JP2023547105A - 炎症促進性プロドラッグ - Google Patents

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Abstract

細胞外抗原に特異的に結合するターゲティング部分、酵素切断可能なリンカー、および自然免疫系アクチベーターを含むプロドラッグが本明細書で提供される。酵素切断可能なリンカーは、ターゲティング部分を自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結することができる。癌を処置する方法、癌をイメージングする方法、および癌の処置をモニターする方法もまた提供される。【選択図】図１

Description

米国において、毎年、６５，０００件を超える腎臓癌の新しい症例が発生し、約１５，０００人の死亡をもたらし、世界中ではこの数の約１０倍である。イメージング研究の頻繁な使用によってより早い検出がもたらされているが、多くも患者の３０％が、腎摘出後に転移性疾患を伴って進行する。腎臓癌は、処置が難しいことで有名になっている厄介な疾患である。一般的に古典的化学療法に対して抵抗性であるため、腎臓癌についての主な処置選択肢は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路をターゲットし、それに従って、新しい血管形成、ならびにそれによる、腫瘍の酸素および栄養素への無制限のアクセスを抑制する薬物である。この処置アプローチは、１０年より長い間、処置未経験の患者についての標準治療になっている。
癌治療における著しい進歩は、免疫療法である。幅広い適用がゆえに特に影響力の強いものは、免疫チェックポイント阻害剤、すなわち、ＣＴＬＡまたはＰＤ１／ＰＤＬ１経路をターゲットする抗体であり、それは、免疫応答のブレーキを外して、抗腫瘍効果を促進する。しかしながら、メラノーマまたは腎細胞癌などの免疫応答性と伝統的にみなされた癌においてさえも、多くの患者が応答しない。免疫療法を開始する前の腫瘍の炎症状態が、より良くかつより深部の応答に関連している。具体的には、「冷たい」腫瘍(cold tumors)の経験的免疫認識の欠如が、癌化学療法の失敗の主な理由である。したがって、腫瘍における炎症の広範な活性化を含む改善された免疫療法の必要性が存在する。
細胞外抗原と特異的に結合するターゲティング部分；第１の酵素切断可能なリンカー；および第１の自然免疫系アクチベーターを含むプロドラッグであって、前記第１のリンカーが、前記ターゲティング部分を前記自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結する、プロドラッグが提供される。前記細胞外抗原は、細胞外腫瘍抗原であり得る。
細胞外抗原は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、または線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり得る。ターゲティング部分は、ＰＳＭＡ、ＣＡ９、またはＦＡＰＩと特異的に結合する分子であり得る。第１の酵素切断可能なリンカーは、カテプシン切断可能なリンカーまたはレグマイン切断可能なリンカーであり得る。酵素切断可能なリンカーは、アジド－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）－ｐ－ニトロフェノール（ＰＮＰ）リンカー、またはアラニン－アラニン－アスパラギンレグマインリンカーであり得る。プロドラッグはさらに、ターゲティング部分と第１のリンカーとの間にスペーサーリンカーを含み得る。リンカースペーサーは、アジド－ＰＥＧ－マレイミドスペーサーリンカー、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－ＰＥＧ－アルキンスペーサーリンカーであり得る。プロドラッグはさらに、アルブミン結合性部分を含み得る。第１の自然免疫系アクチベーターは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを含み得る。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、または混合性ＴＬＲ７／８アゴニストであり得る。ＴＬＲ７アゴニストは、ガーディキモド（gardiquimod）、イミキモド（imiquimod）、テルラトリモド（telratolimod）、またはそれらの類似体であり得る。混合性ＴＬＲ７／８アゴニストはレシキモド（resiquimod）およびそれの類似体であり得る。ＴＬＲ９アゴニストは、ＯＤＮ－２３９５、ＣＭＰ－００１、またはＭＧＮ１７０３であり得る。ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドであり得る。プロドラッグはさらに、放射標識部分（接合団またはキレーターを介して）、自然免疫系の第２のアクチベーター、またはそれらの組合せを含み得る。接合団は、第２のリンカーによりプロドラッグへ連結される１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、または７６Ｂｒから選択される放射性核種での標識のための部分を含み得る。キレーターは、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、および９９ｍＴｃから選択されるイメージングのための放射性核種、ならびに／または６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、および２２７Ｔｈから選択される放射線療法のための放射性核種での標識のための、二官能性キレーター、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）であり得る。第２の自然免疫アクチベーターは、第３のリンカーによりプロドラッグへ連結される炎症促進性分子を含み得る。
プロドラッグ（１）～（１５）から選択されたプロドラッグが提供される。
本明細書に記載されたプロドラッグの１つの有効量を対象に投与するステップを含む、対象において癌を処置する方法が提供される。
癌は、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、または造血器癌であり得る。免疫療法が、プロドラッグの投与の前、それと同時、またはそれの後にさらに投与され得る。例えば、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約１分後もしくは前、３０分後もしくは前、６０分後もしくは前、９０分後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約２時間後もしくは前、５時間後もしくは前、１２時間後もしくは前、２４時間後もしくは前、３６時間後もしくは前、４８時間後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約３日後もしくは前、５日後もしくは前、７日後もしくは前、１４日後もしくは前、２１日後もしくは前、２７日後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。免疫療法は、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ療法、モノクローナル抗体、癌ワクチン、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組合せであり得る。
対象において癌をイメージングする方法であって、本明細書に記載されたプロドラッグの１つを対象に投与するステップ；任意で、前記プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に前記対象に投与するステップ；および前記対象に機能イメージングを実施するステップを含む、方法が提供される。
対象において癌の処置をモニターする方法であって、本明細書に記載されたプロドラッグの１つを対象に投与するステップ；任意で、前記プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に前記対象に免疫療法を投与するステップ；および前記対象に機能イメージングを実施するステップを含む、方法。例えば、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約１分後もしくは前、３０分後もしくは前、６０分後もしくは前、９０分後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約２時間後もしくは前、５時間後もしくは前、１２時間後もしくは前、２４時間後もしくは前、３６時間後もしくは前、４８時間後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約３日後もしくは前、５日後もしくは前、７日後もしくは前、１４日後もしくは前、２１日後もしくは前、２７日後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。機能イメージングは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）であり得る。
ＰＳＭＡ－ＴＬＲ７プロドラッグを示す図である。結合性部分はＰＳＭＡリガンドのクラスである。ガーディキモドは、カテプシンＢ切断可能なリンカー系と付着しており、無痕跡型放出を可能にする。 ガーディキモドＰＳＭＡプロドラッグのＴＬＲ７活性の放出を示す図である。ＰＳＭＡ発現前立腺癌細胞株（ＬｎＣＡＰ）が用いられた。未処理ＬｎＣＡＰ細胞およびＰＳＭＡ陰性マウス腎臓癌細胞株ＲＥＮＣＡが、陰性対照としての役割を果たした。細胞は、プロドラッグに曝され、その後、遊離ガーディキモドが細胞から溶出され、レポーター細胞株へ移された。結果は、光学的濃度測定結果を示し、対照に対して正規化された。 ＰＳＭＡ１１－ＴＬＲ７プロドラッグとのインキュベーションによる、ＰＳＭＡ陰性およびＰＳＭＡ陽性レポーター細胞のＴＬＲ７レポーター活性を示す図である。左：正常なＰＳＭＡ陰性ＨＥＫ２９３ Ｂｌｕｅ ＴＬＲ７レポーター細胞株が、ＰＳＭＡ遺伝子含有レンチウイルスを形質導入された。形質導入細胞のおおよそ５％がその遺伝子を発現した。右：細胞が、ＰＳＭＡ１１－ＴＬＲ７プロドラッグに曝された。ＰＳＭＡ陰性細胞株においてＴＬＲ７レポーター活性はなかった。部分的に形質導入されたＰＳＭＡ陽性細胞株は、ＰＳＭＡ陽性率を大まかに反映する細胞のサブセットにおいてＴＬＲ７活性を示している。 炎症促進性ＴＬＲプロドラッグに応答した炎症の誘導の概要を示す図であり、そのプロドラッグは、細胞内のリソソームにおいてそれらの薬物標的と相互作用する。 「クリック合成」のためのプロドラッグビルディングブロックのモジュラーデザインを示す図である。 示されたＴＬＲプロドラッグの試料合成（上部）および構造（下部）を示す図である。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ａは、示されたＴＬＲ７プロドラッグおよびＴＬＲ９プロドラッグの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ａは、示されたＴＬＲ７プロドラッグおよびＴＬＲ９プロドラッグの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ａは、示されたＴＬＲ７プロドラッグおよびＴＬＲ９プロドラッグの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ａは、示されたＴＬＲ７プロドラッグおよびＴＬＲ９プロドラッグの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ａは、示されたＴＬＲ７プロドラッグおよびＴＬＲ９プロドラッグの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ｂは、ＦＡＰＩ０４とのＴＬＲ７コンジュゲートおよびＴＬＲ９コンジュゲートの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ｃは、アルブミン結合性モチーフ（ＡＢＭ）修飾の、ＦＡＰＩ０４とのＴＬＲ７コンジュゲートおよびＴＬＲ９コンジュゲートを示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ｄは、不可逆性ＰＳＭＡターゲティング部分の構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ｅは、一般的な三機能性セラノスティック（theranostic）コンジュゲートデザインの構造を示す。 ＴＬＲプロドラッグの例の構造を示す図である。図７Ｆは、ＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７の構造を示す。 ＰＥＴイメージングデータから導き出された、組織１グラムあたりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表された定量的器官取込みを示す図である。マウスＰＥＴイメージングは、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ／ＣＴ Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施された。各マウスは、スキャンの間中、２％イソフルラン麻酔で鎮静された。静的ＰＥＴスキャンは、１時間ｐ．ｉ．に１５分間、行われ、ＣＴデータ取得は、５８μｍの焦点を以て、８０ｋＶおよび５００μＡで実行された。全てのＰＥＴおよびＣＴデータは、再構築され、目的の領域（ＲＯＩｓ）が、ＣＴによりディスプレイされた通りにマークされ、組織の１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）としてトレーサー取込みが定量化された。 合成されたＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモドプロドラッグについてのエレクトロスプレーイオン化質量分析結果を示す図である。これらの結果は、合成されたプロドラッグが予想通りであることを示している。 合成されたプロドラッグであるＰＳＭＡ－Ｃ５－カテプシン－ガーディキモドについての液体クロマトグラフィー質量分析結果を示す図である。 合成されたプロドラッグであるＰＳＭＡ－Ｌｅｇｕ－ガーディキモドについての液体クロマトグラフィー質量分析結果を示す図である。 合成されたプロドラッグであるＰＳＭＡ６１７－Ｌｅｇｕ－ガーディキモドについてのエレクトロスプレーイオン化質量分析結果を示す図である。 合成されたＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７コンジュゲートについての質量分析結果を示す図である。 １５分間のＰＥＴスキャン、続いて７分間のＣＴスキャンにより評価された小動物ＰＥＴ／ＣＴイメージング研究を示す図である。その結果は、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍が明らかに観察可能であり、一方、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ３－Ｆｌｕ腫瘍が（筋肉取込みと類似した）非常に弱い画像コントラストを有することを確認している。 定量的取込み分析を示す図であり、それは、コンジュゲート ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢが、ＰＣ３－Ｆｌｕ（０．８±０．３％ＩＤ／ｇ）腫瘍においてより、ＰＣ３－ＰＩＰ（１．９±０．５％ＩＤ／ｇ）腫瘍において高い取込みを生じることを確認している（ｎ＝３）。 ＣＡ９ターゲット化プロドラッグのインビトロ試験を示す図である。１０ｕＭ用量において、約１．３光学密度における試料は、ＣＡ９－ガーディキモドであり、約０．９光学密度における試料はＣＡ９＋ガーディキモドであり、約－０．０５光学密度における試料はＣＡ９＋ＣＡ９－Ｃａｔｈ－ＴＬＲ７であり、約－０．１光学密度における試料はＣＡ９－ＣＡ９－Ｃａｔｈ－ＴＬＲ７である。 炎症促進性プロドラッグであるＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモドの合成および炎症促進性プロドラッグ３の合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモドの合成および炎症促進性プロドラッグ３の合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるプロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡおよびＰＳＭＡ－Ｃ５－カテプシン－ガーディキモド（２）の合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるプロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡおよびＰＳＭＡ－Ｃ５－カテプシン－ガーディキモド（２）の合成を示す図である。 様々な用量の遊離ガーディキモドと比較した場合、ＰＳＭＡプロドラッグが、ＰＳＭＡ陽性ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてＴＬＲ７レポーター活性を誘導するが、ＰＳＭＡ陰性レポーター細胞株においては誘導しないことを示す棒グラフである。Ｙ軸は、光学密度を表す。 様々な用量の遊離ガーディキモドと比較した場合、ＰＳＭＡプロドラッグが、ＰＳＭＡ陽性ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞においてＴＬＲ７レポーター活性を誘導するが、ＰＳＭＡ陰性レポーター細胞株においては誘導しないことを示す線グラフである。Ｙ軸は、光学密度を表す。 炎症促進性プロドラッグであるレグマイン－ガーディキモドの合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるＰＳＭＡ－Ｌｅｇｕ－ガーディキモド（３）およびＰＳＭＡ６１７－ｐｒｏｐの合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるＰＳＭＡ－Ｌｅｇｕ－ガーディキモド（３）およびＰＳＭＡ６１７－ｐｒｏｐの合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７の合成を示す図である。 炎症促進性プロドラッグであるＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７の合成を示す図である。 アジド－ＰＥＧ４－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ－ガーディキモド（プロドラッグＢ）および前駆体分子 ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ、標準プロドラッグであるＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１９Ｆ］ＳＦＢ（５ａ）の合成を示す図である。 アジド－ＰＥＧ４－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ－ガーディキモド（プロドラッグＢ）および前駆体分子 ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ、標準プロドラッグであるＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１９Ｆ］ＳＦＢ（５ａ）の合成を示す図である。
本開示は、炎症促進性プロドラッグの全身送達に有用である小さい薬物コンジュゲートを含むプロドラッグを提供する。本明細書で用いられる場合、用語「プロドラッグ」は、身体内で代謝されて、生物学的に活性なプロドラッグを生成することができる生物学的に不活性な化合物を意味する。炎症促進性プロドラッグは、癌細胞などの標的細胞において選択的に活性化され、腫瘍バルク全体にわたって免疫療法を増強することができる。
プロドラッグ
癌の処置のための炎症促進性プロドラッグが提供される。プロドラッグは、それ自体、腫瘍において自然免疫応答を広く活性化することができる。腫瘍における自然免疫応答の活性化は、例えば変異型タンパク質に対するだけでなく、非変異型だが、過剰発現した腫瘍関連抗原および内因性レトロウイルスに対しても、Ｔ細胞媒介性適応免疫応答をもたらすことができる。本明細書で提供された化合物は、お互いに関連したいくつかのコンポーネントを含む化合物である。
本明細書で提供されたプロドラッグは、例えば、（ｉ）細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合するターゲティング部分；（ｉｉ）酵素切断可能なリンカー；および（ｉｉｉ）自然免疫系アクチベーターを含み得、前記第１の酵素切断可能なリンカーが、前記ターゲティング部分を前記自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結する。
ターゲティング部分
本明細書に提供されたプロドラッグは、細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合するターゲティング部分を含み得る。細胞外腫瘍抗原は、癌細胞の表面上に発現した任意の分子、例えば、膜貫通受容体もしくは膜貫通タンパク質、または腫瘍微小環境に存在する細胞、例えば、間質細胞（例えば、癌腫関連線維芽細胞、ＣＡＦ）、免疫細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ、好中球、腫瘍浸潤リンパ球、またはＴ細胞）、周辺細胞、もしくは内皮細胞の表面に発現した任意の分子であり得る。特異的結合とは、ターゲティング部分が、それの標的の細胞外腫瘍抗原と、それが非標的抗原（例えば、腫瘍細胞の表面に発現していない、または腫瘍微小環境に存在する細胞の表面に発現していない細胞外抗原）に対するだろうより高い特異性および感受性で結合し得ることを意味する。
ターゲティング部分は、細胞表面上に存在するタンパク質またはポリペプチドである、１つまたは複数の細胞外抗原（すなわち、細胞表面タンパク質）と結合することができる。ある実施形態において、細胞外抗原は、腫瘍抗原（すなわち、特異的腫瘍タンパク質）、または内皮細胞上のＰＳＭＡもしくは線維芽細胞上のＦＡＰのような、他の通常に存在する表面タンパク質である。ターゲティング部分は、細胞外腫瘍抗原などの１つまたは複数の細胞外抗原と結合することができる。細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原は、ターゲティング部分に対する１つより多い結合部位を有し得る。
いくつかの実施形態において、プロドラッグのターゲティング部分は、細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合することができる。細胞外腫瘍抗原は、腫瘍細胞上にのみ存在する腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、またはいくつかの腫瘍細胞およびいくつかの正常細胞上に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。例示的な細胞外腫瘍抗原には、変異型癌遺伝子の産物、変異型腫瘍抑制遺伝子の産物、癌遺伝子と腫瘍抑制因子以外の、変異型遺伝子の産物、オンコウイルスにより産生される腫瘍抗原、変化した細胞表面糖脂質および糖タンパク質、癌胎児性抗原などが挙げられる。細胞外腫瘍抗原はまた、正常細胞より、腫瘍細胞上に多く発現する分子であり得る。細胞外腫瘍抗原はまた、例えば腫瘍関連新生血管構造などの非腫瘍細胞上に発現し得る。細胞外腫瘍抗原は、癌の特定の型において特異的に発現し、または癌の多くの異なる型において発現し得る。
例示的な細胞外腫瘍抗原には、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、インテグリン（例えば、αｖβ３）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓおよびｐ５３の異常産物、オクトレオチド受容体などが挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原はＰＳＭＡである。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原はＣＡ９である。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原はＰＳＭＡであり、ターゲティング部分はＰＳＭＡ－１１またはＰＳＭＡ－６１７である。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原はＣＡ９であり、ターゲティング部分はＣＡ９小分子結合剤である。いくつかの実施形態において、細胞外腫瘍抗原はＦＡＰであり、ターゲティング部分は、ＦＡＰＩ－０４などのＦＡＰ阻害剤である。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分は、ＰＳＭＡ－１１、ＰＳＭＡ－６１７、ＣＡ９小分子結合剤、またはＦＡＰＩ－０４である。
酵素切断可能なリンカー
プロドラッグは、１つの酵素切断可能なリンカーを含み得る。２つの個々の要素を付着させるための方法は、リンカーの使用を必要とし得る。本明細書で用いられる場合、用語「リンカー」は、自然免疫系アクチベーターが、ターゲットされるエリア、組織、または細胞に送達されるのを、例えば、自然免疫系アクチベーターをターゲティング部分へ物理的に連結することにより、可能にする任意の結合、小分子、または他の媒体を指す。リンカーは、化合物を連結する能力がある任意の化学的部分であり得る。リンカーは、プロドラッグが活性状態を保持するという条件において、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断に感受性が高くあり得る。リンカーはそれらの化学的モチーフによって分類され、その化学的モチーフには、ジスルフィド基、ヒドラジンもしくはペプチド（切断可能な）、またはチオエステル基（切断不可能な）が挙げられる。リンカーにはまた、荷電リンカーおよびその親水性型が挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「切断可能なリンカー」は、様々な条件下で分解する能力があるリンカー部分を指す。切断に適した条件には、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離および置換反応、ならびに連結の熱力学的性質が挙げられ得るが、それらに限定されない。任意の酵素切断可能なリンカーを用いることができ、それには、例えば、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーが挙げられる。
ペプチドリンカーは、例えば、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）含有リンカーおよびフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）含有リンカーであり得る。Ｖａｌ－ＣｉｔおよびＰｈｅ－Ｌｙｓリンカーは、例えばカテプシンＢにより、切断され得る。追加のペプチドリンカーには、例えば、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン（Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ）リンカーおよびアラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ）リンカーが挙げられる。ペプチドリンカーは、リソソーム酵素およびエンドソーム酵素、例えば、カテプシンＢおよびレグマインによって切断され得る。
非ペプチドリンカーには、例えば、アジド－ＰＥＧ－マレイミドリンカー、β－グルコロニドに基づいたリンカー、または自己犠牲リンカーが挙げられる。β－グルコロン酸に基づいたリンカーは、β－グルコロニダーゼまたはβ－グルコロン酸によって切断され得る。自己犠牲リンカーには、光照射下で切断され得る感光性Ｏ－ニトロベンジル基組込み型リンカーが挙げられる。アジド－ＰＥＧ－マレイミドリンカーは、エンドソーム酵素、例えばカテプシンＢにより切断され得る。非ペプチドリンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。
酵素切断可能なリンカーは、プロドラッグ化合物からの自然免疫系アクチベーターの放出に影響し得る。切断速度および薬物放出速度は、薬物コンジュゲートの半減期として表現され得る。例えば、プロドラッグは、約１分間、約５分間、約１０分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、５５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、約３０日間、および間の任意の数または範囲の半減期を有する切断リンカーを含み得る。
例示的な切断リンカーは、カテプシンＢ切断可能なリンカーである。追加の切断リンカーには、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン（Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ）リンカーおよびアラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ）リンカーが挙げられる。例示的な切断リンカーはまた、レグマイン切断可能なリンカーである。
いくつかの実施形態において、第１の酵素切断可能なリンカーは、アジド－ＰＥＧ－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）－ｐ－ニトロフェノール（ＰＮＰ）リンカーまたはアラニン－アラニン－アスパラギンレグマインリンカーである。
酵素切断可能なリンカーは、ターゲティング部分を自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結することができる。ターゲティング部分と自然免疫系アクチベーターの共有結合性連結は、直接的連結、すなわち、ターゲティング部分と自然免疫系アクチベーターとの間に、例えばスペーサーなどの他の部分を含まない連結であり得る。ターゲティング部分と自然免疫系アクチベーターの共有結合性連結は、間接的連結、すなわち、ターゲティング部分と自然免疫系アクチベーターとの間に、例えばスペーサーなどの他の部分を含む連結であり得る。
スペーサーリンカー
プロドラッグは１つまたは複数のスペーサーリンカーを含み得る。本明細書で用いられる場合、「スペーサー」および「スペーサーリンカー」は交換可能に用いられ、標的との効果的な結合のためにコンジュゲートの可動性を維持するために用いられ得るリンカーを指す。スペーサーは、プロドラッグの自然免疫系アクチベーターのコンポーネントを、ターゲティング部分などのプロドラッグの他のコンポーネントから分離させるために含まれ得る。スペーサーは、立体障害および込み合いを避けること、ならびに自然免疫系アクチベーターのプロドラッグからの放出の部位および速度を調節することを助けることができる。
いくつかの実施形態において、プロドラッグは、ターゲティング部分と第１のリンカーとの間にスペーサーリンカーを含み得る。例えば、アジド－ＰＥＧ－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）－ｐ－ニトロフェノール（ＰＮＰ）リンカーは、自己犠牲的ｐ－アミノベンジルアルコール基（ＰＡＢ）スペーサーを含む。薬物構造および細胞毒性活性への影響は、自己犠牲スペーサーを用いることにより、回避することができる。別の例として、アジド－ＰＥＧ－マレイミドリンカーは、ＰＥＧスペーサーを含む。例えばＰＥＧなどのスペーサーは、親水性であり得、より高い溶解性を与える。
プロドラッグは、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、ターゲティング部分とリンカーとの間にスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、ターゲティング部分とリンカーとの間にスペーサーを含み得、そのリンカーはＰＥＧである。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、ターゲティング部分とＴＬＲアゴニストとの間にスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、リンカーとＴＬＲアゴニストとの間にスペーサーを含み得る。
いくつかの実施形態において、リンカースペーサーは、アジド－ＰＥＧ－マレイミドスペーサーリンカーまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－ＰＥＧ－アルキンスペーサーリンカーであり得る。
アルブミン結合性モチーフ
多くのグラム陽性細菌は、血清タンパク質に結合する能力を有し、例えば、１つまたは複数のアルブミン結合性ドメインまたはモチーフを含む、表面タンパク質を発現する。アルブミンは、血漿中、最も豊富なタンパク質である。アルブミンは、ヒトにおいて、腎臓の濾過カットオフを超えるそれのサイズおよび新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とのｐＨ依存性結合のせいで、１９日間の非常に長い循環半減期を有する。結果として、アルブミンとの非共有結合性会合は、薬物の半減期を延ばすために、およびそれに従って、それらの薬物動態学的性質を伸ばすために、用いることができる。
アルブミン結合性モチーフ（ＡＢＭ）は、アルブミン結合性タンパク質内またはアルブミン結合性部分内に見出すことができる。アルブミン結合性モチーフの例には、例えば、３－ヘリックスバンドル血清アルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）、コンセンサスアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）、またはアルブミン結合性ＦＮ３ドメインが挙げられる。アルブミン結合性モチーフは、例えば、連鎖球菌のプロテインＧドメイン（Ｋｏｎｉｇ ＆ Ｓｋｅｒｒａ、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１８、７３～８３）または米国特許出願第２００３／００６９３９５号もしくはＤｅｎｎｉｓら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３５０３５～３５０４３に記載されているようなものなどの細菌のアルブミン結合性ドメインであり得る。アルブミン結合性モチーフの他の例は、国際公開特許出願第２０１４／０４８９７７号に記載されているようなアミノ酸配列を含み得、そのアミノ酸配列には、例えば、
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＤＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡＩ（配列番号３）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＤＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤＥＩ（配列番号４）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＤＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＥＡＩ（配列番号５）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＤＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＥＥＩ（配列番号６）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＥＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤＡＩ（配列番号７）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＥＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤＥＩ（配列番号８）；
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＥＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＥＡＩ（配列番号９）；および
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＥＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＥＥＩ（配列番号１０）
が挙げられる。
異なるサイズおよび機能を有する、アルブミン結合性タンパク質の多くの異なる型がある。例えば、４０個を超えるアルブミン結合性ドメインが、１つのタンパク質内に見出されており、巨大な細胞壁結合型フィブロネクチン結合性分子内に棒状構造を形成している。このタンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の表面上に見出され、Ｅｂｈ（ＥＣＭ結合性タンパク質相同体、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ２ＦＹＪ６）と呼ばれている。アルブミン結合性ドメインは、グラム陽性細菌により発現した様々な表面タンパク質内に見出されるような小さい３－ヘリックスタンパク質ドメインであり得る。他のアルブミン結合性モチーフは、例えば、米国特許出願公開第２０１９／００３１７２７号および米国特許出願公開第２０１５／０２２５４６４号に記載されている。
ＡＢＭは、ターゲティング部分と第１の自然免疫アクチベーターとの間に位置し得る。ＡＢＭは、ターゲティング部分と第１の自然免疫アクチベーターとの間に直接的に、またはターゲティング部分とリンカースペーサーとの間、ターゲティング部分と第１のリンカーとの間、リンカーと第１の自然免疫アクチベーターとの間、もしくはスペーサーリンカーと第１の自然免疫アクチベーターとの間に、位置し得る。
自然免疫系アクチベーター
プロドラッグは、１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の自然免疫アクチベーターを含み得る。任意の自然免疫アクチベーターを用いることができ、それには、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよびインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、２つ以上のＴＬＲアゴニストの組合せ、または１つもしくは複数のＳＴＩＮＧアゴニストと１つもしくは複数のＴＬＲアゴニストの混合が挙げられる。例として、第１級または第２級脂肪族アミンなどの、連結のための脂肪族アミン基を有する任意の自然免疫アクチベーターを用いることができるが、他の反応基を有する自然免疫アクチベーターも同様に用いることができる。
ＴＬＲおよびＴＬＲアゴニスト
いくつかのＴＬＲは、原形質膜上に位置し得、一方、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のような他のものは、エンドソームの内側に位置し得、そこで、それらは、例えば細胞内病原体の核酸およびヌクレオチドを認識する。ＴＬＲ経路をターゲットすることは、抗ウイルスと抗腫瘍の両方の治療のストラテジーとして、Ｉ型インターフェロンおよび炎症性応答を誘導し得る。重要なことには、ＴＬＲ経路活性化は、樹状細胞成熟をもたらし、それに従って、抗原プロセシング／提示を増強し、最終的に、抗原特異的Ｔ細胞の活性化をもたらすことができる。
任意の哺乳動物ＴＬＲのアゴニストは、自然免疫系アクチベーターとして用いることができ、それには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３のリガンドが挙げられる。例示的なヒトＴＬＲには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０が挙げられる。例示的なＴＬＲリガンドおよび例示的なＴＬＲ発現は表１に示されている。
イミキモド（アルダラまたはＲ－８３７とも呼ばれる）およびガーディキモドなどの低分子合成ＴＬＲ７アゴニストは、自然免疫系アクチベーターとして用いることができる。ガーディキモドは、溶解性および効力が向上した、イミキモドの強力なＴＬＲ７類似体である。重要なことには、ガーディキモドは、化学的コンジュゲーションおよびプロドラッグ放出ストラテジーを可能にする反応性第２級脂肪族アミン基を有する。ＴＬＲ７は、腎細胞癌および他の癌を含む固形腫瘍に事実上、常に存在する自然免疫系の細胞において主に発現する。腫瘍微小環境へ送達された小分子ＴＬＲ７アゴニストは、バイスタンダー細胞へ拡散し、それに従って、炎症促進性場効果を引き起こすことができる。
ＴＬＲ９は、エンドソームにおいて細菌ＤＮＡ内の非メチル化ＣｐＧモチーフを感知する。それは、ＴＬＲ７のように、自然免疫応答の全ての活性化細胞コンポーネントにおいて発現している。追加として、ＴＬＲ９はまた、腎臓癌細胞および他の癌細胞、加えて内皮細胞の大部分においても発現している。古典的ＴＬＲ９アゴニストは、加水分解を防ぎ得るホスホロチオエート骨格を有する低分子ヌクレオチドである。腫瘍への注射後、これらのヌクレオチドは、取り込まれ、エンドソームにおいてそれらの受容体と結合し、その後、Ｉ型インターフェロン産生および炎症をもたらし、それに従って、腫瘍微小環境を再プログラミングすることができる。これは、腎臓癌細胞および他の癌細胞、加えて腫瘍血管構造への直接的な、ＴＬＲ９アゴニストのターゲット化送達を提供することができる。ＴＬＲ９アゴニストは、小分子ではなく、むしろ、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。拡散により膜を横断できるガーディキモドとは違って、ＴＬＲ９アゴニストは、拡散する可能性はあまりない。したがって、ＴＬＲ７／８は、より高い場効果を誘導することができ、ＴＬＲ９活性化は、標的細胞に依存する可能性がより高い。
プロドラッグは、１つまたは複数のＴＬＲアゴニストを自然免疫系アクチベーターとして含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、または混合性ＴＬＲ７／８アゴニストである。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、ガーディキモド、イミキモド、またはテルラトリモドである。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、ＯＤＮ－２３９５、ＣＭＰ－００１、またはＭＧＮ１７０３である。いくつかの実施形態において、混合性ＴＬＲ７／８アゴニストはレシキモドであり得る。
ＳＴＩＮＧおよびＳＴＩＮＧアゴニスト
プロドラッグは、１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを自然免疫系アクチベーターとして含み得る。ＳＴＩＮＧは、ＴＭＥＭ１７３遺伝子によりコードされる小胞体（ＥＲ）タンパク質であり、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達において細胞質ＤＮＡセンサーおよびアダプタータンパク質として機能する。ＳＴＩＮＧは、転写因子ＳＴＡＴ６およびＩＲＦ－３を、例えばＴＢＫ１を通して、活性化し、抗ウイルス応答、および細胞内病原体に対する自然免疫応答を確立することができる。ＳＴＩＮＧは、末梢リンパ系組織における造血細胞に発現し、その造血細胞には、例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、骨髄系細胞、および単球が挙げられる。ＳＴＩＮＧはまた、例えば、肺、卵巣、心臓、平滑筋、網膜、骨髄、および膣に高度に発現している。
ＳＴＩＮＧリガンドには、環状ジヌクレオチドおよびキサンテノン誘導体ＤＭＸＸＡが挙げられる。例示的な環状ジヌクレオチドには、ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＡＤＵ－Ｓ１００（ＭＩＷ１８５）、ＭＫ－１４５４、ＢＭＳ－９８６３０１、ＳＢ １１２８５、ＴＡＫ－６７６、ＭＡＶＵ－１０４、エキソＳＴＩＮＧ、ＣＲＤ５５００などが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧリガンドは、環状ジヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、環状ジヌクレオチドは、ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＡＤＵ－Ｓ１００（ＭＩＷ１８５）、ＭＫ－１４５４、ＢＭＳ－９８６３０１、ＳＢ １１２８５、ＴＡＫ－６７６、ＭＡＶＵ－１０４、エキソＳＴＩＮＧ、またはＣＲＤ５５００である。
例示的なプロドラッグ
例示的なプロドラッグは、例えば、（ｉ）細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と選択的に結合する１つまたは複数のターゲティング部分；（ｉｉ）１つまたは複数の酵素切断可能なリンカー；および（ｉｉｉ）１つまたは複数の自然免疫系アクチベーターを含む。プロドラッグの例は図７に示されている。
放射標識部分は、プロドラッグの放射性核種での標識のために用いることができる。標識は、イメージング、放射線療法、またはイメージングと放射線療法の両方のために有用であり得る。放射標識部分は、接合団によりプロドラッグへ連結され得る。
接合団には、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによるイメージングのために選択された放射性核種での放射標識のためのＤＯＴＡなどの二官能性キレーターを挙げることができる。
いくつかの実施形態において、接合団は、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、または７６Ｂｒから選択される放射性核種で標識するための部分を含み得る。
他の実施形態において、接合団は、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、１７７Ｌｕ、１１１Ｉｎ、および９９ｍＴｃから選択されるイメージングのための放射性核種で放射標識するための二官能性キレーターを含み得る。
いくつかの実施形態において、接合団は、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２２５Ａｃ、および２２７Ｔｈから選択される放射線療法のための放射性核種で放射標識するための二官能性キレーターを含み得る。
プロドラッグは、そのプロドラッグがイメージング、放射線療法、またはイメージングと放射線療法の両方に用いることができるように、放射標識を含み得る。接合団は、第２のリンカーによってプロドラッグへ連結され得る。
例えば、接合団は、機能イメージングに用いることができる。いくつかの実施形態において、機能イメージングは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）であり得る。
第２の自然免疫系アクチベーターは、炎症促進性分子を含み得る。任意の炎症促進性分子を用いることができ、それには、例えば、ＴＬＲアゴニストおよびＳＴＩＮＧアゴニストが挙げられる。自然免疫系の第２（または第３、第４、第５、もしくはそれ以上）のアクチベーターは、自然免疫系の第１のアクチベーターと同じかまたはそれと異なり得る。例えば、自然免疫系の第１のアクチベーターはＴＬＲアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、異なるＴＬＲアゴニストであり得る。別の例として、自然免疫系の第１のアクチベーターはＴＬＲアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、同じＴＬＲアゴニストであり得る。さらに別の例として、自然免疫系の第１のアクチベーターはＳＴＩＮＧアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、異なるＳＴＩＮＧアゴニストであり得る。さらなる例として、第１の自然免疫系アクチベーターはＳＴＩＮＧアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、同じＳＴＩＮＧアゴニストであり得る。なおさらなる例として、第１の自然免疫系アクチベーターはＳＴＩＮＧアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、ＴＬＲアゴニストであり得る。さらに別の例として、第１の自然免疫系アクチベーターはＴＬＲアゴニストであり得、第２の自然免疫系アクチベーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストであり得る。
第２（または第３、第４、第５、もしくはそれ以上）の自然免疫系アクチベーターは、本明細書に記載されているような別のリンカーによって、本明細書に提供されたプロドラッグへ連結され得る。キレート造影剤および／または放射性核種を含有する部分をプロドラッグへ連結するためのリンカー、ならびに自然免疫系アクチベーターをプロドラッグへ連結するためのリンカーは、お互いに同じかまたは異なり得る。これらのリンカーはまた、第１の自然免疫系アクチベーターをプロドラッグへ連結するためのリンカーと同じかまたは異なり得る。例として、自然免疫系アクチベーターなどの免疫原性分子が、プロドラッグへ酵素切断可能なリンカーによって連結され得、ＰＳＭＡ、ＣＡ９、またはａＶｂ３分子などのターゲティング部分は、ジアミンのリンカーによって連結され得る。例示的なプロドラッグは、（ｉ）細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合するターゲティング部分；（ｉｉ）酵素切断可能なリンカー；（ｉｉｉ）自然免疫系アクチベーター、および（ｉｖ）放射性核種含有部分を含み得る。（５ａ）ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１９Ｆ］ＳＦＢおよび（５ｂ）ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢの例は図７Ａに示されている。
癌を処置する方法
対象において癌を処置する方法が提供される。方法は、癌を処置するのに有効な、本明細書で提供されたプロドラッグの量を対象に投与するステップを含み得る。本明細書で提供されたプロドラッグのいずれも癌を処置するために用いることができる。
本明細書で用いられる場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」、「治療の」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指し、その効果には、進行を緩和し、遅らせ、または遅くすること、効果または症状を低下させること、発症を防止すること、疾患または障害の発生を阻害し、寛解させること、疾患、障害、または医学的状態に関する有益なまたは所望の結果、例えば治療効果および／または予防効果を得ることが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、それには、疾患を阻害すること、すなわち、それの発生を抑止すること、および疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことが挙げられる。ある実施形態において、処置は、疾患の１つまたは複数の症状の低下または緩和を引き起こす。治療効果には、処置されることになっている、根底にある障害の根絶または寛解が挙げられる。また、対象が、根底にある障害に未だ苦しめられ得るにしても、対象において改善が観察されるような、根底にある障害に関連した生理学的症状の１つまたは複数の根絶または寛解を以て、治療効果が達成される。ある実施形態において、本明細書における化合物の投与は、疾患に罹りやすくまたは疾患に罹るリスクがあるが、まだそれを有するとは診断されていない対象において、疾患が発生するのを防ぐことができる。場合によっては、予防効果について、プロドラッグまたは組成物は、特定の疾患を発生するリスクがある対象、または疾患の診断がなされていない可能性があるとしても、疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、投与される。本開示の方法は、任意の哺乳動物または他の動物に関して用いることができる。場合によっては、処置は、１つまたは複数の症状の減少または停止を生じ得る。予防的効果には、疾患もしくは状態の出現を遅らせもしくは排除すること、疾患もしくは障害の症状の発生を遅らせもしくは排除すること、疾患もしくは障害の進行を遅くし、停止させ、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、本明細書に開示された方法が実施される任意の個体または患者を指す。用語「対象」は、用語「個体」または「患者」と交換可能に用いることができる。対象は、ヒトであり得るが、当業者によって認識されているように、対象は動物であり得る。したがって、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど、および霊長類（例えば、サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラ）などの哺乳動物を含む他の動物が、対象の定義内に含まれる。
用語「有効量」または「治療的有効量」は、意図された適用、例えば、非限定的に、本明細書に定義されているような疾患処置に影響するのに十分である、本明細書に記載されたプロドラッグまたは組成物の量を指す。治療的有効量は、意図された処置適用（インビボ）、または処置されることになっている対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに依存して、異なり得、それは、当業者によって容易に決定することができる。その用語はまた、標的細胞において特定の応答を誘導するだろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択された特定のプロドラッグまたは組成物、従われるべき投与計画、それが他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与時期、それが投与される組織、およびそれが運ばれる身体的送達系に依存して異なる。
本明細書で提供された方法を用いて、任意の癌を処置することができるが、その癌には、例えば、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、乳癌、子宮頚癌、卵巣癌、脳癌、または造血器癌が挙げられる。いくつかの実施形態において、癌を処置することはさらに、免疫療法の投与の前、それと同時、またはそれの後に、プロドラッグを投与することを含む。例えば、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約１分後もしくは前、３０分後もしくは前、６０分後もしくは前、９０分後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約２時間後もしくは前、５時間後もしくは前、１２時間後もしくは前、２４時間後もしくは前、３６時間後もしくは前、４８時間後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約３日後もしくは前、５日後もしくは前、７日後もしくは前、１４日後もしくは前、２１日後もしくは前、２７日後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。任意の免疫療法が、癌の処置のために投与することができる。免疫療法には、例えば、活性化免疫療法での処置および抑制免疫療法での処置が挙げられる。活性化免疫療法は、免疫応答を誘発または活性化し、一方、抑制免疫療法は、免疫応答を低下させまたは抑制する。免疫療法には、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬（ＩＭｉＤ）などの免疫調節剤での処置を挙げることができる。任意のインターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、または免疫調節性イミド薬（ＩＭｉＤ）が、免疫療法に用いることができる。免疫療法のための例示的なインターロイキンには、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３が挙げられる。免疫療法のための例示的なサイトカインには、インターフェロン、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＭ－ＣＳＦが挙げられる。免疫療法のための例示的なケモカインには、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、およびＣＸＣＬ７が挙げられる。例示的なＩＭｉＤには、サリドマイドおよびそれの類似体レナリドミド、ポマリドミド、ならびにアプレミラストが挙げられる。他の免疫調節剤には、例えば、シトシンリン酸－グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、およびグルカンが挙げられる。
癌免疫療法は、一般的に、癌細胞および腫瘍を破壊するための免疫系の刺激を含む。例示的な癌免疫療法には、患者のＴ細胞へキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するＣＡＲ－Ｔ細胞治療が挙げられる。その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者の血流へ導入されて、養子細胞移入（ＡＣＴ）により癌を処置する。ＣＡＲは、一般的に、癌細胞の細胞表面上に発現した抗原をターゲットすることができる抗原認識ドメイン、および１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む。このように、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的抗原を発現する癌細胞をターゲットして、破壊することができる。例示的なＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、チサゲンレクロイセル（ＫＹＭＲＩＡＨ）およびアキシカブタゲンシロルユーセル（ＹＥＳＣＡＲＴＡ）が挙げられる。
癌免疫療法はまた、ＡＣＴの別の型である、ＴＣＲ治療を含み得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療と類似して、Ｔ細胞が患者から採取され、再設計され、患者へ導入される。ＡＣＴのさらなる型は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）治療を含む。患者由来のＴＩＬは、患者の腫瘍組織から単離され、インビトロで増殖され、その後、患者へ導入される。
癌免疫療法のさらに別の型には、モノクローナル抗体での処置が挙げられる。免疫療法に用いられるモノクローナル抗体は、裸の状態、すなわち、非コンジュゲート型であるか、またはコンジュゲート型、すなわち、それらに化学療法薬もしくは放射性粒子が付着し得る。モノクローナル抗体に加えて、例えばインターロイキンおよびサイトカインなどの他の分子が、癌細胞をターゲットするためにコンジュゲートされ得る。例として、デニロイキンジフチトクス（ＯＮＴＡＫ）は、ジフテリア毒素に付着したＩＬ－２を含む。さらに、癌免疫療法のためのモノクローナル抗体は、二重特異性であり得、すなわち、２つの異なるタンパク質を認識しかつそれと結合するようにデザインされ得る。このように、二重特異性モノクローナル抗体は、例えば、癌細胞の表面上の１つより多い抗原を認識することができる。別の例として、二重特異性抗体は、癌細胞上のタンパク質または抗原、および免疫細胞上のタンパク質または抗原を認識し、それにより、免疫細胞が癌細胞を攻撃するのを促進することができる。
癌を処置するための例示的なモノクローナル抗体には、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、アドトラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））が挙げられる。
さらなる癌免疫療法には、癌細胞に対する免疫応答を誘発する癌ワクチンが挙げられる。
さらに別の癌免疫療法は、チェックポイント阻害剤治療を含む。チェックポイント阻害剤治療は、免疫系機能に影響する免疫チェックポイントを使用またはターゲットする癌処置の一種である。免疫チェックポイントは、刺激性または阻害性であり得る。腫瘍は、免疫系攻撃から自分自身を保護するためにこれらのチェックポイントを使用することができる。チェックポイント治療は、阻害性チェックポイントをブロックして、免疫系機能を回復させることができる。チェックポイントタンパク質には、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤＣＤ１、ＰＤ－１；ＣＤ２７９としても知られている）およびそれのリガンド、ＰＤ－１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ａ２ＡＲ（アデノシンＡ２Ａ受容体）、Ｂ７－Ｈ３（またはＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（またはＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター、またはＣＤ２７２）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子－３）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）、およびＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）が挙げられる。
ＰＤ－１およびＣＤ２７９（表面抗原分類（cluster of differentiation）２７９）としても知られた、プログラム細胞死タンパク質１は、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより、免疫系を下方制御しかつ自己寛容を促進することにおいて重要な役割を果たす細胞表面受容体である。理論に囚われるつもりはないが、ＰＤ－１は、免疫チェックポイントであり、リンパ節中の抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進し、同時に、制御性Ｔ細胞（抗炎症、抑制性Ｔ細胞）におけるアポトーシスを低下させる、二重機構を通して自己免疫から保護する。
ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有する。ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＬＰＳおよびＧＭ－ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）において、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達によりＴ細胞およびＢ細胞において、上方制御されるが、例えば、休眠時のマウスにおいて、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡは、心臓、肺、胸腺、脾臓、および腎臓において検出することができる。ＰＤ－Ｌ１は、ＩＦＮ－γでの処理により、ＰＡ１ミエローマ、Ｐ８１５マスト細胞腫、およびＢ１６ミエローマを含むほとんど全てのマウス腫瘍細胞株に発現する。ＰＤ－Ｌ２発現は、より制限されており、主にＤＣおよび少数の腫瘍株により発現している。
免疫抑制性ＰＤ－１リガンドである、ＰＤ－Ｌ１は、いくつかの癌および多くの腫瘍細胞において発現している。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の阻害は、インビトロでＴ細胞応答を増強し、前臨床抗腫瘍活性を媒介することができる。ＰＤ－１をターゲットするモノクローナル抗体は、癌の処置のために免疫系をブーストすることができる。
ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られた、ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、免疫チェックポイントとして機能して、免疫応答を下方制御するタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞に構成的に発現しているが、一般的には、活性化後の通常のＴ細胞中、特に癌において、上方制御される。ＣＴＬＡ４は、活性化Ｔ細胞によって発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞へ阻害性シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８と相同であり、両方の分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれ、Ｂ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）と結合する。理論に囚われるつもりはないが、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に、ＣＤ２８より高い親和性および結合活性で結合し、それゆえに、それが、それのリガンドにおいてＣＤ２８を打ち負かすことを可能にする。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞へ阻害性シグナルを伝達し、一方、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４はまた、制御性Ｔ細胞においても見出され、それの阻害機能に寄与する。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を通してのＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ－４の発現の増加をもたらす。
いくつかのチェックポイント阻害剤が、癌を処置するために用いることができる。ＰＤ－１阻害剤には、例えば、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））およびニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１阻害剤には、例えば、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、およびデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））が挙げられる。ＣＴＬＡ－４阻害剤には、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））が挙げられる。他のチェックポイント阻害剤には、例えば、抗Ｂ７－Ｈ３抗体（ＭＧＡ２７１／エノブリツズマブ）、抗ＫＩＲ抗体（リリルマブ）、および抗ＬＡＧ３抗体（ＢＭＳ－９８６０１６）が挙げられる。任意のチェックポイント阻害剤を、本明細書に記載された方法において用いることができる。
本明細書で提供されたプロドラッグは、本明細書で提供された方法において、任意の免疫療法または任意の免疫療法の組合せと共に投与することができる。プロドラッグは、それが併用投与される任意の免疫療法または免疫療法の組合せと相乗的であり得る。本明細書で用いられる場合、「相乗的な」とは、２つ以上の薬物の総合効果が、各薬物の個々の効果の和より大きいことを意味する。
いくつかの実施形態において、免疫療法は、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ療法、モノクローナル抗体、癌ワクチン、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組合せを含む。
投与の型および用量
プロドラッグは、任意の経路により投与することができ、その経路には、経口的に、十二指腸内に、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または点滴による）、局所的に、または直腸性になどが挙げられる。プロドラッグは、所望の処置結果を生じるように、任意の用量および任意の頻度で投与することができる。例えば、プロドラッグは、約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与することができる。プロドラッグはまた、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、および間の任意の数または範囲の用量で投与することができる。投与は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、またはそれ以上であり得る。本明細書で提供されたプロドラッグは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、またはそれ以上の間、投与することができる。１日１回または複数回与えられる特定の用量における特定の期間の間の投与が、処置のサイクルを構成し得る。処置のサイクルは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、またはそれ以上の回復時間後、繰り返すことができる。プロドラッグでの処置の単一サイクルまたは１サイクルより多くが投与され得る。処置のコースの間、任意の数のサイクルが、投与され得る。処置の単一コースまたは１コースより多くが、投与され得る。
イメージングの方法
方法は、例えば、（ｉ）細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合する１つまたは複数（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のターゲティング部分；（ｉｉ）１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の酵素切断可能なリンカー；（ｉｉｉ）１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の自然免疫系アクチベーターを含むプロドラッグを対象に投与するステップを含み得る。酵素切断可能なリンカーは、ターゲティング部分を自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結することができる。プロドラッグはさらに、キレート性部分を含み得る。免疫療法が、任意で、プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に投与され得る。例えば、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約１分後もしくは前、３０分後もしくは前、６０分後もしくは前、９０分後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約２時間後もしくは前、５時間後もしくは前、１２時間後もしくは前、２４時間後もしくは前、３６時間後もしくは前、４８時間後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約３日後もしくは前、５日後もしくは前、７日後もしくは前、１４日後もしくは前、２１日後もしくは前、２７日後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。イメージングは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、またはその組合せを対象に実施することを含み得る。
任意の免疫療法が、プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫療法は、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ療法、モノクローナル抗体、癌ワクチン、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組合せの投与を含む。
癌の処置をモニターする方法
癌の処置は、本明細書で提供された方法を用いて、モニターすることができる。方法は、例えば、（ｉ）細胞外腫瘍抗原などの細胞外抗原と特異的に結合する１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のターゲティング部分；（ｉｉ）１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の酵素切断可能なリンカー；（ｉｉｉ）１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の自然免疫系アクチベーターを含むプロドラッグを対象に投与するステップを含み得る。酵素切断可能なリンカーは、ターゲティング部分を自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結することができる。プロドラッグはさらに、キレート造影剤を含み得、そのキレート造影剤は、イメージングの目的のためのそれのコントラスト性質を維持しながら、それの毒性を克服するように、身体内のガドリニウムの分布を改変する。免疫療法が、任意で、プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に投与され得る。例えば、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約１分後もしくは前、３０分後もしくは前、６０分後もしくは前、９０分後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約２時間後もしくは前、５時間後もしくは前、１２時間後もしくは前、２４時間後もしくは前、３６時間後もしくは前、４８時間後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。別の例において、プロドラッグは、免疫療法の投与の、約３日後もしくは前、５日後もしくは前、７日後もしくは前、１４日後もしくは前、２１日後もしくは前、２７日後もしくは前、またはそれより後もしくは前に投与され得る。イメージングは、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、またはその組合せを対象に実施することを含み得る。
本明細書に記載された手順は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の通常の技術を用いる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（定期的更新を含む）（１９９２）；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）；Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻、Ｗｕら編；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ～ＩＶ巻、Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８８）；Ｆｉｒｅら、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（２００５）；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２００５）；Ｅｎｇｅｌｋｅ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｇｏｔｔ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００４）；ならびにＳｏｈａｉｌ、Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ（２００４）参照）。
組成物および方法は、より具体的に下で記載され、本明細書に示された実施例は、それらにおける多数の改変およびバリエーションが当業者に明らかであるように、例証を目的とするのみである。本明細書に用いられる用語は、一般的に、本明細書に記載された組成物および方法の文脈内、ならびに各用語が用いられている特定の文脈での、当技術分野におけるそれらの普通の意味をもつ。いくつかの用語は、組成物および方法の記載に関して実行者に追加のガイダンスを提供するために、本明細書においてより具体的に定義されている。
本明細書で用いられる場合、用語「および／または」は、その関連して列挙された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる組合せを含む。本明細書における説明において、および以下に続く特許請求の範囲を通じて用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈上、明らかに他に指図がない限り、単数形の指示物に加えて、複数形の指示物を含む。数値に関連した用語「約」は、その値が、上下に５％だけ、変動することを意味する。例えば、約１００の値について、９５～１０５（または９５から１０５の間の任意の値）を意味する。
本明細書におけるどこかで言及された全ての特許、特許出願、および他の科学的または技術的著作物は、全体として本明細書に参照により組み入れられている。本明細書で実例として記載された実施形態は、本明細書に具体的に開示され、または具体的には開示されていない任意の要素、限定の非存在下でも、適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書における各場合において、用語「含むこと」、「から本質的になること」、および「からなること」のいずれも、それらの普通の意味を保持しながら、その他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられ、制限の用語として用いられることはなく、そのような用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはその一部分のいかなる等価物も排除するつもりはなく、様々な改変が特許請求の範囲の範囲内で可能であると認識されている。したがって、本方法および組成物が実施形態により具体的に開示されているが、本明細書で開示された概念の任意の特徴、改変、およびバリエーションが、当業者によって講じられ得、しかも、そのような改変およびバリエーションが、本説明および添付の特許請求の範囲により定義されているような組成物および方法の範囲内であると理解されるべきである。
本明細書に記載された任意の単一の用語、単一の要素、単一の句、用語の群、句の群、または要素の群は、それぞれ、特許請求の範囲から具体的に排除することができる。
本明細書に範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、組成または濃度範囲が示されている場合はいつでも、全ての中間の範囲および部分的範囲、加えて、示された範囲に含まれる全ての個々の値が、本開示に含まれることを意図される。本明細書における説明に含まれる任意の部分的範囲、または範囲もしくは部分的範囲における個々の値は、本明細書における態様から排除され得ることは理解されているだろう。本明細書における説明に含まれる任意の要素または段階は、主張された組成物または方法から排除され得ることは理解されているだろう。
加えて、組成物および方法の特徴または態様が、マーカッシュ群または代替の他の群化の表現で記載される場合、その組成物および方法がまた、マーカッシュ群または他の群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してそれらにより記載されることを当業者は認識しているだろう。
以下は、例示のみを目的とし、上記で広義の用語で記載された実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。
この実施例は、ＴＬＲアゴニストプロドラッグのデザインを記載する。
ＴＬＲアゴニストの全身性送達が、用量規制毒性、特にＴＬＲ７アゴニストに対する、宿主の一般的な炎症応答、および／または効力の制限により、望ましくないため、ＴＬＲアゴニストの送達は、一般的に、例えば、週１回の頻度で、繰り返されなければならない局所的または腫瘍内注射に限定される。ＴＬＲアゴニストの臨床開発は、特に、例えば、腎臓癌における再発の最も頻繁に発生する部位である、肺のような深在性転移に関して、例えば、出血、器官損傷、感染、および費用のリスクなどの追加の送達障壁によってさらに阻まれる。腫瘍不均一性は、ＴＬＲアゴニストの局所的または腫瘍内送達の価値が制限される別の理由となる。例えば、たいていの癌のように、転移性腎臓癌は、クローン進化を起こしている。いくつかの腫瘍病巣は、他のものとは免疫学的に異なる。したがって、腫瘍環境の外側の全般的な炎症状態を防ぎながら、全ての患者において全ての転移に炎症を引き起こすことと比較して、患者あたり１～２つの腫瘍への限定された注射は、一般的に、最大限の可能な利益を生じることにはならないだろう。例えばＴＬＲアゴニストの、送達のための炎症促進性プロドラッグのデザインは、プロドラッグの全身注射および標的細胞におけるプロドラッグ活性化を可能にし，それに従って、全身性ＴＬＲアゴニスト送達の望ましくない効果を克服する。
ＴＬＲアゴニスト
炎症促進性プロドラッグは、例えばＴＬＲアゴニストの、送達のためにデザインすることができる。ある実施形態において、任意のＴＬＲのアゴニストが、炎症促進性プロドラッグのデザインにおいて用いることができる。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９の発現ならびにＴＬＲ７およびＴＬＲ９の例示的なアゴニストは、表２に示されている。
ＴＬＲ７およびＴＬＲ９アゴニストプロドラッグは、点滴を通して、腎明細胞癌転移などの癌転移に送達することができる。全てのまたはほとんど全ての癌転移へ、プロドラッグが到達することができ、その結果として、有意に向上した免疫療法を生じる。
プロドラッグ送達の標的
腎臓癌におけるプロドラッグのターゲット化送達は、ａ）腫瘍の微小環境の腎臓癌細胞に特異的であり、ｂ）腎明細胞癌症例の大部分において発現し、および／またはｃ）薬物開発に適した確証されたプローブを有する、確証された表面タンパク質の使用を含み得る。転移性腎臓疾患の大部分を占める腎明細胞癌は、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）および前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）などの特徴的な高品質のマーカーを有し、そのマーカーは、プロドラッグの選択的および効果的送達のために用いることができる。
炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）は、腎明細胞癌細胞上に高度かつ特異的に発現する細胞表面タンパク質である。腎明細胞癌は、ＶＨＬタンパク質の喪失、変異、またはサイレンシングにより分子的に定義され、それは、低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ１／２）の劇的な上方制御をもたらし、それが、次に、腎明細胞癌の９５％において、ＣＡ９の非常に高い発現レベルをもたらす。したがって、ＣＡ９は、正常組織において限られた発現のみを有する、価値の高いマーカー／標的である。例えば、ＣＡ９発現は、腸において最小であり、胆樹において低い。
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺癌の表面上および多くの固形腫瘍（例えば、腎臓癌、乳癌、および肺癌）の新生血管上に発現している。ＰＳＭＡは、転移性前立腺癌のイメージングおよび放射性プローブでのそれの処置に用いることができ、腫瘍へ放射線を送達し得る低分子プローブの臨床的有用性および価値を実証している。腎明細胞癌の豊富かつ高密度な新生血管は、確実に、高レベルのＰＳＭＡを発現している。
理論に囚われるつもりはないが、放射性標識プローブのＰＳＭＡターゲット化送達とは対照的に、ＴＬＲ会合は可逆的であり、薬物を控えることにより、またはコルチコステロイドを投与することにより、対抗され得る。加えて、少なくともＴＬＲ７アゴニズムに関して、主要な標的は、Ｔ細胞と違って、たいていの癌において多数、存在するが、正常な生理的組織においては大量には存在しない自然免疫細胞であり、それゆえに、有害効果のリスクを低下させる。
ＣＡ９およびＰＳＭＡは、腎明細胞癌に発現し、しかも、癌細胞の大部分が、ＣＡ９を介してターゲットすることができ、一方、癌関連血管は、ＰＳＭＡを介してターゲットすることができる。
リンカー
不適切なリンカーデザインは、多数のプロドラッグアプローチの失敗をもたらしてきた。したがって、血清中のプロドラッグの安定性および標的細胞の内側でのタイムリーかつ適切な放出が、プロドラッグデザインのために考慮されるべきである。追加として、ＴＬＲ７アゴニストは、それらの薬理学的活性を回復するためにそれらのリンカーの無痕跡型遊離を必要とする低分子である。真正のカテプシンＢ切断可能な基質である、ペプチドリンカーであるバリン－シトルリン（ＶＡＬ－ＣＩＴ）が、試験のために選択された。カテプシンＢはリソソーム内のみ存在するため、内部移行したプロドラッグは、細胞の内側でのみ切断され、それが、次に、自己犠牲的パラアミノベンジルアルコールを不安定化し、最終的に、無痕跡様式で、ガーディキモドなどのＴＬＲ７アゴニストを放出する。このデザインは、患者の利益を最大限にするための最も高い翻訳可能性を有するプロドラッグを開発する望みを汲み上げている。
ＴＬＲ９アゴニスト／オリゴヌクレオチドについては、洗練されたリンカー系をあまり必要としない。これらの分子は、サイズがかなり大きく、刺激活性を損失することなく、共有結合で連結することができる。ある実施形態において、プロドラッグは、酸性条件によるか、またはＣＡ９もしくはＰＳＭＡ表面受容体の最終的なタンパク質分解によるかのいずれかで、リソソームにおいてそれの表面受容体から放出され得る。次に、そのオリゴヌクレオチドは、それの同族受容体、すなわち、ＴＬＲ９と結合し、ＴＬＲシグナル伝達経路に関与することができる。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグＰＳＭＡ－ＴＬＲ７のデザイン、合成、および試験を記載する。
プロドラッグＰＳＭＡ－ＴＬＲ７（図１）を合成し、精製し、ＰＳＭＡを発現する細胞株（ＬｎＣＡＰ、ＨＥＫ２９３ Ｂｌｕｅ ＴＬＲ７ ＰＳＭＡ）か、またはＰＳＭＡを発現しない細胞株（ＲＥＮＣＡ、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＴＬＲ７）のいずれかとの細胞培養において試験した。ＲＥＮＣＡおよびＬｎＣＡＰ細胞を、対照、プロドラッグ、またはプロドラッグおよび強力なＰＳＭＡ阻害剤、すなわち、２－ホスホノメチルペンタン二酸（ＰＭＰＡ）（ＰＳＭＡプローブとそれらの結合部位において競合する）に曝した。２４～４８時間後、細胞を収集し、エタノールで抽出した。抽出物を乾燥させ、その後、細胞培養培地へ再懸濁し、その後、それを、ＰＳＭＡ陰性ＴＬＲ７受容体細胞株に少なくとも２４時間、アプライした。アルカリホスファターゼ活性の比色基質をアプライし、分光光度法を用いて測定した。そのデータは、ＰＭＰＡが、プロドラッグと競合することができ、細胞表面ＰＳＭＡを介する特異的取込みを示唆した（図２）。
ＰＳＭＡ陰性ＴＬＲ７ ＨＥＫ Ｂｌｕｅ細胞株に、ヒトＰＳＭＡ遺伝子を有するレンチウイルスを安定的に形質導入した。形質導入は、約５％のＰＳＭＡ陽性細胞のサブセットをもたらした（図３、ＰＳＭＡ ＦＩＴＣ発現）。ＰＳＭＡ陰性細胞とＰＳＭＡ陽性細胞の両方を、アルカリホスファターゼ比色基質と共にＰＳＭＡ１１－ＴＬＲ７プロドラッグに曝した。ＰＳＭＡ陰性細胞株における細胞は、ＴＬＲ７標的会合を報告しなかった。しかしながら、混合集団において、ＴＬＲ７受容体刺激を報告する細胞が明らかに存在した。
まとめると、データは、プロドラッグの標的／ＰＳＭＡ特異的取込みを示唆するだけでなく、血清含有培地における有意なプロドラッグ安定性も示している。理論に囚われるつもりはないが、血清安定性は、カテプシンＢ選択的プロドラッグ応答の考えられ得る結果である。アジド－ｐｅｇ化－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰリンカーは、血清において非常に安定しており、細胞内でのみカテプシンＢにより切断され、ガーディキモドなどの小分子の無痕跡型放出を可能にする。さらに、これらの結果は、炎症促進性プロドラッグのデザインおよび試験の成功を示している。理論に囚われるつもりはないが、プロドラッグは、腎明細胞癌またはそれの腫瘍微小環境についての２つの重要な表面マーカーと結合するようにデザインされ、標的細胞のリソソームにおけるそれらの選択的放出をもたらし、その後、ＴＬＲ経路に関与して、有意な炎症応答をもたらす（図４）。
この実施例は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のプロドラッグのデザインを記載する。
ＰＳＭＡおよびＣＡ９を発現する細胞をターゲットするＴＬＲ７およびＴＬＲ９のプロドラッグをデザインした。理論に囚われるつもりはないが、ＰＳＭＡをターゲットするプロドラッグは、腎臓血管をターゲットするようにデザインされ、一方、腎明細胞癌のＣＡ９細胞表面タンパク質をターゲットするプロドラッグは、腫瘍細胞をターゲットするようにデザインされる。
ターゲティングコンポーネント（すなわち、ＰＳＭＡおよびＣＡ９）、加えて炎症性ペイロードのケミストリーを、モジュラー形式でデザインした。これは、単純な「クリック合成」を可能にして、４つの異なる分子：ＰＳＭＡ－ＴＬＲ７、ＰＳＭＡ－ＴＬＲ９、ＣＡ９－ＴＬＲ７、およびＣＡ９－ＴＬＲ９を作製する。クリック合成は、アルキン基とアジド基の間の効率的かつ選択的な銅媒介性カップリング反応を表す。ＰＳＭＡターゲティング性グルタミン－尿素－リジンの主鎖と二重モチーフＣＡ９リガンドを、７－オクチン酸と、標準ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）媒介性ペプチド結合形成を用いて、反応させた。これは、疎水性リンカーを有する両方のターゲティング部分を備え、ＰＳＭＡ結合にとって重要なだけでなく、次のクリック合成のための必要とされるアルキン基も導入する。
リンカー系は、それぞれの炎症ペイロードによって異なる。ガーディキモドは、強力な小分子ＴＬＲ７アゴニストであり、いったんそれが、より大きい分子と共有結合で連結されると、活性を生じない。この分子は、可逆的な／切断可能なリンカー系と共に送達することができる。選択され得るいくつかの可能な選択肢（例えば、ジスルフィド結合）があるが、ガーディキモドの無痕跡型放出を可能にする非常に安定な自己犠牲システムを、試験のために選択した。アジド－ｐｅｇ化－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰリンカー系（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）を用いた。このリンカーは、ヒト血清において極めて安定であり、ＴＬＲ７／９受容体が位置する場所であるリソソームの内側のカテプシンＢによってのみ切断される。重要なことには、ガーディキモドは、リンカーのニトロフェニル炭酸基と高収率で容易に反応する第２級脂肪族アミンを有する。
ＴＬＲ９アゴニストＯＤＮ－２３９５を、試験のために選択した。ＯＤＮ－２３９５は、安定化ホスホロチオエート骨格を有するＩＩＩ型ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、マウスおよびヒトの細胞において強力なＴＬＲ９刺激活性を有する。ガーディキモドとは対照的に、ＴＬＲ９オリゴヌクレオチドは、活性を喪失することなく、他の分子と共有結合で連結することができる。したがって、ＴＬＲ９アゴニストのために、より単純なリンカー系を選択した。ＯＤＮ ２３９５（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ－３’）（配列番号１）は、５’チオール修飾（ＩＤＴ ＤＮＡ）と共に、カスタム製造され、その後、単純なマイケル付加反応において、市販のアジド－ｐｅｇ－マレイミドリンカー（Ｋｅｒａｆａｓｔ）へ連結される。その後、このペイロードは、上記のようにＰＳＭＡかまたはＣＡ９のいずれかのターゲティング部分へクリックすることができる。全ての合成産物は、標準クロマトグラフィー手順を用いて精製され、それらのアイデンティティは、質量分析法で確認される。
図５は、プロドラッグビルディングブロックのモジュラーデザインを示す。ターゲティングコンポーネント上のアルキン基は、ＴＬＲペイロードのアジドへ、銅（Ｉ）媒介性「クリック合成」で連結される。ＰＭＳＡをターゲットするＴＬＲ７プロドラッグの合成のためのストラテジーは、図６の上部に示されている。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９アゴニストを有する、ＰＳＭＡおよびＣＡ９をターゲットする４つのプロドラッグは、図６の下部に示されている。ＰＳＭＡターゲティングＴＬＲ７プロドラッグの構造は図７（プロドラッグ（１）～（４））に示されている。
この実施例は、プロドラッグのインビトロ特徴づけを記載する。
血清中のプロドラッグの安定性、それらの標的に対するそれらの結合親和性、ＴＬＲレポーター活性およびマウス腎臓癌細胞株へのそれらの効果を決定することができる。理論に囚われるつもりはないが、細胞表面タンパク質ＣＡ９およびＰＳＭＡをターゲットする免疫療法プロドラッグは、細胞に入り、それらのカーゴを放出し、ならびに標的細胞におけるＴＬＲ経路を刺激することができる。
血清中安定性アッセイ。プロドラッグは、ＰＢＳ、１０％ＦＢＳを含む細胞培養培地、加えて１００％ヒトおよび１００％マウスの血清において、１０マイクロＭの濃度で、３７℃で最長１週間、インキュベートされ得る。毎日、試料を取り出し、アセトニトリルで抽出し、質量分析法に供する。試料を、ＬＣ－ＭＳに供し、遊離ＴＬＲ７／非コンジュゲート型ＴＬＲ９アゴニストおよびそれらの無傷プロドラッグの標準曲線と比較する。レプリケートアッセイの日内および日間の実行精度および正確度は、変動係数のパーセンテージにより評価される（ＧｒａｐｈＰａｄ）。
プロドラッグの結合親和性。競合蛍光偏光アッセイは、それぞれの標的に対する結合親和性を決定するために用いることができる。ＰＳＭＡおよびＣＡ９プロドラッグのターゲティングモジュールを、アジドＦＩＴＣ誘導体へクリックし、精製する。組換えＣＡ９およびＰＳＭＡタンパク質（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、段階希釈濃度の精製プロドラッグとインキュベートする。ＦＩＴＣ標識リガンドを加え、蛍光偏光測定を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ様式マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ＨＴＳ ｃｏｒｅ）において実施する。実験を、３連で行い、５０％応答を生じる濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）において、シグモイド用量反応回帰関数を用いて計算する。この情報は、プロドラッグの将来的な最適化考察に有用である。
ＴＬＲ７／ＴＬＲ９プロドラッグの標的会合。ガーディキモドおよびＯＤＮ－２３９５のどちらも、それぞれ、ヒトおよびマウスのＴＬＲ７およびＴＬＲ９受容体に会合する。ヒトＴＬＲ７／ＴＬＲ９ ＨＥＫ２９３ Ｂｌｕｅレポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に、細胞表面ＰＳＭＡまたはＣＡ９の安定な発現を強制するレンチウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ａｄｄｇｅｎｅ）を形質導入することができる。細胞を、フローサイトメトリーによりソートし、その後、様々な濃度におけるプロドラッグに２４～４８時間、曝すことができる。誘導されたアルカリホスファターゼ活性の比色検出を実施する。ＥＣ５０濃度を、上記のようにＧｒａｐｈｐａｄを用いて、決定する。
マウス腎臓癌細胞株へのプロドラッグの効果。動物研究に用いられるＲＥＮＣＡ細胞株は、少なくともＴＬＲ７を発現することが報告されているので、野生型細胞、加えてＰＳＭＡおよびＣＡ９形質導入細胞へのプロドラッグの直接的効果を決定することができる。読み出しは、細胞増殖（細胞数）への効果、加えて、ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ）により決定される上清における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）およびインターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－ａ）のようなサイトカインの誘導への効果を含む。
ＰＳＭＡ－ＴＬＲ７についての予備データ（実施例２）は、上記で概要を示された合成アプローチの実行可能性を実証している。追加として、データは、ＰＳＭＡプロドラッグの特異的結合および取込み、加えて遊離ガーディキモドの放出を示唆する。ガーディキモドアプローチと同じ遊離リンカーは、共有結合で連結されたＴＬＲ９が十分な生物活性を示さないならば、用いることができる。
十分なプロドラッグ材料を動物研究のために作製する。各プロドラッグの少なくとも１０～２０ｍｇを、インビボ研究のために調製する。
この実施例は、腎細胞癌の同系マウスモデルにおけるＴＬＲ７およびＴＬＲ９プロドラッグの効力および免疫学的効果の決定を記載する。
マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）における唯一現存する移植可能な同系腎細胞癌モデルはＲＥＮＣＡモデルである。この腫瘍モデルは、古典的明細胞組織像ではないが、それは、以下の２つの顕著な特徴を有し、それらによって、それは利用可能な最良の臨床前モデルとなっている：１）それは、いくつかの臨床前免疫療法研究において、主にＩＬ－２に関して、確証されている、および２）それは、ＰＤ１単剤療法に対して抵抗性である（それは、プロドラッグアプローチが克服しようとする問題である）。追加として、マウス腫瘍血管は、ＰＳＭＡを発現しない。したがって、マウス腫瘍血管上のＰＳＭＡ発現は、ＰＳＭＡ陽性細胞株に匹敵する。
ＰＳＭＡおよびＣＡ９形質導入細胞株を用いることができる。腫瘍を皮下に配置し、７～１０日以内に２００～３００ｍｍ３へ成長させる。典型的には、自然減を考慮して、１０匹のマウスの群に接種する。その後、８つのコホート（プロドラッグあたり２つ）を、週２回、ＩＶ注射により、プロドラッグの２つの異なる用量レベル、例えば、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇに曝す。１つの未処置コホートおよび遊離薬物で処置される１つのコホートが対照としての役割を果たす。動物を、毒性および体重減少についてモニターし、血漿中サイトカインについて血液を採取する。次の実験は、ＩＰで与えられた抗マウスＰＤ１阻害剤（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）と共に最も高い耐性用量における４つの異なるプロドラッグのコホート、およびＰＳＭＡ／ＣＡ９混合型腫瘍においてＴＬＲ７プロドラッグをＴＬＲ９プロドラッグと組み合わせるコホートを組み合わせる。薬物分布研究について、４匹の動物の４つのコホートを、各プロドラッグに曝し、腫瘍、肝臓、および腎臓の注射から６時間後、プロドラッグ分布レベルを、上記のようにＬＣ－ＭＳを用いて決定する。主要評価項目は、退縮として定義される腫瘍応答である。腫瘍体積は、ノギス測定（腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２））を用いて評価され、週３回、決定される。０．０５のアルファおよび０．１のベータを以て、単剤療法で処置されたマウスに対して併用処置されたマウスにおいて３０％のＲＲを決定するのに、１０匹のマウス／群が一般的に十分である。追加として、腫瘍浸潤免疫細胞を、マウス免疫細胞についての最適化多色表現型検査パネル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて特徴づけることができる。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いるフローサイトメトリーコア装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析する。ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、ＮＫ細胞などを含む、細胞数、ならびに処置群間のパーセンテージの比較について、必要に応じて、対応のないｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いる。Ｐ値＜０．０５が有意とみなされる。
用いることができる追加の細胞は、例えば、マウス前立腺癌細胞株ＭＹＣ－ＣＡＰを含む。ＭＹＣ－ＣＡＰ細胞に、ＰＳＭＡの発現のためのレンチウイルスベクターを形質導入する。ＭＹＣ－ＣＡＰ細胞におけるＴＬＲ７の発現を、ｑＰＣＲによって決定する。理論に囚われるつもりはないが、ＴＬＲ７アゴニストは、癌細胞において放出され、その後、自由に、骨髄系由来サプレッサー細胞および樹状細胞などの骨髄系バイスタンダー細胞へ拡散し、例えば、動物モデルにおいて炎症促進性場効果を生じる。例えば、増殖およびＩ型インターフェロンなどのサイトカインの誘導に関する、ＰＳＭＡ陽性およびＰＳＭＡ陰性ＭＹＣ－ＣＡＰ細胞へのプロドラッグの直接的なインビトロ効果を、それぞれ、ＭＴＴアッセイおよびＥＬＩＳＡにより決定する。ＰＳＭＡ陽性およびＰＳＭＡ陰性ＭＹＣ－ＣＡＰ細胞を、雄ＦＶＢマウスへ皮下注射により移植する。腫瘍を２００～３００ｍｍ３に成長させ、プロドラッグでの処置の効果を、上記のように分析する。
これらの研究は、ＴＬＲプロドラッグでの、特にＰＤ１阻害剤と共での全身的処置が、Ｔ細胞浸潤および抗腫瘍効果をもたらすことを示すためにデザインされている。２つの異なるＴＬＲアゴニストの組合せは、この設定において優秀であり得る。試験された初回量において抗腫瘍効果が見られない場合には、さらなる用量増大研究が実施される。理論に囚われるつもりはないが、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９アゴニストでの免疫療法プロドラッグは、同系腎癌モデルと腎癌患者の両方において免疫応答を誘導および／または増強するはずである。腫瘍自体における自然免疫応答の広範な活性化は、究極的に、変異型タンパク質に対してだけでなく、変異していないが過剰発現した腫瘍関連抗原、およびおそらく内因性レトロウイルスに対しても、Ｔ細胞媒介性適応免疫応答をもたらすはずである。
本明細書に記載された小さい薬物コンジュゲート（すなわち、プロドラッグ）は、合成するのが容易であり、かつ抗体－薬物コンジュゲートより好ましいＰＫを有する。本明細書に記載されたプロドラッグは、（ａ）キレート部分での同時イメージング、（ｂ）ベータ線またはアルファ線放射型放射性同位元素での併用療法、（ｃ）ペイロードを増加させること、（ｄ）例えばＴＬＲおよびＳＴＩＮＧアゴニストなどの様々な炎症促進性分子を組み合わせることのために用いることができる、異なる官能基の付着のためのマルチアームバリアントのデザインを可能にする多用途の化学的プラットフォームを提供する。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグのＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモドの合成を記載する（図１６Ａ）。
ガーディキモド（１６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／ＤＭＦ（４ｍＬ／２ｍＬ）中に希釈し、ＤＩＰＥＡ（６０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、窒素下、０℃において加えた。ＴＨＦ／ＤＭＦ（４ｍＬ／２ｍＬ）中アジド－ＰＥＧ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（３８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、この溶液へ０℃、液滴で加え、２４時間、撹拌し続けた。反応混合物を濃縮し、純粋なプロドラッグを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＣＨ２Ｃｌ２中１２％メタノール溶媒混合物から粘着性液体として単離した（１４ｍｇ、３０％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：９４７．５０；実測値：９４８．５２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
プロドラッグ３の合成（図１６Ｂ）。丸底フラスコにおいて、トリホスゲン（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に懸濁し、０℃で撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）中Ｃｂｚ－Ｌｙｓ－Ｏｔ－Ｂｕ．ＨＣｌ（１０ｇ、２７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１０．４ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）の溶液を、トリホスゲン溶液へ２．５時間かけて、液滴で加えた。その後、ＤＩＰＥＡ（１０．４ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（５０ｍＬ）を含有するＬ－グルタミン酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩（７．９６ｇ、２７ｍｍｏｌ）の溶液を、連続液滴で加え、６時間、撹拌した。その混合物を、乾燥状態まで濃縮し、１５０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、２Ｎ ＮａＨＳＯ４および鹹水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させて、黄色の油が生じた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（４：６、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）による精製により、透明の油として所望の産物が得られた。
ＰＳＭＡの合成。プロドラッグ３（６２１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中に希釈し、その混合物を、窒素で５分間、脱気し、続いて、活性炭（６０ｍｇ）上で１０％ Ｐｄを添加し、その混合物をさらに５分間、脱気した。その混合物を、室温で、３６時間、水素気球で水素付加し、その後、濾過し、セライトパッドに通してＤＣＭで洗浄した。その溶液を濃縮して、シロップを得、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨの１５％勾配で溶出して、ＰＳＭＡを透明無色のシロップとして得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：４８７．３３；実測値：４８８．３４（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
プロドラッグ（ｃ）の合成。プロドラッグ（ｂ）（２０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を１ｍｌ ＤＣＭ中に溶解し、Ｎ２下、２分間、撹拌した。この混合物へ、１ｍｌ ＴＦＡを加え、２時間、撹拌し続けた。生成物形成を、ＬＣ－ＭＳによって確認した。最終生成物を、減圧下での蒸発、続いて、セミ分取ＨＰＬＣにより得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：５１７．２３；実測値：５１８．２５（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
クリック反応によるＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモド（１）の合成（図９）。アスコルビン酸ナトリウム（１．５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４（０．４ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌ水中に溶解した。この溶液へ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．５ｍｌ：０．２ｍｌ）中のプロドラッグ（ａ）（１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）およびプロドラッグ（ｃ）（７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下、室温、液滴で加えた。その後、生じた混合物を２４時間、撹拌した。最終生成物は、減圧下での蒸発、続いて、２０分にわたる９０％から１０％までの溶媒Ａ（１０００ｍｌ水および１ｍｌ ＴＦＡ）のＨＰＬＣ、続いて、凍結乾燥により得られ、６ｍｇのＰＳＭＡ－カテプシン－ガーディキモド（１）を提供した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１４６４．７２；実測値：１４６５．７６（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグのＰＳＭＡ－Ｃ５－カテプシン－ガーディキモドの合成を記載する。
プロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡの合成（図１７Ａ）。ＰＳＭＡ（１２１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）および７－オクチン酸（３５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、窒素下、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に加えた。この溶液へ、ＨＢＴＵ（１８９ｍｇ、５０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１３０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）もまた加え、６時間、撹拌し続けた。反応混合物を、水と酢酸エチルの混合物から、有機層を収集することにより、抽出した。その有機層を、蒸発させ、純粋なプロドラッグを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＣＨ２Ｃｌ２中２％メタノール溶媒混合物から単離した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：６０９．４０；実測値：６１０．２６（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
プロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡの合成。プロパルギル－Ｃ５－ｔＢｕ－ＰＳＭＡ（１８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を、１ｍｌ ＤＣＭ中に溶解し、Ｎ２下、２分間、撹拌した。この混合物へ、１ｍｌ ＴＦＡを加え、２時間、撹拌し続けた。生成物形成を、ＬＣ－ＭＳにより確認した。最終生成物のプロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡは、減圧下での蒸発、続いて、セミ分取ＨＰＬＣにより得られた。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：４４１．２１；実測値：４４２．１１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
アスコルビン酸ナトリウム（３ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４（１．２ｍｇ、０．００７２ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌ水中に溶解した。この溶液へ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．５ｍｌ：０．２ｍｌ）中プロドラッグ（ａ）（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）およびプロパルギル－Ｃ５－ＰＳＭＡ（４．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下、室温、液滴で加えた。その後、生じた混合物を、２４時間、撹拌した。最終生成物は、減圧下での蒸発、続いて、９０％から１０％までの溶媒Ａ（１０００ｍｌ水および１ｍｌ ＴＦＡ）での２０分間にわたるＨＰＬＣ、続いて、凍結乾燥により得られ、４ｍｇのＰＳＭＡ－Ｃ５－カテプシン－ガーディキモド（２）を提供した（図１７Ａ）。ＬＣ－ＭＳ １３８９．３７（図１０）。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグのＰＳＭＡ－Ｌｅｇｕ－ガーディキモドの合成を記載する。
レグマイン－ガーディキモドの合成（図１８）。ガーディキモド（１０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＤＭＦ（２ｍＬ／１ｍＬ）中に希釈し、ＤＩＰＥＡ（６０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、窒素下、０℃で加えた。ＴＨＦ／ＤＭＦ（２ｍＬ／１ｍＬ）中アジド－ＰＥＧ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ（２６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液を、この溶液へ０℃、液滴で加え、２４時間、撹拌し続けた。反応混合物を濃縮し、純粋なプロドラッグが、ＨＰＬＣから凍結乾燥後、白色粉末として単離された。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１２３３．６０；実測値：１２３４．６３（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
アスコルビン酸ナトリウム（３ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４（１．２ｍｇ、０．００７２ｍｍｏｌ）を、０．５ｍｌ水中に溶解した。この溶液へ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．５ｍｌ：０．２ｍｌ）中のリンカー２－ガーディキモド（８ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）とプロドラッグ（ｃ）（３．５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下、室温、液滴で加えた。その後、生じた混合物を２４時間、撹拌した。最終生成物は、減圧下での蒸発、続いて、９０％から１０％までの溶媒Ａ（１０００ｍｌ水および１ｍｌ ＴＦＡ）での２０分間にわたるＨＰＬＣ、続いて、凍結乾燥により得られ、５ｍｇのＰＳＭＡ－Ｌｅｇｕ－ガーディキモド（３）を提供した。ＬＣ－ＭＳ １７６５．８６（図１１）。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグであるＰＳＭＡ６１７－Ｌｅｇｕ－ガーディキモドの合成を記載する（図１９）。
ＰＳＭＡ６１７－ｔＢｕ－ｐｒｏｐの合成。ＰＳＭＡ６１７（正確な質量８２３．５１）の合成は、前に報告された手順により行われた。ＰＳＭＡ６１７－ｔＢｕ－ｐｒｏｐの合成について、本発明者らは、ＰＳＭＡ６１７（８２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をプロパルギル－ＰＥＧ１－ＮＨＳ－エステル（２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）で、ＤＣＭ（５ｍｌ）中ＤＩＰＥＡ（５５μＬ）の存在下、窒素下、０℃において処理した。その反応を１２時間、継続した。溶媒を蒸発させ、純粋なプロドラッグがＨＰＬＣから単離された。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：９３３．５５；実測値：９３４．３１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
ＰＳＭＡ６１７－ｐｒｏｐの合成（図１９）。ＰＳＭＡ６１７－ｔＢｕ－ｐｒｏｐ（１２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、１ｍｌ ＤＣＭ中に溶解し、Ｎ２下、２分間、撹拌した。この混合物へ、１．２ｍｌ ＴＦＡを加え、３時間、撹拌し続けた。プロドラッグ形成を、ＬＣ－ＭＳにより確認した。最終生成物のＰＳＭＡ６１７－ｐｒｏｐは、減圧下でのＤＣＭ／ＴＦＡ混合物の蒸発によって、いかなるさらなる精製もなしに、得られた。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：７６５．３６；実測値：７６６．１６（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
最終プロドラッグのＰＳＭＡ６１７－Ｌｅｇｕ－ガーディキモド（４）の合成のためのクリック反応。アスコルビン酸ナトリウム（６ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４（３．６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を０．６ｍｌ水中に溶解した。この溶液へ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．５ｍｌ：０．２ｍｌ）中のリンカー２－ガーディキモド（８ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）およびＰＳＭＡ６１７－ｐｒｏｐ（５ｍｇ、０．００６５ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下、室温、液滴で加えた。その後、生じた混合物を、２４時間、撹拌した。最終生成物は、減圧下での蒸発、続いて、９０％から５％までの溶媒Ａ（１０００ｍｌ水および１ｍｌ ＴＦＡ）での１８分間にわたるＨＰＬＣ、続いて、凍結乾燥により得られ、３ｍｇのＰＳＭＡ６１７－Ｌｅｇｕ－ガーディキモド（４）を提供した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１９９８．９６；実測値：２０００．４２（［Ｍ＋Ｈ］＋）（図１２）。
この実施例は、炎症促進性プロドラッグであるＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７の合成を記載する（図２０）。
ＣＡ９リガンドの合成。市販の、Ｏ－ビス－（アミノエチル）エチレングリコールがプレロードされたトリチル樹脂（４００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をまず、ＤＣＭ中で（３×５分間×４ｍｌ）、その後、ＤＭＦ中で（３×５分間×４ｍｌ）、膨潤させた。Ｆｍｏｃ保護アジドリジン（２８４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２７４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１１０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（２３８μｌ、１．４４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中に溶解し、その混合物を室温で１５分間、静置し、その後、Ｎ２の緩やかな撹拌下、１時間、前記樹脂と反応させた。ＤＭＦでの洗浄（６×１分間×４ｍｌ）後、Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで除去し（１×２分間×４ｍｌおよび２×１０分間×４ｍｌ）、その樹脂を、ＤＭＦで洗浄し（６×１分間×４ｍｌ）、その後、そのペプチドを、Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｌ－アスパラギン酸α－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（２９６ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）および４，４－ビス（４－ヒドロキシフェニル）吉草酸（２０６ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）で２回、示された順番で、前に言及されたのと同じカップリング（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ）およびＦｍｏｃ脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）条件を用いて、伸長した。最後のペプチドカップリングステップ後、ＤＭＦ（２ｍｌ）およびＴＨＦ（２ｍｌ）の混合物中ＣｕＩ（３．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＡ（１２．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、およびアルキン１１（１９８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、その樹脂と、室温で２時間、反応させた。ＤＭＦでの洗浄（６×１分間×４ｍｌ）後、ＴＦＡ（９ｍｌ）、ＴＩＰＳ（５００μｌ）、およびＨ２Ｏ（５００μｌ）の混合物と共に樹脂を撹拌することにより、プロドラッグを切断した。樹脂を、ＴＦＡで洗浄し（１×５分間×４ｍｌ）、混合した切断溶液と洗浄溶液を、氷冷ジエチルエーテル（１００ｍｌ）へ液滴で加えた。その沈殿物を、遠心分離により収集し、その生成物を、逆相ＨＰＬＣにより精製した。凍結乾燥後、ＣＡ９が、白色粉末として収集された（５ｍｇ、１．７％収率）。
最終コンジュゲートのＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７の合成（図２０）。ＣＡ９を、リガンド（８）と、ＤＩＰＥＡおよびＤＭＦの存在下でコンジュゲートさせて、ＣＡ９－ＰＥＧ３－Ｐｒｏｐが生成された。ＣＡ９－ＰＥＧ３－Ｐｒｏｐを、プロドラッグ（９）と、クリック条件下で反応させ、最終のＣＡ９－ＰＥＧ３－ＴＬＲ７コンジュゲートが生成された（図１３）。
この実施例は、ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１９Ｆ］ＳＦＢ（５ａ）およびＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢ（５ｂ）の合成を記載する。
スキーム１は、ＤＩＰＥＡおよびＴＨＦ：ＤＭＦ混合物の存在下、４５％収率でのプロドラッグＢの合成を図解する（図２１）。スキーム２は、重要な前駆体分子ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ（Ｈ）についての合成経路を示す。２，４，６－トリクロロ－１，３，５－トリアジンは、３モード分子のスキャフォールドを合成するための中心コアとして選択された。一置換産物；プロドラッグＤについて、プロパルギル－ＰＥＧ２－アミンを、２，４，６－トリクロロ－１，３，５－トリアジンと、化学量論的様式でコンジュゲートさせた。その後、プロドラッグＤを、ＮＨ２－ＰＥＧ３－ＰＳＭＡと、トリアジン環の第２のハロゲン原子を通して、コンジュゲートさせ、４６％の収率でプロドラッグＥが生成された。ＮＨ２－ＰＥＧ３－ＰＳＭＡ（プロドラッグ４）の合成は、スキームＳ１（ＳＩ）において３段階の合成経路によって記載されている。その後、プロドラッグＥを、４－（アミノメチル）ピペリジンと、トリアジン環の第３のハロゲン原子を通してコンジュゲートさせ、６２％収率で、プロドラッグＦが提供された。４－（アミノメチル）ピペリジンの第２級アミンのより高い反応性により、第１級アミンは、１８Ｆ標識接合団を組み入れるのに利用可能のままである。その後、ｔｅｒｔ－ブチル基を、ＴＦＡの存在下で除去し、６１％収率でプロドラッグＧが生じた。その後、プロドラッグＧとプロドラッグＢの間でクリック反応を実施し、３６％収率で前駆体分子ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ（Ｈ）が生成された。その後、免疫療法の標準薬物コンジュゲート ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１９Ｆ］ＳＦＢ（Ｉ）が、前駆体分子（Ｈ）と［１９Ｆ］ＳＦＢの間での反応により、５７％収率で合成された。
放射化学。［１８Ｆ］ＳＦＢの合成を、３段階の標準方法、スキームＳ２（ＳＩ）によって達成した（図２１）。簡単に述べれば、トリメチルベンゼンアミニウムトリフラートは、放射性フッ素付加を受けて、［１８Ｆ］４－フルオロ安息香酸エチルを生じる。その後、そのエステル基は、テトラプロピルアンモニウムヒドロキシド（ＴＰＡＨ）の存在下で加水分解されて、［１８Ｆ］４－フルオロ安息香酸を提供した。その後、そのカルボン酸基は、Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）で活性化されて、９９％の放射化学純度で［１８Ｆ］ＳＦＢを生じた。
小動物のＰＥＴ／ＣＴイメージング（図１４Ａ）。ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢの器官取込みおよび腫瘍ターゲティング能力を、ＰＳＭＡ陽性およびＰＳＭＡ陰性皮下腫瘍異種移植片を有する重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおいて評価した。図１４Ａは、１５分間のＰＥＴスキャン、続いて７分間のＣＴスキャンにより評価された小動物のＰＥＴ／ＣＴイメージング研究を示す。注射後（ｐ．ｉ．）１時間目における最大強度投影（ＭＩＰ）は、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍が明らかに観察可能であり、一方、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ３－Ｆｌｕ腫瘍が（筋肉取込みと類似した）非常に弱い画像コントラストを有することを示した。
定量的取込み分析（図１４Ｂ）は、コンジュゲート ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢが、ＰＣ３－Ｆｌｕ（０．８±０．３％ＩＤ／ｇ）腫瘍においてより、ＰＣ３－ＰＩＰ（１．９±０．５％ＩＤ／ｇ）腫瘍において高い取込みを生じることを示した（ｎ＝３）。１時間ｐ．ｉ．における、心臓、肺、および肝臓取込みのより高いレベルは、非特異的器官からのＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢのゆっくりとしたクリアランスを示す。観察されたゆっくりとしたクリアランスは、ＴＬＲ－ＬＥＧＵ－ＰＳＭＡ－［１８Ｆ］ＳＦＢの低い親水性による可能性があり、その低い親水性は、疎水性ガーディキモド分子および他の疎水性対応物の存在に起因する。
ＣＡ９ターゲット化プロドラッグのインビトロ試験（図１５）。ＣＡ９カテプシンＴＬＲ７プロドラッグを、ＣＡ９発現／陽性およびＣＡ９陰性のレポーター細胞において試験した。Ｙ軸は、光学密度を表す。ＰＳＭＡプロドラッグデータとは対照的に、ＴＬＲ経路の活性化がなく、このプロドラッグがエンドサイトーシスで取り込まれないことを示す。これは、この特定のプローブについてのネガティブなデータであるが、原理の証明としてＰＳＭＡプローブについての所見を裏付けている。

Claims (28)

  1. （ｉ）細胞外抗原と特異的に結合するターゲティング部分；
    （ｉｉ）第１の酵素切断可能なリンカー；および
    （ｉｉｉ）第１の自然免疫系アクチベーター
    を含むプロドラッグであって、前記第１のリンカーが、前記ターゲティング部分を前記自然免疫系アクチベーターへ共有結合で連結する、プロドラッグ。
  2. 細胞外抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、または線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  3. ターゲティング部分が、ＰＳＭＡ－１１、ＰＳＭＡ－６１７、ＣＡ９小分子結合剤、またはＦＡＰ阻害剤である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  4. ＦＡＰ阻害剤がＦＡＰＩ－０４である、請求項３に記載のプロドラッグ。
  5. 第１の酵素切断可能なリンカーがカテプシン切断可能なリンカーまたはレグマイン切断可能なリンカーである、請求項１に記載のプロドラッグ。
  6. 第１の酵素切断可能なリンカーがアジド－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）－ｐ－ニトロフェノール（ＰＮＰ）リンカーまたはアラニン－アラニン－アスパラギンレグマインリンカーである、請求項１に記載のプロドラッグ。
  7. ターゲティング部分と第１のリンカーとの間にスペーサーリンカーをさらに含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
  8. スペーサーリンカーが、アジド－ＰＥＧ－マレイミドスペーサーリンカーまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－ＰＥＧ－アルキンスペーサーリンカーである、請求項７に記載のプロドラッグ。
  9. アルブミン結合性モチーフをさらに含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
  10. 第１の自然免疫系アクチベーターが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
  11. ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、または混合性ＴＬＲ７／８アゴニストである、請求項１０に記載のプロドラッグ。
  12. ＴＬＲ７アゴニストが、ガーディキモド、イミキモド、またはテルラトリモドである、請求項１１に記載のプロドラッグ。
  13. 混合性ＴＬＲ７／８アゴニストがレシキモドである、請求項１１に記載のプロドラッグ。
  14. ＴＬＲ９アゴニストが、ＯＤＮ－２３９５、ＣＭＰ－００１、またはＭＧＮ１７０３である、請求項１１に記載のプロドラッグ。
  15. ＳＴＩＮＧアゴニストが環状ジヌクレオチドである、請求項１０に記載のプロドラッグ。
  16. 放射標識部分、自然免疫系の第２のアクチベーター、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
  17. 放射標識部分が、接合団またはキレーターによりプロドラッグへ連結される、請求項１６に記載のプロドラッグ。
  18. 接合団が、第２のリンカーによりプロドラッグへ連結される１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、または７６Ｂｒから選択される放射性核種での標識のための安息香酸部分を含む、請求項１７に記載のプロドラッグ。
  19. キレーターが、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、１７７Ｌｕ、および９９ｍＴｃから選択されるイメージングのための放射性核種、ならびに／または６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、および２２３Ｒａから選択される放射線療法のための放射性核種での標識のための１，４，７，１０－テトラアザシクロデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）誘導体を含む、請求項１７に記載のプロドラッグ。
  20. 第２の自然免疫アクチベーターが、第３のリンカーによりプロドラッグへ連結される炎症促進性分子を含む、請求項１６に記載のプロドラッグ。
  21. から選択されるプロドラッグ。
  22. 請求項１または２１に記載のプロドラッグの有効量を対象に投与し、それにより癌を処置するステップを含む、対象において癌を処置する方法。
  23. 癌が、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、メラノーマ、口腔癌、咽頭癌、膵臓癌、子宮癌、甲状腺癌、皮膚癌、頭頚部癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、または造血器癌である、請求項２２に記載の方法。
  24. 免疫療法の投与の前、それと同時、またはそれの後にプロドラッグを投与するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 免疫療法が、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ療法、モノクローナル抗体、癌ワクチン、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組合せである、請求項２４に記載の方法。
  26. 対象において癌をイメージングする方法であって、
    （ｉ）請求項１６～１９のいずれか一項に記載のプロドラッグを対象に投与するステップ；
    （ｉｉ）任意で、前記プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に前記対象に免疫療法を投与するステップ；および
    （ｉｉｉ）前記対象に機能イメージングを実施するステップ
    を含む、方法。
  27. 対象において癌の処置をモニターする方法であって、
    （ｉ）請求項１６に記載のプロドラッグを対象に投与するステップ；
    （ｉｉ）任意で、前記プロドラッグの投与の後、それと同時、またはそれの前に前記対象に免疫療法を投与するステップ；および
    （ｉｉｉ）前記対象に機能イメージングを実施するステップ
    を含む、方法。
  28. 機能イメージングが、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、またはそれらの組合せである、請求項２６または２７に記載の方法。
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