CN108624693B - miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑577在制备肾病诊断标志物中的应用，更具体的涉及miR‑577及其靶基因在制备肾透明细胞癌诊断标志物中的应用。发明对数据库肾透明细胞癌mRNA与miRNA数据进行检索，通过对数据的整合及差异表达分析和靶向分析，选定miR‑577及其调控的靶基因进行分子验证，结果表明miR‑577及其调控的靶基因CD1D、TMEM133、SLFN11能够作为肾透明细胞癌的诊断标志物，具有很好的临床应用价值。

Description

miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用，更具体的涉及miR-577在制备肾透明细胞癌诊断标志物中的应用。

背景技术

miRNA是一类单链小RNA，与其他蛋白质编码基因的mRNA转录本反向互补，长度一般为18-25个nt。它由DNA转录产生，但不翻译成蛋白质，而是在蛋白质合成过程中调节其靶基因的表达量和功能。因此miRNA是一种调控其他蛋白质编码基因的基因。由于miRNA在基因表达调控方面起重要作用，miRNA的表达差异可以引起多种人类疾病，目前已知的与miRNA表达失调有关的疾病系统包括：肿瘤、风湿性疾病、代谢性疾病、心血管疾病以及神经系统疾病等等。其中在与肿瘤相关方面，miRNA发挥着癌基因或抑癌基因的作用，在肿瘤的发生发展过程中起到一个重要的调控作用。

肾透明细胞癌(Clear Cell Renal cell carcinoma)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。对于局限性肾透明细胞癌和局部进展性肾透明细胞癌，早期手术为最佳的治疗方式，手术方式包括开放性手术、普通的腹腔镜手术和机器人辅助腹腔镜手术，手术途径常见有经腹腔途径和经后腹腔途径。然而肾透明细胞癌起病隐匿，大多无典型的临床表现，早期诊断率不高，其中大约30％患者在诊断时已发生转移，失去手术机会。

miRNA与肿瘤相关性研究也是最近miRNA领域的热点之一。在肺癌、食管癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、鼻咽癌等诸多恶性肿瘤的发生发展过程中均发现了miRNA可以通过靶向一些相关的重要基因而参与其中，包括抑癌miRNA和促癌miRNA。有专利显示mir-2355可能是肾透明细胞癌的诊治标志物(CN 201711013993.6)，有很多文章表明miRNA可能起着调节肾透明细胞癌发生发展的作用，如miR-223(miR-223在肾透明细胞癌中的表达与功能，JSouth Med Univ,2015,35(3):338-342)，miR-144-3p(miR-144-3p Promotes CellProliferation,Metastasis,Sunitinib Resistance in Clear Cell Renal CellCarcinoma by Downregulating ARID1A，)。

发明人对TCGA数据库肾透明细胞癌mRNA与miRNA数据进行检索获得六套数据，通过对数据的整合及差异表达分析和靶向分析，选定miR-577及其调控的靶基因CD1D、TMEM133、SLFN11进行RT-PCR验证，结果显示miR-577及其调控的靶基因CD1D、TMEM133、SLFN11能够作为肾透明细胞癌的诊断标志物，具有很好的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肾透明细胞癌诊断试剂，所述肾透明细胞癌诊断试剂能够检测样本中miR-577和/或其前体的表达情况。

所述miR-577序列见序列表SEQ ID NO 8，其前体mir-577序列见序列表SEQ ID NO9。

所述的样本为肿瘤组织或外周血。

进一步，肾透明细胞癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miRNA和/或其前体的转录情况。

优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA和/或其前体的转录。

优选的，所述的基于定量PCR方法包括特异性扩增miRNA和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miRNA和/或其前体的核酸序列杂交的探针。

进一步，扩增miR-577的引物为序列SEQ ID NO 1。

本发明的目的还在于提供上述miRNA和/或其前体在制备肾透明细胞癌诊断工具中的应用。

miR-577靶基因在制备肾透明细胞癌诊断试剂中的应用，所述miR-577靶基因选自下列基因中的一种或几种：CD1D、TMEM133或SLFN11。

进一步，基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miR-577靶基因的转录或基于免疫方法检测样本中miR-577靶基因表达情况；优选采用northern杂交方法、表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miR-577靶基因表达情况；采用western blot和/或ELISA和/胶体金法检测样本中miR-577靶基因对应蛋白表达情况。

本发明的目的在于提供一种治疗肾透明细胞癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

(a)化合物或组合物，所述化合物上调miR-577的转录和/或抑制miR-577靶基因的活性；

(b)药剂学上能接受的载体。

miR-577靶基因为CD1D、TMEM133或SLFN11。

定义：

现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)Northern杂交

又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)miRNA表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(RPA)

miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。

(4)RAKE法

RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。

(5)原位杂交(in situ hybridization)

原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)

荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNAamplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。

高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(shorthairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。

包含在本发明的药物组合物的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本发明的药物组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

说明书附图

图1是miR-577、CD1D、TMEM133、SLFN11在癌组织及癌旁组织相对表里量图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1TCGA数据分析

采用TCGA数据库产生的mRNA与miRNA数据。这些数据来自肾透明细胞癌病例组Primary solid Tumor，对照组Solid Tissue Normal或Control Analyte*。检索结果详见下表1。

表1

mRNA数据分析结果：TCGA数据库IlluminaHiseq_RNASeqV2平台共有20531个基因。本研究删除了不易检测到的基因7950个基因(只保留数据中没有0元素的基因)。将12581个基因用于差异表达基因的筛选。筛选显著差异mRNA的指标为：p_value<0.001，|log2(Fold_change)normalized|>1，|value1-value2|>100，得到差异表达mRNA2361个，上调1350个，下调1011个。

miRNA数据分析结果：TCGA数据库IlluminaHiSeq-miRNASeq平台共有1046个miRNA。本研究删除了不易检测到的miRNA 661个(只保留数据中0元素少于10％的miRNA)。将258个miRNA用于差异表达分析。筛选显著差异miRNA的指标为：p_value<0.001，|log2(Fold_change)normalized|>1，|value1-value2|>100，得到差异表达miRNA52个，上调31个，下调21个。

miRNA-mRNA靶向关系分析：识别miRNA靶基因是研究特定组织和细胞miRNA功能的非常重要的步骤。利用包括RNA22，miRanda，miRDB，miRWalk，PICTAR2及Targetscan这些算法预测差异表达miRNA的靶基因，选取≥4个算法预测出来的靶基因，并在miRWalk数据库查找已验证的差异表达的miRNA的靶基因，然后将所有靶基因与mRNA芯片中与miRNA表达负相关的基因进行整合分析，我们共得到6839个miRNA-靶基因关系对，通过预测得到3724个上调miRNA的miRNA-靶基因关系对，1842个下调miRNA的miRNA-靶基因关系对，并且通过miRWalk数据库得到901个已验证的上调miRNA的miRNA-靶基因关系对，372个已验证的下调miRNA的miRNA-靶基因关系对。

经过上述分析后，我们选定miR-577及其调控的靶基因CD1D、TMEM133、SLFN11。

实施例2实时定量PCR检测miR-577及其靶基因在肾透明细胞癌及癌旁组织的表达情况

2.1样本获取：

选取34例肾透明细胞癌患者的癌组织与癌旁组织，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2.2样本总RNA的提取：

1)取80mg组织块，加入800μl Lysis/Binding缓冲液，使用匀浆器对组织块进行匀浆。匀浆的过程中样品要置于冰上保持低温状态。

2)再加入1/10体积Homogenate Additive到上述已经匀浆的组织样品中，冰上放置10min。

3)加入与Lysis/Binding缓冲液等量体积的水饱和酚，震荡45s,10,000×g室温离心5min。

4)小心取出上清到新的试管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀后，移入纯化柱中，10,000×g，离心15s，倒掉收集管中的液体。由于柱子的最大的体积只有700μl，因此重复此步操作，直到所有的上清都过滤完成。

5)向离心柱子中加入700μl miRNA洗脱液1，室温，10,000×g，离心15s,倒掉收集液，换用新的收集管。

6)再用500μl洗脱液2/3加入离心柱中，10,000×g，离心10s，重复这一步骤一次。

7)离心1min，10,000×g，弃去多余的液体。

8)将上述液体转移到新的离心管，加100μl 95℃预热的DEPC处理30s，10,000×g，离心。

9)使用nanodrop测定RN A浓度和260nm/280nm的比值。

10)得到的RNA保存于-80℃冰箱。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

2.3引物设计：

miR-577扩增引物：

5’-TAGATAAAATATTGGTACCTG-3’(SEQ ID NO 1)

CD1D扩增引物：(NM_001319145.1)

上游引物：5’-ACCTACTGACTGATGACAA-3’(SEQ ID NO 2)

下游引物：5’-CCTCCAACTGCCAATATG-3’(SEQ ID NO 3)TMEM133扩增引物：(NM_152432.3)

上游引物：5’-AGAGAATAACGGTAGGCAGAGT-3’(SEQ ID NO 4)

下游引物：5’-GCACAGAGGTCAACAGTAAGAG-3’(SEQ ID NO 5)SLFN11扩增引物：(NM_001104587.1)

上游引物：5’-GGAGTGGATGATAAGAGT-3’(SEQ ID NO 6)

下游引物：5’-TTGTATATGGCTTGTTCTATT-3’(SEQ ID NO 7)

2.4荧光定量PCR：

表2 RT-PCR体系

miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以通用的snRNA U6作为内参。

扩增程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。

表3 RT-PCR体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.5μl
		下游引物(10uM)	0.5μl
模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至25μl

用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

扩增程序：95°10min，(95℃15sec，55℃60sec)×35个循环。

5统计学分析

采用OriginPro8.1软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，P<0.05(差异显著)和P<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义。结果显示癌组织中miR-577的表达量仅为癌旁组织的三分之一左右，CD1D在癌组织中的表达量是癌旁组织的4.5倍左右，TMEM133在癌组织中的表达量是癌旁组织的2.8倍左右，SLFN11在癌组织中的表达量是癌旁组织的3倍左右，具体见图1，RT-PCR结果与高通量数据分析结果基本一致。对检测结果进行进一步统计，发现34对样本，其中28对样本miR-577的表达与结果一致，在癌组织中低表达，27对样本中CD1D的表达与结果一致，在癌组织中表达量高，27对样本中TMEM133的表达与结果一致，在癌组织中表达量高，25对样本中SLFN11的表达与结果一致，在癌组织中表达量高，4个标志物检测的准确率分别为82.4％、79.4％、79.4％和73.5，显示他们可以作为肾透明细胞癌诊断分子标志物。

表4检测结果统计

	高(癌/癌旁)	低(癌/癌旁)	无差异(癌/癌旁)	准确率
					miR-577	1	28	5	82.4％
CD1D	27	2	5	79.4％
					TMEM133	27	4	3	79.4％
SLFN11	25	3	6	73.5％

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagataaaat attggtacct g 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctactgac tgatgacaa 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctccaactg ccaatatg 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagaataac ggtaggcaga gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcacagaggt caacagtaag ag 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagtggatg ataagagt 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgtatatgg cttgttctat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

uagauaaaau auugguaccu g 21

<210> 9

<211> 96

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ugggggagug aagaguagau aaaauauugg uaccugauga aucugaggcc agguuucaau 60

acuuuaucug cucuucauuu ccccauaucu acuuac 96

Claims (5)

1.诊断试剂制备肾透明细胞癌诊断工具中的应用，其特征在于，诊断试剂检测样本中miR-577和/或其前体的表达情况。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miRNA和/或其前体的转录情况。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用northern 杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA和/或其前体的转录。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，基于定量PCR方法包括特异性扩增miRNA和/或其前体的引物；基于探针杂交方法包括与miRNA和/或其前体的核酸序列杂交的探针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增miR-577的引物为序列SEQ ID NO 1。