CN108699528A - 在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发 - Google Patents

在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发 Download PDF

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Abstract

本发明公开的主题提供诱导干细胞分化为肠神经嵴谱系细胞的体外方法，以及通过这种方法得到的肠神经嵴谱系细胞。本发明公开的主题还提供这种肠神经嵴谱系细胞用于预防和/或治疗肠神经系统病症(例如先天性巨结肠症)、和用于筛选适于预防和/或治疗肠神经系统病症(例如先天性巨结肠症)的化合物的用途。

Description

在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱 系可行的基于细胞的治疗和药物开发
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月23日提交的美国临时申请序列号62/387,468的优先权，将其全部内容并入以供参考，并且对其要求优先权。
序列表
本申请包含已以ASCII形式电子提交的序列表，并且其全部内容并入本文以供参考。所述ASCII拷贝创建于2016年12月20日，命名为“0727340451Seqlist_ST25.txt”并且大小为1,162个字节。
1.介绍
本发明公开的主题涉及衍生自干细胞(例如人干细胞)的肠神经嵴谱系细胞，以及其用于在肠神经系统的疾病比如先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease)中的基于细胞的治疗和药物开发的用途。
2.主题背景
肠神经系统(ENS)对正常胃肠(GI)功能至关重要。它是自主神经系统中最大和最多样化的组成部分，其细胞表达超过30种不同的神经递质，其神经元数量超过脊髓1。ENS可以在很大程度上独立于大脑和脊髓的输入而起作用，因此被称为“第二大脑”1，因为它具有自主性和复杂的细胞结构。ENS发育中的缺陷导致一系列人类疾病2，包括先天性巨结肠症(HD)。HD是一种使人衰弱的遗传性疾病，由ENS祖细胞的发育失败导致迁移到胃肠道，特别是远端结肠3。由于缺乏合适的模型系统和对原发组织的获取有限，人ENS谱系的发育仍然知之甚少。
先前建立了用于从人多能干细胞(hPSC)(包括神经嵴(NC))衍生中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)谱系的基于小分子的方案4-7。然而，尽管进行了大量的努力和GI病症的重要医学意义，但人ENS谱系的体外衍生仍然难以捉摸。因此，仍然需要直接从人干细胞产生ENS前体的体外方法和方案。
3.主题概述
本发明公开的主题涉及衍生自干细胞(例如人干细胞)的肠神经嵴谱系细胞，例如通过体外分化。
在某些实施方式中，本发明公开的主题提供用于诱导干细胞(例如人干细胞)分化的体外方法。在某些实施方式中，用于诱导干细胞分化的体外方法包括使干细胞群体与有效量的一种或多种转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种无翼(wingless)(Wnt)信号传导激活剂接触，并进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
在某些实施方式中，用于诱导干细胞分化的体外方法包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且在从干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触约8天内，进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成(patterning)的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。在某些实施方式中，所述细胞群体与有效量的一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在干细胞群体与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约四天时段内。为清楚起见，一种或多种Wnt信号传导激活剂可与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂在同一天、或一天后、两天后或三天后添加。在某些实施方式中，细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂和一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂在96小时时段内接触。
在本文所述的时段中，如果一种或多种药剂在同一天(在同一24小时时段)添加，则它们可以以任何顺序添加，除非在本文中有相反指示。
本发明公开的主题还提供表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体。在某些实施方式中，分化细胞群体通过以下方法衍生自干细胞群体，该方法包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并进一步使所述细胞与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天。本发明公开的主题进一步提供包含这种分化细胞群体的组合物。
在某些实施方式中，分化细胞群体通过以下方法衍生自干细胞群体，该方法包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且在从干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触约8天时段内，进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天。在某些实施方式中，所述细胞群体与有效量的一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在干细胞群体与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触开始的约四天时段内。本发明公开的主题还提供包含这种分化细胞群体的组合物。
此外，本发明公开的主题提供用于诱导干细胞分化的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒包含(a)一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、(b)一种或多种Wnt信号传导激活剂、和(c)一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子。在某些实施方式中，该试剂盒还包含(d)用于诱导干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书，其中所述说明书包含使所述细胞群体与有效量的所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天的用法说明。在某些非限制性实施方式中，所述说明书包含(i)在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触的约8天内使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子最初接触，和(ii)使所述干细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触的约0至4天内使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂最初接触的用法说明。
在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天。
在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触当日开始约8天时段内。
在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触至少约2天后。
在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约4天后。
在某些实施方式中，所述干细胞群体在其与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触后约第11天或之后已分化为表达一种或多种所述肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
在某些实施方式中，该方法包括使所述干细胞群体与一种或多种Small MothersAgainst Decapentaplegic(SMAD)信号传导抑制剂接触。
在某些实施方式中，该方法包括使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触。
在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触不迟于从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天。在某些实施方式中，该方法包括使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触约2天后。
在某些实施方式中，该方法包括使所述干细胞群体与有效量的所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在所述干细胞群体与有效量的所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天(在同一24小时时段内)。
在某些实施方式中，所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂是SB431542。
在某些实施方式中，所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，SMAD信号传导的抑制剂是LDN193189。
在某些实施方式中，所述一种或多种Wnt信号传导激活剂降低用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)。在某些实施方式中，所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，Wnt信号传导的激活剂是CHIR99021。
在某些实施方式中，所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸(tretinoin)、1,3-顺式视黄酸(isotretinoin)、阿利维A酸(alitretinoin)、阿维A酯(etretinate)、阿维A(acitretin)、他扎罗汀(tazarotene)、贝沙罗汀(bexarotene)、阿达帕林(adapalene)。在某些实施方式中，所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂、Wnt激活剂、及其组合。在某些实施方式中，诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
在某些实施方式中，所述干细胞群体与有效量的诱导迷走神经嵴图式形成的视黄酸接触。在某些实施方式中，所述干细胞群体与两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触，该诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。在某些实施方式中，所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。在某些实施方式中，所述Wnt激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
在某些实施方式中，所述迷走神经嵴图式形成的特征在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达。在某些实施方式中，所述一种或多种区域特异性HOX基因选自HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
在某些实施方式中，所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。在某些实施方式中，所述分化细胞群体还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。在某些实施方式中，所述SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
在某些实施方式中，所述干细胞是人干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是非人干细胞，例如非人灵长类动物干细胞、啮齿类动物干细胞、狗干细胞、猫干细胞等。在某些实施方式中，所述干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，所述人干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞(primoridal germcell-like pluripotent stem cells)、上胚层干细胞、F-class多能干细胞。
在某些实施方式中，该方法还包括使所述分化细胞群体经受有利于所述分化细胞成熟为肠神经元群体的条件。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括在合适的细胞培养基中培养所述分化细胞群体。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与一种或多种增强肠神经系统前体成熟为肠神经元的分子接触。在某些实施方式中，所述一种或多种增强肠神经系统前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和Wnt激活剂。在某些实施方式中，所述生长因子选自FGF信号传导的激活剂(“FGF激活剂”)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、和抗坏血酸。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触至少1天。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约4天。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与GDNF和抗坏血酸接触。在某些实施方式中，所述有利于成熟的条件包括使所述分化细胞群体与GDNF和抗坏血酸接触约10天、约15天、或约45天。
在某些实施方式中，所述分化细胞群体表达一种或多种肠神经元标志物。在某些实施方式中，所述一种或多种肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
本发明公开的主题进一步提供预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症的方法。在某些实施方式中，该方法包括将有效量的本文所述的分化细胞群体施用于患有肠神经系统病症的受试者。
本发明公开的主题进一步提供本文所述的分化细胞群体用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
本发明公开的主题进一步提供本文所述的分化细胞群体在制造用于预防和/或治疗肠神经系统病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
在某些实施方式中，肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
此外，本发明公开的主题提供鉴定适于预防和/或治疗先天性巨结肠症、和/或先天性巨结肠症-相关遗传缺陷、和/或另一种肠神经系统病症的化合物的体外方法。在某些实施方式中，该方法包括鉴定能够拯救由本文所述的分化细胞和/或细胞群体(表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体、和/或表达一种或多种肠神经元标志物的分化细胞群体)递呈的至少一种迁移缺陷的化合物，其中预分化的干细胞包含内皮素B型受体(EDNRB)的纯合功能丧失突变。在某些实施方式中，该方法包括(a)提供(i)所述分化细胞或细胞群体、和(ii)测试化合物；(b)使所述分化细胞或细胞群体与所述测试化合物接触；和(c)测量所述分化细胞或细胞群体的迁移行为。在某些实施方式中，所述分化细胞或细胞群体与所述测试化合物接触至少约6、12、或24小时。
本发明公开的主题还提供一种包含体外分化细胞群体的组合物，其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物并且其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的(Melanocyte-competent)神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
本发明公开的主题还提供一种包含体外分化细胞群体的组合物，其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经元标志物并且其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、肠神经嵴谱系标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
在某些非限制性实施方式中，肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
在某些非限制性实施方式中，肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
在某些非限制性实施方式中，干细胞标志物选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
在某些非限制性实施方式中，CNS标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
在某些非限制性实施方式中，CNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
在某些非限制性实施方式中，MNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
在某些非限制性实施方式中，神经元细胞标志物选自TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
在某些非限制性实施方式中，间充质前体标志物选自SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
在某些非限制性实施方式中，该组合物包含约1x104至约1x1010个表达所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞的群体。
在某些非限制性实施方式中，该组合物包含约1x105至约1x107个表达所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞的群体。
本发明公开的主题还提供一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的β-分泌酶(BACE)的抑制剂。在某些实施方式中，BACE的抑制剂选自BACE2的抑制剂、LY450139、LY2886721、LY2811376、Verubecestat(MK-8931)、和AZD3839。在某些实施方式中，BACE的抑制剂是BACE2的抑制剂。在某些实施方式中，BACE2的抑制剂是BACE抑制剂IV(BACE抑制剂C3)。所述抑制剂可全身地施用于受试者，或者可局部输注入胃肠道(例如结肠)和/或输注胃肠道(例如结肠)的血管。
此外，本发明公开的主题提供一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的酸性蛋白酶的抑制剂。在某些实施方式中，酸性蛋白酶的抑制剂选自胃酶抑素A、利托那韦(Ritonavir)、茚地那韦(Indinavir)、占吉仑(Zankiren)、阿利吉仑(Aliskiren)和LY-450139。在某些实施方式中，酸性蛋白酶的抑制剂是胃酶抑素A。所述抑制剂可全身地施用于受试者，或者可局部输注入胃肠道(例如结肠)和/或输注胃肠道(例如结肠)的血管。
此外，本发明公开的主题提供BACE抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
此外，本发明公开的主题提供酸性蛋白酶的抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
A.在某些非限制性实施方式中，本发明公开的主题提供一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂(“Wnt激活剂”)接触，并进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体(“肠神经系统(ENS)前体”)。
A1.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与所述有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天。
A2.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
A3.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天。
A4.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天。
A5.前述A的方法，其中所述干细胞群体在其与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触后约第11天或之后已分化为表达一种或多种所述肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
A6.前述A的方法，其包括使所述干细胞群体与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触。
A7.前述A的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触。
A8.前述A的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内。
A9.前述A的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天。
A10.前述A的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在与所述群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天。
A11.前述A的方法，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
A12.前述A的方法，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
A13.前述A的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂降低用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)。
A14.前述A的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
A15.前述A的方法，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、及其组合。
A16.前述A的方法，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂和Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
A17.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
A18.前述A的方法，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
A19.前述A的方法，其包括使所述细胞群体与两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
A20.前述A的方法，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。
A21.前述A的方法，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
A22.前述A的方法，其中所述Wnt激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
A23.前述A的方法，其中所述迷走神经嵴图式形成的特征在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达。
A24.前述A的方法，其中所述一种或多种区域特异性HOX基因选自HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
A25.前述A的方法，其中所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
A26.前述A的方法，其中所述分化细胞群体还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。
A27.前述A的方法，其中所述SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
A28.前述A的方法，其中所述干细胞是人干细胞。
A29.前述A的方法，其中所述人干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、上胚层干细胞、和F-class多能干细胞。
A30.前述A的方法，其中所述干细胞是非人干细胞。
A31.前述A的方法，其包括使所述分化细胞群体经受有利于所述分化细胞成熟为表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体的条件。
A32.前述A的方法，其中所述有利于所述分化细胞成熟为所述肠神经元群体的条件包括在合适的细胞培养基中培养所述分化细胞。
A33.前述A的方法，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子。
A34.前述A的方法，其中所述一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和Wnt激活剂。
A35.前述A的方法，其中所述生长因子选自FGF信号传导的激活剂、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、和抗坏血酸。
A36.前述A的方法，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂。
A37.前述A的方法，其中所述分化细胞在包含所述一种或多种FGF信号传导激活剂和所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的所述合适的细胞培养基中培养约4天。
A38.前述A的方法，其中一种或多种FGF信号传导激活剂选自FGF2、FGF4、FGF8、和FGF7。
A39.前述A的方法，其中所述一种或多种肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
B.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体(“ENS前体”)，其中所述分化细胞群体在以下之后衍生自干细胞群体：
使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，和
进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天。
B1.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天。
B2.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触发生在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
B3.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触是在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天。
B4.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触是在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天。
B5.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞群体在其与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触后约第11天或之后已分化为表达一种或多种所述肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
B6.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触。
B7.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触。
B8.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内。
B9.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触是在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天。
B10.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触是在所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天。
B11.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
B12.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
B13.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂降低用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)。
B14.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
B15.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、FGF信号传导的激活剂、Wnt激活剂、及其组合。
B16.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
B17.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
B18.前述B的分化细胞群体，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
B19.前述B的分化细胞群体，其中所述细胞群体与两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
B20.前述B的分化细胞群体，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。
B21.前述B的分化细胞群体，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
B22.前述B的分化细胞群体，其中所述Wnt激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
B23.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
B24.前述B的分化细胞群体，其中所述迷走神经嵴图式形成的特征在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达。
B25.前述B的分化细胞群体，其中所述一种或多种区域特异性HOX基因选自HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
B26.前述B的分化细胞群体，其中所述分化细胞群体还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。
B27.前述B的分化细胞群体，其中所述SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
B28.前述B的分化细胞群体，其中所述干细胞是人干细胞。
B29.前述B的分化细胞群体，其中所述人干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、上胚层干细胞、和F-class多能干细胞。
C.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种包含前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的组合物。
D.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种表达一种或多种肠神经元标志物的体外分化细胞群体，其中所述分化细胞群体衍生自前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
D1.前述D的分化细胞群体，其中在合适的细胞培养基中培养前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体之后，所述分化细胞群体衍生自前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
D2.前述D的分化细胞群体，其中在合适的细胞培养基中培养前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体至少约1天后，所述分化细胞群体衍生自前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
D3.前述D的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子。
D4.前述D的分化细胞群体，其中所述一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和Wnt激活剂。
D5.前述D的分化细胞群体，其中所述生长因子选自FGF信号传导的激活剂、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、和抗坏血酸。
D6.前述D的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂。
D7.前述D的分化细胞群体，其中在合适的包含所述一种或多种FGF信号传导激活剂和所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的细胞培养基中培养前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体约4天后，所述分化细胞群体衍生自前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
D8.前述D的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含GDNF和抗坏血酸。
D9.前述D的分化细胞群体，其中在合适的包含GDNF和抗坏血酸的细胞培养基中培养前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体约10天、约25天、或约45天后，所述分化细胞群体衍生自前述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
D10.前述D的分化细胞群体，其中所述一种或多种FGF信号传导激活剂选自FGF2、FGF4、FGF8、和FGF7。
D11.前述D的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
D12.前述D的分化细胞群体，其中所述一种或多种肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
E.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种包含前述表达一种或多种肠神经元标志物的分化细胞群体的组合物。
F.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症的方法，其包括向患有肠神经系统病症的受试者施用有效量的以下中的一种：
(a)前述分化ENS前体群体；
(b)一种包含前述分化ENS前体群体的组合物；
(c)前述肠神经元群体；和
(d)一种包含前述肠神经元群体的组合物。
F1.前述F的方法，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
F2.前述F的方法，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
G.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供前述分化ENS前体群体，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
G1.前述G的分化细胞群体，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
G2.前述G的分化细胞群体，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
H.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供前述分化ENS前体群体在制造用于预防和/或治疗肠神经系统病症的药物中的用途。
H1.前述H的用途，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
H2.前述H的用途，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
I.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种包含前述分化ENS前体群体的组合物，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
I1.前述I的组合物，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
I2.前述I的组合物，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
J.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供前述分化肠神经元群体，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
J1.前述J的分化细胞群体，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
J2.前述J的分化细胞群体，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
K.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供前述分化肠神经元群体在制造用于预防和/或治疗肠神经系统病症的药物中的用途。
K1.前述K的用途，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
K2.前述K的用途，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
L.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种包含前述分化肠神经元群体的组合物，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
L1.前述L的组合物，其中肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
L2.前述I的组合物，其中肠神经系统病症是中毒性巨结肠。
M.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种在体外筛选适于预防和/或治疗先天性巨结肠症和/或先天性巨结肠症-相关遗传缺陷的化合物的方法，其包括鉴定能够拯救由选自前述分化ENS前体、前述分化肠神经元、及其组合的细胞群体递呈的至少一种迁移缺陷的化合物，其中干细胞包含内皮素B型受体(EDNRB)中的纯合功能丧失突变。
M1.前述M的方法，其包括：
(a)提供(i)所述细胞群体、和(ii)测试化合物；
(b)使所述细胞群体与所述测试化合物接触；和
(c)测量所述细胞群体的迁移行为。
M2.前述M的方法，其中所述细胞群体是ENS前体群体。
M3.前述M的方法，其中所述细胞群体与所述测试化合物接触至少约24小时。
N.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包含：
(a)一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂，
(b)一种或多种Wnt信号传导激活剂，
(c)一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子，和
(d)用于诱导干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天的用法说明。
N1.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天的用法说明。
N2.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内的用法说明。
N3.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天的用法说明。
N4.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天的用法说明。
N5.前述N的试剂盒，其还包含一种或多种SMAD信号传导抑制剂。
N6.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触的用法说明。
N7.前述H的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内的用法说明。
N8.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天的用法说明。
N9.前述N的试剂盒，其中所述说明书包含使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天的用法说明。
N10.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
N11.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
N12.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂降低用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)。
N13.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
N14.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、FGF信号传导的激活剂、Wnt激活剂、及其组合。
N15.前述N的试剂盒，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
N16.前述N的试剂盒，其包含一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子。
N17.前述N的试剂盒，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
N18.前述N的试剂盒，其包含两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子。
N19.前述N的试剂盒，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。
N20.前述N的试剂盒，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
N21.前述N的试剂盒，其中所述Wnt激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
O.在某些非限制性实施方式中，本发明公开的主题提供一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
O1.前述O的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天时段内。
P.在某些非限制性实施方式中，本发明公开的主题提供一种表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体，其中所述分化细胞群体在以下之后衍生自干细胞群体：使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
P1.前述P的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天时段内。
Q.在某些非限制性实施方式中，本发明公开的主题提供一种用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包含(a)一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、(b)一种或多种Wnt信号传导激活剂、(c)一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子、和(d)用于诱导干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内，并且使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天的用法说明。
Q1.前述Q的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内的用法说明。
R.一种包含体外分化细胞群体的组合物，
其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物，并且
其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
R1.前述R的组合物，其中肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
R2.前述R的组合物，其中干细胞标志物选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
R3.前述R的组合物，其中CNS标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
R4.前述R的组合物，其中CNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
R5.前述R的组合物，其中MNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
R6.前述R的组合物，其中神经元细胞标志物选自TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
R7.前述R的组合物，其中间充质前体标志物选自SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
R8.前述R的组合物，其包含约1x104至约1x1010个表达所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞的群体。
S.一种包含体外分化细胞群体的组合物，
其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经元标志物，并且
其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、肠神经嵴谱系标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
S1.前述S的组合物，其中肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
S2.前述S的组合物，其中肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
S3.前述S的组合物，其中干细胞标志物选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
S4.前述S的组合物，其中CNS标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
S5.前述S的组合物，其中CNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
S6.前述S的组合物，其中MNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
S7.前述S的组合物，其中神经元细胞标志物选自TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
S8.前述S的组合物，其中间充质前体标志物选自SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
S9.前述S的组合物，其包含约1x105至约1x107个表达所述一种或多种肠神经元标志物的细胞的群体。
T.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的β-分泌酶(BACE)的抑制剂。
T1.前述T的方法，其中BACE的抑制剂选自BACE2的抑制剂、LY450139、LY2886721、LY2811376、Verubecestat(MK-8931)、和AZD3839。
T2.前述T的方法，其中BACE的抑制剂是BACE2的抑制剂。
T3.前述T的方法，其中BACE2的抑制剂是BACE抑制剂IV(BACE抑制剂C3)。
U.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的酸性蛋白酶的抑制剂。
U1.前述U的方法，其中酸性蛋白酶的抑制剂选自胃酶抑素A、利托那韦、茚地那韦、占吉仑、阿利吉仑和LY-450139。
U2.前述U的方法，其中酸性蛋白酶的抑制剂是胃酶抑素A。
V.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供BACE抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
W.在某些实施方式中，本发明公开的主题提供酸性蛋白酶的抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
4.附图简述
图1A-1J：从hESC诱导ENC前体。(A)为诱导肠NC(ENC)细胞而开发的方案(第0-11天)的示意图。(B)按照(A)中所述的方案，在分化的第11天，ENC的SOX10::GFP和CD49D表达的流式细胞术。(C)与CNC(无RA)相比，CD49D+分选的ENC的SOX10、迷走神经NC标志物HOXB2至HOXB5以及HOXB9的qRT-PCR。(D)CD49D+ ENC中PAX3、RET和EDNRB的免疫荧光染色的定量。(E和F)CD49D+ NC与匹配的CNS前体(分化的第11天)相比的无监督聚类和主成分分析。(G)CD49D+ ENC中与CNS前体相比的前10位和选择的其它(以粗体表示)最差异表达的转录物。(H)将RFP+和CD49D+ ENC进行FACS纯化，用于移植(第11天)到发育中的鸡胚中。(I和J)胚胎内RFP+细胞的迁移；发育中的肠道中的细胞亚群。(I)全标本包埋(whole mount)落射荧光(epifluorescence)，显示注射后24小时RFP+细胞的分布。(J)在躯干水平的胚胎的横截面图像显示RFP+细胞在肠道原基(左图)中的位置和带框区域的放大(右图)。h中比例尺＝25μm(中图)；i中为200μm；j中为10μm；p值为：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(t检验，ENC与CNC相比；n＝3)
图2A-2I：hESC-衍生的NC群体的表征(A)颅NC(CNC)和有黑素细胞能力的NC(MNC)诱导方案的示意图5。(B)CNC和MNC细胞中CD49D和SOX10::GFP的流式细胞术。(C)未分选和CD49D分选的分化NC细胞的SOX10免疫荧光。(D)衍生自H9 hESC和对照和家族性植物神经功能障碍症hiPSC的ENC中CD49D的流式细胞术。(E和F)第11天hESC-衍生的ENC中的肠前体谱系标志物的代表性免疫荧光图像和流式细胞术。(G)与阶段匹配的CNS前体11相比，来自CNC的RNASeq分析的前10位和选择的其它最差异表达的转录物的列表。(H)与阶段匹配的CNS前体相比11，来自MNC的RNASeq分析的前10位和选择的其它最差异表达的转录物的列表。(I)注射后24-36小时CNC和MNC细胞在发育中的鸡胚中的分布。右图：发育中的表面外胚层中MNC细胞簇的更高放大率图像。缩写：NT＝神经管，NotoC＝脊索，S＝体节，c中比例尺＝50μm；e中为25μm；i-左图中为1mm；中图中为50μm，右图中为25μm。
图3A-3K：hESC-衍生的ENC前体分化成各种肠神经元亚型。(A)为ENC前体的神经元分化和成熟开发的方案的示意图。(B)随着肠神经元谱系表达TUJ1和PHOX2A，在单层分化之前从纯化的ENC聚集的表达SOX10::GFP3D的全球体的图像。(C和D)相差和免疫荧光图像以及第40天的ENC谱系细胞的定量。显示细胞表达TRKC、ASCL和PHOX2A/B。使用基于H9 hESC的PHOX2B::GFP报告系(line)(由G.Lee；Johns Hopkins University惠赠)进一步证实PHOX2B表达。(E和F)免疫荧光分析和定量显示不同神经递质的表达。注意：所有细胞均来自CD49D+、FACS纯化的NC以确保NC谱系来源。(G)通过表达光敏感通道-2(ChR2)对ENC-衍生的神经元以光刺激激活的示意图。(H)与ENC-衍生的神经元共培养后经受光刺激的培养物的相差和荧光活体图像。(I)代表光刺激之前和不同450nm光脉冲频率刺激期间SMC收缩程度的图。(J)用于产生组织工程化结肠(TEC)的示意图。(K)对人细胞质标志物SC121和人特异性突触素(hSYN)染色的TEC。虚线表示肌肉和上皮/粘膜下层-样层之间的边界的大致位置。b中的比例尺＝100μm，(所有图)；c、e、h中为50μm；k-左图和中间图中为20μm；k-右图中为40。
图4A-4E：hESC-衍生的肠神经谱系的表征(A)TRKC和PHOX2A表达的流式细胞术。(B)对于TRKC阳性和TRKC阴性的hESC-衍生的ENC前体的PHOX2A和ASCL1的免疫荧光。(C)肠谱系标志物在更长时间的体外分化时段期间的时间过程qRT-PCR分析。(D和E)在分化的第40和60天，ENC-衍生的神经元中的肠神经元前体和神经元标志物的流式细胞术定量。比例尺＝50μm；缩写：FC＝倍数变化。
图5A-5E：CNC产生富含自主性谱系的神经元(A-C)在CNC-衍生的神经元中5-HT(5-羟色胺)、TUJ1和TH表达的代表性免疫荧光图像。与ENC-衍生的谱系相比，尽管存在许多Tuj1+神经元和百分比增加的TH+细胞，但在颅条件下未检测到5-羟色胺能(serotonergic)(5HT+)神经元。(E和E)在CNC和ENC条件下TRKB和TRKC的流式细胞术。比例尺＝50μm。
图6A-6H：人ENC前体在正常和HD成年结肠中广泛迁移(A)移植范例到成年鼠宿主结肠的示意图。(B)在成年NSG结肠壁内所移植的RFP+ hESC-衍生的ENC前体的全标本包埋荧光成像。(C)用RFP+ hESC-衍生的ENC前体移植的NSG结肠的截面的免疫荧光染色，显示TUJ1染色。(D)用hESC-衍生的肠NC前体移植的EDNRBs-1/s-1动物与仅接受基质胶的动物相比的存活曲线。(E)与接受hESC-衍生的ENC移植的动物相比，对照动物中的巨结肠-样表型。(F)用基质胶或RFP+ hESC-衍生的ENC前体移植的正常或HD结肠的截面的免疫荧光染色，显示hESC-衍生的ENC前体在肠肌层和粘膜下层中与正常ENS相似的分布。虚线表示粘膜下层和肌肉层之间的边界。(G)用基质胶或RFP+ hESC-衍生的ENC前体移植的HD结肠的截面的免疫荧光染色，显示SC121和人特异性突触素(hSYN)的表达。(H)移植到EDNRBs-1/s-1HD小鼠的结肠中后移植的hESC-衍生的ENC前体的代表性图像，显示GABA和5HT在人(SC121免疫反应性)细胞亚群中的表达。所有体内实验均以盲法进行。在所有移植动物中确认EDNRBs-1/s-1突变。在b中比例尺＝1cm；在c-左图中为500μm；在c-右图、f和g中为100μm，在h中为25μm；缩写：AU＝任意单位。生存分析的p-值以数值给出，log-rank(Mantel-Cox)检验；每个n＝6。
图7A-7E：与SMC共培养中的hESC-衍生的肠神经元的功能性表征(A)平滑肌细胞(SMC)分化方案的示意图。(B)SMC祖细胞的SMA和ISL1免疫荧光染色。(C)各种ENC-衍生的神经元亚型与SMA+细胞的关联。(D)与SMC共培养40天时ENC-衍生的神经元中和在不存在SMC的情况下阶段匹配的神经元中的突触蛋白::EYFP表达。(E)SMC的单一培养相比于SMC与ENC-衍生的神经元的共培养。上图：相差图像显示共培养中SMC的形态变化。下图：在SMC单一培养相比于SMC与ENC-衍生神经元的共培养物中成熟SMC标志物MYH11和乙酰胆碱受体(AchR)的免疫荧光染色。b、c、e中的比例尺＝50μm；d中为100μm。
图8A-8C：与ENC-衍生的神经元共培养的hESC-衍生的SMC的收缩(A)电影快照显示SMC与ENC-衍生的神经元的共培养物相比于SMC的单一培养物在暴露于乙酰胆碱、卡巴胆碱或KCl介导的去极化后的收缩响应。(B)代表SMC+组织的收缩程度的图表。箭头表示药理刺激的时间。(C)电影快照显示在光刺激之前和在用不同的450nm光脉冲频率刺激期间SMC的收缩响应。对于光遗传激活后的响应的定量，参见图3I。黄点表示由基于相差的软件生成的并用于定量运动的伪着色。所有影片都比实时快5倍。
图9A-9J：在成年NSG和EDNRBs-1/s-l小鼠的结肠中移植的hESC-ENC前体的表征(A)用RFP+ CD49D纯化的hESC-ENC前体移植的结肠的全标本包埋显微镜检查，以跟踪移植后1小时在注射部位的RFP表达，以确保细胞在适当的位置注射，并在2周时显示细胞的分散和细胞亚群的不同簇的聚集。虚线表示完整结肠组织的外边界。(B和C)移植的RFP+ hESC-衍生的CNS前体和CD49D纯化的CNC前体在成年结肠壁内的迁移的全标本包埋荧光成像和定量。(D和E)移植的RFP+ CD49D纯化的hESC-ENC前体在EDNRBs-1/s-1小鼠的结肠中的迁移的全标本包埋荧光成像和定量。(F)通过用RFP+ CD49D纯化的hESC-ENC前体移植的EDNRBs-1/s-1小鼠相比于仅基质胶移植的小鼠的胭脂红染料管饲法的总GI运送时间。(G和H)移植到共表达TUJ1和SC121(F)以及人特异性GFAP(SC123)(G)的EDNRBs-1/s-l小鼠的结肠中3个月后移植的hESC-衍生的肠NC前体的代表性图像。虚线表示粘膜下层和肌肉层之间的边界。(I和J)移植到NSG(WT)和EDNRBs-1/s-1小鼠的结肠中后6周移植的hESC-衍生的ENC前体的代表性图像。虚线表示粘膜下层和肌肉层之间的边界。a中的比例尺＝200μm；b和d中为1cm；g-j中为100μm；缩写：AU＝任意单位。(F)的p-值以数值给出，t-检验用韦尔奇(Welch)校正；n＝3。
图10A-10L：EDNRB信号传导调节人ENC前体细胞迁移(A)基于靶向EDNRB的体外HD疾病建模范例的图示。(B和C)RFP+ CD49D纯化的WT和EDNRB-/- hESC-衍生的ENC(克隆1-4)中的划痕测定的代表性图像和随后的定量。(D)化合物筛选范例的示意图。(E)胃酶抑素A对CD49D纯化的EDNRB-/- hESC-衍生的ENC迁移的影响的剂量反应。(F和G)用胃酶抑素A(10μM)和BACE抑制剂IV(1μM)处理后CD49D纯化的EDNRB-/- hESC-衍生的ENC迁移的代表性图像和定量。(H和I)在CD49D纯化的EDNRB-/- hESC-衍生的ENC中使用5种不同siRNA的一个库和4种针对BACE2的单独siRNA进行BACE2敲低后细胞迁移的代表性图像和定量。(J)胃酶抑素移植前治疗范例的示意图。(K)有或没有胃酶抑素A预处理的情况下，用RFP+ CD49D纯化的WT和EDNRB-/- hESC-衍生的ENC前体移植的NSG小鼠结肠的全标本包埋图像。(L)在距注射部位增加距离处结肠中存在人细胞的动物比例的定量——与(K)和图S9C中的RFP信号的原始数据相比较。b、f和h中的比例尺＝200μm；j中为1cm。c中和i中的p值为：***p<0.001；****p<0.0001(ANOVA；Dunnett检验(与wt相比))。L中分析(距注射部位给定距离处具有细胞的动物比例)的p值以数值给出，Log-rank(Mantel-Cox)检验；每组n≥8。
图11A-11E：建立和表征EDNRB null hESC系(A)WT和Cas9-切口酶的序列在EDNRB-/-克隆的靶向区域中诱导双等位基因无义突变。(B)hESC-衍生的ENC前体中EDNRB的蛋白质印迹分析显示在突变体克隆C1-C4中缺乏蛋白质表达。(C)EDNRB-/- hESC可以基于CD49D表达(C)和SOX10的表达(数据未显示)有效地分化成CD49D+ hESC-衍生的ENC。(D)EDNRB-/- hESC-衍生的ENC相比于WT-衍生细胞的增殖。(E)EDNRB-/- hESC-衍生的ENC相比于WT-衍生细胞中细胞活力的LDH活性测量。(D)中的p值为：*p<0.05，t-检验，n＝3。
图12A-12D：化学筛选拯救EDNRB-/- hESC-衍生的NC前体迁移的化合物(A)化学筛选试验和迁移评分系统中涉及的时间线和实验步骤的示意图。(B)筛选板布局和DMSO对照孔位置的实例。(C)Prestwick文库化合物和DMSO对照的迁移分数。(D)用主要命中化合物处理的EDNRB-/- hESC-衍生的ENC前体的迁移测定和评分。(C)中主要命中化合物的Z-评分以数值给出(与DMSO对照相比，n＝224)
图13A-13F：在hESC-衍生的ENC前体中的迁移的药理学调节(A)在第11天，与阶段匹配的CNS前体相比，在各种hESC-衍生的NC亚谱系中的BACE2表达。(B)qRT-PCR分析以确认与对照siRNA相比siRNA转染后CD49D纯化的EDNRB-/- hESC-衍生的ENC中BACE2的敲低。(C)有或没有胃酶抑素A预处理(与图3l相比)的情况下，用RFP+ CD49D纯化的WT和EDNRB-/-hESC-衍生的ENC前体移植的NSG小鼠的结肠的全标本包埋图像的定量。(D)用EDN3和BQ-788(EDNRB抑制剂)处理的WT CD49D纯化的hESC-衍生的ENC的代表性图像。(E)在用BQ788预处理后，WT hESC-衍生的ENC前体中的结肠迁移测定。(F)(E)中数据的定量。e中的比例尺＝1cm；缩写：AU＝任意单位。
5.主题详述
本发明公开的主题涉及用于诱导干细胞(例如人干细胞)分化为可进一步体外诱导为肠神经元的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(肠神经系统(ENS)前体)的体外方法、通过这种方法产生的细胞(ENS前体和肠神经元)、以及包含这种细胞的组合物。还提供这种细胞用于预防和/或治疗先天性巨结肠症和用于筛选适于预防和/或治疗先天性巨结肠症的化合物的用途。
出于清楚的公开而非限制的目的，详细描述分为以下小节：
5.1.定义
5.2.使干细胞分化的方法
5.3.包含分化细胞群体的组合物
5.4.预防和/或治疗肠神经系统病症的方法
5.5.筛选治疗性化合物的方法
5.6.试剂盒
5.1定义
本说明书中使用的术语在本发明的上下文中和在使用每个术语的特定上下文中通常具有其在本领域中的通常含义。某些术语在下面或说明书中的其它地方讨论，以向从业者提供对描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的惯例，“约”可以指在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％、或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在数值的一个数量级内、例如在5倍以内、或在2倍以内。
如本文所用，参照“信号转导蛋白”的术语“信号传导”是指通过配体结合膜受体蛋白质或一些其它刺激因素激活或以其它方式被影响的蛋白质。信号转导蛋白的实例包括但不限于SMAD、无翼(Wnt)复合蛋白，包括β-catnin、NOTCH、转化生长因子β(TGFβ)、激活素、Nodal和糖原合酶激酶3β(GSK3P)蛋白。对于许多细胞表面受体或内部受体蛋白，配体-受体相互作用与细胞的应答没有直接联系。配体激活的受体可以首先与细胞内的其它蛋白质相互作用，然后产生配体对细胞行为的最终生理效应。通常，在受体激活或抑制后，几种相互作用的细胞蛋白链的行为发生改变。由受体激活诱导的整组细胞变化称为信号转导机制或信号传导通路。
如本文所用，术语“信号”是指控制细胞结构和功能变化的内部和外部因素。它们本质上可以是化学的或物理的。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子和蛋白质，例如转化生长因子-β(TFGβ)、激活素、Nodal、骨形态发生蛋白(BMP)等。
如本文所用，术语“抑制剂”是指干扰(例如，减少、降低、抑制、消除或阻断)分子或通路的信号传导功能的化合物或分子(例如，小分子、肽、拟肽、天然化合物、siRNA、反义核酸、适体或抗体)。抑制剂可以是改变指定蛋白质(信号传导分子，与指定信号传导分子有关的任何分子，指定的相关分子，比如糖原合酶激酶3β(GSK3β))(例如，包括但不限于本文所述的信号传导分子)的任何活性的任何化合物或分子，例如，通过直接接触SMAD信号传导、接触SMAD mRNA，引起SMAD的构象变化，降低SMAD蛋白质水平，或干扰SMAD与信号传导伴侣的相互作用(例如，包括本文所述的那些)，并且影响SMAD靶基因(例如本文所述的那些)的表达。抑制剂还包括通过拦阻上游信号传导分子(例如，在细胞外结构域内)间接调节SMAD生物活性的分子，信号传导分子和效果的实例包括：隔离骨形态发生蛋白的Noggin，其抑制ALK受体1、2、3和6的激活，从而阻止下游SMAD激活。同样，Chordin、Cerberus、Follistatin，类似地隔离SMAD信号传导的细胞外激活剂。Bambi是一种跨膜蛋白，也充当假受体来隔离细胞外TGFb信号传导分子。阻断激活素、Nodal、TGFb和BMP的抗体预期用于中和SMAD信号传导的细胞外激活剂等。抑制剂根据竞争性抑制(以排除或减少另一种已知结合化合物的结合的方式结合活性位点)和变构(allostenc)抑制(以以下方式结合蛋白质：以干扰化合物与该蛋白质的活性位点结合的方式改变蛋白质构象)、加之通过结合并影响指定信号传导分子上游的分子引起指定分子被抑制而诱导的抑制进行描述。抑制剂可以是通过实际接触信号传导靶标来抑制信号传导靶标或信号传导靶通路的“直接抑制剂”。
如本文所用，术语“激活剂”是指增加、诱导、刺激、激活、促进或增强激活分子或通路(例如Wnt信号传导)的信号传导功能的化合物。
如本文所用，术语“衍生物”是指具有类似核心结构的化合物。
如本文所用，术语“细胞的群体”或“细胞群体”是指一组至少两个细胞。在非限制性实例中，细胞群体可以包含至少约10、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000个细胞。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体，比如肠神经系统前体群体或未分化干细胞群体。或者，群体可以包含一种以上细胞类型，例如混合的细胞群体。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够在培养中无限期分裂并产生特化细胞的细胞。人干细胞是指来自人的干细胞。
如本文所用，术语“肠神经系统前体”、“ENS前体”、“肠神经嵴前体、“肠NC前体”或“ENC前体”是指表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞。ENS前体是能够成熟为肠神经元的细胞。人ENS前体是指来自人的ENS前体。肠神经嵴谱系标志物的非限制性实例包括PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
如本文所用，术语“肠神经元”是指表达一种或多种肠神经元标志物的细胞。人肠神经元是指来自人的肠神经元。肠神经元标志物的非限制性实例包括Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指衍生自植入前阶段的胚胎的原始(未分化)细胞，其能够在培养中长时期地分裂而不分化，并且已知会发育成三个主要胚层的细胞和组织。人胚胎干细胞是指来自人的胚胎干细胞。如本文所用，术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指衍生自早期人胚胎、直至并包括胚泡期的一种多能干细胞，其能够在培养中长时期地分裂而不分化，并且已知会发育成三个主要胚层的细胞和组织。
如本文所用，术语“胚胎干细胞系”是指已经在体外条件下培养的胚胎干细胞群体，该条件允许增殖而不分化长达数天、数月至数年。
如本文所用，术语“全能”是指产生身体的所有细胞类型加上构成胚外组织(比如胎盘)的所有细胞类型的能力。
如本文所用，术语“多潜能(multipotent)”是指发育成身体的一种以上细胞类型的能力。
如本文所用，术语“多能”是指发育成生物体的三个发育胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的能力。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指一种类似于胚胎干细胞的多能干细胞，其通过引导某些胚胎基因(比如OCT4、SOX2和KLF4转基因)(参见，例如，Takahashi和Yamanaka Cell 126,663-676(2006)，并入本文以供参考)进入体细胞例如CI4、C72等而形成。
如本文所用，术语“体细胞”是指身体中除配子(卵子或精子)之外的任何细胞；有时称为“成体”细胞。
如本文所用，术语“体细胞(成体)干细胞”是指在许多器官和分化组织中发现的相对罕见的未分化细胞，其具有有限的自我再生(在实验室中)和分化的能力。这些细胞的分化能力不同，但通常仅限于起源器官中的细胞类型。
如本文所用，术语“神经元”是指神经细胞，其是神经系统的主要功能单元。神经元由细胞体及其突起——轴突和一个或多个树突组成。神经元通过在突触处释放神经递质将信息传递给其它神经元或细胞。
如本文所用，术语“增殖”是指细胞数量的增加。
如本文所用，术语“未分化的”是指尚未发育成特化细胞类型的细胞。
如本文所用，术语“分化”是指非特化的胚胎细胞获得特化细胞如心脏、肝脏或肌肉细胞的特征的过程。分化受到细胞的基因与细胞外物理和化学条件的相互作用控制，通常通过涉及细胞表面嵌入蛋白质的信号通路来控制。
如本文所用，术语“定向分化”是指干细胞培养条件的操作以诱导分化成特定(例如，期望的)细胞类型，比如肠神经元前体。
如本文所用，参照干细胞的术语“定向分化”是指使用小分子、生长因子蛋白和其它生长条件来促进干细胞从多能状态转变为更成熟或特化的细胞命运(例如肠神经元前体、肠神经元等)。
如本文所用，参照细胞的术语“诱导分化”是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞分化”是指诱导干细胞(例如，人干细胞)分裂成具有与干细胞不同的特征的子代细胞，比如基因型(例如，如通过遗传分析比如微阵列所确定的基因表达的变化)和/或表型(例如，蛋白质如SOX10和CD49D表达的变化)。
如本文所用，术语“细胞培养”是指在用于研究或医疗的人工培养基中体外细胞的生长。
如本文所用，术语“培养基”是指覆盖培养容器如培养皿、多孔板等中的细胞，并含有营养物以滋养和支持细胞的液体。培养基还可以包含添加的生长因子以在细胞中产生所需的变化。
如本文所用，术语使细胞与化合物(例如，一种或多种抑制剂、激活剂和/或诱导剂)“接触”是指将化合物置于允许其接触细胞的位置。接触可以使用任何合适的方法完成。例如，接触可以通过将化合物加入细胞的管中完成。接触也可以通过将化合物加入到包含细胞的培养基中完成。可以将每种化合物(例如，抑制剂、激活剂、和本文公开的诱导迷走神经嵴图式形成的分子)作为溶液(例如浓缩溶液)加入到包含细胞的培养基中。或者或另外，化合物(例如，抑制剂、激活剂、和本文公开的诱导迷走神经嵴图式形成的分子)以及细胞可以存在于配制的细胞培养基中。
如本文所用，术语“体外”是指人造环境以及在人造环境中发生的过程或反应。体外环境例示但不限于试管和细胞培养物。
如本文所用，术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应，如胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。
如本文所用，与基因或蛋白质相关的术语“表达”是指制备可以使用测定法比如微阵列测定、抗体染色测定等观察到的mRNA或蛋白质。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”是指鉴定特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。细胞的标志物可以不限于一种标志物，标志物可以指标志物的“图式”(pattern)，使得标志物的指定组可以将细胞或细胞类型与另一种细胞或细胞类型鉴别开。
如本文所用，参照本文公开的任何细胞制备时的术语“衍生自”或“建立自”或“分化自”是指从细胞系、组织(如解离的胚胎)、或流体中的亲本细胞获得(例如，分离、纯化等)的细胞，其使用任何操作，比如但不限于，单细胞分离，体外培养，使用例如蛋白质、化学品、辐射、病毒感染、用DNA序列转染、比如用形态发生素等的处理和/或诱变，选择(如通过连续培养)所培养亲本细胞中含有的任何细胞。衍生细胞可以借助对生长因子、细胞因子、细胞因子处理的选择进展、粘附性、粘附性的缺乏、分选程序等的应答从混合种群中选择。
本文的“个体”或“受试者”是脊椎动物，如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、家畜、变种动物(sport animal)、啮齿类动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马匹；和非人类灵长类动物，如猿和猴。
如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何症状或病症。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗性效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、和缓和或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止由于受影响或所诊断的受试者或疑似患有该病症的受试者的病症导致的恶化，而且治疗也可以预防处于病症或疑似患有病症风险的受试者中病症或者病症症状的发作。
5.2使干细胞分化的方法
本发明公开的主题提供用于诱导干细胞(例如人干细胞)分化的体外方法。在某些实施方式中，干细胞是人干细胞。人干细胞的非限制性实例包括人胚胎干细胞(hESC)、人多能干细胞(hPSC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、上胚层干细胞、F-class多能干细胞、成体干细胞、癌干细胞、或任何其它能够谱系特定分化的细胞。在某些实施方式中，人干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在某些实施方式中，人干细胞是人诱导多能干细胞(hiPSC)。在某些实施方式中，干细胞是非人干细胞。非人干细胞的非限制性实例非人灵长类动物干细胞、啮齿类动物干细胞、狗干细胞、猫干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方式中，干细胞是诱导多能干细胞。
本发明人先前公开了使用双SMAD抑制用于诱导干细胞(例如hPSC)分化为一种类型的神经谱系(Chambers(2009)，其全部内容并入以供参考)。此外，本发明人先前公开了通过相继抑制SMAD信号传导然后激活Wnt信号传导来使干细胞分化为伤害感受器(神经嵴衍生的细胞谱系)(Chambers(2012)；WO2011/149762，其全部内容并入以供参考)。这些神经嵴(NC)分化方法和方案产生HOX阴性的SOX10+ NC前体，其指示前/颅身份；颅NC(CNC)，并且这些方法和方案主要产生感觉和伤害感受性神经元。
本文的本发明公开的主题公开一个新发现，肠神经系统(ENS)前体(例如表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞)可以通过相继抑制SMAD信号传导然后激活Wnt信号传导、之后诱导迷走神经嵴身份而分化自干细胞(例如人干细胞)。ENS发育自迷走神经和骶椎神经嵴(NC)。ENS的主要功能是通过协调激活平滑肌层来控制蠕动肠道运动。迷走神经嵴(NC)产生大部分ENS并向尾部迁移以定殖肠的整个长度3。
干细胞向ENS前体的体外分化
在某些实施方式中，体外诱导干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)的分化的方法包括使干细胞群体(例如人干细胞)与有效量的一种或多种转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂中和包括TGFβ、骨形态发生蛋白(BMP)、Nodal、和激活素在内的配体，或通过阻断受体和下游效应子而阻断其信号通路。TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762、Chambers(2009)、和Chambers(2012)，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂是SB431542。“SB431542”是指CAS号为301836-41-9的分子，分子式为C22H18N4O3，并且命名为4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，例如，参见下文结构：
干细胞可以与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、或至少约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触10天至约15天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约11天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约1nM至约300nM、约5nM至约250nM、约10nM至约200nM、约10nM至约50nM、约50nM至约150nM、约80nM至约120nM、约90nM至约110nM、约50nM至约100nM、约100nM至约150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、或约250nM至约300nM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约80nM至约120nM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约100nM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂每日以任何一种上述浓度接触。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂每日以约100nM的浓度接触，以产生ENS前体。
在某些实施方式中，体外诱导干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)分化的方法包括使干细胞与有效量的一种或多种Small Mothers AgainstDecapentaplegic(SMAD)信号传导抑制剂接触。SMAD信号传导的抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762、Chambers(2009)、和Chambers(2012)，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
在某些实施方式中，SMAD信号传导的抑制剂是LDN193189。“LDN193189”是指小分子DM-3189，IUPAC名为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为C25H22N6，其具有下式。
LDN193189能够作为SMAD信号传导抑制剂起作用。LDN193189也是ALK2、ALK3、和ALK6、蛋白质酪氨酸激酶(PTK)的高度有效的小分子抑制剂，抑制I型TGFβ受体的ALK1和ALK3家族成员的信号传导，导致多种生物信号传递的抑制，包括骨形态发生蛋白(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、和激活素细胞因子信号以及后续的Smad1、Smad5、和Smad8的SMAD磷酸化(Yu等,(2008)Nat Med 14:1363-1369；Cuny等,(2008)Bioorg.Med.Chem.Lett.18:4388-4392，并入本文以供参考)。
干细胞可以与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、或至少约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触10天至约15天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约11天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约1μM至100μM、约1μM至20μM、约1μM至15μM、约1μM至10μM、约1μM至5μM、约5μM至10μM、约5μM至15μM、约15μM至20μM、约20μM至30μM、约30μM至40μM、约40μM至50μM、约50μM至60μM、约60μM至70μM、约70μM至80μM、约80μM至90μM、或约90μM至100μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约5μM至15μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触，该抑制剂的浓度为约10μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂每日接触，该抑制剂为任何一种上述浓度。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂每日接触，该抑制剂的浓度为约10μM，以产生ENS前体。
在某些实施方式中，体外诱导干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)分化的方法包括使细胞与有效量的一种或多种无翼(Wnt)信号传导激活剂(也称为“Wnt激活剂”)接触。如本文所用，参照配体的术语“WNT”或“无翼”是指一组能够与WNT受体如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体家族的受体相互作用的分泌蛋白(即人的Intl(integration 1))。如本文所用，参照信号传导通路的术语“WNT”或“无翼”是指由Wnt家族配体和Wnt家族受体比如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体组成、有或没有β-联蛋白介导的信号通路。出于本文所述的目的，优选的WNT信号传导通路包括通过β-联蛋白、例如WNT/-联蛋白的介导。
在某些实施方式中，一种或多种Wnt信号传导激活剂降低用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)。因此，Wnt信号传导的激活剂可以是GSK3β抑制剂。GSK3P抑制剂能够激活WNT信号传导通路，参见例如Cadigan,等,J Cell Sci.2006；119:395-402；Kikuchi,等,Cell Signalling.2007；19:659-671，其全部内容并入本文以供参考。如本文所用，术语“糖原合酶激酶3β抑制剂”是指抑制糖原合酶激酶3β酶的化合物，例如，参见Doble,等,JCell Sci.2003；116:1175-1186，其全部内容并入本文以供参考。
Wnt信号传导的激活剂或GSK3β抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762、Chambers(2012)、和Calder等,J Neurosci.2015 8月19日；35(33):11462-81，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、WNT3A、其衍生物、及其混合物的小分子。
在某些实施方式中，Wnt激活剂是CHIR99021。“CHIR99021”(也称为或“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚酮”)是指IUPAC名为6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈，其具有下式。
CHIR99021具有高度选择性，对一组相关和无关的激酶显示出近千倍的选择性，对人GSK3β的IC50＝6.7nM，并且对啮齿类动物GSK3β同源物为纳摩尔IC50值。
干细胞可以与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、或至少约29天、至少约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触5天至约15天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约11天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约10天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约9天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约1μM至100μM、约1μM至20μM、约1μM至15μM、约1μM至10μM、约1μM至5μM、约5μM至10μM、约5μM至15μM、约15μM至20μM、约20μM至30μM、约30μM至40μM、约40μM至50μM、约50μM至60μM、约60μM至70μM、约70μM至80μM、约80μM至90μM、或约90μM至100μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约1μM至5μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约3μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂每日接触，该激活剂为任何一种上述浓度。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂每日接触，该激活剂的浓度为约3μM，以产生ENS前体。
在某些实施方式中，体外诱导干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)分化的方法包括使细胞与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。迷走神经NC图式形成的特征可以在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达，这些基因包括但不限于同源盒B2(HOXB2)、同源盒B3(HOXB3)8、同源盒B4(HOXB4)、和同源盒B5(HOXB5)9。
在某些实施方式中，该一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸(RA)、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、及其组合。在某些实施方式中，该一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
在某些实施方式中，该诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸(RA)。RA先前已经用作外因子，将CNS前体的区域身份从前部转变为更近尾部的命运，比如在运动神经元特化期间10。本发明人发现RA不仅指导神经嵴谱系中的区域身份，而且还诱导迷走标志物的表达。参见实施例1(例如图1A)。
细胞可以与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、或至少约21天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至多约2天、至多3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、或至多约21天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约21天、约2天至约20天、约2天至约10天、约10天至约15天、约15天至约21天、约2天至约6天、约2天至约5天、或约5天至约10天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天至约10天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触5天至约20天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约10天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至多约20天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或约21天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触，该分子的浓度为约1μM至100μM、约1μM至20μM、约1μM至15μM、约1μM至10μM、约1μM至5μM、约5μM至10μM、约5μM至15μM、约15μM至20μM、约20μM至30μM、约30μM至40μM、约40μM至50μM、约50μM至60μM、约60μM至70μM、约70μM至80μM、约80μM至90μM、或约90μM至100μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触，该分子的浓度为约5μM至15μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触，该分子的浓度为约10μM，以产生ENS前体。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子每日接触，该分子为任何一种上述浓度。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子每日接触，该分子的浓度为约10μM，以产生ENS前体。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约12天；与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约10天；并且与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约11天；与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约9天；并且与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
在某些实施方式中，与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约12天；并且与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。在某些实施方式中，与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约11天；并且与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体(ENS前体)。
肠神经系统(ENS)前体(例如表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞)可以在其与TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂、SMAD信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的激活剂、和诱导迷走神经嵴图式形成的分子中的至少一种最初接触后少于约20天、少于约19天、少于约18天、少于约17天、少于约16天、少于约15天、少于约14天、少于约13天、少于约12天、少于约11天、少于约10天、少于约9天、少于约8天、少于约7天、少于约6天、少于约5天、或少于约4天内分化自干细胞。在某些实施方式中，ENS前体在其与TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂、SMAD信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的激活剂、和诱导迷走神经嵴图式形成的分子中的至少一种最初接触约第11天或之后分化自干细胞。在某些实施方式中，ENS前体在其与TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂、SMAD信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的激活剂、和诱导迷走神经嵴图式形成的分子中的至少一种最初接触后约第11天分化自干细胞。
在某些实施方式中，该两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。FGF信号传导的激活剂的非限制性实例包括FGF2、FGF4、和FGF8。Wnt激活剂的非限制性实例包括CHIR99021和WNT3A。
ENS前体向肠神经元的体外诱导
ENS前体在产生多种神经元亚型的能力方面是独一无二的，可产生数十种不同的神经递质和激素。ENS前体可以在体外进一步诱导/成熟为肠神经元。肠神经元可以是未成熟的肠神经元、成熟的肠神经元、或其组合。可以使分化的ENS前体经受有利于ENS前体成熟为肠神经元群体的条件。
在某些实施方式中，有利于成熟的条件包括在合适的细胞培养基中培养分化ENS前体。在某些实施方式中，合适的细胞培养基是NB培养基。在某些实施方式中，合适的细胞培养基是补充有L-谷氨酰胺(例如来自Gibco，25030-164)、N2(例如来自Stem CellTechnologies，07156)、和B27(例如来自Life Technologies，17504044)的NB培养基。分化ENS前体可以在合适的细胞培养基中培养至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天、或至少约50天，以产生肠神经元。
在某些实施方式中，合适的细胞培养基包含一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子。在某些实施方式中，有利于成熟的条件包括使分化ENS前体与一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子接触。在某些实施方式中，一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子选自本文所述的生长因子和Wnt激活剂。生长因子的非限制性实例包括FGF信号传导的激活剂(FGF激活剂)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、和抗坏血酸。在某些实施方式中，分化ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种WNT激活剂接触以产生肠神经元群体。在某些实施方式中，合适的细胞培养基包含一种或多种FGF激活剂和一种或多种WNT激活剂。FGF信号传导的激活剂的非限制性实例包括FGF2、FGF4、FGF8、和FGF7。在某些实施方式中，一种或多种FGF激活剂是FGF2。在某些实施方式中，一种或多种WNT激活剂是CHIR99021。
在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、或至少约10天，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约1天至约10天、约1天至约5天、约5天至约10天，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约1天至约5天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约4天以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约1nM至100nM、约1nM至20nM、约1nM至15nM、约1nM至10nM、约1nM至5nM、约5nM至10nM、约5nM至15nM、约15nM至20nM、约20nM至30nM、约30nM至40nM、约40nM至50nM、约50nM至60nM、约60nM至70nM、约70nM至80nM、约80nM至90nM、或约90nM至100nM，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约5nM至15nM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为约10nM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂接触，该激活剂为每日、每隔一日或每两日任何一种上述浓度，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF信号传导激活剂接触，该激活剂的浓度为每日约10nM以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种Wnt激活剂接触，该激活剂的浓度为约1μM至100μM、约1μM至20μM、约1μM至15μM、约1μM至10μM、约1μM至5μM、约5μM至10μM、约5μM至15μM、约15μM至20μM、约20μM至30μM、约30μM至40μM、约40μM至50μM、约50μM至60μM、约60μM至70μM、约70μM至80μM、约80μM至90μM、或约90μM至100μM，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种Wnt激活剂接触，该激活剂的浓度为约1μM至5μM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种Wnt激活剂接触，该激活剂的浓度为约3μM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种Wnt激活剂每日、每隔一日或每两日接触，该激活剂为任何一种上述浓度，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种Wnt激活剂每日接触，该激活剂的浓度为约3μM，以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种WNT激活剂在细胞培养基中接触以产生肠神经元。在某些实施方式中，细胞培养基是NB培养基。在某些实施方式中，细胞培养基是补充有L-谷氨酰胺(例如来自Gibco，25030-164)、N2(例如来自Stem Cell Technologies，07156)、和B27(例如来自Life Technologies，17504044)的NB培养基。
在某些实施方式中，分化ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触以产生肠神经元群体。在某些实施方式中，合适的细胞培养基包含GDNF和抗坏血酸。
在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天、或至少约50天，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约1天至约50天、约1天至约10天、约20天至约30天、约30天至约40天、或约40天至约50天，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约10天至约20天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约20天至约30天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约40天至约50天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约10天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约25天以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约45天以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与GDNF接触，GDNF的浓度为约1nM至100nM、约1ng/mL至100ng/mL、约1ng/mL至20ng/mL、约20ng/mL至30ng/mL、约30ng/mL至40ng/mL、约40ng/mL至50ng/mL、约50ng/mL至60ng/mL、约60ng/mL至70ng/mL、约70ng/mL至80ng/mL、约80ng/mL至90ng/mL、或约90ng/mL至100ng/mL，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF接触，GDNF的浓度为约20ng/mL至30ng/mL以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF接触，GDNF的浓度为约25ng/mL以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF信号传导每日、每隔一日或每两日接触，GDNF为任何一种上述浓度，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与FGF信号传导的GDNF每日接触，GDNF的浓度为约25ng/mL，以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与抗坏血酸接触，抗坏血酸的浓度为约50μM至200μM、约50μM至100μM、或约100μM至200μM，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与抗坏血酸接触，抗坏血酸的浓度为约50μM至200μM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与抗坏血酸接触，抗坏血酸的浓度为约100μM以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与抗坏血酸每日、每隔一日或每两日接触，抗坏血酸为任何一种上述浓度，以产生肠神经元。在某些实施方式中，ENS前体与抗坏血酸每日接触，抗坏血酸的浓度为约100μM，以产生肠神经元。
在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸在细胞培养基中接触以产生肠神经元。在某些实施方式中，细胞培养基是NB培养基。在某些实施方式中，细胞培养基是补充有L-谷氨酰胺(例如来自Gibco，25030-164)、N2(例如来自Stem Cell Technologies，07156)、和B27(例如来自Life Technologies，17504044)的NB培养基。
在某些实施方式中，ENS前体与一种或多种FDF激活剂和一种或多种WNT激活剂接触，并且随后与GDNF和抗坏血酸接触。在某些实施方式中，ENS前体与FGF2和CHIR990214接触，并随后与GDNF和抗坏血酸接触。在某些实施方式中，肠神经元是未成熟的肠神经元。在某些实施方式中，该未成熟的肠神经元表达一种或多种肠神经元标志物，包括但不限于β3III类微管蛋白(Tuj1)、成对式同源盒2A(PHOX2A)、成对式同源盒2B(PHOX2B)、神经营养性酪氨酸激酶受体类型3(TRKC)、ASCL1、心脏和神经脊衍生蛋白2(HAND2)、和EDNRB。
未成熟的肠神经元可以进一步分化以使肠神经元成熟。在某些实施方式中，肠神经元是成熟肠神经元。在某些实施方式中，成熟肠神经元表达一种或多种肠神经元标志物，包括但不限于5-羟色胺(5HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、一氧化氮合酶(NOS)、生长抑素(SST)、酪氨酸羟化酶(TH)、和胆碱O-乙酰转移酶(CHAT)。
在某些实施方式中，肠神经元是未成熟的肠神经元和成熟肠神经元的混合物或组合。
在某些实施方式中，有利于成熟的条件还包括使分化ENS前体聚集为3D球状体，并在悬浮培养中培养该3D球状体。在某些实施方式中，该3D球状体在悬浮培养中培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天。在某些实施方式中，该3D球状体在悬浮中培养约4天。在某些实施方式中，该悬浮培养基是补充有N2补充剂、和包含CHIR99021和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的补充剂的神经基质(Neurobasal)培养基。
在某些实施方式中，有利于成熟的条件还包括在悬浮培养中培养3D球状体之后，在抗坏血酸(AA)和GDNF的存在下在贴壁培养中培养3D球状体用于自发分化。
该3D球状体可以在贴壁培养中培养约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、或约12周。在某些实施方式中，该3D球状体在贴壁培养中培养约3周，例如约20天。在某些实施方式中，该3D球状体在贴壁培养中培养约6周，例如约40天。在某些实施方式中，贴壁培养基是补充有N2补充剂、和包含GDNF和抗坏血酸的补充剂的神经基质培养基。在某个非限制性实施方式中，贴壁培养在具有合适涂层(例如聚鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、或其组合)的表面上进行(例如Zeltner,等,(2014)中所述方法，其全部内容并入本文以供参考)。在某些实施方式中，聚集成3D球状体的细胞首先在贴壁培养中分化为未成熟的神经元群体，然后迁移出该3D球状体。
细胞培养基
在某些实施方式中，将上述抑制剂、激活剂和分子加入到包含干细胞的细胞培养基中。合适的细胞培养基包括但不限于血清替代物(“KSR”)培养基、N2培养基、和(“E8/E6”)培养基、以及神经基质(NB)培养基(例如补充有N2和补充剂的NB培养基)。KSR培养基、N2培养基、E8/E6培养基和NB培养基市面上有售。
在某些实施方式中，用于干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)的体外分化的培养基是选自KSR培养基、N2培养基、及其组合的培养基。在某些实施方式中，用于干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)的体外分化的培养基是E8/E6培养基。在某些实施方式中，用于表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞(ENS前体)向表达一种或多种肠神经元标志物的细胞(肠神经元)的体外诱导的培养基是NB培养基。
KSR培养基是一种明确的无血清配方，经过优化以在培养中使未分化的hESC细胞生长和维持。KSR培养基的组分公开于WO2011/149762。在某些实施方式中，KSR培养基包含Knockout DMEM、Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、Pen/Strep、MEM、和13-巯基乙醇。在某些实施方式中，1升的KSR培养基可包含820mL的Knockout DMEM、150mL的Knockout血清替代物、10mL的200mM L-谷氨酰胺、10mL的Pen/Strep、10mL的10mM MEM、和55μΜ的13-巯基乙醇。
在某些实施方式中，干细胞最初在KSR培养基中培养，从干细胞与上述抑制剂、激活剂、和诱导迷走神经嵴图式形成的分子中的至少一种最初接触后约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8天，KSR培养基逐渐用增加量的N2培养基代替。在某些实施方式中，干细胞最初在KSR培养基中培养，从干细胞与上述抑制剂、激活剂、和诱导迷走神经嵴图式形成的分子中的至少一种最初接触后约第4天(例如干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触后4天)，KSR培养基逐渐用增加量的N2培养基代替。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、一种或多种SMAD信号传导抑制剂、一种或多种Wnt信号传导激活剂、和一种或多种诱导迷走神经图式形成的分子接触。在某些实施方式中，将一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、一种或多种SMAD信号传导抑制剂、一种或多种Wnt信号传导激活剂、和一种或多种诱导迷走神经图式形成的分子加入到包含干细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，细胞培养基是KSR培养基。
E8/E6培养基是一种支持人多能干细胞的生长和扩增的无饲养层(feeder-free)和无异源(xeno-free)培养基。E8/E6培养基已证明支持体细胞重编程(reprogramming)。此外，E8/E6培养基可用作配制PSC培养的定制培养基的基质。E8/E6培养基的一个实例描述于Chen等,Nat Methods.2011年5月；8(5):424-9，其全部内容并入以供参考。E8/E6培养基的一个实例公开于WO15/077648，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，E8/E6细胞培养基包含DMEM/F12、抗坏血酸、硒(selenum)、胰岛素、NaHCO3、转铁蛋白、FGF2和TGFβ。E8/E6培养基与KSR培养基的不同之处在于E8/E6培养基不包含活性BMP或Wnt成分。因此，在某些实施方式中，当E8/E6培养基用于本发明公开的干细胞群体以分化为肠神经嵴前体(ENS前体)群体时，一种或多种SMAD信号传导抑制剂(例如抑制BMP的那些)不需要加入到E8/E6培养基中。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、一种或多种Wnt信号传导激活剂、和一种或多种诱导迷走神经图式形成的分子接触。在某些实施方式中，将一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、一种或多种Wnt信号传导激活剂、和一种或多种诱导迷走神经图式形成的分子加入到包含干细胞的细胞培养基。在某些实施方式中，细胞培养基是E8/E6培养基。
N2补充剂是化学上明确的、不含动物成分的、用于在培养中扩增未分化神经干细胞和祖细胞的补充剂。N2补充剂适用于与DMEM/F12培养基一起使用。N2培养基的组分公开于WO2011/149762。在某些实施方式中，N2培养基包含补充有葡萄糖、碳酸氢钠、腐胺、黄体酮、亚硒酸钠、转铁蛋白、和胰岛素的DMEM/F12培养基。在某些实施方式中，1升的N2培养基包含985ml具有DMEM/F12粉末的蒸馏H2O、1.55g的葡萄糖、2.00g的碳酸氢钠、腐胺(1.61g溶于100mL蒸馏水中的100μL等分试样)、黄体酮(0.032g溶于100mL 100％乙醇中的20μL等分试样)、亚硒酸钠(0.5mM蒸馏水中的溶液的60μL等分试样)、100mg的转铁蛋白、和在10mL的5mM NaOH中的25mg胰岛素。
用于培养本发明公开的干细胞群体的细胞培养基不仅决定将与干细胞接触的抑制剂(例如对于KSR培养基，需要一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂；并且对于E8/E6培养基，仅需要一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂)，而且决定上述抑制剂、激活剂和分子与干细胞接触的顺序。
在某些实施方式中，细胞与有效量的一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内(例如同时(在同一天)、约1天、约2天、约3天、或约4天)。一种或多种Wnt信号传导激活剂可以与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂在同一天、或一天后、两天后或三天后加入。在某些实施方式中，细胞在96小时时段内与一种或多种Wnt信号传导激活剂和一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触。
在本文所述的时间段内，如果在同一天(在相同的24小时时段)加入一种或多种试剂(激活剂、抑制剂、分子)，它们可以以任何顺序加入，除非本文有相反指示。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、与一种或多种SMAD信号传导抑制剂、并且与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在同一天，例如通过最初在同一天将这些抑制剂和Wnt信号传导激活剂加入包含干细胞的细胞培养基。在某些实施方式中，细胞培养基是KSR培养基。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂的最初接触的同一天，例如通过最初在同一天将这些抑制剂加入包含干细胞的细胞培养基。在某些实施方式中，细胞培养基是KSR培养基。在某些实施方式中，细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触的约1至约4天(例如约1天、约2天、约3天、或约4天)。在某些实施方式中，细胞培养基是KSR培养基。在某些实施方式中，细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触约2天。
在某些实施方式中，用于干细胞向表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞的体外分化的细胞培养基是E8/E6培养基，并且细胞与一种或多种Wnt激活剂的最初接触在干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂最初接触的同一天，例如最初地在同一天将Wnt激活剂和TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂加入包含干细胞的细胞培养基。在某些实施方式中，将骨形态发生蛋白(BMP)活性试剂加入E8/E6培养基。在某些实施方式中，BMP活性试剂在培养的约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天后从培养基中收回。在某些实施方式中，BMP活性试剂在培养的约3天后从培养基中收回。在某些实施方式中，BMP活性试剂以约0.5至约20ng/mL、或约1至约15ng/ml、或约2至约10ng/ml、或约3至约5ng/ml的浓度存在于培养基中。在某些实施方式中，BMP活性试剂以约5ng/ml的浓度存在于培养基中。
在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内(不晚于约8天)或细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触开始约8天时段内(不晚于约8天)。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触至少约2天。在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天或约8天。
在某些实施方式中，细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约4天。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在第0天，干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂的最初接触在第0天，细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在第2天，并且细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在第6天。在某些实施方式中，细胞培养是KSR培养基、N2培养基、或其组合。
在某些实施方式中，干细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约6天。在某些实施方式中，干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在第0天，细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在第0天，并且细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在第6天。在某些实施方式中，细胞培养是E8/E6培养基。
标志物和报告子
分化ENS前体表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物。肠神经嵴谱系标志物的非限制性实例包括成对盒3(PAX3)、内皮素B型受体(EDNRB)和ret原癌基因(RET)、成对式同源盒2a(PHOX2A)、成对式同源盒2B(PHOX2B)、神经营养性酪氨酸激酶受体类型3(NTRK-3)、无刚毛鳞甲复合体同源物样蛋白1(ASCL1)、心脏和神经脊衍生蛋白2(HAND2)、同源盒B3(HOXB3)、同源盒B5(HOXB5)。
在某些实施方式中，分化ENS前体还表达一种或多种普遍神经嵴标志物。普遍神经嵴标志物的非限制性实例包括叉头盒D3(FOXD3)、转录因子AP-2α(TFAP2A)、T-盒蛋白2(TBX2)、RP4-792G4.2、RNA、28S核醣体5(RNA28S5)、转录因子AP-2β(TFAP2B)、Inscuteable同源物(INSC)、RP11-200A13.2、纤毛和鞭毛相关蛋白126(C1orf192)、视黄酸类X受体γ(RXRG)、补体因子H(CFH)、和SOX10。
在某些实施方式中，分化ENS前体还表达一种或多种迷走神经标志物。迷走神经标志物的非限制性实例包括HOXB2、HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
在某些实施方式中，分化ENS前体细胞还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。在某些实施方式中，SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
肠神经元表达一种或多种肠神经元标志物。肠神经元标志物的非限制性实例包括Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
分化ENS前体或肠神经元还可以表达一种或多种报告子。报告子的非限制性实例包括荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)，青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2)和黄色荧光蛋白衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet、EYFP))，β-半乳糖苷酶(LacZ)；氯霉素乙酰转移酶(cat)；新霉素磷酸转移酶(neo)，酶(如氧化酶和过氧化物酶)；和抗原性分子。如本文所用，术语“报告基因”或“报告子构建体”是指包含编码易于检测或易于测定的蛋白质比如有色蛋白质、荧光蛋白如GFP或酶如β-半乳糖苷酶(lacZ基因)的核酸的遗传构建体。在某些实施方式中，报告子可由肠神经嵴谱系标志物基因的重组启动子驱动，例如，SOX10启动子。
分化ENS前体和进一步成熟的肠神经元可以在分化(例如在细胞培养基中)后纯化。如本文所用，术语“纯化的(purified)”、“提纯(purify)”、“纯化(purification)”、“分离的(isolated)”、“分离(isolate)”和“分离(isolation)”是指从样品中减少至少一种污染物的量。例如，将所需的细胞类型纯化至少10％、至少30％、至少50％、至少75％、并且至少90％>，相应地减少不需要的细胞类型的量。术语“纯化”可以指从样品中去除某些细胞(例如不期望的细胞)。去除或选择非伤害性感受器细胞导致样品中所需伤害性感受器细胞的百分比增加。在某些实施方式中，通过将混合的细胞群体分选成表达至少一种SOX10+神经嵴谱系标志物例如CD49D的细胞来纯化细胞。在某些实施方式中，通过将混合的细胞群体分选成表达至少一种肠神经嵴谱系标志物(例如PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和/或ASCL1)的细胞来纯化细胞。.
本发明公开的主题还提供通过本文所述方法产生的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体、以及包含这种体外分化细胞的组合物。本发明公开的主题还提供通过本文所述的方法产生的表达一种或多种肠神经标志物的体外分化细胞群体、以及包含这种体外分化细胞的组合物。
5.3包含分化细胞群体的组合物
本发明公开的主题提供包含通过本文所述的体外分化方法产生的分化肠神经嵴谱系细胞(或“ENS前体”)群体的组合物。此外，本发明公开的主题提供包含从本文所述的体外分化肠神经嵴谱系细胞(或“ENS前体”)成熟的肠神经元群体的组合物。
此外，本发明公开的主题提供包含体外分化细胞群体的组合物，其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物，并且其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、肠神经元标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
此外，本发明公开的主题提供包含体外分化细胞群体的组合物，其中至少约70％(例如至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或至少约99.5％)的细胞群体表达一种或多种肠神经元标志物，并且其中少于约15％(例如少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％、少于约0.5％、或少于约0.1％)的细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、肠神经嵴谱系标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
肠神经嵴谱系标志物的非限制性实例包括PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
肠神经元标志物的非限制性实例包括Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
干细胞标志物的非限制性实例包括OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
CNS标志物的非限制性实例包括PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
神经元细胞标志物的非限制性实例包括TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
间充质前体标志物的非限制性实例是SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
CNC标志物的非限制性实例包括PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
MNC标志物的非限制性实例包括PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
在某些实施方式中，该组合物包含约1x104至约1x1010、约1x104至约1x105、约1x105至约1x109、约1x105至约1x106、约1x105至约1x107、约1x106至约1x107、约1x106至约1x108、约1x107至约1x108、约1x108至约1x109、约1x108至约1x1010、或约1x109至约1x1010的本发明公开的干细胞-衍生的肠神经嵴谱系细胞或成熟肠神经元的群体。在某些实施方式中，该组合物包含约1x105至约1x107的本发明公开的干细胞-衍生的肠神经嵴谱系细胞或成熟肠神经元的群体。
在某些非限制性实施方式中，组合物还包含生物相容性支架或基质，例如生物相容性三维支架，其在将细胞植入或移植到受试者时促进组织再生。在某些非限制性实施方式中，生物相容性支架包含细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原、多肽或蛋白质、多糖包括纤连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶、和/或水凝胶。(参见，例如U.S.公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433、和2008/0268019号，每个的全部内容并入以供参考)。
在某些实施方式中，组合物是药物组合物，其包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、或其组合。组合物可用于预防和/或治疗肠神经元相关病症，例如先天性巨结肠症(HSCR)。
5.4预防和/或治疗肠神经系统病症的方法
表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞(也称为“干细胞-衍生的肠神经嵴(NC)前体”或“ENS前体”)可用于预防和/或治疗肠神经系统病症(ENS)。从体外分化ENS前体成熟的肠神经元也可用于预防和/或治疗ENS。本发明公开的主题提供预防和/或治疗ENS病症的方法，其包括向患有ENS病症的受试者施用有效量的一种或多种以下物质：
(a)本文所述的分化的本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体(ENS前体)的群体；
(b)包含这种干细胞-衍生的肠NC前体(ENS前体)的组合物；
(c)从本文所述的本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体(ENS前体)成熟的肠神经元群体；和
(d)包含这种肠神经元的组合物。
此外，本发明公开的主题提供本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体(ENS前体)或包含其的组合物、或本发明公开的从干细胞-衍生的肠NC前体(ENS前体)成熟的肠神经元用于预防和/或治疗ENS病症的用途。ENS病症的非限制性实例包括先天性巨结肠症(HD)、中毒性巨结肠、任何肠道神经节细胞缺失症、肠易激综合征、炎症性肠病、胃轻瘫、肠-相关药物副作用或其它治疗并发症。在某些实施方式中，ENS病症是先天性巨结肠症(HD)。在某些实施方式中，干细胞-衍生的肠NC前体表达细胞表面标志物CD49D。
患有HD的儿童目前通过手术切除肠道的无神经节部分来治疗。在挽救生命的同时，手术并未解决幸存患者中剩余胃肠道的永久性功能障碍17。开发用于HD的细胞疗法的主要挑战是需要在远距离上再增殖(repopulate)ENS。在成年个体中，小肠和大肠的长度分别约为5米和1.5米18。因此，任何用于移植的候选细胞类型都可能需要特殊的迁移特性。以前的研究测试了各种候选细胞来源移植到胎儿或出生后的结肠19-21。鼠胎儿-衍生的ENC前体产生最有希望的数据，具有功能整合的证据但体内迁移潜力有限22。此外，原发(primary)ENC前体的可扩展性非常有限，并且不能从人源获得。
肠神经嵴(ENC)的一个关键功能特性是以迷走神经NC水平从神经管分层后能够广泛迁移并定植肠的整个长度3。本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体在受试者(例如成人)的结肠(例如在结肠内广泛迁移)中具有广泛的体内迁移潜力。本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体再增殖于受试者(例如患有ENS病症(例如HD)的受试者)的肠和结肠。在某些实施方式中，本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的施用在从盲肠到直肠的整个长度上再增殖患有ENS病症(例如HD)的受试者的结肠。广泛植入的本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体可以对肠道的无神经节部分进行永久的、真正的修复。本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体也可影响旁分泌细胞因子的释放、免疫调节、和/或屏障功能的改变，这可能有助于预防HD相关的死亡。因此，本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体为ENS病症(例如HD)提供了新的治疗机会。
本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体可以全身地或直接地施用或提供给受试者用于治疗或预防ENS病症。在某些实施方式中，将本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体直接注射到目标器官中(例如受ENS病症(例如HD)影响的器官)。本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体可以直接施用(注射)至受试者的肠区域，例如小肠、结肠、盲肠和/或直肠。在某些实施方式中，将本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者的盲肠。此外，本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体可直接施用(注射)至小肠、结肠、盲肠和/或直肠的壁、平滑肌、结缔组织(connective issue)和/或淋巴管。在某些实施方式中，将本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者的盲肠壁。注射的细胞可以迁移到小肠、结肠、盲肠和/或直肠的平滑肌，并形成功能性神经肌肉接头。
本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元可以在任何生理学上可接受的载体中施用。还提供包含本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元和包含其的药物组合物可通过局部注射、原位(OT)注射、全身注射、静脉内注射或肠胃外给药来施用。在某些实施方式中，本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元通过原位(OT)注射施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者。
本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元和包含其的药物组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散体或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH值。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在施用方面稍微更方便，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质包括，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。通过将本发明公开的主题的组合物、例如包含本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元的组合物掺入所需量的适当溶剂(根据需要，具有各种量的其它成分)中，可制备无菌可注射溶液。这些组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂混合，比如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。组合物也可以冻干。该组合物可含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等，这取决于给药途径和期望的制剂。可以翻阅标准文本，比如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，并入本文以供参考，以制备合适的制剂，而无需过多的实验。
可以加入各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本发明公开的主题，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体相容。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定的水平。可以使用甲基纤维素，因为它易于经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可取决于所选的试剂。重要的一点是使用将达到所选粘度的量。显然，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型例如液体剂型(例如，组合物是否配制成溶液、悬浊液、凝胶或其它液体形式，比如定时释放形式或充液形式)的性质。
本领域技术人员将认识到，组合物的组分应选择为化学惰性的，并且不会影响本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的生活力或功效。这对于化学和药学原理方面的技术人员来说不产生问题，或者通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及过度实验)，从本公开和本文引用的文献中可以容易地避免问题。
关于本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的治疗性用途的一个考虑因素是实现最佳效果所需的细胞数量。最佳效果包括，但不限于，肠的再增殖(repopulation)、结肠的再增殖、以及患有ENS病症(例如HD)的受试者的肠和结肠的再增殖、和/或受试者肠的功能改善。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗时影响有益或期望的临床结果的量。有效量可以以一个或多个剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓ENS病症(例如HD)的进展，或以其它方式减少ENS病症(例如HD)的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重程度以及所施用细胞的形式和有效浓度。
在某些实施方式中，有效量是足以再增殖肠道、再增殖结肠或再增殖患有ENS病症(例如HD)的受试者的肠和结肠的量。在某些实施方式中，有效量是足以改善患有ENS病症(例如HD)的受试者的肠功能的量，例如改善的功能可以是正常人肠道功能的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％。
将施用的细胞的量将根据所治疗的受试者而变化。在某些实施方式中，将约1x104至约1x1010、约1x104至约1x105、约1x105至约1x109、约1x105至约1x106、约1x105至约1x107、约1x106至约1x107、约1x106至约1x108、约1x107至约1x108、约1x108至约1x109、约1x108至约1x1010、或约1x109至约1x1010个本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元施用于受试者。在某些实施方式中，将约1x105至约1x107个本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者。在某些实施方式中，将约2x105个本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者。在某些实施方式中，将约1x106至约1x107个本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者。在某些实施方式中，将约2x106至约4x106个本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或肠神经元施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者。考虑多少会是有效剂量的精准确定可以基于每个受试者个体的因素，包括它们的体型、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以从本公开内容和本领域的知识容易地确定剂量。
在某些实施方式中，施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者用于预防和/或治疗ENS病症的细胞是本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的群体。在某些实施方式中，施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者用于预防和/或治疗ENS病症的细胞是从本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体分化/成熟的肠神经元群体。在某些实施方式中，施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者用于治疗ENS病症的细胞是从本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体分化/成熟的肠神经中枢、感觉神经元和运动神经元的群体。
在某个实施方式中，预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法包括向有此需要的受试者施用有效量的β-分泌酶(BACE)的抑制剂。
在某个实施方式中，预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法包括向有此需要的受试者施用有效量的酸性蛋白酶的抑制剂。
此外，本发明公开的主题提供BACE抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。此外，本发明公开的主题提供酸性蛋白酶的抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
BACE抑制剂的非限制性实例包括BACE2的抑制剂、LY450139、LY2886721、LY2811376、Verubecestat(MK-8931)、和AZD3839。在某些实施方式中，BACE2抑制剂是BACE抑制剂IV(BACE抑制剂C3)。
酸性蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括胃酶抑素A、利托那韦、茚地那韦、占吉仑、阿利吉仑和LY-450139抑制剂。
酸性蛋白酶的抑制剂(例如胃酶抑素A)能够拯救本发明公开的EDNRB中包含纯合功能丧失突变的干细胞衍生的肠NC前体的迁移缺陷。在某些实施方式中，胃酶抑素A的拯救效果是BACE2-介导的效果。
此外，BACE抑制剂(例如BACE2抑制剂，例如BACE抑制剂IV)能够拯救本发明公开的EDNRB中包含纯合功能丧失突变的干细胞衍生的肠NC前体的迁移缺陷。
因此，可以使用酸性蛋白酶的抑制剂(例如胃酶抑素A)、和BACE抑制剂(例如BACE2抑制剂，例如BACE抑制剂IV)用于预防和/或治疗ENS病症。
5.5鉴定治疗性化合物的方法
本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体和/或成熟肠神经元可以用于模拟ENS病症(例如HD)，并充当筛选可克服疾病相关迁移缺陷的候选化合物的平台。候选化合物减轻ENS病症(例如HD)的能力可以通过测定候选化合物拯救由基因突变引起的生理或细胞缺陷的能力来确定，该基因突变引起ENS病症(例如HD)。发明人在拯救HD-相关迁移缺陷中对胃酶抑素A和BACE2抑制的鉴定代表了在药物开发中使用本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的概念验证。参见实施例1。
本发明公开的主题提供鉴定或筛选适于预防和/或治疗ENS病症(例如HD和/或HD-相关遗传缺陷)的化合物的体外方法。在某些实施方式中，该方法包括鉴定能够拯救由包含细胞迁移相关的基因、例如内皮素B型受体(EDNRB)中纯合功能丧失突变的细胞群体递呈的至少一种迁移缺陷的化合物，其中细胞群体选自本发明公开的衍生自干细胞(例如多能干细胞)的肠NC前体、本发明公开的衍生自干细胞衍生的肠NC前体的肠神经元、及其组合或混合物。EDNRB中功能丧失突变是一部分HD患者中众所周知的遗传原因28。
在某些实施方式中，该方法包括：(a)提供(i)包含EDNRB中纯合功能丧失突变的细胞群体，其中细胞群体选自本发明公开的衍生自干细胞(例如多能干细胞)的肠NC前体、本发明公开的衍生自干细胞衍生的肠NC前体的肠神经元、及其组合或混合物，和(ii)测试化合物；(b)使细胞群体与测试化合物接触；和(c)测量细胞群体的迁移行为。在某些实施方式中，细胞群体(例如肠NC前体和/或肠神经元)与测试化合物接触至少约6小时、约12小时、约24小时(1天)，例如约24小时(1天)、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天。
在某些实施方式中，细胞群体是衍生自干细胞的肠NC前体。
任何合适的迁移试验可用于测量肠NC前体的迁移行为，包括例如刮擦检定(例如迁移到细胞培养板的开放空间)、伤口愈合检定、迁移(transmigration)检定(例如穿过微孔)，细胞排斥区检定、微流体检定和细胞迁移检定。此外，用于测量肠NC前体的迁移行为的方法包括测量肠NC前体在半固体培养基(例如，水凝胶培养基)中迁移的能力。在某些实施方式中，肠NC前体在测量其迁移行为之前固定。
在某些实施方式中，该方法还包括确定ENS病症(例如HD或中毒性巨结肠)的因果性基因突变。用于确定HD的因果性基因突变的方法是本领域已知的，包括但不限于家族患者组中的遗传谱系分析，使用小鼠模型的正向和反向遗传学。
5.6.试剂盒
本发明公开的主题提供用于诱导干细胞分化的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒包含有效量的一种或多种转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导抑制剂、有效量的一种或多种无翼(Wnt)信号传导激活剂、有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子、和用于诱导干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书。
在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与抑制剂、激活剂和分子以特定顺序接触的用法说明。接触抑制剂、激活剂和分子的顺序可通过用于培养干细胞的细胞培养基来确定。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞群体与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天的用法说明。在某些实施方式中，说明书包含使细胞群体与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与有效量的一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从或干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内(例如同时(在同一天)、约1天、约2天、约3天、或约4天)的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天的用法说明。
在某些实施方式中，该试剂盒进一步包含有效量的一种或多种Small MothersAgainst Decapentaplegic(SMAD)信号传导抑制剂。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、一种或多种SMAD信号传导抑制剂、和一种或多种Wnt信号传导激活剂同时接触的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触约1至约4天内的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触约2天的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从或细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触开始约8天时段内的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触至少约2天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天或约8天的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约6天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在第0天的用法说明，使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在第0天的用法说明，以及使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在第6天的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触约4天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在第0天的用法说明，使干细胞一种或多种SMAD信号传导抑制剂的最初接触在第0天的用法说明，使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在第2天的用法说明，以及使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在第6天的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、或至少约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触10天至约15天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂接触约11天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、或至少约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触10天至约15天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约11天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、或至少约29天、至少约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、至多约21天、至多约22天、至多约23天、至多约24天、至多约25天、至多约26天、至多约27天、至多约28天、至多约29天、或至多约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约4天至约30天、约4天至约27天、约4天至约26天、约4天至约25天、约4天至约24天、约4天至约20天、约4天至约15天、约4天至约10天、约5天至约15天、约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天、约10天至约20天、约20天至约25天、或约25天至约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触5天至约15天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、或约30天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约11天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约10天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约9天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约8天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、或至少约21天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至多约2天、至多3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天、或至多约21天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至多约20天的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约21天、约2天至约20天、约2天至约10天、约10天至约15天、约15天至约21天、约2天至约6天、约2天至约5天、或约5天至约10天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天至约10天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触5天至约20天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约6天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天至约10天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或约21天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约12天的用法说明；使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约10天的用法说明；和使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触约11天的用法说明；使细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约9天的用法说明；和使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约12天的用法说明；和使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天，以产生ENS前体的用法说明。在某些实施方式中，该说明书包含使干细胞与一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触约11天的用法说明；和使细胞与一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约5天，以产生ENS前体的用法说明。
在某些实施方式中，该试剂盒还包含用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书。
在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包括在合适的细胞培养基中培养ENS前体。在某些实施方式中，该试剂盒还包含一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子，并且该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包括使ENS前体与一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子接触。在某些实施方式中，该一种或多种增强ENS前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和WNT激活剂。在某些实施方式中，生长因子选自FGF激活剂、GDNF、和抗坏血酸。
在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、或至少约10天，以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约1天至约10天、约1天至约5天、约5天至约10天，以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约1天至约5天以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与一种或多种FGF激活剂和一种或多种Wnt激活剂接触约4天以产生肠神经元的用法说明。
在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天、或至少约50天，以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约1天至约50天、约1天至约10天、约20天至约30天、约30天至约40天、或约40天至约50天，以产生肠神经元的的用法说明。在某些实施方式中，ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约10天至约20天以产生肠神经元。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约40天至约50天以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约10天以产生肠神经元的用法说明。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约25天以产生肠神经元。在某些实施方式中，该用于诱导ENS前体成熟为肠神经元的说明书包含使ENS前体与GDNF和抗坏血酸接触约45天以产生肠神经元的用法说明。此外，本发明公开的主题提供用于预防和/或治疗或预防ENS病症(例如HD)的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒包含有效量的本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的群体或包含单位剂量形式的这种前体的组合物。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有治疗性组合物的无菌容器；这些容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管子、袋子、小袋(pouch)、泡罩包装或者本领域已知的其它合适容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适用于保存药物的其它材料制成。
在某些实施方式中，该试剂盒包含用于将本发明公开的干细胞-衍生的肠NC前体的群体或包含其的组合物施用于患有ENS病症(例如HD)的受试者的说明书。该说明书可包含关于使用该细胞或组合物用于预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的信息。在某些实施方式中，该说明书包括以下当中的至少一种：治疗剂的描述；用于预防和/或治疗ENS病症(例如HD)或其症状的剂量方案和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。说明书可直接打印在容器(如果存在的话)上，或作为贴于容器的标签，或者作为容器中或与容器一起提供的单独的纸、册、卡或折叠印刷品。
6.实施例
通过参照以下实施例将更好地理解本发明公开的主题，该实施例作为本发明公开的主题的示例提供，而不是作为限制。
6.1实施例1
概述
本文证明ENS祖细胞从人多能干细胞(hPSC)中的有效衍生和分离及其进一步分化为多种神经递质表型的功能性肠神经元。体外衍生的ENS前体显示出在发育的鸡胚中靶向迁移的能力和如下所述的成年小鼠结肠的广泛定殖。移植的hPSC-衍生的ENS前体迁移并移植到HD小鼠模型(EDNRBs-l/s-l)的结肠中，并引发疾病相关死亡的挽救。最终，建立EDNRB突变体ENS前体使得能够对HD-相关迁移缺陷进行建模并鉴定出胃酶抑素A和其它BACE抑制剂作为新的候选疗法。本文描述的研究建立了一个基于hPSC的用于人ENS发育研究的平台，并揭示了用于治疗HD的新型细胞和基于药物的策略。
方法
hESC和hiPSC系分化为NC细胞是基于双重的SMAD抑制11以及通过CHIR99021-介导的GSK3b抑制引起的WNT信号传导激活5。在NC诱导期间，迷走神经/肠NC(ENC)在RA存在下得到诱导。ENC前体通过在非粘附板(1×105细胞/cm2)中的短暂(4天)3D培养步骤而进一步分化为神经元。神经元分化在含有GDNF和AA的N2培养基中进行。颅和黑素细胞偏向的NC前体5、RA诱导的ENC前体和分化的神经元通过免疫细胞化学、流式细胞术、qRT-PCR和使用RNA测序的全局基因表达分析来表征。ENC前体的体内迁移功能通过在HH14阶段的发育鸡胚中移植、并在24-36小时后分析来进行评估。对于体外连通性(connectivity)研究，hESC在激活素A和BMP4暴露并用TGFβ处理后分化为SMC13。功能性检定通过用450nm光脉冲(4ms，2-10Hz，2-4mW)刺激由H9-SYN::ChR2-YFP hES细胞产生的ENC-衍生的神经元来进行。分化的ENC前体与原代鼠肠组织的功能性相互作用使用体内结肠组织工程化方法，通过用人hESC-ENC前体重新聚集鼠原代肠器官单位16，然后植入NOD-scid IL2Rγnull(NSG)小鼠来评估。对于体内迁移和分化研究，将ENC前体原位移植到成年盲肠(NSG或EDNRB s-l/s-l小鼠)中。在不同时间点收获结肠组织，用于全标本包埋荧光和组织学分析。Prestwick Chemical的高通量筛选使用96孔格式的划痕检定，使用通过基于CRISPR/Cas的靶向建立的衍生自EDNRB-/- hESC系的ENC前体来进行。对筛选的主要命中物胃酶抑素A进行剂量-响应曲线和机理研究。BACE抑制剂IV和siRNA介导的BACE-2的敲低在CD49D+ ENC前体上进行。如果没有另外说明，数据表示为平均值+/-SEM并且来自至少3次独立实验。表1呈现每幅图的实验细节的简短描述。
表1：对应附图中呈现的实验和方法的概述。
对于其它细节，请参见补充方法部分
未分化人胚胎干细胞(hESC)的培养
将hESC系H9(WA-09)和衍生物(SOX10::GFP；SYN::ChR2-YFP；SYN::YFP；PHOX2B:GFP；EF1::RFP EDNRB-/-)以及2个独立的hiPSC系(健康)和家族性植物神经功能障碍症，基于仙台，OMSK(Cytotune))维持在含有hESC培养基的KSR(Life Technologies，10828-028)中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，Global Stem，Rockville，MD)上，如前所述11。以每月间隔对细胞进行支原体检测，并对STR进行分析以确认研究开始时的细胞身份。
神经嵴诱导.
将hESC铺板在含有10nM FGF2(R&D Systems，233-FB-001MG/CF)的hESC培养基中的基质胶(BD Biosciences，354234)包被的培养皿(105细胞/cm2)上。分化开始于含有LDN193189(100nM，Stemgent，Cambridge，MA)和SB431542(10μM，Tocris，Ellisville，MI)的敲除血清替代物(KSR)培养基(KO DMEM+15％KSR，L-谷氨酰胺(Life Technologies，25030-081)，NEAA(Life Technologies，11140-050)。从第4天至第10天，KSR培养基逐渐用增加量的N2培养基取代，如前所述11。对于颅NC(CNC)诱导，从第2天到第11天，除了LDN和SB之外，细胞还用3μM CHIR99021(Tocris Bioscience，4423)处理。从第6天至第11天，肠NC(ENC)分化涉及用视黄酸(10μM)的额外处理。为衍生有黑素细胞能力的NC(MNC)，在第6天至第11天，LDN用BMP4(10nM-R&D，314-bp)和EDN3(10nM，American Peptide公司，88-5-10B)代替5。分化细胞在第11天进行CD49D分选。在第0天至第11天，CNS前体对照细胞通过用LDN和SM处理而产生，如前所述11。在整个稿件中，第0天是培养基从hESC培养基转换为含有LDN和SB的培养基的当日。文本和图中的分化天数是指自多能阶段(第0天)以来的天数。
FACS和免疫荧光分析(IF).
对于IF，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)(Affymetrix-USB，19943)固定20分钟，然后使用1％牛血清白蛋白(BSA)(Thermo Scientific，23209)和0.3％triton X-100(Sigma，T8787)封闭并透化。然后在4℃(摄氏度)下将细胞在一抗溶液中孵育过夜，并在室温(RT)下用荧光团缀合的二抗染色1小时，然后将染色的细胞与DAPI(1ng/ml，Sigma，D9542-5MG)一起孵育，并在成像前清洗几次。对于流式细胞术分析，将细胞用Accutase(Innovative CellTechnologies，AT104)解离，并使用BD Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience，554722)溶液固定和透化，然后使用BD Perm/Wash缓冲液(BD Bioscience，554723)根据制造商的说明书进行洗涤、封闭和透化。然后将细胞用一抗(在4℃过夜)和二抗(在室温下30min)染色，并使用流式细胞仪(Flowjo软件)分析。一抗和工作稀释液的列表在表2中提供。PHOX2A抗体由Dr.J-F Brunet惠赠(兔，1：800稀释)。
表2：一抗和工作稀释液的列表
体内移植.
在注射之前，在37℃将受精卵(来自Charles River农场)孵育50小时。将2x105个CD49D分选的、RFP标记的NC细胞注射到胚胎的迷走神经区域的体节间隙中，靶向体节2和6之间的区域(HH 14胚胎，20-25体节阶段)。36小时后收获胚胎用于全标本包埋落射荧光和组织学分析。
基因表达分析.
对于RNA测序，使用RNeasy RNA纯化试剂盒(Qiagen，74106)提取总RNA。对于qRT-PCR检定，使用Superscript II逆转录酶(Life Technologies，18064-014)将总RNA样品逆转录成cDNA。qRT-PCR反应使用QuantiTect SYBR Green PCR mix(Qiagen，204148)建立。每个数据点代表三次独立的生物学重复。
ENC向肠神经元的体外分化.
ENC细胞在超低附着6-孔培养板(Fisher Scientific，3471)中聚集成3D球状体(5百万个细胞/孔)，并在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem CellTechnologies，07156)和含有CHIR(3μM，Tocris Bioscience，4423)和FGF2(10nM，R&DSystems，233-FB-001MG/CF)的B27(Life Technologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中培养。悬浮培养4天后，将球状体铺板在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(StemCell Technologies，07156)和含有GDNF(25ng/ml，Peprotech，450-10)和抗坏血酸(100μM，Sigma，A8960-5G)的B27(Life Technologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中、在聚鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白(PO/LM/FN)包被的培养皿(如前所述制备38)上。ENC前体从所铺板的球状体中迁移出来并在1-2周内分化为神经元。将细胞固定用于免疫染色或在分化的第25天、第40天和第60天收获用于基因表达分析。
SMC的诱导.
中胚层特化在STEMPRO-34(Gibco，10639-011)培养基中进行。对hESC进行激活素A处理(100ng/ml，R&D，338-AC-010)24小时，然后进行BMP4处理(10ng/ml，R&D，314-bp)，持续4天13。然后细胞通过用PDGF-BB(5ng/ml，Peprotech，100-14B)、TGFb3(5ng/ml，R&Dsystems，243-B3-200)和10％FBS处理而分化为SMC祖细胞。SMC祖细胞可在补充有10％FBS的DMEM中扩增。
EN-SMC共培养.
在加入ENC-衍生的神经元之前三天，将SMC祖细胞铺板在PO/LM/FN包被的培养皿(如前所述制备38)上。在分化的第30天将神经元解离(使用accutase，Innovative CellTechnologies，AT104)并铺板到SMC单层培养物上。培养物在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem Cell Technologies，07156)和含有GDNF(25ng/ml，Peprotech，450-10)和抗坏血酸(100μM，Sigma，A8960-5G)的B27(Life Technologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中保持。功能连通性在共培养的8-16周评估。
共培养的SMC的药理学和光遗传学刺激.
在开始共同培养后3个月，对仅SMC和SMC-ENC-衍生的神经元共培养物进行氯化乙酰胆碱(50μM，Sigma，A6625)、氯化氨甲酰胆碱(10μM，Sigma，C4382)和KCl(55mM)Fisherscientific，BP366-500)处理。光遗传学刺激使用450nm尾纤二极管泵浦固态激光器(OEMLaser，PSU-III LED，OEM Laser Systems,Inc)进行，实现2至4mW/mm2的照射。脉冲宽度为4ms，并且刺激频率范围为2至10Hz。对于运动的定量，将图像使用Metamorph软件集合成堆叠(stack)，并识别具有高对比度的区域(图8中标记为黄色)。自动跟踪(Metamorph软件)每个场的5个代表性高对比度区域的运动。数据以电影(kinetogram)呈现为相对于前一帧在x和y方向(距离)上的像素移动。自动追踪运动有时并不能捕捉到培养物中运动增加＞2倍(2x)的最强烈的运动。因此，这些数据可能部分低估了实际的运动。
嵌合组织工程化结肠(TEC)的产生.
先前描述的方法用于产生TEC16。简言之，收获供体结肠组织并使用分散酶(LifeTechnologies，17105-041)和1型胶原酶(Worthington，CLS-1)消化成类器官单位。然后将类器官单位立即(没有任何体外培养)与CD49D纯化的hESC-衍生的ENC前体(分化的第15天)混合并接种到可生物降解的聚乙醇酸支架上(2-mm片材厚度，60mg cm-3体积重量；孔隙率>95％，Concordia Fibers，Coventry RI)，其成形为具有聚-L丙交酯(PLLA)(DurectCorporation)的2mm长管状物。然后将接种的支架置于并包裹在成年(>2月龄)NSG小鼠的更大网膜上。就在植入之前，这些小鼠用350cGY照射。接种的支架在网膜内分化成结肠样结构持续另外4周，然后通过手术取出用于组织分析。
ENC前体在成年结肠中的移植.
所有小鼠程序均遵循NIH指南进行，并且由当地的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)，机构生物安全委员会(Institutional Biosafety Committee)(IBC)以及胚胎干细胞研究委员会(EmbryonicStem Cell Research Committee)(ESCRO)批准。3-6周龄雄性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠或2-3周龄EDNRBs-l/s-l(SSL/LeJ)小鼠39(n＝12，6只雄性，6只雌性)用于这些研究。动物数量基于纯合宿主的可得性和检测治疗与对照(EDNRBs-l/s-l)之间的大效应以及证明迁移行为(NSG)的稳健性的足够的统计学能力。随机选择动物用于各种治疗范例(NSG和EDNRBs-l/s-l)，但确保每组(EDNRBs-l/s-l)中雄性/雌性比例的均等分布。动物在整个程序中用异氟烷(1％)麻醉，制作小的腹部切口，抬起腹壁肌肉组织并暴露盲肠并使其外露。使用温盐水保持盲肠湿润。将在PBS中70％基质胶(BD Biosciences，354234)中的20μl细胞悬液(2-4百万RFP+ CD49D纯化的hESC-衍生的ENC前体)或在仅PBS中的20μl的70％基质胶(对照移植动物)使用27-计量注射针缓慢注射入盲肠(靶向肌肉层)。使用70％基质胶作为用于细胞注射的载体确保细胞在注射后保持在原位并防止回流到腹膜中。在注射后取出注射针，并将Q-tip放置在注射部位上30秒以防止出血。将盲肠返回腹腔，并且腹壁使用4-0薇乔(vicryl)和锥形针以间断缝合模式闭合，并且皮肤使用无菌创伤夹闭合。伤口闭合后，将动物放在其卧具上方的纸上，并且照顾直到有意识，且最好是进食和饮水。在移植后的不同时间点(范围从两周至四个月)收获组织用于组织学分析。EDNRBs-l/s-l小鼠通过每日注射环孢菌素(10mg/kg i.p，Sigma，30024)进行免疫抑制。
全标本包埋荧光成像和组织学
将收获的结肠样品在4％PFA中固定，4℃过夜，然后成像。成像使用Maestro荧光成像系统(Biotechniques)进行。在4℃下将组织样品在30％蔗糖(Fisher Scientific，BP220-1)溶液中孵育2天，然后包埋在OCT(Fisher Scientific，NC9638938)中并冷冻切片。然后将切片用1％BSA(Thermo Scientific，23209)封闭，并用0.3％Triton X-100(Sigma，T8787)透化。然后在4℃下将切片用一抗溶液染色过夜，并在室温下用荧光团缀合的二抗溶液染色30分钟。然后将染色的切片与DAPI(1ng/ml，Sigma，D9542-5MG)一起孵育并洗涤数次，然后用Vectashield Mounting Medium(vector，H1200)封片，并使用荧光(OlympusIX70)或共聚焦显微镜(Zeiss SP5)成像。
总GI运送时间
使用#24圆头喂食针，对小鼠管饲0.3ml含有6％胭脂红(Sigma，C1022-5G)，0.5％甲基纤维素(Sigma，274429-5G)和0.9 NaCl的染料溶液。在管饲后将针保持在小鼠食道内几秒钟以防止反流。1小时后，每隔10分钟监测所管饲小鼠的粪便颜色。对于每只小鼠，总GI运送时间在管饲时间和观察到红色粪便的时间之间。
基因靶向
双切口酶CRISPR/Cas9体系40用于靶向EF1::RFP H9 hESC中的EDNRB基因座。设计两个引导RNA(使用CRISPR设计工具http://crispr.mit.edu/)以靶向与PAM靶标相距约20bp的编码序列(qRNA#1靶特异性序列：AAGTCTGTGCGGACGCGCCCTGG[SEQ ID NO:1]，RNA#2靶特异性序列：CCAGATCCGCGACAGGCCGCAGG[SEQ ID NO:2])。将细胞用gRNA构建体和GFP-融合的Cas9-D10A切口酶转染。在24小时后对表达GFP的细胞进行FACS纯化并且以低密度(150细胞/cm2)铺板在MEF上。7天后挑取菌落并且在基因组DNA分离和筛选之前进行两次传代。对EDNRB基因的靶向区域进行PCR扩增(正向引物：ACGCCTTCTGGAGCAGGTAG[SEQ ID NO:3]，反向引物：GTCAGGCGGGAAGCCTCTCT[SEQ ID NO:4])并克隆到Zero Blunt TOPO载体(Invitrogen，450245)中。为了确保两个等位基因(来自每个hESC菌落)都得到表现(represent)和测序，选择10个细菌克隆(对于每个hESC克隆)用于质粒纯化和随后的测序。具有双等位基因无义突变的克隆得到扩增并分化用于后续试验。
迁移试验
将ENC细胞铺板在PO/LM/FN包被的(如前所述制备38)96孔或48孔培养板上(30,000/cm2)。24小时后，培养平面(lawn)用移液器吸头手动划痕。给予细胞另外24-48小时以迁移到划痕区域并固定用于成像和定量。定量基于迁移期后位于划痕区域中的细胞核的百分比。使用在划痕后立即固定的参考孔来界定划痕区域。细胞迁移使用具有“ROI中的定量”插件的开源数据分析软件KNIME41(http://knime.org)进行定量，如其它地方详细描述42。
增殖检定
为了定量增殖，FACS纯化的ENC细胞使用CyQUANT NF细胞增殖检定试剂盒(LifeTechnologies，C35006)根据制造商的说明书进行检定。简言之，为了产生一个标准，将细胞以各种密度铺板并使用荧光DNA结合染料试剂进行染色。然后使用读板仪测量总荧光强度(485nm处激发和530nm处发射检测)。在确定线性范围后，将CD49D+ WT和EDNRB-/- ENC前体铺板(6000细胞/cm2)并在0、24、48和72小时进行检定。在检定期间将细胞在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem Cell Technologies，07156)和含有CHIR(3μM，TocrisBioscience，4423)和FGF2(10nM，R&D Systems，233-FB-001MG/CF)的B27(LifeTechnologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中培养。
生活力检定
为了监测WT和EDNRB-/- ENC前体的生活力，使用CytoTox 96细胞毒性检定试剂盒(Promega，G1780)检定细胞的LDH活性。简言之，将细胞以30,000/cm2铺板在96孔板中。24小时后收获上清液和细胞裂解物，并使用读板仪(490nm吸光度)检定LDH活性。生活力通过将裂解物的LDH信号除以总LDH信号(来自裂解物加上清液)来计算。在检定期间将细胞在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem Cell Technologies，07156)和含有CHIR(3μM，Tocris Bioscience，4423)和FGF2(10nM，R&D Systems，233-FB-001MG/CF)的B27(LifeTechnologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中培养。
高通量筛选
化合物筛选使用Prestwick Chemical 来进行。将ENC细胞铺板在96孔板(30,000/cm2)中并在加入化合物前24小时手动划痕。细胞用两种浓度的化合物(10μM和1μM)处理。24小时后将板固定用于全板成像。对化合物基于它们在24小时内促进划痕填充的能力进行评分。显示毒性作用(基于通过DAPI染色评估的细胞数量的显著减少)的化合物评分为0，没有作用的化合物评分为1，具有中等作用的化合物评分为2，并且具有强烈作用(其导致划痕区域的完全填充)的化合物评分为3并鉴定为命中化合物。对命中物进一步验证以确保再现性。将细胞用各种浓度的所选命中化合物(胃酶抑素A)处理用于剂量响应分析。最佳剂量(基于10μM的最佳响应和生活力)用于后续实验。对于预处理实验，在第11天对细胞进行CD49D纯化，并从第12天至第15天用胃酶抑素A处理，然后移植到NSG小鼠的结肠壁中。在检定期间将细胞在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem CellTechnologies，07156)和含有CHIR(3μM，Tocris Bioscience，4423)和FGF2(10nM，R&DSystems，233-FB-001MG/CF)的B27(Life Technologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中培养。
BACE2抑制和敲低
为了抑制BACE2，将ENC前体用1μMβ-分泌酶抑制剂IV(CAS797035-11-1–Calbiochem)处理。为了敲低BACE2，将细胞使用accutase(Innovative CellTechnologies，AT104)解离并用siRNA库(SMARTpool：ON-TARGETplus BACE2 siRNA，Dharmacon，L-003802-00-0005)或4种不同的单独siRNA(Dharmacon，LQ-003802-00-00022nmol)反向转染(使用脂质体RNAiMAX-Life Technologies，13778-150)。敲低通过qRT-PCR测量用BACE2 siRNA相比于对照siRNA库(ON-TARGETplus非靶向库，Dharmacon，D-001810-10-05)转染的细胞中的BACE2 mRNA水平来确认。铺板后24小时对转染的细胞进行划痕，并在48小时后固定用于迁移定量。在检定期间将细胞在补充有L-谷氨酰胺(Gibco，25030-164)、N2(Stem Cell Technologies，07156)和含有CHIR(3μM，Tocris Bioscience，4423)和FGF2(10nM，R&D Systems，233-FB-001MG/CF)的B27(Life Technologies，17504044)的神经基质(NB)培养基中培养。
统计分析
数据表示为平均值±SEM并且来自至少3次独立实验。重复数据(n)在图例和表1中给出。统计分析使用Student t-检验(比较2组)或具有Dunnett检验的ANOVA(相对于对照比较多组)进行。原始数据的分布近似于具有足够重复次数的数据的正态分布(KolmogorovSmirnov正态性检验)以测试正态性。存活分析使用时序(Mantel-Cox)检验进行。主要命中物的Z-分数计算为Z＝(x-μ)/σ。X是迁移分数值，并且对于所有命中化合物为3。μ是平均迁移分数值，并且σ是所有化合物和DMSO对照的标准偏差(n＝224)。
结果
当前的NC分化方案4,5产生HOX阴性的SOX10+ NC前体(指示前部/颅身份；颅NC(CNC))并且主要产生感觉和伤害感受性神经元。相比之下，迷走神经NC身份的特征在于表达特异性、区域限制性HOX基因，包括HOXB38和HOXB59。视黄酸(RA)先前已经用作外因子，将CNS前体的区域身份从前部转变为更近尾部的命运，比如在运动神经元特化期间10。本发明人测试RA的加入是否能相似地指导NC谱系中的区域身份并且诱导迷走神经标志物的表达(图1A)。在RA暴露下获得Sox10::GFP+ NC前体，产率与CNC条件相当，表明RA处理不干扰总体NC诱导(图1B；图2B)。为了促进在各种hPSC系中分离纯NC群体，进行候选表面标志物筛选，并且CD49D(α4-整联蛋白)被鉴定为可靠地标记早期SOX10+ NC谱系的表位(图1Bb，图2A-2C)。CD49D用作标志物以验证在RA存在下对于另外hPSC系的NC诱导(人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)，确认了稳健性(图2D)。在RA存在下衍生的纯化的CD49D+ NC前体，表达HOXB2-B5指示迷走神经身份8,9，而不是更近尾部的HOX转录物比如HOXB9(图1C)。进一步与迷走神经身份一致，CD49D+、RA-处理的NC前体表达早期肠NC(ENC)谱系3的标志物，包括PAX3、EDNRB和RET(图1Dd，图2E和2F)。鉴于人肠NC发育的发育数据很少，进行RNAseq分析以限定hESC-衍生的肠NC前体中、颅NC(CNC)(无RA)中、和黑素细胞偏向NC(MNC)(图2A)以及阶段匹配的CNS前体11的全局基因表达谱。无监督聚类和主成分分析可靠地将所有hPSC-衍生的NC群体的转录物组隔离于CNS谱系细胞(图1E)并进一步区分出各种NC子谱系(图1E和1F)。ENC中与CNS谱系相比最差异表达的基因包括普遍NC标志物如FOXD3或TFAP2A，还有与ENC谱系特异性相关的PAX3和HOX基因(图1G)。CNC和MNC也富含普遍NC标志物，但显示高水平的NEUROG1、ISL1或MLANA、TYR、DCT表达，分别与其NC亚型身份相符(图2G和2H)。各种NC谱系的直接比较产生了人迷走神经NC/ENC谱系的新候选标志物(图1G)。每个NC谱系的前200位最富含的转录物的列表如表3-5所提供。原始RNAseq数据可在GEO http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/获得，登录号：GSE66148。
表3：来自RNA seq数据的hESC-衍生的ENC(迷走神经/肠NC)(第11天)中相比于hESC-衍生的CNS(第11天)的前200位最差异表达的转录物
表4：来自RNA seq数据的hESC-衍生的CNC(颅NC)(第11天)中相比于hESC-衍生的CNS(第11天)的前200位最差异表达的转录物
表5：来自RNA seq数据的hESC-衍生的MNC(黑素细胞偏向)(第11天)中相比于hESC-衍生的CNS(第11天)的前200位最差异表达的转录物
ENC的一个关键功能特性是以迷走神经NC水平从神经管分层后能够广泛迁移并定植肠的整个长度3。将RFP-标记的CD49D+纯化的hPSC-衍生的ENC前体以迷走神经NC的水平注射到发育的鸡胚(图1H)中，导致人细胞沿着胚胎的躯干迁移并定植鸡肠(在57个所注射胚胎的22个中)。相比之下，阶段匹配的CNC或MNC前体显示出更多样化的迁移路径，包括进入胚胎的颅区域(“CNC”)或迁移路径主要限于真皮(MNC)(图2I)。20个用CNC注射的胚胎中仅2个显示鸡肠中存在一些人细胞。因此，分子、表型和迁移数据确认了从hPSC富集迷走神经/ENC的可行性。
在PNS内，ENS前体在产生多种神经元亚型的能力方面是独特的，可产生数十种不同的神经递质和激素。为了解决hESC-衍生的ENC前体是否能够分化为广泛的神经元亚型，将纯化的CD49D+ ENC前体以3D球状体保持4天，然后在抗坏血酸(AA)和胶质细胞系-衍生的神经营养因子(GDNF)存在下在贴壁培养基中自发分化(图3A)。在分离CD49D+细胞后，需要3D球体中间培养步骤以保留高水平的SOX10::GFP表达(图3B)。在分化条件下重新铺板该3D球状体后，表达泛神经元标志物Tuj1和肠神经元前体标志物PHOX2A的未成熟神经元出现(分化的第20天；图3B)。大多数PHOX2A+细胞也是TRKC(NTRK3)阳性的，TRKC是在肠神经元前体12中表达的表面标志物，其适于随后富集PHOX2A+和ASCL1+前体(图4A和4B)。时序表达分析(图4C-4E)显示维持ENC神经元前体标志物表达到分化的第40天(图3C和3D)，然后成熟神经元的百分比强烈增加到第60天(图3E和3F)。与它们的肠神经元身份一致，观察到广泛的神经递质表型，包括5HT+、GABA+和NOS+神经元。源自纯化的CD49D+ RA处理的NC前体的培养物中这些神经递质的存在表明ENC起源，因为这些神经递质不在ENS之外的其它NC衍生物中表达。实际上，在源自CNC条件下衍生的HOX-阴性、CD49D+细胞的平行培养物中未观察到5HT+神经元(图5A和5B)。CNC-衍生的前体分化为表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元(图5C)并且产生高比例的TRKB(NTRK2)-阳性而非TRKC-阳性前体，表明富含交感神经元谱系(图6D)。相比之下，大多数ENC衍生的前体表达TRKC而非TRKB(图5E)。
ENS的主要功能是通过协调平滑肌层的激活来控制蠕动肠道运动。体外衍生的肠神经元的功能性通过评估它们与平滑肌细胞(SMC)的连通性来研究。hESC-衍生的SMC通过体外暴露于激活素A和BMP413并在TGFβ存在下培养后的中胚层中间体产生(图7A)。得到的SMC祖细胞表达表明内脏中胚层身份14的ISL1，并且对平滑肌肌动蛋白(SMA)具有免疫反应性(图7B)。对于连通性研究，肠神经元衍生自在人突触蛋白启动子控制下表达光敏感通道-2(ChR2)-EYFP的hESC系。使用光遗传学报告子细胞系允许光诱导控制神经元活性(图3G)。这些共培养物中的GABA+和5HT+神经元与SMC密切相关，与建立的物理连通性一致(图7C)。神经元与SMC共培养的第25天引发了加速的神经元成熟，如通过SYN::EYFP的表达增加所示(图7D)。相反，hESC-衍生的SMC在共培养条件下也显示出加速成熟的迹象，如通过成熟平滑肌标志物如肌球蛋白重链11(MYH11)和乙酰胆碱受体的表达(AchR；图7E)和响应于乙酰胆碱、卡巴胆碱或KCl处理而收缩的能力所示(图8A和8B)。在不存在光或药理学刺激的情况下，在SMC和ENC-衍生的神经元的共培养物中未观察到自发收缩(共培养的第90天)。相比之下，在光介导的ChR2激活(10Hz频率)后5-10秒，SMC收缩波可以在含有SYN::Chr2-YFP神经元的培养物中触发(图3H、3I和8C)。有趣的是，光-和药物-诱导的SMC收缩都很缓慢并且涉及片状结构的运动，表明细胞之间的协调可能通过间隙连接介导的SMC偶联15。这些研究证明了hESC-衍生的肠神经元和SMC之间的功能连通性。然而，ENS在肠内的体内相互作用更复杂并且涉及多种细胞类型。作为3D模拟这些相互作用的第一步，使用组织工程化方法，将体外衍生的人ENC前体(CD49D+；第15天)与鼠原发肠组织(图3J)组合，不经预培养。使用先前建立的方案以形成类器官单元16，将重组的组织构建体接种到支架上并植入免疫缺陷宿主的网膜上以在体内进一步成熟16。基于人特异性标志物包括SC121和人突触素的表达，人细胞容易在肠样结构中进行检测。重要的是，细胞位于粘膜下层和肌肉层两者中(图3K)，表明它们与两种靶细胞类型相互作用的能力。
使用体外衍生的ENS谱系对肠的再增殖可以为ENS病症比如HD产生新的治疗机会。先前的研究测试了各种候选细胞来源移植到胎儿或出生后的结肠19-21。鼠胎儿衍生的ENC前体产生最有希望的数据，具有功能整合的证据但体内迁移潜力有限22。此外，原发ENC前体的可扩展性非常有限，并且不能从人源获得。为了评估hESC-衍生的肠NC前体在出生后或成年结肠内迁移的能力，在NOD-scid IL2Rγnull(NSG)小鼠中进行CD49D+ RFP-标记的前体的原位(OT)注射(图6A)。将细胞瞄准肌肉层注射到盲肠壁中(图6A)，在注射后1小时产生明确界定的RFP+细胞沉积(图9A；左图；图6B；上图)。值得注意的是，到移植后2-4周，RFP+细胞已经广泛迁移并在从盲肠到直肠的整个长度上再增殖于宿主结肠(图6B)。移植的肠NC前体沿着结肠产生簇(图9A；右图)表达TUJ1(图6C)。相比之下，在相同条件下移植的阶段匹配的CNS和CNC前体仅显示有限的迁移行为(图9B和9C)。
鉴于移植细胞再增殖于宿主结肠的非凡能力，进行体内研究以评估这些肠NC前体在HD动物模型中的治疗益处。一种广泛使用的HD遗传模型是EDNRBs-l/s-l小鼠23。这些小鼠形成巨结肠，因为缺乏适当的ENS功能导致异常蠕动。因此，突变小鼠在4-6周龄时表现出高死亡率。EDNRBs-l/s-l小鼠在出生后2-3周用RFP+ hESC-衍生的肠NC前体(治疗组)或用基质胶载体(对照组)注射。大多数对照-注射的动物(n＝6)在4-5周期间(图6D)具有特征性巨结肠病理学而死亡(图6E)。相比之下，用hESC-衍生的NC前体(n＝6)注射的所有动物存活(图6D)。评估移植动物在6-8周龄时移植存活和迁移的程度。全标本包埋荧光成像确认了hESC-衍生的肠NC前体在HD结肠内的迁移，其中整个结肠中检测到RFP+细胞(图9D和9E)。在初步研究中，还观察到改善GI运送时间的趋势，这在移植的相比于一小部分存活超过治疗6周的基质胶处理动物中使用胭脂红染料管饲法所测量(图9F)。移植后6周和3个月的组织学分析确认了移植的人细胞在HD结肠中的肠肌层和粘膜下层的定位。虽然人细胞定位模拟内源性ENS的多方面(aspects)，但是存在对粘膜下层区域的偏好(图6F；图9G上图)。人细胞也在远端结肠中(图9G，下图)在内源性TUJ1+细胞大大减少的区域中检测到。SC121和人特异性突触素的免疫细胞化学在注射基质胶的动物中未检测到(图6G，左图)，确认了人细胞在结肠组织中的存在，并表明移植细胞上突触前(pre-synaptic)标志物的表达(图6G，右图)。除了神经元标志物如TUJ1的表达(图9G)外，还使用人特异性SC-123抗体观察到GFAP的表达(图9H)。最后在宿主结肠壁内观察到神经元-亚型标志物(包括5-HT、GABA和NOS)与人特异性标志物SC121的的共表达(图6H、9I和9J)。这些移植研究表明，hESC-衍生的肠NC前体在EDNRBs -l/s-l的结肠内广泛迁移，并且能够改善宿主动物的存活。
这些发现证明野生型hPSC-衍生的ENS前体可以再增殖于HD小鼠的结肠。然而，HD-致病的突变通常以细胞自主方式影响ENS前体的迁移3,24。因此，开发用于HD的患者匹配的细胞疗法可能需要互补的遗传或药理学策略以克服移植前ENS前体迁移中的缺陷。由于HD患者的致病性遗传缺陷通常不为人所知或很复杂3,25，并且考虑到需要快速治疗HD儿童，移植前的基因矫正可能不是一个有效的选择。因此，发明人评估了hPSC-衍生的ENS前体是否可以用于模拟HD并且充当筛选可以克服疾病相关迁移缺陷的候选化合物的平台。作为第一步，使用基于CRISPR/Cas的基因靶向技术26,27建立具有EDNRB中纯合功能丧失突变的等基因hESC系(图9A、9B和10A)。EDNRB中功能缺失突变是一部分HD患者中众所周知的遗传原因28。肠NC前体可以以与EDNRB-突变型和对照系相当的效率得到(图9C)。然而，与WT非靶向等基因系相比，来自四种EDNRB-/-克隆的CD49D+肠NC前体在划痕检定中HD-相关ENS表型的建模方面显示出显著的迁移缺陷29,30(图10B和10C)。发明人接下来评估了与野生型ENC相比，EDNRB-/- ENC是否显示出细胞增殖或存活的主要差异。在重新铺板后24小时(在划痕检定中评估的时间点)，未观察到任一检定的显著差异(图9D和9E)。到72小时，EDNRB-/- ENC确实显示减少的增殖，而细胞生活力保持不受影响(图9D和9E)。
进行小分子筛选以鉴定能够拯救在EDNRB突变型肠NC前体中观察到的迁移缺陷的化合物(图10D和11)。筛选由FDA批准的化合物组成的1280种化合物的库(PrestwickChemical)，以便于将来的转化。将结果分成无效果、具有毒性作用、具有中等作用或强烈作用的化合物(图10D和12A-12C)。命中物通过在非-HTS条件下重复划痕检定来进一步验证(图12D)，并选择具有可重复强烈作用的化合物用于进一步继续。在那些经验证的化合物中，特别关注的是分子胃酶抑素A，其显示对EDNRB-/- hESC衍生的NC前体的迁移缺陷的剂量依赖性、接近完全的拯救(图10E)。胃酶抑素A是已知的酸性蛋白酶和各种信号传导通路包括ERK和NFAT1c的抑制剂31。在潜在的胃酶抑素靶标中，BACE2因为RNAseq数据显示在hESC-衍生的NC谱系中上调(图13A)而得到探究，并且因为最近显示BACE-2调节NC衍生物在发育的斑马鱼胚胎中的迁移32。为了解决BACE2是否介导胃酶抑素A的作用，测试了靶向BACE2的结构不相关的小分子的作用。暴露于BACE抑制剂IV拯救划痕检定中的迁移缺陷(图10F和10G)，类似于胃酶抑素A。此外，使用4种不同siRNA的BACE2敲低确认了抑制BACE-2拯救EDNRB-/-细胞中的迁移缺陷(图10H、10I和13B)。最后，发明人测试了体外胃酶抑素A暴露(如图10J所示)是否足以拯救EDNRB-/- ENC前体的体内迁移行为。衍生自EDNRB-/-细胞的NC前体在移植入成年结肠后表现出显著的体内迁移缺陷(图10K和10L)。相比之下，在移植前用胃酶抑素A预处理72小时的EDNRB-null前体显示出体内迁移行为的显著拯救(图10K、10L和13C)。有趣的是，用EDNRB的药理学抑制剂处理的野生型衍生的ENC前体显示出体外和体内类似的迁移缺陷(图13A-13C)，进一步支持EDNRB在人ENC迁移和HD中的作用(图13D-13F)。
讨论
本实施例中描述的研究描述了从人ESC中衍生和预期地纯化肠NC前体的有效策略。与模式生物1,3的研究一致，证明了hESC-衍生的肠NC产生ENS特有的广泛的神经递质表型。ENS中这种显著的神经元亚型多样性不同于感觉神经、交感神经或副交感神经PNS谱系，其主要分别产生谷氨酸能、儿茶酚胺能或胆碱能神经元。在体外模拟人ENS发育的能力应当能够大规模产生限定的人肠神经元亚型，这种技术目前不能从任何其它人细胞来源获得。例如hPSC-衍生的肠5HT-神经元可以充当模拟CNS-作用药物如Prozac的GI副作用的工具33。
主要关注hESC-衍生的肠NC谱系在HD中的潜在细胞治疗应用。最显著的发现之一是人肠NC前体在成年宿主结肠中具有广泛的体内迁移潜力。虽然大多数NSG小鼠(总共102只移植动物)的体内研究限于5-6周的存活期，但在移植后3个月或4个月分析的动物显示出相当的体内特性，没有任何肿瘤形成的证据或其它与移植相关的不良反应。该细胞的治疗潜力通过它们拯救EDNRBs-l/s-l小鼠存活的能力得以说明。细胞广泛植入的潜力可能能够永久性、真正地修复肠的无神经节部分。
胃酶抑素A和BACE2抑制在拯救HD-相关迁移缺陷中的鉴定代表了在药物开发中使用hESC-衍生的肠NC前体的概念验证。BACE-2抑制迁移的机理仍有待阐明。BACE蛋白酶的可能靶标包括先前在NC谱系迁移中密切关联34-36的神经调节蛋白和ErbB受体。目前BACE抑制剂正在临床开发中用于各种适应症，包括治疗阿尔茨海默病37。BACE抑制剂的治疗潜力在HD的小鼠模型中测试。例如，测试了这些化合物是否能够独立于任何基于细胞的干预而直接调节内源性前体。这样的策略可能能够预防妊娠期间的神经节细胞缺失症或靶向修复出生后阶段的肠神经元功能。本实施例中描述的研究，结合胃酶抑素A作为新辅助治疗以能够改善EDNRB-/-肠NC前体的迁移，而得到关注。胃酶抑素A预处理是否能够拯救HD小鼠中的致死性或其它疾病相关表型得以测试。这些发现提出的前景是，化合物能够增强肠NC前体在各种HD-相关遗传缺陷中的迁移。总之，这些研究提出了一种有效的分化策略，其能够接近人ENS发育，并建立HD的新的基于细胞和药物的疗法。人PSC代表了一个探索人类健康和疾病“第二大脑1”的有希望的平台。
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本文引用各种专利和其它出版物，其内容整体并入本文以供参考。
序列表
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<120> 在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发（Cell-Based Treatment And Drug Discovery In Hirschsprung'sDisease
Enabled By Pluripotent Stem Cell-Derived Human Enteric Neural
Crest Lineages）
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<400> 4
gtcaggcggg aagcctctct 20

Claims (158)

1.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
4.根据权利要求3所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天。
5.根据权利要求4所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述干细胞群体在从其与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约第11天或之后已分化为表达一种或多种所述肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其包括使所述干细胞群体与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天时段内。
10.根据权利要求9所述的方法，其包括使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天。
11.根据权利要求9所述的方法，其包括使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在所述群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂使用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)减少。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
16.据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、FGF信号传导的激活剂、Wnt激活剂、及其组合。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其包括使所述细胞群体与一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
20.根据权利要求17所述的方法，其包括使所述细胞群体与两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述迷走神经嵴图式形成的特征在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种区域特异性HOX基因选自HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述分化细胞群体还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述干细胞是人干细胞。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述人干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、上胚层干细胞、和F-class多能干细胞。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其还包括使所述分化细胞群体经受有利于所述分化细胞成熟为表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体的条件。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述有利于所述分化细胞成熟为所述肠神经元群体的条件包括在合适的细胞培养基中培养所述分化细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种增强肠神经嵴(ENC)前体成熟为肠神经元的分子。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和Wnt激活剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述生长因子选自FGF信号传导的激活剂、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、和抗坏血酸。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述分化细胞在包含所述一种或多种FGF信号传导激活剂和所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的所述合适的细胞培养基中培养约4天。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导激活剂选自FGF2、FGF4、FGF8、和FGF7。
39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
40.表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体，其中所述分化细胞群体在以下之后衍生自干细胞群体：
使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且
进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天。
41.根据权利要求40所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天。
42.根据权利要求40或41所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
43.根据权利要求42所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触是在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天。
44.根据权利要求43所述的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触是在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的分化细胞群体，其中所述干细胞群体在其与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触后约第11天或之后已分化为表达一种或多种所述肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与一种或多种SMAD信号传导抑制剂接触。
47.根据权利要求46所述的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内。
49.根据权利要求48所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触是在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天。
50.根据权利要求48所述的分化细胞群体，其中所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天。
51.根据权利要求40-50中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
53.根据权利要求40-52中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂使用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)减少。
54.根据权利要求40-53中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
55.根据权利要求40-54中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、及其组合。
56.根据权利要求40-54中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
57.根据权利要求56所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
58.根据权利要求57所述的分化细胞群体，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
59.根据权利要求56所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触。
60.根据权利要求59所述的分化细胞群体，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt激活剂。
61.根据权利要求56或60所述的分化细胞群体，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
62.根据权利要求56或60所述的分化细胞群体，其中所述Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
63.根据权利要求40-62中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
64.根据权利要求40-63中任一项所述的分化细胞群体，其中所述迷走神经嵴图式形成的特征在于一种或多种区域特异性同源盒(HOX)基因的表达。
65.根据权利要求64所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种区域特异性HOX基因选自HOXB2、HOXB3、HOXB4、和HOXB5。
66.根据权利要求40-65中任一项所述的分化细胞群体，其中所述分化细胞群体还表达一种或多种SOX10+神经嵴谱系标志物。
67.根据权利要求66所述的分化细胞群体，其中所述SOX10+神经嵴谱系标志物是CD49D。
68.根据权利要求40-67中任一项所述的分化细胞群体，其中所述干细胞是人干细胞。
69.根据权利要求40-67中任一项所述的分化细胞群体，其中所述人干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、上胚层干细胞、和F-class多能干细胞。
70.一种组合物，其包含权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体。
71.表达一种或多种肠神经元标志物的体外分化细胞群体，其中所述分化细胞群体衍生自权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
72.根据权利要求71所述的分化细胞群体，其中在合适的细胞培养基中培养所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体后，所述分化细胞群体衍生自所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
73.根据权利要求71或72所述的分化细胞群体，其中在合适的细胞培养基中培养所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体至少约1天后，所述分化细胞群体衍生自所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
74.根据权利要求73所述的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子。
75.根据权利要求74所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种增强ENC前体成熟为肠神经元的分子选自生长因子和Wnt激活剂。
76.根据权利要求75所述的分化细胞群体，其中所述生长因子选自FGF信号传导的激活剂、GDNF、和抗坏血酸。
77.根据权利要求76所述的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂。
78.根据权利要求77所述的分化细胞群体，其中在包含所述一种或多种FGF信号传导激活剂和所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的合适的细胞培养基中培养所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体约4天后，所述分化细胞群体衍生自所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
79.根据权利要求72-76中任一项所述的分化细胞群体，其中所述合适的细胞培养基包含GDNF和抗坏血酸。
80.根据权利要求79所述的分化细胞群体，其中在包含GDNF和抗坏血酸的合适的细胞培养基中培养所述表达所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体约10天、约25天、或约45天后，所述分化细胞群体衍生自所述表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
81.根据权利要求76-78中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种FGF信号传导激活剂选自FGF2、FGF4、FGF8、和FGF7。
82.根据权利要求76-78中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
83.根据权利要求71-82中任一项所述的分化细胞群体，其中所述一种或多种肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
84.一种组合物，其包含权利要求71-83中任一项所述的表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体。
85.一种预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症的方法，其包括向患有肠神经系统病症的受试者施用有效量的以下中的一种：
(a)权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体；
(b)权利要求70所述的组合物；
(c)权利要求71-83中任一项所述的表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体；和
(d)权利要求84所述的组合物。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
87.根据权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
88.根据权利要求87所述的分化细胞群体，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
89.权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体在制造用于预防和/或治疗肠神经系统病症的药物中的用途。
90.根据权利要求89所述的用途，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
91.根据权利要求70所述的组合物，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
93.根据权利要求71-83中任一项所述的表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
94.根据权利要求93所述的细胞群体，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
95.权利要求71-83中任一项所述的表达一种或多种肠神经元标志物的细胞群体在制造用于预防和/或治疗肠神经系统病症的药物中的用途。
96.根据权利要求95所述的用途，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
97.根据权利要求84所述的组合物，其用于预防和/或治疗受试者的肠神经系统病症。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述肠神经系统病症是先天性巨结肠症。
99.一种鉴定适于预防和/或治疗先天性巨结肠症、先天性巨结肠症-相关遗传缺陷、和/或另一种肠神经系统病症的化合物的体外方法，其包括鉴定能够拯救至少一种由细胞群体递呈的迁移缺陷的化合物，所述细胞群体选自权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体、权利要求71-83中任一项所述的表达一种或多种肠神经标志物的细胞群体、及其组合，其中预分化的干细胞包含内皮素B型受体(EDNRB)中的纯合功能丧失突变。
100.根据权利要求99所述的方法，其包括：
(a)提供(i)所述细胞群体，和(ii)测试化合物；
(b)使所述细胞群体与所述测试化合物接触；和
(c)测量所述细胞群体的迁移行为。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述细胞群体是权利要求40-69中任一项所述的表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞群体。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述细胞群体与所述测试化合物接触至少约6小时、至少约12小时、或至少约24小时。
103.一种用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包含：
(a)一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、
(b)一种或多种Wnt信号传导激活剂、
(c)一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子、和
(d)用于诱导所述干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天的用法说明。
104.根据权利要求103所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触约6天的用法说明。
105.根据权利要求103或104所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内的用法说明。
106.根据权利要求105所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起至少约2天的用法说明。
107.根据权利要求106所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约4天的用法说明。
108.根据权利要求103-107中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种SMAD信号传导抑制剂。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂同时接触的用法说明。
110.根据权利要求103-109中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天时段内的用法说明。
111.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约2天的用法说明。
112.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触在所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触的同一天的用法说明。
113.根据权利要求103-112中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。
114.根据权利要求108-113中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种SMAD信号传导抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。
115.根据权利要求103-114中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂使用于激活Wnt信号传导的糖原合酶激酶3β(GSK3β)减少。
116.根据权利要求103-115中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种Wnt信号传导激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。
117.根据权利要求103-116中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自视黄酸、视黄醇、视黄醛、全反式视黄酸、1,3-顺式视黄酸、阿利维A酸、阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林、FGF信号传导的激活剂、Wnt激活剂、及其组合。
118.根据权利要求103-116中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子选自FGF信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、及其组合。
119.根据权利要求117所述的试剂盒，其包含一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子。
120.根据权利要求119所述的试剂盒，其中所述一种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是视黄酸。
121.根据权利要求118所述的试剂盒，其包含两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子。
122.根据权利要求121所述的试剂盒，其中所述两种或更多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子是一种或多种FGF信号传导激活剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂。
123.根据权利要求122所述的试剂盒，其中所述FGF信号传导的激活剂选自FGF2、FGF4、FGF7、和FGF8。
124.根据权利要求122所述的试剂盒，其中所述Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021和WNT3A。
125.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天，以产生表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内。
127.表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的体外分化细胞群体，其中所述分化细胞群体在以下之后衍生自干细胞群体：使干细胞群体与有效量的一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂和一种或多种Wnt信号传导激活剂接触，并且进一步使所述细胞群体与有效量的一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天，其中所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内。
128.根据权利要求127所述的分化细胞群体，其中所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触发生在所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触开始约4天时段内。
129.一种用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包含(a)一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂、(b)一种或多种Wnt信号传导激活剂、(c)一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子、和(d)用于诱导所述干细胞分化为表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物的分化细胞群体的说明书，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子的最初接触在从所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触起约8天时段内，并且使所述细胞群体与所述一种或多种诱导迷走神经嵴图式形成的分子接触至少约2天、约2天至约20天、或约2天至约6天的用法说明。
130.根据权利要求129所述的试剂盒，其中所述说明书包含使所述细胞群体与所述一种或多种Wnt信号传导激活剂的最初接触在从所述干细胞群体与所述一种或多种TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的最初接触起约4天时段内的用法说明。
131.一种包含体外分化细胞群体的组合物，
其中至少约70％的所述细胞群体表达一种或多种肠神经嵴谱系标志物，并且
其中少于约15％的所述细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
132.根据权利要求131所述的组合物，其中所述肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
133.根据权利要求131或132所述的组合物，其中所述干细胞标志物选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的组合物，其中所述CNS标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
135.根据权利要求131-134中任一项所述的组合物，其中所述CNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
136.根据权利要求131-135中任一项所述的组合物，其中所述MNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
137.根据权利要求131-136中任一项所述的组合物，其中所述神经元细胞标志物选自TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
138.根据权利要求131-137中任一项所述的组合物，其中所述间充质前体标志物选自SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
139.根据权利要求131-138中任一项所述的组合物，其包含约1x 104至约1x 1010个表达所述一种或多种肠神经嵴谱系标志物的细胞的群体。
140.一种包含体外分化细胞群体的组合物，
其中至少约70％的所述细胞群体表达一种或多种肠神经元标志物，并且
其中少于约15％的所述细胞群体表达一种或多种选自以下的标志物：干细胞标志物、肠神经嵴谱系标志物、CNS标志物、颅神经嵴(CNC)标志物、有黑素细胞能力的神经嵴(MNC)标志物、神经元细胞标志物、和间充质前体标志物。
141.根据权利要求140所述的组合物，其中所述肠神经嵴谱系标志物选自PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5和ASCL1。
142.根据权利要求140或141所述的组合物，其中所述肠神经元标志物选自Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
143.根据权利要求140-142中任一项所述的组合物，其中所述干细胞标志物选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4和SSEA3。
144.根据权利要求140-143中任一项所述的组合物，其中所述CNS标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
145.根据权利要求140-144中任一项所述的组合物，其中所述CNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
146.根据权利要求140-145中任一项所述的组合物，其中所述MNC标志物选自PAX6、NESTIN、波形蛋白、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2和SOX1。
147.根据权利要求140-146中任一项所述的组合物，其中所述神经元细胞标志物选自TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、P物质、VIP、NPY、GnRH、和CGRP。
148.根据权利要求140-147中任一项所述的组合物，其中所述间充质前体标志物选自SMA、波形蛋白、HLA-ABC、CD105、CD90和CD73。
149.根据权利要求140-148中任一项所述的组合物，其包含约1x 105至约1x 107个表达所述一种或多种肠神经元标志物的细胞的群体。
150.一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向受试者施用有效量的β-分泌酶(BACE)的抑制剂。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述BACE的抑制剂选自BACE2的抑制剂、LY450139、LY2886721、LY2811376、Verubecestat(MK-8931)、和AZD3839。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述BACE的抑制剂是BACE2的抑制剂。
153.根据权利要求151所述的方法，其中所述BACE2的抑制剂是BACE抑制剂IV(BACE抑制剂C3)。
154.一种预防和/或治疗ENS病症(例如HD)的方法，其包括向受试者施用有效量的酸性蛋白酶的抑制剂。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述酸性蛋白酶的抑制剂选自胃酶抑素A、利托那韦、茚地那韦、占吉仑、阿利吉仑和LY-450139。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述酸性蛋白酶的抑制剂是胃酶抑素A。
157.BACE抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
158.酸性蛋白酶的抑制剂用于预防和/或治疗ENS病症的用途。
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