CN116555427A - 用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 - Google Patents
用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116555427A CN116555427A CN202310513361.5A CN202310513361A CN116555427A CN 116555427 A CN116555427 A CN 116555427A CN 202310513361 A CN202310513361 A CN 202310513361A CN 116555427 A CN116555427 A CN 116555427A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- primer
- epb
- alk
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 8
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 abstract description 24
- 101150005988 cin2 gene Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 101150070189 CIN3 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 abstract 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 abstract 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 33
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 15
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101150061050 CIN1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010073478 Anaplastic large-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032004 Large-Cell Anaplastic Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N 0.000 description 1
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027708 Astrotactin-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 102100026127 Clathrin heavy chain 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100038912 E3 SUMO-protein ligase RanBP2 Human genes 0.000 description 1
- 102100030087 Homeobox protein DLX-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000936741 Homo sapiens Astrotactin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000912851 Homo sapiens Clathrin heavy chain 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000864690 Homo sapiens Homeobox protein DLX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001050559 Homo sapiens Kinesin-1 heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 101001109719 Homo sapiens Nucleophosmin Proteins 0.000 description 1
- 101001110357 Homo sapiens Relaxin-3 receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000644537 Homo sapiens Sequestosome-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000830781 Homo sapiens Tropomyosin alpha-4 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000915607 Homo sapiens Zinc finger protein 671 Proteins 0.000 description 1
- 108010007666 IMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100020796 Inosine 5'-monophosphate cyclohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100023422 Kinesin-1 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022678 Nucleophosmin Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100022105 Relaxin-3 receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020814 Sequestosome-1 Human genes 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 1
- 102100024944 Tropomyosin alpha-4 chain Human genes 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 102100028943 Zinc finger protein 671 Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108010062219 ran-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Abstract
本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测和风险评估的生物标志物基因组合,包括ALK基因和EPB基因,同时公开了检测上述宫颈癌样本基因甲基化的引物和探针组合及试剂盒。本发明利用较少的基因组合,使研发和生产检测成本较低,同时能达到较高的检测率和良好的特异性。针对CIN2及以上级别的病变样本,本发明的灵敏度为92.5﹪,特异性为94.3﹪。特别的,针对CIN3病变级别的样本,灵敏度为100﹪,特异性为94.3﹪。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,特别是涉及一种用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌,位居女性恶性肿瘤第二位,严重危害女性生命健康。目前宫颈癌的筛查包括宫颈细胞学检测及人类乳头状瘤病毒(HPV)检测。细胞学检测包括巴氏涂片和TCT液基细胞压片。TCT相较于巴氏涂片更易于发现异常细胞,敏感性较高,但价格相对较高,且诊断水平受医师主观因素影响较大。
HPV DNA检测相比细胞学检测,能够对高危型和低危型进行分型和定量检测,但是>80%的妇女一生中都会感染HPV,90%以上的感染者体内的病毒在两年内自动清除,HPVDNA检测产生大量的假阳性(特异度低)。
宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变的阶段,随病变程度加重,癌变几率升高。即使对于同一级别癌前病变个体,癌症风险也存在差别。宫颈上皮内病变可分为轻度非典型增生(CIN1)、中度非典型增生(CIN2)与重度非典型增生及原位癌(CIN3/CIS);CIN1也称为宫颈低级别病变(LSIL),对应的宫颈高级别病变(HSIL)包含CIN2与CIN3/CIS;CIN的转化性病变(CIN2与CIN3)反映一种异质性疾病;表观遗传学研究表明宫颈癌发展过程伴随着局部基因甲基化异常,基因甲基化改变可以区分早期和晚期宫颈CIN转化病变,可用于宫颈癌筛查诊断和宫颈癌前病变管理。一项使用全基因组甲基化途径的前期研究确定了具有最高联合诊断准确性的三个甲基化组(J AM3/ANKR D1 8C P、C1 3OR F1 8/J AM3/ANKR D1 8CP和J AM3/G FR A1/ANKRD18CP),用于检测宫颈样品中的CIN2+;并且敏感性分别被报告为72%、74%和73%,且相应特异性分别为79%、76%和77%。上海捷诺开发的宫颈癌早期检测产品,同时检测6个基因人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671的甲基化情况,能够得到较高的灵敏度和特异性数据,然而检测基因数量的增加必然会大大提高产品的检测难度和成本。对于一个筛查产品,需要面对大量的客户,成本的提升是一个阻碍成品推广的重大影响因素。
因此,需要确定新的DNA甲基化生物标志物,用于针对宫颈癌的早期检测和易感性全群体筛查明显健康的女性,且用于具有癌前病变的女性的风险评估。同时对靶基因的选择必须做到少而精,经过大量的筛选,找出与宫颈癌相关性最高的目标基因,保证在成本可控的前提下,达到高的准确度。
发明内容
为了获得与宫颈癌相关性较高的甲基化生物标志物,保证在成本可控的前提下,实现更加精准和有效的宫颈高级别病变及宫颈癌早期检测,本发明提供了一种用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒及相关方法。
本发明将ALK和EPB的双基因组合作为非疾病诊断目的检测宫颈癌和风险预测的甲基化生物标志物,利用检测ALK基因甲基化、EPB基因甲基化的特异性引物探针,以重亚硫酸盐转化处理后的宫颈脱落细胞DNA为模板,采用实时荧光定量PCR扩增试剂检测ALK基因和EPB基因甲基化,通过读取荧光检测CT值,对待检样本进行判定,当待检样本判定为阳性,提示有宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险高;反之,当待检样本判定为阴性,表示宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险低。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
本发明具体技术方案如下:
本发明的目的在于提供一种ALK和EPB的基因组合作为非疾病诊断目的的宫颈癌早期检测和风险预测相关的甲基化生物标志物的用途。
红细胞膜蛋白配体4.1样3(EPB41L3)EPB基因(GENE ID:23136)是4.1蛋白家族中一个新发现的抑癌基因,具有抑制肿瘤细胞生长的功能。
间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因(GENE ID:238)编码一种受体酪氨酸激酶(eceptor tyrosine kinase,RTK),为跨膜蛋白,属于胰岛素受体超家族,在大脑发育与及特定的神经元中起重要作用。最初在间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlarge cell lymphoma,ALCL)发现ALK-NPM1融合蛋白,目前已在其它肿瘤中包括神经母细胞瘤和非小细胞肺癌,发现该基因出现突变、扩增或者重排,其中染色体重排最为常见,导致ALK与其他基因产生融合,包括ALK(2号染色体)/EML4(2号染色体),ALK/RANBP2(2号染色体),ALK/ATIC(2号染色体),ALK/TFG(3号染色体),ALK/NPM1(5号染色体),ALK/SQSTM1(5号染色体),ALK/KIF5B(10号染色体),ALK/CLTC(17号染色体),ALK/TPM4(19号染色体),和ALK/MSN(X染色体)。
本发明还提供了一种检测宫颈癌相关基因甲基化的物质在宫颈癌早期检测和风险预测中的用途,所述检测宫颈癌相关基因甲基化的物质为检测ALK和EPB基因甲基化的引物和探针。
本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物和探针组合,所述引物和探针用于检测ALK和EPB的基因组合;所述引物和探针组合包括ALK探针P、ALK正向引物F、ALK反向引物R、EPB探针P、EPB正向引物F、EPB反向引物R;所述ALK探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述ALK正向引物F的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中的任意一种;所述ALK反向引物R的核苷酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5中的任意一种;所述EPB探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;所述EPB正向引物F的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示;所述EPB反向引物R的核苷酸序列选自SEQ ID NO:8~SEQ ID NO:11中的任意一种。
在其中一个实施例中,所述ALK正向引物F、反向引物R的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4所示;所述EPB正向引物F、反向引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
在其中一个实施例中,所述ALK探针P、EPB探针P的5’端均连接有荧光报告基团,且所述ALK探针P、EPB探针P的荧光报告基团互不相同,所述ALK探针P、EPB探针P的3’端均连接有荧光淬灭基团。
在其中一个实施例中,所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5,所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA或MGB。
本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒,包括上述的引物和探针组合、ACT正向引物F、ACT反向引物R和ACT探针P;所述ACT正向引物F、ACT反向引物R和探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12~SEQ ID NO:14所示。
在其中一个实施例中,所述ACT正向引物F的核苷酸序列为ACT-F:aggaggtagggagtatatagg;ACT反向引物R的核苷酸序列为ACT-R:caaccaataaaacctactcctc;ACT探针P的核苷酸序列为ACT-P:accaccacccaacacacaataacaaacaca;其中,ACT-P 5’端荧光报告基团与ALK探针P、EPB探针P的荧光报告基团互不相同,3’端连接有荧光淬灭基团。
在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括10×PCR Buffer,Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照,阳性对照品为宫颈癌组织DNA,阴性对照品为无核酸酶水。
本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法,包括以下步骤:1)提取待检样本DNA;2)将所述待检样本DNA经亚硫酸氢盐转化处理,得到转化后的DNA;3)以所述转化后的DNA为模板,利用上述引物和探针组合进行PCR扩增反应,得到荧光检测结果;4)利用所述荧光检测结果,对待检样本进行判定,当内参CT<40,且内参和目标基因差值≥5,则判定样本为宫颈癌甲基化阴性;当内参CT<40,且内参和目标基因差值<5,则判定样本为宫颈癌甲基化阳性;当内参CT≥40,则判定样本不合格;ALK和EPB基因任何一个为阳性,则样本判断阳性;两个基因都为阴性,则样本判断阴性。
在其中一个实施例中,所述荧光定量PCR反应的条件为:95℃~96℃变性9min~11min;94℃~96℃变性14s~16s,59℃~61℃退火延伸39s~41s并收集荧光信号,50个循环。
本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的系统,包含以下模块:1)DNA提取模块,用以获得待检样本DNA;2)DNA转化模块,用以将所述待检样本DNA经亚硫酸氢盐转化处理,得到转化后的DNA;3)核酸扩增模块,用于以所述转化后的DNA为模板,利用上述引物和探针组合进行PCR扩增反应,得到荧光检测结果;4)数据分析模块,用以利用所述荧光检测结果进行数据分析,对待检样本进行判定。
在其中一个实施例中,所述待检样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清和血细胞中的一种或多种。
相对于现有技术,本发明的有益效果:
本发明选用了两个宫颈癌高度相关的ALK基因和EPB基因作为甲基化生物标志物,较少的基因组合,使研发和生产检测成本较低,并且同时能达到较高的检测率和良好的特异性。
按照目前的行业标准,CIN2及以上级别的病变作为阳性病例,本发明的灵敏度为92.5﹪,特异性为94.3﹪。特别的,针对CIN3病变级别的样本,灵敏度为100﹪,特异性为94.3﹪。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
附图说明
图1为靶基因1阳性样本扩增曲线及结果判断示意图,其中,纵坐标表示荧光强度值,横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数;
图2为靶基因2阳性样本扩增曲线及结果判断示意图,其中,纵坐标表示荧光强度值,横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数;
图3为阴性样本扩增曲线及结果判断示意图,其中,纵坐标表示荧光强度值,横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明使用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PCR仪器为LineGene9600。
实施例一:宫颈癌细胞脱落样品DNA提取及亚硫酸氢盐转化。
1.样本提取
样本保存于细胞保存液中,存于4度。使用上海力敏DNA提取试剂盒(货号D3396-02),按照试剂盒细胞提取步骤进行提取。
2.亚硫酸氢盐转化
将提取的DNA样本按照以下步骤转化:
(1)取PCR管,加入20ul DNA,100ul配制好的亚硫酸盐转化液,20ul
100mM的对苯二酚,98度10分钟,64度2.5小时。
(2)孵育好的DNA转移至1.5ml Ep管,加入250微升的DNA结合液,混匀,转移至DNA纯化柱中,13000转/分离心2分钟,弃废液后,再次13000转/分离心3分钟,弃废液。
(3)加500微升70%乙醇洗涤液,13000转/分离心2分钟,弃废液后13000转/分离心一分钟。
(4)加入300微升脱硫液,室温放置30分钟,13000转/分离心2分钟,弃废液。
(5)加500微升70%乙醇洗涤液,13000转/分离心2分钟,弃废液。
(6)加500微升70%乙醇洗涤液,13000转/分离心2分钟,弃废液。
13000转/分,离心3分钟。
(7)将纯化柱放入新1.5ml离心管,加入100微升1mM Tris-EDTA,50℃孵育5min,13000转/分离心2分钟,得到样品。
实施例二:宫颈癌样本甲基化目标基因的荧光定量PCR扩增检测
1)按照如下表格配制10X buffer:
2)按照如下表格配制PCR反应体系:
试剂 | 体积(ul) |
PCR反应buffer | 5 |
TAQ酶 | 0.5 |
dNTP(10mM) | 1 |
内参ACT探针 | 0.5 |
内参ACT引物 | 1 |
目标基因探针 | 1 |
目标基因引物 | 2 |
模板 | 5 |
无核酸酶水 | 34 |
总体积 | 50 |
3)PCR反应程序
4)检测结果判定
判定方法:计算内参和目标基因CT差值,如果内参CT<40,且内参和目标基因差值≥5,判断待检样本为阴性;若内参CT<40,且内参和目标基因差值<5,判断待检样本为阳性;若内参CT≥40,则样本不合格。ALK和EPB基因任何一个为阳性,判断待检样本为阳性;两个基因都为阴性,判断待检样本为阴性。
实施例三:甲基化位点的选择、引物探针的设计筛选
收集医院不同病理分期样本:其中,宫颈高级别病变(HSIL)样本66例,宫颈低级别病变(LSIL)样本83例。
宫颈脱落细胞样品收集操作如下:
医护人员先以窥阴器暴露宫颈,用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口,单方向旋转5圈以获得足量的上皮细胞样本,然后将宫颈刷头部放入装有丽拓细胞保存液的样本管中,沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断,将刷头留在样本管中,旋紧管盖,做好样本标识,保存于4度。
样本扩增测序:
(1)按照实施例一完成样本的提取、转化;
(2)在ALK和EPB基因启动子序列2000bp待测序列设计普通扩增引物对样本进行扩增。扩增产物进行一代sanger测序;
(3)根据测序结果选择甲基化待测序列如下,序列中各个CG位点甲基化率如下表1所示:
EPB序列:
ALK序列:
表1为所选序列中甲基化率
(4)分析HSIL样本和LSIL样本在所测序列中的每个CG位点的甲基化情况,对宫颈癌样本特异性甲基化位点设计引物探针,每个引物探针组合包含6-8个特异性甲基化CG位点;引物探针的核酸序列如下表2所示:
表2为设计的引物探针及其核酸序列
/>
/>
使用上述探针引物按照实施例一和实施例二对20个正常样本和20个宫颈癌样本完成提取,转化,检测,参照实施例2进行结果分析,筛选出最优探针引物组合,如下表3所示:
表3为筛选的最优探针引物组合
/>
实施例四:医院临床病人样本检测
收集医院不同病例分期样本:其中,正常样本18例,CIN1 17例,CIN2 31例,CIN322例。宫颈脱落细胞样品收集操作如下:医护人员先以窥阴器暴露宫颈,用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口,单方向旋转5圈以获得足量的上皮细胞样本,然后将宫颈刷头部放入装有丽拓细胞保存液的样本管中,沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断,将刷头留在样本管中,旋紧管盖,做好样本标识,保存于4度。
样本检测:
按照实施例一和实施例二完成样本的提取,转化和检测,参照实施例二进行结果分析,探针引物选用实施例三筛选的表2所示的最优组合。
检测结果如下表4:其中,“+“为检测阳性;”-“为检测阴性。
表4为检测结果
/>
/>
/>
根据上述结果,统计分析如下表5所示:
表5为统计分析结果
其中,CIN1-(35例)包含正常(18)例和CIN1(17例),CIN2+(53例)包含CIN2(31例)和CIN3(22例)。
分析结论:由于CIN1级别病变有较高的概率自愈,目前宫颈癌筛查样本的标准为CIN2及以上病变作为阳性病例,从上述结果可得本发明单个探针引物组合检测的特异性在91%-97%之间,灵敏度在75%-85%之间。
为进一步提高检测效率,通过对上述引物探针组合进行组合,期望以多重联检的方式提高试剂盒的检测效果,共有如下表五中8个组合结果如表6所示,其中最优联检方案为组合(1和3)、组合(2和3)。
表6为联合检测结果
针对最优联检方案组合(1和3)对检测结果进行统计分析,结果如下表7所示:
表7为统计分析结果
分析结论:由于CIN1级别病变有较高的概率自愈,目前宫颈癌筛查样本的标准为CIN2及以上病变作为阳性病例,故该发明的灵敏度为92.5﹪,特异性为94.3﹪。特别的,针对CIN3病变级别的样本,灵敏度为100﹪,特异性为94.3﹪。
当待检样本判定为阳性,提示有宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险高;反之,当待检样本判定为阴性,表示宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险低。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
Claims (11)
1.ALK和EPB的基因组合作为非疾病诊断目的的宫颈癌早期检测和风险预测相关的甲基化生物标志物的用途。
2.一种检测宫颈癌相关基因甲基化的物质在宫颈癌早期检测和风险预测中的用途,其特征在于:所述检测宫颈癌相关基因甲基化的物质为检测ALK和EPB基因甲基化的引物和探针。
3.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物和探针组合,其特征在于,所述引物和探针用于检测ALK和EPB的基因组合;所述引物和探针组合包括ALK探针P、ALK正向引物F、ALK反向引物R、EPB探针P、EPB正向引物F、EPB反向引物R;所述ALK探针P的核苷酸序列如SEQID NO:1所示;所述ALK正向引物F的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中的任意一种;所述ALK反向引物R的核苷酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5中的任意一种;所述EPB探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;所述EPB正向引物F的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示;所述EPB反向引物R的核苷酸序列选自SEQ ID NO:8~SEQ ID NO:11中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的引物和探针组合,其特征在于,所述ALK正向引物F、反向引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示;所述EPB正向引物F、反向引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求3所述的引物和探针组合,其特征在于,所述ALK探针P、EPB探针P的5’端均连接有荧光报告基团,且所述ALK探针P、EPB探针P的荧光报告基团互不相同,所述ALK探针P、EPB探针P的3’端均连接有荧光淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的引物和探针组合,其特征在于,所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5,所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA或MGB。
7.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求3~6任一所述的引物和探针组合、ACT正向引物F、ACT反向引物R和ACT探针P;所述ACT正向引物F、ACT反向引物R和探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12~SEQ ID NO:14所示。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括10×PCR Buffer,Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。
9.一种如权利要求7或8任一所述试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:1)提取待检样本DNA;2)将所述待检样本DNA经亚硫酸氢盐转化处理,得到转化后的DNA;3)以所述转化后的DNA为模板,利用如权利要求3~6任一所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应,得到荧光检测结果;4)利用所述荧光检测结果,对待检样本进行判定,当内参CT<40,且内参和目标基因差值≥5,则判定样本为宫颈癌甲基化阴性;当内参CT<40,且内参和目标基因差值<5,则判定样本为宫颈癌甲基化阳性;当内参CT≥40,则判定样本不合格;ALK和EPB基因任何一个为阳性,则样本判断阳性;两个基因都为阴性,则样本判断阴性。
10.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的系统,其特征在于,包含以下模块:
1)DNA提取模块,用以获得待检样本DNA;2)DNA转化模块,用以将所述待检样本DNA经亚硫酸氢盐转化处理,得到转化后的DNA;3)核酸扩增模块,用于以所述转化后的DNA为模板,利用如权利要求3~6任一所述的引物和探针组合进行qPCR扩增反应,得到荧光检测结果;4)数据分析模块,用以利用所述荧光检测结果进行数据分析,对待检样本进行判定。
11.根据权利要求9或10任一所述的试剂盒的使用方法或系统,其特征在于,所述待检样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清和血细胞中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310513361.5A CN116555427A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310513361.5A CN116555427A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116555427A true CN116555427A (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=87495927
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310513361.5A Pending CN116555427A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116555427A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117701720A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-03-15 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 |
CN117701720B (zh) * | 2024-02-05 | 2024-05-17 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 |
-
2023
- 2023-05-09 CN CN202310513361.5A patent/CN116555427A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117701720A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-03-15 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 |
CN117701720B (zh) * | 2024-02-05 | 2024-05-17 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108977543B (zh) | 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂 | |
CN110564857B (zh) | 一种用于早期宫颈癌检测的组合物及试剂盒 | |
CN112646882B (zh) | 一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的组合物及诊断试剂 | |
CN113265456B (zh) | 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合 | |
CN111549135A (zh) | 一种用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法、应用 | |
CN114672568B (zh) | 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒 | |
CN111808962A (zh) | 一种用于宫颈癌检测的试剂盒、使用方法 | |
CN110484625A (zh) | 用于检测prky基因甲基化的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
CN111187842A (zh) | 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒 | |
CN108179195A (zh) | 一种结直肠癌超早期病变检测的试剂盒、方法及其应用 | |
CN113943799A (zh) | 用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用 | |
CN111793690A (zh) | 用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法 | |
CN114214416B (zh) | 与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用 | |
CN109837344A (zh) | 一种甲基化的EphA7核苷酸片段及其检测方法和应用 | |
CN116555427A (zh) | 用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒 | |
CN111154880A (zh) | 一种膀胱癌新型体液活检生物标志物及其应用 | |
CN117701721B (zh) | 宫颈癌sox1-septin9-tac1基因甲基化的检测试剂及试剂盒 | |
CN114540489B (zh) | 一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用 | |
CN114561462B (zh) | 宫颈癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用 | |
CN117701720B (zh) | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 | |
RU2804110C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для определения аллей полиморфизма rs55986091 и способ его применения | |
CN116103406B (zh) | 检测宫颈高级别鳞状上皮内病变的引物探针组合及应用 | |
CN117757946A (zh) | 用于检测宫颈癌甲基化的试剂盒 | |
CN112195280B (zh) | 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv39的探针及其试剂盒 | |
CN116732171B (zh) | 筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |