CN105441565A - 作为骨肉瘤诊治靶标的miRNA - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR-4714-3p作为骨肉瘤诊断标志物的用途。本发明通过高通量测序和QPCR实验证明miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量存在显著差异，因此认为miR-4714-3p可以作为诊断骨肉瘤的分子标志物以用于开发诊断骨肉瘤的产品，该诊断产品具有以下优势：无创、快速、灵敏，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

作为骨肉瘤诊治靶标的miRNA
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miR-4714-3p在诊治骨肉瘤中的用途。
背景技术
骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10～20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。X-射线，断层摄影技术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。
miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
检测miRNA的表达水平可以为疾病的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在疾病发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断骨肉瘤的微小RNA标记物。
本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种微小RNA在制备骨肉瘤诊断工具中的应用，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-4714-3p。
应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-4714-3p功能的条件下，对miR-4714-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-4714-3p是成熟miR-4714-3p。
虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单链形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
进一步，上述诊断工具包括但不限于，芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述诊断工具包括用于检测样本中miR-4714-3p的表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-4714-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针。
本发明提供了一种骨肉瘤的诊断工具，所述诊断工具包括检测样本中miR-4714-3p表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
进一步，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-4714-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针。
进一步，所述试剂盒中的针对miR-4714-3p的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-4714-3p的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断骨肉瘤也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的miR-4714-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-4714-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
本发明中使用的“微小RNA”与“miRNA”、“miR”通用。
本发明中使用的“诊断骨肉瘤”包括对骨肉瘤的预判，即判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险，也包括对骨肉瘤的诊断，即判断受试者是否已经患有骨肉瘤，也包括对骨肉瘤预后的判断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了miR-4714-3p与骨肉瘤相关，通过检测受试者miR-4714-3p的表达，可以判断受试者是否患有骨肉瘤、或者判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-miR-4714-3p，相比传统的检测手段，微小诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨肉瘤的早期诊断，从而降低骨肉瘤的死亡率。
附图说明
图1显示利用高通量测序方法检测miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量；
图2显示利用QPCR检测miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1高通量测序筛选与骨肉瘤相关的miRNA
1、样本收集
5例原发性骨肉瘤患者及5名正常人。受试者要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
2、血液单核细胞RNA提取
将步骤(1)中的细胞融化，加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定OD260和OD280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGENRNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。
3、RNA样品的纯度分析
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，样品纯度要求：OD260/280≧1.8。
4、RNA样品的质量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)
AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。
5、sRNA文库构建
实验采用IlluminaTruSeqSmallRNA试剂盒构建文库，在总RNA中回收长度18-30ntRNA，通过RT-PCR逆转录成单键cDNA，cDNA扩增后，回收cDNA产物，建成小RNAs文库。
6、测序
运用lluminaHiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对miRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
7、结果分析
通过转录组数据分析软件对miRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得到P值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA。设定P值＜0.01，共筛选出7个差异表达的miRNA，其中表达水平上调的miRNA3个，表达水平下调的miRNA4个。如图1所示，miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者中存在差异表达，在骨肉瘤患者血液中miR-4714-3p的水平显著升高(P＜0.05)。
实施例2QPCR验证差异表达的miR-4714-3p
1、根据实施例1中高通量测序结果选择miR-4714-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和骨肉瘤患者各50例，进行血液单核细胞的分离与保存。
2、RNA提取过程同实施例1。
3、逆转录：将10pg-1μg的总RNA模板与2μl10*缓冲液、2μldATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μlOligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5*缓冲液、1μldNTP(10mM)，0.5μlM-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μlpolyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNasefreewater)混合，42℃孵育1h。
4、QPCR反应：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃55s)*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miR-4714-3p的正向引物序列为：5’-CCAACCTAGGTGGTCAGAGTTG-3’(SEQIDNO.1)，反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。以snRNAU6作为参照基因，其上游引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQIDNO.2)；下游引物序列为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQIDNO.3)。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
如图2所示，与正常人相比，骨肉瘤患者血液中miR-4714-3p的表达水平显著升高，与高通量测序结果一致(P＜0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.微小RNA在制备骨肉瘤诊断工具中的应用，其特征在于，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-4714-3p。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-4714-3p。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括检测样本中权利要求1所述的微小RNA表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本的来源包括血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。
7.一种骨肉瘤的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括检测样本中权利要求1所述的微小RNA表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的诊断工具，其特征在于，所述样本的来源包括血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。
9.根据权利要求7所述的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
10.根据权利要求9所述的诊断工具，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。
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