CN106188275A - 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 - Google Patents
识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106188275A CN106188275A CN201510228932.6A CN201510228932A CN106188275A CN 106188275 A CN106188275 A CN 106188275A CN 201510228932 A CN201510228932 A CN 201510228932A CN 106188275 A CN106188275 A CN 106188275A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tcr
- seq
- cell
- chain
- variable domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 37
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 title description 30
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 title description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 72
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 67
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 49
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 38
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 33
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 24
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 description 24
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 description 22
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 description 22
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 description 21
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 12
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 5
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 5
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 2
- 102000004960 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Human genes 0.000 description 2
- 108020000284 NAD(P)H dehydrogenase (quinone) Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 2
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100172874 Caenorhabditis elegans sec-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018404 Glucagonoma Diseases 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 101000934581 Homo sapiens Valacyclovir hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 102100025139 Valacyclovir hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/464488—NY-ESO
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Abstract
本发明提供了一种能够特异性结合衍生自NY‑ESO‑1抗原短肽SLLMWITQC的T细胞受体(TCR),所述抗原短肽SLLMWITQC可与HLA A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外,本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及能够识别源自NY-ESO-1抗原短肽的TCR,本发明还涉及转导上述TCR来获得的NY-ESO-1特异性的T细胞,及他们在预防和治疗NY-ESO-1相关疾病中的用途。
背景技术
NY-ESO-1属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen,CTA)家族,能在睾丸、卵巢组织以及多种不同类型的肿瘤组织中表达,而在其他正常组织中不表达,是一种特异性较强的肿瘤抗原。NY-ESO-1是一种内源性抗原,在细胞内生成后被降解成小分子多肽,并与MHC(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物,被呈递到细胞表面。SLLMWITQC(157-165)是衍生自NY-ESO-1抗原的短肽,是NY-ESO-1相关疾病治疗的一种靶标。研究显示,NY-ESO-1在多种肿瘤组织中均有表达,在神经母细胞瘤(Rodolfo M,et al.,Cancer Res,2003,63(20):6948-6955)、肉瘤(Jungbhth A A et al.,Int J Cancer,200l,94(2):252-256)、恶性黑色素瘤(Barrow C,et al.,Clin Cancer Res,2006,12(3Pt 1):764-771)中有非常高的表达,同时在前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、口腔鳞癌(Ries J,et al.,Anticancer RES,2009,29(12):5125-5130)、以及食管癌(Fujita S,Clin Cancer Res,2004,10(19):6551-6558)中也有较高的表达。对于上述疾病的治疗,可以采用化疗和放射性治疗等方法,但都会对自身的正常细胞造成损害。
T细胞过继免疫治疗是将对靶细胞抗原具有特异性的反应性T细胞转入病人体内,使其针对靶细胞发挥作用。T细胞受体(TCR)是T细胞表面的一种膜蛋白,其能够识别相应的靶细胞表面的抗原短肽。在免疫系统中,通过抗原短肽特异性的TCR与短肽-主组织相容性复合体(pMHC复合物)的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触,然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用,引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应,从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此,本领域技术人员致力于分离出对NY-ESO-1抗原短肽具有特异性的TCR,以及将该TCR转导T细胞来获得对NY-ESO-1抗原短肽具有特异性的T细胞,从而使他们在细胞免疫治疗中发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种识别NY-ESO-1抗原短肽的T细胞受体及其应用。
本发明的第一方面,提供了一种T细胞受体(TCR),所述TCR能够与SLLMWITQC-HLA复合物特异性地结合,其包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域,并且所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90%(较佳地至少95%,更佳地至少98%,最佳的至少99%)序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域,所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列为ALTLNNAGNMLT(SEQ ID NO:12);和/或所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列为ASLDPRAGTDTQY(SEQ ID NO:15)。
在另一优选例中,所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)为:
α CDR1-ATGYPS (SEQ ID NO:10);
α CDR2-ATKADDK (SEQ ID NO:11);和
α CDR3-ALTLNNAGNMLT (SEQ ID NO:12);和/或
所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为:
β CDR1-SNHLY (SEQ ID NO:13);
β CDR2-FYNNEI (SEQ ID NO:14);和
β CDR3-ASLDPRAGTDTQY (SEQ ID NO:15)。
在另一优选例中,所述TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在另一优选例中,所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:5。
在另一优选例中,所述TCR为αβ异质二聚体,其包含TCRα链恒定区TRAC*01和TCRβ链恒定区TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一优选例中,所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO:3和/或所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
在另一优选例中,所述TCR是可溶的。
在另一优选例中,所述TCR为单链。
在另一优选例中,所述TCR是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。
在另一优选例中,所述TCR在α链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位,和/或α链J基因短肽氨基酸倒数第3位、倒数第5位或倒数第7位中具有一个或多个突变;和/或所述TCR在β链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位,和/或β链J基因短肽氨基酸倒数第2位、倒数第4位或倒数第6位中具有一个或多个突变,其中氨基酸位置编号按IMGT(国际免疫遗传学信息系统)中列出的位置编号。
在另一优选例中,所述TCR的α链可变域氨基酸序列包含SEQ ID NO:32和/或所述TCR的β链可变域氨基酸序列包含SEQ ID NO:34。
在另一优选例中,所述TCR的氨基酸序列为SEQ ID NO:30。
在另一优选例中,所述TCR包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链;以及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链;
并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域,或包含功能性可变结构域和所述TCR链恒定结构域的至少一部分。
在另一优选例中,半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。
在另一优选例中,在所述TCR中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点:
TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57;
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77;
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17;
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59;
TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15;
TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54;
TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19;和
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。
在另一优选例中,所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO:26和/或所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO:28。
在另一优选例中,所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
在另一优选例中,与所述T细胞受体结合的偶联物为肽、可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合。优选地,所述治疗剂为抗-CD3抗体。
本发明的第二方面,提供了一种多价TCR复合物,其包含至少两个TCR分子,并且其中的至少一个TCR分子为本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第三方面,提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互补序列。
在另一优选例中,所述核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQID NO:2或SEQ ID NO:33。
在另一优选例中,所述核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQID NO:6或SEQ ID NO:35。
在另一优选例中,所述核酸分子包含编码TCRα链的核苷酸序列SEQ ID NO:4和/或包含编码TCRβ链的核苷酸序列SEQ ID NO:8。
本发明的第四方面,提供了一种载体,所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子;优选地,所述的载体为病毒载体;更优选地,所述的载体为慢病毒载体。
本发明的第五方面,提供了一种分离的宿主细胞,所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。
本发明的第六方面,提供了一种细胞,所述细胞转导本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体;优选地,所述细胞为T细胞或干细胞。
本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的所述的TCR、本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、或本发明第六方面所述的细胞。
本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的T细胞受体、或本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体或本发明第六方面所述的细胞的用途,其特征在于,用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。
本发明的第九方面,提供了一种治疗疾病的方法,包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的TCR、本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第六方面所述的细胞或本发明第七方面所述的药物组合物;
优选地,所述的疾病为神经母细胞瘤、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、口腔鳞癌以及食管癌。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1a、图1b、图1c、图1d、图1e和图1f分别为TCRα链可变域氨基酸序列、TCRα链可变域核苷酸序列、TCRα链氨基酸序列、TCRα链核苷酸序列、具有前导序列的TCRα链氨基酸序列以及具有前导序列的TCRα链核苷酸序列。
图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f分别为TCRβ链可变域氨基酸序列、TCRβ链可变域核苷酸序列、TCRβ链氨基酸序列、TCRβ链核苷酸序列、具有前导序列的TCRβ链氨基酸序列以及具有前导序列的TCRβ链核苷酸序列。
图3为单克隆细胞的CD8+及四聚体-PE双阳性染色结果。
图4a和图4b分别为可溶性TCRα链的氨基酸序列和核苷酸序列。
图5a和图5b分别为可溶性TCRβ链的氨基酸序列和核苷酸序列。
图6为纯化后得到的可溶性TCR的胶图。
图7a和图7b分别为单链TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。
图8a和图8b分别为单链TCRα链的氨基酸序列和核苷酸序列。
图9a和图9b分别为单链TCRβ链的氨基酸序列和核苷酸序列。
图10a和图10b分别为单链TCR连接序列(linker)的氨基酸序列和核苷酸序列。
图11为本发明可溶性TCR与SLLMWITQC-HLA A0201复合物结合的BIAcore动力学图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,找到了与NY-ESO-1抗原短肽SLLMWITQC(157-165)(SEQ ID NO:9)能够特异性结合的TCR,所述抗原短肽SLLMWITQC可与HLA A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外,本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。
术语
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质,可以是Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。因此,其对于抗原的呈递具有特异性,不同的个体有不同的MHC,能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
T细胞受体(TCR),是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中,通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触,然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用,这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应,从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95%的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成,而5%的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链,α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲,α和β各链包含可变区、连接区和恒定区,β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区,但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区),CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合,其中CDR3由可变区和连接区重组而成,被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域,可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到,如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”,TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外,TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区,胞质区很短。
在本发明中,术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。
发明详述
TCR分子
在抗原加工过程中,抗原在细胞内被降解,然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此,本发明的第一方面提供了一种能够特异性结合SLLMWITQC-HLA A0201复合物的TCR分子。优选地,所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。
α链包含具有以下氨基酸序列的CDR:
α CDR1-ATGYPS (SEQ ID NO:10)
α CDR2-ATKADDK (SEQ ID NO:11)
α CDR3-ALTLNNAGNMLT (SEQ ID NO:12)
β链包含具有以下氨基酸序列的CDR:
β CDR1-SNHLY (SEQ ID NO:13)
β CDR2-FYNNEI (SEQ ID NO:14)
β CDR3-ASLDPRAGTDTQY (SEQ ID NO:15)
可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容,本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此,本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90%,优选地95%,更优选地98%序列相同性的氨基酸序列;和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:5具有至少90%,优选地95%,更优选地98%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地,一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域,所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。优选地,所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地,所述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。另一方面,所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域,所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。优选地,所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更优选地,所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根据文献中所述,本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。具体地,所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ,优选地按照从N端到C端的顺序连接。
所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ IDNO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。优选地,所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地,所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。优选地,所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更优选地,所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如,本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”,TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中给出的氨基酸序列的第53位为Arg,在此表示为:TRAC*01外显子1的Arg53,其他以此类推。优选地,本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,和/或β链的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
天然存在的TCR是一种膜蛋白,通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样,TCR也可以被开发应用于诊断和治疗,这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途,它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用,也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地,可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞,另外,可溶性TCR还可与其他分子(如,抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞,从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明也获得了对NY-ESO-1抗原短肽具有特异性的可溶性TCR。
为获得可溶性TCR,一方面,本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如,取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是:TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77;TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17;TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59;TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15;TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54;TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19;或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多50个、或最多30个、或最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸,以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然二硫键的目的,也可通过将形成天然二硫键的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。
如上所述,本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意,恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键,本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
为获得可溶性TCR,另一方面,本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR,这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明可溶性TCR的稳定性提高的突变,如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变:(α和/或β链)可变区氨基酸第11,13,19,21,53,76,89,91,94位,和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3,5,7位,和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2,4,6位,其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统,并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。
本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意,本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。如在本发明实施例4中构建的单链可溶性TCR,其α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:32,编码的核苷酸序列为SEQ ID NO:33;β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:34,编码的核苷酸序列为SEQ ID NO:35。
本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物,如可以用p53的四聚结构域来产生四聚体,或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞,也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。
本发明的TCR可以单独使用,也可与偶联物以共价或其他方式结合,优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的,其中所述TCR用于检测呈递SLLMWITQC-HLA A0201复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素(Koppe等,2005,癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24,539);2.生物毒(Chaudhary等,1989,自然(Nature)339,394;Epel等,2002,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)51,565);3.细胞因子如IL-2等(Gillies等,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Card等,2004,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)53,345;Halin等,2003,癌症研究(Cancer Research)63,3202);4.抗体Fc片段(Mosquera等,2005,免疫学杂志(The Journal Of Immunology)174,4381);5.抗体scFv片段(Zhu等,1995,癌症国际期刊(International Journal ofCancer)62,319);6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等,2005,癌症通信(Cancerletters)239,36;Huang等,2006,美国化学学会杂志(Journal of the AmericanChemical Society)128,2115);7.病毒颗粒(Peng等,2004,基因治疗(Genetherapy)11,1234);8.脂质体(Mamot等,2005,癌症研究(Cancer research)65,11631);9.纳米磁粒;10.前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL));11.化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
另外,本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如,有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此,本发明TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此,在其用于过继性T细胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制,以允许表达鼠科的T细胞的植入。
应理解,本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示,氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下:Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
核酸分子
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子,所述部分可以是一个或多个CDR,α和/或β链的可变域,以及α链和/或β链。
编码本发明第一方面TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下:
α CDR1-gccacaggatacccttcc (SEQ ID NO:16)
α CDR2-gccacgaaggctgatgacaag (SEQ ID NO:17)
α CDR3-gctctgacccttaataatgcaggcaacatgctcacc (SEQ ID NO:18)
编码本发明第一方面TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下:
β CDR1-tctaatcacttatac (SEQ ID NO:19)
β CDR2-ttttataataatgaaatc (SEQ ID NO:20)
β CDR3-gccagcctggacccacgagcgggcacagatacgcagtat (SEQ ID NO:21)
因此,编码本发明TCRα链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,和/或编码本发明TCRβ链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的,该核酸分子可以是RNA或DNA,并且可以包含或不包含内含子。优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽,例如编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6。或者,编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:33和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:35。更优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:8。或者,本发明核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:31。
应理解,由于遗传密码的简并,不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此,编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明,“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白序列,但与SEQ ID NO:2的序列有差别的核酸序列。
核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的,可以根据细胞的类型,改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
载体
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体,包括表达载体,即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
优选地,载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中,例如T细胞中,使得该细胞表达NY-ESO-1抗原特异性的TCR。理想的情况下,该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。
细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或基因组(染色体)中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自:原核细胞和真核细胞,例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。
另外,本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞,特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞,或者可以是从受试者中分离的混合细胞群,诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如,该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC),可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地,该细胞可以用抗体(如,抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化,以便使它们能够更容易接受转染,例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。
备选地,本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞,如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR,因为干细胞表面不表达CD3分子。然而,当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时,CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。
有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如,Robbins等.,(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如,Rosenberg等.,(2008)Nat Rev Cancer8(4):299-308)。
NY-ESO-1抗原相关疾病
本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与NY-ESO-1相关疾病的方法,其包括过继性转移NY-ESO-1特异性T细胞至该受试者的步骤。该NY-ESO-1特异性T细胞可识别SLLMWITQC-HLA A0201复合物。
本发明的NY-ESO-1特异性的T细胞可用于治疗任何呈递NY-ESO-1抗原短肽SLLMWITQC-HLA A0201复合物的NY-ESO-1相关疾病。包括但不限于神经母细胞瘤、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、口腔鳞癌以及食管癌。
治疗方法
可以通过分离患有与NY-ESO-1抗原相关疾病的病人或志愿者的T细胞,并将本发明的TCR导入上述T细胞中,随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此,本发明提供了一种治疗NY-ESO-1相关疾病的方法,包括将分离的表达本发明TCR的T细胞,优选地,该T细胞来源于病人本身,输入到病人体内。一般地,包括(1)分离病人的T细胞,(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞,(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明的TCR能够与NY-ESO-1抗原短肽复合物SLLMWITQC-HLA A0201特异性结合,同时转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。
下面的具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如(Sambrook和Russell等人,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1克隆NY-ESO-1抗原短肽特异性T细胞
利用合成短肽SLLMWITQC(北京赛百盛基因技术有限公司)刺激来自于基因型为HLA-A0201的健康志愿者的外周血淋巴细胞(PBL)。将SLLMWITQC短肽与带有生物素标记的HLA-A*0201复性,制备pHLA单倍体。这些单倍体与用PE标记的链霉亲和素(BD公司)组合成PE标记的四聚体,分选该四聚体及抗-CD8-APC双阳性细胞。扩增分选的细胞,并按上述方法进行二次分选,随后用有限稀释法进行单克隆。单克隆细胞用四聚体染色,筛选到的双阳性克隆如图3所示。
实施例2获取NY-ESO-1抗原短肽特异性T细胞克隆的TCR基因与载体的构建
用Quick-RNATMMiniPrep(ZYMO research)抽提实施例1中筛选到的抗原短肽SLLMWITQC特异性、HLA-A0201限制性的T细胞克隆的总RNA。cDNA的合成采用clontech的SMART RACE cDNA扩增试剂盒,采用的引物是设计在人类TCR基因的C端保守区。将序列克隆至T载体(TAKARA)上进行测序。应注意,该序列为互补序列,不包含内含子。经测序,该双阳性克隆表达的TCR的α链和β链序列结构分别如图1和图2所示,图1a、图1b、图1c、图1d、图1e和图1f分别为TCRα链可变域氨基酸序列、TCRα链可变域核苷酸序列、TCRα链氨基酸序列、TCRα链核苷酸序列、具有前导序列的TCRα链氨基酸序列以及具有前导序列的TCRα链核苷酸序列;图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f分别为TCRβ链可变域氨基酸序列、TCRβ链可变域核苷酸序列、TCRβ链氨基酸序列、TCRβ链核苷酸序列、具有前导序列的TCRβ链氨基酸序列以及具有前导序列的TCRβ链核苷酸序列。
经鉴定,α链包含具有以下氨基酸序列的CDR:
α CDR1-ATGYPS (SEQ ID NO:10)
α CDR2-ATKADDK (SEQ ID NO:11)
α CDR3-ALTLNNAGNMLT (SEQ ID NO:12)
β链包含具有以下氨基酸序列的CDR:
β CDR1-SNHLY (SEQ ID NO:13)
β CDR2-FYNNEI (SEQ ID NO:14)
β CDR3-ASLDPRAGTDTQY (SEQ ID NO:15)
通过重叠(overlap)PCR分别将TCRα链和β链的全长基因克隆至慢病毒表达载体pLenti(addgene)。具体为:用overlap PCR将TCRα链和TCRβ链的全长基因进行连接得到TCRα-2A-TCRβ片段。将慢病毒表达载体及TCRα-2A-TCRβ酶切连接得到pLenti-RHAMMTRA-2A-TRB-IRES-NGFR质粒。作为对照用,同时也构建表达eGFP的慢病毒载体pLenti-eGFP。之后再用293T/17包装假病毒。
实施例3NY-ESO-1抗原短肽特异性可溶TCR的表达、重折叠和纯化
为获得可溶的TCR分子,本发明的TCR分子的α和β链可以分别只包含其可变域及部分恒定域,并且α和β链的恒定域中分别引入了一个半胱氨酸残基以形成人工链间二硫键,引入半胱氨酸残基的位置分别为TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC2*01外显子1的Ser57;其α链的氨基酸序列与核苷酸序列分别如图4a和图4b所示,其β链的氨基酸序列与核苷酸序列分别如图5a和图5b所示,引入的半胱氨酸残基以加粗字母表示。通过《分子克隆实验室手册《(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版,Sambrook和Russell)中描述的标准方法将上述TCRα和β链的目的基因序列经合成后分别插入到表达载体pET28a+(Novagene),上下游的克隆位点分别是NcoI和NotI。插入片段经过测序确认无误。
将TCRα和β链的表达载体分别通过化学转化法转化进入表达细菌BL21(DE3),细菌用LB培养液生长,于OD600=0.6时用终浓度0.5mM IPTG诱导,TCR的α和β链表达后形成的包涵体通过BugBuster Mix(Novagene)进行提取,并且经BugBuster溶液反复多次洗涤,包涵体最后溶解于6M盐酸胍,10mM二硫苏糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸(EDTA),20mM Tris(pH 8.1)中。
溶解后的TCRα和β链以1:1的质量比快速混合于5M尿素,0.4M精氨酸,20mM Tris(pH 8.1),3.7mM cystamine,6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中,终浓度为60mg/mL。混合后将溶液置于10倍体积的去离子水中透析(4℃),12小时后将去离子水换成缓冲液(20mM Tris,pH 8.0)继续于4℃透析12小时。透析完成后的溶液经0.45μM的滤膜过滤后,通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP,5ml,GE Healthcare)纯化。洗脱峰含有复性成功的α和β二聚体的TCR通过SDS-PAGE胶确认。TCR随后通过凝胶过滤层析(HiPrep 16/60,Sephacryl S-100HR,GE Healthcare)进一步纯化。纯化后的TCR纯度经过SDS-PAGE测定大于90%,浓度由BCA法确定。本发明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE胶图如图6所示。
实施例4 NY-ESO-1抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的产生
根据专利文献WO2014/206304中所述,利用定点突变的方法将实施例2中TCRα与β链的可变域构建成了一个以柔性短肽(linker)连接的稳定的可溶性单链TCR分子。该单链TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图7a和图7b所示。其α链可变域的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图8a和图8b所示;其β链可变域的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图9a和图9b所示;其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图10a和图10b所示。
将目的基因经NcoⅠ和NotⅠ双酶切,与经过NcoⅠ和NotⅠ双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α,涂布含卡那霉素的LB平板,37℃倒置培养过夜,挑取阳性克隆进行PCR筛选,对阳性重组子进行测序,确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),用于表达。
实施例5 NY-ESO-1抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的表达、复性和纯化
将实施例4中制备的含有重组质粒pET28a-模板链的BL21(DE 3)菌落全部接种于含有卡那霉素的LB培养基中,37℃培养至OD600为0.6-0.8,加入IPTG至终浓度为0.5mM,37℃继续培养4h。5000rpm离心15min收获细胞沉淀物,用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解细胞沉淀物,6000rpm离心15min回收包涵体,再用Bugbuster(Merck)进行洗涤以除去细胞碎片和膜组分,6000rpm离心15min,收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素)中,高速离心去除不溶物,上清液用BCA法定量后进行分装,于-80℃保存备用。
向5mg溶解的单链TCR包涵体蛋白中,加入2.5mL缓冲液(6M Gua-HCl,50mM Tris-HCl pH 8.1,100mM NaCl,10mM EDTA),再加入DTT至终浓度为10mM,37℃处理30min。用注射器向125mL复性缓冲液(100mM Tris-HClpH 8.1,0.4M L-精氨酸,5M尿素,2mM EDTA,6.5mMβ-mercapthoethylamine,1.87mM Cystamine)中滴加上述处理后的单链TCR,4℃搅拌10min,然后将复性液装入截留量为4kDa的纤维素膜透析袋,透析袋置于1L预冷的水中,4℃缓慢搅拌过夜。17小时后,将透析液换成1L预冷的缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0),4℃继续透析8h,然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析过夜。17小时后,样品经0.45μm滤膜过滤,真空脱气后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare),用20mM Tris-HClpH 8.0配制的0-1M NaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白,收集的洗脱组分进行SDS-PAGE分析,包含单链TCR的组分浓缩后进一步用凝胶过滤柱(Superdex 7510/300,GE Healthcare)进行纯化,目标组分也进行SDS-PAGE分析。
用于BIAcore分析的洗脱组分进一步采用凝胶过滤法测试其纯度。条件为:色谱柱Agilent Bio SEC-3(300A,φ7.8×300mm),流动相为150mM磷酸盐缓冲液,流速0.5mL/min,柱温25℃,紫外检测波长214nm。
实施例6结合表征
BIAcore分析
本实施例证明了可溶性的本发明TCR分子能够与SLLMWITQC-HLA A0201复合物特异性结合。
使用BIAcore T200实时分析系统检测实施例3中得到的TCR分子与SLLMWITQC-HLA A0201复合物的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液,pH 4.77),然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的CM5芯片,使抗体固定在芯片表面,最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面,完成偶联过程,偶联水平约为15,000RU。
使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面,然后将SLLMWITQC-HLA A0201复合物流过检测通道,另一通道作为参比通道,再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片2min,封闭链霉亲和素剩余的结合位点。
上述SLLMWITQC-HLA A0201复合物的制备过程如下:
a.纯化
收集100ml诱导表达重链或轻链的E.coli菌液,于4℃8000g离心10min后用10ml PBS洗涤菌体一次,之后用5ml BugBuster Master MixExtraction Reagents(Merck)剧烈震荡重悬菌体,并于室温旋转孵育20min,之后于4℃,6000g离心15min,弃去上清,收集包涵体。
将上述包涵体重悬于5ml BugBuster Master Mix中,室温旋转孵育5min;加30ml稀释10倍的BugBuster,混匀,4℃6000g离心15min;弃去上清,加30ml稀释10倍的BugBuster重悬包涵体,混匀,4℃6000g离心15min,重复两次,加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重悬包涵体,混匀,4℃6000g离心15min,最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵体,SDS-PAGE检测包涵体纯度,BCA试剂盒测浓度。
b.复性
将合成的短肽SLLMWITQC(北京赛百盛基因技术有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的浓度。轻链和重链的包涵体用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mMDTT来溶解,复性前加入3M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA进一步变性。将SLLMWITQC肽以25mg/L(终浓度)加入复性缓冲液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF,冷却至4℃),然后依次加入20mg/L的轻链和90mg/L的重链(终浓度,重链分三次加入,8h/次),复性在4℃进行至少3天至完成,SDS-PAGE检测能否复性成功。
c.复性后纯化
用10体积的20mM Tris pH 8.0作透析来更换复性缓冲液,至少更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。透析后用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液,然后加载到HiTrap Q HP(GE通用电气公司)阴离子交换柱上(5ml床体积)。利用Akta纯化仪(GE通用电气公司),20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白,pMHC约在250mM NaCl处洗脱,收集诸峰组分,SDS-PAGE检测纯度。
d.生物素化
用Millipore超滤管将纯化的pMHC分子浓缩,同时将缓冲液置换为20mMTris pH 8.0,然后加入生物素化试剂0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA),室温孵育混合物过夜,SDS-PAGE检测生物素化是否完全。
e.纯化生物素化后的复合物
用Millipore超滤管将生物素化标记后的pMHC分子浓缩至1ml,采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pMHC,利用Akta纯化仪(GE通用电气公司),用过滤过的PBS预平衡HiPrepTM 16/60S200HR柱(GE通用电气公司),加载1ml浓缩过的生物素化pMHC分子,然后用PBS以1ml/min流速洗脱。生物素化的pMHC分子在约55ml时作为单峰洗脱出现。合并含有蛋白质的组分,用Millipore超滤管浓缩,BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度,加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)将生物素化的pMHC分子分装保存在-80℃。
利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数,得到本发明可溶性的TCR分子与SLLMWITQC-HLA A0201复合物结合的动力学图谱如图11所示。同时,还利用上述方法检测了本发明可溶性的TCR分子与其他抗原短肽包括KLVALGINAV-HLA A0201复合物等的结合活性,结果显示本发明TCR分子与其他无关抗原短肽均无结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种T细胞受体(TCR),其特征在于,所述TCR能够与SLLMWITQC-HLA复合物结合,其包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域,并且所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90%序列相同性的氨基酸序列;和/或
所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列;
优选地,所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列为ALTLNNAGNMLT(SEQID NO:12);和/或所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列为ASLDPRAGTDTQY(SEQ ID NO:15)。
2.如权利要求1所的TCR,其特征在于,所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)为:
α CDR1-ATGYPS (SEQ ID NO:10)
α CDR2-ATKADDK (SEQ ID NO:11)
α CDR3-ALTLNNAGNMLT (SEQ ID NO:12);和/或
所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为:
β CDR1-SNHLY (SEQ ID NO:13)
β CDR2-FYNNEI (SEQ ID NO:14)
β CDR3-ASLDPRAGTDTQY (SEQ ID NO:15)。
3.如以上任一权利要求所述的TCR,其特征在于,所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物;
优选地,与所述T细胞受体结合的偶联物为肽、可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合;更优选,所述治疗剂为抗-CD3抗体。
4.一种多价TCR复合物,其特征在于,包含至少两个TCR分子,并且其中的至少一个TCR分子为上述任一项权利要求所述的TCR。
5.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含编码上述任一项权利要求所述的TCR分子的核酸序列或其互补序列;
优选地,所述核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:33;
更优选地,所述核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:35。
6.一种载体,其特征在于,所述的载体含有权利要求5中所述的核酸分子;优选地,所述的载体为病毒载体;更优选地,所述的载体为慢病毒载体。
7.一种分离的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞中含有权利要求6中所述的载体或基因组中整合有外源的权利要求5中所述的核酸分子。
8.一种细胞,其特征在于,所述细胞转导权利要求5中所述的核酸分子或权利要求6中所述载体;优选地,所述细胞为T细胞或干细胞。
9.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-3中任一项所述的TCR、权利要求4中所述的TCR复合物、权利要求5中所述的核酸分子、或权利要求8中所述的细胞。
10.权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体、或权利要求4中所述的TCR复合物、或权利要求5中所述的核酸分子、或权利要求6中所述的载体、或权利要求8中所述的细胞的用途,其特征在于,用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510228932.6A CN106188275A (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
PCT/CN2016/081180 WO2016177339A1 (zh) | 2015-05-06 | 2016-05-05 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
CN201680001318.9A CN107197625B (zh) | 2015-05-06 | 2016-05-05 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510228932.6A CN106188275A (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106188275A true CN106188275A (zh) | 2016-12-07 |
Family
ID=57218127
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510228932.6A Pending CN106188275A (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
CN201680001318.9A Active CN107197625B (zh) | 2015-05-06 | 2016-05-05 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680001318.9A Active CN107197625B (zh) | 2015-05-06 | 2016-05-05 | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN106188275A (zh) |
WO (1) | WO2016177339A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108456247A (zh) * | 2017-02-20 | 2018-08-28 | 上海恒润达生生物科技有限公司 | 靶向ny-eso-1的t细胞受体及其用途 |
CN108690130A (zh) * | 2017-04-12 | 2018-10-23 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | 一种识别源自于lmp1抗原短肽的tcr |
CN109251980A (zh) * | 2017-07-14 | 2019-01-22 | 中国人民解放军第八医院 | 膀胱癌组织t细胞图谱模型及其构建方法和构建系统 |
CN110468106A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-11-19 | 上海宇研生物技术有限公司 | Ny-eso-1特异的tcr及其制备方法 |
CN111690051A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-22 | 英威福赛生物技术有限公司 | 靶向ny-eso-1(157-165)表位的特异性t细胞受体及抗肿瘤应用 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108117596B (zh) * | 2016-11-29 | 2023-08-29 | 香雪生命科学技术(广东)有限公司 | 针对ny-eso的高亲和力tcr |
WO2020086647A1 (en) * | 2018-10-23 | 2020-04-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ny-eso-1 t cell receptors and methods of use thereof |
CN111714618A (zh) * | 2019-03-22 | 2020-09-29 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | T细胞和高亲和力pd-1融合蛋白的组合 |
CA3142513A1 (en) | 2019-06-25 | 2020-12-30 | Gilead Sciences, Inc. | Flt3l-fc fusion proteins and methods of use |
CN112442118B (zh) * | 2019-08-30 | 2023-02-14 | 深圳普瑞金生物药业股份有限公司 | 一种tcr及其应用 |
CN117964757A (zh) | 2020-02-14 | 2024-05-03 | 吉利德科学公司 | 与ccr8结合的抗体和融合蛋白及其用途 |
TWI815194B (zh) | 2020-10-22 | 2023-09-11 | 美商基利科學股份有限公司 | 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法 |
TW202313094A (zh) | 2021-05-18 | 2023-04-01 | 美商基利科學股份有限公司 | 使用FLT3L—Fc融合蛋白之方法 |
TW202330504A (zh) | 2021-10-28 | 2023-08-01 | 美商基利科學股份有限公司 | 嗒𠯤—3(2h)—酮衍生物 |
US11919869B2 (en) | 2021-10-29 | 2024-03-05 | Gilead Sciences, Inc. | CD73 compounds |
US20230242508A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-08-03 | Gilead Sciences, Inc. | Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof |
WO2023122581A2 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Gilead Sciences, Inc. | Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof |
TW202340168A (zh) | 2022-01-28 | 2023-10-16 | 美商基利科學股份有限公司 | Parp7抑制劑 |
WO2023148494A1 (en) * | 2022-02-03 | 2023-08-10 | University College Cardiff Consultants Limited | Novel t-cell receptor |
TW202346277A (zh) | 2022-03-17 | 2023-12-01 | 美商基利科學股份有限公司 | Ikaros鋅指家族降解劑及其用途 |
TW202400138A (zh) | 2022-04-21 | 2024-01-01 | 美商基利科學股份有限公司 | Kras g12d調節化合物 |
WO2024006929A1 (en) | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Gilead Sciences, Inc. | Cd73 compounds |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6723832B1 (en) * | 1996-10-03 | 2004-04-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides corresponding to amino acid sequences of NY-ESO-1, which bind to MHC Class I and MHC Class II molecules, and uses thereof |
GB0411123D0 (en) * | 2004-05-19 | 2004-06-23 | Avidex Ltd | High-affinity NY-ESO T cell receptors |
-
2015
- 2015-05-06 CN CN201510228932.6A patent/CN106188275A/zh active Pending
-
2016
- 2016-05-05 WO PCT/CN2016/081180 patent/WO2016177339A1/zh active Application Filing
- 2016-05-05 CN CN201680001318.9A patent/CN107197625B/zh active Active
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108456247A (zh) * | 2017-02-20 | 2018-08-28 | 上海恒润达生生物科技有限公司 | 靶向ny-eso-1的t细胞受体及其用途 |
CN108690130A (zh) * | 2017-04-12 | 2018-10-23 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | 一种识别源自于lmp1抗原短肽的tcr |
CN109251980A (zh) * | 2017-07-14 | 2019-01-22 | 中国人民解放军第八医院 | 膀胱癌组织t细胞图谱模型及其构建方法和构建系统 |
CN110468106A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-11-19 | 上海宇研生物技术有限公司 | Ny-eso-1特异的tcr及其制备方法 |
CN111690051A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-22 | 英威福赛生物技术有限公司 | 靶向ny-eso-1(157-165)表位的特异性t细胞受体及抗肿瘤应用 |
CN111690051B (zh) * | 2020-06-28 | 2021-08-17 | 英威福赛生物技术有限公司 | 靶向ny-eso-1(157-165)表位的特异性t细胞受体及抗肿瘤应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107197625B (zh) | 2021-04-23 |
CN107197625A (zh) | 2017-09-22 |
WO2016177339A1 (zh) | 2016-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106188275A (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106632660B (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的tcr | |
CN110950949B (zh) | 一种识别ssx2抗原的t细胞受体 | |
CN112646024B (zh) | 一种识别kras突变的t细胞受体及其编码序列 | |
CN106749620B (zh) | 识别mage-a1抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106519019B (zh) | 识别prame抗原的tcr | |
CN106831978B (zh) | 识别prame抗原的t细胞受体 | |
CN106478809A (zh) | 识别prame抗原短肽的tcr | |
CN110343167B (zh) | 识别ssx2抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106478808B (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106699874B (zh) | 识别prame抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106478807B (zh) | 识别mage-a3的t细胞受体 | |
CN106084036A (zh) | 识别prame抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106632658B (zh) | 识别ny-eso-1抗原短肽的tcr | |
TW202140540A (zh) | 一種辨識hpv的t細胞受體 | |
CN106336457A (zh) | 识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体 | |
CN106459179B (zh) | 识别rhamm抗原短肽的t细胞受体 | |
CN109575121A (zh) | 识别afp抗原短肽的t细胞受体 | |
WO2021170116A1 (zh) | 一种识别afp的t细胞受体 | |
TW202140539A (zh) | 一種辨識afp抗原短鏈胜肽的t細胞受體及其編碼序列 | |
CN108264550B (zh) | 一种识别源自于prame抗原短肽的tcr | |
CN109251243A (zh) | 一种识别sage1抗原的t细胞受体及编码该受体的核酸 | |
TW202140532A (zh) | 一種辨識afp的t細胞受體及其編碼序列 | |
CN109575120B (zh) | 识别prame抗原短肽的tcr及其编码序列 | |
CN109400696B (zh) | 一种识别prame抗原短肽的tcr |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20171031 Address after: 510663, No. 2, Jinfeng Road, Science Town, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong province (first) Applicant after: Guangdong Xiangxue precision medical technology Co Ltd Address before: 510663 Guangdong city of Guangzhou province Luogang District Science City Jinfeng Road No. 2 Applicant before: Guangzhou Xiangxue Pharmaceutical Co., ltd. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161207 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |