CN105985955A - 小rna组成的指纹图谱在胃癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小RNA组成的指纹图谱在人胃癌诊断和治疗中的应用，由数个microRNA组成的指纹图谱可非常有效地区分胃癌组织和癌旁(正常)组织，灵敏度高，特异性强，可有效用于胃癌诊断。

Description

小RNA组成的指纹图谱在胃癌中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学、生物工程和检测技术领域。具体地，本发明公开了一组小RNA(miRNA；microRNA)指纹图谱在人胃癌诊断中的用途。

背景技术

目前，中国已经成为全球胃癌高发区，每年新发病例40万，死亡30万，且超世界平均水平两倍以上。并且胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。过去半个世纪，人们对胃癌的基础和临床研究投入了大量精力，对胃癌潜在致癌因素有了一定了解(如幽门螺旋杆菌)、胃癌高危人群的有效筛查和早诊率的提高、外科手术和多种治疗手段的应用，胃癌患者的预后有了显著的提高，但总体的5年生存率仍然徘徊于20％。此外，大部分胃癌患者依然难以早期发现，据我们前期研究显示，胃癌患者初诊时60％病例合并淋巴结转移，而超过5％患者存在脏器转移，即使行根治性切除，大部分患者还会出现复发和转移。

胃癌的分期系统是由美国癌症联合委员会AJCC于国际抗癌联盟UICC共同制定，以胃癌数据库为基础，并确切指出淋巴结阳性患者的预后和淋巴结转移的数目有关。现代的胃癌分期是基于原发肿瘤/淋巴结/远处转移(TNM)的系统，而不是以肿瘤的大小为基础。

对于胃癌的基础和临床研究已有相当长的历史，并且取得了显著的进展，尤其是miRNAs在胃癌中的研究，近几年进展较快，业已发现miRNAs在胃癌发生、转移、诊断、评估疗效和判断预后等方面发挥了极其重要的作用。

MicroRNA(miRNA)是一类长度约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，调节约60％的人类编码基因，介导和调节多种病理生理反应。MiRNAs在胃癌发生中起到促癌或者抑癌的功能，通过调控相关基因的表达促进或抑制胃癌的增殖、侵袭和转移。

因此，深入挖掘胃癌发病相关miRNAs，并阐明其作用机制和临床意义，对于指导胃癌诊疗和评估预后具有重要的指导意义。

发明内容

本发明提供了一组与胃癌发病相关的miRNA，利用这些miRNA的表达量可以准确地区分胃癌组织和癌旁组织。

本发明第一方面，提供了一种miRNA集合或组合，所述的miRNA集合或组合包括：

(a)SEQ ID NO.:1-9所示的9个序列；或

(b)与SEQ ID NO.:1-9所示序列互补的9个互补序列；或

(c)来自(a)或(b)的组合，且来自(a)的序列与来自(b)的互补序列互相不为互补。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合还包括：

(a1)一种或多种选自SEQ ID NO.:10-12所示的序列；或

(b1)一种或多种选自与SEQ ID NO.:10-12所示序列互补的互补序列；或

(c2)来自(a1)或(b1)的组合，且来自(a1)的序列与来自(b1)的互补序列互相不为互补。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合含有SEQ ID NO.:1-9所示的全部序列。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括：

(i)序列如SEQ ID NO:1-12所示的12个序列；或

(i i)与SEQ ID NO:1-12所示序列互补的12个序列。

在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。

在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。

本发明第二方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面所述miRNA集合或组合中的miRNA；

较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向 式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明第四方面，提供了一种载体，它含有本发明第一方面所述的miRNA集合或组合，或本发明第三方面所述的多核苷酸集合或组合。

本发明第五方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-9所示全部序列。

在另一优选例中，所述的特异性地对应指的是所述的寡核苷酸探针上的序列分别与SEQ ID NO.:1-9所示的序列互补或基本互补；或分别与SEQ ID NO.:1-9所示序列相同。

在另一优选例中，所述的芯片还含有特异性针对一种或多种选自SEQ ID NO.:10-12所示序列的寡核苷酸探针。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

互补结合区；和/或

与固相载体相连的连接区。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-12所示的全部序列。

本发明第六方面本发明第一方面所述miRNA集合或组合；和/或本发明第五方面所述miRNA芯片的用途，用于制备区分胃癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。

本发明第七方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第五方面所述的miRNA芯片和/或用于本发明第一方面所述miRNA集合或组合的检测试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有本发明第一方面所述的miRNA集合或组合用于阳性对照。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明书，所述的说明书记载了利用本发明miRNA芯片对SEQ ID NO.:1-12所示序列进行测试的方法。

本发明第八方面，提供了一种筛选治疗胃癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在实验组中，在待测物质存在下培养胃癌细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的胃癌细胞；

(b)测定所述实验组中胃癌细胞的miRNA的表达水平，并与对照组中胃癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；

其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗胃癌的候选药物。

在另一优选例中，所述的miRNA为本发明第一方面所述的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的“发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化”指对于某一miRNA而言，满足下式：

Q≤0.6

其中，Q＝abs(A1-A0)/abs(A2-A0)

式中，

A0为癌旁细胞中所述miRNA表达水平；

A1为实验组的所述miRNA表达水平；

A2为对照组的所述miRNA表达水平；

abs表示绝对值。

在另一优选例中，当所述miRNA为胃癌上调型(即A2-A0＞0)时，则A1-A0≤0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。

在另一优选例中，当所述miRNA为胃癌下调型(即A2-A0＜0)时，则A1-A0≥0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。

在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(a)中还包括阳性对照组，即在与所述实验组条件相同且不存在所述待测物质但存在已知治疗胃癌药物的情况下，培养相同的胃癌细胞；

并且，在步骤(b)中还包括将所述实验组中胃癌细胞的一种或多种miRNA的表达水平，并与所述阳性对照组中胃癌细胞的miRNA的表达水平进行比较。

本发明第九方面，提供了一种体外非诊断性的判断细胞或组织是否为胃癌细胞或组织的方法，包括步骤：测定所述的细胞或组织中本发明第一方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常组织或癌旁组织相比，具有显著的差异，则说明该细胞或组织是胃癌细胞或组织。

本发明第十方面，提供了一种诊断胃癌样本的方法，包括步骤：测定样本中本发明第一方面所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常样本相比，具有显著的差异，则说明该样本为胃癌样本。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对12个选定的miRNA对胃癌区分：

图1A为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出胃癌组与正常对照组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性，AUC＝0.985；

图1B为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，y轴表示每个样本的概率密度，x轴表示SVM(支持向量机)算法之值，所有样本(N＝61)，被分为两部分，红色为癌症样本包括21种胃癌细胞系，绿色为对照正常组织，错误率为4.92％(61例样品中错3个)。

图2显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对9个选定的miRNA组合9A，对胃癌区分：

图2A为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出胃癌组与正常对照组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性，AUC＝0.988；

图2B为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，y轴表示每个样本的概率密度，x轴表示SVM(支持向量机)算法之值，所有样本(N＝61)，被分为两部分，红色为癌症样本包括21种胃癌细胞系，绿色为对照正常组织，错误率为6.56％(61例样品中错4个)。

图3显示了通过SVM模型和留一法交叉验证法对9个选定的miRNA组合9B，对胃癌区分：

图3A为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出胃癌组与正常对照组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性，AUC＝0.924；

图3B为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，y轴表示每个样本的概率密度，x轴表示SVM(支持向量机)算法之值，所有样本(N＝61)，被分为两部分，红色为癌症样本包括21种胃癌细胞系，绿色为对照正常组织，错误率为13.1％(61例样品中错8个)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过对近两千个miRNA初筛以及近800个与胃癌相关的miRNA的进一步筛选，首次筛选出数个特异性的miRNA，经检验证明，将这些特异性的miRNA标志物进行一定的组合可非常有效地区分胃癌组织及癌旁组织。本发明提出了miRNA组成的指纹图谱在胃癌诊断中的应用，而围绕小RNA的表达可以通过荧光定量PCR反应检测，提供在胃癌检测中的应用。在此基础上，完成了本发明。

miRNA及其前体

本发明提供了一组新的与胃癌相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:n所示的序列，其中n为选自1-12的正整数。

为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含义。

对于本发明所揭示的胃癌特异性的miRNA，可以通过常规的miRNA芯片技术进行验证，例如包括用常规方法或常规试剂盒抽提miRNA，然后进行检测。代表性的试剂盒包括(但并不限于)：Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提。

此外，还可通过特异性扩增并检测扩增产物(或相应的荧光信号等可检测信号)来检测或验证本发明的胃癌特异性的miRNA。优选的高灵敏度和高特异性的的技术包括(但并不限于)：CN10267663A中所公开的技术。通常，所用引物的特异性结合区可根据所需检测的已知miRNA的序列进行设计，优选地扩增时所用引物的特异性结合区通常是与miRNA完全互补的互补序列。

miRNA集合或组合

本发明提供了一种miRNA的集合或组合，所述的miRNA集合或组合可用于制备区分胃癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。如本文所用，术语“miRNA集合或组合”、“miRNA指纹图谱”可互换使用，均指的是能够特异地、灵敏地区分胃癌组织和正常组织(癌旁组织)的miRNA的总和。

在本发明中，所述的miRNA集合或组合含有SEQ ID NO.:1-9所示的全部序列，优选地，还可以包括一种或多种选自SEQ ID NO.:10-12中所示的序列。通常，本发明miRNA集合或组合除了含有SEQ ID NO.:1-9所有的序列以外，还可以任意的含有SEQ ID NO.:10-12中一种或多种序列从而构成新的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合含有SEQ ID NO.:1-12所示的12个序列。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合含有9个小RNA(SEQ ID NO.:1-9)组成的小RNA指纹图谱，用于区分胃癌组织和癌旁组织。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合有9个小RNA(SEQ ID NO.:1-9、10-12)组成的小RNA指纹图谱，用于区分胃癌组织和癌旁组织。

本发明SEQ ID NO.:1-12所示的序列如下：

SEQ ID NO.:	miRNA名称	成熟的miRNA序列
			1	hsa-miR-551b	gcgacccauacuugguuucag
2	hsa-miR-204	uucccuuugucauccuaugccu
			3	hsa-miR-148a	ucagugcacuacagaacuuugu
4	hsa-miR196a	uagguaguuucauguuguuggg
			5	hsa-miR196b	uagguaguuuccuguuguuggg
6	hsa-miR-133b	uuugguccccuucaaccagcua
			7	hsa-miR-224	caagucacuagugguuccguu
8	hsa-miR-375	uuuguucguucggcucgcguga
			9	hsa-miR-31#	ugcuaugccaacauauugccau
10	hsa-miR-31	aggcaagaugcuggcauagcu
			11	hsa-miR-378d	acuggacuuggagucagaaa
12	hsa-miR-378	acuggacuuggagucagaaggc

其中，HSA-MIR-196a/b在胃癌组织中表达上调，而其他miRNA则在胃癌组织中下调。

应理解，本发明的miRNA集合或组合可将SEQ ID NO.:1-9所示的序列，较佳地SEQ ID NO.:1-12所示序列进行任意地组合，优选为含有SEQ ID NO.:1-2所示的序列，从而通过本领域常规技术设计制备针对这些miRNA集合或组合的寡核苷酸探针，并制备成miRNA芯片或试剂盒以区别胃癌和癌旁(正常)组织。

此外，本发明miRNA集合或组合还可作为所述miRNA芯片或试剂盒的阳性对照，独立包装或经固相载体固定后作为对照。

反义寡核苷酸

根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-ol igonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucle ic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。

将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_{正 向}基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

miRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种miRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种miRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的miRNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分胃癌和癌旁组织。

本发明的所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于(互补或基本互补于)SEQ ID NO:1-9，较佳地还包括10-12所示的序列中的至少1种；较佳地，所述的寡核苷酸探针至少特异性地对应于(互补或基本互补于)SEQ ID NO.:1-12所示的序列。

具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.eris i,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabol ic and genetic control of gene express ion on agenomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将步骤(1)得到的RNA与所述的miRNA芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测步骤(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于区分胃癌组织和癌旁(正常)组织。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。扩增液中还可含有荧光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的试剂盒中还可包括引物。

另外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一类可用于区分胃癌组织和癌旁(正常)组织的新的miRNA指纹图谱；

(2)本发明的miRNA指纹图谱，可非常有效地区分胃癌组织和癌旁(正常)组织，灵敏度高、特异性强。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1样本的收集和信息分析

本研究样品为2011年至2013年期间，长征医院收集所得存档的石蜡样本。所有样品收集经过个人同意，并根据医院的伦理委员会批准协议，病理诊断结果经两名以上病理医师确认。所有病例均为腺癌，肿瘤组织或粘膜组织占到样本的85％以上。患者临床资料包括发病年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移、浸润深度、组织分化和肿瘤TNM分期(AJCC第七版)等。

共93个样品参与了本实验，包括40例胃癌样本，32例正常组织样本，中位年龄59.5岁，以及21例胃癌细胞系。样本从病人身体中移除并存储于-80℃。其中样本被分为两大部分，第一部分为训练样本，包括20例胃癌样本，12例正常组织样本，共计32例样本；第二部分为检测样本，包括20例胃癌样本，20例正常组织样本，以及21种胃癌细胞系样本，共计61例样本。

实施例2总RNA抽提

从石蜡FFPE组织切取7-8片5微米或者4片10微米的组织碎片，去除组织周围多余石蜡。剩余的组织常温保存。

切取的碎片匀浆后，参照Deparaffinization solution(Qiagen，19093)说明书先对石蜡样本进行脱蜡；之后再参照miRNeasy FFPE kit(Qiagen，217504)说明书，抽提总RNA。

电泳检测质量，用紫外分光光度法测定OD260nm和OD280nm，计算RNA浓度。-80℃保存。

实施例3加PolyA尾并反转录

将上述实施例2抽提得到的总RNA用含有0.1％Tween-20(Sigma)的0.1xRNA储存缓冲液(Ambion、USA)稀释成125ng/ul。

用盛元公司生产的miRNA cDNA合成盒(盛元公司产品编号：9000004)为miRNA加上PolyA的尾，并且反转录为cDNA。具体步骤为：将1.5ml离心管置于冰上，加入66微升浓度为125ng/ul的总RNA，33微升盛元公司生产的miRNA cDNA合成反应液I(盛元公司产品编号：9000005)11微升盛元公司生产的miRNA cDNA合成反应液II(盛元公司产品编号：9000006)，和去核酸酶的超纯水至165微升。总RNA量的终浓度为50ng/ul，轻柔混匀后分装入3个0.2ml的PCR管，每管50ul。1000rpm离心10s后放入ABI9700PCR仪进行反应，反应程序：37℃15min，25℃25min，37℃30min，85℃5min，4℃保持。

取出PCR管，将3管RT产物合并，震荡离心后-20℃保存或者直接用于qPCR反应。

实施例4荧光定量PCR检测

在15毫升的离心管中加入141微升实施例3得到的反转录产物，10542微升盛元公司生产的荧光定量PCR酶反应液(盛元公司产品编号：9000008，2x Universal qPCR Master Mix High Rox)，4076微升去核酸酶超纯水(盛元公司产品编号：9000015)，轻柔混匀。

将盛元公司生产的小RNA反应模板，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-Av1.0(盛元公司产品编号：1000002)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-B v1.0(盛元公司产品编号：1000003)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-C v1.0(盛元公司产品编号：1000004)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-D v1.0(盛元公司产品编号：1000005)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-E v1.0(盛元公司产品编号：1000006)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(Thermo、ST16R，转头型号：M-20)。共1888个小RNA反应液，每个反应模板上有3对阳性对照和1个空白对照。小心解开封膜。

将前述步骤得到的混合液倒入加样槽中，使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入盛元公司生产的小RNA反应模板中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。

使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心5min。

放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃2min，后运行96℃5s，60℃1min，3个循环；之后96℃5s，60℃5s，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为SYBR，参比荧光设为Rox。收集数据，进行生物信息学分析。

实施例5miRNA生物统计数据的计算分析

小RNA数据分析图表通过使用R和Bioconductor软件包进行分析。在检测的1888个miRNA和两个内参对照(HSA-RNU6B和HSA-RNU48)，对1888种miRNA进行进一步的分析。确定了检测GC的miRNA panel(2块384孔板包含758个miRNA和10个内参)。发现在检测的72例石蜡组织样本以及21例细胞系中，758个miRNA的Ct值均低于35。每个miRNA的ct值和平均值被差减背景、归一化。

为了去除样品中RNA加入量的差异，分位数-median函数的分析方法用于处理原始的ct值(Sing等人；2005)，结果通过'arrayQual ityMetrics'进行数据分析。通过比对去除肿瘤组织样本(CZ-I I-39号)和癌旁组织样本(CZ-155N和CZ-428N)。

因此，分析了69例组织样本和21例细胞系的miRNA表达。在随后的统计分析，39例肿瘤组织，30瘤旁脂肪组织和21例细胞系之间的miRNA比较，差异表达的miRNA通过使用t检验分析所得，倍数变化2以上的被称为差异表达。

差异表达的miRNA通过使用三种计算机算法：支持向量法(SVM,Bioconductor package“e1071”)，KNN算法(Bioconductor package“class”)和对角线线性判别分析法(Bioconductor package“sfsmisc”)，算法的性能采用留一交叉验证程序，对不同数量的预测标志物进行初步评估。对每一组训练样本中，miRNA基于胃癌组织和瘤旁组织比较产生的t检验值和p值进行排名。前n的miRNA(n为2和35之间的阈值范围)被用来构建基于对训练样本的信息应用得到其余的测试样本的预算模型中。挑选FDR调整的p值低于0.1，差异变化倍数变化大于2的miRNA。

miRNA的命名是根据miRBase Version 20的miRNA数据库，在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。

结果：12个miRNA组成的指纹图谱被选为胃癌诊断的生物标志物(表1)

表1

SEQ ID NO.:	miRNA名称	成熟的miRNA序列
			1	hsa-miR-551b	gcgacccauacuugguuucag
2	hsa-miR-204	uucccuuugucauccuaugccu
			3	hsa-miR-148a	ucagugcacuacagaacuuugu
4	hsa-miR196a	uagguaguuucauguuguuggg
			5	hsa-miR196b	uagguaguuuccuguuguuggg
6	hsa-miR-133b	uuugguccccuucaaccagcua
			7	hsa-miR-224	caagucacuagugguuccguu
8	hsa-miR-375	uuuguucguucggcucgcguga
			9	hsa-miR-31#	ugcuaugccaacauauugccau
10	hsa-miR-31	aggcaagaugcuggcauagcu
			11	hsa-miR-378d	acuggacuuggagucagaaa
12	hsa-miR-378	acuggacuuggagucagaaggc

实施例6对所选定的12个miRNA进行诊断特异性、灵敏度的验证

对选定的12个miRNA用SVM的统计学方法进行验证，如图1所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为0.985，所选择的标记物检测胃癌组织的灵敏度为97％，特异性为90％。

实施例7从12个miRNA中进一步挑选关键miRNA

对实施例5中所选定的miRNA进一步进行排列组合，筛选和测试出特异性、灵敏度均能达到临床检测水平的miRNA组合。结果发现将部分特异性miRNA进行组合后，也能够较有效地诊断出胃癌组织，其中优选的例子如下：

7.1当选取SEQ ID NO.:1-9所示的序列时，标记为9A组，用SVM的统计学方法进行验证，如图2所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为0.988，所选择的标记物检测胃癌组织的灵敏度为95.1％，特异性为95％。

7.2当选取SEQ ID NO.:1-6、10-12所示的序列时，标记为9B组，用SVM的统计学方法进行验证，如图3所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为0.924，所选择的标记物检测胃癌组织的灵敏度为95.1％，特异性为70％。

结论：当选择SEQ ID NO.:1-9作为miRNA指纹图谱的组合时，就能达到满足临床要求的诊断特异性和灵敏度，而将指纹图谱中miRNA的数量扩大到12个时，则所获得的特异性和灵敏度更高。可见本发明miRNA指纹图谱能够非常高效地区分胃癌组织和正常组织(癌旁组织)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合包括：

(a)SEQ ID NO.:1-9所示的9个序列；或

(b)与SEQ ID NO.:1-9所示序列互补的9个互补序列；或

(c)来自(a)或(b)的组合，且来自(a)的序列与来自(b)的互补序列互相不为互补。

2.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合还包括：

(a1)一种或多种选自SEQ ID NO.:10-12所示的序列；或

(b1)一种或多种选自与SEQ ID NO.:10-12所示序列互补的互补序列；或

(c2)来自(a1)或(b1)的组合，且来自(a1)的序列与来自(b1)的互补序列互相不为互补。

3.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA集合或组合包括：

(i)序列如SEQ ID NO:1-12所示的12个序列；或

(i i)与SEQ ID NO:1-12所示序列互补的12个序列。

4.一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，其特征在于，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

5.一种分离的多核苷酸集合或组合，其特征在于，所述的多核苷酸集合或组合中的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述miRNA集合或组合中的miRNA；

较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向 式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA集合或组合，或权利要求5所述的多核苷酸集合或组合。

7.一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-9所示全部序列。

8.权利要求1所述miRNA集合或组合、和/或权利要求7所述miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备区分胃癌组织和癌旁组织的芯片或试剂盒。

9.提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有权利要求7所述的miRNA芯片和/或用于权利要求1所述miRNA集合或组合的检测试剂。

10.一种筛选治疗胃癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在实验组中，在待测物质存在下培养胃癌细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的胃癌细胞；

(b)测定所述实验组中胃癌细胞的miRNA的表达水平，并与对照组中胃癌细胞的miRNA的表达水平进行比较；

其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miRNA的表达水平发生了趋向于癌旁组织细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗胃癌的候选药物。

11.一种体外非诊断性的判断细胞或组织是否为胃癌细胞或组织的方法，其特征在于，包括步骤：测定所述的细胞或组织中权利要求1所述miRNA集合或组合中miRNA的表达水平，当所述的miRNA表达水平与正常组织或癌旁组织相比，具有显著的差异，则说明该细胞或组织是胃癌细胞或组织。