CN106465710A - 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 - Google Patents
脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106465710A CN106465710A CN201610696833.5A CN201610696833A CN106465710A CN 106465710 A CN106465710 A CN 106465710A CN 201610696833 A CN201610696833 A CN 201610696833A CN 106465710 A CN106465710 A CN 106465710A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fatty tissue
- stock solution
- frozen stock
- cell
- cryopreservation methods
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 118
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 229940027278 hetastarch Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 12
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- AEQDJSLRWYMAQI-UHFFFAOYSA-N 2,3,9,10-tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5H-isoquinolino[2,1-b]isoquinoline Chemical compound C1CN2CC(C(=C(OC)C=C3)OC)=C3CC2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2 AEQDJSLRWYMAQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims description 5
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000000176 sodium gluconate Substances 0.000 claims description 5
- 235000012207 sodium gluconate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940005574 sodium gluconate Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 claims 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 42
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 35
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 27
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 4
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102100038021 Steryl-sulfatase Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法。所述冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为0.5%~10%的羟乙基淀粉以及质量百分数为10%~20%的人血白蛋白。所述冻存方法包括:1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心;2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块,加缓冲液并离心;3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液,将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地涉及一种脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的重要成员,源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,属于非终末分化细胞,它既有间质细胞,又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。间充质干细胞分布广泛,被证实能够从多种组织中分离得到。由于间充质干细胞具有增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于规模化制备等特征,故被认为是细胞治疗中最有前景的一个方向。在临床上,MSCs目前被用于研究各种疾病,包括:移植物抗宿主病、心肌梗死、克罗恩病、多发性硬化、系统系红斑狼疮、肝硬化等,取得了良好的效果。此外,间充质干细胞还具有支持造血和促进造血干细胞植入的功用。因此,间充质干细胞为一些难治性疾病的治疗提供了全新的方案,在医学史上具有里程碑意义。
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)又称脂肪来源间充质干细胞,首次由Zuk等在2001年从人类脂肪组织中分离出来,这群细胞具备多向分化潜能和稳定的增殖能力,且外形特征与间充质干细胞相符。因其具备取材容易、获得率高,创伤小和不存在伦理学争议等优势,近些年成为诸多学者的研究热点。脂肪干细胞目前已被证实能够向成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞以及神经元分化,多项动物疾病模型疗效试验充分证实其在潜在的临床应用价值。此外,脂肪干细胞在整形美容方面应用广泛,如隆胸、乳房整形、面部年轻化、以及皱纹和瘢痕修复等,是组织工程和再生医学重要的种子细胞来源。采用合适的方法冻存脂肪组织,并在组织复苏后从中获取活性良好的脂肪干细胞,将为其在临床应用上奠定基础。因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存方法。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明确定了一种新可临床用脂肪组织的长期冻存方法:以供体脂肪为原料,通过脂肪样本预处理、长期组织冻存充质干细胞的方法。此法具有易于操作、可规模化、不受时间限制等优点,做到“一次吸脂、多次使用”、不限组织和细胞、更丰富用途、利于临床多种需求。与现有的直接分离脂肪间充质干细胞并进行细胞冻存更为简便,同时可以节约成本和避免在实验室长期培养带来的微生物污染和细胞分化等风险。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种脂肪组织冻存液,所述冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为0.5%~10%的羟乙基淀粉以及质量百分数为10%~20%的人血白蛋白。
本发明将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护剂二甲基亚砜(DMSO)的浓度大幅度的降低,从传统的10%最低降至5%,再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白制成可直接用于保存临床软组织工程用脂肪组织的冻存液。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低,通过洗涤后将最大程度的避免对人体的毒副作用,故而能够确保该冷冻保护剂保存的脂肪组织用于人体是绝对安全的。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存液,所述冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为3.5%~7%的羟乙基淀粉以及质量百分数为13%~17%的人血白蛋白。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存液,所述冻存液的溶剂为复方电解质注射液;
所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。
一种脂肪组织冻存方法,包括如下步骤:
1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心;
2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块,加缓冲液并离心;
3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液,将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。
脂肪组织由一系列复杂的细胞群组成,包括成熟的脂肪细胞,前体脂肪细胞,纤维细胞,动脉平滑肌细胞,内皮细胞和脂肪间充质干细胞。脂肪组织不仅能够为生物医学再生领域和细胞治疗提供大量所需的干细胞,同时还能够直接作为自体移植物用于外科整形。早在上世纪80年代末,自体脂肪移植就逐渐得到外科医生的认可并用于临床。
脂肪移植虽是一种较为理想的软组织缺损填充手段,但通常移植后脂肪组织体积只能保持在移植时的50%左右,且移植成活率较低。因此,临床上仍需要通过少量、反复、多次移植来达到满意的填充效果。如果能实现一次抽取足够量的脂肪并进行冷冻保存,在需要时复苏,则会减轻对患者多次抽脂造成的痛苦。目前关于脂肪组织低温冻存剂的研究较少,而最佳冷冻保存条件对临床应用也具有重要的研究价值。使用无异源成分的冻存保护剂更符合未来往临床方向延伸的目标。
目前脂肪方面的应用技术主要包括细胞提取及冻存,鲜有脂肪组织冻存。本发明联合使用渗透性保护剂和非渗透性保护剂,以保持冻存过的脂肪组织的细胞活力和生物学功能。
优选的,所述缓冲液为生理盐水、PBS或TBS。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,所述脂肪组织样本为新鲜样本或冷藏保存的样本;
所述冷藏保存的样本保存温度为0℃~4℃,保存时间≤48h。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,在步骤1)和步骤2)中,所述离心的条件为2800rpm~3200rpm离心5min~10min。
离心后,脂肪组织中的油脂会悬于表层,每次离心后都需要把表层油脂吸去,随后再将脂肪组织转移到新的离心管或容器中进行操作,剩余液体和红细胞随离心管废弃,这是为了避免离心管内壁的油脂和其他细胞对脂肪组织的污染。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,在步骤2)中,碎块的大小为0.1mm3~2mm3。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,在步骤3)中,脂肪组织与预冷的脂肪组织冻存液混合的体积比为(1~2):(1~2)。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,所述预冷的脂肪组织冻存液的温度为0℃~4℃。
优选的,如上所述的脂肪组织冻存方法,在步骤3)中,将所述混合液冷冻后移入液氮中保存的操作具体包括:
将所述混合液装于冻存管内,将所述冻存管在0℃~5℃下平衡10min~30min,然后转入-80℃冻存2h~16h,最后转入液氮保存。
优选的,冻存管在0℃~5℃下平衡10min~30min的操作在装有新鲜异丙醇的程序降温盒中进行。
慢冻是为了防止降温过快导致细胞内外水迅速结晶化,导致细胞结构破坏、蛋白质变性、pH改变等不良后果,进而对细胞造成损害。慢冻还能使细胞缓慢失水,减少胞内结晶的形成从而保护细胞。
本发明主要提供了一种临床用脂肪组织长期冻存方法,能够保持脂肪组织的生物活性不发生改变,同时也可在复苏后进行脂肪干细胞的分离扩增,甚至洗涤后直接进行软组织填充等外科手术的临床需求。其中我们将具有细胞毒性但目前尚无法替代的渗透性保护DMSO的浓度大幅度的降低,从传统的10%最低降至5%,再佐以其他大分子非渗透性保护剂如羟乙基淀粉、人血白蛋白和复方电解质注射液制成可直接用于临床软组织工程的脂肪组织。该细胞制剂中的成分DMSO为临床级且浓度较低,通过洗涤后将最大程度的避免对人体的毒副作用;除此之外的其他成分均采用商品化的注射液配制而成,故而能够确保该冷冻保护剂保存的脂肪组织用于人体是绝对安全的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞培养至不同代数的照片;P0:原代细胞;P1:第一次传代后的细胞;P2:第二次传代后的细胞;P3:第三次传代后的细胞;左右分别为不同放大倍数;
图2为本发明实施例2中肌酸激酶活性试验对比分析冻存后脂肪组织和新鲜脂肪组织中细胞活力的结果图;
图3为本发明实施例2中AO/PI双染检测第3代脂肪干细胞存活率;
图4为本发明实施例2中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞成骨诱导染色鉴定图;
图5为本发明实施例2中经冻存的脂肪组织复苏后分离出的脂肪间充质干细胞成脂诱导染色鉴定图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种可临床用长期冻存脂肪组织的制备方法,包括如下内容:
采用吸脂术,从供者大腿或腹部抽吸脂肪组织,用注射器抽取20ml,排尽液体,将脂肪组织收集于无菌瓶内。0~15℃低温运送至实验室;
脂肪组织置于0℃~4℃冰箱内暂存0h~48h。加生理盐水清洗1~4遍,将脂肪组织转移至无菌离心管内加缓冲液充分浸泡后2800rpm~3200rpm离心5min~10min;
吸弃表层油脂,将脂肪组织转移至新的无菌离心管内,剩余液体和红细胞随离心管废弃;
将脂肪组织剪成约0.1mm3~2mm3大小的碎块,加缓冲液,2800rpm~3200rpm离心5min~10min;
吸弃表层油脂,将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内,剩余液体废弃;
得到的脂肪组织与脂肪组织冻存液按(1~2):(1~2)的体积比混合,制成细胞悬液后转入冻存管,将所述冻存管在0℃~5℃下平衡10min~30min,然后转入-80℃冻存2h~16h,最后转入液氮保存;
其中,所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为0.5%~10%的羟乙基淀粉以及质量百分数为10%~20%的人血白蛋白;
较好的,所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为3.5%~7%的羟乙基淀粉以及质量百分数为13%~17%的人血白蛋白;
较好的,所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液;
所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。
实施例1
本实施例提供一种脂肪组织冻存方法,包括以下步骤:
1、脂肪组织前处理:
采用吸脂术,从供者腹部抽吸脂肪组织20ml,排尽液体,将脂肪组织收集于无菌瓶内。0℃~15℃低温运送至实验室。脂肪组织置于4℃冰箱内暂存4h。在百级超净台内操作以下步骤:加入足量PBS,清洗脂肪组织2遍,将脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡,然后2800rpm离心10min。吸弃表层油脂,将脂肪组织转移至新的无菌离心管内,剩余液体和红细胞随离心管废弃。
2、脂肪组织冻存:
将脂肪组织剪成0.1mm3~2mm3的碎块,加PBS,2800rpm离心10min。吸弃表层油脂,将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内。将提前配制好冷藏在4℃的脂肪组织冻存液取出与脂肪组织体积比为1:1进行混合,将混合液分装均匀分装于冻存管内,放入装有新鲜异丙醇的程序降温盒中,在4℃下平衡10min,然后转入-80℃冰箱内冻存8小时,最后转入液氮-196℃保存2周;
其中,所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为5%的二甲基亚砜、质量百分数为10%的羟乙基淀粉以及质量百分数为10%的人血白蛋白;
所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液;
所述复方电解质注射液含有氯化钠5.3g/L、葡萄糖酸钠5.42g/L、三水醋酸钠3.38g/L、氯化钾0.42g/L、六水氯化镁0.35g/L。
3、脂肪组织复苏和脂肪间充质干细胞分离培养:
取出储存于液氮中2周的脂肪组织冻存管,置于室温0.5min,转入37℃水浴锅中,充分摇晃加速解冻。转入百级超净台内将脂肪组织混合液移入离心管内,加入足量4℃PBS,待脂肪组织停止上移,则吸弃下层液体,重复操作2遍,将上层脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡,然后3000rpm离心5min。吸弃第一层油脂,将脂肪组织转移至量杯中,加入等体积量的0.1%I型胶原酶,放入37℃恒温摇床中以150rpm速度振荡消化1h。消化完全后,用100μm细胞滤网过滤,转至离心管内2000rpm离心6min。弃上清,用生理盐水混匀底部细胞,留样计数。1000rpm离心6min,得细胞,用培养液重悬混匀接种至培养瓶。在瓶身处贴上条形码,标记上培养日期,代数,瓶数等,放置于培养箱内,保持培养箱37℃,饱和温度,CO2浓度5%的状态培养。
4、脂肪间充质干细胞扩增培养:
待原代细胞接种后每3天换一次液,当贴壁密度达到90%时收集旧培养液,用PBS清洗一遍,加入0.125%胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml,37℃下消化3min,加入旧培养基终止消化,转入离心管中1000rpm离心6min。弃上清加入生理盐水洗涤,1000rpm离心6min。
以1:3进行扩增种瓶。待细胞贴壁密度达到90%时按照上述方法传代。每一代细胞均进行拍照记录。结果如图1所示。
5、生物学特性研究:
(1)脂肪间充质干细胞计数和活率检测,分别取第1、2、3代细胞,制成单细胞悬液,用COUNTSTAR细胞计数仪进行计数和活率(台盼蓝染色法)的检测。
结果:收获第1代细胞量2.8×107,第2代细胞量9.4×107,第3代细胞量3.5×108;活率分别是98%、97%、99%。
(2)流式检测表型:分别取2和3代脂肪间充质干细胞各3.0×106,分别均匀分装成9管,离心后用PBS重悬,洗涤2次。离心后留1管做空白,表型标记按每管一个标记进行添加(抗体分别为小鼠抗人CD14-FITC、CD19-PE、CD29-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、HLA-DR-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC和CD105-PE)。暗室孵育30min,离心后洗涤2次,然后离心后加200μlPBS重悬,上机测定。
表1流式表型检测结果
流式结果 | CD14 | CD19 | CD29 | CD34 | CD45 | CD73 | CD90 | CD105 | HLA-DR |
P2细胞 | 0.21 | 0.34 | 95.86 | 0.58 | 0.07 | 96.17 | 98.85 | 96.73 | 1.73 |
P3细胞 | 0.18 | 0.10 | 96.02 | 0.51 | 0.06 | 95.03 | 98.92 | 95.61 | 1.77 |
通过上述结果看出,采用本发明冻存的人脂肪组织复苏后分离的细胞经培养高表达黏附
分子和基质细胞标记CD29、CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞标记CD14、CD19、CD34和CD45,也不表达主要组织相容性复合物类分子HLA-DR,符合间充质干细胞特征,且纯度>95%。
实施例2
1、脂肪组织前处理:
于供者皮下注射含利多卡因和肾上腺素的生理盐水注射液后,用16号针头接50ml注射器,直接将20ml脂肪抽吸到注射器内。10℃运送至实验室。在百级超净台内操作以下步骤:加入足量生理盐水,清洗脂肪组织3遍,3200rpm离心5min。吸弃表层油脂,将脂肪组织转移至新的无菌离心管内,剩余液体和红细胞随离心管废弃。
2、脂肪组织冻存:
将脂肪组织剪成0.1mm3~2mm3碎块,加生理盐水,3200rpm离心5min。吸弃表层油脂,将下层脂肪组织转移至新的无菌离心管内。将提前配制好的冷藏在4℃的脂肪组织冻存液取出与脂肪组织体积比为1:2进行混合,以1.5ml/管分装于1.8ml冻存管内,在4℃下平衡30min,然后转入-80℃冰箱内冻存16小时,最后转入液氮-196℃保存2个月;
其中,所述脂肪组织冻存液含有体积百分数为5%的二甲基亚砜、质量百分数为3.5%的羟乙基淀粉以及质量百分数为17%的人血白蛋白;
所述脂肪组织冻存液的溶剂为复方电解质注射液;
所述复方电解质注射液含有氯化钠4.86g/L、葡萄糖酸钠4.62g/L、三水醋酸钠3.98g/L、氯化钾0.32g/L、六水氯化镁0.25g/L。
3、脂肪组织复苏和脂肪间充质干细胞分离培养:
取出储存于液氮中2个月的脂肪组织冻存管,置于室温1min,转入37℃水浴锅中,充分摇晃加速解冻。转入百级超净台内将脂肪组织混合液移入离心管内,加入足量4℃PBS,洗涤2遍,将上层脂肪组织转移至无菌50ml离心管内加PBS充分浸泡,然后3000rpm离心5min。弃液体,加入等体积量的0.15%I型胶原酶,放入37℃恒温摇床中以100rpm速度振荡消化1h。消化完全后,用滤网过滤,转至离心管内2000rpm离心6min。弃上清,用培养液混匀底部细胞,留样计数。1000rpm离心6min,弃上清,用培养液重悬底部细胞,接种至培养瓶。在瓶身处贴上条形码,标记上培养日期,代数,瓶数等,放置于培养箱内,保持培养37℃,饱和温度,CO2浓度5%的状态培养。
4、脂肪间充质干细胞扩增培养:
待原代细胞接种后每3天换一次液,当贴壁密度达到90%时收集旧培养液,用PBS清洗一遍,加入0.125%胰蛋白酶-EDTA消化液1.5ml,37℃下消化3min,加入旧培养基终止消化,转入离心管中1000rpm离心6min。弃上清加入生理盐水洗涤,1000rpm离心6min。以1:3进行扩增种瓶。待细胞贴壁密度达到90%时按照上述方法传代。
5、生物学特性研究:
肌酸激酶测定法测定脂肪组织内细胞活力:肌酸激酶是脂肪组织能量代谢的关键酶,在肌酸和磷酸肌酸、ADP和ATP之间的高能磷酸键的可逆性转移过程中起到催化作用。将0.5ml新鲜脂肪组织和1.5ml生理盐水混匀后导入组织研磨器内,于冰浴中破碎细胞。离心取中间层细胞,加入等体积生理盐水,37℃条件下加入肌酸激酶测试液2.5ml。分别于2min及3min吸取1ml混合液测定OD值,平均值△OD值即为酶活力值。复苏冻存6个月的脂肪组织,测定方式同前。结果显示酶活力值相差不大。结果如图2所示。
6、AO/PI双染检测第3代脂肪干细胞存活率:
Acridine orange(AO)为膜通透荧光染料,结合细胞核DNA发出绿色荧光,标示活细胞;Propidium iodide(PI)仅能通过死细胞膜,结合死细胞的核DNA发出红色荧光,用于标示死细胞。
结果如图3所示,图中较小、形状规则、数量较多的代表活细胞,细胞较大、形状不规则、数量较少的代表死细胞;平均活率为95%。
7、脂肪干细胞分化潜能测定:
成骨诱导:取第3代脂肪干细胞进行成骨诱导试验(赛业,成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基),按照说明书指示,每3天更换新鲜诱导培养基,大约维持4周。诱导完毕进行茜素红染色鉴定。如图4所示:脂肪干细胞经一段时间诱导后,细胞形态发生明显变化,由成纤维细胞状变为多角形,并有钻石样的结晶出现,经茜素红染色后变为红色,确定为钙结节,证实脂肪干细胞具备分化为成骨细胞的能力。
8、成脂诱导:
取第3代脂肪干细胞进行成脂诱导试验(赛业,成人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基),按照说明书指示,每3天交替更换维持液与诱导液,大约维持4周。至脂滴变得较大且圆时可进行油红O染色分析。如图5所示:脂肪干细胞经一段时间诱导后,细胞形态发生明显变化,由成纤维细胞状变得不规则,细胞中并有大片圆形脂滴出现,经油红O染色后变为红色,证实其具备分化为成熟脂肪细胞的能力。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种脂肪组织冻存液,其特征在于,所述冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为0.5%~10%的羟乙基淀粉以及质量百分数为10%~20%的人血白蛋白。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织冻存液,其特征在于,所述冻存液含有体积百分数为4%~6%的二甲基亚砜、质量百分数为3.5%~7%的羟乙基淀粉以及质量百分数为13%~17%的人血白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪组织冻存液,其特征在于,所述冻存液的溶剂为复方电解质注射液;
所述复方电解质注射液含有氯化钠5.26±0.4g/L、葡萄糖酸钠5.02±0.4g/L、三水醋酸钠3.68±0.3g/L、氯化钾0.37±0.05g/L、六水氯化镁0.30±0.05g/L。
4.一种脂肪组织冻存方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)、对脂肪组织样本清洗后将其移入装有缓冲液的离心管中离心;
2)、将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块,加缓冲液并离心;
3)、将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液,将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。
5.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,所述脂肪组织样本为新鲜样本或冷藏保存的样本;
所述冷藏保存的样本保存温度为0℃~4℃,保存时间≤48h。
6.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,在步骤1)和步骤2)中,所述离心的条件为2800rpm~3200rpm离心5min~10min。
7.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,在步骤2)中,碎块的大小为0.1mm3~2mm3。
8.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,在步骤3)中,脂肪组织与预冷的脂肪组织冻存液混合的体积比为(1~2):(1~2)。
9.根据权利要求4所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,所述预冷的脂肪组织冻存液的温度为0℃~4℃。
10.根据权利要求4~9任一项所述的脂肪组织冻存方法,其特征在于,在步骤3)中,将所述混合液冷冻后移入液氮中保存的操作具体包括:
将所述混合液装于冻存管内,将所述冻存管在0℃~5℃下平衡10min~30min,然后转入-80℃冻存2h~16h,最后转入液氮保存;
优选的,冻存管在0℃~5℃下平衡10min~30min的操作在装有新鲜异丙醇的程序降温盒中进行。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610696833.5A CN106465710B (zh) | 2016-08-19 | 2016-08-19 | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610696833.5A CN106465710B (zh) | 2016-08-19 | 2016-08-19 | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106465710A true CN106465710A (zh) | 2017-03-01 |
CN106465710B CN106465710B (zh) | 2020-04-14 |
Family
ID=58229949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610696833.5A Active CN106465710B (zh) | 2016-08-19 | 2016-08-19 | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106465710B (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107041362A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-08-15 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种肿瘤组织块深低温冷冻方法 |
CN108719275A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-11-02 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种用于体外保存脂肪颗粒的保存液及其使用方法 |
CN109221089A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-01-18 | 浙江美泰生物科技有限公司 | 一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法 |
CN109662091A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-23 | 米楠 | 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法 |
CN109845728A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-06-07 | 西安医斯美生物科技有限公司 | 临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法 |
CN110050780A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-07-26 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
CN110786320A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-14 | 郑州市和沐生物科技有限公司 | 一种脂肪组织冻存液及其配置方法 |
CN110973121A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-10 | 广州市拜沃思生物科技有限公司 | 一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法 |
CN111034713A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 广州市拜沃思生物科技有限公司 | 一种冻存大体积脂肪组织的方法 |
CN111449055A (zh) * | 2020-05-23 | 2020-07-28 | 河北康腾生物科技有限公司 | 一种脂肪组织冻存液、制备方法及脂肪组织储存方法 |
CN112674074A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-04-20 | 郑州市和沐生物科技有限公司 | 一种新型脂肪组织冻存液及其配置方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1585602A (zh) * | 2001-09-14 | 2005-02-23 | 马克罗珀尔生物外科公司 | 源于非造血组织的非胚胎细胞的保存 |
CN104542578A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-04-29 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种细胞保存液及其制备方法、应用 |
CN104857022A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-26 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种间充质干细胞注射液、制备方法及其应用 |
CN104873542A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-02 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN104922059A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-23 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN106386783A (zh) * | 2016-06-24 | 2017-02-15 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种间充质干细胞冻存液 |
-
2016
- 2016-08-19 CN CN201610696833.5A patent/CN106465710B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1585602A (zh) * | 2001-09-14 | 2005-02-23 | 马克罗珀尔生物外科公司 | 源于非造血组织的非胚胎细胞的保存 |
CN104542578A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-04-29 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种细胞保存液及其制备方法、应用 |
CN104857022A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-26 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种间充质干细胞注射液、制备方法及其应用 |
CN104873542A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-02 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN104922059A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-23 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN106386783A (zh) * | 2016-06-24 | 2017-02-15 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种间充质干细胞冻存液 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BO-WEN LI 等: "Cryopreservation of Fat Tissue and Application in Autologous Fat Graft: In Vitro and In Vivo Study", 《AESTH PLAST SURG》 * |
刘毅,郭树忠主编: "《整形美容外科学全书 形体雕塑与脂肪移植外科学》", 31 December 2012 * |
罗克桓 等: "二甲基亚砜和羟乙基淀粉联合冷冻保护人骨髓造血细胞的实验研究", 《中华器官移植杂志》 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107041362A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-08-15 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种肿瘤组织块深低温冷冻方法 |
CN107041362B (zh) * | 2017-05-23 | 2020-12-22 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种肿瘤组织块深低温冷冻方法 |
CN108719275A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-11-02 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种用于体外保存脂肪颗粒的保存液及其使用方法 |
CN109221089A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-01-18 | 浙江美泰生物科技有限公司 | 一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法 |
CN109662091A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-23 | 米楠 | 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法 |
CN109662091B (zh) * | 2019-03-01 | 2021-04-13 | 米楠 | 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法 |
WO2020186870A1 (zh) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
CN110050780A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-07-26 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
CN110050780B (zh) * | 2019-03-21 | 2020-10-30 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 |
CN109845728A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-06-07 | 西安医斯美生物科技有限公司 | 临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法 |
CN109845728B (zh) * | 2019-03-25 | 2021-07-23 | 西安医斯美生物科技有限公司 | 临床应用级别的脂肪组织冻存液及冻存方法 |
CN110786320A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-14 | 郑州市和沐生物科技有限公司 | 一种脂肪组织冻存液及其配置方法 |
CN111034713A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-21 | 广州市拜沃思生物科技有限公司 | 一种冻存大体积脂肪组织的方法 |
CN110973121A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-10 | 广州市拜沃思生物科技有限公司 | 一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法 |
CN111449055A (zh) * | 2020-05-23 | 2020-07-28 | 河北康腾生物科技有限公司 | 一种脂肪组织冻存液、制备方法及脂肪组织储存方法 |
CN111449055B (zh) * | 2020-05-23 | 2021-07-23 | 河北康腾生物科技有限公司 | 一种脂肪组织冻存液、制备方法及脂肪组织储存方法 |
CN112674074A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-04-20 | 郑州市和沐生物科技有限公司 | 一种新型脂肪组织冻存液及其配置方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106465710B (zh) | 2020-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106465710A (zh) | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 | |
CN104770363B (zh) | 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 | |
CN104263697B (zh) | 一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法 | |
CN104145943B (zh) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 | |
CN103070161B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法 | |
CN104781394B (zh) | 用于培养间充质干细胞的方法 | |
CN102660502A (zh) | 冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法 | |
CN102807966A (zh) | 胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法 | |
CN104450611B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
CN104542576B (zh) | 一种神经干细胞的冻存液及其使用方法 | |
CN109234229A (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
CN106421920B (zh) | 一种脂肪填充物及其制备方法 | |
CN108456657B (zh) | 犬脐带间充质干细胞及其制备方法和冻存方法 | |
CN104673745A (zh) | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 | |
CN1912109B (zh) | 一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用 | |
CN104974984A (zh) | 一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法 | |
CN103667187A (zh) | 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 | |
CN108486050A (zh) | 从犬的脐带制备间充质干细胞的方法 | |
CN107114357A (zh) | 一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法 | |
CN101974486A (zh) | 从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法 | |
CN108795855A (zh) | 一种间充质干细胞的无血清培养基 | |
CN103380769A (zh) | 用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液 | |
CN106318906A (zh) | 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法 | |
CN105331579A (zh) | 人睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途 | |
CN105850979A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Adipose tissue cryopreservation solution and methods for adipose tissue cryopreservation Granted publication date: 20200414 Pledgee: Zhejiang Hangzhou Yuhang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Science and Technology City Branch Pledgor: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES, Ltd. Registration number: Y2024980003656 |
|
PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |