CN109666744B

CN109666744B - circRNA及其在制备宫颈癌诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN109666744B
Application number: CN201910100365.4A
Authority: CN
Inventors: 马成斌; 刘平; 杨龙涛; 张文缨; 吴琼蔚; 刘彧
Original assignee: Shanghai Changning District Maternal And Child Health Hospital
Current assignee: Shanghai Changning District Maternal And Child Health Hospital
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109666744A

Abstract

本发明涉及circRNA及其在制备宫颈癌诊断试剂中的应用，具体涉及hsa_circ_0000069在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。发明人对宫颈癌测序数据进行进一步挖掘和整合分析，用生物信息学方法构建circRNA‑miRNA‑mRNA相互作用的生物信息调控网络，寻找参与调控宫颈癌的关键分子hsa_circ_0000069和hsa‑miR‑125b‑5p，为宫颈癌的诊断提供了新的分子诊断标志物，为临床疾病基因检测提供研究基础。

Description

circRNA及其在制备宫颈癌诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤基因检测技术领域，具体涉及circRNA及其在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

背景技术

近年来，环状RNA(circular RNA，circRNA)成为继miRNA与1ncRNA后的又一非编码RNA研究热点，受到国内外学者的广泛关注。目前，circRNA的生物学功能研究仍处于探索阶段，已发现circRNA可作为竞争性内源RNA，即miRNA海绵，调节靶基因表达，还可作为转录调节子或RNA结合蛋白在转录后水平间接调控基因，在特定条件下circRNA甚至能够直接翻译蛋白。有研究表示ciRS-7在宫颈癌组织中表达水平明显高于正常宫颈组织，其调控的miR-7则在宫颈癌组织中低表达，显示在宫颈癌中ciRS-7负调控miR-7的表达，从而影响宫颈癌的发生和发展(ciRS-7/miR-7/FAK调节轴对宫颈癌侵袭迁移的影响及紫草素干预机制的研究，博士学位论文，2015)。ciRS-7的发现有助于了解circRNA在宫颈癌中的发生机制，同时也为筛选宫颈癌相关的新的合适的分子标志物提供研究方向。

宫颈癌是常见妇科肿瘤之一，在发展中国家己成为死亡率第二的恶性肿瘤。近年来随着HPV疫苗的广泛应用，宫颈癌己实现了一定程度的一级预防，其发病率与死亡率在许多发达国家明显下降，但较高的HPV感染率却伴随着相对较低的宫颈癌发病率，不但使宫颈癌的筛查及一级预防面临卫生经济学的沉重负担，也提示在宫颈癌发生发展过程中存在个体间遗传差异等其他重要因素。因此，深入探究宫颈癌的确切发病机制，并寻找新型诊断标志物与潜在治疗靶点至关重要。

高通量测序技术的广泛应用为疾病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，发明人对宫颈癌测序数据进行进一步挖掘和整合分析，用生物信息学方法构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用的生物信息调控网络，通过GeneCoDis3对生物信息网络中miRNA的靶基因以及circRNA的来源基因分别进行GO功能分析和Pathway分析，寻找参与调控宫颈癌的关键分子，发现了hsa_circ_0000069。郭等研究表明，hsa_circ_0000069与结直肠癌的增殖、侵袭等密切相关(Comprehensive profile of differentially expressedcircular RNAs revealsthat hsa_circ_0000069is upregulated and promotes cellproliferation,migration,andinvasion in colorectal cancer，Onco TargetsTher.2016；9:7451–7458)。但未有研究显示hsa_circ_0000069与宫颈癌是否相关，发明人还进一步分析得到与hsa_circ_0000069相互作用的hsa-miR-125b-5p，以及hsa-miR-125b-5p的靶基因，构建了hsa_circ_0000069生物信息调控网络。本申请为宫颈癌的诊断提供了新的分子诊断标志物，为临床疾病基因检测提供研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与宫颈鳞癌相关的circRNA，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个RNA或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

优选的，序列与SEQ ID NO.1具有95％、96％、97％、98％或99％以上序列同源性。

更优选的，circRNA为hsa_circ_0000069，序列为SEQ ID NO.1。

本发明的目的在于提供一种检测宫颈癌的试剂，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平。

优选的，相关基因为hsa-miR-125b-5p(序列为SEQ ID NO.2)或hsa-miR-125b-5p的靶基因。

进一步，hsa-miR-125b-5p的靶基因选自下列中的一种或几种：GNPDA1、CXCL13、CPSF6、PAQR4、KIF18B、DHFR、ECE1、USP12、LHX6、CYFIP2、C19orf54、BIRC3、LASP1、MKI67、OAS3、TAF9B、POU2F1、CCDC93、PPT1、TRMT5、RRM2、SET、SUV39H1、TAZ、TDG、WARS、ZNF148、DCTPP1、ATP13A3、ATHL1、LMNB2、SLC7A6、MLEC、CDKN2A、RNASEH2A、SMC2、PARP1、EIF4EBP1、FAT1、NUP205、TMEM2、BACE2、C19orf54、HDGF、KCNS3、KRT7、RFWD3、SNRPB、SSR3、TDG、UNG、SMC6、CCNE1、SLC7A6、AURKB、NUP93或UBAP2L。

优选的，hsa-miR-125b-5p的靶基因为CDKN2A。

进一步，hsa_circ_0000069在宫颈癌样本中高表达，hsa_circ_0000069相关基因hsa-miR-125b-5p在宫颈癌样本中低表达。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列或Northern杂交。

优选的，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平。

优选的，试剂含有与hsa_circ_0000069杂交的探针或扩增hsa_circ_0000069的特异性引物。

进一步，引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

优选的，样本为宫颈癌组织或外周血。

更优选的，宫颈癌为宫颈鳞癌。

本发明的目的在于提供上述试剂在制备宫颈癌诊断制剂中的应用。

检测hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平试剂在制备宫颈癌诊断制剂中的应用。

进一步，相关基因为hsa-miR-125b-5p或hsa-miR-125b-5p的靶基因。

进一步，hsa_circ_0000069高表达样本中罹患宫颈癌风险较高。

进一步，hsa_circ_0000069相关基因hsa-miR-125b-5p低表达样本中罹患宫颈癌风险较高。

优选的，采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平。

进一步，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平。

进一步，引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

优选的，宫颈癌为宫颈鳞癌。

一种宫颈癌检测荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒检测基hsa_circ_0000069和/或其相关基因的表达水平，采用特异的上游引物和下游引物。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。所述内参引物为GAPDH内参引物。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选Reagent进行样本RNA提取。

本申请的优点：

1、本申请首次证实了hsa_circ_0000069可作为宫颈鳞癌的诊断标志物，hsa_circ_0000069在宫颈鳞癌组织中表达量高于癌旁组织，表明hsa_circ_0000069可作为宫颈鳞癌的诊断标志物；

2、检测发现hsa_circ_0000069在宫颈鳞癌中特异性高表达，检测准确率较高，提供了一种更加快速、准确的检测方法；

3、本申请为宫颈鳞癌的诊断提供了新的分子诊断标志物。

定义：

环状RNA(circular RNA，circRNA)，亦称环形RNA，是最近几年研究确认的一种新型的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)分子。根据RNA构成的不同，环状RNA可分为三类：外显子环状RNA(exon circular RNA，ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，lockednucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。

测序技术主要为高通量测序技术(High-throughput sequencing)，又称下一代测序技术(next generation sequencing)，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

Northern杂交，又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定RNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶RNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本RNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

附图说明

图1是hsa_circ_0000069-miRNA-mRNA互作网络图

图2是hsa_circ_0000069在宫颈鳞癌及癌旁组织中差异表达图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1数据筛选及整合分析

GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库。制定数据集纳入标准：

①所选数据集必须为全基因组的mRNA/miRNA/circRNA转录组数据；

②这些数据来自于宫颈鳞癌(CSCC)病例组和对照组(N)的组织(无药物刺激或被转染)；

③本研究均考虑经标准化或者原始数据集。

经筛选，得到以下数据集：

表1筛选纳入的数据集列表

数据分析：

使用工具为R-3.3.3，采用metaMA包分析，meta分析中p值合并所用方法为inversenormal method。

差异表达mRNA筛选标准：FDR<0.05,|combined.ES|>1；并将各数据集上下调不一致的mRNA舍去，共获得1356个差异表达mRNA；

差异表达miRNA筛选标准：FDR<0.05,|combined.ES|>1；并将各数据集上下调不一致的miRNA舍去，共获得13个差异表达miRNA。

采用limma包分析。差异表达circRNA筛选标准：FDR<0.05，|log2FC|>1，得到77个差异表达circRNA。

进一步，使用starBase v3.0的计算，得出3个差异表达circRNA结合差异表达miRNA的关系对，其中一组为hsa_circ_0000069和hsa-miR-125b-5p。

利用包括RNA22，miRanda，miRDB，miRWalk，PICTAR2及Targetscan这些算法预测hsa_circ_0000069结合的差异表达hsa-miR-125b-5p的靶基因，选取≥4个算法预测出来的靶基因，并在miRWalk数据库查找已验证的差异表达的miRNA的靶基因，hsa-miR-125b-5p的靶基因为GNPDA1、CXCL13、CPSF6、PAQR4、KIF18B、DHFR、ECE1、USP12、LHX6、CYFIP2、C19orf54、BIRC3、LASP1、MKI67、OAS3、TAF9B、POU2F1、CCDC93、PPT1、TRMT5、RRM2、SET、SUV39H1、TAZ、TDG、WARS、ZNF148、DCTPP1、ATP13A3、ATHL1、LMNB2、SLC7A6、MLEC、CDKN2A、RNASEH2A、SMC2、PARP1、EIF4EBP1、FAT1、NUP205、TMEM2、BACE2、C19orf54、HDGF、KCNS3、KRT7、RFWD3、SNRPB、SSR3、TDG、UNG、SMC6、CCNE1、SLC7A6、AURKB、NUP93或UBAP2L。利用Cytoscape3.5.0构建网络图，结果见图1。

实施例2 RT-PCR验证宫颈鳞癌组织和癌旁组织中hsa_circ_0000069相对表达量

1.材料

收集上海市长宁区妇幼保健院中妇科病房接受手术的27例宫颈鳞癌患者的组织样本，将患者相应的癌旁组织作为对照组。患者病理诊断经病理科医生核实。患者术前均未接受过放疗或化疗，且无其他外科、内分泌、代谢性、传染性疾病及其他子宫卵巢等妇科疾病。无菌条件获取新鲜组织标本，生理盐水洗去血液后分装入去RNA酶的冻存管内，液氮速冻过夜，-80℃冰箱长期冻存。

2.实验方法

2.1组织总RNA提取

(1)将各组组织在冰上剪碎，取适量(50-100mg)组织于去RNA酶的EP管中加入lml预冷的Trizol，吹打均匀后于冰上静置10min；

(2)加入200μl预冷的氯仿，剧烈震荡30sec后于冰上静置15min，4℃14000rpm/min离心20min；

(3)取出上清于新的去RNA酶的EP管中(注意避免触及中间层)，加入等体积预冷的异丙醇(约500μl)，混匀后冰上静置0.5-1h,4℃14000rpm/min离心20min；

(4)弃上清，加入lml预冷的75％乙醇，颠倒混匀，4℃14000rpm/min离心20min；

(5)弃上清，加入lml预冷的75％乙醇，颠倒混匀，4℃14000rpm/min离心20min；

(6)弃上清，RNA沉淀于超净台内晾干后，加入适量DEPC水充分吹打溶解沉淀。

RNA质量检测标准，A260/A280值介于1.8与2.1之间。2.0为最优，大于2.1，提示RNA降解过多，小于1.8提示存在蛋白等污染。结果表明RNA纯度较高，无蛋白质或DNA等污染。

2.2引物设计

针对circRNA的环状闭合结构，设计背靠背引物(divergent primer)，GAPDH作为内参，送往引物合成公司合成。

hsa_circ_0000069引物：

上游引物：5’-TCACAGAACAAGACAGACAGC-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物：5’-GAGTCGTGATCATGTATTGGCA-3’(SEQ ID NO.4)

目标基因扩增长度：92bp。

2.3反转录

按照PimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)RR037A(Takara)说明书配置反转录反应体系。首先将各试剂进行瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，充分混匀，置于循环器内孵育将RNA反转为cDNA，反转录条件为37℃15min，85℃5sec，最后4℃保存。

2.4 RT-PCR验证样本中hsa_circ_0000069的表达情况

按照SYBR.Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)RR420A(Takara)说明书配置RT-PCR反应体系，具体见下表。首先将各试剂瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，混合均匀，置于ABI 7500PCR仪进行qRT-PCR反应。

表2 RT-PCR反应体系

组分	体积
		SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plu)	10μl
上游引物	1μl
		下游引物	1μl
DNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	6μl
	补平至20μl

反应条件：变性(95℃30sec)；扩增35个循环(95℃5sec；58℃30sec)。

2.5统计学分析

利用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析。数据用均值士标准差表示。P小于0.05代表差异具有统计学意义，所有实验重复三次。

实时定量PCR扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；RT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，结果显示：hsa_circ_0000069在癌组织中表达量明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.001)，是癌旁的10.8倍(具体结果见图2)，在27对样本中，23对样本差异表达明显，表达趋势符合预期，3对样本中表达差异不具有统计学意义，还有一对样本中hsa_circ_0000069在癌旁组织中表达略高于癌组织。RT-PCR验证实验结果与数据分析结果基本一致，显示hsa_circ_0000069是很好的辅助诊断分子标志物，可能具有很好的临床应用价值。

序列表

<110> 上海市长宁区妇幼保健院

<120> circRNA及其在制备宫颈癌诊断试剂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1084

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcttcccaa aagttatctt ctgggaagat gccaatacat gatcacgact ctggtgttga 60

agatgaagat ttttctccaa gaccaattcc tagtcctcat ccagtgagtc agaagatttc 120

taagatccaa ccatcagttc ctgaactttc acttgtgttg gatggcaatt tcatagaatc 180

aaaccctctg cctactccat tggaaatggt gaataatgaa aatcctcctt tgattaacca 240

cttggaacac ttgaagccat tgcaacccca gctttatgat gagaaacaca gtccagaagt 300

tgaagctgga gagccttcct tgagaggaat accaaatcag ttaaaccagg ataaaccagc 360

tcttttgaga cactgcaaag taagacagcc acctgcctat aagaaaggga acccccatac 420

caggaacagt attaaaccat cttctcataa tgggccatct catgatatat ttgaaaagct 480

ccaaacagtt tctgctggaa atgtacaaaa cgaagagtat cctataagac cctccacact 540

taattctagg cagtcttctc ttgccccgca gtcccaacca cacgattttg ttttttcacc 600

ccataattca ggaagaccaa tggaacttca gatacctact cccccactgc catcttactg 660

ttccacaaac gtttgcaggt gttgtcagca tcatagtcat attcaatata gtccgctaaa 720

ttcttggcaa ggagcaaaca cagttggatc cattcaagat gtccagtctg aagcccttca 780

aaagcattca ttatttcacc caagtggatg tccagccctg tactgtaatg cattctgttc 840

ttcaagtagt cctatagcct tgagacctca gggagatatg ggcagttgtt ctccccacag 900

caatattgaa ccatcgcctg tggcaagacc gccttcacat atggacttat gtaacccaca 960

gccttgcaca gtgtgcatgc acacacccaa gactgagtca gataatggaa tgatgggact 1020

atctccagat gcatatcggt tcctcacaga acaagacaga cagctaagac tacttcaggc 1080

acag 1084

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tcacagaaca agacagacag c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

gagtcgtgat catgtattgg ca 22

Claims

1.检测组织样本中hsa_circ_0000069表达水平的试剂在制备宫颈鳞癌诊断制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样本中hsa_circ_0000069的表达水平。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0000069的表达水平。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，核酸杂交技术包括原位杂交、微阵列或Northern 杂交。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，hsa_circ_0000069在宫颈鳞癌样本中高表达。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂含有与hsa_circ_0000069杂交的探针或扩增hsa_circ_0000069的特异性引物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。