CN109971832A - 一种检测基因突变的试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测试剂盒、方法及其用途,特别是涉及一种检测基因的突变的试剂盒、方法及其用途。所述试剂盒包括一对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组,以及由依RNA为模板合成DNA的逆转录酶与依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶组成的混合酶。本发明的方法能够同时检测全血样本中DNA和RNA中的突变序列,采用少量样本就能检测微量的突变型,极大满足目前临床样本检测尤其是液态活检需要。同时,通过调整反应体系,使检测灵敏度达到0.01%。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒、方法及其用途,特别是涉及一种检测基因的突变的试剂盒、方法及其用途。
背景技术
基因突变(gene mutation)是遗传物质的异常改变,一般是指染色体上一个位点内遗传物质的变化,即DNA分子长链中DNA碱基对的置换、增添或缺失等改变而引起基因结构的变化。基因突变是生物进化和物种群体遗传多样性的基础,同时,它也是人类多数遗传病、肿瘤和其他易感性疾病等的直接原因。基因突变的检测是对遗传病、肿瘤等进行临床基因诊断的重要手段,对疾病的早期发现和治疗具有重要意义。
基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。目前基因突变的检测方法尤其是适用于检测低浓度突变靶序列的方法主要有数字PCR(Digital PCR,dPCR)、下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)和扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)。数字PCR技术虽然具有敏感度高、精确度高、可绝对定量等优点,但技术有待普及,试剂盒研发不易,敏感度或有瓶颈,目前仅适用于转化性研究。NGS技术也有不足之处:价格昂贵;读长大约为30-250bp,比Sanger测序短,对序列拼接造成了负担;检测结果仍需要金标准“Sanger测序”来验证;对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确度不够;仍然需要对待测模板进行微乳液PCR扩增,操作繁琐,限制了测序速度。技术专家提出NGS平台能否真正在临床落地,需要工业界,技术人员与临床医生的通力合作,才能将该技术真正受益患者。ARMS技术是目前法规支持的基因检测的主流方法,ARMS技术普及度高,适合医院广泛开展,简便快速,特异性好,是目前医疗市场主流的基因突变检测产品,但是传统的ARMS技术检测灵敏度偏低(1%),在组织里面的敏感性还能够满足临床的需要,但是在血液里面的检测相对而言偏低,无法满足突变靶序列丰度低的样本检测,尤其是日益发展的液态活检技术;另外,传统ARMS技术只能单一检测样本DNA或RNA中的基因突变,尤其对于血液样本只能检测血浆/血清中的游离DNA或RNA,而不能更好地检测血液中循环肿瘤细胞(CTC)核酸、肿瘤细胞来源外泌体(exosome)核酸等类型样本中的突变基因。
发明内容
为了解决上述技术问题的至少一个,本发明的第一方面提供一种检测来自人的生物样本中基因的突变的试剂盒,其特征在于,包括一对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组,以及由依RNA为模板合成DNA的逆转录酶与依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶组成的混合酶。
其中,所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物,所述第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物。
优选地,所述第一引物组与所述第二引物组扩增所述基因的同一外显子。更优选地,所述第一上游引物和所述第二上游引物相同,所述第一下游引物和所述第二下游引物相同。
优选地,所述转录物为mRNA,所述逆转录产物为cDNA。
在本发明的一些优选实施方案中,所述第一上游引物和所述第一下游引物中至少有一个是ARMS引物,所述第二上游引物和所述第二下游引物中至少有一个是ARMS引物。
优选地,所述第一上游引物和所述第一下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第一上游引物是ARMS引物,所述第一下游引物是通用引物。
优选地,所述第二上游引物和所述第二下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第二上游引物是ARMS引物,所述第二下游引物是通用引物。
优选地,所述试剂盒还包括探针,所述探针序列能够与扩增产物结合,具体地,所述探针能够与扩增序列双链的任一链互补。
进一步地,所述探针可带有可检测信号标记。优选地,所述标记为放射性同位素、荧光素、生物素、酶(例如碱性磷酸酶)、酶底物、配体和抗体。更优选地,所述标记为荧光基团和淬灭基团,所述荧光基团和淬灭基团可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、BHQ、TAMRA、MGB。
更优选地,所述试剂盒还包括阻断DNA序列。
在本发明的中另一些优选实施方案中,所述试剂盒还包括探针,所述探针能够与突变型基因的扩增产物结合。具体地,所述探针是根据突变位点前后的序列设计的,其可以与包含突变位点的序列结合。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂盒还包括dNTP、缓冲液。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂盒还包括内控引物。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂盒还包括核酸提取试剂。
优选地,所述核酸提取试剂包括DNA提取试剂和RNA提取试剂。更优选地,所述核酸提取试剂可以同时提取DNA和RNA(DNA and RNA,DAR)。
本发明的第二方面提供一种用于检测基因突变的反应体系,在该体系中,同时包含DNA和RNA,还同时包含依RNA为模板合成DNA的逆转录酶和依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方案中,还同时包含一对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,以及一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组。其中,所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物,所述第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物。
优选地,所述第一引物组与所述第二引物组扩增所述基因的同一外显子。更优选地,所述第一上游引物和所述第二上游引物相同,所述第一下游引物和所述第二下游引物相同。
在本发明的一些优选实施方案中,所述第一上游引物和所述第一下游引物中至少有一个是ARMS引物,所述第二上游引物和所述第二下游引物中至少有一个是ARMS引物。
优选地,所述第一上游引物和所述第一下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第一上游引物是ARMS引物,所述第一下游引物是通用引物。
优选地,所述第二上游引物和所述第二下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第二上游引物是ARMS引物,所述第二下游引物是通用引物。
优选地,所述反应体系还包括探针,所述探针序列能够与扩增产物结合,具体地,所述探针能够与扩增序列双链的任一链互补。
进一步地,所述探针可带有可检测信号标记。优选地,所述标记为放射性同位素、荧光素、生物素、酶(例如碱性磷酸酶)、酶底物、配体和抗体。更优选地,所述标记为荧光基团和淬灭基团,所述荧光基团和淬灭基团可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、BHQ、TAMRA、MGB。
更优选地,所述试剂盒还包括阻断DNA序列。
在本发明的中另一些优选实施方案中,所述反应体系还包括探针,所述探针能够与突变型基因的扩增产物结合。具体地,所述探针是根据突变位点前后的序列设计的,其可以与包含突变位点的序列结合。
在本发明的一些实施方案中,所述反应体系还包括dNTP、缓冲液。
在本发明的一些实施方案中,所述反应体系还包括内控引物。
本发明的第三方面提供一种检测人生物样本中基因的突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取或获取所述生物样本中的核酸,
(2)对步骤(1)获得的核酸进行检测,
其中,所述生物样本是全血样本。
在本发明的一些实施方案中,所述全血样本中包括红细胞、血小板、外泌体。在本发明的另一些实施方案中,所述全血样本中包括红细胞、白细胞、血小板、外泌体、循环正常DNA(circulating normal DNA,cnDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)。在本发明的又一些实施方案中,所述全血样本不包括白细胞。
在本发明的一些优选实施方案中,所述核酸为DNA或RNA。在本发明的一些更优选实施方案中,所述核酸为DAR。
在本发明的一些实施方案中,所述基因选自EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS和PD-L1中的至少1种。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因为1种。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因EGFR,所述突变有29种,分别位于外显子18、外显子19、外显子20或外显子21上。在本发明的一些优选实施方案中,所述突变位于外显子20上。在本发明的一些更优选实施方案中,所述突变为T790M。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因是ALK,所述突变有13种,位于外显子20上。在本发明的一些优选实施方案中,所述突变为融合突变。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因是ROS1,所述突变有15种,分别位于外显子32、外显子34、外显子35和外显子36上。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因是BRAF,所述突变位于外显子15上。在本发明的一些更优选实施方案中,所述突变为V600E。
在本发明的一些优选实施方案中,所述基因是KRAS,所述突变有7种,分别位于密码子12、密码子13上。
在本发明的另一些实施方案中,所述基因为5种。在本发明的一些更优选实施方案中,所述基因为EGFR、ALK、ROS1、BRAF和KRAS,
在本发明的又一些实施方案中,所述基因为6种,即为EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS和PD-L1。
在本发明的一些实施方案中,所述全血样本来自肿瘤患者。在本发明的一些优选实施方案中,所述肿瘤为浸润性肿瘤。在本发明的一些优选实施方案中,所述肿瘤包括肺癌、甲状腺结节、黑色素瘤、结直肠癌。在本发明的一些更优选实施方案中,所述肺癌为非小细胞肺癌。
在本发明的一些实施方案中,所述步骤(2)是利用定量PCR(qPCR)进行的。在本发明的一些优选实施方案中,是利用荧光定量PCR进行的。
在本发明的另一些实施方案中,所述步骤(2)是利用测序方法进行的。在本发明的一些优选实施方案中,是利用二代测序或三代测序方法进行的。
本发明的第四方面提供一种检测生物样本中基因的突变的方法,包括以下步骤:
(1)提取或获取所述生物样本中的总核酸,
(2)在同一个反应体系中对步骤(1)获得的总核酸进行检测,
其中,所述总核酸是指DAR。
在本发明的一些实施方案中,所述生物样本为血浆。
在本发明的一些实施方案中,所述生物样本胸腹水。
在本发明的一些实施方案中,所述生物样本为组织。在本发明的一些优选实施方案中,所述组织为新鲜组织或甲醛固定石蜡包埋组织。在本发明的一些实施方案中,所述组织为肿瘤组织。在本发明的一些优选实施方案中,所述肿瘤为浸润性肿瘤。在本发明的一些优选实施方案中,所述肿瘤包括肺癌、甲状腺结节、黑色素瘤、结直肠癌。在本发明的一些更优选实施方案中,所述肺癌为非小细胞肺癌。
在本发明的一些实施方案中,所述生物样本为全血。
在本发明的一些实施方案中,所述全血样本中包括红细胞、血小板、外泌体。在本发明的另一些实施方案中,所述全血样本中包括红细胞、白细胞、血小板、外泌体、循环正常DNA(circulating normal DNA,cnDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)。在本发明的又一些实施方案中,所述全血样本不包括白细胞。
在本发明的一些实施方案中,所述同一体系中还同时包含依RNA为模板合成DNA的逆转录酶和依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶。
在本发明的另一些实施方案中,步骤(2)中所述同一反应体系中还同时包含对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,以及一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组。其中,所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物,所述第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物。
优选地,所述第一引物组与所述第二引物组扩增所述基因的同一外显子。更优选地,所述第一上游引物和所述第二上游引物相同,所述第一下游引物和所述第二下游引物相同。
在本发明的一些优选实施方案中,所述第一上游引物和所述第一下游引物中至少有一个是ARMS引物,所述第二上游引物和所述第二下游引物中至少有一个是ARMS引物。
优选地,所述第一上游引物和所述第一下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第一上游引物是ARMS引物,所述第一下游引物是通用引物。
优选地,所述第二上游引物和所述第二下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第二上游引物是ARMS引物,所述第二下游引物是通用引物。
优选地,所述同一反应体系还包括探针,所述探针序列能够与扩增产物结合,具体地,所述探针能够与扩增序列双链的任一链互补。
进一步地,所述探针可带有可检测信号标记。优选地,所述标记为放射性同位素、荧光素、生物素、酶(例如碱性磷酸酶)、酶底物、配体和抗体。更优选地,所述标记为荧光基团和淬灭基团,所述荧光基团和淬灭基团可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、BHQ、TAMRA、MGB。
更优选地,所述试剂盒还包括阻断DNA序列。
在本发明的中另一些优选实施方案中,所述同一反应体系还包括探针,所述探针能够与突变型基因的扩增产物结合。具体地,所述探针是根据突变位点前后的序列设计的,其可以与包含突变位点的序列结合。
在本发明的一些实施方案中,所述同一反应体系还包括dNTP、缓冲液。
在本发明的一些实施方案中,所述同一反应体系还包括内控引物。
在本发明的一些实施方案中,所述步骤(2)是利用定量PCR(qPCR)进行的。在本发明的一些优选实施方案中,是利用荧光定量PCR进行的。
在本发明的另一些实施方案中,所述步骤(2)是利用测序方法进行的。在本发明的一些优选实施方案中,是利用二代测序或三代测序方法进行的。
本发明的第五方面提供本发明第一方面所述的试剂盒或第二方面所述的反应体系在筛选用于治疗具有基因突变的患者的靶向药物中的用途。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为EGFR,如果EGFR被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括选自吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、埃克替尼、奥希替尼中的至少一种。在本发明的一些优选实施方案中,如果EGFR被检测到具有T790M突变,则筛选出的靶向药物包括奥希替尼。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为ALK,如果ALK被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括选自艾乐替尼、克唑替尼、色瑞替尼、Lorlatinib、Brigatinib中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为ROS1,如果ROS1被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括选自克唑替尼、色瑞替尼、Cabozantinib、Lorlatinib、DS-6051b中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为BRAF,如果BRAF被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括选自达拉非尼、曲美替尼、维莫非尼中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为KRAS,如果KRAS被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括司美替尼。
在本发明的一些优选实施方案中,目标基因为PD-L1,如果PD-L1被检测到具有突变,则筛选出的靶向药物包括选自派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、Durvalumab中的至少一种。
附图说明
图1为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性血浆DNA结果。
图2为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性血浆DNA/RNA结果。
图3为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性全血DNA结果。
图4为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性全血浆DNA/RNA结果。
图5为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性血浆DNA结果。
图6为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性血浆DNA/RNA结果。
图7为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性全血DNA结果。
图8为实施例1中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性全血DNA/RNA结果。
图9为实施例2中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性FFPE组织DNA结果。
图10为实施例2中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阳性FFPE组织DNA/RNA结果。
图11为实施例2中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性FFPE组织DNA结果。
图12为实施例2中采用CODAR-PCR和普通ARMS检测阴性FFPE组织DNA/RNA结果。
具体实施方式
本发明建立一种高灵敏度高特异性且检测样本类型丰富的基因突变检测方法,即DNA和RNA共扩增技术(Combination of DNA and RNA PCR,CODAR-PCR),其不仅可提高样品的突变检出率还不影响野生型样品和其他类型突变样品的检测和检出,尤其适用于液态活检高野生背景下低含量突变基因的检测。
CODAR-PCR
(1)样本处理:样本类型包括组织、全血、胸腹水,样本采用磁珠法提取试剂盒提取总核酸,即DNA、RNA共提取,全血、胸腹水等液态活检样本核酸包括CTC及肿瘤来源外泌体(exosome)中的总核酸。
(2)PCR扩增子:根据检测位点信息,确定大小合适的扩增子,设置的扩增子完全位于一个外显子内,如果不能设置在同一个外显子内,需要同时在DNA和RNA上设计扩增子,且共用同一条探针,大小控制在100bp碱基以内,最佳大小是70bp碱基左右。
(3)ARMS引物:正向特异性引物,其长度为15-30个碱基,3'末端第一位碱基为突变位置,3'末端第2-3位碱基为错配碱基,其余碱基与待测序列互补。反向通用引物,其长度为15-40,和待测序列的另一条链互补。正向特异性引物与反向通用引物间Tm值差异不超过5℃。
(4)荧光探针:荧光探针类型不限,可以为直链探针或茎环探针等,探针的荧光基团和淬灭基团类型不限,可选用FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、BHQ、TAMRA、MGB等。
(5)阻断DNA序列(blocker):长度为15-40个碱基,3'末端进行-PHO修饰,序列与野生型模板完全互补,且与blocker互补的模板区域包含待测突变位点。blocker的Tm值比引物Tm值高4-7℃,比探针Tm值低5-10℃。在合适的退火温度下,blocker优先与野生型模板结合从而阻断引物与野生模板的结合,而特异性引物可以与突变靶序列结合,从而提高PCR反应特异性。
(6)酶。高效率RT酶及DNA聚合酶。
本发明的有益效果
采用本发明的CODAR-PCR技术,能够同时检测DNA和RNA中的突变序列,丰富了检测样本类型,尤其是采用少量样本就能检测微量的突变型,极大满足目前临床样本检测尤其是液态活检需要。结合样本提取、扩增子选择、特异性引物、blocker、高效率酶系,提高了突变型与野生型之间的区分能力,同时通过调整反应体系,使检测灵敏度达到0.01%(10000拷贝野生型中能检测出1个拷贝的突变型),能耐受1000000拷贝的野生型,而不出现非特异性扩增。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包括在权利要求书中。
样本例
1、样本准备
选择晚期非小细胞肺癌患者全血样本,EGFR基因T790M突变型和野生型各一份,血液处理后分别提取血浆DNA和总核酸(DNA/RNA共提取),全血DNA和总核酸(DNA/RNA共提取),以提取后核酸原液检测。详细信息如下
2、扩增子选择
采用本发明选择扩增子,根据cosmic数据查询的EGFR基因T790M突变型序列,在21外显子内选择扩增子72个碱基。
CCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACA(SEQ ID NO.1)
3、引物、探针和blocker设计
采用本发明设计引物、blocker和探针
突变上游引物:CCACCGTGCAGCTCATAAT(SEQ ID NO.2)
突变下游引物:TGTCTTTGTTTCCCGGAC(SEQ ID NO.3)
突变探针:FAM-GCTCATGCCCTTCGG-MGB(SEQ ID NO.4)
Blocker:CACCGTGCAGCTCATCACG-PHO(SEQ ID NO.5)
内控上游引物:AAATCCTGCATGGCGC(SEQ ID NO.6)
内控下游引物:GCCACTGGATGCTCTCCA(SEQ ID NO.7)
内控探针:VIC-AACAACCCTGCCCTGTG-MGB(SEQ ID NO.8)
4、酶
选择含逆转录酶和DNA聚合酶活性的混合酶系
5、荧光PCR扩增,其体系如下:
组分 | 加入量(μL) |
突变上游引物(100μM) | 0.5 |
突变下游引物(100μM) | 0.5 |
突变探针(100μM) | 0.5 |
内控上游引物(100μM) | 0.2 |
内控下游引物(100μM) | 0.2 |
内控探针(100μM) | 0.2 |
Blocker(100μM) | 1.0 |
混合酶系 | 1.25 |
Buffer | 12.5 |
模板 | 5 |
水 | 3.15 |
共 | 25 |
6、PCR反应程序:
PCR反应在ABI 7500PCR仪上进行
第一阶段:50℃,10分钟
第二阶段:95℃,1分钟
第三阶段:95℃,15秒;60℃,30秒收集荧光信号,50个循环
对比例
1、采用普通ARMS设计引物、探针
突变上游引物:CCACCGTGCAGCTCATCAT(SEQ ID NO.9)
突变下游引物:CCGTATCTCCCTTCCCTGATTAC(SEQ ID NO.10)
2、荧光PCR体系如下
组分 | 加入量(μL) |
突变上游引物(100μM) | 0.5 |
突变下游引物(100μM) | 0.5 |
突变探针(100μM) | 0.5 |
内控上游引物(100μM) | 0.2 |
内控下游引物(100μM) | 0.2 |
内控探针(100μM) | 0.2 |
混合酶系 | 1.25 |
Buffer | 12.5 |
模板 | 5 |
水 | 4.15 |
共 | 25 |
其它条件与操作等,都和本实施例中样本例相同
结果的判定方法为:
(1)CODAR-PCR技术与普通ARMS技术对比:对阳性样本,突变Ct值越小,表明其扩增效率越高,检测灵敏度越高;对阴性样本,突变Ct越大,表明特异性越好。
(2)针对CODAR-PCR技术检测样本及核酸类型对比:对阳性样本不同提取类型核酸(DNA,DNA和RNA),突变Ct值越小,表明其扩增效率越高,检测灵敏度越高;对阴性样本不同提取类型核酸(DNA,DNA和RNA),突变Ct越大,表明特异性越好。
结果如下:
(1)使用对比例中的普通ARMS和CODAR-PCR对晚期非小细胞肺癌患者外周血样本进行检测,由图1、2、3、4可见,CODAR-PCR技术扩增效率比普通ARMS技术更优,使用普通ARMS技术阳性血浆(DNA、DNA/RNA)、阳性全血(DNA、DNA和RNA)突变Ct值分别为42.965、42.274、38.970和36.304,而使用CODAR-PCR技术突变Ct值分别仅为39.301、37.498、37.301和35.476。由图5、6、7、8可见,CODAR-PCR技术特异性比普通ARMS技术更优,使用普通ARMS技术阴性血浆(DNA、DNA/RNA)、阴性全血(DNA、DNA和RNA)突变Ct值分别为43.917、40.397、39.593和37.630,而使用CODAR-PCR技术突变基因都无扩增信号,即无Ct值。
(2)针对CODAR-PCR技术检测阳性血液样本,由图1、2、3、4可知,对于同一种样本类型采用核酸共提取检测比单纯采用DNA检测灵敏度更高,即使用DNA检测突变Ct值为39.704和37.301,而DNA/RNA共检测突变Ct值为37.498和35.476。此外,无论是单纯DNA检测还是DNA/RNA共检测,全血样本检测的灵敏度都高于血浆,即血浆DNA和DNA/RNA检测突变Ct值分别为39.704和37.498,而全血DNA和DNA/RNA检测突变Ct值分别为37.301和35.476。
针对CODAR-PCR技术检测阴性血液样本,由图5、6、7、8可知,对于同一种样本类型采用核酸共提取检测和单纯采用DNA检测特异性无差异,即使用DNA和DNA/RNA共检测突变均无Ct值。此外,无论是单纯DNA检测还是DNA/RNA共检测,全血样本检测的特异性都与血浆检测无差异,即血浆DNA、DNA/RNA和全血DNA、DNA/RNA检测突变均无Ct值。
实施例2:CODAR-PCR技术用于BRAF基因V600E突变检测
样本例
1、样本准备
选择黑色素瘤患者甲醛固定石蜡包埋样本(FFPE样本),BRAF基因V600E突变型和野生型各一份,FFPE组织分别提取DNA和总核酸(DNA/RNA共提取)(DNA/RNA共提取)。
2、扩增子选择
采用本发明选择扩增子,根据cosmic数据查询的EGFR基因T790M突变型序列,在21外显子内选择扩增子85个碱基。
GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGG(SEQ ID NO.11)
3.引物、探针和blocker设计
采用本发明设计引物、blocker和探针
突变上游引物:GGTGATTTTGGTCTAGCTACTGA(SEQ ID NO.12)
突变下游引物:CCATCCACAAAATGGATCCAGAC(SEQ ID NO.13)
突变探针:FAM-ATGGAGTGGGTCCCATCA-MGB(SEQ ID NO.14)
Blocker:GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAA-PHO(SEQ ID NO.15)
内控上游引物:GTGGAATATCAAACAAATGATTAAG(SEQ ID NO.16)
内控下游引物:ATTGATGGTGGATTATGCTCC(SEQ ID NO.17)
内控探针:VIC-ACACAGGAACATATAGAGGC-MGB(SEQ ID NO.18)
4、酶
选择含逆转录酶和DNA聚合酶活性的混合酶系
5、荧光PCR扩增,其体系如下:
组分 | 加入量(μL) |
突变上游引物(100μM) | 0.75 |
突变下游引物(100μM) | 0.75 |
突变探针(100μM) | 0.5 |
内控上游引物(100μM) | 0.25 |
内控下游引物(100μM) | 0.25 |
内控探针(100μM) | 0.25 |
Blocker(100μM) | 1.0 |
混合酶系 | 1.5 |
Buffer | 12.5 |
模板 | 5 |
水 | 2.25 |
共 | 25 |
6、PCR反应程序:
PCR反应在ABI 7500PCR仪上进行
第一阶段:50℃,15分钟
第二阶段:95℃,10分钟
第三阶段:95℃,10秒;60℃,34秒收集荧光信号,45个循环
对比例
1、采用普通ARMS设计引物、探针
突变上游引物:GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA(SEQ ID NO.19)
突变下游引物:CTTACCATCCACAAAATGGATCCAG(SEQ ID NO.20)
2、荧光PCR体系如下
组分 | 加入量(μL) |
突变上游引物(100μM) | 0.75 |
突变下游引物(100μM) | 0.75 |
突变探针(100μM) | 0.5 |
内控上游引物(100μM) | 0.25 |
内控下游引物(100μM) | 0.25 |
内控探针(100μM) | 0.25 |
混合酶系 | 1.5 |
Buffer | 12.5 |
模板 | 5 |
水 | 3.25 |
共 | 25 |
其它条件与操作等,都和本实施例中样本例相同
结果的判定方法为:
(1)CODAR-PCR技术与普通ARMS技术对比:对阳性样本,突变Ct值越小,表明其扩增效率越高,检测灵敏度越高;对阴性样本,突变Ct越大,表明特异性越好。
(2)针对CODAR-PCR技术检测样本及核酸类型对比:对阳性样本不同提取类型核酸(DNA,DNA和RNA),突变Ct值越小,表明其扩增效率越高,检测灵敏度越高;对阴性样本不同提取类型核酸(DNA,DNA和RNA),突变Ct越大,表明特异性越好。
结果如下:
(1)使用对比例中的普通ARMS和CODAR-PCR对黑色素瘤FFPE样本进行检测,由图9、10可见,CODAR-PCR技术扩增效率比普通ARMS技术更优,使用普通ARMS技术阳性样本(DNA、DNA和RNA)突变Ct值分别为37.189和34.976,而使用CODAR-PCR技术突变Ct值分别仅为34.516和32.908。由图11、12可见,CODAR-PCR技术特异性比普通ARMS技术更好,使用普通ARMS技术阴性样本(DNA、DNA和RNA)突变Ct值分别为37.909和37.005,而使用CODAR-PCR技术突变无Ct值。
(2)针对CODAR-PCR技术检测阳性样本,由图9、10可知,对于同一种样本类型采用核酸共提取(DNA/RNA)检测比单纯采用DNA检测灵敏度更高,即使用DNA检测突变Ct值为34.516,而DNA/RNA共检测突变Ct值为32.908;针对CODAR-PCR技术检测阴性样本,由图11、12可知,对于同一种样本类型采用核酸共提取(DNA/RNA)检测和单纯采用DNA检测特异性无差异,即使用DNA和DNA/RNA共检测突变均无Ct值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江数问生物技术有限公司
<120> 一种检测基因突变的试剂盒、方法及其用途
<130> 1012-SWP-2018-003.CN
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<151> 2018-09-28
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaccgtgca gctcatcatg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac tatgtccggg 60
aacacaaaga ca 72
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccgtgca gctcataat 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtctttgtt tcccggac 18
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctcatgccc ttcgg 15
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgtgcag ctcatcacg 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcctgca tggcgc 16
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccactggat gctctcca 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacaaccctg ccctgtg 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaccgtgca gctcatcat 19
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgtatctcc cttccctgat tac 23
<210> 11
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtgattttg gtctagctac agagaaatct cgatggagtg ggtcccatca gtttgaacag 60
ttgtctggat ccattttgtg gatgg 85
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtgattttg gtctagctac tga 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccatccacaa aatggatcca gac 23
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggagtggg tcccatca 18
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtgattttg gtctagctac agtgaaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggaatatc aaacaaatga ttaag 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attgatggtg gattatgctc c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
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<400> 18
acacaggaac atatagaggc 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtgattttg gtctagctac aga 23
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttaccatcc acaaaatgga tccag 25
Claims (10)
1.一种用于检测来自人的生物样本中基因突变的试剂盒,其特征在于,包括一对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组,以及由依RNA为模板合成DNA的逆转录酶与依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶组成的混合酶,
其中,所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物,所述第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物,
优选地,所述第一引物组与所述第二引物组扩增所述基因的同一外显子,更优选地,所述第一上游引物和所述第二上游引物相同,所述第一下游引物和所述第二下游引物相同,
优选地,所述转录物为mRNA,所述逆转录产物为cDNA。
2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述第一上游引物和所述第一下游引物中至少有一个是ARMS引物,所述第二上游引物和所述第二下游引物中至少有一个是ARMS引物,
优选地,所述第一上游引物和所述第一下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第一上游引物是ARMS引物,所述第一下游引物是通用引物,
优选地,所述第二上游引物和所述第二下游引物中一个是ARMS引物,另一个是通用引物,更优选地,所述第二上游引物是ARMS引物,所述第二下游引物是通用引物,
优选地,所述试剂盒还包括探针,所述探针序列能够与扩增产物结合,更优选地,所述试剂盒还包括阻断DNA序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括探针,所述探针能够与突变型基因的扩增产物结合。
4.根据权利要求1-3所述的试剂盒,其特征在于,还包括dNTP、缓冲液,
优选地,还包括内控引物,
优选地,还包括核酸提取试剂,更优选地,所述核酸提取试剂包括DNA提取试剂和RNA提取试剂,更优选地,所述核酸提取试剂可以同时提取DNA和RNA。
5.一种用于检测来自人的生物样本中基因突变的反应体系,其特征在于,所述反应体系中同时包含DNA和RNA,还同时包含依RNA为模板合成DNA的逆转录酶和依DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶,
优选地,所述反应体系包含一对能够扩增所述基因的DNA序列的第一引物组,以及一对能够扩增所述基因转录物的逆转录产物序列的第二引物组。
6.一种检测人生物样本中基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取或获取所述生物样本中的核酸,
(2)对步骤(1)获得的核酸进行检测,
其中,所述生物样本是全血样本,优选地,所述全血样本中包括红细胞、血小板、外泌体,更优选地,所述全血样本不包括白细胞,
优选地,所述核酸为DNA和/或RNA。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述基因为基因,优选地,所述基因选自EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS和PD-L1中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述生物样本来自肿瘤患者,更优选地,所述肿瘤为浸润性肿瘤,更优选地,所述肿瘤包括肺癌、甲状腺结节、黑色素瘤、结直肠癌,最优选地,所述肺癌为非小细胞肺癌。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法,其特征在于,
任选地,所述步骤(2)是利用定量PCR进行的,优选地,是利用荧光定量PCR进行的,
任选地,所述步骤(2)是利用测序方法进行的,优选地,是利用二代测序或三代测序方法进行的。
10.一种检测生物样本中基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取或获取所述生物样本中的总核酸,
(2)在同一个反应体系中对步骤(1)获得的总核酸进行检测,
其中,所述总核酸为DNA和RNA,
优选地,所述生物样本为血浆或全血,
优选地,所述生物样本为组织,更优选地,所述组织为新鲜组织或甲醛固定石蜡包埋组织,
优选地,所述生物样本为胸腹水。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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