CN107858425A - miRNA‑4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法 - Google Patents

miRNA‑4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及循环MiRNA‑4741表达量的检测及其用于肝癌患者诊断及预后的判断。通过对已经确诊为肝癌患者的血清中循环miRNA的种类进行高通量的筛查，并与健康体检者血清中相应miRNA进行比较，找到表达量较高的MiRNA‑4741作为该实验的目标标记物。MiRNA‑4741的表达水平明显高于对照组P＝0.001。ROC曲线分析显示MiRNA‑4741鉴别正常人与肝癌患者的效能AUC＝0.765，灵敏度为75.4％，特异度为66.7％。生存曲线分析显示，表达量越高生存期限越短，相反，表达量越低生存期限越长。

Description

miRNA-4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，涉及一种MiRNA-4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法。
背景技术
肝癌是消化系统常见恶性肿瘤，其死亡率在所有癌症患者中排第三位，并且其五年生存率仅为7％，好发于50-60岁人群，具有高度侵袭性、高度转移、病死率高的特点。病因主要包括：乙型病毒性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等，肝癌的发生最主要的是与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。目前较为有效的方法主要是手术及肝移植治疗，但是通常在肝癌早期无特异性症状，一旦发现则进入晚期，进而失去手术时期。目前HCC患者早期手术切除的5年生存率不到80％，肝移植后的5年生存率只有70％左右，而经皮射频消融术后5年生存率仅有50％，因此寻找新的、灵敏度高的诊断方法，对肝癌的早期诊治和疗效分析尤为重要。
甲胎蛋白(AFP)是目前使用最为广泛的诊断肝癌的肿瘤标志物，但是AFP仍存在诊断误区，例如部分肝癌患者的AFP呈阴性或轻度升高。并且在其他肝脏疾病例如肝炎、肝硬化中，AFP同样也会升高。
MicroRNA是一类内源性、非编码、具有调控功能的小分子RNA，通过识别结合目标mRNA而影响目标mRNA的降解或翻译，从而影响目的蛋白的表达。MicroRNA存在各种体液中如血液、尿液、眼泪等，并且能在其中稳定表达。近年来肝癌的分子生物学研究取得极大的突破，分子通路研究及靶向治疗已成为一大热潮。miRNA在肿瘤发生中的作用主要在于3个方面:1)有些miRNA在正常组织表达下调，在肿瘤组织表达上调，可能起着癌性miRNA的作用；2)有些miRNA则在正常组织表达上调，在肿瘤组织表达下调，可能起着抑癌miRNA的作用；3)一些致癌病毒编码的miRNA也可能参与相关肿瘤的发生。其介导肿瘤生物学调控作用机制主要是：一部分miRNA抑制靶基因的表达，作用于各种引起细胞增殖分化的基因；另一部分miRNA类似于抑癌基因，其在肿瘤细胞中的降低，或功能缺失后引起细胞的恶性转变。检测相关miRNA不仅可以优化肿瘤诊断和个体化治疗，而且可以作为判断疾病预后的工具。
综上，异常表达的microRNA对于肝癌的发生有着重要意义，可为肝癌诊断提供重要依据，可弥补AFP的不足，提高肝癌诊断的灵敏度与特异度。
发明内容
本发明的一个方面涉及miRNA-4741作为原发性肝癌的诊断标志物的用途，所述miRNA-4741的碱基序列为CGGGCUGUCCGGAGGGGUCGGCU。
本发明的另一个方面涉及miRNA-4741用于制备肝癌预后判断试剂的用途。
本发明还提供了一种检测血清样本中miRNA-4741水平的方法，该方法包括：1)采集血浆样本；2)提取样本中总的RNA；3)以提取的RNA为模板合成cDNA；4)使用miRNA-4741引物QIAGEN，218300-MS00039557，miRNA-39引物QIAGEN，218300-MS00019789进行RT-qPCR反应，获得待测血清标本中miRNA-4741的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，即CT值；
5)以microRNA39作内参计算出该削减样本的CT值，根据公式(ΔCT＝CTmiRNA-4741–CTreference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4741的表达水平△CT，
其中CTmiRNA-4741是指肝癌患者血清标本中miRNA-4741的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CTreference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
所述方法优选进一步包括：
6)根据以下公式，计算出待测样品与正常人的△CT差异：
△△CT＝待测样品中目的基因△CT–正常人目的基因△CT，其中正常人目的基因△CT是根据以上公式计算出的正常人的miRNA-4731-3p的表达水平，以2-△△CT值进行目的基因相对定量。
在上述方法中使用用QIAzol Lysis Reagent提取RNA，使用步骤2)获得的Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-free water、miScript Reverse transcription Mix合成cDNA，使用QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4741miScipt Primer Assay、RNase-free water、以上合成的Template cDNA进行PCR反应。
本发明进一步提供了一种用于检测血浆样本中miRNA-4741水平的试剂盒，其包括：RNA提取试剂；cDNA合成试剂；PCR反应试剂、miRNA-4741特异性引物。
进一步，RNA提取试剂为QIAzol Lysis Reagent；cDNA合成试剂为Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-free water、miScriptReverse transcription Mix；PCR反应试剂为QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4741miScipt PrimerAssay、RNase-free water、特异性引物为QIAGEN 218300-MS00039557。
本发明首先是在临床常规收集已经确诊的原发性肝癌患者血清样本为实验组，收集来院体检的健康人血清为对照组。高通量筛查出差异明显的microRNA作为目标标记物。利用RT-qPCR技术检测实验组与对照组目标microRNA的表达量，并进行分析对比。
本发明的主要步骤包括以下几个方面：1)样本采集；2)提取样本中总的RNA；3)合成cDNA；4)RT-qPCR反应，以microRNA39作内参计算出每个生物标记物的PCR相对定量值；5)根据每个生物标记物的PCR相对定量值计算P值，当P值小于0.05时，认为该microRNA可用于鉴别原发性肝癌患者与正常人。
本发明的实验结果表明，肝癌患者血清中miRNA-4741较正常人表达上调，差异有统计学意义。
目前临床上常用的肝癌诊断方法为甲胎蛋白(AFP)、肝功能、影像学等检查方法，然而这些诊断标方法的敏感度和特异度并不十分理想。将肝癌患者血清中miRNA-4741的表达量与AFP、年龄、分期、分型、肿瘤大小、肝功能等进行分析，差异并无统计学意义(表1)。
表1.MicroRNA-4741的相对表达量与肝癌临床特征的相关性分析
将循环miRNA-4741对原发性肝癌患者的诊断效能进行ROC曲线分析，其结果显示AUC＝0.765，灵敏度为75.4％，特异度为66.7％；miRNA-4741联合AFP的诊断效能AUC＝0.887，灵敏度为73.2％，特异度为91.3％。
肝功能指标、门静脉高压、肿瘤状态以及体能状态等临床表现均被作为肝癌预后判断和治疗选择的参考因素。我们对肝癌患者循环miRNA-4741进行生存曲线分析，miRNA-4741的平均△CT为9.40，＞9.40的称为高表达，相反则为低表达。经SPSS18.0统计分析发现：循环miRNA-4741的表达量越高患者的生存时间越短，相反表达量越低生存时间越长，P＜0.05。
附图说明
图1为原发性肝癌患者血清中miRNA-4741表达水平，散点图进一步验证基因芯片结果，原发性肝癌患者循环miRNA-4741表达量较正常人明显上调(图中横线表示各组血清miRNA-4741的中位数值)。
图2为ROC曲线，其中，图2A.ROC曲线分析提示循环miRNA-4741对原发性肝癌及正常人的鉴别效能AUC＝0.765，灵敏度为75.4％，特异度为66.7％；图2B.miRNA-4741联合AFP的诊断效能AUC＝0.887，灵敏度为73.2％，特异度为91.3％。
图3为生存曲线，其显示：循环miRNA-4741的表达量越高患者的生存时间越短，相反表达量越低生存时间越长。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进一步说明。
收集已确诊的原发性肝癌患者血清57例，体检的健康人血清45例。各取外周血4ML，并取得知情同意。室温下离心，3600r，5分钟，取上层血清，至于-80℃冰箱保存备用。
RNA提取方法如下，
⑴取上层血清标本200ul，加入5倍量的QIAzol裂解液，混匀，室温下(23-25℃)静置5分钟；
⑵加入7ul miRneasy serum/plasma spike-in control；
⑶加入与样本等量的氯仿，剧烈摇晃15秒，室温下(23-25℃)静置2-3分钟；
⑷12000Xg,4℃，离心15分钟；
⑸移取上层液600ul,加入1.5倍上层液量的无水乙醇，立即混匀；
⑹吸取700ul混匀液加到RNeasy Minelute spin columns(吸附柱)，在12000X g,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑺重复步骤⑹；
⑻加入700ul的Buffer RWT到吸附柱中，12000Xg,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑼加入500ul的Buffer RPE到吸附柱中，12000Xg,室温，离心30秒，废弃收集液；
⑽加入500ul的80％乙醇到吸附柱中，12000Xg,室温，离心2分钟，废弃收集液和收集管；
⑾重置一个新的2ml的收集管，12000Xg,室温，离心5分钟，废弃收集液和收集管；
⑿重置一个新的1.5ml的收集管，加入14ul无酶水，12000Xg,室温，离心1分钟；
最后收集管中为总的RNA。
cDNA的合成，按照QLAGEN逆转录试剂盒的方法，在普通PCR仪上将溶解的总RNA为模版，加入试剂盒提供的逆转录酶、dNTP以及反应缓冲液，将mRNA逆转录成cDNA。-20℃保存待用。
表2：反应体系的组成
Component Volume
Purified RNA 3ul
5x miScript Hispec Buffer 4ul
10x miScript Nucleics Mix 2ul
RNase-free water 9ul
miScript Reverse transcription Mix 2ul
Total volum 20ul
RT-qPCR检测，血清样本逆转录的cDNA，按照SYBR Green RNA assay荧光实时定量PCR试剂盒的方法，进行荧光实时定量PCR，在ABI7500荧光定量PCR仪读出各个样本的Ct值。miRNA-4741相对表达量分析用MicroRNA-39作内参，血液样本各组相对量＝2-[原发性肝癌组(Ct miRNA-4741-Ct miRNA-39)-正常组(Ct miRNA-4741-Ct miRNA-39)]。
miRNA-4741引物(QIAGEN，货号：218300-MS00039557)，miRNA-4741序列：5'CGGGCUGUCCGGAGGGGUCGGCU
miRNA-39引物(QIAGEN，货号：218300-MS00019789)，miRNA-39序列：5'UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG。
表3实时荧光定量PCR反应体系
数据整理分析，采用ΔCT法整理数据，ΔCT＝CT(标记物)-CT(内参)；统计方法采用SPSS18.0软件分析，T检验方法检测所有数据并采用(x±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果：原发性肝癌患者血清中miRNA-4741表达水平较正常人显著上调(P＜0.05)(图1)；通过ROC曲线，miRNA-4741得到的最佳cut-off值对应的曲线下面积为(图2A)：0.765(P<0.001)，灵敏度为75.4％，特异度为66.7％，而miRNA-4741联合AFP得到的曲线下面积为(图2B)0.887(P<0.001)，灵敏度为73.2％，特异度为91.3％。
综上实验，本发明认为循环miRNA-4741检测联合AFP可提高原发性肝癌患者诊断的灵敏度；并且对判断肝癌患者预后有一定帮助，患者血清miRNA-4741表达量越高，生存时间越短。

Claims (7)

1.miRNA-4741作为原发性肝癌的诊断标志物的用途，所述miRNA-4741的碱基序列为CGGGCUGUCCGGAGGGGUCGGCU。
2.miRNA-4741用于制备肝癌预后判断试剂的用途。
3.一种检测血清样本中miRNA-4741水平的方法，该方法包括：1)采集血清样本；2)提取样本中总的RNA；3)以提取的RNA为模板合成cDNA；4)使用miRNA-4741引物QIAGEN，218300-MS00039557，miRNA-39引物QIAGEN，218300-MS00019789进行RT-qPCR反应，获得待测血清标本中miRNA-4741的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，即CT值；5)以microRNA39作内参计算出该削减样本的CT值，根据公式(ΔCT＝CTmiRNA-4741–CTreference)，根据得到的CT值减去内参的CT值，得到该被检测者miRNA-4741的表达水平△CT，
其中CTmiRNA-4741是指肝癌患者血清标本中miRNA-4741的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CTreference是指内参miR-39的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：
6)根据以下公式，计算出待测样品与正常人的△CT差异：
△△CT＝待测样品中目的基因△CT–正常人目的基因△CT，其中正常人目的基因△CT是根据以上公式计算出的正常人的miRNA-4731-3p的表达水平，以2-△△CT值进行目的基因相对定量。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，使用QIAzol Lysis Reagent提取RNA，使用步骤2)获得的Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-free water、miScript Reverse transcription Mix合成cDNA，使用QuantiTect SYBRGreen PCR Master Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4741miScipt Primer Assay、RNase-free water、以上合成的Template cDNA进行PCR反应。
6.一种用于检测血浆样本中miRNA-4741水平的试剂盒，其包括：RNA提取试剂；cDNA合成试剂；PCR反应试剂、miRNA-4741特异性引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，RNA提取试剂为QIAzol Lysis Reagent；cDNA合成试剂为Purified RNA、miScript Hispec Buffer、miScript Nucleics Mix、RNase-freewater、miScript Reverse transcription Mix；PCR反应试剂为QuantiTect SYBR GreenPCR Master Mix、miScript Universal、Ce_miR-39_1miScipt PrimerAssay或miRNA-4741miScipt Primer Assay、RNase-free water、特异性引物为QIAGEN 218300-MS00039557。
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