CN109251980A - 膀胱癌组织t细胞图谱模型及其构建方法和构建系统 - Google Patents

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Abstract

一种膀胱癌组织T细胞图谱模型及其构建方法和构建系统，其中构建方法包括如下步骤：设置疾病组与对照组，其中，疾病组取膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用；提取各标本的全基因组DNA；扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库；采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。上述膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，通过膀胱癌组织和癌旁组织免疫组库测序分析TCR数量的变化，能发现那些高克隆扩增TCR CDR3序列，可间接获知这些高克隆扩增T细胞亚家族的分布特点，从而有利于进一步研究膀胱癌发生发展机制。

Description

膀胱癌组织T细胞图谱模型及其构建方法和构建系统
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的及其构建方法及和构建系统。
背景技术
膀胱癌(Bladder cancer)是指膀胱内细胞恶性过度生长。转移性膀胱癌患者及晚期膀胱癌患者的中位存活时间仅约14个月，而能获得无肿瘤进展生存的患者仅占15％。这不仅严重危害着人类健康，而且给家庭、社会、国家带来严重的经济负担，已经成为一个需要迫切解决的社会公共卫生问题。
近年来，肿瘤微环境中各种细胞间复杂的相互作用逐渐被人们认识，其中T淋巴细胞在其中发挥着重要作用。T淋巴细胞(T-lymphocytes)是来源于骨髓的多能干细胞，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞、抑制B淋巴细胞产生抗体，对特异性抗原产生应答反应和产生细胞因子等。T淋巴细胞对于膀胱癌细胞具有一定的杀死作用，作为细胞免疫的主力军，其对膀胱癌的治疗和抑制具有非常重要的作用。然而，在膀胱癌患者中，肿瘤微环境内的T淋巴细胞通常处于被抑制或者不识别状态。其中，T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)为存在于T淋巴细胞膜表面能够识别蛋白质抗原的受体，为所有T细胞的特有标志，是T细胞识别不同的抗原及被激活的中心环节。
因此，需要更深层次的了解与肿瘤抗原结合的T细胞受体的基因序列信息和多样性变化，因为这能更深层次的揭开T淋巴细胞参与肿瘤免疫的机理，客观准确地评估膀胱癌免疫状态，为进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制提供理论基础。
发明内容
基于此，有必要提供一种膀胱癌组织T细胞图谱模型及其构建方法和构建系统。
一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，包括如下步骤：设置疾病组与对照组，其中，疾病组取离体的膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取离体的膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用；提取各标本的全基因组DNA；扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库；采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
一种膀胱癌组织T细胞图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。
一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。
上述膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，通过膀胱癌组织和癌旁组织免疫组库测序分析TCR数量的变化，能发现那些高克隆扩增TCR CDR3序列，可间接获知这些高克隆扩增T细胞亚家族的分布特点，从而有利于进一步研究膀胱癌发生发展机制。对这些信息进一步进行验证分析和研究将有助于揭开T淋巴细胞参与肿瘤免疫的机理，客观准确地评估膀胱癌免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制。
附图说明
图1为本发明一实施方式的膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法的步骤流程图；
图2为本发明另一实施方式的膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法的步骤流程图；
图3为本发明又一实施方式的膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法中的CDR3氨基酸序列长度分布图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
例如，请参阅图1，一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，包括如下步骤：设置疾病组与对照组，其中，疾病组取离体的膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取离体的膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用；提取各标本的全基因组DNA；扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库；采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
为了进一步说明上述膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，又一个例子是，请参阅图2，所述构建方法包括如下步骤：
S110：设置疾病组与对照组，其中，疾病组取离体的膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取离体的膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用。例如，组织的标本下简称为组织标本。本实施例中，组织标本收集于2015年11月至2016年1月在广东省深圳市人民医院住院接受根治性膀胱切除术的膀胱癌患者，所有组织标本的取材均事先向患者及家属详细解释说明，征得患者及家属的同意并签署《知情同意书》，本实验研究通过医院伦理委员会的讨论审批。在手术主刀医师和临床肿瘤病理医师的指导帮助下，首先进行大体标本的观察和拍照，确认肿瘤的部位、范围，并注意鉴别周围组织及坏死组织。例如，在标本离体后30分钟内完成切取标本，将膀胱癌及癌旁组织切取成多块直径为0.5cm左右的组织块，然后立刻用0.9％NaCl反复冲洗，之后放入冻存管中并将其置于-20℃冷冻，最后将其储存于-80℃冰箱备用。又如，疾病组及对照组的中离体的标本的选取：本实验所用到的5例膀胱癌组织及癌旁组织标本均来自于广东省深圳市人民医院。例如，所述疾病组与对照组中使用的标本的选取采用如下标准：(1)根治性膀胱切除术后病理确诊为肌层浸润性膀胱癌；(2)术前未接受放疗、化疗；(3)标本具有完整的组织结构，没有坏死组织；(4)有完整的临床资料和其他各种资料。患者的临床分期是根据国际抗癌联盟(第6版)的TNM分期标准进行评定；病理分级是根据WHO 2004分级标准进行评定。共纳人膀胱癌患者5例，男4例，女1例，年龄为44岁～82岁，病程0.5年～4年，肿瘤单发3例，多发2例。肿瘤分期T1～T2期1例，T2～T4期4例。病理分级均为高分级。例如，癌组织标本，即疾病组标本取于切除的膀胱癌患者中癌变部位组织；癌旁组织标本，即对照组标本取于膀胱癌患者中癌变组织旁2cm的组织。
S120：提取各标本的全基因组DNA。例如，本步骤具体包括如下步骤：
(1)、将各标本粉碎成碎片，分别取25mg各标本碎片放入至1.5ml的离心管中，加入180μL buffer ATL；例如，无菌切取膀胱癌组织5g左右，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵，取组织25mg粉碎成碎片放入1.5ml的离心管中，加入180μL buffer ATL。如此，组织粉碎以便于溶解提取DNA。当然，膀胱癌旁组织的处理以此类推。例如，所述buffer ATL为QiagenBuffer ATL，其货号为19076。(2)加入2μL的蛋白酶K，充分涡旋混合均匀，在56℃孵育直至各标本碎片溶解，在各标本碎片溶解的过程中不断涡旋使组织充分散开；又如，此步骤亦可为：加入2μL的蛋白酶K，充分涡旋混合均匀，在56℃孵育直至组织溶解，在组织溶解的过程中不断涡旋使组织充分散开。(3)加入200μL Buffer AL，涡旋混匀15s，56℃孵育10min直至溶解；又如，此步骤亦可为：加入200μL Buffer AL，涡旋混匀15s，56℃孵育10min直至各标本碎片溶解。(4)加入200μL无水乙醇，涡旋混匀15s，得到混合液；(5)将所述混合液加入吸附柱，然后将吸附柱放入收集管中，≥8000rpm离心1min，弃滤液；又如，所述吸附柱为Qiagen quick吸附柱。(6)加入500μL Buffer AW1，≥8000rpm离心1min，弃滤液；又如，Buffer AW1为QIAGEN生产，其货号为19081。(7)加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min，弃滤液；又如，Buffer AW2为QIAGEN生产，其货号为19082。(8)把吸附柱放到一个新的1.5mL收集管内，加入30μL Buffer AE至膜中间，室温放置1min，14000rpm离心1min；使用30μL洗脱液Buffer AE重复此步骤；又如，Buffer AE为QIAGEN生产，其货号为19077。例如，Buffer AL、buffer ATL、Buffer AW1、Buffer AW2、Buffer AE等为DNA Mini and BloodDNA Mini Kit试剂盒中试剂，该试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAamp系列产品，可以市售购买到，使用参见其说明书即可。(9)收集DNA并存放在2℃～8℃冰箱中待用，即得到各标本的全基因组DNA。
S130：检测全基因组DNA中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。例如，DNA含量的检测方法主要有：荧光定量检测和酶标仪检测。
一实施例中，采用荧光定量测定全基因组DNA中DNA含量，用于检测DNA样品的浓度。又如，所述荧光定量检测为Qubit Fluorometer。又如，选用Thermo Fisher Scientific的QubitTM3荧光计进行所述荧光定量检测，其操作及使用参阅其说明书和咨询其技术人员即可。例如，采用荧光定量检测对全基因组DNA中DNA的含量进行检测，其过程如下：首先，配制DNA染料工作液，又如，DNA染料工作液为Quant-iTTM Working Solution，又如，Quant-iTTM Working Solution的配制为：将DNA结合染料Quant-iTTM reagent用Quant-iTTMbuffer按照1：200进行稀释即为Quant-iTTM Working Solution。其次，标准品与标准曲线的制备：取Quant-iTTM standard1(100ng/μL)和Quant-iTTM standard2(100ng/μL)各10μL，与190μL Quant-iTTM Working Solution相混合即为所述标准品；将已配置好的标准品按照Fluorometer已设定好的程序进行标准曲线的制备。最后，样本DNA的定量：将DNA样品在冰上融化后，充分混匀并离心后取2μL～20μL的待测样本与180μL～198μL Quant-iTTMWorking Solution混合，室温条件下静置2min后使DNA与染料充分结合，接着放置于Fluorometer中进行荧光检测，便可以直接从标准曲线上读出与其荧光强度相对应的DNA含量(ng/μL)。
例如，确定是否合格为确定全基因组DNA中的标本DNA的OD260/OD280的比值为1.8～2.0，是则执行下一步骤。
一实施例中，采用琼脂糖凝胶电泳检测全基因组DNA中的完整性，主要是用于检测样品完整性和是否存在蛋白质杂质、RNA等。例如，采用琼脂糖凝胶电泳检测全基因组DNA中的完整性具体包括如下步骤：(1)琼脂糖凝胶的制备：取0.8g琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置于微波炉或沸水浴中加热至完全溶化并摇匀，制成0.8％的琼脂糖凝胶；等到琼脂糖凝胶溶液的温度降到55℃左右时小心倒入插入了梳子的电泳槽水平板上，并注意不要倒满至溢出；待琼脂糖凝胶凝固后向电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，然后将梳子拔出即可。(2)将DNA样品置于冰上融化后，充分混匀并离心。(3)取3μL DNA样品与加样缓冲液混匀后，用移液器将适量混合液加入样品槽中，其中一孔加入2μL DNA marker，并做好记录。(4)电泳及检测全基因组DNA中的完整性。具体的，首先安装好电极导线，连接电源，在120V电压下电泳45min；当电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离后，就切断电流，取出凝胶，放置于紫外灯下检查并扫描图像，根据扫描图像分析全基因组DNA中的完整性。又如，在120V电压下电泳45min中，电泳操作在大型电泳槽中进行。
S140：扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库。
本实施例中，通过对全基因组DNA进行PCR扩增，以扩增出TCR的CDR3区，来分别得到疾病组文库和对照组文库。又如，所述TCR的CDR3区为T淋巴细胞TCRβ链CDR3区域。需要说明的是，在膀胱癌患者的膀胱癌组织中，T细胞在具有大量的膀胱癌细胞的肿瘤微环境中受到了膀胱癌细胞的影响或者损伤，T细胞能不能正常行驶其细胞免疫功能或者参与体液免疫，以至于进一步的能够使机体对膀胱癌细胞进行杀灭和清除，对于膀胱癌的治疗和恢复具有重要影响。T细胞的TCR具有抗原特异性的可变(V)区和恒定(C)区，其中V区是TCR识别抗原多样性和特异性主要取决区。而TCR分为TCRαβ和TCRδγ2种类型，分别由2条多肽链αβ或δγ通过二硫键连接而成的膜结合性异二聚体。TCR在个体发育过程中由V、D、J三个编码基因经过随机重排形成，一个T细胞只表达一个特异性的TCR，这样无数的TCR就形成了TCR的多样性，赋予了T细胞识别各种不同抗原、产生特异性抗体的巨大潜力。其中最能代表T细胞免疫应答特征的是TCR的互补决定区(complementarity determining regions，CDR)，包括CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，其长度和序列决定TCR的特异性，从而决定TCR与抗原的特异性结合，一种CDR3序列决定一个T细胞克隆。本实施例中，通过对T细胞TCR的CDR3区扩增，并对其进行分析，以此来探讨膀胱癌患者的膀胱癌组织中的T细胞受肿瘤微环境的影响，能发现那些高克隆扩增TCR CDR3序列，可间接获知这些高克隆扩增T细胞亚家族的分布特点，从而有利于进一步研究膀胱癌发生发展机制。对这些信息进一步进行验证分析和研究将有助于揭开T淋巴细胞参与肿瘤免疫的机理，客观准确地评估膀胱癌免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制，进而为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。
例如，所述扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库具体包括：
S141：各取各标本的全基因组DNA；例如，从膀胱癌组织和癌旁组织中提取出的全基因组DNA经过浓度和完整性检测合格，来自5个膀胱癌组织的DNA样本根据Qubit值，即荧光强度值按1:1:1:1:1混合成一个DNA样本，更名为一个疾病组；同样来自5个膀胱癌旁组织的DNA样本根据值按1:1:1:1:1混合成一个DNA样本，更名为一个对照组。例如，根据DNA样品检测报告来计算其取用量，又如，取各基因组DNA的一个反应起始量为500ng。
S142：加入引物；例如，加入TRB V/J引物；又如，TRB V/J引物为TRB V引物和/或TRB J引物。例如，所述TRB V/J引物为专门针对CDR3的V区及J区两端设计的引物。例如，所述TRB V引物包括TRBV2、TRBV3-1、TR BV4-1/2/3、TRBV5-1、TRBV5-4/5/6/8、TRBV6-4.1、TRBV6-8/5/1.2、TRBV6-9/7/1.1/6、TRBV6-4.2、TRRBV6-2/3、TRBV7-2/4/6/7/8、TRBV7-3、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2/3、TRBV11-1/2/3、TRBV12-3.2/5.2、TRBV12-3.1/4/5.1、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TR BV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27-1、TRBV28、TRBV29-1和TRBV30-F5。又如，所述TRB J引物包括TRBJ1.1、TRBJ1.2、TRBJ1.3、TRBJ1.4、T RBJ1.5、TRBJ1.6、TRBJ2.1、TRBJ2.2、TRBJ2.3、TRBJ2.4、TRBJ2.5、TRBJ2.6和TRBJ2.7。又如，TRBV2：ATTTCACTCTGAAGATCCGGTCCAC；TRBV3-1：AAACAGTTCCAAATCGMTTCTCAC；TRBV4-1/2/3：CAAGTCGCTTCTC ACCTGAATG；TRBV5-1：GCCAGTTCTCTAACTCTCGCTCT；TRBV5-4/5/6/8：TCAGGTCGCCAGTTCCCTAAYTAT；TRBV6-4.1：CACGTTGGCGTCTGCTGT ACCCT；TRBV6-8/5/1.2：CAGGCTGGTGTCGGCTGCTCCCT；TRBV6-9/7/1.1/6：CAGGCTGGAGTCAGCTGCTCCCT；TRBV6-4.2：AGTCGCTTGCTGTAC CCTCTCAG；TRRBV6-2/3：GGGGTTGGAGTCGGCTGCTCCCT；TRBV7-2/4/6/7/8：GGGATCCGTCTCCACTCTGAMGAT；TRBV7-3：GGGATCCGTCTCTA CTCTGAAGAT；TRBV7-9：GGGATCTTTCTCCACCTTGGAGAT；TRBV9：CCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCT；TRBV10-1：CCTCACTCTGGAGTCTG CTGCC；TRBV10-2/3：CCTCACTCTGGAGTCMGCTACC；TRBV11-1/2/3：G CAGAGAGGCTCAAAGGAGTAGACT；TRBV12-3.2/5.2：GAAGGTGCAGCCT GCAGAACCCAG；TRBV12-3.1/4/5.1：GAAGATCCAGCCCTCAGAACCCAG；TRBV13：TCGATTCTCAGCTCAACAGTTC；TRBV14：GGAGGGACGTATTC TACTCTGAAGG；TRBV15：TTCTTGACATCCGCTCACCAGG；TRBV16：CT GTAGCCTTGAGATCCAGGCTACGA；TRBV18：TAGATGAGTCAGGAATGCC AAAG；TRBV19：TCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGG；TRBV20-1：AACCATGCAAGCCTGACCTT；TRBV24-1：CTCCCTGTCCCTAGAGTCTGCCAT；T RBV25-1：GCCCTCACATACCTCTCAGTACCTC；TRBV27-1：GATCCTGGAG TCGCCCAGC；TRBV28：ATTCTGGAGTCCGCCAGC；TRBV29-1：AACTCT GACTGTGAGCAACATGAG；TRBV30-F5：CAGATCAGCTCTGAGGTGCCCC A；TRBJ1.1：CTTACCTACAACTGTGAGTCTGGTG；TRBJ1.2：CTTACCTACAACGGTTAACCTGGTC；TRBJ1.3：CTTACCTACAACAGTGAGCCAACTT；T RBJ1.4：AAGACAGAGAGCTGGGTTCCACT；TRBJ1.5：CTTACCTAGGATGG AGAGTCGAGTC；TRBJ1.6：CATACCTGTCACAGTGAGCCTG；TRBJ2.1：C CTTCTTACCTAGCACGGTGA；TRBJ2.2：CTTACCCAGTACGGTCAGCCT；T RBJ2.3：CCGCTTACCGAGCACTGTCAG；TRBJ2.4：AGCACTGAGAGCCGGGTCC；TRBJ2.5：CGAGCACCAGGAGCCGCGT；TRBJ2.6：CTCGCCCAGCA CGGTCAGCCT；TRBJ2.7：CTTACCTGTGACCGTGAGCCTG；如此，通过选用所述TRB V/J引物，能够较好地扩增出TCR的CDR3区。尤其需要说明的是，引物的设计对于TCR的CDR3区能否较好地扩增出至关重要。通过选用所述T RB V/J引物，能够较好地扩增出TCR的CDR3区，以此来探讨膀胱癌患者的膀胱癌组织中的T细胞受肿瘤微环境的影响。
S143：进行多重PCR扩增；又如，选用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR扩增；如此，通过选用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR扩增，在TRB V/J引物的基础上，来对TCR的CDR3区进行扩增。例如，多重PCR反应中，扩增30个30cycles。如此，能够扩增出TCR的CDR3区。又如，所述QIAGEN multiplex PCR Kit为QIAGEN的多重PCR试剂盒。
S144：进行电泳检测回收100bp～190bp的多重PCR产物；例如，使用QIAquick GelExtraction kit进行电泳检测回收100bp～190bp的多重PCR产物；例如，在多重PCR完成之后，通过使用QIAquick Gel Extraction kit进行电泳检测回收100bp～190bp的多重PCR产物。又如，所述QIAquick Gel Extraction kit为凝胶回收试剂盒。
S145：进行末端修复反应，并对产物进行纯化；具体的，例如，加入End Repair Mix进行末端修复反应，并对产物使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化；通过向回收的100bp～190bp的多重PCR产物中加入End Repair Mix进行末端修复反应，能够在经过PCR扩增后得到的DNA片段的3’端连上“A”碱基，如此，便于后续对DNA进行的连接操作。例如，所述End Repair Mix为Thermo ScientificTM生产的Fast DNA End Repair Kit，其货号为K0771。
S146：配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接；具体的，例如，利用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接。例如，Adapter oligo mix为Illumina生产，其货号为1005711。又如，DNA ligase为Thermo Scientific公司生产，其货号为EL0014。
S147：通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段。
S148：纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。具体的，例如，使用QIAquick GelExtraction kit进行纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。
通过将经S147步骤中各PCR反应后的产物使用QIAquick Gel Extraction kit进行纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。又如，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目标片段之后，使用QIAquick Gel Extraction kit进行胶纯化回收并溶于Elution Buffer中，即文库构建完成，分别得到疾病组文库和对照组文库。又如，Elution Buffe为promega公司生产，其货号为A1655。
需要说明的是，上述步骤S141至S146需要分别对S141中的疾病组和对照组依次进行，以此来获得与之相对应的疾病组文库和对照组文库。
一实施例中，在所述步骤S148之后，所述构建方法还包括：S149：分别对所述疾病组文库和对照组文库进行检测。例如，对文库的插入片段范围进行检测，和/或，对文库的浓度进行定量检测。又如，分别对所述疾病组文库和所述对照组文库进行片段范围检测和浓度定量。例如，在对文库的插入片段范围进行检测时，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000Reagents)进行检测。又如，使用Agilent 2100Bioanalyzer(AgilentDNA 1000Reagents)进行检测的过程如下：(1)准备凝胶染料混合液：取出Agilent DNA1000试剂盒中的红色DNA凝胶和蓝色DNA浓缩染料，放置室温下平衡试剂大约30min，直至室温；涡旋蓝色DNA浓缩染料，用移液器吸取25μL蓝色DNA浓缩染料，然后添加到一管红色DNA凝胶中；再充分涡旋蓝色DNA浓缩染料和红色DNA凝胶的混合液，通过离心后转移到过滤柱中，混合溶液在4℃避光保存。(2)加载凝胶染料混合液：在实验操作前30min取出蓝色DNA浓缩染料和红色DNA凝胶混合的凝胶染料混合液放置室温平衡，并取出一块新的DNA芯片，小心放置在芯片注胶平台上；用移液器吸取9μL凝胶染料混合液加到标记有G的孔内，安全确保注射器柱塞刚好定位在1ml，然后关闭芯片注胶平台；按压注射器柱塞，直到被夹子卡住，计时等待60S，然后松开夹子，计时等待5S，然后拉回注射器柱塞到1ml的位置；打开芯片注胶平台，用移液器吸取9μL凝胶染料混合液加到其他标记有G的孔内。(3)加载标记物：吸取5μL绿色加载标记物加到Ladder孔内和12个样品孔内，不要留有空孔。(4)加Ladder和加样：用移液器吸取1μL黄色的DNA Ladder液到有标记的孔内，放置到芯片涡旋振荡器上，涡旋1min(2400rpm)；然后5min内将芯片放在Agilent 2100上进行DNA电泳。(5)进行荧光检测，并分析片段范围。
又如，采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库的浓度进行定量检测，又如，采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库的浓度进行定量检测的过程如下：(1)配置PCR反应液：在冰上按标准组份配置PCR反应液。又如，所述在冰上应当理解为在低温下操作，实验中通常从制冰机中取各冰块，配置管放置于冰上或者冰块中，以维持低温的配置环境，这对于本领域技术人员，尤其是对于本领域的实验技术人员，是清楚的、确切的。(2)进行Real-Time PCR反应。(3)实验结果分析：Real-Time PCR反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，最后进行PCR定量时制作标准曲线。根据标准曲线确定出各文库的浓度。
S150：采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。例如，在Illumina MiSeq高通量测序平台上对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。例如，所述采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序具体包括：
S151：稀释各文库并使其变性；例如，使用去离子水或纯水稀释各文库，又如，使用超纯水稀释各文库。例如，向各文库稀释液中加入NaOH变性成单链。例如，加入NaOH使NaOH在文库稀释液中的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，优选为，0.4mol/L～0.5mol/L。
S152：按照预期上机数据量，稀释；并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；本实施例中，所述FlowCell亦可理解为芯片。或者说，所述FlowCell亦可理解为基因芯片。本实施例中，将各文库中的基因片段上的接头与基因芯片Flow Cell基底上的Oligo序列接头互补连接，使各文库中的基因片段被“固定”在基因芯片上。
S153：在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增；本实施例中，桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。又如，所述Flowcell表面所固定的接头为已知序列。
本实施例中，桥式PCR以基因芯片Flowcell基座上所固定的序列接头为模板，进行桥形扩增。这样经过不断反复的扩增循环和变性循环，最终把每个DNA片段都在各自的位置上集中成一束。又如，所述桥式PCR具体包括若干循环反应，其中每一个循环反应包括：变形操作、退火操作及延伸操作。经过若干的循环反应后，把每个DNA片段都在各自被接头固定的位置上扩增多次，并集中成一束。又如，所述循环反应的次数为25次。更详细的PCR反应参数、细节及原理请参见现有技术，本申请在此不再赘述。本实施例中，通过将循环反应的次数设置为25次，如此，能够得到适宜于后续上机测试的浓度，便于测序。
S154：将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HSv3试剂进行上机测序。
本实施例中，制备好的FlowCell即为经过桥式PCR反应后在FlowCell接头附近生成若干产物后的FlowCell。本实施例中，簇生成后，会使特定于四个荧光标记的双脱氧核苷酸和过滤组合对簇进行成像。由此，通过对荧光标记进行依次识别，以完成对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。具体实施例中，对5个肌层浸润性膀胱癌患者的癌组织(疾病组)和其附近癌旁组织(对照组)的T淋巴细胞TCRβ链CDR3区域进行测序，疾病组共获得1789531条总读数(Total Reads)，对照组共获得857022条总读数，
S160：对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。通过对测序结果进行分析，以构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。例如，步骤S160具体为：
S161：对测序结果数据进行过滤处理；例如，对测序结果数据的原始数据(RawReads)进行过滤处理，又如，所述过滤处理包括如下步骤：首先，将含有接头的序列和平均质量低于15(Illumina 0-41质量体系)的读数(reads)进行过滤去掉。其次，对于未知碱基(N碱基)，要求其碱基数要小于5％，并对序列尾部质量较差的序列，在对其低质量部分(质量小于10的碱基)进行截取时还需确保截取后的序列的平均质量大于15，同时，截取后剩余序列的长度要求不小于60。根据以上过滤条件进行过滤处理即可获得过滤后的cleandata。
S162：待数据过滤完成之后，将Pair-end数据的两条序列拼接成一条完整的contig；本实施例中，待数据过滤完成之后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig，例如，在拼接过程中如读长是100的情况下分为两步：(1)将两条序列的尾部进行比对，然后寻找匹配序列。像这样的拼接需要最小10个碱基的重叠，并且重叠区域碱基的匹配率要不小于90％；(2)鉴于免疫组库捕获区域的长短不同，在某些情况下会存在端序列被测通的情况，即在第1部分尾部拼接剩下的序列中，尝试用头部将其继续进行拼接。如此，可得到最终的合并后的序列及合并的序列contig的长度分布图。又如，contig即为重叠群。需要进一步说明的是，高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，read是原始数据；有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig；多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold；一个contig被组成出来之后，鉴定发现contig编码蛋白质的基因，就叫singleton；多个contigs组装成scaffold之后，鉴定发现scaffold编码蛋白质的基因，叫unigene。
S163：对contig进行数据比对分析。例如，使用milaboratory开发的miTCR进行数据比对分析；由于发明研究对象是TCR，因此比对分析使用milaboratory开发的miTCR：http://mitcr.milaborator y.com/downloads/，该软件自动校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。当数据比对完成后，其自动统计CDR3克隆的表达和插入缺失的情况。又如，对contig进行比对分析具体包括：使用milaboratory开发的miTCR对T细胞受体进行自动校正，校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。
S164：根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
需要说明的是，TCR的CDR3由V、D、J三个基因编码，在淋巴细胞的成熟过程中，通过V、D、J基因的重排形成了各种重组序列片段，再加上DNA碱基的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms，SNP)、indel突变形成了T细胞的多样性。但是在某种疾病或者某种特殊的状态下，机体循环或者某个器官内出现某个或某些特异的相关抗原，刺激TCR基因发生针对性和选择性重排，就出现选择性的表达某一些家族的T细胞，即所谓的优势表达。出现某些TCR特异性的T细胞克隆性增殖的现象，破坏了T细胞的多样性。虽然在某个或者某些特异性抗原的持续刺激下，机体T细胞发生了克隆性增殖，但由于机体免疫系统的自稳性使得机体的免疫细胞总数总是维持在一个相对变化不大的水平，因此，在某一数量单元的T细胞中，一种T细胞亚家族的优势生长会导致其它T细胞亚家族的相对抑制生长。从分子数量上来看，这种T细胞的优势表达表现为其相应TCR数量上的相对增加，而其它T细胞亚家族的TCR就会相对减少。
例如，对所述测序数据的序列结构进行分析具体包括：根据比对分析得到的结果，得到比对得到V基因序列的最后位点，D基因的起始位点，D基因的终止位点及J基因的起始位点，通过位点信息找到V-D-J插入缺失的碱基并统计其长度分布。根据比对找到的CDR3区域，并统计CDR3序列的长度分布。本实施例中，根据比对分析得到的结果，不但可获得比对到V基因序列的最后位点，D基因的起始位点和终止位点，以及J基因的起始位点，而且还可通过位点信息来找到V-D-J间碱基的插入缺失情况并统计其长度分布，从而作其长度分布图。又如，根据比对信息找到CDR3区域，统计CDR3序列的长度分布情况并根据其长度分布进行作图。
例如，根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型，还包括：
1、免疫组库的构建，其具体包括：根据比对分析得到的结果，统计每一个克隆的表达情况，分别统计DNA序列，氨基酸序列，V-J组合三种不同分辨率情况下得到的各个样本的表达情况。例如，为了衡量样品的多样性，分别统计和计算疾病组和对照组的distinctclone数，辛普森系数及熵系数，三个系数分别针对DNA、氨基酸、V-J组合三种不同的分辨率。对于每一个样本中每个克隆的表达情况，按照DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的表达。筛选出各细胞亚群的高度克隆性扩增的DNA序列，氨基酸序列，V-J组合，其中，DNA序列的筛选标准为频率大于0.5％，氨基酸序列的筛选标准为频率大于0.5％，V-J组合的筛选标准为频率大于1％。在T细胞发育过程中，TCR的V、D、J基因片段发生重排，结果在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机插入不同数量的核苷酸，形成具有高度多样性的可变区CDR3，其在长度和氨基酸序列上存在较大差异，即CDR3序列决定了一个独特的TCR克隆型，通过免疫组库的建立，统计每一个克隆的表达情况，为后续的分析提供数据支持。
2、免疫组库的差异分析，得到膀胱癌组织T细胞图谱模型。例如，分别针对疾病组和对照组的DNA序列、氨基酸序列、V-J组合统计其多样性差异，得到膀胱癌组织T细胞图谱模型。又如，多样性差异主要包括：样本多样性差异和克隆表达差异两部分。其中，样本多样性差异旨在找出样品间整体克隆表达模式的差别，表达差异则旨在找出差异显著的克隆。样本多样性差异首先针对的是每个样本计算出的多样性系数，即Distinct(uniq)clone数，辛普森和香农熵。根据不同组间样本属性，针对的是DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率，统计计算差异显著性。而对于单克隆表达，根据之前设定的分组方案，在DNA序列、氨基酸序列和V-J组合三个层面进行分析，使用泊松分布等相应的检验方案计算出每一个差异对的P值，同时使用FDR和bonferroni对P值做校正。例如，将克隆扩增程度划分为≥0.5％，0.05～0.5％，0.005～0.05％，0.0005～0.005％和<0.0005％五个等级，定义克隆频率大于0.5％的Clones为高度扩增性克隆(highly expanded clones，HEC)，并从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的克隆扩增程度。每一个Clone的克隆性扩增程度的计算方法是：该Clone在测试样本中出现的次数/该样本的总Total goodsequences数。具体实施例中，根据比对分析得到的结果，获得CDR3氨基酸序列长度分布特征。
根据比对分析得到的结果，对疾病组和对照组T淋巴细胞的TCRβ链CDR3氨基酸序列长度分布进行统计，请参阅图3，其为CDR3氨基酸序列长度分布图，横轴线是CDR3氨基酸序列长度分布区间，竖轴线是不同长度的分布频率，R2表示高斯分布拟合值，其中cancer为对照组，control为对照组。由此发现疾病组中TCRβ链CDR3氨基酸序列的长度分布频率最大的5个为14nt，11nt，12nt，13nt和10nt，对照组中最大的5个为11nt，13nt，12nt，10nt和14nt。随后，一实施例中使用高斯分布拟合值(Gauss distribution fitting values,R2)评估TCRβ链CDR3氨基酸序列长度分布特征。高斯分布拟合值越接近于1，表示该分布越接近于正态分布特征。统计结果显示疾病组的高斯分布拟合值低于对照组(0.83vs 0.98)，表明对照组的CDR3氨基酸序列长度分布比疾病组更趋向于正态分布。
在DNA序列中，一实施例中发现疾病组的高度扩增性克隆数为32个，高克隆比率为46％；对照组的高度扩增性克隆数为14个，高克隆比率为19％，其中，将高度扩增性克隆(Highly expended clone,HEC)定义为某个CDR3序列的表达量超过了总的CDR3序列的0.5％；高克隆比率(HEC ratio)为所有高度扩增性克隆的CDR3序列数占总的CDR3序列数的比例。在氨基酸序列中，疾病组和对照组的高度扩增性克隆数分别为35和14个。无论在高度扩增性克隆数上，还是在高克隆比率上，疾病组都是显著高于对照组。然后一实施例中将克隆扩增程度划分为0～0.001％，0.001～0.01％，0.01～0.1％和0.1％～1四个等级进行比较，发现疾病组中DNA序列克隆频率分布在0.1％～1区间的克隆数量及频率明显高于对照组，而对于分布在低扩增性克隆区间(0～0.001％，0.001～0.01％和0.01～0.1％)的克隆，其在疾病组的数量及频率都低于对照组。该结果表明疾病组中的克隆的扩增性程度明显高于对照组。为了进一步比较疾病组和对照组TCR CDR3多样性，一实施例中使用了香农熵(Shannon entropy)，其在免疫组库领域是免疫多样性的度量，香农熵值越接近于1说明该个体的免疫多样性越好，越接近于0说明该个体免疫多样性越差。结果发现疾病组的香农熵为0.40，对照组的香农熵为0.59，表明疾病组的TCR CDR3组库多样性低于对照组。
一实施例中分析了这些高度扩增性克隆是否在疾病组和对照组之间独有/共有。对于DNA序列，在疾病组中共获得12516个独有DNA序列，其中5个为高度扩增性克隆；对照组中共获得25371个独有DNA序列，其中10个为高度扩增性克隆，请参阅表1：
表1独有高克隆DNA序列汇总(＞0.5％)
由此可见，疾病组5个为高度扩增性克隆的DNA序列和对照组10个为高度扩增性克隆的DNA序列有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
对于氨基酸序列，疾病组中共获得9424个独有氨基酸序列，其中7个为高度扩增性克隆；对照组中共获得了21020个独有氨基酸序列，其中10个为高度扩增性克隆，请参阅表2：
表2独有高克隆氨基酸序列汇总(＞0.5％)
由此可见，疾病组7个为高度扩增性克隆的氨基酸序列和对照组10个为高度扩增性克隆的氨基酸序列亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
然后，一实施例中发现在疾病组和对照组之间有680个共有DNA序列和701个共有氨基酸序列。显示绝大部分的DNA序列和氨基酸序列只在各自样本中被发现。进一步比较分析，请参阅表3，一实施例中发现27个共有DNA序列在疾病组呈高度扩增性克隆，而在对照组呈低度扩增性克隆；4个共有DNA序列在对照组呈高度扩增性克隆，而在癌样本呈低度扩增性克隆，表明疾病组中DNA序列高度扩增性克隆数显著高于对照组。
表3共有DNA序列中高克隆序列汇总(＞0.5％)
由此可见，上述31个共有DNA序列亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。其中，前27个共有DNA序列可成为疾病组图谱，后4个共有DNA序列可成为对照组图谱。进一步的，请参阅表4，一实施例中发现28个共有氨基酸序列在疾病组呈高度扩增性克隆，在对照组呈低度扩增性克隆；4个共有氨基酸序列在对照组呈高度扩增性克隆，而在疾病组呈低度扩增性克隆，表明疾病组中氨基酸序列高度扩增性克隆数显著高于对照组。
表4共有氨基酸序列中高克隆序列汇总(＞0.5％)
由此可见，上述32个共有氨基酸序列亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。经上述统计分析，令人惊奇的发现在DNA序列和氨基酸序列中没有一个高度扩增性克隆在疾病组和对照组间共有。由此可见。上述DNA序列和氨基酸序列皆有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。但是，在没有进一步数据支持的前提下，很难单独根据上述DNA序列和氨基酸序列直接判定是否发生膀胱癌。
为了鉴定是否存在与肿瘤疾病相关的TRBV、TRBD和TRBJ亚类，一实施例中比较了疾病组和对照组中TRBV、TRBD和TRBJ各亚类的表达水平。结果显示在对照组中有4个独有的TRBV基因亚类(TRBV12-1，TRBV5-7，TRBV6-7，TRBV6-8)，其表达频率都较低，但均未在疾病组中表达。由此可见，TRBV12-1、TRBV5-7、TRBV6-7和TRBV6-8亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
在疾病组中未发现独有TRBV基因亚类；在疾病组和对照组中共有的52个TRBV基因亚类中，除了TRBV2(14.316％vs 14.614％)和TRBV25-1(4.430％vs4.040％)表达水平相差不大(±10％)，其他的50个TRBV基因亚类都显示出明显差异。一实施例中通过绘制疾病组和对照组的前20个TRBV基因亚类表达长条图，可以发现疾病组和对照组的TRBV基因亚类百分比呈现明显差异，如TRBV24-1、TRBV24/OR9-2在疾病组中的表达频率均为15.745％，而TRBV24-1、TRBV24/OR9-2在对照组中的表达频率均为3.440％；TRBV30在疾病组中的表达频率为2.182％，在对照组中表达频率高达8.995％。由此可见，TRBV24-1、TRBV24/OR9-2、TRBV30亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
在2个TRBD基因亚类中，疾病组的TRBD1和TRBD2的表达频率分别为38.413％和61.587％，而在对照组中TRBD1和TRBD2的表达频率分别为53.756％和46.244％。结果发现疾病组TRBD2的表达频率大于TRBD1，相反在对照组的是TRBD1的表达频率大于TRBD2。表明疾病组和对照组的TRBD基因亚类表达频率存在明显差异。由此可见，TRBD1和TRBD2亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
在疾病组和对照组均未发现独有TRBJ基因亚类，在共有14个TRBJ基因亚类中，除了TRBJ2-2P(0.001％vs 0.001％)在疾病组和对照组中表达频率无差异，其他13个TRBJ基因亚类的表达频率均显示出明显差异。在疾病组中表达频率前5位的TRBJ基因亚类依次为：TRBJ2-5(33.828％)、TRBJ2-7(15.672％)、TRBJ1-2(12.913％)、TRBJ1-1(8.655％)、TRBJ2-2(7.972％)；对照组中表达频率前5位的TRBJ基因亚类依次为：TRBJ2-7(18.378％)、TRBJ1-1(18.194％)、TRBJ2-5(11.179％)、TRBJ1-2(10.203％)、TRBJ2-3(8.594％)。由此可见，TRBJ2-5、TRBJ2-7、TRBJ1-2、TRBJ1-1、TRBJ2-2和TRBJ2-3亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
虽然通过分析TRBV和TRBJ基因亚类的表达水平，可以筛选出疾病相关的TRBV和TRBJ基因，但V-J组合的使用频率差异更能挖掘出有价值的信息。接着一实施例中比较了疾病组和对照组V-J组合的使用频率，发现疾病组中有7个独有V-J组合,对照组中有132个独有V-J组合，两样本中有483个共有V-J组合。对于疾病组中的7个独有V-J组合,TRBV12-2TRBJ2-5、TRBV12-4TRBJ1-3、TRBV3-2TRBJ2-2、TRBV4-3TRBJ2-4、TRBV6-9TRBJ1-4、TRBV7-1TRBJ2-5、TRBV7-7TRBJ2-6都显示出极低的使用频率(<0.01％)。由此可见，疾病组中的7个独有V-J组合亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
对于对照组的132个独有V-J组合也都显示低使用频率(<1％)，其中使用频率最大的为TRBV24-1TRBJ1-6(0.105％)，由此可见，TRBV24-1TRBJ1-6亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
在483个共有V-J组合中，一实施例中发现有23个在疾病组显示高使用频率(>1％)，有13个V-J组合(TRBV24-1TRBJ2-5、TRBV15TRBJ2-5、TRBV19TRBJ2-2、TRBV2TRBJ2-3、TRBV24-1TRBJ2-1、TRBV2TRBJ1-5、TRBV24-1TRBJ1-2、TRBV15TRBJ1-2、TRBV19TRBJ2-7、TRBV10-3TRBJ2-7、TRBV15TRBJ1-4、TRBV25-1TRBJ1-2、TRBV25-1TRBJ2-7)在疾病组显示高使用频率，而在对照组显示低使用频率，有12个V-J组合(TRBV30TRBJ1-1、TRBV15TRBJ2-3、TRBV12-3TRBJ2-2、TRBV19TRBJ1-1、TRBV24-1TRBJ1-5、TRBV25-1TRBJ1-5、TRBV7-2TRBJ2-7、TRBV20-1TRBJ2-7、TRBV12-3TRBJ2-7、TRBV25-1TRBJ1-1、TRBV20-1TRBJ2-5、TRBV2TRBJ2-1)在对照组显示高使用频率，而在疾病组显示低使用频率。特别注意的是TRBV24-1TRBJ2-5在疾病组显示高使用频率达23.674％，在对照组显示低使用频率(0.759％)；TRBV30-TRBJ1-1在对照组显示高使用频率达4.905％，而在疾病组显示低使用频率(0.223％)。由此可见，所述13个V-J组合和/或所述12个V-J组合亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
在疾病组中表达频率前5位的V-J组合依次为：TRBV24-1TRBJ2-5(23.674％)、TRBV15TRBJ2-5(3.786％)、TRBV19TRBJ2-2(3.775％)、TRBV19TRBJ1-2(3.270％)、TRBV2TRBJ2-3(2.653％)；对照组中表达频率前5位的V-J组合依次为：TRBV30TRBJ1-1(4.905％)、TRBV2TRBJ2-7(3.208％)、TRBV2TRBJ1-1(2.852％)、TRBV15TRBJ2-3(2.691％)、TRBV15TRBJ2-7(2.142％)。由此可见，疾病组和/或对照组表达频率前5位的V-J组合亦有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型。
上述基因亚类及V-J组合在没有进一步数据支持的前提下，很难单独根据上述DNA序列和氨基酸序列直接判定是否发生膀胱癌，一实施例中通过设计各V区家族和J区家族引物，扩增出TCR的所有CDR3区，再结合第二代高通量测序技术和平台，分析膀胱癌组织和癌旁组织中T细胞TCRβ链CDR3区多样性，CDR3氨基酸序列长度分布特征，V区、D区、J区和V-J组合区基因使用频率分布，个体TOP 20V基因使用情况等；从海量数据中筛选膀胱癌组织和癌旁组织中高度克隆性扩增的DNA序列(频率大于0.5％)、氨基酸序列(频率大于0.5％)、V-J组合(频率大于1％)，及独有/共有DNA序列、氨基酸序列和V-J组合等，将来或许有可能成为膀胱癌免疫诊断、治疗或者预后监测的生物标志物。此外，根据香农熵分析膀胱癌组织与癌旁组织中的TCR多样性差异和克隆表达差异。揭示膀胱癌组织和癌旁组织中T淋巴细胞的免疫特性，阐明膀胱癌病理生理机制并寻找新的生物标志物、免疫治疗靶点，进一步研究应该更好地阐明TCR图谱在肿瘤免疫反应和肿瘤发生发展中的作用，以期更好地理解肿瘤的致病机理，并对其诊断、治疗、预防及预后监测提供新的思路。
上述膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，通过膀胱癌组织和癌旁组织免疫组库测序分析TCR数量的变化，能发现那些高克隆扩增TCR CDR3序列，可间接获知这些高克隆扩增T细胞亚家族的分布特点，从而有利于进一步研究膀胱癌发生发展机制。对这些信息进一步进行验证分析和研究将有助于揭开T淋巴细胞参与肿瘤免疫的机理，客观准确地评估膀胱癌免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制，进而为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据，从而在未来可能实现膀胱癌的预防、诊断及治疗。
本发明还提供一种膀胱癌组织T细胞图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。又如，所述膀胱癌组织T细胞图谱模型包括以上“有潜力成为膀胱癌组织T细胞图谱模型”中的至少一组。通过上述膀胱癌组织T细胞图谱模型，有利于通过膀胱癌组织T细胞图谱模型进一步研究膀胱癌发生发展机制。对这些信息进一步进行验证分析和研究将有助于揭开T淋巴细胞参与肿瘤免疫的机理，客观准确地评估膀胱癌免疫状态，进一步阐明膀胱癌的病因学及发病机制，进而为疾病预防、诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。
本发明还提供一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。
需要说明的是，现有的膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建系统，需要较为繁琐的生物实验过程以及数据分析过程，构建过程极为繁琐，对人员实验技能要求较高。并且，实验过程中的人为操作过程，效率较低且极容易出现人为误差，从而使得构建出的膀胱癌组织T细胞图谱模型准确性较差。为了解决上述问题，一实施例中，本发明还提供一种自动性较好的膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建系统，例如，所述构建系统包括样品获取模组、提取模组、扩增模组、测序模组和分析模组；样品获取模组、提取模组、扩增模组、测序模组和分析模组依次顺序连接。其中，样品获取模组用于获取疾病组与对照组的标本；提取模组用于提取各标本的全基因组DNA；所述扩增模组用于扩增出TCR的CDR区，分别得到疾病组文库和对照组文库；所述测序模组用于采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；所述分析模组用于对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
上述构建系统能够自动生成所述膀胱癌组织T细胞图谱模型，提高了构建效率，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力。同时，自动性能较好，还能够减少人为误差，以提高膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性。
一实施例中，提取模组包括第一控制单元，以及分别连接所述第一控制单元的接收单元、粉碎单元、离心预处理单元、蛋白酶添加单元、第一混合处理单元、第二混合处理单元、无水乙醇添加单元、第三混合处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心处理单元、Buffer AW1上样处理单元、第二离心处理单元、Buffer AW2上样处理单元、第三离心处理单元、吸附柱转移及处理单元、Buffer AE第一上样处理单元、第四离心处理单元、Buffer AE第二上样处理单元、第五离心处理单元及DNA收集处理单元。所述第一控制单元用于分别控制接收单元、粉碎单元、离心预处理单元、蛋白酶添加单元、第一混合处理单元、第二混合处理单元、无水乙醇添加单元、第三混合处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心处理单元、Buffer AW1上样处理单元、第二离心处理单元、Buffer AW2上样处理单元、第三离心处理单元、吸附柱转移及处理单元、Buffer AE第一上样处理单元、第四离心处理单元、Buffer AE第二上样处理单元、第五离心处理单元及DNA收集处理单元。接收单元、粉碎单元、离心预处理单元、蛋白酶添加单元、第一混合处理单元、第二混合处理单元、无水乙醇添加单元、第三混合处理单元、吸附柱上样处理单元、第一离心处理单元、Buffer AW1上样处理单元、第二离心处理单元、Buffer AW2上样处理单元、第三离心处理单元、吸附柱转移及处理单元、Buffer AE第一上样处理单元、第四离心处理单元、Buffer AE第二上样处理单元、第五离心处理单元及DNA收集处理单元依次顺序连接。其中，所述接收单元连接所述样品获取模组，所述DNA收集处理单元连接所述扩增模组。接收单元用于从样品获取模组中分别接收疾病组与对照组的标本；粉碎单元用于将各标本粉碎成碎片；离心预处理单元用于分别取25mg各标本碎片放入至1.5ml的离心管中，加入180μL buffer ATL；蛋白酶添加单元用于在每一离心管中加入2μL的蛋白酶K；第一混合处理单元用于将每一离心管在56℃的温度下进行涡旋混合均匀；Buffer AL添加单元用于向混合均匀的各离心管中加入200μL Buffer AL；第二混合处理单元用于将加入了Buffer AL后的各离心管涡旋混合均匀15s，并在56℃温度下孵育10min；无水乙醇添加单元用于向孵育后的各离心管中加入200μL无水乙醇；第三混合处理单元用于将加入了无水乙醇的各离心管涡旋混合均匀15s，得到混合液，吸附柱上样处理单元用于将所述混合液加入吸附柱中，待混合液上样完成之后将所述吸附柱放入收集管中；第一离心处理单元用于将各收集管≥8000rpm离心1min，Buffer AW1上样处理单元，用于将经过第一离心处理单元处理后的各收集管进行弃滤液操作并在弃滤液之后向各收集管中分别加入500μL Buffer AW1；第二离心处理单元用于将经过Buffer AW1上样处理单元处理后的各收集管≥8000rpm离心1min；Buffer AW2上样处理单元用于将经过第二离心处理单元处理后的各收集管进行弃滤液操作，并在弃滤液之后向各收集管中分别加入500μLBuffer AW2；第三离心处理单元用于将经过Buffer AW2上样处理单元处理后的各收集管14000rpm离心3min；吸附柱转移及处理单元用于将经过第三离心处理单元处理后的各收集管进行弃滤液操作，并在弃滤液之后把吸附柱转移到一个新的1.5mL收集管内；Buffer AE第一上样处理单元用于向新的1.5mL收集管内中加入30μL Buffer AE，并于室温静置1min，其中，加入的30μL Buffer AE位于膜中间；第四离心处理单元用于将经过Buffer AE第一上样处理单元处理后的各收集管14000rpm离心1min；Buffer AE第二上样处理单元用于将经过第四离心处理单元处理后的各收集管进行弃滤液操作，并在弃滤液之后向各收集管中加入30μL Buffer AE，并于室温静置1min，其中，加入的30μL Buffer AE位于膜中间；第五离心处理单元用于将经过Buffer AE第二上样处理单元处理后的各收集管14000rpm离心1min；DNA收集处理单元用于将经过第五离心处理单元处理后的各收集管进行弃滤液操作，并在弃滤液之后向各收集管中加TE缓冲液重悬并于2℃～8℃静止待用，即得到各标本的全基因组DNA。例如，TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，其为弱碱性，对DNA的碱基具有较好的保护性，DNA不易破坏其完整性或产生开环及断裂。需要说明的是，TE缓冲液的配置过程请参见现有技术。
上述提取模组，能够从样品获取模组中分别接收疾病组与对照组的标本，并从疾病组与对照组的标本中提取出各标本的全基因组DNA，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性，还能够使得膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建过程效率较高。
一实施例中，扩增模组包括第二控制单元，以及分别连接所述第二控制单元的取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元。所述第二控制单元分别用于控制取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元。所述取样单元、加样单元、扩增处理单元、扩增处理单元、回收单元、末端修复单元、第一纯化单元、接头连接单元、PCR富集单元及第二纯化单元依次顺序连接。其中，所述取样单元连接所述DNA收集处理单元，所述第二纯化单元连接所述测序模组。取样单元用于从DNA收集处理单元中获取各标本的全基因组DNA，并将各标本的全基因组DNA分别加入至PCR管中；加样单元用于向PCR管中加入引物、dNTPs、Taq酶、镁离子及缓冲液，需要说明的是，dNTPs、Taq酶、镁离子及缓冲液的添加量，请参见现有技术。本实施例中，所述引物为TRB V/J引物。扩增处理单元用于将经过加样单元处理后的PCR管进行多重PCR反应。回收单元用于电泳检测并回收100bp～190bp的多重PCR产物；末端修复单元用于向100bp～190bp的多重PCR产物中加入End Repair Mix进行末端修复反应，第一纯化单元用于向末端修复反应的产物中使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化操作；接头连接单元用于利用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接；PCR富集单元用于通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段；第二纯化单元用于使用QIAquick Gel Extraction kit对富集后的经过接头修饰的DNA片段进行纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。
上述扩增模组，能够从DNA收集处理单元中获取各标本的全基因组DNA，并将全基因组DNA自动PCR扩增、纯化成为疾病组文库和对照组文库，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性，还能够使得膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建过程效率较高。
一实施例中，构建系统还包括第一检测模组，所述第一检测模组用于检测全基因组DNA中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则由扩增模组执行其操作。又如，所述第一检测模组包括第一检测单元、第二检测单元及判定执行单元，其中，第一检测单元，用于采用荧光定量测定全基因组DNA中DNA含量；第二检测单元用于采用琼脂糖凝胶电泳检测全基因组DNA中的完整性；判定执行单元用于根据第一检测单元及第二检测单元的检测结果，判定是否合格，是则由扩增模组执行其操作。如此，通过第一检测模组对全基因组进行检测，能够进一步提高后续构建得到的膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性。又如，所述第一检测模组分别连接所述DNA收集处理单元及所述第二控制单元。
一实施例中，测序模组包括第三控制单元，以及分别连接所述第三控制单元的取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元。所述第三控制单元用于分别控制取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元。取样单元、稀释变性单元、FlowCell上样处理单元、桥式PCR扩增单元及测序单元依次顺序连接。其中，所述取样单元连接所述第二纯化单元，所述测序单元连接所述分析模组。取样单元用于从第二纯化单元分别获取疾病组文库和对照组文库；稀释变性单元用于稀释各文库并使各文库中的DNA变性；FlowCell上样处理单元用于按照预期上机数据量，稀释变性后的各文库中的DNA；并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；桥式PCR扩增单元用于在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂对杂交在FlowCell上的DNA完成桥式PCR扩增；测序单元用于将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。又如，所述测序单元还用于连接Illumina MiSeq高通量测序平台，所述测序单元用于将制备好的FlowCell上样至Illumina MiSeq高通量测序平台上并进行测序操作。
上述测序模组，能够从第二纯化单元分别获取疾病组文库和对照组文库，并完成测序，能够自动化操作，避免了传统中需要实验人员较高实验的技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高后续构建得到的膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性，还能够使得膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建过程效率较高。
一实施例中，所述构建方法还包括第二检测模组，所述第二检测模组用于分别对所述疾病组文库和所述对照组文库进行片段范围检测和浓度定量。所述测序模组用于根据所述第二检测模组得到的片段范围值和浓度定量值采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序。如此，能够使各文库在后续进行测序时被准确控制上机量，从而使得测序结果更为准确。又如，所述第二检测模组分别连接所述第二纯化单元及所述第三控制单元。
一实施例中，分析模组包括第四控制单元、以及分别连接所述第四控制单元的过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述第四控制单元用于分别控制过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述过滤单元连接所述测序单元。过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述第四控制单元用于分别控制过滤单元、拼接单元、比对分析单元及图谱构建处理单元，所述过滤单元连接所述测序单元依次顺序连接。过滤单元用于对测序结果数据进行过滤处理；拼接单元用于数据过滤完成之后，将Pair-end数据的两条序列拼接成一条完整的contig；比对分析单元用于对contig进行数据比对分析；图谱构建处理单元用于根据比对分析所得到的结果，统计出每一个克隆的表达情况，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
上述分析模组，能够对测序结果数据进行分析，构建出膀胱癌组织T细胞图谱模型，能够自动化操作，避免了传统中需要技人员较高分析处理技能的问题，同时也能够降低人为误差，能够提高构建得到的膀胱癌组织T细胞图谱模型的准确性，还能够使得膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建过程效率较高。
能够理解，在膀胱癌组织T细胞图谱模型构建之后，其中的图谱模型设计到的基因、蛋白等数量较多，用户阅读膀胱癌组织T细胞图谱模型极为不便。为了使膀胱癌组织T细胞图谱模型也能够便于被阅读，一实施例中，所述构建系统还包括展示投影模块，所述展示投影模块用于将膀胱癌组织T细胞图谱模型投影至幕布上。如此，幕布具有较大的尺寸，能够便于用户阅读和分析膀胱癌组织T细胞图谱模型。又如，所述投影模块连接所述图谱构建处理单元。
一实施例中，所述构建系统还包括数据转换模块和发送模块，所述数据转换模块用于将膀胱癌组织T细胞图谱模型转换成为数字信号，所述发送模块用于将数字信号发送给用户终端。如此，用户可以通过用户终端即时获取所述膀胱癌组织T细胞图谱模型，从而使得用户不需要在膀胱癌组织T细胞图谱模型构建中一直等待，还可以在膀胱癌组织T细胞图谱模型构建完成之后第一时间获取膀胱癌组织T细胞图谱模型，便捷性较好。又如，所述发送模块为无线发送模块和/或有线发送模块。又如，所述数据转换模块连接所述图谱构建处理单元。
一实施例中，所述构建系统还包括接收模块，所述接收模块用于接收操作指令，所述数据转换模块用于根据所述操作指令将膀胱癌组织T细胞图谱模型转换成为数字信号，并由所述发送模块将数字信号发送给用户终端。又如，所述操作指令由所述用户终端发出。如此，用户可以在想要获取膀胱癌组织T细胞图谱模型时，即可通过用户终端操作而获取图谱模型。又如，所述用户终端为电脑、手机、平板电脑、可穿戴智能手表等。
需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
设置疾病组与对照组，其中，疾病组取离体的膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取离体的膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用；
提取各标本的全基因组DNA；
扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库；
采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；
对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取各标本的全基因组DNA，具体包括：
(1)将各标本粉碎成碎片，分别取25mg各标本碎片放入至1.5ml的离心管中，加入180μLbuffer ATL；
(2)加入2μL的蛋白酶K，充分涡旋混合均匀，在56℃孵育直至各标本碎片溶解，在各标本碎片溶解的过程中不断涡旋使组织充分散开；
(3)加入200μL Buffer AL，涡旋混匀15s，56℃孵育10min直至溶解；
(4)加入200μL无水乙醇，涡旋混匀15s，得到混合液；
(5)将所述混合液加入吸附柱，然后将吸附柱放入收集管中，≥8000rpm离心1min，弃滤液；
(6)加入500μL Buffer AW1，≥8000rpm离心1min，弃滤液；
(7)加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min，弃滤液；
(8)把吸附柱放到一个新的1.5mL收集管内，加入30μL Buffer AE至膜中间，室温放置1min，14000rpm离心1min；使用30μL洗脱液Buffer AE重复此步骤；
(9)收集DNA并存放在2℃～8℃冰箱中待用，即得到各标本的全基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在提取各标本的全基因组DNA之后，以及在扩增出TCR的CDR3区之前，所述构建方法还包括：
检测全基因组DNA中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用荧光定量测定全基因组DNA中DNA含量。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳检测全基因组DNA中的完整性。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库具体包括：
取各标本的全基因组DNA；
加入引物；
进行多重PCR扩增；
进行电泳检测回收100bp～190bp的多重PCR产物；
进行末端修复反应，并对产物进行纯化；
配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接；
通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段；
纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库之后，以及在采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序之前，所述构建方法还包括：
分别对所述疾病组文库和所述对照组文库进行片段范围检测和浓度定量。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序，具体包括：
稀释各文库并使各文库中的DNA变性；
按照预期上机数据量，稀释；并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；
在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增；
将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。
9.一种膀胱癌组织T细胞图谱模型，其特征在于，由权利要求1至8中任一项所述的构建方法制备得到。
10.一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建系统，采用如权利要求1至8中任一项所述的构建方法实现。
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