CN110747276B - Bace2作为胶质瘤预后/诊断/治疗标志物的应用 - Google Patents

Bace2作为胶质瘤预后/诊断/治疗标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本公开属于胶质瘤预后标志物技术领域，具体涉及BACE2作为胶质瘤预后/治疗标志物的应用。本公开研究首次证明，较高水平的BACE2表达与较高等级的人脑胶质瘤，GBM的间充质分子亚型和较差的预后相关。此外，TGFβ1通过Smad依赖性信号传导刺激BACE2表达，其通过PP1A/IKK途径调节TNF‑α诱导的NF‑κB活性以促进胶质瘤细胞中的肿瘤发生。BACE2可作为新型生物标志物和治疗人脑胶质瘤的潜在治疗靶点。

Description

BACE2作为胶质瘤预后/诊断/治疗标志物的应用
技术领域
本公开属于胶质瘤预后标志物技术领域，具体涉及BACE2作为胶质瘤预后 /诊断/治疗标志物的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
据报道，人脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤类型，占所有恶性脑肿瘤的约80％。根据世界卫生组织(WHO)，胶质瘤可根据组织学特征分为四个等级 (I-IV)，IV级肿瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM)与预后最差相关，中位生存时间为初诊后仅12-15个月，5年生存率<3％。
BACE2是属于肽酶A1家族的完整膜糖蛋白，分子量为56kDa。之前的研究已经注意到BACE2在阿尔茨海默病(AD)和2型糖尿病中的重要性。此外，先前的研究表明BACE2在原发性乳腺癌和结直肠癌以及结直肠腺瘤中上调，因此表明BACE2在恶性肿瘤进展中的关键作用。
如文献综述所述，NF-κB与癌症发展的许多标志有关，包括不依赖生长因子的增殖，肿瘤侵袭和转移以及细胞凋亡的抑制。TGFβ是一种多任务细胞因子，可调节多种生物过程，包括干性，转移，血管生成和细胞生长。此外，TGFβ刺激癌基因活性以促进某些癌症类型的EMT。根据这些研究可知TGFβ1/Smad信号通路在肿瘤发展中起重要作用。目前，本领域内针对BACE2与胶质瘤关系的研究还较少，关于BACE2与中的表达模式，BACE2在人脑胶质瘤中的临床意义以及BACE2功能的潜在机制也未见相关研究。
发明内容
在本公开研究中，发明人使用公开的数据集来研究BACE2表达与肿瘤分级的关系以及胶质瘤的临床病理学特征和分子特征，并且进一步探索了BACE2在体外和体内的功能。此外，本公开研究了其功能的潜在分子机制。总之，本实施例的研究结果表明，BACE2可能是一种新的预后生物标志物，也是人脑胶质瘤的潜在治疗靶点。
基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供BACE2作为胶质瘤预后/诊断/治疗标志物的应用。
优选的，所述预后标志物用于预测胶质瘤恶性程度，BACE2高表达代表胶质瘤患者的不良预后。
本公开研究表明，人脑胶质瘤样本中BACE2的表达情况显著高于正常脑组织，并且，BACE2的表达水平与脑胶质瘤的级别也相关。间充质亚型胶质瘤细胞中BACE2表达显著增加，本领域公知，间充质亚型与患者的不良临床结果相关。该研究结果表明，胶质瘤中BACE2的表达可用作判断患者预后情况的生物学标志物，具体包括结合统计学结果，用于对患者预后、胶质瘤恶性程度进行预测。
本公开第二方面，提供BACE2抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。
本公开研究结果表明BACE2通过调节细胞周期促进神经胶质瘤细胞的增殖。启示，本领域技术人员可通过抑制BACE2的表达抑制胶质瘤细胞的增殖，实现对肿瘤的抑制甚至治疗作用。
优选的，所述抑制剂包括通过基因工程手段降低BACE2表达的制剂。
本公开第三方面，提供TGFβ/Smad通路抑制剂作为BACE2/PP1A/IKKβ轴抑制剂的应用，或TGFβ/Smad通路激动剂作为BACE2激动剂的应用。
优选的，所述TGFβ/Smad通路激动剂为TGFβ1。
本公开第四方面，提供BACE2抑制剂作为PP1A/IKKβ轴抑制剂的应用。
本公开第五方面，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括检测BACE2表达含量的试剂。
优选的，所述检测BACE2表达含量的试剂包括基于免疫蛋白印记及PCR方法对待测样本中BACE2含量进行检测的试剂。
本公开第六方面，提供一种抗胶质瘤药物，所述抗胶质瘤药物以TGFβ/Smad 通路抑制剂/BACE2/PP1A/IKKβ轴抑制剂或其组合作为活性物质。
本公开第七方面，提供一种胶质瘤治疗方法，所述治疗方法包括阻断或抑制患者肿瘤部位BACE2的表达。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.本公开通过通过公共数据库分析确认BACE2与胶质瘤患者的预后情况具有相关性，并通过多种研究手段确认，BACE2不仅与胶质瘤患病情况相关，BACE2 的表达含量还与胶质瘤的级别相关，高表达的BACE2与胶质瘤的间充质亚型相关，证明了BACE2可作为胶质瘤诊断和预后的标志物进行应用。
2.本公开进一步的提供了BACE2在胶质瘤中的调节机制，明确了BACE2能够促进胶质瘤细胞的侵袭、转移及增殖，这一作用可能通过TGFβ1/Smad通路促进BACE2的高表达，进而通过PP1A/IKKβ轴调节TNF-α诱导的NF-κB通路来实现。本公开的研究结论提供了为BACE2与胶质瘤的关系提供了更为精确和完整的研究机制，为胶质瘤间充质化的进一步发展提供了良好的借鉴意义。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例2中BACE2在正常脑组织与胶质瘤组织中的表达情况；
图1A为TCGA和CGGA数据库定量胶质瘤组织中BACE2表达的结果；
图1B为TCGA和CGGA数据库定量GBM细胞的不同亚型中BACE2表达的结果；
其中，BACE2的相对mRNA表达是Log2转化的；
图1C为ROC曲线显示BACE2作为诊断标志物的敏感性，以区分间充质亚型患者和非间充质亚型患者；
图1D为人神经胶质瘤和正常脑组织样品中通过免疫组织化学分析BACE2蛋白水平，放大倍数：400×；
图1E为用TCGA数据库(n＝667)和CGGA数据库(n＝272)分析LGG和 GBM中BACE2表达的预后价值，截止值是中值BACE2表达水平，***P<0.001； **P<0.01；*P<0.05；ns,不具有显著差异。
图2为实施例2中TCGA数据库对BACE2进行基因富集分析结果图；
图2A为基于相关性分析，在TCGA数据库中总共有1274个与BACE2正相关的基因和与BACE2呈负相关的694个基因；
图2B GSEA分析的结果显示高BACE2表达增强了EMT，肿瘤侵袭，肿瘤转移和G1-S期转变中细胞周期的调节；NES＝归一化富集分数，FDR＝错误发现率。
图3为实施例2中BACE2促进神经胶质瘤细胞的EMT结果图；
图3A为Western印迹分析测定结果图；
用BACE2和siRNA对照转染的U87MG和U251细胞中BACE2的表达水平；通过蛋白质印迹分析测定U87MG和U251细胞中BACE2-LentiOV和 BACE2-LentiNC的表达水平；GAPDH用作对照；
图3B显示了在48小时用BACE2和siRNA对照处理的U87MG和U251细胞的代表性图像；比例尺＝30μm；
图3C显示了在48小时和96小时评估用BACE2和siRNA对照处理的U87MC 和U251细胞球体的代表性图像；比例尺＝200毫米；
图3D为96小时内侵入区域的定量结果；
图3E为U87MG细胞的侵袭测定中的代表性图像和统计结果；
图3F为U251细胞的侵袭测定中的代表性图像和统计结果；
图3G为转染的U87MG迁移测定的代表性图像和统计结果；
图3H为转染的U251细胞迁移测定的代表性图像和统计结果；
图3I为转染的U87MG细胞中EMT蛋白标记物和相关转录因子的表达水平；
图3J为U251细胞中EMT蛋白标记物和相关转录因子的表达水平；
GAPDH用作对照；数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM。***P<0.001； **P<0.01；*P<0.05；ns，无显著差异。
图4为实施例2中BACE2增强胶质瘤细胞的体外侵袭能力结果图；
图4A显示了用BACE2和siRNA对照转染的U87MG和U251细胞中BACE2 的表达水平，以及通过RT-PCR测定的U87MG和U251细胞中BACE2-LentiOV 和BACE2-LentiNC的表达水平；GAPDH用作对照；
图4B在48小时和96小时评估的U87MG和U251细胞球体中的 BACE2-LentiOV和BACE2-LentiNC表达水平的代表性图像；比例尺＝200毫米，
图4C为96小时入侵区域的定量结果；
图4D为伤口愈合测定法用于研究用siRNA或慢病毒转染后的迁移能力；比例尺＝200μm；
图4E为48小时后用BACE2转染的U87MG和U251细胞中的F-肌动蛋白和核染色的代表性免疫荧光图像；比例尺＝30μm；
图4F板状伪足的形成，其量化标准为每组50个随机选择的具有板状伪足的细胞的百分比；结果代表三个独立实验，***P<0.001；**P<0.01；*，P<0.05；ns，无显著差异。
图5为实施例2中BACE2通过调节胶质瘤细胞的细胞周期来促进增殖结果图；
其中，图5A为48小时用BACE2和siRNA对照转染的U87MG和U251细胞中进行的Edu测定的结果，显示了在BACE2-LentiNC和BACE2-LentiOV中48 小时进行的Edu测定的结果，比例尺＝100毫米；
图5B为用转染的U87MG和U251细胞进行的Edu测定的统计结果。
图5C为U87MG转染细胞中在24小时，48小时，96小时进行的CCK-8测定的结果，显示在OD 450处的生长曲线；
图5D为U251转染细胞中在24小时，48小时，96小时进行的CCK-8测定的结果，显示在OD 450处的生长曲线；
图5E为用PI评估细胞周期不同阶段的细胞比例；
图5F为用流式细胞术评估细胞周期不同阶段的细胞比例；
图5G为通过Western印迹分析测定的细胞周期相关蛋白的表达水平，GAPDH 用作对照，数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM。***P<0.001；**P <0.01；*P<0.05；ns，无显著差异；
图5H为通过Western印迹分析测定的相关途径因子的表达水平，GAPDH用作对照，数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM。***P<0.001；**P<0.01； *P<0.05；ns，无显著差异；
图6为BACE2对NF-κB信号通路的调节作用的结果图；
其中，图6A为GSEA分析的结果，显示高BACE2表达增强NF-κB信号传导途径的活化；
图6B为BACE2-LentiOV和BACE2-LentiNC在具有或不具有NF-κB抑制剂 IMD0354(溶于DMSO至10μM)的U87MG和U251细胞中的培养24小时。通过Western印迹测定NF-κB信号传导下游分子，Cyclin D1和N-cadherin的表达水平，GAPDH用作对照；
图6C为采用NF-κB抑制剂IMD0354处理24小时后，用迁移试验测定神经胶质瘤细胞的迁移能力；
图6D为定量迁移测定的结果；
图6E为NF-κB抑制剂IMD0354处理24小时后，用增殖试验测定细胞增殖；
数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM。***P<0.001；**P<0.01；*P <0.05；
图7为实施例2中BACE2通过PP1-IKK轴调节TNFα诱导的NF-κB活性结果图；
其中，图7A为KEGG分析与BACE2基因正相关和负相关的基因；
图7B通过RT-qPCR测定IκBα，A20和IL-8的表达；用BACE2和siRNA对照转染U87MG和U251细胞，48小时后，用或不用TNFα(20ng/mL)处理细胞8小时；
图7C为敲低BACE2阻止TNFα诱导IKKβ的磷酸化；用BACE2和siRNA 对照转染U87MG和U251细胞；48小时后，用或不用TNFα(20ng/mL)处理细胞20分钟，然后进行免疫共沉淀；
图7D为BACE2敲低抑制了IκBα的降解和p65的磷酸化；用BACE2和siRNA 对照转染神经胶质瘤细胞；48小时后，将细胞与TNFα(20ng/mL)一起孵育 15分钟；
图7E代表性图像显示敲低BACE2阻止了由TNFα诱导的NF-κB核转运；转染后48小时，加入TNFα(20ng/ml)，将细胞孵育20分钟，然后进行免疫荧光分析。比例尺＝100毫米；
图7F根据TCGA和CGGA数据库，胶质瘤患者中BACE2表达与p-PP1A表达之间的相关性；
图7G敲低BACE2可抑制PP1A的磷酸化；用BACE2和siRNA对照转染神经胶质瘤细胞48小时；
图7H为PP1A敲低阻止BACE2的下调抑制TNF诱导的p65磷酸化；如图5D 所示处理细胞；GAPDH用作对照；结果代表三个独立实验。***P<0.001；**P <0.01；*P<0.05；ns，无显著差异。
图8为实施例2中TGFβ1促进胶质瘤中BACE2的表达结果图；
其中，图8A显示根据GSEA分析，TGFβ信号传导途径中增强与高BACE2 表达相关；
图8B显示TCGA和CGGA数据库胶质瘤组织中TGFβ1定量表达；
图8C为根据TCGA和CGGA数据库，BACE2表达与胶质瘤患者TGFβ1表达之间的相关性；
图8D为通过Western印迹显示在存在TGFβ1(10ng/mL)的情况下用BACE2 转染的U87MG和U251细胞中的EMT标记表达水平；
图8E显示了通过Western印迹分析对U87MG和U251细胞评估的不同浓度的 TGFβ1(0,1,5和10ng/mL)的BACE2表达水平；
图8F通过蛋白质印迹分析测定，显示用含有或不含有SB431542(10μM)的 TGFβ1处理的U87MG和U251细胞中N-cadherin，BACE2，Smad2和p-Smad2 的蛋白质水平；
图8G显示了来自用si-Smad2或si-NC转染的U87MG和U251细胞的BACE2 和p-Smad2的蛋白质水平，结果代表三个独立实验，***P<0.001；**P<0.01；* P<0.05；ns，无显著差异。
图9为实施例2中敲低BACE2抑制异种移植小鼠的肿瘤发生结果图；
其中，图9A为sh-BACE2或对照转染的U87MG细胞植入后7天和14天的颅内异种移植小鼠的代表性生物发光图像；
图9B为用sh-BACE2或对照转染的U87MG细胞的小鼠的存活分析结果(对数秩检验p<0.01，每组n＝5只动物)；
图9C为植入对照或sh-BACE2异种移植物后约4周进行H&E染色的小鼠脑的切片；
图9D显示测量后的肿瘤大小(mm 3)；
图9E用IHC测定小鼠脑切片中BACE2，N-cadherin和Ki-67的蛋白水平，放大倍数：200×，数据表示为平均值±SD。
图10为胶质瘤细胞中BACE2调节通路的示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释部分:
BACE2：Beta-site APP cleaving enzyme 2；
LGG：低级别神经胶质瘤；
GBM：多形性胶质母细胞瘤。
正如背景技术所介绍的，为了解决现有技术中的不足，本公开提供了BACE2 作为胶质瘤诊断/预后标志物的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
1.材料和方法
1.1临床样本和数据库
从山东大学齐鲁医院神经外科接受手术的患者中采集了29对胶质瘤组织 (WHOII-IV)。随后，将组织包埋在石蜡中。从接受脑外伤颅脑减压治疗的创伤患者收集正常脑组织样本(n＝4)。所有参加者同意及签署有关研究用途的组织捐赠的知情同意书。实验程序是按照《赫尔辛基宣言》进行的。所有患者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院神经外科伦理委员会批准。另外，从癌症基因组图谱研究网络(TCGA；n＝667；http://cancergenome.nih.gov)以及四个外部神经胶质瘤数据库(CGGA，GSE16011，GSE4290和GSE4271)分析了BACE2的转录丰度。
1.2免疫组织化学
切片(4μm)获自石蜡包埋不同等级的人神经胶质瘤的组织。用3％H2O2封闭切片中的内源辣根过氧化物酶(HRP)活性，并将切片在柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸用于抗原修复。将组织与封闭缓冲液(正常山羊血清)在室温下孵育20分钟，弃去山羊血清后，用兔抗BACE2(1:20，Abcam；Cambridge，UK) 处理样品，并在4℃过夜。样品用3,3-二氨基联苯胺(DAB)染色，同时在室温下保持不光10分钟。除了使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替兔抗BACE2外，用与上述样品相同的步骤处理阴性对照组。切片用苏木精复染。
1.3细胞培养
U87MG和U251人GBM细胞购自中国科学院(中国上海)的培养物保藏中心。所有细胞株均在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)与10％的血清,4mM 谷氨酰胺和1％青霉素和链霉素混合湿室有95％O2/5％二氧化碳在37℃。基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析。
使用R语言在TCGA数据库中进行BACE2全基因组谱的相关分析。通过 DAVID网络工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)分析阳性相关基因和负相关基因，在胶质瘤中研究BACE2表达相关的生物学过程和KEGG信号通路。使用基因集富集分析(GSEA)软件(http://software.broadinstitute.org/)分析BACE2 表达与来自Molecular SignaturesDatabase(MSigDB)的特定基因集之间的关联。
1.4 RNA干扰
合成了靶向BACE2的小干扰RNA(siRNA)。根据说明书，使用LipofectamineRNAiMAX试剂(Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA，USA)用siRNA转染细胞。转染后48小时通过RT-PCR和Western印迹分析测定敲低效率。有效的 siRNA序列(n＝2)如下：
si-BACE2#1:5'ACAGAGAGGUCUAGCACAUTT',
si-BACE2#:5'GGGAUUAAAUGGAAUGGAATT3'。
用si-BACE2#1转染用于体外功能实验的神经胶质瘤细胞。
1.5慢病毒转染
使用GeneChem(中国上海)合成的慢病毒转染，根据说明书用慢病毒转染细胞，实现BACE2和对照基因在细胞中的稳定过表达。用1μg/ml嘌呤霉素(Thermo FisherScientific，Grand Island，NY，USA)处理1周后，选择稳定转染的细胞。通过RT-PCR和Western印迹确定转染效率。
1.6实时定量PCR
用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞中分离总RNA。逆转录后，用SYBR PrimeScript PCRKitⅡ(TaKaRa Biotechnology，Dalian，China) 进行实时定量PCR(RT-qPCR)。GAPDH用作对照。
引物序列如下：
BACE2：
5′CGTTTTCTCCATGCAGATGAGTGT3′(F),
5′CCTCCGTTGGTCCCCAGATC3′(R).
IKBα：
5′CCCTACACCTTGCCTGTGAG3′(F),
5′CACCAAAAGCTCCACGATGC3′(R).
A20：
5′GGCCTACAACCCGCATACAA3′(F),
5′GGTCTGATCTCTCTTGGCGG3′(R).
IL-8：
5′GTGTGAAGGTGCAGTTTTGCC3′(F),
5′TTTCTGTGTTGGCGCAGTGT3′(R).
GAPDH：
5′CCATCTTCCAGGAGCGAGATC3′(F),
5′GCCTTCTCCATGGTGGTGAA3′(R).
1.7蛋白质印迹分析
采用1％苯基甲基磺酰氟作为RIPA缓冲液(Beyotime，中国江苏省海门市)，从组织和细胞中提取总蛋白，并采用biinchoninic acid(BCA)法(Beyotime)测定蛋白浓度。将等量的蛋白质装入10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。接下来,western blotting孵化主要抗体在一夜之间在4℃。用TBST洗涤后，室温下用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h，增强化学发光(ECL；使用ECL检测系统(ThermoScientific，北京，中国)。BACE2 (ab5670),N-cadherin(#13116),E-cadherin(#3195),β-catenin(#8480),MMP2 (#40994),Vimentin(#5741),Snail(#3879),Twist(#46702),CDK2(#2546),CDK4 (#12790),Cyclin D1(#2978),c-Myc(#13987),p21(#2947),p27(#3686),p65 (#8242),p-p65(#3033),Smad2(#5339),p-Smad2(#18338),PP1A(#2582),p-PP1A (#2581),IKKβ(#8943),p-IKKβ(#2694),IKBα(#11930),p-IKBα(#2859)and GAPDH(#5174).以GAPDH蛋白为对照，测定相对综合密度值。
1.8免疫共沉淀
根据相应说明书，用Pierce TM Classic Magnetic IP/Co-IP试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)获得蛋白质。将蛋白质在10％SDS-P年龄凝胶上电泳，转移至PVDF膜并与针对第一抗体的第二抗体一起温育。
1.9 3D肿瘤球体侵袭实验
将神经胶质瘤细胞作为单细胞重悬浮于50μl的1×球形组ECM中，将其加入到3D培养合格的96孔球形成板的每个孔中。然后将细胞在室温下以200×g 离心3分钟，然后在37℃下孵育72小时以促进球状体信息。每孔加入50微升侵袭基质，在旋转平板上以300×g离心5分钟，4℃离心5分钟。使用尼康显微镜每24小时拍摄具有球状体的细胞。
1.10细胞侵袭及迁移实验
细胞侵袭实验，将100μl Matrigel在PBS(1：6)中稀释，加入24孔Transwell 装置(8-μm孔；BD Biosciences，San Diego，CA，USA)的上室并维持在37℃， 2小时。弃去上室中的溶液，并将100μlDMEM中的4×105个细胞加入上室中。向下室填充600μl含15％FBS的DMEM，并在37℃下孵育24-48小时,弃去上腔室中含有非侵入细胞的培养基。对于细胞迁移测定，将3x104个细胞置于上室中的100μl DMEM中并孵育12-24小时。用4％多聚甲醛固定侵入或迁移的细胞，并用结晶紫染色。拍摄来自每个孔的五个随机视野，并通过Im年龄J计数细胞数。每个试验一式三份。
1.11伤口愈合测定
将总共1.2×106个细胞接种在6孔板中并在转染后培养2天。用巴斯德吸管刮擦线状伤口穿过细胞层。将板用PBS洗涤两次以除去分离的细胞。用Nikon 显微镜在0小时和48小时拍摄细胞中的线。每个试验一式三份。
1.12免疫荧光
将转染的细胞接种在放置于12孔板中的圆形载玻片上24小时，并用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS洗涤两次，并用0.4％Triton X-100透化10分钟。将载玻片用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽在室温下染色30分钟，同时避光。将细胞核用DAPI染色5分钟。用Nikon倒置荧光显微镜拍摄载玻片。每个试验一式三份。
1.13细胞增殖试验
根据说明(Dojindo，Kumamoto，Japan)，细胞计数试剂盒-8(CCK-8)用于确定细胞增殖的程度。将100微升单细胞悬浮液(2×103细胞)接种于每孔96 孔板中24小时，48小时和72小时。向每个孔中加入100μL含有10％CCK-8的培养基后，将板在37℃下孵育2小时，同时避光，并在450nm波长(OD450) 下测量吸光度。根据制造商的说明书(Ribo-Bio；Guangzhou，China)进行Edu 测定，并将转染的细胞接种在12孔板上12小时。将贴壁细胞与500μL5-乙炔基 -20-脱氧尿苷培养基(1000：1，Ribo-Bio；Guangzhou，China)在37℃下孵育2 小时。将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS洗涤两次，并用0.4％Triton X-100透化10分钟。向每个孔中加入100微升Apollo试剂，并在室温下孵育30 分钟，同时避光。细胞核用DAPI染色。用Nikon倒置荧光显微镜拍摄细胞。每个试验一次三份。
1.14流式细胞仪
将转染的细胞用75％乙醇在4℃下固定过夜。用PBS洗涤细胞，重浮并用 200μL碘化丙啶(PI)(BD Biosciences；San Jose，CA，USA)染色。根据说明，使用流式细胞仪(BDBiosciences)进行细胞周期分析。并使用软件ModFit 4.0 定量。每个试验一次三份。
1.15裸鼠体内成瘤
采用4周龄裸鼠(中国医学科学院肿瘤研究所)建立颅内神经胶质瘤异种移植，以U87MG细胞为细胞模型。在此之前，U87MG细胞通过阴性对照(NC)载体或敲低BACE2(U87-shBACE2)和荧光素酶转导。根据颅内注射U87MG细胞是否转染NC慢病毒或CUL7慢病毒(Lenti-shBACE2)，将原位胶质瘤模型分为两组。如前所述，每只小鼠体内注射30万个细胞。采用生物发光成像技术检测颅内肿瘤在第7天和第14天的生长情况。这些数据被归一化为每只动物开始治疗时检测到的生物发光。附图中所示的误差条表示标准差(SD)。Kaplan-Meier生存曲线绘制为生存时间。
1.16统计分析
Kaplan-Meier方法用于评估生存曲线并将结果与长秩检验进行比较。使用 TCGA数据库确定不同神经胶质瘤亚型中的BACE2表达模式，以及BACE2与以下突变或操作的关联：异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)突变，O-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化，共删除1p/19q，端粒酶逆转录酶(TERT) 丢失和α地中海贫血/智力低下症候群X连锁(ATRX)突变。使用GraphPad Prism 6软件进行t检验或单向ANOVA进行所有其他数据比较。Pearson相关性用于确定BACE2与其他相关基因表达之间的线性关系。双尾χ2检验用于评估BACE2 表达与临床病理学特征之间的关联。所有数据均以平均值±标准误差表示。所有测试均为双侧，p值<0.05被认为具有统计学意义。
实施例2
2.1 BACE2的高表达水平与更高等级的人脑胶质瘤相关。
为了确定BACE2在神经胶质瘤发展中的作用，在正常脑组织，低级别神经胶质瘤(LGG)组织和GBM组织中分析BACE2的表达水平。与LGG和正常脑组织相比，在TCGA和CGGA数据库中，GBM组织中BACE2 mRNA表达显着上调(图1A)。
根据癌症基因表达谱，胶质瘤分为四种分子亚型：神经元型，前神经元型，经典型和间充质型。与间质亚型相比，间充质亚型与患者的不良临床结果相关。因此，基于分子亚型，本实施例检测了BACE2 mRNA表达。与TCGA和CGGA 数据库中的前神经亚型相比，间充质亚型中BACE2表达水平显着增加(图1B)。此外，ROC曲线显示，BACE2蛋白质的表达含量有望用于以区分间充质亚型患者和非间充质亚型患者(图1C)。
此外，通过免疫组织化学分析来自齐鲁医院(济南，中国)的人脑胶质瘤样本和正常脑组织中BACE2蛋白质的水平。结果显示GBM组织中BACE2蛋白表达显着高于LGG和正常脑组织(图1D)。在公开可用的数据库和本实施例所有的原发性神经胶质瘤标本中，BACE2的表达水平与更高等级的人神经胶质瘤相关。
此外，BACE2表达水平还与TCGA数据库中神经胶质瘤患者的临床病理学特征相关。高BACE2表达水平与患者年龄和KPS显着相关(表1)。如一些报道所述，IDH1/2突变，MGMT启动子甲基化，1p/19q共缺失，TERT缺失和ATRX突变与胶质瘤患者的预后更好相关。因此，本实施例分析了BACE2的表达是否与这些分子遗传特征相关。高BACE2表达与胶质瘤患者中的野生型 IDH1相关，而BACE2的低表达与其他特征相关，包括MGMT启动子甲基化， 1p/19q共缺失，TERT缺失和ATRX突变。
表1:人脑胶质瘤患者BACE2表达与不同临床病理特征的相关性。
Figure BDA0002285031930000141
Figure BDA0002285031930000151
注：P值通过卡方检验和Fisher精确检验确定。
2.2胶质瘤患者较差的预后与BACE2的表达相关。
使用Kaplan-Meier存活曲线以确定胶质瘤患者中BACE2表达的预后价值。 本实施例发现，与TCGA数据库中低BACE2表达的患者相比，具有高表达 BACE2的LGG和GBM患者的预后更差(n＝667)。同样，在CGGA数据库中， 具有高BACE2表达的LGG和GBM患者的预后也比具有低BACE2表达的患者 (n＝302)更差。此外，通过多变量Cox回归分析，BACE2被确定为胶质瘤患 者独立的预后指标(表2)。因此，BACE2可能是神经胶质瘤的重要的预后生 物标志物。
表2：单变量Cox回归和多变量Cox回归测定BACE2表达对胶质瘤患者总体生存率的影响
Figure BDA0002285031930000152
2.3 BACE2相关基因富集分析
使用TCGA数据库对BACE2的全基因组谱进行相关性分析，以探索胶质瘤的潜在生物学效应。在数据库中，1274个基因是正相关的，694个基因与BACE2 呈负相关。然后，对这些相关基因进行富集分析。基因本体论(GO)分析显示，与BACE2正相关的基因主要参与促癌过程，包括细胞粘附、细胞增殖、细胞迁移和细胞外基质分解。另一方面，与BACE2负相关的基因在细胞分化或转运过程中极大地富集，例如在神经系统发育、轴突导向和跨膜离子转运调节期间(图 2A)。KEGG分析表明BACE2主要富集与粘着斑，癌症相关途径和肌动蛋白细胞骨架调节相关的过程。最后，GSEA分析显示高BACE2表达与EMT，肿瘤侵袭，肿瘤转移和细胞周期中G1-S相变的调节有统计学相关性(图2B)。总之，这些结果表明BACE2通过调节这些恶性生物学行为促进了胶质瘤的恶性进展。
本实施例在先前的富集分析的基础上，首先进行3D胶原球状体侵袭测定以评估BACE2在细胞侵袭中的作用。通过两个独立的siRNA序列转染U87MG和 U251细胞。此外，通过慢病毒转染U87MG和U251细胞获得BACE2过表达 (BACE2-LentiOV)和对照组(BACE2-LentiNC)神经胶质瘤细胞系。通过 RT-qPCR和Western印迹检查转染效率(图3A和图4A)。与对照组相比，在 U87MG和U251球体中用单一siRNA敲低BACE2可显着降低侵袭面积(图 3C-D)，而BACE2-LentiOV组的侵袭能力与对照组相比有所增加。对照组(图 4B-C)。此外，沉默BACE2还削弱了细胞的侵袭和迁移能力，而BACE2-LentiOV 细胞相对于BACE2-LentiNC细胞的侵袭和迁移能力增强(图3E-F和图4D)。
人们普遍认为EMT在不同肿瘤的侵袭和转移中起重要作用。因此，本实施例探讨了BACE2是否参与了EMT。首先，沉默BACE2引起神经胶质瘤细胞形态转化，U87MG和U251细胞与细胞间的连接更加紧密(图3B)。此外，与对照组相比，沉默BACE2导致一些间充质亚型标记物(N-cadherin，β-catenin， Vimentin)，上游转录因子(Snail，Twist)和MMP2显着减少以及上皮标记物 (E-cadherin)的增加(图3H)。与BACE2-LentiNC组相比，在BACE2-LentiOV组中验证了这些结果(图3I)。另外，如使用免疫荧光法观察到的，敲除BACE2 减少了胶质瘤中的板状伪足的形成(图4E-F)，这是癌症侵袭性生长期间的重要结构因此，基于这些结果，BACE2可以促进神经胶质瘤中的间充质转化EMT。
2.4 BACE2在体外促进胶质瘤细胞的增殖。
富集分析的结果表明BACE2参与细胞增殖和细胞周期。首先，在U87MG 和U251细胞中沉默BACE2显着降低Edu阳性细胞百分比与对照组相比， BACE2-LentiOV组中Edu阳性细胞百分比高于BACE2-LentiNC组(图5A-B)。与该发现一致，CCK-8测定的结果显示BACE2的下调抑制了神经胶质瘤细胞的增殖，而BACE2过表达促进了细胞增殖(图5C-D)。此外，在U87MG和U251 细胞中，与对照组细胞比例相比，siBACE2组细胞中G0/G1细胞比例显着增加，而与对照组中的比例相比，BACE2过表达导致G0/G1细胞比例下降。(图5E-F)。为了通过Western印迹分析确定BACE2的下游靶标，与对照组相比，siBACE2 组中CDK2，CDK4，细胞周期蛋白D1和c-Myc的表达较低，而BACE2-LentiOV 与BACE2-LentiNC相比较高。p21和p27、BACE2沉默组中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制水平升高，BACE2过表达组降低，(图5G-H)。因此，这些结果表明 BACE2通过调节细胞周期促进神经胶质瘤细胞的增殖。
2.5 BACE2通过NF-κB信号通路促进胶质瘤进展。
基于GSEA分析，高BACE2表达参与激活NF-κB信号传导途径(图6A)。众所周知，p65的磷酸化启动经典NF-κB信号传导途径的活化。因此，本实施例测定了胶质瘤中p-p65和p65的水平。在转染的神经胶质瘤细胞中测定p-p65和 p65的表达水平，显示敲低BACE2导致p-p65下调(图5G-H)。接下来，用IMD0354 (一种NF-κB信号传导抑制剂)处理BACE2-LentiOV组。与没有IMD0354的组相比，p-p65，Cyclin D1和N-cadherin的表达降低(图6B)。来自CCK-8和迁移测定的结果显示BACE2-LentiOV组中细胞的增殖和迁移被NF-κB信号传导的抑制所抑制(图6C-E)。这些结果表明BACE2通过NF-κB信号传导途径发出信号。
2.6 BACE2通过PP1A/IKKβ轴调节TNFα诱导的NF-κB活性。
此外，KEGG富集分析表明BACE2与TNF-α信号传导强烈相关(图7A)。之前的研究已经注意到TNF-α通过激活IKK复合物调节NF-κB的重要性。因此，本实施例研究了BACE2是否调节TNFα刺激的NF-κB活性。最初，敲低BACE2 降低了NF-κB下游基因的表达，包括IκBα，A20和IL-8(图7B)。此外，BACE2 敲低抑制了神经胶质瘤细胞中TNF-α诱导的IKKβ的磷酸化(图7C)。由于IκBα和p65是IKK底物，本实施例测定了IκBα和p65的磷酸化，并发现敲低BACE2 抑制TNFα诱导的p-IκBα和p-p65(图7D)。与该发现一致，BACE2敲低抑制p65导入TNF-α刺激的细胞核(图7E)。然而，BACE2如何调节这种TNFα诱导的NF-κB活性仍然未知。众所周知，PP1A通过p-IKKβ的去磷酸化来抑制TNFα刺激的NF-κB活性。基于TCGA和CGGA数据库，本实施例发现BACE2的表达与p-PP1A的表达正相关(图7F)。敲低BACE2后，U87MG和U251细胞系中p-PP1A的表达均下降(图5F-G)。为了研究PP1A是否参与TNFα诱导的NF-κB 中BACE2的调节，本实施例通过Western印迹分析确定了p-p65水平。本实施例发现PP1A敲低逆转了BACE2沉默并阻止TNFα通过PP1A/IKK途径诱导p65 NF-κB活化的磷酸化(图7G)。这些结果表明BACE2通过PP1A/IKKβ途径调节 TNFα诱导的NF-κB活性。
2.7 TGFβ1在神经胶质瘤细胞中诱导BACE2。
调节胶质瘤中BACE2表达的信号传导途径对于探索治疗性治疗至关重要。 基于GSEA，BACE2富含TGFβ信号传导途径(图8A)。众所周知，TGFβ1可 以调节脑肿瘤进展。实际上，与TCGA和CGGA数据库中的LGG细胞相比， GBM细胞中TGFβ1的表达更高，BACE2也是如此(图8B)。此外，在胶质瘤 患者中BACE2和TGFβ1表达之间存在相关性(图8C)。通过蛋白质印迹分析， 本实施例观察到敲低BACE2抑制了U87MG和U251细胞中TGFβ1(10ng/ml) 刺激的EMT，这表明BACE2可能被胶质瘤细胞中的TGFβ1刺激(图9D)。接 下来，对于两种神经胶质瘤细胞系，BACE2的表达随着培养基中TGFβ1浓度的 增加而上调(图9E)。同时，TGFβ1对BACE2的促进作用被SB431542阻断， SB431542是TGFβ/Smad途径的特异性抑制剂。此外，为了确定BACE2是否通 过Smad途径受TGFβ1调节，用si-Smad2转染细胞。在存在TGFβ1的情况下， 与对照组相比，体外Smad2沉默组中BACE2的蛋白质水平降低。因此，上述结 果表明TGFβ1在胶质瘤中通过TGFβ/Smad途径诱导BACE2。
2.8敲低BACE2抑制异种移植小鼠的肿瘤发生
为了进一步确定BACE2的功能，本实施例将研究扩展到体内实验。通过用荧光素酶标记的U87MG转染sh-BACE2慢病毒获得sh-BACE2及其对照组细胞，并将它们移植到裸鼠的脑中。在植入后7天和14天，在体内对小鼠进行生物发光成像(图9A)。来自sh-BACE2组的肿瘤的平均辐射亮度在统计学上低于对照组。sh-BACE2组的总存活率也高于对照组(图9B)。类似地，与对照组的肿瘤相比，具有移植的sh-BACE2细胞的组的肿瘤尺寸显着更小(图9C-D)。在sh-BACE2异种移植物中，N-cadherin，Ki-67和BACE2的蛋白质水平也较低(图 9E)。因此，这些结果证明稳定的BACE2敲低抑制了异种移植小鼠中神经胶质瘤的生长和侵袭。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于检测BACE2表达水平的物质在制备胶质瘤诊断的产品或胶质瘤预后评估的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于预测胶质瘤恶性程度及其患者的预后情况，BACE2高表达代表不良预后。
3.BACE2抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。
4.如权利要求3所述BACE2抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂包括通过基因工程手段降低BACE2表达的制剂。
5.TGFβ/Smad通路抑制剂在制备BACE2抑制剂中的应用，或TGFβ/Smad通路激动剂在制备BACE2激动剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述TGFβ/Smad通路激动剂为TGFβ1。
7.BACE2抑制剂在制备PP1A/IKKβ轴抑制剂中的应用。
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