CN104651305A - 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，首先使用Ⅰ型胶原酶短时消化脐带华通氏胶，得到含细胞外基质蛋白和组织块组成的糊状混合物并进行原代培养；然后在填充床式生物反应器内加入“干细胞生长培养基”用于扩增脐带间充质干细胞，当反应器内的细胞融合率达到标准时，添加“蛋白生产培养基”进行连续培养，收集培养液并处理，最终获得生物活性蛋白。本发明利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，得到的脐带间充质干细胞纯度高，增殖能力好，缩短了干细胞培养时间；并且得到的生物活性蛋白产量高，质控过程方便，易于规模化生产。干细胞和生物活性蛋白均不含任何动物源性成分，提高了临床应用的安全性。

Description

一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前已知对心肌梗死、糖尿病、骨质疏松、骨坏死、狼疮性肾炎、肝硬化、肝衰竭、多发性肝硬化症、系统性红斑狼疮、帕金森病、脊髓损伤等都有一定治疗效果。

早期的间充质干细胞主要来源于成人骨髓，但成人骨髓间充质干细胞数量及增殖分化潜能会随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，且采集具有创伤，供体所受痛苦较大，使其来源受限。而从脐血和外周血中培养间充质干细胞也具有一定难度：由于间充质干细胞在脐血或动员的外周血中数量较少，其体外扩增培养的方法目前只处于实验室研究阶段。当临床需要应用一定数量的干细胞治疗时，需同时考虑干细胞种类及干细胞增殖能力，这就限制了骨髓和脐血干细胞的应用范围。

近来有学者从分娩后的废弃物-脐带中分离培养出间充质干细胞，并进行了形态学、分化功能和表面标志物等生物学表型鉴定，确定了这种新型间充质干细胞的开发潜质。这种新型间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比具有明显的优势：（1）来源充足，取材方便，无伦理学争议；（2）含量丰富，可在体外进行分离、培养，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能；（3）免疫原性极低；（4）分泌能力强，在增殖生长过程中会产生大量生物活性因子等。

目前，从脐带中获得的间充质干细胞除应用于临床研究与治疗外，干细胞分泌产生的各种多肽类细胞因子在美容保健领域也越来越被关注。在干细胞的培养液中含有多种干细胞分泌的生物活性蛋白，如干细胞因子（SCF）、肝细胞生长因子（HGF）、神经生长因子（NGF)、基质细胞源性生长因子（SDF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因（IGF）、表皮生长因子（EGF）、白细胞介素（IL）、巨核细胞集落刺激因子（M-CSF）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等，通过多种因子的协同作用可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。美国科学家LEVI博士就发现干细胞分泌的生物活性蛋白具有除皱作用，这些由多种生长因子组成的生物活性蛋白作用于皮肤真皮层的成纤维干细胞，使处于休眠、损伤的成纤维干细胞被激活和修复，并分化成大量成熟的成纤维细胞用于皮肤更新。

不论是干细胞临床研究和治疗，还是对干细胞分泌因子的开发，均需要大量扩增间充质干细胞，而原代细胞的活性和数量无疑是最关键的，但目前获取原代细胞的组织块直接贴壁法和酶消化法均略显不足。在酶消化法中，使用多种消化酶（CN102127522B、CN101575590B）进行长时间组合消化获取单细胞悬液（胰酶和胶原酶Ⅱ、Ⅳ），消化方式强烈，易对细胞膜造成破坏，致使细胞变形，增殖能力下降，传代次数减少；且多种酶组合消化的消化时间不易把握，最佳配比有待实验确认。此外多种酶的使用也增加了外源物质引入的风险。而单纯使用组织块培养法则培养时间过长，至少需要20天原代细胞才可以进行传代。原代培养时间的延长将会使细胞长时间暴露于体外环境，增加了细胞的不稳定性，使细胞易发生老化，增殖能力减弱，基因突变几率大幅增加。

在现有培养方法中，单次获得的干细胞及生物活性蛋白量远不能满足临床需求，而多批次培养则不可避免的存在批次间的差异性。因此，探索更为有效的干细胞培养和生物活性蛋白的生产方法对临床治疗具有十分重要的意义。

实际生产中多采用培养瓶或滚瓶培养的方式获得培养液来提取生物活性蛋白，但是这种培养方式获取的培养液体积少，多次换液存在污染的风险，且会增加批次间的不稳定性，无法满足规模化生产生物活性蛋白的需求。因此，安全有效地大规模培养干细胞尤其是大量生产生物活性蛋白被提上日程，而实现这一目标最有效的方法是利用生物反应器技术。

生物反应器可以为细胞的体外扩增提供均衡的生长环境，也可实现在培养过程中对细胞代谢和培养液进行在线监控，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞都可选用。通过生物反应器培养细胞可实现细胞高密度生长，产物获取浓度提高、收获量增大，此外，还具有操作简便、质量易于控制、厂房及生产人员需要少等优点。利用生物反应器培养细胞获取生物活性蛋白，以满足临床应用的需求是目前干细胞及生物活性蛋白生产的一大趋势，但是在实际应用中也存在着许多不足：专利CN101985612A使用微载体在培养袋中进行大规模培养贴壁细胞，存在细胞容易沉降及培养液状态不易监控的缺点。专利CN103153318A使用微载体进行培养干细胞，但是微载体较片状载体处理复杂，需要预泡，如处理不当，即会影响干细胞的生长，此外微载体也不利于培养液的渗透。专利CN102732586B也引入生物反应器来实现干细胞培养液的规模化生产。但要实现单位时间内获得更多干细胞培养液的目标，则仍需解决两方面的问题：一方面需要缩短干细胞在生物反应器内的贴壁时间，加快细胞繁殖速率；另一方面则是需要干细胞达到一定密度后仍能够长时间维持活性状态，延长干细胞旁分泌生物活性蛋白的时间。

最初，动物细胞的体外培养均依赖于胎牛血清，这样细胞在体外才能较好的增殖生长。但由于胎牛血清成分复杂，使用含血清的培养基培养细胞存在潜在的细胞毒性作用、外源病毒和致病因子污染问题，使细胞培养的标准化和终产品纯化难度加大，异种血清的残留也易导致临床上的过敏反应。因此，动物细胞无血清培养技术的开发和应用势在必行。所谓无血清培养技术，是指在不含有动物血清或其他生物提取液的情况下，仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养技术。在细胞工程中无血清培养技术的应用，可以有效避免血清培养所带来的不利。美国、欧盟等发达国家早在2010年就已全面停止在生物制药中应用血清，如果继续停留在使用血清培养细胞，以及使用胰酶消化细胞，便会增加在细胞和生物活性蛋白中引入动物源性成分的风险，降低其临床应用的安全性。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，通过培养胶原酶短时消化后得到的混合物，实现缩短原代细胞培养时间目的，采用阶段式培养和间歇式搅拌的方式，促进细胞贴壁，延长干细胞的“青春状态”，提高单位细胞分泌生物活性蛋白的获取量，降低生产成本，便于规模化生产。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，具体步骤如下。

步骤1、脐带的采集及运输。

步骤2、剔除脐带的羊膜和血管后得到华通氏胶并剪成组织小块。

步骤3、使用Ⅰ型胶原酶短时消化得到细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物。

步骤4、取上述糊状混合物涂抹在培养皿内晾干固定。

步骤5、向上述培养皿内加入无血清培养体系原代培养，经过两次全量换液，收集组织小块。

步骤6、将步骤5中收集的组织小块转移至培养瓶内第二次原代培养。

步骤7、两次原代细胞均在融合率达到70%时传代培养，同时收集并保存培养液。

步骤8、扩增后对传代的脐带间充质干细胞进行细胞生物学鉴定。

步骤9、将传代细胞接种至生物反应器内，加入预先配置的干细胞生长培养基，并采用间歇搅拌的方式促进干细胞贴壁，实现干细胞提前进入分泌活性蛋白状态的目的。

步骤10、待细胞完全贴壁后，连续搅拌扩增间充质干细胞。

步骤11、当反应器内的细胞融合率达到80%-85%时，逐步添加预先配置的生物活性蛋白生产培养基以替换干细胞生长培养基，培养24h后开始收集培养液。

步骤12、将步骤11中收集的培养液离心，收取上清液，透析处理后获得生物活性蛋白。

所述步骤1中采集的脐带组织4℃保存，24小时内处理。

所述Ⅰ型胶原酶短时消化时间为10min。

所述步骤5中无血清培养体系是在DMEM/F12培养基中加入血清替代品，不含动物源性物质，且使用前补加15mg/L的L-谷氨酰胺。

所述步骤5中第一次全量换液时间为24h，第二次全量换液时间为第8天。

所述步骤6中细胞培养至第5-6天进行一次全量换液。

所述步骤9中的传代细胞是指第3代至第15代细胞。

所述步骤9中的传代细胞是指第8代至第10代细胞。

所述步骤9中干细胞生长培养基为：含步骤7中收集的培养液10%-20%、10mg/L的无水硫酸镁，1400mg/L的α-酮戊二酸和15mg/L的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基。

所述步骤9中间歇式搅拌是指细胞接种后的6小时内，每30min搅拌一次，每次5min，速度为30rpm。

所述步骤11中生物活性蛋白生产培养基为：含500mg/L的α-酮戊二酸、40mg/L的胆碱补充物、0.05mg/L的维生素C、0.01mg/L的维生素E、0.025mg/L的烟酸和0.05mg/L的谷胱甘肽的DMEM/F12培养基。

所述步骤11中收集培养液总量为反应器体积的2-3倍。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明提供的一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，采用新鲜脐带组织作为间充质干细胞的来源，胶原酶短时消化脐带组织块后会得到混合物，该混合物在培养皿底部构建的三维生长环境减少了组织小块的贴壁时间，大幅提高了细胞生长速度，缩短了原代细胞培养时间，减少基因突变频率，提高细胞稳定性；采用阶段式培养和间歇式搅拌的方式在生物反应器内扩大培养，获取生物活性蛋白，其中干细胞生长培养基和间歇搅拌方式使细胞在生物反应器内更易贴壁，生长速度增加；生物活性蛋白生产培养基用于维持细胞长时间的“青春状态”，延长了细胞分泌生物活性蛋白的时间。本发明获取的细胞和蛋白均不含任何动物源性成分，提高了临床应用的安全性；且质控过程方便，易于规模化生产。

附图说明

图1为不同脐带间充质干细胞培养方式下细胞生长曲线图。

图2为组织小块培养至第3天时镜下观察有细胞从组织小块内爬出。

图3为组织小块培养至第5天时镜下观察大量细胞从组织小块内爬出。

图4为脐带间充质干细胞传代前镜下观察细胞生长情况。

图5为组织小块第一次原代培养后收获第二代细胞的流式检测图。

图6为组织小块第二次原代培养后收获第二代细胞的流式检测图。

图7为脐带间充质干细胞诱导成骨细胞后茜素红染色图。

图8为脐带间充质干细胞诱导成脂细胞后油红O染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。

本发明提供一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，具体步骤如下。

步骤1、脐带的采集及运输。

经产妇知情同意，采集足月健康胎儿新鲜无菌脐带组织，4℃保存，24小时内处理。脐带采集前后七天内采集母体血进行HIV检测、乙肝检测、丙肝检测、梅毒检测、谷丙转氨酶检测、支原体检测，全部检测合格后方可使用。

清洁和消毒：在生物安全柜内取出脐带，先用0.9%的氯化钠注射液进行表面清洗，之后将脐带浸泡在75%酒精内，不超过2min，所述酒精经0.22微米的过滤器进行除菌；最后用0.9%的氯化钠注射液再次清洗，去除残余酒精和血渍。

本发明使用酒精代替传统的抗生素进行消毒除菌，有效消除了抗生素残留的问题，显著提高了所获脐带间充质干细胞临床应用的安全性。

步骤2、将脐带剪成2-3cm的小段后，分别剔除外侧羊膜和内部血管得到华通氏胶；利用医用组织剪将华通氏胶剪成2mm³的组织小块；用0.9%的氯化钠注射液清洗2次，得到无血渍的华通氏胶组织小块（离心力300g，离心5min）。

步骤3、使用Ⅰ型胶原酶短时消化该组织小块，得到细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物。

Ⅰ型胶原酶消化时间优选：取剪切后的组织小块平均分成4等份，加入0.1mg/mL的Ⅰ型胶原酶于37℃条件下分别消化5min、10min、15min、20min，获取含有细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物，消化脐带组织小块的标准：用镊子挑起经Ⅰ型胶原酶消化得到的细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物时有粘连丝为佳。观察糊状混合物有无粘连丝、组织小块漂浮数及细胞游离出组织小块（即细胞长出时间）情况，具体情况如表1。

表1：Ⅰ型胶原酶消化时间优选表。

消化时间	粘连丝	接种组织小块数	组织小块漂浮数	细胞长出时间
					5min	无	30	12	8天
10min	有	30	2.7	5天
					15min	有	30	0.3	5天
20min	有	30	0	5天

由表1可知：随着Ⅰ型胶原酶消化时间的延长，组织小块飘浮数逐渐减少，但细胞长出时间在缩短至5天后不再有明显改变，因此消化时间超过10min后所取得的改善效果在生产中的意义不大，故采用Ⅰ型胶原酶消化组织小块10min即可满足实验要求。

与传统的酶消化法相比，本发明不再使用传统的胰酶或其它酶联合消化组织小块获取单细胞悬液，而是只采用性质温和的胶原酶Ⅰ短时消化获取细胞外基质蛋白，大部分细胞始终保留在组织小块内，避免了消化酶对细胞膜的损伤，保证了细胞活力。

步骤4、取2-3mL上述糊状混合物涂抹在直径10cm的培养皿上，以恰好铺满培养皿底部且组织小块分布均匀为佳，此时可用无菌镊子移动组织小块位置，使其均匀分布；在生物安全柜内自然晾干2min，形成胶状包被层粘附在培养皿底部，组织小块被固定在培养皿底部。

所述糊状混合物在培养皿底部形成的包被层，一方面缩短了组织小块的贴壁时间；另一方面也使细胞更容易从组织小块内游离出（包被层为细胞生长构建了立体的三维生长环境，既促进了细胞对培养皿底部的粘附，又有利于培养液的渗透，还有利于细胞在培养皿底部的增殖和迁移），使原代细胞培养时间大幅缩短。

步骤5、向上述培养皿内缓慢加入10mL间充质干细胞无血清培养体系，放置在CO₂培养箱内37℃、5.0%CO₂浓度下培养24h后进行一次全量换液，去除培养皿内的细胞碎片；在4-5天可观察到细胞从组织小块内爬出，在培养至第8天时进行二次全量换液，以补充营养物质，同时收集组织小块。

所述无血清培养体系是在DMEM/F12培养基中加入血清替代品，且使用前需补加15mg/L的L-谷氨酰胺。

本发明使用无血清无动物来源的试剂（血清替代品、胶原酶）替代传统人脐带间充质干细胞培养中使用的胎牛血清、动物来源的胰蛋白酶，在临床应用中能避免动物血清及动物来源的异种蛋白带来的潜在危险。

步骤6、将步骤5中收集的组织小块转移至培养瓶内，所述培养瓶经多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被，进行再次原代培养，扩增原代细胞，根据细胞生长情况（一般细胞培养至第5-6天）进行一次全量换液，以补充营养物质。

步骤7、细胞融合率达到70%以上时，使用细胞消化液（型号：ACCUTASE GMP，厂家Innovative Cell Technologies）消化收集原代细胞，按照5000-6000个/cm²的细胞密度进行传代培养，并收集每次传代时的培养液于-20℃保存。本发明在细胞收获时使用细胞消化液代替传统的胰蛋白酶消化贴壁细胞，减少了对细胞膜的损害。

在组织小块的不同培养方法中，组织小块贴壁及细胞生长情况的差异，如表2。其中，本发明中组织小块粘附在培养皿底部用时以未加培养基时，培养皿倒置，组织小块未从培养皿底部落下为标准。

表2：组织小块贴壁及细胞生长情况比较。

	粘附培养皿底部用时	明显有细胞出现用时	达70%用时
				组织小块直接贴壁法	15min	11天	19.3天
组织小块初次培养	2min	5天	10天
				组织小块二次培养	5min	4天	9天

由表2可知：在培养皿底部涂抹胶状混合物和包被多聚鸟氨酸/层黏连蛋白的处理方式，均有利于组织小块快速贴壁，且能够明显促进细胞从组织块内爬出及在培养皿底部的生长；相同时间内，相同数量的组织小块通过本发明方法培养后获取的脐带原代间充质干细胞数量比普通组织块贴壁法增加了一倍。

本发明缩短了原代培养时间，减少基因突变频率，细胞稳定性增加，从而提高了脐带间充质干细胞临床应用的安全性。

生长曲线的绘制：按照本发明方法将上述糊状混合物涂抹在直径3cm的培养皿内，每个培养皿内的组织小块数目相同，加入无血清培养体系培养原代细胞，每隔24h消化1个培养皿，收集细胞，并用0.2%的台盼蓝计数活细胞，重复3次实验取平均值绘制生长曲线，如图1所示，图1为不同脐带间充质干细胞培养方式下细胞生长曲线图。其中，实验组为本发明生产脐带间充质干细胞原代细胞的方法，对照组为传统组织块直接贴壁法生产原代细胞。

脐带间充质干细胞的传代扩增：（1）显微镜观察细胞达到70%以上融合时，进行传代扩增：去除培养液，用0.9%的氯化钠注射液洗涤2次后，加入细胞消化液（直径10cm的培养皿加入2mL细胞消化液即可）使贴壁细胞脱离培养皿底部，过滤去除组织小块，离心去上清液后，获得原代脐带间充质干细胞。（2）获取的原代细胞用培养基重悬后接种在培养瓶或培养皿内，接种密度控制在5000-6000个/cm²，培养一段时间后待细胞融合度达到80%-90%时，收集第一代脐带间充质干细胞，作为种子细胞或继续传代培养，继续传代的标准是细胞融合达到85%以上。

接种密度在细胞传代培养中至关重要，因为细胞密度过大，贴壁细胞无足够的空间伸展；细胞密度过低，细胞达到传代所需密度的时间又很长，造成原代细胞老化，使其在传代后的扩增能力和分化潜能都明显下降。本发明将接种密度控制在5000-6000个/cm²，细胞生长状态良好，有益于传代培养。

步骤8、扩增完成后进行细胞生物学鉴定，鉴定后则根据需要冻存或直接使用。

脐带间充质干细胞的鉴定。

1、细胞生长及其形态学特点：请参阅图2-4，采用本发明获得细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物后，将其涂抹在培养皿上进行贴壁培养，培养至第3-5天时经倒置显微镜观察，可发现有较多贴壁细胞生长；培养至10天时，细胞融合率达到70%；组织小块二次利用时，培养24小时后即观察到有细胞进行贴壁生长，9天后细胞融合率达到70%左右。

2、流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志。

收集第二代细胞，磷酸缓冲盐溶液洗涤2次（离心力500g离心3min），调整细胞浓度至5×10⁶个/mL；加入细胞表面标志物对应的抗体后孵育30min，再次洗涤重选后即可上机（流式细胞仪FACSCalibur，BD公司）检测。细胞表面标志物：CD90，CD29，CD105，CD73为阳性标记，CD45，CD34，CD79a，CD14，HLA-DR为阴性标记，具体检测结果如表3所示，图5为组织小块第一次原代培养（初次植块）后收获第二代脐带间充质干细胞的流式检测图，图6为组织小块第二次原代培养（二次植块）后收获第二代脐带间充质干细胞的流式检测图。

表3：脐带间充质干细胞表面标志物检测结果。

表面标记	初次植块第二代细胞表达率	二次植块第二代细胞表达率
			CD90	99.95%	99.99%
CD73	98.50%	98.90%
			CD105	99.37%	99.74%
CD29	99.95%	99.96%
			CD45	0.90%	1.16%
CD34	0.76%	0.95%
			CD79a	1.97%	1.23%
CD14	1.44%	0.85%
			HLA-DR	1.13%	0.73%

由表3可知：在本发明中，组织小块初次培养和第二次培养所收获得的原代脐带间充质干细胞经两次传代培养后，依然符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞的标准：阳性表达率≥95%，阴性表达率≤2%；所获得的细胞可作为临床研究和应用的种子细胞。

3、诱导分化：取特定代次细胞，按照5.0×10³个/cm²的细胞密度接种于6孔板，置于37℃、5%CO₂浓度的二氧化碳培养箱进行培养。待细胞融合率至80%-85%时，开始诱导。每个细胞样品分为成脂分化、成脂对照，成骨分化和成骨对照各3孔，对照组用无血清培养基继续培养。每隔2-3天换一次液。成脂诱导培养至21天，成骨诱导培养至28天；去除培养液，用0.9%的氯化钠注射液洗涤2次，4%多聚甲醛固定15min，0.9%的氯化钠注射液洗涤3次；成脂诱导组进行油红O染色，成骨诱导组进行茜素红染色。镜下观察，油红O染色呈强阳性；茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积。图7为脐带间充质干细胞诱导成骨细胞后茜素红染色图，图8为脐带间充质干细胞诱导成脂细胞后油红O染色图。

成骨培养液的成分为含0.1μM地塞米松、10mM β-磷酸甘油，0.2mM抗坏血酸的MEM。

成脂培养液的成分为含0.5mM 3-异丙基-甲基黄嘌呤、1μM氢化可的松和0.1mM茚甲新的MEM，10%的胎牛血清。

步骤9、任取8-10代细胞接种至填充床式生物反应器内，加入预先配置的干细胞生长培养基，并采用间歇搅拌的方式促进干细胞贴壁。

本发明使用NBS公司的填充床（片状载体）式生物反应器代替传统的细胞工厂或滚瓶培养干细胞，增加了细胞之间的三维联系，使细胞更接近体内自然生长状态；采用AFS-Biocommand监控软件在线监控，能够为细胞生长提供相对均一的生长环境，减少批次间的差异性；培养条件的摸索和特定培养基的开发，促进细胞的高密度生长，和活性蛋白的长时间高产量表达；一次性使用罐体则免去实验前的清洁灭菌准备，可迅速实现不同批次的生产试验，减少产物受污染的风险。所述生物反应器内细胞生长情况是通过培养液含糖量来评定。

干细胞生长培养基：含步骤7中收集的培养液10%-20%、10mg/L的无水硫酸镁、1400mg/L的α-酮戊二酸和15mg/L的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基。在干细胞生长培养基中补加的Mg²⁺可近一步促进细胞贴壁，传代时收集的培养液里含有细胞分泌的贴附因子和刺激因子也可促进细胞贴壁；同时可替代血清，降低生产成本，增加安全性；而L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸的联合作用则促进细胞的生长繁殖。

将种子细胞扩增至特定代次、需求数量后按照2×10⁵-5×10⁵个/mL接种至填充床式生物反应器内，并加入预先配置的干细胞生长培养基。

所述间歇式搅拌是指细胞接种后6小时内，每30min搅拌一次，每次5min，速度为30rpm。

步骤10、待细胞完全贴壁后，调整生物反应器的转速为30-40 rpm，连续搅拌扩增间充质干细胞。

步骤11、当反应器内的细胞融合率达到80%-85%时，逐步添加预先配置的生物活性蛋白生产培养基以替换干细胞生长培养基，培养24小时后开始集培养液，收集的培养液总量为反应器体积的3倍为宜。

生物活性蛋白生产培养基：含500mg/L的α-酮戊二酸、40mg/L的胆碱补充物（如酒石酸胆碱）、0.05mg/L的维生素C、0.01mg/L的维生素E、0.025mg/L的烟酸和0.05mg/L的谷胱甘肽的DMEM/F12培养基。

逐步添加生物活性蛋白生产培养基的方式为：每8小时添加一次生物活性蛋白生产培养基，替换出20%-25%的干细胞生长培养基；开始收集培养液时为每24小时添加一次生物活性蛋白生产培养基，替换出10%-25%的培养液并收集。

本发明根据细胞培养的不同阶段为细胞提供不同的营养，分为干细胞生长培养基和生物活性蛋白生产培养基，实现细胞快速增殖和延长细胞分泌的目标。培养基内的L-谷氨酰胺在细胞能量代谢和生物合成过程中起着重要作用，一方面谷氨酰胺为培养的细胞提供能量，另一方面也为嘌呤和嘧啶的合成提供氨基基团。但在细胞质中，谷氨酰胺会在谷氨酰胺酶催化下被降解成谷氨酸盐和氨，生成的氨在生物反应器培养细胞的过程中不宜扩散，而氨能够影响细胞的能量代谢，抑制细胞的生长。在本发明的培养基中除了含有L-谷氨酰胺外还添加了α-酮戊二酸：细胞生长培养基中加入的α-酮戊二酸可减少游离氨的产量，又可通过三羧酸循环提供能量，从而促进细胞生长。生物活性蛋白生产培养基的作用不再是扩增细胞数量，而是维持细胞的活性状态，从而延长细胞分泌的时间，所以此时加入的α-酮戊二酸更多的是为细胞染色质的去甲基化提供能量，让整个基因组保持开放状态，抑制细胞分化，保持和延长干细胞“青春状态”。生物活性蛋白生产培养基中其他新加成分则是为了稳定细胞膜和细胞内的脂质部分，降低细胞脆性，增加稳定性。

步骤12、对步骤11中收集的培养液进行离心（离心力800g、离心时间15min）去除细胞碎片和残留细胞，得到细胞培养上清液；透析处理去除小于5KDa的小分子，获得生物活性蛋白。本发明所用培养基等原料化学成分明确，不需要再对获取的培养液进行复杂的分离纯化处理，不再需要昂贵的设备，因此，生产成本大幅度降低。

测定生物活性蛋白含量。

本发明生产的生物活性蛋白溶液是多种细胞因子的复合物，根据生物活性蛋白的性质及主要功能选取5个代表性指标检测生物活性蛋白含量的变化。

按照ELISA试剂盒说明书操作，分别检测细胞培养上清中干细胞因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子A（PDGF-A）的水平。具体步骤如下。

（1）取出酶标板，依照次序对应分别加入50μL的细胞因子标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加入50μL培养上清液于空白微孔中；在样品孔中加入10μL的生物素标记液；在标准品孔和样品孔中加入50μL的酶标记溶液。

（2）37℃孵育反应60min；洗板机清洗5次，每次静置10-20s；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃避光孵育反应15 min；每孔加入50μL终止液，终止反应。

（3）每份标本设3个复孔，用全自动酶标仪测450nm处吸光度(A)值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线计算出细胞因子含量。

普通培养瓶培养方式和填充床式生物反应器收集培养上清液后的细胞因子含量比较结果如表4所示。

表4：细胞因子含量比较（单位：pg/mL）。

检测项目	培养瓶方式上清液	生物反应器上清液
			SCF	109.84	191.64
EGF	271.70	651.32
			VEGF	626.67	1881.12
bFGF	227.24	690.81
			PDGF-A	128.97	361.12

由表4可知：对所选取的5个生长因子含量的测定，可知通过生物反应器获取的培养液比普通培养瓶方式获取的培养液里的细胞因子含量提高了2-4倍，因此利用生物反应器生产方式可大幅提高获取生物活性蛋白的产量。

Claims (10)

1.一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1、脐带的采集及运输；

步骤2、剔除脐带的羊膜和血管后得到华通氏胶并剪成组织小块；

步骤3、使用Ⅰ型胶原酶短时消化得到细胞外基质蛋白和组织小块组成的糊状混合物；

步骤4、取上述糊状混合物涂抹在培养皿内晾干固定；

步骤5、向上述培养皿内加入无血清培养体系原代培养，经过两次全量换液，收集组织小块；

步骤6、将步骤5中收集的组织小块转移至培养瓶内第二次原代培养；

步骤7、两次原代细胞均在融合率达到70%时传代培养，同时收集并保存培养液；

步骤8、扩增后对传代的脐带间充质干细胞进行细胞生物学鉴定；

步骤9、将传代细胞接种至生物反应器内，加入预先配置的干细胞生长培养基，并采用间歇搅拌的方式促进干细胞贴壁；

步骤10、待细胞完全贴壁后，连续搅拌扩增间充质干细胞；

步骤11、当反应器内的细胞融合率达到80%-85%时，逐步添加预先配置的生物活性蛋白生产培养基以替换干细胞生长培养基，培养24h后开始收集培养液；

步骤12、将步骤11中收集的培养液离心，收取上清液，透析处理后获得生物活性蛋白。

2.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述Ⅰ型胶原酶短时消化时间为10min。

3.如权利要求2所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中第一次全量换液时间为24h，第二次全量换液时间为第8天。

4.如权利要求3所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤6中细胞培养至第5-6天进行一次全量换液。

5.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤9中的传代细胞是指第3代至第15代细胞。

6.如权利要求5所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤9中的传代细胞是指第8代至第10代细胞。

7.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤9中干细胞生长培养基为：含步骤7中收集的培养液10%-20%、10mg/L的无水硫酸镁、1400mg/L的α-酮戊二酸和15mg/L的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基。

8.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤9中间歇式搅拌是指细胞接种后的6小时内，每30min搅拌一次，每次5min，速度为30rpm。

9.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤11中生物活性蛋白生产培养基为：含500mg/L的α-酮戊二酸、40mg/L的胆碱补充物、0.05mg/L的维生素C、0.01mg/L的维生素E、0.025mg/L的烟酸和0.05mg/L的谷胱甘肽的DMEM/F12培养基。

10.如权利要求1所述的利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法，其特征在于，所述步骤11中收集培养液总量为反应器体积的2-3倍。