BR112019024556A2 - Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo e métodos para uso no tratamento de câncer - Google Patents

Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo e métodos para uso no tratamento de câncer Download PDF

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Christophe Filippi
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Abstract

A presente invenção refere-se à IL2 enxertada nas sequências de CDR de um anticorpo que tem perfis terapêuticos preferenciais em relação a moléculas conhecidas e usadas na clínica. Em particular, as composições de proteína enxertada com citocina de anticorpo fornecidas aumentam ou mantêm as células efetoras T CD8+ ao mesmo tempo que reduzem a atividade de células Treg. Adicionalmente, as composições fornecidas conferem meia-vida, estabilidade e produtividade melhoradas em relação às formulações de IL2 humana recombinante, tais como Proleukin®.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROTEÍ-
NAS ENXERTADAS COM CITOCINA DE ANTICORPO E MÉTODO PARA USO NO TRATAMENTO DE CÂNCER”. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório nº U.S. 62/510.533, depositado em 24 de maio de 2017, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO
[002] A presente invenção refere-se a proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que se ligam ao receptor de baixa afinidade com interleucina-2 (IL2) e métodos de tratamento contra câncer.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[003] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato de ASCII e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita có- pia de ASCII, criada em 5 de abril de 2018, é chamada de PAT057462- WO-PCT_SL.txt e tem 69.489 bytes em tamanho.
ANTECEDENTES
[004] A IL2 foi clonada primeiramente em 1983 (Taniguchi et al., Nature 1983, 302:305 a 310, Devos et al., Nucleic Acid Res. 1983, 11(13):4.307 a 4.323, Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1983, 115:1.040 a 1.047). A proteína IL2 tem um comprimento de 153 aminoácidos com um peptídeo sinal de aminoácidos 1 a 20 e se enovela em uma estrutura de 4 alfa-hélices anfifáticas antiparalelas (Smith K.A., Science 1988, 240:1.169 a 1.176).
[005] A IL2 medeia seu efeito biológico por sinalização através de um receptor de alta afinidade ou de baixa afinidade (Kreig et al., PNAS 2010, 107(26)11.906 a 11.911). O receptor de alta afinidade é trimérico, que consiste em IL2-Rα (CD25), IL2-Rβ (CD122) e IL2-Rγ (CD132). O receptor de baixa afinidade é dimérico, que consiste apenas nas cadeias de IL2-Rβ(CD122) e IL2-Rγ(CD132). O receptor de baixa afinidade se liga a IL2, mas com 10 a 100 vezes menos afinidade que o receptor de alta afinidade trimérico, indicando que IL2-Rα (CD25) é importante para o aumento na afinidade, mas não é um componente de sinalização (Kreig et al., supra). A expressão dos receptores de IL2 também é dis- tinta. O receptor de IL2 de alta afinidade é expresso em células T ativa- das e células T reguladoras CD4+/Foxp3+ (Treg). Em contrapartida, o receptor de IL2 de baixa afinidade é encontrado em células efetoras T CD8+ e células exterminadoras naturais (NK).
[006] A IL2 recombinante (rhIL2) foi inicialmente aprovada para uso clínico em 1992 (Coventry et al., Cancer Mgt Res. 2012 4:215 a 221). Proleukin® (aldesleucina) é uma IL2 modificada, que é aglicosi- lada, carece de uma alanina N-terminal e tem uma serina substituída por cisteína no aminoácido 125. Proleukin® foi inicialmente indicada como uma terapia para melanoma maligno e carcinoma de célula renal, mas foi usada para outros tipos de câncer, tais como colorretal, mama, pulmão e mesotelioma (Coventry, supra). Um estudo que abrangeu 259 pacientes com carcinoma de célula renal de 1986 a 2006 constatou que 23 pacientes têm uma resposta completa e 30 tiveram uma resposta parcial (Klapper et al., Cancer 2008 113(2):293 a 301). Isso representou uma taxa de resposta objetiva geral de 20%, com regressão tumoral completa em 7% dos pacientes com câncer de células renais (Klapper et al., supra).
[007] No entanto, o tratamento contra câncer com IL2 não ocorreu sem efeitos adversos. O estudo com 259 pacientes observou vaza- mento capilar/vascular, vasodilatação e oligúria. Também houve infec- ções de grau 3 e grau 4, tanto de cateteres como infecção geral, atribu- ídas à disfunção de neutrófilos (Klapper et al., supra). A literatura de Proleukin® observa que Proleukin® tem sido associada à exacerbação de doenças autoimunes e distúrbios inflamatórios, tais como doença de Crohn, escleroderma, tireoidite, artrite inflamatória, diabetes mellitus, miastenia gravis oculo-bulbar, glomerulonefrite por IgA crescêntrica, co- lecistite, vasculite cerebral, síndrome de Stevens-Johnson e penfigoide bolhoso.
[008] A constatação de que células Treg expressavam constituti- vamente o receptor de IL2 de alta afinidade e eram dependentes de IL2 para sobrevivência e função indicou a razão de esse efeito colateral ter sido visto (D'Cruz et al., Nat. Immuno. 2005, 6:1.152 a 1.159). Isso ilus- tra a necessidade de produtos terapêuticos de IL2 com farmacocinética melhorada e com seletividade para ativação de células de células T CD8+ através do receptor de baixa afinidade sem ativação de células Treg através do receptor de alta afinidade, visto que isso permite o tra- tamento de câncer sem os efeitos colaterais indesejados vistos com Proleukin®.
DESCRIÇÃO
[009] A presente revelação refere-se à IL2 enxertada nas sequên- cias de CDR de um anticorpo que tem perfis terapêuticos preferenciais em relação a moléculas conhecidas e usadas na clínica. Em particular, as composições de proteína enxertada com citocina de anticorpo forne- cidas aumentam ou mantêm as células efetoras T CD8+ ao mesmo tempo que reduzem a atividade de células Treg. Adicionalmente, as composições fornecidas conferem meia-vida, estabilidade e produtivi- dade melhoradas em relação às formulações de IL2 humana recombi- nante, tais como Proleukin®. A presente revelação fornece, assim, pro- teínas enxertadas com citocina de anticorpo que se ligam a e promovem a sinalização preferencial através do receptor de baixa afinidade com IL2, com ligação reduzida ao receptor de alta afinidade com IL2. São fornecidas proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compre-
endem (i) uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que com- preende uma região variável de cadeia pesada (VH) e (ii) uma sequên- cia de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região vari- ável de cadeia leve (VL) e em que uma molécula de IL2 é enxertada em uma região determinante de complementaridade (CDR) da VH ou da VL do anticorpo.
[0010] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH), que com- preende as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3; e (b) uma região variável de cadeia leve (VL), que compre- ende LCDR1, LCDR2, LCDR3; e (c) uma molécula de Interleucina 2 (IL2) enxertada em uma CDR da VH ou da VL.
[0011] A proteína enxertada com citocina de anticorpo que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em uma CDR de cadeia pesada.
[0012] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a molécula de IL2 é enxertada em uma região selecionada a partir de re- gião determinante da complementaridade 1 (HCDR1), da região deter- minante da complementaridade 2 (HCDR2) ou da região determinante da complementaridade 3 (HCDR3).
[0013] A proteína enxertada com citocina de anticorpo que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em HCDR1.
[0014] A proteína enxertada com citocina de anticorpo que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em uma CDR de cadeia leve.
[0015] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a mo- lécula de IL2 é enxertada em uma região selecionada a partir de região determinante da complementaridade 1 (LCDR1), da região determinante da complementaridade 2 (LCDR2) ou da região determinante da comple- mentaridade 3 (LCDR3).
[0016] A proteína enxertada com citocina de anticorpo que compre- ende uma molécula de IL2 que contém uma mutação que reduz a afini- dade da molécula de IL2 ao receptor de IL2 de alta afinidade.
[0017] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula proliferação de efetora de célula T CD8 maior que a IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0018] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula a proliferação de células Treg menor que a IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0019] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula a proliferação de células NK mais do que IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0020] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo tem uma meia-vida mais longa que a IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0021] A proteína enxertada com citocina de anticorpo em que a molécula de IL2 consiste em SEQ ID NO:4.
[0022] A proteína citocina enxertada em anticorpo em que a molé- cula de IL2 consiste em SEQ ID NO:6.
[0023] A proteína citocina enxertada em anticorpo que compreende uma cadeia pesada de anticorpo de classe de IgG.
[0024] A proteína citocina enxertada em anticorpo em que a IgG é selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4.
[0025] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a especificidade de ligação das CDRs a um alvo é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, pela molécula de IL2 enxertada.
[0026] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a especificidade de ligação das CDRs a um alvo é retida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, na presença da molécula de IL2 enxertada.
[0027] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a especificidade de ligação das CDR é distinta da especificidade de liga- ção da molécula de IL2.
[0028] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a especificidade de ligação da CDR é para um alvo não humano.
[0029] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que o antígeno não humano é um vírus.
[0030] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que o vírus é o vírus sincicial respiratório (RSV).
[0031] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que o RSV é selecionado dentre o subgrupo A de RSV e subgrupo B de RSV.
[0032] A proteína enxertada com citocina de anticorpo em que a porção de arcabouço do anticorpo da proteína enxertada com citocina de anticorpo é humanizada ou humana.
[0033] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreendem: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO: 13, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:29, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:30 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:31; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:45, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:46, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:47; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:62 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:63.
[0034] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO:19, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 35; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 51, e uma região variável de cadeia leve (VL) que com- preende SEQ ID NO: 67.
[0035] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que o anticorpo compreende a região Fc modificada correspondente à função efetora reduzida.
[0036] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a região Fc modificada compreende uma mutação selecionada dentre uma ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A.
[0037] A proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que a região Fc modificada compreende uma combinação de mutações sele- cionadas dentre uma ou mais dentre D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A e P329G/L234A/L235A.
[0038] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreendem uma HCDR1 da SEQ ID NO: 13, uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, uma HCDR3 de SEQ ID NO:15, uma LCDR1 de SEQ ID NO:29, uma LCDR2 de SEQ ID NO:30, uma LCDR3 de SEQ ID NO:31, uma região Fc modificada con- tendo a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com cito- cina de anticorpo estimula menos ativação de células Treg em compa- ração a IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0039] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreendem uma HCDR1 da SEQ ID NO: 45, uma HCDR2 de SEQ ID NO:46, uma HCDR3 de SEQ ID NO:47, uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, uma LCDR2 de SEQ ID NO:62, uma LCDR3 de SEQ ID NO:63, uma região Fc modificada con-
tendo a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com cito- cina de anticorpo estimula menos ativação de células Treg em compa- ração a IL2 recombinante ou Proleukin®.
[0040] As modalidades da presente revelação fornecem ácidos nu- cleicos isolados que codificam uma proteína enxertada com citocina de anticorpo que compreendem: (i) uma cadeia pesada de SEQ ID NO:22 e/ou uma cadeia leve de SEQ ID NO:38; ou (ii) uma cadeia pesada de SEQ ID NO:54 e/ou uma cadeia leve de SEQ ID NO:70.
[0041] As modalidades da presente revelação fornecem células hospedeiras recombinantes adequadas para a produção de uma prote- ína enxertada com citocina de anticorpo que compreende os ácidos nu- cleicos revelados no presente documento que codificam os polipeptí- deos de cadeia pesada e leve da proteína e opcionalmente um sinal de secreção.
[0042] A célula hospedeira recombinante, que é uma linhagem de células de mamífero.
[0043] A célula hospedeira recombinante, em que a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células CHO.
[0044] As modalidades da presente revelação fornecem composi- ções farmacêuticas que compreendem a proteína enxertada com cito- cina de anticorpo revelada no presente documento e um ou mais veícu- los farmaceuticamente aceitáveis.
[0045] As modalidades da presente revelação fornecem métodos para tratar câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeutica- mente eficaz da proteína enxertada com citocina de anticorpo ou a com- posição farmacêutica revelada no presente documento.
[0046] O método para tratar câncer, em que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer da próstata, câncer de mama e linfoma.
[0047] O método para tratar câncer, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo ou a composição farmacêutica é administrada em combinação com outro agente terapêutico.
[0048] O método para tratar câncer, em que o agente terapêutico é outra proteína enxertada com citocina de anticorpo.
[0049] O método para tratar câncer, em que o agente terapêutico é um inibidor de verificação imunológica.
[0050] O método para tratar câncer, em que a verificação imunoló- gica é selecionada dentre o grupo que consiste em: PD-1, PD-L1, PD- L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TI- GIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
[0051] As modalidades da presente revelação fornecem métodos para expandir células efetoras T CD8 em um paciente com necessidade do mesmo que compreendem administrar a proteína enxertada com ci- tocina de anticorpo ou a composição farmacêutica revelada no presente documento ao paciente.
[0052] O método para expandir células efetoras T CD8, em que as células efetoras T CD8 são expandidas e as células Treg não são ex- pandidas.
[0053] O método para expandir células efetoras T CD8, em que os efetores T CD8 são expandidos e as células NK não são expandidas.
[0054] O método para expandir células efetoras T CD8 que compre- ende adicionalmente a administração de um inibidor de ponto de verifi- cação imunológico.
[0055] O método para expandir células efetoras T CD8, em que o ponto de verificação imunológico é selecionado dentre o grupo que con- siste em: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
[0056] As modalidades da presente revelação fornecem o uso de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo no tratamento de câncer que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 13, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:29, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:30 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:31; e (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:45, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:46, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:47; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:62 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:63, no tratamento de câncer.
[0057] O uso da proteína enxertada com citocina de anticorpo no tratamento de câncer, em que a proteína citocina enxertada em anti- corpo é administrada em combinação com outro agente terapêutico.
[0058] O uso da proteína enxertada com citocina de anticorpo, em que o agente terapêutico é um antagonista de um inibidor de ponto de verificação imunológico.
[0059] O uso em que o antagonista do inibidor de ponto de verifica- ção imunológico é selecionado dentre do grupo que consiste em: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
[0060] Em determinadas modalidades, a proteína enxertada com ci- tocina de anticorpo compreende uma região Fc de anticorpo de classe de IgG. Em modalidades particulares, uma imunoglobulina é selecio- nada a partir de região Fc de subclasse IgG1, IgG2 ou IgG4. O anti- corpo, o fragmento de anticorpo ou a molécula de ligação a antígeno opcionalmente contém pelo menos uma modificação que modula (isto é, aumenta ou diminui) a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo a um receptor Fc. A cadeia pesada de imunoglobulina pode compreen- der opcionalmente uma modificação que confere função efetora modifi- cada. Em modalidades particulares, a cadeia pesada de imunoglobulina pode compreender uma mutação que confere a função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.
[0061] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com citocina de anticorpo também compreende variações na porção de IL2 da molé- cula. As variações podem ser mudanças de único aminoácido, deleções de único aminoácido, mudanças de múltiplos aminoácidos e deleções de múltiplos aminoácidos. Essas mudanças na porção de citocina IL2 da molécula podem diminuir a afinidade da proteína enxertada com ci- tocina de anticorpo para o receptor de IL2 de alta afinidade.
[0062] Além disso, a revelação fornece polinucleotídeos que codifi- cam pelo menos uma proteína de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente documento. Em outro aspecto relacionado, são fornecidas célu- las hospedeiras que são adequadas para a produção de uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente docu- mento. Em modalidades particulares, as células hospedeiras compreen- dem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo de cadeia leve e/ou cadeia pesada da proteína enxertada com citocina de anticorpo. Em ainda outro aspecto, são fornecidos métodos para produzir proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que compreendem cultivar as células hospedei- ras fornecidas, conforme descrito no presente documento, sob condições adequadas para expressão, formação e secreção da proteína enxertada com citocina de anticorpo e recuperar a proteína enxertada com citocina de anticorpo da cultura. Em um aspecto adicional, a revelação fornece adi- cionalmente kits que compreendem uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente documento.
[0063] Em outro aspecto relacionado, a revelação fornece adicio- nalmente composições que compreendem uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a reve- lação fornece composições farmacêuticas que compreendem uma pro- teína enxertada com citocina de anticorpo para administrar a um indiví- duo.
[0064] Em um outro aspecto, os métodos para tratar câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente do- cumento. Em um aspecto adicional, é fornecida uma proteína enxertada com citocina de anticorpo para uso no tratamento ou profilaxia de câncer em um indivíduo.
[0065] Em algumas modalidades, o paciente tem um distúrbio de proliferação celular ou câncer, por exemplo, melanoma, câncer de pul- mão, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de mama e linfoma.
DEFINIÇÕES
[0066] Um “anticorpo” se refere a uma molécula da família da imu- noglobulina que compreende uma unidade estrutural tetramérica. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, sendo que cada par tem uma cadeia "leve” (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 kD), conectada através de uma ligação de dis- sulfeto. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante κ, λ, α, γ, δ, ε e μ, assim como os inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas ou como κ ou λ. As cadeias pesadas são classificadas como γ, μ, α, δ ou ε que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE respectivamente. Os anticorpos podem ser qualquer isó- tipo/classe (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2).
[0067] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional.
Os termos “constante” e “variável” são usados estrutural e funcionalmente.
A extremidade N de cada ca- deia define uma região ou domínio variável (V) de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis por reconhecimento de antígeno.
Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada vari- ável (VH) se referem a essas regiões de cadeias leves e pesadas res- pectivamente.
O pareamento de uma VH e VL entre si forma um sítio de ligação a antígeno único.
Além das regiões V, tanto cadeias leves quanto cadeias pesadas contêm uma região ou domínio constante (C). Uma forma secretada de uma região C de imunoglobulina é formada por três domínios C, CH1, CH2, CH3, opcionalmente CH4 (Cμ) e uma região de articulação.
Uma forma ligada a membrana de uma região C de imu- noglobulina também tem domínios membranares e intracelulares.
Cada cadeia leve tem uma VL na extremidade N seguida por um domínio cons- tante (C) em sua outra extremidade.
Os domínios constantes da cadeia leve (CL) e a cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem importantes propriedades biológicas, tais como secreção, mobilidade transplacental, ligação de receptor Fc, ligação de complemento e semelhantes.
Con- vencionalmente, a numeração dos domínios de região constantes au- menta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligação ao antí- geno ou extremidade amino do anticorpo.
O terminal N é uma região variável e no terminal C é uma região constante; os domínios CH3 e CL realmente compreendem os domínios carbóxi-terminais da cadeia pe- sada e leve, respectivamente.
A VL é alinhada com a VH e a CL é ali- nhada com o primeiro domínio constante da cadeia pesada.
Conforme usado no presente documento, um "anticorpo" abrange estruturas con- vencionais de anticorpo e variações de anticorpos.
Desse modo, dentro do escopo desse conceito estão proteínas enxertadas com citocina de anticorpo, anticorpos de comprimento total, anticorpos quiméricos, anti- corpos humanizados, anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo dos mesmos.
[0068] Anticorpos existem como cadeias intactas de imunoglobulina ou como um número de fragmentos de anticorpo bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. O termo "fragmento de anticorpo," conforme usado no presente documento, se refere a uma ou mais porções de um anticorpo que retém seis CDRs. Desse modo, por exemplo, a pepsina ingere um anticorpo abaixo das ligações de dissul- feto na região de articulação para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab' que, por sua vez é uma cadeia leve unida a VH-CH1 por uma ligação de bissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido em condições brandas para rom- per a ligação de dissulfeto na região de articulação, desse modo con- vertendo o dímero F(ab)'2 em um monômero Fab'. O monômero Fab’ é essencialmente um Fab com uma porção da região de articulação (Paul, Fundamental Immunology 3.ª Edição (1993)). Embora vários fragmen- tos de anticorpo sejam definidos em termos de digestão de um anticorpo intacto, uma pessoa de habilidade comum na técnica observará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo ou quimicamente ou com o uso de metodologia recombinante de DNA. Conforme usado no presente documento, um "fragmento de anticorpo" se refere a uma ou mais porções de um anticorpo, ou produzidos pela modificação de anticorpos inteiros ou aqueles sintetizados de novo com o uso de metodologias de DNA recom- binante que retém especificidade de ligação e atividade funcional. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fv, anticor- pos de cadeia únicos (ScFv), Fab, Fab', Fd (domínios Vh e CH1), dAb (Vh e uma CDR isolada); e versões multiméricas desses fragmentos (por exemplo, F(ab')2,) com a mesma especificidade de ligação. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo também podem compreender frag- mentos de anticorpo necessários para obter a especificidade e atividade de ligação desejadas.
[0069] Um domínio “Fab”, conforme usado no contexto compreende um domínio de cadeia pesada variável, um domínio CH1 de região cons- tante, um domínio de cadeia leve variável e um domínio CL de região constante de cadeia leve. A interação dos domínios é estabilizada por uma ligação de dissulfeto entre os domínios CH1 e CL. Em algumas modalidades, os domínios de cadeia pesada do Fab estão na ordem, da extremidade N a extremidade C, VH-CH e os domínios de cadeia leve de um Fab estão na ordem, da extremidade N para extremidade C, VL- CL. Em algumas modalidades, os domínios de cadeia pesada do Fab estão na ordem, da extremidade N para extremidade C, CH-VH e os domínios de cadeia leve do Fab estão na ordem CL-VL. Embora o frag- mento Fab tenha sido identificado historicamente por digestão de papa- ína de uma imunoglobulina intacta, no contexto desta revelação, um “Fab” é produzido tipicamente de maneira recombinante por qualquer método. Cada fragmento Fab é monovalente com relação à ligação ao antígeno, isto é, tem um sítio de ligação a antígeno único.
[0070] Os “domínios determinantes da complementaridade” ou “re- giões determinantes da complementaridade” (“CDR”) se referem de ma- neira intercambiável às regiões hipervariáveis de VL e VH. As CDRs são o sítio-alvo de ligação a proteína das cadeias de anticorpo que abrigam especificidade para tal proteína-alvo. Há três CDRs (CDR1-3, numera- das sequencialmente a partir da extremidade N) em cada VL ou VH hu- mana, que constitui cerca de 15 a 20% dos domínios variáveis. As CDRs são estruturalmente complementares ao epítopo da proteína-alvo e são então diretamente responsáveis pela especificidade da ligação. As ex- tensões restantes da VL ou da VH, as então chamadas regiões estrutu- rantes (FR), exibem menos variação na sequência de aminoácidos (Kuby, Immunology, 4.ª Edição, Capítulo 4. W.H. Freeman & Co., Nova Iorque, 2000).
[0071] As posições de CDRs e regiões estruturantes podem ser de- terminadas com o uso de várias definições bem conhecidas na técnica,
por exemplo, Kabat, Chothia e AbM (consultar, por exemplo, Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, pu- blicação do NIH n.º 91-3242, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205 a 206 (2001); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 a 917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877 a 883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799 a 817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927 a 748 (1997)). Definições de locais de combinação de antígenos são também descritas nas seguintes obras: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219 a 221 (2000); e Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207 a 209 (2001); (numeração ImMunoGenTics (IMGT)) Lefranc, M.-P., The Immunolo- gist, 7, 132 a 136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55 a 77 (2003); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732 a 745 (1996); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 86:9.268 a 9.272 (1989); Mar- tin et al., Methods Enzymol., 203:121 a 153 (1991); e Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141–172 (1996).
[0072] Sob Kabat, resíduos de aminoácido de CDR no VH são enu- merados 31 a 35 (HCDR1), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido de CDR na VL são enumerados 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3). Sob Chothia, aminoáci- dos de CDR na VH são enumerados 26 a 32 (HCDR1), 52 a 56 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido em VL são enumera- dos 26 a 32 (LCDR1), 50 a 52 (LCDR2), e 91 a 96 (LCDR3). Por com- binação das definições de CDR de Kabat e Chothia, as CDRs consistem nos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) em VL humana.
[0073] Uma "cadeia leve variável de anticorpo" ou uma "cadeia pe- sada variável de anticorpo" conforme usado no presente documento se refere a um polipeptídeo que compreende a VL ou VH, respectivamente. A VL endógena é codificada pelos segmentos de gene V (variável) e J (juncional), e a VH endógena por V, D (diversidade), e J. Cada uma den- tre VL ou VH inclui as CDRs assim como as regiões estruturantes (FR). O termo "região variável" ou "região V" se refere de maneira intercam- biável a uma cadeia pesada ou leve que compreende FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma região V pode ser de ocorrência natural, recombinante ou sintética. Nesse pedido, cadeias leves de anticorpo e/ou cadeias pesadas de anticorpo podem, ocasionalmente, ser deno- minadas coletivamente de “cadeias de anticorpo”. Conforme fornecido e descrito adicionalmente no presente documento, uma “cadeia leve va- riável de anticorpo” ou uma “cadeia pesada variável de anticorpo” e/ou uma “região variável” e/ou uma “cadeia de anticorpo” compreende opci- onalmente uma sequência de polipeptídeos de citocina incorporadas em uma CDR.
[0074] A porção C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobu- lina no presente documento, que compreende por exemplo, os domínios CH2 e CH3, é o domínio "Fc". Uma “região Fc”, conforme usado no pre- sente documento se refere à região constante de um anticorpo que ex- clui a primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (CH1). Fc se refere aos últimos dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG e os últimos três domínios de imunoglobu- lina de região constante de IgE e IgM e a extremidade N de articulação flexível a esses domínios. Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, o Fc compreende domínios de imunoglobulina Cγ2 e Cγ3 e a articulação entre Cγ1 e Cγ. Entende-se na técnica que os limites da re- gião Fc podem variar, no entanto, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida como compreendendo resíduos C226 ou P230 para sua extremidade carboxila, com o uso da numeração de acordo com o índice da UE conforme em Kabat et al. (1991, NIH Publi- cation 91 a 3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). A “região Fc" pode se referir a essa região isoladamente ou a essa região no contexto de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. A “região Fc" inclui variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc, por exemplo, na região CH2 e CH3, incluindo, por exemplo, modificações que modulam a função efetora. As regiões Fc também incluem variantes que não resultam em alterações na função biológica. Por exemplo, um ou mais aminoácidos são apagados da extremidade N ou da extremi- dade C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial de função biológica. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma li- sina C terminal é modificada, substituída ou removida. Em modalidades particulares, um ou mais resíduos C-terminal na região Fc são alterados ou removidos. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos C- terminal no Fc (por exemplo, uma lisina terminal) é apagada. Em deter- minadas outras modalidades, um ou mais resíduos C-terminal no Fc são substituídos por um aminoácido alternativo (por exemplo, uma lisina ter- minal é substituída). Tais variantes são selecionadas de acordo com os regulamentos gerais conhecidos na técnica de modo que tenham um efeito mínimo na atividade (consultar, por exemplo, Bowie, et al., Sci- ence 247:306 a 1310, 1990). O domínio Fc é a porção da imunoglobu- lina (Ig) reconhecida por receptores celulares, tais como o FcR, e aos quais a proteína de ativação do complemento, C1 q, se liga. A região de articulação mais baixa, que é codificada na porção 5' no éxon CH2, for- nece flexibilidade dentro do anticorpo para a ligação aos receptores de FcR.
[0075] Um “anticorpo quimérico” é um molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, subs- tituída ou trocada de modo que o sítio de ligação ao antígeno (região variável) seja ligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, função efetora e/ou espécies ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento e fár- maco; ou (b) a região variável, ou uma porção do mesma, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável que tem uma especifici- dade de antígeno diferente ou alterada.
[0076] Um anticorpo “humanizado” é um anticorpo que retém a re- atividade (por exemplo, especificidade de ligação, atividade) de um an- ticorpo não humano ao mesmo tempo que é menos imunogênico em seres humanos. Isso pode ser obtido, por exemplo, retendo-se regiões CDR não humanas e substituindo-se partes restantes de um anticorpo por equivalentes humanos. Consultar, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81:6.851 a 6.855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).
[0077] Um "anticorpo humano" inclui anticorpos que têm regiões va- riáveis nas quais tanto a região estruturante quanto a região de CDR são derivadas das sequências de origem humana. Além disso, caso um anticorpo contenha uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de li- nhagem germinativa humana ou versões que sofreram mutação de se- quências de linhagem germinativa humana ou anticorpo que contém se- quências estruturantes de consenso de análise de sequências estrutu- rantes humanas, por exemplo, conforme descrito em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57 a 86, 2000). Os anticorpos humanos podem incluir re- síduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-es- pecífica in vitro ou por mutação somática in vivo ou uma substituição conservadora para promover estabilidade ou fabricação).
[0078] O termo “sequência de linhagem germinativa humana cor- respondente" se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que codi- ficam uma sequência ou subsequência de aminoácidos de região variá- vel humana que compartilha a identidade de sequência de aminoácido determinada mais alta com uma sequência ou subsequência de amino- ácido de região variável de referência em comparação a todas as outras sequências de aminoácido de região variável conhecidas codificadas por sequências de região variável de imunoglobulina de linhagem ger- minativa humana. Uma sequência de linhagem germinativa humana correspondente também pode se referir à sequência ou subsequência de aminoácidos de região variável humana com uma identidade de se- quência de aminoácidos mais alta com uma sequência ou subsequência de aminoácido de região variável de referência em comparação a todas as outras sequências de aminoácido de região variável avaliadas. Uma sequência de linhagem germinativa humana correspondente pode ser apenas regiões estruturantes, apenas regiões determinantes da com- plementaridade, regiões estruturantes e regiões determinantes da com- plementaridade, um segmento variável (conforme definido acima) ou outras combinações de sequências ou subsequências que compreen- dem uma região variável. A identidade de sequência pode ser determi- nada com o uso dos métodos descritos no presente documento, por exemplo, alinhar duas sequências com o uso do BLAST, ALIGN ou outro algoritmo conhecido na técnica. O ácido nucleico de linhagem germina- tiva humana correspondente ou sequência de aminoácidos podem ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com o ácido nucleico de re- gião variável de referência ou sequência de aminoácidos.
[0079] O termo “valência”, conforme usado no presente documento, se refere ao número de sítios de ligação alvo potencial em um polipep-
tídeo. Cada sítio de ligação alvo se liga especificamente a uma molé- cula-alvo ou um sítio específico em uma molécula-alvo. Quando um po- lipeptídeo compreende mais de um sítio de ligação alvo, cada sítio de ligação alvo pode se ligar especificamente às mesmas ou moléculas di- ferentes (por exemplo, pode se ligar a diferentes moléculas, por exem- plo, antígenos diferentes ou diferentes epítopos na mesma molécula). Um anticorpo convencional, por exemplo, tem dois sítios de ligação e é bivalente; "trivalente" e "tetravalente" se refere à presença de três sítios de ligação e quatro sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de anticorpo. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser monovalentes (isto é, se ligam a uma molécula-alvo), bivalentes ou multivalentes (isto é, se ligam a mais do que uma molécula-alvo).
[0080] O sintagma “se liga especificamente” ou “especificidade de ligação” quando usado no contexto de descrever a interação entre um alvo (por exemplo, uma proteína) e uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, se refere a uma reação de ligação que determina a pre- sença do alvo em uma população heteróloga de proteínas e outros pro- dutos biológicos, por exemplo, em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de sangue, de soro ou de tecido. Desse modo, sob deter- minadas condições designadas, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo com uma especificidade de ligação particular se liga a um alvo particular pelo menos duas vezes o segundo plano e não se liga substancialmente em uma quantidade significativa a outros alvos pre- sentes na amostra. Em uma modalidade, sob condições designadas, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo com uma especifici- dade de ligação particular se liga a um antígeno particular pelo menos dez (10) vezes o segundo plano e não se liga substancialmente em uma quantidade significativamente a outros alvos presentes na amostra. A ligação específica a uma proteína enxertada com citocina de anticorpo sob tais condições pode exigir que uma proteína enxertada com citocina de anticorpo tenha sido selecionada devida à sua especificidade para uma proteína alvo particular. Conforme usado no presente documento, a ligação específica inclui proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo que se ligam seletivamente a receptor de baixa afinidade com IL2 humano e não incluem proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que reagem de maneira cruzada, por exemplo, outros membros de su- perfamília de receptor de citocina. Em algumas modalidades, são sele- cionadas as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que se li- gam seletivamente a receptor de baixa afinidade com IL2 humano e re- agem de maneira cruzada com IL2R de primata não humano (por exem- plo, IL2R de cinomolgo). Em algumas modalidades, as proteínas enxer- tadas com anticorpo são selecionadas que se ligam seletivamente ao receptor de baixa afinidade com IL2 humano e reagem com um alvo adicional. Uma variedade de formatos pode ser usada para selecionar proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que são reativos espe- cificamente com uma proteína-alvo particular. Por exemplo, imunoen- saios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína (consul- tar, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser usados para determinar a imunorreatividade específica). Tipicamente, uma reação de ligação específica ou seletiva produzirá um sinal pelo menos duas vezes em relação ao sinal em segundo plano e mais tipicamente pelo menos que 10 a 100 vezes em relação ao se- gundo plano.
[0081] O termo "constante de dissociação de equilíbrio (KD, M)" se re- fere à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividido pela cons- tante de taxa de associação (ka, temp-1, M-1). As constantes de dissociação em equilíbrio podem ser medidas com o uso de qualquer método conhe- cido na técnica. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo terão geralmente uma constante de dissociação de equilíbrio menor que cerca de 10-7 ou 10-8 M, por exemplo, menor que cerca de 10-9 M ou 10-10 M, em algumas modalidades, menor que cerca de 10-11 M, 10-12 M ou 10-13 M.
[0082] Conforme usado no presente documento, o termo “epítopo” ou “região de ligação” se refere a um domínio na proteína de antígeno que é responsável pela ligação específica entre os CDRs de anticorpo e a proteína de antígeno.
[0083] Conforme usado no presente documento, o termo “região de ligação receptor-citocina” se refere a um domínio a porção de citocina enxertada da proteína enxertada com citocina de anticorpo que é res- ponsável pela ligação específica entre a citocina enxertada e seu recep- tor (por exemplo, o receptor de baixa afinidade com IL2). Há pelo menos uma tal região de ligação receptor-citocina presente em cada proteína enxertada com citocina de anticorpo e cada uma dentre as regiões de ligação pode ser idêntica ou diferente entre si.
[0084] O termo “agonista” se refere de maneira intercambiável a um anticorpo com capacidade para ativar um receptor para induzir uma res- posta mediada por receptor completa ou parcial. Por exemplo, uma ago- nista do receptor de baixa afinidade com IL2 se liga ao receptor de baixa afinidade com IL2 e induz sinalização intracelular mediada por IL2, ativa- ção celular e/ou proliferação de células efetoras T CD8+ e células NK. A proteína enxertada com citocina de anticorpo agonista estimula a sinaliza- ção através do receptor de baixa afinidade com IL de maneira semelhante em alguns sentidos ao ligante de IL2 nativa. A ligação de IL2 ao receptor de baixa afinidade com IL2 induz a ativação de Jak1 e Jak2 que resulta em fosforilação de STAT5. Em algumas modalidades, uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo agonista pode ser identificada por sua capacidade para se ligar ao receptor de baixa afinidade com IL2 e induzir fosforilação de STAT5 e/ou proliferação de células efetoras T CD8+ e cé- lulas NK.
[0085] O termo “IL2” ou “interleucina 2” ou “interleucina-2” ou “IL-2”, de maneira intercambiável, se refere a um membro de família de citocina helicoidal alfa em que as funções de proteína nativas na regulação e manutenção de processos inflamatórios. Uma propriedade de IL2 é o fato de que as extremidades N e C estão próximas entre si no espaço, o que torna a proteína citocina de IL2 adequada para enxerto de anti- corpo. A IL2 que compreende os resíduos 21 a 153 de humano nativo de comprimento completo é utilizada no contexto das proteínas enxer- tadas com citocina de anticorpo agonistas. A IL2 humana, conforme re- velado no presente documento tem sobre seu comprimento completo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com o aminoácido SEQ ID NO:2 e retém a atividade de agonista preferencial das proteínas enxer- tadas com citocina de anticorpo conforme descrito no presente docu- mento e foram publicadas como n.º de registro GenBank: NP_000577. SEQ ID NO:1 é a sequência de cDNA de IL2 humana. O ácido nucleico de IL2 humana que codifica para a proteína IL2, conforme revelado no presente documento, tem sob seu comprimento completo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 e foi publicado sob o n.º de registro GenBank: NM_000586.
[0086] O termo “proteína enxertada com citocina de anticorpo” ou “enxerto de citocina de anticorpo” ou “enxertada” significa que pelo me- nos uma citocina é incorporada diretamente dentro de uma CDR do an- ticorpo, interrompendo a sequência da CDR. A citocina pode ser incor- porada dentro de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3. A citocina pode ser incorporada dentro de HCDR1, HCDR2, HCDR3,
LCDR1, LCDR2 ou LCDR3 e incorporada na sequência N-terminal da CDR ou na sequência C-terminal da CDR. A citocina incorporada dentro de uma CDR pode romper a ligação específica da porção de anticorpo à proteína-alvo original ou a proteína enxertada com citocina de anti- corpo pode reter sua ligação específica à sua proteína-alvo. As citocinas exemplificativas incluem, porém sem limitação; IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, e TNF-β. É possível, também, enxertar uma ci- tocina em uma CDR específica de um “braço” do anticorpo e enxertar outra citocina diferente em uma CDR do outro “braço” do anticorpo. Por exemplo, enxertar a IL2 na HCDR1 de um "braço” do anticorpo e enxer- tar IL-7 na LCDR1 do outro "braço" da proteína enxertada com citocina de anticorpo pode criar uma proteína enxertada com citocina de anti- corpo de função dupla.
[0087] O termo “isolado”, quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente livre de outros componentes celulares com o qual está associado no estado natural. Está, de preferência, em um estado homogêneo. Pode ser uma solução ou seca ou aquosa. A pureza e homogeneidade são determina- das tipicamente com o uso de técnicas químicas analíticas, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto de- sempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é purificada substancialmente. Em particular, um gene isolado é separado dos quadros abertos de leitura que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo “purificado” denota que um ácido nucleico ou proteína gera essencial- mente uma banda em um gel eletroforético. Particularmente, isso signi- fica que o ácido nucleico ou a proteína é pelo menos 85% puro, mais preferencialmente, pelo menos 95% puro e, com máxima preferência, pelo menos 99% puro.
[0088] O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” se refere a áci- dos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polí- meros dos mesmos em forma ou de dupla fita ou de fita única. Salvo quando limitado especificamente, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm proprie- dades de ligação semelhantes como o ácido nucleico referência e são metabolizados de maneira semelhante para nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo quando indicado de outro modo, uma sequência de áci- dos nucleicos específica também abrange implicitamente variantes con- servativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complemen- tares, assim como a sequência explicitamente indicada. De modo espe- cífico, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas ge- rando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou to- dos) códons selecionados é substituída com resíduos de desóxi-ionisina e/ou de base misturada (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5.081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2.605 a 2.608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 a 98 (1994)).
[0089] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polí- meros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural.
[0090] O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aque- les codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-car- boxiglutamato e O-fosfosserina. Os análogos de aminoácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura de base química que o amino- ácido de ocorrência natural, isto é, um α-carbono que é ligado a um hi- drogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exem- plo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil-sulfônio de metionina. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, nor- leucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um ami- noácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.
[0091] "Variantes conservativamente modificadas" se aplica às se- quências tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Com relação às sequências de ácidos nucleicos específicas, variantes conservativa- mente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, às sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. O perito na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina, e TGG, que é comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipep- tídeo está implícita em cada sequência descrita.
[0092] Quanto às sequências de aminoácidos, o versado na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na sequência codificada são uma "vari- ante conservativamente modificada" em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente simi- lar. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais a e não excluem varian- tes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos. Os oito grupos a seguir contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conserva- tivas uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (consultar, por exemplo, Creighton, pro- teínas (1984)).
[0093] A “porcentagem de identidade de sequência” é determinada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na ja- nela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacu- nas) em comparação com a sequência de referência (por exemplo, um po- lipeptídeo), que não compreende adições ou deleções, para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais o resíduo de ácido nucleico ou de ami- noácido idêntico ocorre em ambas as sequências para render o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições cor- respondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência.
[0094] Os termos “idêntico” ou “identidade” percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, re- ferem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mes- mas sequências. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais (isto é, pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência em uma região especificada, ou, quando não especificado, em toda a sequência de uma sequência de referência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação ou na região designada conforme medida com o uso de um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. A revelação fornece polipep- tídeos ou polinucleotídeos que são substancialmente idênticos aos polipep- tídeos ou polinucleotídeos, respectivamente, exemplificados no presente documento (por exemplo, as regiões variáveis exemplificadas em qualquer uma dentre SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:51 ou SEQ ID NO:67). A identidade existe em uma região que tem pelo menos cerca de 15, 25 ou 50 nucleotídeos de comprimento ou, com mais preferência, em uma região que tem 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos de compri- mento, ou ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. Com relação às sequências de aminoácidos, a identidade ou identidade substancial pode existir em uma região que tem pelo menos 5, 10, 15 ou
20 aminoácidos de comprimento, opcionalmente pelo menos cerca de 25, 30, 35, 40, 50, 75 ou 100 aminoácidos de comprimento, opcional- mente pelo menos cerca de 150, 200 ou 250 aminoácidos de compri- mento, ou ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. Com relação às sequências de aminoácidos mais curtas, por exemplo, sequências de aminoácidos de 20 ou menos aminoácidos, a identidade substancial existe quando um ou dois resíduos de aminoácido forem conservativamente substituídos, de acordo com as substituições con- servativas definidas no presente documento.
[0095] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computa- dor, são designadas coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados parâmetros do programa de algoritmo de sequências. Parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâme- tros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula o percentual de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.
[0096] Uma “janela de comparação”, conforme usado no presente documento, inclui referência a um segmento de qualquer uma dentre o número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo que consiste em 20 a 600, normalmente cerca de 50 a cerca de 200, mais normalmente, cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem idealmente alinhadas. Métodos de alinha- mento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970)
Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, por implementações computadorizadas desses algo- ritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Sof- tware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (consultar, por exem- plo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).
[0097] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para deter- minar o percentual de identidade de sequência e similaridade de se- quência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3.389 a 3.402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do Natio- nal Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve iden- tificar primeiramente pares de sequência de elevada pontuação (HSP) identificando palavras pequenas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T de li- mite de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo com- primento em uma sequência de banco de dados. T é denominado o limiar de pontuação da palavra de proximidade (Altschul et al., supra). Estas cor- respondências de palavra de proximidade iniciais atuam como sementes para a iniciação de buscas para se encontrar HSP mais longos contendo as mesmas. As correspondências de palavra se estendem em ambas as direções ao longo de cada sequência na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações acumulati- vas são calculadas com o uso, para sequências de nucleotídeos, dos pa- râmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos corres- pondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A ex- tensão das correspondências de palavra em cada direção é interrom- pida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai de uma quan- tidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumula- tiva fica a zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamen- tos de resíduos de pontuação negativa; ou é alcançada a extremidade de qualquer uma das sequências. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como pa- drões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um compri- mento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915) usa alinhamento (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas.
[0098] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.787). Uma me- dida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor proba- bilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos poderia ocorrer ao acaso. Por exemplo, um ácido nu- cleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for de menos do que cerca de 0,2, mais preferencialmente, de menos do que cerca de 0,01 e, com máxima preferência, de menos do que cerca de 0,001.
[0099] Uma indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico reage imunologicamente de modo cruzado com os anticorpos captados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Assim, tipicamente, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas pelas substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancial- mente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos se hi- bridizam uns aos outros sob condições estringentes, conforme descrito abaixo. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácidos nuclei- cos são substancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores po- dem ser usados para amplificar a sequência.
[00100] O termo “ligar”, quando usado no contexto de descrever como as regiões de ligação são conectadas em uma proteína enxertada com citocina de anticorpo desta invenção, abrange todos os significados possíveis para unir fisicamente as regiões. A multiplicidade de regiões de ligação é frequentemente unida por ligações químicas, tais como uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica ou uma li- gação dissulfeto) ou uma ligação não covalente, que pode ser uma liga- ção direta (isto é, sem um ligante entre as duas regiões de ligação) ou ligação indireta (isto é, com o auxílio de pelo menos uma molécula li- gante entre as duas ou mais regiões de ligação).
[00101] Os termos “sujeito”, “paciente”, e “indivíduo” se referem in- tercambiavelmente a um mamífero, por exemplo, um ser humano ou um mamífero primata não humano. O mamífero também pode ser um ma- mífero de laboratório, por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster. Em algumas modalidades, o mamífero pode ser um mamífero agrícola (por exemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camelídeo) ou mamífero doméstico (por exemplo, canino, felino).
[00102] Conforme usado no presente documento, os termos “tratar”,
“tratando” ou “tratamento” de qualquer doença ou distúrbio se referem, em uma modalidade, ao melhoramento da doença ou distúrbio (isto é, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Em outra modalidade, “tratar”, “tra- tando” ou “tratamento” se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um pa- râmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo pa- ciente. Em ainda outra modalidade, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” re- fere-se à modulação da doença ou distúrbio, fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (por exem- plo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em ainda uma ou- tra modalidade, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” se refere à prevenção ou retardamento do início ou do desenvolvimento ou da progressão de uma doença ou distúrbio.
[00103] O termo “quantidade terapeuticamente aceitável” ou “dose terapeuticamente eficaz” intercambiavelmente se refere a uma quanti- dade suficiente para desencadear o resultado desejado (isto é, uma re- dução na inflamação, inibição da dor, prevenção de inflamação, inibição ou prevenção de resposta inflamatória). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente aceitável não induz nem provoca efeitos secundários indesejáveis. Uma quantidade terapeuticamente aceitável pode ser determinada primeiro administrando-se uma baixa dose e, en- tão, aumentando de modo incremental essa dose até o efeito desejado ser atingido. Uma “dosagem profilaticamente eficaz” e uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo IL2 podem, respectivamente, prevenir o início dos sintomas da doença, ou resultar em uma diminuição na gravidade dos mesmos, incluindo sintomas associados a câncer e tratamento contra câncer.
[00104] O termo “coadministrar” se refere à presença simultânea de dois (ou mais) agentes ativos em um indivíduo. Os agentes ativos que são coadministrados podem ser simultânea ou sequencialmente libera- dos.
[00105] Conforme usado no presente documento, a frase “consistir essencialmente em” se refere aos gêneros ou espécies de agentes far- maceuticamente ativos incluídos em um método ou composição, bem como qualquer veículo inativo ou excipientes para o propósito preten- dido dos métodos ou composições. Em algumas modalidades, a frase “consistir essencialmente em” exclui expressamente a inclusão de um ou mais agentes ativos adicionais diferentes de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo IL2. Em algumas modalidades, a frase “con- sistir essencialmente em” exclui expressamente a inclusão de mais agentes ativos adicionais diferentes de uma proteína enxertada com ci- tocina de anticorpo IL2 e um segundo agente coadministrado.
[00106] Os termos “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plu- ral, a menos que o contexto claramente indique de outra forma.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00107] A Figura 1 é uma tabela que sumariza exemplificativamente as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo IL2 e suas atividades em células efetoras T CD8.
[00108] A Figura 2 mostra que IgG.IL2R67A.H1 tem um meia-vida maior que aquela de Proleukin®. IgG.IL2R67A.H1 tem uma meia-vida de 12 a 14 horas conforme mostrado no gráfico, enquanto Proleukin® tem um T1/2 de menos de 4 horas e não pode ser mostrado no gráfico.
[00109] As Figuras 3A a 3C demonstram que IgG.IL2R67A.H1 ex- pande células efetoras T CD8+ mais eficazmente e com menos toxici- dade que Proleukin® ou uma molécula de fusão IL2-Fc em camundon- gos C57BL/6 a uma dose equivalente de 100 µg, nos pontos no tempo do dia 4, dia 8 e dia 11.
[00110] As Figuras 3D a 3F demonstram que IgG.IL2R67A.H1 ex-
pande células efetoras T CD8+ mais eficazmente e com menos toxici- dade que Proleukin® ou uma molécula de fusão IL2-Fc em camundon- gos C57BL/6 a uma dose equivalente de 500 µg, nos pontos no tempo do dia 4, dia 8 e dia 11.
[00111] A Figura 4A mostra que IgG.IL2R67A.H1 expande seletiva- mente efetores T CD8 e é mais bem tolerado que Proleukin® em ca- mundongos NOD.
[00112] A Figura 4B mostra uma tabela que representa a atividade aumentada de IgG.IL2R67A.H1 e IgG.IL2F71A.H1 em efetores T CD8 em camundongos NOD.
[00113] A Figura 5 mostra um gráfico de uma eficácia de agente único de IgG.IL2R67A.H1 em um modelo de tumor CT26.
[00114] A Figura 6 apresenta os dados de IgG.IL2R67A.H1 como um agente único ou em combinação com um anticorpo em um modelo de camundongo de melanoma B16. O gráfico mostra que IgG.IL2R67A.H1 em combinação com TA99, um anticorpo anti-TRP1, é mais eficaz que TA99 sozinho, uma molécula de fusão IL2-Fc sozinha, TA99 mais uma fusão IL2-Fc. Sinergia foi vista com TA99 e IgG.IL2R67A.H1 nas doses de 100 e 500 µg.
[00115] A Figura 7 mostra um gráfico com valores que monitoram a atividade de pSTAT5 em um painel de células humanas que compara IgG.IL2R67A.H1 e IgG.IL2F71A.H1 com Proleukin®.
[00116] A Figura 8 mostra um gráfico de dados de ELISA mostrando que, quando IL2 é enxertada em CDRH1 de um anticorpo anti-RSV (IgG.IL2R67A.H1), a ligação a RSV é mantida. No entanto, a ligação a RSV é reduzida quando IL2 é enxertada em CDRL3 ou CDRH3. Quando IL2 é enxertada em uma cadeia principal de anticorpo diferente (Xolair), não há ligação a RSV. Proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que têm como alvo o receptor de baixa afinidade com IL2
[00117] No presente documento são fornecidos construtos de prote- ína que compreende uma molécula de IL2 enxertada na região determi- nante da complementaridade (CDR) de um anticorpo. As proteínas en- xertadas com citocina de anticorpo da presente revelação mostram pro- priedades adequadas para serem usadas em pacientes humanos, por exemplo, as mesmas retêm atividade imunoestimuladora semelhante àquela de IL2 humana recombinante ou nativa. Entretanto, os efeitos negativos são diminuídos. Por exemplo, há menos estimulação de célu- las Treg. Outras atividades e características também são demonstradas ao longo do relatório descritivo. Desse modo, são fornecidas proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que têm um perfil terapêutico apri- morado em relação a agentes terapêuticos de IL2 e de IL2 modificada anteriormente conhecidos, tais como Proleukin®, e métodos de uso das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo fornecidas em trata- mento contra câncer.
[00118] Consequentemente, a presente revelação fornece proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que são agonistas do receptor de baixa afinidade com IL2, com perfis de atividade seletiva. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo fornecidas que compreendem uma sequência de cadeias pesadas de imunoglobulina e uma sequên- cia de cadeia leve de imunoglobulina. Cada sequência de cadeias pe- sadas de imunoglobulina compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH), em que a região constante de cadeia pesada consiste em regiões constantes da CH1, CH2 e CH3. Cada sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região cons- tante de cadeia leve (CL). Em cada proteína enxertada com citocina de anticorpo, uma molécula de IL2 é incorporada em uma região determi- nante da complementaridade (CDR) da VH ou VL.
[00119] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com citocina de anticorpo compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorpo- rada na região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorpo- rada na região determinante da complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incor- porada na região determinante da complementaridade de cadeia pe- sada 3 (HCDR3).
[00120] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com citocina de anticorpo compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR de cadeia leve. Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 2 (LCDR2). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 3 (LCDR3).
[00121] Em algumas modalidades, o anticorpo citocina enxertado compreende uma sequência de IL2 incorporada em uma CDR, por meio do qual, a sequência de IL2 é inserida na sequência de CDR. A inserção pode estar na região N-terminal da CDR, ou próxima da mesma, na re- gião intermediária da CDR ou na região C-terminal, ou próxima da mesma, da CDR. Em outras modalidades, o anticorpo citocina enxer- tado compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR, por meio do qual, a sequência de IL2 não sofre deslocamento de quadro de leitura na sequência de CDR. Em outras modalidades, o anticorpo cito- cina enxertado compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR, por meio da qual a sequência de IL2 substitui a totalidade ou parte de uma sequência de CDR. Uma substituição pode ser a região N-ter- minal da CDR, na região intermediária da CDR ou na região C-terminal,
ou próxima da mesma, a CDR. Uma substituição pode ser baixa, como de um ou dois aminoácidos de uma sequência da CDR, ou de toda a sequência da CDR.
[00122] Em algumas modalidades, uma molécula de IL2 é enxertada diretamente em uma CDR sem um ligante de peptídeo, sem aminoáci- dos adicionais entre a sequência da CDR e a sequência de IL2.
[00123] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem cadeias pesadas de imunoglobulina de uma cadeia pesada de anticorpo de classe de IgG. Em determinadas modalidades, uma cadeia pesada IgG é qualquer uma dentre uma sub- classe de uma IgG1, uma IgG2 ou uma IgG4.
[00124] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve selecionadas a partir de uma sequência de imu- noglobulinas utilizada clinicamente conhecida. Em determinadas moda- lidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compreen- dem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que são sequências humanizadas. Em outras determinadas modalidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compreendem sequên- cias de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que são sequências humanas.
[00125] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve selecionadas a partir de sequências de imunoglo- bulinas de linhagem germinativa.
[00126] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que têm especificidade de ligação dos domínios vari- áveis de imunoglobulina para um alvo distinto da especificidade de ligação da molécula de IL2. Em algumas modalidades, a especificidade de ligação do domínio de imunoglobulina variável para o alvo da mesma é retida por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, na presença da citocina enxertada. Em determinadas modalidades, a especificidade de ligação retida é para um alvo não humano. Em de- terminadas modalidades, a especificidade de ligação retida para um ví- rus, por exemplo, RSV. Em outras modalidades, a especificidade de li- gação é para um alvo humano que tem utilidade terapêutica em combi- nação com uma terapia de IL2. Em determinadas modalidades, ter como alvo a especificidade de ligação da imunoglobulina transporta benefício terapêutico adicionalmente ao componente de IL2. Em determinadas modalidades, a especificidade de ligação da imunoglobulina ao seu alvo transporta atividade sinérgica com IL2.
[00127] Em ainda outras modalidades, a especificidade de ligação da imunoglobulina é reduzida por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, pelo enxerto da molécula de IL2.
[00128] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compre- endem uma molécula de IL2 enxertada em uma região determinante da complementaridade (CDR) da VH ou VL. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. Em algumas mo- dalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:4.
[00129] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compre- endem uma molécula de IL2 enxertada em uma região determinante da complementaridade (CDR) da VH ou VL. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6. Em algumas mo- dalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:6.
[00130] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com citocina de anticorpo confere propriedades pró-imunomoduladoras superiores à IL2 humana, IL2 humana recombinante, Proleukin® ou IL2 fundida a um Fc. A proteína enxertada com citocina de anticorpo confere atividade aumentada em células efetoras T CD8 enquanto fornece atividade de Treg reduzida em comparação com IL2 humana, IL2 humana recombi- nante, Proleukin® ou IL2 fundida a um Fc.
[00131] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem uma imunoglobulina IgG modificada que tem um Fc modificado que confere função efetora modificada. Em determinadas modalidades, a região Fc modificada compreende uma mutação selecionada a partir de um ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A. Em modalidades particulares, a cadeia pesada de imunoglobulina pode compreender uma mutação ou combi- nação de mutações que conferem função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.
[00132] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem (i) uma região variável de cadeia pesada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em rela- ção a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:19 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoá- cidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:35. A cadeia de imunoglobulina é uma classe de IgG selecio- nada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imu- noglobulina opcionalmente compreende uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.
[00133] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo compreendem (i) uma região variável de cadeia pe- sada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:51 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:67. A cadeia de imunoglo- bulina é uma classe de IgG selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imunoglobulina opcionalmente com- preende uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A. Proteínas Enxertadas com Citocina de Anticorpo Submetidas a Enge- nharia Genética e Modificadas
[00134] Em determinados aspectos, os construtos enxertados com citocina de anticorpo são gerados enxertando-se uma sequência de IL2 em uma região da CDR de um arcabouço de imunoglobulina. Ambas as cadeias de imunoglobulina de cadeia pesada e leve são produzidas para gerar proteínas enxertadas de anticorpo final. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo conferem atividade terapêutica preferencial em células efetoras T CD8, e as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo têm atividade de Treg reduzida em comparação com IL2 hu- mana nativa ou recombinante (rhIL2 ou Proleukin®) ou IL2 fundida a um Fc.
[00135] A fim de modificar geneticamente as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo, sequências de IL2 que contêm muteínas es- pecíficas (SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:6) são inseridas em um ciclo de CDR de uma proteína de arcabouço de cadeia de imunoglobulina. Os construtos enxertados podem ser preparados com o uso de uma varie- dade de sequências de imunoglobulinas conhecidas que foram utiliza- das em ambientes clínicos, sequências de imunoglobulinas conhecidas que estão em descoberta atual e/ou desenvolvimento clínico, sequên- cias de anticorpo de linhagem germinativa humana, assim como se- quências de cadeias de imunoglobulina de anticorpo inovador. Os cons- trutos são produzidos com o uso de metodologia de biologia molecular padrão que utiliza DNA recombinante que codifica sequências relevan- tes. As sequências de IL2 em um arcabouço exemplificativo, denomina- das GFTX3b, são retratadas na TABELA 2. Os pontos de inserção foram selecionados para serem o ponto intermediário do laço com base em dados de modelo de homologia ou estrutural disponível, no entanto, os pontos de inserção podem ser ajustados para a extremidade N ou C- terminal do laço de CDR.
[00136] Desse modo, a presente revelação fornece anticorpos ou fra- gmentos dos mesmos que se ligam especificamente ao receptor de IL2 de baixa afinidade que compreendem uma proteína IL2 inserida de ma- neira recombinante em uma proteína ou polipeptídeo de anticorpo hete- rólogo para gerar proteínas enxertadas. Em particular, a revelação for- nece proteínas enxertadas que compreendem um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno de um anticorpo descrito no presente do-
cumento ou qualquer outro polipeptídeo de anticorpo de arcabouço re- levante (por exemplo, uma proteína de imunoglobulina de anticorpo completo, um fragmento Fab, fragmento Fc, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, um domínio VH, uma CDR de VH, um domínio VL, uma CDR de VL etc.) e uma proteína citocina heteróloga, polipeptídeo, ou peptídeo, por exemplo, IL2. Métodos para fundir ou conjugar proteínas, polipeptí- deos ou peptídeos a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes nº U.S.
5.336.603. 5.622.929. 5.359.046. 5.349.053. 5.447.851 e 5.112.946; Patentes Europeias n.os EP 307.434 e EP 367.166; Publicações Inter- nacionais n.os WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Im- munol. 154:5590-5600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:11337- 11341. Adicionalmente, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser geradas através das técnicas de embaralha- mento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de éxon e/ou embaralhamento de códon (denominado coletivamente de "emba- ralhamento de DNA"). O embaralhamento de DNA pode ser empregue para preparar construtos de proteína enxertada e/ou para alterar as ati- vidades de anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, anti- corpos ou fragmentos dos mesmos com afinidades mais altas taxas de dissociação inferiores). Consultar, de modo geral, as Patentes nos U.S.
5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724 a 733; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76 a 82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265 a 276; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308 a 313. Anticor- pos ou seus fragmentos, ou os anticorpos codificados ou seus fragmen- tos, podem ser alterados ao serem submetidos a mutagênese aleatória por PCR propensa a erros, inserção aleatória de nucleotídeos ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma proteína de antígeno de interesse pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos etc. de uma ou mais moléculas de citocina heterólogas, por exemplo, IL2, para preparação de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo, conforme fornecido no presente documento.
[00137] Um anticorpo Fab contém seis laços de CDR, 3 na cadeia leve (CDRL1, CDRL2, CDRL3) e 3 na cadeia pesada (CDRH1, CDRH2, CDRH3) que podem servir como sítios de inserção potenciais para uma proteína citocina. As considerações estruturais e funcionais são consi- deradas a fim de determinar que o laço de CDR (ou laços de CDR) para inserir a citocina. Uma vez que o tamanho e conformação de laço de CDR variam consideravelmente em diferentes anticorpos, a CDR ideal para inserção pode ser determinada de maneira empírica para cada combinação particular de anticorpo/proteína. Adicionalmente, visto que uma proteína citocina será inserida em um laço de CDR, isso pode im- por limitações adicionais na estrutura da proteína citocina, conforme dis- cutido no Exemplo 1.
[00138] As CDRs de cadeias de imunoglobulina são determinadas por sistemas de numeração bem conhecidos na técnica, incluindo aque- les descritos no presente documento. Por exemplo, as CDRs foram identificadas e definidas (1) com o uso do sistema de numeração des- crito em Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest” 5.ª Edição. Public Health Service, Institutos Nacionais da Sa- úde, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat"), publicação NIH n.º 91 a 3.242; e (2) Chothia, consultar Al-Lazikani et al., (1997) "Stan- dard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", J.Mol.Biol. 273:927-948. Para sequências de aminoácidos de CDR iden- tificadas com comprimento menor que 20 aminoácidos, uma ou duas substituições de resíduo de aminoácido conservador podem ser tolera- das ao mesmo tempo que ainda retêm a ligação específica desejada e/ou atividade agonista.
[00139] Uma proteína enxertada com citocina de anticorpo pode ser preparada adicionalmente como uso de um anticorpo que tem uma ou mais dentre as sequências de CDRs e/ou VH e/ou VL mostradas no presente documento (por exemplo, TABELA 2) como material inicial para submeter à engenharia genética uma proteína modificada enxer- tada com citocina de anticorpo, que pode ter propriedades alteradas da proteína enxertada com anticorpo inicial. Alternativamente, quaisquer sequências de anticorpos conhecidas podem ser utilizadas como um arcabouço para submeter à engenharia genética proteína modificada enxertada com citocina de anticorpo. Por exemplo, qualquer anticorpo utilizado clinicamente conhecido pode ser utilizado como um arcabouço de materiais iniciais para preparação de proteína enxertada com anti- corpo. Os anticorpos conhecidos e sequências de imunoglobulinas cor- respondentes incluem, por exemplo, palivizumabe, alirocumabe, mepo- lizumabe, necitumumabe, nivolumabe, dinutuximabe, secuquinumabe, evolocumabe, blinatumomabe, pembrolizumabe, ramucirumabe, vedoli- zumabe, siltuximabe, obinutuzumabe, trastuzumabe, raxibacumabe, pertuzumabe, belimumabe, ipilimumabe, denosumabe, tocilizumabe, ofatumumabe, canaquinumabe, golimumabe, ustequinumabe, certolizu- mabe, catumaxomabe, eculizumabe, ranibizumabe, panitumumabe, na- talizumabe, bevacizumabe, cetuximabe, efalizumabe, omalizumabe, to- situmomabe, ibritumomabe, tiuxetano, adalimumabe, alentuzumabe, gentuzumabe, infliximabe, basiliximabe, daclizumabe, rituximabe, abci- ximabe, muromonabe ou modificações dos mesmos. Os anticorpos e sequências de imunoglobulinas conhecidos também incluem sequên- cias de anticorpo de linhagem germinativa. As sequências estruturantes podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA público ou refe- rências publicadas que incluem sequências gênicas de anticorpo de li- nhagem germinativa. Por exemplo, as sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco de dados de sequência de li- nhagens germinativas humanas "VBase" assim como em Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Uni- dos, Publicação NIH n.º 91 a 3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776 a 798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827 a 836. Em ainda outros exemplos, o anticorpo e sequências de imuno- globulinas correspondentes de outras entidades conhecidas que podem estar em descoberta precoce e/ou desenvolvimento de fármaco podem ser adaptados de modo semelhante como material inicial para submeter à engenharia genética uma proteína modificada enxertada com citocina de anticorpo.
[00140] Uma variedade ampla de estruturas ou arcabouços de anti- corpo/imunoglobulina pode ser empregue desde que o polipeptídeo re- sultante inclua pelo menos uma região de ligação que acomoda a incor- poração de uma citocina (por exemplo, IL2). Tais estruturas ou arcabou- ços incluem os 5 idiotipos principais de imunoglobulinas humanas ou fragmentos dos mesmos e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, de preferência, que têm aspectos humanizados e/ou humanos. Os anticorpos, estruturas, arcabouços e fragmentos inovadores conti- nuam a ser descobertos e desenvolvidos pelas pessoas versadas na técnica.
[00141] Os anticorpos podem ser gerados com o uso de métodos que são conhecidos na técnica. Para preparação de anticorpos monoclo- nais, qualquer técnica conhecida na técnica pode ser usada (consultar, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495 a 497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, páginas 77 a 96. Alan R. Liss, Inc. 1985). Técnicas para produção de anticorpos de cadeia única (patente no U.S.
4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para uso em proteínas enxertadas com citocina de anticorpo. Além disso, camundon- gos transgênicos ou outros organismos, tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar e identificar anticorpos primatizados ou humanizados ou humanos. Alternativamente, tecnologia de exibição de fago pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente a antígenos selecionados para uso em proteínas enxertadas com citocina de anticorpo (consultar, por exemplo, McCafferty et al., supra; Marks et al., Biotechnology, 10:779 a 783, (1992)).
[00142] Métodos para primatizar ou humanizar anticorpos não huma- nos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo primatizado ou humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo provenientes de uma fonte que é não primata ou não hu- mana. Tais resíduos de aminoácido não primatas ou não humanos são frequentemente denominados resíduos de importação, que são tipica- mente retirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e co- laboradores (consultar, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 a 327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1.534 a 1.536 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 a 596 (1992)), substituindo-se CDRs de roedores ou sequências de CDRs pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos qui- méricos (patente no U.S. 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos pri- matizados ou humanizados são tipicamente anticorpos primatas ou hu- manos nos quais alguns resíduos de região determinante de comple- mentaridade ("CDR") e possivelmente alguns resíduos estruturantes ("FR") são substituídos por resíduos de sítios análogos em uma espécie originária (por exemplo, anticorpos de roedor) para conferir especifici- dade de ligação.
[00143] Alternativa ou adicionalmente, um método in vivo para subs- tituir uma região variável de anticorpo não humano por uma região vari- ável humana em um anticorpo, enquanto se mantém as mesmas carac- terísticas ou fornece melhores características de ligação relacionadas àquelas do anticorpo não humano, pode ser utilizado para converter an- ticorpos não humanos em anticorpos humanos geneticamente modifica- dos. Consultar, por exemplo, a publicação de patente no U.S. 20050008625 e a publicação de patente no U.S. 2005/0255552. Alter- nativamente, bibliotecas de segmento V humano podem ser geradas por substituição sequencial de cassetes na qual apenas parte do seg- mento V do anticorpo de referência é inicialmente substituída por uma biblioteca de sequências humanas; e “cassetes” humanos identificados que suportam ligação no contexto de sequências de aminoácidos resi- duais do anticorpo de referência são, então, recombinados em uma se- gunda tela da biblioteca para gerar segmentos V completamente huma- nos (consultar, Publicação de Patente no U.S. 2006/0134098).
[00144] Vários anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para uso na preparação de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser produzidos por modificação enzimática ou química dos anti- corpos intactos, ou sintetizados de novo com o uso de metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou identificados com o uso de bibliotecas de exibição de fagos (consultar, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552 a 554, 1990). Por exemplo, minicorpos podem ser gerados com o uso dos métodos descritos na técnica, por exemplo, Vaughan e Sollazzo, Comb. Chem. High Throughput Screen 4:417 a 430 2001. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo enxertos de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Consultar, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315 a 321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1.547 a 1.553 (1992). Anticorpos de cadeia única podem ser iden- tificados com o uso de bibliotecas de exibição de fagos ou bibliotecas de exibição de ribossoma, bibliotecas embaralhadas de genes. Tais bi- bliotecas podem ser construídas a partir de fontes imunocompetentes sintéticas, semissintéticas ou nativas. As sequências de imunoglobuli- nas selecionadas podem, assim, ser utilizadas na preparação de cons- trutos de proteína enxertada com citocina de anticorpo conforme forne- cido no presente documento.
[00145] Os anticorpos, as moléculas de ligação ao antígeno ou as moléculas enxertadas com citocina de anticorpo de uso na presente re- velação incluem adicionalmente anticorpos biespecíficos. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial que tem dois pares de cadeias pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferen- tes. Outros fragmentos de ligação ao antígeno ou porções de anticorpo incluem scFv bivalente (diacorpo), anticorpos scFv biespecifícos em que a molécula de anticorpo reconhece dois epítopos diferentes, domínios de ligação única (dAbs) e minicorpos. As sequências de imunoglobuli- nas selecionadas podem, assim, ser utilizadas na preparação de cons- trutos de proteína enxertada com citocina de anticorpo conforme forne- cido no presente documento.
[00146] Os fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos, por exemplo, um fragmento Fab, scFv, podem ser usados como blocos de construção para construir proteínas enxertadas com citocina de anti-
corpo e podem, opcionalmente, incluir formatos multivalentes. Em algu- mas modalidades, tais moléculas multivalentes compreendem uma re- gião constante de um anticorpo (por exemplo, Fc).
[00147] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser modificadas geneticamente modificando-se um ou mais resíduos em uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL) de um anticorpo, por exemplo, em uma ou mais regiões CDR e tais sequências adapta- das de região de VH e/ou VL são utilizadas para enxertar citocina ou para a preparação de enxerto de citocina. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se situam nas seis regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de ami- noácidos dentro das CDRs são mais diversas entre os anticorpos indi- viduais do que as sequências fora das CDRs. As sequências de CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as proprieda- des de um anticorpo específico construindo-se vetores de expressão que incluem sequências de CDR de um anticorpo específico enxertado em sequências estruturantes de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (consultar, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323 a 327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522 a 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., EUA 86:10029-10033; Patente Nº U.S. 5,225,539 para Winter, e Patente Nº U.S. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 de Queen et al.). Em determinados casos, é be- néfico mutar resíduos nas regiões estruturantes para manter ou intensi- ficar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (consular, por exemplo, Patente nos U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).
[00148] Em alguns aspectos, a mutação de resíduos de aminoácido nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para, assim, me- lhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como “maturação de afinidade”, pode ser benéfica, por exemplo, para otimizar a ligação ao antígeno de um anticorpo em conjunto com o contexto da proteína enxertada com cito- cina. Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a mutação (ou mutações) e o efeito na liga- ção ao anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme descrito no presente documento e/ou ensaios alternativos ou adicionais conhecidos na téc- nica. Modificações conservativas podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resí- duos dentro de uma região de CDR são alterados.
[00149] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo modificados geneti- camente incluem aqueles nos quais modificações foram feitas aos resí- duos estruturantes em VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as pro- priedades do anticorpo. Em algumas modalidades, tais modificações es- truturantes são realizadas para diminuir a imunogenicidade do anti- corpo. Por exemplo, uma abordagem é alterar um ou mais resíduos es- truturantes para a sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos estruturantes que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências de framework de anticorpo com as sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é deri- vado. Para devolver as sequências de região de framework à sua con- figuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem sofrer "mutação reversa" para a sequência de linha germinativa, por exemplo,
por mutagênese sítio-dirigida. A modificação estruturante adicional en- volve mutar um ou mais resíduos na região estruturante, ou até em uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T para, assim, reduzir a potencial imunogenicidade do anticorpo. Essa abordagem é também denominada "desimunização" e é descrita em maior detalhe na Publicação de Patente Nº U.S. 20030153043 de Carr et al.
[00150] Regiões constantes dos anticorpos ou fragmentos de anti- corpo utilizados para a preparação da proteína enxertada com citocina de anticorpo podem ser de qualquer tipo ou subtipo, conforme adequado e podem ser selecionados a partir das espécies do sujeito a ser tratado pelos presentes métodos (por exemplo, ser humano, primata não hu- mano ou outro mamífero, por exemplo, mamífero agrícola (por exemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camelídeo), mamífero doméstico (por exemplo, canino, felino) ou roedor (por exemplo, rato, camundongo, hamster, coelho). Em algumas modalidades, os anticorpos utilizados em proteínas enxertadas com citocina de anticorpo são submetidos à enge- nharia genética para gerar anticorpos humanizados ou Humaneered® . Em algumas modalidades, os anticorpos utilizados em proteínas enxer- tadas com citocina de anticorpo são anticorpos humanos. Em algumas modalidades, o isótipo de região constante de anticorpo é a IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Em determinadas modalidades, o isó- tipo de região constante é IgG1. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compreendem uma IgG. Em algu- mas modalidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compreendem um Fc de IgG1. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo compreendem um Fc de IgG2.
[00151] Adicional ou alternativamente às modificações feitas dentro da estrutura ou das regiões CDR, os anticorpos ou fragmentos de anti- corpo utilizados na preparação de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser submetidos à engenharia genética para incluir mo- dificações dentro de uma região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como, por exemplo, meia- vida sérica, fixação de complemento, ligação ao receptor Fc e/ou citoto- xicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo, fra- gmento de anticorpo do mesmo ou proteína enxertada com citocina de anticorpo pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou ser modifi- cado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais da proteína enxertada com anticorpo-citocina.
[00152] Em uma modalidade, uma região de articulação de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Por exemplo, por meio da abordagem que é adicionalmente descrita na pa- tente no U.S. 5.677.425 de Bodmer et al., em que o número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumen- tar ou diminuir a estabilidade da proteína enxertada com citocina de an- ticorpo. Em uma outra modalidade, uma região de articulação Fc de um anticorpo é mutada para alterar a meia-vida biológica da proteína enxer- tada com citocina de anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mu- tações de aminoácidos são introduzidas na região de interface de domí- nio CH2-CH3 do fragmento da articulação Fc de modo que a proteína enxertada com citocina de anticorpo prejudique a ligação da proteína A Staphylococcyl (SpA) em relação à ligação de SpA ao domínio de arti- culação Fc nativo. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na patente no U.S. 6,165,745, de Ward et al.
[00153] A presente revelação fornece proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo que se ligam especificamente ao receptor de baixa afinidade com IL2 que tem uma meia-vida prolongada in vivo. Em uma outra modalidade, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é modificada para aumentar sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que têm um aumento na meia-vida in vivo também podem ser geradas introdu- zindo-se uma ou mais modificações de aminoácido (isto é, substitui- ções, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fra- gmento de ligação FcRn das mesmas (de preferência, um fragmento de domínio Fc ou de Fc de articulação). Por exemplo, podem ser introduzi- das uma ou mais das seguintes mutações: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente Nº U.S. 6,277,375 de Ward. Consultar, por exemplo, a Publicação Internacional n.º WO 98/23289; a Publicação Internacional n.º WO 97/34631; e a Patente no US 6.277.375. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, a proteína enxertada com citocina de anticorpo é alterada na região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de resgate retirado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito na patente n os U.S. 5.869.046 e 6.121.022 de Presta et al. Em ainda outras modalida- des, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as fun- ções efetoras da proteína enxertada com citocina de anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resí- duo de aminoácido diferente de modo que a proteína enxertada com citocina de anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efe- tor, mas retenha a capacidade para se ligar ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor no qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc (FcR) ou o componente C1 de complemento. Essa abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes nos US
5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.
[00154] Em uma outra modalidade, um ou mais aminoácidos seleci- onados a partir de resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que a proteína enxertada com citocina de anticorpo tenha ligação a C1q e/ou citotoxicidade de- pendente de complemento (CDC) reduzido ou abolido alteradas. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na Patente no U.S. 6.194.551 de Idusogie et al.
[00155] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo que con- têm tais mutações medeiam a citotoxicidade celular dependente de an- ticorpo (ADCC) reduzida ou inexistente ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em algumas modalidades, os resíduos de amino- ácidos L234 e L235 da região constante IgG1 são substituídos por Ala234 e Ala235. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido N267 da região constante IgG1 é substituído por Ala267.
[00156] Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoá- cido são alterados para, assim, alterar a capacidade da proteína enxer- tada com citocina de anticorpo de se fixar ao complemento. Essa abor- dagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
[00157] Em ainda uma outra modalidade, uma região Fc é modifi- cada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar citotoxici- dade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade da proteína enxertada com citocina de anticorpo para um re- ceptor Fcγ modificando-se um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para FcγRl, FcγRII, FcγRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada fo- ram descritas (consultar Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).
[00158] Em ainda uma outra modalidade, a glicosilação de uma pro- teína enxertada com citocina de anticorpo é modificada. Por exemplo, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo aglicosilada pode ser produzida (isto é, a proteína enxertada com citocina de anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para au- mentar a afinidade do anticorpo para “antígeno”. Tais modificações de carboidrato podem ser alcançadas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser efetuadas uma ou mais substituições de aminoáci- dos que resultem na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de arcabouço de região variável para assim eliminar a glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para an- tígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes Nº U.S. 5,714,350 e 6,350,861 de Co et al.
[00159] Adicional ou alternativamente, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo pode ser produzida tendo um tipo alterado de gli- cosilação, tal como uma proteína enxertada com citocina de anticorpo hipofucosilada que tem quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo que tem estruturas GlcNac de bissecção aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a capa- cidade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser alcançadas, por exemplo, expressando-se a proteína enxertada com citocina de an- ticorpo em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alte- rado. Células com maquinário de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressar proteínas enxertadas com citocina de anticorpo recombinan- tes para, assim, produzir uma proteína enxertada com citocina de anti- corpo com glicosilação alterada. Por exemplo, o documento n.º EP
1.176.195 de Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene funcionalmente interrompido FUT8, que codifica uma fucosil transferase, de modo que proteínas enxertadas com citocina de anticorpo expressas em tal linhagem celular exibem hipofucosilação. A publicação PCT WO
03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular de CHO variante, cé- lulas Lecl3, com capacidade reduzida para atacar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosilação de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo expressas na célula hospedeira (consultar também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26.733 a
26.740). A publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. descreve linha- gens celulares geneticamente modificadas para expressar glicosil transfe- rases modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglu- cosaminiltransferase III (GnTIII)) de modo que as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo expressas nas linhagens celulares genetica- mente modificadas exibam aumento de estruturas GlcNac de bissecção, o que resulta no aumento de atividade de ADCC dos anticorpos (con- sultar também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176 a 180).
[00160] Em algumas modalidades, um ou mais domínios, ou regiões, de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo são conectadas por meio de um ligante, por exemplo, um ligante de peptídeo, tal como aqueles que são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6.444 a 6.448; Poljak, RJ., et al. (1994) Structure 2:1121 a 1123). Um ligante de peptí- deo pode variar no comprimento, por exemplo, um ligante pode ter 1 a 100 aminoácidos de comprimento, tipicamente um ligante tem de cinco a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00161] Em algumas modalidades, IL2 é enxertada na sequência da CDR opcionalmente com uma ou mais sequências de ligante de peptí- deo. Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes de peptídeo são independentemente selecionados a partir de uma sequência de (Glyn-Ser)m (SEQ ID NO: 71), uma sequência de (Glyn-Ala)m (SEQ ID
NO: 72), ou qualquer combinação de uma sequência (Glyn-Ser)m/(Glyn- Ala)m (SEQ ID NOS: 71 a 72), em que cada n é independentemente um número inteiro de 1 a 5 e cada m é independentemente um número in- teiro de 0 a 10. Os exemplos de ligantes incluem, porém sem limitação, ligantes à base de glicina ou ligantes de gly/ser G/S, tais como (GmS)n, em que n é um número inteiro positivo igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 e m é um número inteiro positivo igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 (SEQ ID NO: 73). Em determinadas modalidades, um ou mais ligan- tes incluem repetições de G4S (SEQ ID NO: 74), por exemplo, o ligante de Gly-Ser (G4S)n em que n é um número inteiro positivo maior ou igual a 1 (SEQ ID NO: 74). Por exemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 e n=6, n=7, n=8, n=9 e n=10. Em algumas modalidades, Ser pode ser substituído por Ala, por exemplo, ligantes G/A, tais como (GmA)n em que n é um número inteiro positivo igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, e m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 (SEQ ID NO: 75). Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes incluem repetições de G4A (SEQ ID NO: 76), (G4A)n em que n é um número inteiro positivo maior ou igual a 1 (SEQ ID NO: 76). Por exemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 e n=6, n=7, n=8, n=9 e n=10. Em algumas modalidades, o ligante inclui múltiplas repetições de ligantes. Em outras modalidades, um li- gante inclui combinações e múltiplos de G4S (SEQ ID NO: 74) e G4A (SEQ ID NO: 76).
[00162] Outros exemplos de ligantes incluem aqueles baseados em sequências de ligante flexível que ocorrem naturalmente em anticorpos para minimizar a imunogenicidade surgindo de ligantes e junções. Por exemplo, há uma ligação flexível natural entre o domínio variável e um domínio constante CH1 na estrutura molecular de anticorpo. Essa liga- ção natural compreende aproximadamente 10 a 12 resíduos de amino- ácidos, contribuídos por 4 a 6 resíduos da extremidade C do domínio V e 4 a 6 resíduos da extremidade N do domínio CH1. As proteínas en- xertadas com citocina de anticorpo podem, por exemplo, empregar li- gantes que incorporam 5 a 6 resíduos de aminoácido terminais ou 11 a 12 resíduos de aminoácido de CH1 como um ligante. Os resíduos N- terminais do domínio CH1, particularmente os primeiros 5 a 6 resíduos de aminoácido, adotam uma conformação de laço sem estrutura secun- dária forte e, portanto, podem atuar como um ligante flexível. Os resí- duos N-terminais do domínio CH1 são uma extensão natural dos domí- nios variáveis, na medida em que os mesmos são parte das sequências de Ig e, portanto, minimizam a uma grande extensão qualquer imuno- genicidade surgindo, potencialmente, dos ligantes e junções. Em algu- mas modalidades, uma sequência de ligante inclui uma sequência de peptídeos modificada com base em uma sequência de articulação.
[00163] Além disso, as proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo podem incluir sequências marcadoras, tais como um peptídeo, para facilitar a purificação de proteínas enxertadas com citocina de an- ticorpo. Em modalidades preferenciais, uma sequência de aminoácidos marcadores é um peptídeo de hexa-histidina (SEQ ID NO: 78), tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Ave- nue, Chatsworth, CA, 91311), entre outras, muitas das quais se encon- tram comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:821 a 824, por exemplo, a hexa-histidina (SEQ ID NO: 78) fornece a purificação conveniente da proteína enxer- tada. Outras etiquetas de peptídeos úteis para purificação incluem, mas não se limitam a, etiqueta hemaglutinina (“HA”), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), e a etiqueta “flag”.
[00164] Anticorpos podem também ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do an- tígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não se limitam a, vidro,
celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, policloreto de vinila ou po- lipropileno. Ensaios para atividade de proteína enxertada com citocina de anti- corpo
[00165] Os ensaios para identificar proteínas enxertadas com cito- cina de anticorpo são conhecidos na técnica e descritos no presente documento. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo agonis- tas se ligam ao receptor de baixa afinidade com IL2 e promovem, indu- zem, estimulam sinalização intracelular, resultando em proliferação de células efetoras T CD8 assim como outros efeitos imunoestimuladores.
[00166] A ligação das proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo ao receptor de baixa afinidade de IL2 pode ser determinada com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a ligação ao receptor de baixa afinidade de IL2 pode ser determinada com o uso de técnicas conhecidas, incluindo, sem limitação, ELISA, Western blots, ressonância plasmônica de superfície (SPR) (por exemplo, BIAcore) e citometria de fluxo.
[00167] A sinalização intracelular através do receptor de baixa afini- dade de IL2 pode ser medida com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a ativação do receptor de baixa afinidade com IL2 por IL2 promove ativação e sinalização de STAT5. Os métodos para medir a ativação de STAT5 são padrão na técnica (por exemplo, situa- ção da fosforilação da proteína STAT5, ensaios de gene-repórter, en- saios de sinalização a jusante etc.). A ativação através do receptor de baixa afinidade com IL2 expande células efetoras T CD8, de modo que os números absolutos de células efetoras T CD8 possam ser avaliados para a razão entre células efetoras T CD8 e Tregs. Os métodos para medir a proliferação de células são padrão na técnica (por exemplo, en- saios de incorporação de 3H-timidina, identificação de CFSE). Os méto- dos para medir a produção de citocina são bem conhecidos na técnica
(por exemplo, ensaios ELISA, ensaios ELISpot). Na realização de en- saios in vitro, as células de teste ou sobrenadante de cultura das células de teste que entraram em contato com proteínas enxertadas com cito- cina de anticorpo podem ser comparadas a células de controle ou so- brenadantes de cultura de células de controle que não entraram em con- tato com uma proteína enxertada com citocina de anticorpo e/ou aque- les que entraram em contato com IL2 humana recombinante (por exem- plo Proleukin®) ou uma molécula de fusão IL2-Fc.
[00168] A atividade das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo pode também ser medida ex vivo e/ou in vivo. Em alguns aspectos, métodos para medir a ativação de STAT5 através de vários tipos de célula ex vivo de animais tratados com proteínas enxertadas com citocina de anticorpo em comparação a animais de controle não tratados e/ou animais similar- mente tratados com Proleukin® podem ser usados para mostrar a ativi- dade diferencial das proteínas enxertadas com anticorpo agonistas atra- vés dos tipos de célula. As proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo agonistas preferenciais têm a capacidade de ativar e expandir cé- lulas efetoras T CD8. Por exemplo, a ativação e expansão in vivo de células efetoras T CD8 podem ser medidas com o uso de qualquer mé- todo conhecido na técnica, por exemplo, por citometria de fluxo. As pro- teínas enxertadas com citocina de anticorpo agonistas preferenciais po- dem ser terapeuticamente úteis para prevenção, redução, alívio ou tra- tamento de câncer, por exemplo: melanoma, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de mama e linfoma. A eficácia das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo pode ser determinada administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína enxertada com citocina de anticorpo a um sujeito e comparando o su- jeito antes e após a administração da proteína enxertada com citocina de anticorpo. A eficácia das proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo também pode ser determinada administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína enxertada com citocina de an- ticorpo a um sujeito de teste e comparando o sujeito de teste a um su- jeito de controle que não recebeu o anticorpo e/ou comparação a um sujeito similarmente tratado com Proleukin®. Polinucleotídeos que Codificam Proteínas Enxertadas com Cito- cina de Anticorpo
[00169] Em outro aspecto, ácidos nucleicos isolados que codificam pro- teínas de cadeia pesada e leve das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo são fornecidos. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser produzidas por quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, expressão recombinante, síntese química e digestão enzimática de tetrâmeros de anticorpo. A expressão recombinante pode ser de quaisquer células hospedeiras adequadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras de bactérias, células hospedeiras de leveduras, células hospedeiras de in- setos, etc.
[00170] São fornecidos no presente documento polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis exemplificadas em qualquer uma dentre SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:68.
[00171] A revelação fornece, assim, polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de cadeia leve e/ou pesada das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo descritos no presente documento, por exemplo, polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pe- sada ou segmentos que compreendem as regiões determinantes da complementaridade conforme descrito no presente documento. Em al- gumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinu- cleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO:20 e na SEQ ID NO:52. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que co- difica as regiões variáveis de cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nuclei- cos com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO:36 e na SEQ ID NO:68.
[00172] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 22. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 38.
[00173] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 54. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo selecionado dentre a SEQ ID NO: 70.
[00174] Os polinucleotídeos podem codificar apenas a sequência de região variável de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo. Os mesmos podem também codificar tanto uma região variável quanto uma região constante da proteína enxertada com citocina de anticorpo. Algumas das sequências de polinucleotídeos codificam um polipeptídeo que compreende regiões variáveis tanto da cadeia pesada quanto da cadeia leve de uma das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo.
Alguns outros polinucleotídeos codificam dois segmentos de polipeptí- deos que, respectivamente, são substancialmente idênticos às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de uma das proteínas en- xertadas com citocina de anticorpo.
[00175] Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos ou áci- dos nucleicos compreendem DNA. Em outras modalidades, os polinu- cleotídeos ou ácidos nucleicos compreendem RNA, que pode ser de fita simples ou fita dupla.
[00176] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi- nante que compreende os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais cadeias de proteína de imunoglobulina de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, e opcionalmente sinais de secreção são fornecidos. Em determinadas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreende um vetor que codifica uma cadeia de proteína de imuno- globulina e sinais de secreção. Em outras certas modalidades, uma cé- lula hospedeira recombinante compreende um ou mais vetores que co- dificam duas cadeias de proteína de imunoglobulina da proteína enxer- tada com citocina de anticorpo e sinais de secreção. Em algumas mo- dalidades, uma célula hospedeira recombinante compreende um único vetor que codifica duas cadeias de proteína de imunoglobulina da pro- teína enxertada com citocina de anticorpo e sinais de secreção. Em al- gumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compreende dois vetores, um codificando uma cadeia de proteína de imunoglobulina de cadeia pesada e outro codificando uma cadeia de proteína de imu- noglobulina de cadeia leve da proteína enxertada com citocina de anti- corpo, com cada um incluindo sinais de secreção. Uma célula hospe- deira recombinante pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma linhagem celular eu- cariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma linha- gem celular de mamífero. Em algumas modalidades, a linhagem celular hospedeira é uma linhagem celular de CHO para produção de anticor- pos.
[00177] São adicionalmente fornecidos métodos para produzir as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo. Em algumas modalida- des, o método compreende as etapas de (i) cultivar uma célula hospe- deira que compreende um ou mais vetores que codificam as cadeias de proteína de imunoglobulina de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo sob condições adequadas para expressão, formação e secre- ção da proteína enxertada com citocina de anticorpo e (ii) recuperar a proteína enxertada com citocina de anticorpo.
[00178] As sequências de polinucleotídeo podem ser produzidas pela síntese de DNA de fase sólida de novo ou por mutagênese de PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências conforme descritas no presente documento) que codifica uma cadeia de polipeptídeo de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica, tais como o método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Patente Nº U.S. 4,458,066. A introdução de mutações em uma sequência de polinucleotídeos por PCR pode ser realizada conforme descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Ampli- fication, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Proto- cols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
[00179] São também fornecidos na revelação vetores de expressão e células hospedeiras para produzir as proteínas enxertadas com cito- cina de anticorpo descritas acima. Vários vetores de expressão podem ser empregues para expressar polinucleotídeos que codificam as ca- deias de polipeptídeo de imunoglobulina, ou fragmentos, das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo. Vetores de expressão não virais ou com base viral podem ser usados para produzir as proteínas de imu- noglobulina em uma célula hospedeira de mamífero. Os sistemas e ve- tores não virais incluem plasmídeos, vetores epissômicos, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA e cromossomos artificiais humanos (consultar, por exemplo, Harrington et al., Nat. Genet. 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos de proteína enxer- tada com citocina de anticorpo em células de mamíferos (por exemplo, seres humanos) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores MPSV e inúmeros outros vetores conhecidos na técnica para expressar outras proteínas. Os ve- tores virais úteis incluem vetores com base em retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, herpes vírus, vetores com base em SV40, pa- pilomavírus, vírus Epstein Barr HBP, vetores de vírus da vaccínia e vírus da floresta de Semliki (SFV). Consultar Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
[00180] A escolha do vetor de expressão depende das células hos- pedeiras pretendidas nas quais o vetor deve ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências re- guladoras (por exemplo, intensificadores) que são ligadas de maneira funcional aos polinucleotídeos que codificam uma proteína de imuno- globulina da proteína enxertada com citocina de anticorpo. Em algumas modalidades, um promotor induzível é empregue para evitar a expres- são de sequências inseridas exceto sob condições indutoras. Os pro- motores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. As culturas de orga-
nismos transformados podem ser expandidas sob condições não indu- toras sem enviesar a população a codificar as sequências cujos produ- tos de expressão são mais bem tolerados pelas células hospedeiras. Além de promotores, outros elementos reguladores podem também ser exigidos ou desejados para expressão eficiente de uma cadeia de imuno- globulina ou fragmento das proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo. Esses elementos incluem tipicamente um códon de iniciação de ATG e sítio de ligação a ribossomo adjacente ou outras sequências. Adi- cionalmente, a eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores apropriados para o sistema de célula em uso (consul- tar, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o intensifica- dor de SV40 ou intensificador de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.
[00181] Os vetores de expressão podem também fornecer uma po- sição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo que foi exportada para fora da célula e para dentro do meio de cultura. Em determinados aspectos, as se- quências de imunoglobulinas inseridas das proteínas enxertadas com citocina de anticorpo são ligadas a uma sequência de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem usados para receber sequências que codificam domínios variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglo- bulina também codificam, por vezes, regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas enxertadas com as regiões constantes levando, assim, à produção de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo intactas ou fragmentos das mesmas. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.
[00182] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de proteína enxertada com citocina de anticorpo podem ser ou proca- rióticas ou eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente revelação. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis e outras enterobacteriaceae, tais como Salmo- nella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, podem também ser produzidos vetores de expressão, que contêm tipicamente sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Adi- cionalmente, qualquer número dentre uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema promotor de lac- tose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promoto- res controlam tipicamente a expressão, opcionalmente com uma se- quência operadora, e têm sequências de sítio de ligação a ribossomo e similares, para iniciar e concluir a transcrição e a tradução. Outros mi- cróbios, tais como levedura, podem também ser empregues para ex- pressar polipeptídeos de proteína enxertada com citocina de anticorpo. Células de inseto em combinação com vetores de baculovírus podem também ser usadas.
[00183] Em algumas modalidades preferenciais, células hospedeiras de mamífero são usadas para expressar e produzir os polipeptídeos de proteína enxertada com citocina de anticorpo. Por exemplo, as mesmas podem ser uma linhagem celular de mamífero que contém um vetor de expressão exógeno. As mesmas incluem qualquer célula humana ou animal mortal normal ou imortal anormal ou normal. Por exemplo, foram desenvolvidas várias linhagens de células hospedeiras adequadas com a capacidade de secretar imunoglobulinas intatas, incluindo as linha- gens de células CHO, várias linhagens de células Cos, células HeLa, linhagens de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas.
O uso de cultura celular de tecido de mamífero para expressar polipep- tídeos é discutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências de con- trole de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (consultar, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 a 68, 1986) e sítios de informações de processamento necessários, tais como sítios de ligação a ribossoma, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais. Esses veto- res de expressão usualmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, específicos para tipo de célula, específicos para estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Os promotores úteis incluem, porém sem limitação, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal de ade- novírus constitutivo, o promotor de MMTV induzível por dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP polIII, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraciclina (tal como o promotor de CMV precoce imediato humano), o promotor de CMV cons- titutivo e combinações de promotor-intensificador conhecidas na téc- nica.
[00184] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tra- tamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares (consultar, de modo geral, Sambrook et al., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, trata- mento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, in- jeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomas, imunoliposso- mas, conjugados de policátion:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais,
enxerto à proteína estrutural do herpes vírus VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), absorção de DNA intensificada por agente e transdução ex vivo. Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recom- binantes, a expressão estável será frequentemente desejada. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam estavelmente cadeias de proteína enxertada com citocina de anticorpo imunoglobulina podem ser preparadas com o uso de vetores de expressão que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas proliferar por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios se- letivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à sele- ção, e sua presença permite a proliferação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas com o uso de técnicas de cultura de tecido adequadas para o tipo de célula. Composições que compreendem proteínas enxertadas com cito- cina de anticorpo
[00185] São fornecidas composições farmacêuticas que compreen- dem uma proteína enxertada com citocina de anticorpo formulada junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, as com- posições farmacêuticas contêm adicionalmente outros agentes terapêu- ticos que são adequados para tratar ou prevenir um determinado distúr- bio. Veículos farmaceuticamente aceitáveis intensificam ou estabilizam a composição ou facilitam a preparação da composição. Veículos far- maceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, re- vestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes que sejam fisiologica- mente compatíveis.
[00186] Uma composição farmacêutica da presente divulgação pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
Rota e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados de- sejados. É preferencial que a administração seja por administração paren- teral (por exemplo, selecionada a partir de qualquer via dentre intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intra-arterial ou subcutânea) ou administrada proximal ao sítio do alvo. Um veículo farmaceuticamente aceitável é adequado para administração por qualquer uma ou mais dentre administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intra- arterial, subcutânea, intranasal, por inalação, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção). Dependendo da via de administração, o composto ativo, por exemplo, proteína enxertada com citocina de anticorpo, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é for- mulada para administração subcutânea.
[00187] Uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, sozinha ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser feita em formulações aerossóis (isto é, as mesmas podem ser "nebulizadas") para serem administradas por meio da inalação. As formulações aeros- sóis podem ser colocadas em propelentes aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e similares.
[00188] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é estéril e fluida. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio, na composição. A absorção a longo prazo das composições injetáveis pode ser provocada incluindo-se na composição um agente que atrasa a ab-
sorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina. Em deter- minadas modalidades, as composições podem ser preparadas para ar- mazenamento em uma forma liofilizada com o uso de excipientes apro- priados (por exemplo, sacarose).
[00189] As composições farmacêuticas podem ser preparadas em conformidade com os métodos bem conhecidos e normalmente praticados na técnica. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular que é administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequente- mente, há uma ampla variedade de formulações adequadas de composi- ções farmacêuticas. Os métodos aplicáveis para formular uma proteína enxertada com citocina de anticorpo e determinar a dosagem e crono- grama apropriados podem ser encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.ª Edição, University of the Sci- ences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005); e em Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., e em Martindale, Martindale: The Extra Pharma- copoeia, 31.ª Edição, 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, editor, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. As composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz de uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo é empregue nas composições farma- cêuticas. Uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é formulada em forma de dosagem farmaceuticamente aceitável por métodos con- vencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada (por exem- plo, uma resposta terapêutica). Na determinação de uma dose terapêu- tica ou profilaticamente eficaz, uma dose baixa pode ser administrada e então incrementalmente aumentada até uma resposta desejada ser al- cançada com pouco ou nenhum efeito colateral indesejado. Por exem- plo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas po- dem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporci- onalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma unitária de dosagem para facilidade de adminis- tração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, como usado aqui, se relaciona com unidades fisicamente discretas adequa- das como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo cal- culada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.
[00190] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas com- posições farmacêuticas podem ser variados de modo a obter uma quan- tidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta tera- pêutica desejada para um paciente, composição e modo de administra- ção particulares sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos, in- cluindo a atividade das composições particulares empregues, ou seu éster, sal ou amida, a via de administração, o momento de administra- ção, a taxa de excreção do composto particular sendo empregue, a du- ração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, afecção, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado e fatores similares. Artigos de Fabricação/Kits
[00191] Em alguns aspectos, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é fornecida em um artigo de fabricação (isto é, um kit). Uma proteína enxertada com citocina de anticorpo fornecida está geralmente em um frasco ou um recipiente.
Assim, um artigo de fabricação compre- ende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associada ao recipiente.
Os recipientes adequados incluem, por exemplo, uma garrafa, frasco, seringa, bolsa de solução etc.
Conforme apropriado, a proteína enxer- tada com citocina de anticorpo pode estar em forma líquida ou seca (por exemplo, liofilizada). O recipiente retém uma composição que, por si só ou combinada com outra composição, é eficaz para preparar uma com- posição para tratar, prevenir e/ou melhorar câncer.
O rótulo ou bula in- dica que a composição é usada para tratar, prevenir e/ou melhorar cân- cer.
Os artigos de fabricação (kits) que compreendem uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente docu- mento, contêm opcionalmente um ou mais agentes adicionais.
Em algu- mas modalidades, um artigo de fabricação (kit) contém proteína enxer- tada com citocina de anticorpo e um diluente farmaceuticamente acei- tável.
Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é fornecida em um artigo de fabricação (kit) com um ou mais agentes ativos adicionais na mesma formulação (por exemplo, como misturas). Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é fornecida em um artigo de fabricação (kit) com um segundo ou terceiro agente em formulações separadas (por exemplo, em recipientes separados). Em determinadas modalidades, um artigo de fabricação (kit) contém alíquotas da proteína enxertada com citocina de anticorpo em que a alíquota fornece uma ou mais do- ses.
Em algumas modalidades, alíquotas para múltiplas administrações são fornecidas, em que as doses são uniformes ou variadas.
Em moda- lidades particulares, os regimes de dosagem variados são crescentes ou decrescentes, conforme apropriado.
Em algumas modalidades, as dosagens de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo e um segundo agente são independentemente uniformes ou independente- mente variadas.
Em certas modalidades, um artigo de manufatura (kit)
compreende um agente adicional, tal como um agente anticâncer ou molécula de ponto de verificação imunológico. A seleção de um ou mais agentes adicionais dependerá da dosagem, entrega e condição da do- ença a ser tratada. Métodos de tratamento e uso das composições para tratamento de câncer Afecções Submetidas ao Tratamento ou Prevenção
[00192] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo encon- tram uso no tratamento, melhora ou profilaxia de câncer. Em um as- pecto, a revelação fornece métodos de tratamento de câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína en- xertada com citocina de anticorpo, conforme descrito no presente docu- mento. Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é fornecida para uso como um agente terapêutico no trata- mento ou profilaxia de câncer em um indivíduo. Em um aspecto adicio- nal, a revelação fornece uma composição que compreende tal proteína enxertada com citocina de anticorpo para uso no tratamento ou melhora de câncer em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[00193] As afecções submetidas a tratamento incluem várias indica- ções de câncer. Para propósitos terapêuticos, um indivíduo foi diagnos- ticado com câncer. Para propósitos preventivos ou profiláticos, um indi- víduo pode estar em remissão de câncer ou pode antecipar um início futuro. Em algumas modalidades, o paciente tem câncer, está sob sus- peita de ter câncer ou está em remissão do câncer. Os cânceres sub- metidos a tratamento com uma proteína enxertada com citocina de an- ticorpo usualmente derivam benefício da ativação de sinalização de re- ceptor de baixa afinidade com IL2, conforme descrito no presente docu- mento. As indicações de câncer submetidas a tratamento incluem, sem limitação: melanoma, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de mama e linfoma. Administração de proteínas enxertadas com citocina de anticorpo
[00194] Um médico ou veterinário pode começar com doses de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo empregue na composição farmacêutica a níveis menores do que aqueles exigidos para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser alcançado. Em geral, as doses eficazes das compo- sições variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo a do- ença ou afecção específica a ser tratada, meios de administração, sítio- alvo, estado fisiológico do paciente, se um paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento exigem tipicamente titulação para otimizar a segurança e a eficácia. Para a administração com uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, a dosagem está na faixa de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. A dosagem pode ser diária, semanal, quinzenal, men- sal ou mais ou menos frequentemente, conforme necessário ou dese- jado. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses.
[00195] A proteína enxertada com citocina de anticorpo pode ser ad- ministrada em doses únicas ou divididas. Uma proteína enxertada com citocina de anticorpo é usualmente administrada em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as dosagens únicas podem ser semanais, quinze- nais, mensais ou anuais, conforme necessário ou desejado. Os interva- los podem também ser irregulares conforme indicado medindo-se os ní- veis sanguíneos de proteína enxertada com citocina de anticorpo no pa- ciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de proteína enxertada com citocina de anticorpo plasmá- tica de 1 a 1.000 µg/ml e em alguns métodos 25 a 300 µg/ml. Alternati- vamente, a proteína enxertada com citocina de anticorpo pode ser ad- ministrada como uma formulação com liberação sustentada, em tal caso, uma administração menos frequente é exigida. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida da proteína enxertada com citocina de anticorpo no paciente. Em geral, proteínas enxertadas com anticorpo mostram meia-vida mais longa do que esta da IL2 nativa ou citocinas recombinantes, tais como Proleukin®. A dosagem e a frequên- cia de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em geral, para aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativa- mente infrequentes por um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam recebendo tratamento pela duração de suas vidas. Em geral, para aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em in- tervalos de tempo relativamente curtos é por vezes necessária até a progressão da doença ser reduzida ou eliminada e de preferência até o paciente mostrar melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, a um paciente pode ser administrado um regime profi- lático. Coadministração com um segundo agente
[00196] O termo "terapia de combinação" refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma afecção ou distúrbio te- rapêutico descrito na presente revelação. Tal administração engloba a co- administração desses agentes terapêuticos de um modo substancialmente simultâneo, tal como em uma cápsula única tendo uma razão fixa de ingre- dientes ativos. Alternativamente, tal administração engloba a coadministra- ção em recipientes múltiplos ou separados (por exemplo, cápsulas, pós e líquidos) para cada ingrediente ativo. Pós e/ou líquidos podem ser reconsti- tuídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Além disso, tal administração engloba também uso de cada tipo de agente terapêutico de um modo sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em diferentes momentos. Em qualquer um dos casos, o re- gime de tratamento proporcionará efeitos benéficos da combinação de fármacos no tratamento das condições ou distúrbios descritos aqui.
[00197] A terapia de combinação pode fornecer "sinergia" e se mos- tra "sinérgica", isto é, o efeito alcançado quando os ingredientes ativos usados em conjunto são maiores do que a soma dos efeitos que resulta do uso dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e admi- nistrados ou entregues simultaneamente em uma formulação de dosa- gem unitária combinada; (2) entregues por alternação ou em paralelo como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando entregue na terapia de alternação, um efeito sinérgico pode ser alcan- çado quando os compostos são administrados ou entregues sequenci- almente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, en- quanto na terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas em conjunto.
[00198] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método de tratar câncer por administração a um sujeito que precisa do mesmo de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo em combinação com um ou mais inibidores da tirosina quinase, incluindo, porém sem limita- ção, inibidores de EGFR, inibidores de Her2, inibidores de Her3, inibi- dores de IGFR e inibidores de Met.
[00199] Por exemplo, os inibidores de tirosina quinase incluem, porém sem limitação, cloridrato de Erlotinib (Tarceva®); Linifanib (N-[4-(3-amino-1H- indazol-4-il)fenil]-N'-(2-fluoro-5-metilfenil)ureia, também conhecido como ABT 869, disponível junto à Genentech); malato de Sunitinib (Sutent®); Bosutinib
(4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metoxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1- il)propoxi]quinolina-3-carbonitrila, também conhecido como SKI-606 e descrito na Patente no US 6,780,996); Dasatinib (Sprycel®); Pazopanib (Votrient®); Sorafenib (Nexavar®); Zactima (ZD6474); nilotinib (Ta- signa®); Regorafenib (Stivarga®) e Imatinib ou mesilato de Imatinib (Gil- vec® e Gleevec®).
[00200] Os inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) incluem, porém sem limitação, cloridrato de Erlotinib (Tar- ceva®), Gefitnib (Iressa®); N-[4-[(3-Cloro-4-fluorofenil)amino]-7- [[(3''S'')-tetra-hidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-bute- namida, Tovok®); Vandetanib (Caprelsa®); Lapatinib (Tykerb®); (3R,4R)-4-Amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin- 5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); dicloridrato de Canertinib (CI- 1033); 6-[4-[(4-Etil-1-piperazinil)metil]fenil]-N-[(1R)-1-feniletil]- 7H-Pir- rolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (AEE788, CAS 497839-62-0); Mubritinib (TAK165); Pelitinib (EKB569); Afatinib (BIBW2992); Neratinib (HKI-272); ácido N-[4-[[1-[(3-Fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-il]amino]-5-metilpir- rolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-carbâmico, éster (3S)-3-morfolinilmetílico (BMS599626); N-(3,4-Dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aα,5β,6aα)- octa-hidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); e 4-[4-[[(1R)-1-Feniletil]amino]-7H-pir- rolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol (PKI166, CAS 187724-61-4).
[00201] Os anticorpos EGFR incluem, porém sem limitação, Cetuxi- mab (Erbitux®); Panitumumab (Vectibix®); Matuzumab (EMD-72000); Nimotuzumab (hR3); Zalutumumab; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); e ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1).
[00202] Os Inibidores do Receptor do Fator de Crescimento Epidér- mico 2 (receptor HER2) (também conhecido como Neu, ErbB-2, CD340 ou p185) incluem, porém sem limitação, Trastuzumab (Herceptin®); Pertuzu- mab (Omnitarg®); Neratinib (HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4-[(piridin-2-
il)metoxi]fenil]amino]-3-ciano-7-etoxiquinolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2- enamida e descritos na Publicação PCT N.º WO 05/028443); Lapatinib ou ditosilato de Lapatinib (Tykerb®); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxife- nil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); (2E)-N-[4-[(3-Cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3S)-tetra-hi- dro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamida (BIBW- 2992, CAS 850140-72-6); ácido N-[4-[[1-[(3-Fluorofenil)metil]-1H-in- dazol-5-il]amino]-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-carbâmico, éster (3S)-3-morfolinilmetílico (BMS 599626, CAS 714971-09-2); dicloridrato de Canertinib (PD183805 ou CI-1033); e N-(3,4-Dicloro-2-fluorofenil)-6- metoxi-7-[[(3aα,5β,6aα)-octa-hidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]me- toxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8).
[00203] Os inibidores de HER3 incluem, porém sem limitação, LJM716, MM-121, AMG-888, RG7116, REGN-1400, AV-203, MP-RM- 1, MM-111 e MEHD-7945A.
[00204] Os inibidores de MET incluem, porém sem limitação, Cabo- zantinib (XL184, CAS 849217-68-1); Foretinib (GSK1363089, anterior- mente XL880, CAS 849217-64-7); Tivantinib (ARQ197, CAS 1000873- 98-2); 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-N-(5-(7-metoxiquinolin-4-iloxi)piridin-2- il)-5-metil-3-oxo-2-fenil-2,3-di-hidro-1H-pirazol-4-carboxamida (AMG 458); Cryzotinib (Xalkori®, PF-02341066); (3Z)-5-(2,3-Di-hidro-1H-in- dol-1-ilsulfonil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pir- rol-2-il}metileno)-1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona (SU11271); (3Z)-N-(3-Clo- rofenil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol-2- il}metileno)-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida (SU11274); (3Z)-N-(3- Clorofenil)-3-{[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil)-1H-pirrol-2-il]meti- leno}-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida (SU11606); 6-[Difluoro[6-(1- metil-1H-pirazol-4-il)-1,2,4-triazolo[4,3-b]piridazin-3-il]metil]-quinolina (JNJ38877605, CAS 943540-75-8); 2-[4-[1-(Quinolin-6-ilmetil)-1H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]pirazin-6-il]-1H-pirazol-1-il]etanol (PF04217903,
CAS 956905-27-4); N-((2R)-1,4-Dioxan-2-ilmetil)-N-metil-N'-[3-(1-metil- 1H-pirazol-4-il)-5-oxo-5H-benzo[4,5]ciclo-hepta[1,2-b]piridin-7-il]sulfa- mida (MK2461, CAS 917879-39-1); 6-[[6-(1-Metil-1H-pirazol-4-il)-1,2,4- triazolo[4,3-b]piridazin-3-il]tio]-quinolina (SGX523, CAS 1022150-57-7); e (3Z)-5-[[(2,6-Diclorofenil)metil]sulfonil]-3-[[3,5-dimetil-4-[[(2R)-2-(1-pir- rolidinilmetil)-1-pirrolidinil]carbonil]-1H-pirrol-2-il]metileno]-1,3-di-hidro- 2H-indol-2-ona (PHA665752, CAS 477575-56-7).
[00205] Inibidores de IGF1R incluem, mas não se limitam a, BMS- 754807, XL-228, OSI-906, GSK0904529A, A-928605, AXL1717, KW- 2450, MK0646, AMG479, IMCA12, MEDI-573 e BI836845. Ver, por exemplo, Yee, JNCI, 104; 975 (2012) para análise.
[00206] Em outro aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar câncer administrando a um indivíduo que precisa do mesmo uma proteína enxertada com citocina de anticorpo em combinação com um ou mais inibidores de via de sinalização a jusante de FGF, incluindo, porém sem limitação, inibidores de MEK, inibidores de Braf, inibidores de PI3K/Akt, inibidores de SHP2 e também inibidores de mTor.
[00207] Por exemplo, inibidores da proteína quinase ativada por mi- togênio (MEK) incluem, porém sem limitação, XL-518 (também conhe- cido como GDC-0973, Cas n.o 1029872-29-4, disponível junto à ACC Corp.); 2-[(2-Cloro-4-iodofenil)amino]-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro- benzamida (também conhecida como CI-1040 ou PD184352 e descrita na Publicação PCT n.o WO2000035436); N-[(2R)-2,3-di-hidroxipropoxi]- 3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodofenil)amino]- benzamida (também conhe- cida como PD0325901 e descrita na Publicação PCT n.o WO2002006213); 2,3-Bis[amino[(2-aminofenil)tio]metileno]-butanodini- trila (também conhecida como U0126 e descrita na Patente no U.S.
2.779.780); N-[3,4-Difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodofenil)amino]-6-metoxife- nil]-1-[(2R)-2,3-di-hidroxipropil]-ciclopropanossulfonamida (também co- nhecida como RDEA119 ou BAY869766 e descrita na Publicação PCT n.o WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(etilamino)-8,9,16-tri- hidroxi-3,4-dimetil-3,4,9, 19-tetra-hidro-1H-2-benzoxaciclotetradecina- 1,7(8H)-diona] (também conhecida como E6201 e descrita na Publica- ção PCT n.o WO2003076424); 2’-Amino-3’-metoxiflavona (também co- nhecida como PD98059 disponível junto à Biaffin GmbH & Co., KG, Ale- manha); Vemurafenib (PLX-4032, CAS 918504-65-1); (R)-3-(2,3-di-hi- droxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-iodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pi- rimidina-4,7(3H,8H)-diona (TAK-733, CAS 1035555-63-5);
[00208] Pimasertib (AS-703026, CAS 1204531-26-9); e dimetil sul- fóxido de Trametinib (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80).
[00209] Os inibidores de fosfoinositida 3-quinase (PI3K) incluem, po- rém sem limitação, 4-[2-(1H-Indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazin-1- il]metil]tieno[3,2-d]pirimidin-4-il]morfolina (também conhecida como GDC 0941 e descrita nas Publicações PCT n.o WO 09/036082 e WO 09/055730); 2-Metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-di-hidroimi- dazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil]propionitrila (também conhecida como BEZ 235 ou NVP-BEZ 235, e descrita na Publicação PCT n.o WO 06/122806); 4-(trifluorometil)-5-(2,6-dimorfolinopirimidin-4-il)piridin-2- amina (também conhecida como BKM120 ou NVP-BKM120, e descrita na Publicação PCT n.o WO2007/084786); Tozasertib (VX680 ou MK- 0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-Piridinil)-6-quinolinil]metileno]- 2,4-tiazolidinadiona (GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(Acetiloxi)-1-[(di-2-propenilamino)meti- leno]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-octa-hidro-11-hidroxi-4-(metoximetil)-4a,6a-di- metil-ciclopenta[5,6]nafto[1,2-c]piran-2,7,10(1H)-triona (PX866, CAS 502632-66-8); e 8-Fenil-2-(morfolin-4-il)-cromen-4-ona (LY294002, CAS 154447-36-6).
[00210] Os inibidores de mTor incluem, porém sem limitação, Temsi- rolimus (Torisel®); Ridaforolimus (formalmente conhecido como defero- limus, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2
[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)- 1,18-di-hidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil- 2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9] hexatria- conta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclo-hexila, também co- nhecido como AP23573 e MK8669, e descrito na Publicação PCT n.o WO 03/064383); Everolimus (Afinitor® ou RAD001); Rapamicina (AY22989, Sirolimus®); Simapimod (CAS 164301-51-3); (5-{2,4- Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)me- tanol (AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclo-hexil]-6-(6- metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); e N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil- 4H-1-benzopiran-2-il)morfolínio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-α-as- partilL-serina-("L-arginilglicil-L-α-aspartilL-serina-" revelada como SEQ ID NO: 77), sal interno (SF1126, CAS 936487-67-1).
[00211] Ainda em outro aspecto, a presente relação fornece um mé- todo de tratar câncer por administração a um sujeito que precisa do mesmo de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo em com- binação com um ou mais pró-apoptóticos, incluindo, porém sem limita- ção, inibidores de IAP, inibidores de Bcl2, inibidores de MCl1, agentes de Trail, inibidores de Chk.
[00212] Por exemplo, inibidores de IAP, incluem, mas não se limitam a, NVP-LCL161, GDC-0917, AEG-35156, AT406 e TL32711. Outros exemplos de inibidores de IAP incluem, porém sem limitação, aqueles revelados nos documentos n.os WO04/005284, WO 04/007529, WO05/097791, WO 05/069894, WO 05/069888, WO 05/094818, US2006/0014700, US2006/0025347, WO 06/069063, WO 06/010118, WO 06/017295 e WO08/134679.
[00213] Os inibidores de BCL-2 incluem, porém sem limitação, 4-[4- [[2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclo-hexen-1-il]metil]-1-piperazinil]-N-[[4-
[[(1R)-3-(4-morfolinil)-1-[(feniltio)metil]propil]amino]-3-[(trifluorome- til)sulfonil]fenil]sulfonil]benzamida (também conhecida como ABT-263 e descrita na Publicação PCT n.o WO 09/155386); Tetrocarcin A; Antimi- cina; Gossipol ((-)BL-193); Obatoclax; Etil-2-amino-6-ciclopentil-4-(1-ci- ano-2-etoxi-2-oxoetil)-4Hcromona-3-carboxilato (HA14 – 1); Oblimersen (G3139, Genasense®); peptídeo Bak BH3; (-)-Gossipol ácido acético (AT-101); 4-[4-[(4'-cloro[1,1'-bifenil]-2-il)metil]-1-piperazinil]-N-[[4-[[(1R)- 3-(dimetilamino)-1-[(feniltio)metil]propil]amino]-3-nitrofenil]sulfonil]-ben- zamida (ABT-737, CAS 852808-04-9); e Navitoclax (ABT-263, CAS 923564-51-6).
[00214] Agonistas de receptor proapoptóticos (PARAs), incluindo DR4 (TRAILR1) e DR5 (TRAILR2), incluindo, porém sem limitação, Du- lanermin (AMG-951, RhApo2L/TRAIL); Mapatumumab (HRS-ETR1, CAS 658052-09-6); Lexatumumab (HGS-ETR2, CAS 845816-02-6); Apomab (Apomab®); Conatumumab (AMG655, CAS 896731-82-1); e Tigatuzumab (CS1008, CAS 946415-34-5, comercializado pela Daiichi Sankyo).
[00215] Inibidores de quinase de ponto de verificação (CHK) incluem, porém sem limitação, 7-Hidroxistaurosporina (UCN-01); 6-Bromo-3-(1- metil-1H-pirazol-4-il)-5-(3R)-3-piperidinil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7- amina (SCH900776, CAS 891494-63-6); ácido 5-(3-Fluorofenil)-3-urei- dotiofeno-2-carboxílico N-[(S)-piperidin-3-il]amida (AZD7762, CAS 860352-01-8); 4-[((3S)-1-Azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)amino]-3-(1H-benzi- midazol-2-il)-6-cloroquinolin-2(1H)-ona (CHIR 124, CAS 405168-58-3); 7-aminodactinomicina (7-AAD), Isogranulatimida, debromo-himenialdi- sina; N-[5-Bromo-4-metil-2-[(2S)-2-morfolinilmetoxi]-fenil]-N'-(5-metil-2- pirazinil)ureia (LY2603618, CAS 911222-45-2); Sulforafano (CAS 4478- 93-7, isotiocianato de 4-Metilsulfinilbutilo); 9,10,11,12-Tetraidro- 9,12- epoxi-1H-di-indolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pirrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocina- 1,3(2H)-diona (SB-218078, CAS 135897-06-2); e TAT-S216A (Sha et al., Mol. Cancer. Ther 2007; 6(1):147 a 153) e CBP501.
[00216] E um aspecto, a presente revelação fornece um método para tratar câncer administrando a um indivíduo que precisa do mesmo uma proteína enxertada com citocina de anticorpo em combinação com um ou mais inibidores de FGFR. Por exemplo, os inibidores de FGFR in- cluem, porém sem limitação, alaninato de Brivanib (BMS-582664, (S)- ((R)-1-(4-(4-Fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]tri- azin-6-iloxi)propan-2-il)2-aminopropanoato); Vargatef (BIBF1120, CAS 928326-83-4); ácido diláctico de Dovitinib (TKI258, CAS 852433-84-2); 3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenila- mino]-pirimidin-4-il}-1-metil-ureia (BGJ398, CAS 872511-34-7); Danu- sertib (PHA-739358); e (PD173074, CAS 219580-11-7). Em um aspecto específico, a presente revelação fornece um método para tratar câncer administrando a um indivíduo que precisa do mesmo um conjugado de anticorpo e fármaco em combinação com um inibidor de FGFR2, tal como 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-(6((4-(4-etilpiperazin-1-il)fe- nil)amino)pirimidin-4-il)-1-metilureia (também conhecida como BGJ- 398); ou 4-amino-5-fluoro-3-(5-(4-metilpiperazin1-il)-1H-benzo[d]imi- dazol-2-il)quinolin-2(1H)-ona (também conhecido como dovitinib ou TKI- 258). AZD4547 (Gavine et al., 2012, Cancer Research 72, 2.045 a
2.056, N-[5-[2-(3,5-Dimetoxifenil)etil]-2H-pirazol-3-il]-4-(3R,5S)-dieme- tilpiperazin-1-il)benzamida), Ponatinib (AP24534; Gozgit et al., 2012, Mol Cancer Ther., 11; 690 a 699; 3-[2-(imidazo[1,2-b]piridazin-3-il)etinil]- 4-metil-N-{4-[(4-metilpiperazin-1-il)metil]-3-(trifluorometil)fenil}benza- mida, CAS 943319-70-8).
[00217] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser também administradas em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico. Em uma modalidade, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser administradas em combinação com um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imunológico escolhida a partir de um ou mais dentre PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR. Em uma modalidade, o inibidor de ponto de ve- rificação imunológico é um anticorpo anti-PD-1, em que o anticorpo anti- PD-1 é escolhido dentre Nivolumab, Pembrolizumab ou Pidilizumab. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-1 é Nivolumab. Nomes alternativos para Nivolumab incluem MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538 ou BMS-936558. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-1 é Nivolumab (número de registro CAS: 946414-94-4). Nivolumab é um anticorpo monoclonal IgG4 totalmente humano que bloqueia es- pecificamente PD-1. Nivolumab (clone 5C4) e outros anticorpos mono- clonais humanos que se ligam especificamente a PD1 são revelados nos documentos nos US 8.008.449 e WO2006/121168.
[00218] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Pembro- lizumab. Pembrolizumab (também denominado Lambrolizumab, MK- 3475, MK03475, SCH-900475 ou KEYTRUDA®; Merck) é um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado que se liga a PD-1. Pembrolizumab e ou- tros anticorpos anti-PD-1 humanizados são revelados em Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134 a 144, US
8.354.509 e WO2009/114335.
[00219] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Pidilizu- mab. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclonal IgG1k humanizado que se liga a PD1. Pidilizumab e outros anticorpos monoclonais anti-PD-1 humanizados são revelados em WO2009/101611.
[00220] Outros anticorpos anti-PD1 incluem AMP 514 (Amplimmune) e, por exemplo, anticorpos anti-PD1 revelados nos documentos US
8.609.089, US 2010/028330 e/ou US 2012/0114649 e US2016/0108123.
[00221] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com ci- tocina de anticorpo podem ser administradas com o anticorpo anti-Tim3 revelado no documento US2015/0218274. Em outras modalidades, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem ser administra- das com o anticorpo anti-PD-L1 revelado no documento US2016/0108123, Durvalumab® (MEDI4736), Atezolizumab® (MPDL3280A) ou Avelumab®.
EXEMPLOS Exemplo 1: Criação de proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo IL2
[00222] As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo foram ge- radas modificando-se uma sequência de IL2 em regiões CDR de vários arcabouços de imunoglobulina, em seguida, cadeias de imunoglobulina tanto leve quanto pesada foram usadas para gerar as proteínas de cito- cina de anticorpo finais. As proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo conferem propriedades terapêuticas preferenciais de IL2; no en- tanto, as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo reduziram efei- tos indesejados, tais como atividade de célula Treg aumentada, em comparação a rhIL2.
[00223] A fim de criar proteínas enxertadas com citocina de anticorpo, sequências de IL2 que contêm muteínas (SEQ ID NO:4 ou 6) foram inse- ridas em laços de CDR de um arcabouço de cadeia de imunoglobulina. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo foram preparadas com o uso de uma variedade de sequências de imunoglobulinas conhecidas que foram utilizadas em ambientes clínicos assim como sequências de anti- corpo de linhagem germinativa. As sequências de IL2 em um arcabouço exemplificativo, denominadas GFTX3b, são retratadas na TABELA 2. Os pontos de inserção foram selecionados como o ponto intermediário do laço com base nos dados de modelo estruturais ou de homologia disponíveis. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo foram produzidas com o uso de metodologia de biologia molecular padrão que utiliza DNA re- combinante que codifica as sequências relevantes.
[00224] A seleção de qual CDR é escolhida para enxerto de citocina foi baseada nos parâmetros de: a biologia exigida, propriedades biofísi- cas e um perfil de desenvolvimento favorável. O software de modelagem foi útil apenas parcialmente em prever qual CDR e qual localização den- tro da CDR fornecerá os parâmetros desejados, portanto, todos os seis possíveis enxertos de citocina foram feitos e em seguida avaliados em ensaios biológicos. Caso a atividade biológica exigida seja obtida, então as propriedades biofísicas, tais como resolução estrutural quanto a como a molécula enxertada com citocina de anticorpo interage com o respectivo receptor de citocina são solucionadas.
[00225] Para as moléculas enxertadas com citocina de anticorpo IL2, a estrutura do candidato anticorpo considerado para enxerto de citocina foi inicialmente solucionada. A partir dessa estrutura, verificou-se que o paratopo estava na extremidade N mais distante do "braço" do anticorpo e que uma citocina enxertada nessa localização apresentaria a citocina ao seu respectivo receptor. Devido à tecnologia de enxerto, cada prote- ína enxertada com anticorpo IL2 é limitada por um laço de CDR de dife- rentes comprimentos, sequência e ambientes estruturais. Desse modo, IL2 foi enxertada em todas as seis CDRs, correspondentes a LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3 e HCDR-1, HCDR-2 e HCDR-3. A partir da tabela na Figura 1, fica evidente que as proteínas enxertadas com citocina de an- ticorpo são diferentes em suas atividades, incluindo que IL2 enxertada na cadeia leve de CDR2 (IgG.IL2.L2) não expressou. Observou-se, tam- bém, que os enxertos de citocina IL2 no anticorpo com função Fc alte- rada (por exemplo, Fc silencioso) teve um melhor perfil.
[00226] HCDR-1 foi escolhida devido ao fato de que teve a melhor combinação de propriedades (biofísica e biológica) e as mutações de ponto de IL2 que foram incluídas intensificaram as propriedades bioló- gicas desejadas. Para a seleção do ponto de inserção, o centro estrutu- ral do laço de CDR foi escolhido uma vez que forneceria o maior espaço em qualquer um dos lados (de tamanho linear 3,8 Å x o número de re- síduos) e sem ser ligado por qualquer uma teoria, isso forneceu uma molécula estável ao permitir que a IL2 enovele mais prontamente inde- pendentemente. Uma vez que a estrutura do arcabouço de enxerto GFTX3b já era conhecida, o centro estrutural de cada CDR também era conhecido. Isso coincidiu com o centro da sequência laços de CDR, conforme definido com o uso do formato de numeração Chothia. Con- forme mencionado anteriormente, o ponto de inserção dos enxertos de IL-2 comutou para longe do centro e em direção ou à porção de N ou C terminal do laço de CDR. No entanto, a comutação da IL2 dentro do laço de CDR não fez uma diferença significativa na atividade biológica.
[00227] Em resumo, ponto de inserção em cada CDR foi escolhido em uma base estrutural, com a hipótese de que o enxerto na CDR for- nece algum número de impedimento estérico às subunidades individu- ais do receptor IL2. A seleção final para determinar qual enxerto de CDR era melhor para uma citocina particular se baseou na biologia desejada e propriedades biofísicas. A natureza do receptor de citocina, as intera- ções citocina/receptor e o mecanismo de sinalização também exerceu uma função e isso foi feito comparando-se cada molécula de citocina de anticorpo individual para suas respectivas propriedades. TABELA 1 SEQ ID DNA do tipo selva- AGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAG- NO:1 gem de IL2 TAACCTCAACTCCTGCCACAATGTACA-
GGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTG CACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTA- CAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAG- CATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAA TTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATG- CTCACATTTAAGTTTTACATG- CCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGT CTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGC- TAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTT- CACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAAC GTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACA- TTCATGTGTGAATATGCTGATGAGA- CAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTA CCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA- TAATTAAGTGCTTCCCACTTAAAACA- TATCAGGCCTTCTATTTATTTAAATATTTAAATTTTAT ATTTATTGTTGAATGTATGGTTTGCTACCTATTG- TAACTATTATTCTTAATCTTAAAACTA- TAAATATGGATCTTTTATGATTCTTTTTGTAAGCCCT AGGGGCTCTAAAATGGTTTCACTTATTTATCCCAAA- ATATTTATTATTATGTTGAATGTTAA- ATATAGTATCTATGTAGATTGGTTAGTAAAACTATTT AATAAATTTGATAAATA-
TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID Proteína de IL2 MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKT- NO:2 QLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTF-
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-
RWITFCQSIISTLT SEQ ID DNA de muteína de CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTGCCCTGGT- NO:3 IL2 CAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGAC-
CTGCACCTTCTCCGGCTTCAGCCTGGCCCCTACCT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAA- CATCTGCTGCTGGACCTGCAGA- TGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCA AGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACA- TCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTGG AAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT- CCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC ATCTCCACCCTGACCTCCACCTCCGGCATGTCCG- TGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGG- CAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCCGACATTTGGTGGG ACGACAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGACCAACAT GGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCG- CCCGGTCCATGATCACCAACTGGTACTT- CGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG
TCCTCT SEQ ID Proteína de muteína APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL- NO:4 de IL2, o aminoácido TAMLTFKFYMPKKA- de muteína está em TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI negrito e sublinhado NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLT SEQ ID DNA de muteína de GCCCCTACCTCCTCCAGCACCAAGAAAACCCAG- NO:5 IL2 CTGCAGCTCGAACATCTGCTGCTGGAC-
CTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAG AACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTT- CTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAG- CTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAA GCCCCTGGAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC
ATCTCCACCCTGACC SEQ ID Proteína de muteína APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL- NO:6 de IL2, o aminoácido TRMLTAKFYMPKKA- de muteína está em TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNI negrito e sublinhado NVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR-
WITFCQSIISTLT TABELA 2 IgG.IL2R67A.H1 SEQ ID NO:7 (combinado) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTAMLTFKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:8 (combinado) HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS SEQ ID NO:9 (combinado) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:10 (Kabat) HCDR1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL- TAMLTFKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:11 (Kabat) HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS SEQ ID NO:12 (Kabat) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:13(Chothia) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTAMLTFKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGM SEQ ID NO:14 (Chothia) HCDR2 WWDDK SEQ ID NO:15 (Chothia) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:16 (IMGT) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTAMLTFKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMS SEQ ID NO:17 (IMGT) HCDR2 IWWDDKK SEQ ID NO:18 (IMGT) HCDR3 ARSMITNWYFDV SEQ ID NO:19 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAPTSSSTK- KTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN-
PKLTAMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT- FMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWD DKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA-
TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:20 DNA VH CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTGCCCTGG- TCAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGAC-
CTGCACCTTCTCCGGCTTCAGCCTGGCCCCTACCT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAA- CATCTGCTGCTGGACCTGCAGA- TGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCA AGCTGACCGCCATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACA- TCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTGG AAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT- CCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC ATCTCCACCCTGACCTCCACCTCCGGCATGTCCG- TGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGG- CAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCCGACATTTGGTGG GACGACAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGACCAACA TGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCG- CCCGGTCCATGATCACCAACTGGTACTT- CGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG
TCCTCT SEQ ID NO:21 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAPTSSSTK- Pesada KTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN-
PKLTAMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT- FMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWD DKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA- TYYCARSMITNWYFDVWGAG- TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS- LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT- KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL- DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:22 Cadeia CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTGCCCTGG- Pesada TCAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGAC- de DNA CTGCACCTTCTCCGGCTTCAGCCTGGCCCCTACCT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAA- CATCTGCTGCTGGACCTGCAGA-
TGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCA AGCTGACCGCCATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACA- TCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTGG AAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT- CCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC ATCTCCACCCTGACCTCCACCTCCGGCATGTCCG- TGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGG- CAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCCGACATTTGGTGG GACGACAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGACCAACA TGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCG- CCCGGTCCATGATCACCAACTGGTACTT- CGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG TCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTT- CCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTAC- CTCCGGCGGCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTG- GAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTG- CACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCT GTACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTT- CAAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATA- TCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAG GTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGA- CAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTG- CTCCTGAACTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTG TTCCCTCCAAAGCCCAAGGACAC- CCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCG- TGG- TGGTGGCCGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAG TTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA- CAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACA- GTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGG- CAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGG- CCCTGGCCGCCCCTATCGAAAAGACAATCTCCAAG GCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTACA- CCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGAC- CAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGG GCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAG- TCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA- CAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAG- TCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTT- CTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACC ACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGG-
CAAG SEQ ID NO:23 (combinado) LCDR1 KAQLSVGYMH SEQ ID NO:24 (combinado) LCDR2 DTSKLAS SEQ ID NO:25 (combinado) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:26 (Kabat) LCDR1 KAQLSVGYMH SEQ ID NO:27 (Kabat) LCDR2 DTSKLAS SEQ ID NO:28 (Kabat) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:29 (Chothia) LCDR1 QLSVGY SEQ ID NO:30 (Chothia) LCDR2 DTS SEQ ID NO:31 (Chothia) LCDR3 GSGYPF SEQ ID NO:32 (IMGT) LCDR1 LSVGY SEQ ID NO:33 (IMGT) LCDR2 DTS SEQ ID NO:34 (IMGT) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:35 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPS-
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFT
FGGGTKLEIK SEQ ID NO:36 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCACCCTG- TCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT-
CACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGC ACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCC- TAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAG- CTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC TGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCA- GCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACC- TACTACTGTTTTCAAGGCTCCGGCTACCCCTTCACC
TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID NO:37 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPS-
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:38 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCACCCTG- Leve de TCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT-
DNA CACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGC ACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCC- TAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAG- CTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC TGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCA- GCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACC- TACTACTGTTTTCAAGGCTCCGGCTACCCCTTCACC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCG- TACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTT- CCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACC GCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTAC- CCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGG- TGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGA GAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC- TACAGCCTGAGCAGCACCCTGAC- CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGT ACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAG-
CCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC IgG.IL2F71A.H1 SEQ ID NO:39 (combinado) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTAKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:40 (combinado) HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS SEQ ID NO:41 (combinado) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:42 (Kabat) HCDR1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL- TRMLTAKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:43 (Kabat) HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS SEQ ID NO:44 (Kabat) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:45 (Chothia) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTAKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGM SEQ ID NO:46 (Chothia) HCDR2 WWDDK SEQ ID NO:47 (Chothia) HCDR3 SMITNWYFDV SEQ ID NO:48 (IMGT) HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTAKFYMPKKA-
TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-
FCQSIISTLTSTSGMS SEQ ID NO:49 (IMGT) HCDR2 IWWDDKK SEQ ID NO:50 (IMGT) HCDR3 ARSMITNWYFDV SEQ ID NO:51 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAPTSSSTK- KTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN-
PKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT- FMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWD DKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA-
TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:52 DNA VH CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTGCCCTGG- TCAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGAC-
CTGCACCTTCTCCGGCTTCAGCCTGGCCCCTACCT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAA- CATCTGCTGCTGGACCTGCAGA- TGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCA AGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACA- TCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTGG AAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT- CCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC ATCTCCACCCTGACCTCCACCTCCGGCATGTCCG- TGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGG- CAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCCGACATTTGGTGG GACGACAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGACCAACA TGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCG- CCCGGTCCATGATCACCAACTGGTACTT- CGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG
TCCTCT SEQ ID NO:53 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAPTSSSTK- Pesada KTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN-
PKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETT- FMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWD DKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA- TYYCARSMITNWYFDVWGAG- TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS- LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT- KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL- DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:54 Cadeia CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTGCCCTGG- Pesada TCAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGAC- de DNA CTGCACCTTCTCCGGCTTCAGCCTGGCCCCTACCT CCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAA- CATCTGCTGCTGGACCTGCAGA-
TGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCA AGCTGACCCGGATGCTGACCGCCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACA- TCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTGG AAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT- CCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAACTG AAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACG- CCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAA- TTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATC ATCTCCACCCTGACCTCCACCTCCGGCATGTCCG- TGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCTGG- CAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCCGACATTTGGTGG GACGACAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGACCAACA TGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCG- CCCGGTCCATGATCACCAACTGGTACTT- CGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG TCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTT- CCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTAC- CTCCGGCGGCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTG- GAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTG- CACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCT GTACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTT- CAAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATA- TCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAG GTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGA- CAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTG- CTCCTGAACTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTG TTCCCTCCAAAGCCCAAGGACAC- CCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCG- TGG- TGGTGGCCGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAG TTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA- CAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACA- GTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGG- CAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGG- CCCTGGCCGCCCCTATCGAAAAGACAATCTCCAAG GCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTACA- CCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGAC- CAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGG GCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAG- TCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA- CAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAG- TCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTT- CTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACC ACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGG-
CAAG SEQ ID NO:55 (combinado) LCDR1 KAQLSVGYMH SEQ ID NO:56 (combinado) LCDR2 DTSKLAS SEQ ID NO:57 (combinado) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:58 (Kabat) LCDR1 KAQLSVGYMH SEQ ID NO:59 (Kabat) LCDR2 DTSKLAS SEQ ID NO:60 (Kabat) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:61 (Chothia) LCDR1 QLSVGY SEQ ID NO:62 (Chothia) LCDR2 DTS SEQ ID NO:63 (Chothia) LCDR3 GSGYPF SEQ ID NO:64 (IMGT) LCDR1 LSVGY SEQ ID NO:65 (IMGT) LCDR2 DTS SEQ ID NO:66 (IMGT) LCDR3 FQGSGYPFT SEQ ID NO:67 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPS-
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFT
FGGGTKLEIK SEQ ID NO:68 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCACCCTG- TCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT-
CACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGC ACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCC- TAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAG- CTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC TGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCA- GCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACC- TACTACTGTTTTCAAGGCTCCGGCTACCCCTTCACC
TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID NO:69 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPS-
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:70 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCACCCTG- Leve de TCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT-
DNA CACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGC ACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCC- TAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAG- CTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC TGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCA- GCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACC- TACTACTGTTTTCAAGGCTCCGGCTACCCCTTCACC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCG- TACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTT- CCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACC GCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTAC- CCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGG- TGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGA GAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC- TACAGCCTGAGCAGCACCCTGAC- CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGT ACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAG-
CCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC Exemplo 2: IgG.IL2R67A.H1 tem Meia-vida Prolongada em compa- ração com Proleukin® (IL-2)
[00228] Os camundongos CD-1 virgens foram dosados I.P., e o san- gue coletado de todos os animais em pré-dose, 1 hora, 3, 7, 24, 31, 48, 55 e 72 horas pós dose. As amostras sanguíneas foram centrifugadas e as amostras plasmática obtidas. As amostras de plasma resultante foram transferidas para um único tubo de polipropileno e congeladas a -80°C. Todas as amostras foram analisadas, e as concentrações de IgG.IL2R67A.H1 em plasma medidas como uso de imunoensaios. Os parâmetros farmacocinéticos, tal como meia-vida, foram calculados. Cada amostra foi executada em duplicata, com cada uma dentre as aná- lises duplicadas exigindo 5 µl da amostra que foi diluída 1:20. Captura: anticorpo biotinilado IL-2 anti-humano de cabra (R&D Systems BAF202) Detecção: IL-2 anti-humana Alexa 647, Clone MQ1-17H12 (Biolegend n.º 500315). Todos os imunoensaios foram conduzidos com o uso de um Gyrolab® Bioaffy200 com Gyros CD-200s. Conforme mostrado no gráfico na Figura 2, a meia-vida de IgG.IL2R67A.H1 é aproximadamente 12 horas e, então, diminui ao longo das 48 horas seguintes. A meia-vida de Proleukin® não pôde ser mostrada nesse gráfico visto que sua meia- vida é aproximadamente 4 horas. Exemplo 3: IgG.IL2R67A.H1 expande seletivamente efetores T CD8 e é mais bem tolerado que IL-2 Fc ou Proleukin® em camundongos B6 normais
[00229] IgG.IL2R67A.H1 aumenta efetores T CD8 em relação a Tregs sem causar os eventos adversos vistos com a administração de Proleukin®. Após o camundongo receber a dosagem no dia 1, a expan- são de efetor T CD8 foi monitorada no dia 4, no dia 8 e no dia 11. Em cada ponto no tempo, a população de células efetoras T CD8 foi gran- demente expandida, sem expansão de Treg. Isto ocorreu, em contraste com Proleukin® e uma fusão IL-2Fc, em que a mortalidade e a morbi- dade foram observadas em doses equimolares de IL-2.
[00230] Camundongos fêmeas B6 receberam administração de Pro- leukin® (5x por semana), IL-2 Fc e IgG.IL2R67A.H1 (1x/semana) em concentrações equimolares. Oito dias após o primeiro tratamento, ba- ços foram processados para obter uma única suspensão celular e lava- dos em RPMI (FBS a 10%). As células sanguíneas vermelhas foram lisadas com Tampão de Lise de Células Sanguíneas Vermelhas (Sigma n.º R7757) e células contadas para o número de células e viabilidade. A marcação de FACS foi realizada sob protocolos padrão com o uso do tampão de FACS (1xPBS + 0,5% de BSA + 0,05% de azida de sódio). As células foram marcadas com anticorpos de superfície: CD3-efluor 450 anticamundongo de rato (Ebioscience n.o 48-0032), CD4-Pacific Blue anticamundongo de rato (BD Pharmingen n.o 558107), CD8-PerCp anticamundongo de rato (BD Pharmingen n.o 553036), CD44 FITC anti- camundongo de rato (Pharmingen n.o 553133), CD25-APC anticamun- dongo de rato (Ebioscience n.o 17-0251), Nk1.1 anticamundongo de rato (Ebioscience n.o 95-5941) e subsequentemente fixados/permeabiliza- dos e manchados para FoxP3 de acordo com a FoxP3 Staining Set PE anticamundongo/rato (Ebioscience n.o 72-5775). As células foram ana- lisadas no Becton-Dickinson LSR Fortessa® ou Becton-Dickinson FACS LSR II e os dados analisados com software FlowJo®.
[00231] As Figuras 3A a 3C mostram a expansão preferencial de cé- lulas efetoras T CD8 em camundongos fêmeas B6 após a administração de Proleukin® (5x por semana), IL2-Fc e IgG.IL2R67A.H1 (1x/semana) em concentrações equimolares de Proleukin® (IgG.IL2R67A.H1 e IL2- Fc 100 µg ~ 1nmol de equivalente de IL2). Os dados nos gráficos de- monstram que as células efetoras T CD8 proliferam sem proliferação similar de Tregs. Contrastam-se esses dados com Proleukin®, que ex- pandiu tanto efetores T CD8 quanto Tregs. Nota-se que IgG.IL2R67A.H1 foi superior em números absolutos de expansão de cé- lulas efetoras T CD8 e na razão células efetoras T CD8:Tregs para um construto de fusão IL2-Fc, demonstrando que há uma base estrutural e funcional para a proteína enxertada com citocina de anticorpo IgG.IL2R67A.H1. As Figuras 3D a 3F mostram que o efeito benéfico de IgG.IL2R67A.H1 é mais evidente em doses mais altas. Quando 500 µg (5 nmol de equivalente de IL2) de IgG.IL2R67A.H1 foram administrados a camundongos B6, a expansão preferencial das células efetoras T CD8 foi vista em relação às células Treg similarmente à dose mais baixa. Entretanto, no grupo de tratamento com IL2-Fc, os camundongos foram encontrados mortos após apenas uma única dose no nível mais alto (dados não mostrados). Isso indica que IgG.IL2R67A.H1 tem um índice terapêutico maior do que construtos de fusão de IL2-Fc e pode ser ad- ministrado de modo seguro em uma faixa de dosagem mais ampla. Exemplo 4: IgG.IL2R67A.H1 expande seletivamente as células efe- toras T CD8 e é mais bem tolerada do que Proleukin® em Camun- dongos NOD
[00232] O camundongo diabético não obeso (NOD) desenvolve a di- abetes Tipo 1 espontaneamente e é usado muitas vezes como um mo- delo animal para diabetes Tipo 1 humano. Com o uso do mesmo proto- colo para os camundongos B6 descritos no Exemplo 3, IgG.IL2R67A.H1, IL2-Fc e Proleukin® foram administrados a camun- dongos NOD a equivalentes equimolares de Proleukin®. Novamente, a administração de IgG.IL2R67A.H1 nessa dose expandiu preferencial- mente as células efetoras T CD8 em vez de Tregs conforme mostrado no gráfico na Figura 4A. Adicionalmente, a administração de IgG.IL2R67A.H1 não mostrou nenhum evento adverso em camundon- gos NOD, enquanto o grupo tratado com Proleukin® teve 5 camundon- gos moribundos e 2 mortes. A Figura 4B é um gráfico que relata as do- sagens, alterações celulares em vezes e o tipo de célula do modelo de camundongo NOD. Exemplo 5: IgG.IL2R67A.H1 mostra eficácia de agente único em um modelo de camundongo de tumor de cólon CT26
[00233] Após estudar a segurança de IgG.IL2R67A.H1, sua eficácia de agente único foi testada em um modelo de camundongo CT26. As células CT26 murinas são células de carcinoma de cólon de grau IV de crescimento rápido usadas em mais de 500 estudos publicados e são uma das linhagens celulares e modelos comumente usados no desen- volvimento de fármacos. As células CT26 (ATCC CRL-2638) foram cul- tivadas em condições estéreis em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2. As células foram cultivadas em meios RPMI 1640 suplementados com FBS 10%. As células foram passadas a cada 3 a 4 dias. Para o dia da injeção, as células foram coletadas (Passagem 11) e ressuspensas em HBSS a uma concentração de 2,5x 106/ml. As células foram testa- das por Radil quanto à micoplasma e vírus murinos. Camundongos Balbc foram usados. Para cada camundongo, 0,25 x 106 células foram implantadas com injeção subcutânea no flanco direito com o uso de uma agulha de 28g (100 µl de volume de injeção). Após a implantação, os animais foram medidos por calibre e pesados 3 vezes por semana uma vez que os tumores fossem palpáveis. As medições de calibre foram calculadas com o uso de (LxWxW)/2. Os camundongos foram alimenta- dos com dieta normal e alojados em instalação para animais SPF em conformidade com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laborató- rio e regulações do Comitê De Cuidado e Uso de Animais Institucionais.
[00234] Quando os tumores atingiram cerca de 100 mm3, os camun- dongos receberam por via intraperitoneal 12,5 a 100 µg de IgG.IL2R67A.H1. Os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os valores médios de tumor foram plotados com o uso do software Prism 5 (GraphPad®). Um ponto final para estudos de eficácia foi atin- gido quando o tamanho do tumor atingiu um volume de 1.000 mm3. Após injeção, os camundongos foram também monitorados de perto quanto a sinais de deterioração clínica. Se por qualquer razão os camundongos mostraram quaisquer sinais de morbidade, incluindo desconforto respi- ratório, postura curvada, atividade diminuída, paralisia da pata traseira, taquipneia como um sinal para efusões pleurais, perda de peso próxima a 20% ou 15% mais outros sinais ou se sua capacidade de executar atividades normais (alimentação, mobilidade) foi comprometida, os ca- mundongos sofreram eutanásia.
[00235] IgG.IL2R67A.H1 foi eficaz no modelo de camundongo CT26 a doses na faixa de 12,5 µg a 100 µg, com 4 administrações de IgG.IL2R67A.H1 ao longo de 17 dias em um estudo de 20 dias. As cur- vas de volume de tumor mostradas na Figura 5 são indicativas da eficá- cia de IgG.IL2R67A.H1 nesse estudo, na medida em que os volumes de tumor foram mantidos abaixo de 200 mm por 15 dias e, então, abaixo de 400 mm pelos 5 dias restantes. Exemplo 6: IgG.IL2R67A.H1 e produtos terapêuticos contra câncer adicionais mostram eficácia em um modelo de camundongo B16
[00236] Para avaliar a eficácia de IgG.IL2R67A.H1 em combinação com outros produtos terapêuticos contra câncer, um modelo de camun- dongo com melanoma B16F10 foi usado. As células B16F10 (ATCC CRL-6475) foram cultivadas em condições estéreis em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 por duas semanas. Células B16F10 foram cul- tivadas em DMEM+10%FBS. As células foram coletadas e ressuspen- sas em meio isento de FBS DMEM a uma concentração de 1 x 106/100 µl. As células B16F10 foram testadas por Radil quanto à micoplasma e vírus murinos. As células foram implantadas no flanco direito de camun- dongos B6 com o uso de uma agulha de calibre 28 (100 µl de volume de injeção). Após o implante, os camundongos foram medidos por cali- bre e pesados 2 vezes por semana uma vez que os tumores fossem palpáveis. As medições de calibre foram calculadas com o uso de (L x W x W)/2.
[00237] Nesse estudo, IgG.IL2R67A.H1 foi usado como um agente único ou em combinação com o anticorpo TA99, que se liga a Trp1, um antígeno que é expresso em células B16F10. Uma fusão de IL2-Fc foi administrada como um agente único ou em combinação com o anticorpo TA99. Como um controle, o anticorpo TA99 foi administrado como um agente único.
[00238] Surpreendentemente, IgG.IL2R67A.H1, quando adminis- trado como um agente único a uma dose de 500 µg, foi o tratamento mais eficaz nesse modelo (Figura 6). O segundo melhor tratamento foi a combinação de IgG.IL2R67A.H1 (100 µg) e TA99. Essa combinação foi mais eficaz do que IgG.IL2F71A.H1 como um agente único a 100 µg, TA99 em combinação com IgG.IL2F71A.H1 a 500 µg e IL2-Fc como um agente único ou como uma combinação de IL2-Fc/TA99. Quando TA99 foi administrado como um agente único, o mesmo não teve nenhum efeito, e o volume médio do tumor foi similar ao controle não tratado. Esses dados demonstram que IgG.IL2R67A.H1 é eficaz como um agente único no modelo de tumor de camundongo com melanoma, mas é também eficaz quando pareado com outro agente anticâncer. Exemplo 7: Atividade de IgG.IL2R67A.H1 e IgG.IL2F71A.H1 em Cé- lulas Humanas
[00239] A fim de testar a atividade de IgG.IL2R67A.H1 em efetores T CD8 humanos, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) hu- manas foram avaliadas quanto à atividade de pSTAT5. As células PBMC foram deixadas em repouso em meios de teste livres de soro e colocadas em placas. IgG.IL2R67A.H1, IgG.IL2F71A.H1 ou Proleukin® foi adicionada às PBMC e incubada por 20 minutos a 37°C. Após 20 minutos, as células foram fixadas com 1,6% de formaldeído, lavadas e manchadas com marcadores de superfície. Após 30 minutos à tempe- ratura ambiente, as amostras foram lavadas e os péletes celulares res- suspensos foram permeabilizados com -20°C de metanol, lavados e marcados para intercaladores pSTAT5 e DNA. As células foram passa- das em Cytof® e os dados analisados com o software FlowJo® para quantificar o nível da atividade de pSTAT5. A tabela na Figura 7 de- monstra que IgG.IL2R67A.H1 tem ativação preferencial para células efetoras T CD8 e minimiza a ativação de células Treg. Exemplo 8: Ligação de proteínas enxertadas com citocina de anti- corpo
[00240] As sequências de IL2 que contêm uma muteína (SEQ ID NO:4) foram inseridas no laço de CDR de um arcabouço de cadeia de imunoglobulina. As proteínas enxertadas com citocina de anticorpo fo- ram preparadas com o uso de uma variedade de sequências de imuno- globulinas conhecidas que foram utilizadas em ambientes clínicos assim como sequências de anticorpo de linhagem germinativa. Um dentre os anticorpos usados tem RSV como seu antígeno. A fim de determinar se o enxerto com IL2 nas CDRs desse anticorpo reduziu ou revogou a li- gação ao RSV, um ensaio ELISA foi executado nas proteínas RSV ou em PBS ou um tampão de carbonato. Conforme mostrado na Figura 8, isso parece ser influenciado por qual CDR foi escolhida para enxerto com IL2. Por exemplo, IgG.IL2R67A.H1 tem ligação de RSV semelhante ao anticorpo original não enxertado (não modificado). Em contraste, o enxerto com IL2 na cadeia leve de CDR3 (CDR-L3) ou em CDR-H3 re- duz a ligação. Conforme esperado, a IL2 enxertada em um anticorpo irrelevante (Xolair) não produz ligação. Isso demonstra que as proteínas enxertadas com citocina de anticorpo podem reter a ligação ao alvo ori- ginal do arcabouço de anticorpo ou essa ligação pode ser reduzida.
[00241] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos no presente documento têm propósitos ilustrativos e que várias modifica- ções ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e previ- são do presente pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, números de acesso de sequência, patentes e pedidos de patente citados no presente documento são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade para qualquer fim.

Claims (50)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracteri- zada pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH), que compre- ende as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3; e (b) uma região variável de cadeia leve (VL), que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3; e (c) uma molécula de Interleucina 2 (IL2) enxertada em uma CDR da VH ou da VL.
2. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada em uma CDR de cadeia pesada.
3. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a CDR de cadeia pesada é selecionada dentre a região determinante de complementari- dade 1 (HCDR1), região determinante de complementaridade 2 (HCDR2) e região determinante de complementaridade 3 (HCDR3).
4. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada em uma HCDR1.
5. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada em uma CDR de cadeia leve.
6. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a CDR de cadeia leve é selecionada dentre a região determinante de complementaridade 1 (LCDR1), região determinante de complementaridade 2 (LCDR2) e região determinante de complementaridade 3 (LCDR3).
7. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 contém uma mutação que reduz a afinidade da molécula de IL2 a um receptor de IL2 de alta afinidade.
8. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula a prolifera- ção de células efetoras T CD8 mais do que IL2 recombinante ou Pro- leukin®.
9. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula a prolifera- ção de células reguladoras T CD4 menos do que IL2 recombinante ou Proleukin®.
10. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula a prolifera- ção de células NK mais do que IL2 recombinante ou Proleukin®.
11. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo tem uma meia-vida mais longa do que IL2 nativa ou Proleukin®.
12. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 consiste na SEQ ID NO:4.
13. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 consiste na SEQ ID NO:6.
14. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma cadeia pesada de anticorpo da classe IgG.
15. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesada da classe IgG é selecionada dentre IgG1, IgG2 e IgG4.
16. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs a um alvo é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, pela molécula de IL2 enxertada.
17. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs a um alvo é retida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, na presença da molécula de IL2 enxertada.
18. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs é distinta da especificidade de ligação da molécula de IL2.
19. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs é a um antígeno não humano.
20. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o antígeno não humano é um vírus.
21. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o vírus é o vírus sincicial respiratório (RSV).
22. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o RSV é seleci- onado dentre o subgrupo A de RSV e subgrupo B de RSV.
23. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a porção de arcabouço de anticorpo da proteína enxertada com ci- tocina de anticorpo é humanizada ou humana.
24. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracteri- zada pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 13, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:29, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:30 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:31; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO:45, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:46, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:47; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:62 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:63.
25. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracteri- zada pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a SEQ ID NO:19, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 35; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a SEQ ID NO: 51, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 67.
26. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma região Fc modificada que corres- ponde à função efetora reduzida.
27. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a região Fc mo- dificada compreende uma mutação selecionada dentre uma ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A.
28. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a região Fc mo- dificada compreende uma combinação de mutações selecionadas den- tre uma ou mais dentre D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A e P329G/L234A/L235A.
29. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracteri- zada pelo fato de que compreende uma HCDR1 de SEQ ID NO: 13, uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, uma HCDR3 de SEQ ID NO:15, uma LCDR1 de SEQ ID NO:29, uma LCDR2 de SEQ ID NO:30, uma LCDR3 de SEQ ID NO:31, uma região Fc modificada contendo a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula menos ativação de células Treg em comparação a Proleukin®.
30. Proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracteri- zada pelo fato de que compreende uma HCDR1 de SEQ ID NO: 45, uma HCDR2 de SEQ ID NO:46, uma HCDR3 de SEQ ID NO:47, uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, uma LCDR2 de SEQ ID NO:62, uma LCDR3 de SEQ ID NO:63, uma região Fc modificada contendo a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com citocina de anticorpo estimula menos ativação de células Treg em comparação a Proleukin®.
31. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína enxertada com citocina de anticorpo que compre- ende: (i) uma cadeia pesada de SEQ ID NO:22 e uma cadeia leve de SEQ ID NO:38; ou (ii) uma cadeia pesada de SEQ ID NO:54 e uma cadeia leve de SEQ ID NO:70.
32. Célula hospedeira recombinante adequada para a produção de uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação
31, que codifica os polipeptídeos de cadeia pesada e leve da proteína en- xertada com citocina de anticorpo e, opcionalmente, um sinal de secre- ção.
33. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivin- dicação 32, caracterizada pelo fato de que é uma linhagem de células de mamífero.
34. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivin- dicação 33, caracterizada pelo fato de que a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células CHO.
35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína enxertada com citocina de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um veículo far- maceuticamente aceitável.
36. Método para tratar câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína enxer- tada com citocina de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 35.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer da próstata, câncer de mama e linfoma.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, carac- terizado pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo ou composição farmacêutica é administrada em combinação com outro agente terapêutico.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é outra proteína enxertada com citocina de anticorpo.
40. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um inibidor de verificação imu- nológica.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a verificação imunológica é selecionada dentre o grupo que consiste em: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEA- CAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
42. Método para expandir células efetoras T CD8 em um pa- ciente que precisa dos mesmos, caracterizado pelo fato de que compre- ende administrar uma proteína enxertada com citocina de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou a compo- sição farmacêutica, como definida na reivindicação 35, ao paciente.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que as células efetoras T CD8 são expandidas, e as células Treg não são expandidas.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que as células efetoras T CD8 são expandidas, e as células NK não são expandidas.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a administração de um inibidor de verificação imunológica.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a verificação imunológica é selecionada dentre o grupo que consiste em: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEA- CAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
47. Uso de uma proteína enxertada com citocina de anti- corpo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 13, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:14, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:29, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:30 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:31; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO:45, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO:46, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO:47; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO:61, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO:62 e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO:63, no tratamento de câncer.
48. Uso, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a proteína enxertada com citocina de anticorpo é admi- nistrada em combinação com outro agente terapêutico.
49. Uso, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um inibidor de verificação imu- nológica.
50. Uso, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a verificação imunológica é selecionada dentre o grupo que consiste em: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, CTLA-4, LAG-3, CEA- CAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR.
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