KR102171766B1 - Pd-l1 결합력이 증대된 pd-1 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PD-L1 결합력이 증대된 PD-1 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 PD-1 변이체의 제조방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PD-1 변이체는 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합을 효과적으로 억제하여 기존의 면역 관문 억제 치료제와 비교하여 월등히 높은 투과력과 면역세포의 암사멸 효과 또는 감염성 질환의 치료효과를 기대할 수 있으며, 동시에 면역원성 발생의 가능성을 최소화할 수 있다. 더불어, 무당화 구현을 통한 생물의약품 개발 편의성을 도모할 수 있다.

Description

PD-L1 결합력이 증대된 PD-1 변이체{PD-1 Variants with Enhanced PD-L1 Binding Affinity}
본 발명은 PD-L1 결합력이 증대되어, 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합을 효과적으로 억제하는 PD-1 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암 치료를 위한 의약품은 크게 저분자 의약품과 고분자 의약품으로 나뉘며 특이성이 없어 부작용이 상대적으로 큰 저분자 의약품에 비해 특이성이 있는 고분자 의약품이 치료제로서 각광을 받고 있다.
최근 암을 치료하기 위한 방법으로써 면역관문 억제 단백질 중 특히 PD-1/PD-L1 결합의 차단이 암치료에 큰 효과가 있으며, 다른 면역관문 억제 단백질에 비해 부작용이 적다는 결과가 학계에 보고되었다(J. Naidoo et al. (2015) Annals of Oncology, Lucia Gelao et al. (2014) Toxins, Gorge K. Philips et al (2015) International Immunology).
Bristol-Myers Squibb 등의 거대 제약기업이 PD-1/PD-L1 면역관문 억제를 통한 치료용 의약품 개발을 위해 노력하고 있으며, YERVOY(ipilimumab), OPDIVO(nivolumab) 같은 항암 목적의 의약품들이 항체 포맷을 이용하여 개발 중이다.
또한, 종양과 PD-1/PD-L1 결합 중인 TILs(Tumor-infiltrating lymphocytes)의 결합을 제거하기 위해서는 세포 침투력이 뛰어난 치료제가 필요하나 항체는 150 kDa의 매우 큰 거대 분자 단백질로써 침투하기에 불리한 점이 존재한다.
효과적인 면역관문 억제를 통한 암치료를 위해서는 크기가 PD-L1 에 비해 작아서 세포 침투력이 우수한 PD-1이 보다 적합하다고 보이나, 기존의 PD-1 엔지니어링은 yeast display를 통한 screening을 진행하였고 glycan의 heterogenity와 많은 돌연변이 유발로 인한 면역원성 존재 가능성이 있다.
한편, 무당화 형태의 단백질 의약품은 박테리아에서도 저렴하게 대량 생산이 용이하고, 세포주, 배양공정 및 정제공정에 따른 당화 비균질성(glycan heterogenity)의 문제가 전혀 없어 생물의약품 제조에 큰 장점을 갖는다.
따라서, 적은 돌연변이를 갖는 무당화 형태의 PD-1으로써 PD-L1에 높은 변이체의 발굴이 필요하다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 PD-L1과의 결합력이 높아 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합을 효과적으로 억제할 수 있으면서, 동시에 면역원성 발생의 가능성을 최소화할 수 있는 PD-1 변이체를 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 PD-1의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 PD-L1과의 결합력이 크게 향상되고, 돌연변이 위치의 최소화 및/또는 무당화 PD-1의 구현을 통해 면역원성 발생 가능성을 감소시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PD-L1 결합력이 증대된 PD-1 변이체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PD-1 변이체를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 유효성분으로 포함하는 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합 억제제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 대상체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합 억제방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 대상체에게 치료학적 유효량 투여하는 단계를 포함하는 암질환 또는 감염성질환의 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PD-1 변이체의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 PD-L1 결합력이 증대된 PD-1 변이체를 제공한다.
본 발명자들은 PD-L1과의 결합력이 높아 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합을 효과적으로 억제할 수 있으면서, 동시에 면역원성 발생의 가능성을 최소화할 수 있는 PD-1 변이체를 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 PD-1의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써 PD-L1과의 결합력이 크게 향상되고, 돌연변이 위치의 최소화 및/또는 무당화 PD-1의 구현을 통해 면역원성 발생 가능성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 "PD-1 변이체" 또는 "Programmed cell death protein-1 변이체"는 야생형(wild type) PD-1의 아미노산 서열에서 1 또는 2 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 형태의 변이를 포함하는 변이체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 야생형 PD-1의 아미노산 서열은 서열목록 제61서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 결합력이 증대된 PD-1(Programmed cell death protein-1) 변이체는 야생형(Wild type) PD-1의 아미노산 서열의 일부를 포함하며, 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 69번째 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 69번째 아미노산이 C69S, C69T, C69Y, C69G 또는 C69A로 치환된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 36번째 아미노산이 S36P로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 114번째 아미노산이 L114P로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 12번째, 34번째, 92번째, 107번째, 131번째, 132번째 및 142번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 T12S, N34T, N92K 또는 N92S, K107N, H131R, P132L 및 F142L로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 13번째 아미노산이 F13I 또는 F13L로, 46번째 아미노산이 M46I로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 1번째, 17번째, 36번째, 50번째, 79번째, 100번째, 114번째, 127번째 및 139번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 N1S, L17M, S36P, N50S, G79R, G100V, L114P, V127A 및 A139L로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 25번째 아미노산이 N25D로, 92번째 아미노산이 N92S 또는 N92K로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 13번째 아미노산이 F13I 또는 F13L로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 9번째, 88번째, 101번째, 125번째 및 137번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 N9D, R88K, A101V, A125S 및 R137K로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PD-1 변이체는 무당화 PD-1 변이체인 것이다.
현재 상용화된 대부분의 치료용 단백질들은 동물세포 배양을 통해 제조되고 있는데, 단백질을 생산할 때 다양한 당(carbohydrate) 변이체들이 단백질에 수식되게 되고, 이로 인한 당화 비균질성(glycan heterogeniety)은 치료용 단백질의 효능과 안정성에 변이를 유발하며, 항체 제조 공정 중 정제, 분석, QC(Quality Control)에 많은 비용을 요구하게 된다.
고가의 동물세포 배양 시스템이 요구되는 상기 당화 단백질에 비해 무당화(aglycosylated) 단백질은 박테리아에서 대량 생산이 가능하고 속도와 비용 면에서 탁월한 우수성을 지닌다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 세균세포인 것이다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생(exogenous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 세균(bacteria)세포, 보다 바람직하게는 그람 음성 세균세포이다. 상기 세포는 내막과 외막 사이에 원형질막 주위 공간 영역(periplasmic region)을 가지는 점에서 본 발명의 실시에 적합하다. 본 발명의 바람직한 숙주세포의 예로는 E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Haemophilus influenza, Bordotella pertussi, Erwinia amylovora, Rhizobium sp.등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 유효성분으로 포함하는 야생형(wild type) PD-1(Programmed cell death protein-1) 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 간 결합 억제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물, 보다 바람직하게는 암질환 또는 감염성질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 대상체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 야생형(wild type) PD-1(Programmed cell death protein-1) 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 간 결합 억제방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 대상체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 면역반응 증가방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터를 대상체에게 치료학적 유효량 투여하는 단계를 포함하는 암질환 또는 감염성질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 PD-1 변이체, 핵산분자 또는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 감염성질환의 종류는 제한되지 않으며, 바이러스에 의한 감염, 인플루엔자에 의한 감염, 세균에 의한 감염 및 진균에 의한 감염을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “대상체” 또는 “subject”는 상기 PD-1 및 PD-L1간의 결합 억제를 통해 상기 질환을 예방 또는 치료하고자 하는 객체를 의미하며, 바람직하게는 인간 및 동물을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 생물학적 요법, 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 또는 감염성 질환을 치료할 수 있다. 본 발명을 암의 예방 및 치료에 이용하는 경우 상기 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 PD-1 변이체의 제조방법을 제공한다:
a) 상기 PD-1 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 PD-1 변이체를 회수하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 PD-1 변이체의 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 상기 PD-1 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산분자에 추가적으로 무작위적인 점 돌연변이를 가한 PD-1 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리에서 야생형(wild type) PD-1(Programmed cell death protein-1) 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 간 결합을 억제하는 PD-1 변이체를 선별하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리(FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기(Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO(Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 PD-L1 결합력이 증대된 PD-1 변이체를 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 PD-1 변이체의 제조방법 및 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 PD-1 변이체는 야생형 PD-1 및 PD-L1 간 결합을 효과적으로 억제하여 기존의 면역 관문 억제 치료제와 비교하여 월등히 높은 투과력 및 면역세포의 암사멸 효과 또는 감염성 질환의 치료효과를 기대할 수 있으며, 동시에 면역원성 발생의 가능성을 최소화할 수 있다. 더불어, 무당화 구현을 통한 생물의약품 개발 편의성을 도모할 수 있다.
도 1은 동물세포에서 생산되어 정제된 야생형 PD-1과 4가지의 당쇄 변이체 PD-1의 SDS-PAGE 사진을 나타낸다.
도 2는 야생형 PD-1과 4가지 변이체 PD-1의 PD-L1에 대한 결합력 검증 결과를 나타낸다.
도 3은 Tetrameric PD-L1 제조, 형광 표지화 및 활성 검증 결과를 나타낸다.
도 4는 Anti-FLAG-FITC를 사용한 대장균에서 무당화 PD-1의 발현 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 무당화 PD-1의 활성화 검증 결과를 나타낸다.
도 6은 만들어진 초기 라이브러리의 DNA 염기서열 분석 데이터를 나타낸다.
도 7은 유세포 분석기를 통한 라이브러리 enrichment 테스트 결과를 나타낸다.
도 8은 무당화 PD-1 변이체들을 디스플레이하고 있는 대장균 세포들의 PD-L1 결합력 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 무당화 PD-1 변이체들을 디스플레이하고 있는 대장균 세포들의 anti-FLAG-FITC를 사용한 단백질 발현량 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 무당화 PD-1 변이체들을 디스플레이하고 있는 대장균 세포들의 PD-L1 결합력 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 무당화 PD-1 변이체들을 디스플레이하고 있는 대장균 세포들의 anti-FLAG-FITC를 사용한 단백질 발현량 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 CKJ 41을 기반으로 한 신규한 돌연변이를 가진 변이체 탐색 결과를 나타낸다.
도 13은 CKJ 41T를 template로 하여 만들어진 2차 라이브러리의 DNA 염기서열 분석 데이터를 나타낸다.
도 14는 유세포 분석기를 통한 라이브러리 enrichment 테스트 결과를 나타낸다.
도 15는 2차 스크리닝을 통해 발굴한 무당화 PD-1 변이체들을 디스플레이하고 있는 대장균 세포들의 PD-L1 결합력 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 PD-1 변이체와 공통 염기서열 변이체의 PD-L1 결합력 비교 검증 결과를 나타낸다.
도 17은 정제된 대조군 HAC-V와 2가지 PD-1변이체 단백질의 SDS-PAGE 사진을 나타낸다.
도 18은 야생형 PD-1과 HAC-V, 2가지 PD-1 변이체의 PD-L1에 대한 결합력 검증 결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 인간 PD-L1 결합에 영향을 주는 N- linked glycosylation site 검증
인간 PD-1의 당화의 존재가 실제로 PD-L1과의 결합력에 중요한 역할을 한다는 것을 검증하기 위해 PD-1에 존재하는 4개의 당화를 무당화하여 각각의 당화가 결합력에 끼치는 영향을 테스트하였다. PD-1에는 4곳의 N-glycosylation 장소가 존재하기 때문에 4곳에 있는 아스파라진을 각각 알라닌으로 치환한 4가지의 유전체(N25A, N34A, N50A, N92A)를 만들기로 결정하였다. PD-1(Catalog number: HG10377-M)의 유전자와 프라이머(CKJ#1, CKJ#2)를 사용해 PD-1의 외막 부위(아미노산 서열 L25 - Q167)의 유전체를 Vent polymerase를 사용하여 PCR기법으로 증폭하였다. 증폭된 유전체는 BssHII와 XbaI 효소를 사용하여 처리하였으며 마찬가지로 똑같은 효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pMaz 벡터에 라이게이션 하였다. 라이게이션된 플라스미드는 Jude1((F- mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Figure 112019010440744-pat00001
80lacZ△M15 △lacX74 recA1 endA1 araD139 △(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG) 대장균에 transformation하여 개별 콜로니 분석을 통해 sequence를 확인하였다. 제조된 플라스미드를 바탕으로 QuikChange PCR을 이용한 site-directed mutagenesis으로 손쉽게 아스파라진이 알라닌으로 치환된 변이체를 얻기 위해 프라이머들(CKJ#3, CKJ#4, CKJ#5, CKJ#6, CKJ#7, CKJ#8, CKJ#9, CKJ#10)을 디자인하였다. 디자인된 프라이머와 Pfu turbo polymerase(Agilent)를 사용하여 유전체를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 Jude1에 transformation하여 시퀀스를 확인하였다. 만들어진 5가지의 야생형 PD-1(pMaz-야생형PD-1-His tag)과 PD-1 당화 변이체 발현용 벡터(pMaz-N25A PD-1-His tag, pMaz-N34A PD-1-His tag, pMaz-N50A PD-1-His tag, pMaz-N92A PD-1-His tag)를 동물세포(HEK293F)에 transfection하여 6일간 배양 후 세포 배양액을 6,000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22 μm filter를 통해 필터하였다. 걸러진 상등액은 4℃에서 16시간 동안 Ni-NTA resin (Qiagen) 1 ml에 결합 유도하였다. 결합된 resin은 resin의 10 CV (column volume)의 10 mM imidazole(Sigma)이 포함된 PBS 용액으로 세척 후 10 CV의 20 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 한번 더 세척하였다. 마지막으로 250 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 용출액을 회수하였다(도 1). ELISA를 통해 야생형 PD-1과 4가지의 당화가 변이된 PD-1 변이체들의 PD-L1 결합력 변화를 ELISA를 통해 검증하였다. High binding 96 well plate(Costar)에 각각의 단백질을 0.05M Na2CO3, pH9.6(Junsei)로 희석하여 200 ng/well 의 농도로 4℃에서 16시간 결합하였다. 단백질 제거 후 5% skim milk가 포함된 PBST(0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate을 1시간동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 200 μl의 tween20 0.5% 포함된 PBS 용액으로 4번 세척한 후 PD-L1 tetramer를 PBS용액에 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 200 μl의 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 anti-streptavidin-HRP(Genetex)를 PBS에 1:2,000의 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 200 μl의 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl TMB(Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며 20분 뒤 4 N H2SO4로 반응을 종결시켰다(도 2). 반응 결과 N92A 변이체의 경우 야생형 PD-1과의 결합력과 큰 차이가 없었으나 나머지 3개의 당화 변이체는 매우 큰 결합력의 차이를 보여 N25, N34, N50의 당화는 PD-L1과의 결합력에 매우 큰 영향을 끼치는 것으로 나타났다.
실험에 사용한 프라이머들
서열목록 프라이머 서열(5’→3’)
서열목록 제1서열 CKJ#1 GCGGAATTCGGCGCGCACTCCGAATTAGACTCCCCAGACAGGCCC
서열목록 제2서열 CKJ#2 GAATTCCGCTCTAGATTATCAATGATGATGGTGGTGATGTTGGAACTGGCCGGCTGG
서열목록 제3서열 CKJ#3 CGTGGTGACCGAAGGGGACGCCGCCACCTTCACCTGCAGCT
서열목록 제4서열 CKJ#4 AGCTGCAGGTGAAGGTGGCGGCGTCCCCTTCGGTCACCACG
서열목록 제5서열 CKJ#5 ACCTTCACCTGCAGCTTCTCCGCCACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAAC
서열목록 제6서열 CKJ#6 GTTTAGCACGAAGCTCTCCGATGTGGCGGAGAAGCTGCAGGTGAAGGT
서열목록 제7서열 CKJ#7 GTACCGCATGAGCCCCAGCGCCCAGACGGACAAGCTGGCCG
서열목록 제8서열 CKJ#8 CGGCCAGCTTGTCCGTCTGGGCGCTGGGGCTCATGCGGTAC
서열목록 제9서열 CKJ#9 GTCAGGGCCCGGCGCGCCGACAGCGGCACCTACCTCTG
서열목록 제10서열 CKJ#10 CAGAGGTAGGTGCCGCTGTCGGCGCGCCGGGCCCTGAC
서열목록 제11서열 Hw#1 GCGGAATTCGGCGCGCACTCCGAATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACC
서열목록 제12서열 Hw#2 CTTGTGCCTTGCTATCTTTAGACGGGTCAGAGCCACCGCCACCCCTTTCATTTGGAGGATGTGCCAGAG
서열목록 제13서열 HW#3 GACCCGTCTAAAGATAGCAAGGCACAAG
서열목록 제14서열 HW#4 GAATTCCGCTCTAGATCATTAGTGGTGATGATGGTGGTGAG
서열목록 제15서열 JY#1 CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCCTTAGACTCCCCAGACAGGCCC
서열목록 제16서열 JY#2 CGCAGCGAGGCCCCCGAGGCCCCTTGGAACTGGCCGGCTGG
서열목록 제17서열 JY#3 CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCC
서열목록 제18서열 JY#4 CGCAGCGAGGCCCCCGAGGCCCC
실시예 2: PD-1 엔지니어링을 위한 tetrameric 인간 PD-L1 (PD-L1-Streptavidin) 클로닝
인간 PD-L1 gene cDNA를 Sino Biotech(Catalog number: HG10084-M)사에서 구입 후, PD-L1 세포 외막 부분(아미노산 서열 F19 - R238)의 유전자를 primer (HW#1, HW#2)와 Vent polymerase를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 야생형 PD-1과 야생형 PD-L1의 결합해리 상수가 낮기 때문에(평형해리상수 KD=약8.7 μM) 효율적인 무당화 PD-1 변이체 스크리닝 진행을 위해 tetramerization을 통한 avidity effect를 유도하기로 하였다. Tetramerization을 유도하기 위해 PD-L1의 C terminal 부분에 streptavidin을 발현시켜 tetramer를 유도하기로 하였으며, streptavidin와 PD-L1 사이에는 GS링커를 넣어 각각의 단백질의 유동성을 확보하였다. Streptavidin을 primer(HW#3, HW#4)와 Vent polymerase(New England Biolab)를 사용해 유전자를 증폭 후, 앞에 증폭된 PD-L1 유전체와 Vent polymerase를 사용하여 assembly PCR을 진행하였다. 만들어진 유전자는 BssHII와 XbaI(New England Biolab)을 사용해 제한효소 처리하였다. 제한효소 처리된 PD-L1-streptavidin-His tag 유전자는 동일한 제한효소 처리된 동물세포용 벡터인 pMaz벡터에 라이게이션 하였다. 라이게이션 된 플라스미드는 Jude1 대장균에 transformation 시킨 후, single clone을 확보하여 염기서열 분석을 통해 PD-L1-streptavidin-His tag이 pMaz벡터에 성공적으로 삽입된 것을 확인하였다.
실시예 3: Tetrameric PD-L1-streptavidin의 동물세포 발현, 정제 및 형광 물질 레이블링
만들어진 tetrameric PD-L1 발현용 벡터를 동물세포(HEK293F)에 transfection한 후, 6일간 배양 후 세포 배양액을 6,000 rpm, 20분간 원심분리 후, 상등액을 취해 0.22 μm filter를 통해 필터하였다. 걸러진 상등액은 4℃에서 16시간동안 Ni-NTA resin(Qiagen) 1 ml에 결합 유도하였다. Binding된 resin은 resin의 10 CV의 10 mM imidazole(Sigma)이 포함된 PBS 용액으로 세척 후 10 CV의 20 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 한번 더 세척한다. 마지막으로 250 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 용출액을 회수하였다. 정제된 PD-L1 tetramer는 Alexa-488 labeling kit를 사용해 형광표지화 하였다. 형광표지된 tetrameric PD-L1은 ELISA 분석 결과 우수한 PD-1 결합력을 보이는 것을 확인하였다 (도 3).
실시예 4: 박테리아 세포 내막에서 인간 PD-1을 디스플레이하기 위한 클로닝 (야생형 PD-1, HAC-V PD-1)
PD-1의 외막 부위를 디스플레이 하기 위해 primer(JY#1, JY#2)를 사용해 PD-1의 아미노산(아미노산 서열 L25 - Q167)의 DNA를 Vent Polymerase를 통해 PCR로 유전자를 증폭시킨 후, SfiI 제한효소 처리하였다. SfiI 처리된 DNA는 단백질을 대장균 periplasmic region쪽으로 분비 하에 세포내막에 고정화 시키는 시그널 펩타이드인 NlpA 시그널 펩타이드를 사용하기 위해 마찬가지로 SfiI 처리된 pMopac12-NlpA-FLAG벡터에 라이게이션 하여 pMopac12-NlpA-WTPD-1-FLAG벡터를 제조하였다. 대조군으로 사용하기 위한 HAC-V 변이체는 유전자 합성을 통해 진행하였으며, 마찬가지로 NlpA 시그널 펩타이드를 사용하기 위해 SfiI 처리된 pMopac12-NlpA-FLAG벡터에 라이게이션 하여 pMopac12-NlpA-HAC-V PD-1-FLAG 플라스미드를 준비하였다. 그 후 대장균 Jude1에 transformation 하여 single clone을 확보한 후 염기서열 분석을 통해 야생형 PD-1와 HAC-V PD-1이 pMopac-12 벡터에 성공적으로 삽입된 것을 확인하였다.
실시예 5: 유세포 분석기를 이용한 PD-1 및 PD-1 변이체 (야생형 PD-1, HAC-V PD-1)의 대장균에서의 발현 유무 및 PD-L1과의 결합력 검증
클로닝으로 준비된 플라스미드(pMopac12-NlpA-PD-1-FLAG, pMopac12-NlpA-HAC-V PD-1-FLAG, pMopac12-NlpA-Fc-FLAG)를 각각 Jude1 세포에 transformation하였다. 준비된 샘플들을 각각 2% glucose와 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에서 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포를 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:50 비율로 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 단백질이 과발현된 대장균을 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 잔여 배지를 제거하기 위해 e-tube에 넣어진 세포를 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 resuspension하고 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 진행하는 세척과정을 2회 반복하였다. 세포를 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA(pH 8.0)]용액을 사용하여 resuspension하여 37℃, 30 분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 대장균을 모은 후, 상등액을 제거하였다. 원심분리된 대장균은 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2, 10mM MOPS pH 6.8]을 통해 resuspension후 13,500 rpm으로 1 분간 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 원심 분리된 대장균을 resuspension한 뒤 37℃, 15분간 rotation하여 펩티도글리칸 층을 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 12. 5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe와 33 nM의 anti-FLAG-FTIC(SIGMA)를 각각 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe로 labeling하였다. Labeling 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 한다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, Guava(Merck Millipore) 장비를 이용해 분석하였다. 분석결과 무당화 PD-1은 대장균에서 발현은 잘 되지만(도 4) PD-L1과의 결합력은 보이지 못함을 확인할 수 있었으며 무당화 HAC-V PD-1은 약한 PD-L1 결합력이 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 6: 초고속 스크리닝 기법 사용하기 위한 거대 PD-1 error prone library 제작
PD-L1과의 높은 결합력을 보이는 무당화 PD-1을 고속으로 탐색하기 위해 pMopac12-NlpA-PD-1-FLAG를 기반으로 사용해 PD-1의 모든 부위에 에러가 들어갈 수 있게 양쪽의 SfiI site를 포함하는 primer(JY#3, JY#4)를 디자인 하였다. 디자인한 primer와 TaqPolymerase(TAKARA)와 dNTPs(Invitrogen), MgCl2, MnCl2 (SIGMA)를 사용하여 라이브러리를 제작하기 위해 insert를 Error Prone PCR기법을 사용해 유전체를 증폭시켰다. 증폭된 유전체는 포함하는 SfiI효소 처리되어 마찬가지로 SfiI효소 처리가 되어 있는 pMopac12-NlpA-FLAG 벡터에 삽입하여 라이게이션 후, Jude1 세포에 transformation하였다. Transformation된 대장균들은 square plate에 스프레딩 하여 37℃에 16시간 배양한 후 glucose가 2% 함유된 TB로 대장균들을 회수 하여 초기 라이브러리를 확보하였다(도 6).
실시예 7: 유세포 분리기를 사용한 PD-1 변이체 스크리닝
Glucose 가 2% 함유된 TB 배지 25 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가한 후 제작된 라이브러리를 250 mL flask에 접종하고 37℃, 250 rpm으로 4시간 배양 하고 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지 100 ml에 배양된 대장균을 1:100 비율로 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하고, 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 잔여 배지를 제거하기 위해 e-tube에 넣어진 세포를 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 resuspension하고 13,500 RPM으로 1분간 원심분리를 통해 진행하는 세척 과정을 2회 반복하였다. 세포를 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)]용액을 사용하여 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 대장균을 모은 후, 상등액을 제거하였다. 원심분리된 대장균은 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2, 10mM MOPS pH 6.8]을 통해 resuspension후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 원심 분리된 대장균을 resuspension한 뒤 37℃, 15 분간 rotation하여 펩티도글리칸 층을 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여spheroplast에 형광probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml PBS로 resuspension 후, S3 sorter(Bio-Rad) 장비를 이용해 PD-L1에 높은 결합력이 가진 대장균들을 회수하였다. 회수된 대장균들은 primer들(JY#1, JY#2)을 사용한 PCR 증폭으로 유전자를 확보하였고, 유전체들은 sfiI 제한효소 처리되어 마찬가지로 제한효소 처리된 pMopac12-NlpA-FLAG 벡터에 라이게이션 하였다. 플라스미드를 Jude1에 transformation한 후 대장균들은 square plate에 스프레딩 하여 37℃에 16시간 incubation한 후 회수하여 deep freezer에 냉동보관 하였다. 위와 같은 스크리닝 과정을 5회 추가 반복하였다.
실시예 8: PD-L1 친화도 증가 PD-1 변이체들의 enrichment 확인을 위한 대장균 배양
Glucose가 2% 함유된 TB 25 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가한 후 Initial library, 1 round library, 2 round library, 3 round library, 4 round library, 5 round library, 6 round library를 250 mL flask에 넣었다. 37℃, 250 rpm으로 4시간 배양 후, 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 100 ml에 배양된 대장균을 1:100 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 또한 대조군으로 사용하기 위해 glucose가 2% 함유된 TB배지 4 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가하고 야생형 PD-1과 HAC-V-PD-1 cell들을 각각 접종하고 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포를 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지 6 ml에 1:50 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.
실시예 9: 유세포 분석기를 사용한 PD-L1 친화도 증가 PD-1 변이체들의 enrichment 확인
잔여 배지를 제거하기 위해 e-tube에 넣어진 세포를 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 resuspension하고 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 진행하는 세척과정을 2회 반복하였다. 세포를 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)]용액을 사용하여 resuspension하여 37℃, 30 분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 대장균을 모은 후, 상등액을 제거하였다. 원심분리된 대장균은 1 ml의Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2,10mM MOPS pH 6.8]을 통해 resuspension 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 원심 분리된 대장균을 resuspension한 뒤 37℃, 15분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, 유세포 분석기(Guava, Millipore)장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값(Mean fluorescence intensity, MFI) 측정을 통해 분석하였다. 스크리닝이 진행될수록 PD-L1에 결합력이 높은 변이체들이 라이브러리에서 증폭되는 것을 분석할 수 있었다(도 7).
실시예 10: 유세포 분석기 분석을 통한 PD-L1 결합력이 향상된 PD-1 변이체들 확보
마지막 라운드의 단일 콜로니들을 2% glucose와 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에 접종한 후 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포들을 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:50 희석하여 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 잔여 배지를 제거하기 위해 e-tube에 넣어진 세포를 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여resuspension하고 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 진행하는 세척과정을 2회 반복하였다. 세포를 1 ml의 STE[0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8.0)]용액을 사용하여 resuspension하여 37℃, 30분간 rotation을 통해 세포 외막을 제거하였다. 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 대장균을 모은 후, 상등액을 제거하였다. 원심분리된 대장균은 1 ml의 Solution A[0.5 M sucrose, 20 mM MgCl2,10mM MOPS pH 6.8]을 통해 resuspension후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 1 ml의 Solution A와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 원심 분리된 대장균을 resuspension한 뒤 37℃, 15분 간 rotation하여 peptidoglycan layer를 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 resuspension한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1ml의 PBS로 resuspension 후, GUAVA장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 측정을 통해 분석하였다(도 8). 또한 대장균이 디스플레이 하고 있는 PD-1 단백질의 발현량이 형광 세기에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 발현량을 확인 하기 위해 PBS로 resuspension한 뒤 남은 나머지 대장균에서 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 1 μl의 anti-FLAG-FITC를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, 유세포 분석기를 이용해 anti-FLAG-FITC과의 결합력을 통한 단백질의 발현량을 형광 신호 값 측정을 통해 간접적으로 분석하였다(도 9).
PD-L1 결합력이 향상된 PD-1 변이체들
서열목록 PD-1 변이체 PD-1 변이체 위치 및 치환된 아미노산
서열목록 제48서열 No.41 (CKJ 41) S36P / C69S / L114P
서열목록 제50서열 No.45 (CKJ 45) S36P / C69S / K107N / L114P / F142L
서열목록 제51서열 No.46 (CKJ 46) S36P / C69S / L114P / P132L
서열목록 제56서열 No.56 (CKJ 56) S36P / C69S / N92K / L114P / H131R
서열목록 제58서열 No.67 (CKJ 67) N34T / S36P / C69S / L114P
서열목록 제59서열 No.70 (CKJ 70) S36P / C69S
서열목록 제60서열 No.78 (CKJ 78) T12S / S36P / C69S / L114P
서열목록 제49서열 No.44 (CKJ 44) F13I / M46I / N50S / C69Y / V127A
서열목록 제54서열 No.52 (CKJ 52) F13I / M46I / C69Y
서열목록 제52서열 No.49 (CKJ 49) F13L / N25D / C69S / N92S/ R137K
서열목록 제53서열 No.50 (CKJ 50) F13L / N25D / C69S / R88K / N92S/ A125S
서열목록 제55서열 No.55 (CKJ 55) N25D / C69S / N92S / A101V
서열목록 제57서열 No.66 (CKJ 66) N9D / N25D / C69S / N92S / A101V
실시예 11. 추가적인 대조군인 PD-1 변이체와의 비교를 위한 클로닝 (PD-1 S.6.8.3, S.5.1T)
추가적인 대조군으로 사용하기 위한 S.6.8.3와 S.5.1T 변이체는 Primer assembly PCR을 통해 클로닝하였다. 먼저, Primer (S.6.8.3 : JY#5,6,7,8,9,10,11,12 / S.5.1T : JY#13,14,15,16,17,18,19,20)를 이용하여 Vent Polymerase로 primer assembly PCR을 한 후, Amplify PCR을 통해 제대로 Assembly된 유전자를 증폭시켰다. 증폭시킨 유전자를 SfiI 처리 한 후 마찬가지로 SfiI 처리된 pMopac12-NlpA-FLAG벡터에 라이게이션 하여 pMopac12-NlpA-PD-1 S.6.8.3-FLAG와 pMopac12-NlpA-PD-1 S.5.1T-FLAG벡터를 제조하였다. 그 후 대장균 Jude1에 transformation하여 single clone을 확보한 후 염기서열 분석을 통해 성공적으로 삽입된 것을 확인하였다.
추가 실험에 사용한 프라이머들
서열목록 프라이머 서열(5’→3’)
서열목록 제62서열 JY#5 TTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGA
서열목록 제63서열 JY#6 ACGAAGCTCTCCGATGTGTTGGAGAAGCTGCAGGTGAAGGTGGCGTTGTCCCCTTCGGTCACCACGAGCAGGGCT
서열목록 제64서열 JY#7 AACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTC
서열목록 제65서열 JY#8 TGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGCTGGCCTGGCCCAGCTGGCCGCGGTCCTCGGGGAAGGCGGCCAGCTTGT
서열목록 제66서열 JY#9 CGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAGCGACAGCGGCACC
서열목록 제67서열 JY#10 ACCCGCAGGCTCTCCCGGATCTGGATCCGGGGGGCCAGCAGGATGGCGCTACAGAGGTAGGTGCCGCTGTCGCTG
서열목록 제68서열 JY#11 GGGAGAGCCTGCGGGTGGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCAC
서열목록 제69서열 JY#12 TTGGAACTGGCCGGCTGGCCTGGGTGAGGGGCTGGGGTG
서열목록 제70서열 JY#13 TTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGG
서열목록 제71서열 JY#14 CAGTTTAGCACGAAGCTCTCCGATGTGTTGGAGAAGCTGCAGGTGAAGGTGGCGCTGTCCCCTTCGGTCACCACG
서열목록 제72서열 JY#15 GGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGGCCGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGA
서열목록 제73서열 JY#16 CACGCCCGTTGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGGAGTCCTGGCCGGGCTGGCTGCGGTCCTCGGGGAAGGCGG
서열목록 제74서열 JY#17 CTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCGGGGCCCGGCGCTCCGACAGCGGCACCTACCTCTGTTCC
서열목록 제75서열 JY#18 CTGAGCTCTGCCCGCAGGCTCTCCCGGATCTGCACCTTGGGGGCCAGGGAGATGGCGGAACAGAGGTAGGTGCCG
서열목록 제76서열 JY#19 CTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGGCAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCA
서열목록 제77서열 JY#20 TTGGAACTGGCCGGCTGGCCTGGGTGAGGGG
서열목록 제78서열 JY#21 CCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCC
서열목록 제79서열 JY#22 GGAACTGGCCGGCTGGCCTGGGTGAGGGGCTGGGG
실시예 12. 유세포 분석기 분석을 통한 발굴한 PD-1 변이체들과 대조군과의 PD-L1 결합력 비교
결합력이 높은 PD-1 변이체들과 추가적인 대조군들과의 PD-L1 결합력을 비교하기 위해 야생형 PD-1과 대조군인 PD-1 HAC-V, S.6.8.3, S.5.1T와 CKJ 49 및 CKJ 50의 총 6가지를 각각 2% glucose 와 40 μg/ml 의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에 접종한 후 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포들을 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:100 희석하여 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, GUAVA장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 측정을 통해 분석하였다(도 10). 또한 대장균이 디스플레이 하고 있는 PD-1 단백질의 발현량이 형광 세기에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 발현량을 확인하기 위해 PBS로 resuspension한 뒤 남은 나머지 대장균에서 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 1 μl의 anti-FLAG-FITC를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, 유세포 분석기를 이용해 anti-FLAG-FITC과의 결합력을 통한 단백질의 발현량을 형광 신호 값 측정을 통해 간접적으로 분석하였다(도 11).
실시예 13. 신규한 돌연변이를 가진 변이체 탐색을 위한 클로닝
발굴한 변이체 중 가장 신규한 돌연변이를 가지면서 높은 결합력을 지니는 CKJ 41을 기준으로 좀 더 신규한 돌연변이를 가지는 변이체를 발굴하고자 CKJ 41의 C69S를 여러 아미노산 (C,T,Y,A,G) 으로 치환하였다. 이를 위해 디자인한 프라이머와 Pfu turbo polymerase (Agilent)를 사용하여 Quikchange PCR기법으로 유전체를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 Jude1에 transformation하여 시퀀스를 확인하였다.
실시예 14. 유세포 분석기 분석을 통한 신규한 돌연변이를 가진 변이체 탐색
CKJ 41과 대조군인 HAC-V변이체, CKJ 41의 69번째 아미노산이 바뀐 CKJ 41C, CKJ 41T, CKJ 41Y, CKJ 41A, CKJ 41G를 각각 2% glucose 및 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에 접종한 후 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포들을 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:100 희석하여 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, GUAVA 장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 측정을 통해 분석하였다(도 12).
실시예 15. 결합력이 증가된 PD-1 변이체를 확보하기 위한 2차 PD-1 error prone library 제작
PD-L1과의 더 높은 결합력을 보이는 PD-1을 고속으로 탐색하기 위해 돌연변이 수는 적으면서 높은 형광값을 갖는 pMopac12-NlpA-PD-1 CKJ 41T-FLAG를 기반으로 사용해 모든 부위에 에러가 들어갈 수 있게 insert를 준비하였다. 양쪽의 SfiI site를 포함하는 primer (JY#3, JY#4) 및 Taq Polymerase (TAKARA)와 dNTPs (Invitrogen), MgCl2, MnCl2 (SIGMA)를 사용하여 Error Prone PCR기법을 사용해 유전체를 증폭시켜 라이브러리를 제작하고자 했다. 증폭된 유전체는 SfiI 효소 처리되어 마찬가지로 SfiI 효소 처리가 되어 있는 pMopac12-NlpA-FLAG 벡터에 삽입하여 라이게이션 후, Jude1 세포에 transformation하였다. Transformation된 대장균들은 square plate에 스프레딩하여 37℃에 16시간 배양한 후 glucose가 2% 함유된 TB로 대장균들을 회수 하여 초기 라이브러리를 확보하였다(도 13).
실시예 16. 유세포 분리기를 사용한 PD-1 변이체 2차 스크리닝
Glucose가 2% 함유된 TB 배지 25 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가한 후 제작된 라이브러리를 250 mL flask에 접종하고 37℃, 250 rpm으로 4시간 배양하고 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지 100 ml에 배양된 대장균을1:100 비율로 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하고, 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml PBS로 resuspension 후, S3 sorter(Bio-Rad) 장비를 이용해 PD-L1에 더 높은 결합력이 가진 대장균들을 회수하였다. 회수된 대장균들은 primer들 (JY#3, JY#4)을 사용한 PCR 증폭으로 유전자를 확보하였고, 유전체들은 sfiI 제한효소 처리되어 마찬가지로 제한효소 처리된 pMopac12-NlpA-FLAG 벡터에 라이게이션 하였다. 플라스미드를 Jude1에 transformation한 후 대장균들은 square plate에 스프레딩 하여 37℃에 16시간 incubation한 후 회수하여 deep freezer에 냉동보관 하였다. 위와 같은 스크리닝 과정을 probe의 농도를 점차 줄여가며 3회 추가 반복하였다.
실시예 17. PD-L1 친화도 증가 2차 PD-1 변이체들의 enrichment 확인을 위한 대장균 배양
Glucose가 2% 함유된 TB 25 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가한 후 Initial library, 1 round library, 2 round library, 3 round library, 4 round library를 250 mL flask에 넣었다. 37℃, 250 rpm으로 4시간 배양 후, 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 100 ml에 배양된 대장균을 1:100 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 또한 대조군으로 사용하기 위해 glucose가 2% 함유된 TB배지 4 ml에 40 μg/ml의 chloramphenicol을 첨가하고 야생형 PD-1과 HAC-V-PD-1 cell들을 각각 접종하고 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포를 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지 6 ml에 1:100 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.
실시예 18. 유세포 분석기를 사용한 PD-L1 친화도 증가 PD-1 변이체들의 enrichment 확인
실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 4 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, 유세포 분석기 (Guava, Millipore)장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 (Mean fluorescence intensity, MFI) 측정을 통해 분석하였다. 스크리닝이 진행될수록 PD-L1에 결합력이 높은 변이체들이 라이브러리에서 증폭되는 것을 분석할 수 있었다 (도 14).
실시예 19. 유세포 분석기 분석을 통한 PD-L1 결합력이 좀 더 향상된 PD-1 변이체들 추가 확보
마지막 라운드의 단일 콜로니들(APD1-CKJ 41T: CKJ 41T의 무당화 형태, APD1-JY 101: JY 101의 무당화 형태)과 야생형 PD-1, HAC-V을 각각 2% glucose 및 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에 접종한 후 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포들을 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:100 희석하여 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 4 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 resuspension 후, GUAVA 장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 측정을 통해 분석하였다(도 15).
실시예 20. 발굴한 PD-1 변이체의 돌연변이 자리 비교 검증을 위한 변이체 클로닝
CKJ 49, CKJ 50의 중복되는 돌연변이를 가지는 변이체 PD-1_LDSS를 클로닝하여 LDSS에 CKJ 49, 50의 신규한 돌연변이 아미노산이 도입되었을 때 결합력에 영향을 미치는 지 확인하고자 했다. PD-1_LDSS를 만들기 위해 CKJ 49 벡터를 template로 하여 Quikchange PCR 기법을 사용하였다. 이를 위해 디자인된 프라이머 (JY#21, JY#22)와 Pfu turbo polymerase (Agilent)를 사용하여 유전체를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 Jude1에 transformation하여 시퀀스를 확인하였다.
실시예 21. 유세포 분석기 분석을 통한 PD-1 변이체와 공통 염기서열 변이체의 PD-L1 결합력 비교 검증
야생형 PD-1, 대조군인 HAC-V 변이체, CKJ 49, CKJ 50, LDSS를 각각 2% glucose 및 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 TB 배지에 접종한 후 37℃, 250 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 세포들을 40 μg/ml의 chloramphenicol이 포함된 6 ml의 TB 배지에 1:100 희석하여 접종하였다. OD600=0.5까지 배양한 후 20분간 25℃, 250 rpm에서 cooling 과정을 거친 후 1 mM IPTG를 첨가하여 25℃, 250 rpm, 5시간 동안 단백질을 과발현하였다. 대장균들은 OD600 normalize를 통해 동일한 양 만큼씩 e-tube에 넣어 14,000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 회수하였다. 실시예 5에서 명시된 Spheroplasting 방법과 동일하게 실험하였고, 이를 통해 만들어진 spheroplast에 12.5 nM의 tetrameric PD-L1-Alexa488 probe를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1ml의 PBS로 resuspension 후, GUAVA 장비를 이용해 PD-L1과의 결합력을 형광 신호 값 측정을 통해 분석하였다 (도 16). 또한 대장균이 디스플레이 하고 있는 PD-1 단백질의 발현량이 형광 세기에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 발현량을 확인하기 위해 PBS로 resuspension한 뒤 남은 나머지 대장균에서 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 1 μl의 anti-FLAG-FITC를 함께 넣고 상온에서 rotation하여 spheroplast에 형광 probe를 labeling하였다. Labeling의 과정을 1시간 거친 후 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 상등액을 버리고 원심분리된 대장균을 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 다시 13,500 rpm으로 1분간 원심분리를 하였다. 원심분리된 대장균을 1ml의 PBS로 resuspension 후, 유세포 분석기를 이용해 anti-FLAG-FITC과의 결합력을 통한 단백질의 발현량을 형광 신호 값 측정을 통해 간접적으로 분석하였다 (도 16).
추가로 발굴된 PD-L1 결합력이 향상된 PD-1 변이체들
서열목록 PD-1 변이체 PD-1 변이체 위치 및 치환된 아미노산
서열목록 제90서열 CKJ 41T S36P / C69T / L114P
서열목록 제91서열 CKJ 41Y S36P / C69Y / L114P
서열목록 제92서열 CKJ 41G S36P / C69G / L114P
서열목록 제93서열 CKJ 41A S36P / C69A / L114P
서열목록 제94서열 JY101 N1S, F13I, L17M, S36P, M46I, C69T, G79R, G100V, L114P, A139L
서열목록 제95서열 LDSS F13L, N25D, C69S, N92S
실시예 22. PD-1 변이체의 동물세포 발현, 정제 및 결합력 검증
PD-1 변이체를 동물세포로 발현, 정제하여 결합력을 검증하기 위해 먼저 클로닝을 진행하였다. 대조군인 HAC-V, 발굴한 변이체인 CKJ 49, CKJ50 유전자를 primer (CKJ#1, CKJ#2)와 Vent polymerase를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 유전체는 BssHII와 XbaI 효소를 사용하여 처리하였으며 마찬가지로 똑같은 효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pMaz 벡터에 라이게이션 하였다. 라이게이션된 플라스미드는 Jude1 대장균에 transformation하여 개별 콜로니 분석을 통해 sequence를 확인하였다. 만들어진 PD-1 당화 변이체 발현용 벡터 (pMaz-PD1 HAC-V-His tag, pMaz-PD1 CKJ 49-His tag, pMaz-PD1 CKJ 50-His tag)를 동물세포 (HEK293F)에 transfection하여 6일간 배양 후 세포 배양액을 6,000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22 μm filter를 통해 필터하였다. 걸러진 상등액은 4°C에서 16시간 동안 Ni-NTA resin (Qiagen) 1 ml에 결합 유도하였다. 결합된 resin은 resin의 10 CV (column volume)의 10 mM imidazole (Sigma)이 포함된 PBS 용액으로 세척 후 10 CV의 20 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 한번 더 세척하였다. 마지막으로 250 mM imidazole 포함 PBS 용액으로 용출액을 회수하였다 (도 17). ELISA를 통해 야생형 PD-1과 대조군, 2가지 변이체(GPD1-CKJ 49: CKJ 49의 당화 형태, GPD1-CKJ 50: CKJ 50의 당화 형태) 사이의 PD-L1 결합력 변화를 검증하였다. High binding 96 well plate (Costar)에 각각의 단백질을 0.05M Na2CO3, pH9.6 (Junsei)로 희석하여 200 ng/well 의 농도로 4℃에서 16시간 결합하였다. 단백질 제거 후 5% skim milk가 포함된 PBST (0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate을 1시간동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 200 μl의 tween20 0.5% 포함된 PBS 용액으로 4번 세척한 후 PD-L1 tetramer를 PBS용액에 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 200 μl의 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 anti-streptavidin-HRP (Genetex)를 PBS에 1:2,000의 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 200 μl의 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl TMB (Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며 20분뒤 4 N H2SO4로 반응을 종결시켰다. 반응 결과, 당화가 됨으로써 PD-L1에 대한 결합력 변화가 생겼지만, CKJ 49가 가장 뛰어난 결합력을 가지는 것으로 확인되었다(도 18).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Neuracle Genetics, Inc. <120> PD-1 Variants with Enhanced PD-L1 Binding Affinity <130> HP8486 <150> KR 10-2018-0013381 <151> 2018-02-02 <160> 95 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#1 <400> 1 gcggaattcg gcgcgcactc cgaattagac tccccagaca ggccc 45 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#2 <400> 2 gaattccgct ctagattatc aatgatgatg gtggtgatgt tggaactggc cggctgg 57 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#3 <400> 3 cgtggtgacc gaaggggacg ccgccacctt cacctgcagc t 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#4 <400> 4 agctgcaggt gaaggtggcg gcgtcccctt cggtcaccac g 41 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#5 <400> 5 accttcacct gcagcttctc cgccacatcg gagagcttcg tgctaaac 48 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKJ#6 <400> 6 gtttagcacg aagctctccg atgtggcgga gaagctgcag gtgaaggt 48 <210> 7 <211> 41 <212> 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gccagccggc 420 cagttccaac atcaccacca tcatcat 447 <210> 23 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMaz-N92A PD-1-His tag DNA sequence <400> 23 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcgccgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaac atcaccacca tcatcat 447 <210> 24 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1-streptavidin DNA sequence <400> 24 tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggtagcaa tatgacaatt 60 gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctggctg cactaattgt ctattgggaa 120 atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 180 agtagctaca gacagagggc ccggctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 240 cttcagatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggtgt accgctgcat gatcagctat 300 ggtggtgccg actacaagcg aattactgtg aaagtcaatg ccccatacaa caaaatcaac 360 caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag 420 ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag 480 accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga 540 atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600 aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660 ggtggcggtg gctctgaccc gtctaaagat agcaaggcac aagtgagcgc ggcagaggcc 720 ggtattaccg gcacctggta caaccaactg ggttctacgt tcattgttac ggccggtgcc 780 gatggtgcat taacgggtac ctacgaatct gcagtcggca acgcggagtc tcgttacgtt 840 ctgacgggcc gttatgattc tgcaccagcc acggacggca gcggcacggc cttaggttgg 900 accgtggcct ggaagaacaa ctatcgcaat gcccacagcg ccacgacctg gtctggccaa 960 tatgtcggcg gtgcggaagc ccgcattaat acccagtggt tactgacgtc tggcaccacg 1020 gaggccaacg 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caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 29 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 45 DNA sequence <400> 29 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acactccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggacagccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa tgcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagctccaa 429 <210> 30 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 46 DNA sequence <400> 30 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc 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Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala 225 230 235 240 Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val 245 250 255 Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val 260 265 270 Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala 275 280 285 Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp 290 295 300 Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln 305 310 315 320 Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr 325 330 335 Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His 340 345 350 Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala 355 360 365 Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 385 390 395 <210> 46 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA-Wild type PD-1-FLAG Protein sequence <400> 46 Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly Cys Asp Gln Ser Ser Ser Glu Ala Gln 20 25 30 Pro Ala Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys 50 55 60 Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met 65 70 75 80 Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 85 90 95 Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn 100 105 110 Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser 115 120 125 Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile 130 135 140 Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu 145 150 155 160 Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe 165 170 175 Gln Gly Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Asp Tyr Lys 180 185 190 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg Ala 195 200 <210> 47 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA- HAC-V PD-1 -FLAG Protein sequence <400> 47 Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly Cys Asp Gln Ser Ser Ser Glu Ala Gln 20 25 30 Pro Ala Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys 50 55 60 Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu 65 70 75 80 Ser Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 85 90 95 Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn 100 105 110 Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser 115 120 125 Gly Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile 130 135 140 Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu 145 150 155 160 Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe 165 170 175 Gln Gly Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Asp Tyr Lys 180 185 190 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg Ala 195 200 <210> 48 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 41 Protein sequence <400> 48 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 49 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 44 Protein sequence <400> 49 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Ile Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Ile Ser Pro 35 40 45 Ser Ser Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Tyr Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Ala Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 50 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 45 Protein sequence <400> 50 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Asn Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Leu Gln 130 135 140 <210> 51 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 46 Protein sequence <400> 51 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Leu Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 52 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 49 Protein sequence <400> 52 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asp Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Ser Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 53 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 50 Protein sequence <400> 53 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asp Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Lys Ala Arg Arg Ser Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ser Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 54 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 52 Protein sequence <400> 54 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Ile Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Ile Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Tyr Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 55 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 55 Protein sequence <400> 55 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asp Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Ser Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 56 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 56 Protein sequence <400> 56 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Lys Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala Arg Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 57 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 66 Protein sequence <400> 57 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asp Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asp Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Ser Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 58 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 67 Protein sequence <400> 58 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Thr Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 59 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 70 Protein sequence <400> 59 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 60 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants No. 78 Protein sequence <400> 60 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Ser Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 61 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type PD-1 <400> 61 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 62 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#5 <400> 62 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 a 61 <210> 63 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#6 <400> 63 acgaagctct ccgatgtgtt ggagaagctg caggtgaagg tggcgttgtc cccttcggtc 60 accacgagca gggct 75 <210> 64 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#7 <400> 64 aacacatcgg agagcttcgt gctaaactgg taccgcatga gccccagcaa ccagacggac 60 aagctggccg ccttc 75 <210> 65 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#8 <400> 65 tgggcagttg tgtgacacgg aagcggctgg cctggcccag ctggccgcgg tcctcgggga 60 aggcggccag cttgt 75 <210> 66 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#9 <400> 66 cgtgtcacac aactgcccaa cgggcgtgac ttccacatga gcgtggtcag ggcccggcgc 60 agcgacagcg gcacc 75 <210> 67 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#10 <400> 67 acccgcaggc tctcccggat ctggatccgg ggggccagca ggatggcgct acagaggtag 60 gtgccgctgt cgctg 75 <210> 68 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#11 <400> 68 gggagagcct gcgggtggag ctcagggtga cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc 60 accccagccc ctcac 75 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#12 <400> 69 ttggaactgg ccggctggcc tgggtgaggg gctggggtg 39 <210> 70 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#13 <400> 70 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg 70 <210> 71 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#14 <400> 71 cagtttagca cgaagctctc cgatgtgttg gagaagctgc aggtgaaggt ggcgctgtcc 60 ccttcggtca ccacg 75 <210> 72 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#15 <400> 72 ggagagcttc gtgctaaact ggtaccgcat gagccccagc aaccaggccg acaagctggc 60 cgccttcccc gagga 75 <210> 73 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#16 <400> 73 cacgcccgtt gggcagttgt gtgacacgga agcgggagtc ctggccgggc tggctgcggt 60 cctcggggaa ggcgg 75 <210> 74 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#17 <400> 74 ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcgggg cccggcgctc cgacagcggc 60 acctacctct gttcc 75 <210> 75 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#18 <400> 75 ctgagctctg cccgcaggct ctcccggatc tgcaccttgg gggccaggga gatggcggaa 60 cagaggtagg tgccg 75 <210> 76 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#19 <400> 76 ctgcgggcag agctcagggt ggcagagaga agggcagaag tgcccacagc ccaccccagc 60 ccctcaccca ggcca 75 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#20 <400> 77 ttggaactgg ccggctggcc tgggtgaggg g 31 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#21 <400> 78 ccccagcccc tcacccaggc cagccggcca gttcc 35 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JY#22 <400> 79 ggaactggcc ggctggcctg ggtgaggggc tgggg 35 <210> 80 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA-PD-1 S.6.8.3-FLAG DNA sequence <400> 80 atgaaactga caacacatca tctacggaca ggggccgcat tattgctggc cggaattctg 60 ctggcaggtt gcgaccagag tagcagcgag gcccagccgg ccttagactc cccagacagg 120 ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc 180 accttcacct gcagcttctc caacacatcg gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg 240 agccccagca accagacgga caagctggcc gccttccccg aggaccgcgg ccagctgggc 300 caggccagcc gcttccgtgt cacacaactg cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg 360 gtcagggccc ggcgcagcga cagcggcacc tacctctgta gcgccatcct gctggccccc 420 cggatccaga tccgggagag cctgcgggtg gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa 480 gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc aggccagccg gccagttcca aggggcctcg 540 ggggccgaat tcgcggccgc tgcaccagat tataaagatg acgatgacaa agggcgcgcc 600 600 <210> 81 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA-PD-1 S.5.1T-FLAG DNA sequence <400> 81 atgaaactga caacacatca tctacggaca ggggccgcat tattgctggc cggaattctg 60 ctggcaggtt gcgaccagag tagcagcgag gcccagccgg cctgcgacca gagtagcagc 120 gaggcccagc cggccttaga ctccccagac aggccctgga acccccccac cttctcccca 180 gccctgctcg tggtgaccga aggggacagc gccaccttca cctgcagctt ctccaacaca 240 tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc atgagcccca gcaaccaggc cgacaagctg 300 gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc ggccaggact cccgcttccg tgtcacacaa 360 ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcgggg cccggcgctc cgacagcggc 420 acctacctct gttccgccat ctccctggcc cccaaggtgc agatccggga gagcctgcgg 480 gcagagctca gggtggcaga gagaagggca gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca 540 cccaggccag ccggccagtt ccaaggggcc tcgggggccg aattcgcggc cgctgcacca 600 gattataaag atgacgatga caaagggcgc gcc 633 <210> 82 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41T DNA sequence <400> 82 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggacacacgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 83 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41Y DNA sequence <400> 83 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggactaccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 84 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41G DNA sequence <400> 84 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggacgggcgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 85 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41A DNA sequence <400> 85 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggacgcccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 86 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants JY 101 DNA sequence <400> 86 tcagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccatat ccccagccat gctcgtggtg 60 accgaagggg acaacgctac cttcacctgc agcttctcca acacaccgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcataag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggacacacgc ttccgtgtca cacaactgcc caacaggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtgtg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc cgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccattaggc 420 cagttccaa 429 <210> 87 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants LDSS DNA sequence <400> 87 ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccctct ccccagccct gctcgtggtg 60 accgaagggg acgacgccac cttcacctgc agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg 120 ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180 gaccgcagcc agcccggcca ggactcccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240 gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcagtgaca gcggcaccta cctctgtggg 300 gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg 360 acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420 cagttccaa 429 <210> 88 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA-PD-1 S.6.8.3-FLAG Protein sequence <400> 88 Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly Cys Asp Gln Ser Ser Ser Glu Ala Gln 20 25 30 Pro Ala Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys 50 55 60 Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met 65 70 75 80 Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 85 90 95 Gly Gln Leu Gly Gln Ala Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn 100 105 110 Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Ser Asp Ser 115 120 125 Gly Thr Tyr Leu Cys Ser Ala Ile Leu Leu Ala Pro Arg Ile Gln Ile 130 135 140 Arg Glu Ser Leu Arg Val Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu 145 150 155 160 Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe 165 170 175 Gln Gly Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Asp Tyr Lys 180 185 190 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg Ala 195 200 <210> 89 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NlpA-PD-1 S.5.1T-FLAG Protein sequence <400> 89 Met Lys Leu Thr Thr His His Leu Arg Thr Gly Ala Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ile Leu Leu Ala Gly Cys Asp Gln Ser Ser Ser Glu Ala Gln 20 25 30 Pro Ala Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Ser Ala Thr Phe Thr Cys 50 55 60 Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met 65 70 75 80 Ser Pro Ser Asn Gln Ala Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 85 90 95 Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn 100 105 110 Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Asp Ser 115 120 125 Gly Thr Tyr Leu Cys Ser Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Val Gln Ile 130 135 140 Arg Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Ala Glu Arg Arg Ala Glu 145 150 155 160 Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe 165 170 175 Gln Gly Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Asp Tyr Lys 180 185 190 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg Ala 195 200 <210> 90 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41T Protein sequence <400> 90 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Thr Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 91 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41Y Protein sequence <400> 91 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Tyr Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 92 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41G Protein sequence <400> 92 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Gly Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 93 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants CKJ 41A Protein sequence <400> 93 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 94 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants JY 101 Protein sequence <400> 94 Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Ile Ser Pro Ala 1 5 10 15 Met Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Pro Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Ile Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Thr Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Arg Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Val Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Pro Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Leu Gly Gln Phe Gln 130 135 140 <210> 95 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Variants LDSS Protein sequence <400> 95 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asp Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Ser Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln 130 135 140

Claims (25)

  1. 삭제
  2. PD-L1(Programmed death-ligand 1) 결합력이 증대된 PD-1(Programmed cell death protein-1) 변이체로서, 상기 PD-1 변이체는 야생형(Wild type) PD-1의 아미노산 서열의 일부를 포함하며, 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 69번째 아미노산이 C69S, C69T, C69Y, C69G 또는 C69A로 치환된 것; 및 36번째 아미노산이 S36P로 치환된 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 114번째 아미노산이 L114P로 치환된 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 12번째, 34번째, 92번째, 107번째, 131번째, 132번째 및 142번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 T12S, N34T, N92K 또는 N92S, K107N, H131R, P132L 및 F142L로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  6. PD-L1(Programmed death-ligand 1) 결합력이 증대된 PD-1(Programmed cell death protein-1) 변이체로서, 상기 PD-1 변이체는 야생형(Wild type) PD-1의 아미노산 서열의 일부를 포함하며, 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 69번째 아미노산이 C69S, C69T, C69Y, C69G 또는 C69A로 치환된 것; 13번째 아미노산이 F13I 또는 F13L로 치환된 것; 및 46번째 아미노산이 M46I로 치환된 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 1번째, 17번째, 36번째, 50번째, 79번째, 100번째, 114번째, 127번째 및 139번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 N1S, L17M, S36P, N50S, G79R, G100V, L114P, V127A 및 A139L로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  9. PD-L1(Programmed death-ligand 1) 결합력이 증대된 PD-1(Programmed cell death protein-1) 변이체로서, 상기 PD-1 변이체는 야생형(Wild type) PD-1의 아미노산 서열의 일부를 포함하며, 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 69번째 아미노산이 C69S, C69T, C69Y, C69G 또는 C69A로 치환된 것; 25번째 아미노산이 N25D로 치환된 것; 및 92번째 아미노산이 N92S 또는 N92K로 치환된 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 13번째 아미노산이 F13I 또는 F13L로 치환된 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 서열목록 제61서열의 야생형 PD-1의 아미노산 서열 중 9번째, 88번째, 101번째, 125번째 및 137번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 N9D, R88K, A101V, A125S 및 R137K로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  13. 제 2 항, 제 6 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 PD-1 변이체는 무당화 PD-1 변이체인 것을 특징으로 하는 PD-1 변이체.
  14. 제 2 항, 제 6 항 또는 제 9 항의 PD-1 변이체를 코딩하는 핵산분자.
  15. 제 14 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  16. 제 15 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  18. 삭제
  19. 제 2 항, 제 6 항 또는 제 9 항의 PD-1 변이체, 제 14 항의 핵산분자 또는 제 15 항의 벡터를 유효성분으로 포함하는 암질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 하기의 단계를 포함하는 PD-1 변이체의 제조방법:
    a) 제 2 항, 제 6 항 또는 제 9 항의 PD-1 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 PD-1 변이체를 회수하는 단계.
  25. 하기의 단계를 포함하는 PD-1 변이체의 스크리닝 방법:
    a) 제 2 항, 제 6 항 또는 제 9 항의 PD-1 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산분자에 추가적으로 무작위적인 점 돌연변이를 가한 PD-1 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 라이브러리를 구축하는 단계; 및
    b) 상기 라이브러리에서 야생형(wild type) PD-1(Programmed cell death protein-1) 및 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 간 결합을 억제하는 PD-1 변이체를 선별하는 단계.
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