CN104770363B - 一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞领域，公开了一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。本发明所述间充质干细胞的冻存液包括无血清培养基、DMSO、右旋糖酐‑40，其中所述DMSO的浓度为3v/v％～7v/v％，按g/mL计右旋糖酐‑40的浓度为1w/v％～3w/v％。本发明间充质干细胞的冻存液，冻存细胞之后活率显著提高，并保持良好的干细胞特性。本发明所述间充质干细胞的冻存方法采用本发明所述冻存液重悬细胞并调整细胞密度后冻存细胞。本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一，是近几年研究的热点。MSC作为重要的再生医学资源，在临床的疾病治疗领域将有非常重要的应用价值。
间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的细胞冻存方法，使具有临床应用价值的MSC能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。
MSC的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，用含有特定成分的细胞冻存液制成单细胞悬液，分装于冻存管中后置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。
目前现有技术中，细胞冻存液中的主要成分有10％二甲基亚砜(DMSO)、20％～90％胎牛血清(FBS)、剩余组分为不完全培养基。培养基以及FBS可为细胞提供必要的营养物质。DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而达到降低细胞损伤的保护效果。但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率。而高浓度DMSO在常温状态下对细胞具有非常大的毒性作用。
细胞冻存的方法在现有技术中采用最多的是利用冻存盒置于超低温冰箱中放置24～72h，再转移至液氮中进行长期的保存。但冻存盒在逐渐降温的过程中无法精确控制降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种间充质干细胞的冻存液包括无血清培养基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的浓度为3v/v％～7v/v％，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为1w/v％～3w/v％。
本发明所述间充质干细胞的冻存液中含有非渗透性抗冻剂右旋糖酐40，降低了DMSO的浓度。右旋糖酐40能溶于水，但不能进入细胞，使溶液呈过冷状态，通过降低溶质损伤从而起到保护作用。
在一些实施方案中，所述的冻存液中所述DMSO的浓度为5v/v％，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为1w/v％。
在一些实施方案中，所述的冻存液中所述无血清培养基为lonzaUltraCULTUREMEDIUM无血清培养基。
本发明还提供了一种间充质干细胞的冻存方法，取间充质干细胞细胞悬液离心收集细胞，用本发明所述间充质干细胞的冻存液重悬细胞并调整细胞密度，分装于冻存管中冻存。
在一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述细胞密度为1×106/mL。
在一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述冻存的具体方法为≤-80℃冻存。
在一些优选实施方案中，所述的冻存方法中，所述≤-80℃冻存为-80℃超低温冰箱长期冻存或液氮中长期冻存。
在另一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述冻存的具体方法为程序降温仪逐渐降温至-90℃后转移至液氮中进行长期保存。程序降温仪能够更精确地控制降温速率，避免冰晶的产生，降低细胞的损伤。
在一些优选实施方案中，所述的冻存方法中，所述程序降温仪降温程序为：
4℃，维持5min；
-1℃/min直至-4℃；
-25℃/min直至-12℃；
-1℃/min直至-40℃；
-10℃/min直至-90℃；
-90℃，维持5min。
本发明所述间充质干细胞的冻存方法方法，适用于所有类型MSC的冻存方法，所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法具体为组织块剪碎，加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基继续培养，当细胞融合度达到80％～90％后，去掉细胞培养上清，清洗后加入含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，完全培养基终止消化，细胞吹打成单细胞悬液。
其中，在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述完全培养基的组成成分为：Lonza通用UltraCULTURE无血清培养基+5v/v％PALL血清替代物+2mM/L-谷氨酰胺+100mg/L NEAA。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述含EDTA的胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶浓度为0.25％(体积分数)，EDTA浓度为0.04％(体积分数)。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述原代分离培养方法中消化液消化的时间为1-2min。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述间充质干细胞来源与脐带组织。所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。
本发明所述间充质干细胞的分离培养方法中，在组织块有细胞爬出后去掉组织块，并对细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。
本发明所述间充质干细胞的分离培养方法中，在清洗后加入完全培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％。
在一些实施方案中，本发明所述间充质干细胞的分离培养方法中，所述终止消化的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍～10倍。
在一个具体实施例中，本发明分别从细胞存活率、增殖情况以及细胞表面标记进行评价，对比本发明所述间充质干细胞的冻存液与常规冻存液的冻存效果，结果显示无论是在细胞的数量上，还是细胞存活率上，采用本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞均优于常规冻存液冻存的细胞。而增殖情况结果显示本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞相对常规冻存液冻存的细胞，较快进入细胞生长期，且增殖的速度较快。此外细胞表面标记结果显示采用本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞在培养3天后在特异性表面标记的表达率上，明显高于采用常规冻存液冻存的细胞。
在一个具体实施例中，本发明分别从细胞存活率、增殖情况以及细胞表面标记进行评价，对比本发明所述间充质干细胞的冻存方法与对照组冻存盒的冻存效果，结果显示无论是在细胞的数量上，还是细胞存活率上，采用本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞均优于对照组冻存盒冻存的细胞。而增殖情况结果显示本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞相对对照组冻存盒冻存的细胞，较快进入细胞生长期，且增殖的速度较快。此外细胞表面标记结果显示采用本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞在培养3天后在特异性表面标记的表达率上，明显高于采用对照组冻存盒冻存的细胞。
由此可见，采用本发明所述间充质干细胞的冻存液，结合本发明所述间充质干细胞的冻存方法进行间充质干细胞的冻存，将起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
本发明还提供了一种间充质干细胞的冻存试剂盒，包含本发明所述间充质干细胞的冻存液。
本发明所述间充质干细胞的冻存液包括无血清培养基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的浓度为3v/v％～7v/v％，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为1w/v％～3w/v％。与常规细胞冻存液相比本发明所述间充质干细胞的冻存液避免了动物源性物质在临床应用上的潜在风险，也降低了细胞污染的几率，同时降低了DMSO的浓度，减少了DMSO对细胞的毒性作用，具有更高的临床安全性。实验表明，与常规细胞冻存液相比，本发明间充质干细胞的冻存液，冻存细胞之后活率显著提高，并保持良好的干细胞特性，可以用于间充质干细胞的长期保存及应用。本发明所述间充质干细胞的冻存方法采用本发明所述冻存液重悬细胞并调整细胞密度后冻存细胞。与冻存盒冻存的方法相比，本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞以及常规冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线图，其中-为系列1即本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线，为系列2即为常规冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线；
图2示实施例3复苏后的间充质干细胞细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞，图d-f为常规冻存液冻存的细胞；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为CD34及CD44表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为CD34及CD44表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图；
图3示实施例4本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞以及常规冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线图，其中-为系列1即本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线，为系列2即为常规冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线；
图4示实施例4复苏后的间充质干细胞细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞结果图，图d-f为对照组冻存盒冻存的细胞结果图；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为CD34及CD44表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为CD34及CD44表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、脐带间充质干细胞的分离培养
1、取牛脐带组织块，剪碎，将完全培养基加到组织块中，吹打均匀后转移到细胞培养皿中；所述完全培养基的组成成分为：Lonza通用UltraCULTURE无血清培养基+PALL血清替代物+2mM/L-谷氨酰胺+100mg/L NEAA；
2、摇晃培养皿使组织块均匀分布于培养皿中，转移至5％CO2、37℃细胞培养箱中培养，并定期添观察细胞生长情况；
3、当细胞爬出后，弃掉旧培养基及组织块，用PBS清洗培养皿后，加入完全培养基继续置于细胞培养箱中培养；
4、当细胞融合度达到80％～90％后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，加入含EDTA的胰酶混合液进行消化1～2min，加入完全培养基终止消化后，将细胞吹打成单细胞悬液，获得脐带间充质干细胞，并记为P1代细胞。
5、将获得的P1代细胞离心收集后，以1:3的比例进行传代培养，用完全培养基接种到培养皿后，置于5％CO2、37℃培养箱继续培养。当细胞融合度达到80％～90％后即可进行再次传代，并记为P2代细胞，以此类推。
实施例2、脐带间充质干细胞的冻存
1、配制冻存液：按照冻存液各组分的比例提前配制好间充质干细胞的冻存液，其中含5％DMSO(V/V)，1％右旋糖苷-40(质量体积比，g/mL)，其余组分为Ultra CULTURE无血清培养基。将配制好的冻存液放于4℃冰箱中预冷。
2、取实施例1中获得的P2代细胞，当细胞融合度达到80％～90％后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，添加含EDTA的胰酶混合液进行消化1～2min，加入完全培养基终止消化后，将细胞吹打成单细胞悬液，获得P2代脐带间充质干细胞。
3、取少量细胞悬液利用细胞计数仪进行细胞计数，其余悬液1500rpm/min离心5min收集细胞。根据计数结果，加入步骤1预先配制好的间充质干细胞冻存液重悬细胞，将细胞密度调整为1×106/mL。
4、将重悬于冻存液的间充质干细胞分装于2mL无菌冻存管中，每管加入1.5mL，旋紧盖子后用医用胶布封口，用标记笔在冻存管上标记上细胞类型、代数、日期等信息。
5、将冻存管放进程序降温仪的箱体中，打开程序降温仪中预设的程序，开始运行程序，待程序运行结束后转移至液氮中即可。
降温程序为：
4℃，维持5min；
-1℃/min直至-4℃；
-25℃/min直至-12℃；
-1℃/min直至-40℃；
-10℃/min直至-90℃；
-90℃，维持5min。
6、将冻存管从程序降温仪的箱体中取出，立即转移到液氮中进行长期保存。
实施例3、本发明所述间充质干细胞冻存液的效果评价
取实施例2中步骤1～2所获得的脐带间充质干细胞的细胞悬液，采用常规的冻存液即含10％DMSO、20％FBS、70％DMEM/F12，冻存方法与实施例2相同。即除了冻存液的组分不同，其他条件均与实施例2保持一致。
将上述冻存的细胞作为对照组，分别从细胞存活率、增殖情况以及细胞表面标记进行评价，对比本发明所述间充质干细胞的冻存液与常规冻存液的冻存效果。
1、复苏后细胞的细胞存活率比较
分别复苏实验组及对照组的两管细胞，复苏后细胞的存活率结果如表1。
表1不同冻存液冻存后复苏细胞的存活率比较结果
| 冻存液 | 本发明冻存液① | 本发明冻存液② | 常规冻存液① | 常规冻存液② |
| 细胞数量 | 1.34×106 | 1.28×106 | 1.29×106 | 1.27×106 |
| 细胞存活率 | 96.3％ | 95.9％ | 88.4％ | 86.8％ |
表1结果显示，采用本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的两管细胞，细胞数量平均值为1.32×106，复苏后细胞存活率为96.1％；而对照组采用常规冻存液冻存的两管细胞，细胞数量平均值为1.28×106，复苏后细胞存活率为87.6％。由此可见，无论是在细胞的数量上，还是细胞存活率上，采用本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞均优于常规冻存液冻存的细胞。
2、复苏后细胞的增殖情况对比：
绘制本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞以及常规冻存液冻存的细胞复苏后7天生长曲线图，结果如图1
复苏后细胞7天的生长曲线分为3个阶段，第一阶段为适应期，细胞增殖较慢；第二阶段为生长期，细胞增殖较快，呈对数增长；第三阶段为平台期，细胞增殖变慢。由图1结果可见，本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞相对常规冻存液冻存的细胞，较快进入细胞生长期，且增殖的速度较快。
3、复苏后细胞表面标记表达率的结果对比：
脐带间充质干细胞的特异性表面标记有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分别复苏实验组及对照组的两管细胞，在培养3天后消化收集后制成单细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行脐带MSC表面标记物的流式检测。结果见图2。加入的特异性抗体分别为CD34(呈阴性表达)、CD45(呈阴性表达)、CD44(呈阳性表达)、CD90(呈阳性表达)。结果见图2。
由图2结果可见，本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为99.2％，CD45-CD90+表达率为97.8％。常规冻存液冻存的细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为93.8％，CD45-CD90+表达率为92.6％。表明采用本发明所述间充质干细胞的冻存液冻存的细胞在培养3天后在特异性表面标记的表达率上，明显高于采用常规冻存液冻存的细胞。
实施例4、本发明所述间充质干细胞冻存方法的效果评价
取实施例2中步骤1～4所获得的加有脐带间充质干细胞悬液的冻存管2管，冻存方法改为使用冻存盒放置于超低温冰箱中进行降温保存24h，再转移到液氮中进行长期保存。除冻存的降温方法不同，其他条件均与实施例2保持一致。
将上述冻存的细胞作为实验对照组，分别从细胞存活率、增殖情况以及细胞表面标记进行评价，对比本发明所述间充质干细胞的冻存方法与常规冻存方法的冻存效果。
1、复苏后细胞的细胞存活率比较
分别复苏实验组及对照组的两管细胞，复苏后细胞的存活率结果对比如表2。
表2不同冻存方法冻存后复苏细胞的存活率比较结果
| 冻存方法 | 本发明冻存方法① | 本发明冻存方法② | 对照组① | 对照组② |
| 细胞数量 | 1.31×106 | 1.37×106 | 1.25×106 | 1.23×106 |
| 细胞存活率 | 95.5％ | 96.1％ | 91.3％ | 89.5％ |
表2结果显示，采用本发明所述间充质干细胞的冻存方法，即程序降温仪冻存的两管细胞，细胞数量平均值为1.34×106，复苏后细胞存活率为95.5％；而对照组采用冻存盒冻存的两管细胞，细胞数量平均值为1.24×106，复苏后细胞存活率为89.8％。由此可见，无论是在细胞的数量上，还是细胞存活率上，采用本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞均优于对照组冻存盒冻存的细胞。
2、复苏后细胞的增殖情况对比：
绘制本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞以及对照组冻存盒冻存的细胞复苏后7天的生长曲线图，结果如图3。
复苏后细胞7天的生长曲线分为3个阶段，第一阶段为适应期，细胞增殖较慢；第二阶段为生长期，细胞增殖较快，呈对数增长；第三阶段为平台期，细胞增殖变慢。由图3结果可见，本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞相对对照组冻存盒冻存的细胞，较快进入细胞生长期，且增殖的速度较快。
3、复苏后细胞表面标记表达率的结果对比：
脐带间充质干细胞的特异性表面标记有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分别复苏实验组及对照组的两管细胞，在培养3天后消化收集后制成单细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行脐带MSC表面标记物的流式检测。结果见图4。加入的特异性抗体分别为CD34(呈阴性表达)、CD45(呈阴性表达)、CD44(呈阳性表达)、CD90(呈阳性表达)。
由图4结果可见，本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞在培养3天后流式结果显示CD34-CD44+表达率为98.3％，CD45-CD90+表达率为98.5％。对照组冻存盒冻存的细胞在培养3天后，流式结果显示CD34-CD44+表达率为93.6％，CD45-CD90+表达率为91.9％。表明采用本发明所述间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞在特异性表面标记的表达率上，明显高于采用对照组冻存盒冻存的细胞。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞的冻存液，由无血清培养基、DMSO、右旋糖酐-40组成，其中所述DMSO的浓度为3v/v％～7v/v％，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为1w/v％～3w/v％。
2.根据权利要求1所述的冻存液，所述DMSO的浓度为5v/v％，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为1w/v％。
3.根据权利要求1或2所述的冻存液，所述无血清培养基为lonza UltraCULTUREMEDIUM无血清培养基。
4.一种间充质干细胞的冻存方法，取间充质干细胞细胞悬液离心收集细胞，用权利要求1所述间充质干细胞的冻存液重悬细胞并调整细胞密度，分装于冻存管中冻存。
5.根据权利要求4所述的冻存方法，所述细胞密度为1×106/mL。
6.根据权利要求4或5所述的冻存方法，所述冻存的具体方法为≤-80℃冻存。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，所述≤-80℃冻存为-80℃超低温冰箱长期冻存或液氮中长期冻存。
8.根据权利要求4或5所述的冻存方法，所述冻存的具体方法为程序降温仪逐渐降温至-90℃后转移至液氮中进行长期保存。
9.根据权利要求8所述的冻存方法，所述程序降温仪降温程序为：
4℃，维持5min；
-1℃/min直至-4℃；
-25℃/min直至-12℃；
-1℃/min直至-40℃；
-10℃/min直至-90℃；
-90℃，维持5min。
10.一种间充质干细胞的冻存试剂盒，包含权利要求1所述间充质干细胞的冻存液。
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