CN114214416B - 与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用，属于生物技术领域。其中，该生物标志物包括人基因组N序列与14种高危型HPV基因的M序列进行高频整合得到12个基因位点，基因整合位点如下：DSCAM、PIBF1、CASZ1、GRXCR1和LINC02383、LOC101928135和ARPP21、LINC01550和C14orf177、DCLK1、NCOR2和SCARB1、MAU2和GATAD2A、HS3ST1和LINC02360、CASC11和MYC、CAPZB和LOC105378614。该生物标志物对于检测人乳头瘤病毒HPV阳性患者宫颈病变的情况，具备重要的临床诊断意义。

Description

与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及宫颈癌前病变的检测，属于生物技术领域，具体地涉及一种与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用。
背景技术
宫颈癌是全球女性恶性肿瘤中第4位高发恶性肿瘤，仅次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌。据估计，2018年全球约有宫颈癌新发病例57万，死亡病例约31万，且宫颈癌的发病率呈年轻化趋势，严重威胁着人类生命和健康，是亟待解决的重大公共卫生问题。因此，我们需对宫颈癌做到早筛查，早诊断以及早治疗，才能降低该疾病带来的严重后果。
宫颈癌前病变包括低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepitheliallesion,LSIL)和高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)。高度鳞状上皮内病变约66％进展为原位癌，2％进展为浸润癌。发现并处理癌前病变是宫颈癌预防的关键，因此更需要在宫颈癌前病变阶段及时作出诊断和干预措施，才能避免疾病进一步发展。
目前，确诊LSIL和HSIL的方法采用的是阴道镜和病理组织活检，但阴道镜检也出现一些弊端，如在检查时使用3％～5％醋酸、卢戈碘液，这会造成患者一定的不适感，并对患者阴道微环境造成一定的影响，此外，每例阴道镜检查需要花费一定时间，判断具有主观性，且难以评价宫颈管内情况，且阴道镜需要专业的医师和仪器才能进行，对于经济不发达的地区诊断存在一些困难。因此，我们需要找到一种与宫颈癌前病变发生相关的生物分子标志物，开发出可以辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的新方法。
研究显示，人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持续感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因，而HPV DNA与宿主染色体整合才是宫颈细胞癌变的关键分子事件。在90％以上的宫颈癌组织中均发现HPV与宿主细胞染色体的整合，HPV与宿主细胞基因组的整合是宫颈癌发展的最重要的危险因素。与此同时，国内外多个研究组在大样本的癌前病变和宫颈癌人群中均存在不同程度HPV整合。因此将HPV整合作为宫颈癌及其癌前病变的标志物，对宫颈癌前病变和宫颈癌的早期辅助诊断具有非常重要的意义。
基于此需要选择一种灵敏度高，特异性好的检测技术，在庞大的人基因组背景下，找到HPV DNA是否发生整合，同时找到在人基因组上的整合位点，整合片段的大小、整合的数量等，对检测技术做出了极大的挑战。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用。该生物标志物能够辅助诊断人乳头瘤病毒阳性患者的宫颈癌及其癌前病变的情况，进而更有针对性的筛出HPV阳性患者及高风险人群，实现更早的发现和更及时的诊断，进一步提高治愈率和降低宫颈癌死亡率。
为实现上述技术目的，本发明公开了一种与宫颈癌前病变发生相关联的HPV整合基因位点，人基因组N序列与14种高危型HPV基因的M序列进行高频整合得到12个基因位点：
其中，基因整合位点如下：
CAPZB和LOC105378614、DSCAM、PIBF1、CASZ1、GRXCR1和LINC02383、LOC101928135和ARPP21、LINC01550和C14orf177、DCLK1、NCOR2和SCARB1、MAU2和GATAD2A、HS3ST1和LINC02360、CASC11和MYC。
进一步地，各所述基因整合位点的上下游引物序列如下：
PCR扩增所述基因整合位点CAPZB和LOC105378614的上、下游引物序列如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示；
PCR扩增所述基因整合位点DSCAM的上、下游引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示；
PCR扩增所述基因整合位点PIBF1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18所示；
PCR扩增所述基因整合位点CASZ1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示；
PCR扩增所述基因整合位点GRXCR1和LINC02383的上、下游引物序列如SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22所示；
PCR扩增所述基因整合位点LOC101928135和ARPP21的上、下游引物序列如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示；
PCR扩增所述基因整合位点LINC01550和C14orf177的上、下游引物序列如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示；
PCR扩增所述基因整合位点DCLK1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28所示；
PCR扩增所述基因整合位点NCOR2和SCARB1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；
PCR扩增所述基因整合位点MAU2和GATAD2A的上、下游引物序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；
PCR扩增所述基因整合位点HS3ST1和LINC02360的上、下游引物序列如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示；
PCR扩增所述基因整合位点CASC11和MYC的上、下游引物序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示。
进一步地，各所述基因整合位点的序列如下：
所述基因整合位点CAPZB和LOC105378614的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因整合位点DSCAM的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述基因整合位点PIBF1的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述基因整合位点CASZ1的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述基因整合位点GRXCR1和LINC02383的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述基因整合位点LOC101928135和ARPP21的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述基因整合位点LINC01550和C14orf177的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述基因整合位点DCLK1的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述基因整合位点NCOR2和SCARB1的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述基因整合位点MAU2和GATAD2A的序列如SEQ ID NO.10所示；
所述基因整合位点HS3ST1和LINC02360的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述基因整合位点CASC11和MYC的序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明的目的之二是提供了一种用于诊断宫颈癌前病变的生物标志物，它包括上述的HPV整合基因位点高频整合得到的基因序列。
本发明的目的之三是提供了一种上述生物标志物在制备用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒中的应用。
本发明的目的之四是提供了一种用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒，它包括上述的生物标志物。
与此同时，本发明还有一个技术目的是提供一种用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、建库试剂、PCR试剂和若干样品保存管。
进一步地，所述DNA提取试剂包括Buffer ACL、RNaseA、Proteinase K、Buffer WA、Buffer WB和Elution buffer；
所述PCR试剂包括DNA聚合酶、扩增缓冲液和双蒸水；
所述样品保存管2mL EP管；
所述建库试剂包括ERABuffer、Ligation Buffer、Ligase、Hyb Human Block、RNase Block和Target Probes。
此外，本发明还公开了一种上述HPV基因整合位点的筛选方法，它包括如下步骤：
1)基因组DNA的提取：提取人宫颈脱落细胞DNA，保证DNA浓度大于14.8ng/μL，纯度A260/A280大于1.5；
2)文库建立、杂交及测序：
设计含有14种亚型高危型级别的HPV探针；
根据I1lumina的要求构建DNA测序文库，将步骤1)中DNA处理为若干DNA片段，然后将这些DNA片段进行末端修复、加A处理、接头连接及纯化、继续扩增后得到片段长度为350～450bp的预文库；
将14种亚型高危型级别的HPV探针与预文库进行杂交，捕获目标产物，洗脱未杂交片段，进行第二轮PCR扩增和杂交，纯化处理后得到目标测序文库，并对目标测序文库进行测序；
3)生信分析：对接头序列，低质量序列和重复序列进行过滤，对过滤前后的序列质量进行评估，使过滤后的序列Q30大于80％，且序列长度大于100bp；将经过预处理的测序数据，与HPV病毒和人类基因组参考序列进行比对，从中识别出若干部分比对上HPV基因组且部分比对上人类基因组的嵌合体序列；针对所述嵌合体序列，按照在人类基因组上的位置进行局部聚类，将局部聚类的序列与参考基因组进行局部比对，根据局部比对结果识别出HPV整合到人基因组上的准确位置；
4)PCR Sanger测序验证。
进一步地，所述14种亚型高危型级别的HPV探针包括HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV66、HPV 68、HPV 73和HPV 82。
有益效果：
1、本发明设计采用可逆末端终止测序法对HPV DNA整合到人基因组片段测序，能检测到随机整合上去的位点，发现未知的整合区域，相比传统的分子生物学方法，一方面具备准确、灵敏度高、快速和低成本的优点，另一方面能降低检测假阴性，提高检出率；与此同时，针对高危型HPV DNA设计捕获探针，利用液相杂交基因捕获技术可以将目标区域相关基因片段富集，结合高通量测序技术，能够极大地降低人类基因测序、基因学研究及基因诊断的成本，提高测序深度，更精确地发现特定区域变异信息。
2、本发明设计的生物标志物能够辅助诊断人乳头瘤病毒阳性患者的宫颈癌及其癌前病变的情况，进而更有针对性的筛出HPV阳性患者及高风险人群，实现更早的发现和更及时的诊断，进一步提高治愈率和降低宫颈癌死亡率。
3、本发明设计的生物标志物对于检测人乳头瘤病毒HPV阳性患者宫颈病变的情况，具备重要的临床诊断意义。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明公开技术方案的一个技术目的是提供一种与宫颈癌前病变发生相关联的生物分子标志物，该生物分子标志物为HPV基因断裂后整合插入人基因组中形成的融合基因片段。具体的是采用来源于14种高危型级别的HPV基因M序列与来源于人基因组的N序列进行高频整合得到12个基因位点：具体的，本发明的N序列选自下述基因的序列或者基因间的序列：需要特别指出的是，在这些基因中，基因位点在这里指的N序列是位于这两个基因之间的序列。
在某些实施方案中，N序列选自E1、E2、E4、E5、E6、E7、intergenic、L1、L2、LCR、URR。
其中，整合位点如下：具体如表7、表8、表9所示；
DSCAM、PIBF1、CASZ1、(GRXCR1,LINC02383)、(LOC101928135,ARPP21)(LINC01550,C14orf177)、DCLK1、(NCOR2,SCARB1)、(MAU2,GATAD2A)、(HS3ST1,LINC02360)、(CASC11,MYC)、(CAPZB,LOC105378614)。
PCR扩增所述整合位点(CAPZB,LOC105378614)的上、下游引物序列如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示；
PCR扩增所述整合位点DSCAM的上、下游引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
PCR扩增所述整合位点PIBF1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
PCR扩增所述整合位点CASZ1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；
PCR扩增所述整合位点(GRXCR1,LINC02383)的上、下游引物序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；
PCR扩增所述整合位点(LOC101928135,ARPP21)的上、下游引物序列如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示；
PCR扩增所述整合位点(LINC01550,C14orf177)的上、下游引物序列如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示；
PCR扩增所述整合位点DCLK1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；
PCR扩增所述整合位点(NCOR2,SCARB1)的上、下游引物序列如SEQ ID NO.29和SEQID NO.30所示；
PCR扩增所述整合位点(MAU2,GATAD2A)的上、下游引物序列如SEQ ID NO.31和SEQID NO.32所示；
PCR扩增所述整合位点(HS3ST1,LINC02360)的上、下游引物序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；
PCR扩增所述整合位点(CASC11,MYC)的上、下游引物序列如SEQ ID NO.35和SEQID NO.36所示。
所述整合位点(CAPZB,LOC105378614)的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述整合位点DSCAM的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述整合位点PIBF1的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述整合位点CASZ1的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述整合位点(GRXCR1,LINC02383)的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述整合位点(LOC101928135,ARPP21)的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述整合位点(LINC01550,C14orf177)的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述整合位点DCLK1的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述整合位点(NCOR2,SCARB1)的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述整合位点(MAU2,GATAD2A)的序列如SEQ ID NO.10所示；
所述整合位点(HS3ST1,LINC02360)的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述整合位点(CASC11,MYC)的序列如SEQ ID NO.12所示。
实施例2
本实施例公开了上述实施例1描述的生物分子标志物在制备用于辅助诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒中的应用。
具体的，所述检测试剂盒包括生物分子标志物，还包括DNA提取试剂、建库试剂、PCR试剂和若干样品保存管。
其中，所述DNA提取试剂包括Buffer ACL、RNaseA、Proteinase K、Buffer WA、Buffer WB和Elution buffer；其中，所述DNA提取剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
所述PCR试剂包括DNA聚合酶、扩增缓冲液和双蒸水；
所述样品保存管为2mL EP管；
所述建库试剂包括ERABuffer、Ligation Buffer、Ligase、Hyb Human Block、RNase Block和Target Probes等，且其购自艾吉泰康生物科技(北京)有限公司。
实施例3
本实施例公开了上述实施例1描述的生物分子标志物的探究过程，具体的是与宫颈癌前病变发生相关联的HPV基因整合位点的筛选方法，且采用的样本为诊断为宫颈癌前病变且HPV阳性患者的宫颈上皮脱落细胞，具体筛选方法包括如下步骤：
1)基因组DNA提取：采用DNA提取试剂盒对上述样本进行DNA提取，本发明对DNA提取试剂和方法并无特殊要求，可以采用M.R.格林主编的《分子克隆实验指南》第四版DNA提取方法，也可采用商品化DNA提取试剂盒，本发明优选采用诺唯赞生产的Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒，提取好的DNA使用微量紫外仪测定浓度和纯度，且保证DNA浓度大于14.8ng/μL，纯度A260/A280大于1.5。
2)文库构建：文库构建采用Fast Library Prep Kit(for ILM)、TargetEnrichment Kit-Box1(for ILM)、Index&Ada-Block for ILM(PE2.0-8bp)、TargetProbes；
具体构建步骤如下：
2.1)DNA片段化处理：取步骤1)提取的DNA1000ng，计算其体积并用无酶水补足至100μL，转移至0.6mL离心管内，混匀后短暂离心，置于冰上待用；提前打开超声打断仪，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数ON 30s，OFF 30s为1个循环，每10个循环为一轮，共进行3轮，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，减少长片段残留，继续短暂离心后进行下一轮打断；得到200～300bp的相对均一长度的片段。
2.2)DNA片段末端修复和加A处理：取片段化后的样本200ng，计算其体积，用无酶水补足至35μL，然后转移至PCR管中；接下来将样本置于冰盒上并按照如下表1配置反应体系；
表1配置反应体系列表
组分 体积
DNA片段 35μL
PCR反应混合液 5μL
酶混合液 10μL
总体积 50μL
使用移液器吹打混匀上述反应体系，混匀时应尽量避免剧烈震荡，混匀结束后将PCR管放回冰盒上备用；
运行PCR程序，设置PCR仪参数如下表2，其中热盖温度85℃：
表2 PCR扩增仪参数列表
温度 时间 循环数
4℃ 1min 1
20℃ 30min 1
65℃ 30min 1
4℃ ∞ 1
程序运行完成后即可立即进行下步接头连接反应。
2.3)接头连接反应：按如下表3配置的反应体系进行接头反应，先将接头和上述PCR扩增反应结束的样品进行混合，然后加入剩余部分试剂混合液，同时，应尽量减少接头自连几率，并在冰盒上操作进行：
表3反应体系列表
组分 体积
样品 50μL
接头 5μL
无酶水 15μL
PCR反应混合液 20μL
连接酶 10μL
总体积 100μL
对于上述混合液进行轻轻吸打混匀数次，由底部吸出，贴壁打出，尽量避免产生气泡，然后短暂离心；
继续运行PCR扩增仪程序(要求无热盖)，设置PCR仪参数如下表4所示：
表4 PCR仪参数列表
温度 时间 循环数
20℃ 30min 1
4℃ ∞ 1
程序结束后，立即进行下步实验；
2.4)连接后的纯化：使用商品化的核酸纯化磁珠将上述扩增产物纯化至20μL体积。
2.5)Pre-PCR反应：提前至少30min从﹣20℃保存的试剂盒中取出PCR反应混合液、PCR扩增反应引物，置于冰盒上溶解，混匀后置于冰上待用；按照如下表5所示的配置反应体系在冰盒上进行下述操作；
表5反应体系列表
组分 体积
纯化后样品 20μL
PCR反应混合液 25μL
PCR扩增反应引物1 2.5μL
PCR扩增反应引物2 2.5μL
总体积 50μL
使用移液器轻轻吹打混匀上述反应体系，盖上光面PCR盖子，然后短暂离心；将样品置于PCR扩增仪上，启动PCR程序，具体控制条件如下表6：
表6 PCR程序列表
得到扩增产物；
2.6)PCR扩增后纯化
使用商品化的核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化得到范围为350～450bp的预文库片段；
2.7)探针杂交捕获
具体是采用RNA探针捕获技术，即含有14种亚型高危型别HPV探针，与上述预文库片段过夜反应，再让捕获磁珠与探针结合，洗脱文库复合物。对得到的捕获片段进行第二轮PCR扩增和探针杂交，最后纯化得到的DNA文库为捕获文库，即测序文库。
其中，对目标基因捕获采用艾吉泰康的Target Probes进行液相杂交捕获，用艾吉泰康的Target Enrichment Kit-Box1(for ILM)试剂盒完成捕获文库的构建；
富集过程中进行16个PCR循环，最后将质控合格的捕获文库使用Illumina公司的NextSeq platform进行双端(2×150bp)测序。
2.8)测序
将测序文库进行定量和质检，采用二代测序可逆末端终止测序法，即NGS法对HPVDNA整合进行测序，本发明所选测序平台并无限制，可以采用Illumina平台，也可以采用华大基因平台。本发明优选Illumina测序平台，因此选择符合Illumina测序平台建库要求的建库试剂盒，可选用市场商用建库试剂盒，在本发明中优选艾吉泰康生物科技(北京)有限公司生产的建库试剂盒Fast Library Prep Kit(for ILM)。
3)生信分析：首选数据预处理，下机数据中含有一些接头，低质量的,简单重复序列，需要对这部分序列进行质量控制。采用版本：0.20.1的fastp软件对接头，低质量和重复序列进行过滤，并对过滤前后的序列质量进行评估。保证过滤后的序列Q30大于80％，且序列长度大于100bp。
将经过预处理的测序数据，采用序列比对软件，将序列快速比对到HPV病毒和人类基因组参考序列上。同时针对那些不能完全比对上参考基因组的序列，需允许部分匹配。采用版本：0.7.17-r1188的BWA软件进行比对，对比对结果，采用版本：1.7的samtool的软件转换成bam格式，排序和建立index。并采用版本：2.18.29的Picart软件去掉重复的序列。
将经过预处理的测序数据，与HPV病毒和人类基因组参考序列进行比对，从中识别出若干部分比对上HPV基因组且部分比对上人类基因组的嵌合体序列；针对所述嵌合体序列，按照在人类基因组上的位置进行局部聚类，将局部聚类的序列与参考基因组进行局部比对，根据局部比对结果识别出HPV整合到人基因组上的准确位置；
本发明优选采用版本：5.0c的snpEff软件对整合位点附近的基因进行注释。
人乳头瘤病毒基因整合分析软件主要依赖的人乳头瘤病毒基因组序列和人基因组序列，以及基因的位置信息。
4)PCR Sanger测序验证：
使用表7设计的引物，PCR反应总体积50μL，包括25μL的 Master Mix，2μL正反向引物，模板DNA以及纯水。PCR扩增条件：95℃，30s、95℃，5s，25个循环、60℃，20s、72℃，72℃、72℃，5min。将扩增后得到的PCR产物送至武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。并对测序结果进行Blast比对确定整合位点。如下表格所示；
表7 HPV DNA整合位点
结合上述表7可知，通过对人基因组与HPV的整合位点、整合基因进行验证，可以判定宫颈癌前病变程度，这对于检测人乳头瘤病毒HPV阳性患者宫颈病变的情况，具备重要的临床诊断意义。
表8 HPV DNA高频整合位点序列
/>
/>
表9高频整合位点验证引物序列
/>
综上所述，本发明设计采用可逆末端终止测序法对HPV DNA整合到人基因组片段进行测序，检测出随机整合上去的位点，发现未知的整合区域，进一步辅助诊断人乳头瘤病毒阳性患者的宫颈癌及其癌前病变的情况，进而更有针对性的筛出HPV阳性患者及高风险人群，实现更早的发现和更及时的诊断，进一步提高治愈率和降低宫颈癌死亡率。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 与宫颈癌前病变发生相关联的生物标志物及其应用
<141> 2021-12-29
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 845
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tttatatgtc tgtatgtgct tgtatgtgct tgtaaatatt acgttgtatg tgtgtttgta 60
tgtatggtat aataaacatg tgtgtatgtg tttttcactg cttgtgtaac tattgtgtca 120
tgcaacataa ataaacttat tgtttcaaca cctactaatt gtgttgtggt tattcattgt 180
atataaacta tatttgctac atcctgtttt tgttttatat atactatgtt ttgtagcgcc 240
agcggccatt ttgtagcttc aaccgaattc ggttgcatgc tttttggcac aaaatgtgtt 300
tttttaaata gttctatgtc agcaactata gtttaaactt gtacgtttcc tgcttgccat 360
gcgtgccaaa tccctgtttt cctgacctgc actgcttgcc aaccattcca ttgtttttta 420
cactgcacta tgtgcaacta ctgaatcact atgtacattg tgtcatataa aataaatcac 480
tattgttaag ctgtatttat gttttctttt gagatggggt caagctctgt tgctcaggct 540
gaagtgcagt ggcgtgatca taactcattg caaccttgaa ctcttttact caagcaatcc 600
tctggactca gcctcccaag tagctgagac tacagcaact cgtcaccaca cctgactaat 660
ttttaattaa ttaatgtatt tattattatt attttttgag gcagggtctc attctgtcac 720
ccaggcagga gtgctgtgat gtgatgtgat cacggcttat tgcagcctca acctccggtt 780
caagctatcc tcccttctcc aagctatcct cccgcctctt tttttgattt ttttgtagag 840
acaag 845
<210> 2
<211> 418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caattgccaa gctaaatatt taaaagattg tgccacaatg tgcaaacatt ataggcgagc 60
ccaaaaacga caaatgaata tgtcacaatg gatacgattt agatgatacg atttagtcgg 120
gctatggaat gagttgtgtg ggaaccagga gaacagggct tacctttcac ggtcacgtgg 180
acgctctggc tggtggagag ttgtggttga accaacacgt tgcacgtgta ctccccctcg 240
tccacttcct tttgcacatc tgaaagttta agagttccat tgttctcaaa tgccacttgg 300
cggtggttga aaggaagcag gttagagttc ttgtaccatt taatggagta atacggatag 360
ccaatcacac gacagtgaat gtatgtgtcc cgtcctgcta ttgctgtgat gtttttca 418
<210> 3
<211> 340
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggcgggtgcc tgtaatccca gctactcggg aggctgagac agaagaactg tctgaacctg 60
gaaggcggag gctgcagtga gcagagatta cgccactgca ctccagcctg ggcaacaaag 120
caagactccg tctcaaaaaa acaaacaaac aaaatgtcaa tagtggttga aaaacctgga 180
catacacaat tcctagtgtg cccacactat cgtctactat gtcattatcg taggcccatt 240
gtaccatctg tgataattca aatgtacaat cattaaaact atgttgtaat actgtttgtc 300
tttgtatcca ttctggcgtg tctccataca cttcactaat 340
<210> 4
<211> 402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgtagtacag cagcagcatt atattggtat aaaacaggta tgtcaaatat tagtgaagtg 60
tatggagaca cgccagaatg gatacaaaga caaacagtat tacaacatag ttttaatgat 120
tgtacatttg aattatcaca gatggtacaa tgggcctacg ataatgacat agtagacgat 180
agtgtgggca cactaggaat tgtgtatgtc caggtttttc aaccactatt gacattttgt 240
ttgtttgttt ttttgagacg gagtcttgct ttgttgccca ggctggagtg cagtggcgta 300
atctctgctc actgcagcct ccgccttcca ggttcagaca gttcttctgt ctcagcctcc 360
cgagtagctg ggattacagg cacccgccac cacgcccagc tg 402
<210> 5
<211> 449
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agaaaaatat agtaaaaata aagtatggga agttcatgcg ggtggtcagg taatattatg 60
tcctacatct gtgtttagca gcaacgaagt atcctctcct gaaactatta ggcagcactt 120
ggccaaccac tccgccgcga cccataccaa agccgtcgcc ttgggcacca aagaaacaca 180
gacgactatc cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa 240
gttgctgcac agagactcag tggacagtgc tccaatcctc cttttcccct cttgatccac 300
accttgtgtt tgaataggag ctcatgatca tgtgcccaag gctcttcccc gtttttgtcc 360
ctctcaattc tcccagcttc tgtgtgagca ggtgtgatca ctccatcttc tagacccgta 420
gggccatagg tgccctatgg ccagagata 449
<210> 6
<211> 226
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
caataaatca caggtttttt gtattgtatg tatttgtgtg ttatatataa tggttgccca 60
ccgggcacgc agacgtaagg ggtagagatt ttcacttttg tggttatctt ctagatcttg 120
taggcataat ttattcttta tggattaaag atttaaatgt tagacctaaa accataaaca 180
ccctagaaga aaacctaggc attaccattc aggacatatg catggg 226
<210> 7
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gttcaattcc cacctatgag tgagaatatg cggtgtttgg ttttttgttc ttgtgatagt 60
ttactgagaa tgatgatttc caatttcaat tttagcatca tataatttcc tgcataattg 120
tttaaatgtc ctccccttcc tgta 144
<210> 8
<211> 398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cctctgaagt gcacgattag gagagaagaa gttcctctgt cttggtcact tttgcttctc 60
aggtagagta gctcctctgg aaacccctgc ctaatgaagg aaacctggca gggcacacct 120
gctgtccaaa gtcccttact gagagcaaac gtcagtctca ctacatctgt gtttagcagc 180
aacgaagtat cctctcctga aactattagg cagcacttgg ccaaccactc cgccgcgacc 240
cataccaaag ccgtcgcctt gggcaccaaa gaaacacaga cgactatcca gcgaccaaga 300
tcagagccag acaccggaaa cccctgccac accactaagt tgctgcacag agactcagtg 360
gacagtgctc caatcctcac tgcatttaac agctcaca 398
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cttccaaggt tccatgggta tggcttataa tgtgtctctg acataaaagc tatatgcata 60
gaaaataaca gtaaaacagc aaaacgaaga ctctttgaac ttccagacag cgggtatggc 120
aatactgaag tggaaacgca gcagatggta 150
<210> 10
<211> 471
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
attcactatc atatgtaagt gtaacaattg cacttttatg ttttacatta tgtcctgtcc 60
aatgccatgt agacgacact gcagtataca atttacaatg ctttttaaat ctatatctta 120
aacattttaa agtattagca tcacctttta aatgtactat gggtgtagtg ttactattac 180
agttaatccg tcctttgtgt gagctgttaa atgcagtgag gattggagca ctgtccactg 240
agtctctgtg cagcaactta gtggtgtggc aggggtttcc ggtgtctggc tctgatcttg 300
gtcgctggat agtcgtctgt gtttctttgg tgcccaaggc gacggctttg gtatgggtcg 360
cggcggagtg gttggccaag tgctgcctaa tagtttcagg agaggatact tcgttgctgc 420
taaacacaga tgtaggacat aatattacct gaccacccgc atgaacttcc c 471
<210> 11
<211> 473
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tagagtgtgc tttcaggagt ttaattactc tctctggtat aaattcctta ttttcaaaac 60
tgggccactt ggtctcactt tgttatttgt tactattgtt aatagtcaaa tacatttttc 120
agacattaaa tttcccagct acagaagttc tttcctctat atcttaaaca ttttaaagta 180
ttagcatcac cttttaaatg tactatgggt gtagtgttac tattacagtt aatccgtcct 240
ttgtgtgagc tgttaaatgc agtgaggatt ggagcactgt ccactgagtc tctgtgcagc 300
aacttagtgg tgtggcaggg gtttccggtg tctggctctg atcttggtcg ctggatagtc 360
gtctgtgttt ctttggtgcc caaggcgacg gctttggtat gggtcgcggc ggagtggttg 420
gccaagtgct gcctaatagt ttcaggagag gatacttcgt tgctgctaaa cac 473
<210> 12
<211> 460
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gggaggttgc ctgctctctg ccagtctgta ccccaccgtc ccacccccac gcctcccaca 60
cggagttccc aatttctcag ccaggtttca gaagagacaa atcccctttg cgccctgtgg 120
cgccggtttg caacagtctc gggctgccgg gtttgggaga aatcaaaggt gctagacggg 180
agaatatggg aggggcaggg ggtacccgaa ccgcgggacc ggacttccta aaaggggcaa 240
gtggagagct tgtggaccga gccgggggag tcagcagaga cccttgtgaa aaaatccctg 300
ttttcctgac ctgcactgct tgccaaccat tccattgttt tttacactgc actatgtgca 360
actactgaat cactatgtac attgtgtcat ataaaataaa tcactatgcg ccaacgcctt 420
acataccgct gttaggcaca tatttttggc ttgttttaac 460

Claims (5)

1.一种引物在制备用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒中的应用，其特征在于：
所述引物用于扩增如下12个基因位点：
CAPZB和LOC105378614、DSCAM、PIBF1、CASZ1、GRXCR1和LINC02383、LOC101928135和ARPP21、LINC01550和C14orf177、DCLK1、NCOR2和SCARB1、MAU2和GATAD2A、HS3ST1和LINC02360、CASC11和MYC；
其中，CAPZB和LOC105378614的上、下游引物序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；
DSCAM的上、下游引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
PIBF1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
CASZ1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；
GRXCR1和LINC02383的上、下游引物序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；
LOC101928135和ARPP21的上、下游引物序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
LINC01550和C14orf177的上、下游引物序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；
DCLK1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；
NCOR2和SCARB1的上、下游引物序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；
MAU2和GATAD2A的上、下游引物序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；
HS3ST1和LINC02360的上、下游引物序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；
CASC11和MYC的上、下游引物序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：
所述12个基因位点为人基因组N序列与14种高危型HPV基因的M序列进行高频整合得到；
各所述基因整合位点的序列如下：
所述基因整合位点CAPZB和LOC105378614的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因整合位点DSCAM的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述基因整合位点PIBF1的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述基因整合位点CASZ1的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述基因整合位点GRXCR1和LINC02383的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述基因整合位点LOC101928135和ARPP21的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述基因整合位点LINC01550和C14orf177的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述基因整合位点DCLK1的序列如SEQ ID NO.8所示；
所述基因整合位点NCOR2和SCARB1的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述基因整合位点MAU2和GATAD2A的序列如SEQ ID NO.10所示；
所述基因整合位点HS3ST1和LINC02360的序列如SEQ ID NO.11所示；
所述基因整合位点CASC11和MYC的序列如SEQ ID NO.12所示。
3.一种用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1～2中任一项所述的引物。
4.根据权利要求3所述用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、建库试剂、PCR试剂和若干样品保存管。
5.根据权利要求4所述用于诊断宫颈癌前病变的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括Buffer ACL、RNaseA、Proteinase K、Buffer WA、Buffer WB和Elution buffer；
所述PCR试剂包括DNA聚合酶、扩增缓冲液和双蒸水；
所述样品保存管为2mL EP管；
所述建库试剂包括ERA Buffer、Ligation Buffer、Ligase、Hyb Human Block、RNaseBlock和Target Probes。
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