CN113025714B - 用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提出了用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述miRNA为hsa‑miR‑146b、hsa‑miR‑25‑3p、hsa‑miR‑296‑5p、hsa‑miR‑222‑3p、hsa‑miR‑21和hsa‑miR‑95组合；检测试剂盒包括能够扩增所述miRNA生物标志物的引物和能够检测所述miRNA生物标志物的探针。本发明的6种miRNA在血清中稳定表达，联合作为甲状腺癌颈侧方淋巴结转移诊断的生物标志物，其诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。本发明通过血清的miRNA进行甲状腺乳头状癌患者颈侧方淋巴结转移的诊断，与传统的病理活检相比，创伤更小，且适用于由于解剖位置等原因难以进行淋巴结穿刺的患者的术前诊断，同时在患者随访过程中可重复检测。

Description

用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标 志物及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒。

背景技术

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，近30余年，全世界甲状腺癌发病率逐年上升，目前已成为我国女性第四位高发恶性肿瘤，并呈现快速增长趋势。其中，乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)起源于甲状腺滤泡上皮细胞，是甲状腺癌中最常见的类型。约有27％的甲状腺乳头状癌的病人伴有颈侧方淋巴结转移，颈侧方淋巴结转移与患者器官的远处转移，死亡风险及复发风险显著相关。一旦复发，2/3的病人常伴有碘抵抗现象和多器官远处转移，极大地降低病人生存质量。同时，颈侧方淋巴结不仅意味着原发灶更高的侵袭性，也意味着更大的手术创伤及经济负担。因此，寻找特异性的早期诊断标志物，开发新的早期诊断方法，是分化型甲状腺癌的研究热点和难点，也具有重要的临床意义和社会效益。

MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上高度保守，数量约占基因组的1％，其在转录或转录后水平负调控蛋白质编码基因的表达，通过与其靶基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。miRNA人类基因组约30％的基因受miRNA调控，miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。现已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系密切。随着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。

目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测判断与甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移相关的特异性microRNA生物标志物组合及检测试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒。

用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物，所述miRNA为hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95组合。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述miRNA核苷酸序列如下：

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-146b的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-25-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-296-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-222-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-21的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-95的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述miRNA生物标志物来自血清。

更进一步优选的，还包括用于人甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的诊断试剂盒，包括miRNA生物标志物特异性结合的检测物。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测物包括能够扩增所述miRNA生物标志物的引物和能够检测所述miRNA生物标志物的探针。

在以上技术方案的基础上，优选的，采用real time RT-PCR方法检测所述miRNA生物标志物的表达量。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述miRNA生物标志物的探针序列如下所示：

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-146b的探针序列如SEQ ID NO.4所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-25-3p的探针序列如SEQ IDNO.8所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-296-5p的探针序列如SEQ IDNO.12所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-222-3p的探针序列如SEQ IDNO.16所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-21的探针序列如SEQ ID NO.20所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-95的探针序列如SEQ ID NO.24所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述miRNA生物标志物的引物包括反转录引物和上游引物。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述miRNA生物标志物的引物序列如下所示：

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-146b的反转录引物序列如SEQID NO.2所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-146b的上游引物序列如SEQ IDNO.3所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-25-3p的反转录引物序列如SEQID NO.6所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-25-3p的上游引物序列如SEQ IDNO.7所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-296-5p的反转录引物序列如SEQID NO.10所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-296-5p的上游引物序列如SEQID NO.11所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-222-3p的反转录引物序列如SEQID NO.14所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-222-3p的上游引物序列如SEQID NO.15所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-21的反转录引物序列如SEQ IDNO.18所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-21的上游引物序列如SEQ IDNO.19所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-95的反转录引物序列如SEQ IDNO.22所示；

在以上技术方案的基础上，优选的，所述hsa-miR-95的上游引物序列如SEQ IDNO.23所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测物还包括逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTPs、MgCl2和Taq酶。

本发明的用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明将颈侧方淋巴结转移及无颈侧方淋巴结转移的甲状腺乳头状患者癌组织及淋巴结组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的6种：miRNA hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95进行血清学表达分析，结果表明这6种miRNA在血清中稳定表达，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-222-3p表达上调，hsa-miR-21和hsa-miR-95表达下调。这6个miRNA联合起来的AUC可以达到0.997，灵敏度和特异性分别为99.4％和98.3％，这6种miRNA组合与甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的病症指标密切相关，可以作为生物标志物，对甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移病人进行筛查和诊断，为临床治疗提供有效依据。

(2)目前甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的miRNA诊断试剂盒相关研究较少，本发明弥补了该领域的空白。

(3)本发明通过血清的miRNA进行甲状腺乳头状癌患者颈侧方淋巴结转移的诊断，只需要血清而不需要其他组织样品，与传统的病理活检相比，创伤更小，检测更方便，定量精准，且适用于由于解剖位置等原因难以进行淋巴结穿刺的患者的术前诊断，同时在患者随访过程中可重复检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95在颈侧方淋巴结转移甲状腺癌组织和无颈侧方淋巴结转移甲状腺癌组织中的表达；

图2：hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95在颈侧方淋巴结转移患者及无颈侧方淋巴结转移患者血清中的表达；

图3：hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95为依据绘制的ROC曲线；

图4：hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95联合绘制的ROC曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1：伴颈侧方淋巴结转移及不伴颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌组织及淋巴结组织差异miRNA的筛选

1对象和方法

1.1标本来源

在取得患者知情同意后，收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2019年10月-2020年10月经病理证实为颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌乳头状癌患者手术后标本10对，包括癌组织标本10例，术后病理证实癌灶浸润50％以上的阳性淋巴结10例；收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2019年10月-2020年10月经病理证实为无颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌乳头状癌患者，或术前检查证实颈侧方淋巴结无异常，术后病理证实中央区淋巴结无转移的甲状腺乳头状癌患者(以下简称为无颈侧方淋巴结转移患者)手术后标本10对，包括癌组织标本10例，术后病理证实无癌灶浸润的淋巴结10例。所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。

颈侧方淋巴结转移的定义为：同侧、对侧或者双侧颈部Ⅱ区、Ⅲ区、Ⅳ区、Ⅴ区淋巴结的原发甲状腺乳头状癌病灶转移。

1.2主要仪器设备

台式离心机：EppendorfMini spin(美国)Eppendorfcentrifuge 5810R(美国)；核酸浓缩仪：Eppendorfconcentrator 5301(美国)；紫外分光光度计：DU640、天平(Beckman公司产品)；紫外交联仪：GS GENE LINKER UV Chamber(BIO-RAD公司产品)；水浴锅(Memert公司产品)；杂交盒、芯片、芯片扫描仪：LuxScan-10K/A(Capitalbio公司产品)；水平摇床：TDK-2(北京通达科技有限公司)；凝胶成像分析仪：GDS-7600(UPV产品)超净工作台(Memert公司产品)；实时荧光PCR仪：ABI PRISM7500(美国)。

1.3主要实验试剂

Trizol、糖原(Invitrogen公司)；T4RNA连接酶(NEB公司)；Control RNA(Capitalbio公司)；5P’-C-U-Cy3-3’5P’-C-U-Cy5-3’(Dharmacon公司)；Ambion’s miRNAIsolation Kit(Ambion公司)；EDPC、甲酞胺、澳酚蓝(Sigma公司)；20×SSC、10％SDS(PIERCE公司)；50×Dhardt’s(鼎国)；MOPS(Bocherigmer公司)；5×RT Buffer(美国Promega公司)、M-MLV逆转录酶：200u/μl(美国Promega公司)；4×dNTP：10mM each(上海生工生物工程有限公司)；RNase抑制剂40u/μl(大连宝生物工程有限公司)。

1.4组织标本总RNA的提取

Trizol一步法提取组织标本中的总RNA。具体步骤如下：

(1)准备研钵、匀聚器、勺子、剪刀、镊子、液氮等器材和试剂；

(2)研钵预冷：往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷；

(3)带上手套，口罩，迅速从液氮罐中用镊子取出样本，在分析天平中称重，一次提取的组织块重量在0.3-0.5g之间。组织块放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织块融化；

(4)粗研磨后，在超净工作台中，用小勺迅速将研碎的组织移入装有Trizol试剂的勾装器中，按100mg组织加入1ml Trizol，匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止；

(5)用滴管将匀浆液转移到1.5ml离心管中，每管放入约，室温放置以上，保存至-80℃冰箱中直至分析；

(6)匀浆标本常温解冻，按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，vortex30秒，室温放置3min，然后4℃，12000rpm离心15min；

(7)离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相。RNA仅存在水相中，用加样器将上清转移到另一新的1.5ml离心管中，不要吸取中间层。按0.5ml异丙醇/1mlTrizol的比例加入异丙醇，混匀，室温放置10min以上，12000rpm 4℃离心15min；

(8)弃去上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用加样器将剩余的异丙醇吸出，加入1ml 75％乙醇，vortex，7500rpm 4℃离心5min；

(9)弃去75％乙醇，通风橱中自然干燥30min，不要真空离心干燥，RNA不要完全干透，以防不能完全溶解，用DEPC水溶解RNA，每管溶于30μl，60-65℃助溶5min；

(10)RNA定量，吸取1μl的RNA样品，加入49μl DEPC水中，用加样器上下吹打混匀，稀释50倍。用溶解RNA的DEPC水标记空白，吸取50μl加入比色杯中；用紫外分光光度计DU-640测量OD值，计算比值OD260/OD280比值和RNA浓度；RNA浓度＝OD260×40μg/ml×稀释倍数。

1.5总RNA中miRNA的分离提取

取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNAIsolation Kit分离miRNA，具体步骤如下：

(1)取50-100μg总RNA加入EP管，定容至适量体积。加入5倍体积的Lysis/BindingBuffer，混匀；

(2)加十分之一体积的miRNAHomogenate Additive，振荡混匀，置于冰上孵育10分钟；

(3)加三分之一体积的100％乙醇，充分混匀；

(4)将上述混合液加入滤管中，5000rpm离心1分钟，收集滤液(小RNA在滤液中)；

(5)在滤液中加入三分之二体积的100％乙醇，充分混匀；

(6)更换滤管，将步骤S5的混合物进行过滤，5000rpm离心1分钟，弃去滤液，收集管继续使用；

(7)将滤管放在收集管中，用700μl的miRNAwashing solution 1洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液；

(8)用500μl的miRNAwashing solution 2洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液；再用miRNAwashing solution 2洗一遍；将滤管连同收集管10000rpm离心1分钟，除去滤管中残留的液体；

(9)将elution solution加热到95℃；更换一个新的收集管，将50μl 95℃的elution solution加入滤器，合上盖子，室温孵育2分钟；10000rpm离心1分钟，收集滤液，小RNA在滤液中；重复步骤9。

1.6miRNA芯片筛选

1.6.1miRNA芯片

哺乳动物miRNA芯片V3.0针对人677、大鼠292、小鼠461个成熟microRNA，由于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了924条探针(sangermiRNA数据库：mi RNABase10.0)。把这些探针用芯片点样仪Smart-Array TM(CapitalbioCorp,Beijing,China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括人的U6、tRNA作为内标；8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，50％DMSO作为杂交阴性对照。

1.6.2miRNA样品的荧光标记

具体步骤如下：

(1)miRNA的荧光标记：取2-5μg癌组织miRNA经聚乙二醇沉淀，用0.1mgATP、50mMHEPES、3.5m M DDT、20mM MgCl2、10mg/ml BSA、10％DMSO、500ng Cy3标记的5P’-C-U-Cy3-3’(来自Dharmacon公司)和20单位的T4RNA连接酶，用枪头吹打，轻轻混匀；锡纸包裹样品管，在0℃标记反应2小时，同理用Cy5标记癌旁组织miRNA，两种标记后的miRNA混匀；

(2)miRNA的纯化：在上述荧光标记后的样品内加入DEPC水，补齐至100μl，加入1/10体积-20℃预冷的3mmol/L醋酸钠(pH5.2)10μl、糖原10μg、2.5倍体积无水乙醇，于-20℃静置1小时；

(3)miRNA沉淀的漂洗：弃去上清，加入-20℃预冷的75％乙醇800μl，充分混匀后4℃下12000rpm离心5分钟，重复2次，弃去上清，在空气中干燥10min，吹干后用于芯片杂交。

1.6.3miRNA芯片杂交

具体步骤如下：

(1)将RNA溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺2.4μl；0.2％SDS 3.2μl；3×SSC 2.4μl；50×Denhardt’s 1.6μl，DEPC处理水6.4μl)；

(2)恒温金属浴加温，溶解，振荡，混匀；

(3)取出，放置-20℃冰箱内10分钟，使之降温；

(4)95℃变形3min；

(5)冰上迅速冷却，全部滴加到哺乳动物microRNA芯片V3.0上，加盖硅化盖玻片；

(6)杂交盒内消毒后经双蒸水湿润的滤纸保持湿度，42℃杂交过夜，通常16小时以上；

(7)杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS、2×SSC的液体摇床中漂洗4分钟，而后在室温中含有0.2×SSC液体摇床中室温洗4分钟，玻片置于管中，1600rpm离心1分钟甩干后即可用于扫描。

1.6.4芯体扫描及数据处理

芯片用Luxscan 10K/A双通道激光扫描仪(Capitalbio公司)进行扫描。数据提取采用Luxscan 3.0图像分析软件(Capitalbio公司)对芯片图像分析，把图像信号转化为数字信号。

1.7miRNA芯片结果real time RT-PCR验证

1.7.1miRNAreal time RT-PCR引物设计

特异的茎环引物(反转录引物序列)约56个核苷酸，其5’端的48个核苷酸序列是固定的，形成一个茎环的结构，其3’端的8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物(PCR前引物)长约30-31个核苷酸，在3’端有约16-17个核苷酸与对应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65℃。通用的反向引物(PCR后引物)约为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65℃。

1.7.2miRNAreal time RT-PCR

1.7.2.1cDNA逆转录合成

组织标本总RNA逆转录合成cDNA，反应体系如表1：

表1反应体系

组分	体积(单位：μl)
		总RNA模板	1μg(根据浓度计算体积)
Stem-loop RT primer(500nM)	1
		5×RT Buffer	2
100mM DTT	1
		dNTPs(10mMeach)	0.5
RNase抑制剂(40U/μl)	0.1
		M-MLV(200U/μl)	1
加DEPC水	至10

反应条件：16℃，30min；42℃，60min；85℃，5min；4℃，hold。

1.7.2.1miRNAreal time RT-PCR反应

miRNA real time RT-PCR反应体系如表2：

表2 miRNA real time RT-PCR反应体系

组分	体积(单位：μl)
		R	TM
SYBR Premix Ex Taq(2×)	12.5
		正向引物10μM	0.5
反向通用引物μM	0.5
		ROX Reference Dye Ⅱ(50×)	0.5
DNA模板(稀释10倍)	2
		DEPC处理水	至25

反应条件：95℃预变性10min；95℃5s、60℃34s×40。

1.8统计学分析

基因芯片筛选的结果采用Cluster 3.0和Significance Analysis ofMicroarrys(SAM，version2.1)进行分析。数据以(±表示，组间比较采用检验，采用软件进行分析处理，为差异有统计学意义。Real time RT-PCR数据以(x±s)表示，组间比较采用t检验，采用SPSS 17.0软件进行分析处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miRNA基因芯片筛选结果

利用miRNA芯片对20例甲状腺癌组织及20例淋巴结组织的924种miRNA表达情况进行分析，共筛选出同时在伴有或者不伴有颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌组织及有无癌症浸润的淋巴结组织中均差异性表达的miRNA14种，其中hsa-miR-3194、hsa-miR-548j、hsa-miR-6720、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b表达上调，hsa-miR-6734、has-miR-95、has-miR-137、has-miR-21表达下调。

2.2miRNA基因芯片筛选结果的real time RT-PCR验证

用miRNA real time RT-PCR对芯片筛查的结果进行验证，共筛选6种明显差异性表达的miRNA，其中，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p表达上调，hsa-miR-21、hsa-miR-95表达下调(图1)。对这6种表达差异性明显的miRNA进行进一步的血清学表达分析。

实施例2：伴颈侧方淋巴结转移及不伴颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌组织及淋巴结组织中差异性miRNA的血清学分析

1对象和方法

1.1标本来源

在取得患者知情同意后，收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2019年10月-2020年10月60例经病理证实为颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌乳头状癌患者清晨空腹静脉血6ml作为实验组，及120例经病理证实为无颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌乳头状癌患者，或术前检查证实颈侧方淋巴结无异常，术后病理证实中央区淋巴结无转移的甲状腺乳头状癌患者(以下简称为无颈侧方淋巴结转移患者)清晨空腹静脉血6ml作为对照组。所有甲状腺乳头状癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗，且年龄匹配。

1.2血清样本采集及处理

抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4℃1300g(或4000rpm)离心15分钟，取上层血清每300μl分装至RNase-free EP管置于-80℃冰箱储存。

1.3主要仪器设备

Eppendorfcentrifuge(美国)；水平层流洁净工作台(memert公司)；紫外分光光度计nano(Thermo科技)；水浴锅(memert公司)；定时定量PCR仪CFX96(德国BIO-RAD)；Vortex漩涡震荡仪(美国SI)；超低温冰箱(Thermo科技)；Milli Q纯水器(Synthesis公司)。

1.4主要实验试剂

血液总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)；裂解液RLS；去蛋白液RE；漂洗液RW；RNase-free H2O；70％乙醇；RNase-free吸附性RA；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)；E.coli Poly(A)Polymerase(5U/ml)；10×Poly(A)Polymerase Buffer；5×rATP Solution；10×RT Prime；10×RT Buffer；Super Pure dNTP Mixture；Rnasin；Quant RTase；RNase–Free ddH2O；miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)；2×miRNA premix(SYBRROX)；Reverse primer；50×ROXReference Dye；Chloroform(Sigma公司)。

1.5引物设计

表3引物设计

1.6实验方法

1.6.1血清样本总RNA提取

(1)每250μl血清加入750μl裂解液RLS，用加样枪吹打样品几次，裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3:1；

(2)将样品剧烈震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；

(3)4℃条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入新的RNase free的离心管中；

(4)每毫升RLS加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并室温下放置3分钟；

(5)于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中，水相层的容量大约为所加RLS体积的70％，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入RA柱中(吸附柱套在收集管内)；

(7)10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；

(8)加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液；

(9)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液；

(10)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液；

(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(12)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl事先在65℃水浴中加热的RNase free water，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。

1.6.2cDNA转录

在血清样品总RNA提取后，采用在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly(A)，再使用oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。

1.6.2.1miRNA3’末端进行Poly(A)处理

(1)在冰上预冷RNase free的反应管内加入以下试剂至总体积20μl(最后加入E.coli Poly(A)Polymerase)；

表4反应液制备

组分	体积(μl)	终浓度
			总RNA	-	可达2μg
E.coli Poly(A)Polymerase	0.4	2U
			10×Poly(A)Polymerase Buffer	2	1×
10×rATP solution	4	1×
			RNase free ddH2O	-	-
总体积	20	-

(2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟，继续实验。

1.6.2.2Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应，按照表5组分进行反应液的配制。

表5反应液制备

组分	体积(μl)
		Poly(A)反应液	2
10×stem-loop RT Prime	2
		10×RT Buffer	2
Super Pure dNTP Mixture	1
		Rnasin	1
Quant RTase	0.5
		RNase-Free ddH2O	11.5
总体积	20

1.6.3real time RT-PCR

(1)室温融化2×miRNA premix(SYBR)和Reverse primer；

(2)将2×miRNA premix(SYBR)上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，然后轻轻微离心后再使用；

(3)将试剂置于冰上，并按照表6配制反应液，按照表7设置PCR反应程序。

表6反应液制备

组分	50μl体系	终浓度
			2×miRNA premix(SYBR)	25	1×
Forward primer	-	200nM
			Reverse primer	1	200nM
miRNA第一链cDNA	-	-
			ddH2O	至50μl	-

表7 PCR反应程序

循环	温度(℃)	时间	内容
				1×	94	2min	起始模板变性
40-45×	94	20s	PCR循环中模板变性
				-	60	34s	退火、延伸

1.6.4PCR数据处理

PCR扩增结果用CT值来表示，CT值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△△CT方法计算，(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数，△CT sample＝CT sample–CT U6sample，△CTcontrol＝CT control–CT U6control，△△CT＝△CT sample-△CT control)。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验，血清miRNA相对表达量与甲状腺癌临床病理特征的关系采用Mann Whiney检验及Kruskal Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血清目标miRNA的real time RT-PCR检测

本研究对60例有颈侧方淋巴结转移患者血清及120例无颈侧方淋巴结转移患者对照血清中目标miRNA表达情况进行了定量分析，用U6作为内标，结果表明miRNA在血清中稳定表达，用U6作为内参稳定可靠。

2.2有颈侧方淋巴结转移患者及对照物颈侧方淋巴结转移患者血清中目标miRNA表达情况

表8 miRNA表达情况

本发明利用miRNA芯片对10例颈侧方淋巴结转移的甲状腺癌乳头状癌患者及10例无颈侧方淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者癌症组织及淋巴结组织中miRNA表达谱进行了分析，共筛选出14种在癌症组织及淋巴结组织汇总均差异性表达的miRNA，实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证，共筛选出6种明显差异性表达的miRNA，其中，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-222-3p表达上调，hsa-miR-21和hsa-miR-95表达下调(图2)。对照组与颈侧方转移组中hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95相对表达量比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(表8)，表明任一miRNA的上调或下调均对甲状腺癌乳头状癌颈侧方淋巴结转移具有提示意义。

表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的6种miRNA，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95进行进一步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，其中，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-222-3p表达上调，hsa-miR-21和hsa-miR-95表达下调(表8)。结果表明，这6种miRNA可作为诊断甲状腺癌颈侧方淋巴结转移的生物标志物，能够很好的区分甲状腺乳头状癌中伴有颈侧方淋巴结转移患者和无颈侧方淋巴结转移患者。

实施例3：受试者工作特征曲线(ROC)分析

构建ROC曲线来比较6个血清miRNA区分颈侧方淋巴结转移患者及和无颈侧方淋巴结转移患者对照的诊断能力。6个miRNA ROC曲线下面积(AUC)分别为：hsa-miR-146b，0.876(95％置信区间：0.825-0.926)；hsa-miR-25-3p，0.892(95％置信区间：0.848-0.936)；hsa-miR-296-5p，0.926(95％置信区间：0.891-0.961)；hsa-miR-222-3p，0.628(95％置信区间：0.545-0.711)；hsa-miR-21，0.936(95％置信区间：0.904-0.968)；hsa-miR-95，0.742(95％置信区间：0.665-0.819)。在最佳的cut off值下，miRNA的灵敏度和特异性如下：hsa-miR-146b，分别为65.0％和92.5％；hsa-miR-25-3p，分别为100％和67.5％；hsa-miR-296-5p，分别为100％和76.7％；hsa-miR-222-3p，分别为76.7％和45.0％；hsa-miR-21，分别为100％和73.3％；hsa-miR-95，分别为95.0％和64.2％(图3)。这6个miRNA联合起来的AUC可以达到0.997，灵敏度和特异性分别为99.4％和98.3％，明显优于单个miRNA(图4)。该结果表明，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95联合起来对甲状腺癌颈侧方淋巴结转移检测具有非常高的灵敏度和特异性。

实施例4：人甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断用试剂盒

上述实施例表明，hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95联合起来对甲状腺癌颈侧方淋巴结转移检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此，可基于hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95制作用于人甲状腺癌颈侧方淋巴结转移诊断用的试剂盒。该试剂盒包括hsa-miR-146引物、探针；hsa-miR-25-3p引物、探针；hsa-miR-296-5p引物、探针；hsa-miR-222-3p引物、探针；hsa-miR-21引物、探针；hsa-miR-95引物、探针。引物具体包括反转录引物和定量PCR前引物。该试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120> 用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒

<130> 23

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagccta 50

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgctgactg agaactgaat tc 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggatacga cagcctat 18

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cauugcacuu gucucggucu ga 22

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagac 50

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagctggcat tgcacttgtc 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctggatacga ctcagaccg 19

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agggcccccc cucaauccug u 21

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac aggatt 56

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acactccagc tgggagggcc cccctcaatc 30

Claims (6)

1.用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物，其特征在于，所述miRNA为hsa-miR-146b、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-95组合。

2.如权利要求1所述的用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物，其特征在于，所述miRNA核苷酸序列如下：

所述hsa-miR-146b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述hsa-miR-25-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述hsa-miR-296-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述hsa-miR-222-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述hsa-miR-21的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

所述hsa-miR-95的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

3.如权利要求1所述的用于甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移诊断的miRNA生物标志物，其特征在于，所述miRNA生物标志物来自血清。

4.用于人甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的诊断试剂盒，其特征在于，包括与权利要求1所述的miRNA生物标志物特异性结合的引物和探针；

所述miRNA生物标志物的探针序列如下所示：

所述hsa-miR-146b的探针序列如SEQ ID NO.4所示；

所述hsa-miR-25-3p的探针序列如SEQ ID NO.8所示；

所述hsa-miR-296-5p的探针序列如SEQ ID NO.12所示；

所述hsa-miR-222-3p的探针序列如SEQ ID NO.16所示；

所述hsa-miR-21的探针序列如SEQ ID NO.20所示；

所述hsa-miR-95的探针序列如SEQ ID NO.24所示；

所述miRNA生物标志物的引物包括反转录引物和上游引物，所述miRNA生物标志物的引物序列如下所示：

所述hsa-miR-146b的反转录引物序列如SEQ ID NO.2所示；

所述hsa-miR-146b的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；

所述hsa-miR-25-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO.6所示；

所述hsa-miR-25-3p的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示；

所述hsa-miR-296-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO.10所示；

所述hsa-miR-296-5p的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示；

所述hsa-miR-222-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO.14所示；

所述hsa-miR-222-3p的上游引物序列如SEQ ID NO.15所示；

所述hsa-miR-21的反转录引物序列如SEQ ID NO.18所示；

所述hsa-miR-21的上游引物序列如SEQ ID NO.19所示；

所述hsa-miR-95的反转录引物序列如SEQ ID NO.22所示；

所述hsa-miR-95的上游引物序列如SEQ ID NO.23所示。

5.如权利要求4所述的用于人甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的诊断试剂盒，其特征在于，采用real time RT-PCR方法检测所述miRNA生物标志物的表达量。

6.如权利要求4所述的用于人甲状腺乳头状癌颈侧方淋巴结转移的诊断试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTPs、MgCl₂和Taq酶。

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