CN105850979A - 一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液包括10v/v％DMSO、50v/v％骨髓间充质干细胞条件培养基、40v/v％胎牛血清。与常规细胞冻存液相比，采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，细胞回收率明显高于其他常规冻存液，可以用于骨髓间充质干细胞的长期保存及应用。本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存方法将骨髓间充质干细胞消化离心后，去上清，FBS重悬细胞沉淀，加入所述冻存保护液后冻存细胞。与常规的冻存方法相比，本发明骨髓间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后细胞回收率明显高于其他常规方法。

Description

一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewal)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(Mesenchymalstem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一。除此以外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。
骨髓间充质干细胞是来源于骨髓来源的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新我增殖能力以及向分化潜能。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。
间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的骨髓间充质干细胞的冻存方法，使具有临床应用价值的骨髓间充质干细胞能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。
骨髓间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。
目前现有技术中，骨髓间充质干细胞的冻存除了用二甲基亚砜DMSO，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存。但上述配方冻存骨髓间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液，包括
DMSO 10v/v％
骨髓间充质干细胞条件培养基 50v/v％
胎牛血清 40v/v％。
其中，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法为：取骨髓间充质干细胞接种含FBS的DMEM/F12的培养基培养后，收集培养上清，离心后取上清。
在一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述骨髓间充质干细胞优选为汇合度80-90％骨髓间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述接种具体为向按照(5-10)×103/cm2细胞密度接种。
在一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述含FBS的DMEM/F12的培养基中FBS的含量为10v/v％。
在一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述培养具体为培养至细胞汇合度达到80％-90％。
本发明所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法在骨髓间充质干细胞培养后收集培养上清，离心后取上清获得骨髓间充质干细胞条件培养基。其中，所述离心优选为1000rpm-2000rpm离心5min-10min。
进一步的，本发明所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法还包括过滤除菌的步骤。优选为用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明所述骨髓间充质干细胞条件培养基可以放置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
本发明还提供了所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，按比例将骨髓间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMSO。
本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，将骨髓间充质干细胞消化离心后，去上清，FBS重悬细胞沉淀，加入权利要求1所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，-80℃中冻存过夜后，转移至液氮中长久保存。
其中，所述的冻存方法中，所述消化为向细胞中加入0.2％的胰酶消化1min-3min，用骨髓间充质干细胞生长培养基终止酶解；
进一步，所述的冻存方法中，所述离心为1000rpm-1500rpm离心5-10min。
优选的，所述的冻存方法中，所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液的加入量为每(1-2)×106细胞加入1mL所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液。
采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液，结合本发明所述的冻存方法进行骨髓间充质干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果，有利于骨髓间充质干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高。复苏后的细胞回收率明显高于其他常规冻存液。
本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液。
本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液包括10v/v％DMSO、50v/v％骨髓间充质干细胞条件培养基、40v/v％胎牛血清。与常规细胞冻存液相比，采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存后复苏，细胞回收率明显高于其他常规冻存液，可以用于骨髓间充质干细胞的长期保存及应用。本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存方法将骨髓间充质干细胞消化离心后，去上清，FBS重悬细胞沉淀，加入所述冻存保护液后冻存细胞。与常规的冻存方法相比，本发明骨髓间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后细胞回收率明显高于其他常规方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3骨髓间充质干细胞经不同冻存液冻存后复苏的细胞活力检测图，其中实验组为本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存，对照组为标准冻存液冻存；
图2示实施例4复苏后骨髓间充质干细胞空白对照组的表面抗原图；
图3示实施例4复苏后骨髓间充质干细胞实验组的表面抗原图；
图4示实施例5复苏后骨髓间充质干细胞未诱导组茜素红染色图；
图5示实施例5复苏后骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色图；
图6示实施例6复苏后骨髓间充质干细胞未诱导组油红O染色图；
图7示实施例6复苏后骨髓间充质干细胞成脂诱导后油红O染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1、骨髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集
1、骨髓间充质干细胞的培养
取正常人的骨髓样本，在无菌环境下，在骨髓中加入等体积的生理盐水，轻轻混匀，用巴氏吸管吸取骨髓混合液缓慢加入到等体积淋巴细胞分离液中；以300g-400g离心10-15min，离心后用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层；转移到含有5-10mL Hanks缓冲溶液的离心管中，轻轻混匀；以200-300g离心5-15min，去上清，重复清洗1-2次；用骨髓间充质干细胞生长培养基(DMEM+10％FBS+10ng/mL bFGF)重悬细胞沉淀，并接种于培养皿中；放置在37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，去除培养上清，重新换上骨髓间充质干细胞生长培养基；每3天换液，4-8天即可见细胞汇合度达到80-90％；
2、条件培养基收集：用于条件培养基的骨髓间充质干细胞，先按照(5-10)×103/cm2细胞密度接种培养皿，DMEM/F12+10％FBS的培养基进行培养，待细胞汇合度达到80-90％，分别收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000-2000rpm离心5-10min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤除菌，收集在无菌培养瓶中。放置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。
实施例2：骨髓间充质干细胞的冻存保护液
每1mL细胞冻存液配方为：0.1mLDMSO、0.4mLFBS、0.5mL实施例1所述骨髓间充质干细胞条件培养基。
实施例3：骨髓间充质干细胞的冻存
取汇合度达到80-90％的骨髓间充质干细胞，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，去20-50μL细胞悬液进行细胞计数，每(1-2)×106细胞用1mL实施例2所述冻存液进行冻存。细胞置于冻存管加入冻存液，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。半年后取出复苏，计算细胞活力。
对照组：取汇合度达到80-90％的骨髓间充质干细胞，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，去20-50μL细胞悬液进行细胞计数，每(1-2)×106细胞用1mL标准冻存液进行冻存。细胞置于冻存管加入标准冻存液，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。半年后取出复苏，计算细胞活力。其中标准冻存液为：每1mL标准冻存液含0.1mL DMSO、0.9mL FBS。
由图1结果可见，骨髓间充质干细胞经过本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液(实验组)冻存后的细胞复苏活力明显高于标准冻存液(对照组)冻存后的细胞活力。
实施例4：流式细胞仪检测复苏后的骨髓间充质干细胞表面标志。
取实施例3的方法冻存复苏后的细胞，待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2×105细胞数，染色缓冲液(PBS)洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DRA抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。结果如图2和3。
结果显示复苏后的骨髓间充质干细胞阴性表面CD34、CD45、HLA-DR为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90，CD105均呈现阳性。说明采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存的细胞复苏后依然保持骨髓间充质干细胞的生物学特征。
实施例5:冻存复苏后的骨髓间充质干细胞诱导成骨分化鉴定
取实施例3的方法冻存复苏后的细胞，待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照5×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，所述成骨诱导培养基为基础培养基DMEM、10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、150μm抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油、100nM地塞米松。每隔2-3天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图4和图5。
结果显示复苏后的骨髓间充质干细胞，经过成骨诱导4周后，由茜素红染色可见钙化结节。说明采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存的细胞复苏后仍然保持向成骨分化的潜能。
实施例6:冻存复苏后的骨髓间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
取实施例3的方法冻存复苏后的细胞，待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照5×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图6和7。
结果显示，复苏后的骨髓间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明采用本发明所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液冻存的细胞复苏后仍然保持向脂肪分化的潜能。

Claims (10)

1.一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液，其特征在于，包括
DMSO 10v/v％
骨髓间充质干细胞条件培养基 50v/v％
胎牛血清 40v/v％。
2.根据权利要求1所述的冻存保护液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法为：取骨髓间充质干细胞接种含FBS的DMEM/F12的培养基培养后，收集培养上清，离心后取上清。
3.根据权利要求2所述的冻存保护液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述接种具体为向按照(5-10)×103/cm2细胞密度接种。
4.根据权利要求2所述的冻存保护液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述含FBS的DMEM/F12的培养基中FBS的含量为10v/v％。
5.根据权利要求2所述的冻存保护液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述培养具体为培养至细胞汇合度达到80％-90％。
6.根据权利要求2所述的冻存保护液，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述离心为1000rpm-2000rpm离心5min-10min。
7.权利要求1所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液的制备方法，其特征在于，按比例将骨髓间充质干细胞条件培养基与胎牛血清混合，然后加入DMSO。
8.一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞消化离心后，去上清，FBS重悬细胞沉淀，加入权利要求1所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，-80℃中冻存过夜后，转移至液氮中长久保存。
9.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述消化为向细胞中加入0.2％的胰酶消化1min-3min，用骨髓间充质干细胞生长培养基终止酶解；所述离心为1000rpm-1500rpm离心5-10min；所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液的加入量为每(1-2)×106细胞加入1mL所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液。
10.一种骨髓间充质干细胞的冻存试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述骨髓间充质干细胞的冻存保护液。
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