KR20180063885A - 전이 감소를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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리헤 리우
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Abstract

본 명세서에 기술된 주제는 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 또는 상기 방법은 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 상기 표적 세포에서 트랩을 발현하기 위한 작제물을 포함하고, 상기 트랩은 상기 표적 세포에서 발현되어 상기 미세환경을 변형시킨다. 또한 본 명세서에는 암의 전이를 감소시키는 방법이 기술되며, 상기 방법은 암을 앓고 있는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 트랩의 발현을 위한 작제물을 포함하고, 상기 트랩은 전이에 민감한 조직으로 전달되고, 이어서 그 조직에서 발현되고, 여기서 상기 암의 상기 조직으로의 전이는 감소된다. 상기 방법을 수행하기 위한 조성물이 또한 기술된다.

Description

전이 감소를 위한 방법 및 조성물
정부 지원의 언급
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해서 수여된 증서 번호 CA151652, CA149387, CA157738, 및 DK100664 하에 정부 지원으로 수행하였다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
EFS -WEB을 통해서 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 482902_seqlisting.txt로 기록된 서열 목록은 77,671바이트이고, 2016년 9월 14일자로 생성되었으며, 참고로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 명세서에 기술된 주제는 전이에 민감한 조직에서 세포 미세환경 인자를 변형시킴으로써 전이성 암의 발생을 예방 또는 감소시키는 치료에 관한 것이다.
암의 치료에서, 전이 전의 초기 진단 및 치료가 중요한데, 그 이유는 암은 전이되면, 치료요법의 성공률이 실질적으로 낮기 때문이다. 특히, 결장직장암(CRC) 은 전세계에서 진단되는 세 번째로 가장 우세한 암이며, 이것은 세 번째로 가장 많이 언급된 사망으로 이어진다. 미국에서만, 매년 대략 143,460명의 환자가 진단되고, 51,690명의 환자가 사망한다(American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012. Atlanta: American Cancer Society; 2012. p. 25-6). 그러나, 사망의 원인은, 원발성 암이 존재하는 결장의 국지적인 절제가 매우 효율적인 원발성 결장암 존재량으로 인한 것은 거의 드물다. 불행하게도, 간 전이의 발생이 CRC 환자에서 사망의 주요 원인이다(American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012. Atlanta: American Cancer Society; 2012. p. 25-6).
초기 단계의 결장직장암 검출에서, 5-년 생존율은 대략 90%이다. 불행하게도, 이러한 비율은 간 전이가 발생한 후 12% 미만의 생존율로 극적으로 낮아진다. 연구는 또한 진단된 후, 환자의 20%가 이미 간 전이가 발생하였고, 이러한 수치는 사망 시에 간에서 발생된 전이성 병변을 갖는 환자의 60 내지 70%까지에 달한다. (Schima W, Kulinna C, Langenberger H, et al. Liver metastases of colorectal cancer: US, CT or MR? Cancer imaging. International Cancer Imaging Society. 2005; 5(SpecNo A):S149-56).
그러나, 궁극적인 치료 목적이 병이 걸린 세포를 사멸시키거나 이의 재생산을 저해하는 것인, 질환, 예컨대 암에 대한 치료는 세포독성 약물의 투여를 포함한다. 세포독성 약물은 알킬화제, 항대사물질 및 독소를 비롯한, 암의 치료에서 사용되는 다수의 화학치료제를 포함한다. 대부분의 세포독성 약물은 비-선택적이고, 즉 병이 걸린 세포뿐만 아니라 건강한 세포를 사멸시키는데, 이는 이들 작용제가 전신으로(systemically) 전달되는 경우 바람직하지 않은 부작용에 기여한다. 따라서, 독성 작용제의 전신 투여를 필요로 하지 않는 대안적인 요법에 대한 필요성이 존재한다.
본 명세서에서 주제는 전이에 민감한 조직의 미세환경을 변형시킴으로써 공지된 요법의 단점을 다룬다. 이렇게 함으로써, 전이가 예방 또는 감소되고, 세포독성제의 사용이 회피될 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 기술된 주제는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 벡터는 트랩(trap)의 발현을 위한 작제물을 포함하고, 여기서 트랩이 표적 세포에서 발현되어 미세환경을 변형시킨다.
실시형태에서, 본 명세서에 기술된 주제는 암을 갖는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 전이를 감소시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 벡터는 트랩의 발현을 위한 작제물을 포함하고, 트랩은 전이에 민감한 조직에서 발현되어 조직의 미세환경을 변형시키고, 암의 조직으로의 전이를 감소시킨다.
실시형태에서, 본 명세서에 기술된 주제는 환자에게 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 CXCL12과 상호작용하여 이것과 이의 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 주제는 PD-L1에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 PD-L1과 상호작용하여 이것과 이의 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현된다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 PD-1에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드를, 및 PD-1과 상호작용하여 이것과 이의 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현된다.
이들 및 추가 실시형태는 본 명세서에 완전히 개시된다.
도 1은 양성 선택을 위한 표적으로서 C-말단 바이오틴을 갖는 야생형 CXCL12에 대해서 트랩을 설정하는 데 사용되는 케모카인 CXCL12의 내생 단백질 구조를 도시한 도면. (a) 음성 선택을 위해서 결실된 N-말단 모티프와 상호작용하는 CXCR4를 갖는 CXCL12 돌연변이체의 구조. (b) 야생형 CCL2 및 CCL5 및 양성 선택 및 음성 선택을 위해서 사용된 이들의 비-수용체-결합 돌연변이체. (c) 단일 또는 병용 요법을 위해서 사용될 수 있는 동종이량체, 이종이량체, 및 이중특이적 케모/사이토카인 트랩의 개략도.
(d) 3가 트랩의 자가-조립 과정뿐만 아니라 3가 PD-L1 트랩. 추가로, 옥텟(Octet)을 사용한 3가 PD-L1 트랩과 PD-L1의 결합 동역학이 나노입자 시스템을 기반으로 한 유전자 전달을 위해서 사용되는 PD-L1 트랩의 플라스미드 맵과 함께 나타나 있다.
도 2는 CT-26 FL3 세포 이동 및 침윤에 대한 조작된 CXCL12 트랩 단백질의 발생 및 효과를 도시한 도면. (a) pCXCL12 트랩 DNA 서열의 플라스미드 벡터 맵. CXCL12-결합 VH 도메인 및 VL 도메인의 암호 서열을 트랩 유전자의 조립을 위해서 사용하였다. CXCL12 트랩에 대한 최종 서열은 각각 신호전달 펩타이드, VH 도메인, 가요성 링커, VL 도메인, E 태그, 및 His(6X) 태그를 암호화한다. 완전한 cDNA를 Nhe I 부위와 Xho I 부위 사이의 pCDNA3.1 내에서 클로닝시켰고, 정확도를 DNA 서열결정에 의해서 확인하였다. 생물-층 간섭계법(Bio-Layer Interferometry)을 사용한 CXCL12 트랩과 CXCL12 간의 결합 친화도. CXCL12를 AR2G 바이오센서 상에 고정시키고, 상이한 농도의 CXCL12 트랩을 사용하여 결합 동역학을 측정하였고, CXCL12 트랩은 Kd= 4nM인 것을 발견하였다. (b) 조작된 CXCL12 트랩은 대략 120nM의 농도에서 생물학적 활성인 CXCL12(100ng/㎖)에 대해서 절반 최대 저해[ND50]를 가짐을 발견하였다. CXCL12 트랩(각각 2, 4, 8 또는 12㎍/㎖; 각각 60, 120, 240, 또는 360nM) 또는 양성 대조군 CXCL12 Ab(1, 2 또는 4㎍/㎖; 각각 6, 12, 또는 24nM)의 존재 또는 부재 하에서 CXCL12(100ng/㎖; 10nM)로 자극된 CT-26 FL3 세포 이동의 분석. (c) CXCL12 트랩(4 또는 12㎍/㎖; 120 또는 360nM) 또는 양성 대조군 CXCL12 Ab(4㎍/㎖; 24nM)의 존재 또는 부재 하에서 CXCL12(100ng/㎖; 10nM)로 자극시킨 후 CT-26 FL3 세포 침윤의 분석. 데이터는 3회 실시되고, 미처리(CXCL12 또는 처리 단백질 없음) 대조군의 백분율로서 샘플로부터 계산된 평균 ± s.d.로 표현되었다. *p<0.05, **p<0.01, CXCL12(100ng/㎖, 10nM)와 비교하여, 세포 대조군을 자극함(단백질 트랩 또는 AB 처리 없음). NS, 유의하지 않음.
도 3은 TEM 및 DLS에 의한 LCP 나노입자 특징을 도시한 도면. (a) pDNA/mc-CR8C 펩타이드를 함유한 LCP 코어 (b) 음성 우라닐 아세테이트 염색제를 사용한, pDNA/mc-CR8C를 함유한 최종 갈락토스-LCP (c) 45 나노미터 직경 및 +10.0. 수, 부피 및 강도 가중 크기 분포의 제타 전위를 산출하는, pDNA/mc-CR8C를 함유하는 최종 갈락토스-LCP의 동적 광 산란(DLS) 분석. 더 작은 집단(약 45nm)이 바람직한 LCP 입자이고, 더 큰 집단(약 350nm)은 리포좀, 그 다음 박막 수화를 형성하는 과량의 DOTAP 및 콜레스테롤로 인한 것이며, 이는 약 236±32nm의 Z-평균을 산출함; n=6. (d) 10% 혈청 용액에서 시간에 따른 LCP의 안정성을 DLS를 통해서 측정하였다. LCP를 10% 혈청 용액 중에 현탁시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 증가된 z-평균에 의해서 나타나는 임의의 단백질/LCP 응집을 관찰하기 위해서 z-평균을 24시간에 걸쳐서 기록하였다. 데이터를 3회 실시된 샘플로부터 계산된, 평균 ± s.d.로서 표현하였다. z-평균(약 30nm)은 z-평균은 24시간에 걸쳐서 일관되며, 이는 z-평균의 유의하지 않은 증가를 산출하며, 이는 단백질/LCP 응집물의 최소한의 형성을 나타낸다. (e) LCP 내에 캡슐화된 pCXCL12 플라스미드의 벡터 맵 (f) pCXCL12 유전자의 서열.
도 4는 LCP 코어 내에 혼입된 177Lu을 사용한 갈락토스-LCP-pCXCL12 트랩/mcCR8C의 약동학 및 기관 생물분포를 도시한 도면. 대략 250,000 계수치를 꼬리 정맥 주사에 의해서 마우스에게 투여하였다. (a) 꼬리 정맥 절단을 통해서 수집된 혈액 샘플을 수집하고, 칭량하고, 방사능 계수에 대해서 측정하여 순환 시에 남아있느 주사된 용량의 백분율(%ID)을 결정하였다. 2상 분포가 관찰되며, 이는 각각 20분 및 1,054분의 T1/ 2α 및 T1/ 2β를 생성한다. (b) LCP 생물분포/기관 축적을 꼬리 정맥 주사 후 16시간(혈액 방사선 계수가 배경 신호에 도달한 시간)에 측정하였다. 조직 그램 당 주사된 용량의 대략 40 내지 50%는 간에 축적되는 것을 발견하였다. 데이터는 3회 실시된 샘플로부터 계산된, 평균 ± s.d.로 표현되었다.
도 5는 pCXCL12 트랩의 일시적인 발현 및 간 특이적 발현뿐만 아니라 내생 CXCL12의 생물학적 트랩핑 및 면역 세포 모집에 대한 이의 역할을 도시한 도면. (A) 최종 치료 주사 10일 후 희생된 결장직장암의 BALB/c 마우스 모델로부터의 간 조직 및 대조군 건강한 간[건강함(CRC 없음)]의 파라핀-포매된 절편에서 내생 CXCL12 발현. DAPI 핵 염색제(청색)와 함께, CXCL12에 대한 면역형광 염색법(적색). 건강함(CRC 없음), 미처리(PBS), pGFP LCP 대조군(10㎍ 2일 1회 x 3), pTrap LCP(10㎍), pTrap LCP(10㎍ 2일 1회 x 3)를 비롯한, 5개의 군을 연구하였다. 모든 데이터는 3회 실시된 샘플로부터 계산되고, 형광 강도로 보고된, 평균 ± s.d.로서 표현되었다. N.S.는 유의성이 없음을 나타낸다. N.D.는 검출 한계치를 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교된 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. 스케일 막대: 250㎛. (b) 추가 절편을 앰색하여 면역억제 항-염증 MDSC[CDllb+(녹색)/GR1+(적색)] 및 Treg[CD4+(녹색)/Foxp3+(적색)]뿐만 아니라 CD8+ T 세포 집단(녹색)을 비롯한, 면역 세포의 간으로의 모집을 결정하였다. 건강함(CRC 없음), 미처리(종양), 스트로마(Stroma), 및 pTrap LCP(10㎍ 2일 1회 x 3)을 비롯한 4개의 군을 연구하였다. 3색 염색은 또한 정상 간 및 병이 걸린 간을 구별하는 것으로 나타난다. 백색 화살표는 전이성 병변을 나타낸단. 모든 데이터를 3회 실시된 샘플로부터 계산되고, 형광 강도로 보고된, 평균 ± s.d.로 표현한다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. 스케일 막대: 250㎛, pGFP의 pGFP 및 조작된 pCXCL12 트랩의 일시적인 간-특이적 발현을 입증한다. (c) 주요 LCP-축적 기관에서 GFP 발현의 현미경 분석. 간 절편은 최종 주사(10㎍ 2일 1회 x3) 적어도 4일 후에 대해서 일시적인 발현을 입증한다. 스케일 막대: 250㎛. 데이터를 적어도 3개의 샘플로부터 계산되고, 이미지 제이 소프트웨어(이미지 제이 소프트웨어)에 의해서 정량분석된 형광 강도로서 보고된 평균 ± s.d.로서 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타내고, p-값은 미처리 샘플에 대한 유의성을 나타낸다. 스케일 막대 250㎛. (d) His(6X)-태그 ELISA 및 (e) 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 모든 주요 LCP-축적 기관 및 혈청에서 pCXCL12 트랩의 기관 분포/발현을 결정하였다. 용량을 2.0, 10.0, 또는 20.0㎍의 pDNA로 확대하고 꼬리 정맥을 통해서 투여하였다. (f) 기관의 웨스턴 블롯 분석은 His(6X) mAb의 사용을 통한 CXCL12 트랩 발현을 나타낸다. 발현은 일시적이고, 최종 주사(10㎍ 2일 1회 x3) 후 적어도 4일 내지 8일 이하 동안만 지속된다. 총 단백질 농도를 BCA에 의해서 측정하고, 웰/레인당 50㎍의 총 단백질을 로딩하였다. 트랩 단백질을 이론값과 일치하는, 단백질 표준 래더(standard ladder)에 의해서 확인된 바와 같은, 28.6kDa에서 검출하였다. GAPDH가 존재하지 않는, 혈청 샘플을 제외하고는, GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 데이터를 3회 실시된 샘플로부터 계산되고, 미처리 대조군과 비교한 배수 증가로서 나타낸 평균 ± s.d.로 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 군의 p-값을 그래프에 나타낸다.
도 6은 pCXCL12 트랩 LCP 치료 후 간 전이의 감소된 발병을 도시한 도면. (a) 마우스에게 맹장 벽으로 2x106개 CT-26(FL3) RFP/Luc 세포를 접종하였다. 치료 스케줄을 상기에 나타낸다. 치료, 10㎍(0.5㎎/㎏) pDNA를 10, 12, 및 14일에 꼬리 정맥 IV를 통해서 투여하였다. 군은 PBS(미치료; n=7) 및 pGFP LCP(10㎍ 2일 1회 x 3; n=6), 뿐만 아니라 pCXCL12 트랩 LCP(10㎍ 2일 1회 x 3; n=7)를 포함하였다. 전체 종양 질량의 진행 다음에 200㎕ 루시페린(10㎎/㎖)을 IP로 투여하였다. 루시페라제 생물발광 영상화를 루시페린 투여 10분 후에 기록하였다. 전체 마우스 및 간 종양 존재량을 기록하였다. 모든 데이터를 평균 ± s.d.로서 표현하였고, 생물발광 강도로 기록하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. (b) 미처리(n=3) 및 pCXCL12 트랩 LCP(n=4) 군의 총 기관 종양 존재량. 기관에서 종양 존재량의 정량분석을 IVIS/코닥(Kodak) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 모든 데이터를 평균 ± s.d.로서 표현하였고, 생물발광 강도로 기록하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. (c) 파라핀-포매된 간 절편을 3색으로 염색하였다. 큰 종양 존재량(흑색 화살표에 의해서 나타냄) 및 경변증/섬유증(청색 염색, 콜라겐)은 PBS(미치료) 및 pGFP LCP 처리군에서 명확하게 인지된다. pCXCL12 트랩 LCP 치료된 간은 정상의 건강한 간 모폴로지를 가지며, 검출 가능한 전이성 존재량이 없다. 스케일은 250㎛이다. 간 절편에서 콜라겐 정량분석을 기록하였다. 모든 데이터를 평균 ± s.d.로 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다.
도 7은 pCXCL12 트랩 LCP 치료요법 후의 간 전이의 감소된 발병 및 향상된 T 세포 사멸을 도시한 도면. 마우스에게 맹장 벽으로 2x106개 CT-26(FL3) RFP/Luc 세포를 접종하였다. 치료, 10㎍(0.5㎎/㎏) pDNA를 10, 12, 및 14일에 꼬리 정맥 IV를 통해서 투여하였다. 군은 항-Lyt2.2 또는 아이소타입 IgG 대조군이 8일 및 10일에 IP로 투여된(400㎍, 20㎎/㎏) PBS(미치료; n=5) 및 pCXCL12 트랩 LCP(10㎍ 2일 1회 x 3; n=5)를 포함하였다. 접종 및 치료 스케줄/용량 및 21일에 간 종양 질량을 상기에 나타낸다. 마우스에게 200㎕(10㎎/㎖) 루시페린을 IP로 투여하였다. 5분 후, 마우스를 안락사시키고, 간을 적출하고, PBS 중에서 헹구고, 루시페린의 용액(1㎎/㎖) 중에 넣었다. 생물발광 영상을 코닥 카메라를 사용한 IVIS 카이네틱(IVIS kinetic)을 사용하여 기록하였다. 간에서 종양 존재량의 정량분석을 IVIS/코닥 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 데이터를 정규화된 로그-변환 평균 ± s.e로 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. ROI = 관심 영역.
도 8은 CXCL12 트랩 LCP 치료 후 4T1(유방암) 간 전이의 감소된 발병 및 증가된 생존을 도시한 도면. (a) 도는 접종 및 치료 스케줄 및 용량, 뿐만 아니라 접종 7일 후 생물발광 신호 검출 및 종양 존재량 정량분석을 나타낸다. 처리군은 PBS(미치료; n=5), pGFP LCP/항-CD8(n=5), pTrap LCP/항-CD8(n=5), pTrap LCP/아이소타입 IgG(n=5)을 포함하였다. 데이터를 정규화된 로그-변환 평균 ± s.e로 나타내었다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. ROI = 관심 영역. (b) 10일에 종양 존재량 및 정량분석의 유세포 분석법 분석(군당 n=3). 게이팅(gating)은 GFP 양성 종양 세포(P3) 대 비-GFP 양성 세포(P4)로 이루어진다. 데이터를 정규화된 로그-변환 평균 ± s.d로 표현하였다 N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. (c) 모든 4개의 처리군(군당 n=5)을 포함하는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. 마우스 체중, 활동, 및 삶의 질을 평가함으로써 생존을 결정하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다.
도 9는 결장직장암(HT-29) 간 전이의 발병을 감소시키기 위한 치료 전략의 비교를 도시한 도면. (A) 상부의 타임라인은 접종 및 치료 스케줄 및 HT-29에 대한 투여를 나타낸다. 치료는 0 내지 16일에 꼬리 정맥 IV을 통해서 2일 1회 투여되었다. 처리군은 PBS(미치료; n=5), pGFP LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA; n=5), pTrap LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA; n=5), 유리 CXCL12 트랩 단백질(10㎍, 0.5㎎/㎏ 단백질; n=5), 및 AMD3100(100㎍, 5.0㎎/㎏; n=5). (B) 36일(군당 n=5)에 종양 존재량 분석 및 정량분석. 간 전이 존재량을 종양 결절(㎎ 단위)의 절제 및 칭량에 의해서 정량분석하였다. 백색 화살표로 나타낸, 전이성 존재량을 갖는 각각의 처리군으로부터의 영상은 전이성 병변을 나타낸다. 마우스 체중, 활동, 및 삶의 질을 평가함으로써 생존을 결정하였다. 데이터를 평균 ± s.d를 갖는 개별 데이터 지점으로서 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다.
도 10은 LCP 전달을 통한 독성의 감소들 도시한 도면. (a) ALT, AST, 크레아티닌, 및 BUN 측정치 및 혈액 백혈구 세포를 PBS(미치료), 10㎍ pGFP LCP 2일 1회 x 3, 10㎍ pCXCL12 트랩 LCP 2일 1회 x 3, 또는 유리 CXCL12 트랩 단백질(20㎍ 2일 1회 x 3)로의 최종 치료 24시간 후에 계수하는데, 여기서 마우스를 최종 투여 1, 7, 및 14일에 희생시켰다. 모든 데이터를 3회 실시된 샘플로부터의 평균 ± s.d로서 표현한다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타낸다. 상응하는 미처리 대조군과 비교한 개별 군의 p-값을 그래프에 나타낸다. (b) 상이한 기관의 3색 조직학 절편 PBS(미치료), 10㎍ pGFP LCP 2일 1회 x 3, 10㎍ pCXCL12 트랩 LCP 2일 1회 x 3, 또는 유리 CXCL12 트랩 단백질(20㎍ 2일 1회 x 3)로의 최종 치료 24시간 후 상이한 기관의 3색 조직학 절편, 여기서 마우스를 최종 투여 1, 7, 및 14일에 희생시켰다. 모든 3색 조직학 절편은 심장, 폐, 비장, 신장, 및 간을 비롯한 어떤 주요 기관에서도 독성을 나타내지 않는다. 스케일 막대 =100㎛.
도 11은 마우스 암 세포주 및 인간 암 세포주에서 내생 CXCR4 발현을 평가하기 위한 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면. 세포를 ATCC에 의해서 권장된 조건에 따라서 배양하고, 용해시키고, 정확한 단백질 로딩을 위해서 BCA에 의해서 정규화하였다. 각각의 레인에 30㎍의 총 단백질을 제공하였다. 모든 샘플을 동일한 겔 상에서 실시하여 정확한 노출 및 상대적인 발현을 보장하였다. 단백질을 단백질 표준 래더를 사용하여 42kDa에서 식별하였다. 데이터를 3회 실시된 샘플로부터 계산되고, 최고 강도 샘플[CT-26(FL3) 및 HT-29]에 대한 상대적인 강도로 보고되고, GAPDH 강도에 의해서 정규화된, 평균 ± s.d.로 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타내고, p-값은 그래프에서 제1 세포주에 대한 유의성을 나타낸다.
도 12는 마우스(CRC 없음)의 주요 기관 및 CRC 마우스의 간에서의 내생 CXCL12를 도시한 도면. BALB/c 마우스로부터의 상이한 기관에서 내생 CXCL12 발현. 영상은 DAPI 핵 염색제(청색)와 함께, CXCL12(적색)에 대한 면역형광 염색을 나타낸다. 데이터를 적어도 3개의 샘플로부터 계산되고, 형광 강도로서 보고된 평균 ± s.d.로서 표현하였다. N.S.는 유의성 없음을 나타내고, N.D.는 검출 한계치 미만을 나타내고, p-값은 간 샘플에 대한 유의성을 나타낸다. 스케일 막대 250㎛.
도 13은 맹장 접종 24일 후 총 마우스 종양 존재량을 도시한 도면. 마우스에게 2x106 CT-26 F3 RFP/Luc 세포를 맹장 벽으로 접종하였다. 10㎍ pDNA로 이루어진 치료를 꼬리 정맥을 통해서 IV로 10, 12, 및 14일에 투여하였다. 군은 PBS(미치료; n=7), pGFP DNA LCP(10㎍ 2일 1회 x 3; n=6), 및 pCXCL12 트랩 LCP(10㎍ 2일 1회 x 3; n=7)를 포함하였다. 종양의 진행 이후에 200㎕루시페린(10㎎/㎖)을 IP로 투여하였다. 루시페라제 생물발광 영상화를 루시페린 투여 10분 후에 수행하였다.
도 14는 (a) LPD NP(캡슐화 플라스미드를 위한 벡터)의 TEM 영상. (b) KPC 정위 종양(orthotopic tumor)을 보유한 마우스에서 DiI-표지된 LPD NP의 생물분포(주사 후 24시간). (c) 간 및 종양에서 DiI 분포의 형광 영상(백색의 숫자는 기관에서 DiI가 채워진 % 세포를 나타낸다. GFP LPD NP의 1일 2회 용량을 종양을 보유한 마우스에게 정맥내로 주사하였다. 간 및 종양에서 GFP 발현을 나타낸다(녹색 수). 팔로이딘 표지된 세포 액틴. 결과는, 간이 NP로 채워진 주요 기관이지만, 플라스미드 발현은 주로 종양에 존재함(n = 3)을 제안한다. (d) 종양 내의 상이한 세포 집단에서의 GFP 발현. 각각의 세포 집단에서 GFP 양성 세포의 %를 정량분석하였다(백색 숫자). αSMA 양성 섬유모세포 및 RFP 양성 종양 세포는 종양 미세환경 내에서 세포를 생산하는 주요 GFP이다. (e) His-태그 표지된 플라스미드의 일시적인 발현을 His-태그 ELISA에 의해서 정량분석하였다. 트랩의 발현은 1주일 이내에 일시적이었다. 그리고, 다시, 종양은 주요 생산 기관이다. 트랩 단백질과 비교할 때, 플라스미드 전달은 종양에서 트랩 발현을 연장시켰다(n = 4).
도 15는 종양 성장 저해 및 숙주 생존을 도시한 도면. (a) KPC 동종이식편(allograft)을 보유한 마우스에 대한 상이한 치료의 투여 스케줄을 상부 패널에 나타낸다. 상이한 치료(n = 5 내지 7) 후의 KPC 종양의 IVIS 영상을 하부 패널에 나타낸다. (b) KPC(n = 6 내지 10)의 종양 저해 곡선. (c) 치료된 군의 생존 비율. 데이터는 평균 ± SD(n=5 내지 8)를 나타낸다(D&E). 저용량의 플라스미드 치료(30㎍/마우스, 4회)를 갖는 KPC를 보유한 마우스의 최종 시점 종양 중량 (d) 및 고용량의 플라스미드 치료를 갖는 KPC를 보유한 마우스의 최종 시점 종양 중량(50㎍/마우스, 4회, E). n = 4. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 구체적으로 언급되지 않으면 통계 분석은 대조군 군과의 비교에 의해서 계산하였다.
도 16은 장기간 전이 연구를 도시한 도면. (A) 상이한 치료 1개월 후 주요 장기에서 KPC의 전이(n = 4 내지 5). 간, 폐 및 비장은 KPC 전이에 대한 주요 장기이다. (B) PBS 대조군 군의 주요 기관에서 종양 전이의 조직학을 나타낸 H&E 염색. 전이는 마우스가 콤보 트랩 NP로 치료된 경우 상당히 저해되었다. 청색 원 및 화살표는 폐, 비장 및 간에서 전이성 종양 성장을 나타낸다. B에서의 막대는 100㎛를 나타낸다.
도 17은 상이한 치료를 갖는 정위 KPC 췌장암을 보유한 마우스로부터의 비장세포의 IFN-γELISpot 검정법을 도시한 도면. (A) 비장을 종양 보유 동물로부터 수거하였다. 비장세포를 RFP 및 루시페라제 마커가 형질도입된 정상 비장세포(대조군), KPC 세포 또는 KPC 세포로부터의 추출물로 재-자극시켰다. 세포 분비된 IFN-γ를 항-IFN-γ 항체로 염색하였다. 결과를 정량분석하고, 우측 패널에 나타낸다. ns: 유의하지 않음, *** p <0.001. n = 4. B. 비장을 상이한 치료: PBS, CXCL12 트랩 NP, PDL1 트랩 NP 및 콤보 트랩 NP를 갖는 종양 보유 동물로부터 수거하였다. 비장세포를 KPC RFP/Luc로부터의 추출물로 재-자극시켰다. 세포 분비된 IFN-γ를 항-IFN-γ 항체로 염색하였다. 상이한 치료(n = 4) 사이에서 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
도 18은 콤보 트랩 NP가 종양 미세환경으로의 T 세포 침입을 용이하게 한다는 것을 도시한 도면. (a) 상이한 치료를 갖는 KPC 동종이식편의 조직 절편을 CD3(녹색), p53(적색), 및 DAPI(청색)에 대해서 염색하고, 이어서 IF 현미경에 의해서 분석하였다. 인접 H&E 염색은 영역의 스트로마 구조를 나타낸다. 황색 점선은 정상 췌장으로의 종양 세포의 침윤의 모서리를 나타낸다. 주황색-사각형 면적은 보다 양호한 가시화를 위해서 확대된 것이다. 종양 영역을 또한 더 낮은 배율로 제공한다. 스케일 막대는 400㎛를 나타낸다. (b) 종양 영역 내의 CD3+ 세포의 백분율을 각각의 치료로부터의 5개의 대표적인 영상의 이미지 제이를 사용하여 정량분석하였다. (d) 상이한 치료(n = 5) 후 KPC 동종이식편 종양(종양 영역 내)의 단일-세포 현탁액을 CD3 및 CD8에 대한 항체로 염색하였다. CD3+CD8 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의해서 정량분석하였다. * p < 0.05. ** p < 0.01. d 및 e. KPC98027 종양 보유 마우스를 CD8 mAb(300㎍/마우스)의 3일 주사로 미리치료하여 마우스에서 CD8+ T-세포를 고갈시켰다. 아이소타입 mAb를 대조군으로 사용하였다. CD8 고갈되거나 고갈되지 않은 마우스에서 콤보 트랩 NP의 효능을 영상화에 의해서 비교하였고(d), 정량분석하였다(e).
도 19는 종양 미세환경에서 종양-침입 면역 세포의 변화를 도시한 도면. KPC 뮤린 종양 보유 마우스를 4개의 군으로 나누고, PBS, CXCL12 트랩/Ctrl NP, PDL1 트랩/Ctrl NP 또는 콤보 트랩 NP으로 치료하였다. 치료 마지막에, 마우스를 안락사시키고, 종양 조직을 (a) 면역염색 평가 및 (b) 유세포 분석법 검정법을 위해서 수집하였다: 제1 패널은 MDSC(황색)를 나타내고; 제2 패널은 Treg 세포(황색)를 나타내고, 제3 패널은 대식세포(적색)를 나타낸다. 백색으로 나타낸 숫자는 종양에서 각각의 세포 유형의 평균 %를 나타낸다. A에서의 막대는 200㎛를 나타낸다. * p < 0.05; ** p <0.01. 구체적으로 언급되지 않으면 통계 분석은 대조군 군과의 비교에 의해서 계산하였다.
도 20은 트랩 플라스미드 치료 후 CXCL12 및 PD-L1 피복률(coverage)의 변화를 도시한 도면. 형광 영상(a) 및 정량분석(b) 둘 모두가 제공된다(n = 5). a에서의 막대는 200㎛를 나타낸다. 구체적으로 언급되지 않으면 통계 분석은 대조군 군과의 비교에 의해서 계산하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM(n = 4)을 나타낸다. *p < 0.05; ** p < 0.01, ***p < 0.001.
도 21은 종양 미세환경에서 사이토카인의 변화를 나타낸 도면. 사이토카인 수준을 정량분석 RT-PCR을 사용하여 검출하였다. 구체적으로 언급되지 않으면 통계 분석은 대조군 군과의 비교에 의해서 계산하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM(n = 4)을 나타낸다. *p < 0.05; ** p < 0.01, ***p < 0.001.
도 22는 다양한 치료 후 종양 미세환경 변화를 도시한 도면. (A) KPC 보유 마우스를 4개의 군으로 나누고, PBS, CXCL12 트랩/Ctrl NP, PDL1 트랩/Ctrl NP 또는 콤보 트랩 NP. 치료 마지막에, 마우스를 안락사시키고, 종양 조직을 CD31(녹색으로 나타남) 및 αSMA(섬유모세포 염색, 적색으로 나타남)의 이중 형광 염색을 위해서 수거하였다. 대표적인 위치(황색 점선 사각형)를 확대한다(황색 사각형). 혈관은 CXCL12 트랩 또는 콤보 트랩 치료 후에 감압 및 정상화되었다. 황색 화살표는 정상화된 혈관을 나타낸다. 하단 패널 영상은 상응하는 상단 패널 영상에서의 박스 면적으로부터 확대된 것이다. 상단 패널 및 하단 패널의 막대는 각각 500 및 100㎛를 나타낸다. (B) αSMA 피복률의 %, CD31 밀도 및 정상화된 혈관을 각각의 군의 이미지 제이를 사용하여 5개의 대표적인 영상으로부터 정량분석하였다. 구체적으로 언급되지 않으면 통계 분석은 대조군 군과의 비교에 의해서 계산하였다. 모든 데이터를 평균 ± SD(n = 5)로 나타낸다. ** p < 0.01, *** p < 0.001.
도 23은 각각 PBS 또는 콤보 트랩 NP로 치료된 KPC 동종이식편을 보유한 마우스로부터의 상이한 기관 및 종양에서 DiI 표지된 LPD NP의 축적(A) 및 분포(B)를 도시한 도면.
도 24는 각각 PBS, CXCL12 트랩/Ctrl NP, PDL1 트랩/Ctrl NP 및 콤보 트랩 NP로 치료된 마우스로부터의 종양 내의 콜라겐 피복률을 도시한 도면.
도 25는 5개의 군으로 나뉘고, 격일로 4회 용량의 PBS, Ctrl NP, CXCL12 트랩/Ctrl NP, PD-L1 트랩/Ctrl NP 및 콤보 트랩 NP으로 치료된 KPC 보유 마우스의 H&E 모폴로지를 도시한 도면. 치료의 마지막에, 마우스를 안락사시키고, H&E 병리학 염색을 위해서 주요 기관을 수거하였다. 청색 사각형은 PBS 군 및 Ctrl NP 군의 간 및 신장을 강조하고, 이는 심각한 간 및 신장 독성을 나타낸다. 세포 액포화, 벗겨진-퇴행성 세포 및 벗겨진-퇴행성 세포 및 소상 괴사(황색 화살표)가 이들 기관에서 관찰되었다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 암 환자에서 생존율 및 치료의 개선은 전이 발생의 에방 또는 감소에 달려있다. 특히, 결장직장암(CRC) 환자는 간 전이가 발생하는 경향이 있다. 연구는 결장암 세포 상에서 발현되는 케모카인 수용체(CXCR4)와 간 성상 세포(HSC)에 의해서 분비되는 케모카인 리간드(CXCL12) 간의 관계가 CRC 간 전이에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다(Zeelenberg I, Ruuls-Van Stalle L, Roos E. The Chemokine Receptor CXCR4 Is Required for Outgrowth of Colon Carcinoma Micrometastases. Cancer Res., 63: 3833-3839, 2003). 이러한 간 성상 세포는 림프구의 염증 면적으로의 모집을 위해서 내생 CXCL12의 높은 수준을 생성하는 것으로 밝혀진 체류성 혈관 주위 세포(resident perisinusoidal cell)이다. 이동 및 침윤 연구는 높은 수준의 CXCL12의 존재 하에서, 결장직장암 세포(CXCR4 양성)는 CXCL12 농도 구배(gradient)를 통해서 이동 및 침입한다는 것을 보여주었다. 추가로 인간 결장직장암 샘플의 추가 연구는 또한 간 전이의 불량한 예후 및 더 높은 비율이 암 세포 상에서의 CXCR4 발현의 높은 수준과 상관관계가 있다는 것을 발견하였다(Zeelenberg I, Ruuls-Van Stalle L, Roos E. The Chemokine Receptor CXCR4 Is Required for Outgrowth of Colon Carcinoma Micrometastases. Cancer Res., 63: 3833-3839, 2003). 본 명세서에 기술된 바와 같이, 미래의 전이 부위(간)에서 이러한 CXCL12 구배를 (예방적으로) 방해하는 방법이 결장직장 간 전이의 발생을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 방법은 공지된 요법의 문제점을 회피한다. 소분자 CXCR4 길항제인 AMD3100으로의 동물의 치료는, CXCL12/CXRC4 축을 방해하는 것이 결장직장 간 전이의 발생을 감소시킬 수 있음을 입증하였다(Matsusue R, Kubo H, Hisamori S, Okoshi K, Takagi H, Hida K, Nakano K, Itami A, Kawada K, Nagayama S, Sakai Y. epatic stellate cells promote liver metastasis of colon cancer cells by the action of SDF-1/CXCR4 axis. Ann Surg Oncol. 16(9):2645-53, 2009). 그 다음, 다수의 CXCR4 길항제가 개발되었다. 그러나, 면역계에서 CXCL12 및 CXCR4의 내생적 역할은 정상 항상성에 필수적이다. 따라서, 소분자 단백질 및 단백질 요법을 포함하는 이러한 전통적인 치료는 전신적인 오프-타깃(off-target) 독성 문제에 대한 우려가 있다. 추가로, 본 발명자들의 지식으로는, CXCL12를 표적으로 하는 어떤 요법도 전이성 병변의 발생을 감소시키기 위해서 개발되거나 보고되어 있지 않다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, (CXCL12 트랩을 암호화하는) 유전자의 간으로의 전달이 간 미세환경, 예를 들어 그 내에서의 단백질 인자 수준을 변경시킬 수 있는, 독특한 항-암 전략이 성취될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법은 미세환경의 국지적이고, 일시적인 변경을 유발하고, 따라서 다른 세포를 바람직하지 않은 독성으로부터 보호한다. 이러한 유전자의 전달은 인자, 예컨대 CXCL12의 감소된 농도를 달성할 수 있으며, 결장직장암 세포의 이동/침윤에 저항하기 위해서 간을 프라이밍한다. CXCL12와 CXCR4 간의 회합은 간 전이에서 중요한 역할을 하는데, 여기서 CXCR4의 과-발현은 고도로 전이성인 전이성 인간 결장직장 간 전이 병변, 뿐만 아니라 간에서 발현되는 CXCL12의 높은 수준의 특징이다(Shan-shan Zhang, Zhi-peng Han, Ying-ying Jing, et al., CD133+CXCR4+ colon cancer cells exhibit metastatic potential and predict poor prognosis of patients. BMC Med. 10: 85, 2012).
본 명세서에 기술된 주제는 임의의 특정 조직 또는 표적 세포에 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 미세환경을 표적화하는 것은 독특한 항-암 패러다임인데, 여기서는 전이성 병변이 특이적으로 표적화되는 것이 아니라, 대신에 환경이 전이가 형성 또는 진행되기에 적합하지 않게 프라이밍되고, 궁극적으로 전이의 감소된 성장 및 발생을 허용한다. 치료 단백질의 국지적인 간 발현을 위한 표적화 모이어티, 예를 들어 갈락토스 표적화 모이어티의 혼입을 통해서, 오프-타깃 기관 또는 혈청에서 발견되는 발현이 없는 바람직한 조직을 표적화하는 것이 가능하다. 표적화 모이어티, 예를 들어 치료 단백질의 국지적 간 발현을 위한 갈락토스 표적화 모이어티의 혼입을 통해서, 오프-타깃 기관 또는 혈청에서 발현이 발견되지 않으면서 목적하는 조직을 표적화하는 것이 가능하다. 이러한 접근법은 간 이외의 다수의 조직에서 그리고 CXCL12 이외의 다른 트랩과 함께 사용될 수 있기 때문에, 다른 전이성 조직 예컨대 유방, 폐, 림프절, 전립선, 뇌, 췌장 및 골이 표적화될 수 있다.
다른 미세환경 인자는 암 전이의 이동, 침윤, 및 증식에서 역할을 할 수 있다. 이러한 인자는 염증이 유도될 때 관심 기관에서 보다 두드러지게 된다. 이러한 염증은 원발성 암으로부터의 분비된 단백질로부터 환자의 식이까지 다양한 다수의 상이한 환경 인자와 연관될 수 있다. 따라서, 이러한 인자는 또한 본 명세서에 기술된 주제에서 고려된다. 따라서, 고 전이성 조직 또는 전이에 민감한 조직에서 표적화 인자는 다수의 기관에서 전이의 발생/진행을 감소시키기 위한 유망한 치료요법이다.
질환을 치료하는 데 있어서 대부분의 접근법의 불충분한 표적 특이성은 임상에서 이러한 질환의 성공적인 치료를 위한 적용을 제한하였다. 추가로, 다수의 세포외 및 세포내 장벽으로 인해서, 유전자 치료요법의 단점은 실제로 다수의 질환의 임상 치료를 방해하였다. 따라서, 이러한 장벽을 극복하기 위해서, 본 발명자들은 표적 세포의 핵 내에서의 높은 특이성, 축적 및 전달을 갖는 임상 응용을 위해서 벡터를 개발하였다. 본 명세서에 기술된 주제는 이전 치료요법의 문제를 극복하고, 간 전이 및 원발성 암을 치료할 뿐만 아니라 다수의 다른 간 질환, 예컨대 HBV, 지방간, 간 경변증 및 다른 것을 치료할 수 있다. 추가로, 간 질환에 더하여, 상이한 표적화 모니어티, 예컨대 폐 상피 세포 상에서 높게 발현되는 아데노신 A2B 수용체를 표적화하는, 아데노신 유사체의 혼입을 통해서, 트랩, 예컨대 전이에 민감한 다른 조직에서 역할을 하는, CXCL12 또는 다른 미세환경 인자, pDNA 트랩을 축적 및 전달하도록 벡터를 프라이밍시킨다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 높은 전이 속도를 갖는 것으로 공지된 다수의 조직, 예컨대 폐, 림프절, 유방, 골 등의 미세환경 인자를 프라이밍시키는 데 사용될 수 있다.
다루기 힘든 암의 또 다른 유형은 췌장 종양인데, 이것은 이의 강한 면역 억제성 종양 미세환경(TME)으로 인해서 면역치료요법에 저항성이라고 공지되어 있다. CXCL12 및 PD-L1은 억제성 TME를 제어하는 2개의 분자이다. 높은 친화도(각각 (Kd = 4nM 및 16pM)로 이러한 2개의 분자 중 하나에 결합하는, 트랩의 하나의 유형으로서 본 명세서에 또한 지칭된, 융합 단백질이 제조되었고, 표적과의 특이적 결합에 대해서 시험되었다. 각각의 트랩을 암호화하는 플라스미드 DNA가 LPD 나노입자에서 제형화되었고, KPC 정위 췌장암을 보유한 마우스에게 IV에 의해서 주사되었다. 트랩의 발현은 주로 종양에 존재하였고, 부수적으로 간에 존재하였다. 조합 트랩 치료요법은 종양을 수축시키고, 숙주 생존을 57% 상당히 연장시켰다. 트랩 중 하나의 단독은 부분적인 치료 효과를 생성하였다. 본 발명자들은 또한 CXCL12 트랩이 종양으로의 T-세포 침투를 허용하였고, PD-L1 트랩이 침투된 T-세포가 종양 세포를 사멸시키는 것을 허용하였음을 발견하였다. 콤보 트랩 치료요법은 또한 종양 세포의 다른 기관으로의 전이를 상당히 감소시켰다. 간 및 신장을 비롯한 모든 주요 기관에서 어떤 독성도 관찰되지 않았다. 따라서, 조합 트랩 치료요법은 억제성 TME를 상당히 변형시켜서 숙주 면역계가 종양 세포를 사멸시키는 것을 허용한다.
본 명세서에 개시된 주제는 이제 하기에서 보다 완전히 기술될 것이다. 그러나, 본 명세서에 언급된 본 명세서에 개시된 주제의 다수의 변형 및 다른 실시형태는 상기 설명에 제공된 교시의 이점을 갖는 본 명세서에 개시된 주제가 속한 기술 분야의 통상의 기술자에게 함께 떠오를 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 주제는 개시된 특정 실시형태에 제한되지 않으며, 그러한 변형 및 다른 실시형태는 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다는 것을 이해해야 한다. 즉, 본 명세서에 기술된 주제는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포괄한다. 포함된 문헌, 특허 및 유사한 자료 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 기술 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 본 출원과 상이하거나 또는 모순되는 경우에, 본 출원이 우선시된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에 언급된 모든 참고 문헌은 이들의 전문이 참고로 포함된다.
I. 정의
용어 "미세환경"은 표적 세포 및 이의 인접한 환경공간(milieu)을 지칭한다.
용어 "작제물"은 유전 재료의 인공적으로 작제된 분절, 예컨대 핵산 서열, 즉 표적 조직 또는 세포에서 발현되는 핵산 서열을 지칭한다. 그것은 유전 삽입물 및 임의의 필요한 프로모터 등을 함유할 수 있고, 또한 벡터 내에 존재할 것이다.
용어 "에 민감한"은 이의 미세환경으로 인해서 특정 유형의 암이 조직 또는 세포에서 성장 또는 전이되는 경향이 있는 조직 또는 세포를 지칭한다. 비제한적인 예의 방식으로, 결장직장암은 간 세포의 미세환경의 결과로서 간에서 전이 및 성장하는 경향이 있다. 다른 암이 신체에서 특정 조직 및 세포로 전이된다고 공지되어 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 유방암은 간, 뇌 및 부위 림프절, 및 골로 전이되는 경향이 있다. 따라서 이들 조직 및 세포는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 민감하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전이를 감소시키는"은 민감한 조직 및 세포로의 전이를 저해 또는 경감시키는 것을 지칭한다. 전이에서의 감소를 결정하는 많은 방식이 사용될 수 있다. 비제한적인 예의 방식에 의해서, 전형적으로 전이되는 것으로 공지되어 있고, 치료 후에 전이를 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 전이가 예상될 암의 유형을 갖는 대상체가 전이의 감소를 나타낼 것이다. 특히, 본 명세서에 기술된 주제는 임의의 암의 간으로의 전이 감소를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "트랩"은 미세환경에서 표적 분자의 생물학적 활성도를 결합, 저해 또는 감소시키는 발현 산물을 지칭한다. 트랩은 바이러스, 비-바이러스, 합성, 예컨대 나노입자 등일 수 있고, 각각이 서브클로닝을 위한 필요한 재료 및 트랩의 발현을 포함하는 벡터에 의해서 전달된다. 트랩은 또한 단핵구 및 줄기 세포를 비롯한 리포좀 또는 살아있는 세포에 의해서 전달될 수 있다. 저해는 예를 들어, Kd에 의해서, 또는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 또는 그 초과로부터의, 표적의 활성도 감소를 나타냄으로써 측정될 수 있다. 트랩은, 다수의 예에서 본 명세서에 기술된 주제를 고려하여 관련 기술 분야에 공지되어 바와 같은 트랩핑 가능한 단백질인, 목적하는 표적 분자에 대해서 작용하도록 설계된다.
용어 "일시적인"은 비-영구적인 효과를 지칭한다.
용어 "대상체"는 동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않은 포유동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 실시형태에서, 대상체는 질환, 예컨대 암 또는 간 질환을 갖는 것을 진단되었다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭하고, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발생 또는 확산을 예방 또는 둔화(경감)시키는 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 이로운 또는 바람직한 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않음) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 차도(부분적 또는 전체적인지에 관계없음), 검출 가능한지 검출 가능하지 않은지의 여부를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상된 생존과 비교할 때 연장된 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람은 병태 또는 장애를 갖는 경향이 있는 사함 또는 병태 또는 장애가 예방되려는 사람뿐만 아니라 병태 또는 장애를 이미 갖는 사람을 포함한다.
구 "치료 유효량"은 (i) 특정 질환, 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, (ii) 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화, 개선 또는 제거하거나, (iii) 본 명세서에 기술된 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 예방 또는 지연시키는 트랩의 양을 의미한다. 암의 경우, 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/거나; 주변 기관으로의 암 세포 침입을 저해(즉, 어느 정도 둔화시키고, 바람직하게는 중단시킴)하고/하거나; 종양 전이를 저해(즉, 어느 정도 둔화시키고, 바람직하게는 중단시킴)하고/하거나; 종양 성장을 어느 정도 저해하고/하거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
용어 "암"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭 또는 기술한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 염을 나타낸다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염 및 염기 부가 염 둘 모두를 포함한다. 구 "약제학적으로 허용 가능한"은 물질 또는 조성물이 제형에 포함된 다른 성분 및/또는 치료될 포유동물과 화학적으로 그리고/또는 독성학적으로 상용성이어야 한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전달"은 물질 또는 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)의 생리학적 부위, 조직 또는 세포로의 이송을 지칭한다. 이것은 세포의 세포내 부분 또는 세포외 공간으로의 전달을 포함한다. 세포의 세포내 부분으로의 폴리뉴클레오타이드의 전달은 또한 보통 "형질주입"이라 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포내" 또는 "세포내로"는 관련 기술 분야에 이해되는 바와 같은 이의 일상적인 의미를 갖는다. 일반적으로, 막에 의해서 둘러싸인, 세포의 내부의 공간은 "세포내" 공간이라 정의된다. 유사하게, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외" 또는 "세포외로"는 관련 기술 분야에 이해되는 바와 같은 이의 일상적인 의미를 갖는다. 일반적으로, 세포막의 외부 공간이 "세포외" 공간이라 정의된다.
섬유모세포는 동물 조직을 위한 구조 프레임워크(스트로마)인, 세포외 매트릭스 및 콜라겐을 합성하는 세포이다. 섬유모세포의 주요 기능은 세포외 매트릭스의 전구체를 연속적으로 분비함으로써 결합 조직의 구조적 온전성을 유지시키는 것이다. 실시형태에서, 섬유모세포는 본 명세서에 기술된 벡터를 위한 스트로마 표적이다.
하기 약어가 본 명세서에서 사용될 수 있다. 일부 약어는 이들이 이 문서의 텍스트에서 존재하는 곳에서 정의된다.
ALT 알라닌 아미노트랜스퍼라제
AST 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제
BLI 생물-층 간섭계법
BUN 혈액 요소 질소
CMV 사이토메갈로바이러스
CRC 결장직장암
DLS 동적 광 산란
DAPI 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌
DOPA 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트
DOTAP 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판
DSPE 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민
ELISA 효고 결합 면역흡착 검정법
GFP 녹색 형광 단백질
LCP 지질 인산칼슘
mc 모노-사이클릭
NHS N-하이드록시석신이미드
PBS 인산염 완충 염수
PEG 폴리에틸렌 글리콜
PK 약동역학
pTrap 갈락토스-PEG-LCP w/pCXCL12 트랩/mc-CR8C
TEM 투과 전자 현미경
면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 각각 "경쇄 가변 도메인"("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인"("VH 도메인")이라 칭함)은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해서 중단된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합을 위해서 CDR을 정렬하는 작용을 한다. CDR은 항원 결합에 대해서 주로 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지, VL 도메인 및 VH 도메인 둘 모두는 하기 프레임워크(FR) 및 CDR 영역을 포함한다:　 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.　 VL 도메인의 CDR 1, 2, 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3이라 지칭되고; VH 도메인의 CDR 1, 2, 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이라 지칭된다.
각각의 VL 도메인 및 VH 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 CDR의 임의의 종래의 정의에 따른다. 종래의 정의는 카바트(Kabat) 정의(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 코티아(Chothia) 정의(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); CDR-H1이 코티아 CDR과 카바트 CDR의 복합인 코티아 카바트 CDR의 복합; 옥스포드 분자 항체 모델링 소프트웨어에 의해서 사용된 AbM 정의; 및 마틴(Martin) 등의 접촉 정의(bioinfo.org.uk/abs)(표 1 참고)를 포함한다.　 카바트는 널리 사용되는 넘버링 관습(카바트 넘버링)을 제공하는데, 여기서 상이한 중쇄들 사이 또는 상이한 경쇄들 사이의 상응하는 잔기는 동일한 수로 배정된다. 항체가 CDR의 특정 정의(예를 들어, 카바트)에 의해서 CDR을 포함한다고 하는 경우, 그 정의는 항체에 존재하는 CDR 잔기(즉, 카바트 CDR)의 최소 수를 명시한다. 그것은 명시된 정의 외의 또 다른 관습적인 CDR 정의 내에 포함된 다른 잔기가 또한 존재하는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 카바트에 의해서 정의된 CDR을 포함하는 항체는 다른 가능성 중에서 CDR이 카바트 CDR 잔기를 함유하고, 다른 어떤 CDR 잔기도 함유하지 않는 항체, 및 CDR H1이 복합 코티아-카바트 CDR H1이고, 다른 CDR이 카바트 CDR 잔기를 함유하고, 다른 정의를 기반으로 하는 어떤 추가의 CDR 잔기도 함유하지 않는 항체를 포함한다.
Figure pct00001
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차원 접힘에 의해서 병치된 인접 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프라고도 공지됨)는 전형적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되는 반면, 3차원 접힘에 의해서 형성된 에피토프(컨포메이션 에피토프라고도 공지됨)는 전형적으로 변성 용매로의 처리 시에 손실된다. 에피토프는 독특한 공간 컨포메이션에서 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 컨포메이션을 결정하는 방법은 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참고하기 바란다. 에피토프는 선형일 수 있다. 에피토프는 또한 컨포메이션 에피토프일 수 있다. 단수 독립체는 그 독립체 중 하나 이상을 지칭하는 것을 주목해야 하고; 예를 들어, "양이온성 지질"은 하나 이상의 양이온성 지질을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함한다", "포함하다", 및 "포함하는"은 그 맥락이 달리 요구하지 않는 것을 제외하고는, 비-배타적인 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 값을 지칭하는 경우 명시된 양으로부터의 일부 실시형태에서 ± 50%, 일부 실시형태에서 ± 20%, 일부 실시형태에서 ± 10%, 일부 실시형태에서 ± 5%, 일부 실시형태에서 ± 1%, 일부 실시형태에서 ± 0.5%, 일부 실시형태에서 ± 0.1%의 변동을 포함하는 의미이며, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하거나 개시된 조성물을 사용하기에 적절하다.
추가 정의는 하기에 제시되어 있다.
II. 방법
실시형태에서, 본 발명의 주제는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포의 미세 환경을 변형시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 벡터는 표적 세포에서 트랩을 발현하기 위한 작제물을 포함하고, 여기서 트랩이 표적 세포에서 발현되고, 여기서 표적 세포의 미세환경이 변형된다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 트랩의 발현은 유효량의 발현된 트랩의 존재 하에서 표적 세포의 미세환경을 변형시킨다.
표적 세포의 미세환경을 변형시키는 것은 미세환경에서 정상적으로 존재하는 표적 분자의 양을 감소시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 양의 감소는 트랩의 부재 하에서의 양과 비교할 때 표적 세포의 양을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 초과만큼 낮추는 것을 지칭한다.
유용한 표적 분자는 단백질, 예컨대 효소, 케모카인, 사이토카인, 단백질 인자 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 표적은 하기 표 2의 것을 포함한다.
Figure pct00002
특히 유용한 표적 분자는 CXCL12이다. 다른 단백질 인자는 EGF, 뉴래귤린, FGF, HGF, VEGF, VEGFR 및 NRP-1, Ang1 및 Ang2, PDGF(BB-동종이량체) 및 PDGFR, TGF-β, 엔도글린 및 TGF-β 수용체, MCP-1, 히스타민, 인테그린 α2β1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, α6β4 및 α5β1, VE-카데린 및 CD31, 에프린, 플라스미노겐 활성인자, 플라스미노겐 활성인자 저해제-1, eNOS 및 COX-2, AC133, ID1/ID3, LOX, 및 HIF를 포함한다.
저해 및 차단 트랩 및 이의 표적: 거대분자 표적에 대한 저해 트랩은 특이적으로 결합하여 관심 표적의 생물학적 기능을 추가로 저해 또는 차단하는 단백질 분자일 수 있는 트랩을 포함한다. 저해 또는 차단 트랩의 표적은 IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-15, IL-21(및 IL 수용체), TNF-알파(및 TNF-알파 수용체), TGF-베타(및 TGF-베타 수용체), CSF-1(및 CSF-1 수용체), CXCR1 및 이의 리간드(CXCL5, CXCL6, CXCL8), CXCR2 및 이의 리간드(CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 및 CXCL8), CXCR3 및 이의 리간드(CXCL4, CXCL9, CXCL10, CXCL11), CXCR4 및 이의 리간드(CXCL12), CXCR5 및 이의 리간드(CXCL13), CX3CR1 및 이의 리간드(CX3CL1), CCR1 및 이의 리간드(CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23), CCR2 및 이의 리간드(CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL16), CCR3 및 이의 리간드(CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL15, CCL24, CCL26, CCL28), CCR4 및 이의 리간드(CCL17, CCL22), CCR5 및 이의 리간드(CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL14, CCL16), CCR6 및 이의 리간드(CCL20), CCR7 및 이의 리간드(CCL19, CCL21), CCR9 및 이의 리간드(CCL25), CCR10 및 이의 리간드(CCL27 및 CCL28), ACKR3 및 이의 리간드(CCL11, CCL12), ACKR6 및 이의 리간드(CCL18)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 사이토/케모카인 및 이의 상응하는 수용체일 수 있다.
저해 트랩의 표적은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(CD270 또는 TNFRSF14), BTLA(CD272), TIM-3, GAL9, TIGIT, A2aR, LAG-3, KIR 및 MHC 부류 I 또는 II를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역 관문 관련 단백질일 수 있다.
표적은 또한 저해 트랩핑에 의한 상향조절 또는 하향조절이 발현을 억제하거나 또는 IDO, TDO, 아르기나제-1/2, 아데노신 수용체, CD39, CD73, COX2, EP 수용체, 및 iNOS(이것은 아미노산(즉, 트립토판, 아르기닌, 시스테인, 글루타민 및 페닐알라닌)의 (IDO, TDO, ARG1/2에 의한) 이화작용, (CD39, CD73에 의해서 그리고 아데토신 수용체를 통해서 매개된) 아데노신, (COX2에 의한) 프로스타글란딘 E2, 반응성 산소 종(ROS) 및 (iNOS에 의한) 반응성 질소 종(RNS)의 생성에 관여됨)의 생물학적 활성을 감소시키는 것을 포함하고, 이들 모두는 TME의 면역억제를 유발한다.
소분자 대사산물에 대한 저해 트랩: 저해 트랩의 표적은 또한 트립토판 대사산물(즉, IDO 또는 TDO 및 아릴 탄화수소 수용체를 통한 신호에 의해서 생산된 키누레닌), cAMP 및 아데노신(T 세포의 저해, 면역억제 세포의 모집 및/또는 확장 및 결과적으로 면역억제 종양 미세환경에서 중요한 역할을 함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 소분자일 수 있다.
자극 트랩 및 이의 표적: 트랩은 또한 면역 관문 표적 CD28, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137 또는 TNFRSF9), OX40(CD134 또는 TNFRSF4), GITR(CD357 또는 TNFRSF18), CD27(TNFRSF7), 및 CD40(TNFRSF5)에 효능적으로 작용하는 것을 비롯한, 자극성일 수 있다. 자극 트랩은 트랩은 또한 B7.1(CD80), B7.2(CD86), B7-H5(VISTA 또는 Gi24), ICOSL(B7H2 또는 CD275), 4-1BBL(CD137L), OX40L(CD252), GITRL, CD27L(CD70), 및 CD40L(CD154)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 상기 수용체의 리간드의 효능적 효과를 보유하거나 모방하는 것일 수 있다. 효능적 트랩에 대한 표적은 또한 T 세포의 활성화에 중요한 역할을 하는 TLR4, TLR7, TLR8, 및 TLR9를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 일부 톨-유사 수용체를 포함한다. 트랩은 항체-유사 도메인 또는 단편을 기반으로 할 수 있다. 케모/사이토카인 트랩의 국지적이고, 일시적인 발현이 목적하는 생물학적 활성 및 낮은 독성을 유발하는 것을 발견하였다. 표적-결합 생물학의 대부분은 긴 반감기를 갖는 전장 단클론성 항체에 달려있다. 사실, CXCL12 트랩의 전신 투여 및 장기적인 투여는 생체내 데이터에서 입증된 바와 같이, 일시적인 간 손상 및 백혈구 수 감소를 유발할 수 있다. 또한, 큰 크기, 복잡한 구조 및 정교한 번역-후 변형으로 인해서, 전장 항체는 TME를 접근하기 위한 조직 침투에서의 비효율성, 표적-트랩핑 특성, 예컨대 수용체 결합의 분열을 조작 및 최적화하는 데 있어서의 어려움, 높은 안정성, 이중특이성(필요한 경우) 및 Fc-유도된 부작용을 비롯한, 케모/사이토카인 트랩으로서 작용하는 데 있어서 몇몇 내재하는 단점을 갖는다. 이러한 도전을 다루기 위한 본 발명자들의 전략은 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, VH 및 VL 융합 단백질, scFV, 항체, 비-면역글로불린 표적-결합 도메인, 예컨대 비-면역글로불린 스캐폴드(예컨대, FN 도메인-기반 모노바디, Z 도메인-기반 어피바디, DARPIN) 단독 및 임의의 조합물을 기반으로 하는 단일 도메인 항체 유사체의 결합 및/또는 프레임워크 영역으로부터 유래된 펩타이드 또는 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 작은 단백질 도메인을 기반으로 하는 단백질 라이브러리로부터의 목적하는 특징부를 갖는 신규 트랩핑 분자를 개발하는 것이다.
일부 공지된 표적-결합 항체는 본 작업에 기술된 국지적인 유전자 전달 접근법 및 일시적인 유전자 전달 접근법을 위한 트랩으로서 작용하도록 변경 및 조작될 수 있다. 자연 수용체(들)과 효과적으로 경쟁하기 위해서, 트랩은 단백질/펩타이드 디스플레이 및 선택 기술, 예컨대 파지 디스플레이, 세포 표면 디스플레이, mRNA 디스플레이, DNA 디스플레이, 시험관내 단백질 선택에서 널리 사용되는 리보솜 디스플레이를 사용하여, 관심 표적과 상호작용하여 사용될 수 있는 표면 루프 또는 잔기에서 높은 다양성을 갖는 단백질 또는 항체 단편으로부터 지향되는 단백질 선택을 통해서 달성될 가능성이 더 높은 특성인, 수용체-결합 부위에 대해서 특이하게 높은 결합 특이성 및 친화도를 보유해야 한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 간에 대한 CXCR4 양성 결장직장암 세포의 이동/침윤에서 중요한 역할을 한다고 알려진 케모카인인, 특정 중요 케모/사이토카인, 예를 들어, CXCL12에 의해서 매개된 신호전달 경로의 국지적이고, 일시적인 봉쇄는 CRC 전이를 상당히 예방할 수 있다. 본 발명자들은 먼저 프로테아제-저항성 가요성 링커를 통해서 VH 도메인 및 VL 도메인을 융합시킴으로써, 항-CXCL12 항체 서열을 기반으로 하는 CXCL12 트랩 유전자를 조작하였다. 발현 후 간 간세포로부터의 효율적인 분비를 달성하기 위해서, 강한 신호 펩타이드를 N-말단에 혼입한 반면, 친화도 태그를 C-말단에 도입하여 단백질 정제 및 검출을 가능하게 하였다. 생성된 CXCL12 트랩의 암호 서열을 CMV 프로모터에 의해서 지향된, 발현 벡터 pCDNA3.1 내에서 클로닝하였다. 293T 세포에서 발현되고, 이로부터 정제된 생성된 CXCL12 트랩은 CXCL12와 4nM의 Kd를 갖는 것으로 발견되었지만(도 2a), CXCL1, CXCL8 및 CXCL10과 이의 결합은 검출 가능하지 않았다. 이러한 CXCL12 트랩은 CXCL12로 자극되는 CT-26 FL3 세포의 이동 및 침윤을 상당히 억제하였다(도 2b 및 도 2c). 이러한 CXCL12 트랩의 국지적이고, 일시적인 발현을 지질 인산칼슘(LCP) 나노입자를 기반으로 하는 유전자 전달 시스템을 사용하여 시험하였다(도 5). 하기에 상술된 바와 같이, LCP 중에 제형화된 pCXCL12-트랩 pDNA를 갖는 3종의 치료는 다른 기관으로의 암 확산의 징후 없이 CT26-FL3 결장직장 간 전이의 임의의 발생을 완전히 해결하였다(도 6).
훨씬 더 높은 효력을 갖는 CXCL12 트랩을 생성하기 위해서, 본 발명자들은 VH 도메인 라이브러리를 기반으로 하는 CXCL12 트랩을 개발하였다. 시험관내 단백질 분비를 가능하게 하기 위해서, 본 발명자들은 C-말단 바이오틴 태그를 함유한 야생형 재조합 CXCL12(wtCXCL12-바이오틴, 도 1a), 뿐만 아니라 CXCL12 돌연변이체(ΔCXCL12, 도 1b)(여기서 CXCR4-결합에 관여된 N-말단 8 잔기(도 1a에서 청록색으로 강조됨)가 결실됨)를 발현시키고, 정제하였다. wtCXCL12-바이오틴을 양성 선택을 위한 표적으로서 사용한 반면, ΔCXCL12를 경쟁 세척을 통해서 바람직하지 않은 부위에 결합하는 서열을 제거하기 위해서 사용하였다. CCL2 및 CCL5에 대해서 도 1b에 도시된 바와 같이, 다른 케모카인에 대해서 단일 도메인 트랩을 개발하기 위해서 유사한 전략을 사용하였다.
간략하면, 스트렙타비딘-아가로스 칼럼으로 미리-세정된 디스플레이된 VH 도메인 라이브러리를 다이설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 결합 완충제 중에서 적절한 양의 바이오티닐화된 wtCXCL12와 함께 인큐베이션시켰다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 미리-세척된 스트렙타비딘 아가로스 비드를 첨가하여 VH 서열을 포획하였다. 생성된 비드를 먼저 결합 완충제로 세척하여 비특이적으로 결합한 서열을 제거하고, 그 다음 상당히 과량의 ΔCXCL12로 경쟁 세척하여 CXCR4-결합 N-말단으로부터 먼 부위에서 CXCL12에 결합된 VH 서열을 제거하였다. 풍부 풀(pool)을 새로운 선택 라운드를 위해서 재생시켰다. 광범위한 경쟁 세척을 수행하여 매우 느린 오프-레이트(off-rate)로 N-말단 CXCL12에 결합하는 서열의 농후화를 가능하게 하였다. 5회의 선택 라운드 후, 본 발명자들은 ΔCXCL12가 아닌 wtCXCL12에 강하고 특이적으로 결합하는 6개의 VH 서열을 성공적으로 식별하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 이러한 서열은 낮은 나노몰 내지 피코몰의 범위의 wtCXCL12-결합 친화도를 갖는, 매우 느린 오프-레이트를 갖는다.
상승작용적 케모/사이토카인 트랩핑 효과를 갖는 2가 트랩
케모카인은 생리 조건 하에서 단량체 및 이량체로서 존재하고, 주목할 만한 증거는 둘 모두가 생체내에서 기능을 조절한다는 것을 시사한다. 케모카인 이량체화는 결국 다양한 하류 신호전달 경로의 활성화에 차별적으로 영향을 주는, 컨포메이션 하위상태의 분포를 교란시킨다는 가설이 있다. CXCL1, CXCL12, CCR2, CCR5, 및 IL-6 모두는 이량체 또는 올리고머 구조를 채택하여 이의 쌍을 이룬 수용체와 상호작용한다고 보고되어 있다.
일반적으로, CXC 케모카인은 먼저 β-스트랜드 및 α-헬릭스를 사용하여 이량체화하여 구상(globular) 구조를 형성하고, 이량체 계면은 N-말단 및 N-루프 영역에 결합하는 수용체로부터 멀리 위치된다. CC 케모카인은 이의 N-루프를 사용하여 이량체화되고, 연장된 구조, 및 이러한 이의 이량체화 및 수용체 결합 도메인 중첩을 형성한다. 예를 들어, CXCL12는 생리 조건 하에서 단량체 및 이량체 둘 모두를 형성하는데, 이것은 세포 신호전달 및 기능(Ray P 2012 PMID22142194)에 대해서 구별되는 효과를 갖는다. 단량체 CXCL12는 Gαi 및 Akt를 통해서 CXCR4 신호전달을 우세하게 활성화시키고, 이량체 형태는 β-아레스틴 2의 CXCR4로의 모집 및 CXCR4-발현 암 세포의 주화성(chemotaxis)을 보다 효과적으로 촉진시킨다. 중요하게는, 이량체 CXCL12는 CXCR7보다 CXCR4에 우세하게 결합한다. 이러한 발견은, 이량체 CXCL12를 트랩핑하는 것이 CXCR4-매개된 신호전달 경로를 보다 효과적으로 차단할 수 있음을 나타낸다. 동종이량체 또는 이종이량체 트랩은 유전자 융합을 통해서 용이하게 생성될 수 있다(도 1c). 동종이량체 케모/사이토카인 트랩을 생성하기 위해서, 각각의 단일 도메인 트랩을 재조합 융합 단백질로서 가요성 링커를 통해서 그 자체와 유전자 융합할 수 있다. 유사하게, 2개의 독특한 부위에서 관심 케모카인에 결합하는 이종이량체 트랩은 유사한 친화도로 비중첩 부위에 결합하는 2개의 트랩을 사용하여 생성될 수 있다.
2개의 상이한 케모/사이토카인에 의해서 매개되는 신호전달을 차단하는 이중특이적 트랩.
종양 전이 및 TME 면역억제에 관여되는 케모카인 네트워크의 중복성(redundancy)은, 하나를 초과하는 신호전달 경로에 작용하는 트랩핑 치료요법이 보다 효과적이어야 한다는 것을 나타낸다. 2개의 상이한 케모/사이토카인에 의해서 매개된 신호전달 경로를 동시에 차단할 수 있는 이중특이적 트랩은 길이 조정 가능한 가요성 링커를 통해서 독특한 특이성을 갖는 2개의 트랩을 유전자적으로 연결함으로써 생성될 수 있다(도 1c).
매우 효력있는 표적-트랩핑 효율성을 갖는 3가 PD-L1 트랩
관심 표적에 결합하는 고품질 리간드를 개발하는 가장 효과적인 방식 중 하나는 표적-결합 도메인을 거의 모든 유형의 항체 및 다수의 다량체 상호작용 단백질에서 발견되는 바와 같은 이의 다가 형태로 전환시키는 것이다. 가능한 면역원성을 최소화하기 위해서, 마우스, 인간 또는 이러한 단백질을 기반으로 하는 다른 유기체 및 삼량체화 도메인에서 풍부한 세포외 단백질로부터의 고도로 안정한 삼량체화 도메인을 국지적인 유전자 전달 목적 및 일시적인 유전자 전달 목적을 위해서 3가 트랩의 생성을 위해서 사용할 수 있다. 본 발명자들은 인간 CMP-1로부터의 삼량체화 도메인을 사용하도록 선택하였다. 마우스 또는 인간 CMP-1의 C-말단 내에서의 강한 소수성 및 이온성 상호작용이 높은 안정성을 갖는, 평행한, 다이설파이드-연결된, 막대-형상의 삼량체 구조를 생성한다. 본 발명자들은 삼량체화 도메인과의 유전자 융합에 의해서 내생 단백질(예컨대 PD-L1, PD-1)로부터의 표적-결합 도메인의 손쉬운 전환 또는 단백질 선택으로부터의 친화도 도메인의 이의 3가 형태로의 손쉬운 전환을 허용하는 강력한 기술 플랫폼을 개발하였고, 이는 높은 안정성 및 상당히 향상된 결합활성(avidity)을 갖는 3가 트랩을 생성한다. 전형적으로, 낮은 나노몰 내지 피코몰의 결합 친화도로 관심 표적에 결합하는 3가 트랩은 1,000배 더 약한 단량체 도메인으로부터 용이하게 생성될 수 있다. 이러한 삼량체화 도메인의 마우스 서열은 인간 CMP-1의 것에 상당히 상동성이어서, 번역 응용이 바람직한 경우 인간 버전으로 전환하는 것을 용이하게 한다. 삼량체 트랩은 3개의 동일한 단량체의 자가-조립을 통해서 형성되기 때문에, 그것은 단량체를 암호화하는 cDNA 만을 필요로 하는데, 이는 유전자가 훨씬 더 신속하고 더 용이하게 전달되게 한다. 이러한 전략을 사용하여, 본 발명자들은 PD-L1에 결합하는 PD-1의 마우스 또는 인간 세포외 도메인을 마우스 및 인간 카트리지에서 매우 풍부한 안정한 삼량체화 도메인과 유전자 융합시킴으로써 강력한 PD-L1 트랩을 개발하였다(도 1d). 생성된 3가 단백질은 약 16피코몰(이것은 내생 PD-1과 PD-L1 사이에서의 것의 10,000-배 더 높음)의 Kd로 PD-L1에 결합하였다(도 1d). 추가로, 췌장암의 면역 적격 KPC 모델에서, 이러한 삼량체 트랩을 암호화하는 플라스미드 DNA(도 15)는 CXCL12에 대한 트랩과 함께 사용되는 경우, NP의 IV 투여 후에 종양 수축을 효율적으로 유도하였다.
또 다른 실시형태에서, 삼량체는 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성되었고, 여기서 각각의 융합 폴리펩타이드는 PD-1 세포외 도메인, 가요성 링커, 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 상기 삼량체는 PD-L1에 결합할 수 있고, 여기서 융합 폴리펩타이드는 서열번호 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해서 암호화된다.
실시형태에서, 유용한 트랩은 수용체를 포함한다. 사이토카인 수용체는 구조적으로 관련된 패밀리로 존재하고, 사이토카인-매개된 통신을 가능하게 하는 고-친화도 분자 신호전달 복합체를 포함한다. 유형 I 사이토카인 수용체는 이의 세포외 아미노산 도메인에서 특정 보존 모티프를 갖고, 고유한 단백질 타이로신 카이나제 활성이 결핍되어 있다. 이러한 패밀리는 IL2(베타-소단위), IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, IL12, GM-CSF, G-CSF, Epo, LIF, CNTF에 대한 수용체, 및 또한 트롬보포이에틴(TPO), 프로락틴 및 성장 호르몬에 대한 수용체를 포함한다. 유형 I 사이토카인 수용체 패밀리는 수용체 신호전달 성분(gp130, 공통 베타, 및 공통 감마 - IL2 수용체의 감마-쇄)의 3가지 상이한 유형 중 하나와 착물을 형성하는 패밀리 구성원의 능력을 기초로 3개의 하위세트로 나뉜다.
유형 II 사이토카인 수용체는 이종 소단위로 구성된 다량체 수용체이고, 주로 인터페론에 대한 수용체이다. 이러한 패밀리는 IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IL10, IL22, 및 조직 인자에 대한 수용체를 포함한다. 유형 II 사이토카인 수용체의 세포외 도메인은 이의 리간드-결합 도메인에서 구조적 유사성을 공유한다. 몇몇 보존 세포내 서열 모티프가 설명되어 있는데, 이것은 아마도 세포내 효과기 단백질 JAK 및 STAT 단백질에 대한 결합 부위로서 기능한다.
케모카인 수용체는 7개의 막관통 구조를 갖고, 신호 변환을 위해서 G-단백질에 결합된 G 단백질-결합 수용체이다. 케모카인 수용체는 상이한 패밀리로 나뉜다: CC 케모카인 수용체, CXC 케모카인 수용체, CX3C 케모카인 수용체, 및 XC 케모카인 수용체(XCR1).
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 패밀리 구성원은 긴 분자를 생성하는 CXXCXXC의 코어 모티프를 둘러싼 2개의 다이설파이드 결합으로 형성된 시스테인-풍부 도메인(CRD)을 공유한다. TNFR은 다른 불활성 프로카스파제를 절단하여 카스파제 캐스케이드를 촉발시켜 세포가 비가역적으로 아포토시스할 수 있도록 어댑터 단백질(FADD, TRADD 등)을 통해서 프로카스파제와 연관된다.
TGF-베타 수용체는 세린/트레오닌 카이나제 수용체를 단일 통과한다. TGF-베타 수용체는 TGFBR1, TGFBR2, 및 TGFBR3을 포함하는데, 이것은 이의 구조 및 기능 특성에 의해서 구별될 수 있다.
방법이 전신 투여를 포함하지만, 방법은 국지적으로 작용하고, 즉 미세환경에 대한 효과는 일반적으로 표적 세포 내에서 또는 그 주변에서 일반적으로 단리된다. 이는 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이 표적화 세포를 벡터 상에 혼입함으로써 성취될 수 있다.
방법은 또한 일시적이다. 즉, 방법의 효과는 약 삼(3)일 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 20시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 16시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 12시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 10시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 8시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 6시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 4시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 3시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 3시간 이하 동안 지속된다. 실시형태에서, 효과는 약 1 시간 이하 동안 지속된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 주제는 암을 앓고 있는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 전이를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 벡터는 트랩을 포함하고, 여기서 트랩은 전이에 민감한 조직으로 전달되고, 이어서 그 조직 내에서 발현되고, 그 조직으로부터 방출되고, 암의 조직으로의 전이가 감소된다.
이러한 실시형태에서, 방법은 상기에 기술된 모든 변수를 포함한다.
추가로, 방법은 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이 암에 특히 유용하다.
전이의 감소는 즉, 검출 가능하지 않은 총 저해로부터의 암 및/또는 종양의 유형 및 침입력(aggressiveness)을 고려할 때 예상된 것보다 더 낮은 전이의 수준까지일 수 있다. 이러한 유형 및 종양은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 대조군 또는 비교군보다 더 낮은 전이를 나타내는 데이터가 또한 본 명세서에 기술된 방법을 입증한다. 감소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 그 초과로부터일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 주제는 암을 앓고 있는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법에 관한 것이며, 여기서 벡터는 트랩을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 주제는 암을 앓고 있는 대상체에게 조합물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법에 관한 것이며, 여기서 조합물은 적어도 2종의 벡터를 포함하고, 여기서 벡터 중 하나는 사이토카인/케모카인에 대한 트랩을 포함하고, 또 다른 벡터는 암과 연관된 표적에 대한 트랩을 포함한다. 특정 양상에서, 조합물은 CXCL12 케모카인에 대한 트랩 및 PD-L1에 대한 트랩을 포함하고, 암은 췌장암, 예컨대, 췌장관 선암이다. 또 다른 양상에서, 조합물은 CXCL12 케모카인에 대한 트랩 및 PD-1에 대한 트랩을 포함하고, 암은 췌장암, 예컨대 췌장관 선암이다. 또 다른 실시형태에서, 조합물은 CXCL12 트랩과 PD-1 트랩, CXCL12 트랩과 PD-L1 트랩, CXCL12 트랩과 PD-L2 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 CD27 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 CD28 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 ICOS 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 CD40 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 OX40 트랩, CXCL12 트랩과 효능적 CD137 트랩, CXCL12 트랩과 IDO 트랩, CXCL12 트랩과 TDO 트랩, CXCL12 트랩과 ARG1 트랩, CXCL12 트랩과 NOS 트랩, CXCL12 트랩과 TGF-베타 트랩, CXCL12 트랩과 B7-H3 트랩, CXCL12 트랩과 B7-H4 트랩, CXCL12 트랩과 CTLA4 트랩, CXCL12 트랩과 HVEM 트랩, CXCL12 트랩과 BTLA 트랩, CXCL12 트랩과 LAG3 트랩, CXCL12 트랩과 KIR 트랩, CXCL12 트랩과 TIM3 트랩, CXCL12 트랩과 GAL9 트랩, CXCL12 트랩과 A2aR 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCR1 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCR2 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCR4 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCR5 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCR7 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR2 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR4 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR5 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR7 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR9 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCL1 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCL8 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CXCL10 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCL2 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCL5 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCL22 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 IL-6 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 IL-10 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 TGF-베타 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CSF1 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 B7-H3 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 B7-H4 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CTLA4 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 HVEM 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 BTLA 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 LAG3 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 KIR 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 TIM3 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 GAL9 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 A2aR 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 CCR4 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 IDO-1 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 TDO 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 ARG1 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 NOS 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 PI3K 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 CD27 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 CD28 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 ICOS 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 CD40 트랩, PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 OX40 트랩, 및 PD-1 또는 PD-L1 트랩과 효능적 CD137 트랩을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 항-인간 CXCL12 항체로부터의 VH 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 항-인간 CXCL12 항체로부터의 VL 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 항-인간 CXCL12 항체로부터의 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 FN 도메인-기반 모노바디, Z 도메인-기반 어피바디, 및 DARPIN을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항체를 모방하는 비-면역글로불린 도메인을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 인간 CXCL12는 젠뱅크 수탁 번호 AAH39893(서열번호64) 또는 젠뱅크 수탁 번호 AAV49999(서열번호65)에 제시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간 CXCL12의 핵산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 AY802782(서열번호 66)에 제시되어 있다.
또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 VH 영역을 포함하고, 여기서 상기 VH 영역은 서열번호 2, 7, 12 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 VH 영역(여기서, 상기 VH 영역은 서열번호 17과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가짐), 및 VL 영역(여기서, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가짐)을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 VH 영역으로 본질적으로 이루어지고, 여기서, VH 영역은 서열번호 17의 상응하는 VH 영역과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 VL 영역으로 본질적으로 이루어지고, 여기서 VL 영역은 서열번호 18의 상응하는 VL 영역과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, CXCL12 트랩은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 VH 영역을 포함하고, 여기서, 3개의 CDR은 (a) 각각 서열번호 3 내지 5이거나; (b) 3개의 CDR은 각각 서열번호 8 내지 10이거나; (c) 3개의 CDR은 각각 서열번호 13 내지 15이거나; 또는 (d) 3개의 CDR은 각각 서열번호 19 내지 21이고, VL 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖고, 여기서 CDR은 각각 서열번호 22, 23 및 24이다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 63과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해서 암호화된 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
췌장관 선암은 매년 전세계적으로 330,000명의 사람을 사망하게 하는 치명적인 질환이다(American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012. Atlanta: American Cancer Society; 2012. p. 25-6). 5-년 생존율은 단지 약 12%이다. 질환은 화학 및 방사선 치료요법에 대한 저항성이라고 공지되어 있다. 그것은 관문 저해제에 저항성이다. 90% 초과의 PDAC가 돌연변이화된 KRas이고, 대부분은 또한 p53 유전자에서 추가 돌연변이를 함유한다. KRas 및 p53 돌연변이 둘 모두를 함유하는 유전자 변형된 마우스 모델, 즉, KPC 마우스는 PDAC를 자발적으로 발생시키고, 이것은 발생된 임상 질환을 유사하게 모방한다. 본 발명자들은 KPC98027로 지칭되는, KPC 종양으로부터 유래된 세포주를 사용하였고, 이것은 동계 C57BL6 마우스에서 췌장의 테일에서 정위에서 접종되었다. 종양 세포주는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 루시페라제 및 적색 형광 단백질과 함께 안정하게 형질도입되었다.
종양은 관문 저해제를 비롯한 면역치료요법에 저항성이기 때문에, 본 발명자들은 억제성 면역 TME가 종양에서 주요 분자를 표적화하는 트랩 단백질을 국지적으로 발현시킴으로써 변형될 수 있다는 가설을 세웠다. 페이그(Feig) 등의 작업으로부터, CXCL12는 T-세포가 종양을 침윤시키는 것을 허용하지 않는 주요 케모카인인 것 같다(Feig et al., Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer, PNAS, 2013 Dec 10;110(50):20212-7). 종양에서 국지적으로 발현된 CXCL12 트랩은 문제점을 완화시킬 것이다. KPC 종양은 PD-L1을 과발현시키고, 이것은 면역계에서의 관문이다. 종양 세포에서 PD-L1의 과발현은 PD-1/PD-L1 축 상호작용을 통해서 T-세포를 사멸시킬 것이다. 따라서, 본 발명자들은 유전자 치료요법을 통해서 종양에 두 트랩 모두를 전달하기로 결정하였다. 양호하게 설정된 지질-프로타민-DNA(LPD) 나노입자(NP)를 사용하여 종양에 대한 트랩을 암호화하는 플라스미드 DNA를 전달할 수 있다.
조합물은 상승작용적일 수 있다. 용어 "상승작용적"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 2종 이상의 단일 치료제의 상가적 효과보다 더 효과적인 치료 조합물을 지칭한다. 예를 들어, 사이토카인 트랩과 PD-L1 트랩 간의 상승작용적 상호작용의 결정은 본 명세서에 기술된 검정법으로부터 수득된 결과를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 생체내에서 또는 시험관내 방법이 본 명세서에 개시된다. 이러한 검정법의 결과는 조합 앤덱스(Combination Index)를 수득하기 위해서 초우(Chou) 및 탈라레이(Talalay) 조합 방법 및 칼쿠신(CalcuSyn) 소프트웨어를 사용한 용량-효과 분석법을 사용하여 분석될 수 있다(Chou and Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55). 제공된 조합물은 1종 이상의 검정법 시스템으로 평가될 수 있고, 데이터는 항암제 중에서 상승작용, 상가작용 및 길항작용을 정량분석하기 위한 표준 프로그램을 사용하여 분석될 수 있다. 예시적인 프로그램은 문헌[Chou and Talalay, in New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy, Academic Press, 1987, Chapter 2]에 기술된 것이다. 0.8 미만의 조합 인덱스 값은 상승작용을 나타내고, 1.2를 초과하는 값은 길항작용을 나타내고, 0.8 내지 1.2의 값은 상가적 효과를 나타낸다. 조합 치료요법은 "상승작용"을 제공하고, "상승작용적", 즉, 함께 사용되는 활성제가 화합물을 별개로 사용하는 것으로부터 생성된 효과의 합보다 더 큰 경우 달성된 효과임을 증명한다. 상승작용적 효과는 활성제가 (1) 조합된 단위 투여 제형으로 동시에 함께 제형화되고, 투여 또는 전달되는 경우; (2) 별개의 제형으로서 교대로 또는 병렬로 전달되는 경우; 또는 (3) 일부 다른 요법에 의해서 달성될 수 있다. 교대 치료요법으로 전달되는 경우, 상승작용적 효과는, 화합물이 순차적으로, 예를 들어, 별도의 주사기로 상이한 주사에 의해서 투여 또는 전달되는 경우 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 치료요법 동안, 각각의 활성제의 유효 투여량은 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되는 반면, 조합 치료요법에서, 2종 이상의 활성제의 유효 투여량이 함께 투여된다. 조합 효과는 BLISS 독립성 모델 및 최고 단일 작용제(HSA) 모델 둘 모두를 사용하여 평가될 수 있다(Lehar et al., Molecular Systems Biology, 3:80 (2007)). BLISS 점수는 단일 작용제로부터의 강화작용(potentiation)의 정도를 정량분석하고, 양성 BLISS 점수(0 초과)는 단순한 가산성(additivity)을 초과함을 시사한다. 250을 초과하는 누적 양성 BLISS 점수는 시험된 농도 범위 내에서 관찰되는 강한 상승작용인 것으로 간주된다. HSA 점수(0 초과)는 상응하는 농도에서 단일 작용제의 최대치보다 큰 조합 효과를 시사한다.
본 명세서에 기술된 구체적인 실시형태는 하기를 포함한다:
1. 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법으로서, 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하되, 벡터는 표적 세포에서 트랩을 발현하기 위한 작제물을 포함하고, 트랩이 표적 세포 내에서 발현되고, 표적 세포의 미세환경이 변형되는, 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 미세환경의 변형은 미세환경에서 표적 분자의 양을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 표적 분자는 단백질, 단백질 인자, 케모카인, 및 사이토카인, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
4. 실시형태 1 내지 3에 있어서, 표적 분자는 케모카인인, 방법.
5. 실시형태 1 내지 4에 있어서, 케모카인은 CXCL12인, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5에 있어서, 작제물은 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
7. 실시형태 1 내지 6에 있어서, 트랩은 CXCL12 트랩인, 방법.
8. 실시형태 1 내지 7에 있어서, 표적 세포는 기관 세포인, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8에 있어서, 세포는 간, 폐, 뇌 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9에 있어서, 트랩의 발현은 일시적인, 방법.
11. 실시형태 1 내지 10에 있어서, 미세환경의 변형은 일시적인, 방법.
12. 암의 전이를 감소시키는 방법으로서, 암을 갖는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투어하는 단계를 포함하되, 벡터는 트랩의 발현을 위한 작제물을 포함하고, 트랩은 전이에 민감한 조직에서 발현되고, 조직으로의 암의 전이가 감소되는, 방법.
13. 실시형태 12에 있어서, 암은 고형암인, 방법.
14. 실시형태 12 내지 13에 있어서, 암은 폐암, 림프절암, 유방암, 골암, 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
15. 실시형태 12 내지 14에 있어서, 암은 CRC이고, 조직은 간 조직인, 방법.
16. 실시형태 12 내지 15에 있어서, 작제물은 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
17. 실시형태 12 내지 16에 있어서, 트랩은 CXCL12 트랩인, 방법.
본 방법은 질환을 치료하는 데 있어서 대부분의 접근법의 불충분한 표적 특이성을 극복한다. 추가로, 다수의 세포외 장벽 및 세포내 장벽으로 인해서, 유전자 치료요법의 단점은 다수의 질환의 임상적 치료를 사실상 방해한다. 따라서, 이러한 장벽을 극복하기 위해서, 본 명세서에는 높은 특이성, 축적 및 표적 세포, 예컨대 간의 간세포의 핵으로의 전달을 갖는 임상 응용에서의 용도가 발견될 수 있는 벡터가 개시된다. 실시형태에서, 이러한 벡터는 pDNA의 핵 전달을 가능하게 하는 고도로 재생산 가능한 비-바이러스 벡터를 산출한다. 본 명세서에 기술된 LCP 벡터는 CMV 프로모터, 세포외 신호전달 펩타이드, 트랩 단백질, 표적화 모이어티, 및 핵 침투 펩타이드를 쉽게 혼입하는 능력을 제공한다.
벡터는 리포좀일 수 있다. 리포좀은 수성일 수 있는, 코어를 감싸는 지질 이중층을 포함하는 자가-조립성의 실질적으로 구체인 소포(vesicle)이고, 여기서 지질 이중층은 친수성 헤드기 및 소수성 테일을 갖는 양친매성 지질을 포함하며, 여기서 양친매성 지질 분자의 친수성 머리기는 코어 또는 주변 용액을 향해서 배향된 방면, 소수성 테일은 이중층의 내부를 향해서 배향된다. 이에 의해서 지질 이중층 구조는 "내부 리플릿(leaflet)" 및 "외부 리플릿"으로서도 지칭되는 2개의 반대 단층을 포함하고, 여기서 소수성 테일은 주변 매질과의 접촉으로부터 가려져 있다. "내부 리플릿"은 단층이며, 여기서 친수성 헤드 기는 리포좀의 코어를 향해서 배향되어 있다. "외부 리플릿"은 양친매성 지질을 포함하는 단층이고, 여기서 친수성 헤드 기는 리포좀의 외면을 향해서 배향되어 있다. 리포좀은 전형적으로 약 25nm 내지 약 1㎛ 범위의 직경을 갖는다(예를 들어, 문헌[Shah (ed.) (1998) Micelles, Microemulsions, and Monolayers: Science and Technology, Marcel Dekker; Janoff (ed.) (1998) Liposomes: Rational Design, Marcel Dekker] 참고). 용어 "리포좀"은 수성 상의 층과 교대하는 2개 내지 수백개의 동심원 지질 이중층으로 구성된 다중층(multilamellar) 리포좀 및 단일 지질 이중층으로 구성된 단일층(unilamellar) 소포 둘 모두를 포함한다.
리포좀(LCP 유형 및 LDP 유형)의 제조 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 국제 출원 제PCT/US2010/044209호에 널리 공지되어 있다. 리포좀 제조 방법의 검토는 문헌[Liposome Technology (CFC Press NY 1984)]; [Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987)]; [Lichtenberg and Barenholz (1988) Methods Biochem Anal. 33:337-462] 및 미국 특허 제5,283,185호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 양이온성 지질 및 임의로 공동-지질은 균질화기의 사용에 의해서 유화되고, 동결건조되고, 용융되어 다중층 리포좀을 수득할 수 있다. 대안적으로, 단일층 리포좀은 역상 증발 방법에 의해서 생산될 수 있다(Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시형태에서, 리포좀은 박막 수화를 사용하여 생산된다(Bangham et al. (1965) J. Mol. Biol. 13:238-252, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 특정 실시형태에서, 리포좀 제형을 사이징(sizing) 전에 간단히 초음파처리하고, 단시간 동안(예를 들어, 약 10분 동안) 50℃에서 인큐베이션시킬 수 있다(문헌[Templeton et al. (1997) Nature Biotechnology 15:647-652] 참고, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
일부 실시형태에서, 표적화된 리포좀 또는 페길화된(PEGylated) 리포좀은 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이 제조되며, 여기서 방법은 리포좀의 제조 이후에 또는 리포좀의 생산 이후에 사후-삽입 단계를 추가로 포함하며, 여기서 지질-표적화 리간드 접합체 또는 페길화된 지질이 리포좀에 사후-삽입된다. 지질-표적화 리간드 접합체 또는 지질-PEG 접합체를 포함하는 리포좀은 본 명세서에 제공된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 관련 기술 분야에 공지된 기술에 따라서 제조될 수 있다(문헌[Experimental section; Ishida et al. (1999) FEBS Lett. 460:129-133; Perouzel et al. (2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898] 참고, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 사후-삽입 단계는 리포좀을 지질-표적화 리간드 접합체 또는 지질-PEG 접합체와 혼합하고, 입자를 약 50℃ 내지 약 60℃에서 짧은 시간(예를 들어, 약 5분, 약 10분) 동안 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포좀은 약 5㏖%, 약 6㏖%, 약 7㏖%, 약 8㏖%, 약 9㏖%, 약 10㏖%, 약 11㏖%, 약 12㏖%, 약 13㏖%, 약 14㏖%, 약 15㏖%, 약 16㏖%, 약 17㏖%, 약 18㏖%, 약 19㏖%, 및 약 20㏖%를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 약 5 내지 약 20㏖%의 농도에서 지질-PEG 접합체 또는 지질-PEG-표적화 리간드 접합체와 인큐베이션되어 스텔스(stealth) 전달 시스템을 형성한다. 이러한 실시형태 중 일부에서, 지질-PEG 접합체의 농도는 약 10㏖%이다. 지질-PEG 접합체의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 약 100g/㏖, 약 200g/㏖, 약 300g/㏖, 약 400g/㏖, 약 500g/㏖, 약 600g/㏖, 약 700g/㏖, 약 800g/㏖, 약 900g/㏖, 약 1000g/㏖, 약 5000g/㏖, 약 10,000g/㏖, 약 15,000g/㏖, 및 약 20,000g/㏖을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 약 100 내지 약 20,000g/㏖ 범위의 분자량을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 지질-PEG 접합체는 약 2000g/㏖의 분자량을 갖는 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질-PEG 접합체는 DSPE-PEG2000을 포함한다. 지질-PEG-표적화 리간드 접합체는 또한 상기에 기술된 사후-삽입 방법을 사용하여 리포좀 내로 사후-삽입될 수 있다.
실시형태에서, 리포좀은 절단 가능한 2A 펩타이드를 통해서 연결된 PD-1 트랩 융합 단백질 및 CXCL12 트랩을 암호화하는 벡터를 함유하며, 이것은 CXCL12/PD-L1 조합 트랩 치료요법을 위해서 2종 대신에 단지 하나의 조성물을 투여하는 것을 허용한다.
접합을 통한 표적화 갈락토스 모이어티의 DSPE-PEG로의 혼입은 간 간세포 상에서 높게 발현되는 아시알로당단백질 수용체를 통해서 간세포에서 활성 흡수를 허용한다. DOTAP 및 산 민감성 인산칼슘 코어의 사용은 세포질 내로 방출되는, 축합된 pDNA/mc-CR8C 구조의 엔도솜 탈출을 허용한다. 추가로, pDNA와 세포 관통 양이온성 mc-CR8C 펩타이드의 축합은 개선된 핵 흡수 및 방출을 허용한다. pDNA 내에서의 CMV 프로모터의 혼입은 높은 간 발현을 허용한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 이러한 부분의 혼입을 통해서, 목적하는 표적화된 세포 유형에서 높은 치료 수준의 발현을 산출하는 현명하게 설계된 벡터가 제공된다. 이러한 pTrap LCP 벡터는 결장직장 간 전이의 발생을 상당히 감소시키고(80%), 뿐만 아니라 간 내에서 발견되는 종양 존재량을 상당히 감소시킨다(10배). CXCL12 트랩의 증가된 수준, 뿐만 아니라 유리 CXCL12 단백질의 감소된 수준이 용량 의존적인 방식으로 간에서 발견되었고, 뿐만 아니라 면역 세포(CD8+)의 모집 감소가 관찰되었는데, 이는 pTrap LCP 치료의 생물학적으로 특이적인 효과를 입증한다.
따라서, 본 명세서는, 갈락토스-LCP 벡터에서 pDNA의 전달이 3회 주사 QOD 이후에 최소한의 면역 반응 내지 면역 반응 없이, 오프-타깃 효과의 징후를 나타내지 않는다는 것을 보여주었다. 이러한 연구에서 pCXCL12 트랩의 C-말단 단부 상에 혼입된 His-태그는 웨스턴 블롯 및 ELISA 검정법을 통해서 발현 수준을 결정하는 데 필수적이었다. 그러나, 추가 임상 응용을 위해서, His-태그는 필요하지 않을 수 있다. 이는 임의의 면역 반응, 예컨대 중화 항체의 유도를 회피하는 데 도움을 줄 것이다.
추가로, 8일 이하로 지속되는 이러한 작은 CXCL12 트랩(약 28kD)의 일시적인 발현을 갖는 능력은, 의사에게, 치료 효능을 여전히 달성하면서, 면역 반응을 제한하기 위해서, 발현의 수준 및 시간을 엄격하게 제어/모니터링하는 능력을 허용한다.
본 명세서에는 생물-층 간섭계법(BLI)뿐만 아니라 이동 및 침윤의 생체내 억제를 통한 조작된 CXCL12 트랩(단백질)의 친화도 및 생산이 개시된다(도 2). 조작된 CXCL12 트랩은 BLI 분석을 통해서 Kd=4nM를 갖는 것을 발견하였다(도 2a). 추가로, 생체내에서 대략 120nM의 농도에서 생물학적으로 활성인 CXCL12(100ng/㎖)에 대한 절반 최대 저해[ND50]를 생성한다(도 2b). 내생 CXCL12 케모카인으로의 CT-26 세포의 치료는 이동/침윤/증식 경로의 상향 조절을 산출한다고 추가로 보고되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명자들의 CXCL12 트랩 및 상업적으로 입수 가능한 CXCL12 항체(Ab)의, 내생 CXCL12로 자극된 CT-26 FL3 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 능력을 조사하였다(도 2b 및 2c). 이러한 생체내 실험은 CXCL12(100.0ng/㎖)로 자극된 CT-26 FL3 세포의 이동 및 침윤을 감소시키는 CXCL12 트랩의 능력을 입증하고, 이는 각각 8.0㎍/㎖ 및 12.0㎍/㎖에서 완전한 억제를 산출한다(도 2b 및 도 2c). 상업적으로 입수 가능한 항체(2 내지 4ug/㎖의 ND50; 12 내지 24nM)를 또한 대조군으로서 사용하였다.
유용한 생체내 pDNA 용량(단일 주사당 0.5㎎/㎏)은 생체내 발현을 갖는다고 이미 나타난 용량보다 실질적으로 더 낮다. 추가로, 이것은 간 손상을 유발하고, 임상적으로 적용 가능하지 않은 침습성 유체역학적 주사의 사용을 통해서가 아닌 비-바이러스 벡터를 통해서 치료량의 pDNA가 간으로 성공적으로 전달된 첫 번째 예이다. 이러한 전달은 현명하게 설계된 LCP 벡터의 사용에 기인한다.
문헌[2013 Hu et al.]에서, 이러한 벡터를 사용하여 간에서 높은 수준의 루시페라제 발현을 도출하는 것이 처음으로 보고되었다(Hu, Y., et al., A Highly Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nuclei in Vivo. ACS Nano, 2013. 7(6): p. 5376-5384). 그러나, 이러한 수준의 발현은 단지 유체역학적 주사 기술 이후에, 비-바이러스 벡터를 통해서 수득되는 최대이다. 휴(Hu) 등은 이러한 Gal-LCP 벡터를 통한 Cy-3 표지된 pDNA의 전달이 정맥내 꼬리 정맥 주사 6시간 이후에 간세포의 핵에서 우세하게 축적되었다는 것을 발견하였다(Hu, Y., et al., A Highly Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nuclei in Vivo. ACS Nano, 2013. 7(6): p. 5376-5384). 방사성표지된 Gal-LCP-pDNA/mcCR8C 벡터의 기관 분포는 마우스 간에서 현저한 흡수를 입증하였다. 추가로, CXCL12 트랩의 간으로의 전달을 통해서, 본 발명자들은 치료 효과가 간 미세환경에서 발견되는 유리 CXCL12의 감소를 통한 것이었음을 명확하게 입증한다(도 5a). 이러한 치료요법은 간 종양 존재량을 감소시켰는데, 이는 그 다음에 미처리된 병이 걸린 간과 비교할 때 간 염증을 감소시켰다.
미치료 군은 높은 수준의 CXCL12를 생산하였고, 간 전이 축적을 추가로 도왔다. 따라서, 결장직장 환자의 Gal-LCP-pDNA/mcCR8C 벡터로의 예방학적 치료는, 간 CXCL12 발현 및 간 전이 진행에서 중요한 역할을 하는, 간에서의 염증을 감소시키는 것을 도울 수 있다.
이러한 벡터의 사용을 통해서, 다수의 응용 및 치료요법이 예컨대 간 질환의 치료처리에서 실시될 수 있다. 이러한 벡터는 간의 간세포로 높은 수준의 치료 pDNA를 전달하는 능력을 갖는다는 것이 본 명세서에서 입증된다. 따라서, 간 전이 및 원발성 암뿐만 아니라 다수의 다른 간 질환, 예컨대 HBV, 지방간, 간 경변증 및 다수의 다른 것을 치료하는 능력이 본 명세서에 제공된다. 간 질환에 더하여, 상이한 표적화 모이어티, 예컨대 폐 상피 세포 상에서 고도로 발현되는 아데노신 A2B 수용체를 표적으로 하는, 아데노신 유사체의 혼입은 CXCL12 또는 다른 고도로 전이성인 조직에서 역할을 한다고 공지된 다른 미세환경 인자에 대해서 pDNA 트랩을 축적 및 전달하도록 이러한 벡터를 프라이밍할 것이다. 이러한 전략은 높은 전이율을 갖는다고 공지된 다수의 조직, 예컨대 폐, 림프절, 유방, 및 골의 미세환경 인자에 변형을 제공할 수 있다.
III. 조성물
전신 투여에 적합한 조성물이 제공된다.
본 명세서에 기술된 조성물은 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 합성 벡터 등을 포함한다. 미국 공개 출원 제2012-0201872호; 제2011-0117026호; 및 제2011-0117141호를 참고하며, 이들 각각은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 벡터는 또한 리포좀 벡터 또는 살아있는 세포 벡터, 예컨대 단핵구 또는 줄기 세포를 포함한다.
전달 벡터
본 발명의 트랩을 전달하는 적합한 방법은 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 플라스미드 벡터, 리포좀 벡터, 또는 살아있는 세포 벡터, 예컨대 단핵구 또는 줄기 세포를 포함한다.
용어 "벡터"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상이한 숙주 세포들 간의 이송을 위해서 설계된 핵산 작제물을 지칭한다. "발현 벡터" 또는 "유전자 치료치료요법 벡터"는 외래 세포에서 이종 DNA 단편을 혼입 및 발현하는 능력을 갖는 벡터를 지칭한다. 클로닝 또는 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있고, 예를 들어, 발현 벡터는 트랩 유전자의 발현을 위한 기관-특이적 프로모터를 함유할 수 있고, 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있어서, 그것이 2개의 유기체에서, 예를 들어 발현을 위해서 인간 세포에서 그리고 클로닝 및 증폭을 위해서 원핵 숙주에서 유지되는 것을 허용한다. 용어 벡터는 또한 재조합 바이러스, 예를 들어, 치료 화합물 또는 인자를 위한 암호 서열을 함유하도록 변형된 바이러스를 기술하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 기원 또는 리포좀 또는 세포, 예컨대 단핵구 또는 줄기 세포일 수 있다.
용어 "바이러스" "바이러스 입자", "벡터 입자", "바이러스 벡터 입자", 및 "비리온"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 예를 들어, 본 발명의 바이러스 벡터가 적절한 세포 또는 세포주에 형질도입되는 경우 형성되는 감염성 바이러스 입자를 의미하는 것으로 넓게 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 바이러스 입자는 시험관내 또는 생체내에서 DNA를 세포로 이송시키는 목적을 위해서 사용될 수 있다. 용어 "벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터 작제물", "핵산 벡터 작제물", 및 "벡터 작제물"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 유전자 이송을 의한 임의의 핵산 작제물을 의미하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 관련 분야에서 인식되는 의미에 따라서 사용된다. 그것은 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고, 바이러스 벡터 입자 내에서 패키징될 수 있는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내 또는 생체내에서 DNA, RNA 또는 다른 핵산을 세포로 이송하려는 목적을 위해서 사용될 수 있다. 다수의 형태의 바이러스 벡터가 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이의 공급원은 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 관심 트랩의 포유동물 세포로의 도입을 위해서 임의의 벡터를 사용하는 것을 고려한다. 예시적인 벡터는 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스(Ad) 벡터(복제 적격, 복제 결핍 및 이의 거틀러스(gutless) 형태 포함), 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터, 유인원 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 천연두 바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 벡터, 하베이(Harvey) 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터 및 비바이러스 플라스미드 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스는 세포를 효율적으로 형질도입할 수 있고, 그 자신의 DNA를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터의 생성 시에, 비-필수 유전자가 이종(또는 비-네이티브) 단백질을 위한 유전자 또는 암호 서열로 대체된다.
바이러스 벡터의 작제 시에, 비-필수 유전자는 1종 이상의 치료 화합물 또는 인자를 암호화하는 1종 이상의 유전자로 대체된다. 전형적으로, 벡터는 복제점을 포함하고, 벡터는 또한 벡터가 식별 및 선택될 수 있는 "마커" 또는 "선택 가능한 마커" 기능을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 임의의 선택 가능한 마커가 사용될 수 있지만, 이러한 발현 벡터에서 사용하기 위한 선택 가능한 마커는 일반적으로 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 적절한 선택 가능한 마커의 선택은 숙주 세포에 좌우될 것이다. 항생제 또는 다른 독소에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, 네오마이신(Southern et al., J., J Mol Appl Genet. 1982;1(4):327-41 (1982)), 마이코페놀산(Mulligan et al., Science 209:1422-7 (1980)), 퓨로마이신, 제오마이신, 하이그로마이신(Sugden et al., Mol Cell Biol. 5(2):410-3 (1985)) 또는 G418을 포함한다.
"재조합체"로서의 벡터 또는 다른 DNA 서열에 대한 언급은 전형적으로 자연으로부터 단리되거나 자연에서 발견되는 바와 같이 작동 가능하게 연결되지 않은 DNA 서열의 작동 가능한 연결을 단지 인정한다. 조절(발현/대조군) 서열은 발현/대조군 서열이 핵산 서열의 전사 및 적절한 경우 번역을 조절할 때 핵산 암호 서열에 작동적으로 연결된다. 따라서, 발현/대조군 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 장식된 암호 앞의 출발 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호 및 정지 코돈을 포함할 수 있다.
아데노바이러스 유전자 치료요법 벡터는 생체내에서의 강한 발현, 우수한 역가, 및 생체내에서의 분할 및 비-분할 세포를 형질도입하는 능력을 나타낸다고 공지되어 있다(Hitt et al., Adv in Virus Res 55:479-505 (2000)). 생체내에서 사용되는 경우, 이러한 벡터는 벡터 골격에 대해서 도출되는 면역 반응으로 인해서 강하지만 일시적인 유전자 발현으로 이어진다. 본 발명에서 사용하기 위한 재조합 Ad 벡터는 (1) 벡터가 복제-결함 Ad 비리온 내에 혼입되는 것을 가능하게 하는 패키징 부위; 및 (2) 관심 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 관심 트랩을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 감염성 비리온 내로의 혼입을 위해서 필수적이거나 이를 돕는 다른 요소는 5' 및 3' Ad ITR, E2 및 E3 유전자 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 Ad 벡터를 캡슐화하는 복제-결함 Ad 비리온은 Ad 패키징 세포 및 패키징 기술을 사용하여 관련 기술 분야에 공지된 표준 기술에 의해서 제조된다. 이러한 방법의 예는 예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된, 미국 특허 제5,872,005호에서 찾아볼 수 있다. 관심 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 게놈의 결실된 E1A, E1B 또는 E3 영역에서 아데노바이러스 내에 일반적으로 삽입된다. 본 발명을 실시하는 데 사용하기 위한 바람직한 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 야생형 Ad 유전자 산물, 예를 들어 E1a, E1b, E2, E3, E4를 발현하지 않는다. 바람직한 실시형태는 E1, E2A, E4 및 임의로 E3 유전자 영역의 기능을 보완하는 패키징 세포주와 함께 전형적으로 사용되는 비리온이다. 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 명확히 포함된, 미국 특허 제5,872,005호, 제5,994,106호, 제6,133,028호 및 제6,127,175호를 참고하기 바란다. 아데노바이러스 벡터는 관련 기술 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제 및 제형화된다.
재조합 AAV 벡터는 표적화된 세포에서 선택된 유전자 이식된 산물의 발현 및 생산을 안내할 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 재조합 벡터는 이입(encapsidation)에 필수적인 AAV의 서열 및 표적 세포의 감염을 위한 물리적인 구조 모두를 적어도 포함한다.
본 발명을 실시하는 데 사용하기 위한 재조합 AAV(rAAV) 비리온은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 이것은, 이것이 전사의 방향에서 작동적으로 연결된 성분으로서, 전사 개시 및 종결 서열을 포함하는 대조군 서열 및 관심 트랩을 위한 암호 서열을 포함하도록, 작제된다. 이러한 성분은 기능적 AAV ITR 서열에 의해서 5' 및 3' 단부 상에 결합된다. "기능적 AAV ITR 서열"이라는 것은 ITR 서열이 AAV 비리온의 구출, 복제 및 패키징을 위해서 의도되는 바와 같이 기능한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없고, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해서 변경될 수 있거나, 또는 AAV ITR은 몇몇 AAV 항원형(serotype) 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아데노-연관된 바이러스 항원형으로부터 유래된 벡터이다. 바람직한 AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 야생형 REP 및 CAP 유전자를 갖지만, 기능적 플랭킹 ITR 서열을 보유한다.
전형적으로, AAV 발현 벡터는 생산자 세포에 도입되고, 그 다음 AAV 헬퍼 작제물이 도입되는데, 여기서 헬퍼 작제물은 생산자 세포에서 발현될 수 있는 AAV 암호 영역을 포함하고, 이것은 AAV 벡터에서 존재하지 않는 AAV 헬퍼 기능을 보완한다. 헬퍼 작제물은 본 명세서에 참고로 명확히 포함된, 미국 특허 제6,548,286호에 기술된 바와 같이, 전형적으로 ATG로부터 ACG로의 p5를 따라서 출발 코돈을 돌연변이화함으로써 큰 REP 단백질(Rep78 및 Rep68)의 발현을 하향 조절하도록 설계될 수 있다. 이것 다음에 생산자 세포에 헬퍼 바이러스 및/또는 추가 벡터를 도입하는데, 여기서 헬퍼 바이러스 및/또는 추가 벡터는 효율적인 rAAV 생산을 지지할 수 있는 보조 기능을 제공한다. 이어서, 생산자 세포가 배양되어 rAAV를 생산한다. 이러한 단계는 표준 방법을 사용하여 수행된다. 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 캡슐화하는 복제-결함 AAV 비리온은 AAV 패키징 세포 및 패키징 기술을 사용하여 관련 기술 분야에 공지된 표준 기술에 의의해서 수행된다. 이러한 방법의 예는 예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 명확히 포함된 미국 특허 제5,436,146호; 제5,753,500호, 제6,040,183호, 제6,093,570호 및 제6,548,286호에서 찾아볼 수 있다. 패키징을 위한 추가 조성물 및 방법은 또한 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 왕(Wang) 등(미국 특허 제2002/0168342호)에 기술되어 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 지식 내의 이러한 기술을 포함한다.
AAV의 대략 40개의 항원형이 현재 공지되어 있지만, 새로운 항원형 및 기존의 항원형의 변이체가 현재 여전히 식별되어 있고, 이것은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주된다. 문헌[Gao et al (2002), PNAS 99(18):11854-6; Gao et al (2003), PNAS 100(10):6081-6; Bossis and Chiorini (2003), J. Virol. 77(12):6799-810)]을 참고하기 바란다. 상이한 AAV 항원형을 사용하여 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나 또는 특정 표적 조직 내에서 특이적 세포를 표적화한다. 상이한 AAV 항원형의 사용은 악성 조직을 표적화하는 것을 가능하게 할 수 있다. 1, 2, 4, 5 및 6을 비롯한 AAV 항원형은 뇌 조직을 형질도입시키는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 문헌[ Davidson et al (2000), PNAS 97(7)3428-32; Passini et al (2003), J. Virol 77(12):7034-40]을 참고하기 바란다. 특정 AAV 항원형은 표적 조직 또는 세포에서 보다 효율적으로 표적화하고/하거나 복제할 수 있다. 단일 자가-상보성 AAV 벡터가 형질도입 효율을 증가시키고, 이식유전자 발현의 더 신속한 개시를 유발하기 위해서 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다(McCarty et al., Gene Ther. 2001 August;8(16):1248-54).
레트로바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 일반적인 툴이다(Miller, 1992, Nature 357: 455-460). 레트로바이러스 벡터 및 보다 특별하게는 렌티바이러스 벡터가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터가 시험되었고, 이것은 광범위한 표적 세포의 게놈 DNA 내로의 다양한 관심 유전자의 안정한 도입을 위해서 적합한 전달 비히클인 것으로 밝혀져 있다. 비정렬된 단일 카피 이식유전자를 세포로 전달하는 레트로바이러스 벡터의 능력은 레트로바이러스 벡터가 유전자를 세포로 이송하기에 상당히 적합하게 만든다. 추가로, 레트로바이러스는 숙주 세포 상에서의 특이적 세포 표면 수용체에 대한 레트로바이러스 엔벨로프 당단백질의 결합에 의해서 숙주 세포에 진입한다. 그 결과, 암호화된 네이티브 엔벨로프 단백질이 네이티브 엔벨로프 단백질과 상이한 세포 특이성을 갖는(예를 들어, 네이티브 엔벨로프 단백질과 비교할 때 상이한 세포-표면 수용체게 결합하는) 이종 엔벨로프 단백질에 의해서 대체된 위형(pseudotyped) 레트로바이러스 벡터가 또한 본 발명을 실시하는 데 있어서 유용함이 발견될 수 있다. 이식유전자를 암호화하는 레트로바이러스 벡터의 특정 유형의 표적 세포로의 전달을 지향하는 능력은 유전자 치료치료요법 응용을 위해서 매우 바람직하다.
본 발명은 예를 들어, 1종 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레트로바이러스 이송 벡터 및 1종 이상의 패키징 요소를 포함하는 레트로바이러스 패킹 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 위형 레트로바이러스를 생산하기 위해서 이종 또는 기능적으로 변형된 엔벨로프 단백질을 암호화하는 위형 레트로바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터의 코어 서열은 예를 들어, B형, C형, 및 D형 레트로바이러스뿐만 아니라 스푸마바이러스 및 렌티바이러스를 비롯한, 매우 다양한 레트로바이러스로부터 쉽게 유래될 수 있다(문헌[RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985] 참고). 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 레트로바이러스의 예는 렌티바이러스를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 다른 레트로바이러스는 조류 백혈병 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 밍크 세포 초점 형성 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 세망내피증 바이러스 및 라우스 육종 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 뮤린 백혈병 바이러스는 4070A 및 1504A(문헌[Hartley and Rowe, J. Virol. 19:19-25, 1976]), 아벨손(Abelson)(ATCC No. VR-999), 프렌드(Friend)(ATCC No. VR-245), 그래피, 그로스(Graffi, Gross)(ATCC No. VR-590), 키스텐, 하베이(Kirsten, Harvey) 육종 바이러스 및 라우처(Rauscher)(ATCC No. VR-998), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(ATCC No. VR-190)를 포함한다. 이러한 레트로바이러스는 보관소 또는 수집처, 에컨대 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)("ATCC"; 미국 미들랜드주 록빌 소재)으로부터 용이하게 입수되거나 또는 일반적으로 사용 가능한 기술을 사용하여 공지된 공급원으로부터 단리될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 레트로바이러스 벡터 서열은 렌티바이러스로부터 유래된다. 바람직한 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스, 예를 들어, 1형 또는 2형(즉, HIV-1 또는 HIV-2, 여기서 HIV-1은 이전에 임파종 결합 바이러스 3 (HTLV-IE) 및 후천성 면역 결핍증(AIDS)-관련 바이러스(ARV)라 지칭됨), 또는 AIDS 또는 AIDS-유사 질환으로 식별되고, 이것과 연관된 HIV-1 또는 HIV-2에 관련된 또 다른 바이러스이다. 다른 렌티바이러스 벡터는 양 비스나/매디 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 렌티바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV)를 포함한다.
조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 레트로바이러스의 다양한 속 및 종이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Fields Virology, Third Edition, edited by B. N. Fields et al., Lippincott-Raven Publishers (1996)], 예를 들어, 문헌[Chapter 58, Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification, 표 1을 포함하는 제1768면 내지 제1771면], 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 발명은 다양한 레트로바이러스계에 적용 가능하고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 레트로바이러스의 상이한 군에 걸쳐서 공유되는 공통 요소를 인지할 것이다. 모든 레트로바이러스는 표면 돌출부를 갖는 엔벨로핑된 비리온의 특징부를 공유하고, 선형, 양성-감응 단일 가닥 RNA의 하나의 분자, 이량체로 이루어진 게놈, 및 공통 단백질 gag, pol 및 env를 함유한다.
렌티바이러스는 엔벨로프 당단백질 SU(gp120) 및 TM(gp41)(이것은 env 유전자에 의해서 암호화됨); CA(p24), MA(p117) 및 NC(p7-11)(이것은 gag 유전자에 의해서 암호화됨); 및 pol 유전자에 의해서 암호화된 RT, PR 및 IN을 비롯하여, 공통적으로 몇몇 구조 비리온 단백질을 공유한다. HIV-1 및 HIV-2는 합성의 조절에 관여되고, 바이러스 RNA 및 및 다른 증식 기능을 가공하는 보조 단백질 및 다른 단백질을 함유한다. vif, vpr, vpu/vpx, 및 nef 유전자에 의해서 암호화된 보조 단백질은 재조합계로부터 누락(또는 불활성화)될 수 있다. 또한, tat 및 rev는 예를 들어, 돌연변이 또는 결실에 의해서 누락 또는 불활성화될 수 있다.
1세대 렌티바이러스 벡터 패키징 시스템은 gag/pol 및 env을 위한 별개의 패키징 작제물을 제공하며, 전형적으로 안전성 이유로 인해서 이종 또는 기능적으로 변형된 엔벨로프 단백질을 사용한다. 2세대 렌티바이러스 벡터계에서, 보조 유전자, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실 또는 불활성화된다. 3세대 렌티바이러스 벡터계는 tat 유전자가 결실 또는 달리 불활성화(예를 들어, 돌연변이를 통해서)된 것이다.
tat에 의해서 일반적으로 제공되는 전사의 조절을 위한 보상은 강한 구성 프로모터, 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(HCMV-IE) 인핸서/프로모터의 사용에 의해서 제공될 수 있다. 다른 프로모터/인핸서는 관련 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 구성 프로모터의 활성의 강도, 표적 조직(예를 들어, 간-특이적 프로모터)의 특이성, 또는 목적하는 대조군 과발현에 관련된 다른 인자를 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제어된 발현을 달성하기 위해서 유도성 프로모터, 예컨대 tet를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 유전자 암호화 rev는 바람직하게는 별개의 발현 작제물 상에 제공되어, 전형적인 3세대 렌티바이러스 벡터계는 4개의 플라스미드를 포함할 것이다: gagpol, rev, 엔벨로프 및 이송 벡터에 대해서 각각 하나. 사용되는 패키징 시스템의 생성에 관계없이, gag 및 pol은 단일 작제물 또는 별개의 작제물 상에 제공될 수 있다.
합성 비-바이러스 전달제
관심 폴리뉴클레오타이드의 이송 및 발현을 촉진시킬 수 있는 합성 비-바이러스제가 또한 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다. 이러한 합성 비-바이러스제는 양이온성 지질 및 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 양이온성 지질인 비-바이러스 전달제는 다음이온성 DNA에 결합한다. 엔도시토시스(endocytosis) 이후에, 핵산은 유전자 재료가 새로운 숙주 내에 혼입되도록 엔도솜 컴파트먼트뿐만 아니라 전달제로부터 탈출해야 한다. 문헌[Felgner, P. L. Nonviral Strategies for Gene Therapy Sci. Am. 1997, 276, 102-106; Felgner, P. L.; Gadek, T. R.; Holm, M.; Roman, R.; Chan, H. W.; Wenz, M.; Northrop, J. P.; Ringgold, G. M.; Danielsen, M. Lipofectin: A highly efficient, 지질 mediated DNA-transfection procedure Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 7413-7417; Felgner, P. L.; Kumar, R.; Basava, C.; Border, R. C.; Hwang-Felgner, J. In; Vical, Inc. San Diego, Calif.: 미국 특허 제5,264,618, 1993; Felgner, J. H.; Kumar, R.; Sridhar, C. N.; Wheeler, C. J.; Tsai, Y. J.; Border, R.; Ramsey, P.; Martin, M.; Felgner, P. L. Enhanced Gene Delivery and Mechanism Studies with a Novel Series of Cationic Formulations J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550-2561; Freidmann, T. Sci. Am. 1997, 276, 96-101; Behr, J. P. Gene Transfer with Synthetic Cationic Amphiphiles: Prospects for Gene Delivery Bioconjugate Chem. 1994, 5, 382-389; Cotton, M.; Wagner, B. Non-viral Approaches to Gene Therapy Curr. Op. Biotech. 1993, 4, 705-710; Miller, A. D. Cationic Liposomes for Gene Therapy Angew. Chem. Int. 1998, 37, 1768-1785; Scherman, D.; Bessodes, M.; Cameron, B.; Herscovici, J.; Hofland, H.; Pitard, B.; Soubrier, F.; Wils, P.; Crouzet, J. Application of Lipids and Plasmid Design for Gene Delivery to Mammalian Cells Curr. Op. Biotech. 1989, 9, 480; Lasic, D. D. In Surfactants in Cosmetics; 2nd ed.; Rieger, M. M., Rhein, L. D., Eds.; Marcel Dekker, Inc.: New York, 1997; Vol. 68, pp 263-283; Rolland, A. P. From Genes to Gene Medicines: Recent Advances in Nonviral Gene Delivery Crit. Rev. Ther. Drug 1998, 15, 143-198; de Lima, M. C. P.; Simoes, S.; Pires, P.; Faneca, H.; Duzgunes, N. Cationic Lipid-DNA Complexes in Gene Delivery from Biophysics to Biological Applications Adv. Drug. Del. Rev. 2001, 47, 277-294] 참고.
이러한 합성 비-바이러스 전달제는 2가지의 주요 기능을 갖는데, 즉 경질감염될 DNA를 축합시키고, 이의 세포-결합 및 원형질막 및 적절한 경우 2개의 핵막을 통한 통과를 촉진시키는 것이다. 이의 다음이온성 본성으로 인해서, DNA는 또한 다음이온성인 세포의 원형질 막에 대해서 본래 불량한 친화도를 갖는다. 몇몇 군은 동물 및 인간 둘 모두에서 생체내 형질주입을 위한 양친매성 양이온성 지질-핵산 복합체의 사용을 보고하였다. 따라서, 합성 비-바이러스 전달제는 양이온성 또는 다양이온성 전하를 갖는다. 문헌[Gao, X; Huang, L. Cationic Liposome-mediated Gene Transfer Gene Therapy 1995, 2, 710-722; Zhu, N.; Liggott, D.; Liu, Y.; Debs, R. Systemic Gene Expression After Intravenous DNA Delivery into Adult Mice Science 1993, 261, 209-211; Thierry, A. R.; Lunardiiskandar, Y.; Bryant, J. L.; Rabinovich, P.; Gallo, R. C.; Mahan, L. C. Systemic Gene-Therapy-Biodistribution and Long-Term Expression of a Transgene in Mice Proc. Nat. Acad. Sci. 1995, 92, 9742-9746] 참고. 양이온성 도메인 및 소수성 도메인 둘 모두를 갖는 양이온성 양친매성 화합물은 유전자 정보의 전달을 위해서 이미 사용되어 왔다. 사실, 이러한 부류의 화합물은 유전자의 세포내 전달을 위해서 널리 사용된다. 이러한 양이온 화합물은 유전자 형질주입 연구를 위한 가장 대중적인 합성 비-바이러스 전달제인 양이온성 리포좀을 형성할 수 있다.
양이온성 리포좀은 2가지의 기능을 제공한다. 먼저, 그것은 분해로부터 DNA를 보호한다. 두 번째로, 그것은 세포에 도입되는 DNA의 양을 증가시킨다. 이러한 리포좀은 시험관내 및 생체내 연구 둘 모두에서 유용함이 증명되어 있다. 사피니아, 씨. 알.(Safinya, C. R.)은 양이온성 양친매성 물질-DNA 복합체의 구조를 기술한다. 문헌[Radler, J. O.; Koltover, I.; Salditt, T.; Safinya, C. R. Science 1997, 275, 810-814; Templeton, N. S.; Lasic, D. D.; Frederik, P. M.; Strey, H. H.; Roberts, D. D.; Pavlakis, G. N. Nature Biotech. 1997, 15, 647-652; Koltover, I.; Salditt, T.; Radler, J. O.; Safinya, C. R. Science 1998, 281, 78-81; 및 Koltover, I.; Salditt, T.; Safinya, C. R. Biophys. J. 1999, 77, 915-924]. 시험관내 및 생체내 유전자 전달을 위한 이러한 시스템 중 다수는 최신 문헌에 검토되어 있다. 예를 들어, 문헌[Remy, J.; Sirlin, C.; Vierling, P.; Behr, J. Bioconj. Chem. 1994, 5, 647-654; Crystal, R. G. Science 1995, 270, 404-410; Blaese, X.; et, a. Cancer Gene Ther. 1995, 2, 291-297]; 및 상기에 언급된 문헌[Behr, J. P. and Gao, X]을 참고하기 바란다. 바이러스 벡터와 달리, 지질-핵산 복합체는 본질적으로 무제한 크기의 발현 카세트를 이송시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 합성 전달 시스템은 단백질이 결여되어 있기 때문에, 이것은 더 적은 면역원성 반응 및 염증 반응을 생성한다.
베어(Behr)는 유전자 전달을 위해서 다이옥타데실아미돌로글리실스퍼민("DOGS")을 비롯한 다수의 양친매성 물질을 개시한다. 이러한 재료는 TRANSFECTAM(상표명)으로서 상업적으로 입수 가능하다. 비그네론(Vigneron)은 진핵 세포의 형질주입을 위한 구아니디늄-콜레스테롤 양이온성 지질을 기술한다. 펠그너(Felgner)는 형질주입에 적합한 지질/DNA 복합체를 형성하기 위한, N-1-(2,3-다이올레일옥시)프로필-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 비롯한, 양으로 하전된 합성 양이온성 지질의 용도를 개시한다. 비크(Byk)는 양이온성 지질을 기술하는데, 여기서 양친매성 물질의 양이온성 부분은 유전자 형질주입을 위해서 선형, 분지형 또는 구형이다. 블레싱(Blessing) 및 동료들은 스퍼민을 기반으로 하는 양이온성 합성 벡터를 기술한다. 사피니아는 유전자 전달을 위한 폴리(에틸렌 글리콜) 분절을 함유하는 양이온성 지질을 기술한다. 베소즈(Bessodes) 및 동료들은 유전자 전달을 위한 글리코시드 링커를 함유하는 양이온성 지질을 기술한다. 렌(Ren) 및 리우(Liu)는 1,2,4-부탄트라이올을 기반으로 하는 양이온성 지질을 기술한다. 탕(Tang) 및 서먼(Scherman)은 유전자 전달을 위한 다이설파이드 링키지를 함유하는 양이온성 기질을 기술한다. 비어링(Vierling)은 유전자 담체 및 전달 시스템으로서의 고도로 플루오르화된 양이온성 양친매성 물질을 기술한다. 자코핀(Jacopin)은 표적화 리간드를 함유하는 유전자 전달을 위한 양이온 양친매성 물질을 기술한다. 왕(Wang) 및 동료들은 유전자 전달을 위한 카르니틴 기반 양이온성 에스터를 기술한다. 주(Zhu)는 DNA의 정맥내 전달을 위한 양이온성 지질, N[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드의 용도를 기술한다. 문헌[Behr, J. P.; Demeneix, B.; Loeffler, J. P.; Perez-Mutul, J. Efficeint Gene Transfer into Mammalian Primary Endocrine Cells with Lipopolyamine Coated DNA Proc. Nat. Acad. Sci. 1989, 86, 6982-6986; Vigneron, J. P.; Oudrhiri, N.; Fauquet, M.; Vergely, L.; Bradley, J. C.; Basseville, M.; Lehn, P.; Lehn, J. M. Proc. Nat. Acad. Sci. 1996, 93, 9682-9686; Byk, G.; BDubertret, C.; Escriou, V.; Frederic, M.; Jaslin, G.; Rangara, R.; Pitard, B.; Wils, P.; Schwartz, B.; Scherman, D. J. Med. Chem. 1998, 41, 224-235; Blessing, T.; Remy, J. S.; Behr, J. P. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8519-8520; Blessing, T.; Remy, J. S.; Behr, J. P. Proc. Nat. Acad. Sci. 1998, 95, 1427-1431; Schulze, U.; Schmidt, H.; Safinya, C. R. Bioconj. Chem. 1999, 10, 548-552; Bessodes, M.; Dubertret, C.; Jaslin, G.; Scherman, D. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 1393-1395; Herscovici, J.; Egron, M. J.; Quenot, A.; Leclercq, F.; Leforestier, N.; Mignet, N.; Wetzer, B.; Scherman, D. Org. Lett. 2001; Ren, T.; Liu, D. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 7621-7625; Tang, F.; Hughes, J. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 242, 141-145; Tang, F.; Hughes, J. A. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 791-796; Wetzer, B.; Byk, G.; Frederic, M.; Airiau, M.; Blanche, F.; Pitard, B.; Scherman, D. Biochemical J. 2001, 356, 747-756; Vierling, P.; Santaella, C.; Greiner, J. J. Fluorine Chem. 2001, 107, 337-354; Jacopin, J.; Hofland, H.; Scherman, D.; Herscovici, J. J. Biomed. Chem. Lett. 2001, 11, 419-422; 및 Wang, J.; Guo, X.; Xu, Y.; Barron, L.; Szoka, F. C. J. Med. Chem. 1998, 41, 2207-2215]을 참고하기 바란다.
에판드(Epand) 등의 미국 특허 제5,283,185호에서, 상기 발명자들은 "DC-chol"이라고 지칭되는, 양이온성 콜레스테롤 합성 벡터를 비롯한 양친매성 물질의 추가 예를 기술한다. 상기 발명자들은 미국 특허 제5,264,618호에서, 세포 내로의 생물학적 활성 분자의 수송을 용이하게 하는 보다 양이온성인 화합물을 기술한다. 휴스(Hughes) 등의 미국 특허 제6,169,078호 및 제6,153,434호에는 유전자 전달을 위한 다이설파이드 결합을 함유하는 양이온성 지질이 개시되어 있다. 게비예(Gebeyehu) 증의 미국 특허 제5,334,761호에는 생물학적 활성 분자의 세포내 전달에 적합한 추가의 양이온성 양친매성 물질이 기술되어 있다. 티에리(Thierry)의 미국 특허 제6,110,490호에는 유전자 전달을 위한 추가의 양이온성 지질이 기술되어 있다. 언거(Unger) 등의 미국 특허 제6,056,938호에는 적어도 2개의 양이온성 기를 함유하는 양이온성 지질 화합물이 개시되어 있다.
유전자 전달을 위한 중합체 시스템은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 한(Han)의 검토에서, 그는 PLL, 폴리(L-라이신); PEI, 폴리에틸렌이민; pDMEAMA, 폴리(2-다이메틸아미노)에틸-메타크릴레이트; PLGA, 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드) 및 PVP(폴리비닐피롤리돈)를 비롯한, 일반적인 양이온성 중합체 시스템 대부분을 논의하였다. 문헌[Garnett, M. C. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 1999, 16, 147-207; Han, S.; Mahato, R. I.; Sung, Y. K.; Kim, S. W. Molecular Therapy 2000, 2, 302-317; Zauner, W.; Ogris, M.; Wagner, E. Adv. Drug. Del. Rev. 1998, 30, 97-113; Kabanov, A. V.; Kabanov, V. A. Bioconj. Chem. 1995, 6, 7-20; Lynn, D. M.; Anderson, D. G.; Putman, D.; Langer, R. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8155-8156; Boussif, O.; Lezoualc'h, F.; Zanta, M. A.; Mergny, M. D.; Scherman, D.; Demeneix, B.; Behr, J. P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 7297-7301; Choi, J. S.; Joo, D. K.; Kim, C. H.; Kim, K.; Park, J. S. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 474-480; Putnam, D.; Langer, R. Macromolecules 1999, 32, 3658-3662; Gonzalez, M. F.; Ruseckaite, R. A.; Cuadrado, T. R. Journal of Applied Polymer Science 1999, 71, 1223-1230; Tang, M. X.; Redemann, C. T.; Szoka, F. C. In Vitro Gene Delivery by Degraded Polyamidoamine Dendrimers Bioconjugate Chem. 1996, 7, 703-714; Kukowska-latallo, J. F.; Bielinska, A. U.; Johnson, J.; Spinder, R.; Tomalia, D. A.; Baker, J. R. Proc. Nat. Acad. Sci. 1996, 93, 4897-4902; 및 Lim, Y.; Kim, S.; Lee, Y.; Lee, W.; Yang, T.; Lee, M.; Suh, M.; Park, J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2460-2461] 참고.
조사 중인 양이온성 중합체의 일부 대표적인 예가 하기에 기술되어 있다. 예를 들어, 폴리(베타-아미노 에스터)는 플라스미드 DNA를 유전자 전달을 위한 가용성 DNA/중합체 입자로 축합시킨다고 조사 및 증명되었다. 합성 형질주입 벡터의 발견을 가속화하기 위해서, 양이온성 중합체 라이브러리의 병렬 합성 및 스크리닝이 랭거(Langer)에 의해서 보고되었다. 월퍼트(Wolfert)는 유전자 전달을 위한 DNA와 합성 블록 양이온성 공중합체의 자가-조립에 의해서 형성된 유전자 치료요법을 위한 양이온성 벡터를 기술한다. 핸슬러(Haensler) 및 스조카(Szoka)는 유전자 전달을 위한 양이온성 덴드리머 중합체(폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머)의 용도를 기술한다. 왕(Wang)은 유전자 전달을 위한 양이온성 폴리포스포에스터를 기술한다. 푸트남(Putnam)은 DNA의 전달을 위한 이미다졸을 함유하는 양이온성 중합체를 기술한다. 문헌 [Lynn, D. M.; Langer, R. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 10761-10768; Wolfert, M. A.; Schacht, E. H.; Toncheva, V.; Ulbrich, K.; Nazarova, O.; Seymour, L. W. Hum. Gene Ther. 1996, 7, 2123-2133; Haensler, J.; Szoka, F. Bioconj. Chem. 1993, 4, 372; 및 Wang, J.; Mao, H. Q.; Leong, K W. J. Am. Chem. Soc. 2001; Putnam, D.; Gentry, C. A.; Pack, D. W.; Langer, R. Proc. Nat. Acad. Sci. 2001, 98, 1200-1205]을 참고하기 바란다.
유전자 전달을 위한 양이온성 중합체를 기술하는 다수의 특허가 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 골덴버그(Goldenberg) 등의 미국 특허 제5,629,184호에는 올리고뉴클레오타이드의 전달을 위한 비닐아민과 비닐 알코올의 양이온성 공중합체가 기술되어 있다. 토말리아(Tomalia) 등의 미국 특허 제5,714,166호에는 유전자 전달을 위한 수지상 양이온성-아민-말단 중합체가 기술되어 있다. 인(Yin) 등의 미국 특허 제5,919,442호에는 유전자 전달을 위한 하이퍼 콤-분지형(hyper comb-branched) 중합체 접합체가 기술되어 있다. 버게스(Burgess) 등의 미국 특허 제5,948,878호에는 핵산 형질주입 및 생물활성제 전달을 위한 추가의 양이온성 중합체가 기술되어 있다. 박(Park) 등의 미국 특허 제6,177,274호에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 그래프팅된 폴리(L-라이신)(PLL) 및 표적화 모이어티로 이루어진 표적화된 유전자 전달을 위한 화합물이 개시되어 있는데, 여기서 PLL의 적어도 하나의 유리 아미노 작용기는 표적화 모이어티로 치환되어 있고, 그래프팅된 PLL은 적어도 50%의 비치환된 유리 아미노 작용기를 함유한다. 최(Choi) 등의 미국 특허 제6,210,717호에는 양친매성 폴리에스터-다양이온 공중합체 및 양친매성 폴리에스터-당(sugar) 공중합체를 함유하는 표적화된 숙주 세포 내로 선택된 핵산을 전달하는 데 사용되는 생분해성의 혼합된 중합체 마이셀이 기술되어 있다. 박 등의 미국 특허 제6,267,987호에는 조직을 통한 생물활성제의 전달 및 세포 흡수를 위한 양으로 하전된 폴리[알파-(오메가-아미노알킬) 글리콜산]이 개시되어 있다. 서만 등의 미국 특허 제6,200,956호에는 양이온성 폴리펩타이드를 함유하는 핵산을 형질주입하기에 유용한 약제학적 조성물을 기술한다.
본 명세서에 기술된 트랩을 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자 전달 시스템은 국제 특허 출원 제PCT/US2010/044209호에 개시되어 있다.
표적화 리간드
조성물은 벡터와 물리적으로 연관된 표적화 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
"표적화 리간드"란 표적화된 세포 또는 조직에 대해서 벡터 또는 물리적으로 연관된 분자를 표적화하는 분자를 의도한다. 표적화 리간드는 소분자, 펩타이드, 지질, 당, 올리고뉴클레오타이드, 호르몬, 비타민, 항원, 항체 또는 이들의 단편, 특이적 막-수용체 리간드, 항-리간드와 반응할 수 있는 리간드, 푸소제닉 펩타이드(fusogenic peptide), 핵 위치 펩타이드(nuclear localization peptide), 또는 이러한 화합물의 조합물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표적화 리간드의 비제한적인 예는 아시알로당단백질, 인슐린, 저밀도 지질단백질(LDL), 폴레이트, 벤즈아마이드, 유도체, 및 세포 표면 분자에 대해서 지향된 단클론성 항체 및 다클론성 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 벤즈아마이드 유도체를 포함한다. 이러한 실시형태 중 일부에서, 벤즈아마이드 유도체는 아니스아마이드를 포함한다.
"표적화된 세포"라는 것은 표적화 리간드가 물리적으로 연관된 분자를 모집하는 세포를 의도한다. 표적화 리간드는 표적 세포의 하나 이상의 구성성분과 상호작용할 수 있다. 표적화된 세포는 임의의 세포 유형일 수 있거나 또는 다양한 임의의 발달 단계에 있을 수 있고, 다양한 병리학적 상태(즉, 비정상 상태 및 정상 상태)에 있을 수 있다. 예를 들어, 표적화 리간드는 미생물(즉, 원핵 세포(박테리아), 바이러스, 진균, 원생동물 또는 기생충) 또는 진핵 세포(예를 들어, 상피 세포, 근육 세포, 신경 세포, 감각 세포, 암성 세포, 분비 세포, 악성 세포, 적혈구 및 림프구 세포, 줄기 세포) 상의 정상, 비정상 및/또는 독특한 구성성분과 연관될 수 있다. 따라서, 표적화 리간드는 예를 들어, 종양-연관 항원 및 자가면역 질환-연관 항원을 비롯한, 질환-연관 항원인 표적 세포 상의 구성성분과 연관될 수 있다. 이러한 질환-연관 항원은 예를 들어, 성장 인자 수용체, 세포 사이클 조절인자, 혈관형성 인자, 및 신호전달 인자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 표적화된 세포 상의 세포 표면 단백질과 상호작용한다. 이들 실시형태 중 일부에서, 표적화 리간드에 결합할 수 있는 세포 표면 단백질의 발현 수준은 다른 세포에 비해서 표적화된 세포에서 더 높다. 예를 들어, 암 세포는 특정 세포 표면 분자, 예컨대 HER2 수용체(유방 암) 또는 시그마 수용체를 과발현시킨다. 특정 실시형태에서 여기서 표적화 리간드는 벤즈아마이드 유도체, 예컨대 아니스아마이드를 포함하고, 표적화 리간드는 연관된 분자를 시그마-수용체 과발현 세포에 대해서 표적화하는데, 시그마-수용체 과발현 세포는 암 세포, 예컨대 소- 및 비-소-세포 폐 암종, 신장 암종, 결장 암종, 육종, 유방암, 흑색종, 교아종, 신경모세포종, 및 전립선암을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(Aydar, Palmer, and Djamgoz (2004) Cancer Res. 64:5029-5035).
용어 "암" 또는 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭 또는 기술한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "암 세포" 또는 "종양 세포"는 이러한 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 세포를 지칭한다. 용어 "암"은 방광 암종, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 자궁내막암, 간세포 암종, 후두암, 폐암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 갑상선암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암종, 흑색종, 육종, 림프종 및 백혈병의 모든 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암의 모든 유형을 포함한다.
표적화된 세포는 원격암(distant cancer)의 전이에 민감한 것이다. 이와 같이, 표적화된 세포는 임의의 기관에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적화된 세포는 간 세포이다.
표적화 리간드는 물리적으로 연관된 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "물리적으로 연관된"은 2개의 분자 간의 공유 또는 비-공유 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공유 결합" 또는 "공유 상호작용"은 화학 결합을 지칭하는데, 여기서 한쌍의 전자가 2개의 원자 사이에서 공유된다. 2개의 분자는, 그 분자가 분자를 구성하는 원자들 사이에서 적어도 하나의 화학 결합을 갖는 경우 서로에 화학적으로 결합된다고 지칭된다. 따라서 2개의 분자 간의 하나의 화학 결합은 하나의 분자에서의 원자와 또 다른 분자에서의 원자 간의 한쌍의 전자의 공유로 구성된다. 예를 들어, 표적화 리간드는 양이온성 지질의 R 기 중 하나 또는 질소 원자 중 하나를 통해서 본 발명의 지질에 공유 결합될 수 있다. "접합체"는 서로에 공유 결합된 분자의 복합체를 지칭한다. 예를 들어, 표적화 리간드에 공유 결합된 지질의 복합체가 지질-표적화 리간드 접합체라 지칭될 수 있다.
대안적으로, 표적화 리간드는 화학식 (I)의 지질 또는 이의 활성 유도체에 비-공유 결합될 수 있다. "비-공유 결합" 도는 "비-공유 상호작용"은 전자쌍의 공유를 포함하지 않고, 전자기적 상호작용의 보다 분산된 변동을 포함하며, 수소 결합, 이온 상호작용, 반데르 발스 상호작용 및 소수성 결합을 포함할 수 있다. 이러한 지질-표적화 리간드 접합체는 문헌에 널리 기술된 기술에 따라서 쉽게 얻을 수 있다.
관심 폴리뉴클레오타이드
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단수형 핵산, 뿐만 아니라 복수형 핵산을 포함하도록 의도되며, 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 또는 짧은 간섭(short interfering) RNA(siRNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥의 선형 또는 원형일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 통상의 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들어, 아마이드 결합, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견됨)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있는데, 여기서 "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드라는 것은 이의 네이티브 환경으로부터 제거된, 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 예는 이종 숙주 세포 중에 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 다른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성방식으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 또한 단리된 발현 벡터, 발현 작제물, 또는 이들의 집단을 포함할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드"는 또한 중합효소 연쇄 반응에서와 같이, 그 자체의 증폭된 산물을 지칭할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드"는 변형된 핵산, 예컨대 포스포로싸이오에이트, 포스페이트, 고리 원자 변형된 유도체 등을 함유할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드"는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드(즉, 인간 개입 없이 자연에 존재하는 것) 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드(즉, 인간 개입에 의해서만 존재하는 것)일 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드" 둘 모두는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 100개 미만의 뉴클레오타이드 길이이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 폴리뉴클레오타이드"는 세포에서 목적하는 효과(예를 들어, 치료 효과, 유전자 발현의 변화)를 도출하기 위해서 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 관심 폴리뉴클레오타이드는 임의의 길이를 가질 수 있고, 관심 폴리펩타이드에 대한 암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드가 세포 내에서 발현 또는 도입될 때, 관심 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 치료 활성을 갖는다.
i. 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템은 관심 폴리펩타이드에 대한 암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, "관심 폴리펩타이드에 대한 암호 서열" 또는 "관심 폴리펩타이드에 대한 암호 영역"은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암호화하는" 또는 "암호화된"은 명시된 핵산의 맥락에서 사용되는 경우 핵산이 뉴클레오타이드 서열의 명시된 폴리펩타이드로의 번역을 안내하기 위한 필수 정보를 포함한다는 것을 의미한다. 폴리펩타이드가 암호화된 정보는 코돈의 사용에 의해서 명시된다. "암호 영역" 또는 "암호 서열"은 아미노산으로 번역될 수 있는 코돈으로 이루어진 핵산의 부분이다. "정지 코돈" 또는 "번역 종결 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 그것은 암호 영역의 부분이라고 간주될 수 있다. 마찬가지로, 전사 개시 코돈(ATG)은 암호 영역의 부분이라고 간주될 수 있거나 간주될 수 없다. 그러나, 암호 영역에 근접한 임의의 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 암호 영역의 부분이라고 간주되지 않는다. 그러나, 일부 실시형태에서, 암호 영역의 부분으로서 그 자체로 간주되지 않지만, 이러한 조절 서열 및 임의의 다른 조절 서열, 특히 신호 서열 또는 펩타이드 태그를 암호화하는 서열은 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분일 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 암호 서열 및 임의로 관심 폴리펩타이드의 발현, 분비 및/또는 단리에 기여하는 암호 영역에 근접한 임의의 서열을 포함한다.
용어 "발현"은 관련 기술 분야에 이해되는 바와 같은 이의 의미를 갖고, 유전자 또는 암호 서열로 암호화된 유전 정보를 (예를 들어, RNA 중합효소의 효소 작용을 통해서) 폴리뉴클레오타이드의 "전사"를 통해서 RNA(예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로, 그리고 폴리펩타이드-암호화 폴리뉴클레오타이드의 경우에는, mRNA의 "번역"을 통해서 폴리펩타이로 전환시키는 과정을 지칭한다. 따라서, "발현 산물"은 일반적으로 유전자로부터 전사된 RNA(예들 들어, 가공-전 또는 가공-후) 또는 유전자로부터 전사된 RAN에 의해서 암호화된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(예들 들어, 가공-전 또는 가공-후)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 단수형 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 복수형 "폴리펩타이드들"를 포함하도록 의도되고, 아마이드 결합(또한 펩타이드 결합이라 공지됨)에 의해서 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 산물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하는 데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"가 이들 용어 중 임의의 것 대신에 또는 그것과 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "관심 폴리펩타이드"는 세포에서 목적하는 효과(예를 들어, 치료 효과)를 발휘하도록 세포에 전달될 폴리펩타이드 또는 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드를 지칭한다. 관심 폴리펩타이드는 임의의 종 및 임의의 크기를 가질 수 있다.
분자 유전학 및 유전자 조작 기술을 위해서 필요한 광범위한 서열 정보가 널리 공개적으로 입수 가능하다. 포유동물, 뿐만 아니라 인간의 완전한 뉴클레오타이드 서열, 유전자, cDNA 서열, 아미노산 서열 및 게놈에 대한 접근은 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez에서 젠뱅크로부터 입수될 수 있다. 추가 정보는 유전자 및 이의 산물에 대한 전자 백과사전 통합 정보인 젠카즈(GeneCards), 및 위즈만 인스티튜트 오프 사이언스 게놈 앤드 바이오인포매틱스(Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics)(bioinformatics.weizmann.ac.il/cards)로부터의 생의학적 응용으로부터 입수될 수 있고, 뉴클레오타이드 서열 정보는 또한 EMBL 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스(www.ebi.ac.uk/embl) 또는 DNA 데이터뱅크 오어 재팬(DNA Databank or Japan)(DDBJ, www.ddbi.nig.ac.jp)으로부터 입수될 수 있다. 아미노산 서열에 대한 정보를 위한 추가 사이트는 조지타운의 단백질 정보 자원 웹사이트(www.pir.georgetown.edu) 및 스위스-프로트(Swiss-Prot)(au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)를 포함한다.
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 유전 물질, 예컨대 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 pDNA(플라스미드 DNA)를 포함할 수 있는데, 이것은 전사될 때 트랩을 생산한다. 이러한 실시형태에서, 유전 물질은 발현 카세트의 부분일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트에서 발견된 암호 서열을 포함한다.
용어 "도입" 또는 "도입하다"는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 데 사용되는 경우 폴리뉴클레오타이드가 세포의 세포내 영역으로 접근하는 방식으로의 세포에 대한 폴리뉴클레오타이드의 제시를 지칭한다.
발현 카세트는 발현을 위해서 사용될 세포를 기반으로 선택되고, 관심 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오타이드 서열(즉, 관심 폴리펩타이드의 암호 서열)이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 발현 카세트 또는 벡터가 세포 내로 도입될 때 세포에서) 조절 서열(들)에 연결되어 있다는 것을 의미하려는 의도이다. "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 대조군 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California)]을 참고하기 바란다. 조절 서열은 다수의 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성 발현을 안내하는 것 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 안내하는 것(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 발현 카세트의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 사일런싱 요소 또는 관심 폴리펩타이드의 발현 수준 등에 좌우될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 발현 카세트는 전형적으로 핵산의 벡터 내로의 도입을 가능하게 하기 위해서, 제한 효소를 위한 하나 이상의 적절하게 위치된 부위를 포함한다.
적절한 프로모터 및/또는 조절 요소는 관심 세포에서 관련된 전사 단위/사일런싱 요소의 발현을 허용하도록 쉽게 선택될 수 있다는 것이 추가로 인지될 것이다. 특정 실시형태에서, 사일런싱 요소의 세포내 발현을 안내하는 데 사용되는 프로모터는 RNA 중합효소 III(Pol III)에 대한 프로모터이다. 다양한 Pol III 프로모터를 논의하는 문헌은, 예를 들어 문헌[Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(9), 6047-6052; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(8), 5515-5520 (2002); Paddison et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948-958; Brummelkamp et al. (2002) Science 296, 550-553; Miyagashi (2002) Biotech. 20, 497-500; Paul et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508; Tuschl et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 446-448]을 포함한다. 다른 실시형태에 따라서, RNA 중합효소 I에 대한 프로모터, 예를 들어, tRNA 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McCown et al. (2003) Virology 313(2):514-24; Kawasaki (2003) Nucleic Acids Res. 31 (2):700-7]을 참고하기 바란다. 폴리뉴클레오타이드가 관심 폴리펩타이드에 대한 암호 서열을 포함하는 일부 실시형태에서, RNA 중합효소 II에 대한 프로모터가 사용될 수 있다.
조절 서열은 또한 바이러스 조절 요소에 의해서 제공될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 및 유인원 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는, 문헌[Chapters 16 and 17 of Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]을 참고하기 바란다. 문헌[Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California)]를 참고하기 바란다.
시험관내 전사는 T7, SP6, 및 T3 프로모터/중합효소 시스템을 비롯한 다양한 입수 가능한 시스템(예를 들어, 프로메가(Promega), 클론테크(Clontech), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 등으로부터 상업적으로 입수 가능한 것)을 사용하여 수행될 수 있다. T7, SP6, 또는 T3 프로모터를 비롯한 벡터는 관련 기술 분야에 널리 공지ㅗ디어 있고, 사일런싱 요소의 전사를 안내하도록 용이하게 변형될 수 있다.
페길화
벡터의 페길화는 망상내피(reticuloendothelial: RES) 시스템에 의한 벡터의 클리어런스를 감소시킴으로써 전달 시스템의 순환 반감기를 향상시킨다. 임의의 특정 이론 또는 작용 기준에 얽매이고자 함은 아니지만, 페길화된 벡터는 입자의 옵소닌작용을 입체적으로 차단함으로써 RES 시스템을 회피할 수 있다고 여겨진다(Owens and Peppas (2006) Int J Pharm 307:93-102). 옵소닌작용을 피하기 위한 충분한 입체 장애를 제공하기 위해서, 벡터의 외부 표면은 "브러쉬형" 구성으로 PEG 분자에 의해서 완전히 피복되어야 한다. 낮은 표면 피복률에서, PEG 쇄는 전형적으로 "버섯형" 구성을 가질 것인데, 여기서 PEG 분자는 지질 비히클의 표면에 더 가깝게 위치될 것이다. "브러쉬형" 구성에서, PEG 분자는 입자 표면으로부터 더 멀리 연장되어, 입체 장애 효과를 향상시킨다. 그러나, 표면 상의 PEG의 과잉(over-crowdedness)은 중합체 쇄의 이동성을 감소시켜서 입체 장애 효과를 감소시킬 수 있다(Owens and Peppas (2006) Int J Pharm 307:93-102). PEG의 컨포메이션은 벡터의 표면 상의 PEG의 분자량 및 표면 밀도에 좌우된다. 제어 인자는 이의 플로리 치수, RF(이것은 aN 3/5 으로서 정의되며, 식 중 a는 단량체의 지속 길이이고, N은 PEG에서 단량체 단위의 수임)에 대한 비히클 표면 상에서의 PEG 쇄들 간의 거리(D)이다(nicholas et al. (2000) Biochim Biophys Acta 1463:167-178). 이러한 방법은 (1) D>2 RF(깍지형 버섯형)인 경우; (2) D<2 RF(버섯형)인 경우; 및 (3) D< RF(브러쉬형)인 경우로 정의될 수 있다(Nicholas et al.)
약제학적 조성물
본 발명의 지질 및 전달 시스템은 포유동물 조직 배양 시스템에서, 동물 연구에서, 그리고 치료 목적을 위해서 유용하다. 화학식 (I)의 세포독성 양이온성 지질, 및 화학식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 전달 시스템(여기서, 화학식 (I)의 양이온성 지질은 세포독성 활성을 가짐), 화학식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 전달 시스템(여기서, 생물활성 화합물은 치료 활성을 가짐), 및 화학식 (I)의 세포독성 양이온성 지질 및 치료 활성을 갖는 생물활성 화합물을 포함하는 전달 시스템이 치료 응용에서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 개시된 주제는 화학식 (I)의 세포독성 양이온성 지질을 포함하는 약제학적 조성물 또는 화학식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 전달 시스템을 제공한다.
본 발명에 개시된 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 코, 기관지, 눈, 경피(국소), 점막경유, 직장 및 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 사용 가능한 경로에 의해서 환자에게 전달, 즉 투여하기 위해서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 경로는 정맥내, 비경구, 점막경유, 코, 기관지, 질 및 경구이다.
조성물은 약제학적으로 허용 가능한 염으로서 제형화될 수 있다. 구 "약제학적으로 허용 가능한 염(들)"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 사용하기에 안전하고, 효과적이고, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 본 명세서에 개시된 화합물의 염을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 본 발명의 화합물 중에 존재하는 산성 또는 염기성 군의 염을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 염화수소, 브로민화수소, 아이오딘화수소, 니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 보레이트, 아이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타트레이트, 판토테네이트, 바이타트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 퓨마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 폼에이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)), 메실레이트 염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 개시된 특정 화합물은 다양한 아미노산과 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 적합한 염기 염은 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연 및 다이에탄올아민 염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 검토에 대해서는, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19]을 참고하기 바란다. 본 명세서에 기술된 지질의 염은 예를 들어, 용액 중에서 적절한 당량의 화합물과 목적하는 산 또는 염기를 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응이 완결된 후, 염은 염이 불용성인 적절한 양의 용매를 첨가함으로써 용액으로부터 결정화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여 또는 화장용 투여와 상용성인, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 중에 혼입될 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 본 발명에 개시된 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 비경구(예를 들어, 정맥내), 근육내, 피내 또는 피하 적용을 위해서 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석액, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테라아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염화수소산 또는 수산화나트륨을 사용하여 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알 내에 존재할 수 있다.
주사 가능한 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크렘포(Cremophor) EL(상표명)(바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 조성물은 멸균되어야 하고, 용이하게 주사 가능하게 존재하는 정도로 유체여야 한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 안정하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해서 보존되어야 한다. 일반적으로, 관련 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유체성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산물의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염화나트륨이 제형 중에 포함된다. 주사 가능한 제형의 오래 지속되는 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 제형 중에 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 활성 화합물(예를 들어, 화학식 (I)의 세포독성 양이온성 지질 또는 화학식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 전달 시스템)을 필요한 양으로 적절한 용매 중에 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 혼입시키고, 필요한 경우 그 다음 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 주사를 위한 용액은 엔도톡신이 존재하지 않는다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 분말이 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위해서 사용되는 이러한 실시형태에서, 용액을 진공 건조 및 동결-건조에 의해서 제조할 수 있고, 이것은 미리 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 산출한다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해서, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 정제, 트로키제 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 켑슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강청결제로서 사용하기 위해서 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 또는 화장품에서 상용성인 결합제 및/또는 아주반트 재료가 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키제 등은 하기 성분, 또는 유사한 본성의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 검, 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕괴제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제(glidant), 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 착향료, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료. 경구 전달을 위한 조성물은 위장관 내에서의 안정성을 개선시키고/거나 흡수를 향상시키기 위한 작용제를 이롭게 혼입할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해서, 본 명세서에 개시된 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 가스, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압된 용기 또는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이, 또는 네블라이저의 형태로 전달될 수 있다. 액체 에어로졸, 건조 분말 등이 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물의 전신 투여는 또한 점막경유 또는 경피 수단에 의해서 수행될 수 있다. 점막경유 또는 경피 투여를 위해서, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형 중에서 사용된다. 이러한 침투제는 관련 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어, 점막경유 투여를 위해서, 세제, 담즙 염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 코 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해서 성취될 수 있다. 경피 투여를 위해서 활성 화합물은 관련 기술 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 살브(salve), 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
본 명세서에 기술된 조성물은 좌약의 형태로(예를 들어, 통상의 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 함께) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해서 경구 또는 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 이롭다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체를 위한 통합된 투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체 또는 화장품 담체와 회합되어 목적하는 치료 효과를 생성하는 것으로 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물 및 달성될 특정 치료요법 효과의 독특한 특징, 및 (b) 개인의 치료를 위해서 그러한 활성 화합물을 컴파운딩하는 관련 기술 분야에서 내재하는 제한에 의해서 영향을 받고, 그것에 직접 좌우된다. 투여에 관련된 지도는 본 명세서 다른 부분에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료 활성"은 본 명세서에 기술된 조성물을 지칭하는 경우, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성할 수 있는 것을 의도한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "예방"은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 그 효과는 특정 감염 또는 질환 또는 이의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것과 관련하여 예방적일 수 있고/있거나 그 감염 또는 질환의 부분적인 또는 완전한 치유 및/또는 그 감염 또는 질환에 기인한 부작용과 관련하여 치료적일 수 있다. 따라서, 방법은 본 발명의 조성물이 제공되는 대상체에서 질환 또는 장애의 해로운 효과를 "예방"(즉, 지연 또는 저해) 및/또는 "감소시킨다". 대상체는 포유동물, 예컨대 인간을 비롯한 임의의 동물 및 즉, 수의학 용도를 위한, 가축, 예컨대 고양이 또는 개 대상체, 예컨대 소, 말, 염소, 양 및 돼지 대상체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 농장 동물, 야생 동물(야생이든 동물원에 있든 관계없음), 실험 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등, 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 송버드(songbird) 등을 포함하지만 어떤 수단에 의해서도 이에 제한되지 않는 임의의 동물일 수 있다.
원치 않는 병태 또는 질환의 임의의 유형이 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하여 치료적으로 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료하고자 하는 질환 또는 원치 않는 병태는 암이다. 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 용어 "암"은 임의의 유형의 비조절 세포 성장을 포함하고, 암의 모든 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료하고자 하는 암은 결장직장암이다. 암 성장 또는 진행의 저해를 검출하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이의 크기의 감소, 2차 종양의 지연된 출현, 2차 종양의 느린 발생, 2차 종양의 감소된 발생 및 질환의 2차 효과의 느려지거나 감소된 중증도를 검출하기 위해서 원발성 종양의 크기를 측정하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 조성물의 투여가 단독으로 또는 수술 치료요법, 방사선치료요법 또는 임의의 유형의 치료제, 예컨대 약물로의 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 치료 양식과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대상체가 암을 앓고 있는 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 관련 기술 분야에 널리 공지된 임의의 화학치료제와 조합하여 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포독성 생물활성 화합물 및 본 명세서에 기술된 조성물은 대상체에게 동시에 투여될 수 있고, 여기서 세포독성 생물활성 화합물 및 본 명세서에 기술된 조성물 둘 모두는 대상체에게 투여되는 단일 조성물 중에 존재한다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 세포독성 생물활성 화합물 및 본 명세서에 기술된 조성물은 별개의 조성물로 순차적으로 투여된다. "순차적으로"라는 것은 2종의 조성물이 2종의 구별되는 조성물의 2개의 별개의 투여로 대상체에게 번갈아서 투여된다는 것을 의도하고, 여기서 하나의 조성물은 세포독성 생물활성 화합물을 포함하고, 나머진 조성물은 본 명세서에 기술된 조성물을 포함한다.
이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, 본 명세서에 기술된 조성물은 본 명세서 다른 곳에 논의된 바와 같이, 표적화 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 표적화 리간드는 대상체 내에서 표적화된 세포 또는 조직에 물리적으로 연관된 리간드 또는 복합체를 표적으로 할 것이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 전달 시스템은 세포독성이다. 특정 실시형태에서, 표적화된 세포 또는 조직은 병이 걸릴 것이거나 원치 않는 병태를 특징으로 할 것이다.
투여
치료 유효량의 본 명세서에 기술된 조성물의 전달은 이러한 작용제의 치료 유효 용량을 포함하는 약제학적 조성물의 투여를 통해서 수득될 수 있다. "치료 유효량" 또는 "용량"이라는 것은 목적하는 치료 효과를 발생시키기에 충분한 본 명세서에 기술된 조성물의 농도를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 이로운 또는 목적하는 임상 또는 생화학적 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상 투여될 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 유효량은 대상체의 체중, 성별, 연령 및 병력에 따라서 달라질 것이다. 유효량에 영향을 주는 다른 인자는 대상체의 병태의 중증도, 치료될 장애, 바람직한 경우, 지질 또는 지질-포함 복합체와 함께 투여될 아주반트 치료제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 효능 또는 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Isselbacher et al. (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882]을 참고하기 바란다.
약제학적 조성물은 필요에 따라서 다양한 간격으로 또는 상이한 시간 간격에 걸쳐서, 예를 들어 1일 수회, 매일, 2일 1회, 약 1 내지 10주, 2 내지 8주, 약 3 내지 7주, 약 4, 5, 또는 6주 등 동안 주 1회 투여될 수 있다. 통상의 기술자는, 질환, 장애 또는 원치 않는 병태의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환 또는 원치 않는 병태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 인지할 것이다. 일반적으로, 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 많은 경우에는, 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물의 적절한 용량은 이의 효력에 좌우되고, 예를 들어, 미리 선택된 목적하는 반응이 달성될 때까지 증가하는 용량을 투여함으로써 특정 수여자에 대해서 임의로 조정될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 임의의 특정 동물 대상체를 위한 특정 용량 수준은 사용되는 본 명세서에 기술된 특정 조성물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시기, 투여 경로, 배설 속도, 임의의 약물 조합물 및 조절될 발현 또는 활성 정도를 비롯한 다양한 인자에 좌우될 수 있다는 것이 이해된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물의 치료 유효 용량은 간헐적으로 투여된다. "간헐적 투여"라는 것은 본 명세서에 기술된 조성물의 치료 유효 용량을 투여하고, 그 다음 중단 시간 기간이 존재하고, 이어서 치료 유효 용량의 또 다른 투여가 이어지는 것 등을 의도한다. 치료 유효 용량의 투여는 예를 들어, 지속-방출(sustained-release) 제형으로서 연속적인 방식으로 달성될 수 있거나, 또는 그것은 예를 들어, 1일당 1회, 2회, 3회 또는 그 초과의 투여로서 목적하는 매일 투여 요법에 따라서 달성될 수 있다. "중단 시간 기간"이라는 것은 본 명세서에 기술된 조성물의 연속적인 지속-방출 투여 또는 매일 투여의 중단을 의도한다. 중단 시간 기간은 연속적인 지속-방출 투여 또는 매일 투여의 기간보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 중단 시간 기간 동안, 관련 조직에서 본 명세서에 기술된 조성물의 효과의 수준은 실질적으로 치료 동안 수득된 최대 수준보다 낮다. 일부 실시형태에서, 중단 기간은 유효 용량의 농도에 좌우된다. 중단 기간은 적어도 2일, 적어도 4일 또는 적어도 1주일 수 있다. 다른 실시형태에서, 중단 기간은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 그 초과이다. 지속-방출 제형이 사용되는 경우, 중단 기간은 치료 부위에서 본 명세서에 기술된 조성물의 더 긴 체류 시간을 설명하기 위해서 연장되어야 한다. 대안적으로, 지속-방출 제형의 유효 용량의 투여의 빈도가 따라서 감소될 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물의 투여의 간헐적인 스케줄은 목적하는 치료 효과 및 질환 및 원치 않는 병태의 궁극적인 치료가 달성될 때까지 계속될 수 있다.
본 명세서에 개시된 주제의 검토 시에 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 약제학적으로 허용 가능한 염 및 이의 약제학적 조성물을 포함하는 본 명세서에 개시된 조성물이 세포, 세포 배양물, 세포 배양 배지, 조직, 조직 배양물, 조직 배양 배지 등에 직접 투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 명세서에 기술된 조성물을 지칭하는 경우, 용어 "투여하는", 및 이의 파생어는 화합물이 세포와 접촉하는 것을 허용하는 임의의 방법을 포함한다. 본 명세서에 개시된 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 약제학적 조성물은 생체내 또는 생체외에서 세포 또는 조직에 투여(또는 그것과 접촉)될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 약제학적 조성물은 또한 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 개인 대상체, 예를 들어 환자에 대한 투여에 의해서, 예를 들어 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 진피하(subdermal), 또는 두개내 투여) 또는 국소 적용에 의해서 생체내에서 세포 또는 조직에 투여(또는 그것과 접촉)될 수 있다.
IV. 제조 용품
제조 용품은 건조 또는 액체 형태로, 임의의 담체와 함께 본 발명의 방법에 적합한 조성물을 함유하는 바이알 또는 다른 용기를 포함할 수 있다. 제조 용품은 본 발명의 방법을 수행하기 위해서, 용기 상의 레이블의 형태 및/또는 용기가 패키징된 박스 내에 포함된 삽입물의 형태로 지시서를 추가로 포함한다. 지시서는 또한 바이알이 패키징된 상자에 인쇄될 수 있다. 지서서는 대상체 또는 관련 기술 분야의 종사자가 약제학적 조성물을 투여하는 것을 허용하도록 하는 정보, 예컨대 충분한 투여량 및 투여 정보를 포함한다. 관련 기술 분야의 종사자는 임의의 의사, 간호사, 기술자, 배우자 또는 조성물을 투여할 수 있는 다른 간병인을 포함한다고 예상된다. 약제학적 조성물은 또한 대상체에 의해서 자가-투여될 수 있다.
하기 예는 예시의 방식으로 제공되며, 제한의 방식이 아니다.
실시예
신뢰할 만한 동계 정위 결장직장 간 전이 동물 모델의 개발 및 사용은 결장직장 간 전이 형성을 유도하는 데 있어서 CXCL12의 역할에 대한 추가 조사를 허용하였다. 장(Zhang) 등에 의해서 처음으로 보고된 이러한 모델은 CT-26 FL3 세포 (2.0 x 106)를 맹장 벽에 접종하여, 간 전이의 높은 발생(약 90%)을 생성하는 것을 포함한다(Zhang, Y., et al., Development and Characterization of a Reliable Mouse Model of Colorectal Cancer Metastasis to the Liver. Clin Exp Metastasis, 30(7), 2013). CT-26 FL3(RFP/Luc 마커 유전자를 안정하게 발현함) 세포주의 설정을 통해서, 루시페라제 생물발광 분석을 사용하여 작은 조작된 항체 결합 도메인 CXCL12/SDF-1-트랩 단백질(28.6kD)을 암호화하는 pDNA를 전달하는 갈락토스-PEG-LCP 나노입자의 정맥내(IV) 주사가 전이성 병변에 저항하도록 간을 프라이밍하는 것을 입증하였다.
재료 및 방법
1. 재료
1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[석시닐 (폴리에틸렌글리콜)-2000]-N-하이드록시석신이미드(DSPE-PEG2000-N-하이드록실 석신이미드(NHS))를 엔오에프 코퍼레이션(NOF Corporation)(일본 도쿄 소재)으로부터 구입하였다. 0.05N HCl 중의 방사성 177LuCl3를 퍼킨엘머, 인크.(PerkinElmer, Inc.)로부터 구입하였고, 수령 즉시 사용하였다. PBS 완충제 중에서의 10 eq.의 4-아미노페닐 β-d-갈락토피라노시드와 1 eq.의 DSPE-PEG2000-NHS의 접합, 그 다음 클로로포름 추출 및 MWCO 1000 투석 튜브를 사용한 물에 대한 투석을 통해서 DSPE-PEG2000-갈락토스를 합성하였다. 모든 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.)(미국 알리바마주 알라바스터 소재)로부터 구입하였다. 펩타이드는 엘림 바이오파마슈티컬스, 인크.(Elim Biopharmaceuticals, Inc.)(미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)로부터 구입하였고; 모노사이클릭은 mc로 약칭하였다. 호크스트(Hoechst) 핵산 염색제 3342는 써모피셔 사이언티픽(ThermoFischer Scientific)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)으로부터 구입하였다. 형광 Cy3 cDNA 표지 키트는 미루스 레이블아이티 키트(Mirus LabelIT kit)(미루스 바이오(Mirus Bio), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 통해서 획득하였다. 루시페린은 프로메가 코퍼레이션(Promega Corporation)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로부터 구입하였다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해서 유도된 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 플라스미드는 바이우 바이오랩스(Bayou Biolabs)(미국 로스앤젤레스 하라한 소재)에 의해서 제조된 상품이었다. ELISA, IF, 및 IHC 키트뿐만 아니라 항-His-태그, 항-CXCL12, 및 항-CD8을 비롯한 모든 항체, 뿐만 아니라 2차 항체는 아브캄(Abcam)(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)을 통해서 구입하였다. 침윤 및 이동 검정법 키트는 EMD 밀리포어(EMD Millipore)(미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 통해서 구입하였다. 모든 다른 화학물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 6주령의 BALB/c 암컷 마우스(각각 약 18g)는 찰스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories)(미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 구입하였다.
2. 방법
CXCL12 트랩 단백질을 통한 이동 및 침윤의 생체내 억제: 조작된 단백질(CXCL12 트랩)을 시험하여 CT-26 FL3 이동 및 침윤을 억제하는 이의 능력을 결정하였다. 주화성 96-웰 세포 이동 및 24웰 세포 침윤 검정법(EMD 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)을 사용하였다. 세포를 24시간 동안 굶기고, 무혈청 배지 중의 0.5 X106개 세포/㎖의 밀도로 트랜스-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 세포의 하나의 군을 무혈청 배지 중에 유지시킨 반면, 나머지 모든 군은 공급 트레이에서 케모카인(화학유인제) CXCL12(100ng/㎖)의 첨가를 허용하였다. 추가로, CXCL12가 존재하는 3개의 군은 무혈청 배지(미처리), CXCL12 트랩(2, 4, 8, 12㎍/㎖), 또는 상업적으로 입수 가능한 CXCL12 mAb(아브캄)(1, 2, 4㎍/㎖)의 첨가를 허용하였다. 37℃에서 5% CO2 환경에서 4시간 및 24시간 동안 (이동) 및 24시간 동안(침윤) 인큐베이션. 세포를 이동/침윤 플레이트의 하부로부터 분리, 수집 및 용해시켰다. 용해 완충제를 생물발광 플레이트 판독기를 통해서 분석되는 루시페린(루시페라제 검정 용액)과 함께 첨가하였다. 배경 웰을 빼고, 미처리(CXCL12 화학유인제 없음)에 대한 것으로서 정량분석을 기록하였다.
DNA와 함께 로딩된 LCP의 제조 및 특징규명: 변형된 프로토콜을 사용하여 LCP를 제조하였다. 이게팔(Igepal) 520 및 사이클로헥산(3:7 v/v)의 2개의 별개의 마이크로에멀션(각각 60㎖)을 제조하고, 교반 하에 두었다. DNA(180㎍) 용액을 제조하였는데, 여기서 1,800㎕의 2.5M CaCl2를 첨가하였다. 이 용액에, 옥타아르기닌 펩타이드(mc-CR8C)를 2:1의 N:P 비율(약 200㎍)로 첨가하고, 마이크로에멀션에 즉시 첨가하였다. Na2HPO4 용액(1,800㎕, 50 mM)을 또한 제조하고, 나머지 에멀션에 첨가하였다. 각각의 마이크로에멀션을 20분 동안 교반하였다. Na2HPO4를 함유하는 마이크로에멀션을 또한 DNA/펩타이드/CaCl2를 함유하는 마이크로에멀션에 첨가하였다. 이 용액을 5분 동안 교반한 후, 1,200㎕의 (CHCl3 중의) 20mM DOPA를 첨가하였다. DOPA를 첨가한 후, 마이크로에멀션을 추가로 30분 동안 교반하였다. 동일 부피의 100% EtOH(120㎖)를 첨가하여 에멀션을 파괴하였다. 혼합물을 50㎖ 원뿔형 원심분리 튜브로 이송하고, 10,000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액의 경사분리 후, 그 후 침전물을 100% EtOH로 2회 세척하여 미량의 이게팔 및/또는 사이클로헥산을 제거하였다. 이어서, 침전물을 N2 하에서 건조시키고, CHCl3 중에 재현탁시켰다. 큰 응집물을 제거하기 위해서 이 용액을 10,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, LCP "코어"(DOPA의 지질 단층을 지지하고, 이것에 의해서 둘러싸인, 인산칼슘 나노침전물 내에 포집된 DNA 및 펩타이드)를 함유하는 상청액을 회수하였다.
DNA 포집 효율을 특징규명하기 위해서, cDNA를 제조사의 지시서에 따라서 Cy3(미루스 레이블아이티 키트, 미루스 바이오, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 표지하였다. 이러한 Cy3-DNA를 LCP 코어 중에 제형화하고, 그 후 형광 분광분석법을 통해서 회수를 평가하였다. 추가 연구는 호츠트(Hoescht) 핵산 염색법을 사용하여 pDNA/펩타이드가 캡슐화된 DNA 포집 효율을 확인하였고, 코어를 아세트산 완충제 중에서 용해시키고, 펩타이드/DNA를 프로테아제 K의 첨가를 통해서 해리시키고, 호츠트 염색제를 첨가하고, 형광 분광분석법을 통해서 평가하였다. 177Lu-표지된 LCP 코어를 상기에 기술된 바와 같이 제조하였고, 여기서 177LuCl3와 함께 pDNA/펩타이드를 칼슘 에멀션의 CaCl2 용액에 혼입하였다. 두 에멀젼의 공동-침전 시, 177Lu-표지된 LCP 코어를 상기에 기술된 바와 같이 수집하였고, CHCl3 중에서의 원심분리하여 177Lu를 함유하는 응집물을 제거하였다. 최종 LCP 코어는 80%의 177Lu를 캡슐화하였다. 유리 지질과 코어의 혼합물의 건조 및 5% 수성 수크로스 용액을 통한 재수화를 통해서 최종 Gal-LCP-pDNA/mc-CR8C를 제조하였다. 최적의 최종 입자 제형을 위한 코어 대 외부 리플릿의 비는 11㎎ 코어:600㎕ DOTAP(20mM):600㎕ 콜레스테롤(20mM):500㎕ DSPE-PEG2000(20mM)임을 발견하였다. 여기서, 35㏖%의 DOTAP, 35㏖%의 콜레스테롤, 및 30㏖%의 DSPE-PEG2000(또는 25㏖%의 DSPE-PEG 및 5㏖%의 DSPE-PEG-Gal)를 외부 리플릿 지질로서 사용하였다. LCP의 제타 전위 및 입자 크기를 멜버른 제타사이저 나노 시리지즈(Malvern ZetaSizer Nano Series)(미국 매사추세츠주 웨스트보로 소재)를 사용하여 측정하였다. LCP의 TEM 영상을 제올(JEOL) 100CX II TEM(제올, 일본 소재)을 사용하여 획득하였다.
Gal-LCP-pDNA/mc-CR8C의 약동역학, 생물분포, 및 세포 분포: 약동역학 및 정량분석적 생물분포를 상기에 기술된 바와 같이 pDNA와 177Lu의 공동-캡슐화를 통해서 결정하였다. 이러한 방법은 LCP 생물분포를 정확하게 결정하기 위해서 이미 사용되어 왔다. 8주령 BALB/c 암컷 마우스(각각의 군에 대해서 6마리의 마우스를 사용하였음)에게 1 Х 108cpm/㎏의 177Lu에 상응하는, 0.5㎎ pDNA/㎏에서 LCP를 (0.2㎖, 수크로스를 첨가하여 오스몰농도 균형을 맞춤) 개별적으로 주사하였다. 약동학 분석을 위해서, 혈액을 꼬리-니크 출혈(tail-nick bleed)을 통해서 다양한 시간 지점(0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 및 16시간)에서 회수하였다. 생물분포 분석을 위해서, LCP 투여 16시간 후에, 혈액 및 주요 기관을 수집하였다(각 시간 지점에 대해서 6마리의 마우스를 사용함). 혈액 및 조직에서의 방사능을 γ-카운터를 사용하여 측정하였다. 분석을 포에닉스 윈놀린(Phoenix WinNonlin)(버전 6.3, 파사이트 코퍼레이션(Pharsight Corporation); 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 2-구획 모델 하에서 수행하였다.
생체내 유전자 투여 단계적 확대 및 발현 시간: C-말단 단부에 His-태그를 함유하는 pCXCL12 트랩 DNA를 함유하는 갈락토스 표적화된 LCP의 제형을 8주령 BALB/c 암컷 마우스(0.1, 0.5, 또는 1㎎ DNA/㎏, 각각의 군에 대해서 3마리의 마우스를 사용함)에게 꼬리 정맥을 통해서 주사하였다(0.2㎖, 수크로스를 첨가하여 오스몰농도 균형을 맞춤). 발현이 용량 의존성인지를 결정하기 위해서 pCXCL12 트랩 DNA LCP의 증가 농도를 꼬리 정맥 IV 투여한 후에 웨스턴 블롯 분석 및 정량분석을 수행하였다. 마우스를 투여 24시간 후에 질식시켰다. 간, 비장, 폐, 신장, 심장, 및 혈액을 수집하고, RIPA 완충제 중에서 균질화시켰다. 용해물 중의 총 단백질 농도를 비신코닌산 단백질 검정 키트(BCA 단백질 검정 키트, 피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)를 통해서 결정하였다. 그 다음, 50㎍의 총 단백질을 웨스턴 분석을 위해서 로딩하였다. 목적하는 CXCL12 트랩 단백질은 28.6kD의 분자량을 갖는다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. His (6x)-태그 마우스 항체를 1차 항체로서 사용하였다. pCXCL12 트랩의 발현을 PBS 처리군에 대한 상대적인 HRP 강도 증가로서 정량분석하였다.
His-태그 ELISA 키트를 또한 사용하였는데, 여기에는 5㎍의 총 단백질이 추가 발현 분석을 위해서 로딩되어 있었다. 키트는 표준 교정 대조군으로서 사용될 His-태그를 함유하는 표준 단백질을 제공하였다. 따라서, 단백질 발현의 정량분석을 ELISA 분석을 통해서 측정할 수 있다. 용량 단계적 확대 및 발현 연구 이후에, 0.5㎎의 DNA/㎏ 용량을 생체내 치료 연구를 위해서 선택하였다.
C-말단 단부에 His-태그를 함유하는 pCXCL12 트랩을 암호화하는 pDNA를 함유하는 갈락토스 표적화된 LCP의 제형을 꼬리 정맥을 통해서 8주령 BALB/c 암컷 마우스(0.5㎎ DNA/㎏ x 3 QOD, 각각의 군에 대해서 3마리의 마우스를 사용함)에 주사하였다(0.2㎖, 수크로스를 첨가하여 오스몰농도 균형을 맞춤). 발현의 일시적인 시간을 결정하기 위해서 pCXCL12 트랩 DNA LCP를 꼬리 정맥 IV 투여한 후 웨스턴 블롯 분석 및 정량분석을 수행하였다. 투여 1, 2, 4, 또는 8일 후에 마우스를 질식시켰다. 간, 비장, 폐, 신장, 심장, 및 혈액을 수집하고, RIPA 완충제 중에서 균질화시켰다. BCA를 사용하여 단백질 함량을 측정하였다. 그 다음, 50㎍의 총 단백질을 웨스턴 분석을 위해서 로딩하였다. 기관 대 간 발현 수준을 분석하고, 기관 및 간 발현의 정량분석에서의 일관성을 유지시키기 위해서 모든 겔을 특정 기관 및 표준 간 샘플에 로딩하였다. pCXCL12 트랩의 발현을 PBS 처리군에 대한 상대적인 HRP 강도 증가로서 정량분석하였다.
독성 및 병리학 연구: 마우스를 pCXCL12 트랩, pGFP, 블랭크 로딩된 LCP(0.5㎎ DNA/㎏ x 3, QOD)(각각의 군에 대해서 3마리의 마우스를 사용함)로 처리하였다. 추가로, 또 다른 처리군에게 유리 CXCL12 트랩 단백질(1.0㎎ 단백질/㎏ x 3, QOD)을 투여하였다. 최종 꼬리 정맥 주사 24시간 후에 마우스를 질식시켰다. 심장 천자 및 원심분리를 통해서 혈청을 마우스로부터 얻었다. 간 및 신장 손상을 혈청 샘플에서의 AST, ALT 및 BUN의 수준을 측정함으로써 평가하였다. 백혈구, 림프구, 과립구 및 단핵구를 비롯한, 혈액 세포 수준을 전혈 분석으로 측정하였다. 이러한 측정치는 유엔씨 채플 힐(UNC Chapel Hill)에서의 동물 임상 화학 및 유전자 발현 연구소(Animal Clinical Chemistry and Gene Expression Laboratories)에 의해서 정량분석되었다. 추가로, 그 후에 각각의 마우스의 주요 기관을 3색 염색을 위해서 수집, 고정화, 가공하였다. 조직 절편의 영상을 10X 대물렌즈를 갖는 니콘 광 현미경(Nikon light microscope)을 사용하여 수집하였다.
생체내 간 전이 억제: 마우스에게 2x106 CT-26 FL3 RFP/Luc 세포를 맹장 벽으로 접종하였다. 10, 12, 및 14일에 10㎍의 (pDNA) Gal-LCP-pCXCL12 트랩/mc-CR8C의 처리를 꼬리 정맥을 통해서 IV로 투여하였다(n=7). 대조군 군은 PBS/미처리(n=7) 및 Gal-LCP-GFP/mc-CR8C(n=6)를 포함하였다. 종양 덩어리의 진행 이후에 200㎕의 루시페린(10㎎/㎖)을 IP로 투여하였고, 루시페라제 생물발광 영상화를 루시페린의 투여 10분 후에 기록하였다. 24일에 마우스 종양 덩어리는 코닥 카메라를 사용하여 IVIS를 사용하여 생물발광 영상으로 상기에 도시되어 있다. 24일 후, 마우스를 질식시키고, 간을 적출하였다. 간 상에서의 종양 존재량의 정량분석은 이미지 제이 소프트웨어를 사용하여 정량분석하였다. 정량분석이 상기에 제시되어 있으며, 여기서 종양 존재량은 대조군 군과 비교할 때 85%를 초과하게 감소되었음을 발견하였다. 처리 이후에 다른 기관 전이성 존재량의 추가 분석을 연구하였다. 24일에 마우스 전이를 평가하였는데, 여기서 마우스는 200㎕의 루시페린(10㎎/㎖)으로 처리되었다. 마우스의 영상을 찍고, 질식시키고, 이어서 기관을 추출하고, 루시페린(1㎎/㎖)의 용액 중에 넣고, 생물발광에 대해서 영상화하였다.
통계 분석: 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표현하였다. 통계 분석은 단지 2개의 값 세트를 비교하는 경우에는 스투던트 t-시험에 의해서 수행하였고, 데이터가 3개 이상의 군을 포함하는 경우에는 일원 분산 분석(ANOVA) 그 다음 두네트 시험에 의해서 수행하였다. *, **, ***는 각각 p< 0.05, 0.01, 및 0.001을 나타내고, 이것은 유의함으로 간주되고, 도면 또는 도면 설명에 기재되었다. 모든 통계에서, 군은 미처리 대조군에 대해서 비교하였다.
실시예 1
갈락토스-LCP pDNA/mc-CR8C 나노입자의 제형
휴 등은 갈락토스-LCP와 pDNA/mc-CR8C 카고(cargo)의 제형 및 마우스의 간(간세포)으로의 전달을 처음으로 보고하였다(Hu, Y., et al., A Highly Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nuclei in Vivo. ACS Nano, 2013. 7(6): p. 5376-5384). 보고된 바와 같이, 반전 마이크로에멀션을 사용하여 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA)-코팅된 인산칼슘(CaP) 나노입자(LCP "비정질 코어")를 제조하였다. 이러한 코어는 DNA(60% 효율) 및 양이온성 펩타이드 둘 모두를 캡슐화하여, 15 내지 25nm 직경 범위의 코어 크기를 생성할 수 있다. 중공 코어 구조가 투과 전자 현미경(TEM)(도 3a/b) 하에서 가시화될 수 있다. 그 다음, CaP 코어를 둘러싼 DOPA 단층은 양이온성 외부 리플릿 지질(1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP), 헬퍼 지질 콜레스테롤, 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[석시닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000(DSPE-PEG2000))의 첨가를 허용하여 RES 회피를 도와서, 간 사인형 천공(sinusoidal fenestration)을 용이하게 관통할 수 있는 도 3a 내지 도 3c에 도시된, 60nm 미만 직경의 입자("최종" LCP, 직경 40 내지 60nm)를 생성하였다.
실시예 2
LCP 나노입자 크기의 결정
LCP 입자의 유체역학적 직경 및 표면 전하는 동적 광 산란을 통해서 대략 45nm 및 10mV(도 3c)인 것으로 발견되었다. 동적 광 산란은 LCP가 대략 45nm 직경으로 좁게 분산되어 있고, DSPE-PEG2000의 양이온 차폐 능력과 함께 DOTAP의 양이온성 전하로 인해서 양성 제타 전위(대략 +10 mV)를 갖는다는 것을 나타내었다. LCP와 리포좀 혼합물은 236±32nm의 z-평균; n=6을 생성한다. 용액은 10% 우태아 혈청 중에서 적어도 24시간 동안 37℃에서 안정함을 발견하였고, 여기서 z-평균의 어떤 유의한 증가도 발견되지 않았다(도 3d).
실시예 3
LCP 코어에서의 pDNA 캡슐화 효율
갈락토스-LCP pDNA/mc-CR8C의 pDNA 로딩의 결정은 코어를 아세트산 완충제 환경(pH =4) 중에서 용해시킴으로써 달성하였다. 프로테아제 K 용액을 첨가하여 펩타이드로부터 DNA를 해리시켰다. 호크스트 염색제의 첨가는 정량분석적 형광 판독을 허용하여 DNA 캡슐화 효율을 결정하였다. DNA 캡슐화 효율은 대략 50 내지 60%임을 발견하였는데, 이는 휴 등의 제형에 근접하게 상응한다(Hu, Y., et al., A Highly Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nuclei in Vivo. ACS Nano, 2013. 7(6): p. 5376-5384).
실시예 4
갈락토스-LCP-pDNA/mc-CR8C 나노입자 PK 및 기관/간 축적
Lu177 방사성동위원소를 pDNA/mcCR8C LCP 코어에 혼입하여 간 특이성, 약동역학, 및 기관 분포를 결정하였다. Lu177을 함유하는 갈락토스-LCP pCXCL12 트랩/mc-CR8C(pTrap LCP) 입자를 정상 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해서 주사하였다. PK 및 기관 분포 프로파일은, 갈락토스-LCP 나노입자가 각각 20분 및 1054분에서의 T1/2α 및 T1/2β를 갖는 2-상 분포를 나타내고, 뿐만 아니라 IV 주사 16시간 후 간에서 LCP의 대략 50%가 축적됨을 발견하였다(도 4). 갈락토스 표적화가 없는 pTrap LCP 입자의 의 꼬리 정맥 주사는 간 축적에서 상당한 감소(대략 10 내지 15% 축적)를 나타내었는데, 이는 휴 등이 보고한 값에 대등하다.
실시예 5
내생 CXCL12의 생체내 간 발현 프로파일
병이 걸린(결장직장 간 전이 모델) BALB/C 마우스의 간에서 내생 CXCL12의 발현 수준을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 1차 CXCL12 항체 및 형광 태깅된(알렉사 플루어(Alexa Fluor) 594) 2차 항체로의 면역-형광 염색을 통해서 CXCL12의 양을 추출, 포르말린 고정화, 파라핀 절편화 및 평가하였다. 본 발명자들은 본 발명자들의 pTrap LCP의 전달이 CXCL12 트랩핑으로 인해서 감소된 형광 신호를 산출하고, 뿐만 아니라 감소된 전이성 병변으로 인해서 감소된 염증을 산출하는지를 추가로 평하였다. 따라서, pTrap LCP(10㎍ pDNA QOD x 3)의 최종 IV 투여 10일 후, 본 발명자들은 간을 수집하고, 간을 포르말린 고정시키고, 파라핀 절편화하고, CXCL12(적색)에 대한 면역-형광 염색을 사용하였다. 5개의 군(이들 중 4개는 CRC를 함유함)을 연구하였는데, 이것은 미처리(CRC 없음), 미처리(PBS), 갈락토스-LCP pGFP/mc-CR8C(pGFP LCP), pTrap LCP(10㎍), pTrap LCP(10㎍ QOD x 3)를 포함한다. 결과를 도 5a에 도시하며, 여기서 미처리 및 pGFP는 CRC가 없는 마우스로부터의 미처리 간과 비교할 때 형광 강도에서 유의한 변화가 없었고, CXCL12 발현에서 대략 5 내지 6배의 증가를 가졌다. 그러나, pTrap LCP(10㎍ x 1 및 10㎍ QOD x 3) 군 둘 모두는 미처리와 비교할 때 각각 형광 강도가 2.5배 및 5배 감소하였는데, 이는 궁극적으로 CRC가 없는 마우스로부터의 미처리 간에서 발견된 CXCL12의 기준선 수준에 도달하였다(p<0.05)(도 5a). pTrap LCP(10㎍ x 1 및 10㎍ QOD x 3)의 처리 후 간에서 발견된 CXCL12의 감소로 인해서, 본 발명자들은 절편을 추가로 염색하여 간 CD8 T-세포 집단(녹색), MDSC, 및 T-조절 세포(이것은 내생 CXCL12에 의해서 모집될 것이라고 여겨짐)에 대한 효과를 결정하였다. 건강함(CRC 없음, 미처리(종양), 미처리(스트로마), 및 pTrap LCP(10㎍ 2일 1회 x 3)을 비롯한 4개의 군을 연구하였다. 결과를 도 5b에 도시하며, 여기서 pTrap LCP(10㎍ QOD x 3)군은 미처리와 비교할 때 형광 강도 감소를 나타내었다(p<0.05)(도 5b).
실시예 6
pTrap LCP 투여 후 CXCL12-트랩의 생체내 기관 발현/분포
BALB/c 마우스에서 IV 꼬리 정맥 투여를 통한 pTrap LCP의 전달은 간에서 주입된 용량의 거의 50% 축적을 나타내었다(도 4b). 휴 등은 LCP의 대부분이 포획되어, 간세포에서 발현됨을 보고하였다. 휴 등은 또한 PEG 밀도 감소 및 갈락토스 표적화 리간드의 부재가 쿠퍼(Kupffer) 세포 내로의 섭취를 우세하게 이동시켜, pDNA의 발현 수준을 감소시키는 것을 보여주었다. 따라서, 간세포 흡수 및 발현을 보장하기 위해서, 본 발명자들은 휴 등의 제형에서 사용된 PEG 밀도(30% ㏖. 인풋(input)) 및 갈락토스 표적화 리간드를 반영하였다. 본 발명자들은 간 대 다른 기관/혈청에서 pCXCL12 트랩의 우선적인 발현을 추가로 연구하여 본 발명자들이 이러한 CXCL12 트랩의 우세한 간 특이적 발현을 갖는 것을 보장하였다. pCXCL12 트랩의 기관 발현을 결정하기 위해서, 본 발명자들은 C-말단에서 His-태그를 혼입하였는데, 이것은 His-태그 mAb를 통해서 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 허용하였다(도 5d, 5e, 및 5f). 마우스를 증가하는 용량의 pTrap LCP(0.1㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 및 1.0㎎/㎏)로 처리하였다. ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 통해서 본 발명자들은 24시간 후 간 발현에서 용량 의존적 증가를 인지하며, 다른 오프-타깃 기관 또는 혈청에서 발현이 관찰되지 않았다(도 5d 및 5e). pTrap LCP(0.5㎎/㎏ QOD x 3)를 투여하고, 마우스를 1, 2, 4, 및 8일에 질식시킨 추가 연구. 기관을 수집하고, 항-His-태그 mAb를 사용함으로써 웨스턴 블롯을 통해서 분석하였다(도 5f). 이러한 결과는, 갈락토스-LCP 벡터가 임의의 다른 기관 또는 혈청에서 최소 발현을 가지면서, 간에서 우선적인 일시적인 발현을 허용한다는 것을 명확하게 입증한다(도 5d, 5e, 및 5f). 그 다음, 본 발명자들은 간 발현이 일시적인 특성을 유지한다는 것을 보고하며, 여기서 발현은 최종 주사(10㎍ pDNA; 0.5㎎/㎏ QOD x3) 8일 후까지 지속되는 것을 발견하였다(도 5f).
간 대 다른 기관/혈청에서 녹색 형광 단백질 플라스미드(pGFP) 및 CXCL12 트랩 플라스미드(pTrap)의 우선적인 발현이 도 5a에 나타나있다. 최종 pGFP LCP 주사 후 2, 4 및 8일에 기관 절편의 형광 현미경 분석을 통해서, 본 발명자들은 4일까지 지속되는 일시적인 간-특이적 발현을 입증할 수 있었다. 임의의 다른 주요 기관 절편에서 어떤 GFP 신호도 관찰되지 않았다. 추가로, GFP의 발현은 간 내에서의 간세포 집단에서 대부분 존재하는 것을 발견하였다(도 5a).
실시예 7
pTrap LCP 투여 후 마우스에서 결장직장 간 전이의 발생 및 종양 존재량의 감소
본 발명자들은 마우스에서 발견되는 발병 및 전이 존재량에 대한 pTrap LCP의 효과를 조사하였다. 마우스에게 맹장 벽으로 2.0x106 CT-26 FL3(RFP/Luc) 세포를 정위로 접종하였다. 이러한 일련의 실험에서, 처리는 맹장 접종 10일 후에 시작하였다. 3개의 처리군을 조사하였는데, 이것은 PBS(미치료), pGFP LCP로 이루어진 벡터 대조군, 및 pTrap LCP를 포함하였다. 3개의 처리군의 투여는 접종 10일 후에 개시하였는데, 여기서 10, 12, 및 14일에 IV로 꼬리 정맥에 주사하였다(10㎍ pDNA). 200㎕의 루시페린(10㎎/㎖)의 IP 투여 그 다음 생물발광 분석을 통해서 총 마우스 종양 존재량을 추적하였다. 전체 마우스 종양 존재량을 매주 기록하고, 이를 사용하여 10일 전에 마우스를 처리군으로 분류하고, 접종 후 24일에 전체 마우스 종양 존재량을 도 13에 나타낸다. 24일에, 200㎕의 루시페린(10㎎/㎖)을 IP로 투여하고, 맹장에서 많은 1차 종양 존재량으로 인해서 마우스를 질식시켰다. 기관을 수집하고, PBS 중에서 헹구고, 그 후 묽은 루시페린 용액(1㎎/㎖) 중에 넣었다. 간 및 다른 기관을 생물발광 영상화에 의해서 분석하여 전이 종양 존재량을 결정하였다(도 6a 및 6b). 생물발광 분석 이후에, 간을 PBS 중에서 헹구고, 포르말린 용액 중에서 고정시키고, 절편화하고, 추가 모폴로지 분석을 위해서 3색 염색하였다(도 6c). 루시페라제(생물발광 강도)로부터 PBS 및 pGFP LCP는 간 상에서 큰 전이성 종양 존재량을 가지며(도 6a 및 6b), 이것은 그 다음 경변증 및 섬유증 조직을 유발하여 더 두드러지게될 것이라는 것이 명백하다(도 6c). 이에 반해서, pTrap LCP(10㎍ pDNA)로 3회(QOD) 처리된 마우스는 간 전이 형성의 발병에서 상당하고(간 전이 존재량에서 10배 감소), 대략 70 내지 80% 감소를 나타내었다. 3색 염색된 간 절편의 현미경 분석을 통해서 검출된 섬유증 면적은 대조군 시편에서보다 pGFP LCP 마우스로부터 시편에서 상당히 더 작았다(p<0.01)(도 6c). 이는 간 특이적 비-바이러스 벡터에서 pDNA의 전달을 통해서, 치료 단백질을 성공적으로 발현시켜, 치료 효능을 생성한 본 발명자들의 지식에 대한 첫 번째 기록이다. 추가로, 본 발명자들은 이러한 전이가 존재량 및 발병을 감소시킬 뿐만 아니라 이러한 전이가 다른 기관으로 이동 및 침입하는 것이 발견되지 않음을 관찰한다(도 6b).
실시예 8
암-특이적 T 세포는 pTrap LCP 치료요법의 항-전이 효능을 향상시킨다.
CD8+ 림프구의 존재와 함께, pTrap LCP 처리 후 간에서 감소된 MDSC 및 Treg 집단은 간 내에서 종양-촉진(pro-tumor)에서 항-종양 환경으로의 이동을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 pTrap LCP 치료요법 후 간에서 전이의 설정을 감소시키는 세포독성 T 림프구(CTL)의 능력을 조사하였다. 간-특이적 CD8 T 세포 사멸을 향상시키는 pTrap LCP의 능력을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 CD8+ T 세포 집단이 고갈된 마우스에서 pTrap LCP의 항-암 효능을 연구하였다. 본 발명자들은 하리모터(Harimoto) 등에 의해서 보고된 것과 유사한 프로토콜을 따랐는데, 여기서 400㎍ 항-Lyt2.2(2.43; 래트 IgG2b)(14)의 2회 복강내 주사 후에 CD8+ T 세포의 95% 이상이 고갈되었다. 마우스에게 이미 기술된 정위 동계 모델에 따라서 CRC를 접종하였고, 그 다음 처리 전에 T 세포를 고갈시켰다. 이러한 일련의 실험에서, 처리는 맹장 접종 10일 후에 시작하였다. 동물을 3개의 처리군으로 나누었다: 미처리(PBS), 항-CD8(항-Lyt2.2)을 갖는 pTrap LCP, 및 항체 아이소타입 대조군(래트 IgG2b 아이소타입 대조군)을 갖는 pTrap LCP. CD8+ T 세포 집단의 결손을 유지시키기 위해서, 항-Lyt2.2 또는 아이소타입 대조군 IgG(400㎍)의 복강내 주사를 8일 및 10일에 투여하였다. 접종 후 10일에 치료를 시작하였고, 10, 12, 및 14일에 IV 꼬리 정맥을 주사(10㎍ pDNA)하였다. 21일에 맹장에서 높은 원발성 종양 존재량으로 인해서 마우스를 안락사시키고, 생물발광 영상화를 통해서 간 종양 존재량을 결정하였다(도 7). PBS로 처리된 모든 마우스는 간에서 큰 전이성 종양 병변이 발생하였다(도 7). 항-Lyt2.2, 그 다음 pTrap LCP(10㎍ pDNA)의 3회 용량으로 처리된 T 세포-고갈된 마우스는 미처리 마우스와 유사한 간 종양 존재량을 나타내었다. 이에 반해서, 아이소타입 대조군 IgG2b 항체, 그 다음 pTrap LCP로 처리된 마우스는 미처리 동물과 비교할 때 간 전이 존재량에서 5-배 감소를 나타내었고, 간 전이의 발병에서 대략 80% 감소를 나타내었다. 이러한 결과는, CXCL12의 감소와 함께 CTL의 존재가 간에서 전이성 병변의 설정 위험을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 9
전이성 존재량 감소는 유방 암 간 전이 모델에서 증가된 생존과 연관된다.
본 발명자들은 공격적인 마우스 유방 암 간 전이 모델에서 중간 생존율 및 간 종양 존재량에 대한 pTrap LCP의 효과를 조사하였다. 유방 암 간 전이 모델은 고도로 전이성인 뮤린 유방 암 세포주 4T1의 절반-비장 이식(hemi-splenic implantation)으로 이루어진다. 이러한 연구는 임상 치료 기준을 모델링하였는데, 여기서 원발성 종양을 절제하고, 통상적으로 전이성 존재량으로부터 사망이 유발된다. BALB/c 마우스에게 비장의 한 절반부에 1.0x106(0.1 ㎖)의 4T1(GFP/Luc) 세포를 접종하였는데, 이것은 묶여 있었고, 종양 접종 전에 2개의 절반부로 분리되었다. 세포가 제공된 절반-비장을 접종 10분 후에 절제하여 원발성 종양 성장을 감소시켰다. 이러한 일련의 실험에서, 처리는 접종일에 시작하였는데, 그 이유는 간으로의 세포의 신속한 이동, 종종 접종 후 5분 내의 이동으로 인해서이다(15). 본 발명자들은 유방 암 간 전이 모델에 대해서 4개의 처리군을 연구하였다: 미처리(PBS), 항-CD8을 갖는 pGFP LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA 및 400㎍, 20㎎/㎏ 항-Lyt2.2), 항-CD8을 갖는 pTrap LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA 및 400㎍, 20㎎/㎏ 항-Lyt2.2), 및 아이소타입 IgG를 갖는 pTrap LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA 및 400㎍, 20㎎/㎏ 아이소타입 IgG). PBS, pGFP LCP, 또는 pTrap LCP를 0일에 시작하여 6일을 마지막으로 2일에 1회 꼬리 정맥 주사를 통해서 IV로 투여하였다. 항-Lyt2.2 또는 아이소타입 IgG 대조군의 투여는 0일 및 2일에 2회의 IP 주사를 포함하였다. 생물발광 영상화에 의해서 종양 진행을 모니터링하엿다(도 8a). 하기 조건 중 하나가 적용된 경우 마우스를 안락사시켰다: 1주 이내에 10%를 초과하는 극적인 체중 증가 또는 감소 또는 고통의 명확한 징후, 예컨대 탈수, 무활동 또는 호흡 곤란/약한 호흡. 각각의 군으로부터 3마리의 마우스를 접종 10일 후에 안락사시키고, 이들의 기관을 수집하고, PBS 중에서 헹구고, 유세포 분석법 분석에 의해서 종양 존재량에 대해서 간을 분석하였다석(도 8b). pTrap LCP 처리가 제공되지 않은 마우스는 접종 1주 내에 간에서 큰 전이성 종양 병변이 발생하였다(도 8a 및 8b). 이에 반해서, pTrap LC로 처리된 마우스는 간 전이 존재량의 감소 및 간 전이 형성의 발병 감소뿐만 아니라, 모든 다른 처리군(14일 대 25일)보다 중간 생존율이 거의 2-배 증가함을 나타내었다(도 8c).
실시예 10
pTrap LCP, 트랩 단백질, 및 CXCR4 길항제에 의한 간 전이의 설정의 감소
본 발명자들은 면역결핍 무흉선 마우스에서 인간 결장직장암 세포주(HT-29)를 사용하여 간 전이의 설정을 감소시키는 데 있어서의 상이한 치료 양식[항-CXCL12 트랩 단백질, CXCR4 소분자 길항제(AMD3100), 및 pTrap LCP]의 효능을 비교하였다. 인간 결장직장암 간 전이 모델은 CXCR4의 높은 발현을 갖는 결장직장암 세포주 HT-29를 사용하여 상기와 동일한 절반-비장 이식 절차에 따라서 설정하였다(도 11). 이러한 일련의 실험에서, 접종 후 5분 이내에 세포가 간으로 신속하게 이동하기 때문에 접종일에 치료를 다시 시작하였다(15). 결장직장암 간 전이 모델에 대해서 연구된 5개의 처리군은 미처리(PBS), pGFP LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA), pTrap LCP(10㎍, 0.5㎎/㎏ pDNA), 유리 CXCL12 트랩 단백질(10㎍, 0.5㎎/㎏ 단백질), 및 AMD3100(100㎍, 5.0㎎/㎏)이었다. 2일 1회 꼬리 정맥 주사에 의해서 IV로 치료제를 투여하였고, 0일에 시작하여 16일에 끝냈다(도 9a). 36일에 마우스를 안락사시키고, 그들의 간을 수집하고, PBS 중에서 헹구고, 종양 결절을 간으로부터 절제하고, 칭량하였다(도 9b). pTrap LCP 또는 AMD3100 치료제가 제공되지 않은 마우스는 간에서 다수의 전이성 종양 병변이 발생되었다(도 9b). 이에 반해서, pTrap LCP 또는 AMD3100으로 처리된 마우스는 모든 다른 처리군과 비교할 때 치료 동안 간 전이 존재량에서의 감소 및 간 전이 형성의 감소된 발병을 나타내었다.
실시예 11
간, 신장, 및 혈액 기능에 대한 pTrap LCP의 효과(독성 분석)
pTrap LCP(10㎍ QOD x 3)의 투여는 최종 IV 꼬리 정맥 주사 24시간 후에 ALT, AST, 크레아티닌, 또는 BUN 수준에서 유의한 변화를 나타내지 않았고, 뿐만 아니라 어떤 기관의 3색 조직학 절편 분석에서도 독성의 징후를 나타내지 않았다 (도 10a 및 10b). 혈액/면역 세포 수준의 추가 분석은 미처리 마우스와 비교할 때 변화의 징후를 나타내지 않았다(도 10a). 독성학 분석을 또한 조직학 3색 기관 절편에서 확인하였고, 여기서 모든 처리는 정상 조직/세포 모폴로지를 나타내었다(도 10b).
실시예 12
병용 치료요법
재료 및 방법
1,2-다이스테아로릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시 (폴리에틸렌글리콜-2000)] 암모늄 염(DSPE-PEG)을 엔오에프(일본 도쿄 에비수 시부야쿠 소재)로부터 구입하였다. 다이올레오일 포스파티드산(DOPA) 및 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판 클로라이드 염(DOTAP)을 아반티 폴라 리피즈(미국 알리바마주 알라바스터 소재)로부터 구입하였다. 콜레스테롤 및 프로타민을 시그마-알드리치(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 모든 다른 화학물질은 달리 언급되지 않는 한 시그마-알드리치(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다.
CXCL12 트랩 유전자 작제: CXCL12-결합 VH 도메인 및 VL 도메인의 암호 서열을 트랩 유전자의 조립을 위해서 사용하였다. CXCL12 트랩에 대한 최종 서열은 각각 신호전달 펩타이드, VH 도메인, 가요성 링커, VL 도메인, E 태그, 및 His(6x) 태그를 암호화한다. 완전한 cDNA를 NheI 부위와 XhoI 부위 사이에서 pCDNA3.1 내에서 클로닝하고, 정확도를 DNA 서열결정에 의해서 확인하였다.
PDL1 트랩 유전자 작제: 마우스 또는 인간 PD-1의 세포외 도메인의 암호 서열 마우스 또는 인간 CMP1의 삼량체화 도메인의 암호 서열을 PD-L1 트랩 유전자의 조립을 위해서 사용하였다. PD-L1 트랩에 대한 최종 서열은 각각 신호전달 펩타이드, PD-1의 PD-L1 결합 도메인, 가요성 링커, 삼량체화 도메인, E 태그, 및 His(6X) 태그를 암호화한다. 완전한 cDNA를 NheI 부위와 XhoI 부위 사이에서 pCDNA3.1 내에서 클로닝하고, 정확도를 DNA 서열결정에 의해서 확인하였다.
세포주: 원발성 종양 세포주 KPC98027 유래된 KPC 췌장관 선암 마우스 모델(LSL-Kras G12D/ + ; LSL-Trp53 R172H/ + ; C57Bl/6 배경에 대한, Pdx-1-Cre)은 세르게이 코즐로프(Serguei Kozlov) 박사(National Cancer Institute, Center for Advanced Preclinical Research)에 의해서 제공되었고, 이를 둘베코 변형 독수리 배지: 10% 우태아 혈청(FBS)(깁코) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 영양 혼합물 F-12(DMEM/F12)에서 37℃ 및 5% CO2에서 가습 분위기에서 성장시켰다. 세포주의 렌티바이러스 형질주입을 수행하였는데, 여기서 KPC98027 세포를 mCherry 적색 형광 단백질(RFP), 파이어플라이 루시페라제(Luc), 및 퓨로마이신 내성 유전자를 보유하는 벡터로 안정하게 형질주입시켰다. 안정한 형질주입된 KPC98027 세포(KPC98027 RFP/Luc)를 퓨로마이신의 존재 하에서 선택하였다.
마우스에서의 정위 동종이식 KPC 모델: 서브-컨플루언트(sub-confluent) KPC98207(RFP/Luc를 갖거나 갖지 않음) 세포를 수거하고, 이식 직전에 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 세척하였다. 췌장의 테일에 1X106 세포를 정위 주사함으로써 정위 동종이식 KPC 모델을 설정하였다. 간략하면, 8주령 C57Bl/6 마우스를 케타민/자일라진 용액의 IP 주사에 의해서 마취시키고, 반듯이 누운 자세로 놓았다. 중간선 절개를 수행하여 비장 및 췌장을 꺼냈다. 인슐린-게이지 주사를 사용하여, 췌장의 테일에 40㎕의 1Х106 세포를 주사하였다. 그리고, 복벽 및 피부를 6-0 폴리글리콜산 구조로 폐쇄시켰다. 주사 부위를 조직 접착제(쓰리엠(3M), 미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로 밀봉하고, 누출될 수 있는 암 세포를 사멸시키기 위해서 70% 알코올로 멸균시켰다.
항체: 면역염색(IF) 및 유세포 분석법(flow cytr)을 위해서 사용된 1차 항체, 형광 접합된 1차 및 2차를 하기 표 3에 열거하였다.
Figure pct00003
LPD의 제조 및 특징규명: 관련 기술 분야에 널리-설정된 프로토콜을 기반으로 단계식 자가-조립 공정을 통해서 LPD를 제조하였다. 간략하면, DOTAP 및 콜레스테롤(1:1, ㏖/㏖)을 클로로폼 중에 용해시키고, 용매를 제거하였다. 이어서, 지질막을 증류수로 수화시켜 10m㏖/L 콜레스테롤 및 DOTAP의 최종 농축액을 제조하였다. 이어서, 리포좀을 200nm 및 100nm 폴리카보네이트 막(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 소재)을 통해서 순차적으로 압출시켜 70 내지 100nm의 단일층 리포좀을 형성하였다. 5% 글루코스 중의 36㎍ 프로타민 140㎕를 5% 글루코스 중의 50㎍ 플라스미드(대조군 플라스미드로서의 pcDNA 3.1, 또는 CXCL12 또는 PDL1 트랩을 암호화하는 플라스미드)의 동등한 부피와 혼합하여 LPD 폴리플렉스 코어를 제형화하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 60㎕콜레스테롤/DOTAP 리포좀(각각 10m㏖/L)을 첨가하였다. 15% DSPE-PEG의 사후 삽입을 60℃에서 15분 동안 추가로 수행하였다. NP의 크기 및 표면 전하를 멜버른 제타사이저 나노 시리지즈(미국 매사추세츠주 웨스트보로 소재)에 의해서 결정하였다. NP가 음성으로 염색되는 경우 제올 100 CX II TEM(제올, 일본 소재)을 사용하여 TEM 영상을 획득하였다.
LPD NP의 생물분포 및 세포 분포: 대략 0.1%의 소수성 염료 DiI를 DOTAP 리포좀 중에 혼입시켜 DiI-표지된 LPD NP를 제형화하였다. DiI-표지된 LPD NP의 정맥내 주사 24시간 후에, 마우스를 안락사시키고, 주요 기관 및 종양을 수집하였다. 주요 기관에서 LPD NP의 분포를 IVIS(등록상표) 키네틱스 옵티컬 시스템(Kinetics Optical System)(퍼킨 엘머, 미국 캘리포니아주 소재)로 정량적으로 가시화하였다. 여기 파장을 520nm에서 설정한 반면, 방출 파장을 560nm에서 설정하였다. 간 및 종양을 저온유지장치(cryostat)(에이치/아이 해커 인스트루먼츠 앤드 인더스트리즈((H/I Hacker Instruments & Industries), 미국 사우쓰캐롤라이나주 윈스보로 소재)에 의해서 추가로 절편화하여 조직 내에서 LPD NP의 분포를 정량분석하였다. 종양에서 콤보 트랩 LPD NP 처리 전 또는 후에 NP의 축적 및 분포를 추가로 비교 및 정량분석하였다(n = 4).
트랩 단백질의 일시적이고, 국지적인 종양 세포내 분포: LPD NP 캡슐화된 pCXCL12 트랩 DNA, pPD-L1 트랩 DNA의 제형을 KPC98027 RFP/Luc 동종이식편을 보유하는 마우스에게 정맥내로 주사하였다(50㎍ 플라스미드/마우스)(매일 주사, 총 2회). pCXCL12 트랩 DNA 및 pPD-L1 트랩 DNA 둘 모두는 C-말단 단부에서 His-태그를 함유하는데, 이것은 트랩 단백질의 발현을 위한 추적인자로서 사용될 수 있다. 최종 주사 후 1일, 3일, 5일에, 마우스를 희생시키고, 주요 기관 및 종양을 수집하고, RIPA 완충제 중에서 균질화시켰다. 비신코닌산 단백질 검정 키트(BCA 단백질 검정 키트, 피어스, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 통해서 용해물 중의 총 단백질 농도 결정하였다. 상이한 시간 지점에서 기관 및 종양의 His-태그 단백질의 형질주입 및 발현 효율을 ELISA(셀 바이오랩스, 인크.(Cell biolabs, INC.), n = 4)를 사용하여 정량분석하였다. CXCL12 트랩 단백질을 또한 마우스에게 정맥내로 직접 주사하였고, 모니터링된 시간 지점에서 생물분포 및 축적 수준에서 플라스미드 대응체와 비교하였다. KPC98027 RFP/Luc 보유 마우스에게 또한 pGFP DNA를 캡슐화한 LPD NP를 1일 2회 용량 주사로 제공하였다. 최종 주사 3일 후, 종양 조직을 저온-절편화하고, 섬유모세포 마커 αSMA, 백혈구 마커 CD45 및 내피 마커 CD31의 염색으로 처리하였다. 종양 세포를 RFP로 사전-형질주입시켰다. 종양 조직 내에서의 상이한 세포 집단에서 GFP 단백질 발현을 니콘 광 현미경(니콘 코프.(Nikon Corp.), 일본 도쿄 소재)을 사용하여 관찰하였다. 각각의 세포 집단에서 GFP 양성 세포의 %를 염색의 각각의 유형으로부터의 5개의 대표적인 영상으로부터 이미지 제이를 사용하여 정량분석하였다. 계산의 예는 다음과 같다:
Figure pct00004
종양 성장 저해, 전이 억제 및 생존 분석:
KPC98027 RFP/Luc 동종이식편 보유 마우스를 상기에 언급된 바와 같이 설정하였다. 13일에 처리를 시작하였다. 이어서, 마우스를 다음과 같이 6개의 군(n=5 내지 7)으로 무작위화하였다: 미처리군(PBS), Ctrl LPD NP(pcDNA3.1 골격으로 캡슐화됨), CXCL12 트랩/Ctrl NP, PD-L1 트랩/Ctrl NP, 콤보 트랩 NP, 및 유리 콤보 트랩 단백질. 정맥내 주사를 플라스미드/마우스당 50㎍의 총 4회 용량을 위해서 격일로 수행하였다. IVIS(등록상표) 키네틱스 옵티컬 시스템(퍼킨 엘머, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 종양 성장을 5일마다 모니터링하였다. 종양 부피의 증가를 강도의 라디언스(radiance)로서 계산하고, 초기 종양 부피로 표준화하였다(Vt/V0). 장기간 생존을 또한 상이하게 처리된 KPC98027 RFP/Luc 동종이식편 보유 마우스에 대해서 모니터링하였다(각각의 처리군에서, n = 7). 마우스를 2개월에 걸쳐서 모니터링하였다. 카플란-마이어 곡선 및 중간 생존율을 정량분석하고, 이미지 제이를 사용하여 계산하였다. 전이의 연구의 경우, 종양 보유 마우스를 PBS(n = 5), CXCL12 트랩 NP(n = 4), PD-L1 트랩 NP(n = 4), 및 콤보 트랩(n = 5)으로 처리하였다. 접종 1개월 후, 마우스에게 10㎎/㎖ 루시페린을 주사하고, 희생시켰다. 이어서, 주요 기관 및 종양을 적출하고, 루시페린의 용액(5m/㎖) 중에 넣고, 생물발광에 대해서 영상화하였다. 이어서, 주요 기관을 고정시키고, H&E 염색으로 처리하여 각각의 기관에서 종양 전이의 병리학을 관찰하였다.
IFN-γ 생산에 대한 ELISpot 검정법: KPC98027 또는 KPC98027 RFP/Luc 동종이식편 보유 마우스에 대한 비장 세포의 재자극을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하면, 종양 접종 13일 후, 건강한 마우스, KPC98027 보유 마우스, 및 KPC98027 RFP/Luc 보유 마우스의 비장을 수거하고, 멸균 조건에서 단일 세포 현탁물 중에서 분리하였다. BD(상표명) ELISPOT 검정법 지시서에 따라서, 세포를 포획 항체 코팅된 96웰 플레이트에서 웰당 2x105으로 시딩하였다. 이어서, 단일 세포 현탁물을 불활성화된 KPC98027, KPC98027 RFP/Luc 세포 용해물 또는 건강한 마우스 비장 세포 용해물과 함께 37℃에서 40시간 동안 공동-배양하였다. 기한 시간에서, 세포를 수회 세척 단계에 의해서 제거하였다. 검출 항체 첨가 그 다음 효소 접합체 확대에 의해서 INF-γ의 생산을 측정하였다. 빨간 점 신호를 BD ELISpot 기질 세트로 현상시키고, 수동으로 계산하였다.
정량분석 실-시간 PCR(qPCR) 검정법: 총 RNA를 RNeasy 키트(퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 종양 조직으로부터 추출하였다. RT-PCR을 위한 펄스트-스트랜드 신쎄시스 시스템(First-Strand Synthesis System)(인비트로젠, 미국 뉴욕주, 그랜드 아일랜드 소재)을 사용하여 cDNA를 역전사시켰다. cDNA 100ng을 태크만 유니버설 프로브즈 슈퍼믹스 시스템(Taqman Universal Probes Supermix system)(바이오-라드(Bio-rad), 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)으로 증폭시켰다. RT-PCR 반응을 위한 모든 마우스-특이적 프라이머를 표 4에 열거한다(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재). GAPDH를 내생 대조군으로서 사용하였다. 7500 리얼-타임 PCR 시스템(7500 Real-Time PCR System)을 사용하여 반응을 수행하고, 7500 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
Figure pct00005
유세포 분석법 검정법: 종양-침입 면역 림프구를 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 간략하면, 조직을 수거하고, 37℃에서 40 내지 50분 동안 콜라게나제 A 및 DNAase로 소화시켰다. 적혈구 용해 후, 세포를 1㎖ PBS 중에 분산시켰다. 세포내 사이토카인 염색을 위해서, 조직으로부터의 세포를 제조사의 지시서에 따라서 침투 완충제(BD)로 관통시켰다. 상이한 면역 림프구(5Х106/㎖)를 이전 부분에 언급된 플루오레세인-접합된 항체로 염색하였다.
면역형광 염색: 탈파라핀화 단계, 항원 복원 및 투과 이후에, 조직 절편을 1% 우 혈청 알부민(BSA) 중에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 형광단(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)과 접합된 1차 항체를 4℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 핵을 DAPI 함유 봉입제(벡터 래보러토리스 인크, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)로 대비염색하였다. 모든 항체를 제조사의 매뉴얼에 따라서 희석시켰다. 형광 현미경(니콘, 일본 도쿄 소재)을 사용하여 영상을 찍었다. 3개의 무작위로 선택된 현미경 필드를 이미지 제이 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석하였다.
TUNEL 검정법: 제조사의 지시서에 따라서 데드앤드 플루오로메트릭 터널 시스템(DeadEnd Fluorometric TUNEL System)(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 TUNEL 검정법을 수행하였다. FITC(녹색)로 형광 염색된 세포 핵을 TUNEL-양성 핵이라 한정하였다. 슬라이드를 4,6-다이아미니디노-2-페닐-인돌 (DAPI) 벡타쉴드(Vectashield)(벡터 래보러토리스 인크, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)를 사용하여 커버-슬라이딩하였다. TUNEL-양성 핵을 형광 현미경(니콘, 일본 도쿄 소재)을 사용하여 모니터링하였다. 3개의 무작위로 선택된 현미경 필드를 이미지 제이 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석하였다.
H&E 모폴로지 평가 및 혈액 화학 분석: 종양 저해 연구의 최종 처리 4일 후, 상이하게 처리된 마우스를 모두 독성 검정법에 적용하였다. 전혈 및 혈청 둘 모두를 수집하였다. 전혈 세포 성분을 계수하고, 비교하였다. 혈청에서 크레아티닌, 혈액 요소 질소(BUN), 혈청 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 신장 및 간 기능의 지시인자로서 검정하였다. 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 비롯한 기관을 수집하고, UNC 조직학 설비에 의한 H&E 염색을 위해서 고정시켜 기관-특이적 독성을 평가하였다.
통계 분석: 2개의 군을 비교하거나 또는 2개의 군보다 더 큰 군을 비교하는 경우 각각 2-테일드 스투던트 t-시험 또는 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하였다. 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. P-값이 0.05 미만이면 차이가 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
pDNA LPD 투여 후 종양 미세환경 내에서의 pDNA(트랩 또는 GFP)의 일시적이고 국지적인 분포 및 발현
LPD는 우선적으로 플라스미드 DNA, siRNA, mRNA를 비롯한 거대 분자를 항암 치료요법을 위해서 종양으로 전달한다. LPD를 제조하기 위해서, 플라스미드 DNA(pDNA)를 양이온성 프로타민과 축합시켜 약간 양이온성인 복합체 코어를 형성하였다. 코어를 미리 제형화된 양이온성 리포좀(DOTAP, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG)으로 추가로 코팅하였다. TEM 영상은 LPD의 크기(약 70nm)를 확인해 주며, 이의 구체 형상 및 균질한 분포를 나타낸다(도 14a). DiI-표지된 LPD의 생물분포를 평가하기 위해서 생체내 추적인자로서 대략 0.1%의 DiI를 LPD의 지질막에 혼입하였다.
췌장의 테일에 1차 KPC98027 세포를 정위 주사함으로써 섬유조직형성(desmoplastic) KPC 췌장 종양 모델을 생성하였다. DiI-표지된 LPD NP를 마우스에게 정맥내 주사하였다. 주사 24시간 후, 주요 기관에서의 NP 축적을 분석하였다. 유사한 크기의 다른 NP와 일관되게, 간은 LPD NP를 포획한 주요 기관이었다(도 14b). 간에 더하여, 종양이 또 다른 주요 NP 축적 부위이다(도 14b). 조직 저온절편화 데이터는, 간 세포의 40%를 초과하는 모든 간 조직에 걸쳐서 DiI-표지된 NP의 산란된 분포가 표지되었음을 시사한다(도 14c). 이에 반해서, 종양 세포의 단지 25% 미만이 DiI NP를 포획하였고, 높은 사이질액압(interstitial fluidic pressure: IFP) 및 두꺼운 세포외 매트릭스로 인해서 췌장 종양 미세환경 내에서의 종양 내의 NP의 분포는 불균질 및 불균일하였다. 간 및 종양에서 GFP 단백질의 분포를 LPD 전달된 플라스미드(pGFP)의 형질주입 효율의 표시로서 추가로 비교하였다. 간에서 NP의 더 높은 축적에도 불구하고, GFP의 발현은 종양과 비교할 때 매우 낮다(도 14c). 이는, 혈관에 근접하게 국지화된, 쿠퍼 세포가 LPD NP를 비특이적으로 식균작용하였기 때문일 수 있다. 쿠퍼 세포에서 플라스미드의 형질주입 효율은 비교적 낮다. 따라서, 본 발명자들의 결과는, 플라스미드를 캡슐화한 LPD가 KPC 췌장암 내에서 국지적으로 전달 및 발현될 수 있다는 것을 입증한다.
면역형광 염색을 수행하여 벌크 종양 덩어리 내에서 다양한 세포 집단에서 LPD 축적을 결정하였다(도 14d). RFP의 안정한 이식유전자 발현 및 마우스 αSMA, CD45 및 CD31에 대한 형광단-접합된 항체는 각각 종양 세포, 섬유모세포, 백혈구 및 내피 집단을 한정하였다. 결과는, 종양 세포가 NP를 포획하는 주요 세포 집단 중 하나이며, 종양 세포의 30% 초과가 GFP를 발현하였음을 보여준다. 또한, 섬유모세포의 약 60% 초과가 LPD pGFP의 정맥내 주사(2회 용량, 매일) 4일 후에 LPD를 포획하는데, 이는 총 GFP-양성 세포의 약 30%를 차지한다. 이에 반해서, 백혈구 및 내피에서의 GFP의 발현은 무시해도 될 정도이며, 이는 섬유모세포가 NP 분포 및 플라스미드 발현에 대한 주요 스트로마 오프-타깃 부위임을 확인해 준다. 종양 세포에 대한 섬유모세포의 인접한 분포로 인해서, 분비된 트랩의 섬유모세포의 발현은 종양 세포에 접근하는 약물의 치료 농도를 감소시키는 오프-타깃 부위가 아닌 종양 세포에 대한 이의 이웃 효과에 이익을 줄 것이다.
그 다음, 트랩 단백질(PDL1 또는 CXCL12)의 분포 및 발현을 트랩의 C-말단에 혼입된 표적화 가능한 His-태그를 통해서 ELISA를 통해서 평가하였다(도 14e). 순수한 트랩 단백질(CXCL12 트랩)을 또한 주사하고, 비교하였다. 트랩 플라스미드 NP 및 트랩 단백질의 1일 2회 용량 후, 마우스를 2, 4, 6일에 희생시키고, 다른 기관보다는 종양(도 14e)에서 일시적인 플라스미드 형질주입 및 발현을 입증하였다. 이에 반해서, 단백질 트랩은 모니터링된 시간에서 기관 모두에서 상당히 더 낮은 농도로, 신속하게 제거되었다.
이러한 결과는, LPD 벡터가 임의의 다른 기관에서 최소한으로 발현되면서, 종양, 특히 섬유모세포 및 종양 세포 내에서 트랩 플라스미드의 우선적인 일시적인 발현을 허용한다는 것을 입증한다. 본 발명자들은 종양 발현이 일시적인 특성을 유지한다는 것을 보고하며, 여기서 발현은 트랩 플라스미드 주사 4일 후까지 지속되는 것을 발견하였다(도 14e).
pCXCL12 트랩 DNA를 캡슐화한 LPD NP 및 pPD-L1 트랩 DNA를 캡슐화한 LPD NP로의 병용 치료요법은 PC 동종이식편에 대한 항종양 반응을 개선시키고, 전이를 억제하였다.
페이그 등의 이전 연구는, CXCL12와 CXCR4의 상호작용을 저해하는 것이 항 PD-L1의 항종양 활성을 밝히는 것이라는 것을 시사하였다(Feig et al., Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer, PNAS, 2013 Dec 10;110(50):20212-7). LPD 벡터에 의해서 전달되는 플라스미드의 국지적이고, 일시적인 발현 특징으로 인해서, PD-L1 트랩 및 CXCL12 트랩을 암호화하는 플라스미드를 별개로 LPD 벡터 내에 캡슐화하고, KPC 췌장암 치료를 위한 병용 요법으로서 투여하였다. KPC98027 RFP/Luc를 췌장의 테일에 정위로 접종하였다. LPD NP의 투여 스케줄은 도 15a에 제시한다. PBS, pcDNA3.1 골결을 캡슐화한 LPD NP(Ctrl NP), 유리 콤보 트랩 단백질을 대조군으로서 설정하였다. 종양으로부터 방출된 광자의 수로부터 상관된 종양 부피를 평가(a) 및 정량분석(b)하였다. 결과는, CXCL12 트랩 NP 및 PDL1 트랩 NP 단일치료요법 둘 모두가 저용량에서 최소한의 항종양 효능을 나타내었음을 입증하였다(도 15d). 용량을 증가시키면, 단일치료요법에 대한 항종양 효능은 약간 증가하였지만, 단지 부분적으로 효과적이었다(도 15e). 이에 반해서, 콤보 트랩 NP 군은 PBS 군과 비교할 때 종양 성장을 유의하게 저해하였다(P < 0.01). 콤보 군의 종양 중량은 저용량 및 고용량 둘 모두에서 극적으로 감소하였다(도 15e). 한편, 유리 콤보 트랩 단백질은 단지 약하지만, 유의하지 않은 항-암 효과를 나타내었는데, 이는 단백질보다 플라스미드를 사용하는 것의 이점을 시사한다(도 15a 및 15b). 추가로, 최종 치료일 후 전체 생존 분석에서, 중간 생존율은 다른 처리군(PBS, Ctrl NP, CXCL12 트랩 NP 및 PDL1 트랩 NP 군의 경우 각각 40.5, 49, 47, 50일; 도 15c)과 비교할 때 콤보 트랩 NP 치료요법(63.5일)에서 향상되었고, 강력한 치료 효과뿐만 아니라 오래 지속되는 전체 반응을 전달한다. 이는 KPC 종양 성장을 저해하는 CXCR4 길항제 및 항-PD-L1 항체의 조합물을 사용한, 페이그 등에 의해서 관찰된 것과 일치한다(Feig et al., Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer, PNAS, 2013 Dec 10;110(50):20212-7). 도 15에서의 데이터는, 조합된 CXCL12 트랩 NP와 PD-L1 트랩 NP은 실제로 섬유조직형성 KPC 종양-보유 마우스 모델에서 우수한 항종양 효능을 나타내었음을 시사하였다.
추가로, KPC 동종이식편의 접종 1개월 후에 주요 기관에서 종양의 전이를 모니터링하였다. 췌장관 선암(PDAC) 보유 환자와 일관되게, 간 및 폐는 정위 KPC 모델에 대한 주요 전이 부위이다(도 16a). 복막강 내에서의 침윤으로 인해서 비장 및 신장에서 종양이 또한 관찰되었다. 조직학은 대조군 군의 폐, 비장 및 간에서의 전이의 큰 결절을 나타내었다(도 16b). 단일치료요법은 종양 전이를 약간 억제할 수 있고, 콤보 치료요법 만이 전이를 상당히 저해하거나 또는 심지어는 전이를 중단시킬 수 있었다(도 16a 및 16b). 따라서, 콤보 트랩 NP 전략은 종양 전이를 감소시킬 수 있음이 명백하다.
종양 미세환경으로의 향상된 T 세포 침입은 콤보 트랩 NP의 우수한 항-종양 효과를 설명한다.
암 세포 특이적 T 세포 반응은 이미 KPC 모델에서 보고되어 있고, 본 명세서에서 ELISpot 검정법에 의해서 추가로 확인하였다(도 17a). 도 17a는 종양 보유 동물로부터의 비장세포를 사용한 INF-γ ELISpot 검정법 데이터를 나타낸다. 형질주입된 RFP/Luc 마커의 존재 또는 부재 하에서, KPC 세포의 추출은 비장세포를 자극하여 IFN-γ를 분비할 수 있지만, 정상 비장세포로부터의 추출물은 그렇지 않다. 데이터는, KPC 종양이 종양 특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 종양 보유 마우스에서 인지된 면역 반응은 루시페라제 또는 적색 형광 마커에 대한 것이 아니라 아직 식별되지 않은 종양 연관된 항원에 대한 것이었다. 그러나, PD-L1 트랩 NP 및 CXCL12 트랩 NP(단일- 또는 콤보-치료요법 중 하나) 처리된 마우스의 비장으로부터의 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포의 임의의 유의한 증가 부재는 암-특이적 CD8+ T 세포의 향상된 전신 프라이밍에 의해서 성취되지 않았다(도 17b). ELISpot 활성이 비교적 약하였기 때문에(도 17a 및 17b), 암-특이적 세포독성 T-림프구 활성을 증강시킬 수 있는 백신이 트랩의 치료 활성을 추가로 향상시킬 것이다.
면역치료 효과가 암 세포 중에서의 향상된 T-세포 축적에 의해서 유발되었는지를 결정하기 위해서, 췌장에서 T-세포(CD3+)의 분포를 면역형광형광에 의해서 나타내었다(도 18a). T-세포는 PBS 대조군에서 종양과 정상 췌장 조직 사이의 경계에 대부분 위치된 것으로 나타났다. 소량의 T-세포가 종양 영역에서 발견되었지만, 그것은 스트로마 면적에 위치되었다. PD-L1 트랩으로 처리된 동물로부터의 췌장은 T-세포가 종양 영역으로 약간 침투한 것을 나타내었지만, CXCL12 트랩 NP(PD-L1 트랩 NP의 존재 또는 부재하에서)으로 처리된 것은 종양 영역으로의 상당한 T-세포 침입을 나타내었다. 종양 영역에서 T-세포의 국지화를 도 18b에서 정량분석하였다. 종양을 추가로 수집하고, 단일 세포로 분산시켰다. CD3+CD8+ 세포를 유세포 분석법으로 분석하였다(도 18c). 다시, 결과는, CD8+ T-세포가 콤보 트랩 NP 처리된 마우스의 종양에서 상당히 증가된 것을 확인해 준다. 따라서, 본 발명자들은 PD-L1보다는, CXCL12 트랩이 T-세포 침입을 향상시킨 주요 인자였다고 결론내었다. 추가로, CD8에 대한 단클론성 항체를 사용하여 CD8+ T-세포를 고갈시킴으로써 콤보 트랩 NP 치료요법에서 CD8+ T-세포의 역할을 평가하였다(도 18d 및 18e). 콤보 트랩 NP는 종양 성장을 상당히 둔화시켰지만, CD8 T 세포가 제거된 경우에는 그렇지 않음을 나타내었다. 종합하면, 종양 미세환경 내로의 향상된 T-세포 침입이 콤보 트랩 NP의 우수한 항-종양 효과를 유발하는 한가지 주요 원인이다.
종양 미세환경에서 종양-침입 면역 세포 및 사이토카인 수준의 변화
콤보 트랩 NP 전략이 T 세포 침입 및 종양 세포 주변에서의 축적을 효율적으로 개선시킬 수 있는지의 이유를 추가로 설명하기 위해서, 이어서 본 발명자들은 상이한 트랩 NP 치료 이후에 종양 미세환경에서 관련된 구별되는 골수 하위세트 및 사이토카인의 변화를 평가하였는데, 이것은 CD8+ T-세포 항-종양 활성을 마스킹하기 위해서 복잡한 상호작용 네트워크에 참여한다.
면역억제 하위세트, 예컨대 조절 T 세포(Treg), 골수-유래된 억제인자 세포 (MDSC), 및 종양 연관된 대식세포(TAM)는 섬유조직형성 PDAC 모델 내에서 우세한 골수 침윤물이다. 본 발명자들은 종양 절편의 유세포 분석법 및 면역염색 둘 모두에 의해서 종양 미세환경 내에서 이러한 면역 억제 세포의 축적을 관찰한다. MDSC를 제1 조절 하위세트로서 체크하였다. 도 19a 및 19b에 도시된 바와 같이, 트랩 단독 군(CXCL12 트랩 및 PDL1 트랩 중 하나) 및 조합물 군에서 MDSC의 백분율은 대조군 군보다 훨씬 더 낮았다. MDSC는 Treg 발생의 유도에 의해서 면역 관용을 설정할 수 있기 때문에, MDSC의 차단이 Treg의 저해로 이어질 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 도 19a 및 19b에 도시된 바와 같이, 종양 조직에서 Treg의 백분율을 검출하였다. MDSC의 경향성과 일관되게, CXCL12 트랩 NP 처리군 및 조합물 군은 대조군 군보다 더 적은 Treg 세포를 나타내었다. 그러나, PD-L1 트랩 NP는 T 세포 침입을 약간 증가시켰고, 이는 또는 PD-L1 관문 저해제를 사용하여 페이그 등에 의해서 관찰되었다(Feig et al., Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer, PNAS, 2013 Dec 10;110(50):20212-7). 이는 아마도 PD-L1/PD1 상호작용이 STAT-5 포스포릴화를 제어함으로써 Treg 증식 및 활성화를 음으로 조절한다는 사실로 인한 것일 것이다. 대식세포가 억제성 종양 면역 미세환경의 또 다른 중요 성분이다. 도 19a에 도시된 바와 같이, 단일치료요법 및 콤보 치료요법 둘 모두는 축적된 대식세포를 상당히 감소시킬 수 있고, 대식세포를 M1 상태에 선호되게 효율적으로 변화시킬 수 있다(도 19b). 따라서, 치료요법에서 유리하게 트랩에 의해서 억제성 TME의 상당한 리모델링이 존재하였다.
면역 억제성 하위세트와 CXCL12 및 PD-L1의 수준의 상관관계를 위해서, 본 발명자들은 다음으로 정맥내로 전달되는 트랩 NP의 중화 효율을 시험하였다(도 20a 및 20b). PD-L1 트랩 NP가 아닌, CXCL12 트랩 NP가 종양내 분비된 CXCL12를 효율적으로 중화시킬 수 있고, 이는 항-CXCL12 1차 항체에 의해서 검출되는 단백질을 실질적으로 감소시키고, 그 다음 CXCL12/CXCR4 매개된 상호작용을 통해서 MDSC 및Treg 침입을 억제하는 것을 보여주었다. 반면에, 전체 PD-L1 수준은 PD-L1 트랩 NP을 적용함으로써 감소되었고, 또한 CXCL12 트랩 처리에 의해서도 부분적으로 영향을 받았다. 이는 골수 세포가 표피 성장 인자 수용체(EGFR)/미토겐-활성화 단백질 카이나제(MAPK)-의존적 방식으로 종양 세포에서 PD-L1의 발현을 유도할 수 있다는 사실로 인한 것일 것이다. 따라서, CXCL12에 의한 골수 세포의 감소된 모집은 PD-L1의 수준을 감소시켰다. 그 다음, MDSC 및 Treg 세포의 효율적인 고갈은 종양 미세환경 내에서 효과기 T 세포의 침입을 용이하게 하고, 이것이 우수한 항종양 효능을 설명한다.
이어서, 본 발명자들은 사이토카인 수준에 의해서 나타난 바와 같이 콤보 군이 억제성 미세환경을 반전시킬 수 있는지의 여부를 관찰하기 위해서 국지 종양 조직에서 사이토카인 수준을 모니터링하였다(도 21). IL-4 및 IL-10은 암 전이를 촉진시키는 면역억제에 중요한 Th-2 사이토카인이라 공지되어 있다. 한편, IFN-γ, IL-12α 및 TNF-α(Th-1 사이토카인이라 간주됨)는 T 세포 사멸을 용이하게 하고, 종양 진행과 싸우는 세포독성 T 세포에 의해서 분비되는 사이토카인이다. CXCL12 트랩 NP 단일치료요법 군에서, IL-12α 및 IFN-γ는 증가하였고, IL-4는 실질적으로 감소하였지만, IL-10은 여전히 증가하였는데, 이는 약간 억제성 미세환경을 시사한다. 유사하게, PD-L1 트랩 NP 군에서, 전체 Th1 사이토카인의 증가된 수준에도 불구하고, 억제성 사이토카인이 일관되게 높게 유지된다. 그러나, 조합물 군에서, IL-4 및 IL-10 둘 모두는 상당히 감소되었다. 한편, IL-12α, TNF-α 및 IFN-γ는 극적으로 증가하여, M2 대 M1 표현형이 면역-자극 미세환경으로 전환함을 나타낸다. 이것은 결국 림프구의 모집을 활성화시켜서 스캐빈저로서 작용하고, 종양 항원 제시를 용이하게 하고, 강화된 세포독성 T 세포 매개된, 종양-특이적 사멸을 유발할 것이다.
종양 혈관(tumor vessel) 및 종양 연관된 섬유모세포의 변화
종양 연관된 섬유모세포(TAF) 및 혈관생성은 세포독성 T 림프구의 종양 조직으로의 침입을 지연시킨다. α-평활근 액틴(αSMA), TAF 및 CD31의 마커, 및 맥관구조에 대한 마커에 대한 염색에 의해서 TAF에 대한 트랩 NP의 효과를 관찰하였다. 밀도 및 평균 형광(florescence)을 형광 현미경에 의해서 검출하였다. 5개의 현미경 필드를 분석을 위해서 무작위로 선택하였다. 도 22a에 도시된 바와 같이, 단일-군 및 콤보-군 둘 모두에서 CD31의 밀도는 대조군 군의 것보다 더 낮았다. 특히, 콤보 군은 실질적인 혈관 정상화를 나타낸다(도 22b). 혈관은 상당히 압착되었으며, 그 다음 다중 콤보 트랩 처리 후에 NP 관류를 증가시켰고, 분포를 확장시켰다(도 23). 정상화된 혈관은 방출된 IFP의 결과인데, 이것은 대부분 감소된 스트로마 및 세포 밀도로 인한 것이다.
따라서, 본 발명자들은 다음으로 섬유모세포의 밀도를 평가하였다. 콤보 트랩 NP 군은 αSMA의 최저 밀도를 나타내었음을 보여주었다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 PD-L1 트랩이 아닌, CXCL12 트랩 만이 단일치료요법 및 콤보 치료요법 둘 모두에서 αSMA의 감소를 유발하는 것을 발견하였다(도 22a 및 22b). 일관되게, 본 발명자들은, 섬유모세포에 의해서 분비되는 주요 세포외 매트릭스 중 하나인 콜라겐이 CXCL12 트랩 NP 처리군 및 콤보 트랩 NP 둘 모두에서 극적으로 감소되었음을 주목하였다(도 24). 따라서, 본 발명자들은 CXCL12 트랩 NP가 T-세포 침입을 증가시켰고, 억제성 면역 미세환경을 조정함으로써 그리고 섬유모세포 및 콜라겐 함량을 고갈시킴으로써 PD-L1 트랩의 항종양 효능을 밝혀냈다고 결론내었다. 섬유모세포는 KPC 종양 미세환경에서 CXCL12의 주요 공급원으로서 간주되기 때문에, CXCR4-매개된 자가분비 루프는 섬유모세포의 감소 및 스트로마의 리모델링을 설명할 수 있다.
상이한 처리에 대한 독성 평가 및 혈액 화학 분석
독성학 병리학 평가의 결과는, 단일치료요법 및 콤보 트랩 NP의 경우 심장, 간, 비장, 폐 및 신장에서 어떤 현저한 모폴로지 변화도 존재하지 않음을 입증하였다(도 25). 그러나, PBS 군 및 Ctrl NP 군에서는 세포 액포화, 벗겨진-퇴행성 세포 및 소상 괴사가 마우스의 간 및 신장 조직에서 검출되었는데, 이는 대부분 종양의 존재량으로 인한 것인 심각한 간 및 신장 손상을 시사한다. 일관되게, 혈청 생화학 값 분석은 이러한 2개의 군에서 종양 진행에 의해서 간(AST 및 ALT) 또는 신장(크레아티닌 및 BUN) 독성이 유발되었지만, 콤보 트랩 NP 처리된 마우스에서는 그렇지 않음을 입증하였다(표 6). 또한, 전체 혈구 계수치(whole blood cell count)(표 5)는 모든 군에 대해서 정상 범위 내에서 일정하게 유지되며, 이는 전신 빈혈 또는 염증이 처리 후에 발생하지 않음을 제안한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참고로 혼입된 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 제시된 바와 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
상기 발명은 이해의 명확성의 목적을 위해서 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 범주 내에서 특정 변화 및 변경이 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING METASTASES <130> WO 2017/053170 <140> PCT/US2016/051966 <141> 2016-09-15 <150> US 62/232,169 <151> 2015-09-24 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CXCL12-Trap-hSDA-1 <400> 1 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Gly Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Lys 35 40 45 Val Ser Ala Lys Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Arg Arg Arg Arg Thr Ala Asn Phe Arg Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 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Glu Ala Val Ser 180 185 190 Gly Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Ile Ile Ala Ala Ala Gly Ala 195 200 205 Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Gly Gly Ser His His 210 215 220 His His His His 225 <210> 27 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn 1 5 10 15 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala 35 40 45 Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val 50 55 60 Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala 65 70 75 80 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala 85 90 95 Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr 100 105 110 Glu Arg Arg Ala Glu 115 <210> 28 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu 130 <210> 29 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn 1 5 10 15 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu 20 25 30 Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala 35 40 45 Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile 50 55 60 Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr 65 70 75 80 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His 85 90 95 Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr 100 105 110 Glu Arg Ile Leu Glu 115 <210> 31 <211> 147 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn 35 40 45 Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn 50 55 60 Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala 100 105 110 Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile 115 120 125 Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly 130 135 140 Arg Phe Gln 145 <210> 32 <211> 143 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala 1 5 10 15 Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu 20 25 30 Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln 50 55 60 Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His 65 70 75 80 Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu 100 105 110 Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser 115 120 125 Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln 130 135 140 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 33 Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn 1 5 10 15 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Lys Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala 35 40 45 Phe Cys Asn Gly Tyr Ser Gln Pro Val Arg Asp Ala Arg Phe Gln Ile 50 55 60 Val Gln Leu Pro Asn Gly His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Ala 65 70 75 80 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Pro 85 90 95 Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr 100 105 110 Glu Arg Ile Leu Glu 115 <210> 34 <211> 143 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34 Leu Glu Val Leu Asn Lys Pro Trp Arg Pro Leu Thr Phe Ser Pro Thr 1 5 10 15 Trp Leu Thr 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Leu Pro Leu Gly 50 55 60 Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln 65 70 75 80 Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu 85 90 95 Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu 100 105 110 Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn 130 135 140 Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val 145 150 155 160 Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp 165 170 175 Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser 180 185 190 Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro 195 200 <210> 37 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln 35 40 45 Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn Phe Arg 50 55 60 Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Cys Cys 85 90 95 Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp Pro Ala 115 120 125 Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Ala 130 135 140 Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly Lys Arg 145 150 155 160 Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser 165 170 175 Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe 180 185 190 Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro 195 200 205 Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg 210 215 <210> 38 <211> 200 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val Asp Val Gly 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp Phe Asp Arg Arg Glu Cys Thr Glu 20 25 30 Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser 35 40 45 Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly 50 55 60 Lys Ala Leu Phe His Ile Pro Ser Val Gln Val Arg Asp Ser Gly Gln 65 70 75 80 Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu 85 90 95 Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Met Arg Ile Asp Thr Arg Ile Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Thr Cys Gln Ala Arg Gly 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val Pro Ala Asn 130 135 140 Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val 145 150 155 160 Leu Arg Leu Lys Pro Gln Pro Ser Arg Asn Phe Ser Cys Met Phe Trp 165 170 175 Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp Pro Leu Ser 180 185 190 Arg Met Glu Pro Lys Val Pro Arg 195 200 <210> 39 <211> 219 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 39 Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Gln Lys Leu Asp Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Lys Glu Val Ile Gln 35 40 45 Phe Val Glu Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Ser Phe Arg 50 55 60 Gly Arg Ala Phe Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Val 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Cys Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Met Asp Pro Ala 115 120 125 Thr Ser Glu His Glu Leu Met Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Glu Ala 130 135 140 Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Ser Leu Ser Gly Glu Thr 145 150 155 160 Thr Val Thr Thr Ser Gln Thr Glu Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr Ser 165 170 175 Val Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe His Cys Thr Phe 180 185 190 Trp Arg Val His Ser Gly Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro 195 200 205 Glu Leu Pro Val Pro Arg Leu Pro His Asn Arg 210 215 <210> 40 <211> 200 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 40 Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val Asp Phe Gly 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp Phe Asp Arg Arg Glu Cys Thr Glu 20 25 30 Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser 35 40 45 Ser Gln Ser Gln Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Leu Leu Pro Leu Gly 50 55 60 Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Ser Val Gln Val Arg Asp Ser Gly Gln 65 70 75 80 Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu 85 90 95 Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Val Arg Ile Asp Thr Gly Ile Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Ile Cys Gln Ala Arg Gly 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val Pro Ala Asn 130 135 140 Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val 145 150 155 160 Leu Arg Leu Lys Pro Gln Pro Asn Arg Asn Phe Ser Cys Met Phe Trp 165 170 175 Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp Pro Leu Ser 180 185 190 Trp Met Glu Pro Lys Val Pro Arg 195 200 <210> 41 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val 35 40 <210> 42 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Gln Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val 35 40 <210> 43 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Ser Pro Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val 35 40 <210> 44 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Leu Arg Ser Pro Cys Glu Cys Glu Ser Leu Val Glu Phe Gln Gly Arg 1 5 10 15 Thr Leu Gly Ala Leu Glu Ser Leu Thr Leu Asn Leu Ala Gln Leu Thr 20 25 30 Ala Arg Leu Glu Asp Leu Glu Asn Gln Leu Ala Asn Gln Lys 35 40 45 <210> 45 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 His Asp Gln Cys Lys Cys Glu Asn Leu Ile Met Phe Gln Asn Leu Ala 1 5 10 15 Asn Glu Glu Val Arg Lys Leu Thr Gln Arg Leu Glu Glu Met Thr Gln 20 25 30 Arg Met Glu Ala Leu Glu Asn Arg Leu Arg Tyr Arg 35 40 <210> 46 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Thr Glu Asp Ala Cys Gly Cys Glu Ala Thr Leu Ala Phe Gln Asp Lys 1 5 10 15 Val Ser Ser Tyr Leu Gln Arg Leu Asn Thr Lys Leu Asp Asp Ile Leu 20 25 30 Glu Lys Leu Lys Ile Asn Glu Tyr Gly Gln Ile His Arg 35 40 45 <210> 47 <211> 43 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Ile Leu Lys Phe Glu Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Gly Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Ile Ile 35 40 <210> 48 <211> 46 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Leu Arg Ser Pro Cys Glu Cys Glu Ser Leu Val Glu Phe Gln Gly Arg 1 5 10 15 Thr Leu Gly Ala Leu Glu Ser Leu Thr Gln Asn Leu Ala Arg Leu Thr 20 25 30 Glu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Asn Gln Leu Ala Ser Arg Lys 35 40 45 <210> 49 <211> 45 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Thr Gln Asp Gln Cys Lys Cys Glu Asn Leu Ile Gln Phe Gln Asn Leu 1 5 10 15 Ala Asn Glu Glu Val Arg Lys Leu Thr Gln Arg Leu Glu Glu Met Thr 20 25 30 Gln Arg Met Glu Ala Leu Glu Asn Arg Leu Arg Tyr Arg 35 40 45 <210> 50 <211> 43 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Asp Gln Cys Lys Cys Glu Asn Leu Ile Leu Phe Gln Asn Val Ala Asn 1 5 10 15 Glu Glu Val Arg Lys Leu Thr Gln Arg Leu Glu Glu Met Thr Gln Arg 20 25 30 Met Glu Ala Leu Glu Asn Arg Leu Lys Tyr Arg 35 40 <210> 51 <211> 44 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Glu Asp Ala Cys Gly Cys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Gln Glu Lys Val 1 5 10 15 Ser Ser His Leu Gln Lys Leu Asn Thr Lys Leu Asp Asn Ile Leu Lys 20 25 30 Lys Leu Lys Val Thr Glu Tyr Gly Gln Val His Arg 35 40 <210> 52 <211> 43 <212> PRT <213> Ceratotherium simum <400> 52 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Ile Val Lys Phe Gln Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Ile Val 35 40 <210> 53 <211> 43 <212> PRT <213> Nannospalax galili <400> 53 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Ile Val Arg Phe Glu Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Ile Val 35 40 <210> 54 <211> 43 <212> PRT <213> Bison bison <400> 54 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Ile Val Lys Phe Gln Thr Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Ile Val 35 40 <210> 55 <211> 43 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 55 Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Ile Val Arg Phe Glu Ala Lys 1 5 10 15 Val Glu Gly Leu Leu Gln Asp Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 20 25 30 Lys Arg Leu Ala Val Leu Glu Asn Arg Val Ile 35 40 <210> 56 <211> 46 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 56 Glu Thr Gln Asp Gln Cys Lys Cys Glu Asn Leu Ile Gln Phe Gln Asn 1 5 10 15 Leu Ala Asn Glu Glu Val Arg Lys Leu Thr Gln Arg Leu Glu Glu Met 20 25 30 Thr Gln Arg Met Glu Ala Leu Glu Asn Arg Leu Arg Tyr Arg 35 40 45 <210> 57 <211> 26 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 57 Glu Asp Ala Cys Ser Cys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Gln Glu Lys Val 1 5 10 15 Ser Ser His Leu Gln Lys Leu Asn Thr Thr 20 25 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(11) <223> linker sequence can be repeated n times, wherein n=1-20 <400> 58 Gly Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Lys 1 5 10 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> linker sequence can be repeated n times, wherein n=1-20 <400> 59 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <400> 62 Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Lys Pro Glu Pro Glu 1 5 10 15 <210> 63 <211> 1543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12 trap <400> 63 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600 gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660 ctggctagcc accatgaaat gggtcacctt tatcagcctg ctgttcctgt tcagcagcgc 720 ctacagcgga tccgaggtgc agctggtgga atctggcgga ggactggtgc agcctggcgg 780 ctctctgaga ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcagcctg accgtgtact ctgtgcactg 840 ggtgcgccag gccccaggca aaggactgga atgggtggga gccctgtggg gctctggcgg 900 aaccgagtac aacagcaacc tgaagtcccg gttcaccatc agccgggaca ccagcaagaa 960 caccgtgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc 1020 cagagatcag ggcctgaact acggcagcct gttcgactat tggggccagg gcacactcgt 1080 gaccgtgtct agcggaggcg gaggaagtgg cggaggggga tctggcggcg gaggcagcga 1140 tattcagatg acccagtccc ccagcagcct gagcgcctct gtgggcgaca gagtgaccat 1200 cacctgtcgg gccagcgaga gcatcagcta cagcctgtcc tggtatcagc agaagcccgg 1260 caaggccccc aagctgctga tctacaacgc cgtgaagctg gaaagcggcg tgcccagcag 1320 attttccggc agcggctctg gcaccgactt caccctgacc atcagctccc tgcagcccga 1380 ggacttcgcc acctactact gcaagcagta ctggaacacc cccttcacct tcggacaggg 1440 caccaaggtg gaaatcaaga gagcggccgc tggcgcccct gtgccttatc ctgatcccct 1500 ggaacctaga ggcggcagcc accaccacca tcaccactga tga 1543 <210> 64 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys 85 <210> 65 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 85 90 <210> 66 <211> 18818 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 ctttcaggct tctgggacag atcctaggtc cagctgccca cctgattttg tggcaaagaa 60 aaaaagaaga agaagaagcg agaggcgatg gcgtttgctt tggccagatt taagggcaag 120 cgaggctgcg cgcggctccc gcagggtcgg atctccgagc tccagggcgc ccctccaccc 180 gggtgtagat ttcccgcgga ccccttcgcc ctcccgggtt tcatcagctg cgcaggaatg 240 gagctggcca gagctctggg agcggggagg gaggcgccgc caccagaggg cgccggagcc 300 ccagcgctgc ggccggtgag cggccaggct ccccggccca gcccagcaaa ggcctgggga 360 cgcccgacgg ctgccttctt cactggacct cactgccttc agttctttaa gagcagggcc 420 aagtcagtgg ggttcccggc tccaagccca gtgcccaggg tgggtgggtg ggtgggtggg 480 tgggtggatg gatggatgga tggatggatg gagtgccggc ccacagccat ctaacggcca 540 aagtggtttt ggaaaaaaaa tgcacagaag acacctactc ccaccagcgg agttccggag 600 ccctcgcagc ctcctgttga ccgctcccgc ctaatgcagc cgctgaccgc ccactccccg 660 acggccagga ctccccaggg acagggacgt gtccccaggg caggcccctg gatggacgcg 720 gcgactgacc ccacttcgct ggacgctgtg ctgggaagga cacagagagg tggctggggc 780 agcctgcggt cacaaagcga ggcccaaagg ggcgctctcc tcacccccac gcctcctggg 840 tgccgacctg caccctccct tcgccaccgg actggggcca tctgggatgt ctcgggggta 900 tccggagggc taagcaccgc cgagggacgg ctccgtggga agagttttct ggacccagaa 960 ggcagacgcc agtagtactg tcctaggagt cggaggtcgg ggtgggggag ttctcagctc 1020 tttgggtcgc acggagcttt tcttgggtaa ggcagtaagt acttaggttt aaaggactta 1080 cttacagcta ccatttattg agtactgtct gcttgtcaga cacgatgcag agaatttcgc 1140 ggcgtggggc gggtctcatt gaatctcccg tcccactccg cggggtgggc ctgtgattag 1200 ctcatttcac cattgagagg tcggaagtac aaaggctaca ttcgctttta ctgagagccg 1260 ccggcgcctt ctgctttgtt tgtacaggcg aggaaactga ggctcggctg gtggcgccgt 1320 gggcttggag tccgagccac gctgactgca aagacgggtc tcattcccgc agatcgagct 1380 ctgccggcgg ctgcgccgca agccgggcag gtggcgagct tgagccccca cgcacagaaa 1440 gcaggacccc ctcggctgcc ttgggccgcc accgccagca ggccctccgc ccgggactaa 1500 cttgtttgct tttcattggt tctcattcag ttcccgccat cgaaaggccc cgtcccgcag 1560 ctttccacgc gcgccccact ttacgcctaa ggtcctcagt ctctccagtg gggccctgtc 1620 acagggacaa taagcggccc tccagccggc gtcgctcagg ctgcggacct cactgcagac 1680 cgggccagcg gtgcggggcc cagcggagcc tgagaaggtc aaaggccgga gcgcactgcg 1740 cctcgggagc acagagggag cggaggaggg gcgaagggga tgggtggggg gtgccgccga 1800 gggagtcgcg cgtcagagac cccggccacg gccagcactc ggctccgggc ccgcccctca 1860 ccgcgcgccc cgccccgccc cgcctggctc tcccctctaa agcgcccggc gcgcgcctcc 1920 caccgccgca ctttcactct ccgtcagccg cattgcccgc tcggcgtccg gcccccgacc 1980 cgcgctcgtc cgcccgcccg cccgcccgcc cgcgccatga acgccaaggt cgtggtcgtg 2040 ctggtcctcg tgctgaccgc gctctgcctc agcgacggta agtgcgctcg gcggggaggc 2100 cctggcgagg cggccctggc gaggctctgg gcttcggctc ccgcccggcg cagagccgcg 2160 gctcctctgc ctgcgcccgc agtttgcgcc gcccgacaca gtgggggtgg aggcagctcg 2220 cttagctggg cgctctggtg cggtgtcgcg ttcaaagccc tacttttgcg ccgagggttt 2280 gtgacctgca gagagcgacc gcctgacctc aagctggctg cagagcgagg tcagccggga 2340 caactgggca ggaacgcccc aagagagcgt tcgggactgg cgcgggaagg cgcgagggtg 2400 gggagccgcg gaccccagac ccctgcctgc ccaccctcca cccactgcct tcccgctgcg 2460 ggctcggttt ccacaggcga atgggctccg aggtcctgct gcgcacagtg ctggaggtcg 2520 ggcggtgcat ggcgagagcg cgctttgcaa agttcgcctc atgccgcgac ttgaggctgt 2580 gaggtccgat gcagccgcgc agcctccgct ccctgcgaag ccgatcctct ccccacaccc 2640 tcgcggggct cttggccagg cgcgggcggg ctgcgcggcg cagctgtcgg gcttgtgcca 2700 cccgccaggc cgcgcttctg cacagctccg cggtccgcag cgacgcggac ctgggcgcgc 2760 gtccagccgc tgtcttcctg tctcttctcg ggttcacctg agagaggccc agggaccctc 2820 cgagcctcac acgccccctc cccagctccc caaacacacc tgcagacagg ctcttttgtc 2880 accagctggc caagcgcttt gccccagaat gagagctgca gcaaagttca atctccaagg 2940 ccctgggcca ctgggaaccg tggtgtcccg tttcactggg agagggcttt tttcttttct 3000 ttcgctgaag agaaactcgc tgcgctgtca caggacaccg atgcaaacca aaataaactg 3060 ttgcctctga acacacaaaa caaaaccctg tggctcaggc cgctgagctt ccttggctgt 3120 gaagtttcct gcaaagagtt gaaggacact ctgagtgctc ttgcagccgc gggctgtgca 3180 ggcccagcgc gcctcgagcc cttggctggg ttggtgcaga cgtggccccg gcgtcctagc 3240 tggcttggac tgtgcgctgg tgtgagcagg accagcgcag ctgagtcggg ctggagaagc 3300 tgggcagcct ggggtcgtgg cggactgcct aagtgttaag gacacagact gaaggcaatt 3360 gggaatgttc gtcgttgatg aaaagtccct gaggctgtgt ctgcacactg accccccccc 3420 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gctgcttgac aggcgggcct taggtcctgg gagtagaagc aagaattgct tttgaaggaa 4320 atggataatc ccagggggtg gagggggaga ggagagagag cctgtgtgtt gagctctgaa 4380 taggctctga tttctggcct catcaccact gcttggttgg ggggccagag gagcttctct 4440 cctctgggcg ctggagagtc acagccccac ccatcccagc gggggcggct gcagcacttg 4500 cccttggctg catatcttca agctcactgt tgccgggagg gggcttgtgc ctcactaccg 4560 gcctcctatt ctcctgctcc acccccaacc caccccctgc ctcagcttgg aagggcccaa 4620 aagaaatcca gggaaacctg gaggcacaac actcaggagc gtttagctcc tcagttaccc 4680 aggctgcagg ccccggccct gggggtggct ttcccaggtg atctggttac agtgcagtgc 4740 tgacttcccc tgcagggtcc cagtgcagct gctggaagct ggccccagag gtgcctttct 4800 ggagttagat caggtgtaac tgtgaaggct gctttaggtc tctccagtgc catgagtcac 4860 cagcaccctg atgcttggct ttttcctggt tttcagggag ttgcatttgg tcctggggac 4920 aaggaagtgg ggggacaagt ggtccacttt tcctgcaact tggtggctga atacacaatg 4980 caattcctag tccacatcat ccctcaattg attgcagtct gtagaaaaaa taaaataaaa 5040 tgagcccctt actcaagatt tcctcctact tccccagcat tctttcccaa aggtgcagaa 5100 tttcagaacc acagaggtct ctcagaactt tgtaaacagg caaacttaaa aaaaaagaaa 5160 aaagaaaaaa aatctctgga ccaaatattc ttagacatat atttaatctc tgatgaaagg 5220 atccacaagt tcaaataatt tggggtatta agtggggctt ggataaaatc ttcaaggaaa 5280 aaagaaaaac aaaaagcaca cacaaatccc agccctccag ggcttgcaat cctatattta 5340 aagggtgagc agtgggttct gcaggagccc cttgctaatt tacactaatg agtgtcaatt 5400 atggcatttt gtaaattggt gattttgcaa agatcttaat acaattcctg aggctacagc 5460 atccctgcct aggcaatgaa aaccacattt aactccagct ccactaatct ctaagccttg 5520 gggaaagtgc tgggcagaag gtgggtcctt ggcctgctct caggggactc acaggtagga 5580 agccagccag gattcttttg tgccttccag agctttaggt gaatgtgagg aggggtctct 5640 ggggtggggg agggcagcat tcctgagtac tactgtgctt cctggctaga ggcctgtgcc 5700 agaggagaga ggccagggag cctggagcct cttgtccccc tttcttttcc ctgagtaggg 5760 agatctttct cagttgtccc ttgaggaatt ttttttacaa agagtaactg gaaatttcag 5820 taccttggac tgaaaccgtt atctactata attactacct ttatcttgag acactgagca 5880 ggtggcttct aatttaatct cccccctcat ctaggctccg gctctcccca ggcctgttgg 5940 gctccttgcc ctgtagaagc tgagcctgag ctcagccagc actcactgtg ttgcctgagg 6000 agatggcctt tcccaacata caccagtaac ctggaactta ccccagtgat gccgtctctt 6060 gatccttaat cgctgcacca actgctgcag cccagacaca cattaccaaa atctggcagg 6120 gtagtaaagt gccttgttgt ccttacctct tctagggaag cccgtcagcc tgagctacag 6180 atgcccatgc cgattcttcg aaagccatgt tgccagagcc aacgtcaagc atctcaaaat 6240 tctcaacact ccaaactgtg cccttcagat tgtgtaagtc ttgaaattga acatcatcta 6300 acgaacatag ttgcatctaa cgaacatagt aacatctaac ccgagtctta ttaaaggtgt 6360 agaggtgaca agccaagtgt ccaaccttga acttggcata attagtggca gctattctta 6420 tcatgaggac ctttagtatg ccaccaggca ttaattttaa aagccgctct tggcctgggc 6480 accctgctgt gctcgtagta gttctctctt ctttccaaac ctgtgttctt cagcacagca 6540 cagctggatg ctggagaaac tatgggcttc accaaggttt tggctgaagc ctagtaaatt 6600 agccagccct tagctaataa cagtgataac tggcctgcca gtttcgggga tctgatgccc 6660 tacattaact cacaagaccc aaatgcagtt taagtcctct ttaaccattg ggtgaaactt 6720 caacattttc agctcacttg cctgtatttt ctcaagtaca acatatgagg ttttggtgtt 6780 atttggtgtg gatggcagcc actaacattt gattttattc atttgggaaa caaagaccaa 6840 aatcacacat ccacaagaca ggaagatctc agctgggtac agaagaccgg gagaaatgcg 6900 ggaagaaagc catgtgcttg aaagccctct catgctcaag aggtcctgtg tctgaacacg 6960 gggaagcgag ggctcaggga gtctcctgga gaggatttga ttgctcagaa gttctagtgc 7020 taaaaatggg gtggggagac agcagttgga accaaagcta caactttccc aagacttttc 7080 cacccaacac caaatgtttt tacttttgat tttagaaaac tgtttttagt tttgagttaa 7140 ccctttactg ccttgaatgt gtttgttatt tacagtatgt tttagggccc tagaaaatga 7200 atgttttttc agtactttgc ctacaacatg atactttatc tcttgtgaag agtattttaa 7260 agatgctcaa tttagctagc ttggacctgc tttacagcac tgatcatgct ggtttactgg 7320 cctggaaatg caccttgaag ttgaagatgc caaatacaat tctcaggtct gagcagacac 7380 taaattaaca aagaataggc cccagatttg gaccccaatg tgggttgctc cgagccacac 7440 ccatctctgc acccctcttc acctaatgga caggctgctt gaagactccc tgggtgcccc 7500 tgaaccactg ttctggggct tagctgtcct caagaccctt aagtacttgg gctgcatgag 7560 attacctggc accaaagggc tttctggcaa gagatccaga gagatgaaat caggccttcc 7620 ccaggagttt gcatgtaggg aagcttttaa gagtgtgaac ttttaaaaaa caaatgagac 7680 caagaaacat tcagtgaact tgtaaaatct ttctagaaac tattttctgg taagccacct 7740 gcactgcccc tcccctccct ggctggtcac cctcccggtc agaccgcggt gacttctggc 7800 aggcctcctt cctccaggct tcctcatgcc catccttaag tcggccctat atctatcaag 7860 atgacccatc caaataaacc tctgctctgt tgctctccat tctcccctcc ccaggtgcct 7920 agagcatcct gtcgtcccct tcctcagttt cctctgtatg ctttgatgac ccccctggcg 7980 tatttgctcc tgattttccc ttcccgttta tttactctcc aagctcctac ttatccttca 8040 aaggcagctc aaatgctccc ttacatgaat tcccctgcac tgccccggaa agacttctgt 8100 tcacatttcc atgtctctgc aatggaactt cctgcactgc cagcgctgag ctttccccag 8160 cacaccgcga gcacctctgg agcctgagcg taccaagtgg agcacggggt gccagcgagg 8220 gccctagatg ggtgttgggg gagcggatgc acacgttgca gccgcgcctt cctcctgtgc 8280 agccgcacac tgttgccatt ctgttttcac agagcccggc tgaagaacaa caacagacaa 8340 gtgtgcattg acccgaagct aaagtggatt caggagtacc tggagaaagc tttaaacaag 8400 taagcacaac agccaaaaag gactttccgc tagacccact cgaggaaaac taaaaccttg 8460 tgagagatga aagggcaaag acgtggggga gagggggcct taaccatgag gaccaggtgt 8520 gtgtgtgggg tgggcacatt gatctgggat cgggcctgag gtttgccagc atttagaccc 8580 tgcatttata gcatacggta tgatattgca gcttatattc atccatgccc tgtacctgtg 8640 cacgttggaa cttttattac tggggttttt ctaagaaaga aattgtatta tcaacagcat 8700 tttcaagcag ttagttcctt catgatcatc acaatcatca tcattctcat tctcattttt 8760 taaatcaacg agtacttcaa gatctgaatt tggcttgttt ggagcatctc ctctgctccc 8820 ctggggagtc tgggcacagt caggtggtgg cttaacaggg agctggaaaa agtgtccttt 8880 cttcagacac tgaggctccc gcagcagcgc ccctcccaag aggaaggcct ctgtggcact 8940 cagataccga ctggggctgg gcgccgccac tgccttcacc tcctctttca acctcagtga 9000 ttggctctgt gggctccatg tagaagccac tattactggg actgtgctca gagacccctc 9060 tcccagctat tcctactctc tccccgactc cgagagcatg cttaatcttg cttctgcttc 9120 tcatttctgt agcctgatca gcgccgcacc agccgggaag agggtgattg ctggggctcg 9180 tgccctgcat ccctctcctc ccagggcctg ccccacagct cgggccctct gtgagatccg 9240 tctttggcct cctccagaat ggagctggcc ctctcctggg gatgtgtaat ggtccccctg 9300 cttacccgca aaagacaagt ctttacagaa tcaaatgcaa ttttaaatct gagagctcgc 9360 tttgagtgac tgggttttgt gattgcctct gaagcctatg tatgccatgg aggcactaac 9420 aaactctgag gtttccgaaa tcagaagcga aaaaatcagt gaataaacca tcatcttgcc 9480 actaccccct cctgaagcca cagcagggtt tcaggttcca atcagaactg ttggcaaggt 9540 gacatttcca tgcataaatg cgatccacag aaggtcctgg tggtatttgt aactttttgc 9600 aaggcatttt tttatatata tttttgtgca catttttttt tacgtttctt tagaaaacaa 9660 atgtatttca aaatatattt atagtcgaac aattcatata tttgaagtgg agccatatga 9720 atgtcagtag tttatacttc tctattatct caaactactg gcaatttgta aagaaatata 9780 tatgatatat aaatgtgatt gcagcttttc aatgttagcc acagtgtatt ttttcacttg 9840 tactaaaatt gtatcaaatg tgacattata tgcactagca ataaaatgct aattgtttca 9900 tggtataaac gtcctactgt atgtgggaat ttatttacct gaaataaaat tcattagttg 9960 ttagtgatgg agcttataga cgtttctggt ttatatagtt aagcctgcct gcagtcaggt 10020 gtctgagacc ccttctcaca gcccatgtgt gacagtgtat gggcttttct cacgagcaga 10080 ttagatctgc agctcaagtt tttggatctt tttttttttt ttttaacccg attgaaatag 10140 cagtgctggt tttctgaaga ataatatttg actcactaat tcgtcttccc tccctcctcc 10200 tccttggttc tcctaacttc cccatgtaat ccccagagac tcaaccctag taatatcaac 10260 cttttacatt ttcccatgta aaaatcccat gactccaggc catggttaat atgaagcttt 10320 cacagggaca ggtggcctca ccccataaat cattaaatac cattcagctt gaatcatttt 10380 aatgtgacag tcacgagcca gttgctctaa taaaattctg ctaaccagct ctctcccttg 10440 ctctccagaa caatcgcatt cattcccagg agtgttcaca ggcgtctaga aaggggaagg 10500 tgggaccact gccttttttc tcctcttctg aatggcagtc tgaacctggg gcctgcagcc 10560 tccaaaacgt tattcaattt gaaatgcaga catttcttag agaaagctaa gagttcagcc 10620 ctgcattgag aagaagaaaa agtcccatga gagcagggca gggtggggtg acaaggacca 10680 cgatggccag cctggccctg ggtgtaccct gagatgtgga ttccttgtcc ccagtgggaa 10740 tcaggttcag gttggcagat tggcagtcgc tgtaacccat tcacaaaggt gttctaggag 10800 cccattgaac atttgtttga atggaaggaa atgtccaatt tattttaatg aattactgat 10860 aaacagtgct ttgaccaggg gcctccaggc ctgagactga aggcacagtt taaccagtac 10920 acgggccagt gttaaatctt atgcagactg agacgaactt ttgtttattt ccacattatt 10980 aatggttcta ctaattttat ctaagggggc gcagagaaga aaaagtgggg aaaaaagaaa 11040 agataggaaa aaagaagcga cagaagaaga gaaaggctgc ccagaaaagg aaaaactagt 11100 tatctgccac ctcgagatgg accacagttc acttgctctc ggcgctttgt aaatttgctc 11160 gatcctcctc caggacagac ccccatgcag actgggcagg ggctcagact tccgtggggg 11220 agcagtgctt tgctgccctg ccagccacac cggcttctgt atttatgtgc tttttaaggc 11280 ccttgttggt ctgctaagtt atgaagaaag tagttgtgca gagactgggg cgggggtctg 11340 tgacgcggag cctgtgtgct caggactctg tccagaatag cctgggagct ccaggaatgc 11400 ccaggttgct gagcccccca gcccgccctc cacttcctct cttagaaggc ctgcgctcac 11460 tggggagctc accagctcca cacacttgca gtctgcattc ctgtggagac caggctgtgg 11520 ccacctggcc agtgtgcagg gcaacctgct agcccagcag aggtggcctc gccaggaagg 11580 gggtgtgcca cccctctgtg gccctcagga aaggtgaaaa ctgactgacc cttaggaatg 11640 ggccctggct ttttccaaat acccattgcc tttccctcca gcactctgcc acctgggaag 11700 gggcttcttc agcccctcct tcctgggttg tgggagtggc tttatcccca agcccgggtg 11760 ggtttctgca aactgtgtgg ggtgagcccg agggaatgct 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gccatccttc ccgtggaagc cagtagccac 12660 tctagtccat gggactcttg acaaaagcgc cccgagaggg caaacctgtg cccccatact 12720 cgcctgcatt cttcggactc cacatgcagc agggctttgt gcctggggag gggtggccag 12780 tctgtcctgg tcagtatgaa aagctgttgg ccccctaggg acagagggcc cagctaaggc 12840 tgcctgagga tacaaactgc ttgctatccc actcctgggg agcagggtct gcagggactg 12900 agagtgggtc ccaccttgag aacgcatgca aggtccgtcc tgtcttgatg tcttgatgtg 12960 actgtatgtg ccctgggggc tcactgtggt ttacaagtgg cttgtgaagc tcctgggagc 13020 aggtggtaca cccagtgctg aagacagggt cgccgtggaa gagcgaagag cctgaccggg 13080 attcctggtg ggttgaaact aggaagtgct cacaccagtc agagccaaat gaggggtgcg 13140 ctatggtcac tgctctgtcc agcatgcgtt cctcctggga ggtcctggcc acctgtgcac 13200 ccacccctgt gccacctcca gcagtcccac ctggggccac ctacggtggc atggcccctg 13260 gctgagaggc cccgagggcg aagggttact ggaagccacg aaagtgcctc ttgggacagc 13320 cgaggccagg atgcagggca gcagcatcct gagcctcagc cccacgccgg tgccgggtaa 13380 gcagtgtgcc ctgtccccgt cgtatgacca ctctgatggg cctctctgtg ccttcgtgcg 13440 tctgccacgc ccagtgcttg 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ggccagggca gagtgagacc cagccctcat cccgagcacc tccacatcct 14340 ccacgttctg ctcatcattc tctgtctcat ccatcatcat gtgtgtccac gactgtctcc 14400 atggccccgc aaaaggactc tcaggaccaa agctttcatg taaactgtgc accaagcagg 14460 aaatgaaaat gtcttgtgtt acctgaaaac actgtgcaca tctgtgtctt gtttggaata 14520 ttgtccattg tccaatccta tgtttttgtt caaagccagc gtcctcctct gtgaccaatg 14580 tcttgatgca tgcactgttc cccctgtgca gccgctgagc gaggagatgc tccttgggcc 14640 ctttgagtgc agtcctgatc agagccgtgg tcctttgggg tgaactacct tggttccccc 14700 actgatcaca aaaacatggt gggtccatgg gcagagccca agggaattcg gtgtgcacca 14760 gggttgaccc cagaggattg ctgccccatc agtgctccct cacatgtcag taccttcaaa 14820 ctagggccaa gcccagcact gcttgaggaa aacaagcatt cacaacttgt ttttggtttt 14880 taaaacccag tccacaaaat aaccaatcct ggacatgaag attctttccc aattcacatc 14940 taacctcatc ttcttcacca tttggcaatg ccatcatctc ctgccttcct cctgggccct 15000 ctctgctctg cgtgtcacct gtgcttcggg cccttcccac aggacatttc tctaagagaa 15060 caatgtgcta tgtgaagagt aagtcaacct gcctgacatt tggagtgttc cccttccact 15120 gagggcagtc gatagagctg tattaagcca cttaaaatgt tcacttttga caaaggcaag 15180 cacttgtggg tttttgtttt gtttttcatt cagtcttacg aatacttttg ccctttgatt 15240 aaagactcca gttaaaaaaa attttaatga agaaagtgga aaacaaggaa gtcaaagcaa 15300 ggaaactatg taacatgtag gaagtaggaa gtaaattata gtgatgtaat cttgaattgt 15360 aactgttctt gaatttaata atctgtaggg taattagtaa catgtgttaa gtattttcat 15420 aagtatttca aattggagct tcatggcaga aggcaaaccc atcaacaaaa attgtccctt 15480 aaacaaaaat taaaatcctc aatccagcta tgttatattg aaaaaataga gcctgaggga 15540 tctttactag ttataaagat acagaactct ttcaaaacct tttgaaatta acctctcact 15600 ataccagtat aattgagttt tcagtggggc agtcattatc caggtaatcc aagatatttt 15660 aaaatctgtc acgtagaact tggatgtacc tgcccccaat ccatgaacca agaccattga 15720 attcttggtt gaggaaacaa acatgaccct aaatcttgac tacagtcagg aaaggaatca 15780 tttctatttc tcctccatgg gagaaaatag ataagagtag aaactgcagg gaaaattatt 15840 tgcataacaa ttcctctact aacaatcagc tccttcctgg agactgccca gctaaagcaa 15900 tatgcattta aatacagtct tccatttgca agggaaaagt ctcttgtaat 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Claims (145)

  1. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 CXCL12와 상호작용하여, 이것과 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩(trap) 영역을 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현되는, 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 폐암, 림프절암, 유방암, 골암, 전립선암, 뇌암, 간암, 결장직장암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 암은 결장직장암 및 골로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 암은 췌장암으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 췌장암은 내분비성인, 암을 치료하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 췌장암은 외분비성인, 암을 치료하는 방법
  7. 제4항에 있어서, 상기 췌장암은 선암, 선포 세포 암종, 선편평세포(adenosquamous) 암종, 콜로이드질 암종, 미분화형 암종(undifferentiated carcinoma) 파골세포-유사 거대 세포, 간세포 암종, 유두상 점액성 종양 유관(intraductal papillary-mucinous neoplasm), 점액성 낭성 종양, 췌모세포종(pancreatoblastoma), 장액 낭선종, 반지 세포 암종(signet ring cell carcinomas), 고형 가유두상 종양(solid and pseuodpapillarysolid tumor), 췌장관 암종, 또는 미분화형 암종인, 암을 치료하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 췌장암은 췌장관 선암인, 암을 치료하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 세포의 형태로 존재하는, 암을 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 단핵구 또는 줄기 세포인, 암을 치료하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀의 형태로 존재하는, 암을 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리포좀은 표적화 리간드를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 리포좀은 지질-폴리에틸렌 글리콜(지질-PEG) 접합체를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체는 총 표면 지질의 약 12㏖% 내지 약 50㏖%의 양의 PEG를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체는 약 2000 내지 약 5000g/㏖ 범위의 분자량을 갖는 PEG 분자를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 지질-PEG 접합체는 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-카복시-폴리에틸렌 글리콜 2000(DSPE-PEG2000)을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 간 조직으로 전달되는, 암을 치료하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 췌장 조직으로 전달되는, 암을 치료하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, VH 및 VL 융합 단백질, 또는 비-면역글로불린 표적-결합 도메인, 암을 치료하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 서열번호 1, 6, 11 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1, 6, 11 또는 16인, 암을 치료하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 서열번호 1, 6, 11 및 16에 의해서 암호화된 단백질과 동일한, CXCL12 상의 에피토프에 결합하는, 암을 치료하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 VH 영역을 포함하되, 상기 VH 영역은 서열번호 2, 7, 12 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 2인, 암을 치료하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 7인, 암을 치료하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 12인, 암을 치료하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 17인, 암을 치료하는 방법.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 VL 도메인 또는 VL 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 VL 영역을 더 포함하되, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 18인, 암을 치료하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 조성물은 경쇄 불변 영역을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 VL 영역 및 VH 영역을 포함하되, 상기 VH 영역은 서열번호 17과 90% 동일성을 갖고, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 VL 영역 및 VH 영역을 포함하되, 상기 VH 영역은 서열번호 17이고, 상기 VL 영역은 서열번호 18인, 암을 치료하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 VH 영역을 포함하되, 상기 3개의 CDR은 (a) 각각 서열번호 3 내지 5이거나; (b) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 8 내지 10이거나; (c) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 13 내지 15이거나; 또는 (d) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 19 내지 21인, 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 3, 4, 및 5인, 암을 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 8, 9 및 10인, 암을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 7과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 13, 14 및 15인, 암을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 12와 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  43. 제36항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 19, 20 및 21인, 암을 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 17과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  45. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 VL 도메인을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 VL 영역을 더 포함하되, 상기 CDR은 각각 서열번호 22, 23 및 24인, 암을 치료하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 VH 영역의 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 19, 20 및 21이고, 상기 VL 영역의 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 22, 23 및 24인, 암을 치료하는 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, 암을 치료하는 방법.
  51. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 63과 적어도 70% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 63인, 암을 치료하는 방법.
  53. 제1항에 있어서, 상기 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 서열번호 63에 의해서 암호화된 단백질과 동일한, CXCL12 상의 에피토프에 결합하는, 암을 치료하는 방법.
  54. 제1항에 있어서, PD-L1에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 PD-L1과 상호작용하여, 이것과 이의 내생 수용체(들)와의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현되는, 암을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, VH 및 VL 융합 단백질, 또는 비-면역글로불린 표적-결합 도메인인, 암을 치료하는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 조성물 및 제2 조성물은 리포좀, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 세포의 형태로 존재하는, 암을 치료하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 세포는 단핵구 또는 줄기 세포인, 암을 치료하는 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀의 형태로 존재하고, 상기 제2 조성물은 제2 리포좀의 형태로 존재하되, 상기 제1 리포좀 및 상기 제2 리포좀은 순차적으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  59. 제54항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀의 형태로 존재하고, 상기 제2 조성물은 제2 리포좀의 형태로 존재하되, 상기 제1 리포좀 및 상기 제2 리포좀은 공동으로(concomitantly) 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  60. 제54항에 있어서, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체를 포함하되, 각각의 융합 폴리펩타이드는 PD-1 세포외 도메인, 가요성 링커, 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 상기 삼량체는 PD-L1에 결합할 수 있고, 상기 암은 췌장암인, 암을 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 삼량체는 동종삼량체인, 암을 치료하는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 삼량체는 이종삼량체인, 암을 치료하는 방법.
  63. 제60항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 26과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  64. 제60항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 25와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해서 암호화되는, 암을 치료하는 방법.
  65. 제60항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 26인, 암을 치료하는 방법.
  66. 제60항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 25에 의해서 암호화되는, 암을 치료하는 방법.
  67. 제60항에 있어서, 상기 PD-1 세포외 도메인은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  68. 제60항에 있어서, 상기 PD-1 세포외 도메인은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  69. 제60항에 있어서, 상기 삼량체화 도메인은 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  70. 제60항에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열번호 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  71. 제60항에 있어서, 상기 삼량체는 약 16피코몰의 친화도로 PD-L1에 결합할 수 있는, 암을 치료하는 방법.
  72. 제1항에 있어서, PD-1에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 PD-1과 상호작용하여, 이것과 이의 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현되는, 암을 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, VH 및 VL 융합 단백질, 또는 비-면역글로불린 표적-결합 도메인인, 암을 치료하는 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 조성물 및 제2 조성물은 리포좀, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 세포의 형태로 존재하는, 암을 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 세포는 단핵구 또는 줄기 세포인, 암을 치료하는 방법.
  76. 제72항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀의 형태로 존재하고, 상기 제2 조성물은 제2 리포좀의 형태로 존재하되, 상기 제1 리포좀 및 상기 제2 리포좀은 순차적으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
  77. 제72항에 있어서, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 3개의 융합 폴리펩타이로부터 형성된 삼량체를 포함하되, 각각의 융합 폴리펩타이드는 PD-L1 세포외 도메인, 가요성 링커, 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 상기 삼량체는 PD-1에 결합할 수 있고, 상기 암은 췌장암인, 암을 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 삼량체는 동종삼량체인, 암을 치료하는 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 삼량체는 이종삼량체인, 암을 치료하는 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 PD-L1 세포외 도메인은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 암을 치료하는 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 PD-L1 세포외 도메인은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 삼량체화 도메인은 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  83. 제77항에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열번호 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  84. 제54항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 상기 제2 조성물은 상승작용적인, 암을 치료하는 방법.
  85. 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법으로서, 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로(systemically) 투여하는 단계를 포함하되, 상기 벡터는 상기 표적 세포에서 트랩을 발현하기 위한 작제물을 포함하고, 상기 트랩이 상기 표적 세포에서 발현되고, 상기 표적 세포의 상기 미세환경이 변형되는, 암을 치료하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 미세환경을 변형시키는 것은 상기 미세환경에서 표적 분자의 양을 감소시키는 것을 포함하는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질, 단백질 인자, 케모카인, 및 사이토카인, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 단백질은 면역 관문 관련 단백질인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 면역 관문 관련 단백질은 PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA-4인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  90. 제87항에 있어서, 상기 표적 분자는 케모카인인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 케모카인은 CXCL12인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  92. 제85항에 있어서, 상기 작제물은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 목적하는 세포외 또는 세포내 국지화를 위한 신호전달 펩타이드, 및 CXCL12와 상호작용하여, 이것과 이의 내생 수용체(들)의 상호작용을 방해하는 친화도 또는 트랩 영역을 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현되고, 상기 친화도 또는 트랩 영역은 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, 또는 VH 및 VL 융합 단백질, 또는 비-면역글로불린 표적-결합 도메인을 포함하는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  93. 제85항에 있어서, 상기 표적 세포는 기관 세포인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 세포는 폐, 림프절, 유방, 골, 전립선, 뇌, 간, 결장직장 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  95. 제85항에 있어서, 상기 트랩의 상기 발현은 일시적인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  96. 제85항에 있어서, 상기 미세환경을 변형시키는 것은 일시적인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  97. 암의 전이를 감소시키는 방법으로서, 상기 암을 갖는 대상체에게 벡터를 포함하는 조성물을 전신으로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 벡터는 트랩의 발현을 위한 작제물을 포함하고, 상기 트랩은 전이에 민감한 조직에서 발현되고, 상기 암의 상기 조직으로의 전이는 감소되는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 암은 고형암인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 암은 폐암, 림프절암, 유방암, 골암, 전립선암, 뇌암, 간암, 결장직장암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  100. 제97항에 있어서, 상기 트랩은 CXCL12 트랩인, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  101. 제97항에 있어서, 상기 작제물은 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 면역글로불린 VH 도메인, 면역글로불린 VL 도메인, VH 및 VL 융합 단백질, 또는 비-면역글로불린 표적-결합 도메인을 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드는 일시적으로 발현되는, 표적 세포의 미세환경을 변형시키는 방법.
  102. VL 영역 및 VH 영역을 포함하는 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 VH 영역은 서열번호 17과 90% 동일성을 갖고, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  103. 제102항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 18인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  104. 제102항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 17이고, 상기 VL 영역은 서열번호 18인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  105. 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  106. CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 VH 영역이되, 상기 3개의 CDR은 (a) 각각 서열번호 3 내지 5이거나; (b) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 8 내지 10이거나; (c) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 13 내지 15이거나; 또는 (d) 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 19 내지 21인, VH 영역, 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 VL 영역이되, 상기 CDR은 각각 서열번호 22, 23 및 24인, VL 영역을 포함하는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  107. 제106항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 3, 4, 및 5인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  108. 제107항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  109. 제106항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 8, 9 및 10인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  110. 제109항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 7과 적어도 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  111. 제106항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 13, 14 및 15인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  112. 제111항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 12와 적어도 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  113. 제106항에 있어서, 상기 3개의 CDR은 서열번호 19, 20 및 21인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  114. 제113항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 17과 적어도 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  115. 제106항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 18과 적어도 90% 동일성을 갖는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  116. 제106항에 있어서, 상기 VH 영역의 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 19, 20 및 21이고, 상기 VL 영역의 상기 3개의 CDR은 각각 서열번호 22, 23 및 24인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  117. 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  118. 서열번호 63과 적어도 70% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해서 암호화된 CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  119. 제118항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 63인, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  120. CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 63의 DNA에 의해서 암호화된 단백질과 동일한, CXCL12 상의 에피토프에 결합하는, CXCL12에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  121. 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체로서, 각각의 융합 폴리펩타이드는 PD-1 세포외 도메인, 가요성 링커, 및 삼량체화 도메인을 포함하고, 상기 삼량체는 PD-L1에 결합할 수 있는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  122. 제121항에 있어서, 상기 삼량체는 동종삼량체인, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  123. 제121항에 있어서, 상기 삼량체는 이종삼량체인, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  124. 제121항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 26과 적어도 90% 동일성을 갖는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  125. 제121항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 25와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해서 암호화되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  126. 제121항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 26인, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  127. 제121항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 25에 의해서 암호화되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  128. 제121항에 있어서, 상기 PD-1 세포외 도메인은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  129. 제121항에 있어서, 상기 PD-1 세포외 도메인은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  130. 제121항에 있어서, 상기 삼량체화 도메인은 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  131. 제121항에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열번호 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  132. 제121항에 있어서, 상기 삼량체는 약 16피코몰의 친화도로 PD-L1에 결합할 수 있는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  133. 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체로서, 각각의 융합 폴리펩타이드는 PD-L1 세포외 도메인, 가요성 링커, 및 삼량체화 도메인을 포함하되, 상기 삼량체는 PD-1에 결합할 수 있는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  134. 제133항에 있어서, 상기 삼량체는 동종삼량체인, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  135. 제133항에 있어서, 상기 삼량체는 이종 삼량체인, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  136. 제133항에 있어서, 상기 PD-L1 세포외 도메인은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  137. 제133항에 있어서, 상기 PD-L1 세포외 도메인은 서열번호 35, 36, 37, 38, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  138. 제133항에 있어서, 상기 삼량체화 도메인은 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  139. 제133항에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열번호 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3개의 융합 폴리펩타이드로부터 형성된 삼량체.
  140. 제102항 내지 제139항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  141. 제140항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1, 6, 11 또는 16인, 핵산.
  142. 제140항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 26인, 핵산.
  143. 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  144. 서열번호 63과 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  145. 제144항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 63인, 발현 벡터.
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