CN115044539A - 一种鲨鱼肝细胞及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鲨鱼肝细胞及其培养方法，包括如下步骤：获取鲨鱼肝组织样本并进行预处理获得原代肝细胞；将获得的原代肝细胞置于培养基中重悬并培养，获得培养后的鲨鱼肝细胞；所述培养基含有氯化钠，血清替代品，纤粘连蛋白，胰岛素，转铁蛋白，孕酮，丁二胺，硒酸钠，青霉素‑链霉素和谷氨酰胺。本发明涉及肝细胞离体培养技术领域，本发明公开的鲨鱼肝细胞及其培养方法，操作简便，过程易于控制，便于观察，实验结果准确，可重复性好，不使用胎牛血清及动物源蛋白，可避免细菌、真菌、病毒、支原体等污染。可简化过滤性和下游纯化工艺，优化了生产工艺，同时提高细胞生产能力，利于鲨鱼肝细胞离体培养。

Description

一种鲨鱼肝细胞及其培养方法
技术领域
本发明涉及肝细胞离体培养技术领域，特别涉及一种鲨鱼肝细胞及培养方法。
背景技术
离体培养肝细胞是一种可以精确模仿体内肝脏活动的简单系统，广泛应用于肝病机理、药物代谢、致癌研究等，肝细胞的原代培养成功与否主要与肝细胞的分离、培养有关。在现在技术中，肝细胞的培养过程中使用的培养基多采用胎牛血清，由于培养基中引入动物蛋白质、脂类，容易引起细菌、真菌、病毒、支原体等污染。
发明内容
为解决上述存在问题，本发明提供的鲨鱼肝细胞培养方法，在培养过程中培养基不使用胎牛血清，由于培养基中不引入动物蛋白质、脂类，减少了细菌、真菌、病毒、支原体等污染。本发明提供的鲨鱼肝细胞培养方法具有操作简便，过程易于控制，便于观察，实验结果准确，可重复性好的特点。
本发明的一个目的在于提供一种鲨鱼肝细胞培养方法，该方法包括如下步骤：
获取鲨鱼肝组织样本并进行预处理获得原代肝细胞；
将获得的原代肝细胞置于培养基中重悬并培养，获得培养后的鲨鱼肝细胞；
所述培养基含有氯化钠，血清替代品，纤粘连蛋白，胰岛素，转铁蛋白，孕酮，丁二胺，硒酸钠，青霉素-链霉素和谷氨酰胺。
优选的，所述鲨鱼肝组织样本为颗粒刺鲨的肝组织样本。
优选的，所述颗粒刺鲨的肝组织样本通过如下方法获取：
获取颗粒刺鲨，放入消毒液中浸泡，灭菌，取肝脏组织；
清洗肝脏组织获得肝组织样本。
优选的，所述预处理包括：
基于获取的鲨鱼肝组织样本制得原代肝细胞悬液；
对原代肝细胞悬液进行纯化获得原代肝细胞。
优选的，所述原代肝细胞悬液通过以下方法获得：
向获取的鲨鱼肝组织样本中加入胶原酶Ⅳ，置于培养箱中消化，消化完成后，向其中加入培养基终止消化，得到原代肝细胞悬液。
优选的，用于终止消化的培养基为L-15培养基，所述培养基中氯化钠的浓度为0.0362g/ml，每100ml所述培养基中含10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
优选的，所述对原代肝细胞悬液进行纯化获得原代肝细胞包括：
将原代肝细胞悬液通过细胞筛网过滤，并使用含有浓度为0.0362g/ml氯化钠的L-15培养基进行洗涤，置于离心管内离心，去掉上清液后，对细胞沉淀进行重悬得到重悬后的原代肝细胞悬液；
对重悬后的原代肝细胞悬液进行梯度离心纯化，第一次离心力为60g，离心时间5min，去除上清液后对细胞沉淀进行重悬，进行第二次离心，离心力为30g，离心时间为5min，获得纯化后的原代肝细胞。
优选的，所述培养基中氯化钠的浓度为0~0.0702g/ml，每100ml所述培养基中含5~10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
优选的，所述培养基为L-15培养基；
所述培养基中氯化钠的浓度为0.0362g/ml，每100ml所述培养基中含10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
本发明的另一个目的在于提供一种鲨鱼肝细胞，由如上所述的培养方法制得。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明公开的鲨鱼肝细胞及培养方法，操作简便，过程易于控制，便于观察，实验结果准确，可重复性好，由于本方法不使用胎牛血清及动物源蛋白，工艺过程无需对鲨鱼肝细胞进行连续驯化，减少了培养步骤，安全性高、稳定性好、培养过程简单、细胞密度高，产量高，成本相对较低，周期短，可避免细菌、真菌、病毒、支原体等污染，降低了工艺差异和污染风险。
(2)本发明公开的鲨鱼肝细胞培养方法可简化过滤性和下游纯化工艺，优化了生产工艺，同时提高细胞生产能力，利于鲨鱼肝细胞离体培养。
(3)鲨鱼肝脏组织经本方法分离后得到原代肝细胞占细胞悬液67%；分离获得的原代肝细胞悬液经梯度离心纯化后得到原代肝细胞占细胞悬液87%，纯化效果好且细胞形态良好；当添加氯化钠为0时，细胞易破裂，当添加氯化钠浓度为0.0176g/ml时，原代肝细胞仍旧易破裂，当添加氯化钠浓度为0.0362g/ml时，细胞相对较为完整，裂解的细胞较少，说明本方法分离培养成活率更高。
附图说明
图1为颗粒刺鲨解剖取出肝脏方法示意图；
图2为解剖出的颗粒刺鲨肝脏图；
图3为肝组织使用胰蛋白酶消化过程图；
图4为肝组织使用胰蛋白酶消化30min后显微镜20×下的细胞形态图；
图5为肝组织使用胶原酶Ⅳ消化过程图；
图6为肝组织使用胶原酶Ⅳ消化30min后显微镜20×下的细胞形态图；
图7A为原代肝细胞悬液经不含氯化钠的L-15培养基洗涤过200目细胞筛后经1500rpm离心5min的细胞形态图；
图7B为原代肝细胞悬液经不含氯化钠的L-15培养基洗涤过200目细胞筛后经1500rpm离心5min的细胞形态图；
图7C为原代肝细胞悬液经含有氯化钠浓度为0.0362g/ml的L-15培养基洗涤过200目细胞筛后经1500rpm离心5min的细胞形态图；
图7D为原代肝细胞悬液经含有氯化钠浓度为0.0362g/ml的L-15培养基洗涤过200目细胞筛后经1500rpm离心5min的细胞形态图；
图8A为原代肝细胞悬液经过梯度离心纯化后的细胞形态图；
图8B为原代肝细胞悬液经percoll离心纯化后的细胞形态图；
图9A为原代肝细胞悬液离心纯化前的细胞形态图；
图9B为原代肝细胞悬液离心纯化后的细胞形态图；
图10A为原代肝细胞悬液用L-15培养基培养刚铺板时的细胞形态图；
图10B为原代肝细胞悬液用L-15培养基培养24h后的细胞形态图；
图10C为原代肝细胞悬液用氯化钠浓度为0.0176g/ml的L-15培养基培养24h后的细胞形态图；
图10D为原代肝细胞悬液用氯化钠浓度为0.0362g/ml的L-15培养基培养24h后的细胞形态图；
图10E为原代肝细胞悬液用氯化钠浓度为0.0702g/ml的L-15培养基培养24h后的细胞形态图；
图11A为原代肝细胞悬液用5%血清替代品的MEM培养基培养刚铺板时肝细胞显微镜下细胞形态图；
图11B为原代肝细胞悬液用5%血清替代品的MEM培养基培养24h后的细胞形态图；
图11C为原代肝细胞悬液用5%血清替代品的DMEM培养基培养24h后的细胞形态图；
图11D为原代肝细胞悬液用10%血清替代品的L-15培养基培养24h后的细胞形态图；
图4、图6、图9A和图9B中白色箭头所指为肝细胞，黑色箭头所指为红细胞。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
通过解剖取出鲨鱼肝脏，分离，纯化得到鲨鱼肝脏细胞，进行离体培养，可为生物学和医学研究提供基础。基于鲨鱼肝细胞的上述用途，本发明的发明人提供了一种鲨鱼肝细胞的培养方法及由此培养方法获得培养后的鲨鱼肝细胞，本发明提供的培养方法包括获取鲨鱼肝组织样本并进行预处理，对预处理后的原代肝细胞进行培养，获得培养后的鲨鱼肝细胞。
下面，通过具体实施例对本发明方案进行说明。
本发明中所使用的试剂均可通过市售获取。
实施例1
(1)获取鲨鱼肝组织样本并进行预处理获得原代肝细胞。
1)对颗粒刺鲨进行预处理获取鲨鱼肝组织样本。
取一条颗粒刺鲨处死放入75%乙醇标本消毒液中浸泡10min。将浸泡后的颗粒刺鲨置于生物安全柜中紫外灭菌30min。
将经过灭菌的颗粒刺鲨进行解剖取出肝脏，解剖过程如图1所示，将颗粒刺鲨从肛门处开剪，沿侧线下鳍、侧线以及鳃盖边缘剪去体壁，打开腹腔摘取肝脏，如图2所示为解剖出的颗粒刺鲨肝脏图。
取出的肝脏用PBS缓冲液清洗3次，将用PBS缓冲液清洗3次的肝脏剪碎至1-3mm3大小，将剪碎后的肝脏组织用PBS缓冲液清洗至无血发白状即获取鲨鱼肝组织样本。
2)对获取的鲨鱼肝组织样本进行分离，以获得原代肝细胞悬液。
表1 每100ml的L-15培养基中各物质含量
Figure 640052DEST_PATH_IMAGE001
表1为L-15培养基配比条件，按照表1条件配制L-15培养基。
如图3所示，向获取的鲨鱼肝组织样本中加入5ml浓度为0.25g/100ml的胰蛋白酶，然后置于27℃培养箱消化30min，消化完成后，向其中加入按照表1条件配制的L-15培养基液体，终止消化，即得到原代肝细胞悬液。将原代肝细胞悬液置于显微镜下观察，如图4所示，原代肝细胞悬液中原代肝细胞占比1%。
如图5所示，向获取的鲨鱼肝组织样本中加入1ml浓度为0.5g/100ml的胶原酶Ⅳ，然后置于27℃培养箱消化30min，消化完成后，向其中加入按照表1条件配制的L-15培养基液体，终止消化，即得到原代肝细胞悬液。将原代肝细胞悬液置于显微镜下观察，如图6所示，原代肝细胞悬液中原代肝细胞占比67%。
结合图3~图6发现，使用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ对获取的鲨鱼肝组织样本进行消化，都能消化组织得到原代肝细胞悬液。使用胰蛋白酶消化30min后的原代肝细胞悬液，在显微镜下观察到20×细胞形态图如图4所示，原代肝细胞悬液中原代肝细胞占比约1%。使用胶原酶Ⅳ消化30min后的细胞悬液在显微镜下观察到20×细胞形态图如图6所示，原代细胞悬液中原代肝细胞占比约67%。
使用胶原酶Ⅳ消化得到的原代肝细胞悬液中原代肝细胞占比较多，占细胞悬液中的67%，因此采用胶原酶Ⅳ对鲨鱼肝组织样本进行消化。
3)对原代肝细胞悬液进行纯化获得原代肝细胞。
将使用胶原酶Ⅳ消化得到的原代肝细胞悬液分成4组，分别编号A、B、C、D并分别按照下述条件进行处理。
将A和B所述的原代肝细胞悬液分别通过200目细胞筛过滤时，使用不含氯化钠的L-15培养基洗涤三次，每次洗涤使用不含氯化钠的L-15培养基5ml，置于50ml离心管内离心，转速1500rpm，离心5min，去掉上清液后，对细胞沉淀进行重悬得到细胞悬液在显微镜下观察，如图7A和图7B所示，发现细胞绝大多数破裂，极少部分细胞形态较为完整。
将C和D所述的原代肝细胞悬液分别通过200目细胞筛网过滤时，使用含有浓度为0.0362g/ml氯化钠的L-15培养基洗涤三次，每次洗涤使用所述的培养基体积5ml，置于50ml离心管内离心，转速1500rpm，离心5min，去掉上清液后，对细胞沉淀进行重悬得到细胞悬液在显微镜下观察，如图7C和图7D所示，发现大部分细胞形态较为完整，少部分细胞破裂。
对上述的编号为C的原代肝细胞悬液进行梯度离心纯化，第一次离心力为60g，离心时间5min，去除上清液后对细胞沉淀进行重悬，进行第二次离心，离心力为30g，离心时间为5min获得的原代肝细胞沉淀即为纯化后的原代肝细胞，如图8A所示，纯化后原代肝细胞占比86%。
对上述的编号为D的原代肝细胞悬液进行percoll离心纯化，第一次离心力为300g，离心时间5min，去除上清液后对细胞沉淀进行重悬，进行第二次离心，离心力为300g，离心时间为5min获得的原代肝细胞沉淀即为纯化后的原代肝细胞，如图8B所示，纯化后原代肝细胞占比70%。
结合图8A、图8B、图9A、图9B发现，采用梯度离心纯化原代肝细胞的方法获得的原代肝细胞含量更高，分离效果更纯净。
所述采用梯度离心纯化后获得的原代肝细胞形态如图8A所示，原代肝细胞占比86%。所述采用percoll离心纯化后获得的原代肝细胞形态如图8B所示，原代肝细胞占比70%。未离心纯化的细胞悬液中原代肝细胞形态图如图9A所示，其中细胞悬液中原代肝细胞占比67%。采用梯度离心纯化后获得的原代细胞悬液中原代肝细胞形态图如图9B所示，原代肝细胞占比86%。
(2)将获得的原代肝细胞置于培养基中重悬并培养，获得培养后的鲨鱼肝细胞。
从采用梯度离心纯化后获得的原代肝细胞悬液中取20ml，置于离心管内，1500rpm离心5min去掉上清液得到原代肝细胞沉淀。
将离心后的原代肝细胞沉淀使用5ml所述培养基进行重悬。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品5ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM和氯化钠3.62g的L-15培养基。
所述的培养基中青霉素-链霉素配置方法为：将青霉素-链霉素溶液(100X)稀释100倍，每100ml培养基中加入0.5ml稀释后的青霉素-链霉素溶液。
将重悬后的原代肝细胞悬液接种到经多聚赖氨酸包被六孔板中，用显微镜观察刚铺板时培养基中细胞形态，如图10A所示。
多聚赖氨酸六孔板的包被准备过程为，将多聚赖氨酸用ddH2O溶解成浓度为0.01g/100ml的溶液，每个孔中加入2ml浓度为0.01g/100ml多聚赖氨酸溶液，置于27℃培养箱中过夜，干燥待用。
将接种原代肝细胞后的六孔板置于27℃不含CO2的培养箱中培养24h，获得培养后的鲨鱼肝细胞，然后用显微镜观察培养基中鲨鱼肝细胞的细胞形态，如图10B所示。
实施例2
与实施例1相比，仅培养基中氯化钠浓度不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品5ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM和氯化钠1.76g的L-15培养基。
培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图10C所示。
实施例3
与实施例1相比，仅培养基中氯化钠浓度不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品5ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM和氯化钠3.62g的L-15培养基。
培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图10D所示。
实施例4
与实施例1相比，仅培养基中氯化钠浓度不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品5ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM，氯化钠7.02g的L-15培养基。
培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图10E所示。
综上，结合实施例1~实施例4和图10A~图10E发现，接种时原代肝细胞密度较为均匀且原代肝细胞形态完整，培养24h后步骤3所述方法效果较好，培养的肝细胞在显微镜下观察发现细胞密度增加，肝细胞较多。
经24h培养后，实施例1中肝细胞在显微镜下观察如图10B所示，发现完整肝细胞较少，基本为红细胞和肝细胞碎片。经24h培养后，实施例2中肝细胞在显微镜下观察如图10C所示，发现肝细胞死亡较多细胞出现成团，剩余的为红细胞和一部分肝细胞和许多细胞碎片。经24h培养后，实施例3中肝细胞在显微镜下观察如图10D所示，发现肝细胞死亡较少，细胞密度增加，肝细胞形态略有不完整，剩余的大多为肝细胞、少数红细胞和少量的细胞碎片。经24h培养后，实施例4中肝细胞在显微镜下观察如图10E所示，发现肝细胞死亡一部分，细胞密度相对略有增加，剩余的一部分为肝细胞、红细胞和细胞碎片。
实施例5
与实施例3相比，仅培养基组成不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品5ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM，氯化钠3.62g的MEM培养基。
刚铺板时用显微镜观察细胞形态，如图11A所示。培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图11B所示。
实施例6
与实施例3相比，仅培养基组成不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代5ml品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM，氯化钠3.62g的DMEM培养基。
培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图11C所示。
实施例7
与实施例3相比，仅培养基组成不同。
所述的培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品10ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM，氯化钠3.62g的L-15培养基。
培养24h后用显微镜观察培养基中细胞形态，如图11D所示。
结合实施例5~实施例7和图11A~图11D发现，接种时肝细胞密度较为均匀且肝细胞形态完整，按照实施例7方法培养24h后的肝细胞较为完整。
经24h培养后，实施例5中肝细胞在显微镜下观察发现肝脏细胞裂解，减少，细胞状态下降。经24h培养后，实施例6中肝细胞在显微镜下观察发现肝脏细胞成团，减少，细胞状态下降。经24h培养后，实施例7中肝细胞在显微镜下观察发现肝脏细胞较为完整，无明显减少，细胞状态略有下降。
结合实施例7、实施例3和图11D、图10D发现：按照实施例7方法培养24h后的肝细胞较为完整，细胞增加，细胞状态无明显下降，实施例7为目前较优选的培养方法。
实施例8
按照表1中各物质含量设置实验组，培养基为每100ml含有Ultroser G血清替代品10ml，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM，氯化钠3.62g的L-15培养基。
设置对照组，与表1中培养基相比，仅将Ultroser G血清替代品替换为等量的胎牛血清。
不同培养时间鲨鱼肝细胞数量如下表2所示。
表2 不同培养时间鲨鱼肝细胞数量
培养时间(h) 实验组(cells/ml) 对照组(cells/ml)
0 2×10<sup>6</sup> 2×10<sup>6</sup>
8 4.9×10<sup>6</sup> 6.8×10<sup>6</sup>
16 9.7×10<sup>6</sup> 1.4×10<sup>7</sup>
24 3.5×10<sup>7</sup> 3.7×10<sup>7</sup>
48 4.9×10<sup>7</sup> 3.1×10<sup>7</sup>
根据表2中使用不同培养基培养鲨鱼肝细胞，随着培养时间的增加鲨鱼肝细胞数量的变化所示，使用Ultroser G血清替代品的L-15培养基(实验组)和使用胎牛血清的L-15培养基(对照组)培养24小时，细胞数量区别不大。但继续培养，直到48h后，使用Ultroser G血清替代品的L-15培养基(实验组)培养的鲨鱼肝细胞，肝脏细胞完整，轮廓清晰、饱满，活细胞数持续增加，细胞状态无明显下降，细胞贴壁维持较好。
使用胎牛血清的L-15培养基(对照组)培养的鲨鱼肝细胞，肝细胞分化减弱，体枳略小于实验组的细胞，细胞轮廓较清晰、饱满，部分细胞开始凋溶死亡，细胞贴壁维持较弱。
使用本发明提供的方法分离纯化培养的鲨鱼肝细胞，采用血清替代品代替胎牛血清，避免动物蛋白质、脂类的使用，可避免细菌、真菌、病毒、支原体等污染，降低了工艺差异和污染风险。使用本发明提供的方法分离纯化培养的鲨鱼肝细胞可用于研究鲨鱼细胞形态、生长发育、细胞营养、代谢及病变等过程，还可结合细胞整合技术进行遗传分析，具有积极的效果。另外本方法还可分离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞，用于克隆、细胞诱导分化，作为基因转移高效表达载体，为用鲨鱼肝细胞开发生产更多生物制品提供技术支持，造福人类。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
获取鲨鱼肝组织样本并进行预处理获得原代肝细胞；
将获得的原代肝细胞置于培养基中重悬并培养，获得培养后的鲨鱼肝细胞；
所述培养基含有氯化钠，血清替代品，纤粘连蛋白，胰岛素，转铁蛋白，孕酮，丁二胺，硒酸钠，青霉素-链霉素和谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述鲨鱼肝组织样本为颗粒刺鲨的肝组织样本。
3.根据权利要求2所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述颗粒刺鲨的肝组织样本通过如下方法获取：
获取颗粒刺鲨，放入消毒液中浸泡，灭菌，取肝脏组织；
清洗肝脏组织获得肝组织样本。
4.根据权利要求1所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述预处理包括：
基于获取的鲨鱼肝组织样本制得原代肝细胞悬液；
对原代肝细胞悬液进行纯化获得原代肝细胞。
5.根据权利要求4所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述原代肝细胞悬液通过以下方法获得：
向获取的鲨鱼肝组织样本中加入胶原酶Ⅳ，置于培养箱中消化，消化完成后，向其中加入培养基终止消化，得到原代肝细胞悬液。
6.根据权利要求5所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，用于终止消化的培养基为L-15培养基，所述培养基中氯化钠的浓度为0.0362g/ml，每100ml所述培养基中含10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
7.根据权利要求4所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述对原代肝细胞悬液进行纯化获得原代肝细胞包括：
将原代肝细胞悬液通过细胞筛网过滤，并使用含有浓度为0.0362g/ml氯化钠的L-15培养基进行洗涤，置于离心管内离心，去掉上清液后，对细胞沉淀进行重悬得到重悬后的原代肝细胞悬液；
对重悬后的原代肝细胞悬液进行梯度离心纯化，第一次离心力为60g，离心时间5min，去除上清液后对细胞沉淀进行重悬，进行第二次离心，离心力为30g，离心时间为5min，获得纯化后的原代肝细胞。
8.根据权利要求1所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述培养基中氯化钠的浓度为0~0.0702g/ml，每100ml所述培养基中含5~10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
9.根据权利要求1所述的鲨鱼肝细胞培养方法，其特征在于，所述培养基为L-15培养基；
所述培养基中氯化钠的浓度为0.0362g/ml，每100ml所述培养基中含10ml血清替代品，纤粘连蛋白100μg，胰岛素200μg，转铁蛋白10μg，孕酮2μM，丁二胺6mM，硒酸钠3μM，青霉素-链霉素50U，谷氨酰胺200mM。
10.一种鲨鱼肝细胞，其特征在于，由根据权利要求1至9任一项所述的培养方法制得。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109996870A (zh) * 2016-03-14 2019-07-09 新加坡科技研究局 从人多能干细胞产生中脑特异性类器官

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109996870A (zh) * 2016-03-14 2019-07-09 新加坡科技研究局 从人多能干细胞产生中脑特异性类器官

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. YEOH 等: "Long-term culture of fetal rat hepatocytes in media supplemented with fetal calf-serum Ultroser SF or Ultroser G", 《BIOLOGY OF THE CELL》 *
于淼: "鲨鱼肝实质细胞培养及其细胞膜分离纯化的方法学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
卢春凤 等: "《实用医学研究基本技术与方法》", 31 August 2018, 知识产权出版社 *
徐威: "《全国高等医药院校药学类专业第五轮规划教材 药学细胞生物学 供药学及相关专业使用 第3版》", 31 December 2019, 中国医药科技出版社 *
王文君: "大泷六线鱼（Hexagrammos otakii）肝脏和脾脏细胞学观察及其原代培养的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
王祎: "动物无血清细胞培养基的研究现状及进展", 《科教文汇》 *
蒋丽辉等: "鲤鱼肝原代细胞的分离与培养方法", 《渔业研究》 *
陈标 等: "谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响", 《华南农业大学学报》 *
骆源等: "斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立", 《水产学报》 *

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