CN111518764A - 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法。本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L‑精氨酸，杀菌剂，III型胶原，细胞贴附因子。本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，可以延长换液时间，细胞收集率高，最终培养的细胞纯度高，且所含成分少，降低了生产成本，便于后续对脂肪干细胞的深入研究。

Description

一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法。

背景技术

脂肪干细胞是从人体提取的众多干细胞的一种，我们人体从胚胎干细胞开始，包含了很多进化不同程度的干细胞。那么脂肪源性干细胞从它的名字可以看出，是从脂肪组织中提取，它与其他干细胞相比具有取材方便，而且分化作用与其他骨髓来源的干细胞相当。它在再生医学领域，以及将来的组织器官再造、皮肤再生、脂肪再生方面，都会发挥非常重大的作用。这就意味着体外大量培养脂肪干细胞是十分必要的。

而培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。

而现有的常用于培养动物细胞的培养基一般为血清培养基，而血清用于细胞培养中具有如下缺点：成分不明确，血清保存期短，至多一年。不能排除血清中含有易变物质，使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态。血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。血清含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。血清制作过程复杂、批间差异大，成分不能保持一致。使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。质量不稳定，价格昂贵，进出口管制影响盈利，使用不方便。

基于此，中国专利申请CN109337866A公开了一种脂肪干细胞无血清培养基，该培养基中不含血清，包含各种括氨基酸，无机盐成分，生长因子及白蛋白成分，加入的组分过多，使得培养基的成本大大增加，无法保障收集率，而且，容易造成细菌污染。

综上可知，现有技术制得的无血清培养基普遍存在成本高，容易被细菌污染，细胞收集率低的缺点。

发明内容

针对现有技术中普遍存在的缺点，本发明提供了一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法。本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，具有细胞收集率高，成本低，不会造成细菌污染的优点，

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述β球蛋白的终浓度为14～18μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为80～100mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为60～90μg/mL，所述III型胶原的终浓度为4～8μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为25～35μg/mL。

优选地，所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL。

优选地，所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比5～7：2～3组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比8～10：5～7组成。

优选地，所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

本发明还提供了一种所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法，其包括如下步骤：

S1、向基础培养基中加入L-精氨酸及β球蛋白，搅拌均匀，得混合物I；

S2、向步骤S1所得混合物I中加入III型胶原，细胞贴附因子，混合搅拌均匀，得混合物II；

S3、向步骤S2所得混合物II中加入杀菌剂，混合搅拌均匀，即得。

优选地，步骤S1中搅拌均匀的具体操作过程为在200～300rpm的条件下搅拌15～20min。

优选地，步骤S2中混合搅拌均匀的具体操作过程为在500～600rpm的条件下混合搅拌30～40min。

优选地，步骤S3中混合搅拌均匀的具体操作过程为在250～350rpm的条件下混合搅拌20～30min。

本发明中，加入杀菌剂可以有效去除细胞培养过程中出现的细菌、病毒等污染物；加入的细胞贴附因子可以促进培养成功的细胞的贴壁性，有利于最终的细胞收集过程，提高收集率。

而且，本发明还意外的发现，本发明中的L-精氨酸与杀菌剂按一定重量加入，可以降低培养基被细菌污染的概率，延长换液时间，这在一定程度上提高了培养基的使用时间，大大降低了生产成本；而III型胶原与β球蛋白混合使用，联合细胞贴附因子，可以进一步促进细胞贴壁。

与现有技术相比，本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基具有以下优点：

(1)本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，加入了的L-精氨酸和杀菌剂，可以有效请去除细胞培养过程中的各种细菌，降低培养基对细菌污染的概率，延长换液时间；

(2)本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，加入的细胞贴附因子，辅以III型胶原与β球蛋白，可以进一步促进细胞贴壁，提高细胞收集率；

(3)本发明提供的脂肪干细胞无血清培养基，制备过程简单，成本低，极其适合脂肪干细胞的培养，有利于人们对脂肪干细胞深入研究的顺利进行。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

其中，本发明所用试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。

实施例1一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述β球蛋白的终浓度为14μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为80mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为60μg/mL，所述III型胶原的终浓度为4μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为25μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比5：2组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比8：5组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法为：

S1、向基础培养基中加入L-精氨酸及β球蛋白，于200rpm的转速下搅拌15min，至搅拌均匀，得混合物I；

S2、向步骤S1所得混合物I中加入III型胶原，细胞贴附因子，于500rpm的转速下混合搅拌30min，至混合均匀，得混合物II；

S3、向步骤S2所得混合物II中加入杀菌剂，于250rpm的转速线混合搅拌20min，至混合均匀，即得。

实施例2一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述β球蛋白的终浓度为18μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为100mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为90μg/mL，所述III型胶原的终浓度为8μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为35μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比7：3组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比10：7组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法为：

S1、向基础培养基中加入L-精氨酸及β球蛋白，于300rpm的转速下搅拌20min，至搅拌均匀，得混合物I；

S2、向步骤S1所得混合物I中加入III型胶原，细胞贴附因子，于600rpm的转速下混合搅拌40min，至混合均匀，得混合物II；

S3、向步骤S2所得混合物II中加入杀菌剂，于350rpm的转速线混合搅拌30min，至混合均匀，即得。

实施例3一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法为：

S1、向基础培养基中加入L-精氨酸及β球蛋白，于250rpm的转速下搅拌18min，至搅拌均匀，得混合物I；

S2、向步骤S1所得混合物I中加入III型胶原，细胞贴附因子，于550rpm的转速下混合搅拌35min，至混合均匀，得混合物II；

S3、向步骤S2所得混合物II中加入杀菌剂，于300rpm的转速线混合搅拌25min，至混合均匀，即得。

对比例1一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比1：1组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中的杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比1：1组成。

对比例2一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比1：1组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例2中的细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按1：1组成。

对比例3一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例3中不包含L-精氨酸。

对比例4一种脂肪干细胞无血清培养基

所述脂肪干细胞无血清培养基，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂及细胞贴附因子；所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL；所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

所述脂肪干细胞无血清培养基的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例4中不包含III型胶原。

试验例1换液时间对比

1.试验样品：实施例1-3组，对比例1组，对比例3组制得的脂肪干细胞无血清培养基

2.试验方法：将得到的脂肪组织剪成0.lcm×0.lcm×0.lcm大小组织，用0.1mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后置入瓶中，以4倍脂肪组织体积的胶原酶I消化，反复将脂肪组织剪碎至糊状后，37℃摇匀30min，用250μL尼龙纱网将消化后的脂肪组织过滤入离心管中，l000rpm下离心30min，弃去上清液和悬浮的脂肪碎块，沉淀重悬于0.075mmol/L氯化钾，静置l0min后离心，弃去上清，将沉淀等量分成5份，分别重悬于实施例1-3组，对比例1组及对比例3组制得的培养基中，移入培养皿中，于37℃，5％CO₂的温箱，100％湿度进行培养，培养48h后，取少量培养基，观察培养液是否变浑浊，并制成标本，于显微镜下观察细胞污染程度，若显微镜下出现细菌，即更换培养基，若未出现，继续培养，之后，每隔1小时，检测一次，记录培养基开始变浑浊的时间，细菌出现的时间，若出现细菌或培养基变浑浊任一现象，即进行换液，以该时间作为换液时间。

3.试验结果：具体试验结果见表1。

表1不同培养基换液时间对比

试验样品	实施例1组	实施例2组	实施例3组	对比例1组	对比例3组
						换液时间/h	78	75	82	36	37

由表1可知，本发明实施例1-3组制得的脂肪干细胞无血清培养基，大约30小时左右换一次液，而目前已知常规培养基48h-72h即需更换培养液，否则容易造成细胞污染，故本发明实施例1-3组延长了换液时间，尤其是实施例3组换液时间可达82h，延长了10h，故实施例3为本发明最佳实施例，而对比例1组及对比例3组，由于改变了杀菌剂中各组分的配比，去掉了L-精氨酸，导致换液时间大大降低。

试验例2细胞收集率对比

1.试验样品：实施例1-3组，对比例2组及对比例4组制得的脂肪干细胞无血清培养基；

2.试验方法：将得到的脂肪组织剪成0.lcm×0.lcm×0.lcm大小组织，用0.1mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后置入瓶中，以4倍脂肪组织体积的胶原酶I消化，反复将脂肪组织剪碎至糊状后，37℃摇匀30min，用250μL尼龙纱网将消化后的脂肪组织过滤入离心管中，l000rpm下离心30min，弃去上清液和悬浮的脂肪碎块，沉淀重悬于0.075mmol/L氯化钾，静置l0min后离心，弃去上清，将沉淀等量分成5份，分别重悬于实施例1-3组，对比例2组及对比例4组制得的培养基中，然后移入培养瓶中，培养72h，每隔48h更换一次培养基。

培养结束后，先用PBS洗一遍，再用胰蛋白酶消化大概30min，于1000rpm的转速下离心5min，倒掉上清，再用PBS把细胞悬起来，再于1000rpm下离心5min，然后把PBS倒掉，往培养瓶中加入tryplE，转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入实施例1-3组及对比例3组的培养基，反复吹打，至80-90％的细胞不再贴壁，于1000rpm转速下离心10min；弃去上清液，用实施例1-3组，对比例2组及对比例4组制得的培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到细胞悬液，用流式细胞仪进行计数。

3.试验结果：具体试验结果见表2。

表2不同培养基收集的细胞数量对比

试验样品	实施例1组	实施例2组	实施例3组	对比例2组	对比例4组
						细胞数量	2.8×10<sup>6</sup>	2.6×10<sup>6</sup>	3.2×10<sup>6</sup>	8.7×10<sup>5</sup>	9.2×10<sup>5</sup>

由表2可知，本发明实施例1-3组收集到的细胞数量在2.5×10⁶以上，而对比例2，对比例4收集的细胞数量仅为8.7×10⁵，9.2×10⁵，故对比例2组，对比例4组与本发明实施例1-3相比，收集的细胞少很多，这是由于对比例2组的细胞贴附因子中各成分比例发生改变，对比例4去掉III型胶原造成的。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种脂肪干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基，β球蛋白，L-精氨酸，杀菌剂，III型胶原及细胞贴附因子；所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述β球蛋白的终浓度为14～18μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为80～100mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为60～90μg/mL，所述III型胶原的终浓度为4～8μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为25～35μg/mL。

2.如权利要求1所述的脂肪干细胞无血清培养基，其特征在于，所述β球蛋白的终浓度为16μg/mL，所述L-精氨酸的终浓度为90mg/mL，所述杀菌剂的终浓度为75μg/mL，所述III型胶原的终浓度为46μg/mL，所述细胞贴附因子的终浓度为30μg/mL。

3.如权利要求1或2所述的脂肪干细胞无血清培养基，其特征在于，所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比5～7：2～3组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比8～10：5～7组成。

4.如权利要求3所述的脂肪干细胞无血清培养基，其特征在于，所述杀菌剂由芦荟酊及乙基大蒜素按质量比6：2.5组成；所述细胞贴附因子由多聚赖氨酸及层粘连蛋白按质量比9：6组成。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的脂肪干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、向基础培养基中加入L-精氨酸及β球蛋白，搅拌均匀，得混合物I；

S2、向步骤S1所得混合物I中加入III型胶原，细胞贴附因子，混合搅拌均匀，得混合物II；

S3、向步骤S2所得混合物II中加入杀菌剂，混合搅拌均匀，即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中搅拌均匀的具体操作过程为在200～300rpm的条件下搅拌15～20min。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中混合搅拌均匀的具体操作过程为在500～600rpm的条件下混合搅拌30～40min。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中混合搅拌均匀的具体操作过程为在250～350rpm的条件下混合搅拌20～30min。