JP2021105060A - 転移を低減するための方法および組成物 - Google Patents

転移を低減するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】転移を低減するための方法および組成物の提供。【解決手段】本明細書に記載される主題は、標的細胞の微小環境を改変する方法を対象とする。本方法は、対象にベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターは、標的細胞におけるトラップの発現のための構築物を含み、トラップは、標的細胞において発現され、これにより、微小環境を改変する。がんの転移を低下させる方法であって、がんを患う対象に、ベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターが、トラップの発現のための構築物を含み、トラップが、転移に対し感受性である組織に送達され、次いでそこで発現され、組織へのがんの転移が低下される、方法もまた、本明細書に記載されている。本方法を実施するための組成物についても記載されている。【選択図】なし

Description

政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＣＡ１５１６５２、ＣＡ１４９
３８７、ＣＡ１５７７３８、およびＤＫ１００６６４の下の政府支援でなされた。政府は
、本発明において特定の権利を有する。
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル４８２９０２＿ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔに書き込まれた配列表は、７７
，６７１バイトであり、２０１６年９月１４日に作成されており、本明細書によって参考
として本明細書に援用される。
発明の分野
本明細書に記載されている主題は、転移に対し感受性である組織における細胞微小環境
因子を改変することにより、転移性がんの出現を予防または低下させる処置を対象とする
。
背景
がんが転移したら、治療法の成功率は相当により低くなることから、がんの処置におい
て、転移前の早期診断および処置は重大な意味を持つ。特に、結腸直腸がん（ＣＲＣ）は
、世界中で診断される３番目に蔓延したがんであり、３番目に引用される死亡をもたらす
。米国単独では、毎年およそ１４３，４６０名の患者が診断され、５１，６９０名の患者
が死亡する（American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012、Atlan
ta: American Cancer Society；２０１２年、２５〜６頁）。しかし、死因は、原発性
がんが存する結腸の局所的切除が相当に効率的な、原発性結腸がん負荷によるものである
ことは滅多にない。残念ながら、肝臓転移の出現が、ＣＲＣ患者における主な死因である
（American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012、Atlanta: Ameri
can Cancer Society；２０１２年、２５〜６頁）。
結腸直腸がん検出の初期ステージにおいて、５年生存率は、およそ９０％である。残念
ながら、肝臓転移が起こると、この率は、１２％生存未満へと大幅に降下する。研究は、
診断時に、患者の２０％が肝臓転移を既に発症しており、この数字は、死亡時に肝臓にお
ける転移性病変を発症した患者の最大６０〜７０％に達することも見出した（Schima W
、Kulinna C、Langenberger Hら、Liver metastases of colorectal cancer: US,
CT or MR? Cancer imaging.、International Cancer Imaging Society.、２０
０５年；５巻（ＳｐｅｃＮｏ Ａ）：Ｓ１４９〜５６頁）。
さらに、その究極の治療目標が、罹患細胞を死滅させること、またはその繁殖を予防も
しくは阻害することである、がん等の疾患のための処置は、細胞傷害性薬物の投与を含む
。細胞傷害性薬物は、アルキル化剤、代謝拮抗薬および毒素を含む、がんの処置において
使用される多くの化学療法剤を含む。大部分の細胞傷害性薬物は、非選択的であり、罹患
細胞だけでなく健康な細胞も死滅させ、このことは、これらの薬剤が全身に送達される際
の、望ましくない副作用に寄与する。よって、毒性薬剤の全身投与に頼らない、代わりの
治療法の必要がある。
American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012、Atlanta: American Cancer Society；２０１２年、２５〜６頁 Schima W、Kulinna C、Langenberger Hら、Liver metastases of colorectal cancer: US, CT or MR? Cancer imaging.、International Cancer Imaging Society.、２００５年；５巻（ＳｐｅｃＮｏ Ａ）：Ｓ１４９〜５６頁
本明細書における主題は、転移に対し感受性である組織の微小環境を改変することによ
り、公知の治療法の弱点に取り組む。そうすることにより、転移が予防または低下され、
細胞傷害性薬剤の使用を回避することができる。
発明の簡単な要旨
ある実施形態では、本明細書に記載される主題は、標的細胞の微小環境を改変する方法
であって、対象にベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターが、ト
ラップ（ｔｒａｐ）の発現のための構築物を含み、トラップが、標的細胞において発現さ
れ、これにより、微小環境を改変する、方法を対象とする。
ある実施形態では、本明細書に記載されている主題は、がんの転移を低下させる方法で
あって、がんを有する対象にベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベク
ターが、トラップの発現のための構築物を含み、トラップが、転移に対し感受性である組
織において発現され、これにより、組織の微小環境を改変し、組織へのがんの転移を低下
させる、方法を対象とする。
ある実施形態では、本明細書に記載されている主題は、患者におけるがんを処置する方
法であって、患者にＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドをコードする核酸
配列を含む組成物を投与するステップを含み、ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞
内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＣＸＣ
Ｌ１２と相互作用し、その内在性受容体（単数または複数）とそれとの相互作用を破壊す
る領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、方法を対象とする。
別の実施形態では、本明細書に記載されている主題は、ＰＤ−Ｌ１に結合することがで
きるポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む
方法であって、ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリング
ペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＰＤ−Ｌ１と相互作用し、その内在性
受容体（単数または複数）とそれとの相互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチ
ドが、一過性発現される、方法を対象とする。
別の実施形態では、ＰＤ−１に結合することができるポリペプチドをコードする核酸を
含む第２の組成物を投与するステップをさらに含む方法であって、ポリペプチドが、所望
の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領
域であって、ＰＤ−１と相互作用し、その内在性受容体（単数または複数）とそれとの相
互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、方法が提供さ
れる。
これらおよびさらなる実施形態は、本明細書に十分に開示されている。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
患者におけるがんを処置する方法であって、前記患者にＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物を投与するステップを含み、前記ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＣＸＣＬ１２と相互作用し、その内在性受容体とそれとの相互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、方法。（項目２）
前記がんが、肺がん、リンパ節がん、乳がん、骨がん、前立腺がん、脳がん、肝臓がん、結腸直腸がんおよび膵がんからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記がんが、結腸直腸がんおよび骨から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記がんが、膵がんから選択される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記膵がんが、内分泌である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記膵がんが、外分泌である、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記膵がんが、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、膠様癌、破骨細胞様巨細胞による未分化癌、肝様癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞癌、固形および偽乳頭状（pseuodpapillary）腫瘍、膵管癌または未分化癌である
、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記膵がんが、膵管腺癌である、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記組成物が、リポソーム、ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたは細胞の形態である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、単球または幹細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記組成物が、リポソームの形態である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記リポソームが、標的化リガンドを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記リポソームが、脂質−ポリエチレングリコール（脂質−ＰＥＧ）コンジュゲートを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記脂質−ＰＥＧコンジュゲートが、総表面脂質の約１２ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％の間の量のＰＥＧを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記脂質−ＰＥＧコンジュゲートが、約２０００〜約５０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の分子量を有するＰＥＧ分子を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記脂質−ＰＥＧコンジュゲートが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシ−ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記組成物が、肝臓組織に送達される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記組成物が、膵組織に送達される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記親和性またはトラップ領域が、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、ＶＨおよびＶＬ融合タンパク質、または非免疫グロブリン標的結合ドメインである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、配列番号１、６、１１および１６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリペプチドが、配列番号１、６、１１または１６である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＣＸＣＬ１２における、配列番号１、６、１１および１６によってコードされるタンパク質と同じエピトープに結合する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＶＨ領域を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号２、７、１２および１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記ＶＨ領域が、配列番号２である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＶＨ領域が、配列番号７である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ＶＨ領域が、配列番号１２である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記ＶＨ領域が、配列番号１７である、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物が、ＶＬドメインまたはＶＬドメインをコードする核酸を含まない、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記組成物が、重鎖定常領域を含まない、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＶＬ領域をさらに含み、前記ＶＬ領域が、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記ＶＬ領域が、配列番号１８である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記組成物が、軽鎖定常領域を含まない、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号１７に対して９０％の同一性を有し、前記ＶＬ領域が、配列番号１８に対して９０％の同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目３４）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記ＶＨ領域が、配列番号１７であり、前記ＶＬ領域が、配列番号１８である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ポリペプチドが、軽鎖または重鎖定常領域を含まない、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＶＨ領域を含み、前記３個のＣＤＲが、（ａ）それぞれ配列番号３〜５であり；（ｂ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号８〜１０であり；（ｃ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１３〜１５であり；または（ｄ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１９〜２１である、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記３個のＣＤＲが、配列番号３、４および５である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＶＨ領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記３個のＣＤＲが、配列番号８、９および１０である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記ＶＨ領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記３個のＣＤＲが、配列番号１３、１４および１５である、項目３６に記載の方法。（項目４２）
前記ＶＨ領域が、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＣＤＲが、配列番号１９、２０および２１である、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記ＶＨ領域が、配列番号１７に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ポリペプチドが、ＶＬドメインを含まない、項目３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ポリペプチドが、重鎖定常領域を含まない、項目３６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ポリペプチドが、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＶＬ領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、それぞれ配列番号２２、２３および２４である、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記ＶＬ領域が、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ＶＨ領域の前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１９、２０および２１であり、前記ＶＬ領域の前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号２２、２３および２４である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリペプチドが、軽鎖または重鎖定常領域を含まない、項目４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記核酸配列が、配列番号６３に対して少なくとも７０％の同一性を有する、項目１に記載の方法。
（項目５２）
前記核酸配列が、配列番号６３である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
ＣＸＣＬ１２に結合することができる前記ポリペプチドが、ＣＸＣＬ１２における、配列番号６３によってコードされるタンパク質と同じエピトープに結合する、項目１に記載の方法。
（項目５４）
ＰＤ−Ｌ１に結合することができるポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含み、前記ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＰＤ−Ｌ１と相互作用し、その内在性受容体とそれとの相互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、項目１に記載の方法。
（項目５５）
前記親和性またはトラップ領域が、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、ＶＨおよびＶＬ融合タンパク質、または非免疫グロブリン標的結合ドメインである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記組成物および第２の組成物が、リポソーム、ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたは細胞の形態である、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記細胞が、単球または幹細胞である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記組成物が、リポソームの形態であり、前記第２の組成物が、第２のリポソームの形態であり、第１および第２のリポソームが、逐次に投与される、項目５４に記載の方法。（項目５９）
前記組成物が、リポソームの形態であり、前記第２の組成物が、第２のリポソームの形態であり、第１および第２のリポソームが、同時的に投与される、項目５４に記載の方法。
（項目６０）
前記親和性またはトラップ領域が、３個の融合ポリペプチドから形成された三量体を含み、各融合ポリペプチドが、ＰＤ−１細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体が、ＰＤ−Ｌ１に結合することができ、前記がんが、膵がんである、項目５４に記載の方法。
（項目６１）
前記三量体が、ホモ三量体である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記三量体が、ヘテロ三量体である、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２６に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２６である、項目６０に記載の方法。
（項目６６）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２５によってコードされる、項目６０に記載の方法。
（項目６７）
前記ＰＤ−１細胞外ドメインが、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目６０に記載の方法。
（項目６８）
前記ＰＤ−１細胞外ドメインが、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６９）
前記三量体形成ドメインが、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目７０）
前記フレキシブルリンカーが、配列番号５８、５９、６０、６１および６２からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目７１）
前記三量体が、約１６ピコモル濃度の親和性でＰＤ−Ｌ１に結合することができる、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
ＰＤ−１に結合することができるポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を投与するステップをさらに含み、前記ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＰＤ−１と相互作用し、その内在性受容体とそれとの相互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、項目１に記載の方法。
（項目７３）
前記親和性またはトラップ領域が、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、ＶＨおよびＶＬ融合タンパク質、または非免疫グロブリン標的結合ドメインである、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記組成物および第２の組成物が、リポソーム、ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたは細胞の形態である、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記細胞が、単球または幹細胞である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記組成物が、リポソームの形態であり、前記第２の組成物が、第２のリポソームの形態であり、前記第１および第２のリポソームが、逐次に投与される、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
前記親和性またはトラップ領域が、３個の融合ポリペプチドから形成された三量体を含み、各融合ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体が、ＰＤ−１に結合することができ、前記がんが、膵がんである、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記三量体が、ホモ三量体である、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記三量体が、ヘテロ三量体である、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
前記ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記三量体形成ドメインが、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８３）
前記フレキシブルリンカーが、配列番号５８、５９、６０、６１および６２からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８４）
前記組成物および前記第２の組成物が、相乗的である、項目５４または７２に記載の方法。
（項目８５）
標的細胞の微小環境を改変する方法であって、対象にベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、前記ベクターが、前記標的細胞におけるトラップの発現のための構築物を含み、前記トラップが、前記標的細胞において発現され、前記標的細胞の前記微小環境が、改変される、方法。
（項目８６）
前記微小環境の前記改変が、前記微小環境における標的分子の量の低下を含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記標的分子が、タンパク質、タンパク質因子、ケモカインおよびサイトカイン、またはこれらの組合せからなる群から選択される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記タンパク質が、免疫チェックポイント関連タンパク質である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記免疫チェックポイント関連タンパク質が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記標的分子が、ケモカインである、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記ケモカインが、ＣＸＣＬ１２である、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記構築物が、ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドが、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリングペプチドと、親和性またはトラップ領域であって、ＣＸＣＬ１２と相互作用し、その内在性受容体とそれとの相互作用を破壊する領域とを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現され、前記親和性またはトラップ領域が、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、またはＶＨおよびＶＬ融合タンパク質、または非免疫グロブリン標的結合ドメインを含む、項目８５に記載の方法。
（項目９３）
前記標的細胞が、臓器細胞である、項目８５に記載の方法。
（項目９４）
前記細胞が、肺、リンパ節、乳房、骨、前立腺、脳、肝臓、結腸直腸および膵臓からなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記トラップの前記発現が、一過性である、項目８５に記載の方法。
（項目９６）
前記微小環境の前記改変が、一過性である、項目８５に記載の方法。
（項目９７）
がんの転移を低下させる方法であって、前記がんを有する対象に、ベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、前記ベクターが、トラップの発現のための構築物を含み、前記トラップが、転移に対し感受性である組織において発現され、前記組織への前記がんの転移が、低下される、方法。
（項目９８）
前記がんが、固形がんである、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記がんが、肺がん、リンパ節がん、乳がん、骨がん、前立腺がん、脳がん、肝臓がん、結腸直腸がんおよび膵がんからなる群から選択される、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記トラップが、ＣＸＣＬ１２トラップである、項目９７に記載の方法。
（項目１０１）
前記構築物が、ＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドが、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、ＶＨおよびＶＬ融合タンパク質、または非免疫グロブリン標的結合ドメインを含み、前記ポリペプチドが、一過性発現される、項目９７に記載の方法。
（項目１０２）
ＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、ＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドであって、前記ＶＨ領域が、配列番号１７に対して９０％の同一性を有し、前記ＶＬ領域が、配列番号１８に対して９０％の同一性を有する、ポリペプチド。
（項目１０３）
前記ＶＬ領域が、配列番号１８である、項目１０２に記載のポリペプチド。
（項目１０４）
前記ＶＨ領域が、配列番号１７であり、前記ＶＬ領域が、配列番号１８である、項目１０２に記載のポリペプチド。
（項目１０５）
軽鎖または重鎖定常領域を含まない、項目１０２〜１０４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１０６）
ＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドであって、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＶＨ領域であって、前記３個のＣＤＲが、（ａ）それぞれ配列番号３〜５であり；（ｂ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号８〜１０であり；（ｃ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１３〜１５であり；または（ｄ）前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１９〜２１である、ＶＨ領域と、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＶＬ領域であって、前記ＣＤＲが、それぞれ配列番号２２、２３および２４である、ＶＬ領域とを含む、ポリペプチド。
（項目１０７）
前記３個のＣＤＲが、配列番号３、４および５である、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１０８）
前記ＶＨ領域が、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１０７に記載のポリペプチド。
（項目１０９）
前記３個のＣＤＲが、配列番号８、９および１０である、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１１０）
前記ＶＨ領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１０９に記載のポリペプチド。
（項目１１１）
前記３個のＣＤＲが、配列番号１３、１４および１５である、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１１２）
前記ＶＨ領域が、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１１１に記載のポリペプチド。
（項目１１３）
前記ＣＤＲが、配列番号１９、２０および２１である、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１１４）
前記ＶＨ領域が、配列番号１７に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１１３に記載のポリペプチド。
（項目１１５）
前記ＶＬ領域が、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１１６）
前記ＶＨ領域の前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１９、２０および２１であり、前記ＶＬ領域の前記３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号２２、２３および２４である、項目１０６に記載のポリペプチド。
（項目１１７）
軽鎖または重鎖定常領域を含まない、項目１０６〜１１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１８）
配列番号６３に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、ＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチド。
（項目１１９）
前記核酸配列が、配列番号６３である、項目１１８に記載のポリペプチド。
（項目１２０）
ＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドであって、ＣＸＣＬ１２における、配列番号６３のＤＮＡによってコードされるタンパク質と同じエピトープに結合するポリペプチド。
（項目１２１）
３個の融合ポリペプチドから形成された三量体であって、各融合ポリペプチドが、ＰＤ−１細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体が、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる、三量体。
（項目１２２）
ホモ三量体である、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２３）
ヘテロ三量体である、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２４）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２６に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２５）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２５に対して少なくとも７０％配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２６）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２６である、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２７）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２５によってコードされる、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２８）
前記ＰＤ−１細胞外ドメインが、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１２１に記載の三量体。
（項目１２９）
前記ＰＤ−１細胞外ドメインが、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択される、項目１２１に記載の三量体。
（項目１３０）
前記三量体形成ドメインが、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択される、項目１２１に記載の三量体。
（項目１３１）
前記フレキシブルリンカーが、配列番号５８、５９、６０、６１および６２からなる群から選択される、項目１２１に記載の三量体。
（項目１３２）
約１６ピコモル濃度の親和性でＰＤ−Ｌ１に結合することができる、項目１２１に記載の三量体。
（項目１３３）
３個の融合ポリペプチドから形成された三量体であって、各融合ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーおよび三量体形成ドメインを含み、前記三量体が、ＰＤ−１に結合することができる、三量体。
（項目１３４）
ホモ三量体である、項目１３３に記載の三量体。
（項目１３５）
ヘテロ三量体である、項目１３３に記載の三量体。
（項目１３６）
前記ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項目１３３に記載の三量体。
（項目１３７）
前記ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択される、項目１３３に記載の三量体。
（項目１３８）
前記三量体形成ドメインが、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選択される、項目１３３に記載の三量体。
（項目１３９）
前記フレキシブルリンカーが、配列番号５８、５９、６０、６１および６２からなる群から選択される、項目１３３に記載の三量体。
（項目１４０）
項目１０２〜１３９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸。
（項目１４１）
前記ポリペプチドが、配列番号１、６、１１または１６である、項目１４０に記載の核酸。
（項目１４２）
前記融合タンパク質が、配列番号２６である、項目１４０に記載の核酸。
（項目１４３）
項目１４０〜１４２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目１４４）
配列番号６３に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む発現ベクター。
（項目１４５）
前記核酸配列が、配列番号６３である、項目１４４に記載の発現ベクター。
図１は、正の選択のための標的としてＣ末端ビオチンを有する野生型ＣＸＣＬ１２に対するトラップの確立に使用された、ケモカインＣＸＣＬ１２の内在性タンパク質構造を描写する。（Ａ）負の選択のためのＣＸＣＲ４相互作用Ｎ末端モチーフが欠失されたＣＸＣＬ１２突然変異体の構造。（Ｂ）正および負の選択のために使用された、野生型ＣＣＬ２およびＣＣＬ５ならびにこれらの非受容体結合突然変異体の構造。（Ｃ）単一または併用療法に使用することができる、ホモ二量体、ヘテロ二量体および二特異性ケモ／サイトカイントラップの模式図。（Ｄ）三価ＰＤ−Ｌ１トラップと、三価トラップの自己集合プロセス。さらに、Ｏｃｔｅｔを使用したＰＤ−Ｌ１による三価ＰＤ−Ｌ１トラップの結合動態が、ナノ粒子系に基づく遺伝子送達に使用されたＰＤ−Ｌ１トラップのプラスミドマップと共に表示されている。 図１は、正の選択のための標的としてＣ末端ビオチンを有する野生型ＣＸＣＬ１２に対するトラップの確立に使用された、ケモカインＣＸＣＬ１２の内在性タンパク質構造を描写する。（Ａ）負の選択のためのＣＸＣＲ４相互作用Ｎ末端モチーフが欠失されたＣＸＣＬ１２突然変異体の構造。（Ｂ）正および負の選択のために使用された、野生型ＣＣＬ２およびＣＣＬ５ならびにこれらの非受容体結合突然変異体の構造。（Ｃ）単一または併用療法に使用することができる、ホモ二量体、ヘテロ二量体および二特異性ケモ／サイトカイントラップの模式図。（Ｄ）三価ＰＤ−Ｌ１トラップと、三価トラップの自己集合プロセス。さらに、Ｏｃｔｅｔを使用したＰＤ−Ｌ１による三価ＰＤ−Ｌ１トラップの結合動態が、ナノ粒子系に基づく遺伝子送達に使用されたＰＤ−Ｌ１トラップのプラスミドマップと共に表示されている。 図１は、正の選択のための標的としてＣ末端ビオチンを有する野生型ＣＸＣＬ１２に対するトラップの確立に使用された、ケモカインＣＸＣＬ１２の内在性タンパク質構造を描写する。（Ａ）負の選択のためのＣＸＣＲ４相互作用Ｎ末端モチーフが欠失されたＣＸＣＬ１２突然変異体の構造。（Ｂ）正および負の選択のために使用された、野生型ＣＣＬ２およびＣＣＬ５ならびにこれらの非受容体結合突然変異体の構造。（Ｃ）単一または併用療法に使用することができる、ホモ二量体、ヘテロ二量体および二特異性ケモ／サイトカイントラップの模式図。（Ｄ）三価ＰＤ−Ｌ１トラップと、三価トラップの自己集合プロセス。さらに、Ｏｃｔｅｔを使用したＰＤ−Ｌ１による三価ＰＤ−Ｌ１トラップの結合動態が、ナノ粒子系に基づく遺伝子送達に使用されたＰＤ−Ｌ１トラップのプラスミドマップと共に表示されている。
図２は、ＣＴ−２６ ＦＬ３細胞遊走および侵入における操作されたＣＸＣＬ１２トラップタンパク質の開発および効果を描写する。（Ａ）ｐＣＸＣＬ１２トラップＤＮＡ配列のプラスミドベクターマップ。ＣＸＣＬ１２結合ＶＨおよびＶＬドメインのコード配列を、トラップ遺伝子の集合に使用した。ＣＸＣＬ１２トラップの最終配列は、それぞれシグナリングペプチド、ＶＨドメイン、フレキシブルリンカー、ＶＬドメイン、ＥタグおよびＨｉｓ（６×）タグをコードする。完全ｃＤＮＡを、Ｎｈｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉ部位の間でｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって正確さを確認した。ＣＸＣＬ１２トラップおよびＣＸＣＬ１２の間の結合親和性は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒインターフェロメトリーを使用することによる。ＡＲ２Ｇバイオセンサー上にＣＸＣＬ１２を固定化し、異なる濃度のＣＸＣＬ１２トラップを使用して結合動態を測定し、ＣＸＣＬ１２トラップは、Ｋｄ＝４ｎＭを有することが判明した。（Ｂ）操作されたＣＸＣＬ１２トラップは、およそ１２０ｎＭの濃度において生物活性ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）に対する最大半量阻害［ＮＤ５０］を有することが判明した。ＣＸＣＬ１２トラップ（２、４、８または１２μｇ／ｍｌ；それぞれ６０、１２０、２４０または３６０ｎＭ）または陽性対照ＣＸＣＬ１２ Ａｂ（１、２または４μｇ／ｍｌ；それぞれ６、１２または２４ｎＭ）の存在または非存在下で、ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ；１０ｎＭ）により刺激されたＣＴ−２６ ＦＬ３細胞遊走の解析。（Ｃ）ＣＸＣＬ１２トラップ（４または１２μｇ／ｍｌ；１２０または３６０ｎＭ）または陽性対照ＣＸＣＬ１２ Ａｂ（４μｇ／ｍｌ；２４ｎＭ）の存在または非存在下における、ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ；１０ｎＭ）による刺激後のＣＴ−２６ ＦＬ３細胞侵入の解析。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置（ＣＸＣＬ１２または処置タンパク質なし）対照のパーセンテージとして表した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎＭ）刺激細胞（タンパク質トラップまたはＡｂ処置なし）対照と比較。ＮＳ、有意でない。
図３は、ＴＥＭおよびＤＬＳによるＬＣＰナノ粒子特徴付けを描写する。（Ａ）ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃペプチドを含有するＬＣＰコア（Ｂ）ネガティブ酢酸ウラニル染色による、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰ（Ｃ）直径４５ナノメートルおよびゼータ電位＋１０．０を生じる、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰの動的光散乱（ＤＬＳ）解析。数、体積および強度加重サイズ分布は、２つの粒子分布を図解する。小さい方の集団（ほぼ４５ｎｍ）が所望のＬＣＰ粒子であり、大きい方の集団（ほぼ３５０ｎｍ）は、過剰ＤＯＴＡＰおよびコレステロールによるものであり、これは、薄膜水和後にリポソームを形成し、ほぼ２３６±３２ｎｍのＺ−平均を生じる；ｎ＝６。（Ｄ）１０％血清溶液における経時的なＬＣＰの安定性をＤＬＳにより測定した。ＬＣＰを１０％血清溶液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。ｚ−平均増加によって示される任意のタンパク質／ＬＣＰ凝集を観察するために、２４時間にわたってｚ−平均を記録した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表した。ｚ−平均（ほぼ３０ｎｍ）は、２４時間にわたって一貫しており、ｚ−平均の有意な増加を生じず、最小のタンパク質／ＬＣＰ凝集塊形成を示す。（Ｅ）ＬＣＰに被包されるｐＣＸＣＬ１２プラスミドのベクターマップ。（Ｆ）ｐＣＸＣＬ１２遺伝子のＤＮＡ配列。 図３は、ＴＥＭおよびＤＬＳによるＬＣＰナノ粒子特徴付けを描写する。（Ａ）ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃペプチドを含有するＬＣＰコア（Ｂ）ネガティブ酢酸ウラニル染色による、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰ（Ｃ）直径４５ナノメートルおよびゼータ電位＋１０．０を生じる、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰの動的光散乱（ＤＬＳ）解析。数、体積および強度加重サイズ分布は、２つの粒子分布を図解する。小さい方の集団（ほぼ４５ｎｍ）が所望のＬＣＰ粒子であり、大きい方の集団（ほぼ３５０ｎｍ）は、過剰ＤＯＴＡＰおよびコレステロールによるものであり、これは、薄膜水和後にリポソームを形成し、ほぼ２３６±３２ｎｍのＺ−平均を生じる；ｎ＝６。（Ｄ）１０％血清溶液における経時的なＬＣＰの安定性をＤＬＳにより測定した。ＬＣＰを１０％血清溶液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。ｚ−平均増加によって示される任意のタンパク質／ＬＣＰ凝集を観察するために、２４時間にわたってｚ−平均を記録した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表した。ｚ−平均（ほぼ３０ｎｍ）は、２４時間にわたって一貫しており、ｚ−平均の有意な増加を生じず、最小のタンパク質／ＬＣＰ凝集塊形成を示す。（Ｅ）ＬＣＰに被包されるｐＣＸＣＬ１２プラスミドのベクターマップ。（Ｆ）ｐＣＸＣＬ１２遺伝子のＤＮＡ配列。 図３は、ＴＥＭおよびＤＬＳによるＬＣＰナノ粒子特徴付けを描写する。（Ａ）ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃペプチドを含有するＬＣＰコア（Ｂ）ネガティブ酢酸ウラニル染色による、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰ（Ｃ）直径４５ナノメートルおよびゼータ電位＋１０．０を生じる、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰの動的光散乱（ＤＬＳ）解析。数、体積および強度加重サイズ分布は、２つの粒子分布を図解する。小さい方の集団（ほぼ４５ｎｍ）が所望のＬＣＰ粒子であり、大きい方の集団（ほぼ３５０ｎｍ）は、過剰ＤＯＴＡＰおよびコレステロールによるものであり、これは、薄膜水和後にリポソームを形成し、ほぼ２３６±３２ｎｍのＺ−平均を生じる；ｎ＝６。（Ｄ）１０％血清溶液における経時的なＬＣＰの安定性をＤＬＳにより測定した。ＬＣＰを１０％血清溶液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。ｚ−平均増加によって示される任意のタンパク質／ＬＣＰ凝集を観察するために、２４時間にわたってｚ−平均を記録した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表した。ｚ−平均（ほぼ３０ｎｍ）は、２４時間にわたって一貫しており、ｚ−平均の有意な増加を生じず、最小のタンパク質／ＬＣＰ凝集塊形成を示す。（Ｅ）ＬＣＰに被包されるｐＣＸＣＬ１２プラスミドのベクターマップ。（Ｆ）ｐＣＸＣＬ１２遺伝子のＤＮＡ配列。 図３は、ＴＥＭおよびＤＬＳによるＬＣＰナノ粒子特徴付けを描写する。（Ａ）ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃペプチドを含有するＬＣＰコア（Ｂ）ネガティブ酢酸ウラニル染色による、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰ（Ｃ）直径４５ナノメートルおよびゼータ電位＋１０．０を生じる、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを含有する最終ガラクトース−ＬＣＰの動的光散乱（ＤＬＳ）解析。数、体積および強度加重サイズ分布は、２つの粒子分布を図解する。小さい方の集団（ほぼ４５ｎｍ）が所望のＬＣＰ粒子であり、大きい方の集団（ほぼ３５０ｎｍ）は、過剰ＤＯＴＡＰおよびコレステロールによるものであり、これは、薄膜水和後にリポソームを形成し、ほぼ２３６±３２ｎｍのＺ−平均を生じる；ｎ＝６。（Ｄ）１０％血清溶液における経時的なＬＣＰの安定性をＤＬＳにより測定した。ＬＣＰを１０％血清溶液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。ｚ−平均増加によって示される任意のタンパク質／ＬＣＰ凝集を観察するために、２４時間にわたってｚ−平均を記録した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表した。ｚ−平均（ほぼ３０ｎｍ）は、２４時間にわたって一貫しており、ｚ−平均の有意な増加を生じず、最小のタンパク質／ＬＣＰ凝集塊形成を示す。（Ｅ）ＬＣＰに被包されるｐＣＸＣＬ１２プラスミドのベクターマップ。（Ｆ）ｐＣＸＣＬ１２遺伝子のＤＮＡ配列。
図４は、１７７ＬｕがＬＣＰコアに取り込まれた、ガラクトース−ＬＣＰ−ｐＣＸＣＬ１２トラップ／ｍｃＣＲ８Ｃの薬物動態および臓器体内分布解析を描写する。尾静脈注射によって、マウスにおよそ２５０，０００カウントを投与した。（Ａ）尾静脈カットにより収集された血液試料を収集し、秤量し、放射性カウントを測定して、循環中に残る注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ）を決定した。二相分布が観察され、それぞれ２０分間および１，０５４分間のＴ１／２αおよびＴ１／２βを生じる。（Ｂ）尾静脈（vain）注射後１６時間目に（血中放射線カウントがバックグラウンドシグナルに達した時点）、ＬＣＰ体内分布／臓器蓄積を測定した。組織１グラム当たりの注射用量のおよそ４０〜５０％が、肝臓に蓄積することが判明した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表した。
図５は、内在性ＣＸＣＬ１２の生物学的捕捉および免疫細胞補充におけるその役割、ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性および肝臓特異的（specifi）発現を描写する。（Ａ）最終処置注射の１０日後に屠殺された結腸直腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル由来の肝臓組織および対照の健康な肝臓［健康（ＣＲＣなし）］のパラフィン包埋切片における内在性ＣＸＣＬ１２発現。ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）の免疫蛍光染色。健康（ＣＲＣなし）、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ対照（１０μｇを１日おき×３）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、５群を試験した。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。（Ｂ）追加的な切片を染色して、免疫抑制性抗炎症性ＭＤＳＣ［ＣＤｌｌｂ＋（緑色）／ＧＲ１＋（赤色）］およびＴｒｅｇ［ＣＤ４＋（緑色）／Ｆｏｘｐ３＋（赤色）］ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞集団（緑色）を含む、肝臓への免疫細胞の補充を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。正常および罹患した肝臓を区別するために、トリクローム染色も示されている。白色矢印は、転移性病変を示す。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。この結果は、ｐＧＦＰおよび操作されたｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性肝臓特異的発現を実証する。（Ｃ）主要なＬＣＰ蓄積臓器におけるＧＦＰ発現の顕微鏡解析。肝臓切片は、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間の一過性発現を実証する。スケールバー：２５０μｍ。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された蛍光強度として報告された。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、無処置試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。（Ｄ）Ｈｉｓ（６×）タグＥＬＩＳＡおよび（Ｅ）ウェスタンブロット解析を行って、あらゆる主要なＬＣＰ蓄積臓器および血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器分布／発現を決定した。尾静脈を経由して投与される２．０、１０．０または２０．０μｇ ｐＤＮＡから用量を漸増させた。（Ｆ）臓器のウェスタンブロット解析は、Ｈｉｓ（６×）ｍＡｂの使用によるＣＸＣＬ１２トラップ発現を示す。発現は一過性であり、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間かつ８日間以内のみ持続する。総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、ウェル／レーン当たり５０μｇの総タンパク質をロードした。タンパク質標準ラダーによって確認される通り、２８．６ｋＤａにおいてトラップタンパク質を検出し、これは、理論値と一致した。ＧＡＰＤＨが存在しない血清試料を除いて、ローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置対照と比較した倍数増加として示す。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した群のｐ値が、グラフに表示されている。 図５は、内在性ＣＸＣＬ１２の生物学的捕捉および免疫細胞補充におけるその役割、ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性および肝臓特異的（specifi）発現を描写する。（Ａ）最終処置注射の１０日後に屠殺された結腸直腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル由来の肝臓組織および対照の健康な肝臓［健康（ＣＲＣなし）］のパラフィン包埋切片における内在性ＣＸＣＬ１２発現。ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）の免疫蛍光染色。健康（ＣＲＣなし）、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ対照（１０μｇを１日おき×３）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、５群を試験した。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。（Ｂ）追加的な切片を染色して、免疫抑制性抗炎症性ＭＤＳＣ［ＣＤｌｌｂ＋（緑色）／ＧＲ１＋（赤色）］およびＴｒｅｇ［ＣＤ４＋（緑色）／Ｆｏｘｐ３＋（赤色）］ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞集団（緑色）を含む、肝臓への免疫細胞の補充を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。正常および罹患した肝臓を区別するために、トリクローム染色も示されている。白色矢印は、転移性病変を示す。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。この結果は、ｐＧＦＰおよび操作されたｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性肝臓特異的発現を実証する。（Ｃ）主要なＬＣＰ蓄積臓器におけるＧＦＰ発現の顕微鏡解析。肝臓切片は、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間の一過性発現を実証する。スケールバー：２５０μｍ。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された蛍光強度として報告された。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、無処置試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。（Ｄ）Ｈｉｓ（６×）タグＥＬＩＳＡおよび（Ｅ）ウェスタンブロット解析を行って、あらゆる主要なＬＣＰ蓄積臓器および血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器分布／発現を決定した。尾静脈を経由して投与される２．０、１０．０または２０．０μｇ ｐＤＮＡから用量を漸増させた。（Ｆ）臓器のウェスタンブロット解析は、Ｈｉｓ（６×）ｍＡｂの使用によるＣＸＣＬ１２トラップ発現を示す。発現は一過性であり、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間かつ８日間以内のみ持続する。総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、ウェル／レーン当たり５０μｇの総タンパク質をロードした。タンパク質標準ラダーによって確認される通り、２８．６ｋＤａにおいてトラップタンパク質を検出し、これは、理論値と一致した。ＧＡＰＤＨが存在しない血清試料を除いて、ローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置対照と比較した倍数増加として示す。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した群のｐ値が、グラフに表示されている。 図５は、内在性ＣＸＣＬ１２の生物学的捕捉および免疫細胞補充におけるその役割、ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性および肝臓特異的（specifi）発現を描写する。（Ａ）最終処置注射の１０日後に屠殺された結腸直腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル由来の肝臓組織および対照の健康な肝臓［健康（ＣＲＣなし）］のパラフィン包埋切片における内在性ＣＸＣＬ１２発現。ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）の免疫蛍光染色。健康（ＣＲＣなし）、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ対照（１０μｇを１日おき×３）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、５群を試験した。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。（Ｂ）追加的な切片を染色して、免疫抑制性抗炎症性ＭＤＳＣ［ＣＤｌｌｂ＋（緑色）／ＧＲ１＋（赤色）］およびＴｒｅｇ［ＣＤ４＋（緑色）／Ｆｏｘｐ３＋（赤色）］ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞集団（緑色）を含む、肝臓への免疫細胞の補充を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。正常および罹患した肝臓を区別するために、トリクローム染色も示されている。白色矢印は、転移性病変を示す。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。この結果は、ｐＧＦＰおよび操作されたｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性肝臓特異的発現を実証する。（Ｃ）主要なＬＣＰ蓄積臓器におけるＧＦＰ発現の顕微鏡解析。肝臓切片は、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間の一過性発現を実証する。スケールバー：２５０μｍ。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された蛍光強度として報告された。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、無処置試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。（Ｄ）Ｈｉｓ（６×）タグＥＬＩＳＡおよび（Ｅ）ウェスタンブロット解析を行って、あらゆる主要なＬＣＰ蓄積臓器および血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器分布／発現を決定した。尾静脈を経由して投与される２．０、１０．０または２０．０μｇ ｐＤＮＡから用量を漸増させた。（Ｆ）臓器のウェスタンブロット解析は、Ｈｉｓ（６×）ｍＡｂの使用によるＣＸＣＬ１２トラップ発現を示す。発現は一過性であり、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間かつ８日間以内のみ持続する。総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、ウェル／レーン当たり５０μｇの総タンパク質をロードした。タンパク質標準ラダーによって確認される通り、２８．６ｋＤａにおいてトラップタンパク質を検出し、これは、理論値と一致した。ＧＡＰＤＨが存在しない血清試料を除いて、ローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置対照と比較した倍数増加として示す。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した群のｐ値が、グラフに表示されている。 図５は、内在性ＣＸＣＬ１２の生物学的捕捉および免疫細胞補充におけるその役割、ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性および肝臓特異的（specifi）発現を描写する。（Ａ）最終処置注射の１０日後に屠殺された結腸直腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル由来の肝臓組織および対照の健康な肝臓［健康（ＣＲＣなし）］のパラフィン包埋切片における内在性ＣＸＣＬ１２発現。ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）の免疫蛍光染色。健康（ＣＲＣなし）、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ対照（１０μｇを１日おき×３）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、５群を試験した。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。（Ｂ）追加的な切片を染色して、免疫抑制性抗炎症性ＭＤＳＣ［ＣＤｌｌｂ＋（緑色）／ＧＲ１＋（赤色）］およびＴｒｅｇ［ＣＤ４＋（緑色）／Ｆｏｘｐ３＋（赤色）］ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞集団（緑色）を含む、肝臓への免疫細胞の補充を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。正常および罹患した肝臓を区別するために、トリクローム染色も示されている。白色矢印は、転移性病変を示す。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。この結果は、ｐＧＦＰおよび操作されたｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性肝臓特異的発現を実証する。（Ｃ）主要なＬＣＰ蓄積臓器におけるＧＦＰ発現の顕微鏡解析。肝臓切片は、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間の一過性発現を実証する。スケールバー：２５０μｍ。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された蛍光強度として報告された。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、無処置試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。（Ｄ）Ｈｉｓ（６×）タグＥＬＩＳＡおよび（Ｅ）ウェスタンブロット解析を行って、あらゆる主要なＬＣＰ蓄積臓器および血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器分布／発現を決定した。尾静脈を経由して投与される２．０、１０．０または２０．０μｇ ｐＤＮＡから用量を漸増させた。（Ｆ）臓器のウェスタンブロット解析は、Ｈｉｓ（６×）ｍＡｂの使用によるＣＸＣＬ１２トラップ発現を示す。発現は一過性であり、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間かつ８日間以内のみ持続する。総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、ウェル／レーン当たり５０μｇの総タンパク質をロードした。タンパク質標準ラダーによって確認される通り、２８．６ｋＤａにおいてトラップタンパク質を検出し、これは、理論値と一致した。ＧＡＰＤＨが存在しない血清試料を除いて、ローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置対照と比較した倍数増加として示す。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した群のｐ値が、グラフに表示されている。 図５は、内在性ＣＸＣＬ１２の生物学的捕捉および免疫細胞補充におけるその役割、ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性および肝臓特異的（specifi）発現を描写する。（Ａ）最終処置注射の１０日後に屠殺された結腸直腸がんのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル由来の肝臓組織および対照の健康な肝臓［健康（ＣＲＣなし）］のパラフィン包埋切片における内在性ＣＸＣＬ１２発現。ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）の免疫蛍光染色。健康（ＣＲＣなし）、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ対照（１０μｇを１日おき×３）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、５群を試験した。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。（Ｂ）追加的な切片を染色して、免疫抑制性抗炎症性ＭＤＳＣ［ＣＤｌｌｂ＋（緑色）／ＧＲ１＋（赤色）］およびＴｒｅｇ［ＣＤ４＋（緑色）／Ｆｏｘｐ３＋（赤色）］ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞集団（緑色）を含む、肝臓への免疫細胞の補充を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。正常および罹患した肝臓を区別するために、トリクローム染色も示されている。白色矢印は、転移性病変を示す。全データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。スケールバー：２５０μｍ。この結果は、ｐＧＦＰおよび操作されたｐＣＸＣＬ１２トラップの一過性肝臓特異的発現を実証する。（Ｃ）主要なＬＣＰ蓄積臓器におけるＧＦＰ発現の顕微鏡解析。肝臓切片は、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間の一過性発現を実証する。スケールバー：２５０μｍ。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された蛍光強度として報告された。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、無処置試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。（Ｄ）Ｈｉｓ（６×）タグＥＬＩＳＡおよび（Ｅ）ウェスタンブロット解析を行って、あらゆる主要なＬＣＰ蓄積臓器および血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器分布／発現を決定した。尾静脈を経由して投与される２．０、１０．０または２０．０μｇ ｐＤＮＡから用量を漸増させた。（Ｆ）臓器のウェスタンブロット解析は、Ｈｉｓ（６×）ｍＡｂの使用によるＣＸＣＬ１２トラップ発現を示す。発現は一過性であり、最終注射（１０μｇを１日おき×３）後少なくとも４日間かつ８日間以内のみ持続する。総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、ウェル／レーン当たり５０μｇの総タンパク質をロードした。タンパク質標準ラダーによって確認される通り、２８．６ｋＤａにおいてトラップタンパク質を検出し、これは、理論値と一致した。ＧＡＰＤＨが存在しない血清試料を除いて、ローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、無処置対照と比較した倍数増加として示す。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した群のｐ値が、グラフに表示されている。
図６は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置後の肝臓転移の発生率減少を描写する。（Ａ）マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６（ＦＬ３）ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。処置スケジュールは、上に示されている。処置、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ｐＤＮＡを、１０、１２および１４日目に尾静脈ＩＶにより投与した。群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝７）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝６）ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝７）を含んだ。全体的腫瘍量の進行は、２００μｌルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）ＩＰの投与によって追跡された。ルシフェリン投与の１０分後に、ルシフェラーゼ生物発光イメージングを記録した。マウス全体および肝臓腫瘍負荷を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｂ）無処置（ｎ＝３）および治療的ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（ｎ＝４）群の総臓器腫瘍負荷。臓器における腫瘍負荷の定量化をＩＶＩＳ／Ｋｏｄａｋソフトウェアにより行った。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｃ）パラフィン包埋した肝臓切片をトリクロームで染色した。大きな腫瘍負荷（黒色矢印によって示される）および硬変／線維症（青色染色、コラーゲン）が、ＰＢＳ（無処置）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ処置群において明らかに見られる。ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置した肝臓は、正常で健康な肝臓形態を有し、検出可能な転移性負荷がない。スケールバーは２５０μｍである。肝臓切片におけるコラーゲン定量化を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。 図６は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置後の肝臓転移の発生率減少を描写する。（Ａ）マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６（ＦＬ３）ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。処置スケジュールは、上に示されている。処置、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ｐＤＮＡを、１０、１２および１４日目に尾静脈ＩＶにより投与した。群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝７）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝６）ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝７）を含んだ。全体的腫瘍量の進行は、２００μｌルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）ＩＰの投与によって追跡された。ルシフェリン投与の１０分後に、ルシフェラーゼ生物発光イメージングを記録した。マウス全体および肝臓腫瘍負荷を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｂ）無処置（ｎ＝３）および治療的ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（ｎ＝４）群の総臓器腫瘍負荷。臓器における腫瘍負荷の定量化をＩＶＩＳ／Ｋｏｄａｋソフトウェアにより行った。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｃ）パラフィン包埋した肝臓切片をトリクロームで染色した。大きな腫瘍負荷（黒色矢印によって示される）および硬変／線維症（青色染色、コラーゲン）が、ＰＢＳ（無処置）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ処置群において明らかに見られる。ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置した肝臓は、正常で健康な肝臓形態を有し、検出可能な転移性負荷がない。スケールバーは２５０μｍである。肝臓切片におけるコラーゲン定量化を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。 図６は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置後の肝臓転移の発生率減少を描写する。（Ａ）マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６（ＦＬ３）ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。処置スケジュールは、上に示されている。処置、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ｐＤＮＡを、１０、１２および１４日目に尾静脈ＩＶにより投与した。群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝７）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝６）ならびにｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝７）を含んだ。全体的腫瘍量の進行は、２００μｌルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）ＩＰの投与によって追跡された。ルシフェリン投与の１０分後に、ルシフェラーゼ生物発光イメージングを記録した。マウス全体および肝臓腫瘍負荷を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｂ）無処置（ｎ＝３）および治療的ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（ｎ＝４）群の総臓器腫瘍負荷。臓器における腫瘍負荷の定量化をＩＶＩＳ／Ｋｏｄａｋソフトウェアにより行った。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表し、生物発光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｃ）パラフィン包埋した肝臓切片をトリクロームで染色した。大きな腫瘍負荷（黒色矢印によって示される）および硬変／線維症（青色染色、コラーゲン）が、ＰＢＳ（無処置）およびｐＧＦＰ ＬＣＰ処置群において明らかに見られる。ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置した肝臓は、正常で健康な肝臓形態を有し、検出可能な転移性負荷がない。スケールバーは２５０μｍである。肝臓切片におけるコラーゲン定量化を記録した。全データは、平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。
図７は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ治療法後の、肝臓転移の発生率減少およびＴ細胞死滅の増強を描写する。マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６（ＦＬ３）ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。処置、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ｐＤＮＡを、１０、１２および１４日目に尾静脈ＩＶにより投与した。群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝５）、ならびに８および１０日目にＩＰ（４００μｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）投与された抗Ｌｙｔ２．２またはアイソタイプＩｇＧ対照のいずれかによる、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝５）を含んだ。接種および処置スケジュール／用量ならびに２１日目の肝臓腫瘍量を上に示す。マウスに、２００μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）ルシフェリンＩＰを投与した。５分後に、マウスを安楽死させ、肝臓を摘出し、ＰＢＳにおいてすすぎ、ルシフェリンの溶液（１ｍｇ／ｍｌ）中に置いた。Ｋｏｄａｋカメラを備えるＩＶＩＳ ｋｉｎｅｔｉｃを使用して、生物発光画像を記録した。肝臓における腫瘍負荷の定量化をＩＶＩＳ／Ｋｏｄａｋソフトウェアにより行った。データは、正規化された対数変換平均±ｓ．ｅ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。ＲＯＩ＝目的の領域。
図８は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置後の、４Ｔ１（乳がん）肝臓転移の発生率減少および生存増加を描写する。（Ａ）本図は、接種および処置スケジュールおよび用量、ならびに接種７日後の生物発光シグナル検出および腫瘍負荷定量化を示す。処置群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝５）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ／抗ＣＤ８（ｎ＝５）、ｐトラップ ＬＣＰ／抗ＣＤ８（ｎ＝５）、ｐトラップ ＬＣＰ／アイソタイプＩｇＧ（ｎ＝５）を含んだ。データは、正規化された対数変換平均±ｓ．ｅ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。ＲＯＩ＝目的の領域。（Ｂ）１０日目の腫瘍負荷のフローサイトメトリー解析および定量化（１群当たりｎ＝３）。ゲーティングは、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞（Ｐ３）対非ＧＦＰ陽性細胞（Ｐ４）からなる。データは、正規化された平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｃ）全４種の処置群（１群当たりｎ＝５）を含むカプラン・マイヤー生存曲線。マウスの体重、活動性およびクオリティ・オブ・ライフを評価することにより、生存を決定した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。 図８は、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ処置後の、４Ｔ１（乳がん）肝臓転移の発生率減少および生存増加を描写する。（Ａ）本図は、接種および処置スケジュールおよび用量、ならびに接種７日後の生物発光シグナル検出および腫瘍負荷定量化を示す。処置群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝５）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ／抗ＣＤ８（ｎ＝５）、ｐトラップ ＬＣＰ／抗ＣＤ８（ｎ＝５）、ｐトラップ ＬＣＰ／アイソタイプＩｇＧ（ｎ＝５）を含んだ。データは、正規化された対数変換平均±ｓ．ｅ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。ＲＯＩ＝目的の領域。（Ｂ）１０日目の腫瘍負荷のフローサイトメトリー解析および定量化（１群当たりｎ＝３）。ゲーティングは、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞（Ｐ３）対非ＧＦＰ陽性細胞（Ｐ４）からなる。データは、正規化された平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｃ）全４種の処置群（１群当たりｎ＝５）を含むカプラン・マイヤー生存曲線。マウスの体重、活動性およびクオリティ・オブ・ライフを評価することにより、生存を決定した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。
図９は、結腸直腸がん（ＨＴ−２９）肝臓転移の発生率を低下させるための治療戦略の比較を描写する。（Ａ）上部の予定表は、接種および処置スケジュールならびにＨＴ−２９の投薬を示す。尾静脈ＩＶにより、０〜１６日目に１日おきに処置を投与した。処置群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝５）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡ；ｎ＝５）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡ；ｎ＝５）、遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇタンパク質；ｎ＝５）およびＡＭＤ３１００（１００μｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）を含んだ。（Ｂ）３６日目の腫瘍負荷解析および定量化（１群当たりｎ＝５）。腫瘍小結節の切除および秤量により、肝臓転移負荷を定量化した（ｍｇ単位）。転移性負荷による各処置群由来の肝臓の画像が示され、白色矢印は、転移性病変を示す。マウスの体重、活動性およびクオリティ・オブ・ライフを評価することにより、生存を決定した。データは、個々のデータ点と平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。
図１０は、ＬＣＰ送達による毒性の低下を描写する。（Ａ）ＰＢＳ（無処置）、１０μｇ ｐＧＦＰ ＬＣＰを１日おき×３、１０μｇ ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰを１日おき×３または遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（２０μｇを１日おき×３）による最終処置２４時間後の、ＡＬＴ、ＡＳＴ、クレアチニンおよびＢＵＮ測定値ならびに血中白血球細胞数であり、この場合、最終投与後１、７および１４日目にマウスを屠殺した。全データは、３回複製して実験した試料から平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｂ）ＰＢＳ（無処置）、１０μｇ ｐＧＦＰ ＬＣＰを１日おき×３、１０μｇ ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰを１日おき×３または遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（２０μｇを１日おき×３）による最終処置２４時間後の、異なる臓器のトリクローム組織学切片であり、この場合、最終投与後１、７および１４日目にマウスを屠殺した。全トリクローム組織学切片は、心臓、肺、脾臓、腎臓および肝臓を含むいずれの主要な臓器における毒性も示さない。スケールバー＝１００μｍ。 図１０は、ＬＣＰ送達による毒性の低下を描写する。（Ａ）ＰＢＳ（無処置）、１０μｇ ｐＧＦＰ ＬＣＰを１日おき×３、１０μｇ ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰを１日おき×３または遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（２０μｇを１日おき×３）による最終処置２４時間後の、ＡＬＴ、ＡＳＴ、クレアチニンおよびＢＵＮ測定値ならびに血中白血球細胞数であり、この場合、最終投与後１、７および１４日目にマウスを屠殺した。全データは、３回複製して実験した試料から平均±ｓ．ｄ．として表した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示する。対応する無処置対照と比較した個々の群のｐ値が、グラフに表示されている。（Ｂ）ＰＢＳ（無処置）、１０μｇ ｐＧＦＰ ＬＣＰを１日おき×３、１０μｇ ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰを１日おき×３または遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（２０μｇを１日おき×３）による最終処置２４時間後の、異なる臓器のトリクローム組織学切片であり、この場合、最終投与後１、７および１４日目にマウスを屠殺した。全トリクローム組織学切片は、心臓、肺、脾臓、腎臓および肝臓を含むいずれの主要な臓器における毒性も示さない。スケールバー＝１００μｍ。
図１１は、マウスおよびヒトがん細胞株における内在性ＣＸＣＲ４発現を評価するためのウェスタンブロット解析を描写する。ＡＴＣＣによって推奨される条件に従って細胞を培養し、溶解し、正確なタンパク質ローディングのためにＢＣＡによって正規化した。各レーンは、３０μｇの総タンパク質を受け入れた。全試料を同じゲルで泳動して、正確な曝露および相対的発現を確実にした。タンパク質標準ラダーを使用して、タンパク質を４２ｋＤａにおいて同定した。データは、３回複製して実験した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、最高強度試料［ＣＴ−２６（ＦＬ３）およびＨＴ−２９］に対する相対的強度として報告し、ＧＡＰＤＨ強度によって正規化した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、グラフにおける第１の細胞株に対する有意差を表す。
図１２は、マウス（ＣＲＣなし）の主要な臓器およびＣＲＣマウスの肝臓における内在性ＣＸＣＬ１２を描写する。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の異なる臓器における内在性ＣＸＣＬ１２発現。画像は、ＤＡＰＩ核染色（青色）と共に、ＣＸＣＬ１２（赤色）に対する免疫蛍光染色を示す。データは、少なくとも３回複製した試料から計算された平均±ｓ．ｄ．として表し、蛍光強度として報告した。Ｎ．Ｓ．は、有意差なしを表示し、Ｎ．Ｄ．は、検出限界未満を表示し、ｐ値は、肝臓試料に対する有意差を表す。スケールバー２５０μｍ。
図１３は、盲腸接種後２４日目の総マウス腫瘍負荷を描写する。マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６ Ｆ３ ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。１０μｇ ｐＤＮＡからなる処置を、１０、１２および１４日目に尾静脈ＩＶにより投与した。群は、ＰＢＳ（無処置；ｎ＝７）、ｐＧＦＰ ＤＮＡ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝６）およびｐＣＸＣＬ１２トラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３；ｎ＝７）を含んだ。腫瘍量の進行は、２００μｌルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）ＩＰの投与によって追跡された。ルシフェリン投与の１０分後にルシフェラーゼ生物発光イメージングを行った。
図１４は、（Ａ）ＬＰＤ ＮＰ（プラスミドを被包するためのベクター）のＴＥＭ画像、（Ｂ）ＫＰＣ同所性腫瘍を有するマウスにおけるＤｉＩ標識ＬＰＤ ＮＰの体内分布（注射２４時間後）、（Ｃ）肝臓および腫瘍におけるＤｉＩ分布の蛍光画像（白色数字は、臓器におけるＤｉＩを取り入れた細胞の％を示す）を描写する。ＧＦＰ ＬＰＤ ＮＰの２回の一日用量を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。肝臓および腫瘍におけるＧＦＰ発現を示す（緑色数字）。ファロイジン標識された細胞アクチン。結果は、肝臓が、ＮＰを取り入れる主要な臓器であるが、プラスミド発現が主に腫瘍中にある（ｎ＝３）ことを示唆する。（Ｄ）腫瘍内の異なる細胞集団におけるＧＦＰ発現。各細胞集団におけるＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した（白色数字）。αＳＭＡ陽性線維芽細胞およびＲＦＰ陽性腫瘍細胞は、腫瘍微小環境内の主要なＧＦＰ産生細胞である。（Ｅ）Ｈｉｓタグ標識されたトラッププラスミドの一過性発現を、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡによって定量化した。トラップの発現は、１週間以内の一過性であった。重ねて、腫瘍は、主要な産生臓器である。トラップタンパク質と比較して、プラスミド送達は、腫瘍におけるトラップ発現を延長した（ｎ＝４）。 図１４は、（Ａ）ＬＰＤ ＮＰ（プラスミドを被包するためのベクター）のＴＥＭ画像、（Ｂ）ＫＰＣ同所性腫瘍を有するマウスにおけるＤｉＩ標識ＬＰＤ ＮＰの体内分布（注射２４時間後）、（Ｃ）肝臓および腫瘍におけるＤｉＩ分布の蛍光画像（白色数字は、臓器におけるＤｉＩを取り入れた細胞の％を示す）を描写する。ＧＦＰ ＬＰＤ ＮＰの２回の一日用量を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。肝臓および腫瘍におけるＧＦＰ発現を示す（緑色数字）。ファロイジン標識された細胞アクチン。結果は、肝臓が、ＮＰを取り入れる主要な臓器であるが、プラスミド発現が主に腫瘍中にある（ｎ＝３）ことを示唆する。（Ｄ）腫瘍内の異なる細胞集団におけるＧＦＰ発現。各細胞集団におけるＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した（白色数字）。αＳＭＡ陽性線維芽細胞およびＲＦＰ陽性腫瘍細胞は、腫瘍微小環境内の主要なＧＦＰ産生細胞である。（Ｅ）Ｈｉｓタグ標識されたトラッププラスミドの一過性発現を、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡによって定量化した。トラップの発現は、１週間以内の一過性であった。重ねて、腫瘍は、主要な産生臓器である。トラップタンパク質と比較して、プラスミド送達は、腫瘍におけるトラップ発現を延長した（ｎ＝４）。 図１４は、（Ａ）ＬＰＤ ＮＰ（プラスミドを被包するためのベクター）のＴＥＭ画像、（Ｂ）ＫＰＣ同所性腫瘍を有するマウスにおけるＤｉＩ標識ＬＰＤ ＮＰの体内分布（注射２４時間後）、（Ｃ）肝臓および腫瘍におけるＤｉＩ分布の蛍光画像（白色数字は、臓器におけるＤｉＩを取り入れた細胞の％を示す）を描写する。ＧＦＰ ＬＰＤ ＮＰの２回の一日用量を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。肝臓および腫瘍におけるＧＦＰ発現を示す（緑色数字）。ファロイジン標識された細胞アクチン。結果は、肝臓が、ＮＰを取り入れる主要な臓器であるが、プラスミド発現が主に腫瘍中にある（ｎ＝３）ことを示唆する。（Ｄ）腫瘍内の異なる細胞集団におけるＧＦＰ発現。各細胞集団におけるＧＦＰ陽性細胞の％を定量化した（白色数字）。αＳＭＡ陽性線維芽細胞およびＲＦＰ陽性腫瘍細胞は、腫瘍微小環境内の主要なＧＦＰ産生細胞である。（Ｅ）Ｈｉｓタグ標識されたトラッププラスミドの一過性発現を、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡによって定量化した。トラップの発現は、１週間以内の一過性であった。重ねて、腫瘍は、主要な産生臓器である。トラップタンパク質と比較して、プラスミド送達は、腫瘍におけるトラップ発現を延長した（ｎ＝４）。
図１５は、腫瘍成長阻害および宿主生存を描写する。（Ａ）ＫＰＣ同種移植片を有するマウスにおける異なる処置の投薬スケジュールは、上部パネルに示されている。異なる処置（ｎ＝５〜７）後のＫＰＣ腫瘍のＩＶＩＳ画像は、下部パネルに示されている。（Ｂ）ＫＰＣの腫瘍阻害曲線（ｎ＝６〜１０）。（Ｃ）処置群の生存比率。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５〜８を示す。（Ｄ＆Ｅ）。低用量プラスミド処置（３０μｇ／マウス、４回、（Ｄ）および高用量プラスミド処置（５０μｇ／マウス、４回、Ｅ）によるＫＰＣを有するマウスの終了時点腫瘍重量。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。特に言及されていない場合、統計解析は、対照群との比較によって計算した。
図１６は、長期転移試験を描写する。（Ａ）異なる処置（ｎ＝４〜５）から１ヶ月後の主要な臓器におけるＫＰＣ細胞の転移。肝臓、肺および脾臓は、ＫＰＣ転移のための主要な臓器である。（Ｂ）Ｈ＆Ｅ染色は、ＰＢＳ対照群の主要な臓器における腫瘍転移の組織学を示す。マウスが併用トラップ ＮＰ（ｃｏｍｂｏ ｔｒａｐ ＮＰ）で処置された場合、転移は、有意に阻害された。青色の丸および矢印は、肺、脾臓および肝臓における転移性腫瘍成長を示す。Ｂにおけるバーは、１００μｍを表す。
図１７は、異なる処置による同所性ＫＰＣ膵がんを有するマウス由来の脾細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを描写する。（Ａ）腫瘍を有する動物から脾臓を収集した。脾細胞を、正常脾細胞（対照）、ＫＰＣ細胞、またはＲＦＰおよびルシフェラーゼマーカーを形質導入したＫＰＣ細胞由来の抽出物で再刺激した。ＩＦＮ−γを分泌した細胞は、抗ＩＦＮ−γ抗体で染色した。結果を定量化し、右のパネルに示す。ｎｓ：有意でない、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ＝４。Ｂ．異なる処置：ＰＢＳ、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ、ＰＤＬ１トラップ ＮＰおよび併用トラップ ＮＰによる、腫瘍を有する動物から脾臓を収集した。脾細胞を、ＫＰＣ ＲＦＰ／Ｌｕｃ由来の抽出物で再刺激した。ＩＦＮ−γを分泌した細胞は、抗ＩＦＮ−γ抗体で染色した。異なる処置（ｎ＝４）の間に有意差は見出されなかった。
図１８は、併用トラップ ＮＰが、腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤を容易にすることを描写する。（Ａ）異なる処置によるＫＰＣ同種移植片由来の組織切片は、ＣＤ３（緑色）、ｐ５３（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を染色し、次いでＩＦ顕微鏡法によって解析した。隣接するＨ＆Ｅ染色は、領域の間質構造物を示す。黄色点線は、正常膵臓への腫瘍細胞の侵入の縁を実証する。オレンジ色の長方形区域は、より優れた可視化のためにズームインされている。腫瘍領域は、より低い拡大率でも示されている。スケールバーは、４００μｍを示す。（Ｂ）各処置由来の５枚の代表的な画像のｉｍａｇｅ Ｊにより腫瘍領域内のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを定量化した。（Ｃ）異なる処置（ｎ＝５）後のＫＰＣ同種移植片腫瘍（腫瘍領域内）の単細胞懸濁液を、ＣＤ３およびＣＤ８の抗体で染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって定量化されている。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。ＤおよびＥ。ＫＰＣ９８０２７腫瘍を有するマウスを、ＣＤ８ ｍＡｂ（３００μｇ／マウス）の３回の毎日注射により前処置して、マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。アイソタイプｍＡｂを対照として使用した。ＣＤ８枯渇ありまたはなしのマウスにおける併用トラップ ＮＰの有効性を、イメージング（Ｄ）および定量化（Ｅ）によって比較した。 図１８は、併用トラップ ＮＰが、腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤を容易にすることを描写する。（Ａ）異なる処置によるＫＰＣ同種移植片由来の組織切片は、ＣＤ３（緑色）、ｐ５３（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を染色し、次いでＩＦ顕微鏡法によって解析した。隣接するＨ＆Ｅ染色は、領域の間質構造物を示す。黄色点線は、正常膵臓への腫瘍細胞の侵入の縁を実証する。オレンジ色の長方形区域は、より優れた可視化のためにズームインされている。腫瘍領域は、より低い拡大率でも示されている。スケールバーは、４００μｍを示す。（Ｂ）各処置由来の５枚の代表的な画像のｉｍａｇｅ Ｊにより腫瘍領域内のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを定量化した。（Ｃ）異なる処置（ｎ＝５）後のＫＰＣ同種移植片腫瘍（腫瘍領域内）の単細胞懸濁液を、ＣＤ３およびＣＤ８の抗体で染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって定量化されている。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。ＤおよびＥ。ＫＰＣ９８０２７腫瘍を有するマウスを、ＣＤ８ ｍＡｂ（３００μｇ／マウス）の３回の毎日注射により前処置して、マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。アイソタイプｍＡｂを対照として使用した。ＣＤ８枯渇ありまたはなしのマウスにおける併用トラップ ＮＰの有効性を、イメージング（Ｄ）および定量化（Ｅ）によって比較した。 図１８は、併用トラップ ＮＰが、腫瘍微小環境へのＴ細胞浸潤を容易にすることを描写する。（Ａ）異なる処置によるＫＰＣ同種移植片由来の組織切片は、ＣＤ３（緑色）、ｐ５３（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を染色し、次いでＩＦ顕微鏡法によって解析した。隣接するＨ＆Ｅ染色は、領域の間質構造物を示す。黄色点線は、正常膵臓への腫瘍細胞の侵入の縁を実証する。オレンジ色の長方形区域は、より優れた可視化のためにズームインされている。腫瘍領域は、より低い拡大率でも示されている。スケールバーは、４００μｍを示す。（Ｂ）各処置由来の５枚の代表的な画像のｉｍａｇｅ Ｊにより腫瘍領域内のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを定量化した。（Ｃ）異なる処置（ｎ＝５）後のＫＰＣ同種移植片腫瘍（腫瘍領域内）の単細胞懸濁液を、ＣＤ３およびＣＤ８の抗体で染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって定量化されている。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。ＤおよびＥ。ＫＰＣ９８０２７腫瘍を有するマウスを、ＣＤ８ ｍＡｂ（３００μｇ／マウス）の３回の毎日注射により前処置して、マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。アイソタイプｍＡｂを対照として使用した。ＣＤ８枯渇ありまたはなしのマウスにおける併用トラップ ＮＰの有効性を、イメージング（Ｄ）および定量化（Ｅ）によって比較した。
図１９は、腫瘍微小環境における腫瘍浸潤免疫細胞の変化を描写する。ＫＰＣマウス腫瘍を有するマウスを４群に分け、ＰＢＳ、ＣＸＣＬ１２トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤＬ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰまたは併用トラップ ＮＰのいずれかで処置した。処置の終わりに、マウスを安楽死させ、（Ａ）免疫染色評価および（Ｂ）フローサイトメトリーアッセイのために腫瘍組織を収集した：第１のパネルは、ＭＤＳＣ（黄色）を示し、第２のパネルは、Ｔｒｅｇ細胞（黄色）を示し、第３のパネルは、マクロファージ（赤色）を示す。白色で示す数字は、腫瘍における各細胞型の平均％を示す。Ａにおけるバーは、２００μｍを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。特に言及されていない場合、統計解析は、無処置群との比較によって計算した。 図１９は、腫瘍微小環境における腫瘍浸潤免疫細胞の変化を描写する。ＫＰＣマウス腫瘍を有するマウスを４群に分け、ＰＢＳ、ＣＸＣＬ１２トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤＬ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰまたは併用トラップ ＮＰのいずれかで処置した。処置の終わりに、マウスを安楽死させ、（Ａ）免疫染色評価および（Ｂ）フローサイトメトリーアッセイのために腫瘍組織を収集した：第１のパネルは、ＭＤＳＣ（黄色）を示し、第２のパネルは、Ｔｒｅｇ細胞（黄色）を示し、第３のパネルは、マクロファージ（赤色）を示す。白色で示す数字は、腫瘍における各細胞型の平均％を示す。Ａにおけるバーは、２００μｍを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。特に言及されていない場合、統計解析は、無処置群との比較によって計算した。
図２０は、トラッププラスミド処置後のＣＸＣＬ１２およびＰＤ−Ｌ１被覆度の変化を描写する。蛍光画像（Ａ）および定量化（Ｂ）の両方を示す（ｎ＝５）。Ａにおけるバーは、２００μｍを表す。特に言及されていない場合、統計解析は、対照群との比較によって計算した。全データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図２１は、腫瘍微小環境におけるサイトカインの変化を描写する。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、サイトカインレベルを検出した。特に言及されていない場合、統計解析は、対照群との比較によって計算した。全データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図２２は、様々な処置後の腫瘍微小環境変化を描写する。（Ａ）ＫＰＣを有するマウスを４群に分け、ＰＢＳ、ＣＸＣＬ１２トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤＬ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰまたは併用トラップ ＮＰのいずれかで処置した。処置の終わりに、マウスを安楽死させ、ＣＤ３１（緑色として示す）およびαＳＭＡ（線維芽細胞染色、赤色として示す）の二重蛍光染色のために腫瘍組織を収集した。代表的な場所（黄色点の四角）はズームインされている（黄色四角）。ＣＸＣＬ１２トラップまたは併用トラップ処置後に、血管は除圧および正常化された。黄色矢印は、正常化された血管を示す。下部パネル画像は、対応する上部パネル画像におけるボックスで囲った区域から拡大されている。上部および下部パネルにおけるバーは、それぞれ５００および１００μｍを表す。（Ｂ）αＳＭＡ被覆度、ＣＤ３１密度および正常化された血管の％は、各群の５枚の代表的な画像からＩｍａｇｅ Ｊを使用して定量化した。特に言及されていない場合、統計解析は、対照群との比較によって計算した。全データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）を示す、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図２３は、ＰＢＳまたは併用トラップ ＮＰのいずれかで処置したＫＰＣ同種移植片を有するマウス由来のそれぞれ異なる臓器および腫瘍におけるＤｉＩ標識されたＬＰＤ ＮＰの蓄積（Ａ）および分布（Ｂ）を描写する。
図２４は、それぞれＰＢＳ、ＣＸＣＬ１２トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤＬ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰおよび併用トラップ ＮＰで処置したマウス由来の腫瘍内のコラーゲン被覆度を描写する。
図２５は、５群に分けられ、２日毎に４用量のＰＢＳ、Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＣＸＣＬ１２トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤ−Ｌ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰおよび併用トラップ ＮＰで処置されたＫＰＣを有するマウスのＨ＆Ｅ形態を描写する。処置の終わりに、マウスを安楽死させ、Ｈ＆Ｅ病理染色のために主要な臓器を収集した。青色長方形は、ＰＢＳおよびＣｔｒｌ ＮＰ群の肝臓および腎臓を強調し、重度の肝臓および腎臓毒性を示す。細胞空胞化、落屑した変性細胞および巣状壊死（黄色矢印）が、これらの臓器において観察された。
詳細な説明
本明細書に開示されている通り、がん患者の生存率および処置の改善は、転移の出現の
予防または減少にかかっている。特に、結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者は、肝臓転移を発症
する傾向がある。研究により、結腸がん細胞において発現されたケモカイン受容体（ＣＸ
ＣＲ４）と、肝星細胞（ＨＳＣ）によって分泌されたケモカインリガンド（ＣＸＣＬ１２
）との間の関係性が、ＣＲＣ肝臓転移における有意な役割を果たすことが示された（Zeel
enberg I、Ruuls-Van Stalle L、Roos E.、The Chemokine Receptor CXCR4 Is
Required for Outgrowth of Colon Carcinoma Micrometastases.、Cancer Res.、
６３巻：３８３３〜３８３９頁、２００３年）。これらの肝星細胞は、炎症区域へのリン
パ球補充のために高レベルの内在性ＣＸＣＬ１２を産生することを示した常在性類洞周囲
細胞である。遊走および侵入試験は、高レベルのＣＸＣＬ１２の存在下で、結腸直腸がん
細胞（ＣＸＣＲ４陽性）が、ＣＸＣＬ１２濃度勾配を介して遊走および侵入することを示
した。ヒト結腸直腸がん試料のさらなる試験は、予後不良およびより高い率の肝臓転移が
、がん細胞における高レベルのＣＸＣＲ４発現と相関することも見出した（Zeelenberg
I、Ruuls-Van Stalle L、Roos E.、The Chemokine Receptor CXCR4 Is Required
for Outgrowth of Colon Carcinoma Micrometastases.、Cancer Res.、６３巻：
３８３３〜３８３９頁、２００３年）。本明細書に記載されている通り、将来の転移部位
（肝臓）におけるこのＣＸＣＬ１２勾配を破壊する方法（予防的に）は、結腸直腸肝臓転
移の出現を減少させることができる。
本明細書に記載されている通り、本方法は、既知の治療法の問題を回避する。小分子Ｃ
ＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００による動物の処置は、ＣＸＣＬ１２／ＣＸ
ＲＣ４軸の破壊が、結腸直腸肝臓転移の出現を減少させることができることを実証した（
Matsusue R、Kubo H、Hisamori S、Okoshi K、Takagi H、Hida K、Nakano K、Ita
mi A、Kawada K、Nagayama S、Sakai Y.、epatic stellate cells promote live
r metastasis of colon cancer cells by the action of SDF-1/CXCR4 axis.
、Ann Surg Oncol.、１６巻（９号）：２６４５〜５３頁、２００９年）。その後、多
くのＣＸＣＲ４アンタゴニストが開発された。しかし、免疫系におけるＣＸＣＬ１２およ
びＣＸＣＲ４の内在性の役割は、正常な恒常性に不可欠である。したがって、小分子およ
びタンパク質療法を含むこれらの伝統的な処置は、全身性オフターゲット毒性の懸念がつ
いてまわる。さらに、本出願人らの知る限りにおいて、ＣＸＣＬ１２を標的とする治療法
は、開発されたことがない、または転移性病変の出現を低下させると報告されたことがな
い。
本明細書に開示されている通り、肝臓への遺伝子（ＣＸＣＬ１２トラップをコード）の
送達が肝臓微小環境、例えば、その中でのタンパク質因子レベルを変更し得る、特有の抗
がん戦略を達成することができる。本明細書に記載されている方法は、微小環境の局所的
および一過性の改変をもたらし、これにより、望ましくない毒性から他の細胞を救う。こ
のような遺伝子の送達は、ＣＸＣＬ１２等の因子の濃度低下を達成することができ、結腸
直腸がん細胞の遊走／侵入に抵抗するよう肝臓をプライミングする。ＣＸＣＬ１２および
ＣＸＣＲ４の間の会合は、ＣＸＣＲ４の過剰発現が高度に転移性のヒト結腸直腸肝臓転移
病変に特徴的な肝臓転移および肝臓において発現される高レベルのＣＸＣＬ１２における
重大な役割を果たす（Shan-shan Zhang、Zhi-peng Han、Ying-ying Jingら、CD133+CX
CR4+ colon cancer cells exhibit metastatic potential and predict poor
prognosis of patients.、BMC Med.１０巻：８５頁、２０１２年）。
本明細書に記載されている主題は、いかなる特定の組織または標的細胞にも限定されな
い。本明細書に開示されている通り、微小環境を標的にすることは、特有の抗がんパラダ
イムであり、転移性病変が特異的に標的にされない代わりに、環境が、転移が形成または
進行するのに不適となるようにプライミングされ、最終的に、成長および転移の出現の減
少を可能にする。標的部分、例えば、治療用タンパク質の局所的肝臓発現のためのガラク
トース標的化部分を取り込むことにより、発現がオフターゲット臓器または血清において
見出されることなく、所望の組織を標的にすることが可能になる。このアプローチは、肝
臓に加えて多くの組織において、ＣＸＣＬ１２に加えて他のトラップと共に使用すること
ができるため、乳房、肺、リンパ節、前立腺、脳、膵臓および骨等、他の転移性組織を標
的にすることができる。
他の微小環境因子は、がん転移の遊走、侵入および増殖における役割を果たすことがで
きる。これらの因子は、炎症が誘導される場合、目的の臓器においてより顕著になる。こ
の炎症は、原発性がん由来の分泌タンパク質から患者の食事までさまざまである、多くの
異なる環境因子に関連し得る。したがって、これらの因子を標的にすることも、本明細書
に記載されている主題において企図される。したがって、高転移性組織または転移に対し
感受性である組織における因子を標的にすることは、多くの臓器における転移の出現／進
行を低下させるのに有望な治療法である。
疾患の処置における多くのアプローチの不十分な標的特異性は、診療所におけるこれら
の疾患の処置成功のための適用を限定した。さらに、多数の細胞外および細胞内障壁に起
因する遺伝子療法の弱点は、多くの疾患の臨床処置を真に妨害した。したがって、これら
の障壁を克服するために、本出願人らは、標的細胞の核への高い特異性、蓄積および送達
を伴う臨床適用のためのベクターを開発した。本明細書に記載されている主題は、以前の
治療法の問題を克服し、肝臓転移および原発性がんのみならず、ＨＢＶ、脂肪肝、肝臓硬
変およびその他多数等、多数の他の肝臓疾患を処置することができる。さらに、肝臓疾患
に加えて、アデノシンアナログ等、異なる標的部分を取り込むことにより、肺上皮細胞に
おける高度に発現されたアデノシンＡ２Ｂ受容体を標的にすることは、転移に対し感受性
である他の組織における役割を果たす、ＣＸＣＬ１２または他の微小環境因子に対するｐ
ＤＮＡトラップ等のトラップを蓄積および送達するようにベクターをプライミングする。
したがって、本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、肺、リンパ節、乳
房、骨その他等、高い転移率を有することが知られている多数の組織の微小環境因子をプ
ライミングすることができる。
別の種類の治療が困難ながんは、その強い免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）のために
免疫療法に対し抵抗性であることが知られる膵腫瘍である。ＣＸＣＬ１２およびＰＤ−Ｌ
１は、抑制性ＴＭＥを制御する２種の分子である。これら２種の分子の一方に高い親和性
で（それぞれＫｄ＝４ｎＭおよび１６ｐＭ）結合する、本明細書において１つの種類のト
ラップとも称される融合タンパク質を製造し、標的との特異的結合に関して検査した。各
トラップをコードするプラスミドＤＮＡをＬＰＤナノ粒子中に製剤化し、ＫＰＣ同所性膵
がんを有するマウスにＩＶ注射した。トラップの発現は、主に腫瘍において、２番目に肝
臓において為される。併用トラップ療法は、腫瘍を縮め、宿主生存を５７％有意に延長し
た。どちらかのトラップ単独は、部分的な治療効果しか生じなかった。本出願人らは、Ｃ
ＸＣＬ１２トラップが、腫瘍へのＴ細胞浸透を可能にし、ＰＤ−Ｌ１トラップが、浸潤さ
れたＴ細胞に腫瘍細胞を死滅させたことも見出した。併用トラップ療法はまた、他の臓器
への腫瘍細胞の転移を有意に低下させた。肝臓および腎臓を含む全ての主要な臓器におい
て、毒性は見られなかった。したがって、併用トラップ療法は、抑制性ＴＭＥを有意に改
変して、宿主免疫系に腫瘍細胞を死滅させた。
次に、現在開示されている主題について、より十分に以後に記載する。しかし、本明細
書に表記されている現在開示されている主題の多くの改変および他の実施形態が、前述に
示されている教示の利益を有する現在開示されている主題が属する技術分野の当業者に想
定され得る。したがって、現在開示されている主題が、開示されている特異的な実施形態
に限定されるべきではないこと、また、改変および他の実施形態が、添付の特許請求の範
囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。言い換えると、本明細書に記載さ
れている主題は、あらゆる代替物、改変および均等物を網羅する。定義された用語、用語
使用、記載されている技法その他が挙げられるがこれらに限定されない、組み込まれた文
献、特許および同様の材料のうち１種または複数が、本願とは異なるまたはこれと矛盾す
る場合、本願が優先される。他に定義されなければ、本明細書に使用されているあらゆる
技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する
。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、こ
れらの全体を参照により本明細書に組み込む。
Ｉ．定義
用語「微小環境」は、標的細胞およびその隣接する環境を指す。
用語「構築物」は、標的組織または細胞において発現されるべき核酸配列等の遺伝子材
料の人工的に構築されたセグメントを指す。これは、遺伝子挿入物を含有することができ
、任意の必要なプロモーター等もベクター中に存在し得る。
用語「感受性」は、その微小環境のため、ある特定の種類のがんが、当該組織または細
胞において成長または転移する傾向がある組織または細胞を指す。非限定例として、結腸
直腸がんは、肝臓細胞の微小環境の結果として、肝臓において転移および成長する傾向が
ある。他のがんは、身体における特定の組織および細胞に転移することが知られている。
別の非限定例では、乳がんは、肝臓、脳および領域性リンパ節および骨において転移する
傾向がある。よって、これらの組織および細胞は、本明細書で使用されるように感受性で
ある。
本明細書で使用する場合、「転移の低下」は、感受性組織および細胞への転移の阻害ま
たは低減を指す。転移の低下を決定する多数の方法を使用することができる。非限定例と
して、転移することが典型的に知られ、転移することが予想されるある種のがんを有する
対象であって、処置後に転移を殆どまたは全く示さない対象は、転移の低下を示し得る。
特に、本明細書に記載されている主題は、肝臓へのいずれかのがんの転移の低下を提供す
る。
本明細書で使用する場合、用語「トラップ」は、微小環境における標的分子に結合、阻
害またはその生物活性を低下させる発現産物を指す。トラップは、トラップのサブクロー
ニングおよび発現に必要な材料をそれぞれ含む、ウイルス、非ウイルス、ナノ粒子等の合
成その他であり得るベクターによって送達される。トラップは、リポソームまたは単球お
よび幹細胞を含む生細胞によって送達されてもよい。阻害は、１、５、１０、１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０も
しくは９５％またはそれよりも多い、例えばＫｄによって、または標的の活性の低下を示
すことにより測定することができる。トラップは、多くの事例では、本明細書に記載され
ている主題を考慮して、本技術分野で公知の通り、捕捉可能なタンパク質である、所望の
標的分子に対して働くように設計される。
用語「一過性」は、永続的でない効果を指す。
用語「対象」は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、
ウサギ、ラット、マウスその他が挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物等の動物
を指す。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。実施形態では、対象は、がんま
たは肝臓疾患等の疾患と診断されている。
用語「処置する」および「処置」は、治療的処置および予防的または予防上の対策の両
方を指し、その目標は、がんの発症または伝播等、望まれない生理的変化または障害を予
防または減速（低減）することである。本開示の目的のため、有益なまたは所望の臨床結
果として、検出可能であれ検出不能であれ、症状の軽減、疾患の程度の縮小、安定化され
た（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患進行を遅延または遅らせること、疾患状態の
寛解または緩和、および緩解（部分的であれ完全であれ）が挙げられるがこれらに限定さ
れない。「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存と比較した、生存の延長を意
味することもできる。処置を必要とする者は、状態または障害を既に有する者、および状
態もしくは障害を有する傾向がある者、または状態もしくは障害が予防されるべき者を含
む。
語句「治療有効量」は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を処置もしくは予防する
、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害の１種もしくは複数の症状を減弱、寛解もしく
は排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載されている特定の疾患、状態もしくは障害
の１種もしくは複数の症状の発病を予防もしくは遅延させる、トラップの量を意味する。
がんの場合、治療有効量は、がん細胞の数を低下させることができる；腫瘍サイズを低下
させることができる；末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害（すなわち、ある程度遅らせ、好
ましくは停止）することができる；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度遅らせ、好まし
くは停止）することができる；腫瘍成長をある程度阻害することができる；および／また
はがんに関連する症状のうち１種もしくは複数をある程度和らげることができる。
用語「がん」は、調節されていない細胞成長によって典型的に特徴付けられる、哺乳動
物における生理的状態を指すまたは記載する。「腫瘍」は、１種または複数のがん性細胞
を含む。
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたは他の面で望ましくないことのない
塩を表示する。薬学的に許容される塩は、酸および塩基付加塩の両方を含む。語句「薬学
的に許容される」は、物質または組成物が、製剤を構成する他の成分と、および／または
それにより処置されている哺乳動物と、化学的および／または毒物学的に適合性でなけれ
ばならないことを示す。
本明細書において使用する場合、用語「送達」は、生理的部位、組織または細胞への物
質または分子（例えば、ポリヌクレオチド）の移動を指す。この用語は、細胞の細胞内部
分へのまたは細胞外空間への送達を包含する。細胞の細胞内部分へのポリヌクレオチドの
送達は、「トランスフェクション」と称されることも多い。
本明細書において使用する場合、用語「細胞内」または「細胞内に」は、本技術分野で
理解されるその通常の意味を有する。一般に、膜に取り囲まれた細胞の内側の空間は、「
細胞内」空間として定義される。同様に、本明細書において使用する場合、用語「細胞外
」または「細胞外に」は、本技術分野で理解されるその通常の意味を有する。一般に、細
胞膜の外側の空間は、「細胞外」空間として定義される。
線維芽細胞は、動物組織のための構造的枠組み（間質）である、細胞外マトリックスお
よびコラーゲンを合成する細胞である。線維芽細胞の主な機能は、細胞外マトリックスの
前駆体を連続的に分泌することにより、結合組織の構造的統合性を維持することである。
実施形態では、線維芽細胞は、本明細書に記載されているベクターのための間質標的であ
る。
本明細書において次の略語を使用することができる。いくつかの略語は、本文書の文中
に現れる箇所で定義されている。
ＡＬＴ アラニンアミノトランスフェラーゼ
ＡＳＴ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＢＬＩ Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒインターフェロメトリー
ＢＵＮ 血中尿素窒素
ＣＭＶ サイトメガロウイルス
ＣＲＣ 結腸直腸がん
ＤＬＳ 動的光散乱
ＤＡＰＩ ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＤＯＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＴＡＰ １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン
ＤＳＰＥ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールア
ミン
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＬＣＰ 脂質リン酸カルシウム
ｍｃ 単環式
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＫ 薬物動態
ｐトラップ ガラクトース−ＰＥＧ−ＬＣＰ ｗ／ｐＣＸＣＬ１２トラップ／ｍｃ−ＣＲ
８Ｃ
ＴＥＭ 透過型電子顕微鏡法
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域（本明細書において、それぞれ「軽鎖可変ドメ
イン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも称さ
れる）は、３個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断される「フレームワ
ーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のための
ＣＤＲの整列に役立つ。ＣＤＲは、主に抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を含む
。アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＶＬおよびＶＨドメインは両者共に、次の
フレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ領域を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２
、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２および３は、本明細書に
おいて、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３とも称される；ＶＨド
メインのＣＤＲ１、２および３は、本明細書において、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−
Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３とも称される。
各ＶＬおよびＶＨドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＣＤＲのいずれか従来の定義に
従う。従来の定義は、Ｋａｂａｔ定義（Kabat、Sequences of Proteins of Immunolo
gical Interest（National Institutes of Health、Bethesda、MD、１９８７年およ
び１９９１年）、Ｃｈｏｔｈｉａ定義（ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol.１９６巻：
９０１〜９１７頁、１９８７年；Chothiaら、Nature ３４２巻：８７８〜８８３頁、１
９８９年）；ＣＤＲ−Ｈ１がＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲの複合である、Ｃ
ｈｏｔｈｉａ Ｋａｂａｔ ＣＤＲの複合；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの抗体モ
デリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義；ならびにＭａｒｔｉｎらの接触定
義（bioinfo.org.uk/abs）を含む（表１を参照）。Ｋａｂａｔは、広く使用されているナ
ンバリングの慣例（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供し、異なる重鎖間または異なる軽鎖
間の対応する残基が、同じ番号を割り当てられる。抗体が、ＣＤＲのある特定の定義（例
えば、Ｋａｂａｔ）によるＣＤＲを含むと言われる場合、この定義は、抗体に存在する最
小数のＣＤＲ残基を指定する（すなわち、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）。これは、別の従来のＣ
ＤＲ定義内に収まるが指定された定義の外側にある他の残基も存在することを除外しない
。例えば、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲを含む抗体は、いくつかある可能性の中
でもとりわけ、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ残基を含有し、他のＣＤＲ残基を含有しな
い抗体と、ＣＤＲ Ｈ１が、複合Ｃｈｏｔｈｉａ−Ｋａｂａｔ ＣＤＲ Ｈ１であり、他
のＣＤＲが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ残基を含有し、他の定義に基づく追加的なＣＤＲ残基を
含有しない抗体とを含む。
Figure 2021105060
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原における部位を指す。エピトープは、連続
アミノ酸、または１個もしくは複数のタンパク質の三次フォールディングによって並置さ
れた非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープ（直鎖状
エピトープとしても公知）は典型的に、変性溶媒への曝露に際して保持される一方、三次
フォールディングによって形成されたエピトープ（立体構造エピトープとしても公知）は
典型的に、変性溶媒による処置の際に失われる。エピトープは典型的に、特有の空間的立
体構造において、少なくとも３、より通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を
含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法は、例えば、ｘ線結晶学および２次元
核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols、Methods in Molecular B
iology内、６６巻、Glenn E. Morris編（１９９６年）を参照されたい。エピトープは
、直鎖状となることができる。エピトープは、立体構造エピトープとなることもできる。
用語「１つの（a）」または「１つの（an）」を冠する実体が、当該実体の１個または複
数を指すことに留意されたい。例えば、「カチオン性脂質（a cationic lipid）」は、
１個または複数のカチオン性脂質を表すものと理解される。したがって、用語「１つの（
a）」（または「１つの（an）」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、
本明細書において互換的に使用することができる。
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「を含む（comprise）」、「を含む（co
mprises）」および「を含んでいる（comprising）」は、文脈がそれ以外を要求する場合
を除いて、非排他的な意味で使用されている。
本明細書において使用する場合、用語「約」は、ある値を参照する場合、指定された量
から、一部の実施形態では、±５０％、一部の実施形態では、±２０％、一部の実施形態
では、±１０％、一部の実施形態では、±５％、一部の実施形態では、±１％、一部の実
施形態では、±０．５％、一部の実施形態では、±０．１％の変動を包含し、このような
変動が、開示されている方法を実施するのに、または開示されている組成物を用いるのに
適切となるようなものであることを意味する。
追加的な定義を下に表記する。
ＩＩ．方法
ある実施形態では、本主題は、標的細胞の微小環境を改変する方法であって、対象にベ
クターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターが、標的細胞におけるトラ
ップの発現のための構築物を含み、トラップが、標的細胞において発現され、標的細胞の
微小環境が、改変される、方法を対象とする。
本明細書に記載されている通り、トラップの発現は、標的細胞の微小環境を改変するた
めの、有効量の発現されたトラップの存在をもたらす。
標的細胞の微小環境の改変は、微小環境において正常に存在する標的分子の量の低下を
含む。本明細書において使用する場合、量の低下は、トラップの非存在下における量と比
較した、標的分子の量の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、
５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれよりも多い低減を
指す。
有用な標的分子は、酵素、ケモカイン、サイトカイン、タンパク質因子およびこれらの
組合せ等、タンパク質を含む。適した標的は、下表２における標的を含む。
Figure 2021105060
特に有用な標的分子は、ＣＸＣＬ１２である。他のタンパク質因子は、ＥＧＦ、ニュー
レグリン、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲおよびＮＲＰ−１、Ａｎｇ１およびＡ
ｎｇ２、ＰＤＧＦ（ＢＢ−ホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ、ＴＧＦ−β、エンドグリンお
よびＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、ヒスタミン、インテグリンα２β１、αＶβ３、α
Ｖβ５、αＶβ６、α６β４およびα５β１、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１、エフリ
ン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１、ｅＮ
ＯＳおよびＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１／ＩＤ３、ＬＯＸならびにＨＩＦを含む。
阻害性および遮断性トラップならびにそれらの標的：巨大分子標的のための阻害性トラ
ップは、目的の標的に特異的に結合し、さらにはその生物学的機能を阻害または遮断する
タンパク質分子となり得るトラップを含む。阻害性または遮断性トラップの標的は、サイ
トカイン／ケモカインおよびそれらの対応する受容体であり得、そのようなものとして、
ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１（およ
びＩＬ受容体）、ＴＮＦ−アルファ（およびＴＮＦ−アルファ受容体）、ＴＧＦ−ベータ
（およびＴＧＦ−ベータ受容体）、ＣＳＦ−１（およびＣＳＦ−１受容体）、ＣＸＣＲ１
およびそのリガンド（ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８）、ＣＸＣＲ２およびそのリ
ガンド（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７お
よびＣＸＣＬ８）、ＣＸＣＲ３およびそのリガンド（ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ
１０、ＣＸＣＬ１１）、ＣＸＣＲ４およびそのリガンド（ＣＸＣＬ１２）、ＣＸＣＲ５お
よびそのリガンド（ＣＸＣＬ１３）、ＣＸ３ＣＲ１およびそのリガンド（ＣＸ３ＣＬ１）
、ＣＣＲ１およびそのリガンド（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、
ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２３）、ＣＣＲ２
およびそのリガンド（ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１
６）、ＣＣＲ３およびそのリガンド（ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣ
Ｌ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２８）、ＣＣＲ４およびそのリガ
ンド（ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２）、ＣＣＲ５およびそのリガンド（ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、
ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１６）、ＣＣＲ６およびそのリガンド（ＣＣＬ
２０）、ＣＣＲ７およびそのリガンド（ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１）、ＣＣＲ９およびその
リガンド（ＣＣＬ２５）、ＣＣＲ１０およびそのリガンド（ＣＣＬ２７およびＣＣＬ２８
）、ＡＣＫＲ３およびそのリガンド（ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２）、ＡＣＫＲ６およびその
リガンド（ＣＣＬ１８）が挙げられるがこれらに限定されない。
阻害性トラップの標的は、免疫チェックポイント関連タンパク質であり得、そのような
ものとして、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７
６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０またはＴＮＦＲＳＦ１４）、Ｂ
ＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＴＩＭ−３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲ、ＬＡＧ−３、Ｋ
ＩＲおよびＭＨＣクラスＩまたはＩＩが挙げられるがこれらに限定されない。
標的は、阻害性捕捉によるその上方または下方調節が、アミノ酸（すなわち、トリプト
ファン、アルギニン、システイン、グルタミンおよびフェニルアラニン）の異化（ＩＤＯ
、ＴＤＯ、ＡＲＧ１／２による）、アデノシン（ＣＤ３９、ＣＤ７３による、また、アデ
ノシン受容体により媒介される）、プロスタグランジンＥ２（ＣＯＸ２による）、活性酸
素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）（ｉＮＯＳによる）の生成に関与する、ＩＤ
Ｏ、ＴＤＯ、アルギナーゼ−１／２、アデノシン受容体、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＯＸ２
、ＥＰ受容体およびｉＮＯＳの発現を抑制またはその生物活性を低下し得る標的も含む（
これら全て、ＴＭＥの免疫抑制をもたらす）。
小分子代謝物のための阻害性トラップ：阻害性トラップの標的は、小分子でもあり得、
そのようなものとして、トリプトファン代謝物（すなわち、ＩＤＯまたはＴＤＯによって
産生され、アリール炭化水素受容体を介してシグナル伝達するキヌレニン）、Ｔ細胞の阻
害、免疫抑制性細胞の補充および／または増大ならびに結果的に免疫抑制性腫瘍微小環境
において重大な意味を持つ役割を果たすｃＡＭＰおよびアデノシンが挙げられるがこれら
に限定されない。
刺激性トラップおよびその標的：トラップは、刺激性（simulative）でもあり得、免疫
チェックポイント標的ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７また
はＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３
５７またはＴＮＦＲＳＦ１８）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）およびＣＤ４０（ＴＮＦＲ
ＳＦ５）においてアゴニスト的に作用するものを含む。刺激性トラップは、上述の受容体
のリガンドのアゴニスト効果を保有または模倣するものでもあり得、そのようなものとし
て、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡまたはＧｉ
２４）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２またはＣＤ２７５）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ｏ
Ｘ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ
１５４）が挙げられるがこれらに限定されない。アゴニストトラップのための標的は、Ｔ
細胞の活性化において重大な意味を持つ役割を果たす、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８お
よびＴＬＲ９が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかのｔｏｌｌ様受容体も含む
。トラップは、抗体様ドメインまたは断片に基づき得る。ケモ／サイトカイントラップの
局所的および一過性発現が、所望の生物活性および低い毒性をもたらすことが見出された
。標的結合生物製剤の大部分は、長い半減期を有する全長モノクローナル抗体に頼る。実
際に、本出願人らのｉｎ ｖｉｖｏデータにおいて実証される通り、ＣＸＣＬ１２トラッ
プの全身性および延長された投与は、一過性肝臓損傷および低下した白血球細胞数をもた
らすことができる。加えて、大きいサイズ、複雑な構造および精巧な翻訳後修飾のため、
全長抗体は、ケモ／サイトカイントラップとして役立つ際に、いくつかの固有の不利益を
有し、そのようなものとして、ＴＭＥにアクセスするための組織浸透における非効率、受
容体結合の破壊等の標的捕捉特性を操作および最適化することの困難、高い安定性、二特
異性（必要であれば）およびＦｃ誘導性の副作用が挙げられる。課題に取り組むための本
出願人らの戦略は、免疫グロブリンＶＨドメイン、免疫グロブリンＶＬドメイン、ＶＨお
よびＶＬ融合タンパク質、ｓｃＦＶ、抗体の結合および／またはフレームワーク領域に由
来するペプチドまたはタンパク質、非免疫グロブリン足場に基づくシングルドメイン抗体
模倣物等の非免疫グロブリン標的結合ドメイン（ＦＮドメインに基づくモノボディ（mono
body）、Ｚドメインに基づくアフィボディ（affibody）、ＤＡＲＰＩＮ等）を単独でおよ
びいずれかの組合せで挙げられるがこれらに限定されない、小さなタンパク質ドメインに
基づくタンパク質ライブラリーから、所望の特色を有する新規捕捉分子を開発することで
ある。
いくつかの公知の標的結合抗体は、本研究に記載されている局所的および一過性遺伝子
送達アプローチのためのトラップとして役立つように変更および操作することができる。
天然の受容体（単数または複数）と有効に競合するために、トラップは、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏタンパク質選択において広く使用されているファージディスプレイ、細胞表面ディスプ
レイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ等、タンパ
ク質／ペプチドディスプレイおよび選択技術を使用して目的の標的との相互作用において
利用することができる、表面ループまたは残基における高い多様性を有するタンパク質ま
たは抗体断片ライブラリーからの有向性タンパク質選択により達成する可能性がより高い
特性である、受容体結合部位に対し非常に高い結合特異性および親和性を保有するべきで
ある。
本明細書に記載されている通り、ある特定の重要なケモ／サイトカイン、例えば、肝臓
へのＣＸＣＲ４陽性結腸直腸がん細胞の遊走／侵入における中枢的役割の遂行に関係づけ
られてきたケモカインであるＣＸＣＬ１２によって媒介されるシグナリング経路の局所的
および一過性遮断は、ＣＲＣ転移を有意に予防することができる。本出願人らはまず、プ
ロテアーゼ抵抗性フレキシブルリンカーを介してＶＨおよびＶＬドメインを融合すること
により、抗ＣＸＣＬ１２抗体配列に基づきＣＸＣＬ１２トラップ遺伝子を操作した。発現
後に肝臓の肝細胞からの効率的分泌を達成するために、強いシグナルペプチドがＮ末端に
取り込まれた一方で、タンパク質精製および検出を容易にするための親和性タグがＣ末端
に導入された。その結果得られるＣＸＣＬ１２トラップのコード配列を、ＣＭＶプロモー
ターによって駆動される発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１にクローニングした。２９３Ｔ細
胞において発現され、これから精製された、その結果得られるＣＸＣＬ１２トラップは、
ＣＸＣＬ１２と４ｎＭのＫｄを有する（図２Ａ）一方、それとＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８お
よびＣＸＣＬ１０との結合は検出不能であったことが判明した。このＣＸＣＬ１２トラッ
プは、ＣＸＣＬ１２により刺激されたＣＴ−２６ ＦＬ３細胞の遊走および侵入を大いに
抑制した（図２Ｂ〜Ｃ）。脂質リン酸カルシウム（ＬＣＰ）ナノ粒子に基づく遺伝子送達
系を使用して、このＣＸＣＬ１２トラップの局所的および一過性発現を検査した（図５）
。下に詳述する通り、ＬＣＰにおいて製剤化されたｐＣＸＣＬ１２−トラップ ｐＤＮＡ
による３種の処置は、ＣＴ２６−ＦＬ３結腸直腸肝臓転移のいかなる出現もほぼ完全に消
散し、他の臓器へのがん伝播の徴候はなかった（図６）。
はるかにより高い効力を有するＣＸＣＬ１２トラップを生成するために、本出願人らは
、ＶＨドメインライブラリーに基づくＣＸＣＬ１２トラップを開発した。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏタンパク質選択を容易にするために、本出願人らは、Ｃ末端ビオチンタグを含有する野
生型組換えＣＸＣＬ１２（ｗｔＣＸＣＬ１２−ビオチン、図１Ａ）、およびＣＸＣＲ４結
合に関係づけられるＮ末端８残基（図１Ａにおいてシアンで強調）が欠失されたＣＸＣＬ
１２突然変異体（ΔＣＸＣＬ１２、図１Ａ）を発現および精製した。ｗｔＣＸＣＬ１２−
ビオチンは、正の選択のための標的として使用した一方、ΔＣＸＣＬ１２は、競合的洗浄
により所望でない部位に結合する配列を除去するために使用した。ＣＣＬ２およびＣＣＬ
５に関して図１Ｂに図解されている通り、同様の戦略を使用して、他のケモカインに対す
るシングルドメイントラップを開発した。
簡潔に説明すると、ストレプトアビジン−アガロースカラムにより予め清澄化された、
ディスプレイされているＶＨドメインライブラリーを、ジスルフィド結合の形成を容易に
する結合バッファーにおいて適切な量のビオチン化ｗｔＣＸＣＬ１２と共にインキュベー
トした。混合物を室温で１時間インキュベートし、続いて予洗したストレプトアビジンア
ガロースビーズを添加して、ＶＨ配列を捕捉した。その結果得られるビーズをまず、結合
バッファーで洗浄して、非特異的に結合した配列を除去し、続いて、大過剰のΔＣＸＣＬ
１２により競合的洗浄を行って、ＣＸＣＲ４結合Ｎ末端から離れた部位においてＣＸＣＬ
１２に結合したＶＨ配列を除去した。新たな選択ラウンドのために濃縮プールを再生した
。大規模な競合的洗浄を行って、非常に遅いオフレートでＮ末端ＣＸＣＬ１２に結合する
配列の濃縮を容易にした。５ラウンドの選択後に、本出願人らは、ｗｔＣＸＣＬ１２に緊
密にかつ特異的に結合するが、ΔＣＸＣＬ１２には結合しない、６種のＶＨ配列の同定に
成功した。図１Ａに示す通り、これらの配列は、非常に遅いオフレートを有し、ｗｔＣＸ
ＣＬ１２結合親和性は、低ナノモル濃度からピコモル濃度の範囲内である。
相乗的ケモ／サイトカイン捕捉効果を有する二価トラップ
ケモカインは、生理的条件下で単量体および二量体として存在し、説得力のある証拠は
、両方の形態が、ｉｎ ｖｉｖｏ機能を調節することを示唆する。ケモカイン二量体形成
が、立体構造的準安定状態の分布を撹乱し、次いでこれが、様々な下流シグナリング経路
の活性化に差次的に影響を与えることが仮定された。ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ
２、ＣＣＲ５およびＩＬ−６は全て、二量体またはオリゴマー構造をとって、それらの対
形成する受容体と相互作用することが報告された。
一般に、ＣＸＣケモカインは、球状構造を形成する第１のβ−ストランドおよびα−ヘ
リックスを使用して二量体形成し、二量体界面は、受容体結合Ｎ末端およびＮループ領域
から離れて位置づけられる。ＣＣケモカインは、そのＮループ残基を使用して二量体形成
し、拡張された構造を形成するため、その二量体形成および受容体結合ドメインは重複す
る。例えば、ＣＸＣＬ１２は、生理的条件下で、細胞シグナリングおよび機能に別個の効
果を保有する単量体および二量体の両方を形成する（Ray P ２０１２年、ＰＭＩＤ２２
１４２１９４）。単量体ＣＸＣＬ１２は、ＧαｉおよびＡｋｔを介してＣＸＣＲ４シグナ
リングを優先的に活性化するが、二量体型は、ＣＸＣＲ４へのβ−アレスチン２の補充お
よびＣＸＣＲ４発現がん細胞の走化性をより有効に促進する。有意には、二量体ＣＸＣＬ
１２は、ＣＸＣＲ７よりもＣＸＣＲ４に優先的に結合する。これらの知見は、二量体ＣＸ
ＣＬ１２の捕捉が、ＣＸＣＲ４媒介性シグナリング経路をより有効に遮断することができ
ることを示す。ホモ二量体またはヘテロ二量体トラップは、遺伝子融合により容易に生成
することができる（図１Ｃ）。ホモ二量体ケモ／サイトカイントラップを生成するために
、各シングルドメイントラップは、組換え融合タンパク質として、フレキシブルリンカー
を介してそれ自身と遺伝子的に融合することができる。同様に、２個の特有の部位におい
て目的のケモカインに結合するヘテロ二量体トラップは、同様の親和性で非重複部位に結
合する２種のトラップを使用して生成することができる。
２種の異なるケモ／サイトカインによって媒介されるシグナリングを遮断する二特異性ト
ラップ
腫瘍転移およびＴＭＥ免疫抑制に関与するケモカインネットワークの冗長性は、１種よ
り多くのシグナリング経路に作用する捕捉療法が、より有効になる筈であることを示す。
２種の異なるケモ／サイトカインによって媒介されるシグナリング経路を同時に遮断する
ことができる二特異性トラップは、長さを調整できるフレキシブルリンカーを介して特有
の特異性を有する２種のトラップを遺伝子的に連結することにより生成することができる
（図１Ｃ）。
非常に強力な標的捕捉効率を有する三価ＰＤ−Ｌ１トラップ
目的の標的に結合する高品質リガンドを開発する最も有効な方法の１つは、ほぼ全ての
種類の抗体および多数の多量体相互作用タンパク質において観察される通り、標的結合ド
メインをその多価型に変換することによる。免疫原性の可能性を最小化するために、マウ
ス、ヒトもしくは他の生物における豊富な細胞外タンパク質由来の高度に安定した三量体
形成ドメイン、またはこのようなタンパク質に基づく三量体形成ドメインを、局所的およ
び一過性遺伝子送達目的のための三価トラップの生成に使用することができる。本出願人
らは、ヒトＣＭＰ−１由来の三量体形成ドメインを使用することを選んだ。マウスまたは
ヒトＣＭＰ−１のＣ末端内の強い疎水性およびイオン性相互作用は、高い安定性を有する
平行した、ジスルフィド結合した、桿状の三量体構造をもたらす。本出願人らは、三量体
形成ドメインと遺伝子的に融合することにより、その三価型へと、内在性タンパク質（Ｐ
Ｄ−Ｌ１、ＰＤ−１等）由来の標的結合ドメインを、またはタンパク質選択由来の親和性
ドメインを手軽に変換し、高い安定性および有意に増強されたアビディティーを有する三
価トラップをもたらすことを可能にする頑強な技術基盤を開発した。典型的には、低ナノ
モル濃度からピコモル濃度の結合親和性で目的の標的に結合する三価トラップは、１，０
００倍弱い単量体ドメインから容易に生成することができる。この三量体形成ドメインの
マウス配列は、ヒトＣＭＰ−１のものと高度に相同であり、トランスレーショナルな適用
が望まれる場合、ヒトバージョンへとスイッチすることを容易にする。三量体トラップは
、３個の同一単量体の自己集合により形成されるため、単量体をコードするｃＤＮＡのみ
を必要とし、これは、送達されるべき遺伝子をはるかにより短くし、送達をより容易にす
る。この戦略を使用して、本出願人らは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−１のマウスまたは
ヒト細胞外ドメインを、マウスおよびヒト軟骨において非常に豊富な安定した三量体形成
ドメインと遺伝子的に融合することにより、強力なＰＤ−Ｌ１トラップを開発した（図１
Ｄ）。その結果得られる三価タンパク質は、約１６ピコモル濃度におけるＫｄでＰＤ−Ｌ
１に結合し、これは、内在性ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の間のものよりも１０，０００倍
高かった（図１Ｄ）。さらに、膵がんの免疫適格性ＫＰＣモデルにおいて、この三量体ト
ラップをコードするプラスミドＤＮＡ（図１５）は、ＣＸＣＬ１２に対するトラップと共
に使用された場合に、ＮＰのＩＶ投与後に腫瘍縮小を効率的に誘導した。
別の実施形態では、３個の融合ポリペプチドから形成された三量体であって、各融合ポ
リペプチドが、ＰＤ−１細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーおよび三量体形成ドメイ
ンを含み、前記三量体は、ＰＤ−Ｌ１に結合することができ、融合ポリペプチドが、配列
番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、三量体が
提供される。
実施形態では、有用なトラップは、受容体を含む。サイトカイン受容体は、構造的に関
連するファミリーにおいて存在し、サイトカイン媒介性の連絡を容易にする高親和性分子
シグナリング複合体を含む。Ｉ型サイトカイン受容体は、その細胞外アミノ酸ドメインに
ある特定の保存されたモチーフを有し、固有のタンパク質チロシンキナーゼ活性を欠く。
このファミリーは、ＩＬ２（ベータ−サブユニット）、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６
、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＬＩＦ、
ＣＮＴＦの受容体を含み、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、プロラクチンおよび成長ホルモ
ンの受容体も含む。Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーは、３つの異なる型の受容体シグ
ナリング構成成分（ｇｐ１３０、共通ベータおよび共通ガンマ−ＩＬ２受容体のガンマ鎖
）の１つと複合体を形成するファミリーメンバーの能力に基づいて３種のサブセットへと
細分される。
ＩＩ型サイトカイン受容体は、異種サブユニットで構成された多量体の受容体であり、
主にインターフェロンの受容体である。このファミリーは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−
ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ１０、ＩＬ２２および組織因子の受容体を含む。ＩＩ型サ
イトカイン受容体の細胞外ドメインは、そのリガンド結合ドメインにおける構造的類似性
を共有する。いくつかの保存された細胞内配列モチーフについて記載されており、これら
はおそらく、細胞内エフェクタータンパク質ＪＡＫおよびＳＴＡＴタンパク質のための結
合部位として機能する。
ケモカイン受容体は、７回膜貫通構造を有するＧタンパク質共役型受容体であり、シグ
ナル伝達のためにＧタンパク質と共役する。ケモカイン受容体は、異なるファミリーへと
分けられる：ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容
体およびＸＣケモカイン受容体（ＸＣＲ１）。
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーは、細長い分子を作製する、ＣＸ
ＸＣＸＸＣのコアモチーフを囲む３個のジスルフィド結合でできたシステイン−リッチド
メイン（ＣＲＤ）を共有する。ＴＮＦＲは、アダプタータンパク質（ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤ
Ｄ等）を介してプロカスパーゼと会合し、これは、他の不活性プロカスパーゼを切断し、
カスパーゼカスケードを誘発し、細胞をアポトーシスへと不可逆的にコミットすることが
できる。
ＴＧＦ−ベータ受容体は、１回貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体である。ＴＧ
Ｆ−ベータ受容体は、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２およびＴＧＦＢＲ３を含み、これらは
、その構造的および機能的特性によって区別することができる。
本方法は、全身投与を含むが、微小環境における効果が一般に、標的細胞内にまたはそ
の周りに隔離されているという点において、本方法は、局所的に作用する。これは、本明
細書の他の箇所に記載されている通り、ベクターに標的化リガンドを取り込むことにより
達成することができる。
本方法は、また、一過性である。すなわち、本方法の効果は、約三（３）日間またはそ
れ未満持続する。実施形態では、効果は、約２０時間またはそれ未満持続する。実施形態
では、効果は、約１６時間またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約１２時間
またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約１０時間またはそれ未満持続する。
実施形態では、効果は、約８時間またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約６
時間またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約４時間またはそれ未満持続する
。実施形態では、効果は、約３時間またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約
３時間またはそれ未満持続する。実施形態では、効果は、約１時間またはそれ未満持続す
る。
別の実施形態では、本主題は、がんの転移を低下させる方法であって、がんを患う対象
に、ベクターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターが、トラップを含み
、トラップが、転移に対し感受性である組織に送達され、次いでそこで発現され、そこか
ら放出され、組織へのがんの転移が低下される、方法を対象とする。
本実施形態では、本方法は、上述のあらゆる改変を含む。
その上、本方法は、本明細書の他の箇所に記載されている通り、がんにおいて特に有用
である。
転移の低下は、完全阻害からのものであり得る、すなわち、検出不能から、がんおよび
／または腫瘍の種類および攻撃性を考慮した予想よりも低い転移レベルまでであり得る。
このような種類および腫瘍は、当業者にとって公知である。対照または比較対象よりも低
い転移を示すデータも、本明細書に記載されている方法を証明する。低下は、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８
０、８５、９０、９５％またはそれよりも多くからであり得る。
別の実施形態では、本主題は、がんを処置する方法であって、がんを患う対象に、ベク
ターを含む組成物を全身投与するステップを含み、ベクターが、トラップを含む、方法を
対象とする。
別の実施形態では、本主題は、がんを処置する方法であって、がんを患う対象に、組合
せを全身投与するステップを含み、組合せが、少なくとも２種のベクターを含み、ベクタ
ーの１種が、サイトカイン／ケモカインのためのトラップを含み、別のベクターが、がん
に関連する標的のためのトラップを含む、方法を対象とする。特定の態様では、組合せは
、ＣＸＣＬ１２ケモカインのためのトラップおよびＰＤ−Ｌ１のためのトラップを含み、
がんは、膵管腺癌等の膵がんである。別の態様では、組合せは、ＣＸＣＬ１２ケモカイン
のためのトラップおよびＰＤ−１のためのトラップを含み、がんは、膵管腺癌等の膵がん
である。別の実施形態では、組合せは、ＣＸＣＬ１２トラップとＰＤ−１トラップ、ＣＸ
ＣＬ１２トラップとＰＤ−Ｌ１トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＰＤ−Ｌ２トラップ、
ＣＸＣＬ１２トラップとアゴニストＣＤ２７トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとアゴニス
トＣＤ２８トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとアゴニストＩＣＯＳトラップ、ＣＸＣＬ１
２トラップとアゴニストＣＤ４０トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとアゴニストＯＸ４０
トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとアゴニストＣＤ１３７トラップ、ＣＸＣＬ１２トラッ
プとＩＤＯトラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＴＤＯトラップ、ＣＸＣＬ１２トラップと
ＡＲＧ１トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＮＯＳトラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＴ
ＧＦ−ベータトラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＢ７−Ｈ３トラップ、ＣＸＣＬ１２トラ
ップとＢ７−Ｈ４トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＣＴＬＡ４トラップ、ＣＸＣＬ１２
トラップとＨＶＥＭトラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＢＴＬＡトラップ、ＣＸＣＬ１２
トラップとＬＡＧ３トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＫＩＲトラップ、ＣＸＣＬ１２ト
ラップとＴＩＭ３トラップ、ＣＸＣＬ１２トラップとＧＡＬ９トラップ、ＣＸＣＬ１２ト
ラップとＡ２ａＲトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＲ１トラップ、
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＲ２トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１ト
ラップとＣＸＣＲ４トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＲ５トラップ
、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＲ７トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１
トラップとＣＣＲ２トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＲ４トラップ、
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＲ５トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラ
ップとＣＣＲ７トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＲ９トラップ、ＰＤ
−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＬ１トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラッ
プとＣＸＣＬ８トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＸＣＬ１０トラップ、
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＬ２トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラ
ップとＣＣＬ５トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＬ２２トラップ、Ｐ
Ｄ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＩＬ−６トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラッ
プとＩＬ−１０トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＴＧＦ−ベータトラップ
、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＳＦ１トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１ト
ラップとＢ７−Ｈ３トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＢ７−Ｈ４トラップ
、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＴＬＡ４トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１
トラップとＨＶＥＭトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＢＴＬＡトラップ、
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＬＡＧ３トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラ
ップとＫＩＲトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＴＩＭ３トラップ、ＰＤ−
１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＧＡＬ９トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップと
Ａ２ａＲトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＣＣＲ４トラップ、ＰＤ−１ま
たはＰＤ−Ｌ１トラップとＩＤＯ−１トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＴ
ＤＯトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＡＲＧ１トラップ、ＰＤ−１または
ＰＤ−Ｌ１トラップとＮＯＳトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとＰＩ３Ｋト
ラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとアゴニストＣＤ２７トラップ、ＰＤ−１ま
たはＰＤ−Ｌ１トラップとアゴニストＣＤ２８トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラ
ップとアゴニストＩＣＯＳトラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとアゴニストＣ
Ｄ４０トラップ、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとアゴニストＯＸ４０トラップ、お
よびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１トラップとアゴニストＣＤ１３７トラップを含む。
別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、抗ヒトＣＸＣＬ１２抗体由来のＶＨ領域
を含む。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、抗ヒトＣＸＣＬ１２抗体由来のＶ
Ｌ領域を含む。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、抗ヒトＣＸＣＬ１２抗体由
来のＶＨおよびＶＬ領域を含む融合タンパク質を含む。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２
トラップは、ＦＮドメインに基づくモノボディ、Ｚドメインに基づくアフィボディおよび
ＤＡＲＰＩＮが挙げられるがこれらに限定されない、抗体を模倣する非免疫グロブリンド
メインを含む。
別の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（Acession No.）
ＡＡＨ３９８９３（配列番号６４）またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ４９９９９（配
列番号６５）に表記されている。別の実施形態では、ヒトＣＸＣＬ１２の核酸配列は、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８０２７８２（配列番号６６）に表記されている。
別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、ＶＨ領域を含み、前記ＶＨ領域は、配列
番号２、７、１２および１７からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、配列番号１７に対して少なくとも少なく
とも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ領域と
、配列番号１８に対して少なくとも少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％の同一性を有するＶＬ領域とを含む。
別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、ＶＨ領域から本質的になり、ＶＨ領域は
、配列番号１７の対応するＶＨ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有する。別の実
施形態（emobodiment）では、ＣＸＣＬ１２トラップは、ＶＬ領域から本質的になり、Ｖ
Ｌ領域は、配列番号１８の対応するＶＬ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有する
。
別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２トラップは、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有す
るＶＨ領域であって、３個のＣＤＲが（ａ）、それぞれ配列番号３〜５であり；（ｂ）３
個のＣＤＲが、それぞれ配列番号８〜１０であり；（ｃ）３個のＣＤＲが、それぞれ配列
番号１３〜１５であり；または（ｄ）３個のＣＤＲが、それぞれ配列番号１９〜２１であ
る、ＶＨ領域と、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＶＬ領域であって、ＣＤＲが
、それぞれ配列番号２２、２３および２４である、ＶＬ領域とを含む。
別の実施形態では、配列番号６３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する核酸配列によ
ってコードされるＣＸＣＬ１２に結合することができるポリペプチドが提供される。
膵管腺癌は、毎年世界的に３３０，０００名を死亡させる生死にかかわる疾患である（
American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2012、Atlanta: America
n Cancer Society；２０１２年、２５〜６頁）。５年生存率は、僅か約１２％である。
この疾患は、化学療法および放射線療法に対し抵抗性であることが公知である。これは、
チェックポイントインヒビターに対しても抵抗性である。９０％を超えるＰＤＡＣが、Ｋ
Ｒａｓが突然変異しており、大部分は、ｐ５３遺伝子に追加的な突然変異も含有する。Ｋ
Ｒａｓおよびｐ５３突然変異の両方を含有する遺伝的に改変されたマウスモデル、すなわ
ち、臨床疾患を密接に模倣するＰＤＡＣを自発的に発症する、ＫＰＣマウスが開発された
。本出願人らは、同一遺伝子Ｃ５７ＢＬ６マウスの膵尾部において同所性に接種された、
ＫＰＣ９８０２７と呼ばれるＫＰＣ腫瘍に由来する細胞株を使用した。腫瘍細胞株は、レ
ンチウイルスベクターを使用して、ルシフェラーゼおよび赤色蛍光タンパク質を安定して
形質導入された。
腫瘍は、チェックポイントインヒビターを含む免疫療法に対し抵抗性であるため、本出
願人らは、抑制性免疫ＴＭＥが、腫瘍における重要な分子を標的とするトラップタンパク
質を局所的に発現させることにより改変され得ると仮定した。Ｆｅｉｇらの研究から、Ｃ
ＸＣＬ１２が、Ｔ細胞を腫瘍に浸潤させない重要なケモカインであると思われる（Feigら
、Targeing CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts syn
ergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer、PNAS、２０１３
年１２月１０日；１１０巻（５０号）：２０２１２〜７頁）。腫瘍において局所的に発現
されたＣＸＣＬ１２トラップは、この問題を軽減する筈である。ＫＰＣ腫瘍は、免疫系に
おけるチェックポイントであるＰＤ−Ｌ１を過剰発現する。腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１
の過剰発現は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸相互作用によるＴ細胞の死滅をもたらすであろう
。よって、本出願人らは、遺伝子療法により腫瘍に両方のトラップを送達することを決断
した。十分に確立された脂質−プロタミン−ＤＮＡ（ＬＰＤ）ナノ粒子（ＮＰ）を使用し
て、トラップをコードするプラスミドＤＮＡを腫瘍に送達した。
組合せは、相乗的であり得る。用語「相乗的」は、本明細書において使用する場合、２
種またはそれよりも多い単一治療剤の相加的効果よりも有効な、治療的組合せを指す。例
えば、サイトカイントラップおよびＰＤ−Ｌ１トラップの間の相乗的相互作用の決定は、
本明細書に記載されているアッセイから得られる結果に基づくことができる。例えば、本
明細書に開示されているｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。これらのアッセイ
の結果は、組合せ指数を得るためのＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアによるＣｈｏｕおよび
Ｔａｌａｌａｙの組合せ方法および用量効果解析を使用して解析することができる（Chou
およびTalalay、１９８４年、Adv. Enzyme Regul.２２巻：２７〜５５頁）。提供され
ている組合せは、１種または複数のアッセイ系において評価することができ、データは、
抗がん剤の間の相乗性、相加性（additivism）およびアンタゴニズムを定量化するための
標準プログラムを利用して解析することができる。例としてのプログラムは、Chouおよび
Talalay、New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy内、Academic Pres
s、１９８７年、第２章によって記載されているプログラムである。０．８未満の組合せ
指数値は、相乗作用を示し、１．２を超える値は、アンタゴニズムを示し、０．８〜１．
２の間の値は、相加的効果を示す。併用療法は、「相乗作用」をもたらし、「相乗的」、
すなわち、共に使用された活性薬剤が、化合物の別々の使用に起因する効果の和を超えた
場合に達成される効果であると立証することができる。活性薬剤が、（１）同時製剤化さ
れ、組み合わせた単位投薬量製剤において同時に投与もしくは送達される場合；（２）別
々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）いくつかの他のレ
ジメンによる場合、相乗的効果が達成され得る。交互の治療法において送達される場合、
化合物が、逐次に、例えば、別々のシリンジにおける異なる注射によって投与または送達
されると、相乗的効果が達成され得る。一般に、交互の治療法の間に、各活性薬剤の有効
投薬量は、逐次に、すなわち、連続的に投与される一方、併用療法では、２種またはそれ
よりも多い活性薬剤の有効投薬量は、共に投与される。組合せ効果は、ＢＬＩＳＳ独立モ
デルおよび最高単剤（ＨＳＡ）モデルの両方を使用して評価することができる（Leharら
、Molecular Systems Biology、３巻：８０頁（２００７年））。ＢＬＩＳＳスコアは
、単剤からの増強作用の程度を定量化し、正のＢＬＩＳＳスコア（０を超える）は、単純
な相加性を超えるものを示唆する。２５０を超える累積的な正のＢＬＩＳＳスコアは、検
査した濃度範囲内で観察される強い相乗作用とみなされる。ＨＳＡスコア（０を超える）
は、対応する濃度における単剤応答の最大を超える組合せ効果を示唆する。
本明細書に記載されている特異的な実施形態は、次のものを含む：
１．標的細胞の微小環境を改変する方法であって、対象にベクターを含む組成物を全身投
与するステップを含み、ベクターが、標的細胞におけるトラップの発現のための構築物を
含み、トラップが、標的細胞において発現され、標的細胞の微小環境が、改変される、方
法。
２．微小環境の改変が、微小環境における標的分子の量の低下を含む、実施形態１に記載
の方法。
３．標的分子が、タンパク質、タンパク質因子、ケモカインおよびサイトカインまたはこ
れらの組合せからなる群から選択される、実施形態１〜２に記載の方法。
４．標的分子が、ケモカインである、実施形態１〜３に記載の方法。
５．ケモカインが、ＣＸＣＬ１２である、実施形態１〜４に記載の方法。
６．構築物が、目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜５に記載の方法。
７．トラップが、ＣＸＣＬ１２トラップである、実施形態１〜６に記載の方法。
８．標的細胞が、臓器細胞である、実施形態１〜７に記載の方法。
９．細胞が、肝臓、肺、脳および乳房からなる群から選択される、実施形態１〜８に記載
の方法。
１０．トラップの発現が一過性である、実施形態１〜９に記載の方法。
１１．微小環境の改変が一過性である、実施形態１〜１０に記載の方法。
１２．がんの転移を低下させる方法であって、がんを有する対象に、ベクターを含む組成
物を全身投与するステップを含み、ベクターが、トラップの発現のための構築物を含み、
トラップが、転移に対し感受性である組織において発現され、組織へのがんの転移が低下
される、方法。
１３．がんが、固形がんである、実施形態１２に記載の方法。
１４．がんが、肺がん、リンパ節がん、乳がん、骨がんおよび結腸直腸がんからなる群か
ら選択される、実施形態１２〜１３に記載の方法。
１５．がんが、ＣＲＣであり、組織が、肝臓組織である、実施形態１２〜１４に記載の方
法。
１６．構築物が、目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１２〜１５に記載の方法。
１７．トラップが、ＣＸＣＬ１２トラップである、実施形態１２〜１６に記載の方法。
本方法は、疾患の処置における大部分のアプローチの不十分な標的特異性を克服する。
さらに、多数の細胞外および細胞内障壁による遺伝子療法の弱点が、多くの疾患の臨床処
置を真に妨害した。したがって、これらの障壁を克服するために、肝臓の肝細胞の核等、
標的細胞への高い特異性、蓄積および送達による臨床適用における使用を見出すことがで
きるベクターが本明細書に開示されている。ある実施形態では、このベクターは、ｐＤＮ
Ａを核送達することができる高度に再生産可能な非ウイルスベクターを生じる。本明細書
に記載されているＬＣＰベクターは、ＣＭＶプロモーター、細胞外シグナリングペプチド
、トラップタンパク質、標的部分および核浸透ペプチドを容易に取り込む能力を提供する
。
ベクターは、リポソームであり得る。リポソームは、水性となり得るコアを取り囲む脂
質二重層を含む自己集合する実質的に球状の小胞であり、脂質二重層は、親水性頭部およ
び疎水性尾部を有する両親媒性脂質を含み、両親媒性脂質分子の親水性頭部は、コアまた
は周囲の溶液へと配向される一方、疎水性尾部は、二重層の内部へと配向する。これによ
り、脂質二重層構造は、「内葉」および「外葉」と称される、２個の対向する単層を含み
、疎水性尾部は、周囲の培地との接触から遮蔽される。「内葉」は、親水性頭部がリポソ
ームのコアへと配向された単層である。「外葉」は、両親媒性脂質を含む単層であり、そ
の親水性頭部は、リポソームの外表面へと配向されている。リポソームは典型的に、約２
５ｎｍ〜約１μｍに及ぶ直径を有する（例えば、Shah（編）（１９９８年）Micelles, M
icroemulsions, and Monolayers: Science and Technology、Marcel Dekker；Jano
ff（編）（１９９８年）Liposomes: Rational Design、Marcel Dekkerを参照）。用語
「リポソーム」は、水相の層と交互に現れる２〜数百個の程度の同心円状脂質二重層で構
成された多重膜リポソームと、単一の脂質二重層で構成された単層膜小胞の両方を包含す
る。
リポソーム（ＬＣＰおよびＬＤＰ型）を作製するための方法は、本技術分野で周知であ
り、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４２
０９。リポソーム調製の方法論の総説は、これらのそれぞれが、その全体を参照により本
明細書に組み込む、Liposome Technology（CFC Press NY １９８４年）；Liposomes
by Ostro（Marcel Dekker、１９８７年）；LichtenbergおよびBarenholz（１９８８
年）Methods Biochem Anal.３３巻：３３７〜４６２頁および米国特許第５，２８３，
１８５号に見出すことができる。例えば、カチオン性脂質および任意選択で共脂質（co-l
ipid）は、ホモジナイザーの使用により乳化し、凍結乾燥し、融解して、多重膜リポソー
ムを得ることができる。あるいは、単層膜リポソームは、逆相蒸発方法によって産生する
ことができる（その全体を参照により本明細書に組み込むSzokaおよびPapahadjopoulos（
１９７８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７５巻：４１９４〜４１９８頁）。一部
の実施形態では、リポソームは、薄膜水分補給を使用して産生される（その全体を参照に
より本明細書に組み込むBanghamら（１９６５年）J. Mol. Biol.１３巻：２３８〜２５
２頁）。ある特定の実施形態では、リポソーム製剤は、サイズ分類（sizing）に先立ち、
短時間超音波処理し、５０℃で短い期間（例えば、約１０分間）インキュベートすること
ができる（その全体を参照により本明細書に組み込むTempletonら（１９９７年）Nature
Biotechnology １５巻：６４７〜６５２頁を参照）。
一部の実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されている通り、標的化リポソームま
たはペグ化リポソームが作製され、この方法は、リポソームの調製後に、またはリポソー
ムの産生後に、後挿入ステップをさらに含み、脂質−標的化リガンドコンジュゲートまた
はペグ化脂質が、リポソームへと後挿入される。脂質−標的化リガンドコンジュゲートま
たは脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含むリポソームは、本明細書に示す技法が挙げられる
がこれらに限定されない、本技術分野で公知の技法に従って調製することができる（その
全体を参照により本明細書に組み込む実験セクション；Ishidaら（１９９９年）FEBS Le
tt.４６０巻：１２９〜１３３頁；Perouzelら（２００３年）Bioconjug. Chem.１４巻：
８８４〜８９８頁を参照）。後挿入ステップは、脂質−標的化リガンドコンジュゲートま
たは脂質−ＰＥＧコンジュゲートとリポソームを混合するサブステップと、粒子を約５０
℃〜約６０℃で短期間（例えば、約５分間、約１０分間）インキュベートするサブステッ
プとを含むことができる。一部の実施形態では、リポソームは、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏ
ｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、
約１２ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約１６ｍｏｌ％、
約１７ｍｏｌ％、約１８ｍｏｌ％、約１９ｍｏｌ％および約２０ｍｏｌ％が挙げられるが
これらに限定されない、約５〜約２０ｍｏｌ％の濃度の脂質−ＰＥＧコンジュゲートまた
は脂質−ＰＥＧ標的化リガンドコンジュゲートと共にインキュベートされて、ステルス送
達系を形成する。これらの実施形態の一部では、脂質−ＰＥＧコンジュゲートの濃度は、
約１０ｍｏｌ％である。脂質−ＰＥＧコンジュゲートのポリエチレングリコール部分は、
約１００ｇ／ｍｏｌ、約２００ｇ／ｍｏｌ、約３００ｇ／ｍｏｌ、約４００ｇ／ｍｏｌ、
約５００ｇ／ｍｏｌ、約６００ｇ／ｍｏｌ、約７００ｇ／ｍｏｌ、約８００ｇ／ｍｏｌ、
約９００ｇ／ｍｏｌ、約１０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ、約１０，０００ｇ
／ｍｏｌ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌおよび約２０，０００ｇ／ｍｏｌが挙げられるがこ
れらに限定されない、約１００〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌに及ぶ分子量を有することが
できる。ある特定の実施形態では、脂質−ＰＥＧコンジュゲートは、約２０００ｇ／ｍｏ
ｌの分子量を有するＰＥＧ分子を含む。一部の実施形態では、脂質−ＰＥＧコンジュゲー
トは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む。脂質−ＰＥＧ標的化リガンドコンジュゲートは
、上述の後挿入方法を使用してリポソームへと後挿入することもできる。
ある実施形態では、リポソームは、ＣＸＣＬ１２／ＰＤ−Ｌ１併用トラップ療法のため
に２種の代わりにただ１種の組成物の投与を可能にする、切断可能２Ａペプチドを介して
連結されたＣＸＣＬ１２トラップおよびＰＤ−１トラップ融合タンパク質をコードするベ
クターを含有する。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧへのコンジュゲーションによる標的ガラクトース部分の取り込みは、
肝臓の肝細胞において高度に発現されるアシアロ糖タンパク質受容体による肝細胞におけ
る活性な取り入れを可能にする。ＤＯＴＡＰおよび酸感応性リン酸カルシウムコアの使用
は、細胞質へと放出される、凝縮したｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃ構造のエンドソームエス
ケープを可能にする。さらに、膜浸透カチオン性ｍｃ−ＣＲ８ＣペプチドによるｐＤＮＡ
の凝縮は、改善された核取り入れおよび放出を可能にする。ｐＤＮＡ内へのＣＭＶプロモ
ーターの取り込みは、高い肝臓発現を可能にする。
本明細書に記載されている通り、これらの部分の取り込みにより、所望の標的にされた
細胞型において高い治療レベルの発現を生じる理にかなって設計されたベクターが提供さ
れる。このｐトラップ ＬＣＰベクターは、結腸直腸肝臓転移の出現の有意な減少をもた
らし（８０％）、肝臓内に見出される腫瘍負荷も有意に減少させる（１０分の１）。増加
したレベルのＣＸＣＬ１２トラップおよび減少したレベルの遊離ＣＸＣＬ１２タンパク質
が、用量依存性様式で肝臓に見出され、また、免疫細胞（ＣＤ８＋）補充の低下が見出さ
れ、ｐトラップ ＬＣＰ処置の生物学的に特異的な効果を実証する。
よって、本明細書において、ガラクトース−ＬＣＰベクターにおけるｐＤＮＡの送達が
、オフターゲット効果の徴候を示さず、３回の注射ＱＯＤの後に、免疫応答は最小から皆
無であることが示されている。これらの試験において、ｐＣＸＣＬ１２トラップのＣ末端
に取り込まれたＨｉｓタグは、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによる発現
レベルの決定に必要であった。しかし、さらなる臨床適用のため、Ｈｉｓタグは必要でな
い場合がある。これは、中和抗体の誘導等、いずれかの免疫応答の回避に役立つであろう
。
さらに、８日間以内持続する、この小さな（ほぼ２８ｋＤ）ＣＸＣＬ１２トラップの一
過性発現を有する能力は、治療有効性を依然として達成しつつ、免疫応答を限定するため
に、発現のレベルおよび時間を緊密に制御／モニターする能力を臨床医に与える。
Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒインターフェロメトリー（ＢＬＩ）による操作されたＣＸＣＬ１２
トラップ（タンパク質）の親和性および産生、ならびに遊走および侵入のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ抑制が本明細書に開示されている（図２）。操作されたＣＸＣＬ１２トラップは、ＢＬ
Ｉ解析によりＫｄ＝４ｎＭを有することが判明した（図２Ａ）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでの生物活性ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）に対する最大半量阻害［ＮＤ５０］の
産生は、およそ１２０ｎＭの濃度（図２Ｂ）。内在性ＣＸＣＬ１２ケモカインによるＣＴ
−２６細胞の処置が、遊走／侵入／増殖経路の上方調節を生じることも報告された。した
がって、本出願人らは、内在性ＣＸＣＬ１２で刺激されたＣＴ−２６ ＦＬ３細胞の遊走
および侵入を抑制する、本出願人らのＣＸＣＬ１２トラップおよび市販のＣＸＣＬ１２抗
体（Ａｂ）の能力を調べた（図２Ｂおよび２Ｃ）。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、そ
れぞれ８．０μｇ／ｍｌおよび１２．０μｇ／ｍｌにおいて完全抑制を生じる、ＣＸＣＬ
１２（１００．０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＣＴ−２６ ＦＬ３細胞の遊走および侵入を
減少させるＣＸＣＬ１２トラップの能力を実証する（図２Ｂおよび２Ｃ）。市販の抗体（
２〜４ｕｇ／ｍｌのＮＤ５０；１２〜２４ｎＭ）も対照として使用した。
有用なｉｎ ｖｉｖｏ ｐＤＮＡ用量（単一注射当たり０．５ｍｇ／ｋｇ）は、ｉｎ
ｖｉｖｏ発現を有すると以前に示された用量よりも実質的に低い。さらに、これは、治療
量のｐＤＮＡが、肝臓傷害をもたらし臨床的に適用不能である侵襲的水力学的注射の使用
による以外の、非ウイルスベクターによる肝臓への送達に成功した最初の事例である。こ
のような送達は、理にかなって設計されたＬＣＰベクターの使用に起因し得る。
２０１３年に、Ｈｕらは、肝臓における高レベルのルシフェラーゼ発現を誘発するため
のこのベクターの使用を初めて報告した（Hu, Y.ら、A Highly Efficient Synthetic
Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nuclei in Vivo.
ACS Nano、２０１３年、７巻（６号）：５３７６〜５３８４頁）。さらに、この発現レ
ベルは、非ウイルスベクターにより得られる最高であり、水力学的注射技法のみに劣る。
Ｈｕらは、このＧａｌ−ＬＣＰベクターによるＣｙ−３標識されたｐＤＮＡの送達が、静
脈内尾静脈注射６時間後に肝細胞の核において優先的に蓄積したことを見出した（Hu, Y
.ら、A Highly Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DN
A to Hepatocyte Nuclei in Vivo.ACS Nano、２０１３年、７巻（６号）：５３７
６〜５３８４頁）。放射標識されたＧａｌ−ＬＣＰ−ｐＤＮＡ／ｍｃＣＲ８Ｃベクターの
臓器分布は、マウス肝臓における顕著な取り込みを実証した。さらに、肝臓へのＣＸＣＬ
１２トラップの送達により、本出願人らは、治療効果が、肝臓微小環境に存在する遊離Ｃ
ＸＣＬ１２の減少によるものであったことを明らかに実証する（図５Ａ）。この治療法は
、肝臓腫瘍負荷の減少を生じ、これはその後、無処置罹患肝臓と比較して肝臓炎症を減少
させた。
無処置群は、より高レベルのＣＸＣＬ１２を産生し、肝臓転移蓄積にさらに役立った。
したがって、このＧａｌ−ＬＣＰ−ｐＤＮＡ／ｍｃＣＲ８Ｃベクターによる結腸直腸患者
の予防的処置は、肝臓における炎症の減少に役立つことができ、これは、肝臓ＣＸＣＬ１
２発現および肝臓転移進行において重大な意味を持つ役割を果たす。
このベクターの使用により、肝臓疾患の処置等、いくつかの適用および治療法を実施す
ることができる。本明細書において、このベクターが、肝臓の肝細胞へと高レベルの治療
用ｐＤＮＡを送達する能力を有することが示されている。したがって、肝臓転移および原
発性がんのみならず、ＨＢＶ、脂肪肝、肝臓硬変およびその他多く等の多数の他の肝臓疾
患も処置する能力が、本明細書に提供される。肝臓疾患に加えて、肺上皮細胞における高
度に発現されるアデノシンＡ２Ｂ受容体を標的とする、アデノシンアナログ等、異なる標
的部分の取り込みは、ＣＸＣＬ１２または他の高度に転移性の組織における役割を果たす
ことが知られている他の微小環境因子に対するｐＤＮＡトラップを蓄積および送達するよ
うに、このベクターをプライミングし得る。このような戦略は、肺、リンパ節、乳房およ
び骨等、高い転移率を有することが公知である多数の組織の微小環境因子に対する改変を
もたらすことができる。
ＩＩＩ．組成物
全身投与に適した組成物が提供される。
本明細書に記載されている組成物は、ベクターを含む。本明細書において使用する場合
、ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、合成ベクターその他を含む。こ
れらそれぞれ、その全体を参照により本明細書に組み込む、米国公開出願第２０１２−０
２０１８７２号；同第２０１１−０１１７０２６号；および同第２０１１−０１１７１４
１号を参照されたい。ベクターは、リポソームベクターまたは単球もしくは幹細胞等の生
細胞ベクターも含む。
送達ベクター
本発明のトラップの送達に適した方法は、プラスミドベクター、リポソームベクターま
たは単球もしくは幹細胞等の生細胞ベクター等、ウイルスベクターおよび非ウイルスベク
ターを含む。
用語「ベクター」は、本明細書において使用する場合、異なる宿主細胞間の移動のため
に設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」または「遺伝子療法ベクター」は、外
来性細胞において異種ＤＮＡ断片を取り込み、発現する能力を有するベクターを指す。ク
ローニングまたは発現ベクターは、追加的なエレメントを含むことができ、例えば、発現
ベクターは、トラップ遺伝子の発現のための臓器特異的プロモーターを含有することがで
き、所望の細胞外または細胞内局在化のためのシグナリング配列を含有することができる
。発現ベクターは、２種の複製系を有することができ、これにより、２種の生物において
、例えば、発現のためにヒト細胞においてならびにクローニングおよび増幅のために原核
生物宿主において維持されることが可能になる。ベクターという用語は、組換えウイルス
、例えば、治療用化合物または因子のコード配列を含有するように改変されたウイルスの
記載に使用することもできる。本明細書において使用する場合、ベクターは、ウイルスま
たは非ウイルス起源のもの、またはリポソームまたは単球もしくは幹細胞等の細胞であっ
てもよい。
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」
および「ビリオン」は、互換的に使用されており、例えば、本発明のウイルスベクターが
適切な細胞または細胞株に形質導入されるときに形成される、感染性ウイルス粒子を意味
するものとして広く理解されたい。本発明に係るウイルス粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまた
はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞にＤＮＡを移入する目的で利用することができる。用
語「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」
、「核酸ベクター構築物」および「ベクター構築物」は、当業者によって理解される通り
、遺伝子移入のためのいずれかの核酸構築物を意味するように本明細書で互換的に使用さ
れている。
本明細書において使用する場合、用語「ウイルスベクター」は、その技術分野で認識さ
れている意味に従って使用されている。これは、ウイルス起源の少なくとも１種のエレメ
ントを含む核酸ベクター構築物を指し、ウイルスベクター粒子にパッケージングされてい
てよい。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいず
れかで、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を細胞に移入する目的で利用することができる。
多数の形態のウイルスベクターが本技術分野で公知であり、その供給源として、アデノウ
イルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられるがこれらに限
定されない。
本発明は、哺乳動物細胞への目的のトラップの導入のためのいずれかのベクターの使用
を企図する。例示的なベクターとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、その
複製適格性、複製欠損およびガットレス（gutless）形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）
ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベ
クター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘル
ペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベ
クター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター、ラウ
ス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルスプラスミドベクター等、ウイルスおよび非ウイ
ルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、ウイ
ルスベクターである。ウイルスは、細胞を効率的に形質導入し、それ自身のＤＮＡを宿主
細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターの生成において、非必須遺伝子は
、異種（または非ネイティブ）タンパク質の遺伝子またはコード配列により置き換えられ
る。
ウイルスベクターの構築において、非必須遺伝子は、１種または複数の治療用化合物ま
たは因子をコードする１種または複数の遺伝子により置き換えられる。典型的には、ベク
ターは、複製起点を含み、ベクターは、また、ベクターを同定および選択することができ
る、「マーカー」または「選択可能マーカー」機能を含んでも含まなくてもよい。いかな
る選択可能マーカーを使用してもよいが、このような発現ベクターにおける使用のための
選択可能マーカーは一般に、本技術分野で公知であり、適正な選択可能マーカーの選択は
、宿主細胞に依存し得る。抗生物質または他の毒素に対する抵抗性を付与するタンパク質
をコードする選択可能マーカー遺伝子の例として、アンピシリン、メトトレキセート、テ
トラサイクリン、ネオマイシン（Southernら、J., J Mol Appl Genet.１９８２年；
１巻（４号）：３２７〜４１頁（１９８２年））、ミコフェノール酸（Mulliganら、Scie
nce ２０９巻：１４２２〜７頁（１９８０年））、ピューロマイシン、ゼオマイシン（z
eomycin）、ハイグロマイシン（Sugdenら、Mol Cell Biol.５巻（２号）：４１０〜３
頁（１９８５年））またはＧ４１８が挙げられる。
「組換え」としてのベクターまたは他のＤＮＡ配列の参照は、自然から単離された際に
または自然に見出される際に典型的には作動可能に連結されていないＤＮＡ配列の、作動
可能な連結を単に認めるものである。発現／制御配列が、核酸配列の転写および必要に応
じて翻訳を調節する場合、調節（発現／対照）配列は、核酸コード配列に操作可能に連結
されている。よって、発現／制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネー
ター、コード配列（sequined）の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのた
めのスプライシングシグナル、および終止コドンを含むことができる。
アデノウイルス遺伝子療法ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強い発現、優れた力価、な
らびにｉｎ ｖｉｖｏで分裂および非分裂細胞に形質導入する能力を示すことが公知であ
る（Hittら、Adv in Virus Res ５５巻：４７９〜５０５頁（２０００年））。ｉｎ
ｖｉｖｏで使用される場合、ベクター骨格に対し誘発される免疫応答のため、これらの
ベクターは、強いが一過性の遺伝子発現をもたらす。本発明における使用のための組換え
Ａｄベクターは、（１）ベクターが複製欠損Ａｄビリオンに取り込まれることを可能にす
るパッケージング部位；および（２）目的のトラップをコードするポリヌクレオチド等、
目的のポリヌクレオチドを含む。感染性ビリオンへの取り込みに必要なまたは役立つ他の
エレメントは、５’および３’Ａｄ ＩＴＲ、Ｅ２およびＥ３遺伝子等を含む。
本発明の組換えＡｄベクターを被包する複製欠損Ａｄビリオンは、Ａｄパッケージング
細胞およびパッケージング技術を使用して、本技術分野で公知の標準技法によって作製さ
れる。これらの方法の例は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、米国特
許第５，８７２，００５号に見出すことができる。目的のポリヌクレオチド（polynuclel
otide）は一般的に、アデノウイルスにおける、ウイルスゲノムの欠失Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂま
たはＥ３領域に挿入される。本発明の実施における使用のための好ましいアデノウイルス
ベクターは、１種または複数の野生型Ａｄ遺伝子産物、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、
Ｅ３、Ｅ４を発現しない。好ましい実施形態は、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および任意選択でＥ
３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞株と共に典型的に使用されるビリオン
である。例えば、これらの全体を参照により本明細書に明確に組み込む、米国特許第５，
８７２，００５号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１３３，０２８号および同第６
，１２７，１７５号を参照されたい。アデノウイルスベクターは、本技術分野で公知の標
準技法を使用して、精製および製剤化される。
組換えＡＡＶベクターは、標的化された細胞における選択されたトランスジェニック産
物の発現および産生を方向づけることができることを特徴とする。よって、組換えベクタ
ーは、キャプシド形成に必須なＡＡＶの少なくとも全ての配列および標的細胞の感染のた
めの物理的構造を含む。
本発明の実施における使用のための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、当業者に公
知の標準方法論を使用して産生することができ、転写の方向づけにおける操作可能に連結
された構成成分として、転写開始および終結配列を含む制御配列、ならびに目的のトラッ
プのためのコード配列を含むように構築される。これらの構成成分は、機能的ＡＡＶ Ｉ
ＴＲ配列によって５’および３’端において結合されている。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配
列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに意
図される通りに機能することを意味する。したがって、本発明のベクターにおける使用の
ためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの
挿入、欠失もしくは置換によって変更され得る、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡ
ＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡ
Ｖ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８等を限定するこ
となく含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。好ましいＡＡＶベク
ターは、野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子が全体的にまたは部分的に欠失しているが、機
能的フランキングＩＴＲ配列を保持する。
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターが産生細胞に導入され、続いて、ＡＡＶヘルパー構築
物が導入され、このヘルパー構築物は、産生株細胞において発現され得るＡＡＶコード領
域を含み、ＡＡＶベクターにおいて欠くＡＡＶヘルパー機能を補完する。ヘルパー構築物
は、参照により本明細書に明確に組み込む米国特許第６，５４８，２８６号に記載されて
いる通り、典型的には、ｐ５に続く開始コドンをＡＴＧからＡＣＧへと突然変異させるこ
とにより、大きなＲＥＰタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現を下方調節す
るように設計することができる。これに続いて、産生株細胞へヘルパーウイルスおよび／
または追加的なベクターが導入され、ヘルパーウイルスおよび／または追加的なベクター
は、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持することができる補助機能を提供する。次いで
産生株細胞が培養されて、ｒＡＡＶを産生する。これらのステップは、標準方法論を使用
して行われる。本発明の組換えＡＡＶベクターを被包する複製欠損ＡＡＶビリオンは、Ａ
ＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用して、本技術分野で公知の標準
技法によって作製される。これらの方法の例は、例えば、これらの全体を参照により本明
細書に明確に組み込む、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号、
同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号および同第６，５４８，２８６号
に見出すことができる。パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、同様にそ
の全体を参照により本明細書に組み込む、Wangら（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記
載されており、当業者の知識の内の技法を含む。
およそ４０種の血清型のＡＡＶが現在公知であるがしかし、新たな血清型および現存す
る血清型のバリアントが、今日もまだ同定されており、本発明の範囲内であるとみなされ
る。Gaoら（２００２年）PNAS ９９巻（１８号）：１１８５４〜６頁；Gaoら（２００３
年）PNAS １００巻（１０号）：６０８１〜６頁；BossisおよびChiorini（２００３年）
J. Virol.７７巻（１２号）：６７９９〜８１０頁）を参照されたい。異なるＡＡＶ血清
型が使用されて、特定の標的細胞の形質導入を最適化する、または特定の標的組織内の特
異的細胞型を標的とする。異なるＡＡＶ血清型の使用は、悪性組織の標的化を容易にする
ことができる。１、２、４、５および６を含むＡＡＶ血清型は、脳組織を形質導入するこ
とが示された。例えば、Davidsonら（２０００年）PNAS ９７巻（７号）３４２８〜３２
頁；Passiniら（２００３年）J. Virol ７７巻（１２号）：７０３４〜４０頁）を参照
されたい。特定のＡＡＶ血清型は、標的組織または細胞においてより効率的に標的化およ
び／または複製することができる。形質導入効率を増加させ、導入遺伝子発現のより速い
発生をもたらすために、本発明の実施において、単一の自己相補的ＡＡＶベクターを使用
することができる（McCartyら、Gene Ther.２００１年８月；８巻（１６号）：１２４８
〜５４頁）。
レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Miller、１９
９２年、Nature ３５７巻：４５５〜４６０頁）。本発明の実施において、レトロウイル
スベクターおよびより具体的にはレンチウイルスベクターを使用することができる。レト
ロウイルスベクターを検査したところ、広範囲の標的細胞のゲノムＤＮＡへの種々の目的
の遺伝子の安定した導入に適した送達媒体であることが判明した。細胞へと再編成されて
いない単一コピーの導入遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの能力は、レトロウイ
ルスベクターを細胞への遺伝子の移入に十分に適したものとする。さらに、宿主細胞にお
ける特異的細胞表面受容体へのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合により、
レトロウイルスは宿主細胞に進入する。結果的に、コードされるネイティブエンベロープ
タンパク質が、ネイティブエンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する異種エ
ンベロープタンパク質によって置き換えられた、シュードタイプのレトロウイルスベクタ
ー（例えば、ネイティブエンベロープタンパク質と比較して異なる細胞表面受容体に結合
する）も、本発明の実施における有用性を見出すことができる。導入遺伝子をコードする
レトロウイルスベクターの送達を特異的な型の標的細胞へと方向づける能力は、遺伝子療
法適用のために高度に望ましい。
本発明は、例えば、１種または複数の目的のポリヌクレオチドと、１種または複数のパ
ッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターとを含むレトロウ
イルス移入ベクターを含むレトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、シュー
ドタイプのレトロウイルスを産生するための、異種または機能的に改変されたエンベロー
プタンパク質をコードするシュードタイプのレトロウイルスベクターを提供する。
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ、ＣおよびＤ型レトロウイ
ルスならびにスプーマウイルスおよびレンチウイルスを含む多種多様なレトロウイルスか
ら容易に派生させることができる（RNA Tumor Viruses、第２版、Cold Spring Harbo
r Laboratory、１９８５年を参照）。本発明の組成物および方法における使用に適した
レトロウイルスの例として、レンチウイルスが挙げられるがこれに限定されない。本発明
の組成物および方法における使用に適した他のレトロウイルスとして、トリ白血病ウイル
ス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、
マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが挙げられるがこれ
らに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ
（HartleyおよびRowe、J. Virol.１９巻：１９〜２５頁、１９７６年）、エーベルソン
（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィ（Gr
affi）、グロス（Gross）（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、カーステン、ハーベイ肉腫ウ
イルスおよびラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）ならびにモロニーマウス白血病ウ
イルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスは、アメリカ合
衆国培養細胞系統保存機関（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）等の寄託機関
もしくは収集機関から容易に得ることができる、または一般的に利用できる技法を使用し
て公知供給源から単離することができる。
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスに由来する。好
ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、１もしくは２型（すなわち、
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり、ＨＩＶ−１は、以前にリンパ節症関連ウイルス３（
ＨＴＬＶ−ＩＥ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼
ばれていた）、または同定され、ＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ様疾患に関連するＨＩＶ−１
もしくはＨＩＶ−２に関係する別のウイルスである。他のレンチウイルスベクターは、ヒ
ツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス
、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血症ウイルス（ＥＩＡＶ）およびヤギ
関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む。
組成物および方法における使用に適したレトロウイルスの様々な属および系統は、本技
術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込む、Fields Virology、第３
版、B. N. Fieldsら編、Lippincott-Raven Publishers（１９９６年）参照、例えば、
第５８章、Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification
、１７６８〜１７７１頁、表１を含む、を参照）。
本発明は、種々のレトロウイルス系に適用可能であり、当業者であれば、レトロウイル
スの異なる群にわたって共有される共通エレメントを認めるであろう。あらゆるレトロウ
イルスは、表面突起を有し、二量体からなるゲノムである、１分子の直鎖状プラス・セン
スの一本鎖ＲＮＡ、ならびに共通タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する、エ
ンベロープに包まれたビリオンの特色を共有する。
レンチウイルスは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質ＳＵ
（ｇｐ１２０）およびＴＭ（ｇｐ４１）；ｇａｇ遺伝子によってコードされるＣＡ（ｐ２
４）、ＭＡ（ｐ１１７）およびＮＣ（ｐ７−１１）；ならびにｐｏｌ遺伝子によってコー
ドされるＲＴ、ＰＲおよびＩＮを含む、いくつかの構造的ビリオンタンパク質を共通して
共有する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングの
調節ならびに他の複製機能に関与する補助および他のタンパク質を含有する。ｖｉｆ、ｖ
ｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘおよびｎｅｆ遺伝子によってコードされる補助タンパク質は、組換
え系から省略（または不活性化）され得る。加えて、ｔａｔおよびｒｅｖは、例えば、突
然変異または欠失によって省略または不活性化され得る。
第一世代レンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖの
ための別々のパッケージング構築物を提供し、典型的に、安全性の理由から異種または機
能的に改変されたエンベロープタンパク質を用いる。第二世代レンチウイルスベクター系
において、補助遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆは、欠失または不活性化され
る。第三世代レンチウイルスベクター系は、ｔａｔ遺伝子が欠失または他の方法で不活性
化された（例えば、突然変異により）ベクター系である。
ｔａｔによって通常提供される転写の調節のための補償は、ヒトサイトメガロウイルス
最初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーター等、強い構成的プロモーターの使
用によって提供され得る。他のプロモーター／エンハンサーは、本技術分野で理解される
通り、構成的プロモーター活性の強度、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プ
ロモーター）または所望の発現制御に関する他の因子に基づき選択され得る。例えば、一
部の実施形態では、ｔｅｔ等の誘導性プロモーターを用いて、制御された発現を達成する
ことが望ましい。典型的な第三世代レンチウイルスベクター系が、４種のプラスミドを含
むことになるように、ｒｅｖをコードする遺伝子は、好ましくは、別々の発現構築物に配
置される：ｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープおよび移入ベクター毎に１種。用いるパ
ッケージング系の世代に関係なく、ｇａｇおよびｐｏｌは、単一の構築物または別々の構
築物に配置することができる。
合成非ウイルス送達剤
目的のポリヌクレオチドの移入および発現を促進することができる合成非ウイルス剤も
、本発明の方法における使用に適している。そのような薬剤として、カチオン性脂質およ
びポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。カチオン性脂質である非ウイルス送達
剤は、ポリアニオン性ＤＮＡに結合する。遺伝子材料が、新たな宿主の内に取り込まれる
ように、エンドサイトーシス後に、核酸は、送達剤およびエンドソーム区画からエスケー
プしなければならない。Felgner, P. L. Nonviral Strategies for Gene Therapy
Sci. Am. 1997, 276, 102-106; Felgner, P. L.; Gadek, T. R.; Holm, M
.; Roman, R.; Chan, H. W.; Wenz, M.; Northrop, J. P.; Ringgold, G.
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ansfection procedure Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 7413-7417; F
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Felgner, J. H.; Kumar, R.; Sridhar, C. N.; Wheeler, C. J.; Tsai, Y.
J.; Border, R.; Ramsey, P.; Martin, M.; Felgner, P. L. Enhanced Gen
e Delivery and Mechanism Studies with a Novel Series of Cationic Form
ulations J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550-2561; Freidmann, T. Sci. Am.
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2-389; Cotton, M.; Wagner, B. Non-viral Approaches to Gene Therapy Cur
r. Op. Biotech. 1993, 4, 705-710; Miller, A. D. Cationic Liposomes fo
r Gene Therapy Angew. Chem. Int. 1998, 37, 1768-1785; Scherman, D.; B
essodes, M.; Cameron, B.; Herscovici, J.; Hofland, H.; Pitard, B.; Sou
brier, F.; Wils, P.; Crouzet, J. Application of Lipids and Plasmid De
sign for Gene Delivery to Mammalian Cells Curr. Op. Biotech. 1989, 9,
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M., Rhein, L. D., Eds.; Marcel Dekker, Inc.: New York, 1997; Vol.
68, pp 263-283; Rolland, A. P. From Genes to Gene Medicines: Recent
Advances in Nonviral Gene Delivery Crit. Rev. Ther. Drug 1998, 15, 14
3-198; de Lima, M. C. P.; Simoes, S.; Pires, P.; Faneca, H.; Duzgune
s, N. Cationic Lipid-DNA Complexes in Gene Delivery from Biophysics to
Biological Applications Adv. Drug. Del. Rev. 2001, 47, 277-294を参照さ
れたい。
これらの合成非ウイルス送達剤は、トランスフェクトされるＤＮＡを凝縮することと、
その細胞結合ならびに細胞膜および必要に応じて２つの核膜を越えた通過を促進すること
という２種の主な機能を有する。そのポリアニオン性の性質のため、ＤＮＡは天然に、同
様にポリアニオン性である細胞の細胞膜に対し不十分な親和性を有する。いくつかのグル
ープが、動物およびヒトの両方におけるｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのための両
親媒性カチオン性脂質−核酸複合体の使用を報告した。よって、合成非ウイルス送達剤は
、カチオン性またはポリカチオン性電荷を有する。Gao, X；Huang, L.、Cationic Lip
osome-mediated Gene Transfer Gene Therapy １９９５年、２巻、７１０〜７２２
頁；Zhu, N.；Liggott, D.；Liu, Y.；Debs, R.、Systemic Gene Expression Aft
er Intravenous DNA Delivery into Adult Mice、Science １９９３年、２６１巻
、２０９〜２１１頁；Thierry, A. R.；Lunardiiskandar, Y.；Bryant, J. L.；Rab
inovich, P.；Gallo, R. C.；Mahan, L. C.、Systemic Gene-Therapy-Biodistribu
tion and Long-Term Expression of a Transgene in Mice、Proc. Nat. Acad.
Sci.１９９５年、９２巻、９７４２〜９７４６頁を参照されたい。カチオン性および疎
水性ドメインの両方を保有するカチオン性両親媒性化合物が、遺伝情報の送達のために以
前に使用された。実際に、このクラスの化合物は、遺伝子の細胞内送達のために広く使用
されている。このようなカチオン性化合物は、遺伝子トランスフェクション研究のための
最も一般的な合成非ウイルス送達剤である、カチオン性リポソームを形成することができ
る。
カチオン性リポソームは、２種の機能を果たす。第一に、これは、ＤＮＡを分解から保
護する。第二に、これは、細胞に進入するＤＮＡの量を増加させる。このようなリポソー
ムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究の両方で有用であることを立証した。
Ｓａｆｉｎｙａ，Ｃ．Ｒ．は、カチオン性両親媒性物質−ＤＮＡ複合体の構造について記
載する。Radler, J. O.; Koltover, I.; Salditt, T.; Safinya, C. R. Scien
ce 1997, 275, 810-814; Templeton, N. S.; Lasic, D. D.; Frederik, P.
M.; Strey, H. H.; Roberts, D. D.; Pavlakis, G. N. Nature Biotech. 19
97, 15, 647-652; Koltover, I.; Salditt, T.; Radler, J. O.; Safinya, C
. R. Science 1998, 281, 78-81; and Koltover, I.; Salditt, T.; Safinya
, C. R. Biophys. J. 1999, 77, 915-924を参照されたい。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよ
びｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子送達のためのこれらの系の多くは、最近の論文に概説さ
れている。Remy, J.；Sirlin, C.；Vierling, P.；Behr, J.、Bioconj. Chem.１９
９４年、５巻、６４７〜６５４頁；Crystal, R. G.、Science １９９５年、２７０巻
、４０４〜４１０頁；Blaese, X.ら（et, a.）、Cancer Gene Ther.１９９５年、２
巻、２９１〜２９７頁；ならびに上に引用されたBehr, J. P.およびGao, Xを参照され
たい。ウイルスベクターとは異なり、脂質−核酸複合体は、基本的に無制限のサイズの発
現カセットの移入に使用することができる。このような合成送達系は、タンパク質を欠く
ため、その惹起する免疫原性および炎症性応答がより少なくなる場合がある。
Ｂｅｈｒは、遺伝子送達のためのジオクタデシルアミドログリシルスペルミン（「ＤＯ
ＧＳ」）を含む多数の両親媒性物質を開示する。この材料は、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（
商標）として市販されている。Ｖｉｇｎｅｒｏｎは、真核細胞のトランスフェクションの
ためのグアニジニウム−コレステロールカチオン性脂質について記載する。Ｆｅｌｇｎｅ
ｒは、トランスフェクションに適した脂質／ＤＮＡ複合体を形成するための、Ｎ−１−（
２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド
（「ＤＯＴＭＡ」）を含む正電荷を持つ合成カチオン性脂質の使用を開示する。Ｂｙｋは
、遺伝子トランスフェクションのための、両親媒性物質のカチオン性部分が直鎖状、分枝
状または球状のいずれかであるカチオン性脂質について記載する。Ｂｌｅｓｓｉｎｇおよ
び共同研究者らは、スペルミンに基づくカチオン性合成ベクターについて記載する。Ｓａ
ｆｉｎｙａは、遺伝子送達のためのポリ（エチレングリコール）セグメントを含有するカ
チオン性脂質について記載する。Ｂｅｓｓｏｄｅｓおよび共同研究者らは、遺伝子送達の
ためのグリコシドリンカーを含有するカチオン性脂質について記載する。ＲｅｎおよびＬ
ｉｕは、１，２，４−ブタントリオールに基づくカチオン性脂質について記載する。Ｔａ
ｎｇおよびＳｃｈｅｒｍａｎは、遺伝子送達のためのジスルフィド結合を含有するカチオ
ン性脂質について記載する。Ｖｉｅｒｌｉｎｇは、遺伝子担体および送達系としての高度
にフッ素化されたカチオン性両親媒性物質について記載する。Ｊａｃｏｐｉｎは、標的化
リガンドを含有する遺伝子送達のためのカチオン両親媒性物質について記載する。Ｗａｎ
ｇおよび共同研究者らは、遺伝子送達のためのカルニチンに基づくカチオン性エステルに
ついて記載する。Ｚｈｕは、ＤＮＡの静脈内送達のためのカチオン性脂質、Ｎ［１−（２
，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド
の使用について記載する。Behr, J. P.; Demeneix, B.; Loeffler, J. P.; Pere
z-Mutul, J. Efficeint Gene Transfer into Mammalian Primary Endocrine Ce
lls with Lipopolyamine Coated DNA Proc. Nat. Acad. Sci. 1989, 86, 698
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T.; Remy, J. S.; Behr, J. P. Proc. Nat. Acad. Sci. 1998, 95, 1427-1
431; Schulze, U.; Schmidt, H.; Safinya, C. R. Bioconj. Chem. 1999, 10
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erling, P.; Santaella, C.; Greiner, J. J. Fluorine Chem. 2001, 107, 3
37-354; Jacopin, J.; Hofland, H.; Scherman, D.; Herscovici, J. J. Biom
ed. Chem. Lett. 2001, 11, 419-422; and Wang, J.; Guo, X.; Xu, Y.; B
arron, L.; Szoka, F. C. J. Med. Chem. 1998, 41, 2207-2215を参照された
い。
Ｅｐａｎｄらの米国特許第５，２８３，１８５号において、発明者らは、「ＤＣ−ｃｈ
ｏｌ」と命名されたカチオン性コレステロール合成ベクターを含む両親媒性物質の追加的
な例について記載する。発明者らは、米国特許第５，２６４，６１８号において、細胞へ
の生物学的活性分子の輸送を容易にするより多くのカチオン性化合物について記載する。
Ｈｕｇｈｅｓらの米国特許第６，１６９，０７８号および同第６，１５３，４３４号は、
遺伝子送達のためのジスルフィド結合を含有するカチオン性脂質を開示する。Ｇｅｂｅｙ
ｅｈｕらの米国特許第５，３３４，７６１号は、生物学的活性分子の細胞内送達に適した
追加的なカチオン性両親媒性物質について記載する。Ｔｈｉｅｒｒｙの米国特許第６，１
１０，４９０号は、遺伝子送達のための追加的なカチオン性脂質について記載する。Ｕｎ
ｇｅｒらの米国特許第６，０５６，９３８号は、少なくとも２個のカチオン性の基を含有
するカチオン性脂質化合物を開示する。
遺伝子送達のためのポリマー系は、本技術分野で公知である。Ｈａｎは、自身の総説に
おいて、ＰＬＬ、ポリ（Ｌ−リシン）；ＰＥＩ、ポリエチレンイミン；ｐＤＭＥＡＭＡ、
ポリ（２−ジメチルアミノ）エチル−メタクリル酸塩；ＰＬＧＡ、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチ
ド−ｃｏ−グリコリド）およびＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を含む一般的なカチオン
性ポリマー系の殆どについて考察した。Garnett, M. C. Crit. Rev. Ther. Drug
Carrier Sys. 1999, 16, 147-207; Han, S.; Mahato, R. I.; Sung, Y. K.;
Kim, S. W. Molecular Therapy 2000, 2, 302-317; Zauner, W.; Ogris, M
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D. G.; Putman, D.; Langer, R. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8155-81
56; Boussif, O.; Lezoualc'h, F.; Zanta, M. A.; Mergny, M. D.; Scherma
n, D.; Demeneix, B.; Behr, J. P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 9
2, 7297-7301; Choi, J. S.; Joo, D. K.; Kim, C. H.; Kim, K.; Park,
J. S. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 474-480; Putnam, D.; Langer, R.
Macromolecules 1999, 32, 3658-3662; Gonzalez, M. F.; Ruseckaite, R. A.;
Cuadrado, T. R. Journal of Applied Polymer Science 1999, 71, 1223-12
30; Tang, M. X.; Redemann, C. T.; Szoka, F. C. In Vitro Gene Delive
ry by Degraded Polyamidoamine Dendrimers Bioconjugate Chem. 1996, 7, 70
3-714; Kukowska-latallo, J. F.; Bielinska, A. U.; Johnson, J.; Spinder,
R.; Tomalia, D. A.; Baker, J. R. Proc. Nat. Acad. Sci. 1996, 93,
4897-4902; and Lim, Y.; Kim, S.; Lee, Y.; Lee, W.; Yang, T.; Lee, M
.; Suh, M.; Park, J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2460-2461を参照され
たい。
調査中のカチオン性ポリマーのいくつかの代表例について下に記載する。例えば、ポリ
（ベータ−アミノエステル）が探索されており、遺伝子送達のための可溶性ＤＮＡ／ポリ
マー粒子へとプラスミドＤＮＡを凝縮することが示された。合成トランスフェクションベ
クターの発見を加速させるために、カチオン性ポリマーライブラリーの並行合成およびス
クリーニングがＬａｎｇｅｒによって報告された。Ｗｏｌｆｅｒｔは、合成ブロックカチ
オン性コポリマーによるＤＮＡの自己集合によって形成される遺伝子療法のためのカチオ
ン性ベクターについて記載する。ＨａｅｎｓｌｅｒおよびＳｚｏｋａは、遺伝子送達のた
めのカチオン性デンドリマーポリマー（ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー）
の使用について記載する。Ｗａｎｇは、遺伝子送達のためのカチオン性ポリリン酸エステ
ルについて記載する。Ｐｕｔｎａｍは、ＤＮＡの送達のためのイミダゾールを含有するカ
チオン性ポリマーについて記載する。Lynn, D. M.; Langer, R. J. Am. Chem. S
oc. 2000, 122, 10761-10768; Wolfert, M. A.; Schacht, E. H.; Toncheva,
V.; Ulbrich, K.; Nazarova, O.; Seymour, L. W. Hum. Gene Ther. 1996,
7, 2123-2133; Haensler, J.; Szoka, F. Bioconj. Chem. 1993, 4, 372;
and Wang, J.; Mao, H. Q.; Leong, K W. J. Am. Chem. Soc. 2001; Putn
am, D.; Gentry, C. A.; Pack, D. W.; Langer, R. Proc. Nat. Acad. Sci
. 2001, 98, 1200-1205を参照されたい。
遺伝子送達のためのカチオン性ポリマーについて記載するいくつかの特許も公知である
。例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの米国特許第５，６２９，１８４号は、オリゴヌクレ
オチドの送達のためのビニルアミンおよびビニルアルコールのカチオン性コポリマーにつ
いて記載する。Ｔｏｍａｌｉａらの米国特許第５，７１４，１６６号は、遺伝子送達のた
めの樹状カチオン性アミン終結ポリマーを開示する。Ｙｉｎらの米国特許第５，９１９，
４４２号は、遺伝子送達のためのカチオン性ハイパーコーム分枝状ポリマーコンジュゲー
トについて記載する。Ｂｕｒｇｅｓｓらの米国特許第５，９４８，８７８号は、核酸トラ
ンスフェクションおよび生物活性薬剤送達のための追加的なカチオン性ポリマーについて
記載する。Ｐａｒｋらの米国特許第６，１７７，２７４号は、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）グラフトされたポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）および標的部分からなる標的化遺
伝子送達のための化合物を開示し、ＰＬＬの少なくとも１個の遊離アミノ官能基は、標的
部分により置換されており、グラフトされたＰＬＬは、少なくとも５０％の非置換遊離ア
ミノ官能基を含有する。Ｃｈｏｉらの米国特許第６，２１０，７１７号は、両親媒性ポリ
エステル−ポリカチオンコポリマーおよび両親媒性ポリエステル−糖コポリマーを含有す
る、標的化宿主細胞への選択された核酸の送達に使用される生分解性混合型ポリマーミセ
ルについて記載する。Ｐａｒｋらの米国特許第６，２６７，９８７号は、組織および細胞
取り入れによる生物活性薬剤の送達のための正電荷を持つポリ［アルファ−（オメガ−ア
ミノアルキル）グリコール酸］を開示する。Ｓｃｈｅｒｍａｎらの米国特許第６，２００
，９５６号は、カチオン性ポリペプチドを含有する核酸のトランスフェクトに有用な医薬
組成物について記載する。
本明細書に記載されているトラップの送達における使用に適したナノ粒子送達系は、Ｐ
ＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４２０９に開示されている。
標的化リガンド
組成物は、ベクターと物理的に会合された標的化リガンドをさらに含むことができる。
「標的化リガンド」とは、標的にされる細胞または組織へとベクターまたは物理的に会
合された分子を進める分子のことを意図する。標的化リガンドとして、小分子、ペプチド
、脂質、糖、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体もしくはその断片、
特異的膜受容体リガンド、抗リガンドと反応することができるリガンド、融合性ペプチド
、核局在化ペプチド、またはこのような化合物の組合せを挙げることができるがこれらに
限定されない。標的化リガンドの非限定例として、アシアロ糖タンパク質、インスリン、
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、葉酸塩、ベンズアミド誘導体、ならびに細胞表面分子
に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体が挙げられる。一部の実施形態では、
小分子は、ベンズアミド誘導体を含む。これらの実施形態の一部では、ベンズアミド誘導
体は、アニスアミドを含む。
「標的にされる細胞」とは、標的化リガンドが、物理的に会合された分子を補充する細
胞のことを意図する。標的化リガンドは、標的細胞の１種または複数の構成物と相互作用
することができる。標的化される細胞は、様々な表現型を示すいかなる細胞型またはいか
なる発生段階であってもよく、様々な病理学的状態（すなわち、異常および正常状態）に
あってもよい。例えば、標的化リガンドは、微生物（すなわち、原核細胞（細菌）、ウイ
ルス、真菌、原生動物または寄生生物）または真核細胞（例えば、上皮細胞、筋肉細胞、
神経細胞、感覚性細胞、がん性細胞、分泌性細胞、悪性細胞、赤血球系およびリンパ系細
胞、幹細胞）における正常、異常および／または特有の構成物と会合することができる。
よって、標的化リガンドは、例えば、腫瘍関連抗原および自己免疫性疾患関連抗原を含む
疾患関連抗原である、標的細胞における構成物（constitutient）と会合することができ
る。このような疾患関連抗原は、例えば、増殖因子受容体、細胞周期調節因子、血管新生
因子およびシグナリング因子を含む。
一部の実施形態では、標的化リガンドは、標的化される細胞における細胞表面タンパク
質と相互作用する。これらの実施形態の一部では、標的化リガンドに結合することができ
る細胞表面タンパク質の発現レベルは、他の細胞と比べて、標的化される細胞において高
い。例えば、がん細胞は、ＨＥＲ２受容体（乳がん）またはシグマ受容体等、ある特定の
細胞表面分子を過剰発現する。標的化リガンドがアニスアミド等のベンズアミド誘導体を
含む、ある特定の実施形態では、標的化リガンドは、小細胞および非小細胞肺癌、腎癌、
結腸癌、肉腫、乳がん、メラノーマ、グリオブラストーマ、ニューロブラストーマおよび
前立腺がん等、がん細胞を挙げることができるがこれらに限定されない、シグマ−受容体
過剰発現細胞へと会合分子を標的化させる（Aydar、PalmerおよびDjamgoz（２００４年）
Cancer Res.６４巻：５０２９〜５０３５頁）。
用語「がん」または「がん性」は、調節されていない細胞成長によって典型的に特徴付
けられる、哺乳動物における生理的状態を指すまたは説明する。本明細書において使用す
る場合、「がん細胞」または「腫瘍細胞」は、この調節されていない細胞成長によって特
徴付けられる細胞を指す。用語「がん」は、膀胱癌、脳腫瘍、乳がん、子宮頸部がん、結
腸直腸がん、食道がん、子宮内膜がん、肝細胞癌、喉頭がん、肺がん、骨肉腫、卵巣がん
、膵がん、前立腺がん、腎癌および甲状腺がんを限定することなく含む、あらゆる形態の
癌腫、メラノーマ、肉腫、リンパ腫および白血病が挙げられるがこれらに限定されない、
あらゆる種類のがんを包含する。
標的化される細胞は、遠隔がんの転移に対し感受性である細胞である。したがって、標
的化される細胞は、いかなる臓器に存在してもよい。特定の実施形態では、標的化される
細胞は、肝臓細胞である。
標的化リガンドは、ベクターに物理的に会合されていてよい。本明細書において使用す
る場合、用語「物理的に会合」は、２分子間の共有結合によるか、または共有結合によら
ない相互作用のいずれかを指す。本明細書において使用する場合、用語「共有結合による
結合」または「共有結合による相互作用」は、一対の電子が、２原子間で共有された化学
結合を指す。２分子が、分子を構成する原子の間に少なくとも１個の化学結合を有する場
合、該２分子は、互いに化学的に結合したと言われる。２分子間の１個の化学結合は、し
たがって、一方の分子中の原子と別の分子中の原子との間の１対の電子の共有で構成され
る。例えば、標的化リガンドは、窒素原子の１個またはカチオン性脂質のＲ基の１個を介
して、本発明の脂質に共有結合により結合されていてよい。「コンジュゲート」は、互い
に共有結合により結合された分子の複合体を指す。例えば、標的化リガンドに共有結合に
より結合された脂質の複合体は、脂質−標的化リガンドコンジュゲートと称され得る。
あるいは、標的化リガンドは、式（Ｉ）の脂質またはその活性誘導体に共有結合によら
ず結合されてよい。「共有結合によらない結合」または「共有結合によらない相互作用」
は、数対の電子の共有が関与しないが、むしろ、電磁相互作用のより分散した変種が関与
し、水素結合、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用および疎水性結合を含む
ことができる。このような脂質−標的化リガンドコンジュゲートは、文献に広く記載され
ている技法に従って容易に得ることができる。
目的のポリヌクレオチド
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され
、核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮ
Ａ（ｐＤＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一
本鎖であっても二本鎖であっても、直鎖状であっても環状であってもよい。ポリヌクレオ
チドは、従来のホスホジエステル結合または従来のものではない結合（例えば、ペプチド
核酸（ＰＮＡ）に存在するようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」は、ポ
リヌクレオチドに存在するいずれか１種または複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡま
たはＲＮＡ断片を指す。用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸またはポリヌクレ
オチドを指すことができ、「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、そのネイテ
ィブ環境から除去された、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのことを意図する。単離された
ポリヌクレオチドの例として、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド
、または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる
。本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により産生されたこのよ
うな分子をさらに含む。単離されたポリヌクレオチドは、単離された発現ベクター、発現
構築物またはこれらの集団を含むこともできる。「ポリヌクレオチド」は、ポリメラーゼ
連鎖反応におけるような、それ自体の増幅された産物を指すこともできる。「ポリヌクレ
オチド」は、ホスホロチオエート、ホスフェート、環原子修飾された誘導体その他等、修
飾された核酸を含有することができる。「ポリヌクレオチド」は、天然起源のポリヌクレ
オチド（すなわち、ヒトの介入なしで自然に存在するもの）または組換えポリヌクレオチ
ド（すなわち、ヒトの介入によってのみ存在するもの）であり得る。用語「ポリヌクレオ
チド」および「オリゴヌクレオチド」は両者共に、ヌクレオチドのポリマーを指すが、本
明細書において使用する場合、オリゴヌクレオチドは典型的に、１００ヌクレオチド未満
の長さである。
本明細書において使用する場合、用語「目的のポリヌクレオチド」は、細胞に送達され
て、該細胞において所望の効果（例えば、治療効果、遺伝子発現の変化）を誘発するべき
ポリヌクレオチドを指す。目的のポリヌクレオチドは、いかなる長さのものであってもよ
く、目的のポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができるがこ
れに限定されない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが、細胞において発現ま
たは導入される場合、目的のポリヌクレオチドまたはこれにコードされるポリペプチドは
、治療活性を有する。
ｉ．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド送達系は、目的のポリペプチドのコード配列を
含むポリヌクレオチドを含む。
本発明の目的のため、「目的のポリペプチドのコード配列」または「目的のポリペプチ
ドのコード領域」は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。本明細
書において使用する場合、用語「コードする」または「コードされる」は、指定された核
酸の文脈において使用される場合、核酸が、ヌクレオチド配列から指定されたポリペプチ
ドへの翻訳を方向づけるために必要な情報を含むことを意味する。ポリペプチドがコード
される情報は、コドンの使用によって指定される。「コード領域」または「コード配列」
は、アミノ酸へと翻訳され得るコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」または
「翻訳終結コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、アミノ酸へと翻訳されないが、
コード領域の一部であるとみなすことができる。同様に、転写開始コドン（ＡＴＧ）は、
コード領域の一部であるとみなしてもみなさなくてもよい。しかし、コード領域に隣接す
るいずれかの配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、
イントロンその他は、コード領域の一部であるとみなされない。しかし、一部の実施形態
では、それ自体はコード領域の一部とみなされないが、これらの調節配列および他のいず
れかの調節配列、特に、シグナル配列またはペプチドタグをコードする配列は、目的のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一部となり得る。よって、目的のポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列は、コード配列と、任意選択で、目的のポリペ
プチドの発現、分泌および／または単離に寄与するコード領域に隣接するいずれかの配列
とを含む。
用語「発現」は、本技術分野で理解される通りのその意味を有し、ポリヌクレオチドの
「転写」により（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用により）、遺伝子またはコード
配列にコードされた遺伝情報をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓ
ｎＲＮＡ）に変換し、また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関しては、ｍ
ＲＮＡの「翻訳」によりポリペプチドに変換するプロセスを指す。よって、「発現産物」
は一般に、遺伝子もしくはポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ（例えば、プロセシン
グ前または後のいずれか）、または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされたポ
リペプチド（例えば、修飾前または後のいずれか）である。
本明細書において使用する場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、単数
の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結
合（ペプチド結合としても公知）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成
された分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個またはそれよりも多いアミノ酸のいず
れかの鎖（単数または複数）を指し、特異的な長さの産物を指すものではない。よって、
ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖
」、または２個もしくはそれよりも多いアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すように使
用される他のいずれかの用語が、「ポリペプチド」の定義の内に含まれ、用語「ポリペプ
チド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと互換的に使用することができ
る。
用語「目的のポリペプチド」は、細胞において所望の効果（例えば、治療効果）を誘発
するために、細胞に送達されるべきポリペプチド、または細胞に送達されるべきポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチドを指す。目的のポリペプチドは、いずれかの
種およびいずれかのサイズのものであり得る。
分子遺伝学および遺伝子工学技法に必要とされる大規模な配列情報は、広く公開されて
いる。哺乳動物およびヒトの完全ヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配
列およびゲノムへのアクセスは、ウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/EntrezにおいてＧ
ｅｎＢａｎｋから得ることができる。追加的な情報は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
由来の遺伝子およびその産物ならびに生物医学的適用に関する情報を統合する電子百科事
典である、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ（bioinformatics.weizmann.ac.il/cards）から得ること
もでき、ヌクレオチド配列情報は、ＥＭＢＬ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄａｔａｂａｓｅ（www.ebi.ac.uk/embl）または日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、
www.ddbi.nig.ac.jp）から得ることもできる。アミノ酸配列に関する情報のための追加的
なサイトは、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎのタンパク質情報資源ウェブサイト（www.pir.george
town.edu）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（au.expasy.org/sprot/sprot-top.html）を含む
。
上に論じた通り、本発明の組成物は、転写されるとトラップを産生する、目的のポリヌ
クレオチド、例えば、ｐＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）等の遺伝子材料を含むことができる
。このような実施形態では、遺伝子材料は、発現カセットの一部となることができる。加
えて、ポリヌクレオチドは、発現カセットに見出されるコード配列を含む。
用語「導入」または「導入する」は、ポリヌクレオチドを参照する場合、ポリヌクレオ
チドが、細胞の細胞内領域へのアクセスを獲得するような様式での、細胞へのポリヌクレ
オチドの提示を指す。
発現カセットは、目的のポリペプチドに作動可能に連結された、発現に使用される細胞
に基づいて選択される１種または複数の調節配列を含む。「作動可能に連結される」は、
目的のヌクレオチド配列（すなわち、目的のポリペプチドのコード配列）が、ヌクレオチ
ド配列の発現を可能にする様式で（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系における、ま
たは発現カセットもしくはベクターが細胞に導入された場合は細胞における）、調節配列
（単数または複数）に連結されることを意味するように意図される。「調節配列」は、プ
ロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグ
ナル）を含む。例えば、Goeddel（１９９０年）Gene Expression Technology: Method
s in Enzymology １８５巻内（Academic Press、San Diego、California）を参照さ
れたい。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方
向づける配列と、ある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を方向づける
配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。当業者であれば、発現カセットの設計が、
形質転換される宿主細胞の選択、所望のサイレンシングエレメントまたは目的のポリペプ
チドの発現のレベルその他等の因子に依存し得ることが認められよう。このような発現カ
セットは典型的に、ベクターへの核酸の導入を容易にするために、１種または複数の適切
に配置された制限酵素部位を含む。
適切なプロモーターおよび／または調節エレメントが、目的の細胞における関連する転
写単位／サイレンシングエレメントの発現を可能にするように容易に選択され得ることが
さらに認められよう。ある特定の実施形態では、サイレンシングエレメントの細胞内発現
の方向づけに利用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）
のプロモーターである。様々なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターについて論じる参考文献は、
例えば、Yuら（２００２年）Proc. Natl. Acad. Sci.９９巻（９号）、６０４７〜６
０５２頁；Suiら（２００２年）Proc. Natl. Acad. Sci.９９巻（８号）、５５１５〜
５５２０頁（２００２年）；Paddisonら（２００２年）Genes and Dev.１６巻、９４８
〜９５８頁；Brummelkampら（２００２年）Science ２９６巻、５５０〜５５３頁；Miya
gashi（２００２年）Biotech.２０巻、４９７〜５００頁；Paulら（２００２年）Nat. B
iotech.２０巻、５０５〜５０８頁；Tuschlら（２００２年）Nat. Biotech.２０巻、４
４６〜４４８頁を含む。他の実施形態によると、ＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター、
例えば、ｔＲＮＡプロモーターを使用することができる。McCownら（２００３年）Virolo
gy ３１３巻（２号）：５１４〜２４頁；Kawasaki（２００３年）Nucleic Acids Res.
３１巻（２号）：７００〜７頁を参照されたい。ポリヌクレオチドが目的のポリペプチド
のコード配列を含む、一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターを使
用することができる。
調節配列は、ウイルス調節エレメントによって提供されてもよい。例えば、一般的に使
用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよび
サルウイルス４０に由来する。原核および真核細胞の両方のための他の適した発現系に関
しては、Sambrookら（１９８９年）Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第
２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York）の第１６お
よび１７章を参照されたい。Goeddel（１９９０年）Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology １８５巻内（Academic Press、San Diego、California）を
参照されたい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３プロモーター／ポリメラーゼ系を含
む種々の利用できる系を使用して行うことができる（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓその他から市販されている系）。Ｔ
７、ＳＰ６またはＴ３プロモーターを含むベクターは、本技術分野で周知であり、サイレ
ンシングエレメントの転写を方向づけるように容易に改変することができる。
ペグ化
ベクターのペグ化は、細網内皮（ＲＥＳ）系によるベクターのクリアランスを低下させ
ることにより、送達系の循環半減期を増強する。いずれか特定の理論または作用機序に制
約されるものではないが、ペグ化されたベクターは、粒子のオプソニン化を立体的に遮断
することにより、ＲＥＳ系から逃れることができると考えられる（OwensおよびPeppas（
２００６年）Int J Pharm ３０７巻：９３〜１０２頁）。オプソニン化の回避に十分
な立体障害をもたらすために、ベクターの外表面は、「ブラシ」立体配置のＰＥＧ分子で
完全に覆われる必要がある。低い表面被覆度では、ＰＥＧ鎖は典型的に、ＰＥＧ分子が脂
質媒体の表面により近くに位置づけられることになる、「マッシュルーム」立体配置を有
するであろう。「ブラシ」立体配置では、ＰＥＧ分子は、粒子表面からさらに離れて拡張
され、立体障害効果を増強する。しかし、表面におけるＰＥＧの過密性は、ポリマー鎖の
移動性を減少し、これにより、立体障害効果を減少し得る（OwensおよびPeppas（２００
６年）Int J Pharm ３０７巻：９３〜１０２頁）。ＰＥＧの立体構造は、ベクターの
表面におけるＰＥＧの表面密度および分子質量に依存する。制御因子は、ａＮ３／５（式
中、ａは、単量体の持続長であり、Ｎは、ＰＥＧにおける単量体単位の数である）として
定義される、それらのフローリディメンション（Flory dimension）ＲＦと比べた、媒体
表面におけるＰＥＧ鎖間の距離（Ｄ）である（Nicholasら（２０００年）Biochim Bioph
ys Acta １４６３巻：１６７〜１７８頁）。３つの型式を定義することができる：（１
）Ｄ＞２ＲＦの場合（指状嵌入型（interdigitated）マッシュルーム）；（２）Ｄ＜２Ｒ
Ｆの場合（マッシュルーム）；および（３）Ｄ＜ＲＦの場合（ブラシ）（Nicholasら）。
医薬組成物
本発明の脂質および送達系は、哺乳動物組織培養系において、動物試験において、およ
び治療目的のために有用である。式（Ｉ）の細胞傷害性カチオン性脂質および式（Ｉ）の
カチオン性脂質を含む送達系において、式（Ｉ）のカチオン性脂質は、細胞傷害性活性を
有し、送達系は、式（Ｉ）のカチオン性脂質を含み、生物活性化合物は、治療活性を有し
、送達系は、式（Ｉ）の細胞傷害性カチオン性脂質を含み、治療活性（acitivity）を有
する生物活性化合物は、治療適用において使用することができる。したがって、現在開示
されている主題は、式（Ｉ）の細胞傷害性カチオン性脂質または式（Ｉ）のカチオン性脂
質を含む送達系を含む医薬組成物を提供する。
現在開示されている組成物は、非経口的（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻
、気管支、点眼（opthalmic）、経皮（外用）、経粘膜、直腸および腟経路が挙げられる
がこれらに限定されない、いずれか利用できる経路によって、送達、すなわち、対象への
投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、送達の経路は、静脈内、非
経口的、経粘膜、経鼻、気管支、腟および経口である。
組成物は、薬学的に許容される塩として製剤化することができる。語句「薬学的に許容
される塩（単数または複数）」は、本明細書において使用する場合、対象における使用に
安全かつ有効であり、所望の生物活性を保有する、現在開示されている化合物の塩を意味
する。薬学的に許容される塩は、本発明の化合物に存在する酸性または塩基性の基の塩を
含む。薬学的に許容される酸付加塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝
酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、ホウ酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩
、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アス
コルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩（gentisinate）、フマル酸
塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩（glucaronate）、サッカレート、ギ酸塩、安息香酸
塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩
（benzensulfonate）、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１，１’−メ
チレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩（naphthoate）））、メシル酸塩が
挙げられるがこれらに限定されない。現在開示されている化合物のいくつかは、様々なア
ミノ酸による薬学的に許容される塩を生成することができる。適した塩基塩として、アル
ミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛およびジ
エタノールアミン塩が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩に関す
る総説については、参照により本明細書に組み込む、Bergeら（１９７７年）J. Pharm.
Sci.６６巻：１〜１９頁を参照されたい。本明細書に記載されている脂質の塩は、例え
ば、溶液において所望の酸または塩基と化合物の適切な均等物とを反応させることにより
調製することができる。反応が完了した後に、塩は、塩が不溶性である適切な量の溶媒の
添加により、溶液から晶出される。
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、医薬品または化
粧品投与と適合性である、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤
および吸収遅延剤その他を含む。補足活性化合物も、組成物に取り込まれてよい。
当業者であれば認めるであろうが、現在開示されている医薬組成物は、その意図される
投与経路と適合性となるように製剤化される。非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内、皮
内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の構成成分を含むことができる：
注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレ
ングリコールまたは他の合成溶媒等、無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラ
ベン等、抗細菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等、抗酸化剤；エチレンジ
アミン四酢酸等、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等、バッファー；およ
び塩化ナトリウムまたはデキストロース等、浸透圧の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸ま
たは水酸化ナトリウム等、酸または塩基で調整することができる。非経口的調製物は、ガ
ラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル内に封
入することができる。
注射用の使用に適した医薬組成物は典型的に、無菌水性溶液（水溶性である場合）また
は分散、および無菌注射用溶液または分散の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投
与のため、適した担体は、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（
ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む
。組成物は、無菌となるべきであり、容易なシリンジ通過性（syringability）が存在す
る程度まで流動性となるべきである。一部の実施形態では、医薬組成物は、製造および貯
蔵の条件下で安定しており、細菌および真菌等、微生物の汚染作用から保護されるべきで
ある。一般に、関連する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセ
ロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレン（polyetheylene）グリコールそ
の他）およびこれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適正な流
動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散の場合は要求される粒子
サイズの維持により、およびサーファクタントの使用により維持することができる。微生
物の作用の予防は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール
、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールその他によって達成することができる。一
部の実施形態では、等張剤、例えば、糖、マンニトール（manitol）もしくはソルビトー
ル等の多価アルコール、または塩化ナトリウムが、製剤に含まれる。注射用製剤の延長さ
れた吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラ
チンを製剤中に含むことによりもたらされてよい。
無菌注射用溶液は、要求に応じて上に列挙されている成分の１種または組合せを有する
適切な溶媒に、要求された量の活性化合物（例えば、式（Ｉ）の細胞傷害性カチオン性脂
質または式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む送達系）を取り込み、続いて濾過滅菌すること
により調製することができる。ある特定の実施形態では、注射のための溶液は、エンドト
キシンを含まない。一般に、分散は、基礎分散媒および上に列挙されるもの由来の要求さ
れる他の成分を含有する無菌媒体に、活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌
粉末が無菌注射用溶液の調製に使用される実施形態では、溶液は、その以前に滅菌濾過さ
れた溶液から活性成分プラスいずれか追加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およ
び凍結乾燥によって調製することができる。
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。経口治療投与の目的のため
、活性化合物は、賦形剤と共に取り込まれて、錠剤、トローチ剤またはカプセル、例えば
、ゼラチンカプセルの形態で使用されてよい。経口組成物は、口腔洗浄薬としての使用の
ための流体担体を使用して調製することもできる。医薬品または化粧品として適合性の結
合剤および／またはアジュバント材料が、組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸剤
、カプセル、トローチ剤その他は、次の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有
することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン等、バイン
ダー；デンプンもしくはラクトース等、賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくは
コーンスターチ等、崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ等、滑
沢剤；コロイド性二酸化ケイ素等、流動促進剤；スクロースもしくはサッカリン等、甘味
剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ風味付け等、調味料。経口
送達のための組成物は、胃腸管内における安定性を改善するためおよび／または吸収を増
強するための薬剤を有利に取り込むことができる。
吸入による投与のため、現在開示されている組成物は、適した噴霧剤、例えば、二酸化
炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロ
ゾルスプレーの形態で送達することができる。液体エアロゾル、乾燥粉末その他を使用す
ることもできる。
現在開示されている組成物の全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。
経粘膜または経皮投与のため、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が、製剤において使用
される。このような浸透剤は一般に、本技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のた
め、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の
使用により達成することができる。経皮投与のため、活性化合物は、一般に本技術分野で
公知の通り、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームへと製剤化される。
本明細書に記載されている組成物は、直腸送達のため、坐薬（例えば、カカオバターお
よび他のグリセリド等、従来の坐薬基剤による）または停留浣腸の形態で調製することも
できる。
投与および投薬量均一性を容易にするための投薬量単位形態で経口または非経口的組成
物を製剤化することが有利である。投薬量単位形態は、本明細書において使用する場合、
処置されるべき対象のための単位投薬量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位
は、要求される医薬品または化粧品担体に関連した所望の治療効果を生じるように計算さ
れた所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投薬量単位形態に関する詳述は、（ａ）
活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の処
置のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の限界によって指示され、これ
らに直接依存する。投薬に関するガイダンスについては、本明細書の他の箇所で示す。
本明細書において使用する場合、「治療活性」は、本明細書に記載されている組成物を
参照する場合、それを必要とする対象に投与されたときに、所望の薬理的および／または
生理的効果を誘発することができる意図される活性である。
本明細書において使用する場合、用語「処置」または「予防」は、所望の薬理的および
／または生理的効果を得ることを指す。効果は、特定の感染もしくは疾患またはその徴候
もしくは症状の完全または部分的予防の観点から予防的であり得る、および／あるいは感
染もしくは疾患、および／または感染もしくは疾患に起因し得る有害効果の部分的または
完全治癒の観点から治療的であり得る。したがって、本方法は、本発明の組成物を受ける
対象における疾患または障害の有害効果を「予防する」（すなわち、遅延または阻害する
）および／または「低下させる」（すなわち、減少させる、遅らせるまたは寛解する）。
対象は、ヒト等の哺乳動物を含み、ネコまたはイヌ対象等の飼育動物、ウシ、ウマ、ヤギ
、ヒツジおよびブタ対象等が挙げられるがこれらに限定されない家畜、野生動物（野生の
ものであれ、動物園のものであれ）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イ
ヌ、ネコ等々の研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽類等々の鳥類種を含むがこれ
らに決して限定されることがない、すなわち、獣医学使用のための、いずれかの動物であ
り得る。
いずれかの種類の望まれない状態または疾患は、現在開示されている組成物により治療
的に処置することができる。一部の実施形態では、処置されるべき疾患または望まれない
状態は、がんである。本明細書の他の箇所に記載されている通り、用語「がん」は、いず
れかの種類の調節されていない細胞成長を包含し、あらゆる形態のがんを含む。一部の実
施形態では、処置されるべきがんは、結腸直腸がんである。がん成長または進行の阻害を
検出するための方法は、本技術分野で公知であり、そのようなものとして、そのサイズの
低下を検出するための原発性腫瘍のサイズの測定、二次腫瘍の遅延した出現、二次腫瘍の
遅くなった発症、二次腫瘍の減少した出現、および疾患の二次効果の遅くなったまたは減
少した重症度が挙げられるがこれらに限定されない。
当業者であれば、本明細書に記載されている組成物の投与を、単独で、または外科的治
療法、放射線療法もしくは薬物等のいずれかの種類の治療剤による処置が挙げられるがこ
れらに限定されない、他の治療モダリティと併せて使用することができることを理解する
であろう。対象ががんを患う実施形態では、本明細書に記載されている組成物は、本技術
分野で周知のいずれかの化学療法剤と組み合わせて送達することができる。
一部の実施形態では、細胞傷害性生物活性化合物および本明細書に記載されている組成
物は、対象に同時に投与することができ、細胞傷害性生物活性化合物および本明細書に記
載されている組成物は両者共に、対象に投与される単一の組成物内に存在する。あるいは
、他の実施形態では、細胞傷害性生物活性化合物および本明細書に記載されている組成物
は、別々の組成物において逐次に投与される。「逐次に」とは、２種の組成物が、２種の
別個の組成物の２回の別々の投与により、対象に次々に投与され、一方の組成物は、細胞
傷害性生物活性化合物を含み、他方の組成物は、本明細書に記載されている組成物を含む
ことを意図する。
それを必要とする対象に投与される場合、本明細書に記載されている組成物は、本明細
書の他の箇所に論じられている通り、標的化リガンドをさらに含むことができる。これら
の実施形態では、標的化リガンドは、物理的に会合されたリガンドまたは複合体を、対象
内の標的化される細胞または組織に標的化させるであろう。一部の実施形態では、標的化
送達系は、細胞傷害性である。ある特定の実施形態では、標的化される細胞または組織は
、望まれない状態に罹患するまたはこれによって特徴付けられるであろう。
投薬
本明細書に記載されている組成物の治療有効量の送達は、この薬剤の治療有効用量を含
む医薬組成物の投与により得ることができる。「治療有効量」または「用量」とは、所望
の治療効果の誘発に十分な、本明細書に記載されている組成物の濃度を意味する。
本明細書において使用する場合、「有効量」は、有益なまたは所望の臨床または生化学
的結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１または複数回投与することができる
。
本明細書に記載されている組成物の有効量は、対象の体重、性別、年齢および病歴に従
って変動するであろう。有効量に影響を与える他の因子として、対象の状態の重症度、処
置されている障害、および要望に応じて、脂質または脂質を含む複合体と共に投与されて
いるアジュバント治療剤を挙げることができるがこれらに限定されない。有効性および投
薬量を決定するための方法は、当業者にとって公知である。例えば、参照により本明細書
に組み込む、Isselbacherら（１９９６年）Harrison's Principles of Internal Med
icine、第１３版、１８１４〜１８８２頁を参照されたい。
医薬組成物は、要求に応じて様々な間隔で、異なる期間にわたって、例えば、１日当た
り複数回、毎日、１日おきに、１週間に１回を約１〜１０週間の間、２〜８週間の間、約
３〜７週間の間、約４、５または６週間その他で投与することができる。当業者であれば
、疾患、障害または望まれない状態の重症度、以前の処置、対象の総体的な健康および／
または年齢、ならびに存在する他の疾患または望まれない状態が挙げられるがこれらに限
定されない、ある特定の因子が、対象を有効に処置するために要求される投薬量およびタ
イミングに影響を与え得ることを認めるであろう。一般に、対象の処置は、単一の処置を
含むことができる、または多くの場合、一連の処置を含むことができる。
本明細書に記載されている組成物の適切な用量が、その効力に依存し、任意選択で、例
えば、予め選択された所望の応答が達成されるまで増加用量の投与により、特定のレシピ
エントに合わせることができることを理解されたい。いずれか特定の動物対象に特異的な
用量レベルが、用いられている本明細書に記載されている特異的組成物の活性、対象の年
齢、体重、総体的な健康、性別および食事、投与の時間、投与の経路、排泄率、いずれか
の薬物組合せ、ならびにモジュレートされるべき発現または活性の程度を含む、種々の因
子に依存し得ることが理解される。
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の治療有効用量は、間欠
的に投与される。「間欠的投与」とは、本明細書に記載されている組成物の治療有効用量
の投与に続く中断の期間と、次いでこれに続く治療有効用量の別の投与、その他を意図す
るものである。治療有効用量の投与は、例えば、徐放製剤によるような、連続的様式で達
成することができる、または例えば、１日当たり１、２、３回またはそれよりも多い投与
によるような、所望の一日投薬量レジメンに従って達成することができる。「中断の期間
」とは、本明細書に記載されている組成物の連続的徐放または毎日投与の中断を意図する
ものである。中断の期間は、連続的徐放または毎日投与の期間よりも長くても短くてもよ
い。中断の期間において、関連する組織における本明細書に記載されている組成物の効果
のレベルは、処置中に得られる最大レベルを実質的に下回る。一部の実施形態では、中断
期間は、有効用量の濃度に依存する。中断期間は、少なくとも２日間、少なくとも４日間
または少なくとも１週間であり得る。他の実施形態では、中断の期間は、少なくとも１ヶ
月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間またはそれよりも長い。徐放製剤が使用される場合
、中断期間は、治療部位における本明細書に記載されている組成物のより長い滞留時間を
説明するために拡張されなければならない。あるいは、徐放製剤の有効用量の投与の頻度
は、それにしたがって減少されてよい。本明細書に記載されている組成物の投与の間欠的
スケジュールは、所望の治療効果および最終的に、疾患または望まれない状態の処置が達
成されるまで続けることができる。
当業者は、現在開示されている主題の審査により、その薬学的に許容される塩および医
薬組成物を含む現在開示されている組成物が、細胞、細胞培養物、細胞培養培地、組織、
組織培養物、組織培養培地その他に直接的に投与され得ることを認めるであろう。本明細
書に記載されている組成物を参照する場合、用語「投与」およびその派生は、化合物が細
胞に接触することを可能にするいずれかの方法を含む。現在開示されている組成物または
その薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖ
ｏで細胞または組織に投与され得る（またはこれと接触され得る）。現在開示されている
組成物またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物はまた、個々の対象、例えば
、患者への投与によって、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている通り、全身投与
（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下または頭蓋内投与）または外用適用によって
、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞または組織に投与され得る（またはこれと接触され得る）。
ＩＶ．製造品
製造品は、乾燥または液体のいずれかの形態で、本方法に適した組成物をいずれかの担
体と共に含有するバイアルまたは他の容器を含むことができる。製造品は、本発明の方法
を実施するために、容器上のラベルの形態で、および／または容器がパッケージングされ
た箱の中に入れられた能書の形態で、説明書をさらに含む。説明書は、バイアルがパッケ
ージングされた箱の上に印刷されていてもよい。対象または当該分野の従事者が、医薬組
成物を投与することができるように、説明書は、十分な投薬量および投与情報等の情報を
含有する。当該分野の従事者が、組成物を投与することができるいずれかの医者、看護師
、技術者、配偶者または他の介護者を包含することが予想される。医薬組成物は、対象に
よって自己投与されてもよい。
次の実施例は、限定としてではなく説明として提供される。
信頼できる同一遺伝子同所性結腸直腸肝臓転移の動物モデルの開発および使用は、結腸
直腸肝臓転移形成の駆動におけるＣＸＣＬ１２の役割をさらに調べることを可能にした。
Ｚｈａｎｇらによって最初に報告されたこのモデルは、盲腸壁に接種され、肝臓転移の高
出現率（ほぼ９０％）を生じるＣＴ−２６ ＦＬ３細胞（２．０×１０６個）が関与する
（Zhang, Y.ら、Development and Characterization of a Reliable Mouse Mode
l of Colorectal Cancer Metastasis to the Liver.、Clin Exp Metastasis、
３０巻（７号）、２０１３年）。ＣＴ−２６ ＦＬ３（ＲＦＰ／Ｌｕｃマーカー遺伝子を
安定して発現する）細胞株の確立により、ルシフェラーゼ生物発光解析を使用して、小さ
な操作された抗体結合ドメインＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１−トラップタンパク質（２８．
６ｋＤ）をコードするｐＤＮＡを送達するガラクトース−ＰＥＧ−ＬＣＰナノ粒子の静脈
内（ＩＶ）注射が、転移性病変に抵抗するように肝臓をプライミングすることを実証した
。
材料と方法
１．材料
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ
−［サクシニル（ポリエチレングリコール）−２０００］−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｎ−ヒドロキシルサクシニミド（ＮＨＳ））をＮＯＦ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。０．０５Ｎ ＨＣｌ中
の放射性１７７ＬｕＣｌ３をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．から購入し、受け取り次
第利用した。ＰＢＳバッファーにおける１０ｅｑ．の４−アミノフェニルβ−ｄ−ガラク
トピラノシドおよび１ｅｑ．のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳのコンジュゲーション
と、続くクロロホルム抽出およびＭＷＣＯ １０００透析管を使用した水に対する透析に
より、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ガラクトースを合成した。他のあらゆる脂質は、Ａｖ
ａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入
した。ペプチドは、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａ
ｙｗａｒｄ、ＣＡ）から購入した；単環式はｍｃと略す。ヘキスト核酸染色剤３３４２は
、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ
Ｙ）から購入した。蛍光Ｃｙ３ ｃＤＮＡ標識キットは、（Ｍｉｒｕｓ ＬａｂｅｌＩＴ
キット、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）経由で取得した。ルシフェリンは
、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）をコードするプラスミドは、Ｂａｙｏｕ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｈａｒａｈａｎ、ＬＡ
）によって特注調製された。ＥＬＩＳＡ、ＩＦおよびＩＨＣキット、ならびに抗Ｈｉｓタ
グ、抗ＣＸＣＬ１２および抗ＣＤ８ならびに二次抗体を含むあらゆる抗体は、Ａｂｃａｍ
（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を通じて購入した。侵入および遊走アッセイキットは、Ｅ
ＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通じて購入した。他のあらゆ
る化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得て、さら
に精製することなく使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（各ほぼ１８ｇ）は、Ｃｈａ
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から
購入した。
２．方法
ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質による遊走および侵入のｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制：操作
されたタンパク質（ＣＸＣＬ１２トラップ）を検査して、ＣＴ−２６ ＦＬ３遊走および
侵入を抑制するその能力を決定した。走化性９６ウェル細胞遊走および２４ウェル細胞侵
入アッセイ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用した。細
胞を２４時間飢餓状態にし、無血清培地において０．５×１０６細胞／ｍｌの密度でトラ
ンス（trans）−ウェルプレート上に播種した。１群の細胞は、そのまま無血清培地に維
持したが、他の全群には、フィーダートレーにおいてケモカイン（走化性因子）ＣＸＣＬ
１２（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。さらに、ＣＸＣＬ１２が存在する３群には、無血
清培地（処置なし）、ＣＸＣＬ１２トラップ（２、４、８、１２μｇ／ｍｌ）または市販
のＣＸＣＬ１２ ｍＡｂ（Ａｂｃａｍ）（１、２、４μｇ／ｍｌ）を添加した。４および
２４時間の（遊走）ならびに２４時間（侵入）の、５％ＣＯ２環境における３７℃のイン
キュベーション。遊走／侵入プレートの底面から細胞を取り外し、収集し、溶解した。ル
シフェリン（ルシフェラーゼアッセイ溶液）と共に溶解バッファーを添加し、これを生物
発光プレートリーダーにより解析する。バックグラウンドウェルを減算し、無処置（ＣＸ
ＣＬ１２走化性因子なし）と比べた定量化を報告した。
ＤＮＡをロードしたＬＣＰの調製および特徴付け：改変されたプロトコールを使用して
ＬＣＰを調製した。Ｉｇｅｐａｌ ５２０およびシクロヘキサン（３：７ｖ／ｖ）の、２
種の別々のマイクロエマルション（各６０ｍＬ）を調製し、撹拌下に置いた。１，８００
μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２が添加された、ＤＮＡ（１８０μｇ）溶液を調製した。この
溶液に、２：１のＮ：Ｐ比で（ほぼ２００μｇ）オクタアルギニンペプチド（ｍｃ−ＣＲ
８Ｃ）を添加し、マイクロエマルションへと直ちに添加した。Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（１，
８００μＬ、５０ｍＭ）も調製し、他のマイクロエマルションに添加した。各マイクロエ
マルションを２０分間撹拌した。Ｎａ２ＨＰＯ４を含有するマイクロエマルションを、Ｄ
ＮＡ／ペプチド／ＣａＣｌ２を含有するマイクロエマルションに添加した。この溶液を５
分間撹拌し、その後、１，２００μＬの２０ｍＭ ＤＯＰＡ（ＣＨＣｌ３中）を添加した
。ＤＯＰＡの添加後に、さらに３０分間マイクロエマルションを撹拌したままにした。等
容量の１００％ＥｔＯＨ（１２０ｍｌ）を添加して、エマルションを破壊した。この混合
物を５０ｍｌコニカル遠心管に移し、１０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清をデ
カントした後に、その後１００％ＥｔＯＨで沈殿物を２回洗浄して、Ｉｇｅｐａｌおよび
／またはシクロヘキサンの痕跡を除去した。次いで、Ｎ２下で沈殿物を乾燥させ、ＣＨＣ
ｌ３に再懸濁した。大きな凝集塊の除去のため、この溶液を１０，０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、ＬＣＰ「コア」（ＤＯＰＡの脂質単層を支持し、これに囲まれた、リン酸カ
ルシウムナノ沈殿物内に捕捉されたＤＮＡおよびペプチド）を含有する上清を回収した。
ＤＮＡ捕捉効率を特徴付けるために、メーカーの説明書に従って、ｃＤＮＡをＣｙ３（
Ｍｉｒｕｓ ＬａｂｅｌＩＴキット、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で標
識した。このようなＣｙ３−ＤＮＡをＬＣＰコアへと製剤化し、その後、回収を蛍光分光
測定により査定した。さらなる試験は、ヘキスト（Hoescht）核酸染色剤を使用して、ｐ
ＤＮＡ／ペプチドが被包されるＤＮＡ捕捉効率を確認し、コアを酢酸バッファーに溶解し
、プロテアーゼＫの添加によりペプチド／ＤＮＡを解離させ、ヘキスト（Hoescht）染色
剤を添加し、蛍光分光測定により査定した。１７７ＬｕＣｌ３と共にｐＤＮＡ／ペプチド
がカルシウムエマルションのＣａＣｌ２溶液に取り込まれた、１７７Ｌｕ標識されたＬＣ
Ｐコアを上述の通りに調製した。２種のエマルションの共沈殿後に、１７７Ｌｕを含有す
る凝集塊を除去するＣＨＣｌ３における遠心分離により、１７７Ｌｕ標識されたＬＣＰコ
アを上述の通りに収集した。最終ＬＣＰコアは、１７７Ｌｕの８０％を被包した。遊離脂
質およびコアの混合物の乾燥ならびに５％スクロース水溶液による再水分補給により、最
終Ｇａｌ−ＬＣＰ−ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃを産生した。最適な最終粒子製剤のための
外葉脂質に対するコアの比は、１１ｍｇコア：６００μｌ ＤＯＴＡＰ（２０ｍＭ）：６
００μｌコレステロール（２０ｍＭ）：５００μｌ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（２０ｍ
Ｍ）であることが判明した。その中で、３５ｍｏｌ％ＤＯＴＡＰ、３５ｍｏｌ％コレステ
ロールおよび３０ｍｏｌ％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（または２５ｍｏｌ％ＤＳＰＥ−Ｐ
ＥＧおよび５ｍｏｌ％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｇａｌ）を外葉脂質として利用した。Ｍａｌｖ
ｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏシリーズ（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使
用して、ＬＣＰのゼータ電位および粒子サイズを測定した。ＪＥＯＬ １００ＣＸ ＩＩ
ＴＥＭ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を使用して、ＬＣＰのＴＥＭ画像を取得した。
Ｇａｌ−ＬＣＰ−ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃの薬物動態、体内分布および細胞分布：上
述の通りに１７７ＬｕとｐＤＮＡの同時被包により、薬物動態および定量的体内分布を決
定した。このような方法は、ＬＣＰ体内分布を正確に決定するために以前に利用された。
８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（群毎に６匹のマウスを利用）に、１７７Ｌｕの１×１０８
ｃｐｍ／ｋｇの用量に対応する、０．５ｍｇ ｐＤＮＡ／ｋｇのＬＣＰを個々に注射した
（０．２ｍＬ、スクロースの添加によりモル浸透圧濃度のバランスを保つ）。薬物動態解
析のため、尾に切れ目を入れて出血させることにより、様々な時点（０．５、１、２、４
、８、１２および１６時間）で血液を回収した。体内分布解析のため、ＬＣＰの投与１６
時間後に、血液および主要な臓器を収集した（時点毎に６匹のマウスを利用）。γ−カウ
ンターを使用して、両方の試験における血液および組織中の放射活性を測定した。Ｐｈｏ
ｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン６．３、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を利用した２区画モデル下で、解析を
行った。
ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子用量漸増および発現時間：Ｃ末端にＨｉｓタグを含有するｐＣＸ
ＣＬ１２トラップ ＤＮＡを含有するガラクトース標的化ＬＣＰの製剤を、尾静脈を介し
て８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（０．１、０．５または１ｍｇ ＤＮＡ／ｋｇ、群毎に３
匹のマウスを利用）に注射した（０．２ｍＬ、スクロースの添加によりモル浸透圧濃度の
バランスを保つ）。発現が用量依存性であるか決定するための、ｐＣＸＣＬ１２トラップ
ＤＮＡ ＬＣＰの増加濃度の尾静脈ＩＶ投与後のウェスタンブロット解析および定量化
。投与２４時間後にマウスを絶命（sacked）させた。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および
血液を収集し、ＲＩＰＡバッファー中でホモジナイズした。ビシンコニン酸タンパク質ア
ッセイキット（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ
Ｌ）により、溶解物中の総タンパク質濃度を決定した。その後、ウェスタン解析のために
５０μｇの総タンパク質をロードした。所望のＣＸＣＬ１２トラップタンパク質は、２８
．６ｋＤの分子量を有する。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。Ｈｉｓ（６
×）タグマウス抗体を一次抗体として使用した。ＰＢＳ処置された群を上回る相対的ＨＲ
Ｐ強度増加として、ｐＣＸＣＬ１２トラップの発現を定量化した。
さらなる発現解析のために５μｇの総タンパク質をロードした、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡ
キットも使用した。キットは、標準較正対照として使用されるためのＨｉｓタグを含有す
る標準タンパク質を提供した。したがって、ＥＬＩＳＡ解析によりタンパク質発現の定量
化を測定することができる。用量漸増および発現試験の後に、ｉｎ ｖｉｖｏ治療試験の
ために０．５ｍｇ ＤＮＡ／ｋｇ用量を選んだ。
Ｃ末端にＨｉｓタグを含有する、ｐＣＸＣＬ１２トラップをコードするｐＤＮＡを含有
するガラクトース標的化ＬＣＰの製剤を、尾静脈を介して８週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（
０．５ｍｇ ＤＮＡ／ｋｇ×３、ＱＯＤ、群毎に３匹のマウスを利用）に注射した（０．
２ｍＬ、スクロースの添加によりモル浸透圧濃度のバランスを保つ）。一過性発現時間を
決定するための、ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＤＮＡ ＬＣＰの尾静脈ＩＶ投与後のウェス
タンブロット解析および定量化。投与１、２、４または８日後に、マウスを絶命させた。
肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および血液を収集し、ＲＩＰＡバッファー中でホモジナイズ
した。ＢＣＡを使用して、タンパク質含有量を測定した。その後、ウェスタン解析のため
に５０μｇの総タンパク質をロードした。臓器対肝臓発現レベルを解析し、臓器および肝
臓発現の定量化における一貫性を維持するために、全ゲルに特異的な臓器および標準肝臓
試料をロードした。ＰＢＳ処置された群を上回る相対的ＨＲＰ強度増加として、ｐＣＸＣ
Ｌ１２トラップの発現を定量化した。
毒性および病理試験：ｐＣＸＣＬ１２トラップ、ｐＧＦＰ、ブランクロードされたＬＣ
Ｐ（０．５ｍｇ ＤＮＡ／ｋｇ×３、ＱＯＤ）によりマウスを処置した（群毎に３匹のマ
ウスを利用）。さらに、別の処置群に、遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（１．０ｍ
ｇタンパク質／ｋｇ×３、ＱＯＤ）を投与した。最終尾静脈注射２４時間後にマウスを絶
命させた。心穿刺および遠心分離によりマウスから血清を得た。血清試料におけるＡＳＴ
、ＡＬＴおよびＢＵＮのレベルを測定することにより、肝および腎損傷を査定した。白血
球細胞、リンパ球、顆粒球および単球を含む血球細胞レベルを全血解析により測定した。
ＵＮＣ Ｃｈａｐｅｌ ＨｉｌｌにおけるＡｎｉｍａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによっ
て、これらの測定値を定量化した。さらに、各マウスの主要な臓器を収集し、固定し、そ
の後トリクローム染色のために加工した。１０×対物レンズによりＮｉｋｏｎ光学顕微鏡
を使用して、組織切片の画像を収集した。
ｉｎ ｖｉｖｏ肝臓転移抑制：マウスの盲腸壁に、２×１０６個のＣＴ−２６ ＦＬ３
ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種した。１０、１２および１４日目における１０μｇ（ｐＤＮ
Ａ）Ｇａｌ−ＬＣＰ−ｐＣＸＣＬ１２トラップ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃの処置を、尾静脈ＩＶを
介して投与した（ｎ＝７）。対照群は、ＰＢＳ／無処置（ｎ＝７）およびＧａｌ−ＬＣＰ
−ＧＦＰ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃ（ｎ＝６）を含んだ。腫瘍量の進行は、２００μｌルシフェリ
ン（１０ｍｇ／ｍｌ）ＩＰの投与によって追跡された。ルシフェリンの投与１０分後にル
シフェラーゼ生物発光イメージングを記録した。２４日目のマウス腫瘍量は、Ｋｏｄａｋ
カメラを備えるＩＶＩＳを使用した生物発光画像の上に示されている。２４日後に、マウ
スを絶命させ、肝臓を摘出した。肝臓における腫瘍負荷の定量化を、ｉｍａｇｅ Ｊソフ
トウェアを使用して定量化した。定量化は上に示されており、腫瘍負荷は、対照群と比較
して、８５％を超えて低下されることが判明した。処置後の他の臓器転移性負荷のさらな
る解析を試験した。２００μｌのルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）によりマウスが処置さ
れた場合の、マウス転移を２４日目に査定した。マウスを撮像し、絶命させ、次いで臓器
を摘出し、ルシフェリン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液中に置き、生物発光に関して撮像した。
統計解析：データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。２つの値セットのみが比
較された場合、ステューデントｔ検定によって統計解析を行い、データに３つまたはそれ
よりも多い群が関与した場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、続くダネット検定に
よって行った。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、０．０１および０．００１
を表示し、有意とみなされ、図または図の説明文に記述された。全統計において、群は、
無処置対照に対して比較される。
（実施例１）
ガラクトース−ＬＣＰ ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃナノ粒子の製剤
Ｈｕらは、ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃカーゴを有するガラクトース−ＬＣＰの製剤およ
びマウスの肝臓（肝細胞）への送達を最初に報告した（Hu, Y.ら、A Highly Efficien
t Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyte Nucle
i in Vivo.、ACS Nano、２０１３年、７巻（６号）：５３７６〜５３８４頁）。報告
される通り、リバースマイクロエマルションを使用して、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）コーティングされたリン酸カルシウム（ＣａＰ
）ナノ粒子（ＬＣＰ「アモルファスコア」）を調製した。これらのコアは、ＤＮＡ（６０
％効率）およびカチオン性ペプチドの両方を被包することができ、直径１５〜２５ｎｍに
及ぶコアサイズを生じる。中空コア構造は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）下で可視化す
ることができる（図３Ａ／Ｂ）。その後、ＣａＰコアを囲むＤＯＰＡ単層は、カチオン性
外葉脂質（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ
）、ヘルパー脂質コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−
ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［サクシニル（ポリエチレングリコール）−２０
００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００））の付加を可能にして、ＲＥＳ逃避を支援し、６０ｎ
ｍ以下の粒子を産生する（図３Ａ〜Ｃに示す「最終」ＬＣＰ、４０〜６０ｎｍの直径、こ
れは、肝類洞開窓を容易に浸透し得る）。
（実施例２）
ＬＣＰナノ粒子サイズの決定
ＬＣＰ粒子の水力学的直径および表面電荷は、動的光散乱により、およそ４５ｎｍおよ
び１０ｍＶであることが判明した（図３Ｃ）。動的光散乱は、ＬＣＰが、直径４５ｎｍ前
後に狭く分散し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のカチオン遮蔽能力と共にＤＯＴＡＰのカチ
オン性電荷のため、正のゼータ電位（＋１０ｍＶ前後）を有することを示した。ＬＣＰお
よびリポソーム混合物は、２３６±３２ｎｍのｚ−平均をもたらす；ｎ＝６。溶液は、３
７℃で少なくとも２４時間１０％ウシ胎仔血清において安定し、その際に、ｚ−平均の有
意な増加が観察されなかったことが判明した（図３Ｄ）。
（実施例３）
ＬＣＰコアにおけるｐＤＮＡ被包効率
ガラクトース−ＬＣＰ ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８ＣのｐＤＮＡローディングの決定は、
酢酸バッファー環境（ｐＨ＝４）におけるコアの溶解により達成された。プロテアーゼＫ
溶液の添加により、ペプチドからＤＮＡを解離した。ヘキスト染色剤の添加は、定量的蛍
光読み取りを可能にして、ＤＮＡ被包効率を決定した。ＤＮＡ被包効率は、Ｈｕらの製剤
に密接に対応する、およそ５０〜６０％であることが判明した（Hu, Y.ら、A Highly
Efficient Synthetic Vector: Nonhydrodynamic Delivery of DNA to Hepatocyt
e Nuclei in Vivo.、ACS Nano、２０１３年、７巻（６号）：５３７６〜５３８４頁
）。
（実施例４）
ガラクトース−ＬＣＰ−ｐＤＮＡ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃナノ粒子ＰＫおよび臓器／肝臓蓄積
ｐＤＮＡ／ｍｃＣＲ８Ｃ ＬＣＰコアへのＬｕ１７７放射性同位元素の取り込みにより
、肝臓特異性、薬物動態および臓器分布を決定した。Ｌｕ１７７を含有するガラクトース
−ＬＣＰ ｐＣＸＣＬ１２トラップ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃ（ｐトラップ ＬＣＰ）粒子を、尾
静脈を介して正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。ＰＫおよび臓器分布プロファイルは、
ガラクトース−ＬＣＰナノ粒子が、それぞれ２０分間および１０５４分間のＴ１／２αお
よびＴ１／２βによる二相分布を示し、ならびにＩＶ注射１６時間後に肝臓に蓄積するお
よそ５０％のＬＣＰを示すことを見出した（図４）。ガラクトース標的化なしのｐトラッ
プ ＬＣＰ粒子の尾静脈注射は、肝臓蓄積の有意な減少である、およそ１０〜１５％蓄積
を示し、これは、Ｈｕらが報告した値に匹敵する。
（実施例５）
内在性ＣＸＣＬ１２のｉｎ ｖｉｖｏ肝臓発現プロファイル
罹患した（結腸直腸肝臓転移モデル）ＢＡＬＢ／Ｃマウスの肝臓における内在性ＣＸＣ
Ｌ１２の発現レベルを検証するために、本出願人らは、摘出し、ホルマリン固定し、パラ
フィン切片を作製し、一次ＣＸＣＬ１２抗体および蛍光でタグ付けされた（Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ５９４）二次抗体を用いた免疫蛍光染色によりＣＸＣＬ１２の量を査定した
。本出願人らは、本出願人らのｐトラップ ＬＣＰの送達が、ＣＸＣＬ１２捕捉による蛍
光シグナル減少および転移性病変減少による炎症減少を生じるかさらに査定した。したが
って、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ ｐＤＮＡ ＱＯＤ×３）の最終ＩＶ投与１０日後
に、本出願人らは、肝臓を収集し、肝臓をホルマリン固定し、パラフィン切片を作製し、
ＣＸＣＬ１２（赤色）に対する免疫蛍光染色を使用した。無処置（ＣＲＣなし）、無処置
（ＰＢＳ）、ガラクトース−ＬＣＰ ｐＧＦＰ／ｍｃ−ＣＲ８Ｃ（ｐＧＦＰ ＬＣＰ）、
ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ ＱＯＤ×３）を含む
、５群（そのうち４群はＣＲＣを含有）を試験した。図５ａに結果を示し、無処置および
ｐＧＦＰは、蛍光強度に有意差がなく、ＣＲＣなしマウス由来の無処置肝臓と比較して、
ＣＸＣＬ１２発現のおよそ５〜６倍増加を有した。しかし、両方のｐトラップ ＬＣＰ（
１０μｇ×１および１０μｇ ＱＯＤ×３）群は、無処置と比較してそれぞれ蛍光強度の
５分の２および５分の１の減少を示し、ＣＲＣなしマウス由来の無処置肝臓に見出される
ＣＸＣＬ１２のベースラインレベルに最終的に達した（ｐ＜０．０５）（図５Ａ）。ｐト
ラップ ＬＣＰ（１０μｇ×１および１０μｇ ＱＯＤ×３）の処置後の肝臓に見出され
るＣＸＣＬ１２の減少により、本出願人らは、切片をさらに染色して、内在性ＣＸＣＬ１
２によって補充されると考えられる、肝臓ＣＤ８Ｔ細胞集団（緑色）、ＭＤＳＣおよび調
節性Ｔ細胞における効果を決定した。健康（ＣＲＣなし）、無処置（腫瘍）、無処置（間
質）およびｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇを１日おき×３）を含む、４群を試験した。図
５Ｂに結果を示し、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ ＱＯＤ×３）群は、無処置と比較し
て減少蛍光強度を示した（ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。
（実施例６）
ｐトラップ ＬＣＰ投与後のＣＸＣＬ１２−トラップのｉｎ ｖｉｖｏ臓器発現／分布
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＶ尾静脈投与によるｐトラップ ＬＣＰの送達は、肝臓
に蓄積する注射用量の殆ど５０％を生じる（図４Ｂ）。Ｈｕらは、ＬＣＰの大部分が、肝
細胞に取り入れられ、発現されることを報告した。Ｈｕらは、ＰＥＧ密度減少およびガラ
クトース標的化リガンドの非存在が、クッパー細胞へと優先的に取り入れをシフトし、ｐ
ＤＮＡの発現レベルを減少させることも示した。したがって、肝細胞取り入れおよび発現
を保証するために、本出願人らは、Ｈｕらの製剤において使用されたＰＥＧ密度（３０％
ｍｏｌ．インプット）およびガラクトース標的化リガンドを模写する。本出願人らは、肝
臓、対、他の臓器／血清におけるｐＣＸＣＬ１２トラップの優先的発現をさらに調べて、
本出願人らが、このＣＸＣＬ１２トラップの優先的肝臓特異的発現を得ていることを保証
した。ｐＣＸＣＬ１２トラップの臓器発現を決定するために、本出願人らは、Ｃ末端にＨ
ｉｓタグを取り込み、これにより、ＨｉｓタグｍＡｂによるＥＬＩＳＡおよびウェスタン
ブロット解析を可能にした（図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ）。増加用量のｐトラップ ＬＣＰ
（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇ）によりマウスを処置し
た。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット解析により、本出願人らは、２４時間後に、肝
臓発現における用量依存性増加を見出し、他のオフターゲット臓器または血清には発現が
見られなかった（図５Ｄおよび５Ｅ）。さらなる試験において、ｐトラップ ＬＣＰ（０
．５ｍｇ／ｋｇ ＱＯＤ×３）を投与し、１、２、４および８日目にマウスを絶命させた
。臓器を収集し、抗ＨｉｓタグｍＡｂを使用したウェスタンブロットにより解析した（図
５Ｆ）。これらの結果は、ガラクトース−ＬＣＰベクターが、肝臓における優先的一過性
発現を可能にし、他のいずれかの臓器または血清においては最小の発現となることを明ら
かに実証する（図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ）。その後、本出願人らは、肝臓発現が、一過性
の特性を保持し、発現が、最終注射後（１０μｇ ｐＤＮＡ；０．５ｍｇ／ｋｇ ＱＯＤ
×３）最大８日間持続することが見出されることを報告する（図５Ｆ）。
肝臓、対、他の臓器／血清における緑色蛍光タンパク質プラスミド（ｐＧＦＰ）および
ＣＸＣＬ１２トラッププラスミド（ｐトラップ）の優先的発現を図５Ａに示す。最終ｐＧ
ＦＰ ＬＣＰ注射後２、４および８日目における臓器切片の蛍光顕微鏡解析により、本出
願人らは、最大４日間持続する一過性肝臓特異的発現を実証することができた。ＧＦＰシ
グナルは、他のいずれかの主要な臓器切片において見られなかった。さらに、ＧＦＰの発
現は、肝臓内の肝細胞集団に主に存在することが判明した（図５Ａ）。
（実施例７）
ｐトラップ ＬＣＰ投与後のマウスにおける結腸直腸肝臓転移の減少した出現および腫瘍
負荷
本出願人らは、マウスに見出される発生率および転移負荷におけるｐトラップ ＬＣＰ
の効果を試験した。マウスの盲腸壁に、２．０×１０６個のＣＴ−２６ ＦＬ３（ＲＦＰ
／Ｌｕｃ）細胞を同所性接種した。この一連の実験において、処置は、盲腸接種１０日後
に始まった。ＰＢＳ（無処置）、ｐＧＦＰ ＬＣＰからなるベクター対照およびｐトラッ
プ ＬＣＰを含む、３種の処置群について探索した。接種後１０日目に３種の処置群の投
与を開始し、１０、１２および１４日目にＩＶ尾静脈注射（１０μｇ ｐＤＮＡ）を行っ
た。総マウス腫瘍負荷は、２００μｌのルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）のＩＰ投与と、
続く生物発光解析により追跡した。マウス全体の腫瘍負荷を毎週記録し、１０日目より前
に処置群へとマウスを選別するために使用し、接種後２４日目のマウス全体の腫瘍負荷を
図１３に示す。２４日目に、２００μｌのルシフェリン（１０ｍｇ／ｍｌ）をＩＰ投与し
、盲腸における重度の原発性腫瘍負荷のためマウスを絶命させた。臓器を収集し、ＰＢＳ
においてすすぎ、その後、希釈されたルシフェリン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）中に置いた。生
物発光イメージングによって肝臓および他の臓器を解析して、転移腫瘍負荷を決定した（
図６Ａおよび６Ｂ）。生物発光解析後に、肝臓をＰＢＳにおいてすすぎ、ホルマリン溶液
において固定し、切片作製し、さらなる形態学的解析のためトリクローム染色した（図６
Ｃ）。ルシフェラーゼ（生物発光強度）から、ＰＢＳおよびｐＧＦＰ ＬＣＰが、肝臓に
大きな転移性腫瘍負荷を有し（図６Ａおよび６Ｂ）、これがその後、硬変および線維性組
織をより顕著にしていることが明らかである（図６Ｃ）。対照的に、ｐトラップ ＬＣＰ
（１０μｇ ｐＤＮＡ）３回（ＱＯＤ）により処置したマウスは、肝臓転移形成の発生率
の有意（肝臓転移負荷の１０分の１の低下）かつおよそ７０〜８０％の減少を示した。ト
リクローム染色された肝臓切片の顕微鏡解析により検出された線維性区域は、対照検体よ
りもｐＧＦＰ ＬＣＰマウス由来の検体において有意に少なかった（ｐ＜０．０１）（図
６Ｃ）。これは、本出願人らの知る限りにおいて、治療有効性を生じる、肝臓特異的非ウ
イルスベクターにおけるｐＤＮＡの送達による治療用タンパク質の発現に成功した最初の
報告である。さらに、本出願人らは、転移が、負荷および発生率において低下されたのみ
ならず、転移が、他の臓器に遊走および侵入することが見出されないことを観察する（図
６Ｂ）。
（実施例８）
がん特異的Ｔ細胞は、ｐトラップ ＬＣＰ治療法の抗転移有効性を増強する
ＣＤ８＋リンパ球の存在と共に、ｐトラップ ＬＣＰ処置後の肝臓における減少したＭ
ＤＳＣおよびＴｒｅｇ集団は、肝臓内における腫瘍促進性（免疫抑制性）から抗腫瘍の環
境へのシフトを意味づける。したがって、本出願人らは、ｐトラップ ＬＣＰ治療法後の
肝臓における転移の確立を減少させる細胞傷害性Ｔリンパ球の（ＣＴＬの）能力を試験し
た。がん特異的ＣＤ８ Ｔ細胞死滅を増強するｐトラップ ＬＣＰの能力を調べるために
、本出願人らは、枯渇したＣＤ８＋Ｔ細胞集団を有するマウスにおけるｐトラップ ＬＣ
Ｐの抗がん有効性を試験した。本出願人らは、Ｈａｒｉｍｏｔｏらによって報告されたも
のと同様のプロトコールに従い、４００μｇ抗Ｌｙｔ２．２（２．４３；ラットＩｇＧ２
ｂ）の２回の腹腔内注射後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の≧９５％が枯渇された（１４）。マ
ウスに、前に記載した同所性同一遺伝子モデルに従ってＣＲＣを接種し、続いて、処置前
にＴ細胞枯渇を行った。この一連の実験において、処置は、盲腸接種１０日後に始まった
。動物を３種の処置群に分けた：無処置（ＰＢＳ）、ｐトラップ ＬＣＰと抗ＣＤ８（抗
Ｌｙｔ２．２）、およびｐトラップ ＬＣＰと抗体アイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ｂ
アイソタイプ対照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の枯渇を維持するために、抗Ｌｙｔ２．２また
はアイソタイプ対照ＩｇＧ（４００μｇ）の腹腔内注射を８および１０日目に投与した。
接種後１０日目に処置を開始し、１０、１２および１４日目にＩＶ尾静脈注射（１０μｇ
ｐＤＮＡ）を行った。盲腸における重度の原発性腫瘍負荷のため、２１日目にマウスを
安楽死させ、生物発光イメージングにより肝臓腫瘍負荷を決定した（図７）。ＰＢＳによ
り処置した全マウスは、肝臓において大きな転移性腫瘍病変を発症した（図７）。抗Ｌｙ
ｔ２．２と、続く３用量のｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ ｐＤＮＡ）により処置したＴ
細胞枯渇マウスは、無処置マウスと同様の肝臓腫瘍負荷を示した。対照的に、アイソタイ
プ対照ＩｇＧ２ｂ抗体と、続くｐトラップ ＬＣＰにより処置したマウスは、無処置動物
と比較して、肝臓転移負荷の５分の１の低下および肝臓転移発生率のおよそ８０％の減少
を示した。これらの結果は、ＣＸＣＬ１２の低下と共にＣＴＬの存在が、肝臓における転
移性病変の確立のリスクを減少させることを示す。
（実施例９）
転移性負荷低下は、乳がん肝臓転移モデルにおける生存増加に関連する
本出願人らは、高悪性度マウス乳がん肝臓転移モデルにおいて、生存期間中央値および
肝臓腫瘍負荷におけるｐトラップ ＬＣＰの効果を試験した。乳がん肝臓転移モデルは、
高度に転移性のマウス乳がん細胞株４Ｔ１の半脾臓（hemi-splenic）植え込みからなる。
これらの試験は、原発性腫瘍が切除され、死亡が通常転移性負荷に起因する、臨床標準治
療をモデル化した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓の半分に、１．０×１０６個（０．１ｍＬ
）の４Ｔ１（ＧＦＰ／Ｌｕｃ）細胞を接種し、脾臓は、腫瘍接種前に結紮されて二等分に
分けられている。細胞を受けた半脾臓を接種１０分後に切除して、原発性腫瘍成長を減少
させた。この一連の実験において、接種後５分間以内のことが多い、肝臓への急速な細胞
遊走のため、処置は接種日に始まった（１５）。本出願人らは、乳がん肝臓転移モデルに
関して４種の処置群を試験した：無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰと抗ＣＤ８（１０
μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡおよび４００μｇ、２０ｍｇ／ｋｇ抗Ｌｙｔ２．２）
、ｐトラップ ＬＣＰと抗ＣＤ８（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡおよび４００
μｇ、２０ｍｇ／ｋｇ抗Ｌｙｔ２．２）、およびｐトラップ ＬＣＰとアイソタイプＩｇ
Ｇ（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡおよび４００μｇ、２０ｍｇ／ｋｇアイソタ
イプＩｇＧ）。ＰＢＳ、ｐＧＦＰ ＬＣＰまたはｐトラップ ＬＣＰを、０日目に開始し
て６日目に終了して、１日おきに尾静脈注射によりＩＶ投与した。抗Ｌｙｔ２．２または
アイソタイプＩｇＧ対照の投与は、０および２日目の２回のＩＰ注射を含んだ。生物発光
イメージングによって腫瘍進行をモニターした（図８Ａ）。次の状態のうち１種が当ては
まる場合、マウスを安楽死させた：１週間以内における１０％を超える劇的な体重増加も
しくは体重減少、または脱水、不活動もしくは息切れ／弱い呼吸等、窮迫の明らかな徴候
。接種１０日後に各群由来の３匹のマウスを安楽死させ、それらの臓器を収集し、ＰＢＳ
においてすすぎ、フローサイトメトリー解析によって腫瘍負荷に関して肝臓を解析した（
図８Ｂ）。ｐトラップ ＬＣＰ処置を受けなかったマウスは、接種後の第１週目以内に、
肝臓において大きな転移性腫瘍病変を発症した（図８Ａおよび８Ｂ）。対照的に、ｐトラ
ップ ＬＣＰにより処置したマウスは、肝臓転移負荷の低下および肝臓転移形成発生率の
減少、ならびに他の全ての処置群に対して（１４日対２５日）、生存期間中央値のほぼ２
倍の増加を示した（図８Ｃ）。
（実施例１０）
ｐトラップ ＬＣＰ、トラップタンパク質およびＣＸＣＲ４アンタゴニストによる肝臓転
移の確立の低下
本出願人らは、免疫不全胸腺欠損マウスにおけるヒト結腸直腸がん細胞株（ＨＴ−２９
）を使用して、肝臓転移の確立の低下における異なる治療モダリティ［抗ＣＸＣＬ１２ト
ラップタンパク質、ＣＸＣＲ４小分子アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００）およびｐトラッ
プ ＬＣＰ］の有効性を比較した。ＣＸＣＲ４の高発現を有する、結腸直腸がん細胞株Ｈ
Ｔ−２９を使用して、上述と同じ半脾臓植え込み手技に従って、ヒト結腸直腸がん肝臓転
移モデルを確立した（図１１）。この一連の実験において、接種後５分間以内の肝臓への
急速な細胞遊走のため、処置はこの場合も接種日に始まった（１５）。結腸直腸がん肝臓
転移モデルに関して試験した５種の処置群は、無処置（ＰＢＳ）、ｐＧＦＰ ＬＣＰ（１
０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｐＤＮＡ）、ｐトラップ ＬＣＰ（１０μｇ、０．５ｍｇ／
ｋｇ ｐＤＮＡ）、遊離ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ
タンパク質）およびＡＭＤ３１００（１００μｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ）であった。処置は
、０日目に開始して１６日目に終結して、１日おきに尾静脈注射によってＩＶ投与した（
図９Ａ）。３６日目にマウスを安楽死させ、その肝臓を収集し、ＰＢＳにおいてすすぎ、
肝臓から腫瘍小結節を切除し、秤量した（図９Ｂ）。ｐトラップ ＬＣＰまたはＡＭＤ３
１００処置を受けなかったマウスは、肝臓において多数の転移性腫瘍病変を発症した（図
９Ｂ）。対照的に、ｐトラップ ＬＣＰまたはＡＭＤ３１００により処置したマウスは、
他の全処置群と比較して、処置中に肝臓転移負荷の低下および肝臓転移形成の発生率の減
少を示した。
（実施例１１）
肝臓、腎臓および血液機能におけるｐトラップ ＬＣＰの効果（毒性解析）
ｐトラップ ＬＣＰの投与（１０μｇ ＱＯＤ×３）は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、クレアチニ
ンまたはＢＵＮレベルの有意な変化を示さず、また、最終ＩＶ尾静脈注射２４時間後に、
いずれかの臓器のトリクローム組織学切片の解析において毒性の徴候を示さなかった（図
１０Ａおよび１０Ｂ）。血液／免疫細胞レベルのさらなる解析は、無処置マウスと比較し
て、変化の徴候を示さなかった（図１０Ａ）。組織学的トリクローム臓器切片における毒
物学的解析も確認され、全処置が、正常な組織／細胞形態を示した（図１０Ｂ）。
（実施例１２）
併用療法
材料と方法
１，２−ジステアロイル（distearoryl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールア
ミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）］アンモニウム塩（ＤＳＰ
Ｅ−ＰＥＧ）は、ＮＯＦ（Ｅｂｉｓｕ Ｓｈｉｂｕｙａ−ｋｕ、Ｔｏｋｙｏ）から購入し
た。ジオレオイルホスファチジン酸（phosphatydic acid）（ＤＯＰＡ）および１，２−
ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンクロライド塩（ＤＯＴＡＰ）は、
Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）から購
入した。コレステロールおよびプロタミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。他のあらゆる化学物質は、特に言及されていない
場合、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
ＣＸＣＬ１２トラップ遺伝子構築：トラップ遺伝子の集合のために、ＣＸＣＬ１２結合
ＶＨおよびＶＬドメインのコード配列を使用した。ＣＸＣＬ１２トラップの最終配列は、
それぞれシグナリングペプチド、ＶＨドメイン、フレキシブルリンカー、ＶＬドメイン、
ＥタグおよびＨｉｓ（６×）タグをコードする。ｐＣＤＮＡ３．１のＮｈｅＩおよびＸｈ
ｏＩ部位の間に、完全ｃＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって正確さを確認
した。
ＰＤＬ１トラップ遺伝子構築：ＰＤ−Ｌ１トラップ遺伝子の集合のために、マウスまた
はヒトＰＤ−１の細胞外ドメインおよびマウスまたはヒトＣＭＰ１の三量体形成ドメイン
のコード配列を使用した。ＰＤ−Ｌ１トラップの最終配列は、それぞれシグナリングペプ
チド、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１結合ドメイン、フレキシブルリンカー、三量体形成ドメイン
、ＥタグおよびＨｉｓ（６×）タグをコードする。ｐＣＤＮＡ３．１のＮｈｅＩおよびＸ
ｈｏＩ部位の間に、完全ｃＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって正確さを確
認した。
細胞株：原発性腫瘍細胞株ＫＰＣ９８０２７由来のＫＰＣ膵管腺癌マウスモデル（ＬＳ
Ｌ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；ＬＳＬ−Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ、
Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド）は、Ｓｅｒｇｕｅｉ Ｋｏｚｌｏｖ博士（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって提供され、ダルベッコ変法イー
グル培地において培養した：３７℃および５％ＣＯ２、加湿雰囲気における、１０％ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充し
た栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）。細胞株のレンチウイルストランスフェク
ションを行い、ＫＰＣ９８０２７細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）
、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）およびピューロマイシン抵抗性遺伝子を保有するベク
ターにより安定してトランスフェクトされた。安定してトランスフェクトされたＫＰＣ９
８０２７細胞（ＫＰＣ９８０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃ）をピューロマイシンの存在下で選択
した。
マウスにおける同所性同種移植ＫＰＣモデル：植え込みの直前に、サブコンフルエント
なＫＰＣ９８２０７（ＲＦＰ／Ｌｕｃありまたはなし）細胞を収集し、リン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）において洗浄した。膵尾部への１×１０６個の細胞の同所性注射により、同所
性同種移植ＫＰＣモデルを確立した。簡潔に説明すると、ケタミン／キシラジン溶液のＩ
Ｐ注射によって８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに麻酔をし、仰臥位に置いた。正中線切開を
行い、脾臓および膵臓を露出させた。インスリンゲージ（gage）シリンジを使用して、４
０μＬにおける１×１０６個の細胞を膵尾部に注射した。そして、６−０ポリグリコール
酸縫合糸により腹壁および皮膚を閉鎖した。組織接着剤（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）
で注射部位を封着し、７０％アルコールで滅菌して、漏出した可能性があるがん細胞を死
滅させた。
抗体：免疫染色（ＩＦ）およびフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｒ）に使用し
た一次抗体、蛍光コンジュゲートした一次および二次を下表３に収載する。
Figure 2021105060
ＬＰＤの調製および特徴付け：本技術分野で十分に確立されたプロトコールに基づく段
階的自己集合プロセスにより、ＬＰＤを調製した。手短に説明すると、ＤＯＴＡＰおよび
コレステロール（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）をクロロホルムに溶解し、溶媒を除去した。
次いで、脂質薄膜に蒸留水を水分補給させて、最終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌコレステロール
およびＤＯＴＡＰを作製した。次いで、２００ｎｍおよび１００ｎｍポリカーボネート膜
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を通してリポソームを逐次押し出して、７０〜１００ｎｍ
単層膜リポソームを形成した。５％グルコースにおける１４０μＬの３６μｇプロタミン
を５％グルコースにおける等容量の５０μｇプラスミド（対照プラスミドとしてのｐｃＤ
ＮＡ３．１、またはＣＸＣＬ１２もしくはＰＤＬ１トラップをコードするプラスミドのい
ずれか）と混合することにより、ＬＰＤポリプレックスコアを製剤化した。混合物を室温
で１０分間インキュベートし、次いで６０μｌコレステロール／ＤＯＴＡＰリポソーム（
各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。１５％ＤＳＰＥ−ＰＥＧの後挿入を６０℃で１５分間
さらに行った。Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏシリーズ（Ｗｅｓｔｂｏ
ｒｏｕｇｈ、ＭＡ）によって、ＮＰのサイズおよび表面電荷を決定した。ＪＥＯＬ １０
０ ＣＸ ＩＩ ＴＥＭ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を使用して、ＮＰがネガティブ染色さ
れたＴＥＭ画像を取得した。
ＬＰＤ ＮＰの体内分布および細胞分布：およそ０．１％の疎水性色素ＤｉＩをＤＯＴ
ＡＰリポソーム中に取り込んで、ＤｉＩ標識されたＬＰＤ ＮＰを製剤化した。ＤｉＩ標
識されたＬＰＤ ＮＰの静脈内注射の２４時間後に、マウスを安楽死させ、主要な臓器お
よび腫瘍を収集した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ）により、主要な臓器におけるＬＰＤ ＮＰの
分布を定量的に可視化した。励起波長は５２０ｎｍに設定し、一方、発光波長は５６０ｎ
ｍに設定した。クリオスタット（Ｈ／Ｉ Ｈａｃｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ＆Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｗｉｎｎｓｂｏｒｏ、ＳＣ）によって肝臓および腫瘍の切片をさらに
作製して、組織内におけるＬＰＤ ＮＰの分布を定量化した。腫瘍における併用トラップ
ＬＰＤ ＮＰ処置前または後のＮＰの蓄積および分布をさらに比較および定量化した（
ｎ＝４）。
トラップタンパク質の一過性、局所的および腫瘍内細胞分布：ｐＣＸＣＬ１２トラップ
ＤＮＡ、ｐＰＤ−Ｌ１トラップ ＤＮＡを被包するＬＰＤ ＮＰの製剤を、ＫＰＣ９８
０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃ同種移植片を有するマウスに静脈内注射した（５０μｇプラスミ
ド／マウス）（毎日注射、合計して２回）。ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＤＮＡおよびｐＰ
Ｄ−Ｌ１トラップ ＤＮＡの両方は、Ｃ末端にＨｉｓタグを含有しており、これをトラッ
プタンパク質の発現のための追跡者として使用することができる。最終注射後１、３、５
日目に、マウスを屠殺し、主要な臓器および腫瘍を収集し、ＲＩＰＡバッファー中でホモ
ジナイズした。ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ＢＣＡタンパク質アッセイキ
ット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により、溶解物における総タンパク質濃
度を決定した。ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ，ＩＮＣ．、ｎ＝４）を使用して
、異なる時点での臓器および腫瘍におけるＨｉｓタグタンパク質のトランスフェクション
および発現効率を定量化した。ＣＸＣＬ１２トラップタンパク質も、マウスに直接的に静
脈内注射して、モニターされた時点での体内分布および蓄積レベルにおいてプラスミド対
応物と比較した。ＫＰＣ９８０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃを有するマウスにも、ｐＧＦＰ Ｄ
ＮＡを被包するＬＰＤ ＮＰの２用量の毎日注射を与えた。最終注射の３日後に、腫瘍組
織の凍結切片を作製し、線維芽細胞マーカーαＳＭＡ、白血球マーカーＣＤ４５および内
皮マーカーＣＤ３１の染色により加工した。腫瘍細胞にＲＦＰをプレトランスフェクトし
た。Ｎｉｋｏｎ光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ）を使用して、腫瘍組
織内の異なる細胞集団におけるＧＦＰタンパク質発現を観察した。ｉｍａｇｅ Ｊを使用
して、各種の染色由来の５枚の代表的な画像から、各細胞集団におけるＧＦＰ陽性細胞の
％を定量化した。ここに、計算の例を示す：
Figure 2021105060
腫瘍成長阻害、転移抑制および生存解析：上に言及されている通りに、ＫＰＣ９８０２
７ ＲＦＰ／Ｌｕｃ同種移植片を有するマウスを確立した。１３日目に処置を開始した。
次いで、次の通りの６群（ｎ＝５〜７）にマウスをランダム化した：無処置群（ＰＢＳ）
、Ｃｔｒｌ ＬＰＤ ＮＰ（ｐｃＤＮＡ３．１骨格により被包）、ＣＸＣＬ１２トラップ
／Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＰＤ−Ｌ１トラップ／Ｃｔｒｌ ＮＰ、併用トラップ ＮＰおよび遊
離併用トラップタンパク質。プラスミド／マウス当たり総計４用量の５０μｇのため、２
日毎に静脈内注射を行った。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｏｐｔｉｃａｌ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ）を使用して、５日毎に腫瘍成長をモニ
ターした。腫瘍体積の増加を強度の放射輝度として計算し、初期腫瘍体積により標準化し
た（Ｖｔ／Ｖ０）。異なる処置（各処置群においてｎ＝７）によるＫＰＣ９８０２７ Ｒ
ＦＰ／Ｌｕｃ同種移植片を有するマウスにおいて、長期生存もモニターした。２ヶ月間に
わたってマウスをモニターした。Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、カプラン・マイヤー曲線お
よび生存期間中央値を定量化および計算した。転移の試験のため、腫瘍を有するマウスを
、ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ（ｎ＝４）、ＰＤ−Ｌ１トラップ Ｎ
Ｐ（ｎ＝４）および併用トラップ（ｎ＝５）により処置した。接種１ヶ月後に、マウスに
１０ｍｇ／ｍＬルシフェリンを注射し、屠殺した。次いで、主要な臓器および腫瘍を摘出
し、ルシフェリンの溶液（５ｍ／ｍＬ）中に置き、生物発光に関して撮像した。次いで、
主要な臓器を固定し、Ｈ＆Ｅ染色により加工して、各臓器における腫瘍転移の病理を観察
した。
ＩＦＮ−γ産生のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：以前に記載した通りに、ＫＰＣ９８
０２７またはＫＰＣ９８０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃ同種移植片を有するマウスの脾臓細胞の
再刺激を行った。簡潔に説明すると、腫瘍接種１３日後に、健康なマウス、ＫＰＣ９８０
２７およびＫＰＣ９８０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃを有するマウスにおける脾臓を収集し、無
菌条件で単細胞懸濁液へと分離させた。ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ説明書に従
って、捕捉抗体コーティングされた９６ウェルプレートにおいてウェル当たり２×１０５
個の細胞を播種した。次いで、単細胞懸濁液を、不活性化ＫＰＣ９８０２７、ＫＰＣ９８
０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃ細胞溶解物または健康なマウス脾臓細胞溶解物のいずれかと３７
℃で４０時間共培養した。既定の時間（due time）において、数回の洗浄ステップによ
って細胞を除去した。検出抗体添加と、続く酵素コンジュゲート拡大によって、ＩＮＦ−
γの産生を測定した。ＢＤ ＥＬＩＳｐｏｔ基質セットにより赤色ドットシグナルを発色
させ、手作業で計算した。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ：ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ
、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、腫瘍組織から全ＲＮＡを抽出した。Ｆｉｒｓｔ
−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、ｃＤＮＡを逆転写した。
Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｓｙｓｔｅｍ（
Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により、１００ｎｇのｃＤＮＡを増幅した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応のためのマウス特異的プライマーを全て表４に収載する（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）。内在性対照としてＧＡＰ
ＤＨを使用した。７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して反応
を行い、７５００ソフトウェアによりデータを解析した。
Figure 2021105060
フローサイトメトリーアッセイ：フローサイトメトリーによって腫瘍浸潤免疫リンパ球
を解析した。簡潔に説明すると、組織を収集し、コラゲナーゼＡおよびＤＮＡａｓｅで３
７℃にて４０〜５０分間消化した。赤血球細胞溶解後に、１ｍＬのＰＢＳにより細胞を分
散させた。細胞内サイトカイン染色のため、メーカーの説明書に従って、浸透バッファー
（ＢＤ）により組織由来の細胞を浸透させた。異なる免疫リンパ球（５×１０６／ｍＬ）
を、以前のセクションで言及されている、フルオレセインにコンジュゲートされた抗体で
染色した。
免疫蛍光染色：脱パラフィンステップ、抗原回復および透過処理後に、組織切片を１％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において室温で１時間ブロッキングした。フルオロフォア
によりコンジュゲートされた一次抗体（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を
一晩４℃でインキュベートし、ＤＡＰＩ含有封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で核を対比染色した。全抗体をメーカ
ーのマニュアルに従って希釈した。蛍光顕微鏡法（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ
）を使用して、画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、３個のランダ
ムに選択された顕微鏡視野を定量的に解析した。
ＴＵＮＥＬアッセイ：ＤｅａｄＥｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙ
ｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、メーカー（manufactur
es）の説明書に従ってＴＵＮＥＬアッセイを行った。ＦＩＴＣ（緑色）により蛍光染色さ
れた細胞核をＴＵＮＥＬ陽性核として定義した。４，６−ジアミジノ（diaminidino）−
２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、スライドにカバーグラスを
かけた。蛍光顕微鏡法（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、ＴＵＮＥＬ
陽性核をモニターした。Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、３個のランダムに選択された顕微鏡
視野を定量的に解析した。
Ｈ＆Ｅ形態評価および血液化学解析：腫瘍阻害試験の最終処置４日後に、異なる処置に
よるマウスを全て毒性アッセイに付した。全血および血清の両方を収集した。全血細胞構
成成分をカウントおよび比較した。血清中のクレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血
清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフ
ェラーゼ（ＡＬＴ）を、腎および肝臓機能の指標としてアッセイした。心臓、肝臓、脾臓
、肺および腎臓を含む臓器を、ＵＮＣ組織学施設によるＨ＆Ｅ染色のために収集および固
定して、臓器特異的毒性を評価した。
統計解析：それぞれ２群または２群超を比較する場合、両側ステューデントｔ検定また
は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用し
て、統計解析を行った。Ｐ値が０．０５未満であった場合、差は、統計的に有意であると
みなした。
ｐＤＮＡ ＬＰＤ投与後の腫瘍微小環境内におけるｐＤＮＡ（トラップまたはＧＦＰ）の
一過性および局所的分布および発現
ＬＰＤは、抗がん療法のため、腫瘍にプラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む
巨大分子を優先的に送達する。ＬＰＤを調製するために、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）
をカチオン性プロタミンにより凝縮させて、僅かにアニオン性の複合体コアを形成した。
コアを、予め製剤化されたカチオン性リポソーム（ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびＤ
ＳＰＥ−ＰＥＧ）でさらにコーティングした。ＴＥＭ画像は、ＬＰＤのサイズ（ほぼ７０
ｎｍ）を確認し、その球状の形状および均質な分布を示す（図１４Ａ）。ＤｉＩのおよそ
０．１％が、ＤｉＩ標識されたＬＰＤの体内分布を評価するためのｉｎ ｖｉｖｏ追跡者
としてＬＰＤの脂質膜に取り込まれた。
膵尾部への初代ＫＰＣ９８０２７細胞の同所性注射から、線維形成性ＫＰＣ膵腫瘍モデ
ルを生成した。ＤｉＩ標識されたＬＰＤ ＮＰをマウスに静脈内注射した。注射２４時間
後に、主要な臓器におけるＮＰ蓄積を解析した。同様のサイズの他のＮＰと一貫して、肝
臓は、ＬＰＤ ＮＰを取り入れた主要な臓器であった（図１４Ｂ）。肝臓に加えて、腫瘍
は、別の主要なＮＰ蓄積部位である（図１４Ｂ）。組織の凍結切片データは、全肝臓組織
にわたるＤｉＩ標識されたＮＰの散乱した分布を示唆し、肝臓細胞の４０％超が標識され
ていた（図１４Ｃ）。対照的に、腫瘍細胞の２５％未満のみが、ＤｉＩ ＮＰを取り入れ
ており、大部分は膵腫瘍微小環境内の高い間質液流圧（ＩＦＰ）および厚い細胞外マトリ
ックスのため、腫瘍内のＮＰの分布は、不均一かつ不均等であった。ＬＰＤ送達プラスミ
ド（ｐＧＦＰ）のトランスフェクション効率の表示として、肝臓および腫瘍におけるＧＦ
Ｐタンパク質の分布をさらに比較した。肝臓におけるより高いＮＰ蓄積にもかかわらず、
腫瘍と比較して、ＧＦＰの発現は極めて低い（図１４Ｃ）。これは、血管近傍に局在化し
たクッパー細胞が、ＬＰＤ ＮＰを非特異的に貪食したことに起因する可能性がある。ク
ッパー細胞におけるプラスミドのトランスフェクション効率は、相対的に低い。したがっ
て、本出願人らの結果は、プラスミドを被包するＬＰＤが、ＫＰＣ膵がん内で局所的に送
達および発現され得ることを実証する。
免疫蛍光染色を行って、かさ高い腫瘍量内の様々な細胞集団におけるＬＰＤ蓄積を決定
した（図１４Ｄ）。ＲＦＰならびにマウスαＳＭＡ、ＣＤ４５およびＣＤ３１に対するフ
ルオロフォアコンジュゲートされた抗体の安定した導入遺伝子発現は、それぞれ腫瘍細胞
、線維芽細胞、白血球および内皮集団を定義した。結果は、腫瘍細胞が、ＮＰを取り入れ
る主要な細胞集団の１種であることを示す；腫瘍細胞の６０％超が、ＧＦＰを発現した。
加えて、線維芽細胞のほぼ３０％超が、ＬＰＤ ｐＧＦＰの静脈内注射（２用量、毎日）
４日後にＬＰＤを取り入れ、総ＧＦＰ陽性細胞のほぼ３０％を占める。対照的に、白血球
および内皮におけるＧＦＰの発現は無視できるほどのものであり、線維芽細胞が、ＮＰ分
布およびプラスミド発現の主要な間質オフターゲット部位であることを確認する。腫瘍細
胞に対する線維芽細胞の隣接する分布のため、分泌されたトラップの線維芽細胞の発現は
、腫瘍細胞に接近する薬物の治療濃度を縮小するオフターゲット部位としてではなく、腫
瘍細胞に対するその隣接効果に恩恵をもたらすであろう。
その後、トラップのＣ末端に取り込まれた標的化可能Ｈｉｓタグを介したＥＬＩＳＡに
より、トラップタンパク質（ＰＤＬ１またはＣＸＣＬ１２のいずれか）の分布および発現
を査定した（図１４Ｅ）。純粋トラップタンパク質（ＣＸＣＬ１２トラップ）も注射し、
比較した。トラッププラスミドＮＰおよびトラップタンパク質の２回の一日用量の後、２
、４、６日目にマウスを屠殺し、他の臓器よりむしろ、腫瘍における一過性プラスミドト
ランスフェクションおよび発現を実証した（図１４Ｅ）。対照的に、タンパク質トラップ
は急速に排除され、モニター時に全臓器において有意により低い濃度であった。
これらの結果は、ＬＰＤベクターが、腫瘍、特に、線維芽細胞および腫瘍細胞内でトラ
ッププラスミドの優先的一過性発現を可能にし、他のいずれかの臓器においては最小の発
現であったことを実証する。本出願人らは、腫瘍発現が、トラッププラスミド注射後に発
現が最大４日間まで持続することが見出される、一過性特性を保持することを報告する（
図１４Ｅ）。
ｐＣＸＣＬ１２トラップ ＤＮＡを被包するＬＰＤ ＮＰおよびｐＰＤ−Ｌ１トラップ
ＤＮＡを被包するＬＰＤ ＮＰによる組み合わせた治療法は、ＫＰＣ同種移植片に対する
抗腫瘍応答を改善し、転移を抑制した
Ｆｅｉｇらによる以前の研究は、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＬ１２との相互作用の阻害が、抗
ＰＤ−Ｌ１の抗腫瘍活性を明らかにすることを示唆した（Feigら、Targeting CXCL12 f
rom FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-P
D-L1 immunotherapy in pancreatic cancer、PNAS、２０１３年１２月１０日；１１
０巻（５０号）：２０２１２〜７頁）。ＬＰＤベクターによって送達されるプラスミドの
局所的および一過性発現特色のため、ＰＤ−Ｌ１トラップおよびＣＸＣＬ１２トラップを
コードするプラスミドをＬＰＤベクターに別々に被包し、ＫＰＣ膵がん処置のための組み
合わせたレジメンとして投与した。ＫＰＣ９８０２７ ＲＦＰ／Ｌｕｃは、膵尾部に同所
性接種した。ＬＰＤ ＮＰの投薬スケジュールは、図１５Ａに示されている。ＰＢＳ、ｐ
ｃＤＮＡ３．１骨格を被包するＬＰＤ ＮＰ（Ｃｔｒｌ ＮＰ）、遊離併用トラップタン
パク質を対照として設定した。腫瘍から放射された光子の数から相関した腫瘍体積を査定
し、Ａ）、定量化した、Ｂ）。結果は、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰおよびＰＤＬ１トラ
ップ ＮＰ単独療法の両方が、低用量で最小の抗腫瘍有効性を示したことを実証した（図
１５Ｄ）。単独療法の抗腫瘍有効性は、用量を増加させると、僅かに増加したが、ほんの
部分的に有効である（図１５Ｅ）。それどころか、併用トラップ ＮＰ群は、ＰＢＳ群と
比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（Ｐ＜０．０１）。併用群の腫瘍重量は、低および
高用量の両方で劇的に減少した（図１５Ｅ）。一方、遊離併用トラップタンパク質は、僅
かな、ただし有意でない抗がん効果のみを示し、タンパク質よりもむしろプラスミド使用
の利点を示唆する（図１５Ａおよび１５Ｂ）。さらに、処置最終日の後の全生存解析にお
いて、生存期間中央値は、他の処置群（それぞれＰＢＳ、Ｃｔｒｌ ＮＰ、ＣＸＣＬ１２
トラップ ＮＰおよびＰＤＬ１トラップ ＮＰ群のため、４０．５、４９、４７、５０日
間；図１５Ｃ）と比較して、併用トラップ ＮＰ治療法（６３．５日間）において増強さ
れており、強力な治療効果のみならず、長続きする全体応答も伝達する。これは、Ｆｅｉ
ｇらによる観察と一貫しており、Ｆｅｉｇらは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよび抗ＰＤ
−Ｌ１抗体の組合せを使用して、ＫＰＣ腫瘍成長を阻害した（Feigら、Targeting CXCL1
2 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with an
ti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer、PNAS、２０１３年１２月１０日；
１１０巻（５０号）：２０２１２〜７頁）。図１５におけるデータは、ＰＤ−Ｌ１トラッ
プ ＮＰと組み合わせたＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰが実際に、線維形成性ＫＰＣ腫瘍を
有するマウスモデルにおいて優れた抗腫瘍有効性を示したことを示唆した。
さらに、ＫＰＣ同種移植片の接種１ヶ月後に、主要な臓器における腫瘍の転移をモニタ
ーした。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者と一貫して、肝臓および肺は、同所性ＫＰＣ
モデルの主要な転移部位である（図１６Ａ）。腫瘍は、腹腔内の侵入により、脾臓および
腎臓においても観察された。組織学は、対照群の肺、脾臓および肝臓における転移の大き
な小結節を示す（図１６Ｂ）。単独療法は、腫瘍転移を僅かに抑制することができ、併用
療法のみが、転移を有意に阻害またはさらには抑止することができた（図１６Ａおよび１
６Ｂ）。よって、併用トラップ ＮＰ戦略が、腫瘍転移を低下させることができたことが
明らかであった。
腫瘍微小環境への増強されたＴ細胞浸潤は、併用トラップ ＮＰの優れた抗腫瘍効果を説
明する
がん細胞特異的Ｔ細胞応答が、ＫＰＣモデルにおいて以前に報告されており、ＥＬＩＳ
ｐｏｔアッセイによって本明細書においてさらに確認された（図１７Ａ）。図１７Ａは、
腫瘍を有する動物由来の脾細胞を使用した、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイデータ
を示す。トランスフェクトされたＲＦＰ／Ｌｕｃマーカーありまたはなしの、ＫＰＣ細胞
からの抽出物は、ＩＦＮ−γを分泌するように脾細胞を刺激することができたが、正常脾
細胞からの抽出物にはできなかった。データは、ＫＰＣ腫瘍が、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を
誘導することができたことを示す。腫瘍を有するマウスに見られる免疫応答は、ルシフェ
ラーゼまたは赤色蛍光マーカーに向けられていなかったが、まだ同定されていない（yet-
to-be）腫瘍関連抗原に向けられた。しかし、ＰＤ−Ｌ１トラップ ＮＰおよびＣＸＣＬ
１２トラップ ＮＰ（単独または併用療法のいずれか）処置されたマウスの脾臓由来のＩ
ＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれか有意な増加の非存在は、併用トラップ ＮＰの抗
腫瘍効果が、がん特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増強された全身性プライミングによって達成さ
れなかったことを示す（図１７Ｂ）。ＥＬＩＳｐｏｔ活性は、相対的に弱かったため（図
１７Ａおよび１７Ｂ）、がん特異的細胞傷害性Ｔリンパ球活性をブーストすることができ
るワクチンは、トラップの治療活性をさらに増強するであろう。
免疫療法効果が、がん細胞の間での増強されたＴ細胞蓄積に起因するものであったか決
定するために、膵臓におけるＴ細胞（ＣＤ３＋）の分布が免疫蛍光によって示された（図
１８Ａ）。ＰＢＳ対照において、Ｔ細胞が、腫瘍および正常膵臓組織の間の境界に大部分
は位置づけられたことが示された。少量のＴ細胞が、腫瘍領域に見出されたが、間質区域
に位置づけられた。ＰＤ−Ｌ１トラップにより処置した動物由来の膵臓は、腫瘍領域への
Ｔ細胞のある程度の浸透を示したが、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ（ＰＤ−Ｌ１トラップ
ＮＰありまたはなし）により処置したものは、腫瘍領域への大規模なＴ細胞浸潤を示し
た。腫瘍領域におけるＴ細胞の局在化は、図１８Ｂにおいて定量化されている。腫瘍をさ
らに収集し、単細胞へと分散させた。ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞をフローサイトメトリーによ
り解析した（図１８Ｃ）。結果は、またしても、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、併用トラップ ＮＰ
処置マウスの腫瘍において有意に増加されたことを確認する。よって、本出願人らは、Ｐ
Ｄ−Ｌ１ではなくＣＸＣＬ１２のトラップが、Ｔ細胞浸潤を増強した主要な因子であった
と結論する。さらに、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を枯
渇させることにより、併用トラップ ＮＰ治療法におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の役割を評価し
た（図１８Ｄおよび１８Ｅ）。併用トラップ ＮＰが、腫瘍成長を有意に遅らせたが、Ｃ
Ｄ８ Ｔ細胞が除去された場合はこれができなかったことが示された。まとめると、腫瘍
微小環境への増強されたＴ細胞浸潤は、併用トラップ ＮＰの優れた抗腫瘍効果をもたら
す１つの主要な理由である。
腫瘍微小環境における腫瘍浸潤免疫細胞およびサイトカインレベルの変化
併用トラップ ＮＰ戦略が、腫瘍細胞の周囲でＴ細胞浸潤および蓄積を効率的に改善す
ることができた理由をさらに解明するために、本出願人らは次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗腫
瘍活性をマスクするための複雑な相互作用ネットワークに参加する、異なるトラップ Ｎ
Ｐ処置後の腫瘍微小環境における関連する別個の骨髄性サブセットおよびサイトカインの
変化を評価した。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および腫瘍関連
マクロファージ（ＴＡＭ）等、免疫抑制性サブセットは、線維形成性ＰＤＡＣモデル内の
骨髄性浸潤を支配するため、本出願人らは、フローサイトメトリーおよび腫瘍切片の免疫
染色の両方によって、腫瘍微小環境内におけるこれらの免疫抑制性細胞の蓄積を試験する
。ＭＤＳＣは、最初の調節性サブセットとしてチェックされた。図１９Ａおよび１９Ｂに
示す通り、トラップのみの群（ＣＸＣＬ１２トラップおよびＰＤＬ１トラップのいずれか
）および組合せ群におけるＭＤＳＣのパーセンテージは、対照群よりもはるかに低かった
。ＭＤＳＣは、Ｔｒｅｇ発生の誘導によって免疫寛容を確立することができるため、ＭＤ
ＳＣの遮断は、Ｔｒｅｇの阻害をもたらすことができる。したがって、図１９Ａおよび１
９Ｂに示す通り、本出願人らは、腫瘍組織におけるＴｒｅｇのパーセンテージを検出した
。ＭＤＳＣの傾向と一貫して、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ処置群および組合せ群は、対
照群よりも少ないＴｒｅｇ細胞を示した。しかし、ＰＤ−Ｌ１トラップ ＮＰは、Ｔ細胞
浸潤を僅かに増加させ、これは、ＰＤ−Ｌ１チェックポイントインヒビターを使用したＦ
ｅｉｇらによっても観察された（Feigら、Targeting CXCL12 from FAP-expressing c
arcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy i
n pancreatic cancer、PNAS、２０１３年１２月１０日；１１０巻（５０号）：２０２
１２〜７頁）。これは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１相互作用が、ＳＴＡＴ−５リン酸化を制御す
ることにより、Ｔｒｅｇ増殖および活性化を負に調節するという事実によるものである可
能性が最も高い。マクロファージは、抑制性腫瘍免疫微小環境の別の重要な構成成分であ
る。図１９Ａに示す通り、ＰＤ−Ｌ１単独療法および併用療法の両方が、蓄積されたマク
ロファージを有意に減少させることができ、効率的にマクロファージをＭ１状態に有利に
することができた（図１９Ｂ）。よって、治療法に有利になるトラップによって抑制性Ｔ
ＭＥの有意なリモデリングが存在した。
免疫抑制性サブセットの観察を、ＣＸＣＬ１２およびＰＤ−Ｌ１のレベルと相関させる
ため、本出願人らは次に、静脈内送達されたトラップ ＮＰの中和効率を検査する（図２
０Ａおよび２０Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１トラップ ＮＰではなくＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰが
、腫瘍内分泌されたＣＸＣＬ１２を効率的に中和し、抗ＣＸＣＬ１２一次抗体によって検
出されるタンパク質の実質的な減少をもたらし、その後、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４媒介
性相互作用によりＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ浸潤を阻害することができることが示された。
その一方で、全体的ＰＤ−Ｌ１レベルは、ＰＤ−Ｌ１トラップ ＮＰの適用により縮小さ
れたのみならず、ＣＸＣＬ１２トラップ処置によっても部分的に影響された。これは、骨
髄性細胞が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）／マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ
（ＭＡＰＫ）依存性様式で、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を誘導することができる
という事実によるものである可能性がある。したがって、ＣＸＣＬ１２による骨髄性細胞
補充の低下は、ＰＤ−Ｌ１のレベルを減少させた。ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞の効率的
な枯渇はその後、腫瘍微小環境内におけるエフェクターＴ細胞の浸潤を容易にし、優れた
抗腫瘍有効性を説明する。
次いで、本出願人らは、併用群が、サイトカインレベルによって示される抑制性微小環
境を反転することができるか否か見るために、局所的腫瘍組織におけるサイトカインレベ
ルをモニターした（図２１）。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、がん転移を促進するための
免疫抑制に重大な意味を持つ、Ｔｈ−２サイトカインとして公知である。一方、ＩＦＮ−
γ、ＩＬ−１２αおよびＴＮＦ−α（Ｔｈ−１サイトカインとみなされる）は、Ｔ細胞死
滅を容易にし、腫瘍進行と戦う、細胞傷害性Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインであ
る。ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ単独療法群において、ＩＬ−１２αおよびＩＦＮ−γが
増加し、ＩＬ−４が実質的に減少したが、ＩＬ−１０は依然として増加しており、僅かに
抑制性の微小環境を示唆する。同様に、ＰＤ−Ｌ１トラップ ＮＰ群において、全体的Ｔ
ｈ１サイトカインのレベル増加にもかかわらず、抑制性サイトカインは一貫して高いまま
である。しかし、組合せ群において、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の両方が、有意に減少さ
れた。一方、ＩＬ−１２α、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、劇的に増加され、免疫刺激
微小環境へのＭ２からＭ１表現型（phonotype）スイッチを示す。これは結果的に、スカ
ベンジャーとして作用するようにリンパ球の補充を活性化し、腫瘍抗原提示を容易にし、
増感された細胞傷害性Ｔ細胞媒介性腫瘍特異的死滅をもたらすであろう。
腫瘍血管および腫瘍関連線維芽細胞の変化
腫瘍関連線維芽細胞（ＴＡＦ）および血管新生は、腫瘍組織への細胞傷害性Ｔリンパ球
の浸潤を妨害する。ＴＡＦのマーカーであるα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、および脈
管構造のマーカーであるＣＤ３１に関して染色することにより、ＴＡＦにおけるトラップ
ＮＰの効果を調べた。蛍光顕微鏡法によって密度および平均蛍光（florescence）を検出
した。解析のため、５個の顕微鏡視野をランダムに選択した。図２２Ａに示す通り、単独
および併用群の両方におけるＣＤ３１の密度は、対照群のものよりも低かった。併用群は
特に、実質的血管正常化を実証する（図２２Ｂ）。複数の併用トラップ処置後に、血管が
有意に除圧され、その後ＮＰパーフュージョンを増加させ、分布を拡張した（図２３）。
正常化された血管は、大部分は減少した間質および細胞密度による、放出されたＩＦＰの
結果である。
したがって、本出願人らは次に、線維芽細胞の密度を評価する。併用トラップ ＮＰ群
が、αＳＭＡの最低密度を示したことが示された。興味深いことに、本出願人らは、ＰＤ
−Ｌ１トラップではなくＣＸＣＬ１２トラップのみが、単独療法および併用療法の両方に
おいてαＳＭＡの減少をもたらすことを見出した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。一貫して、
本出願人らは、線維芽細胞によって分泌される主要な細胞外マトリックスの１種であるコ
ラーゲンが、ＣＸＣＬ１２トラップ ＮＰ処置群および併用トラップ ＮＰの両方におい
て劇的に減少されたことに留意した（図２４）。したがって、本出願人らは、ＣＸＣＬ１
２トラップ ＮＰが、Ｔ細胞浸潤を増加させ、抑制性免疫微小環境を調整することにより
、ＰＤ−Ｌ１トラップの抗腫瘍有効性を明らかにしたのみならず、これは、線維芽細胞お
よびコラーゲン含有量を枯渇させることによるものでもあると結論する。線維芽細胞は、
ＫＰＣ腫瘍微小環境におけるＣＸＣＬ１２の主要な供給源と考えられるため、ＣＸＣＲ４
媒介性自己分泌ループは、線維芽細胞の減少および間質のリモデリングを説明することが
できる。
異なる処置のための毒性評価および血液化学解析
毒物学的病理評価の結果は、単独療法および併用トラップ ＮＰ（ｃｏｍｂｏ ｔｒａ
ｐ ＮＰ）に関して、心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓に、いかなる注目すべき形態学的
変化もなかったことを実証した（図２５）。しかし、細胞空胞化、落屑した変性細胞およ
び巣状壊死が、ＰＢＳおよびＣｔｒｌ ＮＰ群においてマウスの肝臓および腎組織におい
て検出され、重度の肝臓および腎臓損傷を示唆し、これは、腫瘍の負荷によるものである
可能性が最も高かった。一貫して、血清生化学的値の解析は、肝臓（ＡＳＴおよびＡＬＴ
）または腎臓（クレアチニンおよびＢＵＮ）毒性が、併用トラップ ＮＰ処置マウスでは
なく、これら２群における腫瘍進行に起因することを実証した（表６）。加えて、全血球
細胞数（表５）は、全群に関して正常範囲内で一定のままであり、全身性貧血症または炎
症が、処置後に起こらなかったことを示唆する。
Figure 2021105060
Figure 2021105060
本明細書で言及されているあらゆる刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野
の当業者の技能水準を示す。あらゆる刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許
出願のそれぞれが、参照により組み込まれていると具体的にかつ個々に示されているのと
同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。
前述の発明について、理解を明確にする目的のための説明および例として、ある程度詳
細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変更および修正が実施され
てよいことは明らかであろう。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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