CN105779641A - 用于膀胱癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于膀胱癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：hsa‑miR‑384、hsa‑miR‑126‑5p、hsa‑miR‑424‑5p、hsa‑miR‑19b‑3p和hsa‑miR‑26a‑5p。本发明将膀胱癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT‑PCR中CT值小于30)的5种miRNA hsa‑miR‑384、hsa‑miR‑126‑5p、hsa‑miR‑19b‑3p、hsa‑miR‑424‑5p及hsa‑miR‑26a‑5p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，hsa‑miR‑384、hsa‑miR‑126‑5p和hsa‑miR‑424‑5p表达下调，hsa‑miR‑19b‑3p和hsa‑miR‑26a‑5p表达上调。这5种miRNA可以作为膀胱癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。

Description

用于膀胱癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测，涉及用于人膀胱癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系统肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。随着我国老龄化进程加速，膀胱癌发病率呈现逐年上升的趋势。国内大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的发病率已位列男性常见恶性肿瘤的第六位，而死亡率位列第七位。
MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上高度保守，数量约占基因组的1％，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋白质编码基因的表达：通过与其靶基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。人类基因组约30％的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
迄今为止，尚未寻找到可靠的microRNA生物标志物用于诊断人膀胱癌。
发明内容
本发明的目的在于提供用于膀胱癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一组用于人膀胱癌诊断的microRNA生物标志物，包括：hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p；所述hsa-miR-384的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述hsa-miR-126-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述hsa-miR-424-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述hsa-miR-19b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述hsa-miR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
进一步地，所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
一组人膀胱癌诊断用microRNA引物、探针的组合，包括hsa-miR-384引物、探针；hsa-miR-126-5p引物、探针；hsa-miR-424-5p引物、探针；hsa-miR-19b-3p引物、探针；hsa-miR-26a-5p引物、探针；所述引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物；hsa-miR-384的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-126-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-424-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-19b-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-26a-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
一种人膀胱癌的肿瘤诊断试剂盒，包括如上所述的microRNA引物、探针的组合。
进一步地，所述的人膀胱癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
本发明的优点：
本发明将膀胱癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNAhsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-424-5p及hsa-miR-26a-5p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-424-5p表达下调，hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p表达上调。这5种miRNA可以作为膀胱癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：膀胱癌组织差异性miRNA的筛选
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年1月-2014年3月经病理证实为膀胱癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围的癌旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
1.2主要仪器设备
台式离心机：EppendorfMinispin(美国)Eppendorfcentrifuge5810R(美国)
核酸浓缩仪：Eppendorfconcentrator5301(美国)
紫外分光光度计：DU640、天平(Beckman公司产品)
紫外交联仪：GSGENELINKERUVChamber(BIO-RAD公司产品)
水浴锅(Memert公司产品)
杂交盒、芯片、芯片扫描仪：LuxScan-10K/A(Capitalbio公司产品)
水平摇床：TDK-2(北京通达科技有限公司)
凝胶成像分析仪：GDS-7600(UPV产品)
超净工作台(Memert公司产品)
实时荧光PCR仪：ABIPRISM7500(美国)
1.3主要实验试剂
Trizol、糖原(Invitrogen公司)；T4RNA连接酶(NEB公司)；ControlRNA(Capitalbio公司)；5P’-C-U-Cy3-3’5P’-C-U-Cy5-3’(Dharmacon公司)；Ambion’smiRNAIsolationKit(Ambion公司)；EDPC、甲酞胺、澳酚蓝(Sigma公司)；20×SSC、10％SDS(PIERCE公司)；50×Dhardt’s(鼎国)；MOPS(Bocherigmer公司)；5×RTBuffer(美国Promega公司)、M-MLV逆转录酶：200u/μl(美国Promega公司)；4×dNTP：10mMeach(上海生工生物工程有限公司)；RNase抑制剂40u/μl(大连宝生物工程有限公司)。
1.4组织标本总RNA的提取
Trizol一步法提取组织标本中的总RNA。具体步骤如下：
(1)准备研钵、匀聚器、勺子、剪刀、镊子、液氮等器材和试剂；
(2)研钵预冷：往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷；
(3)带上手套，口罩，迅速从液氮罐中用镊子取出样本，在分析天平中称重，一次提取的组织块重量在0.3-0.5g之间。组织块放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织块融化。
(4)粗研磨后，在超净工作台中，用小勺迅速将研碎的组织移入装有Trizol试剂的勾装器中，按100mg组织加入1mlTrizol，匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。
(5)用滴管将匀浆液转移到1.5ml离心管中，每管放入约，室温放置以上，保存至-80℃冰箱中直至分析。
(6)匀浆标本常温解冻，按0.2ml氯仿/1mlTrizol的比例加入氯仿，vortex30秒，室温放置3min，然后4℃，12000rpm离心15min。
(7)离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相。RNA仅存在水相中，用加样器将上清转移到另一新的1.5ml离心管中，不要吸取中间层。按0.5ml异丙醇/1mlTrizol的比例加入异丙醇，混匀，室温放置10min以上，12000rpm4℃离心15min。
(8)弃去上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用加样器将剩余的异丙醇吸出，加入1ml75％乙醇，vortex，7500rpm4℃离心5min。
(9)弃去75％乙醇，通风橱中自然干燥30min，不要真空离心干燥，RNA不要完全干透，以防不能完全溶解，用DEPC水溶解RNA，每管溶于30μl，60-65℃助溶5min。
(10)RNA定量，吸取1μl的RNA样品，加入49μlDEPC水中，用加样器上下吹打混匀，稀释50倍。用溶解RNA的DEPC水标记空白，吸取50μl加入比色杯中。用紫外分光光度计DU-640测量OD值，计算比值OD260/OD280比值和RNA浓度。
RNA浓度＝OD260×40μg/ml×稀释倍数。
1.5总RNA中miRNA的分离提取
取50-100μg总RNA用Ambion’smiRNAIsolationKit分离miRNA，具体步骤如下：
(1)取50-100μg总RNA加入EP管，定容至适量体积。加入5倍体积的Lysis/BindingBuffer，混匀。
(2)加十分之一体积的miRNAHomogenateAdditive，振荡混匀，置于冰上孵育10分钟。
(3)加三分之一体积的100％乙醇，充分混勾。
(4)将上述混合液加入滤管中，5000rpm离心1分钟，收集滤液(小RNA在滤液中)。
(5)在滤液中加入三分之二体积的100％乙醇，充分混匀。
(6)更换滤管，将步骤(5)的混合物进行过滤，5000rpm离心1分钟，弃去滤液，收集管继续使用。
(7)将滤管放在收集管中，用700μl的miRNAwashingsolution1洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液。
(8)用500μl的miRNAwashingsolution2洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液；再用miRNAwashingsolution2洗一遍；将滤管连同收集管10000rpm离心1分钟，除去滤管中残留的液体。
(9)将elutionsolution加热到95℃；更换一个新的收集管，将50μl95℃的elutionsolution加入滤器，合上盖子，室温孵育2分钟；10000rpm离心1分钟，收集滤液，小RNA在滤液中。重复步骤(9)。
1.6miRNA芯片筛选
1.6.1miRNA芯片
哺乳动物miRNA芯片V3.0针对人677、大鼠292、小鼠461个成熟microRNA，由于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了924条探针(sangermiRNA数据库：miRNABase10.0)。把这些探针用芯片点样仪Smart-ArrayTM(CapitalbioCorp,Beijing,China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括人的U6、tRNA作为内标；8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，，50％DMSO作为杂交阴性对照。
1.6.2miRNA样品的荧光标记
具体步骤如下：
(1)miRNA的荧光标记：取2-5μg癌组织miRNA经聚乙二醇沉淀，用0.1mgATP、50mMHEPES、3.5mMDDT、20mMMgCl2、10mg/mlBSA、10％DMSO、500ngCy3标记的5P’-C-U-Cy3-3’(来自Dharmacon公司)和20单位的T4RNA连接酶，用枪头吹打，轻轻混匀。锡纸包裹样品管，在0℃标记反应2小时。同理用Cy5标记癌旁组织miRNA。两种标记后的miRNA混匀。
(2)miRNA的纯化：在上述荧光标记后的样品内加入DEPC水，补齐至100μl，加入十分之一体积-20℃预冷的3mmol/L醋酸钠(pH5.2)10μl、糖原10μg、2.5倍体积无水乙醇，于-20℃静置1小时。
(3)miRNA沉淀的漂洗：弃去上清，加入-20℃预冷的75％乙醇800μl，充分混匀后4℃下12000rpm离心5分钟。重复2次。弃去上清，在空气中干燥10min，吹干后用于芯片杂交。
1.6.3miRNA芯片杂交
具体步骤如下：
(1)将RNA溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺2.4μl；0.2％SDS3.2μl；3×SSC2.4μl；50×Denhardt’s1.6μl，DEPC处理水6.4μl)。
(2)恒温金属浴加温，溶解，振荡，混匀。
(3)取出，放置-20℃冰箱内10分钟，使之降温。
(4)95℃变形3min。
(5)冰上迅速冷却，全部滴加到哺乳动物microRNA芯片V3.0上，加盖硅化盖玻片。
(6)杂交盒内消毒后经双蒸水湿润的滤纸保持湿度，42℃杂交过夜，通常16小时以上。
(7)杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS、2×SSC的液体摇床中漂洗4分钟，而后在室温中含有0.2×SSC液体摇床中室温洗4分钟，玻片置于管中，1600rpm离心1分钟甩干后即可用于扫描。
1.6.4芯体扫描及数据处理
芯片用Luxscan10K/A双通道激光扫描仪(Capitalbio公司)进行扫描。数据提取采用Luxscan3.0图像分析软件(Capitalbio公司)对芯片图像分析，把图像信号转化为数字信号。
1.7miRNA芯片结果realtimeRT-PCR验证
1.7.1miRNArealtimeRT-PCR引物设计
特异的茎环引物(反转录引物序列)约56个核苷酸，其5’端的48个核苷酸序列是固定的，形成一个茎环的结构，其3’端的8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物(PCR前引物)长约30-31个核苷酸，在3’端有约16-17个核苷酸与对应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物(PCR后引物)约为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
1.7.2miRNArealtimeRT-PCR
1.7.2.1cDNA逆转录合成
组织标本总RNA逆转录合成cDNA，反应体系如下：
组分 体积(单位：μl)
总RNA模板 1μg(根据浓度计算体积)
Stem-loop RT primer(500nM) 1
5×RT Buffer 2
100mM DTT 1
dNTPs(10mM each) 0.5
RNase抑制剂(40U/μl) 0.1
M-MLV(200U/μl) 1
加DEPC水 至10μl
反应条件：16℃，30min；42℃，60min；85℃，5min；4℃，hold。
1.7.2.1miRNArealtimeRT-PCR反应
miRNArealtimeRT-PCR反应体系如下：
组分 体积(单位：μl)
SYBRRPremixExTaqTM(2×) 12.5
正向引物10μM 0.55 -->
反向通用引物μM 0.5
ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.5
DNA模板(稀释10倍) 2
DEPC处理水 至25
反应条件：95℃预变性10min；95℃5s、60℃34s×40。
1.8统计学分析
基因芯片筛选的结果采用Cluster3.0和SignificanceAnalysisofMicroarrys(SAM，version2.1)进行分析。数据以(±表示，组间比较采用检验，采用软件进行分析处理，为差异有统计学意义。RealtimeRT-PCR数据以(x±s)表示，组间比较采用t检验，采用SPSS17.0软件进行分析处理，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1miRNA基因芯片筛选结果
利用miRNA芯片对8对膀胱癌组织及配对的癌旁组织中924种miRNA表达情况进行分析，共筛选出18种差异性表达的miRNA，其中hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-193b、hsa-miR-26a-5p表达上调，hsa-miR-145、hsa-miR-384、hsa-miR-132、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-497、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、has-let-7b、hsa-miR-10a、hsa-miR-143、hsa-miR-125a-5p、rno-miR-324-3p表达下调。
2.2miRNA基因芯片筛选结果的realtimeRT-PCR验证
用miRNArealtimeRT-PCR对芯片筛查的结果进行验证，共筛选出8种差异性表达的miRNA，其中，hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-193b和hsa-miR-26a-5p表达上调，hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-384、hsa-miR-132、hsa-miR-99a表达下调。对其中表达差异性明显的5种miRNA，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-424-5p及hsa-miR-26a-5p进行进一步的血清学表达分析。
实施例2：膀胱癌组织中差异性miRNA的血清学分析
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年5月至2014年7月165例经病理诊断明确的膀胱癌患者和120例健康人清晨空腹静脉血6ml作为对照。所有膀胱癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗。120例健康对照组为未患有恶性肿瘤及其他疾病，同时年龄匹配的健康人群。
1.2血清样本采集及处理
抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4℃1300g(或4000rpm)离心15分钟，取上层血清每300μl分装至RNase-freeEP管置于-80℃冰箱储存。
1.3主要仪器设备
Eppendorfcentrifuge(美国)；水平层流洁净工作台(memert公司)；紫外分光光度计nano(Thermo科技)；水浴锅(memert公司)；定时定量PCR仪CFX96(德国BIO-RAD)；Vortex漩涡震荡仪(美国SI)；超低温冰箱(Thermo科技)；MilliQ纯水器(Synthesis公司)。
1.4主要实验试剂
血液总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)；裂解液RLS；去蛋白液RE；漂洗液RW；RNase-freeH2O；70％乙醇；RNase-free吸附性RA；miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)；E.coliPoly(A)Polymerase(5U/ml)；10×Poly(A)PolymeraseBuffer；5×rATPSolution；10×RTPrime；10×RTBuffer；SuperPuredNTPMixture；Rnasin；QuantRTase；RNase–FreeddH2O；miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)；2×miRNApremix(SYBRROX)；Reverseprimer；50×ROXReferenceDye；Chloroform(Sigma公司)。
1.5引物设计
1.6实验方法
1.6.1血清样本总RNA提取
(1)每250μl血清加入750μl裂解液RLS，用加样枪吹打样品几次，裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3:1。
(2)将样品剧烈震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)4℃条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入新的RNasefree的离心管中。
(4)每毫升RLS加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并室温下放置3分钟。
(5)于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入RA柱中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl事先在65℃水浴中加热的RNasefreewater，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
1.6.2cDNA转录
在血清样品总RNA提取后，采用在miRNA3’末端加多聚A尾Poly(A)，再使用oligo(dT)-universaltag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。
1.6.2.1miRNA3’末端进行Poly(A)处理
(1)在冰上预冷RNasefree的反应管内加入以下试剂至总体积20μl(最后加入E.coliPoly(A)Polymerase)。
组分 体积(μl) 终浓度
总RNA 可达2μg
E.coli Poly(A)Polymerase 0.4 2U
10×Poly(A)Polymerase Buffer 2 1×
10×rATP solution 4 1×
RNase free ddH2O - -
总体积 20 -
(2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟，继续实验。
1.6.2.1Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应
按照下表组分进行反应液的配制
组分 体积(μl)
Poly(A)反应液 2
10×stem-loop RT Prime 2
10×RT Buffer 2
Super Pure dNTP Mixture 1
Rnasin 18 -->
Quant RTase 0.5
RNase-Free ddH2O 11.5
总体积 20
1.6.3realtimeRT-PCR
(1)室温融化2×miRNApremix(SYBR)和Reverseprimer。
(2)将2×miRNApremix(SYBR)上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，轻轻微离心后使用。
(3)将试剂置于冰上，并按照下表配制反应体积。
组分 50μl体系 终浓度
2×miRNA premix(SYBR) 25 1×
Forward primer - 200nM
Reverse primer 1 200nM
miRNA第一链cDNA - -
ddH2O 至50μl -
PCR反应程序按照下表设置
循环 温度(℃) 时间 内容
1× 94 2min 起始模板变性
40-45× 94 20s PCR循环中模板变性
60 34s 退火、延伸
1.6.4PCR数据处理
PCR扩增结果用CT值来表示，CT值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△△CT方法计算，(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数，△CTsample＝CTsample–CTU6sample，△CTcontrol＝CTcontrol–CTU6control，△△CT＝△CTsample-△CTcontrol)。
1.7统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验，血清miRNA相对表达量与膀胱癌临床病理特征的关系采用MannWhiney检验及KruskalWallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1血清目标miRNA的realtimeRT-PCR检测
本研究对165例膀胱癌患者和120例健康对照组血清中目标miRNA表达情况进行了定量分析，采用U6作为内标，结果表明miRNA在血清中稳定表达，用U6作为内参稳定可靠。
2.2膀胱癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况
对照组与膀胱癌组hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-26a-5p及hsa-miR-384相对表达量比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
数据见下表。
组别 hsa-miR-26a-5p hsa-miR-126-5p hsa-miR-19b-3p hsa-miR-424-5p hsa-miR-384
对照组 1.13±0.22 1.03±0.29 1.18±0.26 0.90±0.12 0.94±0.17
膀胱癌组 2.89±0.25 0.47±0.32 2.95±0.23 0.57±0.14 0.51±0.21
t值 2.552 2.694 2.548 2.371 2.395
P值 0.011 0.012 0.01 0.010 0.011
本发明利用miRNA芯片对8对膀胱癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行了分析，共筛选出18种差异性表达的miRNA，实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证，共筛选出8种差异性表达的miRNA，其中，hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-193b和hsa-miR-26a-5p表达上调，hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-384、hsa-miR-132、hsa-miR-99a表达下调。肿瘤的发生是一系列分子生物学行为改变累计的结果，涉及到细胞周期、细胞凋亡、增殖分化等各个方面，因此应该有一系列miRNA表达的改变参与肿瘤的发生，基因芯片的结果验证了这一假设，多种miRNA的表达发生了改变。
表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-424-5p及hsa-miR-26a-5p进行进一步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-424-5p表达下调，hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p表达上调。该结果表明，这5种miRNA可作为膀胱癌诊断的生物标志物。
实施例3：受试者工作特征曲线(ROC)分析
构建ROC曲线来比较5个血清miRNA区分膀胱癌病人和健康对照的诊断能力。5个miRNAROC曲线下面积(AUC)分别为：hsa-miR-384，0.805(95％置信区间：0.760-0.920)；hsa-miR-126-5p，0.811(95％置信区间：0.736-0.902)；hsa-miR-424-5p，0.819(95％置信区间：0.734-0.894)；hsa-miR-19b-3p，0.803(95％置信区间：0.765-0.920)；hsa-miR-26a-5p，0.718(95％置信区间：0.644-0.832)。在最佳的cutoff值下，miRNA的灵敏度和特异性如下：hsa-miR-384，分别为83.3％和82.7％；hsa-miR-126-5p，分别为64.8％和94.2％；hsa-miR-424-5p，分别为90.7％和61.5％；hsa-miR-19b-3p，分别为70.4％和82.5％；hsa-miR-26a-5p，分别为67.3％和74.1％。这5个miRNA联合起来的AUC可以达到0.989，灵敏度和特异性分别为94.3％和93.2％，明显优于单个miRNA。该结果表明，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p联合起来对膀胱癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。
实施例4：人膀胱癌诊断用试剂盒
上述实施例表明，hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p联合起来对膀胱癌检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此，可基于hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p制作用于人膀胱癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括hsa-miR-384引物、探针；hsa-miR-126-5p引物、探针；hsa-miR-424-5p引物、探针；hsa-miR-19b-3p引物、探针；hsa-miR-26a-5p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，该试剂盒中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。下表为引物和探针的一种设计。
引物和探针的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (5)

1.一组用于人膀胱癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于包括：hsa-miR-384、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p；所述hsa-miR-384的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述hsa-miR-126-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述hsa-miR-424-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述hsa-miR-19b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述hsa-miR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的用于人膀胱癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于：所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
3.一组人膀胱癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于：包括hsa-miR-384引物、探针；hsa-miR-126-5p引物、探针；hsa-miR-424-5p引物、探针；hsa-miR-19b-3p引物、探针；hsa-miR-26a-5p引物、探针；所述引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物；hsa-miR-384的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-126-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-424-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-19b-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；hsa-miR-26a-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
4.一种人膀胱癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：包括如权利要求3所述的microRNA引物、探针的组合。
5.根据权利要求4所述的人膀胱癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
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CN108728439A (zh) * 2017-04-19 2018-11-02 上海翔琼生物技术有限公司 小rna组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
CN114269950A (zh) * 2019-08-19 2022-04-01 上海翔琼生物技术有限公司 检测膀胱及泌尿道上皮癌的尿液小rna指纹图谱及其应用

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