CN107858434A - lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用 - Google Patents

lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用，所述lncRNA选自TD‑2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20中的一种或几种，本发明通过实验证明了lncRNA TD‑2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20在肝癌患者中呈现差异性表达；本发明同时公开了预测肝癌预后的风险评分模型，根据该模型，作为辅助手段预测肝癌患者的预后，从而对患者进行风险评估和监测。

Description

lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是威胁、人类健康的第二大疾病。尽管近年来恶性肿瘤的死亡率逐 渐下降，但肝癌的发病率确逐年上升。肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，位居我国 恶性肿瘤发病率第四位，病死原因第二位，尤其在东亚、东南亚、非洲和南欧。 目前先进的肝癌外科手术治疗方式及索拉菲尼等靶向药物的应用明显改善了肝 癌患者的生活质量，然而由于多数患者在确诊时已经处于中晚期且肝癌异质性较 大，大多数患者治疗效果不良、预后较差。
长非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核 苷酸的非编码RNA。200nt这一长度区分了lncRNA与其它较短的非编码RNA， 如microRNA，siRNA，piRNA与snoRNA等。由于与编码基因相比lncRNA 的保守性较弱，并且早年研究没有发现lncRNA有任何生物学功能，因此lncRNA 曾一度被认为是DNA中转录的“噪声”。直至后来人们才发现，这类与mRNA 长度相似RNA，虽然不编码蛋白质，但是在细胞周期、细胞凋亡、细胞分化与 多能化等方面都行使着重要的调控作用。
如今，越来越多的研究结果表明，lncRNA在癌症等疾病的发生与发展过程 中发挥着重要作用。在癌症中，lncRNA转录水平的异常往往可以标志着疾病的 进展程度，有时也可以用来预测个体的患病风险。目前关于lncRNA分子在肝癌 调控机制中的研究还处于起步阶段。因此，通过分析、研究lncRNA在肝癌的发 生发展机制，对肝癌的诊断、预防和治疗起着重要作用，并且为肝癌的基因靶向 治疗提供可能。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供一种预测肝癌预后 的手段和产品。
本发明的目的之二，在于提供一种诊断肝癌的产品。
本发明的目的之三，在于提供一种预测肝癌患者预后的风险评分模型。为了 实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了lncRNA在制备诊断肝癌的产品中的应用，所述lncRNA选自 CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20中的一种或几种。
优选的所述lncRNA为CTD-2574D22.4或SERHL，以及CTD-2574D22.4或 SERHL与MIR100HG、SNHG20的任意组合，以及四种lncRNA的组合。
本发明提供了lncRNA在制备预测肝癌预后的产品中的应用，所述lncRNA选 自CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20中的一种或几种。
其中，上面所述的产品包括(但不限于)芯片、或试剂盒。芯片包括基因芯 片；试剂盒包括基因检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载 体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测基因表达水平的针对 CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20基因的寡核苷酸探针；所述基 因检测试剂盒包括用于检测CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20基 因表达水平的引物或芯片。
进一步，所述lncRNA为CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20。
进一步，产品包括检测样本中CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、 SNHG20的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的探针；或
特异性扩增CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的引物。
进一步，特异性扩增CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的引 物序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8 所示。
本发明提供了一种预测肝癌预后的产品，所述产品包括检测标本中 CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高 通量测序平台检测CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20的表达水 平的试剂。
其中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增 CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20基因的引物；所述用实时定量 PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增CTD-2574D22.4、SERHL、 MIR100HG、SNHG20基因的引物；所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括：与 CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20基因的核酸序列杂交的探针； 所述用芯片诊断肝癌的产品包括与ENSG00000262155基因的核酸序列杂交的探 针。
进一步，每例标本在分别进行检测后，使用公式： 进行风险评分，其中，N为用于预测预后的lncRNA数，Expi为每个lncRNA 的表达水平，Ci为每个lncRNA的回归系数；lncRNA CTD-2574D22.4、SERHL、 MIR100HG、SNHG20，对应的回归系数分别为0.284、0.714、-0.193、0.136。
进一步，评价个体肝癌预后的信息时，把患者的lncRNA的表达水平代入公 式中，得出风险评分，然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危 组，大于该值的患者属于高危组。
当风险评分较高时，患者的预后较差，即生存期较短；当风险评分较低时， 患者的预后较好，即生存期较长。
在本发明中，选自CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的一种 或几种进行了风险评分，发现一种或几种均具有预测肝癌预后的能力，但是把4 中lncRNA联合起来预测肝癌预后则具有更强的诊断效能。
本发明提供了一种预测肝癌患者预后的风险评分模型，所述风险评分模型为： 风险评分＝(0.284×CTD-2574D22.4的表达水平)+(0.714×SERHL的表达水平) +(-0.193×MIR100HG的表达水平)+(0.136×SNHG20的表达水平)，当风险评 分较高时，患者预后不良；当风险评分较低时，患者预后良好。
在本发明中，“肝癌”包括源于肝细胞本身的肝细胞癌和其他组织传播到肝 脏的转移性肝癌，优选的，“肝癌”指肝细胞癌。
在本发明中，用于预测肝癌预后的标志物是指基因标志物，作为在肝癌出现 后预测肝癌预后的标准。该标志物具有显著低的p值，其中所述p值根据所述标 志物在具有不同预后的患者的肝癌细胞和/或组织中的表达差异计算得到。优选 的，所述标志物的p值小于0.05。
所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、 咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本 发明的具体实施方式中，所述样本为组织。
在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分 结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多 核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严 谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接 或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括(但不限于)：溶液相、固相、 混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例 如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码 连接的探针、以及固定于珠上的探针。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的 碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源 性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中 核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标， 2′-O，4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、 TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
“引物”是指能够互补地与模板结合并使逆转录酶或DNA聚合酶能够启动 模板复制的具有自由3’羟基的核酸序列。引物是具有与特定基因核酸序列互补的 序列的核苷酸，可以使用长度约7bp～50bp、优选约10bp～30bp的引物。其他的 RT-PCR试剂盒根据具体的实施方式可以包括试管或其他适合的容器、反应缓冲 液、脱氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、 DEPC-水、无菌水等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像 分析软件。
本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合 成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性 实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷 酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷 酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代 磷酸酯等)。
术语“预后”指关于医学发展(例如，长期存活可能性、无疾病存活率等) 的预期，包括积极预后或消极预后，所述消极预后包括疾病进展如复发，肿瘤生 长、转移和耐药死亡率，并且积极预后包括疾病缓解如无疾病状态，疾病改善 如肿瘤消退或稳定。
术语“差异表达基因”或“基因差异表达”是指，与正常或对照用靶的表达 相比，在患有肝癌的患者体内得到更高或更低水平的活化的基因。此外，“差异 表达基因”或“差异基因表达”包括相同疾病的不同分期内得到更高或更低水平 的活化的基因。这种差异可通过如RNA水平、表面显示、分泌或其他分配上的变 化而得以证明。从本发明的目的出发，将“差异基因表达”视为从正常的或患有 疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的基因的表达之间存 在1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现 象。
差异基因的检测方法包括(但不限于)RT-PCR、竞争性RT-PCR(competitive RT-PCR)、实时RT-PCR(Real-time RT PCR)、RNA酶保护测定法(RPA；RNase protectionassay)、northern印迹法(northern blotting)、DNA微阵列芯片等。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20在肝癌 患者组织中差异表达，通过检测CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20 的表达水平可以诊断患者是否患有肝癌。
本发明发现了CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的差异表达 与肝癌的预后有关系，通过检测CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20 的表达水平，带入风险评分模型，可以预测肝癌患者的预后，从而对患者进行风 险评估和监测。
附图说明
图1是QPCR检测四个lncRNA在肝癌中的差异表达图；
图2是四个lncRNA标志物与训练组肝癌患者整体生存期的关系图；其中，图A是 RS模型预测训练组肝癌患者预后的ROC曲线图；图B是肝癌患者的风险评分分布、 整体生存期状态以及lncRNAs表达水平图；图C是RS模型预测肝癌患者预后的 Kaplan-Meier生存曲线图；
图3是RS模型预测不同数据集中的肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；其中，图A TCGA验证组；图B GEO数据集GSE36376；图C GEO数据集GSE14520； 图D GEO数据集GSE14520；
图4是RS模型预测不同临床分期的肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；其中，图A临床I期；图B临床II期；图C临床III/IV期。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 QPCR检测lncRNA在肝癌患者中的表达水平
1、样品收集
各收集84例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标 本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA提取
利用Invitrogen的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具 体步骤进行操作。
3、逆转录：
采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别 加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
QPCR扩增检验
根据CTD-2574D22.4(Ensemble gene ID：ENST00000567795)、SERHL (NC_000022.11)、MIR100HG(NC_000011.10)、SNHG20(NC_000017.11)的 序列设计引物，并由上海生工合成。
CTD-2574D22.4的引物序列为：
正向引物：5’-ACCGGCCTGTAGTTTTA-3’(SEQ ID NO.1)
反向引物：5’-AAGTACGACGAGGTTCA-3’(SEQ ID NO.2)
SERHL的引物序列为：
正向引物：5’-ACTTTTATTACGTTGCCAT-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-CACCAGTCCAGACTACTT-3’(SEQ ID NO.4)
MIR100HG的引物序列为：
正向引物：5’-CACTTCATGCTGCTATGTCG-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-TCTTCTCAGGCACAATC-3’(SEQ ID NO.6)
SNHG20的引物序列为：
正向引物：5’-ATGGCTATAAATAGATACA-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-GGTACAAACAGGGAG-3’(SEQ ID NO.8)
管家基因GAPDH的引物序列为：
正向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.9)
反向引物：5’-GAACCTGGAAGAGTCCGAAGTA-3’(SEQ ID NO.10)
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以 上以保证结果的可靠性。
配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物 (5μM)各1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。
扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行 PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认 为当P＜0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图1所示，与癌旁组织相比，CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、 SNHG20在肝癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例2检测IncRNA对肝癌患者生存期的影响
1、样本
从TCGA数据库中筛选连续的病理确诊及手术切除的肝癌病例364例的肝癌 组织和癌旁组织，随机分为训练组(182例)和验证组(182例)，纳入的病人的 临床信息包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、新发肿瘤以及生存期信息。
2、数据分析
提取lncRNA表达和生存时间数据，对训练组的lncRNA数据采用survival包的coxph函数做单变量Cox回归分析，筛选得到单变量Cox回归中p值＜0.01。
3、结果
经单变量Cox回归分析，发现在肝癌患者中呈现差异表达的lncRNA CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20与肝癌患者的生存期相关，其 中CTD-2574D22.4、SERHL、和SNHG20呈正系数，MIR100HG呈负系数，即 CTD-2574D22.4、SERHL、和SNHG20高表达患者的生存期短，MIR100HG高表 达患者的生存期较长。
实施例3 RS模型预测肝癌患者预后的效能检测
1、数据分析
每个筛选的lncRNA的预后特征通过单变量Cox回归分析，在训练组， lncRNAs与病人的整体存活率相关(P＜0.01)。然后使用R包中的多变量Cox回归 计算每个lncRNA对生存预测的贡献值。建立风险评分模型来评估病人的风险， 评分公式如下：
风险评分其中N代表用于预后预测的lncRNA数， Expi代表lncRNAi的表达水平，Ci代表从多变量Cox回归分析中获得的lncRNAi的 回归系数。
使用ROC曲线和AUC曲线来确定RS模型预测的敏感性和特异性。利用 Kaplan-Meier生存曲线分析不同肝癌数据集高风险组和低风险组的区别，使用 Cox比例风险回归模型对lncRNA RS模型和其他临床特征进行独立危险因素分析， 对风险评分、年龄、性别、肿瘤的分级、分期和临床辅助诊断因子进行多变量分 析，得出风险比和95％置信区间(CI)，所有的数据分析使用R/Bio-conductor包(版 本3.3.0)。
2、实验结果：
肝癌预后的风险评分模型：风险评分(RS)＝(0.284×CTD-2574D22.4的表 达水平)+(0.714×SERHL的表达水平)+(-0.193×MIR100HG的表达水平)+ (0.136×SNHG20的表达水平)。
各临床指标与各基因的Cox风险回归模型预测患者的独立危险因素如下：
表1每组数据的单变量和多变量Cox回归分析
使用RS模型预测肝癌患者预后的结果显示，4个lncRNA可分别作为判断预后 的独立预后因子，而不受年龄、性别、肿瘤分级和肿瘤分期等因素的影响。4个 lncRNA联合后形成的曲线下面积(AUC)是最高的，同时4个lncRNA联合也具 有较高的敏感性和特异性，如图2所示。
对不同的数据集进行生存期分析，结果如图3所示，RS模型对肝癌患者的生 存期具有较好的预测效果。在TCGA数据库的验证组(n＝182)、TCGA数据集 (n＝364)，低风险组相比高风险组具有较长的中位生存期，分别是(19.4个月 vs16.07个月，P＝0.0017)、(22.4个月vs13.6个月，P＝1.12E-8)；在GEO数据集 GSE36376、GSE14520中，也具有相似的结果；进一步分析数据集GSE14520中 肝癌患者的无复发生存期，发现RS模型对其生存期也具有较好的判定作用。
对不同临床分期的肝癌患者进行生存期分析，结果如图4所示，发现RS模型 对不同分期的肝癌患者具有较好的预测效果，根据RS模型，评分较高的患者具 有较短的生存期。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属肿瘤医院
<120> lncRNA在肝癌诊断以及预后预测中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accggcctgt agtttta 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtacgacg aggttca 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acttttatta cgttgccat 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccagtcca gactactt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacttcatgc tgctatgtcg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttctcagg cacaatc 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggctataa atagataca 19
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtacaaaca gggag 15
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaacctggaa gagtccgaag ta 22

Claims (10)

1.lncRNA在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20中的一种或几种。
2.lncRNA在制备预测肝癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述lncRNA为CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，产品包括检测样本中CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的探针；或
特异性扩增CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的引物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，特异性扩增CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20的引物序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8所示。
7.一种预测肝癌预后的产品，其特征在于，所述产品包括检测标本中CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG和SNHG20的表达水平的试剂。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于，每例标本在分别进行检测后，使用公式：进行风险评分，其中，N为用于预测预后的lncRNA数，Expi为每个lncRNA的表达水平，Ci为每个lncRNA的回归系数；lncRNA CTD-2574D22.4、SERHL、MIR100HG、SNHG20，对应的回归系数分别为0.284、0.714、-0.193、0.136。
10.一种预测肝癌患者预后的风险评分模型，其特征在于，所述风险评分模型为：风险评分＝(0.284×CTD-2574D22.4的表达水平)+(0.714×SERHL的表达水平)+(-0.193×MIR100HG的表达水平)+(0.136×SNHG20的表达水平)，当风险评分较高时，患者预后不良；当风险评分较低时，患者预后良好。
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