CN115927646B - 一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用。本发明利用ARMS+Sequence Specific High‑BLocker（SSHB），结合特定的反应程序的方法，检测孕妇(RhD基因纯合缺失型)外周血胎儿cffDNA基因分型。本发明中利用探针熔解曲线的方法开发出的RhD基因分型检测体系只需要1ng DNA核酸样本、1管qPCR就可以检测新生儿、成人（包含已孕夫妇）的RhD基因分型，可以为血清学检测结果为Rh阴性的孕妇进行初筛，确定是否可以做孕血胎儿无创RhD基因分型检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
Rh血型系统是临床意义最大、最复杂的血型系统之一。Rh血型是红细胞的一个主要抗原系统，由RhD和RhCE基因共同表达；RhD基因编码D抗原，而RHCE基因编码Cc、Ee 抗原。当红细胞上存在D抗原时，即Rh阳性Rh（+）；当红细胞上缺乏D抗原时，即Rh阴性Rh（-）。当Rh阴性女性怀有Rh阳性血型胎儿时可发生母胎血型不合导致的新生儿溶血病。母胎Rh血型不合所致胎儿溶血是由于Rh阴性母体产生了针对Rh阳性胎儿血型抗原的特异性抗体，通过胎盘进入胎儿血循环，从而引起胎儿红细胞破坏，发生胎儿溶血性贫血，重度贫血可引起胎儿贫血、缺氧、心衰、水肿，甚至死胎、新生儿死亡等严重后果。其轻重程度和母亲体内RH抗体量、胎儿红细胞被致敏程度以及胎儿的代偿能力等因素有关。注射抗-D免疫球蛋白是目前预防母体致敏的主要方法。抗D免疫球蛋白可以破坏进入母体血液的Rh-(D) 抗原，抑制母体血液产生抗Rh-(D) 抗体。一般是在孕期28周和婴儿出生后72小时内，肌注抗Rh(D)免疫球蛋白，能阻止胎儿RhD阳性红细胞对母体的致敏作用，预防新生儿溶血症。
由于抗-D免疫球蛋白为人血提取物，较为稀缺，仅建议对有必要使用的孕妇进行注射（即RhD阴性血型母亲+RhD阳性血型胎儿），因此明确胎儿血型非常重要。当胎儿的血型不能确定时，传统的产前诊断可能依靠穿刺明确胎儿血型。但是由于穿刺本身的风险，同时可能使已致敏的孕妇产生更多的抗体，易引起胎儿流产或加重溶血病情。随着无创产前筛查技术的发展，现已可通过孕妇外周血细胞胎儿游离DNA检测技术明确胎儿RhD血型，避免因穿刺带来的风险，在临床处理及医疗成本效益等方面具有重要意义。
目前可利用的确定胎儿 RhD 状态的方法通常需要侵入性过程以获得用于测试的胎儿细胞。例如，可进行绒毛膜取样 (CVS) 或羊膜穿刺法以筛选 RhD 状态或遗传异常。然而，自发性流产、感染和异源免疫均与这样的侵入性过程相关。因此，希望开发出确定胎儿RhD 状态的非侵入性过程，以避免与侵入性诊断测试相关的并发症和不必要地给予昂贵的预防治疗。
RhD和RhCE基因高度同源，同时在孕妇12-16周时外周血中胎儿的cffDNA在总cffDNA的占比仅为10％，如何在这种高背景下准确的检测出胎儿的RhD基因分型是该领域难以解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组。
本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒。
本发明还提供了上述引物探针组在检测人类家系Rh血型基因型中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组，具体为：
（1）当检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型时，所述引物探针组1的序列为：
RJ-RHD1227上游引物如SEQ ID NO.1所示：
5’ CGTTTTGACACACAATATTTCGATT 3’；
RJ-RHD1227下游引物如SEQ ID NO.2所示：
5'CTCATAAACAGCAAGTCAACATATATACT 3'；
RJ-RHD1227探针如SEQ ID NO.3所示：
FAM-5' TGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAAAACTTG 3'-BHQ1；
（2）当检测孕妇游离DNA来鉴定胎儿Rhd基因分型时，所述引物探针组2的序列为：
RhD缺失上游引物如SEQ ID NO.4所示：
5' CTACCACATGAACATGATGCACA 3'
RhD缺失下游引物如SEQ ID NO.5所示：
5' GGGTATCGTTGCTGTCTGATCT 3'
RhD缺失探针如SEQ ID NO.6所示：
FAM-5' CCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCT 3'-BHQ1
RhD缺失内参上游引物如SEQ ID NO.7所示：
5' CCTCTGACTTCAACAGCGACAC 3'
RhD缺失内参下游引物如SEQ ID NO.8所示：
5' ATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT 3'
RhD缺失内参探针如SEQ ID NO.9所示：
VIC-5' ACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTG 3'-BHQ1
RhD1227上游引物如SEQ ID NO.10所示：
5' TTAAACAGGTTTGCTCCTAAATCTT 3'
RhD1227下游引物如SEQ ID NO.11所示：
5' CTATCACGTTAATAGGTGAAAAATCTTTCT 3'
RhD1227探针如SEQ ID NO.12所示：
FAM-5' AATATTTAGCCTCATGAGGTGCTTTCC 3'-BHQ1
RhD1227内参上游引物如SEQ ID NO.13所示：
5' AATCCCAAAAGATACTACGTGGTG 3'
RhD1227内参下游引物如SEQ ID NO.14所示：
5' ACATTCAGAGTTCATAAATTTCAACAA 3'
RhD1227内参探针如SEQ ID NO.15所示：
VIC-5' CTCAGAAACAAAGCATGACTGGCATTA 3'-BHQ1；
RhD 缺失SSHB如SEQ ID NO.16所示：
5' CATGAACCTGAGGCACTTCTACG-C3spacer 3'
RhD1227 SSHB如SEQ ID NO.17所示：
5' TAGGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAA-C3spacer 3'。
本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针组1或引物探针组2，反应Buffer和taq酶组成。
本发明所提供的试剂盒中：
（1）当试剂盒含有引物探针组1时，具体组成为：
（2）当试剂盒含有引物探针组2时：
RhD缺失体系为：
G1227A体系为：
本发明还提供了一种利用上述试剂盒在检测检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）利用探针熔解曲线的方法检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型检测；
（2）然后利用ARMS+Sequence Specific High-BLocker（SSHB）无创检测孕妇游离DNA来鉴定胎儿Rhd基因分型。
进一步的，步骤（1）中进行检测时，PCR扩增程序为：
进一步的，步骤（2）中，具体为：征集Rh阴性血型孕妇（12-28周）家系（血清学检测）的临床样本，通过一代测序进行孕妇血液白细胞核酸基因分型检测，确定孕妇的Rhd基因分型，用于配制Rh阳性（RhD野生型）梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阴性（ RhD G1227A纯合突变型）梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阴性（ RhD 纯合缺失型）梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；针对RhD缺失型孕妇外周血进行cffDNA提取和qPCR检测。
进一步的，步骤（2）中进行检测时，PCR扩增程序为：
。
本发明利用ARMS+Sequence Specific High-BLocker（SSHB），结合特定的反应程序的方法，检测孕妇(RhD基因纯合缺失型)外周血胎儿cffDNA基因分型，要包括引物，检测探针，Sequence Specific High-BLocker（SSHB）,反应Buffer和taq酶组成；体系一中在高退火温度下SSHB优先和RhCE基因模板(母亲和胎儿)或进行充分结合，在低退火温度下SSHB和RhD基因模板不结合或者极少量结合且引物和RHD基因模板充分结合；体系二中高退火温度下SSHB优先和RhCE基因模板(母亲和胎儿)、RhD基因野生型模板进行充分结合，在低退火温度下SSHB和RhD基因突变型模板不结合或者极少量结合且引物和RHD基因突变型模板充分结合；通过上述方法能够抑制母亲以及胎儿本身中RhCE基因背景的扩增（30ng RHCE基因组模板在qPCR中无荧光信号），同时极大的提高RhD的检测效率（可以检测出1ng cffDNA中10％的点突变和缺失）。
与现有Rh血型基因检测方法相比，本发明具有以下优势：
（1）本发明包含了中国人群Rh阴性血型最常见的基因突变：RhD基因缺失和RhDG1227A突变型两种，覆盖了中国人群Rh阴性90％以上的基因分型。
（2）本发明中利用探针熔解曲线的方法开发出的RhD基因分型检测体系只需要1ngDNA核酸样本、1管qPCR就可以检测新生儿、成人（包含已孕夫妇）的RhD基因分型，可以为血清学检测结果为Rh阴性的孕妇进行初筛，确定是否可以做孕血胎儿无创RhD基因分型检测。
（3）本发明所述的孕血胎儿无创RhD基因分型检测检测方法灵敏度高，在qPCR检测平台，1ng的cffDNA核酸中可以检测到10％的突变频率。
（4）本发明所述的孕血胎儿无创RhD基因分型检测通用性强，该技术也可以应用到数字PCR平台中。
附图说明
图1显示Rh阳性（Rhd野生型）梯度样本DNA核酸的熔解曲线。A:1ng RhD阴性（野生型）DNA核酸，B:10ngRhD阴性（野生型）DNA核酸。
图2显示Rh阴性（RhD纯合缺失型）梯度样本DNA核酸的熔解曲线。A:1ng Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸，B:10ngRh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸。
图3显示Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）梯度样本DNA核酸的熔解曲线。A:1ng Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸，B:10ng Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸。
图4显示Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸的熔解曲线。A:1ng Rh阳性（RhDG1227A杂合突变型）DNA核酸，B:10ng Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸。
图5显示RhD缺失体系中Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸的扩增曲线。A:0.05ng Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸，B:0.1ng Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸。
图6显示RhD缺失体系中Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸的扩增曲线。A:0.05ngRh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸，B:0.1ng Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸。
图7显示RhD缺失体系中Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸的扩增曲线。A:0.05ngRh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸，B:0.1ng Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸。
图8显示RhD缺失体系中Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸的扩增曲线。A:1ng Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸，B:10ng Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸。
图9显示RhD缺失体系中孕妇Rh阴性（RhD纯合缺失型）外周血提取 1ng cffDNA核酸的扩增曲线。A: Rh阴性[1227（G＞A）/DeL双重杂合突变）]DNA核酸，B:Rh阴性（RhD纯合缺失）DNA核酸，C:Rh阳性（RhD杂合缺失）DNA核酸。其A-C样本的RhD基因分型是通过胎儿出生后进行基因检测确定。
图10显示RhD G1227A点突变体系中Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸的扩增曲线。A:1ng Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸，B:10ng Rh阳性（RhD野生型）DNA核酸。
图11显示RhD G1227A点突变体系中Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸的扩增曲线。A:0.05ng Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸，B:0.1ng Rh阴性（RhD G1227A纯合突变型）DNA核酸。
图12显示RhD G1227A点突变体系中Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸的扩增曲线。A:0.05ng Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸，B:0.1ng Rh阳性（RhD G1227A杂合突变型）DNA核酸。
图13显示RhD G1227A点突变体系中Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸的扩增曲线。A:1ng Rh阴性（RhD纯合缺失型）DNA核酸，B:10ng RhD阴性（纯合缺失型）DNA核酸。
图14显示RhD G1227A点突变体系中孕妇Rh阴性（RhD缺失型）外周血提取1ngcffDNA核酸的扩增曲线。A: Rh阴性[1227（G＞A）/DeL 双重杂合突变）]DNA核酸，B:Rh阴性（RhD 纯合缺失）DNA核酸，C:Rh阳性（RhD杂合缺失）DNA核酸。其A-C样本的RhD基因分型是通过胎儿出生后进行基因检测确定。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1：探针熔解曲线的方法检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型检测
基因序列确定：确定目标基因序列及突变位点位置及该位点上下游100bp以内所有SNP人群突变频率；本领域技术人员可以根据UCSC确定目标基因序列，通过NCBI确定突变位点以及SNP人群突变频率。
1、引物探针的设计
（1）引物和探针设计
引物设计：突变位点上下游序列进行SNP分析，保证ARMS引物内不含有高频的SNP位点，其他上下游引物同样选择不含有高频的SNP位点，；引物的长度为17-30nt，Tm值56-62℃，扩增的长度不超过700bp。
探针设计：利用PrimerPremier5软件设计检测探针，探针选择在在ARMS引物的同一条链上进行设计，检测探针为taqman水解型探针，对探针5’端FAM标记，3’端BHQ1标记，Tm值为为65-72℃。
RJ-RHD1227上游引物：5’ CGTTTTGACACACAATATTTCGATT 3’
RJ-RHD1227下游引物：5' CTCATAAACAGCAAGTCAACATATATACT 3'
RJ-RHD1227探针：FAM-5' TGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAAAACTTG 3'-BHQ1
2、检测样本的准备
通过临床征集并一代测序确定RhD野生型、RhD纯合缺失型、RhD G1227A纯合突变和杂合突变类型的样本，提取核酸使用Qubit 2.0准确测定浓度。并将上述样本类型，分别稀释到0.1ng/μL、1ng/μL。
3、实验检测
体系如表1所示：
表1
程序：所用仪器为荧光定量宏石SLAN-96P仪器，具体见表2；
表2
实验过程分别设置加入RhD野生型、RhD纯合缺失型、RhD G1227A纯合突变和杂合突变类型的样本，各样本分别取0.1ng/μL、1ng/μL核酸各10μL进行检测。
结果解析：实验结果如图1所示，RhD野生型样本DNA核酸的熔解曲线，表明本体系在1-10ng的RhD野生型样本核酸中可以正常检出单峰，Tm值为54.5℃。图2所示，RhD缺失型样本DNA核酸的熔解曲线（纯合缺失），表明本体系在1-10ng的RhD纯合缺失型样本核酸中无峰图。图3所示，RhD G1227A纯合突变样本DNA核酸的熔解曲线，表明本体系在1-10ng的RhD纯合突变样本可以正常检出单峰，Tm值61.5℃。图4所示，RhD G1227A杂合突变样本DNA核酸的熔解曲线，表明本体系在1-10ng的RhD杂合突变样本可以正常检出双峰，Tm值为54.5℃和61.5℃。
结论：根据本发明方法可完成1-10ng的基因组DNA检测，并通过是否有峰图及其峰图的Tm值范围判断样本RhD基因的分型，其判读参考下表3。
表3
实施例2：一种利用ARMS+Sequence Specific High-BLocker（SSHB）无创检测孕妇游离DNA来鉴定胎儿Rhd基因分型方法
1、引物探针和SSHB的设计
（1）引物和探针设计
引物设计：突变位点上下游序列进行SNP分析，保证ARMS引物内不含有高频的SNP位点，其他上下游引物同样选择不含有高频的SNP位点，；引物的长度为17-30nt，Tm值56-62℃，扩增的长度尽量不超过120bp。
探针设计：利用Primer Premier5软件设计检测探针，探针选择和阻断剂在同一条链上进行设计，探针位于阻断剂的下游相隔1-20个碱基；检测探针为taqman水解型探针，对探针5’端FAM和VIC标记，3’端BHQ1标记，Tm值为为65-72℃。
RhD缺失上游引物：5' CTACCACATGAACATGATGCACA 3'
RhD缺失下游引物：5' GGGTATCGTTGCTGTCTGATCT 3'
RhD缺失探针：FAM-5' CCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCT 3'-BHQ1
RhD缺失内参上游引物：5' CCTCTGACTTCAACAGCGACAC 3'
RhD缺失内参下游引物：5' ATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT 3'
RhD缺失内参探针：VIC-5' ACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTG 3'-BHQ1
RhD1227上游引物：5' TTAAACAGGTTTGCTCCTAAATCTT 3'
RhD1227下游引物：5' CTATCACGTTAATAGGTGAAAAATCTTTCT 3'
RhD1227探针：FAM-5' AATATTTAGCCTCATGAGGTGCTTTCC 3'-BHQ1
RhD1227内参上游引物：5' AATCCCAAAAGATACTACGTGGTG 3'
RhD1227内参下游引物：5' ACATTCAGAGTTCATAAATTTCAACAA 3'
RhD1227内参探针：VIC-5' CTCAGAAACAAAGCATGACTGGCATTA 3'-BHQ1
（2）SSHB的设计
利用Primer Premier5软件设计阻断剂，阻断剂优先选择和ARMS引物在同一条链上进行设计，要检测的突变位置优先位于阻断剂的中间1/3位置；阻断剂的5’端和ARMS引物的3’端有连续5-15个碱基完全相同（末端碱基除外）；阻断剂的3’端使用C3spacer进行封闭。
RhD 缺失SSHB：5' CATGAACCTGAGGCACTTCTACG 3'
RhD1227 SSHB：5' TAGGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAA 3'
2、检测样本的准备
通过临床征集并一代测序确定RhD野生型、RhD纯化缺失型、RhD G1227A纯合突变和杂合突变类型的样本，提取核酸使用Qubit 2.0准确测定浓度。并将上述样本类型，RhD野生型样本稀释到0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL，RhD G1227A纯合突变和杂合突变类型的样本分别稀释到0.005ng/μL、0.01ng/μL，RhD纯合缺失型样本稀释到0.1ng/μL、1ng/μL。
3、实验检测
体系：RhD缺失体系，具体将表4。
表4
体系：G1227A体系，见表5。
表5
实验过程分别设置RhD缺失体系和RhD G1227A体系分别加入RhD野生型、RhD纯合缺失型、RhD G1227A纯合突变和杂合突变类型的样本。
结果解析：
（1）RhD缺失体系
程序：所用仪器为荧光定量PCR仪ABI7500，见表6。
表6
实验结果如图5所示，RhD缺失体系中RhD野生型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在0.05-0.1ng的RhD野生型样本核酸中可以正常扩增。图6所示RhD缺失体系中RhD G1227A纯合突变型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在0.05-0.1ng的RhD G1227A纯合突变型样本核酸中中可以正常扩增。图7所示，RhD缺失体系中RhD G1227A杂合突变型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在0.05-0.1ng的RhD G1227A杂合突变型样本核酸中可以正常扩增。图8所示，RhD缺失体系中RhD纯合缺失型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在1-10ng的RhD纯合缺失型样本核酸无扩增。图9所示，RhD缺失体系中孕妇（RhD纯合缺失型）外周血提取 1ngcffDNA核酸的扩增曲线（样本的RhD基因分型是通过胎儿出生后进行基因检测确定），表明本体系可以检测cffDNA中是否存在非RhD基因纯合缺失型核酸。
RhD G1227A体系
实验结果如图10所示，G1227A体系中RhD野生型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在1-10ng的RhD野生型样本核酸中无扩增。图11所示G1227A体系中RhD G1227A纯合突变型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在0.05-0.1ng的RhD G1227A纯合突变型样本核酸中中可以正常扩增。图12所示，G1227A体系中RhDG1227A杂合突变型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在0.05ng的RhD G1227A杂合突变型样本核酸无扩增，0.1ng的RhD G1227A杂合突变型样本核酸中可以正常扩增。图13所示，G1227A体系中RhD纯合缺失型DNA核酸的扩增曲线，表明本体系在1-10ng的RhD纯合缺失型样本核酸中无扩增。图14所示，G1227A体系中孕妇Rh阴性（RhD纯合缺失型）外周血提取 1ng cffDNA核酸的扩增曲线（样本的RhD基因分型是通过胎儿出生后进行基因检测确定），表明本体系可以检测cffDNA中是否存在RhD基因G1227A突变型核酸。
结论：RhD缺失体系可以检测0.005ng的RhD基因非缺失型核酸，RhD G1227A体系可以检测0.01ng的RhD基因（G1227A）点突变型核酸，并通过cffDNA样本进行验证，表明本发明方法可以从孕妇外周血中检出胎儿的RhD基因分型，并确定胎儿的Rh血型。
孕妇的外周血检测结果可以通过下表中两个体系的检测ct值进行判读，具体见下表7（孕妇cffDNA结果判定标准如下表（母亲Rhd基因型为纯合缺失））
表7
/>
序列表
<110> 银丰基因科技有限公司、银丰生物工程集团有限公司
<120>一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
CGTTT TGACA CACAA TATTT CGATT 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
CTCAT AAACA GCAAG TCAAC ATATA TACT 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
TGTGA AAAAT CTTAC CTTCC AGAAA ACTTG 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
CTACC ACATG AACAT GATGC ACA 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
GGGTA TCGTT GCTGT CTGAT CT 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
CCTAT TTTGG GCTGT CTGTG GCCT 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
CCTCT GACTT CAACA GCGAC AC 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400>8
ATGAG CTTGA CAAAG TGGTC GT 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 9
ACCTT TGACG CTGGG GCTGG CATTG 25
<210>10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 10
TTAAA CAGGT TTGCT CCTAA ATCTT 25
<210>11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 11
CTATC ACGTT AATAG GTGAA AAATC TTTCT 30
<210>12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 12
AATAT TTAGC CTCAT GAGGT GCTTT CC 27
<210>13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 13
AATCC CAAAA GATAC TACGT GGTG 24
<210>14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 14
ACATT CAGAG TTCAT AAATT TCAAC AA 24
<210>15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 15
CTCAG AAACA AAGCA TGACT GGCAT TA 27
<210>16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 16
CATGA ACCTG AGGCA CTTCT ACG 23
<210>17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 17
TAGGT GAAAA ATCTT ACCTT CCAGA A 26
Claims (5)
1.一种含有检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物探针组1和引物探针组2；
所述引物探针组1用于检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型，其序列为：
RJ-RHD1227上游引物：5' CGTTTTGACACACAATATTTCGATT 3'；
RJ-RHD1227下游引物：5' CTCATAAACAGCAAGTCAACATATATACT 3'；
RJ-RHD1227探针：FAM-5' TGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAAAACTTG 3'-BHQ1；
所述引物探针组2用于检测孕妇游离DNA来鉴定胎儿Rhd基因分型，其序列为：
RhD缺失上游引物：5' CTACCACATGAACATGATGCACA 3'
RhD缺失下游引物：5' GGGTATCGTTGCTGTCTGATCT 3'
RhD缺失探针：FAM-5' CCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCT 3'-BHQ1
RhD缺失内参上游引物：5' CCTCTGACTTCAACAGCGACAC 3'
RhD缺失内参下游引物：5' ATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT 3'
RhD缺失内参探针：VIC-5' ACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTG 3'-BHQ1
RhD1227上游引物：5' TTAAACAGGTTTGCTCCTAAATCTT 3'
RhD1227下游引物：5' CTATCACGTTAATAGGTGAAAAATCTTTCT 3'
RhD1227探针：FAM-5' AATATTTAGCCTCATGAGGTGCTTTCC 3'-BHQ1
RhD1227内参上游引物：5' AATCCCAAAAGATACTACGTGGTG 3'
RhD1227内参下游引物：5' ACATTCAGAGTTCATAAATTTCAACAA 3'
RhD1227内参探针：VIC-5' CTCAGAAACAAAGCATGACTGGCATTA 3'-BHQ1；
RhD 缺失SSHB：5' CATGAACCTGAGGCACTTCTACG-C3spacer 3'
RhD1227 SSHB：5' TAGGTGAAAAATCTTACCTTCCAGAA-C3spacer 3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应Buffer和Taq酶。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
（1）引物探针组1的检测体系为：
；
（2）引物探针组2的检测体系为：
RhD缺失体系为：
；
G1227A体系为：
。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，配制Rh阳性RhD野生型梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阳性RhD G1227A杂合突变型梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阴性RhD G1227A纯合突变型梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；配制Rh阴性RhD 纯合缺失型梯度DNA核酸：0.005ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL；针对RhD缺失型孕妇外周血进行cffDNA提取和qPCR检测。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，引物探针组1所采用的PCR扩增程序为：
；
所述试剂盒使用时，引物探针组2所采用的PCR扩增程序为：
。
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