CN103980354B - 真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因 - Google Patents
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Abstract
本发明首次运用基因工程手段提供了一种来源于真菌的新的免疫调节蛋白—FIP‑ppl。本发明还提供并合成了编码上述蛋白的基因，所述蛋白FIP‑ppl具有免疫调节和抗肿瘤作用。经实验证实，所述蛋白对脾淋巴细胞具有催分裂作用，并可增加细胞介素2的合成；本发明还证实了所述蛋白对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC823均具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。本发明的蛋白FIP‑ppl与已发现的多数真菌免疫调节蛋白同源性低，是一种新型的免疫调节和抗肿瘤生物制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因。
背景技术：
真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下简称为FIPs)是近年来从一些高等担子菌(食用菌类)子实体中提取的，与植物凝集素和免疫球蛋白结构和功能相似的一类小分子蛋白质。FIPs具有调节免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇和抑制机体自体免疫等多种重要的生理功能。
FIPs具有独特的生理功能，而且具有极强的稳定性和食用安全性，可以调节免疫力，抑制肿瘤发生，治疗过敏等。因此，FIPs即可以用作增强机体健康的保健品功能成分，还可以开发成预防和治疗疾病的天然药物。
目前世界上报道的FIPs种类较少，并且多数是从蘑菇中得到的。虽然真菌的种类繁多，但是由于食用菌含有大量多糖和其它杂质成分，且FIPs的相对含量较低，小肽制备、分析相对较难，导致FIPs蛋白的提取工艺复杂、周期长、成本高、得率低，因而严重影响和限制了新的FIPs的发现及其大量制备。而且，临床与医药应用均具有一定的剂量和纯度要求，若开发和应用此类药品，必须获得相当数量的蛋白质纯品。所以，真正能应用的FIPs较少。
因此，通过基因工程方法从已完成基因组测序的真菌中获得可开发利用的FIPs蛋白，既能丰富FIPs家族的种类，更能为人类健康的保健和治疗提供新的免疫调节剂。
发明内容：
本发明的目的是通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌的免疫调节蛋白，并将其应用于免疫调节和抗肿瘤药物的制备中。
本发明的目的还包括提供上述真菌免疫调节蛋白的基因、重组表达载体、重组菌株。
本发明的另一目的是提供上述真菌免疫调节蛋白的制备方法。
本发明人通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌Postia placenta Mad-698-R的免疫调节蛋白FIP-ppl，发现其适合于在保健品和医药中使用。
所述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl，全长125个氨基酸，理论分子量为14.738kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
FIP-ppl蛋白是一种新型的真菌免疫调节蛋白。本发明人通过将其cDNA序列推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现：FIP-ppl蛋白与小孢灵芝、赤灵芝、紫灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性仅分别为58％、56％、54％和52％。说明FIP-ppl是一种新的真菌免疫调节蛋白。
本发明还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因：通过一对引物FIP-P-GST-F(EcoRI)：5'-GAA TTC ATT ACT TAT GTT CTT CAG G-3'和FIP-P-22b-R’(XhoI)：5'-CTC GAG TTA CTG GGA CTG GG-3'，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因，DNA全序列分析结果表明，fip-ppl全长384bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了包含蛋白FIP-ppl基因的重组表达载体。方法是将本发明的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的表述载体是pGEX-4T-1。
作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是pGEX-4T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达载体pGEX-fip-ppl。
将上述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌。所述宿主细胞优选为大肠杆菌Rosetta，得到重组菌株ROS/GST-FIP-ppl。
本发明还提供了包含真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因的重组菌株，优选为重组菌株ROS/GST-FIP-ppl。
本发明还提供了制备真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的方法，包括以下步骤：
1)将含FIP-ppl基因的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的表达；以及
3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。
经免疫调节、肿瘤抑制和凋亡实验证实：FIP-ppl蛋白对脾淋巴细胞具有催分裂作用，增加细胞介素2的合成，对二种肿瘤细胞包括肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC823均具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，可应用于保健品和医药等工业(详见实施例3～6)。
本发明优点和有益效果：
1、可以提供相当数量的免疫调节蛋白质FIP-ppl纯品，完全能满足临床与医药应用需求。
FIP-ppl在该大肠杆菌表达系统中实现高效表达，表达量为36mg/L(实施例2)；经柱纯化后，蛋白质的含量达到电泳纯(图1A)，经质谱鉴定表达正确(图1B)。而目前通常从几千克食用菌中只能提取毫克级蛋白。
2、FIP-ppl可作为免疫调节剂，提高机体免疫力。
FIP-ppl可以高效激活淋巴系统，提高免疫力(实施例3)，还可以激活T淋巴细胞增殖，诱导TH1特异性的细胞介素合成(实施例4)。
3、FIP-ppl具有抗肿瘤活性，具有治疗应用潜力。
对胃癌细胞和肝癌细胞具有毒性作用，特别是对于胃癌细胞MGC823具有更高毒性和特异性(实施例5)，其作用机理是通过诱导肿瘤细胞凋亡对细胞产生毒性(实施例6)。
4、首次运用基因工程手段提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白。
由于运用基因工程手段来产业化生产真菌免疫调节蛋白FIP-ppl产品还未见报道。本发明首次提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白FIP-ppl。而且，根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。
附图说明：
图1～图5是对本发明纯化制备的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl进行的分析和功能实验，其中：
图1是SDS-PAGE分析和质谱鉴定：其中，图1A为SDS-PAGE分析，条带1为分子量标品，条带2为纯化的FIP-ppl蛋白；图1B为质谱鉴定，底端划线部分为质谱鉴定序列。
图2是蛋白FIP-ppl促进鼠脾淋巴细胞增殖结果。
图3是蛋白FIP-ppl促进细胞介素2合成结果。
图4是蛋白FIP-ppl肿瘤抑制实验结果。
图5是蛋白FIP-ppl诱导肿瘤细胞凋亡结果。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。
试验材料
1、细胞株：人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC823、4-6周无致敏环境下生长的BalB/C小鼠。
2、试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：
试剂盒：Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，小鼠白介素2定量ELISA检测试剂盒购于北京鼎国生物公司；
PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成；
酶类：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司；
仪器：离心机、振荡摇床、显微镜、酶标仪、流式细胞仪；
生化试剂：氨苄青霉素、青霉素(钠盐)、硫酸链霉素、溴酚兰、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、噻唑兰(MTT)、小牛血清(BSA)、植物凝集素(PHA)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品。
3、培养基
RPM11640培养基(pH7.2)：加入10％BSA、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，0.22μm滤膜过滤灭菌后4℃保存；高糖DMEM培养液。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1真菌免疫调节蛋白FIP-ppl编码基因fip-ppl的筛选和克隆
以金针菇真菌免疫调节蛋白FIP-fve为诱饵，在NCBI真菌基因组数据库中进行BLAST比对，在担子真菌Postia placenta Mad-698-R基因组中发现与FIP-fve同源性为52％的FIP-ppl编码基因，密码子优化后，合成基因；设计并合成引物FIP-P-GST-F(EcoRI:5'-GAATTC ATT ACT TAT GTT CTT CAG G-3')和FIP-P-22b-R(XhoI:5'-CTC GAG TTA CTGGGA CTG GG-3')，用以上引物扩增合成基因，连接到克隆载体T-vector，进行测序验证；获得FIP-ppl编码基因全长384bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的制备。
用限制酶EcoRI和XhoI酶切以上克隆载体，获得目标基因fip-ppl，将目标基因连接到经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1，获得含有真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因的重组表达载体pGEX-fip-ppl，转化大肠杆菌Rosetta，获得重组菌株ROS/GST-FIP-ppl。
取含有重组质粒的ROS/GST-FIP-ppl菌株，接种于200mL含有50μg/ml氨苄的LB培养液中，37℃200rpm培养至OD600为0.8-1.0，加0.1mM IPTG，25℃200rpm诱导培养6h后，离心收集菌体。0.2体积的PBS溶解菌体，超声波破碎，离心收集上清。GST柱纯化后，用100U/ml凝血酶30℃作用24h切除GST标签。
实验结果：
显示重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl在大肠杆菌中成功表达，表达量为36mg/L；经柱纯化后，蛋白质的含量达到电泳纯(图1A)，经质谱鉴定表达正确(图1B)。
结论：
FIP-ppl在该大肠杆菌表达系统中实现高效表达，因此可以快速提供相当数量的蛋白质纯品，以满足临床与医药应用需求。
实施例3重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl对小鼠脾淋巴细胞增殖活性测定
实验方法：
采用MTT法测定重组真菌免疫调节蛋白对小鼠脾淋巴细胞的促分裂作用。所用抗生素、重组蛋白FIP-ppl、ConA、LPS和MTT都用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存。
1)取4-6周无致敏环境下生长的BalB/C小鼠，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡5分钟，在超净工作台中无菌条件取脾脏。
2)采用研磨法(4-6层灭菌纱布或200目细胞筛)分离脾淋巴细胞。
3)用3ml RPMIl640培养液(不含FBS和双抗)悬浮脾细胞，2000rpm离心2分钟。
4)小心吸取上清，重复步骤(3)3-5次。
5)将脾细胞悬浮于1ml配制好的RPMIl640培养液(含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中，稀释浓度至1x106细胞/ml。
6)在96孔培养板上每孔加入100μl脾淋巴细胞悬浮液，加入重组免疫调节蛋白PBS溶液(终浓度1、2、4、8、16和32μg/mL)，同时加pH7.210mM PBS、ConA(终浓度5μg/ml)和LPS(终浓度2μg/ml)分别做为阴性对照和阳性对照。另外，为了观察重组蛋白的协同作用，分别加入重组蛋白与ConA和LPS的混合液。每个测试样品做3个平行。
7)将培养板封口，放置于5％CO2，37℃培养箱中培养48-72小时，在显微镜下观察细胞增殖效果。
8)沿培养板孔内壁小心加入20μl MTT(5mg/ml)的PBS液，轻轻振荡30秒混匀，继续培养4-5小时。
9)小心吸取上清，尽量吸干细胞培养液，加入100μl DMSO，轻轻振荡10分钟后，放入酶标仪(Model680，Bio-Rad)，于570nm测定吸光值，记录读数。制作反应-柱状图。
实验结果：
FIP-ppl可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖；浓度为2μg/mL时，重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用最强(图2)；FIP-ppl与刀豆蛋白ConA具有协同作用，二者同时作用时，FIP-ppl的最强增殖浓度降为1μg/mL。
结论：
FIP-ppl可以高效激活淋巴系统，提高免疫力。
实施例4重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl促细胞因子白介素2分泌活性测定
实验方法：通过ELISA方法检测重组免疫调节蛋白促进小鼠脾淋巴细胞分泌白介素2(IL-2)的作用,以测定其免疫调节活性。
1)BaIB/C小鼠脾淋巴细胞悬浮液制备同上，最终稀释于配制好的RPMIl640培养液(含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)中，稀释浓度至1x107细胞/ml。
2)在96孔培养板中加入100μl细胞悬浮液，100μl重组蛋白液，终工作浓度为1、2、4、8、16和32μg/ml，同时加100μl ConA(5μg/ml)和pH7.210mM PBS做正负对照，每个样品3个平行。密封好后，轻轻震荡混匀，放于5％CO2，37℃培养箱中培养48小时。
3)吸出细胞培养液，2000rpm室温离心5分钟，收集上清。用小鼠IL-2定量ELISA试剂盒检测IL-2合成。
实验结果：
FIP-ppl可以诱导小鼠脾淋巴细胞合成IL-2(图3)；有效浓度为1、2、和4μg/mL；浓度为2μg/mL时，重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl诱导小鼠脾淋巴细胞合成的IL-2最多。
结论：
FIP-ppl可以激活T淋巴细胞增殖，诱导TH1特异性的细胞介素合成。
实施例5MTT法测定重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl体外抗肿瘤活性
实验方法：
1)在相应的培养液中传代培养肿瘤细胞，计数肿瘤细胞，稀释到终浓度为5×105细胞/ml。
2)在96孔培养板内每孔加入100μl肿瘤细胞悬浮液，100μl重组蛋白样品，终浓度为2、4、8、16、32和64μg/ml。同时加入5-氟尿嘧啶(5，10μg/mL)做正对照。每个样品3个平行。
3)混匀后，放于5％CO2，37℃培养箱中培养12-72小时。每隔12小时显微镜观察抗肿瘤结果。
4)24小时后，沿培养板孔内壁小心加入20μl MTT的PBS液，轻轻振荡30秒混匀，继续培养4-5小时。
5)小心吸取上清，尽量吸干细胞培养液，加入100μl DMSO，轻轻振荡10分钟后，放入酶标仪，于570nm测定吸光值，记录读数，制作反应-曲线柱状图。
实验结果：
FIP-ppl对不同肿瘤细胞的毒性作用不同，对胃癌细胞的毒性作用强于对肝癌的毒性作用(图4)；在检测浓度2–64μg/ml，FIP-ppl对胃癌细胞MGC823均具有毒性作用；而只有在检测浓度为32和64μg/ml时，FIP-ppl对肝癌细胞HepG2具有毒性作用。
结论：
FIP-ppl对肿瘤细胞具有高毒性和特异性，具有治疗应用潜力。
实施例6重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl诱导肿瘤活性凋亡分析
实验方法：
1)在5％CO2，37℃培养箱中用相应细胞培养液培养肿瘤细胞株，细胞计数，使其终浓度为l x106细胞/ml。
2)在12孔培养板中每孔加入0.8ml肿瘤细胞悬浮液，加入0.2ml终浓度为32和64μg/ml的重组真菌免疫调节蛋白，以正常生长的肿瘤细胞做负对照，每个样品浓度做3个平行；在5％CO2，37℃培养箱中培养24小时。
3)3000rpm，室温离心5分钟，收集肿瘤细胞。诱导肿瘤细胞的凋亡率用Annexin-V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒测定。
4)用pH7.210mM PBS洗涤肿瘤细胞，3000rpm，室温离心5分钟，共2次。确保最终收集细胞数为1.5×105。
5)加入试剂盒内结合缓冲液500μl，混匀；再加入2μl Annexin-V-EGFP，混匀；最后加入5μl碘化丙啶(PI)，充分混匀。
6)室温避光暗处反应10-15分钟，在1个小时内送至流式细胞仪进行测试。
7)FCM采用488nm激发波长，530nm发射波长；Annexin-V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道(FLl)；PI红色荧光通过PI通道(FL3)。
8)以未经PI和EGFP染色的正常生长的肿瘤细胞做阴性对照，用于圈定细胞群并且调整2种荧光滤光片的基础电压和增益值，以十字门法记录所有被荧光标记的肿瘤细胞，同时计算诱导细胞凋亡率。
实验结果：
FIP-ppl可以诱导肿瘤细胞MGC823和HepG2凋亡(图5)，32和64μg/ml时诱导肿瘤细胞MGC823的凋亡率为7.88％和11.43％，诱导HepG2的凋亡率为5.37％和7.45％，对MGC823的凋亡作用强于HepG2的。
结论：
FIP-ppl通过诱导肿瘤细胞凋亡对细胞产生毒性，其诱导肿瘤细胞凋亡具有特异性，对胃癌细胞的作用强于对肝癌细胞。
Claims (10)
1.真菌免疫调节蛋白FIP-ppl，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白FIP-ppl的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，是权利要求2所述的基因插入表达载体pGEX-4T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，所得到的重组表达载体pGEX-fip-ppl。
5.权利要求3或4所述的重组表达载体转化的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，为大肠杆菌细胞。
7.含权利要求2所述基因的重组工程菌株。
8.一种制备真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的方法，包括以下步骤：
1)用权利要求3或4的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的表达；以及
3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。
9.含权利要求1所述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的制剂。
10.权利要求1所述的蛋白FIP-ppl在制备免疫调节剂和抗肿瘤制剂中的应用，所述肿瘤是肝癌和胃癌。
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