CN109996870A - 从人多能干细胞产生中脑特异性类器官 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了在培养中衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：(a)培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；(b)培养来自(a)的所述神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；(c)在细胞外基质中包埋和培养来自(b)的所述中脑区域化组织以获得神经上皮组织；和(c)培养来自(c)的所述神经上皮组织以获得中脑样类器官。本文还公开了适用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：(a)TGF‑β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和(b)WNT信号激活剂；适用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：(a)TGF‑β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；(b)WNT信号激活剂；(c)刺猬信号蛋白；和(d)成纤维细胞生长因子；适用于衍生和维持神经上皮组织的培养基，包含：(a)刺猬信号蛋白；和(b)成纤维细胞生长因子；以及适用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：(a)神经营养因子；(b)抗坏血酸；和(c)cAMP依赖性通路的激活剂。

Description

从人多能干细胞产生中脑特异性类器官
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月14日提交的新加坡临时申请No.10201601965P的优先权，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
发明领域
本发明一般涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及产生类器官的方法。
背景技术
对功能性人脑组织的限制性接触机会是了解人类神经系统发育及其在脑部疾病中功能障碍的最大挑战。最近，人类多能干细胞(hPSCs)的快速研究进展正在克服这一挑战，hPSC包括例如胚胎干细胞(hESCs)和诱导的多能干细胞(iPSCs)，它们可以从任何个体产生，并且可以被引导体外分化成代表所有胚层的衍生物，包括神经元细胞。在过去的几十年中，人类多能干细胞向神经元的分化方案完全基于条件下的二维(2D)方法，这些方法无法概括发展中的三维(3D)神经系统的细胞结构或完整的体内神经回路的复杂性和功能性。以前的报告证明了婴儿大脑的产生适合于研究发育障碍。然而，成熟脑类器官的产生仍然具有挑战性。
由于在再生医学中以及在鉴定影响中脑多巴胺能(mDA)神经元的疾病的机制中的兴趣日益增加，从人多能干细胞产生中脑多巴胺能神经元一直是一个激烈的研究领域。然而，它主要使用传统的2D方法产生中脑多巴胺能神经元。虽然这些研究肯定会推动该领域的发展，但尚不清楚是否可以开发出针对中脑的3D类器官模型。
因此，需要开发用于产生脑部分的类器官培养物例如皮质类器官、端脑类器官和小脑组织的3D系统。
发明内容
在一个方面，本发明涉及衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：(a)培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；(b)培养来自(a)的神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；(c)在细胞外基质中包埋和培养来自(b)的中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；和培养来自(c)的神经上皮组织以获得中脑样类器官。
另一方面，本发明涉及通过本文公开的方法获得的分离的中脑样类器官。
另一方面，本发明涉及用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和(b)WNT信号激活剂。
另一方面，本发明涉及用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；(b)WNT信号激活剂；(c)刺猬信号蛋白；(d)成纤维细胞生长因子。
另一方面，本发明涉及用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，包含：(a)刺猬信号蛋白；和(b)成纤维细胞生长因子。
另一方面，本发明涉及用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：(a)神经营养因子；(b)抗坏血酸；和(c)cAMP依赖性通路的激活剂。
附图的简要说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，其中：
图1提供了显示来自人多能干细胞(hPSC)的人中脑样类器官(hMLO)的产生和表征的数据。(A)显示了说明产生人中脑样类器官的总体策略的示意图。微分干涉对比显微镜(DIC)图像说明了每个阶段细胞的典型形态。SBNC：SB431542、头蛋白和CHIR99021；SF：SHH-C25II和FGF8；BGAC：BDNF、GDNF、抗坏血酸和db-cAMP。比例尺＝500μm。(B)左：显示在第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片图像，对Ki67和MAP2染色。右图：显示图像左部分所示白色框的放大视图的显微图像。左比例尺＝200μm。右比例尺＝10μm。(C)显示了柱状图，其显示通过荧光激活细胞分选(FACS)分析定量的第25天和第35天人中脑样类器官中存在的Ki67+和MAP2+细胞的百分比。n＝3，*p<0.05，使用学生t检验确定。(D)显示在神经上皮(NE)的顶端区域的EdU、OTX2和aPKC的免疫染色的显微照片。比例尺＝20μm。(E)显示柱状图，其描绘了神经上皮(NE)顶端区域的OTX2+和OTX+/EdU+细胞的百分比；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝7。(F)显示人中脑样类器官中的层状结构的示意图(bas.：基底；ap.：顶端；MZ：外套层；IZ：中间区；VZ：腹侧区)。(G)显示了针对MAP2和MASH1染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝50μm。(H)显示描绘了第35天人中脑样类器官的EdU标记物和OTX2免疫染色的显微照片。比例尺＝20μm。(I)显示了针对NURR1和MASH1染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝20μm。(J)显示在第4天、14天和24天对FOXA2(底板祖细胞)和OTX2(中脑中间祖细胞)染色的人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝50μm。(K)显示了描绘了在第45天人中脑样类器官的FOXA2和酪氨酸羟化酶(TH)的免疫染色的显微照片图像。比例尺＝50μm。(K)中显示的染色的定量显示在(L)中的柱状图中；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。(M)显示了针对LMX1A和TH标记物的第45天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝50μm。(M)的标记物的定量显示在(N)中的柱状图中；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。(O)显示描绘了在第60天用DAT和TH抗体对外套层(MZ)细胞进行免疫染色的结果的显微照片。放大视图(白色框区域被放大在图像的右侧)以说明一些细胞对于DAT和TH是双重阳性的。(O)中提供的免疫染色的定量显示在(P)中的柱状图中；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。比例尺＝20μm。
图2显示了人中脑样类器官(hMLO)的转录表征结果。(A)显示了热图，其显示了通过倍数变化分类的二维多巴胺能神经元(2D-DA)神经元和人中脑样类器官之间的差异表达基因。(B)显示了热图和来自二维多巴胺能神经元(2D-DA)神经元、人中脑样类器官(hMLO)和胎儿中脑的表达数据的聚类。使用2D-DA神经元和人中脑样类器官之间的差异表达基因的归一化基因表达的相关性来估计样品之间的距离。(C)显示维恩图，其显示与2D-DA神经元相比，在人中脑样类器官和胎儿中脑中显示上调或下调的基因的重叠。(使用Fisher精确检验估计统计学显著性)。(D)显示热图，其显示通过倍数变化分类的在2D-DA神经元和人中脑样类器官和人类胎儿中脑之间差异表达的基因，(E)显示在胎儿中脑和hMLO中表达但在2D-DA神经元中不表达的示例性基因的图谱，(F)中显示的图谱是通常在胎儿中脑、人中脑样类器官和2D-DA神经元中表达的实例性基因。通过RNA测序测量示例性基因的表达水平。Y轴表示归一化的读数。黑色区域表示归一化的读取计数，灰色区域表示映射到两个外显子的分离读取。
图3显示了人中脑样类器官(hMLO)中神经黑色素(NM)的鉴定结果。(A)提供显微照片图像，其显示在第112天人中脑样类器官中的暗颗粒的外观。值得注意的是，暗色素位于神经元区室(带尾箭头(arrows))以及细胞外区室(箭头(arrowheads))内。比例尺＝200μm。(B)显示Fontana-Masson染色的显微图像，用于揭示人中脑样类器官中的神经黑色素样颗粒。显示神经黑色素样颗粒存在于细胞内和细胞外区室(分别为蓝色和黑色箭头)。黑色比例尺＝100μm。灰色比例尺＝20μm。B'(左下)是B中区域的放大视图。B”(右)是B'中区域的放大视图。(C)显示人死后中脑组织的Fontana-Masson染色的显微照片，显示人中脑组织中存在神经黑色素样颗粒。标记为SN的区域是黑质(Substantia nigra)。黑色比例尺＝1mm。灰色比例尺＝200μm。C'(右上)是C中的区域的放大视图，其是通过镶嵌较大区域的多个图像而生成的。C”(右下)是C'区域的放大视图。(D)显示量化人中脑样类器官中的神经黑色素含量的测量的柱状图(n＝3，分别针对每个时间帧)。(E)显示在第122天人中脑样类器官中的分离的神经黑色素(NM)颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。(F)显示了人死后中脑组织中的分离的神经黑色素(NM)颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。比例尺＝200nm。(G)显示明视场显微镜图像和Fontana-Masson染色切片的显微照片，显示通过L-DOPA(50μM)和多巴胺(50μM)处理加速神经黑色素样颗粒的形成。灰色比例尺＝2mm。黑色比例尺＝100μm。G'、G”和G”'是黑色矩形的高倍放大图像。(H)显示明视场显微镜图像和Fontana-Masson染色切片的显微照片，显示与人中脑样类器官(左栏)相比，在鼠中脑样类器官(MLO；右栏)中未观察到神经黑色素样颗粒。值得注意的是，人中脑样类器官(hMLO)和鼠中脑样类器官(mMLO)均含有TH阳性中脑多巴胺能(mDA)神经元(下图)。灰色比例尺＝2mm。黑色比例尺＝500μm。白色比例尺＝20μm。
图4显示了来自人中脑样类器官(hMLO)的多巴胺能神经元的功能表征的结果。(A)显示了说明用于原位研究人中脑样类器官[记录(Rec.)和电刺激(Stim.)]的电生理活动的实验装置的示意图。(B)显示代表性迹线记录，显示人中脑样类器官内的神经元中存在电压依赖性Na+和K+电流。电生理记录开始时的灰色框突出显示Na+通道依赖性内向电流的存在。(C)显示了线图，显示了记录的Na+和K+电流的平均电流-电压关系(I/V)曲线(分别为第33-50天和第65-84天，n＝12和14)。(D)显示从通过电流注入诱发的第35天人中脑样类器官内的神经元记录的多个动作电位(AP；下图)的代表性迹线(上图)。(E)显示了线图，描绘了人中脑样类器官内的神经元的响应于特定电流脉冲振幅而产生的动作电位数(Aps)(分别为第33-50天和第65-84天，n＝12和14)。(F)显示电生理学记录，显示第80天从人中脑样类器官内的神经元记录的自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和自发抑制性突触后电流(sIPSC)(在第一记录中显示(1))。这些sEPSC和sIPSC分别受CNQX(AMPA型谷氨酸受体拮抗剂)和AP5(NMDA型谷氨酸受体拮抗剂；结果显示在第二记录(2)中)和木防己苦毒素(PTX，GABAA阻断剂；结果显示在第三个记录(3)中)阻断。(G)显示了描绘在第50天人中脑样类器官中记录的电刺激诱发的突触反应的示意图。灰点表示电刺激的开始。(H和I)显示自发动作电位(Aps)的代表性迹线和频率。(J)显示了兴奋性去极化反跳的示例性迹线。兴奋性去极化反跳的特征在于超极化脉冲后的瞬时去极化，由于存在独特的离子通道，这对于黑质多巴胺能神经元是独特的。插图显示了各个迹线的放大视图。(K)显示了起搏器样射击的代表性迹线和喹吡罗对射频的影响。(K)中所示现象的统计分析在(L)所示的柱状图中提供(*p＝0.021，配对t检验，n＝3)。(M)显示在记录期间充满生物胞素的神经元的酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色的显微照片，表明记录的神经元表达TH。比例尺＝5μm。(N)通过高效液相色谱(HPLC)[hMLO4w、5w、7w和9w(n＝4)测量人中脑样类器官(hMLO)和人脑类器官(hCO)中的多巴胺hMLO13w、hCO 7w和27w、w表示周(n＝3)]。
图5显示了人中脑样类器官(hMLO)的表征结果，以及人中脑样类器官(hMLO)中脑多巴胺能(mDA)神经元的表征结果。(A)显示了描绘定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)也称为实时逆转录酶PCR结果的柱状图。针对FOXA2、OTX2、CORIN和LMX1A(中脑祖细胞标记物)分析从用SBNC(SB431542、头蛋白和CHIR99021)或SBNC+SF(SHH-C25II和FGF8)处理的人胚胎干细胞(hESCs)或人中脑样类器官(hMLO)解离的细胞。(B)显示了微分干涉对比(DIC)图像，其示出了每个阶段的人中脑样类器官的典型形态，如各个图像的顶部所指示的。比例尺＝2mm。(C)显示了圆形图，显示了在每个阶段人中脑样类器官的生长速率，如图(D)右侧所示，图(D)显示了在针对aPKC和MAP2染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片图像。值得注意的是，在人中脑样类器官中存在多个圆形玫瑰花结。比例尺＝200μm。(E)显示在针对aPKC和EdU染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片，显示增殖的EdU阳性细胞位于神经上皮的顶面。比例尺＝20μm。(F)显示了针对LMX1A和OTX2标记的第14天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。(F)中所示染色的定量表示在(G)中所示的柱状图中；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。比例尺＝50μm。(H)显示针对LMX1A和FOXA2染色的第45天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片图像。比例尺＝20μm。(H)中所示染色的定量显示在(I)中的柱状图中；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。(J)显示定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)(也称为实时逆转录酶PCR)分析从hMLO解离的TH、MAP2、NURR1、LMX1A、EN1、EN2和PITX3的细胞的结果。每个都以柱形图呈现。(K)显示在第35天位于MZ中的酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的显微图像。左比例尺＝100μm。右比例尺＝10μm。箭头指示TH和MAP2双阳性细胞。(L)显示在第35天和第60天从人中脑样类器官解离的细胞的流式细胞术分析结果，以散点图表示。(M)显示(L)中存在的中脑多巴胺能(mDA)神经元(TH+/MAP2+)百分比的定量，显示在第60天显著增加；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。(L)左下方：
针对一抗染色的人胚胎干细胞(hESC)细胞和二抗染色的人胚胎干细胞(hESC)细胞的流式细胞术分析。(L)右下方：针对仅用二抗染色的人中脑样类器官来源细胞的流式细胞术分析。阈值门基于用于量化表达TH和MAP2的细胞的百分比的阴性对照。(N)显示在第60天人中脑样类器官的外套层(MZ)内G蛋白激活的内向整流钾通道2(GIRK2)和酪氨酸羟化酶(TH)双阳性神经元的显微图像，包括较高放大倍数的视图以更好地说明共定位。比例尺＝10μm。(O)显示在第60天对酪氨酸羟化酶(TH)和Calbindin(Calb，针对多巴胺能(DA)神经元的A10亚型的标记物)进行免疫染色的人中脑样类器官的冷冻切片的显微图像，包括最左图中的白色框的较高放大倍数的视图，图示说明对TH或Calb为阳性的细胞(1)，和对TH和Calb均为双阳性的细胞(2)。比例尺＝10μm。
图6显示了2D-DA神经元的表征结果，(A-D)人中脑样类器官(hMLO)的转录特征(EF)，以及人中脑样类器官的区域和细胞特征(hMLO；GI)。(A)显示针对多巴胺能(DA)神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)和FOXA2的第25天二维多巴胺能(2D-DA)神经元的免疫染色的显微照片。(B)显示柱状图，其描绘了第25天和第45天TH+/MAP2+细胞的定量；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝5。比例尺＝20μm。(C)显示柱状图，描绘了针对EN1、EN2、LMX1A、NURR1、FOXA2和TH的2D-DA神经元的定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)(也称为实时逆转录酶PCR)分析的结果，每个标记物的结果显示在它们自己的柱状图中。(D)显示柱状图，其显示通过高效液相色谱(HPLC)测量的2D神经元中的多巴胺含量(n＝3)。(E)显示维恩图，表明与2D生长的人多巴胺能(DA)神经元相比，人中脑样类器官和胎儿中脑中上调基因和下调基因的重叠。(使用Fisher精确检验估计统计显著性；相对于图2C)。(F)显示来自成人前脑、成人后脑、成年中脑、胎儿中脑、人中脑样类器官和2D-DA神经元(2D-DA神经元-1：数据未显示RNA-seq数据；2D-DA神经元-2：基于(Lin et al.,2016)的RNA-seq数据)的RNA测序(RNA-Seq)数据的主成分分析(PCA)的结果。使用在所有样品中的标准化读数计数中具有最高方差(正则化对数转换)的前1000个基因计算PCA。对于该分析剔除组蛋白基因。(G)显示在针对OTX2(中脑标记物)和FOXG1(前脑标记物)染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝100μm。(H)显示在针对OTX2和GBX2(后脑标记物)染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。(I)显示在针对GABA(GABA能神经元标记物)、ChAT(胆碱能神经元标记物)和5-HT(5-羟色胺能神经元标记物)染色的第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片。比例尺＝50μm。
图7显示了在人中脑样类器官(hMLO)中分离的神经黑色素(NM)颗粒的表征结果和含有神经黑色素(NM)的细胞的转录表征的结果。(A)显示在成年小鼠皮肤组织的冷冻切片上进行的Fontana-Masson染色的显微照片，其显示出黑色素沉积物。左栏：阳性对照。A'(左下)是左上图中区域的放大图。右栏：通过去除Fontana-Masson染色的一种组分(氨硝酸银溶液)进行的阴性对照。A”(右下)是右上图中区域的放大视图。比例尺＝100μm。(B)显示在第15天和第30天人类大脑类器官的代表性差异干涉对比(DIC)显微镜图像。比例尺＝200μm。(C)显示在第70天用Fontana-Masson染色方法染色的人脑类器官(hCO)的冷冻切片的显微照片。注意到人脑类器官(hCO)中缺少神经黑色素(NM)样颗粒。比例尺＝100μm。(D和E)显示从第122天人中脑样类器官分离的神经黑色素(NM)颗粒的偏转和高度图像的结果。使用原子力显微镜(AFM)对固定的神经黑色素颗粒进行成像。(F)显示了图谱，显示使用原子力显微镜(AFM)沿a-a'轴(黑色)和b-b'轴产生的高度分布，如(E)中所示。所有处理的AFM图像的实际尺寸为2×2μm。(G)显示用载体(模拟物)和L-DOPA(50μM)处理10天的人脑类器官(hCO)的显微照片。显示人脑类器官未显示任何神经黑色素(NM)样颗粒或任何有色沉积物(相对于图3G)。比例尺＝2mm。(H)显示说明用于研究含神经黑色素(NM)的细胞的实验装置的示意图。(I)显示了第146天人中脑样类器官的代表性明场图像，其用于分选含神经黑色素(NM)的细胞。比例尺＝200μm。(J和K)显示在120-150天从人中脑样类器官解离的细胞的流式细胞术分析(FAC)的结果。(K)中显示的柱状图显示了在(J)中分选的含神经黑色素(NM)的细胞的百分比的定量。(L)显示用抗MAP2抗体和抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体对分选的含神经黑色素(NM)的细胞进行免疫染色的显微照片。比例尺＝50μm。(M)显示柱状图，其显示使用实时聚合酶链式反应(qPCR)对神经黑色素流式细胞术(NM FACS)分选后的MAP2+和TH+/MAP2+细胞定量的结果；平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)，n＝3。(N和O)显示基因表达图，其描绘了单细胞基因表达谱的结果以使用微流体动态阵列从第120-150天的人中脑样类器官中鉴定含有神经黑色素(NM)的中脑多巴胺能(mDA)神经元。在表达图的底部，各表达水平(显示为Ct值)被分别以灰度颜色编码(HK，管家基因；pan-NA，泛神经元基因；pan-DA，泛多巴胺能神经元基因；SNpc，黑质致密部相关基因；VTA，腹侧被盖区相关基因；PD，帕金森病相关基因)。
术语的定义
如本文所用，术语“类器官”是指小型化的并且在一些情况下，是在体外三维产生的器官的简化形式，其显示了逼真的和解剖学上正确的微观解剖学。它们衍生自一种或多种来自组织、胚胎干细胞或诱导的多能干细胞的细胞，其由于例如其自我更新和分化能力而能够在三维培养中自组织。
如本文所用，术语“类胚体”是指多能干细胞的三维聚集体。包含类胚体的多能细胞类型包括但不限于衍生自胚胎的胚泡期的胚胎干细胞(ESC)，所述胚胎来自例如小鼠(mESC)、灵长类动物和人(hESC)的来源。另外，类胚体可以由通过替代技术衍生的胚胎干细胞形成，包括体细胞核移植或体细胞的重编程以产生诱导的多能干细胞(iPS)。与以单层形式培养的ES胚胎干细胞相似，类胚体内的胚胎干细胞沿着三种胚系-内胚层、外胚层和中胚层-经历分化和细胞特化-其包含所有体细胞类型(其均为体内细胞类型，不包括种系细胞)。
如本文所用，术语“神经元谱系类胚体”是指多能干细胞具有产生或成为神经元的潜力的类胚体。
如本文所用，术语“中脑(midbrain)”，也称为间脑(mesencephalon)，是指脑的位于脑干内在大脑皮层下方后脑上方的一部分。
如本文所用，术语“中脑区域化组织”是指对中脑区域特异的组织。
如本文所用，术语“黑质”是指位于间脑(也称为中脑)中的脑结构，其在奖励和运动中起重要作用。Substantia nigra是拉丁语的“黑色物质”，反映了由于在这些较暗区域中存在的多巴胺能神经元中高水平的神经黑色素，黑质部分看起来比邻近区域更暗。虽然黑质在大脑切片中显示为连续带，但解剖学研究发现，它实际上由两部分组成，具有截然不同的连接和功能：根据Sano在1910年的分类，黑质致密部和黑质网状部。黑质致密部主要用作基底神经节电路的输入，为纹状体提供多巴胺。黑质网状部主要用作输出，将来自基底神经节的信号传递给许多其他脑结构。
如本文所用，术语“多巴胺”是指3,4-二羟基苯乙胺(IUPAC 4-(2-氨基乙基)苯-1,2-二醇)，其是儿茶酚胺和苯乙胺家族的有机化学品，其在大脑和身体中起着若干重要作用。它是通过从其前体化学物质L-DOPA的分子中除去羧基而合成的胺，其在脑和肾中合成。多巴胺也在植物和大多数多细胞动物中合成。在大脑中，多巴胺作为一种神经递质发挥作用-一种由神经元(神经细胞)释放的用于向其他神经细胞发送信号的化学物质。大脑包含几种不同的多巴胺通路，其中一种通路在奖励动机行为中起主要作用。大多数类型的奖励都会增加大脑中的多巴胺水平，许多成瘾药物会增加多巴胺的神经元活动。其他脑多巴胺通路参与运动控制和控制各种激素的释放。这些通路和细胞群形成神经调节的多巴胺系统。
如本文所用，术语“DAn”或“多巴胺能神经元”或“多巴胺神经元”是指脑中的投射神经元，其合成并释放神经递质多巴胺。这些多巴胺能神经元形成所谓的多巴胺能通路。多巴胺神经元具有在整个通路长度上运行的轴突。神经元的神经细胞密质部分产生多巴胺合成所需的酶，然后通过投射轴突传递到它们的突触目的地，在那里产生大部分多巴胺。由于暗色素黑色素的存在，黑质等区域中的多巴胺能神经细胞体往往会着色。多巴胺能通路涉及许多功能，例如执行功能、学习、奖励、动机和神经内分泌控制。
如本文所用，术语“NANOG”是指与未分化的胚胎干细胞的自我更新密切相关的转录因子。在人类中，该蛋白质由NANOG基因编码。
如本文所用，术语“Oct4”，也称为八聚体结合转录因子4或POU5F1(POU结构域，第5类，转录因子1)，是指人类中由POU5F1基因编码的蛋白质。Oct-4是POU家族的同源域转录因子。该蛋白质与未分化的胚胎干细胞的自我更新密切相关。因此，它经常被用作未分化细胞的标记物。Oct-4表达必须被严格控制；过多或过少都会导致细胞分化。
如本文所用，术语“抑制剂”是指能够降低、下调或在某些情况下完全停止靶分子活性的分子或化合物。抑制剂通常以其靶标为特征并命名；例如，与酶结合从而降低其活性的化合物被称为酶抑制剂。抑制剂可以是可逆的或不可逆的，这意味着就与其靶标的结合而言，该靶标结合可以随后被破坏(可逆)或不被破坏(不可逆)。例如，靶分子的抑制可以是竞争性的、反竞争性的、非竞争性的或混合的。相反，已知能够增加、上调或启动靶分子活性的分子或化合物称为活化剂。
如本文所用，术语“L-DOPA”，也称为左旋多巴或L-3,4-二羟基苯丙氨酸，是指制备为并用作人、某些动物和植物的正常生物学的一部分的氨基酸。在一些动物和人中，L-DOPA由氨基酸L-酪氨酸合成。L-DOPA是神经递质多巴胺、去甲肾上腺素(noradrenaline)和肾上腺素(adrenaline)的前体，统称为儿茶酚胺。此外，L-DOPA本身介导大脑和中枢神经系统释放神经营养因子。
具体实施方式
类器官是模仿器官组织和功能的细胞结构。与单细胞型培养相反，类器官由在空间上有组织的多种细胞类型组成。本公开证明了3D培养条件允许类器官的细胞解开多种细胞类型的自组织能力，这通过产生适当的生态位环境加强了特定细胞类型的更好的存活和成熟。因此，本公开描述了通过将人胚胎干细胞分化成中脑样类器官来产生能够重现中脑特征的类器官的方法。
可引导多能干细胞(PSC)有效分化成大部分同源的细胞类型，例如神经元。这些体外产生的神经元实现了下游研究和潜在的治疗应用。三维(3D)培养系统的最新进展导致与人脑的不同部分具有相似性的脑类器官的产生。本文公开了将人多能干细胞分化成包含不同神经元细胞层的大的多细胞类器官样结构的方法。重要的是，在其中，检测到电活性和功能成熟的中脑多巴胺能(mDA)神经元、多巴胺产生和神经黑色素样色素。外源性多巴胺前体的应用促进了神经黑色素样色素的积累。相反，在使用非3D方法产生的多巴胺能神经元或由小鼠胚胎干细胞产生的中脑样类器官中未检测到神经黑色素。因此，本文公开的3D方法产生了中脑样类器官，其概括了人类中脑的特征，这提供了能够研究人中脑和相关疾病的新系统。
因此，本文公开了衍生和维持中脑样类器官的方法，包括培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；培养来自(a)的神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；在细胞外基质中包埋和培养来自(b)的中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；培养来自(c)的神经上皮组织以获得中脑样类器官。
如本文所用，术语“干细胞”是指未分化的生物细胞，其能够分化成更特化的细胞并且能够分裂(通过有丝分裂)以产生更多的干细胞。干细胞存在于多细胞生物中。在哺乳动物中，存在两种广泛类型的干细胞：胚胎干细胞，其例如从胚泡的内细胞团中分离；和成体干细胞，其存在于各种组织中。在成体生物中，干细胞和祖细胞通过补充成体组织而作为身体的修复系统起作用。在发育中的胚胎中，干细胞可以分化成所有特化细胞-来自存在于胚胎发育的早期阶段的三个主要胚层(称为外胚层、内胚层和中胚层)中的任何一个-但也保持再生器官如血液、皮肤或肠道组织的正常更新。
人体中三种常见的、可获得的自体成体干细胞来源是：骨髓，需要通过收获细胞进行提取，通常来自股骨或髂嵴；脂肪组织(脂质细胞)，需要通过吸脂提取；和血液，需要提取，通常通过血液分离机。干细胞也可以在出生后从脐带血中取出。在所有干细胞类型中，自体采集涉及风险最小。根据定义，自体细胞是从自己的身体获得的。成体干细胞经常用于各种医学治疗(例如，骨髓移植)。现在可以使干细胞人工生长和转化(分化)成为具有与各种组织如肌肉或神经的细胞一致的特征的特化细胞类型。
任何哺乳动物干细胞均可根据本文公开的本发明方法使用，包括但不限于从脐带血、胎盘和其他来源分离的干细胞。干细胞可以从任何哺乳动物物种中分离，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猪、绵羊、牛、马、猴和人。在一个实例中，干细胞获自人。干细胞可以包括多能细胞，其是具有完全分化多样性的、自我更新并且可以在组织内保持休眠或静止的细胞。干细胞还可包括多能细胞或定向祖细胞。在一个实例中，本文公开的方法在不使用人胚胎干细胞的情况下进行。根据本发明，可以使用其他类型的多能细胞代替人胚胎干细胞。在另一个实例中，本文公开的方法在诱导的多能干细胞上进行。在又一个实例中，使用非人源胚胎干细胞进行本文公开的方法。
如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有分化成三个胚层中任何一个的潜力的干细胞：内胚层，例如，内部胃粘膜、胃肠道和肺部从内胚层发育；中胚层，例如肌肉、骨骼、血液和泌尿生殖器结构从中胚层发育；或外胚层，例如表皮组织和神经系统从外胚层发育。然而，值得注意的是，细胞多能性被认为是一个连续体，范围从可以形成胚体的每个细胞的完全多能细胞例如胚胎干细胞和诱导的多能干细胞到可以形成所有三个胚层的细胞但可能不具有完全多能细胞的所有特征的不完全或部分多能细胞。
细胞培养是细胞在模拟其自然环境然而在其自然环境之外的受控条件下生长的过程。细胞培养条件因细胞类型而异，但所需的人工环境通常由具有一种或多种底物的合适容器或提供必需营养素(例如氨基酸、碳水化合物、维生素和矿物质)以及细胞生长所需的生长因子、激素和气体(通常是CO2和/或O2)的一种或多种介质以及调节生理化学环境(例如，pH缓冲、渗透压、温度、湿度等)的一种或多种介质组成。大多数细胞需要在其上生长的表面或人工基质(也称为粘附或单层培养)，而其他细胞可以在培养基(也称为悬浮培养)中自由漂浮，通常在搅拌下(例如，滚瓶培养等)。在实践中，术语“细胞培养”是指，与其他类型的使细胞生长的培养诸如植物组织培养、真菌培养、微生物培养(细菌培养)和细胞用作例如病毒复制的宿主的病毒培养相比，培养来自多细胞真核生物尤其是动物细胞以及患病的人体组织(例如，HeLa细胞、PC3细胞和HEK293T细胞)的细胞。
用于细胞培养的细胞培养基通常包含至少以下项目：碳或碳水化合物源(例如葡萄糖或谷氨酰胺)，作为能量来源；氨基酸，用于蛋白质合成；维生素，促进细胞生存和生长；平衡的盐溶液，通常是各种离子的混合物以维持细胞内的最佳渗透压并作为各种辅助因子介导的反应(例如细胞粘附、酶促反应等)的辅助因子；pH指示剂(例如酚红；表示pH从中性变为碱性或酸性，通常表明存在营养物耗尽、污染、坏死细胞积聚等)和维持培养基中所需的pH的缓冲液(例如碳酸氢盐或HEPES缓冲液)。除了上面列出的组分之外，细胞培养基可以并且通常由本领域技术人员修改至他们在细胞培养中的期望要求。例如，对于体内某些细胞系的生长和维持需要使用胎牛血清或牛血清，但一些细胞系不需要使用，而在其他细胞系中，例如当细胞因子分析中需要血清饥饿细胞时，则避免使用。如本领域所定义，“确定的培养基”(也称为“化学成分确定的培养基”或“合成培养基”)是使用的所有化学品都是已知的并且不存在酵母、动物或植物组织的细胞培养基。
基本培养基是那些含有可能用于菌落生长的最低限度营养物且通常不含氨基酸的细胞培养基，并且通常用于“野生型”微生物生长。基本培养基也可用于选择或反选重组体或结合体。基本培养基通常含有碳源，碳源可以是诸如葡萄糖的糖或者诸如琥珀酸盐的能量较少的来源；各种盐，可能因细菌种类和生长条件而不同；这些通常提供必需的元素，如镁、氮、磷和硫，以使细菌合成蛋白质和核酸；和水。补充基本培养基是含有单一选定试剂通常是氨基酸或糖的基本培养基。该补充允许培养例如特定系的营养缺陷型重组体。
选择性培养基仅用于选定的微生物的生长。例如，如果微生物对某种抗生素(例如氨苄青霉素或四环素)具有抗性，那么可以将该抗生素添加到培养基中以防止其他不具有抗性的细胞生长。缺乏氨基酸如脯氨酸的培养基与例如不能合成它的大肠杆菌一起使用，在基因组学出现之前通常用于绘制细菌染色体。选择性生长培养基也用于细胞培养，以确保具有某些特性例如抗生素抗性或合成某种代谢物的能力的细胞的存活或增殖。通常，特定基因或基因的等位基因的存在赋予细胞在选择性培养基中生长的能力。在这种情况下，该基因被称为标记物。真核细胞的选择性生长培养基通常含有新霉素，以选择已用携带新霉素抗性基因作为标记物的质粒成功转染的细胞。丙氧鸟苷是该规则的一个例外，因为它用于特异性杀死携带其各自标记物即单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)的细胞。
细胞培养中细胞的标准环境生长条件通常是37℃的温度，5％的CO2含量和95％的湿度。通过使用例如培养箱可以实现和维持所有这些条件。如果需要，细胞培养基也可用于在细胞中产生某些条件，例如，在特定处理或分析方法之前细胞饥饿，要求细胞要被饥饿或离开培养基的某些组分(例如，无血清培养基)。
细胞培养可以在二维(2D)或三维(3D)设置中进行。二维细胞培养的实例是，但不限于，在任何标准细胞培养容器例如培养皿、6孔板、96孔板、培养瓶和滚瓶中的细胞培养。
有多种平台可用于促进三维细胞结构的生长，包括但不限于支架系统，如水凝胶基质和固体支架；以及无支架系统，如低粘附板、纳米粒子促进磁悬浮和悬滴板。因此，在一个实例中，本文公开的方法是三维方法。在另一个实例中，水凝胶是，但不限于，天然和合成材料，例如动物细胞外基质、提取物水凝胶、蛋白质水凝胶、肽水凝胶、聚合物水凝胶和木基纳米纤维素水凝胶。实质上，用于三维细胞培养的水凝胶通常由具有高保水性的相互连接的孔组成，这使得能够有效地运输诸如营养物和气体的物质。
细胞分化是描述细胞从一种细胞类型到另一种细胞类型的变化的过程。最常见的是，细胞变为更特殊的类型。在多细胞生物的发育过程中，分化发生多次，因为它从简单的受精卵变为组织和细胞类型的复杂系统。在成年期，分化仍在继续，因为成体干细胞在组织修复期间和正常细胞更新期间分裂并产生完全分化的子细胞。例如，响应于抗原暴露，发生一些分化。分化显著改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活动和对信号的反应。这些变化主要归因于基因表达中高度可控的修饰，并且是表观遗传学领域的研究。除少数例外，细胞分化几乎从未涉及DNA序列本身的变化。因此，尽管具有相同的基因组，但是不同的细胞可以具有通常在时间上分开的非常不同的物理特征。
存在多种水平的细胞潜能，即细胞的状态或分化成其他细胞类型的能力。更大的潜能表明可以从该细胞的状态衍生出更多数量的细胞。可以分化成所有细胞类型(包括胎盘组织)的细胞，被称为全能细胞。在哺乳动物中，只有受精卵和随后的卵裂球是全能的，而在植物中，许多分化的细胞可以通过简单的实验室技术变得全能。可以分化成成体生物的所有细胞类型的细胞被称为多能细胞。这种细胞在高等植物中也称为分生细胞，在动物中也称为胚胎干细胞。细胞的潜能可以被诱导，在某些情况下甚至可以被逆转，即从更分化(即更接近最终末端细胞类型)到较低分化(即更接近全能或细胞)的细胞分化的变化。例如，已经显示四种转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Kfl4(也称为Yamanaka因子)的病毒诱导表达足以从成人成纤维细胞产生多能性(iPS)细胞。多能细胞是可以分化成多种不同但密切相关的细胞类型的细胞。寡能细胞在分化能力方面比多能细胞更受限制，但仍然可以分化成几种密切相关的细胞类型。最后，单能细胞可以分化成仅一种细胞类型，但能够自我更新。在细胞病理学中，细胞分化水平作为例如癌症进展的量度。“Grade”是肿瘤中细胞分化程度的标记物。
哺乳动物体内有三种基本类型的细胞：生殖细胞、体细胞和干细胞。成年人中大约100万亿(1014)细胞中的每一个都具有其自身的基因组拷贝或多个拷贝，除了某些细胞类型，例如在其完全分化状态下缺乏细胞核的红细胞。大多数细胞是二倍体，意味着它们每个染色体有两个拷贝。这种称为体细胞的细胞构成人体的大部分，如皮肤和肌肉细胞。细胞分化以专门针对不同的功能。
生殖细胞系是生物体中产生配子的任何细胞系-卵子和精子-因此在几代人中是连续的。另一方面，干细胞具有无限期分裂的能力并产生特化细胞，这在人类发育的背景下被最好地描述。
当精子使卵子受精并产生具有形成整个生物体的潜能的单个细胞时，发育开始。在受精后的短时间内，该细胞分裂成相同的细胞。在人类中，在受精后大约四天和几次细胞分裂循环后，这些细胞开始专门化，形成一个空心细胞球，称为胚泡。胚泡具有外层细胞和空心球内的细胞簇，称为内细胞团。内细胞团的细胞继续形成人体内存在的几乎所有不同组织。尽管内细胞团的细胞几乎可以形成人体中发现的每种细胞，但它们不能形成生物体。这些细胞被称为多能细胞。
多能干细胞进一步专门化为多能祖细胞，然后产生功能细胞。干细胞和祖细胞的实例，包括但不限于，通过神经发生过程在胎儿脑中产生兴奋性神经元的放射状神经胶质细胞(胚胎神经干细胞)；产生红细胞、白细胞和血小板的来自骨髓的造血干细胞(成体干细胞)；产生基质细胞、脂肪细胞和骨细胞类型的来自骨髓的间充质干细胞(成体干细胞)；产生各种类型的皮肤细胞的上皮干细胞(祖细胞)；和有助于分化的肌肉组织的肌肉卫星细胞(祖细胞)。
当由细胞卵裂球从哺乳动物的单层囊胚分化到生殖细胞的三个主要层，即外胚层、中胚层和内胚层(从最远端(外部)到近端(内部)列出)时，创建由四种氨基酸精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸组成的细胞粘附分子引导的通路。外胚层最终形成有机体的皮肤和神经系统，中胚层形成骨骼和肌肉组织，内胚层形成内部器官。
生物体中的每种特化细胞类型表达构成该物种基因组的所有基因的子集。每种细胞类型由其受调节基因表达的特定模式限定。因此，细胞分化是细胞从一种细胞类型到另一种细胞类型的转变，并且因此涉及从一种基因表达模式转换到另一种模式。发育过程中的细胞分化可以理解为基因调控网络的结果。调节基因及其顺式调节模块是基因调控网络中的节点；他们接收输入并在网络中的其他地方创建输出。一些进化上保守类型的分子过程通常涉及控制这些变化的细胞机制。控制细胞分化的主要类型的分子过程涉及细胞信号传导。在细胞分化控制过程中将信息从细胞传递到细胞的许多信号分子称为生长因子。尽管特定信号转导通路的细节不同，但这些通路通常共享以下一般步骤。由一个细胞产生的配体与另一个细胞的细胞外区域中的受体结合，诱导受体的构象变化。受体的细胞质结构域的形状发生变化，受体获得酶活性。然后受体催化磷酸化其他蛋白质的反应，激活它们。磷酸化反应的级联最终激活休眠转录因子或细胞骨架蛋白，从而有助于靶细胞中的分化过程。细胞和组织的能力可以不同，这是它们响应外部信号的能力的变化。
信号诱导是指信号事件的级联，在此期间细胞或组织向另一细胞或组织发信号以影响其发育命运。例如，已经研究了晶状体在不同鱼类中的眼睛形成中的作用，并提供了信号诱导的显著例子。
其他重要的机制属于不对称细胞分裂的范畴，这种分裂导致子细胞具有不同的发育命运。由于不对称表达的母体细胞质决定簇或由于细胞信号传导，可能发生不对称的细胞分裂。在前一种机制中，由于亲本细胞中调节分子的不均匀分布，在胞质分裂期间产生了不同的子细胞；每个子细胞遗传的独特细胞质导致每个子细胞的不同分化模式。
由于每个细胞，无论细胞类型如何，都具有相同的基因组，因此必须在基因表达水平上确定细胞类型。虽然基因表达的调节可以通过包括基因启动子和增强子的顺式和反式调节元件发生，但是问题是如何在多代细胞分裂中维持这种表达模式。事实证明，表观遗传过程在调节采用干细胞命运、祖细胞命运或成熟细胞命运的决定中起着至关重要的作用。
胚胎干细胞能够自我更新并根据其在体内的位置分化成所需的命运。通过表观遗传机制维持干细胞稳态，所述表观遗传机制在调节染色质结构以及特定基因转录程序方面具有高度动态性。表观遗传学已被用于指基因表达的变化，这些变化可通过不影响DNA序列的修饰而遗传。例如，哺乳动物表观基因组在早期干细胞发育过程中经历全面重塑，这需要保证将细胞限制在所需的谱系中。有证据表明维持干细胞的谱系提交是通过表观遗传机制来控制的，例如但不限于DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构的ATP依赖性重塑的调节。
在分子生物学中，转录因子(或序列特异性DNA结合因子)是通过与特定DNA序列结合来控制遗传信息从DNA到信使RNA的转录速率的蛋白质。反过来，这有助于调节该序列附近基因的表达。这在细胞发育中例如在胚胎发生期间是必需的。
通过促进(作为激活剂)或阻断(作为阻遏物)RNA聚合酶(进行从DNA到RNA的遗传信息的实际转录的酶)募集到特定基因，转录因子单独或与复合物中的其他蛋白质组合起作用。转录因子的一个定义特征是它们含有至少一个DNA结合结构域(DBD)，它附着于与它们调节的基因相邻的特定DNA序列。转录因子通常基于其DNA结合域分类为不同的家族。其他蛋白质，例如但不限于共激活剂、染色质重建子、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶、激酶和甲基化酶，虽然对基因调控也是必需的，但缺乏DNA结合域，因此，不属于转录因子的定义。转录因子是读取和解释DNA中的遗传“蓝图”的蛋白质组之一。它们与DNA结合并帮助启动升高或降低基因转录的程序。因此，它们对许多重要的细胞过程至关重要。转录因子涉及许多重要功能和生物学作用，例如但不限于生物体发育。
多细胞生物中的许多转录因子参与发育。响应于刺激，这些转录因子打开或关闭适当基因的转录，这反过来允许细胞命运决定和细胞分化所需的细胞形态或活性的变化。例如，Hox转录因子家族对于从果蝇至人类的多样化的生物体中适当的身体模式形成是重要的。另一个例子是由性别决定区Y(SRY)基因编码的转录因子，其在决定人类性别中起主要作用。
因此，在一个实例中，该方法如本文所公开，其中多能干细胞在第一细胞培养基中培养，其中第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂和/或WNT-信号激活剂。在一个实例中，第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂或SMAD2/3抑制剂。在另一个实例中，第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂和SMAD2/3抑制剂。在又一个实例中，第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂或SMAD2/3抑制剂，以及WNT信号激活剂。在另一个实例中，第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂和SMAD2/3抑制剂和WNT信号激活剂。在又一个实例中，第一细胞培养基包含TGF-β抑制剂或SMAD2/3抑制剂或WNT信号激活剂。
本发明还包括用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和WNT信号激活剂。在一个实例中，用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基还包含百分比为40％至50％(任选47％)的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％(任选47％)的基础胚胎神经元细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选为1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选为1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选为1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％(任选为0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选为1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选1％)的用维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml(任选1μg/ml)的用于细胞增殖的补充剂。
在另一个实例中，公开了用于衍生和维持神经元谱系类胚体的细胞培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEM/F12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μg/ml至5μg/ml的肝素、30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632和100ng/ml至300ng/ml的头蛋白。
本发明还包括用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，其包含TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；WNT信号激活剂；刺猬信号蛋白；和成纤维细胞生长因子。在一个实例中，如本文所公开的用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基(任选47％)、百分比40％至50％(任选为47％)的基础胚胎神经元细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂(任选0.1％)、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化的细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选1％)的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml(任选1μg/ml)的用于细胞增殖的补充剂。
在另一个实例中，公开了用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEM/F12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μg/ml至5μg/ml的肝素、30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632、100ng/ml至300ng/ml的头蛋白、100ng/ml至300ng/ml的SHH-C25II和100ng/ml至300ng/ml的FGF8。
本发明还包括用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，其包含刺猬信号蛋白和成纤维细胞生长因子。在一个实例中，用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基还包含百分比为90％至95％(任选94％)的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％(任选0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选2％)的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml(任选2.5μg/ml)的生长补充剂、浓度为50ng/ml至500ng/ml(任选200ng)的干细胞生长促进剂。
在一个实例中，本文公开了用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，其中所述培养基包含80％至100％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.5μg/ml至10μg/ml的胰岛素、50ng/ml至500ng/ml的层粘连蛋白、100ng/ml至300ng/ml SHH-C25II和100ng/ml至300ng/ml的FGF8。
本发明还包括用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，其包含神经营养因子；抗坏血酸；和cAMP依赖性通路的激活剂。在一个实例中，用于衍生和维持中脑样类器官的培养基还包含百分比为90％至95％(任选94％)的基底胚胎神经细胞生长培养基，百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％(任选0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比0.5％至5％(任选2％)的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml(任选2.5μg/ml)的生长补充剂以及浓度为50ng/ml至500ng/ml(任选200ng/ml)的干细胞生长促进剂。
在另一个实例中，公开了用于衍生和维持中脑样类器官的细胞培养基，其中培养基包含80％至100％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、5ng/ml至50ng/ml的BDNF、5ng/ml至50ng/ml的GDNF、70μM至600μM的抗坏血酸和20μM至850μM的dc-cAMP。
在另一个实例中，第一细胞培养基还包含百分比为40％至50％(任选47％)的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％(任选47％)的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.05％(任选0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选1％)的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml(任选1μg/ml)的用于细胞增殖的补充剂。
本文还公开了第二培养基。因此，在一个实例中，该方法如本文所公开的，其中在第二细胞培养基中培养神经元谱系类胚体，其中第二细胞培养基包含TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；WNT信号激活剂；刺猬信号蛋白；和成纤维细胞生长因子。在另一个实例中，第二细胞培养基包含TGF-β抑制剂和SMAD2/3抑制剂、WNT信号激活剂、刺猬信号蛋白和成纤维细胞生长因子。在另一个实例中，第二细胞培养基包含TGF-β抑制剂或SMAD2/3抑制剂；WNT信号激活剂；刺猬信号蛋白；和成纤维细胞生长因子。
在另一个实例中，第二细胞培养基还包含百分比为40％至50％(任选47％)的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％(任选47％)的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％(任选0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选1％)的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml(任选1μg/ml)的用于细胞增殖的补充剂。
本文还公开了第三培养基。在一个实例中，该方法如本文所公开，其中在第三细胞培养基中培养中脑区域化组织，其中第三细胞培养基包含刺猬信号蛋白和成纤维细胞生长因子。
在另一个实例中，第三细胞培养基还包含百分比为90％至95％(任选94％)的基础胚胎神经元细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素、百分比为0.05％至0.5％(任选0.1％)的还原剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选2％)的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml(任选2.5μg/ml)的生长补充剂以及浓度为50ng/ml至500ng/ml(任选200ng/ml)的干细胞生长促进剂。
本文还公开了第四培养基。在一个实例中，该方法如本文所述，其中在第四细胞培养基中培养神经上皮组织，其中第四细胞培养基包含神经营养因子、抗坏血酸和cAMP依赖性通路的激活剂。
在一个实例中，第四细胞培养基还包含百分比为90％至95％(任选94％)的基础胚胎神经元细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％(任选1％)的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％(任选1％)的抗生素，百分比为0.05％至0.5％(任选0.1％)的还原剂，百分比为0.5％至3％(任选1％)的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％(任选2％)的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml(任选2.5μg/ml)的生长补充剂以及浓度为50ng/ml至500ng/ml(任选200ng/ml)的干细胞生长促进剂。
在一个实例中，基底生长细胞培养基是，但不限于，Eagle最小必需培养基(EMEM)；α最小必需培养基(aMEM)；达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)；达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F-12)；Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI或RPMI1640)；Glasgow's最小必需培养基(GMEM)；Biggers、Gwatkin和Judah培养基(BGJ)；Biggers、Gwatkin和Judah培养基Fitton-Jackson改良(BGJb)；Basal Medium Eagle(BME)；用于卵子培养的Brinster培养基(BMOC-3)；Connaught Medical Research Laboratories培养基(CMRL)；neurobasal培养基；CO2-Independent培养基；Ham's F-10营养混合物；Ham's F-12营养素混合物；改良MEM；Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)；培养基199；Leibovitz's L-15；McCoy's 5A；MCDB 131；Media 199；mTeSR培养基；最小必需培养基(MEM)；改良Eagle培养基(MEM)；Waymouth's MB 752/1；Williams’Media E；或组合，其已知的替代或改良。在一个实例中，基础细胞生长培养基是达尔伯克改良伊格尔培养基/Nutrient F-12(DMEM/F12)。在另一个实例中，基础胚胎神经元细胞生长培养基是Neurobasal培养基。在又一个例子中，
任何细胞培养基可以根据要进行的实验、考虑中的细胞类型以及细胞的所需状态(饥饿或其他)在需要时补充其他组分。细胞培养补充剂包括但不限于血清、氨基酸、化合物、盐、缓冲盐或试剂、抗生素、抗真菌剂、细胞因子、生长因子、激素、脂质及其衍生物。
在一个实例中，血清是但不限于胎牛血清(FCS)、胎牛血清(FBS)、人血清(huS)、血小板裂解物(hPL)、人血小板裂解物(hPL)及其组合。
在一个实例中，抗真菌剂是，但不限于，两性霉素B、Clotimazol、制霉菌素及其组合。
在一个实例中，氨基酸是，但不限于，异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸、丝氨酸、其组合和衍生物。在一个实例中，氨基酸是谷氨酰胺。根据需要，本文列出的氨基酸可以以L-立体异构体或D-立体异构体提供。在一个实例中，谷氨酰胺补充剂是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
在另一个实例中，抗生素是，但不限于，氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、多粘菌素B、放线菌素、博来霉素、环己酰胺、遗传霉素(G148)、潮霉素B、丝裂霉素C及其组合。在一个实例中，抗生素是青霉素。在另一个实例中，抗生素是链霉素。在又一个实例中，抗生素是青霉素和链霉素。
在一个实例中，盐、缓冲盐或试剂是，但不限于，氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸氢钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4)、氯化钙(CaCl2)、氯化钙(CaCl2×2H2O)、右旋糖、葡萄糖、碳酸氢钠(NaHCO3)及其组合。
在一个实例中，化合物是，但不限于，碳酸氢钠和β-巯基乙醇。在一个实例中，还原剂是β-巯基乙醇。
在另一个实例中，用于扩增未分化细胞的补充剂是N-2补充剂。
在一个实例中，用于维持神经元的补充剂是不含维生素A的B27。
在另一个实例中，用于细胞增殖的补充剂是肝素。
在一个实例中，生长补充剂是胰岛素。
在另一个实例中，干细胞生长促进剂是层粘连蛋白。
细胞可以长时间保存在培养物中。理论上，给定最佳生长条件并且在稳定的细胞培养环境中，可以无限期地保持细胞(例如永生化细胞系)。另外，从技术上讲，细胞培养中细胞的寿命由细胞的物理限制来定义，并且可以例如通过确定细胞的Hayflick限度或基于细胞的端粒长度来计算。因此，在一个实例中，如本文(a)中所定义的培养步骤持续3至5天。在一个实例中，如(b)中所定义的培养步骤持续3至5天。在一个实例中，如本文(c)中所定义的培养步骤持续1至2天。
在一个实例中，该方法如本文所公开，其中在培养基中培养的神经元谱系类胚体的特征在于标记物PAX6和SOX1。在另一个实例中，神经元谱系标记物是PAX6。在另一个实例中，神经元谱系标记物是SOX1。
在另一个实例中，该方法如本文所公开，其中多能标记物是OCT4和NANOG。在另一个实例中，多能标记物是OCT4。在又一个实例中，多能标记物是OCT4。
在另一个实例中，该方法如本文所公开，其中在第一细胞培养基和第二细胞培养基中培养的神经元谱系类胚体的特征在于，但不限于，以下标记物的一种或多种：PAX6和SOX1、OCT4和NANOG。
在一个实例中，该方法如本文所公开，其中要在细胞培养基中培养的中脑区域化组织的特征在于以下标记物中的任一种或多种：CORIN、OTX2、FOXA2、MASH1、NURR1、LMX1A及其组合。在一个实例中，标记物是CORIN。在另一个例子中，标记物是OTX2。在又一个实例中，标记物是FOXA2。在另一个例子中，标记物是MASH1。在另一个例子中，标记物为NURR1。在又一个实例中、标记物是LMX1A。在一个实例中，标记物是CORIN和OTX2。在另一个实例中，标记物是CORIN和FOXA2。在又一个实例中，标记物是CORIN和MASH1。在另一个实例中，标记物是CORIN和LMX1A。在另一个实例中，标记物是OXT2与如上公开的任何其他标记物的组合。在另一个实例中，标记物是FOXA2与如上公开的任何其他标记物的组合。在另一个实例中，标记物是MASH1与如上公开的任何其他标记物的组合。在另一个实例中，标记物是NURR1与如上公开的任何其他标记物的组合。在另一个实例中，标记物是LMX1A与如上公开的任何其他标记物的组合。在另一个实例中，该方法如本文所公开，其中在第三细胞培养基中培养的中脑区域化组织的特征在于标记物CORIN、OTX2、FOXA2和LMX1A。
在一个实例中，该方法如本文所公开，其中中脑样类器官是人中脑样类器官。在另一个实例中，分离的中脑样类器官是人中脑样类器官。
本发明的目的还包括使用本文公开的方法分离中脑样类器官。在一个实例中，分离的中脑样类器官包括中脑特异性细胞。在另一个实例中，公开了包含中脑特异性细胞的分离的中脑样类器官。在又一个实例中，分离的中脑样类器官是成熟的中脑样类器官。在另一个实例中，分离的中脑样类器官是黑质类器官。在另一个实例中，包含在本文公开的分离的中脑样类器官中的中脑特异性细胞包含多巴胺能神经元。
在另一个实例中，如本文所公开的分离的中脑样类器官的特征在于存在至少一个或多个以下特征：增殖性腹侧区(VZ)、中间区(IZ)和外套层(MZ)。在一个实例中，增殖性腹侧区(VZ)的特征在于存在神经祖细胞。在另一个实例中，中间区(IZ)的特征在于存在未成熟的中脑多巴胺能神经元。在又一个实例中，外套层(MZ)的特征在于存在成熟的中脑多巴胺能神经元。在一个实例中，增殖性腹侧区(VZ)的特征在于存在神经祖细胞，中间区(IZ)的特征在于存在未成熟的中脑多巴胺能神经元，并且外套层(MZ)的特征在于存在成熟的中脑多巴胺能神经元。
在一个实例中，本文公开的分离的中脑样类器官的神经上皮展示出顶端-基底极性。在另一个实例中，顶端-基底极性的特征在于以下标记物中的任何一种的定位：非典型蛋白激酶C(aPKC)、Ki67、MAP2、OTX2、EdU和MASH1。
在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于神经祖细胞标记物PAX6。在另一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于神经祖细胞标记物SOX1。在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于神经祖细胞标记物PAX6和SOX1。
在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于一种或多种以下未成熟中脑多巴胺能神经元标记物MASH1、OTX2和NURR1。在另一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物MASH1。在又一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物OTX2。在另一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物NURR1。在另一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物OTX2和NURR1。在又一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物MASH1和NURR1。在另一个实例中，神经祖细胞和/或未成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于未成熟的中脑多巴胺能神经元标记物OTX2和MASH1。
在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于一种或多种以下标记物：MAP2、酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白(DAT)。在另一个实例中，成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物MAP2。在另一个实例中，成熟的中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物酪氨酸羟化酶(TH)。在又一个实例中，成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物多巴胺转运蛋白(DAT)。在又一个实例中，成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物MAP2和多巴胺转运蛋白(DAT)。在又一个实例中，成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白(DAT)。在另一个实例中，成熟中脑多巴胺能神经元的特征在于标记物MAP2和多巴胺转运蛋白(DAT)。
在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中成熟的中脑多巴胺能神经元是黑质致密部(SNpc)的中脑多巴胺能神经元(也称为A9神经元)。
在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，其中中脑多巴胺能神经元能够产生多巴胺，表现出成熟的神经元特性，和/或能够与中脑样类器官内的神经元形成突触。
如本文所用，术语“神经黑色素”是指在脑中发现的暗色素，其在结构上与黑色素相关。神经黑色素是5,6-二羟基吲哚单体的聚合物，并且在黑质致密部和蓝斑的儿茶酚胺能细胞中大量表达，给结构带来深色。色素是由5,6-二羟基吲哚制成的聚合物，这些单体在人体中的浓度高于其他灵长类动物。黑质中含有神经黑色素的神经元经历神经退化，神经黑色素浓度随着年龄增加而增加，表明在神经保护(神经黑色素可以螯合金属和外源性物质)或衰老中的作用。神经黑色素产生不同的颜色的特定的脑切片，例如黑质或蓝斑。神经黑色素是一种黑色素，类似于其他形式的神经末梢区域的(peripheral)黑色素。它不溶于有机化合物，可用银染标记。它被称为神经黑色素，这是因为它的功能和含有它的组织中出现的颜色变化。它含有黑色/棕色着色颗粒。神经黑色素被发现在衰老过程中累积，并且在生命的最初2至3年内被发现。据信它可以保护黑质中的神经元免受铁诱导的氧化应激。由于其稳定的自由基结构，它被认为是真正的黑色素，并且它强烈地螯合金属。
因此，在一个实例中，分离的中脑样类器官如本文所公开，包含神经黑色素。在另一个实例中，神经黑色素是由中脑多巴胺能神经元产生的。在又一个实例中，神经黑色素在黑质中累积。
如本文所用，术语“TGF-β抑制剂”是指能够阻断或下调TGF-β作用的分子或化合物。TGF-β是细胞因子的转化生长因子β超家族的多肽成员。它是分泌蛋白质，执行许多细胞功能，包括但不限于控制细胞生长、细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡。在人类中，TGF-β1由TGFB1基因编码。该超家族的其他成员包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、抗苗勒管激素(AMH)、激活素(例如，激活素A、激活素B和激活素AB)、Nodal和不同的TGF-β(例如、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3)。
TGF-β和所述细胞因子的转化生长因子β超家族的相关蛋白参与所谓的TGF-β信号传导通路。该通路涉及成体生物体和发育中的胚胎中的许多细胞过程，包括但不限于细胞生长、细胞分化、细胞凋亡、细胞稳态和其他细胞功能。尽管TGF-β信号传导通路调节的细胞过程范围很广，但该过程相对明确。TGF-β超家族配体与II型受体(通常是丝氨酸/苏氨酸受体激酶)结合，其募集并磷酸化I型受体。然后I型受体磷酸化经受体调节的SMAD(R-SMAD)，其现在可以结合co-SMAD SMAD4(也称为SMAD家族成员n°4、母体抗同源序列同源物4、JIP、MADH4、MYHRS或DPC4(在胰腺癌-4中缺失))。R-SMAD/co-SMAD复合物在细胞核中积累，在那里它们作为转录因子起作用并参与靶基因表达的调节。
因此，在一个实例中，TGF-β抑制剂的特征在于以下特征的至少一种或多种，这些特征是但不限于：抑制TGF-βI型受体ALK5激酶；抑制I型激活素/淋巴结受体ALK4；抑制I型淋巴结受体ALK7；抑制SMAD2/3磷酸化；和/或抑制激活素/TGFβ/SMAD信号传导通路。
在一个实例中，TGF-β抑制剂是但不限于，A83-01 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺、A 77-01 4-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉、SD-208 2-(5-氯-2-氟苯基)-N-吡啶-4-哌啶-4-胺、LY2157299 4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-羧酰胺、SB 431542 4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺、GW788388N-(恶-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺、SB505124 2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-叔丁基-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶、SB525334 6-[2-叔丁基-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉、IN 1130 2-[3-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-4-甲基-1,3-噻唑-3-鎓-5-基]乙醇、ITD 1(6,6-二甲基-5,7-二氢咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-4-鎓-3-基)甲基N,N'-二环己基氨基甲酰亚胺酯、LY2109761 4-[2-[4-(2-吡啶)-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-7-基]氧乙基]吗啉、K02288 3-[6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基]苯酚、TGF-βRI激酶抑制剂[3-(吡啶)-2-基)-4-(4-喹啉基)]-1H-吡唑]或其衍生物。
在一个实例中，TGF-β抑制剂以约0.5nM至约100μM、或约1nM至约90μM、或约2nM至约80μM、或约3nM至约70μM、或约4nM至约60μM、或约5nM至约50μM、或约10nM至约40μM、或约20nM至约30μM、或约30nM至约20μM、或约40nM至约10μM、或约50nM至约5μM、或约100nM至约2μM、或约200nM至约1μM、或约300nM至约800nM、或约500nM至约700nM、或约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM或20μM的浓度提供。
如本文所用，术语“SMAD”是指细胞内蛋白质，其将细胞外信号从转化生长因子β(TGF-β)配体转导至细胞核，在那里它们激活下游基因转录。SMAD形成两个经受体调节的SMAD和一个co-SMAD的三聚体，充当调节某些基因表达的转录因子。其他SMAD蛋白是，但不限于，SMAD1、SMAD2(也称为Mothers against decapentaplegic homolog 2、JV18、JV18-1、MADH2、MADR2、hMAD-2或SMAD家族成员2)、SMAD3(也称为Mothers againstdecapentaplegic homolog 3、HSPC193、HsT17436、JV15-2、LDS1C、LDS3、MADH3或SMAD家族成员3)、SMAD4(共同介体SMAD(co-SMAD)，也称为SMAD家族成员n°4、Mothers againstdecapentaplegic homolog 4、JIP、MADH4、MYHRS或DPC4(在胰腺癌4中缺失))、SMAD5(也称为Mothers against decapentaplegic homolog 5、DWFC、JV5-1、MADH5或SMAD家族成员5)、SMAD6(拮抗或抑制性SMAD，其阻断R-SMAD和co-SMAD的激活；也称为AOVD2、HsT17432、MADH6、MADH7、SMAD家族成员6)、SMAD7(拮抗或抑制性SMAD，其阻断R-SMADs和co-SMAD的激活；也称为CRCS3，Mothers against decapentaplegic homolog 7(MADH7)、MADH8，SMAD家族成员7)和SMAD8/9(也称为Mothers against decapentaplegic homolog 9、SMAD9、SMAD8、MADH9、PPH2、SMAD8、SMAD8A、SMAD8B、SMAD家族成员9或MADH6)。因此，如本文所用，术语“SMAD抑制剂”是指能够抑制(即抑制或下调)SMAD蛋白活性的分子化合物。
因此，在一个实例中，SMAD2/3抑制剂是，但不限于，SMAD2/3磷酸化抑制剂和靶向SMAD2和SMAD3转录物的mRNA的siRNA。
在一个实例中，SMAD2/3抑制剂以约0.5nM至约100μM、或约1nM至约90μM、或约2nM至约80μM、或约3nM至约70μM、或约4nM至约60μM、或约5nM至约50μM、或约10nM至约40μM、或约20nM至约30μM、或约30nM至约20μM、或约40nM至约10μM、或约50nM至约5μM、或约100nM至约2μM、或约200nM至约1μM、或约300nM至约800nM、或约500nM至约700nM、或约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM的浓度提供。
如本文所用，术语“Wnt”是指所谓的Wnt信号传导通路，一组由蛋白质组成的信号转导通路，其通过细胞表面受体将信号传递到细胞中。已经表征了三种Wnt信号传导通路：经典Wnt通路，非经典平面细胞极性通路和非经典Wnt/钙通路。通过Wnt-蛋白质配体与卷曲蛋白家族受体结合来激活所有三种通路，所述卷曲家族受体将生物信号传递至细胞内的散乱蛋白。典型的Wnt通路导致基因转录的调节。非典型平面细胞极性通路调节负责细胞形状的细胞骨架。非经典Wnt/钙通路调节细胞内的钙。Wnt信号传导通路使用附近细胞-细胞通信(旁分泌)或相同细胞通信(自分泌)。Wnt信号通路在动物中具有高度进化保守性，这意味着它们在从果蝇到人类的动物物种中是相似的。
Wnt信号传导首先针对其在癌发生中的作用被鉴定，然后是针对其在胚胎发育中的功能。其控制的胚胎过程包括但不限于体轴图案化(patterning)、细胞命运决定、细胞增殖和细胞迁移。这些过程对于正确形成包括骨骼、心脏和肌肉在内的重要组织是必需的。其在胚胎发育中的作用在Wnt通路蛋白中的基因突变产生异常果蝇胚胎时被发现。Wnt信号传导还控制组织再生，例如，在成人骨髓、皮肤和肠中。
如本文所用，术语“GSK-3”是指糖原合成酶激酶3，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上。在哺乳动物中，GSK-3蛋白由两种已知基因编码，GSK-3α(GSK3A)和GSK-3β(GSK3B)。
如本文所用，术语“WNT信号激活剂”是指激活或上调Wnt信号传导通路中涉及的基因的分子或化合物。
因此，在一个实例中，WNT信号激活剂是，但不限于，2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶(CAS no.853220-52-7)、(1-(4-(萘-2-基)嘧啶-2-基)哌啶-4-基)甲胺(WAY 262611或DKK1抑制剂)、WAY-316606(5-(苯基磺酰基)-N-4-哌啶基-2-(三氟甲基)苯磺酰胺盐酸盐)、杂芳基嘧啶、芳基嘧啶、IQ1(2-[2-(4-乙酰基苯基)二氮烯基]-2-(3,4-二氢-3,3-二甲基-1)(2H)-异喹啉亚基)乙酰胺；CAS号331001-62-8)、QS11((2S)-2-[2-(茚满-5-基氧基)-9-(1,1'-联苯-4-基)甲基)-9H-嘌呤-6-基氨基]-3-苯基-丙-1-醇；CAS号944328-88-5)，SB-216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮)、BIO(6-溴靛玉红-3'-)肟)、脱氧胆酸(DCA)、2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶或其衍生物。
在另一个实例中，WNT信号激活剂是GSK3抑制剂。在又一个实例中，GSK3抑制剂是，但不限于，CHIR-99021(6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈)、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)、SB 216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚)-3-基)吡咯-2,5-二酮)、CHIR-98014(6-N-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-咪唑-1-基嘧啶-2-基]氨基]乙基]-3-硝基吡啶-2,6-二胺)、TWS119(3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚)、IM-12(3-[2-(4-氟苯基)乙基氨基]-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮)、1-氮杂半萘酮9-溴-7,12-二氢吡啶并[3'，2'：2,3]氮杂环庚烷并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮、AR-A014418 1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲、SB415286 3-(3-氯-4-羟基苯胺基)-4-(2-硝基苯基)吡咯-2,5-二酮、AZD1080(3E)-3-[5-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡啶-2-亚基]-2-氧代-1H-吲哚-5-甲腈、AZD2858 3-氨基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基苯基]-N-吡啶-3-基-吡嗪-2-甲酰胺、靛玉红(3E)-3-(3-氧代-1H-吲哚-2-亚基)-1H-吲哚-2-酮或其衍生物。
在一个实例中，WNT信号激活剂的浓度为约0.5nM至约100μM、或约1nM至约90μM、或约2nM至约80μM、或约3nM至约70μM、或约4nM至约60μM、或约5nM至约50μM、或约10nM至约40μM、或约20nM至约30μM、或约30nM至约20μM、或约40nM至约10μM、或约50nM至约5μM、或约100nM至约2μM、或约200nM至约1μM、或约300nM至约800nM、或约500nM至约700nM、或约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM或20μM。
如本文所用，术语“刺猬信号蛋白”是指在所谓的刺猬信号传导通路中起作用的蛋白质。刺猬信号通路是一种信号通路，通过它可将细胞分化信息传递给胚胎细胞。胚胎的不同部分具有不同浓度的刺猬信号蛋白。该通路也在成人中起作用。与该通路的功能障碍相关的疾病也是已知的，包括但不限于基底细胞癌。
刺猬信号通路是动物发育的关键调节因子之一，存在于所有两侧对称动物(即具有双侧对称性的动物)中。该通路的名称来自其多肽配体，一种称为刺猬(Hh)的细胞间信号分子，发现于果蝇属的果蝇中。Hh是果蝇的片段极性基因产物之一，参与建立果蝇身体计划的基础。在胚胎发生和变态的后期阶段，该分子仍然很重要。
目前在哺乳动物中已知有三种刺猬同源物，沙漠刺猬同源物(DHH)、印度刺猬因子同源物(IHH)和音猬因子(SHH)，其中音猬因子是研究得最好的。该通路在脊椎动物胚胎发育过程中同样重要，因此在进化发育生物学中为兴趣对象。在缺失该通路组分的敲除小鼠中已显示，脑、骨骼、肌肉组织、胃肠道和肺都不能正确发育。最近的研究指出刺猬信号传导在调节参与成体组织的维持和再生的成体干细胞中的作用。该通路还涉及一些癌症的发展。
因此，在一个实例中，刺猬信号蛋白是，但不限于，沙漠刺猬同源物(DHH)、印度刺猬因子同源物(IHH)或音猬因子(SHH)。
在一个实例中，刺猬信号蛋白的浓度为约0.5nM至约100μM、或约1nM至约90μM、或约2nM至约80μM、或约3nM至约70μM、或约4nM至约60μM、或约5nM至约50μM、或约10nM至约40μM、或约20nM至约30μM、或约30nM至约20μM、或约40nM至约10μM、或约50nM至约5μM、或约100nM至约2μM、或约200nM至约1μM、或约300nM至约800nM、或约500nM至约700nM、或约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM或20μM。
如本文所用，术语“成纤维细胞生长因子”是指生长因子家族，其成员参与血管生成、伤口愈合、胚胎发育和各种内分泌信号传导通路。成纤维细胞生长因子是肝素结合蛋白，已经显示与细胞表面相关的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的相互作用对于成纤维细胞生长因子信号转导是必需的。成纤维细胞生长因子是多种细胞和组织增殖和分化过程中的关键参与者。成纤维细胞生长因子是具有多种作用的多功能蛋白质；它们是最常见的有丝分裂原，但也具有调节、形态和内分泌作用。由于它们对多种细胞类型的多重作用，它们也被选择性地称为“多能”生长因子和“混杂”生长因子。混杂是指各种分子如何结合并引发单一受体的响应的生物化学和药理学概念。在成纤维细胞生长因子的情况下，四种受体亚型可被超过二十种不同的成纤维细胞生长因子配体激活。因此，FGF在发育过程中的功能包括中胚层诱导、前后轴模式、肢体发育、神经诱导和神经发育以及成熟组织/系统血管生成，角化细胞组织和伤口愈合过程。
成纤维细胞生长因子在脊椎动物和无脊椎动物的正常发育期间是关键的，并且其功能的任何不规则行为导致一系列发育缺陷。在禽类原肠胚形成期间由成体细胞分泌的成纤维细胞生长因子在刺激涉及在原条形成期间Koller镰状细胞的差异运动的Wnt信号传导通路中起作用。FGF1和FGF2的一个重要功能是促进内皮细胞增殖和内皮细胞物理组织成管状结构。因此，它们促进血管生成，即来自预先存在的脉管系统的新血管的生长。FGF1和FGF2是比血管内皮生长因子(VEGF)或血小板衍生生长因子(PDGF)更有效的血管生成因子。在临床实验研究中已示出FGF1在心脏中诱导血管生成。除了刺激血管生长外，成纤维细胞生长因子也是伤口愈合的重要因素。FGF1和FGF2刺激血管生成和产生肉芽组织的成纤维细胞的增殖，肉芽组织在伤口愈合过程的早期填充伤口空间/腔。FGF7和FGF10(也分别称为角化细胞生长因子KGF和KGF2)通过刺激上皮细胞的增殖、迁移和分化来刺激受损皮肤和粘膜组织的修复，并且它们对组织重塑具有直接的趋化作用。在中枢神经系统发育过程中，成纤维细胞生长因子在神经干细胞增殖、神经发生、轴突生长和分化中起重要作用。成纤维细胞生长因子信号传导通过减少神经元分化促进发育中的大脑皮层的表面积生长是重要的，因此允许皮质祖细胞(称为放射状神经胶质细胞)的自我更新，并且已经使用FGF2诱导小鼠脑的人工Gyrification。另一种成纤维细胞生长因子家族成员FGF8调节大脑皮层(布罗德曼区)功能区的大小和位置。FGF对于维持成年大脑也很重要。因此，成纤维细胞生长因子是发育期间和成年期神经元存活的主要决定因素。海马体内的成人神经发生，例如很大程度上取决于FGF2。此外，FGF1和FGF2似乎参与突触可塑性的调节和归因于学习和记忆的过程，至少在海马体中。十五种旁分泌成纤维细胞生长因子是结合硫酸乙酰肝素的分泌蛋白，因此可以与含有硫酸乙酰肝素蛋白多糖的组织的细胞外基质结合。FGF蛋白的这种局部作用被归类为旁分泌信号传导，最常见的是通过JAK-STAT信号传导通路或受体酪氨酸激酶(RTK)通路。
FGF19亚家族成员(FGF15、FGF19、FGF21和FGF23)与硫酸乙酰肝素的结合程度较低，因此可以在肠、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼等远端组织中以内分泌方式发挥作用。[9]例如，FGF15和FGF19(FGF15/19)由肠细胞产生，但作用于表达FGFR4的肝细胞，以下调胆汁酸合成途径中的关键基因(CYP7A1)。FGF23由骨骼产生，但作用于表达FGFR1的肾细胞，以调节维生素D和磷酸盐稳态的合成。在人类中，已鉴定出22个FGF家族成员，所有成员都是结构相关的信号分子。已知FGF1至FGF10均结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。FGF1也称为酸性成纤维细胞生长因子，FGF2也称为碱性成纤维细胞生长因子。FGF11、FGF12、FGF13和FGF14也称为FGF同源因子1至FGF同源因子4(FHF1-FHF4)，已显示与FGF相比具有不同的功能。尽管这些因子具有非常相似的序列同源性，但它们不结合FGFR并且参与与FGF无关的细胞内过程。该组也称为“iFGF”。人FGF18参与包括软骨在内的各种组织中的细胞发育和形态发生。人FGF20基于其与非洲爪蟾FGF-20(XFGF-20)的同源性被鉴定。FGF15至FGF23在后面描述并且功能仍在被表征中。FGF15是人FGF19的小鼠直向同源物(不存在人FGF15)，并且在它们的功能共享的情况下，它们通常被描述为FGF15/19。[9]与其他FGF的局部活性相反，FGF15/19、FGF21和FGF23具有全身性作用。已经解决了FGF1的晶体结构，发现其与白细胞介素1-β有关。两个家族具有相同的β三叶草折叠，由12链β-折叠结构组成，β折叠排列在围绕中心轴的3个相似的叶片中，6个链形成反平行的β-桶。通常，β-折叠保存完好，晶体结构叠加在这些区域。干预环较不保守-白细胞介素-1β中β链6和β链7之间的环路稍长。
因此，在一个实例中，成纤维细胞生长因子是，但不限于，FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14及其组合。在另一个实例中，成纤维细胞生长因子是FGF8。
在一个实例中，成纤维细胞生长因子的浓度为约0.5nM至约100μM、或约1nM至约90μM、或约2nM至约80μM、或约3nM至约70μM、或约4nM至约60μM、或约5nM至约50μM、或约10nM至约40μM、或约20nM至约30μM、或约30nM至约20μM、或约40nM至约10μM、或约50nM至约5μM、或约100nM至约2μM、或约200nM至约1μM、或约300nM至约800nM、或约500nM至约700nM、或约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM或20μM。
如本文所用，术语“ECM”或“细胞外基质”是指由细胞分泌的细胞外分子的集合，其为周围细胞提供结构和生物化学支持。由于在不同的多细胞谱系中独立进化的多细胞性，ECM的组成在多细胞结构之间变化；然而，细胞粘附、细胞间通讯和分化是ECM的常见功能。
动物细胞外基质包括间质基质和基底膜。间质基质存在于各种动物细胞之间(即，在细胞间隙中)。多糖和纤维蛋白的凝胶填充间隙空间并充当抵抗施加在细胞外基质(ECM)上的应力的承压缓冲剂。基底膜是细胞外基质的片状沉积物，各种上皮细胞停留在其上。动物中的每种类型的结缔组织都具有一种类型的细胞外基质：胶原纤维和骨矿物质包括骨组织的细胞外基质；网状纤维和基质包括疏松结缔组织的细胞外基质；血浆是血液的细胞外基质。
除了更复杂的信号分子之外，植物细胞外基质还包括细胞壁组分，如纤维素。一些单细胞生物采用多细胞生物膜，其中细胞包埋在主要由细胞外聚合物(EPS)组成的细胞外基质中。细胞外基质由于其多样性质和组成可以起到许多功能，例如提供支持、将组织彼此分离以及调节细胞间通讯。细胞外基质调节细胞的动态行为。此外，它还能隔离各种细胞生长因子，并作为它们的局部存储库。生理条件的变化可以引发蛋白酶活性，导致这些存储库的局部释放。这允许快速和局部的生长因子介导的细胞功能的激活，而不需要从头合成。
细胞外基质的刚度和弹性对细胞迁移、基因表达和分化具有重要意义。细胞主动感知细胞外基质的刚性，并在称为趋硬行为的现象中优先向更硬的表面迁移。细胞还可以检测弹性并调整其基因表达。细胞外基质的组分由驻留细胞在细胞内产生并通过胞吐作用分泌到细胞外基质中。一旦被分泌，它们就会与现有的基质聚合在一起。细胞外基质由纤维蛋白和糖胺聚糖(GAG)的互锁网组成。因此，细胞外基质可包括但不限于蛋白多糖(例如，硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白)、非蛋白多糖(例如透明质酸)、蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性蛋白)和其他组分，例如但不限于纤连蛋白和层粘连蛋白。
因此，在一个实例中，细胞外基质促进细胞分化和/或可维持三维培养和/或促进复杂组织的发育。因此，构成细胞外基质的材料是，但不限于，基底膜基质、明胶、甲基纤维素、胶原、藻酸盐、藻酸盐微球、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白多糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支撑材料。在一个实例中，细胞外基质由基底膜基质组成。
如本文所用，术语“神经营养因子”是指生物分子家族-几乎所有生物分子都是肽或小蛋白质-支持发育中的以及成熟神经元的生长、存活和分化。大多数神经营养因子通过酪氨酸激酶(通常是受体酪氨酸激酶)发出信号，对神经元发挥营养作用。在成熟的神经系统中，它们促进神经元存活、诱导突触可塑性并调节长期记忆的形成。神经营养因子还促进中枢神经系统和周围神经系统中神经元的初始生长和发育，并且它们能够在试管和动物模型中重新生长受损神经元。一些神经营养因子也由靶组织释放，以指导发育中轴突的生长。大多数神经营养因子属于三个家族之一：(1)神经营养蛋白、(2)神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体(GFL)和(3)神经营养细胞因子。尽管引发的细胞反应经常重叠，但每个家族都有自己独特的细胞信号传导机制。
因此，在一个实例中，神经营养因子是，但不限于神经营养蛋白、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体(GFL)和神经生成细胞因子。在另一个实例中，神经营养蛋白是，但不限于，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4(NT-4)。在另一个实例中，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体(GFL)是，但不限于，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、Artemin(ARTN)和人PSP(PSPN)。
在一个实例中，神经营养因子的浓度为约0.1nM至约100μM、或约0.2nM至约90μM、或约0.3nM至约80μM、或约0.4nM至约70μM、或约0.5nM至约60μM、或约0.6nM至约50μM、或约0.7nM至约40μM、或约0.8nM至约30μM、或约0.9nM至约20μM、或约1nM至约10μM、或约5nM至约5μM、或约10nM至约4μM、或约20nm至约3μM、或约30nm至约2μM、或约40nm至约1μM、或约50nm至约900nm、或约100nm至约800nm、或约200nm到约700nm、或约300nm至约600nm、或约400nm至约500nm、或约0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM或20μM。
如本文所用，术语“抗坏血酸”是指维生素，即维生素C，具有式C6H8O6的有机化合物。它用于细胞培养以维持健康细胞。抗坏血酸起到抗氧化作用，降低干细胞分化过程中产生的活性氧水平。
在一个实例中，抗坏血酸的浓度为约1μM至约1mM、或约5μM至约950μM、或约10μM至约900μM、或约20μM至约850μM、约30μM至约800μM、或约40μM至约750μM、或约50μM至约700μM、或约60μM至约650μM、或约70μM至约600μM、或约80μM至约550μM、或约90μM至约500μM、或约100μM至约450μM、或约125μM至约400μM、或约150μM至约350μM、或约175μM至约300μM、或约200μM至约250μM、或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM、250μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或约1mM。
如本文所用，术语“cAMP依赖性通路的激活剂”，也称为腺苷酸环化酶通路，是指用于细胞通讯的G蛋白偶联受体触发的信号级联。在人类中，cAMP代表环腺苷一磷酸(也称为cAMP、环AMP、或3',5'-环腺苷一磷酸；信号通路中重要的第二信使)通过激活蛋白激酶A(也称为PKA，cAMP依赖性蛋白激酶)起作用，是最早发现的几种激酶之一。蛋白激酶A具有四个亚单元，两个催化亚基和两个调节亚基。cAMP与蛋白激酶A的调节亚基结合并使它们脱离催化亚基。然后，这些催化亚单元进入细胞核，在那里它们对转录过程产生影响。这些催化亚基的进一步作用主要取决于cAMP依赖性蛋白激酶本身，其根据细胞类型而变化。
cAMP依赖性通路是许多生物体和生命过程所必需的。许多不同的细胞反应由cAMP介导。这些包括但不限于心率增加、皮质醇分泌和糖原和脂肪分解。cAMP还因其在维持大脑记忆、心脏舒张和肾脏吸收水分方面的作用而闻名。cAMP依赖性通路可以激活酶并调节基因表达，因此可以在细胞分化中发挥不可或缺的作用。就疾病而言，如果cAMP依赖性通路不在适当的控制之下，它最终可导致过度增殖，这可能导致癌症和任何其他过度增殖性疾病的发展和/或进展。
在一个实例中，cAMP依赖性通路的激活剂是，但不限于，二丁酰基-cAMP(dbCAMP)，毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色烯-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素。
在一个实例中，cAMP依赖性通路的激活剂的浓度为约1μM至约1mM、或约5μM至约950μM、或约10μM至约900μM、或约20μM至约850μM、或约20μM至约500μM、约30μM至约800μM、或约40μM至约750μM、或约50μM至约700μM、或约60μM至约650μM、或约70μM至约600μM、或约80μM至约550μM、或约90μM至约500μM、或约100μM至约450μM、或约125μM至约400μM、或约150μM至约350μM、或约175μM至约300μM、或约200μM至约250μM、或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM、250μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或约1mM。
例如，当细胞在悬浮液中生长时或当使用支架时，细胞培养的方法可能需要搅动细胞。因此，在一个实例中，使用本文公开的方法将定轨振荡器用于培养神经上皮组织。
来自人多能干细胞的人中脑样类器官的产生和表征
在本公开中，将自组织原理应用于人胚胎干细胞(hESC)培养并且在不存在细胞外支架的情况下产生含有中脑多巴胺能神经元的人中脑样类器官(hMLO)。首先，将人胚胎干细胞解离成单个细胞，并使其在低附着的V形96孔培养皿中形成均匀大小(约400μm)的类胚体(EB)(图1A)。为了抑制间充质分化并促进神经外胚层分化，这些类胚体同时经受DUAL-SMAD抑制因子(头蛋白和SB431542)和Wnt通路激活剂(CHIR99021)。得到的类胚体经历了中脑命运4天。将音猬因子和FGF8加入类胚体培养物中另外3天。神经诱导和中脑图案化后，神经类器官产生中脑多巴胺能祖细胞，如mDA祖细胞标记物(包括PAX6、CORIN和FOXA1)的免疫染色(图5A、图5B和图5C)以及基因表达谱(图5D和图5E)所示。随后，每个神经外胚层球体包埋在具有减少量的生长因子的基底膜基质以提供3D环境过夜，随后将其转移到置于定轨振荡器上的组织培养皿中的神经元培养基直至分析那天，所述培养基补充有神经营养因子如BDNF和GDNF。使用定轨振荡器大大改善了神经类器官的活力、存活和分化(数据未显示)。这些神经类器官生长至30天直径超过2000μm，并显示多个神经鞘膜(图1A和图5F和图5G)。接下来，进行冷冻切片以表征人中脑样类器官，并观察到人中脑样类器官的神经上皮基于非典型蛋白激酶C(aPKC)(一种顶端标记蛋白)的定位显示出顶端-基底极性(图5H)。在神经上皮的顶面也检测到Ki67阳性增殖细胞，但在神经上皮的基底表面观察到MAP2阳性神经元(图1B)。流式细胞术分析进一步显示，在第25天，51％的细胞为Ki67(一种增殖的细胞标记物)阳性，但在第35天仅有19％的细胞为Ki67阳性，表明祖细胞的比例在人中脑样类器官成熟时降低(图1C)。相应地，人中脑样类器官中MAP2阳性细胞的比例增加至3.6倍，这与含有MAP2阳性细胞的层的尺寸增加相关(图1C)。这些数据表明人中脑样类器官中的细胞逐渐从神经祖细胞转变为更成熟的神经元。为了进一步表征发育中的中脑神经上皮细胞，用EdU标记增殖中的祖细胞，并针对OTX2进行染色，OTX2是指导和分离中脑与后脑的转录因子。OTX2的表达从顶面内的细胞中出现并延伸至人中脑样类器官内的神经上皮的中间区域(图1D和51I)，并且该区域中约35％的细胞对于EdU和OTX2均为双阳性(图1E)。该结果表明，人中脑样类器官的顶端区域附近的增殖细胞是中脑祖细胞。接下来，使用针对不同细胞类型的标记物的抗体通过免疫染色在35天进一步分析神经类器官的细胞结构。类似于最终产生mDA神经元的小鼠胚胎中脑底板的分层，35天时人中脑样类器官显示三层：神经祖细胞所在的增殖腹侧区(VZ)；中间区(IZ)，未成熟mDA神经元在腹侧迁移时穿过的层；以及成熟mDA神经元开始表达与多巴胺合成相关的基因的外套层(MZ)(图1F)。在VZ和IZ中，中脑祖细胞表达MASH1和OTX2(图1G和H)。在IZ中检测到在有丝分裂后mDA祖细胞中表达的孤儿核受体NURR1(图1I)。该数据表明，所呈现的体外人中脑样类器官培养系统产生使人想起通过具有不同的顶端-基底极化的多个叠层中的神经祖细胞的分化而扩大的早期的体内中脑的类器官。
鉴定和验证人中脑样类器官中的A9mDA神经元
可能是通过增加MZ处的神经祖细胞和神经祖细胞衍生的成熟神经元，人中脑样类器官大小呈指数增长(图5G)。在成熟神经元标记物MAP2标记的MZ处，神经元开始表达是中脑多巴胺能(mDA)神经元的主要标记物的酪氨酸羟化酶(TH)(图2A)。
为了进一步量化所产生的人中脑样类器官中的神经元群体，将人中脑样类器官解离成单细胞悬浮液并进行流式细胞术分析。有趣的是，15％的MAP2阳性成熟神经元共表达TH，表明MZ处的成熟神经元确实是mDA神经元(图2B)。该数据表明35天时的神经类器官类似于包含三层不同的神经元群体(包括DA祖细胞、中间祖细胞和mDA神经元)的早期中脑底板组织有序。实际上，在第60天，人中脑样类器官的MZ内的TH阳性神经元表达mDA神经元标记物DAT(图2C和图2D)。
mDA神经元有两种主要的亚型：黑质致密部(SNpc)(也称为A9神经元)的mDA神经元，它们产生黑质纹状体通路；腹侧被盖区(VTA)的mDA神经元(也称为A10神经元)，它们产生中脑边缘和中皮层通路，神经支配边缘系统和新皮层的部分。在第60天，可以观察到TH阳性神经元，其对GIRK2也是阳性的，G蛋白门控的内向整流K+通道2是在A9亚型mDA神经元中富集表达的重要功能蛋白(图1E和图1F)。然而，几乎所有TH阳性神经元都对Calbindin呈阴性，Calbindin是一种钙结合蛋白，通常在A10亚型mDA神经元中表达(图2G和图2H)。该数据表明，长期培养的人中脑样类器官产生mDA神经元，其分化成A9亚型的神经元。人中脑样类器官中A9多巴胺能神经元的功能成熟
接下来，测试了人中脑样类器官中的神经元是否是电活性和功能成熟的。不是从人中脑样类器官中解离和培养单层细胞，而是将人中脑样类器官切成350μm切片，并进行急性靶向全细胞贴片记录(图3A)。在电压钳模式下，人中脑样类器官中的神经元显示出快速、失活的内向和外向电流，这可能分别对应于电压依赖性钠(Na+)通道和钾(K+)通道的开放(图3B)。来自电压门控Na+通道和电压门控K+通道的峰值电流从第33天到第65天显著增加(图3C)。与此一致，观察到膜电阻(Rm)显著降低和膜电容(Cm)增加，这与神经元的功能成熟相关。通过在电流钳模式下使膜去极化可以引发动作电位(AP)(图3D)，并且人中脑样类器官中的大多数神经元可以引发动作电位(69.23％，n＝26)(图3E)。人中脑样类器官中的一些神经元显示出节律性放电，这与啮齿动物DA神经元相似(图6A)(Ferrari等，2012)。接下来，研究了人中脑样类器官中的神经元是否表现出原位自发突触传递(图3F)，并发现大多数记录的神经元表现出自发的兴奋性突触后电流(sEPSCs)，以及自发抑制性突触后电流(图6B)。另外，响应于细胞外电刺激，观察到大幅度兴奋性突触后电位(EPSP>20pA)，证明人中脑样类器官内的神经元参与网络活动(图3G)。在人中脑样类器官中记录的神经元(用生物胞素标记)的回顾性免疫组织化学显示，大多数神经元(n＝10个中的8个)是TH阳性，表明记录的神经元确实是mDA神经元(图3H)。为了进一步确定人中脑样类器官中的mDA神经元是否产生细胞外多巴胺，进行了高效液相色谱(HPLC)测量，发现随着它们成熟进展，人中脑样类器官中多巴胺含量逐渐增加(图3I)。总之，该数据表明人中脑样类器官中的mDA神经元产生DA，表现出成熟的神经元特性，并且能够与人中脑样类器官中的神经元形成突触。
鉴定人中脑样类器官中的而不是小鼠中脑样类器官中的的神经黑色素。
在人中脑样类器官的长期培养过程中，从第45天开始，通过光学显微镜可以在人中脑样类器官的表面上观察到稀疏的黑褐色沉积物。这些沉积物的数量随时间逐渐增加(图4A)。不受理论束缚，假设这些深色沉积物是神经黑色素(NM)，其为在人和灵长类动物的SN中积累的不溶的黑褐色颗粒状色素。为了证实这一点，人中脑样类器官经石蜡包埋、切片成人中脑样类器官切片、Fontana-Masson染色以进行神经黑色素检测。发现这些沉积物对Fontana-Masson染色确实是阳性的(图4B、图7A和图7B)。在图4B中，在神经元细胞溶质中观察到大的、粗糙的、黑色染色的颗粒(可能是神经黑色素)，并且可以观察到这些颗粒中的一些(大小为2μm至3μm)在神经元细胞外，表明这些神经黑色素可以从人中脑样类器官中的hDA神经元分泌出(图4B)。相反，Fontana-Masson染色未能在体外在相当的天数从2D培养的人诱导的DA神经元检测到阳性颗粒(数据未显示)。鉴于神经黑色素是作为mDA神经元中DA合成的副产物合成的，外源性多巴胺前体(L-DOPA)的添加被理解为加速神经黑色素在较年轻的人中脑样类器官中的积累。实际上，在第35天用来自人中脑样类器官的L-DOPA(50μM)处理的人中脑样类器官中观察到神经黑色素样颗粒的强烈分布，而在同一天的未处理的人类中脑样类器官中未观察到神经黑色素样颗粒(图4C)。为了检查含有神经黑色素的细胞是否TH阳性细胞，使用来自相同的人中脑样类器官的相邻切片进行免疫染色。因此，在同一人中脑样类器官中观察到来自显示为Fontana-Masson染色阳性的区域的TH阳性细胞(图4D)。神经黑色素样颗粒主要在灵长类动物中观察到，但在小鼠中没有观察到。在小鼠胚胎干细胞衍生的中脑样类器官中没有观察到神经黑色素样颗粒，该小鼠胚胎干细胞衍生的中脑样类器官在体外在相当的天数含有高百分比的TH阳性神经元(图4D)。此外，在来自同一人类胚胎干细胞系(H1系)的人脑类器官中可能没有检测到Fontana-Masson染色阳性颗粒(图7B)，表明只有在三维培养中生长的mDA神经元才能原位产生神经黑色素样颗粒。总之，已经证明人类胚胎干细胞聚集体可以被转向分化成中脑祖细胞，最终自组织成包含具有功能性mDA神经元的三个不同层的3D人中脑样类器官。发现只有3D中脑样类器官中的人mDA神经元才能产生神经黑色素样颗粒，而2D培养中的人mDA神经元或3D中脑样类器官中的小鼠mDA神经元不能产生神经黑色素样颗粒(图4D)。
最近，通过使用合成的多巴胺黑色素代替天然的多巴胺黑色素，研究了NM与小神经胶质细胞诱导的神经炎症导致的PD中DA神经元的易损性的关联。
本文说明性描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任何要素，限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”，“包含”，“含有”等应当被广泛地解读而不受限制。另外，这里使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施例和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。
在此广泛和一般地描述了本发明。落入一般公开内容中的每个较窄物种和亚属组群也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或否定限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体叙述了被切除的材料。
其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。
实验部分
hESCs的培养
使用人胚胎干细胞系(hESC)H1系(WA01，第30代)和H9系(WA09，第25代)。在无饲养细胞条件下在mTeSR培养基(Stemcell Technologies)中在包被基底膜基质的6孔板(BDBiosciences)上在37℃在5％湿润的CO2培养箱中维持人胚胎干细胞。每天更换培养基，并使用1mg/ml Dispase(Stemcell Technologies)每5天分离人胚胎干细胞培养物。所有人胚胎干细胞系均被证实对支原体污染呈阴性并且表现出正常的核型。可商购的人胚胎干细胞(ESC)系(H1和H9；WiCell研究所)用于参考实验。这些细胞系由人胚胎的内细胞团建立。据了解，所有与这些细胞系有关的信息都是公开的(参见例如James et al.,1998，以及https://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa01.cmsx和https://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa09.cmsx在线提供的信息)。
产生人中脑样类器官
为了产生人中脑样类器官，使用少于40代的人胚胎干细胞系。用TrypLE Express(Life Technologies)将人胚胎干细胞从完整的克隆解离为单细胞，并在具有V底锥形孔(Sumitomo Bakelite)的低细胞粘附96孔培养板的每个孔中铺板10,000个细胞以在神经元诱导培养基中形成均一的EB，神经元诱导培养基含有DMEM/F12：Neurobasal(1：1)、1：100N2补充剂(Invitrogen)、1：50不含维生素A的B27(Invitrogen)、1％GlutaMAX(Invitrogen)、1％最小必需培养基-非必需氨基酸(Invitrogen)和0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)、补充有1μg/ml肝素(Sigma-Aldrich)、10μM SB431542(Stemgent)、200ng/ml头蛋白(Prospec)、0.8μM CHIR99021(Reagents Direct)和10μM ROCK抑制剂Y27632(Calbiochem)。最初48小时加入ROCK抑制剂，第2天更换神经元诱导培养基。在第4天，加入100ng/ml SHH-C25II(R&amp；D Systems)和100ng/ml FGF8(R&amp；D Systems)培养人中脑样类器官，用于中脑图案化。3天后，人中脑样类器官开始挤出神经外胚层芽，完全除去培养基并立即通过使用预先冷却的200μl移液管头移液在每个孔中加入30μl生长因子降低的基底膜基质。将基底膜基质包埋的中脑样类器官放入37℃培养箱中30分钟以使基底膜基质凝固，并在含有Neurobasal、1：100N2补充剂(Invitrogen)、1：50不含维生素A的B27(Invitrogen)、1％GlutaMAX(Invitrogen)、1％最小必需培养基-非必需氨基酸(Invitrogen)和0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)，补充有2.5μg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich)、200ng/ml层粘连蛋白(Sigma-Aldrich)、100ng/ml SHH-C25II(R&D Systems)和100ng/ml FGF8(R&D Systems)的组织生长诱导培养基中生长24小时。一旦hMLO被包埋在基底膜基质中，类器官开始形成更多扩张的神经上皮。为了促进生长和分化，通过使用经切割的1000μl移液管头移液将hMLO转移到超低附着6孔板(Costar)上含有Neurobasal、1：100N2补充剂(Invitrogen)、1：50不含维生素A的B27(Invitrogen)、1％GlutaMAX(Invitrogen)、1％最小必需培养基-非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)、10ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/mlGDNF(Peprotech)、100μM抗坏血酸(Sigma-Aldrich)和125μM db-cAMP(Sigma-Aldrich)的最终分化培养基中。使用定轨振荡器培养人中脑样类器官以增强营养和氧气的交换。在培养基中包括抗生素(100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素)以防止潜在的细菌污染以进行长期培养。培养基每3天更换一次。
免疫组化
将人中脑样类器官在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，在PBS中的30％蔗糖溶液中于4℃温育过夜，随后包埋在O.C.T化合物(SakuraFinetek)中用于冷冻切片。冷冻的人中脑样类器官以16μm厚度冷冻切片。对于免疫组织化学，用封闭缓冲液(含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.5％Triton X-100的PBS)在室温下封闭冷冻切片的人中脑样类器官1小时。然后用在缓冲液(含有1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS)中稀释的一抗对切片染色，并在室温下用PBS中的二抗染色1小时。所有切片用DAPI(1/5000，Sigma-Aldrich)复染，并用Aqua-mount(Thermo)固定或保持在PBS中，避光。在LSM710共聚焦显微镜或Observer Z.1倒置显微镜(Zeiss)上拍摄图像。表4中描述了一抗和二抗。RNA提取、逆转录、实时RT-PCR和RNA-seq制备
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从hMLO、2D-DA神经元或未分化的hESC分离总RNA。用DNASE I(Ambion)消化DNA污染物，并使用SuperScript II试剂盒(Invitrogen)逆转录500ng RNA以产生cDNA。使用ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystem)进行定量RT-PCR。应用ΔΔCt方法将每个基因的表达水平标准化为GAPDH的表达水平。使用的引物先前进行测试以确保特定的解链曲线，并且另外通过使用由人神经元样品(ScienCell)制备的人cDNA文库进行验证。对于hMLO和2D-DA神经元的RNA-seq文库制备，通过柱(Puelink RNA Minikit，Ambion)进一步纯化总RNA，并根据制造商的方案使用4μg总RNA来制备(TruSeq RNASample Preparation Kit v2,Illumina)。样品被多重化并被测序单读取150bp配对末端(HiSeq 2000，Illumina)。
人脑解剖
使用手术刀和手持式牙钻在目视检查下从妊娠中期胎儿脑干切开中脑的腹侧半部分(表3)。病例是母亲知情同意捐献的，并基于肉眼的大脑检查中没有任何先天性解剖异常以及产前检查中未发现任何主要遗传缺陷进行选择。IRB批准来自Western IRB，这是一个被美国许多独立机构使用的私人且经过充分认证的IRB：地址：1019 39th Avenue SESuite 120,Puyallup,WA 98374-2115。研究编号：1126332。WIRB协议号：20111080。批准到期：2016年7月18日。
死后大脑：RNA提取和测序
此前已描述了死后RNA提取和测序以及RNA-seq数据处理的细节(Jaffe et al.,2015)。从胎儿脑获得腹侧中脑的死后组织匀浆。RNA提取后，使用Agilent TechnologiesBioanalyzer 2100的高分辨率毛细管电泳测量RNA质量，并获得所有10个样品的RNA完整值(RNA integrity number，RIN)。
核糖体RNA去除(depeletion)(RiboZero)与链特异性文库制备和Q/C
使用Illumina TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero sample Prep Kit按照制造商的方案构建RNA-seq文库。使用Ribo-zero珠从经约800ng DNA酶处理的总RNA中去除核糖体RNA。纯化后，在升高的温度(94℃)下使用二价阳离子持续2分钟，将不含核糖体RNA的总RNA片段化成小片。在此条件下，片段长度范围为130-290bp，中值长度为185bp。使用逆转录酶和随机引物将切割的RNA片段复制成第一链cDNA。使用DNA聚合酶I和RnaseH，以dUTP代替dTTP合成第二链cDNA。然后使用T4DNA聚合酶、T4PNK和Klenow DNA聚合酶对这些cDNA片段进行末端修复过程，并使用Klenow exo(3'至5'exo minus)添加单个'A'碱基，然后使用T4DNA连接酶连接Illumina PE连接子。将指标(96个独特的双指标对)插入Illumina连接子中，以便在必要时可以在8泳道流通池的一个泳道中对多个样品进行测序。然后将这些产物纯化并用15个PCR循环富集以产生最终cDNA文库，用于使用H100碱基对配对末端读数和Illumina HiSeq3000进行高通量DNA测序，每个样品靶向约100M的测序片段(reads)。通过Qubit(Invitrogen，CA)测量RNA文库的浓度。使用HT DNA 1K/12K/HiSens Labchip通过LabChipGX(Caliper，MA)测量RNA-seq文库的质量。
生物信息学分析
使用GENCODE Release 19版本的基因注释，用TopHat2-2.0.12(Kim et al.,2013)将RNA-Seq数据针对人类基因组版本hg19作图。R-3.1.2(Team,2014)和Bioconductor3.0(Gentleman et al.,2004)用于RNA-Seq分析。使用R package GenomicAlignments(mode＝'Union'，inter.feature＝FALSE)(Lawrence et al.,2013)计数测序片段，仅保留主要测序片段的比对。使用DESeq 2(Love et al.,2014)计算计数的Rlog转换值和差异表达。对于上调和下调基因，我们分别使用调整后的p值阈值0.0005和对数倍数变化阈值2(-2)。使用ggplot2_1.0.0(Wickham,2009)创建覆盖图(图2E和图2F)和PCA(图6F)。将来自GTEx项目的成人脑RNA-Seq数据(Consortium,2015)用作比较。为了绘制热图中的基因表达，通过倍数变化对基因进行分类，并且通过减去平均值并除以标准偏差来标准化每个基因的表达评估分布以用于可视化。
流式细胞术
对于细胞内染色，将细胞固定并用转录因子染色缓冲液组(eBioscience)透化。简而言之，首先用TrypLETM Express(Gibco)解离细胞，离心并将细胞沉淀重悬于1ml 1×固定/透化缓冲液中，在黑暗中于4℃持续30分钟。在不洗涤以使细胞损失最小化的情况下，向细胞悬浮液中加入2ml 1×透化缓冲液并将样品离心。滗析上清液，并在室温用100μl透化缓冲液中的抗体将样品染色1小时。最后，将300μl染色缓冲液加入细胞悬浮液中直至分析。通过具有细胞过滤器(BD Biosciences)的BD Falcon 12×75mm管过滤细胞。使用BDLSRFortressaTM X-20(BD Biosciences)进行流式细胞术分析，并且所有数据由FlowJo软件表示。用两个阴性对照样品定义负阈值门(用单独的二抗体染色的解离的hMLO细胞和用一抗和二抗二者染色的hESC)。
多巴胺能神经元诱导(2D方法)
按照基于底板的神经诱导方案进行DA神经元分化(Kriks et al.,2011)。将hESC以35×103个细胞/cm2铺板，并在含有DMEM、15％KSR、2mM L-谷氨酰胺和10μMβ-巯基乙醇，添加有100nM LDN193189(Stemgent)和10μM SB431542的基底培养基1中在基底膜基质上生长24小时。在第1天，将培养基更换为添加有100nM LDN193189、10μM SB431542、100ng/mlSHH-C25II、2μM嘌呤胺(Stemgent)和100ng/ml FGF8的基底培养基1，持续2天。在第3天，添加3μM CHIR99021改变培养基。至第5天，如前所述，将培养基逐渐转移至含有DMEM、N2补充剂、2mM L-谷氨酰胺和10μMβ-巯基乙醇(基底培养基2)的N2培养基中持续2天(Chambers etal.,2009)。在第11天起，将含有Neurobasal/B27/L-谷氨酰胺(Invitrogen)基地培养基3更换为补充有3μM CHIR99021，持续2天。之后，使用补充有10μM DAPT(Sigma-Aldrich)、0.2mM抗坏血酸、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM db-cAMP和1ng/ml TGF-β3(Invitrogen)的基底培养基3直至20天，每隔一天更换一次培养基。在第20天，将细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA解离，以高细胞密度(每平方厘米300-400×103个细胞)重新铺板在预包被有0.1mg/ml聚赖氨酸和1μg/ml层粘连蛋白的皿中。细胞在含有10μM DAPT、0.2mM抗坏血酸、20ng/mlBDNF、20ng/ml GDNF、0.2mM db-cAMP和1ng/ml TGF-β3的Neurobasal/B27培养基中生长，每隔一天更换新鲜培养基直至如所示的实验分析。
产生脑器官
使用与Lancaster等人相同的方案产生脑类器官(Lancaster and Knoblich,2014；Lancaster等，2013)。简而言之，用TrypLETM Express解离hESC，将10,000个细胞平铺在具有V底锥形孔的低细胞粘附96孔培养板的每个孔中以形成DMEM/F12和20％Knockout血清替代物(Gibco)、1％GlutaMax(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)、4ng/ml的bFGF(Invitrogen)和20μM ROCK抑制剂Y27632(Calbiochem)中的EB。在第6天，将EB转移至低粘附24孔板中含有DMEM/F12、1：100N2补充剂(Invitrogen)、1％GlutaMax(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)和1μg/ml肝素(Sigma-Aldrich公司)的神经诱导培养基中。在第11天EB开始形成神经上皮，并转移到带有小凹坑的Parafilm片上的基底膜基质(BD Bioscience)包埋中。基底膜基质液滴在37℃固化，并在含有以下的分化培养基中生长以允许静止增长：DMEM/F12：Neurobasal(1：1)、1：100N2补充剂(Invitrogen)、1：50不含维生素A的B27(Invitrogen)、1％GlutaMAX(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)、2.5μg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich)和100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素(Gibco-BRL)。在第15天，将液滴转移到超低附着6孔板(Costar)上在分化培养基中含有B27补充剂和维生素A(Invitrogen)的分化培养基中。大脑类器官在定轨振荡器上培养。每3天更换一次培养基。
神经黑色素染色(Fontana-Masson染色)
将人中脑样类器官在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜，在PBS中洗涤，包埋在石蜡块中，随后切成4μm厚。接下来，将hMLOsections脱石蜡，用蒸馏水水合，并根据制造商的方案用Fontana-Masson染色试剂盒(Abcam)染色(Carriel et al.,2011)。简而言之，将切片置于氨性银溶液中并在58℃至60℃水浴中孵育30至60分钟，直至组织切片变为黄色/棕色。用蒸馏水洗涤组织切片，并在氯化金溶液(0.2％)中孵育30秒。接下来，将切片在氯化金溶液(0.2％)中孵育30秒，随后与硫代硫酸钠溶液(5％)一起温育2分钟。最后，将切片在核快红溶液中孵育5分钟以进行染色和固定。在LSM710共聚焦显微镜或Observer Z.1倒置显微镜(Zeiss)上拍摄图像。
神经黑色素的分离和定量
将NM颗粒阳性的hMLO在具有1.5ml pH 7.4磷酸盐缓冲液(50mM)的玻璃管中匀浆，然后以12,000g离心30分钟。将得到的沉淀用pH7.4磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后在37℃使用振荡器用1.5ml含有十二烷基硫酸钠(5mg/ml)和0.2mg/ml蛋白酶K(Fermentas)的Tris缓冲液(50mM，pH7.4)重悬浮3小时。随后将重悬的NM颗粒以12,000g离心30分钟，然后用NaCl(9mg/ml)洗涤两次，并用蒸馏水洗涤两次。为了定量NM颗粒，将NM颗粒在80℃溶解于1ml的1M NaOH中1小时，以通过分光光度计(350nm)测量NM。离心溶液并收集上清液。对于通过AFM和SEM对NM结构的成像，将沉淀用1.5ml甲醇和1ml己烷洗涤。最后，通过冷冻干燥(Bush etal.,2006；Zecca et al.,2002)。
原子力显微镜(AFM)
在该测量中，使用商业AFM系统(NX-Bio，Park Systems Corp.，Korea)。安装在AFM头上的Z扫描仪使探头在样品表面上移动时可以保持恒定的反馈条件(力或距离)。它还与商用倒置光学显微镜(Ti eclipse，Nikon，Japan)相结合，使得可以轻松检测样品和AFM探针位置。所有图像均在室温于空气条件中使用AFM接触模式进行。扫描面积为2×2μm2，分辨率为256×256像素。同时收集高度和偏转图像，扫描速率为0.8-1.2Hz。为了获得可靠的图像，我们使用非常柔软的商用Si悬臂(CSG-01，NT-MDT，Russia)，用UV/臭氧清洁剂清洁15分钟。通过测量探针的热波动来评估探针的弹簧常数(0.06N/m)和共振频率(12kHz)。对于AFM成像，通过移液管将NM溶液(5μl)滴加到清洁和切割的云母表面上来制备NM样品。将云母表面上的NM样品储存并在黑暗条件下干燥，直至NM完全干燥。
扫描电子显微镜(SEM)
在SEM分析之前，对NM样品实施如上所述的用于AFM样品制备的程序。然后使用Auto Fine Coater(JEOL JFC-1600，Japan)在20mA用10nm厚的金层溅射涂覆预干燥的样品50秒，并且使用配备有加热电压为5.0kV的冷阴极发射器的场发射扫描电子显微镜(JEOL6340F，Japan)处理SEM图像。
单细胞基因表达分析
通过TrypLETM Express将120天至150天的hMLO解离成单细胞，并通过具有细胞过滤器的BD Falcon 12×75mm管过滤细胞。为了收集含有NM的细胞，基于使用激发激光355nm和过滤器530/30检测，使用BD FACSAria II(BD Bioscience)将细胞直接分选到装有5μl逆转录特异性靶扩增溶液(Life Technologies)的96孔PCR板中(Nighswander-Rempel etal.,2005)。对于阳性对照，将2D分化的DA神经元悬浮并直接用相同的FACS仪器置于96孔PCR板中。在具有20个循环的预扩增的热循环仪中进行逆转录(RT)特异性靶扩增，并且通过核酸外切酶1(New England BioLabs)处理消化未使用的引物，然后在分析之前将样品稀释3倍。通过qRT-PCR验证96孔PCR板中的预扩增产物GAPDH、MAP2和TH的表达，并且除去了显示弱表达或不表达这些基因的细胞。为了表征hMLO中的mDA神经元，分析了除那些细胞之外的细胞。根据制造商的说明，使用具有低ROX(Bio-Rad)的2X SsoFast EvaGreen Supermix和在Biomark系统(Fluidigm)上的96×96动态阵列中的单个qPCR引物分析这些样品。使用BioMark实时PCR分析软件(Fluidigm)计算Ct值。结果表示为通过图7N和图7O中的颜色编码的Ct值的热图。每个引物对被设计和验证以确保特定的解链曲线并且另外通过使用商业参考样品[从人神经元制备的人cDNA文库(ScienCell)]进行评估。
电生理学
全细胞膜片钳记录技术用于测量人中脑样类器官中神经元的内在特性。将每个人中脑样类器官置于室中，并浸没在连续灌注的在30℃至32℃用95％O2和5％CO2饱和的人工CSF(aCSF)下。用细胞内溶液填充贴片移液管(2至4MΩ)，该细胞内溶液含有(以mM计)：甲磺酸钾135、KCl 10、HEPES 10、EGTA 1Na2ATP 2；290mOsm；用KOH将pH调节至7.2-7.4。使用IR-DIC可视化技术和Olympus BX51WI直立显微镜，使用×60水浸透镜进行全细胞记录。使用MultiClamp 700B放大器记录信号，使用贝塞尔滤波器以3kHz过滤，并使用Digidata 1322A模拟-数字(A/D)板(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)以10kHz数字化。为了测量Na+电流和K+电流，施加电压阶跃(500毫秒持续时间)，从-70mV的保持电位到-50mV至+90mV(10mV增量)的测试电位范围。对于兴奋性测试，注入一系列增幅(5pA步长)的电流脉冲(500毫秒)以产生电流发射频率关系。在-70mV的保持电位收集自发兴奋性突触后电流(sEPSC)。通过位于距hMLO内的记录神经元约300μm的钨丝电极诱导诱发兴奋性突触后电流(eEPSCs)。
高效液相色谱(HPLC)
将单个人中脑样类器官或人皮质球体(hCO)在100μl 0.5N高氯酸中匀浆，离心，并通过0.1mm过滤器(Millipore)过滤。仅将得到的上清液加载到HPLC系统(ThermoScientific)中。多巴胺的流动相用12.5％乙腈缓冲液(pH3.0，90mM磷酸二氢钠一水合物、50mM柠檬酸、2.1mM 1-辛磺酸盐一水合物和0.1mM EDTA)运行。使用Dionex Coulochem III电化学检测器以通过定制程序测定多巴胺水平，灵敏度范围为2-10nA。然后结果通过细胞计数的归一化和峰读数转换为数值表达来分析。
统计分析
所有实验以至少一式三份进行，结果表示为平均值±标准误差。使用单向ANOVA检验进行统计学分析，然后如果需要，进行学生t检验。p<0.05被认为是统计学上显著的。
表
表1：NM颗粒的定量分析。通过使用定制的原子力显微镜收集数据，并使用定制的成像过程程序进行分析。
表2：本研究中分析的每个诱导神经元的主要电生理参数的总结
表3：用于进行RNA-seq分析的每个人类胎儿中脑样本的信息。
表4：用于免疫染色和流式细胞术的抗体及其稀释液的列表
表5：在这项工作中用于定量RT-PCR的引物的详细信息
参考文献：
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序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 从人多能干细胞中产生中脑特异性类器官
<130> 9869SG4380
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAX6 正向引物
<400> 7
tccacccggc agaagattgt a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAX6 反向引物
<400> 8
tgtctcggat ttcccaagca a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX1 正向引物
<400> 9
gaacgccttc atggtgtggt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX1 反向引物
<400> 10
tgtaatccgg gtgctccttc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OTX2 正向引物
<400> 11
ccagacatct tcatgcgaga g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OTX2 反向引物
<400> 12
ggcaggtctc actttgtttt g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CORIN 正向引物
<400> 13
aatcccacaa cagagcatcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CORIN 反向引物
<400> 14
ggagcagttg acctcgtcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXA2 正向引物
<400> 15
ggggtagtgc atcacctgtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXA2 反向引物
<400> 16
ccgttctcca tcaacaacct 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAP2 正向引物
<400> 17
cgaagcgcca atggattcc 19
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAP2 反向引物
<400> 18
tgaactatcc ttgcagacac ct 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TH 正向引物
<400> 19
tgtctgagga gcctgagatt cg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TH 反向引物
<400> 20
gcttgtcctt ggcgtcactg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PITX3 正向引物
<400> 21
ccaaccttag tccgtgccag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PITX3 反向引物
<400> 22
tgtgtagggc ctagtccacc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EN1 正向引物
<400> 23
tctcgctgtc tctccctctc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EN1 反向引物
<400> 24
cgtggcttac tccccattta 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EN2 正向引物
<400> 25
ccggcgtggg tctactgta 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EN2 反向引物
<400> 26
cctctttgtt cgggttcttc tt 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NURR1 正向引物
<400> 27
gctggactcc ccattgcttt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NURR1 反向引物
<400> 28
cggagctgta ttctcccgaa 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMX1A 正向引物
<400> 29
acgtccgaga accatcttga c 21
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMX1A 反向引物
<400> 30
caccaccgtt tgtctgagc 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMX1B 正向引物
<400> 31
cggactgcgc caagatgtt 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMX1B 反向引物
<400> 32
ttgactcgca tcaggaagcg 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDC 正向引物
<400> 33
attcatctgc cctgagttcc g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DDC 反向引物
<400> 34
ccaatagcca tttgtgggga t 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALDH1A1 正向引物
<400> 35
ccgtggcgta ctatggatgc 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALDH1A1 反向引物
<400> 36
gcagcagacg atctctttcg at 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALDH1A2 正向引物
<400> 37
gggtgtgttc ttcaatcaag gt 22
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALDH1A2 反向引物
<400> 38
tggtggggtc aaagggact 19
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GIRK2 正向引物
<400> 39
cacatcagcc gagatcggac 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GIRK2 反向引物
<400> 40
ggtagcgata ggtctccctc a 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNS3 正向引物
<400> 41
aggagctgtg cgtattctca t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNS3 反向引物
<400> 42
cttgcgttcc tggtagcgat t 21
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX6 正向引物
<400> 43
agggagtctt gccgatgtg 19
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX6 反向引物
<400> 44
caggctctca ggtgtacctt ta 22
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OXR1 正向引物
<400> 45
ttcgaccaaa cctaagtgat ccc 23
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OXR1 反向引物
<400> 46
ggggtgtcta aacctgtcat tg 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNCG 正向引物
<400> 47
tgagcagcgt caacactgtg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNCG 反向引物
<400> 48
gaggtgaccg cgatgttctc 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SATB1 正向引物
<400> 49
agagctgtca gtggaaggaa aca 23
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SATB1 反向引物
<400> 50
gtggcactgt tgaacgaaac aaat 24
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZDHHC2 正向引物
<400> 51
tcccggtggt gttcatcac 19
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZDHHC2 反向引物
<400> 52
caacttgttc gccagtgttt tc 22
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB3C 正向引物
<400> 53
ggaagacgag cgggtcatc 19
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB3C 反向引物
<400> 54
ctctctgaca ttttgtcgca gat 23
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF1 正向引物
<400> 55
acaccgacgg gcttttatac g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF1 反向引物
<400> 56
cccattcttc ttgaggccaa c 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAD1 正向引物
<400> 57
gcggacccca ataccactaa c 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAD1 反向引物
<400> 58
cacaaggcga ctcttctctt c 21
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALB1 foward primer
<400> 59
tgtggatcag tatgggcaaa ga 22
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALB1 反向引物
<400> 60
ctcagtttct atgaagccac tgt 23
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALB2 正向引物
<400> 61
agcgccgagt ttatggagg 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CALB2 反向引物
<400> 62
tggtttgggt gtattcctgg a 21
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TACR3 正向引物
<400> 63
ctctggtccc tggcgtatg 19
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TACR3 反向引物
<400> 64
tgaagcgcgt agatgaaatt ga 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CARTPT 正向引物
<400> 65
ccgagccctg gacatctact 20
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CARTPT 反向引物
<400> 66
atgggaacac gtttactctt gag 23
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGF 正向引物
<400> 67
cgctgacccg agtgaatctg 20
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGF 反向引物
<400> 68
catacgcgcc tggaattga 19
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIP 正向引物
<400> 69
ccaaaacaaa ccagaacagt cagc 24
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIP 反向引物
<400> 70
tgagaagagt caggagcaca agg 23
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LPL 正向引物
<400> 71
tcattcccgg agtagcagag t 21
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LPL 反向引物
<400> 72
ggccacaagt tttggcacc 19
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EFNB3 正向引物
<400> 73
ctcggcgaat aagaggttcc a 21
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EFNB3 反向引物
<400> 74
gtgaagcgga gatccaggtc 20
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGR1 正向引物
<400> 75
ggtcagtggc ctagtgagc 19
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGR1 反向引物
<400> 76
gtgccgctga gtaaatggga 20
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FZD1 正向引物
<400> 77
atcgaagcca actcacagta ttt 23
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FZD1 反向引物
<400> 78
cacgttgtta agccccacg 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADCYAP1 正向引物
<400> 79
ccactcggac gggatcttc 19
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADCYAP1 反向引物
<400> 80
gccgccaagt atttcttgac ag 22
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SDC2 正向引物
<400> 81
tggaaaccac gacgctgaat a 21
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SDC2 反向引物
<400> 82
ataactccac cagcaatgac ag 22
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NEFM 正向引物
<400> 83
gaaatcgctg cgtacagaaa ac 22
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NEFM 反向引物
<400> 84
taatggctgt cagggcctct t 21
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LRRK2 正向引物
<400> 85
ttttgatgcc atgcactcat ttc 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LRRK2 反向引物
<400> 86
ggaatcgcta gggaatgtaa aca 23
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PARK2 正向引物
<400> 87
cccacctctg acaaggaaac a 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PARK2 反向引物
<400> 88
tcgtgaacaa actgccgatc a 21
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PARK7 正向引物
<400> 89
aaccggaagg gcctgatag 19
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PARK7 反向引物
<400> 90
gcaagagggt gtgttgtaac t 21
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNCA 正向引物
<400> 91
aagagggtgt tctctatgta ggc 23
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNCA 反向引物
<400> 92
gctcctccaa catttgtcac tt 22
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCAM 正向引物
<400> 93
ggctccttgg actcatcttt c 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCAM 反向引物
<400> 94
gacatcacct gctacttcct g 21
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAPT 正向引物
<400> 95
gaagattggg tccctggaca ata 23
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAPT 反向引物
<400> 96
aggtcagctt gtgggtttca 20
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAD2 正向引物
<400> 97
caaacattta tcaacatgcg cttc 24
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAD2 反向引物
<400> 98
ctatgacact ggagacaagg c 21
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGAT 正向引物
<400> 99
agatgatgag aaacaacccc ag 22
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGAT 反向引物
<400> 100
cacgacaagc ccaaaatcac 20
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLX5 正向引物
<400> 101
acagagactt cacgactccc ag 22
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLX5 反向引物
<400> 102
tgtggggctg ctctggtcta 20
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLX6 正向引物
<400> 103
tggtgaaaga gaagcatttt ggact 25
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DLX6 反向引物
<400> 104
agagaagggc tgttatgtga ggaa 24
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERT 正向引物
<400> 105
tgctggcttt tgctagctac 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SERT 反向引物
<400> 106
gaagctcgtc atgcagttca 20
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPH2 正向引物
<400> 107
atggctcaga tcccctctac a 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPH2 反向引物
<400> 108
ggatccgcaa gtagtggaac a 21
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGLUT1 正向引物
<400> 109
tcaagtcccc gattccgtgc 20
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGLUT1 反向引物
<400> 110
tgcgattttg gttgtttccc ca 22
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGLUT2 正向引物
<400> 111
tggggctaca tcatcactca 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VGLUT2 反向引物
<400> 112
gaagtatggc agctccgaaa 20

Claims (57)

1.一种衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：
(a)培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；
(b)培养来自(a)的所述神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；
(c)在细胞外基质中包埋和培养来自(b)的所述中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；和
(d)培养来自(c)的所述神经上皮组织以获得中脑样类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在第一细胞培养基中培养步骤(a)中的所述多能干细胞，其中所述第一细胞培养基包含：
(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
(b)WNT信号激活剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二细胞培养基中培养步骤(b)的所述神经元谱系类胚体，其中所述第二细胞培养基包含：
(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
(b)WNT信号激活剂；
(c)刺猬信号蛋白；和
(d)成纤维细胞生长因子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在第三细胞培养基中培养步骤(c)的所述中脑区域化组织，其中所述第三细胞培养基包含：
(a)刺猬信号蛋白；和
(b)成纤维细胞生长因子。
5.根据权利要求1或4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质促进细胞分化和/或可维持三维培养和/或促进复杂组织的发育，并且所述细胞外基质由选自由以下组成的组的物质制成：基底膜基质、明胶、甲基纤维素、胶原、藻酸盐、藻酸盐微球、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白多糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支撑材料。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在第四种细胞培养基中培养步骤(d)的所述神经上皮组织，其中所述第四种细胞培养基包含：
(a)神经营养因子；
(b)抗坏血酸；和
(c)cAMP依赖性通路的激活剂。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂选自由以下组成的组：4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB 431542)、(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺(ROCK抑制剂Y27632)及其衍生物。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述WNT信号激活剂是GSK3抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR-990216-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈或其衍生物。
10.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述刺猬信号蛋白选自由以下组成的组：沙漠刺猬因子同源物(DHH)、印度刺猬因子同源物(IHH)和音猬因子(SHH)。
11.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF8。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述神经营养因子选自以下组成的组：神经营养蛋白、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体(GFL)和神经生成细胞因子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述神经营养蛋白选自以下组成的组：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4(NT-4)。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述GFL选自以下组成的组：神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、Artemin(ARTN)和人PSP(PSPN)。
15.根据权利要求6所述的方法，其中所述cAMP依赖性通路的激活剂是二丁酰基-cAMP(dbCAMP)。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一细胞培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.05％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml的用于细胞增殖的补充剂。
17.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二细胞培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml的用于细胞增殖的补充剂。
18.根据权利要求4所述的方法，其中所述第三细胞培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml的生长补充剂、以及浓度为50ng/ml至500ng/ml的干细胞生长促进剂。
19.根据权利要求6所述的方法，其中所述第四细胞培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml的生长补充剂、以及浓度为50ng/ml至500ng/ml的干细胞生长促进剂。
20.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中所述基础细胞生长培养基是达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)/Nutrient F-12。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述基础胚胎神经元细胞生长培养基是Neurobasal培养基。
22.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述谷氨酰胺补充剂是GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)。
23.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述抗生素是青霉素/链霉素。
24.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述还原剂是β-巯基乙醇。
25.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述用于扩增未分化细胞的补充剂是N-2补充剂。
26.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述用于维持神经元的补充剂是不含维生素A的B27。
27.根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述用于细胞增殖的补充剂是肝素。
28.根据权利要求18的方法，其中所述生长补充剂是胰岛素。
29.根据权利要求18的方法，其中所述干细胞生长促进剂是层粘连蛋白。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是三维方法。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在(a)下的培养为3至5天。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在(b)下的培养为3至5天。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在(c)下的培养为1至2天。
34.一种分离的中脑样类器官，通过前述权利要求中任一项所述的方法获得。
35.根据权利要求34所述的分离的中脑样类器官，包含中脑特异性细胞。
36.一种用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：
(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和
(b)WNT信号激活剂。
37.一种用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：
(a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
(b)WNT信号激活剂；
(c)刺猬信号蛋白；和
(d)成纤维细胞生长因子。
38.一种用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，包含：
(a)刺猬信号蛋白；和
(b)成纤维细胞生长因子。
39.一种用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：
(a)神经营养因子；
(b)抗坏血酸；和
(c)cAMP依赖性通路的激活剂。
40.根据权利要求36所述的培养基，其中所述用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml的用于细胞增殖的补充剂。
41.根据权利要求37所述的培养基，其中所述用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)、百分比0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μg/ml至5μg/ml的用于细胞增殖的补充剂。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml的生长补充剂、以及浓度为50ng/ml至500ng/ml的干细胞生长促进剂。
43.根据权利要求39所述的培养基，其中用于衍生和维持中脑样类器官的培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂，百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μg/ml至10μg/ml的生长补充剂、以及浓度为50ng/ml至500ng/ml的干细胞生长促进剂。
44.根据权利要求40或41中任一项所述的培养基，其中所述基础细胞生长培养基是达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)/Nutrient F-12。
45.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述基础胚胎神经元细胞生长培养基是Neurobasal培养基。
46.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述谷氨酰胺补充剂是GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)。
47.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述抗生素是青霉素G/链霉素。
48.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述还原剂是β-巯基乙醇。
49.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述用于扩增未分化细胞的补充剂是N-2补充剂。
50.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述用于维持神经元的补充剂是不含维生素A的B27。
51.根据权利要求40-41中任一项所述的培养基，其中所述用于细胞增殖的补充剂是肝素。
52.根据权利要求42所述的培养基，其中所述生长补充剂是胰岛素。
53.根据权利要求42所述的培养基，其中所述干细胞生长促进剂是层粘连蛋白。
54.根据权利要求40和权利要求44至51中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEM/F12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μg/ml至5μg/ml的肝素，30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632和100ng/ml至300ng/ml的头蛋白。
55.根据权利要求41和权利要求44至51中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEM/F12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μg/ml至5μg/ml的肝素、30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632、100ng/ml至300ng/ml的头蛋白、100ng/ml至300ng/ml SHH-C25II和100ng/ml至300ng/ml FGF8。
56.根据权利要求42、权利要求45至50和权利要求52至53中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含80％至100％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.5μg/ml至10μg/ml胰岛素、50ng/ml至500ng/ml层粘连蛋白、100ng/ml至300ng/ml SHH-C25II和100ng/ml至300ng/ml FGF8。
57.根据权利要求43和权利要求45-50中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含80％-100％的Neurobasal培养基、0.5％-3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％-3％的非必需氨基酸(NEAA)补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、5ng/ml至50ng/ml BDNF、5ng/ml至50ng/ml GDNF、70μM至600μM抗坏血酸和20μM至850μM的dc-cAMP。
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