CN107164531A

CN107164531A - 一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN107164531A
Application number: CN201710540078.6A
Authority: CN
Inventors: 曹巍; 代敏; 常菁; 吴莉华; 田夫; 崔渊博; 吕朋举; 龚芬芬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2017-09-15

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用。该标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过研究证明，肺癌患者与肺结节患者及健康人群相比，血清LncRNA标志物显著高表达，由此可见该LncRNA标志物可以用于早期肺癌的筛查及辅助诊断，也可进行肺癌疗效评价、耐药监测、预后评估，作为肺癌新型分子诊断标记物，特异性和灵敏度高。

Description

一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用。

背景技术

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，已成为全世界癌相关性死亡的主要原因，占所有癌症相关死亡的21.7％，严重威胁着人类的健康和生命。目前，尽管肺癌的治疗已取得较大进展，但其发病机制尚不清楚且缺乏有效的早期诊断手段，绝大多数就诊的肺癌患者确诊时肿瘤已经发生了侵袭和转移，因此肺癌预后仍然较差，5年的生存率仅为17％左右。大量的研究表明，肺癌的早期诊断和早期治疗是降低其死亡率的有效办法。低剂量螺旋CT在早期肺癌筛查方面具有较高的敏感性，然而其较高的敏感性，也使得其筛查肺癌的假阳性率较高，存在“过度诊断”，导致一些不必要的检查和手术。传统的肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、组织多肽特异性抗原(TPA)等标志物的检测缺乏肺癌组织特异性，灵敏度也不够高。而纤维支气管镜检查、胸腔镜、胸腔穿刺、胸膜活检及淋巴结活检等入侵式的检查，具有创伤性。因此寻找有效的、敏感的肿瘤早期诊断及预后标志物具有重要意义。

人类基因组中超过90％的基因被转录为非编码RNA。LncRNA是长度大于200nt的一类非编码RNA。这些LncRNA曾经被认为仅仅是转录“噪声”，但是越来越多证据表明，LncRNA参与许多生物学过程，可调控细胞的生长、分化和代谢，在癌症的发生发展中发挥重要作用。已有的一些研究在许多肿瘤组织中发现了LncRNA的异常表达，探索LncRNA在肺癌的生物学功能以及LncRNA的表达与肺癌的关系对了解肺癌的发生发展以及早期诊断具有重大意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物，特异性和灵敏度高。

同时，本发明还在于提供一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物的应用。

一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物，所述LncRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述LncRNA标志物可以作为肺癌标志物对肺癌进行早期筛查和辅助诊断及预后评估，那么能够检测LncRNA标志物的试剂可以用于制备肺癌早期筛查及辅助诊断用试剂盒、芯片或者用于制备或筛选人肺癌的肿瘤诊断药物，用于判断肺癌是否易感，进行肺癌的早期诊断，评估肺癌的治疗效果及预后。

检测上述LncRNA的方法有很多种，包括但不限于多聚酶链式反应、实时定量PCR、基于核酸序列扩增法、转录介导的扩增、连接酶链反应等。根据上述检测方法，上述用于制备试剂盒、芯片或人肺癌的肿瘤诊断药物的检测LncRNA标志物的试剂需要包括能够捕获上述LncRNA的捕获剂，该捕获剂可以是能够特异性识别上述LncRNA的引物和/或探针。

可选的，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

通过研究证明，与肺结节患者及健康人群相比，肺癌患者血清LncRNA标志物显著高表达，由此可见该LncRNA标志物可以用于肺癌的早期筛查及辅助诊断，也可以通过将检测到的血清中的LncRNA的相对表达量与阈值进行比较，进而对早期肺癌以及肺癌的转移及预后状况进行辅助性预测和判断，其中阈值可以采用大量的统计试验得出，统计出健康人群的相对表达量范围、不同时期肺癌患者的相对表达量范围以及不同转移状况肺癌患者的相对表达量范围。

本发明的有益效果在于：本发明请求保护的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LncRNA作为肺癌早期筛查及辅助诊断的标志物，通过检测血清中所述LncRNA的相对表达量进行肺癌早期筛查及辅助诊断，也可进行肺癌疗效评价及预后评估，特异性和灵敏度高。

附图说明

图1为实施例中三组人群中LncRNA标志物的相对表达量。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

血清中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LncRNA的表达量检测，具体基于qRT-PCR技术进行检测，操作步骤为：

一、血浆RNA提取(按照试剂盒说明书进行，mirVana^TMPARIS^TMKit，AM1556)

1、实验前将2×Denaturing Solution放在37℃水浴锅中30min以使其完全溶解；

2、取适量的血浆(不足100μL时，用Cell Disruption Buffer补至100μL)，加入等量的2×Denaturing Solution，涡旋/振荡混匀，冰上放置5分钟；

3、加入与总体积等量的酚/氯仿，注意吸取试剂下层的氯仿，涡旋混匀30-60秒，室温12000rpm、5min；

4、小心吸取水相上清到新的1.5mL离心管中；

5、加1/3倍体积的无水乙醇，振荡混匀；

6、将离心柱放置于收集管中，转移上步的混合液体到柱子中，室温12000rpm、30秒，至全部过柱，弃滤液，将离心柱重新放置到收集管中；

7、吸取700μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，室温12000rpm、15秒，弃滤液，将离心柱重新放置到收集管中；

8、吸取500μL Wash Solution 2/3过柱洗涤，室温12000rpm、30秒，弃滤液；

9、重复8；

10、将柱子置于收集管中，室温12000rpm、空转1分钟；

11、将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入20-50μL、95℃预热的ElutionSolution或无酶水，室温12000rpm、30秒，收集管中的液体即为提取的总RNA，超低温冰箱保存。

二、反转录(20μL体系，50ng/样本；按照试剂盒说明书进行，Thermo K1622)

1、试剂盒充分解冻后，轻混并短暂离心，放置于冰上；

2、按照下列顺序加入相关组分于200μL PCR管中：总RNA 50ng；Oligo(dT)引物1μL；无酶水补充至12μL；

3、将PCR管置于65℃水浴中处理5min，放置于冰上；

4、按照下列顺序依次加入相关组分于PCR管中：5×Reaction Buffer、4μL，Ribolock RNase Inhibitor、1μL，10mM dNTP Mix、2μL，反转录酶、1μL；轻轻混匀并简短离心；

5、按照下列条件进行反应：42℃、1h，70℃、5min；反转录完成后，将cDNA保存于-20℃。

三、qRT-PCR检测(20μL体系；按照试剂盒说明书进行，DBI 2043，使用自行设计的引物)

1、每个基因做2个复孔，每个反应孔20ul PCR反应液按如下配制：模板cDNA 1ul(5ng)；自主设计的上下游引物各0.8ul；Rox 0.04ul；SYBR Mix10ul；dH₂O Up to 20ul；

2、采用三步法进行qRT-PCR反应，条件设置为：95℃、2min预变性；95℃、10s，64℃、34s，72℃、30s，反应45个循环；添加熔解曲线；

3、反应结束后观察qRT-PCR的扩增曲线；

4、记录Ct值并进行数据分析。

其中自主设计的上下游引物为：

上游引物5'-CCAGACAGCAGCAAAGCAAT-3'，

下游引物5'-GGAAGCAGCAAATGTGTCCAT-3'；

四、数据分析方法：

以GAPDH管家基因作为内参，采用相对定量法，计算基因的相对表达量。基因的相对表达量用ΔCt表示，ΔCt＝待测样品的目的基因的Ct的平均值一内参基因的Ct的平均值。

实施例不同人群血清中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LncRNA的表达差异

样本：459例健康人群外周血、225例肺结节人群外周血、77例肺癌人群外周血；肺癌筛查使用低剂量螺旋CT，筛查阳性/癌前病变、癌/疑似癌确诊以组织病理学诊断为金标准。

采用上述方法分别对上述健康人群(肺癌阴性)、肺结节人群(肺癌疑似)和肺癌人群的外周血中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LncRNA的表达水平进行检测，采用SPSS19.0统计软件统计分析，单因素方差分析比较三组人群中LncRNA标志物的表达水平，P＜0.05具有统计学差异。结果如下图1所示，由图1所示的结果可知，与肺癌阴性组相比，肺癌疑似组血清LncRNA标志物相对表达量升高但无明显差异(P＝0.254)，肺癌组血清与肺癌疑似组LncRNA标志物相对表达量明显升高差异具有统计学意义(P＜0.001)；与肺癌阴性组相比，肺癌组血清LncRNA标志物相对表达量明显升高差异具有统计学意义(P＝0.003)。由此可见本发明所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LncRNA与肺癌的发生发展关系密切，可以作为肺癌筛查及辅助诊断标志物。

因此，能够检测LncRNA标志物的试剂可以用于制备肺癌诊断用试剂盒、芯片或者用于制备或筛选人肺癌的肿瘤诊断药物，用于判断肺癌是否易感，进行肺癌的早期诊断，疗效评价及预后评估。

上述用于制备试剂盒、芯片或人肺癌的肿瘤诊断药物的检测LncRNA标志物的试剂需要包括能够捕获上述LncRNA的捕获剂，该捕获剂可以是能够特异性识别上述LncRNA的引物和/或探针，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物5'-CCAGACAGCAGCAAAGCAAT-3'，

下游引物5'-GGAAGCAGCAAATGTGTCCAT-3'。

SEQUENCE LISTING

<110>曹巍

<120>一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用

<160>3

<210>1

<211>1419

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ccttgagctg tggtgggctc cacccagttg gagcttcctg gctgctttgt 50

ttacctaatc aagcctgggc aatggcgggc gcccctcccc cagcctcgct 100

gccgccttgc agtttgatct cagactgctg tgctagcaat cagcgagatt 150

ccgtgggcgt aggaccctct gagccagaat gtgattttga agaaaggagg 200

aaagatgtga aaagtgattg gtcagccaca ttcatggtgt tgagaaaaga 250

atttgctttt ctggaacata gcctgtgata gcagaacaac acctggcaag 300

aaacaggtta tgtttggctg gagagtcatt ggcactatca agaaatatta 350

aagtgtagat ttgagagagg aggagaaaga cccaagcaaa attgaaaacc 400

aggtgggacc cagacagcag caaagcaatg gaagcatgta ttttggtcaa 450

tatagagtta atacacaatt ttgcccctct tcttctgatc atgggactca 500

tattaccagt cttcacattt cctttaaatt caggaatcag gaagaatttc 550

cagagtttgc agatggacac atttgctgct tccattctaa acataagtta 600

gaagaacctt tcaactggat tccaacttta atatgtcaca aacataaaaa 650

agaaagctat ttcctggact tttcttcatt agaaattaat agattgtcaa 700

ttggcatagg gaaaagataa tcaacagatg ccaaccccaa gttaacagaa 750

atgctaaaat tataagacaa agacttcaaa atagctattt taattttgcc 800

tagtgaggta aatgcaaaca tgctcactat gaatgaaaac aggtaatctc 850

agcagtcatg taaactataa aaataagcaa atataaattt tagaattaaa 900

acacaatatc taaaaataaa ttcacctgat attctcaata gaaaaaatgg 950

taatgcagag aaaaatgtat gaaaatatgg caatttgaag aagagagaag 1000

agatcaataa aataaataag tatatccttg gagacctgtg gatgtttttt 1050

gaaaagtgaa tcatgtaagt aattgaagtc ccagaagaaa agaaaagaag 1100

aggatgagca gaaaaaaatt tctgaaaaaa tatctgaaag cttaaacact 1150

ataatgaaag acacacattt acaaactcaa gaagtttagt aaaccaaaaa 1200

caataaaatc aaagagaact gtgccaagcg acatcatttt caacctgctg 1250

aagatcttga cagcagtcag agaaaaaaga cacacttatt acacagagag 1300

gaacaataca ttaaatacta gcacacttct catcagagat cattaagccc 1350

agaagacagt ggaatgagat ctttaaagtg ctgaaataaa ataaatgttg 1400

attaaaaaat tctatagct 1419

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>根据特性核苷酸序列设计，用以目标连接目标核苷酸序列。

<400>2

ccagacagca gcaaagcaat 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggaagcagca aatgtgtcca t 21

Claims

1.一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物，其特征在于，所述LncRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种检测如权利要求1所述的LncRNA标志物的试剂在制备肺癌筛查和辅助诊断用试剂盒的应用。

3.一种检测如权利要求1所述的LncRNA标志物的试剂在制备肺癌筛查和辅助诊断用芯片的应用。

4.一种检测如权利要求1所述的LncRNA标志物的试剂在制备或筛选人肺癌的肿瘤诊断药物中的应用。

5.如权利要求2～5任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂包括捕获如权利要求1所述的LncRNA的捕获剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述捕获剂为能够特异性识别所述LncRNA的引物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。