CN111154880A - 一种膀胱癌新型体液活检生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组辅助诊断膀胱癌的体液生物标志物，该生物标志物为SNP位点rs1485891776、rs3764324和/或rs1488782245。本发明通过SNP基因型诊断试剂和诊断试剂盒的研制和应用，可使得膀胱癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础。

Description

一种膀胱癌新型体液活检生物标志物及其应用

技术领域

本发明专利涉及到一种癌症标志物，具体的涉及膀胱癌新型体液活检生物标志物及其应用。

背景技术

膀胱癌是全球发病第9位的常见恶性肿瘤，发病率仅次于肺癌，在死亡方面位居第13位。膀胱癌的大多数组织学类型为尿路上皮癌，可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)或肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。约75％的新诊断患者为NMIBC，复发率高，5年生存率达90％，MIBC患者5年生存率为50％且50％发生转移，5年生存率仅为5％。目前临床上对于高级别浸润性膀胱癌无理想疗法，可用的方法包括根治性膀胱切除术和化疗，但预后差。膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜检查及组织病理活检，但膀胱镜检查为创伤性检查，对患者伤害较大，易引起疼痛、血尿等并发症，花费多，也难以实现肿瘤的早期诊断和疗效的实时监控，因此其临床应用有限。一般通过组织病理活检发现膀胱肿瘤基因异常，但由于肿瘤的异质性，部分组织活检或许不能代表侵袭性最强的亚群。尿细胞学检查是检测膀胱癌的非侵入性方法，为临床常用的诊断方法，但其存在主观性较强、对于恶性程度低的肿瘤不够敏感并且依赖于操作等缺点。以上方法均有自己的局限性，因此寻找膀胱癌的特异检测标志物迫在眉睫。

近年来，随着对液体活检的研究不断深入，为肿瘤的研究提供了一个新的方向，发现液体活检在肿瘤研究中有重要意义，液体活检采取癌症患者体液(尤其是血液或尿液)来检测其中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、循环游离DNA(cfDNA)(包括循环肿瘤DNA，ctDNA)及外泌体等特异性肿瘤标志物并对癌症做出早期诊断，因其可实时监控肿瘤患者疾病状况而迅速成为临床关注的焦点，具有无创、易重复等优点，能检测出与肿瘤靶向治疗或治疗抵抗有关的基因改变，可动态评估特定分子标志物，未来液体活检在肿瘤的制定个体化治疗方案、监测疗效、判断预后等方面具有潜在的应用前景。而且血标本和尿标本是无创的，相对容易获得，使得此项研究更具有临床应用价值。

CTCs最早是在1869年由Ashwort提出，现在CTCs普遍定义为从实体瘤或者转移灶脱落因自行脱落或者诊疗操作而进入患者外周血的肿瘤细胞，也称为肿瘤微小转移灶或者循环上皮细胞。小部分进入外周血不被机体的免疫系统识别并且清除的CTCs能够通过黏附和聚集形成极小的癌栓，侵出血管透过基底膜，在远处器官形成转移灶。恶性肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的重要原因，越来越多的分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现。目前肿瘤的发现和诊断临床上仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志的监测，难以早期发现肿瘤的转移或复发，也难以及时反映疗效。近年来许多研究结果证实，存在于外周血中的CTCs在肿瘤转移过程中发挥着重要作用，其检测技术的出现，对早期发现肿瘤微转移、评估预后和疗效以及肿瘤的个体化治疗具有重要意义。有研究显示，上皮来源的恶性消化系肿瘤，如胰腺癌、结肠癌、肝癌和胃癌等患者的外周血中都可以检测到CTCs，并且CTCs的数量、形态和动态变化能够反映肿瘤的进展和治疗效果。

循环游离DNA(cfDNA)，也叫游离DNA，是指循环血浆或血清、脑脊液、滑膜液中，游离于细胞外的DNA片段。含量非常稀少，常为双链，片段较短，大约在160-180bp之间，来源于正常或者肿瘤细胞。其中来自肿瘤患者的肿瘤细胞由于非程序性死亡而释放的DNA，为循环肿瘤DNA(ctDNA)。一般认为，凋亡和坏死的肿瘤细胞通常被巨唾细胞或其他清道夫细胞吞噬，吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞可以主动地释放消化了的DNA。多种肿瘤患者ctDNA含量高于健康人，研究表明，一个携带100g肿瘤，约相当于3×1010个肿瘤细胞的患者，每天约有高达3.3％的肿瘤细胞释放入外周血。可见，定量检测ctDNA为指标来反映肿瘤的存在和严重。通过对肿瘤患者ctDNA的定量检测及特征性的基因检测为临床肿瘤的早期诊断、预后监测及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、敏感、特异、微创的分子生物学检测手段。

由于ctDNA在血浆或血清中含量稀少，对于检测它的技术要求较高，较常用的如分光光度法，实时荧光定量PCR(qPCR)等检测方法由于准确性较差，无法实现绝对定量等问题，因此我们使用近年来兴起的数字PCR(Digital PCR)来定量检测ctDNA，数字PCR是一种绝对定量技术。目前，国内外使用数字PCR定量检测患者血浆中的ctDNA鲜有报道，我们实验室已经建立数字PCR定量检测血浆中ctDNA的方法，稳定可靠，具有可重复性。

目前，ctDNA无创检测是临床上的研究热点，对ctDNA进行基因组变异和相关临床分析，于肿瘤早筛、用药和预后而言都是非常有意义的。ctDNA作为肿瘤标志物的研究还处于初步阶段，迄今研究的肿瘤种类还很少，ctDNA中的基因组变异研究的很少，国内未见膀胱癌的研究报道。ctDNA基因组变异比组织更具有特异性，且ctDNA可直接从血液和尿液标本中分离出来，凭借其在体液中半衰期短的特点，ctDNA可实时反映肿瘤的动态变化，还能消除组织检测中肿瘤异质性的缺陷，因此，ctDNA可作为膀胱癌新型体液活检生物标志物，也为基因治疗提供了新靶点。本项目旨在筛选出在膀胱癌诊断和预后中有临床应用价值的ctDNA基因组变异，为研究液体活检基因突变这一新的分子标志物在膀胱癌无创性诊断、预后和治疗监测中开辟一条新的途径，同时也为进一步阐明膀胱癌的发病机制提供实验基础和理论研究数据。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种辅助诊断膀胱癌的生物标志物在制备膀胱癌辅助检测或诊断的产品中的应用，其特征在于，该生物标志物选自如下组的SNP：rs1485891776、rs3764324或rs1488782245。

优选地，所述生物标志物为rs1485891776。

优选地，所述生物标志物为rs3764324。

优选地，所述生物标志物为rs1488782245。

优选地，所述生物标志物为rs1485891776、rs3764324和rs1488782245的组合。

优选地，所述产品包括用于扩增所述SNP位点的引物。

优选地，所述引物序列为：

本发明还提供了一种检测如下SNP位点的引物在制备膀胱癌辅助检测或诊断的试剂盒中的应用，所述SNP选自如下组的：rs1485891776、rs3764324或rs1488782245。

优选地，其中引物序列如SEQ ID NOs：1-6所示。

优选地，其中所述试剂盒还包括dNTPs，双蒸水，Taq酶。

还提供了所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：

(1)收集待测个体的血液标本；

(2)提取循环肿瘤DNA；

(3)使用针对所述SNP位点的引物进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，确定SNP位点的类型。

优选地，其中提取循环肿瘤DNA的步骤如下：

A.血浆的分离与保存

采用两步离心法，将血浆分离并保存：使用真空抗凝采血管采集样本，采集后及时将采血管轻微地颠倒混匀8次在4℃下低温冷却低速离心机，将采血管经1600g离心15min，回收上清血浆转移至2.0mL EP管并提前置于冰盒上编号，将冰盒上2.0mL EP管中放入冷却好的低速离心机中，经16000g离心10min，回收上清血浆并分批送入冰盒上的2.0mL EP管中，编号后迅速保存至-80℃冰箱直到游离DNA提取；

B.ctDNA纯化提取

a.在两个1.5mL离心管中分别加入20μL蛋白酶K储存液和200μL相同血浆样本，然后分别加入200μL缓冲液，经旋涡振荡15秒后在56℃下水浴10min；

b.在两管中加入320μL无水乙醇，混匀；

c.在2mL离心管中置核酸纯化柱，加入步骤2中的一管混合液，12000rpm离心30s后弃掉滤液，回置同一纯化柱，加入步骤2的另一管混合液，再次弃掉滤液并回置纯化柱，在纯化柱中加入500μL含无水乙醇的洗脱液，重复离心后弃掉滤液，在柱中加入700μ1洗脱液，重复离心，弃掉滤液后回置核酸纯化柱，14000rpm离心1min；

d.保留核酸纯化柱，将其放入试剂盒提供1.5mL离心管中，在纯化柱膜的中间加入经56℃预热的25-30μ1Buffer TE，室温静置1分钟后12000rpm离心30s；

e.弃掉纯化柱，洗脱的血浆游离核酸可立即用于PCR或RT-PCR检测，或在-20℃下储血浆游离核酸备用。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明开发了新的膀胱癌体液活检生物标志物，之前未有关于该新型标志物的报道。本发明的提出，为膀胱癌的快速诊断提供了新途径。

(2)本发明以ctDNA为检测对象，具有灵敏度高的优势，ctDNA在10pg以上都可以进行检测。采用本发明的膀胱癌检测方法，抽取5-10mL外周血液，通过对ctDNA的突变分析，快速完成膀胱癌的预测，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响。

附图说明

图1为本发明的临床病例标本检测分析流程图。

图2为本发明的3个SNP位点的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1膀胱癌循环肿瘤DNA基因组变异的筛选

筛选流程参见图1，具体步骤如下：

(1)循环肿瘤DNA基因组变异的筛选

①标本收集：

收集不同病理类型膀胱癌患者治疗前、后及治疗后不同阶段血液标本100例，详实的记录受检者的临床资料包括年龄、性别、组织病理类型、分级、实验室检查、各种影像学检查、疾病进展以及患有其他疾病情况等。组织学分类采用2016年《WHO泌尿系统及男性生殖器官肿瘤分类》分类标准(第4版)对膀胱癌进行组织病理学分类：尿路上皮(移行细胞)癌、鳞状细胞癌和腺癌。

同时收集年龄性别与膀胱癌病例组相匹配的非癌症正常人的血液标本78例。

②循环肿瘤DNA的提取：

优化后的提取步骤如下：

A.血浆的分离与保存

采用两步离心法，将血浆分离并保存：使用真空抗凝采血管采集样本，采集后及时将采血管轻微地颠倒混匀8次在4℃下低温冷却低速离心机，将采血管经1600g离心15min，回收上清血浆转移至2.0mL EP管并提前置于冰盒上编号，将冰盒上2.0mL EP管中放入冷却好的低速离心机中，经16000g离心10min，回收上清血浆并分批送入冰盒上的2.0mL EP管中，编号后迅速保存至-80℃冰箱直到游离DNA提取。

B.ctDNA纯化提取

a.在两个1.5mL离心管中分别加入20μL蛋白酶K储存液和200μL相同血浆样本，然后分别加入200μL含CarrierRNA的BufferVL，经旋涡振荡15秒后在56℃下水浴10min。

b.在两管中加入320μL无水乙醇，混匀。

c.在2mL离心管中置核酸纯化柱，加入步骤2中的一管混合液，12000rpm离心30s后弃掉滤液，回置同一纯化柱，加入步骤2的另一管混合液，再次弃掉滤液并回置纯化柱，在纯化柱中加入500μL含无水乙醇的BufferWA，重复离心后弃掉滤液，在柱中加入700μ1BufferWA，重复离心，弃掉滤液后回置核酸纯化柱，14000rpm离心1min。

d.保留核酸纯化柱，将其放入试剂盒提供1.5mL离心管中，在纯化柱膜的中间加入经56℃预热的25-30μ1Buffer TE，室温静置1分钟后12000rpm离心30s。

e.弃掉纯化柱，洗脱的血浆游离核酸可立即用于PCR或RT-PCR检测，或在-20℃下储血浆游离核酸备用。

③循环肿瘤DNA基因变异的初筛：

将上述步骤提取的循环肿瘤DNA扩增后进行二代测序，检测基因组变异，分析数据，筛选出与对照组差异显著的基因突变。

④循环肿瘤DNA基因变异的验证：

运用数字PCR技术对初筛的ctDNA基因组变异进行一一验证。数字PCR技术是一种新的核酸检测和定量方法，采用“分而治之”的策略，将一个标准PCR反应分配到数量众多的、纳升级的反应器中，在每个反应器中包含0、1或者多个拷贝的目标分子，进行“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，对每个反应器的荧光信号进行计数统计和分析，最终根据泊松分布原理及阳性反应器的个数与比例，计算出原始样本中的模板拷贝数。这种检测方式具有比传统PCR更出色的灵敏度和特异性、精确性，可以实现真正意义上的绝对定量。

⑤统计学分析

数据的统计学分析采用SPSS18.0软件进行，使用PASS软件计算诊断、预后所需临床样本量，采用单因素方差分析进行组间比较，相关性分析采用Spearman rankcoefficient test检验法。

结果：对二代数据进行深度加工和生物信息学序列比对，确定出“膀胱癌”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的70个SNP位点为优选敏感级位点，经过后期的数字PCR技术验证后，选取被证实的8个突变位点进行基因型频率分布分析，分析后发现3个值得关注的SNP位点：位点1：位于TERT基因上的突变位点rs1485891776(G>A)，位点2：位于NRK基因上的突变位点rs1488782245(C>T)；位点3：位于FUS基因上的突变位点rs3764324(T>A)。其中，位点rs1485891776的A等位基因的频率在病例组显著高于正常对照组(P＝0.006)，Logistic回归分析显示，与GG基因型比较，经年龄和性别等因素校正后，携带变异AA及AG基因型的个体患膀胱癌的风险显著增加，携带A等位基因的个体患膀胱癌风险是G等位基因个体者的1.51倍(95％CI为1.13～1.75，p＝0.008)。位点rs1488782245的C等位基因的频率在病例组显著高于正常对照组(P＝0.009)，Logistic回归分析显示，与TT基因型比较，经年龄和性别等因素校正后，携带变异CC及CT基因型的个体患膀胱癌的风险显著增加，携带C等位基因的个体患膀胱癌风险是G等位基因个体者的1.47倍(95％CI为1.04～1.65，p＝0.002)。位点rs3764324的A等位基因的频率在病例组显著高于正常对照组(P＝0.01)，Logistic回归分析显示，与TT基因型比较，经年龄和性别等因素校正后，携带变异AA基因型的个体患膀胱癌的风险显著增加，携带A等位基因的个体患膀胱癌风险是T等位基因个体者的1.35倍(95％CI为1.38～2.15，p＝0.007)。

实施例2膀胱癌循环肿瘤DNA基因组变异的临床应用价值评估

为了验证3个突变位点的可靠性，采用不同于实施例1中的病例样本，进行如下实验：

1、提取另外58例膀胱癌患者的循环肿瘤DNA作为样品，并采用常规PCR扩增获得3个SNP位点的产物，对扩增产物纯化后进行测序。扩增时使用如下引物：

表1引物序列

PCR反应体系如表2所示。

表2PCR扩增体系

PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻。

2、测序

PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化，并上样测序。

3、数据分析

用SPSS软件对测序后的结果进行分析，并进行ROC曲线的绘制及曲线下面积的计算和分析，各指标AUC的比较采用单一变量的Z检验，P<0.05被认为差异具有统计学意义；各指标的Cut-off值确立采用函数法，“敏感度+特异性”取最大值时所代表的诊断界值即为Cut-off值，依据此值及金标准(病理诊断结果)计算临床诊断性能评价指标(敏感性，特异性)。采用Kalpan-Meier生存分析法，对单因素方差分析中P<0.05者进行COX回归多因素模型分析。

结果发现：依据ROC曲线计算出的曲线下面积分别为，AUC rs1488782245：0.822，AUC rs3764324：0.869，AUC rs1485891776：0.913，三者的诊断性能比常用的膀胱癌血清肿瘤标记物CA19-9和CK19的AUC显著优异(p＝0.006)(其中AUC _CA19-9：0.782，AUC _CK19：0.809)，rs1485891776的诊断性能最优。同时使用三个SNP位点进行诊断，赋予诊断更高的灵敏度和特异性。

实施例3用于膀胱癌辅助诊断的SNP试剂盒

基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增所述3个SNP位点的特异性引物，所述试剂盒还有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再辅助判断膀胱癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断。

Claims (10)

1.一种辅助诊断膀胱癌的体液生物标志物在制备膀胱癌辅助检测或诊断的产品中的应用，其特征在于，该生物标志物选自如下组的SNP：rs1485891776、rs3764324或rs1488782245。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为rs1485891776。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为rs1485891776、rs3764324和rs1488782245的组合。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括用于扩增所述SNP位点的引物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物序列为：

6.一种检测如下SNP位点的引物在制备膀胱癌辅助检测或诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述SNP选自如下组的：rs1485891776、rs3764324或rs1488782245。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，其中引物序列如SEQ ID NOs：1-6所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，其中所述试剂盒还包括dNTPs，双蒸水，Taq酶。

9.一种如权利要求6或7中所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：

(1)收集待测个体的血液标本；

(2)提取循环肿瘤DNA；

(3)使用针对所述SNP位点的引物进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，确定SNP位点的类型。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中提取循环肿瘤DNA的步骤如下：

A.血浆的分离与保存

采用两步离心法，将血浆分离并保存：使用真空抗凝采血管采集样本，采集后及时将采血管轻微地颠倒混匀8次在4℃下低温冷却低速离心机，将采血管经1600g离心15min，回收上清血浆转移至2.0mL EP管并提前置于冰盒上编号，将冰盒上2.0mL EP管中放入冷却好的低速离心机中，经16000g离心10min，回收上清血浆并分批送入冰盒上的2.0mL EP管中，编号后迅速保存至-80℃冰箱直到游离DNA提取；

B.ctDNA纯化提取

a.在两个1.5mL离心管中分别加入20μL蛋白酶K储存液和200μL相同血浆样本，然后分别加入200μL缓冲液，经旋涡振荡15秒后在56℃下水浴10min；

b.在两管中加入320μL无水乙醇，混匀；

c.在2mL离心管中置核酸纯化柱，加入步骤2中的一管混合液，12000rpm离心30s后弃掉滤液，回置同一纯化柱，加入步骤2的另一管混合液，再次弃掉滤液并回置纯化柱，在纯化柱中加入500μL含无水乙醇的洗脱液，重复离心后弃掉滤液，在柱中加入700μ1洗脱液，重复离心，弃掉滤液后回置核酸纯化柱，14000rpm离心1min；

d.保留核酸纯化柱，将其放入试剂盒提供1.5mL离心管中，在纯化柱膜的中间加入经56℃预热的25-30μ1Buffer TE，室温静置1分钟后12000rpm离心30s；

e.弃掉纯化柱，洗脱的血浆游离核酸可立即用于PCR或RT-PCR检测，或在-20℃下储血浆游离核酸备用。

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