CN108728439A - 小rna组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用 - Google Patents

小rna组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小RNA组成的指纹图谱在人膀胱癌诊断中的应用，由数个miRNA组成的指纹图谱能够非常有效地区分膀胱癌组织和癌旁组织，灵敏度高，特异性强，可有效用于膀胱癌诊断。

Description

小RNA组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学、生物工程和检测技术领域，具体地，涉及一组小RNA指纹图谱及其在人膀胱癌诊断中的用途。
背景技术
膀胱癌(Carcinoma of Bladder；Bladder cancer)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病以男性为主,其发病率居男性肿瘤发病率的第4位,发病率仅次于前列腺癌；死亡率居男性肿瘤的第9位,男性发病率是女性的14倍。在中国，膀胱癌在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中居首位,且近年来有逐年增加的趋势。
原发膀胱肿瘤绝大多数来自于上皮组织，其中约90％-95％为尿路上皮细胞癌(Urothelial cell carcinoma,UCC),鳞状细胞癌(3％-7％)与腺癌(2％)相对较少。虽然近年来研究报道了一系列尿液生物标志物可能对膀胱癌的早期诊断、预后复发以及治疗有所帮助，但是目前临床上诊断的金标准还是以尿脱落细胞学检查、膀胱镜检及组织活检为主。尿脱落细胞学检查特异性高，但灵敏度低；而膀胱镜是有创检查，不能早期诊断且患者依从性差。因此，寻找一种简单、经济、非创伤性、灵敏度高的检测方法用于诊断膀胱癌、监测膀胱肿瘤的复发和判断预后就变得很有必要。
最近几年，非编码RNA(non-coding RNA)引起生物学界的高度关注，包括siRNA、PiRNA、lncRNA和miRNA。MicroRNA(小RNA，miRNA)是一类长度约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，调节约60％的人类编码基因，在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极其重要的作用。研究发现miRNA广泛存在于肿瘤细胞中，参与着肿瘤的发生，转移及浸润。且大量研究表明，miRNA的表达无论是在组织、血清还是在尿液中均可以稳定表达。目前，文献报道指出，miR-145，miR-143和miR-125b作为抑癌基因在膀胱癌组织样本中表达降低，同时作为促癌基因的miR-183，miR-96、miR-17-5p和miR-20a则在膀胱癌组织中过表达(Hirofumi Yoshino,.Nature Reviews Urology 10,2013,396-404)。
因此，深入挖掘膀胱癌发病机理相关miRNAs，并阐明其作用机制和临床意义，对于指导膀胱癌诊断治疗以及膀胱肿瘤复发监测具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于诊断膀胱癌以及检测膀胱肿瘤的复发。
本发明的第一方面，提供一种miRNA集合或组合，所述的miRNA集合或组合为：
(a)序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；
(b)与SEQ ID NO:1-31所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或
(c)至少一种来自序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA与至少一种来自与SEQ IDNO:1-31所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA的序列与来自与SEQ ID NO:1-31所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。
在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由如SEQ ID NO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3-5种miRNA所构成。
在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由如SEQ ID NO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3种或4种miRNA所构成。
在另一优选例中，来源于SEQ ID NO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27组成的如表4所示的10组miRNA指纹图谱能够非常准确的区分膀胱癌组织和正常(癌旁)组织，满足膀胱癌诊断的临床检验要求。
在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。
本发明的第二方面，提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成第一方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。
本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成第一方面所述miRNA集合或组合中的miRNA；
较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
本发明的第四方面，提供一种载体，它含有第一方面所述的miRNA集合或组合，或第三方面所述的多核苷酸集合或组合。
本发明的第五方面，提供一种miRNA芯片，
所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-31所示的部分或全部序列。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-3所示的全部序列。
在另一优选例中，所述的特异性地对应指的是所述的寡核苷酸探针上的序列分别与SEQ ID NO.:1-31所示的序列互补或基本互补；或分别与SEQ ID NO.:1-31所示序列相同。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
本发明的第六方面，提供第一方面所述miRNA集合或组合、和/或第五方面所述miRNA芯片的用途，用于制备区分膀胱癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。
本发明的第七方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有第五方面所述的miRNA芯片；和/或
检测第一方面所述miRNA集合或组合的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有本发明第一方面所述的miRNA集合或组合用于阳性对照。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明书，所述的说明书记载了利用本发明miRNA芯片对SEQ ID NO.:1-31所示部分或全部序列进行测试的方法。
本发明的第八方面，提供一种筛选治疗膀胱癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在实验组中，在待测物质存在下培养膀胱癌细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的膀胱癌细胞；
(b)测定所述实验组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平，并与对照组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；
其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗膀胱癌的候选药物。
在另一优选例中，所述的miRNA为第二方面所述的miRNA集合或组合。
在另一优选例中，所述的“发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化”指指对于某一miRNA而言，满足下式：
Q≤0.6
其中，Q＝abs(A1-A0)/abs(A2-A0)
式中，
A0为癌旁细胞中所述miRNA表达水平；
A1为实验组的所述miRNA表达水平；
A2为对照组的所述miRNA表达水平；
abs表示绝对值。
在另一优选例中，当所述miRNA为膀胱癌上调型(即A2-A0＞0)时，则A1-A0≤0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。
在另一优选例中，当所述miRNA为膀胱癌下调型(即A2-A0＜0)时，则A1-A0≥0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。
在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(a)中还包括阳性对照组，即在与所述实验组条件相同且不存在所述待测物质但存在已知治疗膀胱癌药物的情况下，培养相同的膀胱癌细胞；
并且，在步骤(b)中还包括将所述实验组中膀胱癌细胞的一种或多种miRNA的表达水平，并与所述阳性对照组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平进行比较。
本发明的第九方面，提供一种体外非诊断性的判断细胞或组织是否为膀胱癌细胞或组织的方法，所述方法包括步骤：
测定所述的细胞或组织中第一方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常组织或癌旁组织相比，具有显著的差异，则说明该细胞或组织是膀胱癌细胞或组织。
本发明的第十方面，提供一种诊断膀胱癌样本的方法，包括步骤：测定样本中本发明第一方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常样本相比，具有显著的差异，则说明该样本为膀胱癌样本。
本发明提供了31个与膀胱癌诊断相关的miRNA标志物，由其中两个或两个以上的miRNA组合形成的指纹图谱，基于相对于正常或良性对照组织中差异表达的膀胱癌特异miRNA的特征，用于区分膀胱癌组织和癌旁(正常)组织，实现膀胱癌诊断的目的。具体地，在本研究中，发明人通过miRNAs的定量聚合酶链反应(qPCR)的实验方法，检测并分析膀胱癌肿瘤组织和癌旁(正常)组织中miRNA表达情况，并通过生物信息学的方法筛选出用于区分膀胱癌肿瘤组织和癌旁(正常)组织的miRNA指纹图谱。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对4个选定的miRNA组合10对膀胱癌区分，其中A为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，y轴表示每个样本的概率(>＝0.5为癌症，<0.5为正常或良性)，所有组织样本(N＝38)被分为两部分，右边部分表示正常(癌旁)对照组织，左边部分为癌症组(膀胱癌组织)，错误率为0(38例样品中错0个)，100％完全区分；B为通过SVM模型基于留一法交叉检验得出癌旁(正常)对照组织与膀胱癌组织组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏度，x轴表示特异性，AUC＝1。
图2为选定的4个miRNA组合10预测区分膀胱癌组与正常(癌旁)对照组，y轴表示每个样本的概率(>＝0.5为癌症，<0.5为正常或良性)，所有组织样本(N＝21)被分为两部分，右边部分表示正常(癌旁)对照组织，左边部分为癌症组(膀胱癌组织)，错误率为0(21例样品中错0个)，准确率100％。
具体实施方式
本发明人通过大量的筛选首次筛选出数个特异性的miRNA，经检验证明，这些特异性的miRNA能够非常有效地区分膀胱癌组织及癌旁(正常)组织。具体地，发明人基于SYBR-GREEN荧光定量RT-PCR检测方法，检测分析384个miRNA在膀胱组织样品中的表达，提供了31个与膀胱癌诊断相关的miRNA标志物，研究结果显示本发明的miRNA指纹图谱能够从膀胱癌癌旁(正常)组织中显著的区分恶性的膀胱癌肿瘤组织。本发明提供miRNA组成的指纹图谱在膀胱癌诊断中的应用，围绕小RNA的表达可以通过实时定量PCR方法或荧光定量PCR反应检测，实现膀胱癌诊断的目的。在此基础上完成了本发明。
miRNA及其前体
本发明提供了一组新的与膀胱癌相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:n所示的序列，其中n为选自1-31的正整数。
为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含义。
对于本发明所揭示的膀胱癌特异性的miRNA，可以通过常规的miRNA芯片技术进行验证，例如包括用常规方法或常规试剂盒抽提miRNA，然后进行检测。代表性的试剂盒包括(但并不限于)：Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提。
此外，还可通过特异性扩增并检测扩增产物(或相应的荧光信号等可检测信号)来检测或验证本发明的膀胱癌特异性的miRNA。优选的高灵敏度和高特异性的的技术包括(但并不限于)：CN10267663A中所公开的技术。通常，所用引物的特异性结合区可根据所需检测的已知miRNA的序列进行设计，优选地扩增时所用引物的特异性结合区通常是与miRNA完全互补的互补序列。
miRNA集合或组合
本发明提供了一种miRNA的集合或组合，所述的miRNA集合或组合可用于制备区分膀胱癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。如本文所用，术语“miRNA集合或组合”、“miRNA指纹图谱”可互换使用，均指的是能够特异地、灵敏地区分膀胱癌组织和正常组织(癌旁组织)的miRNA的总和。
在本发明中，所述的miRNA集合或组合含有SEQ ID NO.:1-31所示的全部序列。
应理解，本发明的miRNA集合或组合可将SEQ ID NO.:1-31所示的序列，通过本领域常规技术设计制备针对这些miRNA集合或组合的寡核苷酸探针，并制备成miRNA芯片或试剂盒以区别膀胱癌和癌旁(正常)组织。
此外，本发明miRNA集合或组合还可作为所述miRNA芯片或试剂盒的阳性对照，独立包装或经固相载体固定后作为对照。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
miRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种miRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种miRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的miRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分膀胱癌和癌旁组织。
本发明所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于(互补或基本互补于)SEQ ID NO:1-31中的至少一种。
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：
(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；
(2)将步骤(1)得到的RNA与所述的miRNA芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；
(3)检测步骤(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。
从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。
更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。
对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。
将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
检测试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于区分膀胱癌组织和癌旁(正常)组织。
更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。扩增液中还可含有荧光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的试剂盒中还可包括引物。
另外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供了一类可用于区分膀胱癌组织和癌旁(正常)组织的新的miRNA指纹图谱；
(2)本发明的miRNA指纹图谱，能够非常有效地区分膀胱癌组织和癌旁(正常)组织，灵敏度高、特异性强。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
样本的收集和信息分析
本研究样品为2016年3月至2016年11月期间，从复旦大学附属中山医院收集所得的冰冻组织样本。所有样品收集经过个人同意，并遵循医院的伦理委员会批准，病理诊断结果经两名以上病理医师确认。总共59例样本，包括30例膀胱癌样本，29例癌旁(正常)组织样本，年龄从46至90岁(平均71.1岁)。样本从病人身体中移除并存储于-80℃。患者临床资料包括发病年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级等样本信息见表1。
表1样品信息
生物统计分析时将59例样本分为两大部分，第一部分为训练建模样本，包括19例膀胱癌样本，19例配对的癌旁(正常)组织样本，共计38例样本；第二部分为检测样本，包括11例膀胱癌样本，10例癌旁(正常)组织样本，共计21例样本。
实施例2
总RNA抽提
从冰冻组织切取大约50mg的组织碎片，参照miRNeasy mini kit(Qiagen，217004)说明书，抽提总RNA。
电泳检测质量，用紫外分光光度法测定OD260nm和OD280nm，计算RNA浓度。-80℃保存。
实施例3
加PolyA尾并反转录
将上述实施例2抽提得到的总RNA用含有0.1％Tween-20(Sigma)的0.1xRNA储存缓冲液(Ambion、USA)稀释成1ng/ul。
用盛元公司生产的 miRNA cDNA合成盒(盛元公司产品编号：9000004)为miRNA加上PolyA的尾，并且反转录为cDNA。具体步骤为：
将1.5ml离心管置于冰上，加入40微升浓度为1ng/ul的总RNA，20微升盛元公司生产的 miRNA cDNA合成反应液I(盛元公司产品编号：9000005)6.67微升盛元公司生产的 miRNA cDNA合成反应液II(盛元公司产品编号：9000006)，和去核酸酶的超纯水至33.3微升。总RNA量为40ng，轻柔混匀后分装入2个0.2ml的PCR管，每管50ul。1000rpm离心10s后放入ABI9700PCR仪进行反应，反应程序：37℃60min，95℃10min，4℃保持。
取出PCR管，将2管RT产物合并，震荡离心后-20℃保存或者直接用于qPCR反应。
实施例4
荧光定量PCR检测
在15毫升的离心管中加入92微升实施例3得到的反转录产物，2304微升盛元公司生产的荧光定量PCR酶反应液(盛元公司产品编号：9000008，2x UniversalqPCR Master Mix High Rox)，289微升去核酸酶超纯水(盛元公司产品编号：9000015)，轻柔混匀。
将盛元公司生产的小RNA反应模板芯片，SharpvueTM Bladder cancer miRNAArray(盛元公司产品编号：1000030)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(Thermo、ST16R，转头型号：M-20)。共384个小RNA反应液，每个反应模板上有3对阳性对照和1个空白对照。小心解开封膜。
将前述步骤得到的混合液倒入加样槽中，使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入盛元公司生产的小RNA反应模板芯片中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。
使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心2min。
放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃10min，后运行96℃5s，58℃1min，3个循环；之后96℃5s，60℃30s，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为SYBR，参比荧光设为Rox。收集数据，进行生物信息学分析。
实施例5
miRNA生物统计数据的计算分析
基于荧光定量PCR得到的384个miRNA的表达数据，通过R和e1071软件包进行分析。首先，如果任一miRNA的检测Ct值大于32，那么其Ct值设置为32。然后，通过比较肿瘤组织和对照组织每一miRNA的Ct平均值，发现有366个miRNA在肿瘤组织和对照组织的平均Ct值均低于32。在随后的训练建模分析中，19例肿瘤组织和19例正常(癌旁)组织之间的miRNA比较分析，通过使用t检验分析所得，倍数变化2以上的被称为差异表达。
如表2所示在膀胱癌组织和正常癌旁组织中miRNA的显著表达，69种miRNA在膀胱癌组织表达倍数大于2，其中5种上调(hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-431、hsa-miR-429、hsa-miR-425)，64种下调(hsa-miR-1、hsa-miR-125b、hsa-miR-99a、hsa-miR-145、hsa-miR-100、hsa-miR-143等最显著)。
表2膀胱癌组织miRNA表达倍数2以上的69种miRNA表达情况
通过计算比较每两个不同的miRNA Ct值之间的差异，产生66430个新变量，加上原先的366个数据变量，共得到66796个变量。
对所有变量进行T检验分析，取2个P值最大的变量和P值最小的前24个变量，去除重复的miRNA，获得31个miRNA作为标志物，见表3，其中hsa-miR-431表达上调，hsa-miR-10b、hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-24、hsa-miR-30a表达下调。
本发明中，miRNA的命名是根据miRBase Version 20的miRNA数据库，在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。
表3：膀胱癌诊断的生物标志物
SEQ ID NO.: miRNA名称 成熟的miRNA序列
1 hsa-let-7a# CUAUACAAUCUACUGUCUUUC
2 hsa-miR-1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
3 hsa-miR-10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG
4 hsa-miR-1260 AUCCCACCUCUGCCACCA
5 hsa-miR-133a UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG
6 hsa-miR-145 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
7 hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG
8 hsa-miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
9 hsa-miR-16-1# CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA
10 hsa-miR-181c# AACCAUCGACCGUUGAGUGGAC
11 hsa-miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
12 hsa-miR-21# CAACACCAGUCGAUGGGCUGU
13 hsa-miR-24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG
14 hsa-miR-25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA
15 hsa-miR-296-3p GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC
16 hsa-miR-30a UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG
17 hsa-miR-3162-3p UCCCUACCCCUCCACUCCCCA
18 hsa-miR-324-5p CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU
19 hsa-miR-326 CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG
20 hsa-miR-378b ACUGGACUUGGAGGCAGAA
21 hsa-miR-3944 UUCGGGCUGGCCUGCUGCUCCGG
22 hsa-miR-4251 CCUGAGAAAAGGGCCAA
23 hsa-miR-4306 UGGAGAGAAAGGCAGUA
24 hsa-miR-431 UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA
25 hsa-miR-449b AGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGC
26 hsa-miR-4787-3p GAUGCGCCGCCCACUGCCCCGCGC
27 hsa-miR-484 UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU
28 hsa-miR-625# GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA
29 hsa-miR-671-3p UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC
30 hsa-miR-766 ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC
31 hsa-miR-99b CACCCGUAGAACCGACCUUGCG
从31个miRNA中，通过随机选取小于或等于12个miRNA，得到所有的miRNA组合，通过使用三种计算机算法：支持向量法(SVM,Bioconductor package“e1071”)，KNN算法(Bioconductor package“class”)和对角线线性判别分析法(Bioconductor package“sfsmisc”)，算法的性能采用留一交叉验证程序，对不同数量和组合的预测标志物进行训练集样品分析的初步评估。
实施例6
对所选定的31个miRNA进行诊断特异性和灵敏度的验证
对选定的31个miRNA所形成的组合用SVM的统计学方法进行验证，得到了灵敏度和特异性最好的10组miRNA组合，见表4和表5，列表中所选的miRNA组合对38例训练样品进行了验证，得到的ROC曲线，AUC为1，所选择的标记物检测膀胱癌组织的灵敏度为100％，特异性为100％(以组合10为例，如图1所示)，10组miRNA指纹图谱的组合，均能达到满足临床要求的诊断特异性和灵敏度。
表4 10组诊断膀胱癌的特异性miRNA组合
组合名称 miRNA 1 miRNA 2 miRNA 3 miRNA 4
miRNA组合1 hsa-miR-133a hsa-miR-431 hsa-miR-4251
miRNA组合2 hsa-miR-296-3p hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合3 hsa-miR-10b hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合4 hsa-miR-484 hsa-miR-449b hsa-miR-133a
miRNA组合5 hsa-let-7a# hsa-miR-133a hsa-miR-431 hsa-miR-4251
miRNA组合6 hsa-let-7a# hsa-miR-449b hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合7 hsa-miR-1260 hsa-miR-449b hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合8 hsa-miR-296-3p hsa-miR-449b hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合9 hsa-miR-484 hsa-miR-449b hsa-miR-133a hsa-miR-4251
miRNA组合10 hsa-miR-326 hsa-miR-181c# hsa-miR-133a hsa-miR-4251
表5 SVM验证结果
实施例7
膀胱癌特异性miRNA标志物组合检测样本验证
按照实施例2、3、4的方法检测21例样本，包括11例膀胱癌样本，10例癌旁(正常)组织样本，用实施例6中确定的10组膀胱癌miRNA指纹图谱通过SVM的统计学方法进行验证。
所选择的10组标记物检测膀胱癌组织的灵敏度均为100％，特异性均大于90％，准确率均大于95％，如表6所示，优选的，组合10检测样本灵敏度100％，特异性100％，准确率为100％(如图2所示)。检测结果充分验证了所用模型的可靠性和稳定性以及进一步验证了所选择的miRNA标志物。
表6 10组膀胱癌特异性的miRNA组合验证结果
可见本发明miRNA指纹图谱能够完全高效和准确地区分膀胱癌组织和正常组织(癌旁组织)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海翔琼生物技术有限公司
<120> 小RNA组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
<130> P2017-0049
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
cuauacaauc uacugucuuu c 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
uacccuguag aaccgaauuu gug 23
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
aucccaccuc ugccacca 18
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
guccaguuuu cccaggaauc ccu 23
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
uagcagcaca uaaugguuug ug 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
ccaguauuaa cugugcugcu ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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aaccaucgac cguugagugg ac 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
uagcuuauca gacugauguu ga 22
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caacaccagu cgaugggcug u 21
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uggcucaguu cagcaggaac ag 22
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cauugcacuu gucucggucu ga 22
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gaggguuggg uggaggcucu cc 22
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uucgggcugg ccugcugcuc cgg 23
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ccugagaaaa gggccaa 17
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uggagagaaa ggcagua 17
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ugucuugcag gccgucaugc a 21
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aggcagugua uuguuagcug gc 22
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gaugcgccgc ccacugcccc gcgc 24
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ucaggcucag uccccucccg au 22
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<400> 29
uccgguucuc agggcuccac c 21
<210> 30
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
acuccagccc cacagccuca gc 22
<210> 31
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
cacccguaga accgaccuug cg 22

Claims (10)

1.一种miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合为：
(a)序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；
(b)与SEQ ID NO:1-31所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合；或
(c)至少一种来自序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA与至少一种来自与SEQ ID NO:1-31所示序列互补的miRNA构成的组合，其中来自序列如SEQ ID NO:1-31所示的miRNA的序列与来自与SEQ ID NO:1-31所示序列互补的miRNA的序列互相不为互补。
2.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述miRNA集合或组合由如SEQID NO:1，3，4，5，10，15，19，22，24，25，27所示的序列中3-5种miRNA所构成。
3.一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，其特征在于，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA集合或组合中的miRNA。
4.一种分离的多核苷酸集合或组合，其特征在于，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述miRNA集合或组合中的miRNA；
较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I，
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA集合或组合，或权利要求4所述的多核苷酸集合或组合。
6.一种miRNA芯片，其特征在于，
所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-31所示的部分或全部序列。
7.如权利要求6所述的miRNA芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-3所示的全部序列。
8.权利要求1所述miRNA集合或组合、和/或权利要求6所述miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备区分膀胱癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。
9.一种试剂盒，所述的试剂盒中含有权利要求6所述的miRNA芯片；和/或
检测权利要求1所述miRNA集合或组合的试剂。
10.一种筛选治疗膀胱癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在实验组中，在待测物质存在下培养膀胱癌细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的膀胱癌细胞；
(b)测定所述实验组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平，并与对照组中膀胱癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；
其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗膀胱癌的候选药物。
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