain CDR3 <400> 194 Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 195 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab light chain CDR1 <400> 195 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab light chain CDR2 <400> 196 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic avelumab light chain CDR3 <400> 197 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val 1 5 10 <210> 198 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab heavy chain <400> 198 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 199 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab light chain <400> 199 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 200 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab variable heavy chain <400> 200 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 201 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab variable light chain <400> 201 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab heavy chain CDR1 <400> 202 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 203 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab heavy chain CDR2 <400> 203 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab heavy chain CDR3 <400> 204 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 205 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab light chain CDR1 <400> 205 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab light chain CDR2 <400> 206 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic atezolizumab light chain CDR3 <400> 207 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 208 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab heavy chain <400> 208 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His 225 <210> 209 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab light chain <400> 209 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 210 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab variable heavy chain <400> 210 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 211 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab variable light chain <400> 211 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 212 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab heavy chain CDR1 <400> 212 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 213 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab heavy chain CDR2 <400> 213 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys 1 5 10 <210> 214 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab heavy chain CDR3 <400> 214 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 215 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab light chain CDR1 <400> 215 Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr 1 5 <210> 216 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab light chain CDR2 <400> 216 Gly Ala Phe 1 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ipilimumab light chain CDR3 <400> 217 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 218 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab heavy chain <400> 218 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 210 215 220 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 219 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab light chain <400> 219 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 220 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab variable heavy chain <400> 220 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu 85 90 95 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 <210> 221 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab variable light chain <400> 221 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 100 105 110 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab heavy chain CDR1 <400> 222 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 223 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab heavy chain CDR2 <400> 223 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 224 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab heavy chain CDR3 <400> 224 Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 225 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab light chain CDR1 <400> 225 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 226 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab light chain CDR2 <400> 226 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic tremelimumab light chain CDR3 <400> 227 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 228 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab heavy chain <400> 228 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 229 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab light chain <400> 229 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 230 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab variable heavy chain <400> 230 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 231 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab variable light chain <400> 231 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 232 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab heavy chain CDR1 <400> 232 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 1 5 <210> 233 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab heavy chain CDR2 <400> 233 Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile 1 5 <210> 234 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab heavy chain CDR3 <400> 234 Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 235 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab light chain CDR1 <400> 235 Gln Ser Val Ser Arg Tyr 1 5 <210> 236 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab light chain CDR2 <400> 236 Gly Ala Ser 1 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zalifrelimab light chain CDR3 <400> 237 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5

Claims (58)

  1. TIL의 효력을 결정하는 방법으로서,
    a. 표적 세포와 TIL 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
    b. 수확물을 수득하거나 상기 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
    c. (1) 상기 수확물을 상기 TIL 세포 상의 하나 이상의 마커의 발현에 대해 평가하거나 또는 (2) 상기 상청액을 상기 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여, 상기 TIL에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이
    d. (i) 상기 표적 세포와 음성 대조군 세포, 또는 (ii) 상기 TIL 세포 및 상기 표적 세포와 인간 백혈구 항원(HLA) 차단 항체를 포함하는 음성 대조군의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계로서, 상기 제2 기간은 선택적으로 상기 제1 기간과 동시에 일어나는 것인 단계;
    e. 상기 제2 공배양으로부터 제2 수확물을 수득하거나 제2 상청액을 추출하는 단계;
    f. (1) 상기 제2 수확물을 상기 TIL 세포 상의 상기 하나 이상의 마커의 발현에 대해 평가하거나, 또는 (2) 상기 제2 상청액을 상기 TIL 세포로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
    g. 단계 c로부터의 상기 하나 이상의 관찰 값을 단계 f로부터의 상기 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 여기서 각각의 관찰 값 또는 관찰 값의 세트가 상응하는 대조 값 또는 대조 값 세트와 비교되어 상기 TIL의 효능을 결정하는 단계
    인 추가 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TIL은 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물, 골수 침윤 림프구(MIL) 생성물, 또는 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 방법은 선택적으로 동결보존된 TIL 생성물, MIL 생성물, 또는 PBL 생성물을 해동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL은 인간으로부터의 TIL 생성물이고, 상기 TIL 생성물은 종양의 절제 또는 종양의 단편화 또는 분해에 의해 수득되고, 급속 확장 프로토콜 단계를 포함하는 TIL 확장 공정에 의해 제조되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자의 치료에 사용하기 위해 상기 TIL을 방출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 단핵구 세포, B-림프모구성 세포, 버킷 림프종 세포, Raji 세포, Thp1 세포, Ramos 세포, U937 세포, Daudi 세포, 및 이들의 유도체, 변이체, 변형 또는 자손, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이러한 표적 세포 또는 이들의 조합은 선택적으로 방사선조사되고, 상기 표적 세포 또는 이들의 조합은 선택적으로 상기 TIL, MIL, 또는 PBL 생성물과 동종반응성인, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 MHC 또는 HLA 클래스 I 및 MHC 또는 HLA 클래스 II 발현이 결여된 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 K562 세포 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손이고, 이러한 음성 대조군 세포는 선택적으로 방사선조사되는, 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 생성 세포의 수 대 상기 표적 세포의 수 사이의 비가 5:1 내지 1:5 사이이고, 상기 TIL 생성 세포의 수 대 상기 음성 대조군 세포의 수 사이의 비가 5:1 내지 1:5인, 방법.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 생성 세포의 수 대 상기 음성 대조군 세포의 수 사이의 비가 1:2 내지 1:4이고, 상기 TIL 생성 세포의 수 대 상기 음성 대조군 세포의 수 사이의 비가 1:2 내지 1:4인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기간이 약 6시간 내지 약 48시간인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기간이 약 6시간 내지 약 48시간인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기간이 약 12시간, 약 18시간 및 약 24시간으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기간이 약 12시간, 약 18시간 및 약 24시간으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 상의 하나 이상의 마커가 CD25, CD69, CD134, CD137, CD150, KLRG1 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL로부터 분비된 상기 하나 이상의 분석물이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 생성물로부터 분비된 상기 하나 이상의 분석물이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 그랜자임 B, 퍼포린, TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-14, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-25, IL-26, MIP-1β 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 관찰 값의 양은 상기 하나 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값의 양에 대해 정규화되고, 상기 하나 이상의 분석물 각각에 대한 대조 값에 비해 관찰 값의 증가는 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 생성물이 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 인간 환자로부터의 TIL 세포와 종양의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단에 의해 수득되는 종양으로부터 제조되는, 방법.
  19. 종양 침윤 림프구(TIL) 집단을 사용하여 치료를 필요로 하는 환자의 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 환자로부터 수득한 종양 샘플을 (i) 다수의 종양 단편 또는 (ii) 종양 분해물로 처리함으로써, 외과적 절제, 바늘 생검, 코어 생검, 소형 생검, 또는 다른 수단에 의해 상기 환자로부터 절제된 종양으로부터의 TIL의 제1 집단을 수득하고/하거나 수용하는 단계;
    (b) 상기 TIL의 제1 집단을 밀폐 시스템에 첨가하는 단계;
    (c) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양함으로써 1차 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 1차 확장은 제1 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 상기 1차 확장은 약 3 내지 14일 동안 수행되어 TIL의 제2 집단을 수득하고, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (d) 상기 TIL의 제2 집단의 세포 배양 배지에 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 보충하여 2차 확장을 수행함으로써 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 2차 확장은 상기 TIL의 제3 집단을 수득하기 위해 약 7-14일 동안 수행되며, 여기서 상기 TIL의 제3 집단은 TIL의 치료 집단이고, 상기 2차 확장은 제2 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 단계 (c)에서 단계 (d)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (e) 단계 (d)로부터 수득한 상기 TIL의 치료 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (d)로부터 단계 (e)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (f) 단계 (e)로부터의 상기 TIL의 치료 집단을 주입 백으로 전달하는 단계로서, 단계 (e)로부터 단계 (f)로의 전달은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (g) 선택적으로, 단계 (f)로부터의 상기 TIL의 치료 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존하는 단계;
    (h) 상기 TIL의 치료 집단의 효력을 다음을 통해 결정하는 것인, 단계:
    i. 상기 TIL의 치료 집단을 포함하는 주입 백이 단계 (g)에서 선택적으로 동결보존된 경우, 상기 TIL의 치료 집단을 포함하는 주입 백을 선택적으로 해동시키는 단계;
    ii. 상기 TIL의 치료 집단의 일부와 표적 세포의 공배양을 제1 기간 동안 수행하는 단계;
    iii. 상기 공배양으로부터 수확물 또는 상청액을 수득하는 단계;
    iv. (1) 상기 수확물을 상기 TIL의 치료 집단의 일부에서 하나 이상의 마커의 발현에 대해 평가하거나, 또는 (2) 상기 상청액을 상기 TIL의 치료 집단의 일부로부터 분비된 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 상기 TIL의 치료 집단에 대한 효력을 결정하는 하나 이상의 관찰 값을 수득하는 단계;
    v. (i) 상기 TIL의 치료 집단의 일부와 함께 음성 대조군 세포, 또는 (ii) 상기 TIL의 치료 집단의 제2 일부 및 상기 표적 세포와 함께 인간 백혈구 항원(HLA) 차단 항체의 제2 공배양을 제2 기간 동안 수행하는 단계;
    vi. 상기 제2 공배양으로부터 제2 수확물 또는 제2 상청액을 수득하는 단계;
    vii. (1) 상기 제2 수확물을 상기 TIL의 치료 집단의 제2 일부에서 상기 하나 이상의 마커의 발현에 대해 평가하거나, (2) 상기 제2 상청액을 상기 TIL의 치료 집단의 제2 일부로부터 분비되는 하나 이상의 분석물에 대해 평가하여 하나 이상의 대조 값을 수득하는 단계; 및
    viii. 상기 하나 이상의 관찰 값을 상기 하나 이상의 대조 값과 비교하는 단계로서, 각각의 관찰 값이 이의 상응하는 대조 값과 비교되어 상기 TIL의 치료 집단의 효력을 결정하는 것인, 단계; 및
    (i) 상기 TIL의 치료 집단이 효력이 있는 것으로 결정되는 경우, 상기 단계 (f) 또는 (g)의 주입 백으로부터의 상기 TIL의 치료 집단의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 수확된 TIL의 효력 및/또는 기능성을 검사하는 단계가 동결보존 후, 또는 선택적으로 동결보존 단계 전후에 일어나는 것인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 환자가 CTLA-4 저해제, PD-1 저해제 또는 PD-L1 저해제에 대해 절제 불가능하거나, 전이성이거나, 저항성(resistant) 또는 불응성인 종양을 갖고, 선택적으로 상기 환자는 이전에 CTLA-4 저해제, PD-1 저해제, 또는 PD-L1 저해제로 치료받은 적이 있는 것인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 TIL의 제2 집단은 상기 TIL의 제1 집단보다 수가 적어도 50배 더 많은, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 확장이 약 10일 내지 약 12일의 기간에 걸쳐 수행되는 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 확장이 약 10일 내지 약 12일의 기간에 걸쳐 수행되는 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 확장이 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되는 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 확장이 약 11일의 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2가 상기 1차 확장에서 상기 세포 배양 배지에 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 확장 단계에서, 상기 IL-2는 1000 IU/mL 내지 6000 IU/mL 사이의 초기 농도로 존재하고, 상기 OKT-3 항체는 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는, 방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자에게 상기 TIL을 투여하기 전에 비-골수파괴성 림프구고갈 요법으로 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 비-골수파괴성 림프구고갈 요법이 사이클로포스파미드를 60 mg/m2/일의 용량으로 2일 동안 투여한 후, 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 5일 동안 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 비-골수파괴성 림프구고갈 요법이 사이클로포스파미드를 60 mg/m2/일의 용량으로 및 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 2일 동안 투여한 후, 플루다라빈을 25 mg/m2/일의 용량으로 3일 동안 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 치료 집단을 상기 환자에게 투여한 후 다음 날부터 시작하여 IL-2 요법으로 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자에게 상기 TIL의 치료 집단을 투여한 날과 동일한 날에 시작하여 IL-2 요법으로 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 IL-2 요법이 상기 환자에게 상기 TIL의 치료 집단을 투여 완료한 후 약 3 내지 약 24시간 후에 투여되는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 IL-2 요법은 내성이 생길 때까지 매 8시간마다 15분 볼러스 정맥 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨 또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 고용량 IL-2 요법인 방법.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 단계가 상기 종양 샘플을 효소 배지에서 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제19항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 단계가 상기 종양 샘플을 기계적으로 파괴하여 상기 종양 샘플을 해리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 환자로부터 수득한 종양 샘플을 종양 분해물로 처리하는 단계가 상기 해리된 종양 샘플을 밀도 구배 분리를 사용하여 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 효소 배지가 DNase를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 효소 배지가 약 30 단위/mL의 DNase를 포함하는, 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 효소 배지가 콜라게나제를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 효소 배지가 약 1.0 mg/mL의 콜라게나제를 포함하는, 방법.
  43. 제19항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 난소암, 췌장암, 자궁내막암, 갑상선암, 자궁경부암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 방광암, 유방암, 두경부암, 교모세포종, 위장암, 신장암, 육종, 및 신장 세포 암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제19항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 CTLA-4 저해제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. T 세포 생성물의 효력을 결정하는 방법으로서,
    e. 상이한 표적 세포 농도에서 T 세포 생성 세포와 표적 세포의 적어도 3가지 공배양을 수행하는 단계;
    f. 상이한 표적 세포 농도에서 T 세포 기준 표준 세포와 표적 세포의 적어도 3가지 공배양을 수행하는 단계;
    g. 각각의 상기 공배양으로부터 상청액을 추출하는 단계; 및
    h. 상기 상청액을 상기 T 세포 생성 세포 및 T 세포 기준 표준 세포로부터 분비된 사이토카인에 대해 평가하여 상기 T 세포 생성물의 효력을 결정하는 용량-농도를 수득하는 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 표적 세포는 단핵구 세포인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 T 세포 생성물이 종양 침윤 림프구(TIL) 생성물, 골수 침윤 림프구(MIL) 생성물, 또는 말초 혈액 림프구(PBL) 생성물인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 단핵구 세포가 U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형, 또는 자손이고, 상기 사이토카인이 인터페론-γ인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 공배양이 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 및 약 48시간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 시간 기간 동안 수행되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 T 세포 생성물이 TIL 생성물이고, 웰당 약 4×105, 약 2×105, 약 1×105 및 약 0.5×105 표적 세포의 4가지 표적 세포 용량 농도 및 웰당 약 1.5×106 TIL의 단일 TIL 세포 농도가 사용되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, T 세포 생성 세포와 함께 표적 세포의 적어도 4가지 공배양 및 T 세포 기준 표준 세포와 함께 표적 세포의 적어도 4가지 공배양이 사용되고, 평행선 분석이 수행되고, 하나의 이상치(outlier) 표적 세포 용량 농도는 폐기되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 효력 검정 매트릭스의 구성요소인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 효력 검정 매트릭스가 CD3, CD28 및/또는 CD137 자극을 사용하고 인터페론-γ, 그랜자임 B, 또는 종양 괴사 인자-α를 보고하는 비드 기반 검정 또는 플레이트 기반 검정, 총 생존 세포에 대한 검정, 생존 세포 백분율에 대한 검정, CD4+ 세포 함량에 대한 검정, CD8+ 세포 함량에 대한 검정, TEM 세포 함량에 대한 검정, TCM 세포 함량에 대한 검정, LAG3+ 세포 함량에 대한 검정, 및 KLRG1+ 세포 함량에 대한 검정, CD101+ 세포 함량에 대한 검정, CD69+ 세포 함량에 대한 검정, TSCM 세포 함량에 대한 검정, TEMRA 세포 함량에 대한 검정, Treg 세포 함량에 대한 검정, PD-1+ 세포 함량에 대한 검정, TIM3+ 세포 함량에 대한 검정, CD25+ 세포 함량에 대한 검정, CD27+ 세포 함량에 대한 검정, CD28+ 세포 함량에 대한 검정, CD56+ 세포 함량에 대한 검정, CTLA-4+ 세포 함량에 대한 검정, TIGIT+ 세포 함량에 대한 검정, 및 CD57+ 세포 함량에 대한 검정으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검정을 포함하는, 방법.
  53. 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 종양 분해물 또는 종양 단편을 밀폐 시스템에 첨가하는 단계로서, 상기 종양 분해물 또는 종양 단편이 TIL의 제1 집단을 포함하고 상기 대상체로부터 절제된 종양으로부터 수득되는 것인 단계;
    (b) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단을 배양하여 1차 확장을 수행함으로써 TIL의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 1차 확장은 제1 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되며, 상기 1차 확장은 TIL의 제2 집단을 수득하기 위해 약 3-11일 동안 수행되며, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (c) IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 추가적인 세포 배양 배지를 보충하여 2차 확장을 수행함으로써 TIL의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 2차 확장은 TIL의 제3 집단을 수득하기 위해 약 7-11일 동안 수행되고, 상기 2차 확장은 제2 가스 투과성 표면적을 제공하는 밀폐 용기에서 수행되고, 단계 (b)에서 단계 (c)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (d) 단계 (c)로부터 수득된 TIL의 제3 집단을 수확하는 단계로서, 단계 (c)에서 단계 (d)로의 전환은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (e) 단계 (d)로부터 수확된 TIL의 제3 집단을 주입 백으로 전달하는 단계로서, 단계 (d)에서 (e)로의 전달은 상기 시스템을 열지 않고 일어나는 것인, 단계;
    (f) 단계 (e)로부터의 수확된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
    (g) 단계 (f)에서의 상기 주입 백으로부터의 상기 TIL의 제3 집단의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 APC는 Raji, Ramos, Daudi, U937 또는 Thp1 세포, 또는 이의 파생물, 변이체, 변형 또는 자손으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 암이 흑색종(전이성 흑색종 및 포도막 흑색종 포함), 난소암, 자궁경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암, 방광암, 유방암, 인유두종 바이러스로 인한 암, 두경부암(두경부 편평세포암종(HNSCC) 포함), 식도암, 식도위접합부암, 위암, 위장관암, 신장암 및 신장세포암종으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 1차 확장 및 상기 단계 (b)에서의 2차 확장이 11일의 기간 내에 각각 개별적으로 수행되는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)가 약 10일 내지 약 22일 내에 수행되는, 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 효력이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 또는 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 결정된 것인, 방법.
  58. 제19항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 효력이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 또는 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 결정된 것인, 방법.
KR1020237036004A 2021-03-25 2022-03-25 T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물 KR20240032711A (ko)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163166210P 2021-03-25 2021-03-25
US63/166,210 2021-03-25
US202163189829P 2021-05-18 2021-05-18
US63/189,829 2021-05-18
US202163212933P 2021-06-21 2021-06-21
US63/212,933 2021-06-21
US202163233035P 2021-08-13 2021-08-13
US63/233,035 2021-08-13
US202163246890P 2021-09-22 2021-09-22
US63/246,890 2021-09-22
US202163286145P 2021-12-06 2021-12-06
US63/286,145 2021-12-06
US202263309919P 2022-02-14 2022-02-14
US63/309,919 2022-02-14
PCT/US2022/022030 WO2022204564A2 (en) 2021-03-25 2022-03-25 Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240032711A true KR20240032711A (ko) 2024-03-12

Family

ID=81654979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237036004A KR20240032711A (ko) 2021-03-25 2022-03-25 T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20220313806A1 (ko)
EP (1) EP4314253A2 (ko)
JP (1) JP2024512029A (ko)
KR (1) KR20240032711A (ko)
AU (1) AU2022246174A1 (ko)
CA (1) CA3213163A1 (ko)
IL (1) IL306072A (ko)
TW (1) TW202305360A (ko)
WO (1) WO2022204564A2 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818103A (en) 1981-05-15 1989-04-04 Ratcom Flow cytometry
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4660971A (en) 1984-05-03 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Optical features of flow cytometry apparatus
US4662742A (en) 1985-05-10 1987-05-05 Becton, Dickinson And Company Scatter/fluorescene beam splitter in a flow cytometry apparatus
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4710635A (en) 1986-04-14 1987-12-01 Becton, Dickinson And Company Dual laser excitation from single laser source
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5057413A (en) 1988-06-13 1991-10-15 Becton, Dickinson And Company Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US5620842A (en) 1995-03-29 1997-04-15 Becton Dickinson And Company Determination of the number of fluorescent molecules on calibration beads for flow cytometry
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5641457A (en) 1995-04-25 1997-06-24 Systemix Sterile flow cytometer and sorter with mechanical isolation between flow chamber and sterile enclosure
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5985216A (en) 1997-07-24 1999-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Flow cytometry nozzle for high efficiency cell sorting
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6079836A (en) 1998-07-20 2000-06-27 Coulter International Corp. Flow cytometer droplet break-off location adjustment mechanism
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6495333B1 (en) 1998-09-22 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Flow cytometric, whole blood dendritic cell immune function assay
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6256096B1 (en) 1999-01-11 2001-07-03 Softray Flow cytometry apparatus and method
US20010006416A1 (en) 1999-01-11 2001-07-05 Johnson Paul E. Ribbon flow cytometry apparatus and methods
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
US6890487B1 (en) 1999-09-30 2005-05-10 Science & Technology Corporation ©UNM Flow cytometry for high throughput screening
US6482652B2 (en) 2000-03-23 2002-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological particle sorter
US6700130B2 (en) 2001-06-29 2004-03-02 Honeywell International Inc. Optical detection system for flow cytometry
ES2382636T3 (es) 2000-10-31 2012-06-12 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Método para producir composiciones para la administración mejorada de moléculas bioactivas
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
US20020186375A1 (en) 2001-05-01 2002-12-12 Asbury Charles L. Device and methods for detecting samples in a flow cytometer independent of variations in fluorescence polarization
US7479630B2 (en) 2004-03-25 2009-01-20 Bandura Dmitry R Method and apparatus for flow cytometry linked with elemental analysis
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
CA2495251C (en) 2002-08-14 2018-03-06 Macrogenics, Inc. Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof
WO2004017041A2 (en) 2002-08-15 2004-02-26 Xy, Inc. High resolution flow cytometer
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2325329B1 (en) 2002-12-23 2014-02-12 Promega Corporation Improved luciferase-based assays
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
US20080089892A1 (en) 2004-01-12 2008-04-17 Eli Lilly And Co. Fc Region Variants
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
JP4756948B2 (ja) 2005-08-08 2011-08-24 ベイバイオサイエンス株式会社 フローサイトメータおよびフローサイトメトリ方法
US8629981B2 (en) 2008-02-01 2014-01-14 Palo Alto Research Center Incorporated Analyzers with time variation based on color-coded spatial modulation
US9645010B2 (en) 2009-03-10 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and methods
PT2637694T (pt) 2010-11-12 2021-05-05 Nektar Therapeutics Conjugados de uma fração de il-2 e um polímero
WO2012129201A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
US20140295426A1 (en) 2011-07-28 2014-10-02 Veridex Llc Methods for Diagnosing Cancer by Characterization of Tumor Cells Associated with Pleural or Serous Fluids
JP6322626B2 (ja) 2012-06-08 2018-05-09 アルカーメス，インコーポレイテッド ムチン−ドメインポリペプチドリンカーを含む融合ポリペプチド
CN110579435B (zh) 2012-10-15 2023-09-26 纳诺赛莱克特生物医药股份有限公司 颗粒分选的系统、设备和方法
EP2961415B1 (en) 2013-03-01 2021-01-06 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor
EP3838288A1 (en) 2014-06-11 2021-06-23 polybiocept GmbH Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy
US9453791B2 (en) 2014-07-01 2016-09-27 Octrolix Bv Flow cytometry system and method
KR102600559B1 (ko) 2015-10-13 2023-11-10 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 다중모드 형광 이미징 유동 세포 계측 시스템
US10648900B2 (en) 2015-12-23 2020-05-12 Becton, Dickinson And Company Multi-color flow cytometric analysis of samples with low cell numbers
WO2017214010A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Verily Life Sciences Llc Temporal multiplexed excitation for miniaturized, planar fluorescence activated cell sorting
JP6638135B2 (ja) 2016-06-22 2020-01-29 本田技研工業株式会社 電動機
BR112019008305A2 (pt) 2016-10-26 2019-08-06 Iovance Biotherapeutics Inc métodos para expansão de linfócitos infiltrantes de tumor, para avaliação da atividade metabólica de uma população de células til, para tratamento de um sujeito com câncer e para ensaiar tils, e, população de tils expandidos
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
CA3044250A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Remnant tumor infiltrating lymphocytes and methods of preparing and using the same
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
WO2018209115A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
BR112019024556A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Novartis Ag Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo e métodos para uso no tratamento de câncer
US20200181220A1 (en) 2017-08-03 2020-06-11 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
SG11202004457XA (en) 2017-11-17 2020-06-29 Iovance Biotherapeutics Inc Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
GB201801067D0 (en) 2018-01-23 2018-03-07 Price Nicola Kaye Biomarkers predictive of tumour infiltrating lymphocyte therapy and uses thereof
BR112020021660A2 (pt) 2018-04-27 2021-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, composição de criopreservação
US11187041B2 (en) 2018-07-12 2021-11-30 National Oilwell Vareo, L.P. Sensor equipped downhole motor assembly and method
AU2019374761A1 (en) 2018-11-05 2021-06-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
GB201900858D0 (en) 2019-01-22 2019-03-13 Price Nicola Kaye Receptors providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
CN114949240A (zh) 2019-02-06 2022-08-30 新索思股份有限公司 Il-2缀合物及其使用方法
US11246906B2 (en) 2019-06-11 2022-02-15 Alkermes Pharma Ireland Limited Compositions and methods for subcutaneous administration of cancer immunotherapy
WO2021123832A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Instil Bio (Uk) Limited Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20220313806A1 (en) 2022-10-06
IL306072A (en) 2023-11-01
CA3213163A1 (en) 2022-09-29
US20240082375A1 (en) 2024-03-14
WO2022204564A2 (en) 2022-09-29
EP4314253A2 (en) 2024-02-07
WO2022204564A3 (en) 2022-11-10
AU2022246174A1 (en) 2023-09-14
TW202305360A (zh) 2023-02-01
JP2024512029A (ja) 2024-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023523855A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用
JP2024506557A (ja) 修飾された腫瘍浸潤リンパ球を作製する方法及び養子細胞療法におけるそれらの使用
JP2023554395A (ja) Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
JP2024500403A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
JP2024519029A (ja) Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
JP2024510505A (ja) Ｃｄ３９／ｃｄ６９選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張及びｔｉｌにおける遺伝子ノックアウトのための方法
JP2024501452A (ja) Ｂｒａｆ阻害剤及び／またはｍｅｋ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球治療によるがん患者の治療
US20240082375A1 (en) Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
JP2023524108A (ja) 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
WO2023009716A1 (en) Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
JP2024509184A (ja) 腫瘍保存及び細胞培養組成物
US20240133871A1 (en) Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
CN117480246A (zh) 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物
WO2023049862A1 (en) Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
WO2024098027A1 (en) Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2023220608A1 (en) Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023086803A1 (en) Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023004074A2 (en) Method for cryopreservation of solid tumor fragments
CN117940557A (zh) 制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用
WO2023196877A1 (en) Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023147488A1 (en) Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
CN116829156A (zh) 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗